特表 2023-538519 ＡＡＶベクターを使用したプラコフィリン－２（ＰＫＰ２）遺伝子治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-08

(54)【発明の名称】ＡＡＶベクターを使用したプラコフィリン－２（ＰＫＰ２）遺伝子治療

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20230901BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230901BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230901BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230901BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20230901BHJP

   A61P 9/06 20060101ALI20230901BHJP

   A61K 38/17 20060101ALN20230901BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C12N15/864 100Z

A61K35/76

A61K48/00

A61P9/04

A61P9/06

A61K38/17

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023507876

(86)(22)【出願日】2021-08-09

(85)【翻訳文提出日】2023-03-14

(86)【国際出願番号】 US2021045220

(87)【国際公開番号】W WO2022032226

(87)【国際公開日】2022-02-10

(31)【優先権主張番号】63/063,032

(32)【優先日】2020-08-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521067485

【氏名又は名称】スペースクラフト セブン リミテッド ライアビリティ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ハーツォグ クリストファー ディーン

(72)【発明者】

【氏名】サクラメント チェスター ビッテンコート

(72)【発明者】

【氏名】プラバカール ラジ

(72)【発明者】

【氏名】リックス デイビッド

【テーマコード（参考）】

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084MA17

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA36

4C084ZA37

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087MA17

4C087MA65

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA36

4C087ZA37

(57)【要約】

例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用した、ＰＫＰ２（プラコフィリン－２）の遺伝子治療を本明細書において提供する。ベクターのプロモーターは、ＭＨＣＫ７プロモーターまたは心筋トロポニンＴ（ＨＴＮＮＴ２）プロモーターであり得る。キャプシドは、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ７４キャプシドまたはその機能的バリアントであり得る。他のプロモーターまたはキャプシドを使用してもよい。さらに、治療方法、例えば静脈内、冠動脈内、頸動脈内、または心臓内のｒＡＡＶベクターの投与による治療方法、ならびに他の組成物および方法も提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

発現カセット、および
任意で、隣接するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）
を含む、ポリヌクレオチドであって、
プロモーターに動作可能に連結された、プラコフィリン－２（ＰＫＰ２）またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列
を含む、前記ポリヌクレオチド。

【請求項2】

前記プロモーターが心臓特異的プロモーターである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項3】

前記プロモーターが筋特異的プロモーターである、請求項１または請求項２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

前記プロモーターが心筋細胞特異的プロモーターである、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項5】

前記プロモーターがミオシン重鎖クレアチンキナーゼ７（ＭＨＣＫ７）プロモーターである、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項6】

前記ＭＨＣＫ７プロモーターが、配列番号３１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項7】

前記プロモーターが心筋トロポニンＴ（ｈＴＮＮＴ２）プロモーターである、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項8】

前記ｈＴＮＮＴ２プロモーターが、配列番号３２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項9】

前記発現カセットが、心筋トロポニンＴ（ｈＴＮＮＴ２）遺伝子のエクソン１を含み、
任意で、前記ｈＴＮＮＴ２プロモーターおよびエクソン１が一緒に、配列番号３２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、
請求項１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項10】

前記プロモーターがユビキタスプロモーター、任意でＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーターである、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項11】

前記発現カセットがポリＡシグナルを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項12】

前記ポリＡシグナルがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡである、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項13】

前記発現カセットが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、任意でＷＰＲＥ（ｘ）を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項14】

前記プラコフィリン－２（ＰＫＰ２）またはその機能的バリアントがＰＫＰ２である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項15】

前記ＰＫＰ２が機能的ＰＫＰ２である、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項16】

前記ＰＫＰ２がヒトＰＫＰ２である、請求項１４または請求項１５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項17】

前記ＰＫＰ２がＰＫＰ２アイソフォームＡである、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項18】

前記ＰＫＰ２アイソフォームＡが、配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項19】

前記ＰＫＰ２がＰＫＰ２アイソフォームＢである、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項20】

前記ＰＫＰ２が、配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項21】

ＰＫＰ２をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトＰＫＰ２ポリヌクレオチドである、請求項１～２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項22】

ＰＫＰ２をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項23】

ＰＫＰ２をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項24】

少なくとも約４．０ｋｂ、少なくとも約４．１ｋｂ、少なくとも約４．２ｋｂ、少なくとも約４．３ｋｂ、少なくとも約４．４ｋｂ、または少なくとも約４．５ｋｂを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項25】

最大で約４．１ｋｂ、最大で約４．２ｋｂ、最大で約４．３ｋｂ、最大で約４．４ｋｂ、最大で約４．５ｋｂ、または最大で約４．６ｋｂを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項26】

４．０ｋｂ～４．６ｋｂ、４．０ｋｂ～４．５ｋｂ、または４．０ｋｂ～４．４ｋｂを含むか、あるいは４．０ｋｂ～４．３ｋｂ、４．０ｋｂ～４．２ｋｂ、または４．０ｋｂ～４．１ｋｂを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項27】

前記ＰＫＰ２またはその機能的バリアントが、少なくとも８００個または少なくとも８３０個のアミノ酸を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項28】

配列番号８～１５のいずれか一つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項29】

前記発現カセットが、５’および３’の逆位末端反復（ＩＴＲ）によって隣接されている、請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項30】

前記ＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲであり、および／または
前記ＩＴＲが、配列番号２０～２６のいずれか一つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、
請求項２９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項31】

請求項１～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子治療ベクター。

【請求項32】

前記遺伝子治療ベクターが組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項３１に記載のベクター。

【請求項33】

前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９またはその機能的バリアントである、請求項３２に記載のベクター。

【請求項34】

前記ｒＡＡＶベクターが、配列番号７７のいずれか一つと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む、請求項３３に記載のベクター。

【請求項35】

前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ１０またはその機能的バリアントである、請求項３２に記載のベクター。

【請求項36】

前記ｒＡＡＶベクターが、配列番号７９のいずれか一つと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む、請求項３５に記載のベクター。

【請求項37】

前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ６またはその機能的バリアントである、請求項３２に記載のベクター。

【請求項38】

前記ｒＡＡＶベクターが、配列番号７８のいずれか一つと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む、請求項３７に記載のベクター。

【請求項39】

前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ７４またはその機能的バリアントである、請求項３８に記載のベクター。

【請求項40】

前記ｒＡＡＶベクターが、配列番号８０のいずれか一つと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む、請求項３９に記載のベクター。

【請求項41】

それを必要とする対象において疾患または障害を治療および／または予防する方法であって、請求項３１～４０のいずれか一項に記載のベクターを前記対象に投与する工程を含む、前記方法。

【請求項42】

前記疾患または障害が心障害である、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記疾患または障害が心筋症である、請求項４１または４２に記載の方法。

【請求項44】

前記心筋症が、不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記心筋症が、肥大型心筋症または拡張型心筋症である、請求項４３に記載の方法。

【請求項46】

前記疾患または障害が、心筋の線維脂肪性浸潤によって特徴付けられる、請求項４１に記載の方法。

【請求項47】

前記疾患または障害が心不全である、請求項４１または４２に記載の方法。

【請求項48】

前記対象が哺乳動物である、請求項４１～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記対象が霊長類である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記対象がヒトである、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記対象がＰＲＰ２遺伝子に変異を有する、請求項４１～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記ベクターが、静脈内注射、心臓内注射、心臓内注入、および／または心臓カテーテル法により投与される、請求項４１～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記投与が、ＰＫＰ２発現を少なくとも約５％増加させる、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記投与が、ＰＫＰ２発現を少なくとも約３０％増加させる、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記投与が、ＰＫＰ２発現を少なくとも約７０％増加させる、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記投与が、ＰＫＰ２発現を約５％～約１０％増加させる、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記投与が、ＰＫＰ２発現を約３０％～約５０％増加させる、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記投与が、ＰＫＰ２発現を約５０％～約７０％増加させる、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記投与が、ＰＫＰ２発現を約７０％～約１００％増加させる、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記疾患または障害を治療および／または予防する、請求項４１～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

有効量の前記ベクターを投与する工程を含む、請求項４１～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記疾患または障害が、前記対象のＰＫＰ２の機能喪失に関連するかまたはそれにより引き起こされる、請求項４１～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記疾患または障害が、前記対象のＰＫＰ２の機能獲得に関連するかまたはそれにより引き起こされる、請求項４１～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記対象が、
配列番号２の配列を有するヒトＰＫＰ２をコードするヒトＰＫＰ２遺伝子に対して、ｐ．Ａｒｇ４９０Ｔｒｐ、Ａｓｐ２６Ａｓｎ、Ｔｈｒ５０＿Ｖａｌ５１ＳｅｒｆｓＸ６０、Ａｒｇ７９Ｘ、Ｔｙｒ８６Ｘ、Ｇｌｎ１３３Ｘ、Ｖａｌ４０６ＳｅｒｆｓＸ３、Ｔｙｒ６１６Ｘ、Ｔｒｐ６７６Ｘ、Ｃｙｓ７９６Ａｒｇ、Ｃｙｓ７９６Ｅ、Ｔｙｒ８０７Ｘ、Ｇｌｕ６２Ｌｙｓ、Ｓ６８８Ｐ、Ｔｒｐ８４８Ｘ、Ｙ８６Ｘ、Ｖ４０６Ｘ、Ｙ６１６Ｘ、Ｗ８４８Ｘ、およびＹ８０７Ｘから選択されるアミノ酸置換を引き起こす変異
を有する、請求項４１～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

有効量の前記ベクターを含む医薬組成物を投与する工程を含む、請求項４１～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

約１×１０^１１ベクターゲノムから約１×１０^１３ベクターゲノムのベクターを前記対象に投与する工程、約１×１０^１２ベクターゲノムから約１×１０^１４ベクターゲノムのベクターを前記対象に投与する工程、または約１×１０^１３ベクターゲノムから約１×１０^１５ベクターゲノムのベクターを前記対象に投与する工程を含む、請求項４１～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

請求項３１～４０のいずれか一項に記載のベクターを含む、医薬組成物。

【請求項68】

請求項３１～４０のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項６８に記載の医薬組成物および任意で使用説明書を含む、キット。

【請求項69】

任意で請求項４１～６６のいずれか一項に記載の方法による、疾患または障害の治療における請求項３１～４０のいずれか一項に記載のベクターの使用。

【請求項70】

任意で請求項４１～６６のいずれか一項に記載の方法による、疾患または障害の治療における使用のための請求項３１～４０のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項71】

配列番号１２～１５および８９～９２のいずれか一つまたは配列番号８～１１および９３～９６のいずれか一つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項72】

前記プロモーターがＭＨＣＫ７プロモーターである、請求項７１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項73】

前記ＭＨＣＫ７プロモーターが、配列番号３１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項７２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項74】

前記ＰＫＰ２がヒトＰＫＰ２である、請求項７１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項75】

前記ＰＫＰ２がＰＫＰ２アイソフォームＡである、請求項７４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項76】

前記ＰＫＰ２アイソフォームＡが、配列番号１と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項７５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項77】

請求項７１～７６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子治療ベクター。

【請求項78】

前記遺伝子治療ベクターが組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項７７に記載のベクター。

【請求項79】

前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９ベクターである、請求項７８に記載のベクター。

【請求項80】

前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ７４ベクターである、請求項７８に記載のベクター。

【請求項81】

ＰＲＰ２遺伝子に変異を有すると特定された対象において心障害を治療および／または予防する方法であって、請求項７７～８０のいずれか一項に記載のベクターを前記対象に投与する工程を含む、前記方法。

【請求項82】

前記心障害が、心筋症、任意で不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）、肥大型心筋症、または拡張型心筋症である、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記心障害が心不全である、請求項８１に記載の方法。

【請求項84】

前記対象が哺乳動物である、請求項８１～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記ベクターが、静脈内注射、心臓内注射、心臓内注入、および／または心臓カテーテル法により投与される、請求項８１～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

左心室駆出率（ＬＶＥＦ％）の減少を、ＰＲＰ２遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された減少と比較して任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する、請求項８１～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

左心室短縮率（ＦＳ％）の減少を、ＰＲＰ２遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された減少と比較して任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する、請求項８１～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

平方ミリメートル単位の右心室面積（ＲＶ面積（ｍｍ２））の増加を、ＰＲＰ２遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された増加と比較して任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する、請求項８１～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

毎秒ミリメートル単位の右心室速度時間積分（ＲＶ ＶＴＩ（ｍｍ／秒））の減少を、ＰＲＰ２遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された減少と比較して任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する、請求項８１～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

左心室または右心室の線維症の増加を、ＰＲＰ２遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された増加と比較して任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する、請求項８１～８９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月７日に出願された米国仮特許出願第６３／０６３，０３２号に対する優先権の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＲＯＰＡ＿０２１＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは約２１２ＫＢで、２０２１年８月８日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。

【背景技術】

【0003】

背景
不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）は、成人発症型心疾患の一種であり、１，０００人に１人から１，２５０人に１人が罹患すると推定される。心臓の筋肉壁（心筋）が経時的に破壊され、これにより、異常な心拍（不整脈）のリスクが上昇し、罹患した個人が激しい運動をすると突然死するリスクが高まることが明らかである。患者にはまた、心臓の不規則な鼓動またはドキドキ感（動悸）、ふらつき、失神（卒倒）、息切れ、脚または腹部の異常な腫脹も起こる。経時的に、ＡＲＶＣは心不全につながる可能性がある。

【0004】

少なくとも１３個の遺伝子がＡＲＶＣに関与しており、その多くが、細胞間に強い接着をもたらす細胞内接合部である、デスモソームの生合成に関与している。デスモソームが適切に形成されない場合、心筋細胞は互いに分離して死に至る場合がある。特に右心室は衰弱し、脂肪沈着物および瘢痕組織が損傷した心筋に取って代わり、右心室の膨張につながる場合がある。これらの変化は、最終的に効果的な心臓ポンプを妨げ、心拍を制御する電気信号を混乱させ、不整脈につながる。常染色体優性プラコフィリン－２（ＰＫＰ２）心筋症は、ＰＫＰ２に影響を及ぼす変異が検出される遺伝性ＡＲＶＣである。

【0005】

したがって、ＡＲＶＣを含むＰＫＰ２関連の疾患および障害の治療に対するアンメットニーズが当技術分野に残されている。本明細書に開示される組成物および方法は、この必要性に対処する。

【発明の概要】

【0006】

概要
本発明は、概して、ＰＫＰ２を発現するベクターまたはその機能的バリアントを使用した、疾患または障害、例えば、心疾患または心障害のための遺伝子治療に関する。

【0007】

一態様では、本開示は、発現カセット、および任意で、隣接するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むポリヌクレオチドであって、プロモーターに動作可能に連結された、プラコフィリン－２（ＰＫＰ２）またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。

【0008】

一部の実施形態では、プロモーターは、心臓特異的プロモーターである。

【0009】

一部の実施形態では、プロモーターは、筋特異的プロモーターである。

【0010】

一部の実施形態では、プロモーターは、心筋細胞特異的プロモーターである。

【0011】

一部の実施形態では、プロモーターは、ミオシン重鎖クレアチンキナーゼ７（ＭＨＣＫ７）プロモーターである。

【0012】

一部の実施形態では、ＭＨＣＫ７プロモーターは、配列番号３１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。

【0013】

一部の実施形態では、プロモーターは、心筋トロポニンＴ（ｈＴＮＮＴ２）プロモーターである。

【0014】

一部の実施形態では、ｈＴＮＮＴ２プロモーターは、配列番号３２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。

【0015】

一部の実施形態では、発現カセットは、心筋トロポニンＴ（ｈＴＮＮＴ２）遺伝子のエクソン１を含み、任意で、ｈＴＮＮＴ２プロモーターおよびエクソン１は一緒に、配列番号３２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を共有する。

【0016】

一部の実施形態では、プロモーターはユビキタスプロモーター、任意でＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーターである。

【0017】

一部の実施形態では、発現カセットは、ポリＡシグナルを含む。

【0018】

一部の実施形態では、ポリＡシグナルは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡである。

【0019】

一部の実施形態では、発現カセットは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、任意でＷＰＲＥ（ｘ）を含む。

【0020】

一部の実施形態では、プラコフィリン－２（ＰＫＰ２）またはその機能的バリアントは、ＰＫＰ２である。

【0021】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２は機能的ＰＫＰ２である。

【0022】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２はヒトＰＫＰ２である。

【0023】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２は、ＰＫＰ２アイソフォームＡである。

【0024】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２アイソフォームＡは、配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。

【0025】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２は、ＰＫＰ２アイソフォームＢである。

【0026】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２は、配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。

【0027】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２をコードするポリヌクレオチド配列は、ヒトＰＫＰ２ポリヌクレオチドである。

【0028】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。

【0029】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。

【0030】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは少なくとも約４．０ｋｂ、少なくとも約４．１ｋｂ、少なくとも約４．２ｋｂ、少なくとも約４．３ｋｂ、少なくとも約４．４ｋｂ、または少なくとも約４．５ｋｂを含む。

【0031】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、最大で約４．１ｋｂ、最大で約４．２ｋｂ、最大で約４．３ｋｂ、最大で約４．４ｋｂ、最大で約４．５ｋｂ、または最大で約４．６ｋｂを含む。

【0032】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、４．０ｋｂ～４．６ｋｂ、４．０ｋｂ～４．５ｋｂ、または４．０ｋｂ～４．４ｋｂを含むか、あるいはポリヌクレオチドは、４．０ｋｂ～４．３ｋｂ、４．０ｋｂ～４．２ｋｂ、または４．０ｋｂ～４．１ｋｂを含む。

【0033】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２またはその機能的バリアントは、少なくとも８００個または少なくとも８３０個のアミノ酸を含む。

【0034】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号８～１５のいずれか一つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。

【0035】

一部の実施形態では、発現カセットは、５’および３’の逆位末端反復（ＩＴＲ）によって隣接されている。

【0036】

一部の実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶ２ ＩＴＲであり、および／またはＩＴＲは、配列番号２０～２６のいずれか一つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。

【0037】

別の態様では、本開示は、前述の実施形態のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子治療ベクターを提供する。

【0038】

一部の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。

【0039】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９またはその機能的バリアントである。

【0040】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号７７のいずれか一つと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む。

【0041】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｈ１０またはその機能的バリアントである。

【0042】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号７９のいずれか一つと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む。

【0043】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６またはその機能的バリアントである。

【0044】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号７８のいずれか一つと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む。

【0045】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｈ７４またはその機能的バリアントである。

【0046】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号８０のいずれか一つと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む。

【0047】

別の態様では、本開示は、それを必要とする対象において疾患または障害を治療および／または予防する方法であって、前述の実施形態のいずれか一つに記載のベクターを対象に投与する工程を含む、方法を提供する。

【0048】

一部の実施形態では、疾患または障害は、心障害である。

【0049】

一部の実施形態では、疾患または障害は、心筋症である。

【0050】

一部の実施形態では、心筋症は、不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）である。

【0051】

一部の実施形態では、心筋症は、肥大型心筋症または拡張型心筋症である。

【0052】

一部の実施形態では、疾患または障害は、心筋の線維脂肪性浸潤によって特徴付けられる。

【0053】

一部の実施形態では、疾患または障害は心不全である。

【0054】

一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。

【0055】

一部の実施形態では、対象は霊長類である。

【0056】

一部の実施形態では、対象はヒトである。

【0057】

一部の実施形態では、対象は、ＰＲＰ２遺伝子に変異を有する。

【0058】

一部の実施形態では、ベクターは、静脈内注射、心臓内注射、心臓内注入、および／または心臓カテーテル法により投与される。

【0059】

一部の実施形態では、投与は、ＰＫＰ２発現を少なくとも約５％増加させる。

【0060】

一部の実施形態では、投与は、ＰＫＰ２発現を少なくとも約３０％増加させる。

【0061】

一部の実施形態では、投与は、ＰＫＰ２発現を少なくとも約７０％増加させる。

【0062】

一部の実施形態では、投与は、ＰＫＰ２発現を約５％～約１０％増加させる。

【0063】

一部の実施形態では、投与は、ＰＫＰ２発現を約３０％～約５０％増加させる。

【0064】

一部の実施形態では、投与は、ＰＫＰ２発現を約５０％～約７０％増加させる。

【0065】

一部の実施形態では、投与は、ＰＫＰ２発現を約７０％～約１００％増加させる。

【0066】

一部の実施形態では、本方法は、疾患または障害を治療および／または予防する。

【0067】

一部の実施形態では、本方法は、有効量のベクターを投与する工程を含む。

【0068】

一部の実施形態では、疾患または障害は、対象のＰＫＰ２の機能喪失に関連するかまたはそれにより引き起こされる。

【0069】

一部の実施形態では、疾患または障害は、対象のＰＫＰ２の機能獲得に関連するかまたはそれにより引き起こされる。

【0070】

一部の実施形態では、対象は、配列番号２の配列を有するヒトＰＫＰ２をコードするヒトＰＫＰ２遺伝子に対して、ｐ．Ａｒｇ４９０Ｔｒｐ、Ａｓｐ２６Ａｓｎ、Ｔｈｒ５０＿Ｖａｌ５１ＳｅｒｆｓＸ６０、Ａｒｇ７９Ｘ、Ｔｙｒ８６Ｘ、Ｇｌｎ１３３Ｘ、Ｖａｌ４０６ＳｅｒｆｓＸ３、Ｔｙｒ６１６Ｘ、Ｔｒｐ６７６Ｘ、Ｃｙｓ７９６Ａｒｇ、Ｃｙｓ７９６Ｅ、Ｔｙｒ８０７Ｘ、Ｇｌｕ６２Ｌｙｓ、Ｓ６８８Ｐ、Ｔｒｐ８４８Ｘ、Ｙ８６Ｘ、Ｖ４０６Ｘ、Ｙ６１６Ｘ、Ｗ８４８Ｘ、およびＹ８０７Ｘから選択されるアミノ酸置換を引き起こす変異を有する。

【0071】

一部の実施形態では、本方法は、有効量のベクターを含む医薬組成物を投与する工程を含む。

【0072】

一部の実施形態では、本方法は、約１×１０^１１ベクターゲノムから約１×１０^１３ベクターゲノムのベクターを対象に投与する工程、約１×１０^１２ベクターゲノムから約１×１０^１４ベクターゲノムのベクターを対象に投与する工程、または約１×１０^１３ベクターゲノムから約１×１０^１５ベクターゲノムのベクターを対象に投与する工程を含む。

【0073】

別の態様では、本開示は、前述の実施形態のいずれか一つに記載のベクターを含む、医薬組成物を提供する。

【0074】

別の態様では、本開示は、前述の実施形態のいずれか一つに記載のベクターまたは前述の実施形態に記載の医薬組成物および任意で使用説明書を含むキットを提供する。

【0075】

別の態様では、本開示は、任意で前述の実施形態のいずれか一つに記載の方法による、疾患または障害の治療における前述の実施形態のいずれか一つに記載のベクターの使用を提供する。

【0076】

別の態様では、本開示は、任意で前述の実施形態のいずれか一つに記載の方法による、疾患または障害の治療における使用のための前述の実施形態のいずれか一つに記載のベクターを提供する。

【0077】

別の態様では、本開示は、配列番号１２～１５および８９～９２のいずれか一つまたは配列番号８～１１および９３～９６のいずれか一つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。

【0078】

一部の実施形態では、プロモーターは、ＭＨＣＫ７プロモーターである。

【0079】

一部の実施形態では、ＭＨＣＫ７プロモーターは、配列番号３１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。

【0080】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２はヒトＰＫＰ２である。

【0081】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２は、ＰＫＰ２アイソフォームＡである。

【0082】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２アイソフォームＡは、配列番号１と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を共有する。

【0083】

別の態様では、本開示は、前述の実施形態のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子治療ベクターを提供する。

【0084】

一部の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。

【0085】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ９ベクターである。

【0086】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶｒｈ７４ベクターである。

【0087】

別の態様では、本開示は、ＰＲＰ２遺伝子に変異を有すると特定された対象において心障害を治療および／または予防する方法であって、前述の実施形態のいずれか一つに記載のベクターを対象に投与する工程を含む、方法を提供する。

【0088】

一部の実施形態では、心障害は、心筋症、任意で不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）、肥大型心筋症、または拡張型心筋症である。

【0089】

一部の実施形態では、心障害は心不全である。

【0090】

一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。

【0091】

一部の実施形態では、ベクターは、静脈内注射、心臓内注射、心臓内注入、および／または心臓カテーテル法により投与される。

【0092】

一部の実施形態では、本方法は、左心室駆出率（ＬＶＥＦ％）の減少を、ＰＲＰ２遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された減少と比較して任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する。

【0093】

一部の実施形態では、本方法は、左心室短縮率（ＦＳ％）の減少を、ＰＲＰ２遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された減少と比較して任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する。

【0094】

一部の実施形態では、本方法は、平方ミリメートル単位の右心室面積（ＲＶ面積（ｍｍ２））の増加を、ＰＲＰ２遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された増加と比較して任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する。

【0095】

一部の実施形態では、本方法は、毎秒ミリメートル単位の右心室速度時間積分（ＲＶ ＶＴＩ（ｍｍ／秒））の減少を、ＰＲＰ２遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された減少と比較して任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する。

【0096】

一部の実施形態では、本方法は、左心室または右心室の線維症の増加を、ＰＲＰ２遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された増加と比較して任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する。

【0097】

様々な他の態様および実施形態が、以下の詳細な説明に開示されている。本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

【図面の簡単な説明】

【0098】

【図1】図１は、ベクターゲノムの非限定的な例を表す図を示す。ベクターゲノムの完全なポリヌクレオチド配列は、配列番号１２である。発現カセットは配列番号８である。本明細書に記載のＭＨＣＫ７プロモーターは、図中「エンハンサー／ＭＨＣＫ７」と表示されている。

【図2】図２は、ベクターゲノムの非限定的な例を表す図を示す。ベクターゲノムの完全なポリヌクレオチド配列は、配列番号１３である。発現カセットは配列番号９である。

【図3】図３は、ベクターゲノムの非限定的な例を表す図を示す。ベクターゲノムの完全なポリヌクレオチド配列は、配列番号１４である。発現カセットは配列番号１０である。本明細書に記載のＭＨＣＫ７プロモーターは、図中「エンハンサー／ＭＨＣＫ７」と表示されている。

【図4】図４は、ベクターゲノムの非限定的な例を表す図を示す。ベクターゲノムの完全なポリヌクレオチド配列は、配列番号１５である。発現カセットは配列番号１１である。

【図5】図５Ａ～図５Ｂは、形質導入された分化ＡＣ１６細胞におけるＰＫＰ２タンパク質の発現を示す。図５Ａは、ＰＫＰ２（上パネル）またはローディングコントロールであるＧＡＰＤＨ（下パネル）のウェスタンブロット（ＷＢ）を示す。図５Ｂは、ウェスタンブロットの棒グラフを示す。ＡＡＶベクター血清型（ＡＡＶ９またはｒｈ７４）およびプロモーター（ＭＨＣＫ７またはｈＴｎＴ）が記録される。対照には、ＧＦＰベクター（ＣＯＮ－ＧＦＰ）および形質導入なし（Ｔｄｘｎなし）が含まれていた。

【図6】図６Ａ～図６Ｄは、正常なマウス（左の棒）、未処置ＰＫＰ２ノックアウトマウス（真ん中の棒、ｃＫＯ ＰＫＰ２）、または処置されたマウス（右の棒）に対する左心室駆出率（ＬＶＥＦ％）を示す。図６Ａは、ＡＡＶ９ベクターおよびＭＨＣＫ７プロモーター（ＡＡＶ９－ＭＨＣＫ７）を用いた結果を示す。図６Ｂは、ＡＡＶｒｈ．７４ベクターおよびＭＨＣＫ７プロモーター（ＡＡＶｒｈ．７４－ＭＨＣＫ７）を用いた結果を示す。図６Ｃは、ＡＡＶ９ベクターおよびｈＴｎＴプロモーター（ＡＡＶ９－ｈＴｎＴ）を用いた結果を示す。図６Ｄは、ＡＡＶｒｈ．７４ベクターおよびｈＴｎＴプロモーター（ＡＡＶｒｈ．７４－ｈＴｎＴ）を用いた結果を示す。

【図7】図７Ａ～図７Ｄは、正常なマウス（左の棒）、未処置ＰＫＰ２ノックアウトマウス（真ん中の棒、ｃＫＯ ＰＫＰ２）、または処置されたマウス（右の棒）に対する左心室短縮率（ＦＳ％）を示す。図７Ａは、ＡＡＶ９ベクターおよびＭＨＣＫ７プロモーター（ＡＡＶ９－ＭＨＣＫ７）を用いた結果を示す。図７Ｂは、ＡＡＶｒｈ．７４ベクターおよびＭＨＣＫ７プロモーター（ＡＡＶｒｈ．７４－ＭＨＣＫ７）を用いた結果を示す。図７Ｃは、ＡＡＶ９ベクターおよびｈＴｎＴプロモーター（ＡＡＶ９－ｈＴｎＴ）を用いた結果を示す。図７Ｄは、ＡＡＶｒｈ．７４ベクターおよびｈＴｎＴプロモーター（ＡＡＶｒｈ．７４－ｈＴｎＴ）を用いた結果を示す。

【図8】図８Ａ～図８Ｄは、正常なマウス（左の棒）、未処置ＰＫＰ２ノックアウトマウス（真ん中の棒、ｃＫＯ ＰＫＰ２）、または処置されたマウス（右の棒）の右心室面積を平方ミリメートル（ＲＶ面積（ｍｍ^２））で示す。図８Ａは、ＡＡＶ９ベクターおよびＭＨＣＫ７プロモーター（ＡＡＶ９－ＭＨＣＫ７）を用いた結果を示す。図８Ｂは、ＡＡＶｒｈ．７４ベクターおよびＭＨＣＫ７プロモーター（ＡＡＶｒｈ．７４－ＭＨＣＫ７）を用いた結果を示す。図８Ｃは、ＡＡＶ９ベクターおよびｈＴｎＴプロモーター（ＡＡＶ９－ｈＴｎＴ）を用いた結果を示す。図８Ｄは、ＡＡＶｒｈ．７４ベクターおよびｈＴｎＴプロモーター（ＡＡＶｒｈ．７４－ｈＴｎＴ）を用いた結果を示す。

【図9】図９Ａ～図９Ｄは、正常なマウス（左の棒）、未処置ＰＫＰ２ノックアウトマウス（真ん中の棒、ｃＫＯ ＰＫＰ２）、または処置されたマウス（右の棒）について、右心室速度時間積分を毎秒ミリメートル（ＲＶ ＶＴＩ（ｍｍ／秒））で示す。図９Ａは、ＡＡＶ９ベクターおよびＭＨＣＫ７プロモーター（ＡＡＶ９－ＭＨＣＫ７）を用いた結果を示す。図９Ｂは、ＡＡＶｒｈ．７４ベクターおよびＭＨＣＫ７プロモーター（ＡＡＶｒｈ．７４－ＭＨＣＫ７）を用いた結果を示す。図９Ｃは、ＡＡＶ９ベクターおよびｈＴｎＴプロモーター（ＡＡＶ９－ｈＴｎＴ）を用いた結果を示す。図９Ｄは、ＡＡＶｒｈ．７４ベクターおよびｈＴｎＴプロモーター（ＡＡＶｒｈ．７４－ｈＴｎＴ）を用いた結果を示す。

【図10】図１０Ａ～図１０Ｂは、心臓のトリクローム組織学的染色後のパーセントコラーゲンの定量化に基づく、左心室および右心室における線維症の程度を示す。条件付きＰＫＰ２遺伝子ノックアウトのない対照動物（Ｃｒｅ Ｎｅｇ群）は、コラーゲンがほとんどないことが見出され、製剤緩衝液を受けている対照ＰＫＰ２ノックアウト動物（ＣＫＯ ＦＢ群）は、左右両方の心室において、コラーゲンの実質的に高い割合を有することが見出された。ＡＡＶを介したＰＫＰ２の過剰発現は、すべてのＡＡＶ注射群で様々な程度のコラーゲンの強力な減衰をもたらした〔全群でｎ＝４；ｐ値は、ボンフェローニ事後分析による一元配置分散分析の結果を反映する〕。図１０Ａは、左心室のパーセントコラーゲンの棒グラフである。図１０Ｂは、右心室のパーセントコラーゲンの棒グラフである。

【図11】図１１は、ベクターゲノムの非限定的な例を表す図を示す。ベクターゲノムの完全なポリヌクレオチド配列は、配列番号８９である。発現カセットは配列番号９３である。本明細書に記載のＭＨＣＫ７プロモーターは、図中「エンハンサー／ＭＨＣＫ７」と表示されている。

【図12】図１２は、ベクターゲノムの非限定的な例を表す図を示す。ベクターゲノムの完全なポリヌクレオチド配列は、配列番号９０である。発現カセットは配列番号９４である。

【図13】図１３は、ベクターゲノムの非限定的な例を表す図を示す。ベクターゲノムの完全なポリヌクレオチド配列は、配列番号９１である。発現カセットは配列番号９５である。本明細書に記載のＭＨＣＫ７プロモーターは、図中「エンハンサー／ＭＨＣＫ７」と表示されている。

【図14】図１４は、ベクターゲノムの非限定的な例を表す図を示す。ベクターゲノムの完全なポリヌクレオチド配列は、配列番号９２である。発現カセットは配列番号９６である。

【発明を実施するための形態】

【0099】

発明の詳細な説明
本開示は、ＰＫＰ２ポリペプチドまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドを送達するＰＫＰ２用の遺伝子治療ベクターを、使用方法、ならびに他の組成物および方法と共に提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＰＫＰ２ポリペプチドまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたプロモーター配列を含む、遺伝子治療ベクターに関する。一部の実施形態では、プロモーターは、ミオシン重鎖クレアチンキナーゼ７（ＭＨＣＫ７）プロモーターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ９ベクターである。一部の実施形態では、プロモーターはＭＨＣＫ７プロモーターであり、ＡＡＶベクターはＡＡＶ９ベクターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ｈＴＮＮＴ２プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターはｈＴＮＮＴ２プロモーターであり、ＡＡＶベクターはＡＡＶ９ベクターである。一部の実施形態では、ＰＫＰ２はヒトＰＫＰ２ａである。一部の実施形態では、ＰＫＰ２はヒトＰＫＰ２ｂである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターはｒｈ７４ベクターである。一部の実施形態では、プロモーターはＭＨＣＫ７プロモーターであり、ＡＡＶベクターはｒｈ７４ベクターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ｈＴＮＮＴ２プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターはｈＴＮＮＴ２プロモーターであり、ＡＡＶベクターはｒｈ７４ベクターである。一部の実施形態では、ＰＫＰ２はヒトＰＫＰ２ａである。一部の実施形態では、ＰＫＰ２はヒトＰＫＰ２ｂである。

【0100】

本開示はさらに、本開示の遺伝子治療ベクターを対象に投与することによって、対象における障害または障害を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、障害または障害は、不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）である。

【0101】

特定の実施形態では、治療される対象は、ＰＫＰ２遺伝子中に一つまたは複数の変異を有するＡＲＶＣ患者である。ＡＲＶＣ患者の半数以上が、タンパク質プラコフィリン－２（ＰＫＰ２）をコードするデスモソーム遺伝子ＰＫＰ２において変異を保有している。ＰＫＰ２は、ブルガダ症候群（ＢｒＳ）および特発性心室細動とも関連している。これは、アルマジロリピートおよびプラコフィリンタンパク質ファミリーのメンバーである。タンパク質は、Ｎ末端ドメインおよびＣ末端ドメインに隣接した九つの中央で保存されたアルマジロリピートドメインを含有する。カドヘリンを細胞骨格内の中間フィラメントに連結させる働きをする。

【0102】

プラコフィリン２は、細胞デスモソームおよび核に局在し、プラコグロビン、デスモプラキン、およびデスモソームカドヘリンを、Ｎ末端頭部ドメインを介して結合する。ＰＫＰ２は、細胞間接触を促進するデスモソーム中間フィラメントアセンブリに横方向の安定化力を提供する。また、細胞内シグナル伝達調節、電気生理学的および輸送調節、ならびに転写プロセスの制御における役割も果たす可能性がある。

【0103】

野生型マウスの心臓にＰＫＰ２ａのＣ末端欠失変異体（Ｒ７３５Ｘ）をコードするＡＡＶ９ベクターを静脈内注射すると、処置したマウスが運動訓練を受けると、ＡＲＶＣの出現が加速される。Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．６５（１４）：１４３８－５０（２０１５）を参照されたい。変異ＰＫＰ２ａは疾患の表現型を引き起こし、非変異ＰＫＰ２ａを発現するコントロールＡＡＶ９ベクターは、野生型マウスで表現型の変化を引き起こさない。野生型ヒトＰＫＰ２ａの異種発現は、疾患または機能変化をしない。これらの研究は、変異型ＰＫＰ２ａが疾患の表現型を引き起こす可能性があることを実証している。非変異ＰＫＰ２の異種発現は、野生型マウスにおいて表現型の変化をもたらさなかったため、ＰＫＰ２の治癒的役割を実証できなかった。

【0104】

本発明によれば、ＰＫＰ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドであって、ＰＫＰ２またはその機能的バリアントが、少なくとも８００または少なくとも８３０のアミノ酸を含む（例えば、Ａｒｇ－７３５ではＣ末端切断なし）ポリヌクレオチドは、遺伝子治療ベクターの生成に用いられ得る。結果として生じるベクターは、例えば、ＡＲＶＣ、ブルガダ症候群（ＢｒＳ）、特発性心室細動、拡張型心筋症（ＤＣＭ）などの例えば、ＰＫＰ２－関連疾患または障害などの疾患または障害の治療に使用され得る。

【0105】

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関連する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施において使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書に記載されたすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先される。さらに、本明細書に記載される材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。

【0106】

本明細書に記載されるすべての刊行物および特許は、それぞれの個々の刊行物または特許が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書の任意の定義を含めて本出願が優先される。しかしながら、本明細書に引用される任意の参照文献、記事、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、有効な先行技術を構成するか、または世界の任意の国で共通の一般知識の一部を形成するという承認または任意の形態の提案とされるものではなく、またそのように解釈されるべきではない。

【0107】

本記載では、別段の示唆がない限り、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比範囲、または整数範囲は、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合にはその分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。用語「約」は、数字または数の直前にある場合、その数字または数がプラスまたはマイナス１０％の範囲であることを意味する。本明細書で使用される場合、用語「ａ」および「ａｎ」は、別段の示唆がない限り、列挙された構成要素のうちの「一つまたは複数」を指すことが理解されるべきである。代替物（例えば、「または」）の使用は、代替物のいずれか一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。用語「および／または」は、選択肢の一方または両方を意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は同義で使用される。

【0108】

本明細書で使用される場合、用語「同一性」および「同一である」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に関して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって生成されたアライメントなどの、その「クエリー」配列と「対象」配列とのアライメントにおける、完全に一致している残基のパーセンテージを指す。同一性は、特に明記しない限り、対象配列の全長にわたって計算される。したがって、クエリー配列が、対象配列と整列しているときに、対象配列中の残基の少なくともｘ％（切り捨て）が、クエリー配列中の対応する残基と完全に一致するように整列される場合、クエリー配列は、対象配列と「少なくともｘ％の同一性を共有する」。対象配列が可変位置（例えば、Ｘで示される残基）を有する場合、クエリー配列中の任意の残基へのアライメントは、一致としてカウントされる。配列アライメントは、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔサービス（ＢＬＡＳＴ＋バージョン２．１２．０）を使用して実施されてもよい。

【0109】

本明細書で使用される場合、用語「動作可能に連結された」は、二つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、転写された配列に対する転写調節配列の機能的関係を指す。例えば、プロモーター配列は、適切な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激するか、または調節する場合、コード配列に動作可能に連結される。一般に、転写された配列に動作可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写された配列に物理的に連続しており、すなわち、それらはシス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの転写調節配列は、それらが転写を促進するコード配列に物理的に連続している、または近接して配置されている必要はない。

【0110】

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する一つまたは複数の対象ポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含む組換えベクターを指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物をコードし発現するプラスミドでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在するとき、複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。あるいは、ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子を発現するように安定的に操作された宿主細胞を使用して、感染性粒子にパッケージングされてもよい。

【0111】

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも一つのＡＡＶキャプシドタンパク質およびキャプシド化ポリヌクレオチドＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子を指す。本明細書で使用される場合、粒子が、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、通常、これは、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と呼ばれる。したがって、ＡＡＶベクター粒子の産生は、ベクターがＡＡＶベクター粒子内に含まれるため、必然的にＡＡＶベクターの産生を含む。

【0112】

本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、真核細胞においてポリヌクレオチドからのＲＮＡ転写の開始を促進することができるポリヌクレオチド配列を指す。

【0113】

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ベクター（例えば、ｒＡＡＶビリオン）によってパッケージングされたポリヌクレオチド配列を指し、隣接配列（ＡＡＶ中、逆位末端反復）を含む。用語「発現カセット」および「ポリヌクレオチドカセット」は、隣接ＩＴＲ配列間のベクターゲノムの部分を指す。「発現カセット」は、ベクターゲノムが、発現を駆動するエレメント（例えば、プロモーター）に動作可能に連結された遺伝子産物をコードする少なくとも一つの遺伝子を含むことを意味する。

【0114】

本明細書で使用される場合、用語「必要としている患者」または「必要としている対象」は、本明細書に開示される組換え遺伝子治療ベクターまたは遺伝子編集システムを用いた治療または改善に適している疾患、障害、または状態のリスクのあるまたは罹患している患者または対象を指す。必要とする患者または対象は、例えば、心臓に関連する障害と診断された患者または対象であってもよい。対象は、ＰＫＰ２タンパク質の異常な発現を引き起こす、ＰＫＰ２遺伝子の変異、またはＰＫＰ２遺伝子の全部もしくは一部の欠失、または遺伝子調節配列の欠失を有し得る。「対象」および「患者」は、本明細書では互換的に使用される。本明細書に記載される方法によって治療される対象は、成人または子供であってよい。対象は年齢の範囲であり得る。

【0115】

本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、親タンパク質と比較して、一つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、用語「機能的バリアント」は、親タンパク質と比較して、一つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有し、親タンパク質の一つまたは複数の所望の活性を保持するタンパク質を指す。

【0116】

本明細書で使用される場合、「治療する」とは、疾患または障害の一つまたは複数の症状を改善することを指す。用語「予防する」は、疾患もしくは障害の一つまたは複数の症状の発症を遅延もしくは中断すること、またはＰＫＰ２－関連疾患もしくは障害、例えば、不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）の進行を遅延させることを指す。

【0117】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは約４．７ｋｂの長さであり、二つの約１４５ヌクレオチド逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには複数の公知のバリアントがあり、抗原エピトープによって分類される場合、血清型と呼ばれることもある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ－１の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ－２の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ 登録番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４（１９８３）で提供され、ＡＡＶ－３の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿１８２９で提供され、ＡＡＶ－４の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１８２９で提供され、ＡＡＶ－５のゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０８５７１６で提供され、ＡＡＶ－６の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００ １８６２で提供され、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９で提供され、ＡＡＶ－９のゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）で提供され、ＡＡＶ－１０のゲノムはＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）で提供され、ＡＡＶ－１１ゲノムはＶｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）で提供される。ＡＡＶｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４３４，９２８号で提供されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組込みを導くシス作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれる。三つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置からｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と命名）は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする二つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロン（ヌクレオチド２１０７および２２２７）のディファレンシャルスプライシング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）と連動して二つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子から四つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）を産生する。Ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製を最終的に担う複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、三つのキャプシドタンパク質ＶＰ１，ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、三つの関連するキャプシドタンパク質の産生に関与する。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５にある。ＡＡＶのライフサイクルと遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）で概説されている。

【0118】

ＡＡＶは、例えば遺伝子治療などで外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的な独自の特徴を有している。培養中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は無症状および無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を許容する。さらに、ＡＡＶはゆっくりと分裂する細胞と分裂しない細胞に形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外エレメント）として、これらの細胞の生存期間に本質的に存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド内にクローン化ＤＮＡとして挿入され、これにより組換えゲノムの構築が実現可能となる。さらに、ＡＡＶ複製およびゲノムのキャプシド化を指示するシグナルは、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれているため、ゲノムの内部約４．３ｋｂの一部またはすべて（複製および構造キャプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）は、外来ＤＮＡで置換されてもよい。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質をトランスで提供してもよい。ＡＡＶのもう一つの重要な特徴は、ＡＡＶが非常に安定した強力なウイルスであることである。アデノウイルスの不活化に使用される条件（５６°～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を軽減する。ＡＡＶは凍結乾燥することもできる。最後に、ＡＡＶ感染細胞は重複感染に耐性がない。

【0119】

本発明の実施に有用な遺伝子送達ウイルスベクターは、分子生物学の技術分野で周知の方法論を利用して構築され得る。典型的には、導入遺伝子を担持するウイルスベクターは、導入遺伝子、適切な調節因子、およびウイルスタンパク質の産生に必要な要素をコードするポリヌクレオチドから構築され、これは細胞形質導入を媒介する。かかる組換えウイルスは、当技術分野で周知の技術によって、例えば、パッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスによる一過性トランスフェクションによって生成され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例には、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ９細胞（任意選択的にバキュロウイルスヘルパーベクターを有する）、２９３細胞などが含まれるが、これらに限定されない。ＵＳ２０１７／０２１８３９５Ａ１に記載されるように、ヘルペスウイルス系システムを使用してＡＡＶベクターを産生することができる。かかる複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコルは、例えば、Ｗ０９５／１４７８５、Ｗ０９６／２２３７８、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号およびＷ０９４／１９４７８に記載されており、それら各々の完全な内容が参照により本明細書に組み込まれる。

【0120】

本開示は、プラコフィリン－２（ＰＫＰ２）タンパク質またはポリペプチドに関連する組成物および使用方法を企図する。ＰＫＰ２の様々な変異は、ｖａｎ Ｔｉｎｔｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１３：１６５０－５８（２００６）；Ｎｏｖｅｌｌｉ Ｆｒｏｎｔ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．（２００８）；および他の情報源に記載されているような疾患を含む、心筋症および心不全に関連することが知られている。したがって、ウイルスベクターを介したＰＫＰ２遺伝子の送達は、心筋症および心不全などのＰＫＰ２－関連ヒト疾患に対する実行可能な治療法としての役目を果たし得る。

【0121】

不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）を有する人では、２３０を超えるＰＫＰ２遺伝子の変異が特定されている。（“ＰＫＰ２ ｇｅｎｅ，”ＭｅｄｌｉｎｅＰｌｕｓを参照）。この状態は、心臓の二つの下腔の一つである右心室を囲む心筋に最も一般的に影響を与える。ＡＲＶＣは、異常な心拍（不整脈）および突然死のリスクを高める。ＰＫＰ２遺伝子変異の一部は、異常に短いプラコフィリン２の産生につながる。他の変異は、そのタンパク質構成要素（アミノ酸）のうちの一つまたは複数を追加、削除、または変更することによって、プラコフィリン２の構造を変化させる。研究は、改変されたタンパク質が、デスモソームの形成および機能を損なうことを示唆している。

【0122】

正常なデスモソームがなければ、心筋の細胞は互いに分離し、特に心筋にストレスが加わると（激しい運動中など）死滅する。損傷した心筋は、徐々に脂肪および瘢痕組織によって置換される。この異常な組織が蓄積すると、右心室の壁が伸張し、心臓が効果的に血液をポンプで送ることができなくなる。これらの変化はまた、不整脈につながる可能性がある、鼓動を制御する電気信号も破壊する。ＰＫＰ２－関連疾患の説明は、以下の参考文献に見出すことができる：Ｂｏｎｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５１：４５２－４５４（１９９８）［ＰｕｂＭｅｄ：９７２１２１６］；Ｂｏｎｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．８８：２８６－２８７（２０００）［ＰｕｂＭｅｄ：１０８２８６１１］；Ｄａｌａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１３：１６４１－１６４９（２００６）［ＰｕｂＭｅｄ：１６５４９６４０］；Ｇｅｒｕｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３６：１１６２－１１６４ （２００４ ［ＰｕｂＭｅｄ：１５４８９８５３］；Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６７：１４９－１６０（２００４）［ＰｕｂＭｅｄ：１５４７９７４１］；Ｍａｒｃｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ６５：３８４－３９８（１９８２）［ＰｕｂＭｅｄ：７０５３８９９］；ａｎｄ Ｍｅｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３５：１００９－１０２５（１９９６）［ＰｕｂＭｅｄ：８９２２３８３］．Ｓｅｅ ａｌｓｏ ＯＭＩＭ．ｏｒｇ ｅｎｔｒｙ ６０２８６１（“ＰＬＡＫＯＰＨＩＬＩＮ ２；ＰＫＰ２”）。

【0123】

ヒトＰＫＰ２ａおよびそのアイソフォームＰＫＰ２ｂの天然配列を以下に示し、Ａｒｇ－７３５に下線を引いた：
ＰＫＰ２ａ（配列番号１）－８３７アミノ酸
1 MAAPGAPAEY GYIRTVLGQQ ILGQLDSSSL ALPSEAKLKL
41 AGSSGRGGQT VKSLRIQEQV QQTLARKGRS SVGNGNLHRT
81 SSVPEYVYNL HLVENDFVGG RSPVPKTYDM LKAGTTATYE
121 GRWGRGTAQY SSQKSVEERS LRHPLRRLEI SPDSSPERAH
161 YTHSDYQYSQ RSQAGHTLHH QESRRAALLV PPRYARSEIV
201 GVSRAGTTSR QRHFDTYHRQ YQHGSVSDTV FDSIPANPAL
241 LTYPRPGTSR SMGNLLEKEN YLTAGLTVGQ VRPLVPLQPV
281 TQNRASRSSW HQSSFHSTRT LREAGPSVAV DSSGRRAHLT
321 VGQAAAGGSG NLLTERSTFT DSQLGNADME MTLERAVSML
361 EADHMLPSRI SAAATFIQHE CFQKSEARKR VNQLRGILKL
401 LQLLKVQNED VQRAVCGALR NLVFEDNDNK LEVAELNGVP
441 RLLQVLKQTR DLETKKQITG LLWNLSSNDK LKNLMITEAL
481 LTLTENIIIP FSGWPEGDYP KANGLLDFDI FYNVTGCLRN
521 MSSAGADGRK AMRRCDGLID SLVHYVRGTI ADYQPDDKAT
561 ENCVCILHNL SYQLEAELPE KYSQNIYIQN RNIQTDNNKS
601 IGCFGSRSRK VKEQYQDVPM PEEKSNPKGV EWLWHSIVIR
641 MYLSLIAKSV RNYTQEASLG ALQNLTAGSG PMPTSVAQTV
681 VQKESGLQHT RKMLHVGDPS VKKTAISLLR NLSRNLSLQN
721 EIAKETLPDL VSIIPDTVPS TDLLIETTAS ACYTLNNIIQ
761 NSYQNARDLL NTGGIQKIMA ISAGDAYASN KASKAASVLL
801 YSLWAHTELH HAYKKAQFKK TDFVNSRTAK AYHSLKD
ＰＫＰ２ｂ（配列番号２）－８８１アミノ酸
1 MAAPGAPAEY GYIRTVLGQQ ILGQLDSSSL ALPSEAKLKL
41 AGSSGRGGQT VKSLRIQEQV QQTLARKGRS SVGNGNLHRT
81 SSVPEYVYNL HLVENDFVGG RSPVPKTYDM LKAGTTATYE
121 GRWGRGTAQY SSQKSVEERS LRHPLRRLEI SPDSSPERAH
161 YTHSDYQYSQ RSQAGHTLHH QESRRAALLV PPRYARSEIV
201 GVSRAGTTSR QRHFDTYHRQ YQHGSVSDTV FDSIPANPAL
241 LTYPRPGTSR SMGNLLEKEN YLTAGLTVGQ VRPLVPLQPV
281 TQNRASRSSW HQSSFHSTRT LREAGPSVAV DSSGRRAHLT
321 VGQAAAGGSG NLLTERSTFT DSQLGNADME MTLERAVSML
361 EADHMLPSRI SAAATFIQHE CFQKSEARKR VNQLRGILKL
401 LQLLKVQNED VQRAVCGALR NLVFEDNDNK LEVAELNGVP
441 RLLQVLKQTR DLETKKQITD HTVNLRSRNG WPGAVAHACN
481 PSTLGGQGGR ITRSGVRDQP DQHGLLWNLS SNDKLKNLMI
521 TEALLTLTEN IIIPFSGWPE GDYPKANGLL DFDIFYNVTG
561 CLRNMSSAGA DGRKAMRRCD GLIDSLVHYV RGTIADYQPD
601 DKATENCVCI LHNLSYQLEA ELPEKYSQNI YIQNRNIQTD
641 NNKSIGCFGS RSRKVKEQYQ DVPMPEEKSN PKGVEWLWHS
681 IVIRMYLSLI AKSVRNYTQE ASLGALQNLT AGSGPMPTSV
721 AQTVVQKESG LQHTRKMLHV GDPSVKKTAI SLLRNLSRNL
761 SLQNEIAKET LPDLVSIIPD TVPSTDLLIE TTASACYTLN
801 NIIQNSYQNA RDLLNTGGIQ KIMAISAGDA YASNKASKAA
841 SVLLYSLWAH TELHHAYKKA QFKKTDFVNS RTAKAYHSLK
881 D

【0124】

ＰＫＰ２－関連疾患の実験モデルの一つはＲ７３５Ｘモデルであり、Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ６５：１４３８－５０（２０１５）に記載される通りである。Ｒ７３５Ｘは、ＰＫＰ２ｂアイソフォームに従って番号付けされる。ＰＫＰ２ａのＲ７３５Ｘ変異体は、Ａｒｇ－６９０でのＣ末端切断のため、６９０アミノ酸長である（ＰＫＰ２ｂ、配列番号２に対してＡｒｇ－７３５）。

【0125】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２タンパク質は、配列番号１または配列番号２のいずれか一つと、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＰＫＰ２タンパク質は、野生型または天然のＰＫＰ２タンパク質、例えば、ヒトＰＫＰ２ａまたはヒトＰＫＰ２ｂである。

【0126】

一部の実施形態では、本開示は、キャプシドおよびベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供し、ベクターゲノムは、プロモーターに動作可能に連結されたＰＫＰ２またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本開示は、キャプシドおよびベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供し、ベクターゲノムは、プロモーターに動作可能に連結されたＰＫＰ２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。ＰＫＰ２ａをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0127】

ＰＫＰ２ｂをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0128】

任意選択的に、ベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド配列は、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号５）を含むがこれに限定されないコザック配列を含んでもよい。コザック配列は、ＰＫＰ２ａタンパク質またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列と重複してもよい。例えば、ベクターゲノムは、配列番号６と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列（最初の十個のヌクレオチドがコザック配列を構成する）を含み得る。

【0129】

コザック配列は、ＰＫＰ２ｂタンパク質またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列と重複してもよい。例えば、ベクターゲノムは、配列番号７と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列（最初の十個のヌクレオチドがコザック配列を構成する）を含み得る。

【0130】

一実施形態では、コザック配列は、以下のいずれか一つを含む、またはいずれか一つからなる代替コザック配列である：
（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ（配列番号１６）；
ＡＧＮＮＡＵＧＮ；
ＡＮＮＡＵＧＧ；
ＡＮＮＡＵＧＣ；
ＡＣＣＡＵＧＧ；および
ＧＡＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号１８）。

【0131】

一部の実施形態では、ベクターゲノムは、コザック配列を含まない。

【0132】

ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されてもよい。例えば、ベクターゲノムは、配列番号８７と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、ＰＫＰ２ａをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0133】

ベクターゲノムは、配列番号８８と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、ＰＫＰ２ｂをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0134】

本開示のＡＡＶビリオンは、ベクターゲノムを含む。ベクターゲノムは、発現カセット（またはポリヌクレオチド配列の発現を必要としない遺伝子編集用途のためのポリヌクレオチドカセット）を含んでもよい。任意の好適な逆位末端反復（ＩＴＲ）を使用してもよい。ＩＴＲは、ＡＡＶビリオン中に存在するキャプシドと同じ血清型からのＡＡＶ ＩＴＲであってもよく、またはキャプシドとは異なる血清型のＡＡＶ ＩＴＲであってもよい（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、ＡＡＶ９キャプシドまたはＡＡＶｒｈ７４キャプシドを有するＡＡＶビリオンと共に使用されてもよい）。いずれの場合も、キャプシドの血清型は、ビリオンに適用される名称を決定する。ＩＴＲは、概して、ベクターゲノムの５’末端および３’末端の要素である。ベクターゲノムはまた、概して、プロモーター、導入遺伝子、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列（例えば、ＷＰＲＥ要素）、およびポリアデニル化配列を、５’から３’の順に含有する。変形では、ベクターゲノムは、エンハンサーエレメント（一般にプロモーターの５’側）および／またはエクソン（一般にプロモーターの３’側）を含む。変形では、本開示のベクターゲノムは、遺伝子編集システムで修復テンプレートとして使用される、部分的または完全な導入遺伝子配列をコードする。こうした変形では、ベクターゲノムは、外因性プロモーターを含んでもよく、または遺伝子編集システムは、導入遺伝子を、心臓または筋細胞特異的プロモーターなどの内因性プロモーターを有するゲノム内の座位内に挿入してもよい。

【0135】

一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号２０と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0136】

一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号２１と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0137】

一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号２２と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0138】

一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号２３と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0139】

一部の実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号２４と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0140】

一部の実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号２５と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0141】

一部の実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号２６と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0142】

一部の実施形態では、ベクターゲノムは、例えば、配列番号２７、配列番号２８、または配列番号２９と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、一つまたは複数のフィラー（ｆｉｌｌｅｒ）配列を含む。

【0143】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２タンパク質、またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列は、プロモーターに動作可能に連結される。特定の実施形態では、プロモーターは、ＭＨＣＫ７プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、ＴＮＮＴ２プロモーターである。

【0144】

本開示は、様々なプロモーターの使用を企図する。本開示の実施形態で有用なプロモーターとしては、限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、またはＣＭＶエンハンサーと、ニワトリベータ－アクチンプロモーターおよびウサギベータ－グロビン遺伝子の一部（ＣＡＧ）とから構成されるプロモーター配列が挙げられる。場合によっては、プロモーターは合成プロモーターであってもよい。合成プロモーターの例は、Ｓｃｈｌａｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ．１０７（６）：２５３８－４３（２０１０）によって提供される。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号３０と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0145】

一部の実施形態では、ＰＫＰ２タンパク質、またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに動作可能に連結される。誘導性プロモーターは、薬剤の添加もしくは蓄積に応答して、または薬剤の除去、分解、もしくは希釈に応答して、ポリヌクレオチド配列を転写的に発現させるか、または転写的に発現させないように構成され得る。薬剤は薬物であってもよい。薬剤は、テトラサイクリンまたはその誘導体の一つであってもよく、これには限定されないが、ドキシサイクリンが含まれる。場合によっては、誘導性プロモーターは、ｔｅｔ－ｏｎプロモーター、ｔｅｔ－ｏｆｆプロモーター、化学的に調節されたプロモーター、物理的に調節されたプロモーター（すなわち、光の存在もしくは不在、または低温もしくは高温に応答するプロモーター）である。誘導性プロモーターには、重金属イオン誘導性プロモーター（マウス乳腺腫瘍ウイルス（ｍＭＴＶ）プロモーターまたは様々な成長ホルモンプロモーターなど）、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性なＴ７ファージ由来のプロモーターが含まれる。誘導性プロモーターのこのリストは非限定的である。

【0146】

場合によっては、プロモーターは、非心細胞よりも心細胞で発現を駆動することができるプロモーターなどの組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、以下に限定されないが、デスミン（Ｄｅｓ）、アルファ－ミオシン重鎖（α－ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２）、心筋トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）、心筋トロポニンＴ（ｈＴＮＮＴ２）、筋クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、およびＭＨＣＫ７などのそれらのプロモーター／エンハンサーの領域の組み合わせを含む、任意の様々な心細胞特異的プロモーターから選択される。場合によっては、プロモーターはユビキタスプロモーターである。「ユビキチンプロモーター」は、実験条件または臨床条件下で組織特異的ではないプロモーターを指す。場合によっては、ユビキタスプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメント、ニワトリベータ－アクチン遺伝子イントロン、ウサギベータ－グロビン遺伝子（ＣＡＧ）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、真核生物翻訳伸長因子１アルファ１（ＥＦ１－アルファ）、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ニワトリベータアクチン、およびヒトベータアクチンプロモーターのいずれか一つである。

【0147】

一部の実施形態では、プロモーター配列は、表３から選択される。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号３１～５１と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号３１～５１のいずれか一つのポリヌクレオチド配列の断片、例えば、配列番号３１～５１のいずれか一つの少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を含む断片を含む。

【0148】

（表３）

【0149】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号３１と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号３２と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号３３と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0150】

プロモーターの更なる例示的な例は、シミアンウイルス４０由来のＳＶ４０後期プロモーター、バキュロウイルス多面体エンハンサー／プロモーターエレメント、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ｔｋ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の最初期プロモーター、およびＬＴＲエレメントを含む様々なレトロウイルスプロモーターである。多種多様な他のプロモーターが公知であり、当技術分野で一般的に利用可能であり、多くのそのようなプロモーターの配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースなどの配列データベースで利用可能である。

【0151】

場合によっては、本開示のベクターは、エンハンサー、イントロン、ポリＡシグナル、２Ａペプチドコード配列、ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）、およびＨＰＲＥ（Ｂ型肝炎転写後調節エレメント）からなる群から選択される一つまたは複数の調節エレメントをさらに含む。

【0152】

一部の実施形態では、ベクターはＣＭＶエンハンサーを含む。

【0153】

特定の実施形態では、ベクターは、一つまたは複数のエンハンサーを含む。特定の実施形態では、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサー配列、ＧＡＰＤＨエンハンサー配列、β－アクチンエンハンサー配列、またはＥＦ１－αエンハンサー配列である。前述の配列は、当該技術分野で公知である。例えば、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）エンハンサーの配列は、配列番号５０である。

【0154】

特定の実施形態では、ベクターは、一つまたは複数のイントロンを含む。特定の実施形態では、イントロンは、ウサギグロビンイントロン配列、ニワトリβ－アクチンイントロン配列、合成イントロン配列、ＳＶ４０イントロン、またはＥＦ１－αイントロン配列である。

【0155】

特定の実施形態では、ベクターはポリＡ配列を含む。特定の実施形態では、ポリＡ配列は、ウサギグロビンポリＡ配列、ヒト成長ホルモンポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列、ＰＧＫポリＡ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、またはＴＫポリＡ配列である。一部の実施形態では、ポリＡシグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）であってもよい。

【0156】

特定の実施形態では、ベクターは、一つまたは複数の転写物安定化エレメントを含む。特定の実施形態では、転写物安定化エレメントは、ＷＰＲＥ配列、ＨＰＲＥ配列、足場付着領域、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲである。特定の実施形態では、ベクターは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方を含む。

【0157】

一部の実施形態では、ベクターは、表４から選択される５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号５１～６１のいずれか一つと、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0158】

（表４）

【0159】

一部の実施形態では、ベクターは、表５から選択される３’非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号６２～７０のいずれか一つと、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0160】

（表５）

【0161】

一部の実施形態では、ベクターは、表６から選択されるポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む。一部の実施形態では、ポリＡシグナルは、配列番号７１～７５のいずれか一つと、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

【0162】

（表６）

【0163】

例示的ベクターゲノムは、図１～４、および１１～１４に示され、配列番号１２～１５、および８９～９２として提供される。各配列の発現カセットは、配列番号８～１１または９３～９６である。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１２～１５、および８９～９２のいずれか一つと、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を共有する、任意にＩＴＲ配列を伴うか、または伴わないポリヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になる、またはそれからなる。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号８～１１、および９３～９６のいずれか一つと、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0164】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＭＨＣＫ７プロモーター、ＰＫＰａ導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）エレメント、ｐＡＧＨ－ＨＳ配列、および３’ＩＴＲを、５’から３’の順に含む。ベクターゲノムは、ポリヌクレオチド配列の配列番号３１、配列番号３、６、および８７のいずれか一つ、配列番号６３、および配列番号７５、または前述の各々に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を、５’から３’の順に含んでもよい。特定の実施形態では、このベクターゲノムは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ７４ベクターにパッケージングされる。この実施形態のＰＫＰ２ａ導入遺伝子は、全長導入遺伝子、すなわち、少なくとも８００または少なくとも８３０のアミノ酸のＰＫＰをコードする導入遺伝子である。

【0165】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ｈＴｎｎＴ２プロモーター、ＰＫＰａ導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）エレメント、ｐＡＧＨ－ＨＳ配列、および３’ＩＴＲを、５’から３’の順に含む。ベクターゲノムは、ポリヌクレオチド配列の配列番号３２または３３、配列番号３、６、および８７のいずれか一つ、配列番号６３、および配列番号７５、または前述の各々に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を、５’から３’の順に含んでもよい。特定の実施形態では、このベクターゲノムは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ７４ベクターにパッケージングされる。この実施形態のＰＫＰ２ａ導入遺伝子は、全長導入遺伝子、すなわち、少なくとも８００または少なくとも８３０のアミノ酸のＰＫＰをコードする導入遺伝子である。

【0166】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＭＨＣＫ７プロモーター、ＰＫＰｂ導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）エレメント、ｐＡＧＨ－ＨＳ配列、および３’ＩＴＲを、５’から３’の順に含む。ベクターゲノムは、ポリヌクレオチド配列の配列番号３１、配列番号４、７、および８８のいずれか一つ、配列番号６３、および配列番号７５、または前述の各々に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を、５’から３’の順に含んでもよい。特定の実施形態では、このベクターゲノムは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ７４ベクターにパッケージングされる。この実施形態のＰＫＰ２ｂ導入遺伝子は、全長導入遺伝子、すなわち、少なくとも８００または少なくとも８３０のアミノ酸のＰＫＰをコードする導入遺伝子である。

【0167】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ｈＴｎｎＴ２プロモーター、ＰＫＰｂ導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）エレメント、ｐＡＧＨ－ＨＳ配列、および３’ＩＴＲを、５’から３’の順に含む。ベクターゲノムは、ポリヌクレオチド配列の配列番号３２または３３、配列番号４、７、および８８のいずれか一つ、配列番号６３、および配列番号７５、または前述の各々に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を、５’から３’の順に含んでもよい。特定の実施形態では、このベクターゲノムは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ７４ベクターにパッケージングされる。この実施形態のＰＫＰ２ｂ導入遺伝子は、全長導入遺伝子、すなわち、少なくとも８００または少なくとも８３０のアミノ酸のＰＫＰをコードする導入遺伝子である。

【0168】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＭＨＣＫ７プロモーター、ＰＫＰａ導入遺伝子、任意にＷＰＲＥ（ｘ）エレメント、ポリアデニル化配列、および３’ＩＴＲを、５’から３’の順に含む。ベクターゲノムは、ポリヌクレオチド配列の配列番号３１、配列番号３、６、および８７のいずれか一つ、または前述の各々に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を、５’から３’の順に含んでもよい。特定の実施形態では、このベクターゲノムは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ７４ベクターにパッケージングされる。この実施形態のＰＫＰ２ａ導入遺伝子は、全長導入遺伝子、すなわち、少なくとも８００または少なくとも８３０のアミノ酸のＰＫＰをコードする導入遺伝子である。

【0169】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ｈＴｎｎＴ２プロモーター、ＰＫＰａ導入遺伝子、任意にＷＰＲＥ（ｘ）エレメント、ポリアデニル化配列、および３’ＩＴＲを、５’から３’の順に含む。ベクターゲノムは、ポリヌクレオチド配列の配列番号３２または３３、配列番号３、６、および８７のいずれか一つ、または前述の各々に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を、５’から３’の順に含んでもよい。特定の実施形態では、このベクターゲノムは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ７４ベクターにパッケージングされる。この実施形態のＰＫＰ２ａ導入遺伝子は、全長導入遺伝子、すなわち、少なくとも８００または少なくとも８３０のアミノ酸のＰＫＰをコードする導入遺伝子である。

【0170】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＭＨＣＫ７プロモーター、ＰＫＰｂ導入遺伝子、任意にＷＰＲＥ（ｘ）エレメント、ポリアデニル化配列、および３’ＩＴＲを、５’から３’の順に含む。ベクターゲノムは、ポリヌクレオチド配列の配列番号３１、配列番号４、７、および８８のいずれか一つ、または前述の各々に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を、５’から３’の順に含んでもよい。特定の実施形態では、このベクターゲノムは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ７４ベクターにパッケージングされる。この実施形態のＰＫＰ２ｂ導入遺伝子は、全長導入遺伝子、すなわち、少なくとも８００または少なくとも８３０のアミノ酸のＰＫＰをコードする導入遺伝子である。

【0171】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ｈＴｎｎＴ２プロモーター、ＰＫＰｂ導入遺伝子、任意にＷＰＲＥ（ｘ）エレメント、ポリアデニル化配列、および３’ＩＴＲを、５’から３’の順に含む。ベクターゲノムは、ポリヌクレオチド配列の配列番号３２または３３、配列番号４、７、および８８のいずれか一つ、または前述の各々に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を、５’から３’の順に含んでもよい。特定の実施形態では、このベクターゲノムは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ７４ベクターにパッケージングされる。この実施形態のＰＫＰ２ｂ導入遺伝子は、全長導入遺伝子、すなわち、少なくとも８００または少なくとも８３０のアミノ酸のＰＫＰをコードする導入遺伝子である。

【0172】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＭＨＣＫ７プロモーター、ＳＶ４０イントロン、ＰＫＰａ導入遺伝子、任意にＷＰＲＥ（ｘ）エレメント、ポリアデニル化配列、および３’ＩＴＲを、５’から３’の順に含む。ベクターゲノムは、５’から３’の順に、ポリヌクレオチド配列の配列番号３１、配列番号５３または６１、配列番号３、６、および８７のいずれか一つ、または前述の各々に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の実施形態では、このベクターゲノムは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ７４ベクターにパッケージングされる。この実施形態のＰＫＰ２ａ導入遺伝子は、全長導入遺伝子、すなわち、少なくとも８００または少なくとも８３０のアミノ酸のＰＫＰをコードする導入遺伝子である。

【0173】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ｈＴｎｎＴ２プロモーター、ＳＶ４０イントロン、ＰＫＰａ導入遺伝子、任意にＷＰＲＥ（ｘ）エレメント、ポリアデニル化配列、および３’ＩＴＲを、５’から３’の順に含む。ベクターゲノムは、ポリヌクレオチド配列の配列番号３２または３３、配列番号５３または６１、配列番号３、６、および８７のいずれか一つ、または前述の各々に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を、５’から３’の順に含んでもよい。特定の実施形態では、このベクターゲノムは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ７４ベクターにパッケージングされる。この実施形態のＰＫＰ２ａ導入遺伝子は、全長導入遺伝子、すなわち、少なくとも８００または少なくとも８３０のアミノ酸のＰＫＰをコードする導入遺伝子である。

【0174】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ＭＨＣＫ７プロモーター、ＳＶ４０イントロン、ＰＫＰｂ導入遺伝子、任意にＷＰＲＥ（ｘ）エレメント、ポリアデニル化配列、および３’ＩＴＲを、５’から３’の順に含む。ベクターゲノムは、５’から３’の順に、ポリヌクレオチド配列の配列番号３１、配列番号５３または６１、配列番号４、７、および８８のいずれか一つ、または前述の各々に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の実施形態では、このベクターゲノムは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ７４ベクターにパッケージングされる。この実施形態のＰＫＰ２ｂ導入遺伝子は、全長導入遺伝子、すなわち、少なくとも８００または少なくとも８３０のアミノ酸のＰＫＰをコードする導入遺伝子である。

【0175】

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、５’ＩＴＲ、ｈＴｎｎＴ２プロモーター、ＳＶ４０イントロン、ＰＫＰｂ導入遺伝子、任意にＷＰＲＥ（ｘ）エレメント、ポリアデニル化配列、および３’ＩＴＲを、５’から３’の順に含む。ベクターゲノムは、ポリヌクレオチド配列の配列番号３２または３３、配列番号５３または６１、配列番号４、７、および８８のいずれか一つ、または前述の各々に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を、５’から３’の順に含んでもよい。特定の実施形態では、このベクターゲノムは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ７４ベクターにパッケージングされる。この実施形態のＰＫＰ２ｂ導入遺伝子は、全長導入遺伝子、すなわち、少なくとも８００または少なくとも８３０のアミノ酸のＰＫＰをコードする導入遺伝子である。

【0176】

それぞれの場合で、任意でＷＰＲＥ要素が存在してもよく、または存在しなくてもよい。

【0177】

アデノ随伴ウイルスベクター
本発明の実践において有用なＡＡＶベクターは、アデノウイルスベースおよびヘルパーフリーシステムを含む様々なシステムを使用して、ＡＡＶビリオン（ウイルス粒子）にパッケージングされ得る。ＡＡＶ生物学における標準的な方法には、以下に記載されるものが含まれる。Ｋｗｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．（２００８）２５（３）：４８９－９９；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００６）１４（３）：３１６－２７．Ｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００４）１０（２）：３０２－１７；Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００３）３（４）：２８１－３０４；Ｄｅｙｌｅ ＤＲ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＷ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２００９）１１（４）：４４２－４４７；ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００１）８（１６）：１２４８－５４；およびＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２００１）４（４）：３８３－９１。ヘルパーフリーシステムには、ＵＳ６，００４，７９７、ＵＳ７，５８８，７７２、およびＵＳ７，０９４，６０４に記載されているものが含まれていた。

【0178】

ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶバリアントまたは血清型由来であってもよく、ＡＡＶバリアントまたは血清型には、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、およびＡＡＶｒｈ１０が含まれるが、これらに限定されない。シュードタイプ化されたｒＡＡＶの製造は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。キャプシド変異を伴うｒＡＡＶなどの他のタイプのｒＡＡＶバリアントも意図されている。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野で公知である。

【0179】

場合によっては、ｒＡＡＶは自己相補的なゲノムを含む。本明細書で定義されるように、「自己相補的」または「二本鎖」ゲノムを含むｒＡＡＶは、以下に記載されるように、ｒＡＡＶのコード領域が分子内二本鎖ＤＮＡテンプレートを形成するように構成されるように操作されたｒＡＡＶを指す。ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．８（１６）：１２４８－５４（２００１）。本開示は、感染（形質導入のような）時に、ｒＡＡＶゲノムの第二の鎖の細胞介在性合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの二つの相補的な半分が、すぐに複製および転写ができる一つの二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成するので、場合によっては、自己相補的ゲノムを含むｒＡＡＶの使用を企図する。ｒＡＡＶに見られる完全コード容量（４．７～６ｋｂ）の代わりに、自己相補的ゲノムを含むｒＡＡＶは、その量の約半分（約２．４ｋｂ）しか保持できないことが理解されよう。

【0180】

他の場合では、ｒＡＡＶベクターは一本鎖のゲノムを含む。本明細書で定義されるように、「単一標準」ゲノムは、自己相補的ではないゲノムを指す。ほとんどの場合、非組換えＡＡＶは一本鎖ＤＮＡゲノムを有している。ｒＡＡＶは、細胞の効率的な形質導入を達成するためにｓｃＡＡＶであるべきといういくつかの兆候があった。しかしながら、本開示は、ｒＡＡＶベクターの他の遺伝子改変が、標的細胞において最適な遺伝子転写を得るために有益であり得るという理解の下で、自己相補的ゲノムではなく、一本鎖ゲノムを有するかもしれないｒＡＡＶベクターを企図している。場合によっては、本開示は、マウス眼の前眼部への効率的な遺伝子導入を達成できる一本鎖ｒＡＡＶベクターに関する。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｃｈｉｅｖｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｙｅ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １２（８）：ｅ０１８２４７３（２０１７）を参照されたい。

【0181】

場合によっては、ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７４のベクターである。シュードタイプ化されたｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。キャプシド変異を伴うｒＡＡＶなどの他のタイプのｒＡＡＶバリアントも意図されている。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。場合によっては、ｒＡＡＶベクターは血清型ＡＡＶ９のベクターである。一部の実施形態では、当該ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ９のベクターであり、一本鎖ゲノムを含む。一部の実施形態では、当該ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ９のベクターであり、自己相補的ゲノムを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２の逆位末端反復（ＩＴＲ）の配列を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ２ゲノムを含み、その結果、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ－２／９ベクター、ＡＡＶ－２／６ベクター、またはＡＡＶ－２／８ベクターである。

【0182】

最も良く知られているＡＡＶに対する完全長配列およびキャプシド遺伝子の配列は、米国特許第８，５２４，４４６号に提供され、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0183】

ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ配列を含んでよく、または野生型ＡＡＶ配列に対する一つまたは複数の改変を含んでもよい。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、キャプシドタンパク質、任意に、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３内に、任意に、置換、欠失、または挿入などの一つまたは複数のアミノ酸改変を含む。特定の実施形態では、改変は、ＡＡＶベクターが対象に提供されるとき、免疫原性の低下をもたらす。

【0184】

ｒＡＡＶのキャプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが内皮細胞、またはより具体的には内皮端細胞などの対象の特定標的組織に標的化されるように改変されてもよい。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは対象の脳室内に直接注射される。

【0185】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ２ ｒＡＡＶビリオンである。キャプシドの多くは、ＡＡＶ２キャプシドまたはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、ＡＡＶ２キャプシドは、例えば、配列番号７６などの参照ＡＡＶ２キャプシドと少なくとも９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。

【0186】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ９ ｒＡＡＶビリオンである。キャプシドの多くは、ＡＡＶ９キャプシドまたはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドは、例えば、配列番号７７などの参照ＡＡＶ９キャプシドと少なくとも９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。

【0187】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ６ ｒＡＡＶビリオンである。キャプシドの多くは、ＡＡＶ９キャプシドまたはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、ＡＡＶ６キャプシドは、例えば、配列番号７８などの参照ＡＡＶ６キャプシドと少なくとも９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。

【0188】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶｒｈ．１０ ｒＡＡＶビリオンである。キャプシドの多くは、ＡＡＶ９キャプシドまたはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、ＡＡＶｒｈ．１０キャプシドは、例えば、配列番号７９などの参照ＡＡＶｒｈ．１０キャプシドと少なくとも９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。

【0189】

一部の実施形態では、キャプシドタンパク質は、トランスファープラスミドに、トランスでプラスミド上に供給されるポリヌクレオチドによってコードされる。野生型ＡＡＶｒｈ７４キャップのポリヌクレオチド配列は、配列番号８０として提供される。

【0190】

本開示はさらに、配列番号８１～８３、および相同体またはその機能的バリアントを含むＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のタンパク質配列を提供する。

【0191】

特定の事例では、ＡＡＶｒｈ７４キャプシドは、配列番号８１に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号８１に記載されるＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ１のアミノ酸配列と、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より一般的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一な配列を含む、または本質的にからなる、またはさらになるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号８２に記載されるＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ２のアミノ酸配列と、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より一般的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一な配列を含む、または本質的にからなる、またはさらになるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号８３に記載されるＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ３のアミノ酸配列と、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より一般的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一な配列を含む、または本質的にからなる、またはさらになるポリペプチドを含む。

【0192】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ ｒＡＡＶビリオンまたはその好中球性バリアントであり、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１５／０３８９５８Ａ１号および第ＷＯ２０１７／１００６７１Ａ１号に開示されているものなどであるが、これらに限定されない。例えば、ＡＡＶキャプシドは、配列ＴＬＡＶＰＦＫ（配列番号８５）またはＫＦＰＶＡＬＴ（配列番号８６）からの少なくとも４つの連続アミノ酸を含んでもよく、例えば、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８および５８９をコードする配列の間に挿入される。

【0193】

キャプシドの多くは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂキャプシドまたはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂキャプシドは、例えば、配列番号８４などの参照ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂキャプシドと少なくとも９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する。

【0194】

本開示のｒＡＡＶビリオンに使用される更なるＡＡＶキャプシドには、国際特許公開第ＷＯ２００９／０１２１７６Ａ２号および第ＷＯ２０１５／１６８６６６Ａ２号に開示されているものが含まれる。

【0195】

理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶｒｈ．７４、またはＡＡＶｒｈ．１０ベクターが、ベクターに望ましい心臓向性を付与すると決定した。理論に拘束されるものではないが、本発明者らはさらに、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶｒｈ．７４、またはＡＡＶｒｈ．１０ベクターが、心細胞に望ましい特異性を提供し得ると決定した。

【0196】

一態様では、本開示は、本開示のｒＡＡＶビリオンと、一つまたは複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む医薬組成物を提供する。

【0197】

任意に、注射による投与の目的のために、滅菌水溶液などの様々な溶液を使用することができる。このような水溶液は、所望により緩衝されてもよく、液体希釈剤は、生理食塩水またはグルコースによって最初に等張することができる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含有する）または薬理学的に許容可能な塩としてのｒＡＡＶの溶液は、例えば、０．００１％または０．０１％でＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８などの界面活性剤と好適に混合された水中で調製することができる。ｒＡＡＶの分散体は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物、ならびに油中で調製されてもよい。通常の保存および使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含有する。この関連で、使用される滅菌水性媒体はすべて、当業者に周知の標準技術によって容易に取得可能である。

【0198】

注射可能な使用に適した医薬品形態としては、これらに限定されないが、滅菌水溶液または分散液、ならびに滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。いずれの場合も、形態は滅菌されており、容易に注射可能な（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）程度に流動的でなければならない。製造および保管の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合に必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の長期間の吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。

【0199】

滅菌注射可能な溶液は、必要に応じて、上記で列挙された様々な他の成分と、適切な溶媒中に必要な量のｒＡＡＶを組み込み、その後に濾過滅菌することにより調製され得る。一般的に、分散剤は、滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体および上記で列挙されたものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌された注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、特定の調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、活性成分に加えて、事前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。

【0200】

別の態様では、本開示は、本開示のｒＡＡＶビリオンと、使用説明書と、含む、キットを含む。

【0201】

ある態様において、本開示は、細胞においてＰＫＰ２活性を増加させる方法を提供し、この方法は、細胞を本開示のｒＡＡＶと接触させることを含む。別の態様では、本開示は、対象におけるＰＫＰ２活性を増加させる方法を提供し、この方法は、本開示のｒＡＡＶを対象に投与することを含む。一部の実施形態では、細胞および／または対象は、ＰＫＰ２メッセンジャーＲＮＡまたはＰＫＰ２タンパク質の発現レベルおよび／または活性が欠損しており、および／またはＰＫＰ２の機能喪失変異を含む。細胞は、心細胞、例えば、心筋細胞であってもよい。特定の実施形態では、対象は哺乳類、例えばヒトである。

【0202】

一部の実施形態では、本方法は、例えば、心筋細胞などの心細胞の生存を、細胞培養で、および／またはインビボで促進する。一部の実施形態では、本方法は、心臓の機能を促進および／または回復させる。

【0203】

別の態様では、本開示は、疾患または障害の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法を提供し、この方法は、有効量の本開示のｒＡＡＶビリオンを対象に投与することを含む。一部の実施形態では、疾患または障害は、心疾患または障害である。心障害の例には、心不全、不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）、ブルガダ症候群（ＢｒＳ）、および特発性心室細動などが挙げられる。特定の実施形態では、対象は、不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）に罹患しているか、またはそのリスクがある。特定の実施形態では、対象は、ＰＫＰ２遺伝子に機能喪失変異を有する哺乳類、例えばヒトである。特定の方法では、ｒＡＡＶビリオンを用いた治療は、対象、例えば、対象の心臓または心組織において、ｒＡＡＶビリオンによってコードされるＰＫＰ２タンパク質の発現をもたらす。特定の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンを用いた治療は、対象の心臓内で検出可能な少なくとも二倍、少なくとも五倍、少なくとも十倍、またはそれ以上のＰＫＰ２タンパク質レベルをもたらす。

【0204】

ＡＡＶを介したＰＫＰ２タンパク質の心臓への送達は、寿命を延ばし、心細胞の変性、心不全、瘢痕化、駆出率の低下、不整脈、狭心症、運動不耐性、狭心症（胸痛）、心臓突然死、労作性筋肉痛および痙攣を予防または軽減する可能性がある。ＡＡＶを介したＰＫＰ２タンパク質の心臓への送達は、病理学的心電図、心臓ＭＲＩ、心臓生検の使用によって検出される正常な疾患経過からの改善、または予防を示し、発作性心室性不整脈の減少、心臓突然死の減少、および／または右心室心筋における線維脂肪沈着のさらなる発達の減少もしくは欠如をもたらし得る。本開示の方法は、右心室駆出率（ＲＶＥＦ）の減少、回復、および／または増加を防止し得る。

【0205】

本明細書中に開示する方法によって、心臓における効率的な生体分布が提供され得る。それらによって、心細胞、例えば、心筋細胞の全て、または実質的な割合での持続的な発現がもたらされ得る。注目すべきことに、本明細書中に開示する方法によって、ＡＡＶベクター投与後の対象の寿命を通して、ＰＫＰ２タンパク質の持続性の発現が提供され得る。一部の実施形態では、治療に応答してのＰＫＰ２タンパク質発現は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０年持続する。

【0206】

併用療法も本発明によって企図される。本発明の方法の標準的な医学的治療（例えば、コルチコステロイドまたは局所的減圧薬）との組み合わせが、新規の療法との組み合わせと同様に、具体的に企図される。一部の場合では、対象は、本明細書中に記載するｒＡＡＶの投与に対する免疫応答を防止または低減するためにステロイドおよび／または免疫抑制剤の併用で治療され得る。

【0207】

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、対象の総体重の１キログラム当たりのＡＡＶベクター（ｖｇ）の約１×１０^１２～５×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ）または約１×１０^１２～６×１０^１４ｖｇの用量（ｖｇ／ｋｇ）で投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０^１３～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの間の用量で投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約５×１０^１３～３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの間の用量で投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの間の用量で投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、または約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満の用量で投与される。特定の実施形態では、これらの用量のいずれかで送達されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ ｒｈ７４ベクターである。一部の事例では、ＡＡＶ ｒｈ７４ベクターにはＡＡＶ９ベクターよりも高用量を使用することが有利であり得る。

【0208】

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態では、これらの用量のいずれかで送達されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ ｒｈ７４ベクターである。

【0209】

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態では、これらの用量のいずれかで送達されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ ｒｈ７４ベクターである。

【0210】

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、対象の総体重の１キログラム当たり、ＡＡＶベクター（ｖｇ）の約１×１０^１２～５×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ）の用量（ｖｇ／ｋｇ）で全身的に投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０^１３～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの間の用量で全身的に投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約５×１０^１３～３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの間の用量で全身的に投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの間の用量で全身的に投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、または約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満の用量で全身的に投与される。特定の実施形態では、これらの用量のいずれかで送達されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ ｒｈ７４ベクターである。

【0211】

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で全身的に投与される。特定の実施形態では、これらの用量のいずれかで送達されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ ｒｈ７４ベクターである。

【0212】

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で全身的に投与される。特定の実施形態では、これらの用量のいずれかで送達されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ ｒｈ７４ベクターである。

【0213】

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、対象の総体重の１キログラム当たりＡＡＶベクター（ｖｇ）の約１×１０^１２～５×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ）の間の用量（ｖｇ／ｋｇ）で静脈内投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０^１３～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの間の用量で静脈内投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約５×１０^１３～３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの間の用量で静脈内投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの間の用量で静脈内投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、または約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満の用量で静脈内投与される。特定の実施形態では、これらの用量のいずれかで送達されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ ｒｈ７４ベクターである。

【0214】

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される。

【0215】

一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、または７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される。特定の実施形態では、これらの用量のいずれかで送達されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ ｒｈ７４ベクターである。

【0216】

患者における機能改善、臨床的利益または有効性の証拠は、ニューヨーク心臓協会の機能分類（ＮＹＨＡクラス）、病理心電図、心臓ＭＲＩ、心臓生検の変化、発作性心室性不整脈の減少、心臓突然死の減少、および／または右心室心筋における線維脂肪沈着物のさらなる発達の減少または欠如によって明らかにされ得る。有益性は、通常、Ｔ波逆転、Ｓ波アップストロークの延長、局所的ＱＲＳ拡大、および／または発作性心室頻拍などの不整脈源性右室心筋症に関連する心電図特徴で観察され得る。

【0217】

一部の実施形態では、本方法は、ＰＫＰ２の機能喪失に関連するまたはそれによって引き起こされる疾患または障害に罹患している、またはそのリスクがある、未治療の対象において観察された減少と比較して、左心室駆出率（ＬＶＥＦ％）の減少を、任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する。

【0218】

一部の実施形態では、本方法は、ＰＫＰ２の機能喪失に関連するまたはそれによって引き起こされる疾患または障害に罹患している、またはそのリスクがある、未治療の対象において観察された減少と比較して、左心室短縮率（ＦＳ％）の減少を、任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する。

【0219】

一部の実施形態では、本方法は、ＰＫＰ２の機能喪失に関連するまたはそれによって引き起こされる疾患または障害に罹患している、またはそのリスクがある、未治療の対象において観察された増加と比較して、平方ミリメートルでの右心室面積（ＲＶ面積（ｍｍ２））の増加を、任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する。

【0220】

一部の実施形態では、本方法は、ＰＫＰ２の機能喪失に関連するまたはそれによって引き起こされる疾患または障害に罹患している、またはそのリスクがある、未治療の対象において観察された低下と比較して、ミリメートル毎秒での右心室速度時間積分（ＲＶ ＶＴＩ（ｍｍ／秒））の低下を、任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する。

【0221】

一部の実施形態では、本方法は、ＰＫＰ２の機能喪失に関連するまたはそれによって引き起こされる疾患または障害に罹患している、またはそのリスクがある、未治療の対象において観察された増加と比較して、左心室または右心室の線維症の増加を、任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する。

【0222】

組成物の有効用量の投与は、限定されないが、全身的、局所的、直接注射、静脈内、心臓内投与を含む、当技術分野において標準の経路により得る。一部の場合では、投与は、全身的、局所的、直接注射、静脈内、心臓内注射を含む。投与は、心臓カテーテル法により実施してもよい。

【0223】

一部の実施形態では、本開示は、有効用量の本発明のｒＡＡＶおよび組成物の局所投与および全身投与を提供する。例えば、全身投与は、全身が影響を受けるように循環系に投与され得る。全身投与には、注射、注入、または移植による親（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与が含まれる。本明細書中に開示する組成物のための投与の経路は、静脈内（「ＩＶ」）投与、腹腔内（「ＩＰ」）投与、筋肉内（「ＩＭ」）投与、病変内投与、もしくは皮下（「ＳＣ」）投与、または徐放装置、例えば、ミニ浸透圧ポンプ、デポ製剤などの移植を含む。一部の実施形態では、本開示の方法は、本開示のＡＡＶベクター、またはその医薬組成物を、静脈内、筋肉内、動脈内、腎内、尿道内、心臓内、冠動脈内、心筋内、皮内、硬膜外、皮下、腹腔内、脳室内、イオントフォレーシス、または頭蓋内投与により投与することを含む。

【0224】

特に、本発明のｒＡＡＶの投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織中に輸送する任意の物理的方法を使用することにより達成され得る。投与は、以下に限定されないが、心臓中への注射を含む。

【0225】

一部の実施形態では、本開示の方法は、心臓内送達を含む。注入は、注入ポンプを使用して、専用カニューレ、カテーテル、シリンジ／針を使用して実施してもよい。投与は、心臓への、有効量のｒＡＡＶビリオン、またはｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物の送達を含み得る。これらは、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腎内、尿道内、心臓内、冠動脈内、心筋内、皮内、硬膜外、皮下、腹腔内、脳室内、イオントフォレーシス、または頭蓋内投与を介して達成され得る。本開示の組成物は、さらに静脈内投与されてもよい。

【0226】

本明細書中に開示する治療の方法は、心室肥大、心室頻拍、運動不耐性、狭心症、およびＲＶＥＦの低下を含むがこれらに限定されない一つまたは複数の症状を軽減および／または予防し得る。

【実施例】

【0227】

実施例１：前臨床生物活性および有効性
図１～図４に示すベクターを試験する。ＡＡＶベクターまたはそれぞれの発現カセットを、培養心筋細胞（例えば、多能性幹細胞心筋細胞、ｉＰＳＣ－ＣＭ）、またはこれらの構築物を用いたトランスフェクションまたは形質導入に適している他の細胞を使用して、インビトロで試験する。ＰＫＰ２の発現を、免疫蛍光およびウェスタンブロットにより評価する。患者ｉＰＳＣ由来の心筋細胞を用いた細胞ベースの研究が、ＰＫＰ２の密度の増加に関連する、脂肪生成能の低下（例えば、脂質蓄積の減少）、アップレギュレーションの低下、または異常なペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ活性化による、ＰＫＰ２導入遺伝子の過剰発現（ＡＡＶベクター形質導入および／またはベクタープラスミドによるトランスフェクションのいずれか）の利点を明らかにする。

【0228】

選択されたベクターを、心筋症の変異マウスモデル（例えば、ＰＫＰ２－ｃＫＯなど）を使用してインビボで試験する。ＰＫＰ２のＡＡＶを介した過剰発現の利益の証拠は、「ＰＫＰ２－ｃＫＯ」と呼ばれる、心筋細胞特異的、タモキシフェン活性化、ＰＫＰ２ノックアウトマウス系統を使用して明らかにされ得る。このマウスモデルは、ＰＫＰ２発現喪失の開始の制御を可能にし、成体筋細胞へのＰＫＰ２の喪失を制限し、このマウスでは右心室優勢で、不整脈源性心筋症につながる分子的および機能的事象の進行を開始する。類似の病理過程をもたらす追加のマウスモデルも利用して、心筋細胞におけるＰＫＰ２のＡＡＶを介した過剰発現の利益を明らかにすることができる。ＡＡＶを介したＰＫＰ２過剰発現の利益は、生存率の増加、左心室および／または右心室からの心エコー図で観察される心筋症の正常な進行の軽減（例えば、ＰＫＰ ｃＫＯ製剤緩衝液対照動物と比較して、左心室駆出率、左心室短縮率、および右心室速度時間間隔の増大）によって示される。

【0229】

ＰＫＰ２タンパク質のＡＡＶ媒介送達の機能的利益の電気生理学的証拠は、影響を受けた心筋細胞における疾患関連の破壊されたカルシウムダイナミクスの軽減によって実証され、特に、Ｌ型カルシウム電流、筋小胞体カルシウム漏出、拡張期カルシウム漏出の測定、ならびにピーク振幅までの時間および弛緩時定数など、影響を受けた（例えば、ＰＫＰ２欠損）心筋細胞におけるカルシウム移行の標準測定で実証される。組織学的解析は、ｃＫＯ製剤緩衝液注入対照と比較して、心室を含む心臓の様々な領域で、疾患関連のコラーゲン沈着（例えば、トリクローム染色による）の出現の減少により、ＡＡＶを介したＰＫＰ２過剰発現の利益を明らかにする。非ＡＡＶ－ＰＫＰ２処置したＰＫＰ２－ｃＫＯ疾患対照と比較して、Ｃａｓｑ２、および／またはＴｒｄｎ、および／またはＣａｖ １．２、および／またはＡｎｋＢおよび／またはＲｙＲ２の相対レベルの増加（すなわち、正規化）によって測定した、カルシウムシグナル伝達経路に関与する心筋細胞の心室タンパク質を評価することによって、さらなる利益も明らかにされる。

【0230】

実施例２：アデノ随伴ウイルスベクターのインビトロ試験
本明細書に記載されるＡＡＶベクター（図１１～図１２を参照）を調製し、ヒト心筋細胞株である分化したＡＣ１６細胞を形質導入するために使用した。ＰＫＰ２（ＰＫＰ２ａアイソフォーム）の発現レベルをウェスタンブロットで評価した（図５Ａ～図５Ｂ）。驚くべきことに、ＭＨＣＫ７プロモーターは、心筋細胞でＰＫＰ２の強固な発現を引き起こすが、ｈＴｎｎＴ２プロモーター（「ｈＴｎＴ」）は、現在の試験条件下では、バックグラウンドを超えるわずかなＰＫＰ２レベルを生成する。ＡＡＶｒｈ．７４血清型は、ＡＡＶ９血清型ベクターよりも高いＰＫＰ２の発現を誘導した。

【0231】

これらの結果に基づいて、ＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶｒｈ７４ベクターを効果的に使用して、心筋細胞においてＰＫＰ２を発現させることができ、またＰＫＰ２発現の相対レベルのみを評価する場合、ＭＨＣＫ７プロモーターは、ｈＴｎｎＴ２プロモーターよりも優れていると結論付けた。

【0232】

実施例３：アデノ随伴ウイルスベクターのインビボ有効性
Ｃｅｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ．，２０１７に記載されるようなＰＫＰ２欠損の「ＰＫＰ２－ｃＫＯ」マウスモデルを得た。この心筋細胞特異的、タモキシフェン活性化ＰＫＰ２ノックアウトマウス系統（αＭＨＣ－Ｃｒｅ－ＥＲ（Ｔ２）／Ｐｋｐ２ ｆｌ／ｆｌ、「ＰＫＰ２－ｃＫＯ」と称される）を利用して、ＰＫＰ２発現喪失の開始を制御した（Ｃｅｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ，２０１７を参照）。このマウスモデルにおけるＰＫＰ２発現の条件付き喪失は、成体筋細胞に限定され、ＰＫＰ２－ｃＫＯの結果としての分子的、構造的および機能的事象の経時的進行が確立されている（Ｃｅｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ，２０１７）。成人の心室筋細胞のＰＫＰ２欠損は、ＡＲＶＣの疾患表現型と一致する、「特徴的な」機能的、分子的、および構造的な指標を含む、ＲＶ優勢の不整脈源性心筋症を引き起こすのに十分である。

【0233】

ＰＫＰ２－Ｃｋｏマウスにタモキシフェンを注射し、筋細胞特異的なＰＫＰ２のノックアウトを引き起こした。マウスに、ＡＡＶベクター（以下に説明）を３×１０^１３ｖｇ／ｋｇで静脈内（尾静脈）注射した。四週間後、ＰＫＰ２の筋細胞特異的ノックアウトは、マウスをタモキシフェンで処置することによって誘導された。使用したベクターゲノムは：

【0234】

５’ＩＴＲ；ＭＨＣＫ７プロモーター（そのエンハンサーエレメントを含む）；ＳＶ４０イントロン；コザック配列；ＰＫＰａ導入遺伝子；ＷＰＲＥ（ｘ）；ｈＧＨポリアデニル化配列）；３’ＩＴＲ－図１１に示す。

【0235】

５’ＩＴＲ；ｈＴｎｎＴ２プロモーター（エクソン１を含む）；コザック配列；ＰＫＰａ導入遺伝子；ＷＰＲＥ（ｘ）；ｈＧＨポリアデニル化配列）；３’ＩＴＲ－図１２に示す。

【0236】

各ベクターゲノムを、ＡＡＶ９血清型またはＡＡＶｒｈ７４血清型ベクターで試験した。

【0237】

ＡＡＶ処置の２５週間後または３２週間後である、タモキシフェン処置の２１日後または２８日後に、マウスを、Ｃｅｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ，２０１７に本質的に記載されるように、または当技術分野で公知の標準方法論を使用して、様々な生理パラメータについて評価した。疾患の治療における有効性は、左心室駆出率（ＬＶＥＦ％）（図６Ａ～図６Ｄ）、左心室短縮率（ＦＳ％）（図７Ａ～図７Ｄ）、平方ミリメートル単位の右心室面積（ＲＶ面積（ｍｍ^２））（図８Ａ～図８Ｄ）、毎秒ミリメートル単位の右心室速度時間積分（ＲＶ ＶＴＩ（ｍｍ／秒））（図９Ａ～図９Ｄ）、および線維症の程度（図１０Ａ～図１０Ｂ）によって評価された。これらの測定値は、ヒト疾患におけるＡＲＶＣを示す重要なパラメータの一つであるため、心筋細胞におけるＡＡＶを介したＰＫＰ２過剰発現の潜在的な有効性を評価するための適切な機能的および形態学的指標である。一般的に、右心室は通常、（疾患に関係なく）わずかに多くの線維症を有し、これは、ｃＫＯモデルにおけるＰＫＰ２の欠損と共にさらに悪化する。タモキシフェン注射はＰＫＰ遺伝子の筋細胞特異的ノックアウトを引き起こすため、タモキシフェン注射から２１日以内にこれらのパラメータの進行性の悪化が観察された。

【0238】

ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．７４を介したＰＫＰ発現の後に、程度の差こそあれ、疾患表現型の緩和の証拠が観察された。前処理パラダイム（タモキシフェン誘発ＰＫＰ ｃＫＯの４週間前にＡＡＶ）を使用してこれまでに研究された用量（３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）では、ＡＡＶ９は驚くべきことに、すべてのパラメータに対して最も強固な効果をもたらした。それにもかかわらず、ＡＡＶｒｈ７４の心臓指向性、およびこのモデルにおいてＡＡＶｒｈ．７４を介したＰＫＰ２の過剰発現により生物学的効果（例えば、ＬＶＥＦ％、ＦＳ％、および右心室面積）が観察されたことを考慮すると、適切なプロモーター（すなわち、ＭＨＣＫ７またはｈＴｎｎＴ２のいずれか）と組み合わせたＡＡＶｒｈ．７４の用量の最適化は、このベクターに対する強固な治療能力を可能にし得る。

【0239】

これらの結果は、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．７４の両方が、ＰＫＰ－ｃＫＯマウスが適切なモデルと考えられている、不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）［不整脈源性右室異形成（ＡＲＶＤ）または不整脈源性心筋症（ＡＣＭ）としても知られる］などのＰＫＰ２－関連疾患を治療するために使用できることを実証している。さらに、ＭＨＣＫ７プロモーターまたはｈＴｎｎＴ２プロモーターのいずれかを有するベクターは、ＰＫＰ２－関連疾患の治療に効果的であることが示されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

2023538519000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-04-25

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

発現カセット、および
任意で、隣接するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）
を含む、ポリヌクレオチドであって、
プロモーターに動作可能に連結された、プラコフィリン－２（ＰＫＰ２）またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列
を含む、前記ポリヌクレオチド。

【請求項2】

前記プロモーターが心臓特異的プロモーターである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項3】

前記プロモーターが筋特異的プロモーターである、請求項１または請求項２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

前記プロモーターが心筋細胞特異的プロモーターである、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項5】

前記プロモーターがミオシン重鎖クレアチンキナーゼ７（ＭＨＣＫ７）プロモーターである、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項6】

前記ＭＨＣＫ７プロモーターが、配列番号３１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項7】

前記プロモーターが心筋トロポニンＴ（ｈＴＮＮＴ２）プロモーターである、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項8】

前記ｈＴＮＮＴ２プロモーターが、配列番号３２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項9】

前記発現カセットが、心筋トロポニンＴ（ｈＴＮＮＴ２）遺伝子のエクソン１を含み、
任意で、前記ｈＴＮＮＴ２プロモーターおよびエクソン１が一緒に、配列番号３２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、
請求項１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項10】

前記プロモーターがユビキタスプロモーター、任意でＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーターである、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項11】

前記発現カセットがポリＡシグナルを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項12】

前記ポリＡシグナルがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡである、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項13】

前記発現カセットが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、任意でＷＰＲＥ（ｘ）を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項14】

前記プラコフィリン－２（ＰＫＰ２）またはその機能的バリアントがＰＫＰ２である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項15】

前記ＰＫＰ２が機能的ＰＫＰ２である、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項16】

前記ＰＫＰ２がヒトＰＫＰ２である、請求項１４または請求項１５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項17】

前記ＰＫＰ２がＰＫＰ２アイソフォームＡである、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項18】

前記ＰＫＰ２アイソフォームＡが、配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項19】

前記ＰＫＰ２がＰＫＰ２アイソフォームＢである、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項20】

前記ＰＫＰ２が、配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項21】

ＰＫＰ２をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトＰＫＰ２ポリヌクレオチドである、請求項１～２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項22】

ＰＫＰ２をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項23】

ＰＫＰ２をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項24】

少なくとも約４．０ｋｂ、少なくとも約４．１ｋｂ、少なくとも約４．２ｋｂ、少なくとも約４．３ｋｂ、少なくとも約４．４ｋｂ、または少なくとも約４．５ｋｂを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項25】

最大で約４．１ｋｂ、最大で約４．２ｋｂ、最大で約４．３ｋｂ、最大で約４．４ｋｂ、最大で約４．５ｋｂ、または最大で約４．６ｋｂを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項26】

４．０ｋｂ～４．６ｋｂ、４．０ｋｂ～４．５ｋｂ、または４．０ｋｂ～４．４ｋｂを含むか、あるいは４．０ｋｂ～４．３ｋｂ、４．０ｋｂ～４．２ｋｂ、または４．０ｋｂ～４．１ｋｂを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項27】

前記ＰＫＰ２またはその機能的バリアントが、少なくとも８００個または少なくとも８３０個のアミノ酸を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項28】

配列番号８～１５のいずれか一つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項29】

前記発現カセットが、５’および３’の逆位末端反復（ＩＴＲ）によって隣接されている、請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項30】

前記ＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲであり、および／または
前記ＩＴＲが、配列番号２０～２６のいずれか一つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、
請求項２９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項31】

請求項１～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子治療ベクター。

【請求項32】

前記遺伝子治療ベクターが組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項３１に記載のベクター。

【請求項33】

前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９またはその機能的バリアントである、請求項３２に記載のベクター。

【請求項34】

前記ｒＡＡＶベクターが、配列番号７７のいずれか一つと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む、請求項３３に記載のベクター。

【請求項35】

前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ１０またはその機能的バリアントである、請求項３２に記載のベクター。

【請求項36】

前記ｒＡＡＶベクターが、配列番号７９のいずれか一つと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む、請求項３５に記載のベクター。

【請求項37】

前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ６またはその機能的バリアントである、請求項３２に記載のベクター。

【請求項38】

前記ｒＡＡＶベクターが、配列番号７８のいずれか一つと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む、請求項３７に記載のベクター。

【請求項39】

前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ７４またはその機能的バリアントである、請求項３８に記載のベクター。

【請求項40】

前記ｒＡＡＶベクターが、配列番号８０のいずれか一つと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む、請求項３９に記載のベクター。

【請求項41】

それを必要とする対象において疾患または障害を治療および／または予防する方法であって、請求項３１～４０のいずれか一項に記載のベクターを前記対象に投与する工程を含む、前記方法。

【請求項42】

前記疾患または障害が心障害である、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記疾患または障害が心筋症である、請求項４１または４２に記載の方法。

【請求項44】

前記心筋症が、不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記心筋症が、肥大型心筋症または拡張型心筋症である、請求項４３に記載の方法。

【請求項46】

前記疾患または障害が、心筋の線維脂肪性浸潤によって特徴付けられる、請求項４１に記載の方法。

【請求項47】

前記疾患または障害が心不全である、請求項４１または４２に記載の方法。

【請求項48】

前記対象が哺乳動物である、請求項４１～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記対象が霊長類である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記対象がヒトである、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記対象がＰＫＰ２遺伝子に変異を有する、請求項４１～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記ベクターが、静脈内注射、心臓内注射、心臓内注入、および／または心臓カテーテル法により投与される、請求項４１～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記投与が、ＰＫＰ２発現を少なくとも約５％増加させる、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記投与が、ＰＫＰ２発現を少なくとも約３０％増加させる、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記投与が、ＰＫＰ２発現を少なくとも約７０％増加させる、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記投与が、ＰＫＰ２発現を約５％～約１０％増加させる、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記投与が、ＰＫＰ２発現を約３０％～約５０％増加させる、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記投与が、ＰＫＰ２発現を約５０％～約７０％増加させる、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記投与が、ＰＫＰ２発現を約７０％～約１００％増加させる、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記疾患または障害を治療および／または予防する、請求項４１～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

有効量の前記ベクターを投与する工程を含む、請求項４１～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記疾患または障害が、前記対象のＰＫＰ２の機能喪失に関連するかまたはそれにより引き起こされる、請求項４１～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記疾患または障害が、前記対象のＰＫＰ２の機能獲得に関連するかまたはそれにより引き起こされる、請求項４１～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記対象が、
配列番号２の配列を有するヒトＰＫＰ２をコードするヒトＰＫＰ２遺伝子に対して、Ａｒｇ４９０Ｔｒｐ、Ａｓｐ２６Ａｓｎ、Ｔｈｒ５０＿Ｖａｌ５１ＳｅｒｆｓＸ６０、Ａｒｇ７９Ｘ、Ｔｙｒ８６Ｘ、Ｇｌｎ１３３Ｘ、Ｖａｌ４０６ＳｅｒｆｓＸ３、Ｔｙｒ６１６Ｘ、Ｔｒｐ６７６Ｘ、Ｃｙｓ７９６Ａｒｇ、Ｃｙｓ７９６Ｅ、Ｔｙｒ８０７Ｘ、Ｇｌｕ６２Ｌｙｓ、Ｓ６８８Ｐ、Ｔｒｐ８４８Ｘ、Ｙ８６Ｘ、Ｖ４０６Ｘ、Ｙ６１６Ｘ、Ｗ８４８Ｘ、およびＹ８０７Ｘから選択されるアミノ酸置換を引き起こす変異
を有する、請求項４１～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

有効量の前記ベクターを含む医薬組成物を投与する工程を含む、請求項４１～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

約１×１０^１１ベクターゲノムから約１×１０^１３ベクターゲノムのベクターを前記対象に投与する工程、約１×１０^１２ベクターゲノムから約１×１０^１４ベクターゲノムのベクターを前記対象に投与する工程、または約１×１０^１３ベクターゲノムから約１×１０^１５ベクターゲノムのベクターを前記対象に投与する工程を含む、請求項４１～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

請求項３１～４０のいずれか一項に記載のベクターを含む、医薬組成物。

【請求項68】

請求項３１～４０のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項６８に記載の医薬組成物および任意で使用説明書を含む、キット。

【請求項69】

任意で請求項４１～６６のいずれか一項に記載の方法による、疾患または障害の治療における請求項３１～４０のいずれか一項に記載のベクターの使用。

【請求項70】

任意で請求項４１～６６のいずれか一項に記載の方法による、疾患または障害の治療における使用のための請求項３１～４０のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項71】

配列番号１２～１５および８９～９２のいずれか一つまたは配列番号８～１１および９３～９６のいずれか一つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項72】

前記プロモーターがＭＨＣＫ７プロモーターである、請求項７１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項73】

前記ＭＨＣＫ７プロモーターが、配列番号３１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項７２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項74】

前記ＰＫＰ２がヒトＰＫＰ２である、請求項７１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項75】

前記ＰＫＰ２がＰＫＰ２アイソフォームＡである、請求項７４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項76】

前記ＰＫＰ２アイソフォームＡが、配列番号１と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を共有する、請求項７５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項77】

請求項７１～７６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子治療ベクター。

【請求項78】

前記遺伝子治療ベクターが組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項７７に記載のベクター。

【請求項79】

前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９ベクターである、請求項７８に記載のベクター。

【請求項80】

前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ７４ベクターである、請求項７８に記載のベクター。

【請求項81】

ＰＫＰ２遺伝子に変異を有すると特定された対象において心障害を治療および／または予防する方法であって、請求項７７～８０のいずれか一項に記載のベクターを前記対象に投与する工程を含む、前記方法。

【請求項82】

前記心障害が、心筋症、任意で不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）、肥大型心筋症、または拡張型心筋症である、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記心障害が心不全である、請求項８１に記載の方法。

【請求項84】

前記対象が哺乳動物である、請求項８１～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記ベクターが、静脈内注射、心臓内注射、心臓内注入、および／または心臓カテーテル法により投与される、請求項８１～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

左心室駆出率（ＬＶＥＦ％）の減少を、ＰＫＰ２遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された減少と比較して任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する、請求項８１～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

左心室短縮率（ＦＳ％）の減少を、ＰＫＰ２遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された減少と比較して任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する、請求項８１～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

平方ミリメートル単位の右心室面積（ＲＶ面積（ｍｍ２））の増加を、ＰＫＰ２遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された増加と比較して任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する、請求項８１～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

毎秒ミリメートル単位の右心室速度時間積分（ＲＶ ＶＴＩ（ｍｍ／秒））の減少を、ＰＫＰ２遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された減少と比較して任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する、請求項８１～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

左心室または右心室の線維症の増加を、ＰＫＰ２遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された増加と比較して任意で約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％、防止または低減する、請求項８１～８９のいずれか一項に記載の方法。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0097】

[本発明1001]
発現カセット、および
任意で、隣接するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）
を含む、ポリヌクレオチドであって、
プロモーターに動作可能に連結された、プラコフィリン－2（ＰＫＰ2）またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列
を含む、前記ポリヌクレオチド。
[本発明1002]
前記プロモーターが心臓特異的プロモーターである、本発明1001のポリヌクレオチド。
[本発明1003]
前記プロモーターが筋特異的プロモーターである、本発明1001または本発明1002のポリヌクレオチド。
[本発明1004]
前記プロモーターが心筋細胞特異的プロモーターである、本発明1001～1003のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1005]
前記プロモーターがミオシン重鎖クレアチンキナーゼ7（ＭＨＣＫ7）プロモーターである、本発明1001～1004のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1006]
前記ＭＨＣＫ7プロモーターが、配列番号31と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を共有する、本発明1005のポリヌクレオチド。
[本発明1007]
前記プロモーターが心筋トロポニンＴ（ｈＴＮＮＴ2）プロモーターである、本発明1001～1004のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1008]
前記ｈＴＮＮＴ2プロモーターが、配列番号32と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を共有する、本発明1007のポリヌクレオチド。
[本発明1009]
前記発現カセットが、心筋トロポニンＴ（ｈＴＮＮＴ2）遺伝子のエクソン1を含み、
任意で、前記ｈＴＮＮＴ2プロモーターおよびエクソン1が一緒に、配列番号32と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を共有する、
本発明1001～1008のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1010]
前記プロモーターがユビキタスプロモーター、任意でＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーターである、本発明1001～1004のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1011]
前記発現カセットがポリＡシグナルを含む、本発明1001～1010のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1012]
前記ポリＡシグナルがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡである、本発明1011のポリヌクレオチド。
[本発明1013]
前記発現カセットが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、任意でＷＰＲＥ（ｘ）を含む、本発明1001～1012のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1014]
前記プラコフィリン－2（ＰＫＰ2）またはその機能的バリアントがＰＫＰ2である、本発明1001～1013のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1015]
前記ＰＫＰ2が機能的ＰＫＰ2である、本発明1014のポリヌクレオチド。
[本発明1016]
前記ＰＫＰ2がヒトＰＫＰ2である、本発明1014または本発明1015のポリヌクレオチド。
[本発明1017]
前記ＰＫＰ2がＰＫＰ2アイソフォームＡである、本発明1016のポリヌクレオチド。
[本発明1018]
前記ＰＫＰ2アイソフォームＡが、配列番号1と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を共有する、本発明1017のポリヌクレオチド。
[本発明1019]
前記ＰＫＰ2がＰＫＰ2アイソフォームＢである、本発明1016のポリヌクレオチド。
[本発明1020]
前記ＰＫＰ2が、配列番号2と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を共有する、本発明1019のポリヌクレオチド。
[本発明1021]
ＰＫＰ2をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトＰＫＰ2ポリヌクレオチドである、本発明1001～1020のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1022]
ＰＫＰ2をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号3と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を共有する、本発明1001～1021のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1023]
ＰＫＰ2をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号4と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を共有する、本発明1001～1021のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1024]
少なくとも約4．0ｋｂ、少なくとも約4．1ｋｂ、少なくとも約4．2ｋｂ、少なくとも約4．3ｋｂ、少なくとも約4．4ｋｂ、または少なくとも約4．5ｋｂを含む、本発明1001～1023のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1025]
最大で約4．1ｋｂ、最大で約4．2ｋｂ、最大で約4．3ｋｂ、最大で約4．4ｋｂ、最大で約4．5ｋｂ、または最大で約4．6ｋｂを含む、本発明1001～1024のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1026]
4．0ｋｂ～4．6ｋｂ、4．0ｋｂ～4．5ｋｂ、または4．0ｋｂ～4．4ｋｂを含むか、あるいは4．0ｋｂ～4．3ｋｂ、4．0ｋｂ～4．2ｋｂ、または4．0ｋｂ～4．1ｋｂを含む、本発明1001～1025のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1027]
前記ＰＫＰ2またはその機能的バリアントが、少なくとも800個または少なくとも830個のアミノ酸を含む、本発明1001～1025のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1028]
配列番号8～15のいずれか一つと少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を共有する、本発明1001～1027のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1029]
前記発現カセットが、5’および3’の逆位末端反復（ＩＴＲ）によって隣接されている、本発明1001～1028のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1030]
前記ＩＴＲがＡＡＶ2 ＩＴＲであり、および／または
前記ＩＴＲが、配列番号20～26のいずれか一つと少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を共有する、
本発明1029のポリヌクレオチド。
[本発明1031]
本発明1001～1030のいずれかのポリヌクレオチドを含む、遺伝子治療ベクター。
[本発明1032]
前記遺伝子治療ベクターが組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、本発明1031のベクター。
[本発明1033]
前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ9またはその機能的バリアントである、本発明1032のベクター。
[本発明1034]
前記ｒＡＡＶベクターが、配列番号77のいずれか一つと90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む、本発明1033のベクター。
[本発明1035]
前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ10またはその機能的バリアントである、本発明1032のベクター。
[本発明1036]
前記ｒＡＡＶベクターが、配列番号79のいずれか一つと90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む、本発明1035のベクター。
[本発明1037]
前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ6またはその機能的バリアントである、本発明1032のベクター。
[本発明1038]
前記ｒＡＡＶベクターが、配列番号78のいずれか一つと90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む、本発明1037のベクター。
[本発明1039]
前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ74またはその機能的バリアントである、本発明1038のベクター。
[本発明1040]
前記ｒＡＡＶベクターが、配列番号80のいずれか一つと90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を共有するキャプシドタンパク質を含む、本発明1039のベクター。
[本発明1041]
それを必要とする対象において疾患または障害を治療および／または予防する方法であって、本発明1031～1040のいずれかのベクターを前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1042]
前記疾患または障害が心障害である、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記疾患または障害が心筋症である、本発明1041または1042の方法。
[本発明1044]
前記心筋症が、不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）である、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記心筋症が、肥大型心筋症または拡張型心筋症である、本発明1043の方法。
[本発明1046]
前記疾患または障害が、心筋の線維脂肪性浸潤によって特徴付けられる、本発明1041の方法。
[本発明1047]
前記疾患または障害が心不全である、本発明1041または1042の方法。
[本発明1048]
前記対象が哺乳動物である、本発明1041～1057のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記対象が霊長類である、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記対象がヒトである、本発明1049の方法。
[本発明1051]
前記対象がＰＲＰ2遺伝子に変異を有する、本発明1041～1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記ベクターが、静脈内注射、心臓内注射、心臓内注入、および／または心臓カテーテル法により投与される、本発明1041～1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記投与が、ＰＫＰ2発現を少なくとも約5％増加させる、本発明1041～1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
前記投与が、ＰＫＰ2発現を少なくとも約30％増加させる、本発明1041～1052のいずれかの方法。
[本発明1055]
前記投与が、ＰＫＰ2発現を少なくとも約70％増加させる、本発明1041～1052のいずれかの方法。
[本発明1056]
前記投与が、ＰＫＰ2発現を約5％～約10％増加させる、本発明1041～1052のいずれかの方法。
[本発明1057]
前記投与が、ＰＫＰ2発現を約30％～約50％増加させる、本発明1041～1052のいずれかの方法。
[本発明1058]
前記投与が、ＰＫＰ2発現を約50％～約70％増加させる、本発明1041～1052のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記投与が、ＰＫＰ2発現を約70％～約100％増加させる、本発明1041～1052のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記疾患または障害を治療および／または予防する、本発明1041～1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
有効量の前記ベクターを投与する工程を含む、本発明1041～1060のいずれかの方法。
[本発明1062]
前記疾患または障害が、前記対象のＰＫＰ2の機能喪失に関連するかまたはそれにより引き起こされる、本発明1041～1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
前記疾患または障害が、前記対象のＰＫＰ2の機能獲得に関連するかまたはそれにより引き起こされる、本発明1041～1061のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記対象が、
配列番号2の配列を有するヒトＰＫＰ2をコードするヒトＰＫＰ2遺伝子に対して、ｐ．Ａｒｇ490Ｔｒｐ、Ａｓｐ26Ａｓｎ、Ｔｈｒ50＿Ｖａｌ51ＳｅｒｆｓＸ60、Ａｒｇ79Ｘ、Ｔｙｒ86Ｘ、Ｇｌｎ133Ｘ、Ｖａｌ406ＳｅｒｆｓＸ3、Ｔｙｒ616Ｘ、Ｔｒｐ676Ｘ、Ｃｙｓ796Ａｒｇ、Ｃｙｓ796Ｅ、Ｔｙｒ807Ｘ、Ｇｌｕ62Ｌｙｓ、Ｓ688Ｐ、Ｔｒｐ848Ｘ、Ｙ86Ｘ、Ｖ406Ｘ、Ｙ616Ｘ、Ｗ848Ｘ、およびＹ807Ｘから選択されるアミノ酸置換を引き起こす変異
を有する、本発明1041～1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
有効量の前記ベクターを含む医薬組成物を投与する工程を含む、本発明1041～1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
約1×10 ¹¹ ベクターゲノムから約1×10 ¹³ ベクターゲノムのベクターを前記対象に投与する工程、約1×10 ¹² ベクターゲノムから約1×10 ¹⁴ ベクターゲノムのベクターを前記対象に投与する工程、または約1×10 ¹³ ベクターゲノムから約1×10 ¹⁵ ベクターゲノムのベクターを前記対象に投与する工程を含む、本発明1041～1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
本発明1031～1040のいずれかのベクターを含む、医薬組成物。
[本発明1068]
本発明1031～1040のいずれかのベクターまたは本発明1068の医薬組成物および任意で使用説明書を含む、キット。
[本発明1069]
任意で本発明1041～1066のいずれかの方法による、疾患または障害の治療における本発明1031～1040のいずれかのベクターの使用。
[本発明1070]
任意で本発明1041～1066のいずれかの方法による、疾患または障害の治療における使用のための本発明1031～1040のいずれかのベクター。
[本発明1071]
配列番号12～15および89～92のいずれか一つまたは配列番号8～11および93～96のいずれか一つと少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1072]
前記プロモーターがＭＨＣＫ7プロモーターである、本発明1071のポリヌクレオチド。
[本発明1073]
前記ＭＨＣＫ7プロモーターが、配列番号31と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を共有する、本発明1072のポリヌクレオチド。
[本発明1074]
前記ＰＫＰ2がヒトＰＫＰ2である、本発明1071のポリヌクレオチド。
[本発明1075]
前記ＰＫＰ2がＰＫＰ2アイソフォームＡである、本発明1074のポリヌクレオチド。
[本発明1076]
前記ＰＫＰ2アイソフォームＡが、配列番号1と少なくとも80％、90％、95％、99％、または100％の同一性を共有する、本発明1075のポリヌクレオチド。
[本発明1077]
本発明1071～1076のいずれかのポリヌクレオチドを含む、遺伝子治療ベクター。
[本発明1078]
前記遺伝子治療ベクターが組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、本発明1077のベクター。
[本発明1079]
前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ9ベクターである、本発明1078のベクター。
[本発明1080]
前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶｒｈ74ベクターである、本発明1078のベクター。
[本発明1081]
ＰＲＰ2遺伝子に変異を有すると特定された対象において心障害を治療および／または予防する方法であって、本発明1077～1080のいずれかのベクターを前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1082]
前記心障害が、心筋症、任意で不整脈源性右室心筋症（ＡＲＶＣ）、肥大型心筋症、または拡張型心筋症である、本発明1081の方法。
[本発明1083]
前記心障害が心不全である、本発明1081の方法。
[本発明1084]
前記対象が哺乳動物である、本発明1081～1083のいずれかの方法。
[本発明1085]
前記ベクターが、静脈内注射、心臓内注射、心臓内注入、および／または心臓カテーテル法により投与される、本発明1081～1084のいずれかの方法。
[本発明1086]
左心室駆出率（ＬＶＥＦ％）の減少を、ＰＲＰ2遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された減少と比較して任意で約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、または約100％、防止または低減する、本発明1081～1085のいずれかの方法。
[本発明1087]
左心室短縮率（ＦＳ％）の減少を、ＰＲＰ2遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された減少と比較して任意で約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、または約100％、防止または低減する、本発明1081～1086のいずれかの方法。
[本発明1088]
平方ミリメートル単位の右心室面積（ＲＶ面積（ｍｍ2））の増加を、ＰＲＰ2遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された増加と比較して任意で約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、または約100％、防止または低減する、本発明1081～1087のいずれかの方法。
[本発明1089]
毎秒ミリメートル単位の右心室速度時間積分（ＲＶ ＶＴＩ（ｍｍ／秒））の減少を、ＰＲＰ2遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された減少と比較して任意で約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、または約100％、防止または低減する、本発明1081～1088のいずれかの方法。
[本発明1090]
左心室または右心室の線維症の増加を、ＰＲＰ2遺伝子に変異を有すると特定された未治療の対象において観察された増加と比較して任意で約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、または約100％、防止または低減する、本発明1081～1089のいずれかの方法。
様々な他の態様および実施形態が、以下の詳細な説明に開示されている。本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

【国際調査報告】