▶ アケソ バイオファーマ カンパニー，リミティドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-07
(54)【発明の名称】抗ＣＤ７３抗体とその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20230831BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230831BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20230831BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230831BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230831BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20230831BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20230831BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230831BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230831BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230831BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230831BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C07K19/00
C07K16/46
A61K39/395 P
A61K39/395 U
A61P31/12
A61P33/00
A61P31/10
A61P31/04
A61P35/00
A61P37/04
C12N15/13 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023511960
(86)(22)【出願日】2021-08-16
(85)【翻訳文提出日】2023-04-10
(86)【国際出願番号】 CN2021112771
(87)【国際公開番号】W WO2022037531
(87)【国際公開日】2022-02-24
(31)【優先権主張番号】202010828886.4
(32)【優先日】2020-08-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202011152518.9
(32)【優先日】2020-10-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520404676
【氏名又は名称】アケソ バイオファーマ カンパニー，リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100182730
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 浩明
(72)【発明者】
【氏名】ワン チョンミン
(72)【発明者】
【氏名】チン シアオピン
(72)【発明者】
【氏名】リー パイヨン
(72)【発明者】
【氏名】シア ユイ
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA14
4C085BB22
4C085BB36
4C085BB41
4C085BB43
4C085CC02
4C085EE01
4C085GG02
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本開示は、抗ＣＤ７３抗体、及びコロナウイルス感染によって引き起こされる疾患の治療におけるその適用に関する。具体的には抗体の重鎖可変領域は、配列番号１５～１７に示されるＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３などのアミノ酸配列を含み、及び抗体の軽鎖可変領域は配列番号１８～２０に示されるＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３などのアミノ酸配列を含む。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
コロナウイルス感染によって引き起こされる疾患を治療するための抗ＣＤ７３（例えばヒトＣＤ７３）抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗ＣＤ７３抗体は、配列番号２に示されるＶＨに含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４に示されるＶＬに含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
好ましくは前記抗ＣＤ７３抗体は、
配列番号１５に示されるアミノ酸配列、それと少なくともと８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又はその配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＨＣＤＲ１；
配列番号１６に示されるアミノ酸配列、それと少なくともと８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又はその配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＨＣＤＲ２；
配列番号１７に示されるアミノ酸配列、それと少なくともと８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又はその配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＨＣＤＲ３；
配列番号１８に示されるアミノ酸配列、それと少なくともと８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又はその配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＬＣＤＲ１；
配列番号１９に示されるアミノ酸配列、それと少なくともと８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又はその配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＬＣＤＲ２；及び
配列番号２０に示されるアミノ酸配列、それと少なくともと８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又はその配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＬＣＤＲ３、を含む上記抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
請求項１に記載の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体のＶＨは、
配列番号２、配列番号６、又は配列番号１０、これと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、若しくは９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又は配列番号２、配列番号６、若しくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、及び
前記抗体のＶＬは、
配列番号４、配列番号８、配列番号１２ 又は配列番号１４、これと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、若しくは９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又は配列番号４、配列番号８、配列番号１２ 若しくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、上記抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
請求項１又は２に記載の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片であって、ここで、抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２に示される通りで、及び抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４に示される通りであり；
抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に示される通りで、及び抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に示される通りであり；
抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０に示される通りで、及び抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１２に示される通りであり；又は
抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０に示される通りで、及び抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に示される通りである、上記抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
抗体のＣＨがＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７であり、ＣＬがＩｇカッパ鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４である、請求項１又は２に記載の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項5】
請求項１又は２に記載の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片であって、ここで前記抗体が、モノクローナル抗体（好ましくは抗ＣＤ７３抗体が、保存番号ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｃ２０１８１３７のハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体である）、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）であり、好ましくは抗体の重鎖アミノ酸配列は配列番号２３に示される通りであり、及び軽鎖アミノ酸配列は配列番号２４に示される通りである、上記抗体又はその抗原結合断片。
【請求項6】
前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆａｂ／ｃ、ＣＤＲ断片、単鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は二重特異性抗体から選択される、請求項１又は２に記載の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項7】
請求項１～６のいずれかに記載の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片及び結合部分を含む、コロナウイルス感染に起因する疾患を治療するための結合体であって、ここで、前記結合部分は、精製タグ（例えばＨｉｓタグ）、検出可能な標識物、又は小分子薬であり；好ましくは前記結合部分は、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、着色物質、ポリエチレングリコール、又は酵素であり；好ましくは前記小分子薬は小分子細胞傷害性薬であり；より好ましくは前記小分子薬は腫瘍化学療法薬であり、より好ましくは前記抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、リンカーによって前記小分子薬に連結されており；例えばリンカーは、ヒドラゾン結合、ジスルフィド結合、又はペプチド結合であり；より好ましくは前記抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、特定のモル比で前記小分子薬に連結され；例えば前記モル比は１：（２～４）である、上記結合体。
【請求項8】
請求項１～６のいずれかに記載の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片を含む、コロナウイルス感染に起因する疾患を治療するための融合タンパク質又は多重特異性抗体（好ましくは二重特異性抗体）。
【請求項9】
請求項１～６のいずれかに記載の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合断片、請求項７に記載の結合体、又は請求項８に記載の融合タンパク質若しくは多重特異性抗体を含むキットであって、好ましくは前記キットは、ワクチンとして使用される二次抗体又は抗原をさらに含み、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片を特異的に認識する前記二次抗体はウイルス感染（好ましくはコロナウイルス科のウイルス感染）を治療するためのものであり、ワクチンとして使用される抗原は、ウイルス、細菌、真菌、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ、寄生虫、プリオン、又は腫瘍から選択され；任意選択的に、二次抗体は、検出可能な標識物、例えば放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、着色物質、又は酵素をさらに含み；好ましくはキットは、試料中のＣＤ７３の存在又はそのレベルを検出するために使用される、上記キット。
【請求項10】
請求項１～６のいずれかに記載の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合断片、請求項７に記載の結合体、又は請求項８に記載の融合タンパク質若しくは多重特異性抗体を含む、コロナウイルス感染によって引き起こされる疾患を治療するための医薬組成物又は単一薬物投与単位であって、任意選択的に、前記医薬組成物又は単一薬物投薬単位は、医薬的に許容し得るベクター及び／又は賦形剤をさらに含み、好ましくは前記医薬組成物は、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射、又は病巣内注射による投与に適した形態であるである、上記組成物又は単一薬物投与単位。
【請求項11】
好ましくは新規コロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及び／又はＭＥＲＳ－ＣｏＶから選択される、コロナウイルス感染を治療及び／又は予防するための薬物又はキットの調製における、請求項１～６に記載の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合断片、請求項７に記載の結合体、又は請求項８に記載の融合タンパク質若しくは多重特異性抗体の使用目的。
【請求項12】
請求項１～６のいずれかに記載の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合断片、請求項７に記載の結合体、又は請求項８に記載の融合タンパク質若しくは多重特異性抗体の有効量を被験体又は患者に投与することを含む、コロナウイルス感染を治療及び／又は予防するための方法であって、好ましくは前記コロナウイルス科ウイルスは、新規コロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及び／又はＭＥＲＳ－ＣｏＶから選択され、より好ましくは抗ウイルス薬は被験体又は患者に同時又は連続的に投与され、好ましくは抗ウイルス薬はＲＮＡウイルス阻害剤である、上記方法。
【請求項13】
請求項１２に記載の方法であって、より好ましくは抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合断片、結合体、融合タンパク質、又は多重特異性抗体の有効用量は、０．００１ｍｇ～１，０００ｍｇ、より好ましくは０．００１ｍｇ～９００ｍｇ、０．００１ｍｇ～８００ｍｇ、０．００１ｍｇ～７００ｍｇ、０．００１ｍｇ～６００ｍｇ、０．００１ｍｇ～５００ｍｇ、０．００１ｍｇ～４００ｍｇ、０．００１ｍｇ～３００ｍｇ、０．００１ｍｇ～２００ｍｇ、又は０．００１ｍｇ～１００ｍｇ、最も好ましくは１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、又は１，０００ｍｇであり、又は有効用量は、被験体又は患者の体重に基づいて０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１～９０ｍｇ／ｋｇ、１～８０ｍｇ／ｋｇ、１～７０ｍｇ／ｋｇ、１～６０ｍｇ／ｋｇ、１～５０ｍｇ／ｋｇ、１～４０ｍｇ／ｋｇ、１～３０ｍｇ／ｋｇ、１～２０ｍｇ／ｋｇ、又は１～１０ｍｇ／ｋｇである、上記方法。
【請求項14】
請求項１２に記載の方法であって、抗ウイルス薬の有効量は、１００～２，４００ｍｇ、好ましくは１００ｍｇ～２，３００ｍｇ、１００ｍｇ～２，２００ｍｇ、１００ｍｇ～２，１００ｍｇ、１００ｍｇ～２，０００ｍｇ、１００ｍｇ～１，９００ｍｇ、１００ｍｇ～１，８００ｍｇ、１００ｍｇ～１，７００ｍｇ、１００ｍｇ～１，６００ｍｇ、１００ｍｇ～１，８００ｍｇ、１００ｍｇ～１，８００ｍｇ、１００ｍｇ～１，８００ｍｇ、１００ｍｇ～１８００ｍｇ、又は１００ｍｇ～１８００ｍｇ、より好ましくは１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、又は１０００ｍｇであり；あるいは、抗ウイルス薬の有効用量は、被験体又は患者の体重に基づいて０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１～９０ｍｇ／ｋｇ、１～８０ｍｇ／ｋｇ、１～７０ｍｇ／ｋｇ、１～６０ｍｇ／ｋｇ、１～５０ｍｇ／ｋｇ、１～４０ｍｇ／ｋｇ、１～３０ｍｇ／ｋｇ、１～２０ｍｇ／ｋｇ、又は１～１０ｍｇ／ｋｇである、上記方法。
【請求項15】
抗原に対する生物の免疫を増強するための補助剤として使用される、請求項１～６のいずれかに記載の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合断片、請求項７に記載の結合体、又は請求項８に記載の融合タンパク質若しくは多重特異性抗体。
【請求項16】
抗原は、ウイルス、細菌、真菌、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ、寄生虫、プリオン、又は腫瘍に由来し；好ましくはウイルスは、ＲＮＡウイルス及びＤＮＡウイルスを含み；
好ましくはＲＮＡウイルスは、コロナウイルス科ウイルスを含み；
好ましくはコロナウイルスは、２０１９年の新規コロナウイルス（新規コロナウイルス肺炎ＣＯＶＩＤ－１９を誘発する２０１９－ｎＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（これらは重症の急性呼吸器症候群を誘発する）、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ（これは中東呼吸器症候群を誘発する）を含む、請求項１～６のいずれかに記載の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合断片、請求項７に記載の結合体、又は請求項８に記載の融合タンパク質若しくは多重特異性抗体。
【請求項17】
ワクチン接種の前又は後に、請求項１～６のいずれかに記載の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合断片、請求項７に記載の結合体、又は請求項８に記載の融合タンパク質若しくは多重特異性抗体を被験体に投与することを含む、ワクチンの有効性を上昇させるか又はワクチンに対する生物の応答性を増強する方法であって、好ましくは、ワクチンに含まれる抗原は、ウイルス、細菌、真菌、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ、寄生虫、プリオン、又は腫瘍に由来し；
好ましくはウイルスは、ＲＮＡウイルス及びＤＮＡウイルスを含み；
好ましくはＲＮＡウイルスは、コロナウイルス科ウイルスを含み；
好ましくはコロナウイルスは、２０１９年の新規コロナウイルス（新規コロナウイルス肺炎ＣＯＶＩＤ－１９を誘発する２０１９－ｎＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（これらは重症の急性呼吸器症候群を誘発する）、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ（これは中東呼吸器症候群を誘発する）を含む、上記方法。
【請求項18】
請求項１～６のいずれかに記載の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合断片、請求項７に記載の結合体、又は請求項８に記載の融合タンパク質若しくは多重特異性抗体が、１回以上（好ましくは静脈内に）投与される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、免疫学の分野に関する。特に本発明は、抗ＣＤ７３抗体とその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
エクト－５'－ヌクレオチダーゼ、すなわちＣＤ７３タンパク質は、ＮＴ５Ｅ遺伝子によってコードされるタンパク質分子量７０ＫＤの多機能糖タンパク質であり、グリコシルホスファチジルリノシトール（ＧＰＩ）により細胞膜に固定されている（Zimmermann H. Biochem J. 1992; 285: 345-365）。
【0003】
ＣＤ７３はヒト組織細胞の表面に広く分布しており、及びまた樹状細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）などの免疫細胞の表面にも広く発現している。
【0004】
ＣＤ７３は加水分解酵素活性と非加水分解酵素活性の両方を有する。ＣＤ７３の酵素的及び非酵素的機能の免疫抑制メカニズムは、ＣＤ７３－アデノシン代謝シグナル伝達経路によって媒介される。ＣＤ７３の上流のＣＤ３９は、ＡＴＰによるアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の生成を触媒することができ、生成されたＡＭＰはＣＤ７３によってアデノシンに変換される。アデノシンは下流のアデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）に結合し、これは、ＬＣＫ、ＭＡＰＫ、ＰＫＣなどの一連の免疫活性化関連シグナル伝達経路を阻害し、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）及びＣｓｋを活性化することによってＴ細胞の免疫殺傷を阻害し、こうして免疫抑制効果を発揮する（Antonioli L, et al Nat Rev Cancer. 2013; 13: 842-857）。
【0005】
コロナウイルス科のウイルスには、２０１９新型コロナウイルス（新型コロナウイルス肺炎ＣＯＶＩＤ－１９を誘発する２０１９－ｎＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（重症急性呼吸器症候群を誘発する）、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ（中東呼吸器症候群を誘発する）が含まれる。上記のウイルス感染症は、重度の臨床症状を引き起こしたり、生命を脅かすことさえある。
【0006】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶは、さまざまなメカニズムを通して免疫応答と戦う。これらのメカニズムの１つは、１型インターフェロン（ＩＦＮ－１）の発現とシグナル伝達を阻害する（Kindler, E., Thiel et al. SARS-CoV and IFN: Too Little, Too Late. Cell Host Microbe 2016, 19 (2), 139-141）。誘導性Ｉ型インターフェロンは、ウイルス感染に対する細胞耐性を誘導し、ウイルス感染細胞のアポトーシスを促進することにより、抗ウイルス免疫応答において重要な役割を果たす。ＳＡＲＳ－ＣｏＶはＩＦＮ－Ｉの急速な増加を妨害し、これがコロナウイルスの複製を促進する。ＡＴＰはＩＦＮ産生を促進し、改善された細胞外ＡＴＰは、シグナル伝達経路Ｐ３８／ＪＮＫ／ＡＴＦ－２を介してＩＦＮ分泌を促進することにより、このサイクルを逆転できることが証明されている。従って、ＡＴＰを欠く細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶやＣＯＶＩＤ－１９などのウイルス感染の影響に対してより感受性になる（Taghizadeh-Hesary F., Akbari H. The Powerful Immune System Against Powerful COVID-19: A Hypothesis. Medical Hypotheses, 2020, 109762）。インビトロ実験では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、インターフェロンを阻害する複数のタンパク質を発現することが示されており（Konno, Yoriyuki, et al. SARS-CoV-2 ORF3b is a potent interferon antagonist whose activity is further increased by a naturally occurring elongation variant. bioRxiv (2020 Yuen, Chun-Kit, et al. SARS-CoV-2 nsp13, nsp14, nsp15 and orf6 function as potent interferon antagonists. Emerging Microbes and Infections (2020): 1 - 29）、これが、効果的な初期免疫応答を阻害する重要なメカニズムであることを証明している。
【0007】
インターフェロンは、急性期での役割に加えて、免疫抑制性Ｔｒｅｇの発生にも重要な役割を果たす。重症のＣＯＶＩＤ－１９患者の肺損傷は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）と関連しており、免疫抑制メカニズムが時間内に活性化されない可能性があることを示している（Acharya, D., Liu, G. & Gack, M.U. Dysregulation of type I interferon responses in COVID-19. Nat Rev Immunol 20, 397-398 (2020)）．これはＣＯＶＩＤ－１９患者のＴｒｅｇ数によって裏付けられており、これが疾患の重症度に反比例する。
【0008】
ＡＴＰ分解経路の阻害は、ＣＯＶＩＤ－１９を治療するためのメカニズムとして使用できる可能性がある。ＡＴＰはインターフェロンの分泌を刺激し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の強力なインターフェロン阻害メカニズムと戦うことができる。うまく行けば、これは感染の初期段階でウイルスを排除するのに役立つであろう。
【0009】
ＣＯＶＩＤ－１９患者の２つの臨床症状は、低酸素症と低酸素血症である。低酸素誘導因子－１（ＨＩＦ－１）及び他の分子のアップレギュレーションにより、ＣＤ７３が広範囲に発現される（Synnestvedt K, et al. J Clin Invest. 2002; 110: 993 - 1002）。さらに、Ａ２Ｂ受容体は、低酸素状態でより容易に活性化される。Ａ２Ｂ受容体の活性化は、関連細胞による大量のＩＬ－６の産生を直接促進し、肺線維細胞の分化を誘導する（Hongyan Zhong, Luiz Belardinelli et al. Synergy between A2B Adenosine Receptors and Hypoxia in Activating Human Lung Fibroblasts. Am J Respir Cell Mol Biol, 2005, 32: 2 - 8）。さらに、ＩＬ－６は、ＣＯＶＩＤ－１９患者のサイトカインストームにおける主要な炎症因子の１つである。従って、アデノシンレベルを下げることは、ＣＲＳと呼吸窮迫の患者にとって特に有益となり得る。多くの研究で、重篤かつ重篤なＣＯＶＩＤ－１９患者で、ＩＬ－６とＧＭ－ＣＳＦが有意に上昇していることが報告されている（Characteristics of lymphocyte subsets and cytokines in peripheral blood of 123 hospitalized patients with 2019 novel coronavirus pneumonia (NCP). Wan SX, Yi QJ, Fan SB, Lv JL, Zhang XX, Guo L, Lang CH, Xiao Q, Xiao KH, et al. medRxiv 02/10/2020. 20021832; Chen Lei, Liu Huiguo, Liu Wei et al. Analysis of clinical characteristics of 29 patients with COVID-19. Chinese Journal of Tuberculosis and Respiratory Diseases, 2020, 43: E005）。重症の急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）感染に関する研究でも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ３ａタンパク質がマクロファージのＮＬＲＰ３インフラマソーム（inflammasome）を直接活性化し、下流のＩＬ－６上昇を媒介するメカニズムが確認されている（Chen IY, Moriyama M, Chang MF, Ichinohe T. Severe Respiratory Syndrome Coronavirus Viroporin 3a Activates the NLRP3 Inflammasome. Front Microbiol. eCollection 2019）．
【0010】
免疫応答を強化することで、ウイルスクリアランスの高速化、回復時間の短縮、合併症の減少、免疫の長期化、再感染の防止につながる可能性がある。免疫応答を強化する能力は、ＣＯＶＩＤ－１９やその他の流行病を治療する潜在的な機会を提供する。
【0011】
ＣＤ７３は、ヒトＢ細胞、Ｔ細胞、骨髄細胞、骨髄間質細胞、胸腺上皮細胞に発現している。研究（Giovanni Forte, Rosalinda Sorrentino et al. Inhibition of CD73 Improves B Cell-Mediated Anti-Tumor Immunity in a Mouse Model of Melanoma. The Journal of Immunology, 2012, 189: 2226 - 2233.）では、ＣＤ７３の拮抗作用が、抗菌、抗毒素、抗ウイルス抗体の主要成分であるＩｇＧの産生においてＩＬ－１７Ａを介してＢ細胞の活性に影響を与え得ることが示されている。同じコロナウイルス科ウイルスの感染によって引き起こされたＣＯＶＩＤ－１９で死亡した患者の剖検で、患者の血液中のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の数が大幅に減少していたが、ＩＬ－１７Ａを産生するＴｈ１７細胞の割合が有意に高かったことが判明した（Xu Z, Shi L, Wang YJ, Zhang JY, Huang L, Zhang C et al. Pathological findings of COVID-19 associated with acute respiratory distress syndrome. The Lancet Respiratory Medicine. 2020）．
【0012】
要約すると、ＣＤ７３をブロックすることは、ＣＤ７３のアデノシン経路を調節し、免疫応答に影響を与えることにより、ＣＯＶＩＤ－１９を含むコロナウイルス科のウイルスによって引き起こされる疾患を治療するために、使用できる可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
発明の要約
本開示の発明者らは、組換えヒトＣＤ７３を抗原として発現する哺乳動物細胞発現系を用いてマウスを免疫し、マウス脾細胞とミエローマ細胞を融合させてハイブリドーマを得ることを開示する。本発明者らは、多数の試料をスクリーニングすることにより、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４（保存番号ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｃ２０１８１３７）を得た。
本開示の発明者らは、組換えヒトＣＤ７３を抗原として発現する哺乳動物細胞発現系を用いてマウスを免疫し、マウス脾細胞とミエローマ細胞を融合させてハイブリドーマを得ることを開示する。本発明者らは、多数の試料をスクリーニングすることにより、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４（保存番号ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｃ２０１８１３７）を得た。
【0014】
本開示の発明者らは、驚くべきことに、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４が、それぞれ、ヒトＣＤ７３に特異的に結合する特異的モノクローナル抗体（１９Ｆ３と命名）を分泌及び産生できることを見出した。さらに、本開示の発明者らは、抗ヒトＣＤ７３ヒト化抗体（１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３と命名）を作製した。
【0015】
本開示の発明者らはまた、驚くべきことに、本開示の抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３が、非基質競合的にＣＤ７３の酵素活性を阻害し、アデノシンの産生を減少させ、細胞膜表面でのＣＤ７３のエンドサイトーシスを促進し、及びＢ細胞の活性化と増殖を刺激するのに非常に有効であることを見出した。本開示の抗体は、コロナウイルス感染に関連する疾患を治療することができる。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本開示の１つの態様は、コロナウイルスによって引き起こされる感染症を治療及び／又は予防するための抗ＣＤ７３（例えばヒトＣＤ７３）抗体又はその抗原結合断片に関し、ここで抗ＣＤ７３抗体は以下を含む：
配列番号２、配列番号６、又は配列番号１０に示される重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、又は配列番号１４に示される軽鎖可変領域に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
配列番号２、配列番号６、又は配列番号１０に示される重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、又は配列番号１４に示される軽鎖可変領域に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
【0017】
好ましくはＩＭＧＴ番号付けシステムによれば、抗ＣＤ７３抗体は以下を含む：
配列番号１５に示されるアミノ酸配列、それと少なくともと８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又はその配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＨＣＤＲ１；
配列番号１５に示されるアミノ酸配列、それと少なくともと８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又はその配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＨＣＤＲ１；
【0018】
配列番号１６に示されるアミノ酸配列、それと少なくともと８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又はその配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＨＣＤＲ２；
【0019】
配列番号１７に示されるアミノ酸配列、それと少なくともと８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又はその配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＨＣＤＲ３；
【0020】
配列番号１８に示されるアミノ酸配列、それと少なくともと８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又はその配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＬＣＤＲ１；
【0021】
配列番号１９に示されるアミノ酸配列、それと少なくともと８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又はその配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＬＣＤＲ２；及び
【0022】
配列番号２０に示されるアミノ酸配列、それと少なくともと８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又はその配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、又は３）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＬＣＤＲ３。
【0023】
本開示のいくつかの実施態様において、
抗体の重鎖可変領域は、以下の配列を含むか又はそれからなる：
配列番号２、配列番号６、又は配列番号１０、これと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又は配列番号２、配列番号６、若しくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列；及び
抗体の重鎖可変領域は、以下の配列を含むか又はそれからなる：
配列番号２、配列番号６、又は配列番号１０、これと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又は配列番号２、配列番号６、若しくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列；及び
【0024】
抗体のＶＬは、以下の配列を含むか又はそれからなる：
配列番号４、配列番号８、配列番号１２ 又は配列番号１４、これと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又は配列番号４、配列番号８、配列番号１２ 若しくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列。
配列番号４、配列番号８、配列番号１２ 又は配列番号１４、これと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列、又は配列番号４、配列番号８、配列番号１２ 若しくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入、又は欠失）を有するアミノ酸配列。
【0025】
本開示のいくつかの実施態様において、抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２に示される通りで、及び抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４に示される通りであり；
抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に示される通りで、及び抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に示される通りであり；
抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０に示される通りで、及び抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１２に示される通りであり；又は
抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０に示される通りで、及び抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に示される通りである。
抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に示される通りで、及び抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に示される通りであり；
抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０に示される通りで、及び抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１２に示される通りであり；又は
抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０に示される通りで、及び抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に示される通りである。
【0026】
本開示のいくつかの実施態様において、抗体の重鎖定常領域は、Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７であり、軽鎖定常領域はＩｇカッパ鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４である。
【0027】
軽鎖と重鎖の可変領域が抗原結合を決定し；各鎖の可変領域には、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域が含まれる（重鎖（Ｈ）のＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、そして軽鎖（Ｌ）のＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、これらは、Kabat et al.（Bethesda M.d., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 1991; 1 - 3: 91 - 3242を参照）によって命名された。
【0028】
好ましくはＣＤＲは、ＩＭＧＴ番号付けシステムによっても定義できる。Ehrenmann, Francois, Quentin Kaas, and Marie-Paule Lefranc. IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF. Nucleic acids research 2009; 38(suppl_1): D301 - D307を参照されたい。
【0029】
モノクローナル抗体配列のＣＤＲのアミノ酸配列は、ＩＭＧＴの定義に従って、当業者に周知の技術によって、例えばＶＢＡＳＥ２データベースによって分析される。
【0030】
抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域配列がわかっている場合、抗体のＣＤＲを決定するためのいくつかの方法（Kabat、ＩＭＧＴ、Chothia、及びＡｂＭ番号付けシステムを含む）がある。
【0031】
しかし、抗体又はその変種に関する各ＣＤＲ定義の適用は、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内である。抗体の可変領域のアミノ酸配列が与えられている場合、当業者は一般に、配列自体以外の実験データに依存することなく、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを判定することができる。
【0032】
本開示が関係する抗体１９Ｆ３、１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２、及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３は、同じＣＤＲを有する：
その重鎖可変領域の３つのＣＤＲのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＨＣＤＲ１：ＧＹＳＦＴＧＹＴ（配列番号１５）、
ＨＣＤＲ２：ＩＮＰＹＮＡＧＴ（配列番号１６）、
ＨＣＤＲ３：ＡＲＳＥＹＲＹＧＧＤＹＦＤＹ（配列番号１７）；
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＬＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹ（配列番号１８）、
ＬＣＤＲ２：ＦＡＳ（配列番号１９）、
ＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＤＴＰＹＴ（配列番号２０）。
その重鎖可変領域の３つのＣＤＲのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＨＣＤＲ１：ＧＹＳＦＴＧＹＴ（配列番号１５）、
ＨＣＤＲ２：ＩＮＰＹＮＡＧＴ（配列番号１６）、
ＨＣＤＲ３：ＡＲＳＥＹＲＹＧＧＤＹＦＤＹ（配列番号１７）；
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＬＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹ（配列番号１８）、
ＬＣＤＲ２：ＦＡＳ（配列番号１９）、
ＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＤＴＰＹＴ（配列番号２０）。
【0033】
本開示のいくつかの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体である。本開示のいくつかの実施態様において、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）であり、好ましくは抗ＣＤ７３抗体の重鎖アミノ酸配列は配列番号２３に示される通りであり、及び軽鎖アミノ酸配列は配列番号２４に示される通りである。
【0034】
本開示のいくつかの例において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆａｂ／ｃ、ＣＤＲ断片、単鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は二重特異性抗体から選択される。
【0035】
本開示の別の態様は、抗体と結合部分とを含む、コロナウイルスによって引き起こされる感染を治療及び／又は予防するための結合体に関し、ここで、本開示の任意の項目において、抗体は、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片であり、結合部分は、精製タグ（例えばＨｉｓタグ）、検出可能な標識物、又は小分子薬であり；好ましくは結合部分は、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、着色物質、ポリエチレングリコール、又は酵素であり；好ましくは小分子薬は小分子細胞傷害性薬であり；より好ましくは小分子薬は腫瘍化学療法薬であり、より好ましくは抗体又はその抗原結合断片は、リンカーによって小分子薬に連結されており；例えばリンカーは、ヒドラゾン結合、ジスルフィド結合、又はペプチド結合であり；より好ましくは抗体又はその抗原結合断片は、特定のモル比で小分子薬に連結され；例えばモル比は１：（２～４）である。
【0036】
本開示のさらに別の態様は、コロナウイルスによって引き起こされる感染症を治療及び予防するための融合タンパク質又は多重特異性抗体（好ましくは二重特異性抗体）に関し、前記融合タンパク質又は多重特異性抗体は、本開示の任意の項目において抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片を含む。
【0037】
本開示のさらに別の態様は、コロナウイルスによって引き起こされる感染症を治療及び予防するためのキットに関し、前記キットは、有効用量（例えば０．００１ｍｇ～１，０００ｍｇ）の本開示の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合断片、本開示の結合体、融合タンパク質、又は多重特異性抗体を含み、及び任意選択的に１つ又は複数の抗ウイルス薬の有効用量（例えば１００～２，４００ｍｇ）をさらに含む。
【0038】
本開示のさらに別の態様は、コロナウイルスによって引き起こされる感染症を治療及び予防するためのキットに関し、前記キットは、本開示の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合断片、本開示の結合体、融合タンパク質、又は多重特異性抗体を含み、及びウイルス、細菌、真菌、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ、寄生虫、プリオン、又は腫瘍から選択されるワクチンとして使用される抗原を含む。
【0039】
本開示のさらに別の態様は、コロナウイルスによって引き起こされる感染症を治療及び予防するための医薬組成物に関し、前記医薬組成物は、本開示の任意の項目の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片、及び本開示の結合体、融合タンパク質、又は多重特異性抗体を含み、任意選択的に、前記医薬組成物はさらに、医薬的に許容し得るベクター及び／又は賦形剤を含む。好ましくは医薬組成物は、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射、又は病巣内注射による投与に適した形態である。
【0040】
本開示のさらに別の態様は、好ましくは、新規コロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及び／又はＭＥＲＳ－ＣｏＶから選択される、コロナウイルス感染を治療及び／又は予防するための薬物又はキットの調製における、コロナウイルスによって引き起こされる感染症を治療及び予防するための抗体又はその抗原結合断片、結合体、又は融合タンパク質、又は多重特異性抗体の使用目的に関する。
【0041】
本開示のさらに別の態様は、有効用量の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合断片、結合体、又は融合タンパク質、又は多重特異性抗体を被験体又は患者に投与することを含む、コロナウイルス感染症を治療及び／又は予防する方法に関し、好ましくはコロナウイルス科ウイルスは、新規コロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及び／又はＭＥＲＳ－ＣｏＶから選択される。いくつかの実施態様において、前記方法は、被験体又は患者に抗ウイルス薬（ファビピラビルなど）を同時又は連続的に投与することを含み、好ましくは抗ウイルス薬はＲＮＡウイルス阻害剤である。
【0042】
いくつかの実施態様において、本開示の抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合断片、抗体－薬物結合体、又は二重特異性抗体の有効用量は、０．００１ｍｇ～１，０００ｍｇ、より好ましくは０．００１ｍｇ～９００ｍｇ、０．００１ｍｇ～８００ｍｇ、０．００１ｍｇ～７００ｍｇ、０．００１ｍｇ～６００ｍｇ、０．００１ｍｇ～５００ｍｇ、０．００１ｍｇ～４００ｍｇ、０．００１ｍｇ～３００ｍｇ、０．００１ｍｇ～２００ｍｇ、又は０．００１ｍｇ～１００ｍｇ、最も好ましくは１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、又は１，０００ｍｇであり、又は有効用量は、被験体又は患者の体重に基づいて０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１～９０ｍｇ／ｋｇ、１～８０ｍｇ／ｋｇ、１～７０ｍｇ／ｋｇ、１～６０ｍｇ／ｋｇ、１～５０ｍｇ／ｋｇ、１～４０ｍｇ／ｋｇ、１～３０ｍｇ／ｋｇ、１～２０ｍｇ／ｋｇ、又は１～１０ｍｇ／ｋｇである。
【0043】
本開示の上記実施態様のいずれかにおいて、１つ又は複数の抗ウイルス薬（例えばファビピラビル）の有効用量は、１００～２，４００ｍｇ、好ましくは１００ｍｇ～２，３００ｍｇ、１００ｍｇ～２，２００ｍｇ、１００ｍｇ～２，１００ｍｇ、１００ｍｇ～２，０００ｍｇ、１００ｍｇ～１，９００ｍｇ、１００ｍｇ～１，８００ｍｇ、１００ｍｇ～１，７００ｍｇ、１００ｍｇ～１，６００ｍｇ、１００ｍｇ～１，８００ｍｇ、１００ｍｇ～１，８００ｍｇ、１００ｍｇ～１，８００ｍｇ、１００ｍｇ～１８００ｍｇ、又は１００ｍｇ～１８００ｍｇ、より好ましくは１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、又は１０００ｍｇである。あるいは、本開示の上記の実施態様のいずれかにおいて、抗ウイルス薬の有効用量は、被験体又は患者の体重に基づいて０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１～９０ｍｇ／ｋｇ、１～８０ｍｇ／ｋｇ、１～７０ｍｇ／ｋｇ、１～６０ｍｇ／ｋｇ、１～５０ｍｇ／ｋｇ、１～４０ｍｇ／ｋｇ、１～３０ｍｇ／ｋｇ、１～２０ｍｇ／ｋｇ、又は１～１０ｍｇ／ｋｇである。本開示の別の態様は、０．００１ｍｇ～１，０００ｍｇの本開示の抗体又はその抗原結合断片、好ましくは０．００１ｍｇ～９００ｍｇ、０．００１ｍｇ～８００ｍｇ、０．００１ｍｇ～７００ｍｇ、０．００１ｍｇ～６００ｍｇ、０．００１ｍｇ～５００ｍｇ、０．００１ｍｇ～４００ｍｇ、０．００１ｍｇ～３００ｍｇ、０．００１ｍｇ～２００ｍｇ、又は０．００１ｍｇ～１００ｍｇ、より好ましくは１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、又は１，０００ｍｇの本開示の抗体又はその抗原結合断片を含有する単回薬物投与単位に関する。
【0044】
本開示のさらに別の態様は、２０１８年６月２１日に中国の武漢にある中国タイプカルチャーコレクションセンター（China Center for Type Culture Collection：ＣＣＴＣＣ）で保存番号ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｃ２０１８１３７で保存されたハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４に関する。
【0045】
本開示の別の態様はまた、抗原に対する生物の免疫応答を増強するための補助剤として使用される、本開示の抗ＣＤ７３抗体、又は抗原結合断片、結合体、又は融合タンパク質、又は多重特異性抗体に関する。いくつかの実施態様において、抗原は、ウイルス、細菌、真菌、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ、寄生虫、プリオン、又は腫瘍に由来し；
好ましくはウイルスは、ＲＮＡウイルス及びＤＮＡウイルスを含み；
好ましくはＲＮＡウイルスは、コロナウイルス科ウイルスを含み；
好ましくはコロナウイルスは、２０１９年の新規コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９を誘発する２０１９－ｎＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（これらは重症の急性呼吸器症候群を誘発する）、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ（これは中東呼吸器症候群を誘発する）を含む。
好ましくはウイルスは、ＲＮＡウイルス及びＤＮＡウイルスを含み；
好ましくはＲＮＡウイルスは、コロナウイルス科ウイルスを含み；
好ましくはコロナウイルスは、２０１９年の新規コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９を誘発する２０１９－ｎＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（これらは重症の急性呼吸器症候群を誘発する）、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ（これは中東呼吸器症候群を誘発する）を含む。
【0046】
本発明の別の態様は、ワクチン接種の前又は後に、本開示の抗ＣＤ７３抗体、又は抗原結合断片、結合体、融合タンパク質、又は多重特異性抗体を被験体に投与することを含む、ワクチンの有効性を高める方法又はワクチンに対する生物の応答性を増強する方法に関し、好ましくはワクチンに含まれる抗原は、ウイルス、細菌、真菌、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ、寄生虫、プリオン、又は腫瘍に由来し；
好ましくはウイルスは、ＲＮＡウイルス及びＤＮＡウイルスを含み；
好ましくはＲＮＡウイルスは、コロナウイルスを含み；
好ましくはコロナウイルスは、２０１９年の新規コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９を誘発する２０１９－ｎＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（これらは重症の急性呼吸器症候群を誘発する）、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ（これは中東呼吸器症候群を誘発する）を含む。
好ましくはウイルスは、ＲＮＡウイルス及びＤＮＡウイルスを含み；
好ましくはＲＮＡウイルスは、コロナウイルスを含み；
好ましくはコロナウイルスは、２０１９年の新規コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９を誘発する２０１９－ｎＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（これらは重症の急性呼吸器症候群を誘発する）、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ（これは中東呼吸器症候群を誘発する）を含む。
【0047】
いくつかの実施態様において、抗ＣＤ７３抗体若しくはその抗原結合断片、結合体、融合タンパク質、又は多重特異性抗体は、（好ましくは静脈内に）１回又は複数回投与される。
【0048】
本開示において、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、特に明記しない限り、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学の実験操作手順はすべて、それぞれの技術分野で広く使用されている日常的な工程である。同時に、本開示をよりよく理解するために、関連する用語の定義及び説明を以下に提供する。
【0049】
ＥＣ５０という用語は、最大効果の５０％のための濃度を指し、これは、最大効果の５０％を誘発することができる濃度を指す。
【0050】
本明細書で使用される用語「抗体」は、典型的には２対のポリペプチド鎖（各対は「軽」（Ｌ）鎖及び「重」（Ｈ）鎖を有する）からなる免疫グロブリン分子を指す。抗体軽鎖は、κ軽鎖及びλ軽鎖として分類され得る。重鎖はμ、δ、γ、α、又はεとして分類され、抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして定義される。軽鎖及び重鎖内で、可変領域と定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はさらに、約３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。ＣＨは３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＣＬは、１つのドメインＣＬで構成される。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。ＶＨ及びＶＬ領域はまた、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が散在する超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序である：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４であり、アミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）がそれぞれ抗原結合部位を形成する。各領域又はドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda M.d. (1987 and 1991)、又はChothia & Lesk J. Mol. Biol. 1987; 196: 901 - 917; Chothia et al. Nature 1989; 342: 878 - 883、又はEhrenmann, Francois, Quentin Kaas, and Marie-Paule Lefranc. “IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF.” Nucleic acids research 2009; 38(suppl_1): D301 - D307に従う。「抗体」という用語は、特定の抗体産生方法によって限定されない。例えばこれは特に、組換え抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含む。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体であり得る。
【0051】
本明細書で使用される用語「ｍＡｂ」及び「モノクローナル抗体」は、相同性の高い抗体分子の群からの抗体又は抗体の断片を指し、また、自発的に発生する自然変異を除いて同一である抗体分子の群を指す。ｍＡｂは、抗原上の単一のエピトープに対して非常に特異的である。ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と比較して、通常、抗原上の異なるエピトープを典型的に認識する少なくとも２つ以上の異なる抗体を含む。モノクローナル抗体は通常、Kohler et al. (Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity [J]. nature, 1975; 256 (5517): 495)によって最初に報告されたハイブリドーマ技術を使用して得られるが、組換えＤＮＡ技術（米国特許第４，８１６，５６７号参照）を使用して得ることもできる。
【0052】
本明細書で使用される用語「ヒト化抗体」は、ヒト免疫グロブリン（リセプター抗体）のＣＤＲの全部又は一部が非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲで置換された後に得られる抗体又は抗体断片を指し、ここで、ドナー抗体は、予想される特異性、親和性、又は反応性を有する非ヒト（例えばマウス、ラット、又はウサギ）抗体でもよい。さらに、リセプター抗体のＦＲのいくつかのアミノ酸残基はまた、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基、又は他の抗体のアミノ酸残基で置換されて、その抗体の性能をさらに改良又は最適化することもできる。ヒト化抗体のさらなる詳細については、例えばJones et al., Nature 1986; 321: 522 - 525; Reichmann et al., Nature 1988; 332: 323 - 329; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992; 2: 593 - 596; 及び Clark M. Antibody humanization: a case of the ‘Emperor's new clothes'?[J]. Immunol. Today, 2000; 21 (8): 397 - 402を参照されたい。
【0053】
本明細書で使用される用語「分離された」又は「単離された」は、自然な状態で用手法的に得られることを指す。「別個の」物質又は成分が自然界に存在する場合、それが存在する自然環境が変化したか、又はその物質が自然環境から単離されたか、又はその両方である。例えば特定の単離されていないポリヌクレオチド又はポリペプチドは生きている動物に自然に存在し、そのような自然状態から分離された高純度の同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、分離されたと言われる。「分離された」又は「単離された」という用語は、人工又は合成材料と混合された物質を除外するものではなく、物質の活性に影響を与えない他の不純な物質の存在を除外するものでもない。
【0054】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドが挿入され得る核酸ビヒクルを指す。挿入されたポリヌクレオチドにコードされたタンパク質の発現を可能にするベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入、又はトランスフェクションによって宿主細胞に導入することができ、その結果、それによって運ばれる遺伝物質要素が宿主細胞で発現される。ベクターは当業者に周知されており、特に限定されるものではないが、以下のものを含む：プラスミド；バクテリオファージ；コスミド；人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）；バクテリオファージの例は、λバクテリオファージ又はＭ１３バクテリオファージ及び動物ウイルスなどである。ベクターとして使用できる動物ウイルスには、特に限定されるものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポバビリセテス（例えばＳＶ４０）が含まれる。ベクターは、特に限定されるものではないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素、及びレポーター遺伝子を含む、発現を制御する様々な要素を含み得る。さらに、ベクターは複製開始点をむ得る。
【0055】
本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、ベクターを導入するために使用できる細胞を指し、特に限定されるものではないが、原核細胞、例えば大腸菌又は枯草菌；真菌細胞、例えば酵母細胞又はコウジカビ属；昆虫細胞、例えばＳ２ショウジョウバエ細胞又はＳｆ９；又は動物細胞、例えば線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＧＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞；又はヒト細胞を含む。
【0056】
「特異的結合」という用語は、２つの分子間の非ランダム結合反応、例えば抗体とそれに対する抗原との間の反応などを指す。特定の実施態様において、抗原に特異的に結合する抗体（又は抗原に特異的な抗体）は、例えば約１０－５Ｍ未満、例えば約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ以下の親和性（ＫＤ）で抗原に結合する抗体を指す。
【0057】
本明細書で使用される用語「ＫＤ」は、抗体と抗原との間の結合親和性を説明するために使用される特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。解離平衡定数が小さいほど、抗体と抗原の結合が強くなり、抗体と抗原の間の親和性が高くなります。典型的には、抗体は、約１０－５Ｍ未満、例えば約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ以下の解離平衡定数（ＫＤ）で抗原（例えばＰＤ－１タンパク質）に結合する。ＫＤは、当業者によく知られている方法を使用して、例えばFortebio分子相互作用装置を使用して決定することができる。
【0058】
本明細書で使用される「ｍＡｂ」及び「モノクローナル抗体」という用語は、同じ意味を有し、交換可能に使用され得る。「ポリクローナル抗体」と「ｐＡｂ」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用できる。「ポリペプチド」と「タンパク質」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用することができる。また本開示では、アミノ酸は、典型的には当技術分野で周知の１文字及び３文字の略語で表される。例えばアラニンは、Ａ又はＡｌａで表すことができる。
【0059】
本明細書で使用される用語「医薬的に許容し得るベクター及び／又は賦形剤」は、被験体及び活性成分と薬理学的及び／又は生理学的に適合することが当技術分野で周知のベクター及び／又は賦形剤（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照）を指し、特に限定されるものではないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、補助剤、及びイオン強度増強剤を含む。例えばｐＨ調整剤には、特に限定されるものではないが、リン酸緩衝生理食塩水が含まれ；界面活性剤には、特に限定されるものではないが、カチオン性、アニオン性、又は非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）－８０が含まれる；イオン強度増強剤には、特に限定されるものではないが、塩化ナトリウムが含まれる。
【0060】
本開示において用語「単一薬物投与単位」は、投与レジメンの時点で被験体又は患者に１アンプル単位などで投与される、本開示の抗体若しくはその抗原結合断片、抗体－薬物結合体、又は二重特異性抗体（又はそれを含む医薬組成物）の単一薬物投与形態を意味する。本明細書で使用される用語「有効用量」は、所望の効果を得るのに又は少なくとも部分的に得るのに十分な用量を指す。例えば疾患（例えばコロナウイルス科のウイルス、好ましくはＣＯＶＩＤ－１９によって引き起こされる疾患）を予防するための有効用量は、疾患の発生を予防、停止、又は遅らせるのに十分な量を指し、疾患を治療するための有効用量は、すでに疾患を有する患者の疾患及びその合併症を治癒又は少なくとも部分的に止めるのに十分な用量を指す。
【0061】
本発明の有益な効果：
本開示のモノクローナル抗体は、良好な特異性でＣＤ７３に結合することができ、非常に効果的に、非基質競合的にＣＤ７３の酵素活性を阻害し、細胞表面でＣＤ７３のエンドサイトーシスを誘導することができ、こうして、アデノシンの産生を低下させ；また、アデノシンに依存しない方法でＢ細胞の活性化と増殖を刺激することもできる。
本開示のモノクローナル抗体は、良好な特異性でＣＤ７３に結合することができ、非常に効果的に、非基質競合的にＣＤ７３の酵素活性を阻害し、細胞表面でＣＤ７３のエンドサイトーシスを誘導することができ、こうして、アデノシンの産生を低下させ；また、アデノシンに依存しない方法でＢ細胞の活性化と増殖を刺激することもできる。
【図面の簡単な説明】
【0062】
【図1】１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３によって誘導されたＢ細胞ＣＤ６９のＭＦＩ値。
【0063】
【図2】１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３によって誘導されたＢ細胞ＣＤ８３のＭＦＩ値。
【0064】
【図3】抗ＣＤ７３抗体を添加されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の酵素活性の検出結果。
【0065】
【図4】抗ＣＤ７３抗体を添加されたＵ８７－ＭＧ細胞の酵素活性の検出結果。
【0066】
【0067】
【0068】
【図7】ＣＯＶＩＤ－１９Ｓタンパク質に対する抗体産生の誘導における、抗ＣＤ７３抗体の有効性の検出結果。
【0069】
【図8】ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ１９＋Ｂ細胞に対する抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の結合活性の、ＦＡＣＳによる検出結果。
【0070】
【図9】ヒトＰＢＭＣ膜により発現されたＣＤ７３の酵素活性の阻害の、抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）による検出結果。
【0071】
【図10】抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）によるＢ細胞活性の効果的な誘導の、ＦＡＣＳによる検出結果。
【0072】
【図11】抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）によるＢ細胞増殖の刺激の検出結果。
【発明を実施するための形態】
【0073】
具体的な実施態様
実施態様に関連して、本開示の例が以下で詳細に説明される。以下の実施例が例示のみを目的としており、本開示の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを、当業者は理解しているであろう。実施例に特定の技術又は条件が記載されていない場合、それらは当該技術分野の文献に記載されている技術又は条件に従って実施される（例えばJ. Sambrook et al. による Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 及び Huang Peitang et al.により翻訳された第３版, Science Pressを参照）か、又は製品の説明書に従っている。製造業者が特定されていない試薬や機器の従来品は、市場から購入することができる。例えばＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＵ８７－ＭＧ細胞は、ＡＴＣＣから購入できる。
実施態様に関連して、本開示の例が以下で詳細に説明される。以下の実施例が例示のみを目的としており、本開示の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを、当業者は理解しているであろう。実施例に特定の技術又は条件が記載されていない場合、それらは当該技術分野の文献に記載されている技術又は条件に従って実施される（例えばJ. Sambrook et al. による Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 及び Huang Peitang et al.により翻訳された第３版, Science Pressを参照）か、又は製品の説明書に従っている。製造業者が特定されていない試薬や機器の従来品は、市場から購入することができる。例えばＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＵ８７－ＭＧ細胞は、ＡＴＣＣから購入できる。
【0074】
本開示の以下の実施例において、使用されたＢＡＬＢ／ｃマウスは、広東医学研究所動物センター（Guangdong Medical Laboratory Animal Center）から購入された。
【0075】
以下の本開示の実施例において、陽性対照抗体ＭＥＤＩ９４４７（Oleclumab）は、Akeso Biopharma Co., Ltd.製のものを使用し、その配列は、Medlmmune LimitedによりＷＨＯ薬物情報データベース及び関連特許（https://www.who.int/medicines/publications/druginformation/innlists/en/）に開示されたOleclumabアミノ酸配列を用いて構築・合成したものであり、実施例ではＭＥＤＩ９４４７又はＭＥＤＩ９４４７（Akeso）又はＭＥＤＩ－９４４７（Ａｋｅｓｏ）とラベル付けされている。
【0076】
本開示の以下の実施例において、使用された対照抗体ＣＰＩ－００６は、医薬品の一般名がムパドリマブ（Mupadolimab）であり、Akeso Biopharma Co., Ltd.によって製造され、その配列はＷＨＯにおける配列（ＷＨＯ薬物情報，提唱された国際一般名（Proposed INN）（List 125. 2021, 35(2): 484 - 485）に一致している。ＣＰＩ－００６（ムパドリマブ）の重鎖アミノ酸配列は配列番号２１の通りであり、ＣＰＩ－００６の軽鎖アミノ酸配列は配列番号２２の通りである。
【0077】
本開示の以下の実施例において、使用されたアイソタイプ対照抗体、ヒト抗鶏卵リゾチームＩｇＧ（すなわち、抗ＨＥＬ抗体、又はｈＩｇＧと略されるヒトＩｇＧ、又はアイソタイプ対照）の配列は、Acierno et al.（Acierno et al. J Mol Biol. 2007; 374 (1): 130 - 146）によって発表された「親和性成熟は抗タンパク質抗体のＦｖドメインの安定性及び可塑性を増加させる」中のＦａｂ Ｆ１０．６．６配列の可変領域配列由来であった。実施例で使用したｈＩｇＧ１ＤＭは、ｈＧ１ＤＭ定常領域配列を有する抗ＨＥＬアイソタイプ対照抗体であり、Akeso Biopharma Co., Ltd.の研究室で調製された。
【0078】
本開示の以下の実施例において、使用された正常ヒト末梢血はZhongshan血液銀行からのものであり、ヒト末梢血細胞は、提供者からインフォームドコンセントを得て、Akeso Biopharma Co., Ltd.によって単離及び調製された。
【0079】
本開示の以下の実施例において、使用されたＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３抗体は、Biolegend（カタログ番号３４４８０４）から得た。使用されたＰＥ標識抗ヒトＣＤ１９抗体は、Ｂiolegend（カタログ番号３０２２５４）から得た。使用されたＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ６９抗体は、Biolegend（カタログ番号３１０９１０）から得た。使用したＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ８３抗体は、Biolegend（カタログ番号３０５３１２）から得た。使用されたアクリジンオレンジ染色液は、Thermofisher（カタログ番号９３００１）から得た。使用されたヨウ化プロピジウム染色液はBD（カタログ番号５１－６６２１１Ｅ）から得た。使用されたＡＰＣ標識マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体は、Biolegend（カタログ番号４００１２２）から得た。使用されたマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体は、Thermofisher（カタログ番号１０４００Ｃ）から得た。使用されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）はSigma（カタログ番号Ｖ９００９３３－１ＫＧ）から得た。使用されたＲＰＭＩ１６４０はGibco（カタログ番号は２２４００－０８９）から得た。使用されたウシ胎児血清は、Excell bio（カタログ番号ＦＳＰ５００）から得た。使用されたピルビン酸ナトリウムは、Gibco（カタログ番号１１３６０－０７０）から得た。使用された非必須アミノ酸は、Gibco（カタログ番号１１１４０－０５０）から得た。使用されたＬ－グルタミンはGibco（カタログ番号２５０３０－０８１）から得た。使用されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１はＡＴＣＣ（カタログ番号ＨＴＢ－２６）から得た。使用されたＵ８７－ＭＧはＡＴＣＣ（カタログ番号ＨＴＢ－１４）から得た。使用されたＣＴＧ色原体溶液は、promega（カタログ番号Ｇ８４６１）からのCellTiter-Glo（登録商標）One Solution Assayキットであった。使用されたAlexa Fluor（登録商標）６４７標識マウス抗ヒトＩｇＧ二次抗体は、Southern Biotech（カタログ番号９０４０－３１）から得た。
【実施例】
【0080】
実施例１：抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３の調製
１．ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４の調製
抗ＣＤ７３抗体の調製に使用した抗原は、ヒトＮＴ５Ｅ－Ｈｉｓ（ＮＴ５ＥはGenbank ＩＤ：ＮＰ＿００２５１７．１、位置：１－５５２）であった。免疫したマウスの脾細胞をマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製した。ヒトＮＴ５Ｅ（ＮＴ５ＥはGenbank ＩＤ：ＮＰ＿００２５１７．１、位置：１－５５２）－ビオチンを抗原とし、間接ＥＬＩＳＡ法によりハイブリドーマをスクリーニングして、ＣＤ７３に特異的に結合する抗体を分泌することができるハイブリドーマを得た。スクリーニングされたハイブリドーマに対して希釈クローニングを行うことにより、安定したハイブリドーマ株が得られた。上記のハイブリドーマ株はそれぞれハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４と命名され、分泌されたモノクローナル抗体はそれぞれ１９Ｆ３と命名される。
１．ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４の調製
抗ＣＤ７３抗体の調製に使用した抗原は、ヒトＮＴ５Ｅ－Ｈｉｓ（ＮＴ５ＥはGenbank ＩＤ：ＮＰ＿００２５１７．１、位置：１－５５２）であった。免疫したマウスの脾細胞をマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製した。ヒトＮＴ５Ｅ（ＮＴ５ＥはGenbank ＩＤ：ＮＰ＿００２５１７．１、位置：１－５５２）－ビオチンを抗原とし、間接ＥＬＩＳＡ法によりハイブリドーマをスクリーニングして、ＣＤ７３に特異的に結合する抗体を分泌することができるハイブリドーマを得た。スクリーニングされたハイブリドーマに対して希釈クローニングを行うことにより、安定したハイブリドーマ株が得られた。上記のハイブリドーマ株はそれぞれハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４と命名され、分泌されたモノクローナル抗体はそれぞれ１９Ｆ３と命名される。
【0081】
ハイブリドーマ株ＬＴ０１４（ＣＤ７３－１９Ｆ３としても知られている）は、２０１８年６月２１日にＣＣＴＣＣに保存番号ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｃ２０１８１３７でで保存され、保存先は、中国、武漢、武漢大学（Wuhan University）、郵便番号４３００７２である。
【0082】
２．抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３の調製
上記で調製したＬＴ０１４細胞株をＣＤ培地（化学合成培地）（１％ペニシリンを含有するＣＤ培地、セルインキュベーター中５％ＣＯ２、３７℃で培養）を用いて、それぞれ培養した。７日後、細胞培養上清を採取し、高速で遠心分離し、微多孔膜で真空濾過し、ＨｉＴｒａｐプロテインＡ ＨＰカラムを用いて精製し、抗体１９Ｆ３をそれぞれ調製した。
上記で調製したＬＴ０１４細胞株をＣＤ培地（化学合成培地）（１％ペニシリンを含有するＣＤ培地、セルインキュベーター中５％ＣＯ２、３７℃で培養）を用いて、それぞれ培養した。７日後、細胞培養上清を採取し、高速で遠心分離し、微多孔膜で真空濾過し、ＨｉＴｒａｐプロテインＡ ＨＰカラムを用いて精製し、抗体１９Ｆ３をそれぞれ調製した。
【0083】
実施例２：抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３の配列解析
ｍＲＮＡは、実施例１で培養したＬＴ０１４細胞株から、培養細胞／細菌用総ＲＮＡ抽出キット（Tiangen、カタログ番号ＤＰ４３０）の方法に従って抽出した。
ｃＤＮＡは、ＲＴ－ＰＣＲキットのInvitrogen SuperScript（登録商標）III First-Strand Synthesis Systemの説明書に従って合成し、ＰＣＲ増幅を行った。
ｍＲＮＡは、実施例１で培養したＬＴ０１４細胞株から、培養細胞／細菌用総ＲＮＡ抽出キット（Tiangen、カタログ番号ＤＰ４３０）の方法に従って抽出した。
ｃＤＮＡは、ＲＴ－ＰＣＲキットのInvitrogen SuperScript（登録商標）III First-Strand Synthesis Systemの説明書に従って合成し、ＰＣＲ増幅を行った。
【0084】
ＴＡクローニングは、ＰＣＲ増幅産物に対して直接実施した。具体的な手順については、pEASY-T1 Cloning Kit（Transgen CT101）の説明書を参照されたい。
ＴＡクローニング産物は直接配列決定され、配列決定結果は以下の通りである：
ＶＨの核酸配列は配列番号１に示される通りで、長さは３６３ｂｐであった。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号２に示される通りで、長さは１２１ａａであった；
ここで、重鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１５に示される通りであり、重鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１６に示される通りであり、及び重鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号１７に示される通りである．
ＴＡクローニング産物は直接配列決定され、配列決定結果は以下の通りである：
ＶＨの核酸配列は配列番号１に示される通りで、長さは３６３ｂｐであった。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号２に示される通りで、長さは１２１ａａであった；
ここで、重鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１５に示される通りであり、重鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１６に示される通りであり、及び重鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号１７に示される通りである．
【0085】
ＶＬの核酸配列は配列番号３に示される通りで、長さは３３９ｂｐであった。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号４に示される通りで、長さは１１３ａａであった；
ここで、軽鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１８に示される通りであり、軽鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１９に示される通りであり、及び軽鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号２０に示される通りである。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号４に示される通りで、長さは１１３ａａであった；
ここで、軽鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１８に示される通りであり、軽鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１９に示される通りであり、及び軽鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号２０に示される通りである。
【0086】
実施例３：ヒトＣＤ７３に対するヒト化抗体の軽鎖及び重鎖の設計と調製
１．ヒトＣＤ７３に対するヒト化抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２、及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３の軽鎖及び重鎖の設計
抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３の可変領域配列は、ヒトＣＤ７３タンパク質の三次元結晶構造（Hage T, Reinemer P, Sebald W. Crystals of a 1:1 complex between human interleukin-4 and the extracellular domain of its receptor alpha chain. Eur J Biochem. 1998; 258 (2): 831 - 6）及び実施例２で得られた抗体１９Ｆ３の配列（抗体定常領域配列、ＮＣＢＩのデータベース、Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７はＣＨに使用された；Ｉｇκ鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４はＣＬに使用された）に従って、コンピューターシミュレートされたモデルにより設計された突然変異により得られた。
１．ヒトＣＤ７３に対するヒト化抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２、及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３の軽鎖及び重鎖の設計
抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３の可変領域配列は、ヒトＣＤ７３タンパク質の三次元結晶構造（Hage T, Reinemer P, Sebald W. Crystals of a 1:1 complex between human interleukin-4 and the extracellular domain of its receptor alpha chain. Eur J Biochem. 1998; 258 (2): 831 - 6）及び実施例２で得られた抗体１９Ｆ３の配列（抗体定常領域配列、ＮＣＢＩのデータベース、Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７はＣＨに使用された；Ｉｇκ鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４はＣＬに使用された）に従って、コンピューターシミュレートされたモデルにより設計された突然変異により得られた。
【0087】
設計された可変領域配列は以下の通りである：
（１）ヒト化モノクローナル抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１のＶＨ及びＶＬ配列
ＶＨの核酸配列は配列番号５に示される通りで、長さは３６３ｂｐであった。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号６に示される通りで、長さは１２１ａａであり、ここで、重鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１５に示される通りであり、重鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１６に示される通りであり、及び重鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号１７に示す通りである。
（１）ヒト化モノクローナル抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１のＶＨ及びＶＬ配列
ＶＨの核酸配列は配列番号５に示される通りで、長さは３６３ｂｐであった。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号６に示される通りで、長さは１２１ａａであり、ここで、重鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１５に示される通りであり、重鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１６に示される通りであり、及び重鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号１７に示す通りである。
【0088】
ＶＬの核酸配列は配列番号７に示される通りで、長さは３３９ｂｐであった。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号８に示される通りで、長さは１１３ａａであり、ここで、軽鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１８に示される通りであり、軽鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１９に示される通りであり、及び軽鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号２０に示す通りである。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号８に示される通りで、長さは１１３ａａであり、ここで、軽鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１８に示される通りであり、軽鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１９に示される通りであり、及び軽鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号２０に示す通りである。
【0089】
（２）ヒト化モノクローナル抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２のＶＨ及びＶＬ配列
ＶＨの核酸配列は配列番号９に示される通りで、長さは３６３ｂｐであった。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号１０に示される通りで、長さは１２１ａａであり、ここで、重鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１５に示される通りであり、重鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１６に示される通りであり、及び重鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号１７に示される通りである。
ＶＨの核酸配列は配列番号９に示される通りで、長さは３６３ｂｐであった。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号１０に示される通りで、長さは１２１ａａであり、ここで、重鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１５に示される通りであり、重鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１６に示される通りであり、及び重鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号１７に示される通りである。
【0090】
ＶＬの核酸配列は配列番号１１に示される通りで、長さは３３９ｂｐであった。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号１２に示される通りで、長さは１１３ａａであり、ここで、軽鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１８に示される通りであり、軽鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１９に示される通りであり、及び軽鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号２０に示される通りである。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号１２に示される通りで、長さは１１３ａａであり、ここで、軽鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１８に示される通りであり、軽鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１９に示される通りであり、及び軽鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号２０に示される通りである。
【0091】
（３）ヒト化モノクローナル抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３のＶＨ及びＶＬ配列
ＶＨの核酸配列は配列番号９に示される通りで、長さは３６３ｂｐであった。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号１０に示される通りで、長さは１２１ａａであり、ここで、重鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１５に示される通りであり、重鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１６に示される通りであり、及び重鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号１７に示される通りである。
ＶＨの核酸配列は配列番号９に示される通りで、長さは３６３ｂｐであった。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号１０に示される通りで、長さは１２１ａａであり、ここで、重鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１５に示される通りであり、重鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１６に示される通りであり、及び重鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号１７に示される通りである。
【0092】
ＶＬの核酸配列は配列番号１３に示される通りで、長さは３３９ｂｐであった。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号１４に示される通りで、長さは１１３ａａであり、ここで、軽鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１８に示される通りであり、軽鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１９に示される通りであり、及び軽鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号２０に示される通りである。
これによりコードされるアミノ酸配列は配列番号１４に示される通りで、長さは１１３ａａであり、ここで、軽鎖ＣＤＲ１の配列は配列番号１８に示される通りであり、軽鎖ＣＤＲ２の配列は配列番号１９に示される通りであり、及び軽鎖ＣＤＲ３の配列は配列番号２０に示される通りである。
【0093】
３．ヒト化抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２、及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３の調製
Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７）がＣＨに使用され、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４）がＣＬに使用された。
Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７）がＣＨに使用され、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４）がＣＬに使用された。
【0094】
１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡ、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡ、及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡを、それぞれｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（GenScriptにより提供された）ベクターにクローニングして、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｈ１、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｌ１、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｈ２、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｌ２、及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｌ３を得た。"Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第２版）"で紹介されている標準技術を参考に、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩを消化して、重鎖と軽鎖の全長遺伝子を合成し、制限酵素（ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ）の消化を介して、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングして、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ１、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ１、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ２、及びｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ３を得て、組換え発現プラスミドの重鎖／軽鎖遺伝子について配列決定分析を行った。続いて、対応する軽鎖及び重鎖組換えプラスミド設計を含む遺伝子の組み合わせ（ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ１／ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ１、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２／ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ２、及びｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２／ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ３）を、それぞれ２９３Ｆ細胞で同時トランスフェクトし、培養液を採取して精製した。配列決定の検証に合格した後、エンドトキシングレードの発現プラスミドを調製し、このプラスミドを抗体発現のためにＨＥＫ２９３細胞で一時的にトランスフェクトした。７日間培養した後、細胞培養液を採取し、プロテインＡカラムを用いてアフィニティー精製を行い、ヒト化抗体を得た。
【0095】
４．ヒト化抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の調製
Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４）が、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）抗体のＣＬに使用された（配列番号２２を参照）。
Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４）が、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）抗体のＣＬに使用された（配列番号２２を参照）。
【0096】
Ｉｇガンマ－１鎖Ｃ領域（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７）に基づいて、ＣＨの２３４位にロイシンからアラニンへの点突然変異（Ｌ２３４Ａ）を導入し、２３５位にロイシンからアラニンへの点突然変異（Ｌ２３５Ａ）を導入して、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）と名付けたヒト化抗体を得た。１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の全長重鎖アミノ酸配列については配列番号２３を参照し、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の全長軽鎖アミノ酸配列については配列番号２４を参照されたい。
【0097】
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の重鎖ｃＤＮＡ及び軽鎖ｃＤＮＡを、それぞれｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（GenScriptにより提供された）ベクターにクローニングして、それぞれｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１ＤＭ）及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｌ３を得た。「MolecularCloning:ALaboratoryManual（第２版）」で紹介されている標準技術を参考に、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩを消化して、重鎖と軽鎖の全長遺伝子に合成し、制限酵素（ＥｃｏＲＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩ）の消化を介して、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングして、発現プラスミｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１ＤＭ）及びｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ３を得て、組換え発現プラスミドの重鎖／軽鎖遺伝子について配列決定分析を行った。続いて、軽鎖及び重鎖組換えプラスミド設計を含む遺伝子の組み合わせ（ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１ＤＭ）／ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ３）を、それぞれ２９３Ｆ細胞で同時トランスフェクトし、培養液を採取して精製した。配列決定の検証に合格した後、エンドトキシングレードの発現プラスミドを調製し、このプラスミドを抗体発現のためにＨＥＫ２９３細胞で一時的にトランスフェクトした。７日間培養した後、細胞培養液を採取し、プロテインＡカラムを用いてアフィニティー精製を行い、ヒト化抗体を得た。
【0098】
実施例４：抗ＣＤ７３抗体によるＢ細胞活性化の効果的な誘導
ＣＤ６９はＣ型膜貫通糖タンパク質であり、活性化されたＴ、Ｂ、ＮＫ、及びその他のリンパ球の表面に発現されることが多く、通常はリンパ球の早期活性化のマーカーとして使用される。ＣＤ８３は、成熟ＤＣで広く発現されるもう１つの早期活性化マーカーであり、Ｂリンパ球などの活性化免疫細胞でも発現される。ＣＤ８３は、細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ及びＣＤ８６分子の分解を防ぐことができ、免疫調節に関与する。Ｂ細胞は活性化されると、抗体やサイトカインを分泌する記憶Ｂ細胞や形質細胞になり、ウイルスなどの外因性微生物による感染に対する免疫応答に関与する。
ＣＤ６９はＣ型膜貫通糖タンパク質であり、活性化されたＴ、Ｂ、ＮＫ、及びその他のリンパ球の表面に発現されることが多く、通常はリンパ球の早期活性化のマーカーとして使用される。ＣＤ８３は、成熟ＤＣで広く発現されるもう１つの早期活性化マーカーであり、Ｂリンパ球などの活性化免疫細胞でも発現される。ＣＤ８３は、細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ及びＣＤ８６分子の分解を防ぐことができ、免疫調節に関与する。Ｂ細胞は活性化されると、抗体やサイトカインを分泌する記憶Ｂ細胞や形質細胞になり、ウイルスなどの外因性微生物による感染に対する免疫応答に関与する。
【0099】
この試験では、ＣＤ６９とＣＤ８３がＢ細胞活性化の分子マーカーとして使用され、ＣＤ６９及びＣＤ８３のＭＦＩ値と陽性率はＢ細胞活性化活性に正比例していた。
【0100】
実験工程：Ficoll-PaqueTM Plusキットの単離培地の説明書に従って、健康なヒト末梢血ＰＢＭＣを単離し、単離したＰＢＭＣを後で使用するために凍結保存した。実験当日、ＰＢＭＣはいつも通り蘇生し、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ピルビン酸ナトリウム＋１％非必須アミノ酸＋１％Ｌ－グルタミン）に再懸濁し、２４０×１０４細胞／５００μＬ／ウェルで１２ウェルプレートに接種し、対応する抗体濃度の溶液５００μＬを、１群あたり２重ウェルで加え、ウェルを一晩培養した。翌日、ウェル内の細胞をピペッティングにより分散させ、各群を５ウェルに分け、７５０×ｇで５分間遠心分離し、細胞を採取し、１００μＬのマウスＩｇＧアイソタイプ対照抗体（最終濃度５μｇ／ｍＬ）を各ウェルに加え、氷上で２０分間インキュベートし、７５０×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、以下の二次抗体１００μＬを各群の対応する各ウェルにそれぞれ添加し［ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３抗体（５０倍希釈）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ１９抗体（５０倍希釈）ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ６９抗体（１００倍希釈）、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ８３抗体（５０倍希釈）、ＡＰＣ標識マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（１００倍希釈）］、氷上でインキュベートし、４０分間遮光し、１％ＰＢＳＡ（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）１００μＬを各ウェルに加え、７５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を２００μＬ／チューブの１％ＰＢＳＡで再懸濁し、沈殿させ、フローチューブに移し、検出のためにフローサイトメーター（FACS Calibur）にロードした。
【0101】
フローイングソフトウェアを使用してフローヒストグラムと散布図をプロットし、ＣＤ３－ＣＤ１９＋細胞サブセットのＣＤ６９とＣＤ８３によって表されるＭＦＩ値を分析した。Graphpad prismソフトウェアを使用して、対応するＭＦＩ値に従って平均±標準偏差ＳＤをプロットし、一元配置分散分析を実行した。Ｐ＜０．０５は差が有意であることを示し、Ｐ＜０．０１は差が非常に有意であることを示した。
【0102】
その結果は図１及び２に示される。１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３処理群のＣＤ６９及びＣＤ８３のＭＦＩ値は、アイソタイプ対照の値よりも有意に高く、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３がＢ細胞の活性化を誘導し、ＣＤ６９及びＣＤ８３の発現をアップレギュレートすることができ、その活性が、臨床研究下で同一標的対照抗体ＭＥＤＩ９４４７よりも優れていることを示している。しかし、ＣＤ７３酵素活性阻害剤ＡＰＣＰ（Sigma、カタログ番号Ｍ３７６３－１０ＭＧ）は、Ｂ細胞表面のＣＤ６９及びＣＤ８３の発現に影響を与えなかったことから、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３が、ＣＤ７３酵素活性阻害とは異なるシグナル伝達経路を介してＢ細胞の活性化を誘導できることを示している。
【0103】
この試験の検出結果は、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３がＢ細胞（ＣＤ３－ＣＤ１９＋）の表面上のＣＤ６９及びＣＤ８３の発現を有意にアップレギュレートできることを示しており、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３がＢ細胞の活性化を誘導する生物学的活性を有することを示しており、この活性は、臨床研究下で同一標的対照抗体ＭＥＤＩ９４４７よりも有意に優れていることを示している。同時に、検出結果は、ＣＤ７３酵素活性阻害剤ＡＰＣＰが、Ｂ細胞の表面上のＣＤ６９及びＣＤ８３の発現に影響を与えなかったことを示し、これは、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３がＣＤ７３酵素活性阻害とは異なるシグナル伝達経路を介してＢ細胞の活性化を誘導し、それによってウイルス抗原に対する免疫応答を促進できることを示している。抗体１９Ｆ３、抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、及び抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２は同様の結果を達成した。
【0104】
実施例５：抗ＣＤ７３抗体による内因的に発現されたＣＤ７３の酵素活性の阻害の検出
１．抗ＣＤ７３抗体によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で内因的に発現されたＣＤ７３の酵素活性の阻害活性の検出
実験工程は以下の通りである。良好な状態の対数期ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を採取し、無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁して計数した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を９６ウェルプレートに３×１０４細胞／１００μＬ／ウェルで接種した。抗体は無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地で希釈し、初期濃度２００μｇ／ｍＬで２．５倍勾配希釈を行った。抗体を９６ウェルプレートに５０ｕＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、ＲＰＭＩ－１６４０で希釈した５０μＬの６００μＭ ＡＭＰを各ウェルに加えた。３時間後に２５μＬの細胞培養上清を採取し、新しい９６ウェルプレートに移し、２５μＬの１００μＭ ＡＴＰを各ウェルに添加した。５０ｕＬのＣＴＧ（CellTiter-Glo（登録商標）One Solution Assay、promega、Ｃａｔ：Ｇ８４６１）色素原溶液を使用して発色させ、マルチラベルマイクロプレート検出器（PerkinElmer ２１４０－００２０）でデータを読み取った。
１．抗ＣＤ７３抗体によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で内因的に発現されたＣＤ７３の酵素活性の阻害活性の検出
実験工程は以下の通りである。良好な状態の対数期ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を採取し、無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁して計数した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を９６ウェルプレートに３×１０４細胞／１００μＬ／ウェルで接種した。抗体は無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地で希釈し、初期濃度２００μｇ／ｍＬで２．５倍勾配希釈を行った。抗体を９６ウェルプレートに５０ｕＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、ＲＰＭＩ－１６４０で希釈した５０μＬの６００μＭ ＡＭＰを各ウェルに加えた。３時間後に２５μＬの細胞培養上清を採取し、新しい９６ウェルプレートに移し、２５μＬの１００μＭ ＡＴＰを各ウェルに添加した。５０ｕＬのＣＴＧ（CellTiter-Glo（登録商標）One Solution Assay、promega、Ｃａｔ：Ｇ８４６１）色素原溶液を使用して発色させ、マルチラベルマイクロプレート検出器（PerkinElmer ２１４０－００２０）でデータを読み取った。
【0105】
実験結果：結果は図３に示される。１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３及び同一標的陽性対照薬ＭＥＤＩ９４４７の両方は、ＡＭＰをアデノシンに触媒するＭＤＡ－ＭＢ－２３１に内因的に発現されるＣＤ７３の酵素活性を用量依存的に阻害することができ、こうして、生成される平均蛍光強度（ＭＦＩ）ＲＬＵ（相対光単位）が用量依存的に低下した。
【0106】
上記の実験結果は、追加されたＡＭＰが、ＣＤ７３抗体処理がない場合、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の細胞表面に内因的に発現されるＣＤ７３の酵素触媒下でアデノシンに変換され、それによってルシフェラーゼ活性の阻害を緩和する可能性があることを示している。抗体の添加後、ＣＤ７３は抗体によって結合され、これがその酵素触媒活性を低下させ、ＡＭＰからアデノシンへの変換が妨げる。これは、抗ＣＤ７３抗体がＣＤ７３の酵素活性を非基質競合的に効果的に阻害し、アデノシンの産生を低下させることを示唆している。
【0107】
２．Ｕ８７－ＭＧ細胞に添加された抗ＣＤ７３抗体の酵素活性の検出
実験工程は以下の通りである。良好な状態の対数期Ｕ８７－ＭＧ細胞を採取し、無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁して計数した。Ｕ８７－ＭＧ細胞を９６ウェルプレートに３×１０４細胞／１００μＬ／ウェルで接種した。抗体は無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地で希釈し、初期濃度２００μｇ／ｍＬで２．５倍勾配希釈を行った。抗体を９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、ＲＰＭＩ－１６４０で希釈した５０μＬの６００μＭ ＡＭＰを各ウェルに加えた。３時間後に２５μＬの細胞培養上清を採取し、新しい９６ウェルプレートに移し、２５μＬの１００μＭ ＡＴＰを各ウェルに添加した。５０ｕＬのＣＴＧ（CellTiter-Glo（登録商標）One Solution Assay、promega、Ｃａｔ：Ｇ８４６１）色素原溶液を使用して発色させ、マルチラベルマイクロプレート検出器（PerkinElmer ２１４０－００２０）でデータを読み取った。
実験工程は以下の通りである。良好な状態の対数期Ｕ８７－ＭＧ細胞を採取し、無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁して計数した。Ｕ８７－ＭＧ細胞を９６ウェルプレートに３×１０４細胞／１００μＬ／ウェルで接種した。抗体は無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地で希釈し、初期濃度２００μｇ／ｍＬで２．５倍勾配希釈を行った。抗体を９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、ＲＰＭＩ－１６４０で希釈した５０μＬの６００μＭ ＡＭＰを各ウェルに加えた。３時間後に２５μＬの細胞培養上清を採取し、新しい９６ウェルプレートに移し、２５μＬの１００μＭ ＡＴＰを各ウェルに添加した。５０ｕＬのＣＴＧ（CellTiter-Glo（登録商標）One Solution Assay、promega、Ｃａｔ：Ｇ８４６１）色素原溶液を使用して発色させ、マルチラベルマイクロプレート検出器（PerkinElmer ２１４０－００２０）でデータを読み取った。
【0108】
実験結果：結果は図４に示される。１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３及び同一標的陽性対照薬ＭＥＤＩ９４４７の両方が、ＡＭＰをアデノシンに触媒するＭＤＡ－ＭＢ－２３１に内因的に発現されるＣＤ７３の酵素活性を用量依存的に阻害することができ、こうして、生成されるＭＦＩ ＲＬＵが用量依存的に低下した。
【0109】
上記の実験結果は、追加されたＡＭＰが、ＣＤ７３抗体処理がない場合、８７－ＭＧの細胞表面に内因的に発現されるＣＤ７３の酵素触媒下でアデノシンに変換され、それによってルシフェラーゼ活性の阻害を緩和する可能性があることを示している。抗体の添加後、ＣＤ７３は抗体によって結合され、これがその酵素触媒活性を低下させ、ＡＭＰからアデノシンへの変換が妨げられる。これは、抗ＣＤ７３抗体がＣＤ７３の酵素活性を非基質競合的に効果的に阻害し、アデノシンの産生を低下させることを示唆している。抗体１９Ｆ３、抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、及び抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２は同様の結果を達成した。
【0110】
実施例６：抗ＣＤ７３抗体による細胞膜表面でのＣＤ７３発現のインターナリゼーションの効果的な誘導
この試験では、ＦＡＣＳ法を使用して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＵ８７－ＭＧ細胞の膜表面での１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３を介したＣＤ７３のインターナリゼーションの生物学的活性を評価した。間接的インターナリゼーション法のＭＦＩ値は、エンドサイトーシス活性に反比例した。
この試験では、ＦＡＣＳ法を使用して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＵ８７－ＭＧ細胞の膜表面での１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３を介したＣＤ７３のインターナリゼーションの生物学的活性を評価した。間接的インターナリゼーション法のＭＦＩ値は、エンドサイトーシス活性に反比例した。
【0111】
実験工程：細胞を完全培地で対数増殖期まで培養し、１７０×ｇで５分間遠心分離し、細胞を採取し、計数して、生存率を３０ｗ／試料で測定した。対応する濃度に希釈した抗体溶液を実験計画に従って１００μＬ／チューブで添加し、ブランク及びアイソタイプ対照を設計し、氷上で１時間インキュベートした。１％ＰＢＳＡを１，０００μＬ加え、１，２００×ｇで５分間遠心分離後、上清を廃棄し、洗浄を１回繰り返した。対応する完全培地２００μＬを各チューブに加え、エンドサイトーシスを３７℃でさまざまな時間行った。エンドサイトーシス後、１％ＰＢＳＡ（０．０５％アジ化ナトリウム含有、SIGMA、カタログ番号Ｓ２００２－２５Ｇ）を１，０００μＬ加え、１２００×ｇで５分間遠心分離した。１００μＬの対応する蛍光二次抗体を各チューブに加え、充分混合し、氷上で光を遮断して４０分間インキュベートした。１％ＰＢＳＡ（０．０５％アジ化ナトリウム含有）１，０００μＬを加え、１，２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。２００μＬの１％ＰＢＳＡ（０．０５％アジ化ナトリウムを含む）／チューブを加え、細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー試料ローディングチューブに移し、ローディングしして試験した。
【0112】
インターナリゼーションの結果は図５及び６に示される。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＵ８７－ＭＧ細胞で３７℃で０．５時間インキュベートした後、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３のＭＦＩ値の減少が明確に観察され（図５Ａ及び６Ａを参照）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３のみが細胞膜表面でのＣＤ７３のインターナリゼーションを迅速に媒介できることを示している。２２時間のインキュベーション後、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３を介したインターナリゼーション率は６０．７５％に達し、及び同一標的対照薬ＭＥＤＩ９４４７のインターナリゼーション率は５０．５３％であり、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３よりも１０．２２％低かった（図６Ｂを参照）。２２時間後、Ｕ８７－ＭＧ細胞における１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３を介したＣＤ７３のインターナリゼーション率は８２．３９％で、及び同一標的対照抗体ＭＥＤＩ９４４７の２２時間のインターナリゼーション率は７３．６５％であり、これは、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３より８．７４％低かった（図５Ｂを参照）。抗体１９Ｆ３、抗体１９Ｆ３、抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、及び抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２は同様の結果を達成した。
【0113】
実施例７：ＥＬＩＳＡによって決定された、抗原ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンに対する抗ＣＤ７３抗体の結合活性
実験工程：マイクロプレートを２μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコーティングした後、マイクロプレートを４℃で１２時間インキュベートした。インキュベーション終了後、抗原をコーティングしたマイクロプレートをＰＢＳＴで１回リンスした後、マイクロプレートブロッキング緩衝液として１％ＢＳＡ ＰＢＳＴ溶液を用いて２時間ブロッキングした。ブロッキング終了後、ＰＢＳＴを用いてマイクロプレートを３回洗浄した。抗原であるヒトＮＴ５Ｅ－ビオチン（Akeso Biopharma Co., Ltd.により調製された、バッチ番号２０１６０５０５）を０．５μｇ／ｍＬで添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴを用いてプレートを３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で連続希釈した抗体をマイクロプレートウェルに添加した。抗体希釈勾配の詳細については、表１を参照されたい。被験抗体を含むマイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、インキュベーション終了後、マイクロプレートをＰＢＳＴを用いて３回洗浄した。プレートを洗浄後、１：５，０００の比率でに希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson、カタログ番号１０９－０３５－０８８）、又は１：５，０００の比率で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson、カタログ番号１１５－０３５－０６２）二次抗体使用溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション終了後、ＰＢＳＴを用いてプレートを４回洗浄し、ＴＭＢ（Neogen、３０８１７７）を添加し、５分間遮光して発色させ、停止液を添加して発色反応を停止させた。マイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーにセットし、４５０ｎｍの光学波長を選択してマイクロプレートの各ウェルのＯＤ値を読み取った。データは、SoftMax Pro 6.2.1ソフトウェアを使用して分析及び処理した。
実験工程：マイクロプレートを２μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコーティングした後、マイクロプレートを４℃で１２時間インキュベートした。インキュベーション終了後、抗原をコーティングしたマイクロプレートをＰＢＳＴで１回リンスした後、マイクロプレートブロッキング緩衝液として１％ＢＳＡ ＰＢＳＴ溶液を用いて２時間ブロッキングした。ブロッキング終了後、ＰＢＳＴを用いてマイクロプレートを３回洗浄した。抗原であるヒトＮＴ５Ｅ－ビオチン（Akeso Biopharma Co., Ltd.により調製された、バッチ番号２０１６０５０５）を０．５μｇ／ｍＬで添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴを用いてプレートを３回洗浄した。ＰＢＳＴ溶液で連続希釈した抗体をマイクロプレートウェルに添加した。抗体希釈勾配の詳細については、表１を参照されたい。被験抗体を含むマイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、インキュベーション終了後、マイクロプレートをＰＢＳＴを用いて３回洗浄した。プレートを洗浄後、１：５，０００の比率でに希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson、カタログ番号１０９－０３５－０８８）、又は１：５，０００の比率で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson、カタログ番号１１５－０３５－０６２）二次抗体使用溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション終了後、ＰＢＳＴを用いてプレートを４回洗浄し、ＴＭＢ（Neogen、３０８１７７）を添加し、５分間遮光して発色させ、停止液を添加して発色反応を停止させた。マイクロプレートを直ちにマイクロプレートリーダーにセットし、４５０ｎｍの光学波長を選択してマイクロプレートの各ウェルのＯＤ値を読み取った。データは、SoftMax Pro 6.2.1ソフトウェアを使用して分析及び処理した。
【0114】
抗原ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンへの抗ＣＤ７３抗体の結合を検出するための各用量のＯＤ値については、表１を参照されたい。抗体濃度を横軸、吸光度を縦軸にしてカーブフィッティングを行い、抗体の結合ＥＣ５０を算出した。結果は以下の表１に示される。
【0115】
実験結果は、抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３、及びマウス抗体１９Ｆ３がヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンに効果的に結合でき、結合効率が用量依存的であることを示した。基本的に同じ実験条件下で、ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンへの１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１の結合のＥＣ５０は０．０４９ｎＭ、ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンへの１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２の結合のＥＣ５０は０．０６４ｎＭ、ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンへの１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３の結合のＥＣ５０は０．０６１ｎＭであり、ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンへの同一標的陽性薬ＭＥＤＩ９４４７の結合のＥＣ５０は０．０４８ｎＭであり、ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンへのマウス抗体１９Ｆ３の結合のＥＣ５０は０．０１８ｎＭであった。
【0116】
上記の実験結果から、ヒトＮＴ５Ｅ－ビオチンへの１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３、及びマウス抗体１９Ｆ３の結合活性は、同じ実験条件下で、それぞれ同一標的陽性薬ＭＥＤＩ９４４７と同等であることが示され、１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２、及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３が、ＣＤ７３に効果的に結合する機能を有することを示唆している。
【表1】
【0117】
実施例８：抗ＣＤ７３抗体によるＣＯＶＩＤ－１９Ｓタンパク質に対する抗体産生の効果的な誘導
１．実験材料：
ｈＩｇＧ１ＤＭ、Akeso Biopharma Co., Ltd.製；Ｓ－タンパク質（ｎＣｏＶ＿ＳＲＢＤ－ｍＦｃ、配列はＹＰ＿００９７２４３９０．１参照）、Akeso Biopharma Co., Ltd.製；ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）、SIGMAから購入、カタログ番号Ｆ５８８１－１０ｍｌ；ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）、SIGMAから購入、カタログ番号Ｆ５５０６－１０ｍｌ。
１．実験材料：
ｈＩｇＧ１ＤＭ、Akeso Biopharma Co., Ltd.製；Ｓ－タンパク質（ｎＣｏＶ＿ＳＲＢＤ－ｍＦｃ、配列はＹＰ＿００９７２４３９０．１参照）、Akeso Biopharma Co., Ltd.製；ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）、SIGMAから購入、カタログ番号Ｆ５８８１－１０ｍｌ；ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）、SIGMAから購入、カタログ番号Ｆ５５０６－１０ｍｌ。
【0118】
２．実験方法：
実験プロトコールと投与計画を以下の表に示す。
実験プロトコールと投与計画を以下の表に示す。
【表2】
【0119】
３．実験結果：
図７に示されるように、モデル群では、マウスにＳタンパク質（２５μｇ／マウス）＋アジュバント誘導注射を施した後、マウス血清中のＳタンパク質特異的ＩｇＧのレベルが上昇し、Ｓタンパク質（２５μｇ／マウス）＋アジュバントが、ＣＯＶＩＤ－１９Ｓタンパク質に対する体の免疫応答を効果的に誘導することができることを示唆している。１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）投与群におけるマウス血清中のＳ蛋白特異的ＩｇＧは、アイソタイプ対照群と比較して、様々な程度で増加した。５１日目に、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の高用量群と低用量群の差は統計的に有意であり（Ｔ検定）、マウスにおけるＳタンパク質特異的ＩｇＧの促進効果は、低用量の１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）（１０ｍｇ／ｋｇ）群で有意性がより高かった。抗体１９Ｆ３、抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、及び抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２は同様の結果を達成した。
図７に示されるように、モデル群では、マウスにＳタンパク質（２５μｇ／マウス）＋アジュバント誘導注射を施した後、マウス血清中のＳタンパク質特異的ＩｇＧのレベルが上昇し、Ｓタンパク質（２５μｇ／マウス）＋アジュバントが、ＣＯＶＩＤ－１９Ｓタンパク質に対する体の免疫応答を効果的に誘導することができることを示唆している。１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）投与群におけるマウス血清中のＳ蛋白特異的ＩｇＧは、アイソタイプ対照群と比較して、様々な程度で増加した。５１日目に、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の高用量群と低用量群の差は統計的に有意であり（Ｔ検定）、マウスにおけるＳタンパク質特異的ＩｇＧの促進効果は、低用量の１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）（１０ｍｇ／ｋｇ）群で有意性がより高かった。抗体１９Ｆ３、抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、及び抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２は同様の結果を達成した。
【0120】
実施例９：ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ１９＋Ｂ細胞に対する抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の結合活性のＦＡＣＳによる検出
実験工程は以下の通りである。ＰＢＭＣを蘇生させ、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、完全培地に再懸濁し、計数し、３７℃で一晩インキュベートした。溶液を１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を採取し、希釈抗体溶液を１００μＬ／ウェルで添加し、充分混合し、４℃の冷蔵庫で１時間インキュベートした。溶液を７５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、２００μＬの１×ＰＢＳ（１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含む）で２回洗浄した。抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ（２μＬ／１００μＬ）、抗ヒトＣＤ１９－ＰＥ（２μＬ／１００μＬ）（Biolegend、製品番号３０２２５４）、抗ヒトＣＤ８－ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５（１μＬ／１００μＬ）、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＡＦ６４７（１：３００）（Southern Biotech、カタログ番号９０４０－３１）を加え、４℃で３０分間インキュベートした。溶液を７５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、２００μＬの１×ＰＢＳ（１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含む）で１回洗浄し、３００μＬの１×ＰＢＳ（１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含む）に再懸濁し、フローチューブに移し、ロードして試験した。
実験工程は以下の通りである。ＰＢＭＣを蘇生させ、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、完全培地に再懸濁し、計数し、３７℃で一晩インキュベートした。溶液を１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を採取し、希釈抗体溶液を１００μＬ／ウェルで添加し、充分混合し、４℃の冷蔵庫で１時間インキュベートした。溶液を７５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、２００μＬの１×ＰＢＳ（１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含む）で２回洗浄した。抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ（２μＬ／１００μＬ）、抗ヒトＣＤ１９－ＰＥ（２μＬ／１００μＬ）（Biolegend、製品番号３０２２５４）、抗ヒトＣＤ８－ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５（１μＬ／１００μＬ）、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＡＦ６４７（１：３００）（Southern Biotech、カタログ番号９０４０－３１）を加え、４℃で３０分間インキュベートした。溶液を７５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、２００μＬの１×ＰＢＳ（１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含む）で１回洗浄し、３００μＬの１×ＰＢＳ（１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含む）に再懸濁し、フローチューブに移し、ロードして試験した。
【0121】
その結果は図８及び図３に示される。ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）及び陽性対照抗体ＣＰＩ－００６の結合活性ＥＣ５０（ｎＭ）は、それぞれ０．０８７ｎＭ及び０．２８８ｎＭであり、ＣＤ１９＋Ｂ細胞に対する抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）及び陽性対照抗体ＣＰＩ－００６の結合活性ＥＣ５０（ｎＭ）は、それぞれ０．０１８ｎＭ及び０．１０８ｎＭであった。１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）と同一標的陽性対照ＣＰＩ－００６の両方が、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ１９＋Ｂ細胞によって発現されるＣＤ７３に用量依存的に結合し、それによってＭＦＩが用量依存的に増加した。
【0122】
上記の結果は、同じ実験条件下で、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）が陽性対照抗体ＣＰＩ－００６よりも強くＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ１９＋Ｂ細胞に結合することを示している。
【表3】
【0123】
実施例１０：抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）による、ヒトＰＢＭＣ膜に発現されたＣＤ７３の酵素活性の阻害
実験工程は以下の通りである：密度勾配遠心分離によって新鮮なヒトＰＢＭＣを分離し、アッセイ培地（無血清ＲＰＭＩ－１６４０）に再懸濁した。細胞数を数え、生存率を測定し、溶液を１０×１０４細胞／ウェルに基づいて９６ウェルプレートに６０μＬ／ウェルで接種した。抗体は、アッセイ培地を使用して次の濃度に希釈した：３０、１０、３．３、１．１、０．１１、０．０１１、０．００１１、及び０．０００１１μｇ／ｍＬ。抗体を９６ウェルプレートに６０μＬ／ウェルで添加し、細胞と穏やかに混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。６０μＭの濃度のＡＭＰ溶液（TCI、カタログ番号Ａ０１５８）を、後で使用するためにアッセイ培地を使用して調製した。３０μＭの濃度のＡＴＰ溶液を、後で使用するためにＴＭバッファー（akesobio、２０１９１００９）を使用して調製した。細胞抗体を３０分間インキュベートした後、調製したＡＭＰ溶液を６０μＬ／ウェルで添加し、穏やかに混合し、３７℃で一晩（１０時間）インキュベートした。一晩のインキュベーションが終了する前に、きれいな黒色の９６ウェルプレートを取り出し、ＣＴＧ（promega、カタログ番号Ｇ８４６１）を４０μＬ／ウェルで加えた。一晩インキュベーションの終了後、インキュベーター内の９６ウェルプレートを取り出し、７５０×ｇで５分間遠心分離し、上清をウェルあたり１００μＬ／ウェルのＣＴＧを有するた黒色の９６ウェルプレートに移し、プレートをを軽くたたき、光を避けて室温で５分間置いた。５分後、調製したＡＴＰ溶液を黒色の９６ウェルプレートに１０μＬ／ウェルで加え、プレートを軽くたたいて充分混合し、室温で１５分間置いて遮光した。１５分後、Envisionマイクロプレートリーダーを使用してＲＬＵ値を検出した。
実験工程は以下の通りである：密度勾配遠心分離によって新鮮なヒトＰＢＭＣを分離し、アッセイ培地（無血清ＲＰＭＩ－１６４０）に再懸濁した。細胞数を数え、生存率を測定し、溶液を１０×１０４細胞／ウェルに基づいて９６ウェルプレートに６０μＬ／ウェルで接種した。抗体は、アッセイ培地を使用して次の濃度に希釈した：３０、１０、３．３、１．１、０．１１、０．０１１、０．００１１、及び０．０００１１μｇ／ｍＬ。抗体を９６ウェルプレートに６０μＬ／ウェルで添加し、細胞と穏やかに混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。６０μＭの濃度のＡＭＰ溶液（TCI、カタログ番号Ａ０１５８）を、後で使用するためにアッセイ培地を使用して調製した。３０μＭの濃度のＡＴＰ溶液を、後で使用するためにＴＭバッファー（akesobio、２０１９１００９）を使用して調製した。細胞抗体を３０分間インキュベートした後、調製したＡＭＰ溶液を６０μＬ／ウェルで添加し、穏やかに混合し、３７℃で一晩（１０時間）インキュベートした。一晩のインキュベーションが終了する前に、きれいな黒色の９６ウェルプレートを取り出し、ＣＴＧ（promega、カタログ番号Ｇ８４６１）を４０μＬ／ウェルで加えた。一晩インキュベーションの終了後、インキュベーター内の９６ウェルプレートを取り出し、７５０×ｇで５分間遠心分離し、上清をウェルあたり１００μＬ／ウェルのＣＴＧを有するた黒色の９６ウェルプレートに移し、プレートをを軽くたたき、光を避けて室温で５分間置いた。５分後、調製したＡＴＰ溶液を黒色の９６ウェルプレートに１０μＬ／ウェルで加え、プレートを軽くたたいて充分混合し、室温で１５分間置いて遮光した。１５分後、Envisionマイクロプレートリーダーを使用してＲＬＵ値を検出した。
【0124】
実験結果：結果は図９及び表４に示される。ヒトＰＢＭＣ膜によって発現されたＣＤ７３の阻害における１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）、ＭＥＤＩ９４４７、及びＣＰＩ－００６の酵素活性及び有効性ＥＣ５０（ｎＭ）は、それぞれ０．０３３ｎＭ、０．００６４ｎＭ、及び０．２２５８ｎＭであった。１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）及び同一標的陽性対照薬ＭＥＤＩ９４４７及びＣＰＩ－００６のすべてが、ＡＭＰをアデノシンに触媒するヒトＰＢＭＣによって発現されたＣＤ７３の酵素活性を用量依存的に阻害し、それによって、産生されるＭＦＩを用量依存的に減少させた。さらに、抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の阻害率は、陽性対照薬ＭＥＤＩ９４４７及びＣＰＩ－００６よりも大きかった。
【表4】
【0125】
実施例１１：ＦＡＣＳによって検出される、抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）によるＢ細胞活性化の効果的な誘導
ＣＤ６９はＣ型膜貫通糖タンパク質であり、活性化されたＴ、Ｂ、ＮＫ、及びその他のリンパ球の表面に発現されることが多く、通常はリンパ球の早期活性化のマーカーとして使用される。ＣＤ８３は、成熟ＤＣで広く発現されるもう１つの早期活性化マーカーであり、Ｂリンパ球などの活性化免疫細胞でも発現される。ＣＤ８３は、細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ及びＣＤ８６分子の分解を防ぐことができ、免疫調節に関与する。Ｂ細胞は活性化された後、記憶Ｂ細胞や形質細胞になることができ、これらは抗体やサイトカインを分泌し、ウイルスなどの外因性微生物による感染に対する免疫応答に関与する。活性化されたＢ細胞は、ＩｇＭ主体の抗体を産生する。ＨＬＡ－ＤＲはＢ細胞に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子であり、ＨＬＡ－ＤＲ発現の増加はＢリンパ球活性化のマーカーである。従って、この試験では、ＣＤ６９、ＣＤ８３、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＩｇＭがＢ細胞活性化の分子マーカーとして使用され、ＣＤ６９、ＣＤ８３、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＩｇＭのＭＦＩ値と陽性率は、Ｂ細胞活性化活性に正比例した。
ＣＤ６９はＣ型膜貫通糖タンパク質であり、活性化されたＴ、Ｂ、ＮＫ、及びその他のリンパ球の表面に発現されることが多く、通常はリンパ球の早期活性化のマーカーとして使用される。ＣＤ８３は、成熟ＤＣで広く発現されるもう１つの早期活性化マーカーであり、Ｂリンパ球などの活性化免疫細胞でも発現される。ＣＤ８３は、細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ及びＣＤ８６分子の分解を防ぐことができ、免疫調節に関与する。Ｂ細胞は活性化された後、記憶Ｂ細胞や形質細胞になることができ、これらは抗体やサイトカインを分泌し、ウイルスなどの外因性微生物による感染に対する免疫応答に関与する。活性化されたＢ細胞は、ＩｇＭ主体の抗体を産生する。ＨＬＡ－ＤＲはＢ細胞に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子であり、ＨＬＡ－ＤＲ発現の増加はＢリンパ球活性化のマーカーである。従って、この試験では、ＣＤ６９、ＣＤ８３、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＩｇＭがＢ細胞活性化の分子マーカーとして使用され、ＣＤ６９、ＣＤ８３、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＩｇＭのＭＦＩ値と陽性率は、Ｂ細胞活性化活性に正比例した。
【0126】
実験工程は以下の通りである。
Ｂ細胞を蘇生させ、完全培地に再懸濁し、計数し、９６ウェルプレートに１００，０００細胞／１００μＬ／ウェルで接種し、各群に２重のウェルを設定した。抗体又はＡＰＣＰ（アデノシン５'－（α，β－メチレン）二リン酸（Sigma、カタログ番号Ｍ３７６３－１０ＭＧ）を加え、充分混合し、インキュベーターでインキュベートした。実験ウェル（５０μＬのｈＩｇＧ１（Akesobio、バッチ番号２０１７０４２４）を添加）を最初にＢ細胞と３０分間インキュベートし、次に対応する抗体濃度の溶液５０μＬを添加した。それぞれ４時間と３日間のインキュベーション後、Ｂ細胞を採取し、フローサイトメトリーを行ってＣＤ３－ＣＤ１９＋Ｂ細胞のＣＤ６９／ＣＤ８３／ＨＬＡ－ＤＲ／ＩｇＭ発現レベルを検出した。
Ｂ細胞を蘇生させ、完全培地に再懸濁し、計数し、９６ウェルプレートに１００，０００細胞／１００μＬ／ウェルで接種し、各群に２重のウェルを設定した。抗体又はＡＰＣＰ（アデノシン５'－（α，β－メチレン）二リン酸（Sigma、カタログ番号Ｍ３７６３－１０ＭＧ）を加え、充分混合し、インキュベーターでインキュベートした。実験ウェル（５０μＬのｈＩｇＧ１（Akesobio、バッチ番号２０１７０４２４）を添加）を最初にＢ細胞と３０分間インキュベートし、次に対応する抗体濃度の溶液５０μＬを添加した。それぞれ４時間と３日間のインキュベーション後、Ｂ細胞を採取し、フローサイトメトリーを行ってＣＤ３－ＣＤ１９＋Ｂ細胞のＣＤ６９／ＣＤ８３／ＨＬＡ－ＤＲ／ＩｇＭ発現レベルを検出した。
【0127】
ＦＡＣＳ操作手順：ウェルプレートの各ウェルのＢ細胞を穏やかに混合し、９６ウェルプレートの５つのウェルに均等に移し、７５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ＰＢＳＡ（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）に再懸濁し、及びマウスＩｇＧ（マウスＩｇＧアイソタイプ対照）を１００ｕＬ／ウェルで添加して、５μｇ／ｍｌの最終濃度を得た。溶液を氷上で２０分間インキュベートし、７５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、Ｍｉｘ１／２／３／４／５／６／７をそれぞれ加えた。
【0128】
Ｍｉｘ１：１００ｕＬのＰＢＳＡ；
Ｍｉｘ２：１００μＬのＰＢＳＡが、２μＬのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３（Biolegendから購入、カタログ番号３４４８０４）＋２μＬのＰＥ抗ヒトＣＤ１９（Biolegendから購入、カタログ番号３０２２５４）を含む；
Ｍｉｘ３：１００μＬのＰＢＳＡが、２μＬのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３＋２μＬのＰＥ抗ヒトＣＤ１９＋１μＬのＡＰＣ抗ヒトＣＤ６９（Biolegendから購入、カタログ番号３１０９１０）を含む；
Ｍｉｘ４：１００μＬのＰＢＳＡが、２μＬのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３＋２μＬのＰＥ抗ヒトＣＤ１９＋２μＬのＡＰＣ抗ヒトＣＤ８３（Biolegendから購入、カタログ番号３０５３１２）を含む；
Ｍｉｘ５：１００μＬのＰＢＳＡが、２μＬのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３＋２μＬのＰＥ抗ヒトＣＤ１９＋２μＬのＡＰＣ抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ（Biolegendから購入、カタログ番号３６１６１０）を含む；
Ｍｉｘ６：１００μＬのＰＢＳＡが、２μＬのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３＋２μＬのＰＥ抗ヒトＣＤ１９＋２μＬのＡＰＣ抗ヒトＩｇＤ（Biolegendから購入、カタログ番号３４８２２２）＋２μＬのＰｅｒＣＰ／シアニン５．５抗ヒトＣＤ２７抗体（Biolegend、カタログ番号３５６４０８）を含む；
Ｍｉｘ７：１００μＬのＰＢＳＡが、２μＬのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３＋２μＬのＰＥ抗ヒトＣＤ１９＋２μＬのＡＰＣ抗ヒトＩｇＭ（Biolegendから購入、カタログ番号３１４５１０）を含む。
Ｍｉｘ２：１００μＬのＰＢＳＡが、２μＬのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３（Biolegendから購入、カタログ番号３４４８０４）＋２μＬのＰＥ抗ヒトＣＤ１９（Biolegendから購入、カタログ番号３０２２５４）を含む；
Ｍｉｘ３：１００μＬのＰＢＳＡが、２μＬのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３＋２μＬのＰＥ抗ヒトＣＤ１９＋１μＬのＡＰＣ抗ヒトＣＤ６９（Biolegendから購入、カタログ番号３１０９１０）を含む；
Ｍｉｘ４：１００μＬのＰＢＳＡが、２μＬのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３＋２μＬのＰＥ抗ヒトＣＤ１９＋２μＬのＡＰＣ抗ヒトＣＤ８３（Biolegendから購入、カタログ番号３０５３１２）を含む；
Ｍｉｘ５：１００μＬのＰＢＳＡが、２μＬのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３＋２μＬのＰＥ抗ヒトＣＤ１９＋２μＬのＡＰＣ抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ（Biolegendから購入、カタログ番号３６１６１０）を含む；
Ｍｉｘ６：１００μＬのＰＢＳＡが、２μＬのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３＋２μＬのＰＥ抗ヒトＣＤ１９＋２μＬのＡＰＣ抗ヒトＩｇＤ（Biolegendから購入、カタログ番号３４８２２２）＋２μＬのＰｅｒＣＰ／シアニン５．５抗ヒトＣＤ２７抗体（Biolegend、カタログ番号３５６４０８）を含む；
Ｍｉｘ７：１００μＬのＰＢＳＡが、２μＬのＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３＋２μＬのＰＥ抗ヒトＣＤ１９＋２μＬのＡＰＣ抗ヒトＩｇＭ（Biolegendから購入、カタログ番号３１４５１０）を含む。
【0129】
溶液を氷上で４０分間インキュベートし、２００μＬのＰＢＳＡ／ウェルを加え、７５０×ｇで５分間遠心分離し、洗浄した。２００μＬのＰＢＳＡ／ウェルを添加し、細胞を再懸濁し、ロードして試験した。
【0130】
結果は図１０に示される。１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）処理群のＣＤ６９、ＣＤ８３、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＩｇＭのＭＦＩ値は、アイソタイプ対照の値よりも有意に高く、これは、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）がＢ細胞の活性化を誘導し、ＣＤ６９、ＣＤ８３、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＩｇＭの発現をアップレギュレートし、その活性が、臨床研究中の同一標的対照抗体ＭＥＤＩ９４４７及びＣＰＩ－００６よりも優れていることを示している。しかし、ＣＤ７３酵素活性阻害剤ＡＰＣＰ（Sigma、カタログ番号Ｍ３７６３－１０ＭＧ）は、Ｂ細胞表面のＣＤ６９、ＣＤ８３、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＩｇＭの発現に影響を与えなかったため、これは、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）が、ＣＤ７３酵素阻害とは異なるシグナル伝達経路を介してＢ細胞の活性化を誘導することができることを示している。
【0131】
実施例１２：抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）によるＢ細胞増殖の刺激
実験工程は以下の通りである。ＰＢＭＣを蘇生させ、２５０×ｇで５分間遠心分離し、完全培地に再懸濁して、計数した。溶液を遠心分離し、完全培地を廃棄し、ＲＰＭＩ－１６４０で１回洗浄し、再懸濁した。０．２５μＭのＣＦＳＥ（Biolegend、カタログ番号４２３８０１）溶液を１×１０６細胞／ｍＬになるように添加し、インキュベーター内で３７℃で２分間遮光してインキュベートした。２～３倍血清含有培地を加えて反応を停止させ、溶液を２５０×ｇ（１，２００ｒｐｍ）で５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０完全培地に再懸濁し、計数し、細胞懸濁液を２４ウェルプレートに２．４×１０６細胞／ウェルで添加し、対応する濃度の抗体溶液を実験計画に従って各ウェルに添加し、二酸化炭素インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２で７日間インキュベートした。２４ウェルプレートの上清の半分をＤ３で廃棄し、完全培地で希釈した対応する濃度の抗体溶液を加えた。培養のＤ６で、２４ウェルプレートの上清の半分を廃棄し、完全培地で希釈した対応する濃度の抗体溶液を加えた。培養のＤ７で、細胞を２４ウェルプレートから採取し、以下の手順に従ってフローサイトメーターにロードした。細胞を１，２００×ｇで５分間遠心分離し、採取し、対応する細胞番号群を取得し、５μｇ／ｍＬのＭＳマウスＩｇＧ（Thermofisher、カタログ番号１０４００Ｃ）で２０分間インキュベートした。溶液を遠心分離し、洗浄し、対応する蛍光抗体を加えて６０分間インキュベートした。溶液を１％ＰＢＳＡに再懸濁し、フローチューブに移し、ロードして試験した。
実験工程は以下の通りである。ＰＢＭＣを蘇生させ、２５０×ｇで５分間遠心分離し、完全培地に再懸濁して、計数した。溶液を遠心分離し、完全培地を廃棄し、ＲＰＭＩ－１６４０で１回洗浄し、再懸濁した。０．２５μＭのＣＦＳＥ（Biolegend、カタログ番号４２３８０１）溶液を１×１０６細胞／ｍＬになるように添加し、インキュベーター内で３７℃で２分間遮光してインキュベートした。２～３倍血清含有培地を加えて反応を停止させ、溶液を２５０×ｇ（１，２００ｒｐｍ）で５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０完全培地に再懸濁し、計数し、細胞懸濁液を２４ウェルプレートに２．４×１０６細胞／ウェルで添加し、対応する濃度の抗体溶液を実験計画に従って各ウェルに添加し、二酸化炭素インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２で７日間インキュベートした。２４ウェルプレートの上清の半分をＤ３で廃棄し、完全培地で希釈した対応する濃度の抗体溶液を加えた。培養のＤ６で、２４ウェルプレートの上清の半分を廃棄し、完全培地で希釈した対応する濃度の抗体溶液を加えた。培養のＤ７で、細胞を２４ウェルプレートから採取し、以下の手順に従ってフローサイトメーターにロードした。細胞を１，２００×ｇで５分間遠心分離し、採取し、対応する細胞番号群を取得し、５μｇ／ｍＬのＭＳマウスＩｇＧ（Thermofisher、カタログ番号１０４００Ｃ）で２０分間インキュベートした。溶液を遠心分離し、洗浄し、対応する蛍光抗体を加えて６０分間インキュベートした。溶液を１％ＰＢＳＡに再懸濁し、フローチューブに移し、ロードして試験した。
【0132】
結果は図１１に示される。異なる抗体をヒトＰＢＭＣに添加し、７日間処理した後、ヒトＩｇＧ１ＤＭと比較して、ＭＥＤＩ９４４７処理群ではＢ細胞の増殖は観察されなかったが、一方Ｂ細胞の増殖は、０．０５μｇ／ｍＬという低濃度の１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３によって有意に促進することができた。抗体１９Ｆ３、抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１、及び抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２は同様の結果を達成した。
【0133】
配列表
Akeso Biopharma Co., Ltd.
発明の名称：抗ＣＤ７３抗体及びその使用
１９Ｆ３ ＶＨの核酸配列（配列番号１）
GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCAGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCCTCCATGCGGATGTCTTGTAAGGCCTCTGGCTACAGCTTCACCGGCTATACAATGAACTGGGTGAAGCAGTCTCACGGCAAGAATCTGGAGTGGATCGGCCTGATCAACCCTTACAATGCCGGCACCAGCTATAACCAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACCCTGACAGTGGACAAGAGCTCCTCTACCGCCTACATGGAGCTGCTGTCCCTGACATCTGAGGATAGCGCCGTGTACTATTGCGCCCGGTCCGAGTACAGATATGGCGGCGACTACTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCACACTGACAGTGAGCTCC
Akeso Biopharma Co., Ltd.
発明の名称：抗ＣＤ７３抗体及びその使用
１９Ｆ３ ＶＨの核酸配列（配列番号１）
GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCAGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCCTCCATGCGGATGTCTTGTAAGGCCTCTGGCTACAGCTTCACCGGCTATACAATGAACTGGGTGAAGCAGTCTCACGGCAAGAATCTGGAGTGGATCGGCCTGATCAACCCTTACAATGCCGGCACCAGCTATAACCAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACCCTGACAGTGGACAAGAGCTCCTCTACCGCCTACATGGAGCTGCTGTCCCTGACATCTGAGGATAGCGCCGTGTACTATTGCGCCCGGTCCGAGTACAGATATGGCGGCGACTACTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCACACTGACAGTGAGCTCC
【0134】
１９Ｆ３ ＶＨのアミノ酸配列（配列番号２）
EVQLQQSGPELVKPGASMRMSCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNAGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSEYRYGGDYFDYWGQGTTLTVSS
EVQLQQSGPELVKPGASMRMSCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNAGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSEYRYGGDYFDYWGQGTTLTVSS
【0135】
１９Ｆ３ ＶＬの核酸配列：（配列番号３）
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAAGCTCCCTGGCAATGAGCGTGGGACAGAAGGTGACAATGTCTTGTAAGTCTAGCCAGAGCCTGCTGAACTCCTCTAATCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCCAAGCTGCTGGTGTACTTTGCCAGCACCAGGGAGTCCGGAGTGCCTGACAGATTCATCGGCTCCGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCGTGCAGGCAGAGGACCTGGCAGATTATTTCTGCCAGCAGCACTACGACACCCCTTATACATTTGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAAGCTCCCTGGCAATGAGCGTGGGACAGAAGGTGACAATGTCTTGTAAGTCTAGCCAGAGCCTGCTGAACTCCTCTAATCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCCAAGCTGCTGGTGTACTTTGCCAGCACCAGGGAGTCCGGAGTGCCTGACAGATTCATCGGCTCCGGCTCTGGCACAGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCGTGCAGGCAGAGGACCTGGCAGATTATTTCTGCCAGCAGCACTACGACACCCCTTATACATTTGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
【0136】
１９Ｆ３ ＶＬのアミノ酸配列：（配列番号４）
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYDTPYTFGGGTKLEIK
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYDTPYTFGGGTKLEIK
【0137】
１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１ ＶＨの核酸配列：（配列番号５）
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCAGAGGTGGTGAAGCCAGGAGCCTCTATGAAGATGAGCTGTAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTATACAATGAACTGGGTGAAGCAGGCCCACGGCCAGAATCTGGAGTGGATCGGCCTGATCAACCCTTACAATGCCGGCACCTCTTATAACCAGAAGTTTCAGGGCAAGGCCACCCTGACAGTGGACAAGTCCACCTCTACAGCCTACATGGAGCTGAGCTCCCTGCGGAGCGAGGATACAGCCGTGTACTATTGCGCCCGGTCCGAGTACAGATATGGCGGCGACTACTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCACACTGACCGTGTCTAGC
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCAGAGGTGGTGAAGCCAGGAGCCTCTATGAAGATGAGCTGTAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTATACAATGAACTGGGTGAAGCAGGCCCACGGCCAGAATCTGGAGTGGATCGGCCTGATCAACCCTTACAATGCCGGCACCTCTTATAACCAGAAGTTTCAGGGCAAGGCCACCCTGACAGTGGACAAGTCCACCTCTACAGCCTACATGGAGCTGAGCTCCCTGCGGAGCGAGGATACAGCCGTGTACTATTGCGCCCGGTCCGAGTACAGATATGGCGGCGACTACTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCACACTGACCGTGTCTAGC
【0138】
１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１ ＶＨのアミノ酸配列：（配列番号６）
QVQLQQSGAEVVKPGASMKMSCKASGYSFTGYTMNWVKQAHGQNLEWIGLINPYNAGTSYNQKFQGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEYRYGGDYFDYWGQGTTLTVSS
QVQLQQSGAEVVKPGASMKMSCKASGYSFTGYTMNWVKQAHGQNLEWIGLINPYNAGTSYNQKFQGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEYRYGGDYFDYWGQGTTLTVSS
【0139】
１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１ ＶＬの核酸配列：（配列番号７）
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAAGCTCCCTGGCAATGTCTGTGGGAGAGAGGGTGACAATGTCCTGTAAGTCTAGCCAGTCTCTGCTGAACTCCTCTAATCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTAAGCTGCTGGTGTACTTTGCCTCTACCAGGGAGAGCGGAGTGCCAGACAGATTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCGTGCAGGCAGAGGACCTGGCAGATTATTTCTGCCAGCAGCACTACGATACCCCCTATACATTTGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAAGCTCCCTGGCAATGTCTGTGGGAGAGAGGGTGACAATGTCCTGTAAGTCTAGCCAGTCTCTGCTGAACTCCTCTAATCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTAAGCTGCTGGTGTACTTTGCCTCTACCAGGGAGAGCGGAGTGCCAGACAGATTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCGTGCAGGCAGAGGACCTGGCAGATTATTTCTGCCAGCAGCACTACGATACCCCCTATACATTTGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
【0140】
１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１ ＶＬのアミノ酸配列：（配列番号８）
DIVMTQSPSSLAMSVGERVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLVYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYDTPYTFGGGTKLEIK
DIVMTQSPSSLAMSVGERVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLVYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYDTPYTFGGGTKLEIK
【0141】
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３ ＶＨの核酸配列：（配列番号９）
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGGTGAAGCCAGGAGCCTCTGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTATACAATGAACTGGGTGAGGCAGGCACCAGGACAGAATCTGGAGTGGATCGGCCTGATCAACCCTTACAATGCCGGCACCTCTTATAACCAGAAGTTTCAGGGCAAGGTGACCCTGACAGTGGACAAGTCCACCTCTACAGCCTACATGGAGCTGAGCTCCCTGCGGAGCGAGGATACAGCCGTGTACTATTGCGCCCGGTCCGAGTACAGATATGGCGGCGACTACTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCACACTGACCGTGTCTAGC
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGGTGAAGCCAGGAGCCTCTGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCCAGCGGCTACTCCTTCACCGGCTATACAATGAACTGGGTGAGGCAGGCACCAGGACAGAATCTGGAGTGGATCGGCCTGATCAACCCTTACAATGCCGGCACCTCTTATAACCAGAAGTTTCAGGGCAAGGTGACCCTGACAGTGGACAAGTCCACCTCTACAGCCTACATGGAGCTGAGCTCCCTGCGGAGCGAGGATACAGCCGTGTACTATTGCGCCCGGTCCGAGTACAGATATGGCGGCGACTACTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCACACTGACCGTGTCTAGC
【0142】
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３ ＶＨのアミノ酸配列：（配列番号１０）
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQNLEWIGLINPYNAGTSYNQKFQGKVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEYRYGGDYFDYWGQGTTLTVSS
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQNLEWIGLINPYNAGTSYNQKFQGKVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEYRYGGDYFDYWGQGTTLTVSS
【0143】
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２ ＶＨの核酸配列：（配列番号１１）
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAAGCTCCCTGGCCGTGTCTGTGGGAGAGCGGGTGACAATCTCCTGTAAGTCTAGCCAGTCTCTGCTGAACTCCTCTAATCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACTTCGCCTCTACCAGGGAGAGCGGAGTGCCAGACAGATTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCGTGCAGGCAGAGGACGTGGCAGATTACTATTGCCAGCAGCACTACGATACCCCCTATACATTTGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAAGCTCCCTGGCCGTGTCTGTGGGAGAGCGGGTGACAATCTCCTGTAAGTCTAGCCAGTCTCTGCTGAACTCCTCTAATCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACTTCGCCTCTACCAGGGAGAGCGGAGTGCCAGACAGATTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCGTGCAGGCAGAGGACGTGGCAGATTACTATTGCCAGCAGCACTACGATACCCCCTATACATTTGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
【0144】
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２ ＶＬのアミノ酸配列：（配列番号１２）
DIVMTQSPSSLAVSVGERVTISCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLIYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVADYYCQQHYDTPYTFGGGTKLEIK
DIVMTQSPSSLAVSVGERVTISCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLIYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVADYYCQQHYDTPYTFGGGTKLEIK
【0145】
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３ ＶＬの核酸配列：（配列番号１３）
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAAGCTCCCTGGCCGTGTCTGTGGGAGAGCGGGTGACAATCTCCTGTAAGTCTAGCCAGTCTCTGCTGAACTCCTCTAATCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACTTCGCCTCTACCAGGGAGAGCGGAGTGCCAGACAGATTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGGCAGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGCCAGCAGCACTACGATACCCCCTATACATTTGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAAGCTCCCTGGCCGTGTCTGTGGGAGAGCGGGTGACAATCTCCTGTAAGTCTAGCCAGTCTCTGCTGAACTCCTCTAATCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACTTCGCCTCTACCAGGGAGAGCGGAGTGCCAGACAGATTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGGCAGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGCCAGCAGCACTACGATACCCCCTATACATTTGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
【0146】
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３ ＶＬのアミノ酸配列：（配列番号１４）
DIVMTQSPSSLAVSVGERVTISCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLIYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYDTPYTFGGGTKLEIK
DIVMTQSPSSLAVSVGERVTISCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLIYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYDTPYTFGGGTKLEIK
【0147】
１９Ｆ３及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３のＣＤＲ
ＨＣＤＲ１：GYSFTGYT（配列番号１５）
ＨＣＤＲ２：INPYNAGT （配列番号１６）
ＨＣＤＲ３：ARSEYRYGGDYFDY （配列番号１７）
ＬＣＤＲ１：QSLLNSSNQKNY （配列番号１８）
ＬＣＤＲ２：FAS （配列番号１９）
ＬＣＤＲ３：QQHYDTPYT （配列番号２０）。
ＨＣＤＲ１：GYSFTGYT（配列番号１５）
ＨＣＤＲ２：INPYNAGT （配列番号１６）
ＨＣＤＲ３：ARSEYRYGGDYFDY （配列番号１７）
ＬＣＤＲ１：QSLLNSSNQKNY （配列番号１８）
ＬＣＤＲ２：FAS （配列番号１９）
ＬＣＤＲ３：QQHYDTPYT （配列番号２０）。
【0148】
ＣＰＩ－００６重鎖のアミノ酸配列：（配列番号２１）
QVQLVQSGAEVEKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPGSGNTNYNEKFKTRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAKEGGLTTEDYALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
QVQLVQSGAEVEKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPGSGNTNYNEKFKTRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAKEGGLTTEDYALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【0149】
ＣＰＩ－００６軽鎖のアミノ酸配列：（配列番号２２）
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKNVSTSGYSYMHWYQQKPGQAPRLLIYLASNLESGIPPRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCQHSRELPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKNVSTSGYSYMHWYQQKPGQAPRLLIYLASNLESGIPPRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCQHSRELPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【0150】
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）重鎖の全長アミノ酸配列（配列番号２３）
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQNLEWIGLINPYNAGTSYNQKFQGKVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEYRYGGDYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQNLEWIGLINPYNAGTSYNQKFQGKVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEYRYGGDYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【0151】
１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）軽鎖の全長アミノ酸配列：（配列番号２４）
DIVMTQSPSSLAVSVGERVTISCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQAPKLLIYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYDTPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
注：下線部分はＣＤＲ配列を表す。
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注：下線部分はＣＤＲ配列を表す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】