特表 2023-538665 トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントを有するＣＯＶＩＤ－１９ワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-08

(54)【発明の名称】トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントを有するＣＯＶＩＤ－１９ワクチン

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/215 20060101AFI20230901BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230901BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20230901BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20230901BHJP

   A61K 47/06 20060101ALI20230901BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20230901BHJP

   C12N 15/866 20060101ALI20230901BHJP

   C12N 15/50 20060101ALI20230901BHJP

【ＦＩ】

A61K39/215

A61P31/14

A61K9/107

A61K47/22

A61K47/06

A61K47/26

C12N15/866 Z ZNA

C12N15/50

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023513099

(86)(22)【出願日】2021-08-23

(85)【翻訳文提出日】2023-04-14

(86)【国際出願番号】 US2021047149

(87)【国際公開番号】W WO2022046633

(87)【国際公開日】2022-03-03

(31)【優先権主張番号】63/069,171

(32)【優先日】2020-08-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/184,155

(32)【優先日】2021-05-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/189,044

(32)【優先日】2021-05-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/215,092

(32)【優先日】2021-06-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517055195

【氏名又は名称】サノフィ パスツール インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】305060279

【氏名又は名称】グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】ナタリー・アノソバ

(72)【発明者】

【氏名】サルバドール・フェルナンド・オウサル

(72)【発明者】

【氏名】キャサリン・ベリー

(72)【発明者】

【氏名】フローレンス・ブデ

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・ブロイアー

(72)【発明者】

【氏名】ダニロ・カシミロ

(72)【発明者】

【氏名】ローマン・エム・チックス

(72)【発明者】

【氏名】グスタボ・ダヤン

(72)【発明者】

【氏名】ガイ・デ・ブライン

(72)【発明者】

【氏名】カルロス・ダイアズグラナドーズ

(72)【発明者】

【氏名】トン－ミン・フー

(72)【発明者】

【氏名】マリー・ギャリノ

(72)【発明者】

【氏名】ロリー・グレイディ

(72)【発明者】

【氏名】サンジェイ・グルナタン

(72)【発明者】

【氏名】キリル・カルニン

(72)【発明者】

【氏名】ニコライ・クラムツォーフ

(72)【発明者】

【氏名】ヴァレリー・ルキュリエ

(72)【発明者】

【氏名】ナウシーン・ラフマーン

(72)【発明者】

【氏名】ソフィー・ルイス

(72)【発明者】

【氏名】スティーヴン・サバリーノ

(72)【発明者】

【氏名】サランヤ・シュリダー

(72)【発明者】

【氏名】インドレッス・ケー・スリヴァスターヴァ

(72)【発明者】

【氏名】ジェームズ・タルタリア

(72)【発明者】

【氏名】ティモシー・ティベッツ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

【Ｆターム（参考）】

4C076AA17

4C076BB15

4C076CC06

4C076DD08F

4C076DD23

4C076DD26

4C076DD34

4C076DD59

4C076FF11

4C085AA03

4C085BA71

4C085BB11

4C085CC08

4C085DD62

4C085FF11

4C085GG03

(57)【要約】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症およびＣＯＶＩＤ－１９の予防的処置のための新規ワクチン、ならびにそのワクチンを作製する方法が提供され、ここで、ワクチンは、トコフェロールおよびスクアレンを含む水中油型エマルションを含有する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫原性組成物であって、
（ａ）１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質であって、１つまたはそれ以上のタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、
（ｉ）配列番号１０の残基１９～１２４３と少なくとも９５％同一であり、配列番号１０の６８７～６９０位における残基ＧＳＡＳ（配列番号６）と配列番号１０の９９１位および９９２位における残基ＰＰとが維持されている配列；ならびに
（ｉｉ）配列番号７を含む三量体化ドメイン
を含むポリペプチドの三量体である、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質；ならびに
（ｂ）トコフェロールおよびスクアレンを含む水中油型エマルションであるアジュバント
を含む、免疫原性組成物。

【請求項2】

免疫原性組成物であって、
（ａ）１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質であって、それぞれは、
Ｎ末端からＣ末端へと、（ｉ）昆虫またはバキュロウイルスタンパク質に由来するシグナルペプチド、（ｉｉ）配列番号１０の残基１９～１２４３と少なくとも９５％同一であり、配列番号１０の６８７～６９０位における残基ＧＳＡＳ（配列番号６）と配列番号１０の９９１位および９９２位における残基ＰＰとが維持されている配列；ならびに（ｉｉｉ）配列番号７を含む三量体化ドメインを含むポリペプチドを発現させるために、昆虫細胞にバキュロウイルスベクターを導入する工程、
ポリペプチドの発現および三量体化を可能にする条件下で昆虫細胞を培養する工程、ならびに
組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を培養物から単離する工程であって、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質はシグナル配列を有しないポリペプチドの三量体である、工程
を含む方法によって産生される、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質；ならびに
（ｂ）トコフェロールおよびスクアレンを含む水中油型エマルションであるアジュバント
を含む、免疫原性組成物。

【請求項3】

バキュロウイルスベクターは、ポリペプチドのコード配列に作動可能に連結したポリヘドリンプロモーターを含む、請求項２に記載の免疫原性組成物。

【請求項4】

昆虫またはバキュロウイルスタンパク質はキチナーゼである、請求項２または３に記載の免疫原性組成物。

【請求項5】

シグナルペプチドは配列番号３を含む、請求項４に記載の免疫原性組成物。

【請求項6】

（ｉ）配列番号１０の残基１９～１２４３と同一の配列を含むかもしくは有するポリペプチドの三量体である組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質、
（ｉｉ）配列番号１３の残基１９～１２４０と同一の配列を含むかもしくは有するポリペプチドの三量体である組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質、または
（ｉｉｉ）場合により等量の（ｉ）と（ｉｉ）の両方
を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項7】

組成物０．５ｍＬごとまたは組成物の各用量について：
（ｉ）それぞれの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を約２μｇ～約５０μｇ、場合により約２．５μｇ～約５０μｇまたは約５μｇ～約５０μｇ含む抗原構成成分；ならびに
（ｉｉ）水中油型エマルションアジュバントであって、
ａ）場合により表９に示され、さらに場合によりアジュバントが０．２５ｍＬで提供される、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン１０．６９ｍｇ、ポリソルベート８０ ４．８６ｍｇ、およびα－トコフェロール１１．８６ｍｇ、
ｂ）場合により表９に示され、さらに場合によりアジュバントが０．２５ｍＬで提供される、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン５．３５ｍｇ、ポリソルベート８０ ２．４３ｍｇ、およびα－トコフェロール５．９３ｍｇ、
ｃ）場合により表９に示され、さらに場合によりアジュバントが０．２５ｍＬで提供される、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン２．６７ｍｇ、ポリソルベート８０ １．２２ｍｇ、およびα－トコフェロール２．９７ｍｇ、または
ｄ）場合により表９に示され、さらに場合によりアジュバントが０．２５ｍＬで提供される、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン１．３４ｍｇ、ポリソルベート８０ ０．６１ｍｇ、およびα－トコフェロール１．４８ｍｇ
を含むか、またはそれらを混合することによって調製される、水中油型エマルションアジュバント
を含むか、またはそれらを混合することによって調製される、請求項１～６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項8】

組成物０．５ｍＬごとまたは組成物の各用量について、それぞれの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を２．５、５、１０、１５、または４５μｇ含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。

【請求項9】

抗原構成成分は：
リン酸一ナトリウム一水和物０．０９７ｍｇ、
無水リン酸二水素ナトリウム０．２６ｍｇ、
塩化ナトリウム２．２ｍｇ、
ポリソルベート２０ ５５０μｇ、および
水約０．２５ｍＬ
を含むか、またはそれらを混合することによって調製される、請求項７または８に記載の免疫原性組成物。

【請求項10】

組成物０．５ｍＬごとまたは組成物の各用量について、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を合計で５μｇ含み、場合により、２つの異なる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を等量で含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項11】

組成物０．５ｍＬごとまたは組成物の各用量について、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を合計で１０μｇ含み、場合により、２つの異なる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を等量で含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を含有する容器。

【請求項13】

バイアルまたはシリンジである、請求項１２に記載の容器。

【請求項14】

単回用量の免疫原性組成物を含有し、場合により、単回用量は０．５ｍＬの容量である、請求項１２または１３に記載の容器。

【請求項15】

複数回用量の免疫原性組成物を含有し、場合により、用量のそれぞれは０．５ｍＬの容量である、請求項１２または１３に記載の容器。

【請求項16】

筋肉内ワクチン接種のためのキットであって、２つの容器を含み、
（ａ）第１の容器は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質であって、１つまたはそれ以上のタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、
（ｉ）（Ａ）配列番号１０の６８７～６９０位における残基ＧＳＡＳ（配列番号６）と配列番号１０の９９１位および９９２位における残基ＰＰとが配列に維持されている、配列番号１０の残基１９～１２４３、または
（Ｂ）配列番号１３の６８４～６８７位における残基ＧＳＡＳ（配列番号６）と配列番号１３の９８８位および９８９位における残基ＰＰとが配列に維持されている、配列番号１３の残基１９～１２４０
と少なくとも９５％同一である配列；ならびに
（ｉｉ）配列番号７を含む三量体化ドメイン
を含むポリペプチドの三量体である、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む医薬組成物を含有し；
（ｂ）第２の容器は、トコフェロールおよびスクアレンを含む水中油型アジュバントを含有する、
キット。

【請求項17】

第１の容器は、
（ｉ）配列番号１０の残基１９～１２４３と同一の配列を含むかもしくは有するポリペプチドの三量体である組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質、
（ｉｉ）配列番号１３の残基１９～１２４０と同一の配列を含むかもしくは有するポリペプチドの三量体である組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質、または
（ｉｉｉ）場合により等量の（ｉ）と（ｉｉ）の両方
を含む、請求項１６に記載のキット。

【請求項18】

第１の容器は、１回またはそれ以上の用量の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含み、タンパク質の各用量は、合計で約２．５～４５、場合により５～４５μｇであり、場合により表Ａ、表８、または表１２に示されるようにリン酸緩衝生理食塩水０．２５ｍＬにおいて提供される、請求項１６または１７に記載のキット。

【請求項19】

タンパク質の各用量は、合計で２．５、５、１０、１５、または４５μｇである、請求項１８に記載のキット。

【請求項20】

第２の容器は、１回またはそれ以上の用量のアジュバントを含み、アジュバントの各用量は、０．２５ｍＬの容量であり、
（ａ）場合により表９に示されるように、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン１０．６９ｍｇ、
ポリソルベート８０ ４．８６ｍｇ、および
α－トコフェロール１１．８６ｍｇ、
（ｂ）場合により表９に示されるように、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン５．３５ｍｇ、
ポリソルベート８０ ２．４３ｍｇ、および
α－トコフェロール５．９３ｍｇ、
（ｃ）場合により表９に示されるように、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン２．６７ｍｇ、
ポリソルベート８０ １．２２ｍｇ、および
α－トコフェロール２．９７ｍｇ、または
（ｄ）場合により表９に示されるように、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン１．３４ｍｇ、
ポリソルベート８０ ０．６１ｍｇ、および
α－トコフェロール１．４８ｍｇ
を含む、請求項１６～１９のいずれか１項に記載のキット。

【請求項21】

ワクチンキットを作製する方法であって：
請求項１～１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の組換えＳタンパク質およびアジュバントを提供する工程、ならびに
タンパク質およびアジュバントを別個の滅菌容器に包装する工程
を含む、方法。

【請求項22】

それを必要とする対象においてＣＯＶＩＤ－１９を防止または改善する方法であって、対象に、請求項１～１１のいずれか１項に記載の予防有効量の免疫原性組成物を投与する工程を含む、方法。

【請求項23】

それを必要とする対象においてＣＯＶＩＤ－１９を防止または改善する方法であって、対象に、請求項１～１１のいずれか１項に記載の予防有効量の免疫原性組成物を投与する工程を含み、投与する工程の前に、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したことがあるか、または第１のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを接種されたことがある、方法。

【請求項24】

投与する工程の前に、対象は、遺伝子、サブユニット、または死滅ワクチンを接種されたことがある、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

対象は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ抗原をコードするｍＲＮＡを含む遺伝子ワクチンを接種されたことがある、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

投与する工程は、感染から、または対象が第１のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを接種されてから４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１年、またはそれ以上後、場合により４～１０か月後、さらに場合により８か月後に行われ、場合により、免疫原性組成物は、それぞれの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を２．５または５μｇ含み、さらに場合により、免疫原性組成物は一価または多価である、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

免疫原性組成物は、１用量当たり約５～約５０μｇ、または約２．５～約５０μｇ、場合により２．５、５、１０、１５、または４５μｇの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質で対象に筋肉内投与される、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

予防有効量は単回用量または２回もしくはそれ以上の用量で、場合により筋肉内に投与される、請求項２２～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

２用量の免疫原性組成物を約２週間～約３または４か月の間隔で対象に投与する工程を含み、免疫原性組成物の各用量は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を合計で２．５、５、または１０μｇ含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

間隔は、約３週間もしくは約２１日、または約４週間もしくは約２８日、または約１か月である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

対象はヒト対象であり、場合により、ヒト対象は、小児、成人、または高齢者である、請求項２２～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

場合により請求項２２～３１のいずれか１項に記載の方法における、ＣＯＶＩＤ－１９の予防的処置における使用のための、請求項１～１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項33】

場合により請求項２２～３１のいずれか１項に記載の方法における、ＣＯＶＩＤ－１９の予防的処置のための医薬の製造のための、請求項１～１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。

【請求項34】

トコフェロールは、アルファ－トコフェロール、場合によりＤ，Ｌ－アルファ－トコフェロールである、請求項１～３３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項35】

アジュバントは１μｍ未満の平均液滴サイズを有し、場合により、平均液滴サイズは、５００ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、５０～２００ｎｍ、１２０～１８０ｎｍ、または１４０～１８０ｎｍである、請求項１～３４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項36】

アジュバントは、０．２またはそれ以下のような、０．５もしくはそれ以下、または０．３もしくはそれ以下の多分散指数を有する、請求項１～３５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項37】

アジュバントは、ポロキサマー４０１、ポロキサマー１８８、ポリソルベート８０、トリオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、およびポリオキシエチレン１２セチル／ステアリルエーテルから選択される界面活性剤を、単独、または互いとの組合せ、または他の界面活性剤との組合せのいずれかで含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項38】

アジュバントは、ポリソルベート８０、トリオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、およびポリオキシエチレン１２セチル／ステアリルエーテルから選択される界面活性剤を、単独または互いとの組合せのいずれかで含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項39】

アジュバントはポリソルベート８０を含む、請求項１～３８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項40】

アジュバントは１種、２種、または３種の界面活性剤を含む、請求項１～３９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項41】

アジュバントにおけるスクアレンのトコフェロールに対する重量比は、０．１～１０、場合により０．２～５、０．３～３、０．４～２、０．７２～１．１３６、０．８～１、０．８５～０．９５、または０．９である、請求項１～４０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項42】

アジュバントにおけるスクアレンの界面活性剤に対する重量比は、０．７３～６．６、場合により１～５、１．２～４、１．７１～２．８、２～２．４、２．１～２．３、または２．２である、請求項１～４１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項43】

単回用量のアジュバントにおけるスクアレンの量は、少なくとも１．２ｍｇ、場合により１．２～２０ｍｇ、１．２～１５ｍｇ、１．２～２ｍｇ、１．２１～１．５２ｍｇ、２～４ｍｇ、２．４３～３．０３ｍｇ、４～８ｍｇ、４．８７～６．０５ｍｇ、８～１２．１ｍｇ、または９．７５～１２．１ｍｇである、請求項１～４２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項44】

単回用量のアジュバントにおけるトコフェロールの量は、少なくとも１．３ｍｇ、場合により１．３～２２ｍｇ、１．３～１６．６ｍｇ、１．３～２ｍｇ、１．３３～１．６９ｍｇ、２～４ｍｇ、２．６６～３．３９ｍｇ、４～８ｍｇ、５．３２～６．７７ｍｇ、８～１３．６ｍｇ、または１０．６５～１３．５３ｍｇである、請求項１～４３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項45】

単回用量のアジュバントにおける界面活性剤の量は、少なくとも０．４ｍｇ、場合により０．４～９．５ｍｇ、０．４～７ｍｇ、０．４～１ｍｇ、０．５４～０．７１ｍｇ、１～２ｍｇ、１．０８～１．４２ｍｇ、２～４ｍｇ、２．１６～２．８４ｍｇ、４～７ｍｇ、または４．３２～５．６８ｍｇである、請求項１～４４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項46】

アジュバントは、
スクアレン、
トコフェロール、場合によりＤ，Ｌ－アルファ－トコフェロール
界面活性剤、場合によりポリソルベート８０、および
水
を含むかまたはそれから本質的になる、請求項１～４５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項47】

筋肉内注射のための単回用量の容量は、０．０５～１ｍＬ、場合により０．１～０．６ｍＬ、０．２～０．３ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．４～０．６ｍＬ、または０．５ｍＬである、請求項１～４６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項48】

免疫原性組成物、または第１および第２の容器の内容物の混合物は、４～９、場合により５～８．５、５．５～８、または６．５～７．４のｐＨを有する、請求項１～４７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項49】

免疫原性組成物、または第１および第２の容器の内容物の混合物は、２５０～７５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、場合により２５０～５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２７０～５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、または２７０～４００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量モル浸透圧濃度を有する、請求項１～４８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項50】

免疫原性組成物、または第１および第２の容器の内容物の混合物は、スクアレンを１ｍＬ当たり０．８～１００ｍｇ、場合により１ｍＬ当たり１．２～４８．４ｍｇ、１ｍＬ当たり１０～３０ｍｇ、または１ｍＬ当たり２１．３８ｍｇ含む、請求項１～４９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項51】

筋肉内注射のための単回用量のアジュバントの容量は、組換えＳタンパク質との混合前に、０．０５ｍＬ～１ｍＬ、場合により０．１～０．６ｍＬ、０．２～０．３ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．４～０．６ｍＬ、または０．５ｍＬである、請求項１～５０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項52】

アジュバントは、組換えＳタンパク質との混合前に、
４～９、場合により５～８．５、５．５～８、または６．５～７．４のｐＨを有し、
２５０～７５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、場合により２５０～５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２７０～５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、または２７０～４００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量モル浸透圧濃度を有し、
場合により表９に示されるように、緩衝剤および／または浸透圧調整剤、場合により改変リン酸緩衝生理食塩水を含み、
１ｍＬ当たり０．８～１００ｍｇ、場合により１ｍＬ当たり１．２～４８．４ｍｇのスクアレン濃度を有し、
０．０５ｍＬ～１ｍＬ、場合により０．１～０．６ｍＬの単回用量の容量を有する、
請求項１～５１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項53】

組換えＳタンパク質は、アジュバントとの混合前に、
０．２～０．３ｍＬ、場合により０．２５ｍＬ、０．４～０．６ｍＬ、または０．５ｍＬの単回用量の容量、
４～９、場合により５～８．５、５．５～８、または６．５～７．４のｐＨ、および
２５０～７５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、場合により２５０～５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２７０～５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、または２７０～４００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量モル浸透圧濃度
を有する水性液体溶液で提供される、請求項１～５２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項54】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していない対象を処置するための、請求項１～５３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【請求項55】

それを必要とするヒト対象において、
１つもしくはそれ以上のＣＯＶＩＤ－１９症状の重症度および／もしくは１つもしくはそれ以上のＣＯＶＩＤ－１９症状が対象によって経験される時間を部分的もしくは完全に低下させる、
チャレンジ後に、確立された感染症を発症する可能性を低下させる、
疾病の進行を遅らせ、場合により生存を延長させる、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体を産生させる、ならびに／または
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質特異的Ｔ細胞応答である
免疫応答を誘発するための、請求項１～５４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、使用のための免疫原性組成物、容器、キット、方法、または使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月２４日に出願された米国仮出願第６３／０６９，１７１号；２０２１年５月４日に出願された同第６３／１８４，１５５号；２０２１年５月１４日に出願された同第６３／１８９，０４４号；および２０２１年６月２５日に出願された同第６３／２１５，０９２号の優先権を主張する。上述の優先権出願の開示は、それらの全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究開発
本発明は、米国保健福祉省およびＡＳＰＲ－ＢＡＲＤＡによって授与されたＨＨＳＯ１００２０１６００００５Ｉ；ならびに米国陸軍契約司令部ＡＣＣ－ＮＪによって交付され、米国保健福祉省および国防総省の共同ミッションとして授与された他の取引契約（ＯＴＡ）Ｗ１５ＱＫＮ－１６－９－１００２の下、政府支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

【0003】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる配列表を含有する。２０２１年８月１０日に作成された配列表の電子コピーは、０２５５３２＿ＷＯ００５＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、４８，８４５バイトのサイズである。

【背景技術】

【0004】

コロナウイルスは、多種多様な哺乳動物種およびトリ種に感染するエンベローププラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスのファミリーである。そのウイルスゲノムは、ウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質で構成され脂質エンベロープによって囲まれているカプシドに包まれている。脂質エンベロープには、膜（Ｍ）タンパク質、エンベロープ低分子膜（Ｅ）タンパク質、ヘマグルチニンエステラーゼ（ＨＥ）、およびスパイク（Ｓ）タンパク質が包埋されている。Ｓタンパク質はウイルスの細胞への付着および侵入を媒介する。

【0005】

ヒトコロナウイルス（ｈＣｏＶ）は呼吸器疾患を引き起こす。低病原性ｈＣｏＶは、上気道に感染し、軽度の感冒を引き起こす。高病原性ｈＣｏＶは、主に下気道に感染し、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）および中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの重度で死に至る場合もある肺炎を引き起こし得る。ｈＣｏＶによって引き起こされる重度の肺炎は、典型的には、急速なウイルス複製、大規模な炎症細胞浸潤、ならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの上昇に関連し、急性肺損傷および急性呼吸窮迫症候群をもたらす（例えば、非特許文献１を参照のこと）。

【0006】

２０１９年新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）としても公知の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、および最初のＳＡＲＳ－ＣｏＶに次いで７番目に知られた、ヒトに感染するコロナウイルスである（非特許文献２）。２００３年のＳＡＲＳの大流行に関与したＳＡＲＳ関連コロナウイルス株と同様、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はサルベコウイルス亜属のメンバーである（ベータ－ＣｏＶ Ｂ系統）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は進行中の２０１９～２１年のコロナウイルス疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因である（非特許文献３；非特許文献４；ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９０８９４７．３；非特許文献５）。ヒトからヒトへの伝播は主として呼吸器液滴およびエアロゾルを介して行われる。

【0007】

ＣＯＶＩＤ－１９の臨床プロファイルは多様である。大部分の症例では、感染した個人は無症候性であり得るかまたは軽度の症状を有し得る。症状を有する個人において、典型的に現れる症状としては、発熱、咳、息切れ、嗅覚脱失、および疲労が挙げられる。より重度の所見としては、急性呼吸窮迫症候群、脳卒中、およびサイトカイン放出症候群が挙げられ、これらは場合によっては死に至る。重度の疾病は、いかなる年齢の健康な個人にも生じる可能性があるが、主に高齢であるかまたは基礎疾患を有する成人において生じる。老年者は、最も一般的に冒され、高い死亡率を有する。重度の疾病および死亡に関連する併存疾患および他の状態としては、慢性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、免疫不全状態、肥満、重篤な心臓病（例えば、心不全、冠動脈疾患、または心ミオパチー）、鎌状赤血球症、糖尿病、高血圧症、肝疾患、および肺線維症が挙げられる。ＣＯＶＩＤ－１９のリスクは、国ごと、および世界中の国の中の地域ごとでも異なる（例えば、非特許文献６；非特許文献７を参照のこと）。

【0008】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、細胞表面タンパク質のアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）への結合を介して細胞に感染する（非特許文献８；非特許文献９）。ウイルスはＳタンパク質を介して宿主細胞への侵入を達成する。Ｓタンパク質は、クラスＩ融合タンパク質であり、ウイルスが免疫監視機構を逃れるのに役立つ多糖で厚くコーティングされている。このタンパク質は前駆体Ｓポリペプチドのプロセシングにより産生される。前駆体ポリペプチドは、グリコシル化、シグナルペプチドの除去、および残基６８５と６８６との間でのプロタンパク質転換酵素フーリンによる切断を受けて、２つのサブユニットＳ１およびＳ２を生じる。Ｓ１およびＳ２はプロトマーとして会合したままである。Ｓタンパク質は、プロトマーの三量体であり、準安定な融合前立体構造で存在する。Ｓ１サブユニットが宿主細胞受容体に結合すると、Ｓ１サブユニットはタンパク質から放出される。残りのＳ２サブユニットは高度に安定な融合後立体構造に移行し、ウイルスと宿主細胞との間での膜融合、したがってウイルスの細胞への侵入を容易にする（例えば、非特許文献１０；非特許文献１１を参照のこと）。

【0009】

Ｓタンパク質はワクチン開発において重要な標的である。このタンパク質は、融合前立体構造において、中和感受性が最も高いエピトープを提示すると予期される（例えば、非特許文献１０、前出を参照のこと）。首尾よい免疫化戦略は安定な抗原を必要とし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を融合前立体構造で安定化させる試みは記載されている（例えば、非特許文献１２を参照のこと）。

【0010】

ＣＯＶＩＤ－１９によって引き起こされた公衆衛生危機は、とりわけ開発途上国においては依然として収まっていない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株は出現し続けている。継続するＣＯＶＩＤ－１９の脅威と戦うのに役立ち得る有効なワクチンを開発する緊急の必要性は依然として存在する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｃｈａｎｎａｐｐａｎａｖａｒ ａｎｄ Ｐｅｒｌｍａｎ、Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ（２０１７）３９（５）：５２９～３９

【非特許文献2】Ｚｈｕら、Ｎ Ｅｎｇ Ｍｅｄ．（２０２０）３８２（８）：７２７～３３

【非特許文献3】Ｃｈａｎら、Ｌａｎｃｅｔ（２０２０）３９５（１０２２３）：５１４～２３

【非特許文献4】Ｘｕら、Ｌａｎｃｅｔ Ｒｅｓｐｉｒ Ｍｅｄ．（２０２０）ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ２２１３－２６００（２０）３００７６－Ｘ

【非特許文献5】Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａら、ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２０）ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．０２．０７．９３７８６２

【非特許文献6】ｄｅ Ｓｏｕｚａ、Ｎａｔ Ｈｕｍ Ｂｅｈａｖ．（２０２０）４：８５６～８６５

【非特許文献7】Ｃｈｅｎ、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．（２０２０）１１：４３８

【非特許文献8】Ｈｏｆｆｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ（２０２０）１８１（２）：２７１～８０

【非特許文献9】Ｗａｌｌｓら、Ｃｅｌｌ（２０２０）１８１（２）：２８１～９２

【非特許文献10】Ｗｒａｐｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０２０）１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｂ２５０７

【非特許文献11】Ｓｈａｎｇら、ＰＮＡＳ（２０２０）１１７（２１）：１１７２７～３４

【非特許文献12】Ｘｉｏｎｇら、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０２０）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９４－０２０－０４７８－５

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0012】

本開示は、免疫原性組成物であって、（ａ）１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質であって、１つまたはそれ以上のタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、（ｉ）（１）配列番号１０の残基１９～１２４３または（２）配列番号１３の残基１９～１２４０と少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６、９７、９８、または９９％）同一であり、配列番号１０の６８７～６９０位（および配列番号１３における対応する位置）における残基ＧＳＡＳ（配列番号６）と配列番号１０の９９１位および９９２位（および配列番号１３における対応する位置）における残基ＰＰとが維持されている配列；ならびに（ｉｉ）配列番号７を含む三量体化ドメインを含むポリペプチドの三量体である、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質；ならびに（ｂ）トコフェロールおよびスクアレンを含む水中油型エマルションであるアジュバントを含む、免疫原性組成物を提供する。組成物が２つまたはそれ以上のタンパク質を有すると記載される場合、これらのタンパク質は互いに異なることが意図されている。

【0013】

別の態様では、本開示は、免疫原性組成物であって、（ａ）１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質であって、それぞれは、Ｎ末端からＣ末端へと、（ｉ）昆虫またはバキュロウイルスタンパク質（例えば、キチナーゼ）に由来するシグナルペプチド、（ｉｉ）（１）配列番号１０の残基１９～１２４３または（２）配列番号１３の残基１９～１２４０と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６、９７、９８、または９９％）同一であり、配列番号１０の６８７～６９０位（および配列番号１３における対応する位置）における残基ＧＳＡＳ（配列番号６）と配列番号１０の９９１位および９９２位（および配列番号１３における対応する位置）における残基ＰＰとが維持されている配列；ならびに（ｉｉｉ）配列番号７を含む三量体化ドメインを含むポリペプチドを発現させるために、昆虫細胞にバキュロウイルスベクターを導入する工程、ポリペプチドの発現および三量体化を可能にする条件下で昆虫細胞を培養する工程、ならびに組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を培養物から単離する工程であって、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質はシグナル配列を有しないポリペプチドの三量体である、工程を含む方法によって取得可能である、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質；ならびに（ｂ）トコフェロールおよびスクアレンを含む水中油型エマルションであるアジュバントを含む、免疫原性組成物を提供する。一部の実施形態では、バキュロウイルス発現ベクターは、ポリペプチドのコード配列に作動可能に連結したポリヘドリンプロモーターを含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは昆虫またはバキュロウイルスキチナーゼに由来する。一部の実施形態では、シグナルペプチドは配列番号３を含む。

【0014】

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、１つ（一価）またはそれ以上（多価）の異なる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む。例えば、組成物は、２つ（二価）、３つ（三価）、または４つ（四価）の異なる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む。

【0015】

一部の実施形態では、組換えポリペプチドは、（ｉ）配列番号１０の残基１９～１２４３または（ｉｉ）配列番号１３の残基１９～１２４０と同一の配列を含むかまたは有する。一部の実施形態では、組成物は二価であり、配列番号１０の残基１９～１２４３と同一の配列を含むかまたは有する組換えポリペプチドの三量体である組換えタンパク質、および配列番号１３の残基１９～１２４０と同一の配列を含むかまたは有する組換えポリペプチドの三量体を、場合により等量で含む。

【0016】

一部の実施形態では、各用量（例えば、約０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、または０．７ｍＬにおける）の免疫原性組成物は：（ｉ）それぞれの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を約２μｇ～約５０μｇ、場合により約２．５μｇ～約５０μｇまたは約５μｇ～約５０μｇ含む抗原構成成分；ならびに（ｉｉ）水中油型エマルションアジュバントであって、ａ）場合により表９に示され、さらに場合によりアジュバントが０．２５ｍＬで提供される、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン１０．６９ｍｇ、ポリソルベート８０ ４．８６ｍｇ、およびα－トコフェロール１１．８６ｍｇ、ｂ）場合により表９に示され、さらに場合によりアジュバントが０．２５ｍＬで提供される、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン５．３４ｍｇ、ポリソルベート８０ ２．４３ｍｇ、およびα－トコフェロール５．９３ｍｇ、ｃ）場合により表９に示され、さらに場合によりアジュバントが０．２５ｍＬで提供される、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン２．６７ｍｇ、ポリソルベート８０ １．２２ｍｇ、およびα－トコフェロール２．９７ｍｇ、またはｄ）場合により表９に示され、さらに場合によりアジュバントが０．２５ｍＬで提供される、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン１．３４ｍｇ、ポリソルベート８０ ０．６１ｍｇ、およびα－トコフェロール１．４８ｍｇを含む、水中油型エマルションアジュバントを含むか、またはそれらを混合することによって調製される。あるいは、上述のタンパク質量は、組成物における総タンパク質量である。

【0017】

一部の実施形態では、各用量（例えば、約０．５ｍＬにおける）の免疫原性組成物は、抗原構成成分０．２５ｍＬとＡＳ０３アジュバント（ＡＳ０３_Ａ）０．２５ｍＬとを混合することによって調製される。抗原構成成分０．２５ｍＬは、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０９７５ｍｇ、リン酸水素ナトリウム十二水和物０．６５ｍｇ（無水リン酸水素二ナトリウム０．２６ｍｇに相当）、塩化ナトリウム２．２ｍｇ、ポリソルベート２０ ５０～６００（例えば、５５または５５０）μｇ、および水約０．２５ｍＬ（ｑ．ｓ．０．２５ｍＬまで）を含むことができるか、またはそれらを混合することによって調製することができる。ある特定の実施形態では、抗原構成成分０．２５ｍＬまたは最終免疫原性組成物（アジュバント含有）０．５ｍＬは、それぞれの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を２．５μｇ含み、場合により、組成物は、２つの異なる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を等量で含み；組成物が一価である場合、それは組換えＳタンパク質を２．５μｇ含む。ある特定の実施形態では、抗原構成成分０．２５ｍＬまたは最終免疫原性組成物（アジュバント含有）０．５ｍＬは、それぞれの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を５μｇ含み、場合により、組成物は、２つの異なる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を等量で含み；組成物が一価である場合、それは組換えＳタンパク質を５μｇ含む。ある特定の実施形態では、抗原構成成分０．２５ｍＬまたは最終免疫原性組成物（アジュバント含有）０．５ｍＬは、それぞれの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を１０μｇ含み、場合により、組成物は、２つの異なる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を等量で含み；組成物が一価である場合、それは組換えＳタンパク質を１０μｇ含む。あるいは、上述のタンパク質量は、組成物における各タンパク質のタンパク質量ではなく、組成物における総タンパク質量である。

【0018】

別の態様では、本開示は、単回用量または複数回用量の本明細書に記載される免疫原性組成物を含有する容器であって、各用量が例えば約０．２５または約０．５ｍＬの容量である、容器を提供する。一部の実施形態では、容器はバイアルまたはシリンジである。

【0019】

別の態様では、本開示は、筋肉内ワクチン接種のためのキットであって、２つの容器を含み、（ａ）第１の容器は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質であって、１つまたはそれ以上のタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、（ｉ）（Ａ）配列番号１０の６８７～６９０位における残基ＧＳＡＳ（配列番号６）と配列番号１０の９９１位および９９２位における残基ＰＰとが配列に維持されている、配列番号１０の残基１９～１２４３、または（Ｂ）配列番号１３の６８４～６８７位における残基ＧＳＡＳ（配列番号６）と配列番号１３の９８８位および９８９位における残基ＰＰとが配列に維持されている、配列番号１３の残基１９～１２４０と少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６、９７、９８、または９９％）同一である配列；ならびに（ｉｉ）配列番号７を含む三量体化ドメインを含むポリペプチドの三量体である、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む医薬組成物を含有し；（ｂ）第２の容器は、トコフェロールおよびスクアレンを含む水中油型アジュバントを含有する、キットを提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１０の残基１９～１２４３または（ｉｉ）配列番号１３の残基１９～１２４０と同一の配列を含むかまたは有する。さらなる実施形態では、容器は２つの異なる組換えＳタンパク質を含有し、それぞれは上述の配列のうちの１つを有する。一部の実施形態では、第１の容器は、場合により表Ａ、表８、または表１２に示されるようにリン酸緩衝生理食塩水において提供される１回またはそれ以上の用量の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含み、各用量（０．２５ｍＬの容量）は、組換えＳタンパク質を（合計でまたは別個に）約２．５μｇ～４５μｇ、場合により５μｇ～４５μｇ（例えば、２．５、５、１０、１５、または４５μｇ）有する。一部の実施形態では、第２の容器は、１回またはそれ以上の用量のアジュバントを含み、アジュバントの各用量は、０．２５ｍＬの容量であり、ａ）場合により表９に示されるように、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン１０．６９ｍｇ、ポリソルベート８０ ４．８６ｍｇ、およびα－トコフェロール１１．８６ｍｇ、ｂ）場合により表９に示されるように、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン５．３５ｍｇ、ポリソルベート８０ ２．４３ｍｇ、およびα－トコフェロール５．９３ｍｇ、ｃ）場合により表９に示されるように、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン２．６７ｍｇ、ポリソルベート８０ １．２２ｍｇ、およびα－トコフェロール２．９７ｍｇ、またはｄ）場合により表９に示されるように、リン酸緩衝生理食塩水中スクアレン１．３４ｍｇ、ポリソルベート８０ ０．６１ｍｇ、およびα－トコフェロール１．４８ｍｇを含む。

【0020】

本開示はまた、ワクチンキットを作製する方法であって、免疫原性組成物の組換えＳタンパク質およびアジュバントを提供する工程、ならびにタンパク質およびアジュバントを別個の滅菌容器に包装する工程を含む、方法を提供する。

【0021】

本開示は、それを必要とする対象においてＣＯＶＩＤ－１９を防止または改善する方法であって、対象に、本明細書における予防有効量の免疫原性組成物を投与する工程を含む、方法をさらに提供する。一部の実施形態では、予防有効量は単回用量または２回もしくはそれ以上の用量で投与される。一部の実施形態では、予防有効量は、１用量当たり約５～約５０μｇ、場合により１用量当たり５、１０、１５、または４５μｇの、単回用量または２回もしくはそれ以上の用量で筋肉内投与される組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質である。一部の実施形態では、２回またはそれ以上の用量の免疫原性組成物は、約２週間～約３か月（例えば、約３週間または約２１日）の間隔で投与され、免疫原性組成物の各用量は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を５μｇまたは１０μｇ含む。一部の実施形態では、対象は、下記の表Ｂにおけるレジメン１、１０、１１、または１２に従って、本明細書における免疫原性組成物を投与される。

【0022】

一部の実施形態では、本免疫原性組成物は、例えばＣＯＶＩＤ－１９を防止または改善するためのブースターワクチンとして、過去にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象または同じかもしくは異なるウイルス株に対するＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを接種されたことがある対象に使用される。第１のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンは、死滅ワクチン、サブユニットワクチン、または遺伝子ワクチン（例えば、ｍＲＮＡもしくはウイルスベクターワクチン）であり得る。ある特定の実施形態では、対象は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ抗原をコードするｍＲＮＡを含む遺伝子ワクチンを接種されたことがある。ある特定の実施形態では、本免疫原性組成物は、感染から、または対象が第１のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを接種されてから約４週間、約１か月、約３か月、約６か月、約４～１０か月、または約１年後に対象に投与され、場合により、免疫原性組成物は、組換えＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２タンパク質を２．５μｇまたは５μｇ含み、さらに場合により、免疫原性組成物は一価または多価である。さらなる実施形態では、ブースター接種は、第１のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン接種の終了から約８か月後に行われる。一部の実施形態では、遺伝子ワクチンは、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ抗原をコードするｍＲＮＡを含み、場合により、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は、配列番号１、４、１０、１３、もしくは１４、またはその抗原性断片を含む。ある特定の実施形態では、本明細書におけるブースター免疫原性組成物は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を１用量当たり２．５または５μｇ含む。ある特定の実施形態では、ブースター免疫原性組成物は一価（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１０または１３を含む組換えＳタンパク質を含む）または二価（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１０を含む第１の組換えＳタンパク質と、シグナル配列を有しない配列番号１３を含む第２の組換えＳタンパク質とを含む）である。一部の実施形態では、対象は、下記の表Ｂにおけるレジメン２、３、４、５、６、７、８、または９に従って、本明細書における免疫原性組成物を投与される。

【0023】

本開示はまた、ＣＯＶＩＤ－１９の予防的処置における使用のための、本明細書に記載される免疫原性組成物を提供する。

【0024】

本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９の予防的処置のための医薬の製造のための、本明細書に記載される免疫原性組成物の使用をさらに提供する。予防的処置は、本明細書に記載される、それを必要とする対象においてＣＯＶＩＤ－１９を防止または改善し得る。

【0025】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される免疫原性組成物において、組換えＳタンパク質は、本明細書におけるトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントと共にＣＯＶＩＤ－１９の予防的処置において使用され；本明細書に記載されるトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、組換えＳタンパク質と共にＣＯＶＩＤ－１９の予防的処置において使用され；ＣＯＶＩＤ－１９の予防的処置における使用のための、製造物品（例えばワクチン接種キット、例えば、筋肉内注射のためのワクチン接種キット）の製造のための組換えＳタンパク質およびアジュバントの使用。

【0026】

以下の実施形態は、（ｉ）本明細書に記載される免疫原性組成物、（ｉｉ）そのあらゆる使用、（ｉｉｉ）本明細書に記載される容器キット、（ｉｖ）免疫原性組成物および容器キットの予防および治療上の使用、ならびに（ｖ）本明細書に記載される、それを必要とする対象においてＣＯＶＩＤ－１９を防止または改善する方法に適用される。

【0027】

ある特定の実施形態では、トコフェロールは、アルファ－トコフェロール、場合によりＤ／Ｌ－アルファ－トコフェロールである。

【0028】

ある特定の実施形態では、アジュバントは１μｍ未満の平均液滴サイズを有し、場合により、平均液滴サイズは、５００ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、５０～２００ｎｍ、１２０～１８０ｎｍ、または１４０～１８０ｎｍである。

【0029】

ある特定の実施形態では、アジュバントは、０．３もしくはそれ以下、または０．２もしくはそれ以下のような、０．５またはそれ以下の多分散指数を有する。

【0030】

ある特定の実施形態では、アジュバントは、ポロキサマー４０１、ポロキサマー１８８、ポリソルベート８０、トリオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、およびポリオキシエチレン１２セチル／ステアリルエーテルから選択される界面活性剤を、単独、または互いとの組合せ、または他の界面活性剤との組合せのいずれかで含む。

【0031】

ある特定の実施形態では、アジュバントは、ポリソルベート８０、トリオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、およびポリオキシエチレン１２セチル／ステアリルエーテルから選択される界面活性剤を、単独または互いとの組合せのいずれかで含む。

【0032】

ある特定の実施形態では、アジュバントはポリソルベート８０を含む。

【0033】

ある特定の実施形態では、アジュバントは１種、２種、または３種の界面活性剤を含む。

【0034】

ある特定の実施形態では、アジュバントにおけるスクアレンのトコフェロールに対する重量比は、０．１～１０、場合により０．２～５、０．３～３、０．４～２、０．７２～１．１３６、０．８～１、０．８５～０．９５、または０．９である。

【0035】

ある特定の実施形態では、アジュバントにおけるスクアレンの界面活性剤に対する重量比は、０．７３～６．６、場合により１～５、１．２～４、１．７１～２．８、２～２．４、２．１～２．３、または２．２である。

【0036】

ある特定の実施形態では、ヒト対象は、小児、成人、または高齢者である。

【0037】

ある特定の実施形態では、単回用量のアジュバントにおけるスクアレンの量は、少なくとも１．２ｍｇ、場合により１．２～２０ｍｇ、１．２～１５ｍｇ、１．２～２ｍｇ、１．２１～１．５２ｍｇ、２～４ｍｇ、２．４３～３．０３ｍｇ、４～８ｍｇ、４．８７～６．０５ｍｇ、８～１２．１ｍｇ、または９．７５～１２．１ｍｇである。

【0038】

ある特定の実施形態では、単回用量のアジュバントにおけるトコフェロールの量は、少なくとも１．３ｍｇ、場合により１．３～２２ｍｇ、１．３～１６．６ｍｇ、１．３～２ｍｇ、１．３３～１．６９ｍｇ、２～４ｍｇ、２．６６～３．３９ｍｇ、４～８ｍｇ、５．３２～６．７７ｍｇ、８～１３．６ｍｇ、または１０．６５～１３．５３ｍｇである。

【0039】

ある特定の実施形態では、単回用量のアジュバントにおける界面活性剤の量は、少なくとも０．４ｍｇ、場合により０．４～９．５ｍｇ、０．４～７ｍｇ、０．４～１ｍｇ、０．５４～０．７１ｍｇ、１～２ｍｇ、１．０８～１．４２ｍｇ、２～４ｍｇ、２．１６～２．８４ｍｇ、４～７ｍｇ、または４．３２～５．６８ｍｇである。

【0040】

ある特定の実施形態では、アジュバントは、スクアレン；トコフェロール、場合によりＤ／Ｌ－アルファ－トコフェロール；界面活性剤、場合によりポリソルベート８０；および水を含むかまたはそれから本質的になる。

【0041】

ある特定の実施形態では、筋肉内注射のための単回用量の免疫原性組成物の容量は、０．０５ｍＬ～１ｍＬ、場合により０．１～０．６ｍＬ、０．２～０．３ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．４～０．６ｍＬ、または０．５ｍＬである。

【0042】

ある特定の実施形態では、免疫原性組成物、または第１および第２の容器の内容物の混合物は、４～９、場合により５～８．５、５．５～８、または６．５～７．４のｐＨを有する。

【0043】

ある特定の実施形態では、免疫原性組成物、または第１および第２の容器の内容物の混合物は、２５０～７５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、場合により２５０～５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２７０～５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、または２７０～４００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量モル浸透圧濃度を有する。

【0044】

ある特定の実施形態では、免疫原性組成物、または第１および第２の容器の内容物の混合物は、スクアレンを１ｍＬ当たり０．８～１００ｍｇ、場合により１ｍＬ当たり１．２～４８．４ｍｇ、１ｍＬ当たり１０～３０ｍｇ、または１ｍＬ当たり２１．３８ｍｇ含む。

【0045】

ある特定の実施形態では、筋肉内注射のための単回用量のアジュバントの容量は、組換えＳタンパク質との混合前に、０．０５ｍＬ～１ｍＬ、場合により０．１～０．６ｍＬ、０．２～０．３ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．４～０．６ｍＬ、または０．５ｍＬである。

【0046】

ある特定の実施形態では、アジュバントは、組換えＳタンパク質との混合前に、４～９、場合により５～８．５、５．５～８、または６．５～７．４のｐＨを有し；２５０～７５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、場合により２５０～５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２７０～５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、または２７０～４００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量モル浸透圧濃度を有し；緩衝剤および／または浸透圧調整剤、場合により改変リン酸緩衝生理食塩水を含み；１ｍＬ当たり０．８～１００ｍｇ、場合により１ｍｌ当たり１．２～４８．４ｍｇのスクアレン濃度を有し；０．０５ｍＬ～１ｍＬ、場合により０．１～０．６ｍＬの単回用量の容量を有する。

【0047】

ある特定の実施形態では、組換えＳタンパク質は、アジュバントとの混合前に、０．２～０．３ｍＬ、場合により０．２５ｍＬ、０．４～０．６ｍＬ、または０．５ｍｌの単回用量の容量；４～９、場合により５～８．５、５．５～８、または６．５～７．４のｐＨ；および２５０～７５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、場合により２５０～５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２７０～５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、または２７０～４００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量モル浸透圧濃度を有する水性液体溶液で提供される。

【0048】

本開示の実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していない対象を処置するのに好適である。本開示の実施形態は、それを必要とするヒト対象において、１つもしくはそれ以上の症状の重症度および／もしくは１つもしくはそれ以上の症状が対象によって経験される時間を部分的もしくは完全に低下させる、チャレンジ後に、確立された感染症を発症する可能性を低下させる、疾病の進行を遅らせ、場合により生存を延長させる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体を産生させる、ならびに／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質特異的Ｔ細胞応答である免疫応答を誘発するのに好適である。

【0049】

本発明の他の構成、目的、および利点は、以下の詳細な説明において明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示しているが、限定としてではなく例示としてのみ与えられていることが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、詳細な説明から当業者に明らかとなるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1】組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のバキュロウイルス発現カセットを含有する構築物１の設計を示す図である。発現カセットは、ポリヘドリンプロモーターと、キチナーゼシグナル配列（「ｓｓ」）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質外部ドメインを含有するポリペプチドのコード配列とを含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質外部ドメインは、Ｓ１／Ｓ２接合部の推定フーリン切断部位に突然変異、およびＳ２サブユニットに二重プロリン置換を含有する。

【図2A】合成されたｇＢｌｏｃｋ断片を有するＳａｐＩ消化ｐＰＳＣ１２ＤＢ－ＬＩＣトランスファープラスミドの構築を示す概略図である。ＳａｐＩ線状化トランスファープラスミドは灰色で示し、ポリヘドリンプロモーターは緑色の矢印で示し、ｇＢｌｏｃｋ断片は、黄色、青色、および橙色で示し、各重複配列を同一の色で示す（上段のパネル）。ｐｒｅＳ ｄＴＭ遺伝子を含有する最終トランスファープラスミドを下段のパネルに示す。

【図2B】ｇＢｌｏｃｋ断片の５’および３’末端配列を示す図である（記載順に、それぞれ配列番号１４～２３）。

【図3】組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を発現させるためのバキュロウイルス構築物を生成するプロセスを示す図である。ＭＶ：マスターウイルス。

【図4】０日目／２１日目にアジュバントを含有しないｐｒｅＳ ｄＴＭおよびＳ ｄＴＭを注射したマウスにおける２１日目および３６日目の血清Ｓ特異的ＩｇＧレベルを示すプロットである。力価はＯＤ＝０．２の希釈倍率の逆数として表す。ＥＵ：ＥＬＩＳＡ単位。ｐｒｅＳ ｄＴＭ：膜貫通および細胞質ドメインを欠失した組換え安定化融合前ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質（配列番号１０）。Ｓ ｄＴＭ：膜貫通および細胞質ドメインを欠失した組換え非安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質。

【図5】注射したマウスにおける２１日目および３６日目の、アジュバントＡＳ０３のＳ特異的ＩｇＧレベルに対する効果を示すプロットである。力価はＯＤ＝０．２の希釈倍率の逆数として表す。薄い灰色の四角および三角：２１日目。濃い灰色の四角および三角：３６日目。

【図6A】３６日目に免疫化マウスから得た血清抗体のＰＲＮＴ_５０力価を示すプロットである。下方の水平破線は、出発希釈倍率の１／２である定量下限値（ＬＬＯＱ）を示す。

【図6B】図６Ａと同じ研究由来の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を呈するＩｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ偽ウイルスに対する中和性抗体の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）力価を示す図である。

【図7】ＡＳ０３アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭ群およびナイーブ対照群における、Ｓ１ペプチドプールでの刺激に応答してＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－５サイトカインを発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の百分率のプロットである（バー＝平均％）。

【図8】標的とした１５μｇのＡＳ０３アジュバント含有または非含有ｐｒｅＳ ｄＴＭを用いて免疫化したアカゲザルにおける、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２融合前Ｓタンパク質に対する血清ＩｇＧのレベルを示すプロットである。ＩｇＧレベルは、０日目、２１日目、および２８日目に測定した。Ｘ軸における「－」はビヒクル対照を示す。Ｙ軸はＥＵの対数スケールを表す。

【図9】図８と同じ研究由来の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を呈するＩｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ偽ウイルスに対する中和性抗体の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）力価を示すプロットである。Ｙ軸はＩＣ_５０力価のＬｏｇ_１０値を表す。「Ｃｏｎｖ」：ヒトＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２回復期血清（高力価）。

【図10】図８と同じ研究由来の、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する中和性抗体の５０％マイクロ中和（ＭＮ_５０）価を示すプロットである。Ｙ軸はマイクロ中和（ＭＮ）アッセイにおけるＭＮ_５０価のＬｏｇ_１０値を表す。

【図11】２．２５μｇの標的用量のアジュバント含有もしくは非含有ｐｒｅＳ ｄＴＭまたはプラセボを用いて１回または２回のいずれかで免疫化したハムスターにおける、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２融合前Ｓタンパク質に対する血清ＩｇＧのレベルを示すプロットである。ＩｇＧレベルは、３５日目（１回投与コホートの場合は投与１の１４日後、２回投与コホートの場合は投与２の１４日後）に測定した。力価はＯＤ＝０．２の希釈倍率の逆数として表す。下方の水平破線は試験を行った最低希釈倍率の逆数を示す。Ｙ軸はＥＵのＬｏｇ_１０スケールを表す。

【図12】２．２５μｇの標的用量のアジュバント含有もしくは非含有ｐｒｅＳ ｄＴＭまたはプラセボを用いて１回または２回のいずれかで免疫化したハムスターにおける、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を呈するＩｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ偽ウイルスに対する中和性抗体のＩＤ_５０力価を示すグラフである。偽ウイルス中和性抗体レベルは、３５日目（１回投与コホートの場合は投与１の１４日後、２回投与コホートの場合は投与２の１４日後）に測定した。下方の水平破線は試験を行った最低希釈倍率の逆数を示す。技術的な問題のために、プラセボ群の１匹のハムスターを解析から除外した。

【図13】２．２５μｇの標的用量のＡＳ０３アジュバント含有もしくは非含有ｐｒｅＳ ｄＴＭまたはプラセボを用いて１回（１回投与コホート、左側のプロット）または２回（２回投与コホート、右側のプロット）のいずれかで免疫化したハムスターにおける、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＵＳＡ／ＷＡ１／２０２０（Ｐ２）株でのチャレンジ後０～４日目の体重変化パーセントを示す１組のプロットである。

【図14】２．２５μｇの標的用量のアジュバント含有もしくは非含有ｐｒｅＳ ｄＴＭまたはプラセボを用いて免疫化し、次いで、最後の免疫化の３５日後に２．３Ｅ４ ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＵＳＡ／ＷＡ１／２０２０株でチャレンジしたハムスターの２回投与コホートにおける、肺（左側のプロット）および鼻孔（右側のプロット）の総ウイルス量を示す１組のプロットである。Ｙ軸は、チャレンジ後４日目および７日目におけるゲノムコピー／グラムをＬｏｇ_１０スケールで示す。

【図15】２．２５μｇの標的用量のアジュバント含有もしくは非含有ｐｒｅＳ ｄＴＭまたはプラセボを用いて免疫化し、次いで、最後の免疫化の３５日後に２．３Ｅ４ ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＵＳＡ／ＷＡ１／２０２０株でチャレンジしたハムスターの２回投与コホートにおける、肺（左側のプロット）および鼻孔（右側のプロット）のサブゲノムウイルス量を示す１組のプロットである。Ｙ軸は、チャレンジ後４日目および７日目におけるゲノムコピー／グラムをＬｏｇ_１０スケールで示す。

【図16A】２．２５μｇの標的用量のアジュバント含有もしくは非含有ｐｒｅＳ ｄＴＭまたはプラセボを用いて免疫化し、次いで、最後の免疫化の３５日後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＵＳＡ／ＷＡ１／２０２０株でチャレンジしたハムスターにおける肺病態のスコアリングを示す１組のプロットである。各点は単一のハムスターを表す。Ｙ軸は肺病態スコアを０（正常）～３（重度）の尺度で示す。バーは群の中央値を表す。

【図16B】ベータ変異株でのチャレンジ後のナイーブおよび組換えＳ免疫化ハムスターにおける個々の毎日の体重減少（％）を示すプロットである。記号は個々のデータを表し、線は群の平均を表す。

【図17】全ての年齢群における、いずれかの用量のｐｒｅＳ ｄＴＭ後の非自発的（ｓｏｌｉｃｉｔｅｄ）反応の発生率を示す棒グラフである。

【図18】年齢群ごとの、いずれかの用量のｐｒｅＳ ｄＴＭ後の非自発的反応の発生率を示す１組の棒グラフである。

【図19】注射２の後（「ＰＤ２」）における、ｐｒｅＳ ｄＴＭの３つの用量（５、１０、および１５μｇ）の反応原性を示す棒グラフである。ＶＡＴ０２：第ＩＩ相臨床試験。

【図20】ＣｏＶ２－０６＿ＮＨＰ研究由来のカニクイザルにおける、５週目にＶＳＶ－ＰｓＶ（Ｎｅｘｅｌｉｓ、左側のパネル）またはレンチウイルス－ＰｓＶ（ＳＰ ＲＥＩ、右側のパネル）中和化アッセイを使用して測定した個々のＤ６１４偽ビリオン（ＰｓＶ）中和抗体（Ｎａｂ）価（Ｌｏｇ_１０）を示す１組のグラフである。太いバーは群の平均を表し、点線は試験を行った最低希釈倍率の逆数であり、ＶＳＶ－ＰｓＶアッセイのＬＬＯＱは１．５Ｌｏｇ_１０である。３つ全ての用量レベルを合わせた場合の倍率変化をグラフの下に示す。

【図21】カニクイザルにおける、５週目時点の懸念される変異株に対する個々のレンチウイルス－ＰｓＶ ＮＡｂ価（Ｌｏｇ_１０）を示すグラフである。点線は試験を行った最低希釈倍率の逆数を表す。ＣｏＶ２ ｐｒｅＳ ｄＴＭ－ＡＳ０３：本明細書に記載される、ＡＳ０３と共に製剤化した武漢株（Ｄ６１４）および／またはＢ．１．３５１（南アフリカ）変異型株に由来する組換えＳタンパク質。

【図22】ｍＲＮＡプライミングマカク（左側のパネル）、サブユニットプライミングマカク（中央のパネル）、およびヒト回復期血清（右側のパネル）における、ブースター免疫化前後の個々のＳ結合ＩｇＧ価（Ｌｏｇ_１０ＥＵ）を示す１組のグラフである。線およびバーは群の平均を表し、水平点線は試験を行った最低希釈倍率の逆数を表す。

【図23-1】ｍＲＮＡプライミング（左側のパネル）およびサブユニットプライミング（中央のパネル）マカクにおけるブースター免疫化前後の個々のＤ６１４Ｇ（上）およびＢ．１．３５１（下）ＰｓＶ ＮＡｂ価（Ｌｏｇ_１０）を、ヒト回復期血清（右側のパネル）におけるＤ６１４ ＰｓＶ ＮＡｂ価と比較して示すグラフのパネルである。線およびバーは群の平均を表し、水平点線は試験を行った最低希釈倍率の逆数を表す。

【図23-2】図２３－１の続き。

【図24】ｍＲＮＡプライミング（左側のパネル）およびサブユニットプライミング（右側のパネル）マカクにおける、ブースター免疫化後の懸念される変異株およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対する個々のＰｓＶ ＮＡｂ価を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0051】

本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９に対する防御となる免疫原性組成物を提供する。組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に由来し、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系において発現する組換えタンパク質を含む。組換えタンパク質は、Ｓタンパク質の膜貫通および細胞質ドメインの全部または一部を欠く一方で、Ｓタンパク質の細胞外部分（例えば、Ｓタンパク質外部ドメインの全体または一部）を含み得る。組換えタンパク質は、３つの同一のサブユニットポリペプチドで構成することができ（すなわち、ホモ三量体）、それぞれは、安定化した天然型融合前三量体配置における３つのサブユニットポリペプチドの三量体化を容易にするバキュロウイルス／昆虫細胞系での発現に最適化された三量体化モチーフを含有する。免疫原性組成物は、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントをさらに含む。

【0052】

本明細書における免疫原性組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ナイーブヒト対象における症候性ＣＯＶＩＤ－１９の防止、中等度～重度のＣＯＶＩＤ－１９の防止（例えば、入院の防止）、無症候性感染の防止のために使用することができ、同種適合株に対する免疫原性、ウイルス負荷の減少、および／または流行している変異型株に対する防御を誘発することができる。別段の指示がない限り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２「変異株」とは、Ｓタンパク質における１つまたはそれ以上のアミノ酸が、起源である武漢株（配列番号１）と異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を指す。

【0053】

本明細書で使用する場合、「免疫原性組成物」、「ワクチン」、および「ワクチン組成物」という用語は、交換可能であり、ＣＯＶＩＤ－１９症状の緩和ならびに疾患からの回復および生存の向上を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対する予防的防御を誘発することができる構成成分を含有する組成物を指す。

【0054】

本明細書で使用する場合、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントとは、問合せ配列と参照配列とを最大の同一性を求めてアラインメントした場合における、参照配列の残基と同一である問合せ配列におけるアミノ酸残基の百分率を指す。相同配列は、参照配列と同じ長さであっても、それより短くても（例えば、参照配列の少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）の長さであっても）よい。

【0055】

Ｉ．免疫原性組成物の抗原構成成分
本開示の免疫原性組成物は組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む。組換えタンパク質は、ウイルスエンベロープにおいて天然型融合前三量体立体構造を維持するために安定化される。

【0056】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は１２７３個のアミノ酸残基を有する。Ｓタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＹＰ＿００９７２４３９０において入手可能である。配列を以下に示す。シグナル配列は四角で囲み（ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳ（配列番号２））、膜貫通および細胞内ドメインは下線で示す。Ｓ１およびＳ２接合部は残基６８５と６８６との間にあり、これらの残基は太字かつ下線で示す。

【0057】

【化1】

【0058】

本明細書における組換えＳタンパク質は、３つの同一のポリペプチド（本明細書では「組換えＳポリペプチド」）で構成される。成熟前、各組換えＳポリペプチドは、昆虫細胞におけるタンパク質発現に好適なシグナル配列を含んでもよい。例えば、シグナル配列は昆虫またはバキュロウイルスタンパク質に由来する。シグナル配列はまた、人工シグナル配列であり得る。一部の実施形態では、シグナル配列は、キチナーゼおよびＧＰ６４などの昆虫またはバキュロウイルスタンパク質に由来する。例示的なキチナーゼシグナル配列は、野生型キチナーゼシグナル配列
ＭＬＹＫＬＬＮＶＬＷ ＬＶＡＶＳＮＡ（配列番号１１）
または突然変異キチナーゼシグナル配列
ＭＰＬＹＫＬＬＮＶＬ ＷＬＶＡＶＳＮＡ（配列番号３）
である。このキチナーゼシグナル配列と相同（例えば、少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％同一）である配列もまた、シグナルペプチド機能が保持されている限り、使用することができる。米国特許第８，５４１，００３号もまた参照のこと。

【0059】

本明細書における組換えＳタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質外部ドメイン配列、例えば、配列番号１の残基１４～１，２１１に対応する配列を含む。例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質外部ドメイン配列は以下のように示される：

【化2】

【0060】

一部の実施形態では、組換えＳタンパク質は、本明細書にさらに記載されるある特定のアミノ酸置換を除いては配列番号４の配列を含むことができ、配列番号４と少なくとも９９％（例えば、少なくとも９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％）同一である。さらなる実施形態では、配列番号４の６６９～６７２位における残基（太字）は残基ＧＳＡＳ（配列番号６）に変更される、ならびに／または配列番号４の９７３位および７４位における残基（下線）は残基ＰＰに変更される。

【0061】

一部の実施形態では、組換えＳタンパク質は、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックにおいて流行している変異株に見出される１つまたはそれ以上の共通の突然変異を含む。そのような突然変異の１つは、現在の世界中でのＣＯＶＩＤ－１９罹患の大部分に関連するＤ６１４Ｇ突然変異（配列番号１に従った番号付け）である。組換えＳタンパク質に含まれる場合がある他の突然変異は、Ｗ１５２Ｃ、Ｋ４１７Ｔ／Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｖ４４５Ｉ、Ｇ４４６Ａ／Ｓ、Ｌ４５２Ｒ、Ｙ４５３Ｆ、Ｌ４５５Ｆ、Ｆ４５６Ｌ、Ａ４７５Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｔ４７８Ｉ／Ｋ／Ａ、Ｖ４８３Ａ／Ｆ／Ｉ、Ｅ４８４Ｑ／Ｋ／Ｄ／Ａ、Ｆ４９０Ｓ／Ｌ、Ｑ４９３Ｌ／Ｒ、Ｓ４９４Ｐ／Ｌ、Ｙ４９５Ｎ、Ｇ４９６Ｌ、Ｐ４９９Ｈ、Ｎ５０１Ｙ、Ｖ５０３Ｆ／Ｉ、Ｙ５０５Ｗ／Ｈ、Ｑ５０６Ｈ／Ｋ、およびＰ６８１Ｈ突然変異（配列番号１に従った番号付け）のうちの１つまたはそれ以上であり得る。一部の実施形態では、組換えＳタンパク質は、突然変異Ｎ４４０Ｋ、Ｔ４７９Ｉ／Ｋ／Ａ、およびＤ６１４Ｇのうちの１つまたはそれ以上を含み得る。

【0062】

一部の実施形態では、組換えＳタンパク質は、Ｂ．１．１．７（イギリスまたはアルファ変異株；例えば、Ｎ５０１Ｙ／Ｐ６８１Ｈ／Ｈ６９／Ｖ７０の欠失）、Ｂ．１．３５１（南アフリカまたはベータ変異株；例えば、Ｋ４１７Ｎ／Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ）、Ｂ１．６１７（インドまたはデルタ変異株；例えば、Ｌ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ突然変異）、Ｐ．１（ブラジルまたはガンマ変異株；例えば、Ｋ４１７Ｔ／Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ）、およびＣＡＬ．２０Ｃ株（ａｋａ．Ｂ．１．４２９；カリフォルニアまたはイプシロン変異株；例えば、Ｗ１５２Ｃ／Ｌ４５２Ｒ）などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に見出される１つまたはそれ以上の突然変異を含む。

【0063】

組換えＳタンパク質における外部ドメイン配列は、宿主細胞（例えば、昆虫細胞）におけるタンパク質の発現および産生タンパク質の安定性を向上させるために改変してもよい。一部の実施形態では、Ｓ外部ドメイン配列は、Ｓ１サブユニットとＳ２サブユニットとの接合部におけるプロタンパク質転換酵素（ＰＰＣ）モチーフ（フーリン切断部位）を除去する突然変異を含有する。例えば、フーリン切断部位における配列ＲＲＡＲ（配列番号５；配列番号１の残基６８２～６８５に対応）は、ＧＳＡＳ（配列番号６）に変更される。そのような突然変異は、未変性Ｓタンパク質の融合前立体構造を保存するのに役立つ。

【0064】

一部の実施形態では、外部ドメイン配列は、中和応答を生じる可能性がより高い融合前エピトープの抗原提示を容易にするために、組換えＳタンパク質をより安定な立体構造に維持するのに役立つ他の突然変異を含有する。例えば、配列番号１の残基９８６および９８７に対応するアミノ酸（ＫＶ）はＰＰに突然変異される（例えば、Ｗｒａｐｐ、前出；Ｋｉｒｃｈｄｏｅｒｆｅｒら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０１８）８：１５７０１；Ｘｉｏｎｇ、前出を参照のこと）。

【0065】

本明細書における組換えＳタンパク質は、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系での発現に最適化された三量体化ドメインをＣ末端領域に含み、その結果、Ｓタンパク質は未変性Ｓタンパク質の安定化した融合前立体構造をとることができる。フォルドンドメインコード配列は、Ｓ外部ドメインコード配列の最後のコドンと停止コドンとの間に挿入することができる。一部の実施形態では、三量体化ドメインは、Ｔ４ファージのフィブリチンのフォルドンドメインに由来する（例えば、Ｍｅｉｅｒら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２００４）３４４（４）：１０５１～６９；国際公開第２０１８／０８１３１８号を参照のこと）。例示的なフォルドン配列を以下に示す：
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧ ＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷ ＶＦＬＳＴＦＬ（配列番号７）。

【0066】

一部の実施形態では、フォルドン配列は、宿主細胞における組換えタンパク質の発現を増強するように最適化してもよい。例えば、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）属の細胞）における組換えタンパク質の発現を増強するために、フォルドン配列をコードする配列をコドン最適化してもよい。以下は、フォルドンドメインの天然のコード配列（上）およびコドン最適化型（下）を示す（ヌクレオチド点突然変異はアスタリスクによって示される）：

【化3】

【0067】

組換えＳタンパク質は、精製を容易にするためにタグ（例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、またはＶ５タグ）を含んでもよい。

【0068】

一部の実施形態では、組換えＳタンパク質は、以下の配列を有するが、プロセシングされて構築された後はシグナル配列を有しない、ポリペプチドの三量体であり得る。以下の配列において、シグナル配列は下線（残基１～１８）、フォルドン配列は二重下線（残基１２１７～１２４３）で示し、野生型配列に対する突然変異（人工的に導入した）は太字かつ下線で示す（残基６８７～６９０および９９１～９９２）。このタンパク質は、本明細書において「ｐｒｅＳ ｄＴＭ」または「Ｄ６１４ ｐｒｅＳ ｄＴＭ」とも称される。

【0069】

【化4】

【0070】

配列番号１０と相同である配列もまた使用することができる。例えば、配列が配列番号１０と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６、９７、９８、または９９％）同一である組換えＳポリペプチドが使用可能である。相同配列は、配列番号１０と同じ長さであっても、配列番号１０より１０％以下（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％以下）だけ短いかまたは長くてもよい。さらなる実施形態では、配列番号１０の６８７～６９０位における残基ＧＳＡＳ（配列番号６）ならびに／または配列番号１０の９９１位および９９２位における残基ＰＰは、そのような相同配列に維持される。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、例えば、初期パラメータを使用するＢＬＡＳＴ（登録商標）（米国立医学図書館の米国立生物工学情報センターのウェブサイトにおいて利用可能）によって得ることができる。

【0071】

一部の実施形態では、ｐｒｅＳ ｄＴＭの変異株（本明細書ではまた「ｐｒｅＳ ｄＴＭ変異株」）、すなわち、配列番号１０と異なるアミノ酸を（例えば、シグナル配列領域の外側に）１つまたはそれ以上含有する組換えＳタンパク質が使用される。さらなる実施形態では、組換えＳタンパク質は南アフリカまたはベータ変異株Ｂ．１．３５１に由来する。この変異株は、以下の突然変異（武漢株または配列番号１に対する）：（ｉ）ＮＴＤドメインにおける：Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２ｄｅｌ、Ａ２４３ｄｅｌ、およびＬ２４４ｄｅｌ；（ｉｉ）ＲＢＤドメインにおける：Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ；（ｉｉｉ）Ｓ１ドメインにおける：Ｄ６１４Ｇ；ならびに（ｉｖ）Ａ７０１Ｖを含有する。Ｓタンパク質は、プロセシングされて産生細胞から分泌された後はシグナル配列（下線；残基１～１８）を有しない以下の配列（配列番号１３）を含み得る。Ｔ４フォルドン配列は二重下線で示し（残基１２１４～１２４０）；配列番号１０からの変異は四角で囲んで太字で示し；人工的に導入された突然変異（残基６８４～６８７および残基９８８～９８９）は下線かつ太字で示す。武漢株に由来するＳタンパク質と比較して、このタンパク質は、以下の２４３～２４６位における「ＦＱＴＬ」の直後に３個の残基「ＬＡＬ」の欠失も有する。

【0072】

【化5】

【0073】

一部の実施形態では、本免疫原性組成物は多価（例えば、二価、三価、または四価）である。すなわち、組成物は、複数（例えば、２つ、３つ、または４つの）異なる組換えＳタンパク質を含む。多価組成物における１つまたはそれ以上の組換えＳタンパク質は、Ｄ６１４ＧなどのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に見出される１つまたはそれ以上の突然変異、ならびに新たに出現した変異型株、例えば、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｂ．１．６１７、Ｐ．１、およびＣＡＬ．２０Ｃに見出される突然変異を含み得る。

【0074】

一部の実施形態では、本免疫原性組成物は二価である。さらなる実施形態では、二価組成物は、武漢株に由来する第１の組換えＳタンパク質と、南アフリカ株に由来する第２の組換えＳタンパク質とを含む。ある特定の実施形態では、二価組成物は、シグナル配列を有しない配列番号１０を含む組換えＳタンパク質と、シグナル配列を有しない配列番号１３を含む組換えＳタンパク質とを含む。

【0075】

ＩＩ．免疫原性組成物のアジュバント構成成分
本免疫原性組成物は、薬学的に許容される成分を有するトコフェロール含有スクアレンベース水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルションアジュバントを含む。トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントとも称されるそのようなアジュバントは、組換えＳタンパク質に対する免疫応答の規模および／または質を増強する。

【0076】

スクアレンは、化学式［（ＣＨ_３）_２Ｃ［＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）］２＝ＣＨＣＨ_２－］_２（すなわち、Ｃ_３０Ｈ_５０；ＣＡＳ登録番号７６８３－６４－９）を有する分枝鎖の不飽和テルペノイドである。これは、２，６，１０，１５，１９，２３－ヘキサメチル－２，６，１０，１４，１８，２２－テトラコサヘキサエンとしても公知である。スクアレンは良好な生物適合性を示し、容易に代謝される。

【0077】

トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、１種またはそれ以上のトコフェロールを含有する。α、β、γ、δ、ε、および／またはξトコフェロールのいずれも使用可能であるが、典型的にはα－トコフェロール（またはアルファ－トコフェロール）が使用される。Ｄ－アルファ－トコフェロールおよびＤ／Ｌ－アルファ－トコフェロールはいずれも使用可能である。一部の実施形態では、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、アルファ－トコフェロール、例えば、Ｄ／Ｌ－アルファ－トコフェロールを含有する。

【0078】

トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、典型的にはサブミクロン（１μｍ未満）の液滴サイズを有し得る。一部の実施形態では、液滴は平均して５００ｎｍ未満、例えば、２００ｎｍ未満である。２００ｎｍ未満の液滴サイズは、濾過による滅菌を容易にすることができるという点で有益である。８０～２００ｎｍの範囲の液滴サイズが、効力、製造の一貫性、および安定性の理由で目的のものであるという証拠が存在する（Ｋｌｕｃｋｅｒら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．（２０１２）１０１（１２）：４４９０～５００；Ｓｈａｈら、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）（２０１４）９：２６７１～８１；Ｓｈａｈら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．（２０１５）１０４：１３５２～６１；Ｓｈａｈら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１９）９：１１５２０）。一部の実施形態では、アジュバントは、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、または少なくとも１００ｎｍ（例えば、少なくとも１２０ｎｍ）の平均液滴サイズを有する。例えば、アジュバントは、５０～２００ｎｍ（例えば、８０～２００ｎｍ）、１２０～１８０ｎｍ、または１４０～１８０ｎｍ、例えば約１６０ｎｍの平均液滴サイズを有し得る。

【0079】

液滴サイズの均一性は望ましい。０．７よりも大きい多分散指数（ＰｄＩ）は、サンプルが非常に幅広いサイズ分布を有することを示し、０の報告値は、サイズの差異が存在しないことを意味する。好適には、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、０．５もしくはそれ以下、または０．３もしくはそれ以下、例えば０．２またはそれ以下のＰｄＩを有する。

【0080】

液滴サイズとは、本明細書で使用する場合、エマルションにおける油滴の平均直径を意味し、様々な手段で、例えば、Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＵＳＡ）から入手可能なＡｃｃｕｓｉｚｅｒ（商標）およびＮｉｃｏｍｐ（商標）シリーズの機器、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＫ）製のＺｅｔａｓｉｚｅｒ（商標）機器、または堀場製作所（日本、京都）製の粒度分布測定装置などの装置を用いる動的光散乱法および／または単一粒子光学検知法の技法を使用して決定することができる（Ｓｃｈａｒｔｌ、Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ（２００７））。動的光散乱法（ＤＬＳ）とは、液滴サイズを決定する方法である。平均液滴直径を定めるための方法は、Ｚ平均、すなわち、ＤＬＳによって測定した液滴のアンサンブル集合の流体力学的サイズの強度加重平均である。Ｚ平均は、単一粒径（液滴直径）を想定し、単一の指数関数フィッティングを自己相関関数に適用する、測定した相関曲線のキュムラント解析に由来する。したがって、本明細書における平均液滴サイズへの言及は強度加重平均、理想的にはＺ平均として考えられるべきである。ＰｄＩ値は、平均直径を測定する同じ計装によって容易に求められる。

【0081】

安定なサブミクロンのエマルションを維持するために、１種またはそれ以上の乳化剤（すなわち、界面活性剤）が概して必要とされる。界面活性剤は、「ＨＬＢ」（グリフィンの親水性／親油性バランス）によって分類することができ、一般に、１～１０の範囲のＨＬＢは界面活性剤が水よりも油に可溶であることを意味し、１０～２０の範囲のＨＬＢは界面活性剤が油よりも水に可溶であることを意味する。多くの目的の界面活性剤のＨＬＢ値は、容易に入手可能であるかまたは実験的に決定することができ、例えば、ポリソルベート８０は１５．０のＨＬＢを有し、ＴＰＧＳは１３～１３．２のＨＬＢを有する。トリオレイン酸ソルビタンは１．８のＨＬＢを有する。２種またはそれ以上の界面活性剤がブレンドされる場合、得られるブレンドのＨＬＢは典型的には加重平均によって算出される。例えば、ポリソルベート８０とＴＰＧＳとの７０／３０重量％混合物は、（１５．０×０．７０）＋（１３×０．３０）、すなわち１４．４のＨＬＢを有する。ポリソルベート８０とトリオレイン酸ソルビタンとの７０／３０重量％混合物は、（１５．０×０．７０）＋（１．８×０．３０）、すなわち１１．０４のＨＬＢを有する。

【0082】

界面活性剤は、典型的には代謝可能（生分解性）かつ生体適合性で、医薬品としての使用に好適であり得る。界面活性剤としては、イオン性（カチオン性、アニオン性、もしくは双性イオン性）および／または非イオン性界面活性剤を挙げることができる。非イオン性界面活性剤のみの使用は、例えばｐＨ非依存性のために望ましい。したがって、本発明は：（ｉ）ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎもしくはポリソルベートと称される）、例えばポリソルベート２０およびポリソルベート８０；（ｉｉ）ＤＯＷＦＡＸ（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）（例えば、Ｆ６８、Ｆ１２７、もしくはＬ１２１グレード）もしくはＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（商標）の商品名で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／もしくはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー、例えばポロキサマー４０７、ポロキサマー４０１、およびポロキサマー１８８；（ｉｉｉ）オクトキシノール－９（トリトンＸ１００、もしくはｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が目的のものである、繰り返しエトキシ（オキシ－１，２－エタンジイル）基の数が様々であり得るオクトキシノール；（ｉｖ）（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０／ＮＰ－４０）；（ｖ）リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；（ｖｉ）ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪族エーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）界面活性剤として公知）、例えばポリオキシエチレン－４－ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）３０、Ｅｍｕｌｇｉｎ（登録商標）１０４Ｐ）、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン１２セチル／ステアリルエーテル（Ｅｕｍｕｌｇｉｎ（登録商標）Ｂ１、セテアレス－１２、もしくはポリオキシエチレンセトステアリルエーテル）；（ｖｉｉ）ソルビタンエステル（一般的にＳｐａｎとして公知）、例えば、トリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ（登録商標）８５）、モノオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ（登録商標）８０）、およびモノラウリン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ（登録商標）２０）；または（ｖｉｉｉ）トコフェロール誘導体界面活性剤、例えばアルファ－トコフェロール－ポリエチレングリコールコハク酸（ＴＰＧＳ）を含むがこれらに限定されない界面活性剤を使用することができる。薬学的に許容される界面活性剤の多くの例は当技術分野で公知である。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２００９年、第６版）を参照のこと。スクアレンエマルションアジュバントにおいて使用する界面活性剤の選択を最適化するための方法は、Ｋｌｕｃｋｅｒら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．（２０１２）１０１（１２）：４４９０～５００に例示されている。

【0083】

概して、界面活性剤構成成分は、１０～１８の間、例えば１２～１７の間（例えば、１３～１６）のＨＬＢを有する。これは、典型的には単一の界面活性剤を使用して、または一部の実施形態では、界面活性剤の混合物を使用して達成することができる。目的の界面活性剤としては：単独、互いとの組合せ、または他の界面活性剤との組合せのいずれかにおけるポロキサマー４０１、ポロキサマー１８８、ポリソルベート８０、トリオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、およびポリオキシエチレン１２セチル／ステアリルエーテルを挙げることができる。単独または互いとの組合せのいずれかにおけるポリソルベート８０、トリオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、およびポリオキシエチレン１２セチル／ステアリルエーテルが目的のものである。目的の界面活性剤はポリソルベート８０である。目的の界面活性剤の組合せは、ポリソルベート８０とトリオレイン酸ソルビタンである。目的の界面活性剤のさらなる組合せは、モノオレイン酸ソルビタンとポリオキシエチレンセトステアリルエーテルである。

【0084】

ある特定の実施形態では、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、ポリソルベート８０などの１種の界面活性剤を含む。一部の実施形態では、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、ポリソルベート８０とトリオレイン酸ソルビタン、またはモノオレイン酸ソルビタンとポリオキシエチレンセトステアリルエーテルなどの２種の界面活性剤を含む。他の実施形態では、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、３種の界面活性剤などの３種またはそれ以上の界面活性剤を含む。

【0085】

望ましくは、スクアレンのトコフェロールに対する重量比は、２０またはそれ以下（すなわち、トコフェロール１重量単位当たりスクアレン２０重量単位もしくはそれ以下、または、別の言い方をすると、スクアレン２０重量単位当たりトコフェロール少なくとも１重量単位）、例えば１０またはそれ以下である。好適には、スクアレンのトコフェロールに対する重量比は、０．１またはそれ以上である。典型的には、スクアレンのトコフェロールに対する重量比は、０．１～１０、０．２～５、または０．３～３、例えば０．４～２である。好適には、スクアレンのトコフェロールに対する重量比は、０．７２～１．１３６、０．８～１、または０．８５～０．９５、例えば０．９である。

【0086】

典型的には、スクアレンの界面活性剤に対する重量比は、０．７３～６．６、１～５、または１．２～４である。好適には、スクアレンの界面活性剤に対する重量比は、１．７１～２．８、２～２．４、または２．１～２．３、例えば２．２である。

【0087】

単回ヒト用量などの単回用量のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントにおけるスクアレンの量は、典型的には少なくとも１．２ｍｇである。概して、単回ヒト用量などの単回用量のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントにおけるスクアレンの量は、５０ｍｇまたはそれ以下である。単回ヒト用量などの単回用量のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントにおけるスクアレンの量は、１．２～２０ｍｇ（例えば、１．２～１５ｍｇ）であり得る。単回ヒト用量などの単回用量のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントにおけるスクアレンの量は、１．２～２ｍｇ、２～４ｍｇ、４～８ｍｇ、または８～１２．１ｍｇであり得る。例えば、単回ヒト用量などの単回用量のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントにおけるスクアレンの量は、１．２１～１．５２ｍｇ、２．４３～３．０３ｍｇ、４．８７～６．０５ｍｇ、または９．７５～１２．１ｍｇであり得る。

【0088】

単回ヒト用量などの単回用量のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントにおけるトコフェロールの量は、典型的には少なくとも１．３ｍｇである。概して、単回ヒト用量などの単回用量のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントにおけるトコフェロールの量は、５５ｍｇまたはそれ以下である。単回ヒト用量などの単回用量のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントにおけるトコフェロールの量は、１．３～２２ｍｇ（例えば、１．３～１６．６ｍｇ）であり得る。単回ヒト用量などの単回用量のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントにおけるトコフェロールの量は、１．３～２ｍｇ、２～４ｍｇ、４～８ｍｇ、または８～１３．６ｍｇであり得る。例えば、単回ヒト用量などの単回用量のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントにおけるトコフェロールの量は、１．３３～１．６９ｍｇ、２．６６～３．３９ｍｇ、５．３２～６．７７ｍｇ、または１０．６５～１３．５３ｍｇであり得る。

【0089】

単回ヒト用量などの単回用量のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントにおける界面活性剤の量は、典型的には少なくとも０．４ｍｇである。概して、単回ヒト用量などの単回用量のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントにおける界面活性剤の量は、１８ｍｇまたはそれ以下である。単回ヒト用量などの単回用量のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントにおける界面活性剤の量は、０．４～９．５ｍｇ（例えば、０．４～７ｍｇ）であり得る。単回ヒト用量などの単回用量のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントにおける界面活性剤の量は、０．４～１ｍｇ、１～２ｍｇ、２～４ｍｇ、または４～７ｍｇであり得る。例えば、単回ヒト用量などの単回用量のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントにおける界面活性剤の量は、０．５４～０．７１ｍｇ、１．０８～１．４２ｍｇ、２．１６～２．８４ｍｇ、または４．３２～５．６８ｍｇであり得る。

【0090】

ある特定の実施形態では、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、スクアレン、トコフェロール、界面活性剤、および水を含み得るかまたはそれから本質的になり得る。例えば、スクアレン、トコフェロール、界面活性剤、および水に加えて、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、緩衝剤および／または浸透圧調整剤、例えば、改変リン酸緩衝生理食塩水（リン酸二ナトリウム、二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、および塩化カリウム）などの、所期の最終生成物およびワクチン接種戦略に応じて所望されるかまたは必要とされる追加の構成成分を含有してもよい。

【0091】

均一に小さい液滴サイズおよび長期安定性を有するトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントを得るために、高圧ホモジナイゼーション（ＨＰＨまたはマイクロフルイダイゼーション）を適用することができる（例えば、欧州特許第０８６８９１８（Ｂ１）号および国際公開第２００６／１００１０９号を参照のこと）。簡潔に述べると、スクアレンおよびトコフェロールから構成される油相を窒素雰囲気下で作製することができる。典型的には注射用水またはリン酸緩衝生理食塩水およびポリソルベート８０から構成される水相は別個に調製する。油相および水相を例えば１：９の比（油相の容量対水相の容量）で合わせ、その後、例えばインラインホモジナイザーによる１パス処理およびマイクロフルイダイザー（おおよそ１５０００ｐｓｉ）による３パス処理によってホモジナイゼーションおよびマイクロフルイダイゼーションを行う。次いで、得られたエマルションを、例えば重なった２枚の０．５／０．２μｍフィルターに２回連続（すなわち、０．５／０．２／０．５／０．２）で通すことによって滅菌濾過することができる、（例えば、国際公開第２０１１／１５４４４４号を参照のこと）。操作は、望ましくは不活性雰囲気、例えば窒素下で行われる。正圧を印加してもよい（例えば、国際公開第２０１１／１５４４４３号を参照のこと）。

【0092】

国際特許出願第２０２０／１６００８０号およびＬｏｄａｙａら（Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２０１９）３１６：１２～２１）は、自己乳化アジュバントシステム（ＳＥＡＳ）であるトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントおよびその製造を記載している。

【0093】

一部の実施形態では、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントはＡＳ０３アジュバントである。例えば、国際公開第２００６／１００１０９号；Ｇａｒｃｏｎら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１２）１１：３４９～６６；Ｃｏｈｅｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１９）３７（２３）：３００６～２１を参照のこと。このアジュバントには、スクアレン、アルファ－トコフェロール、およびポリソルベート８０が含まれる。ヒト成人への使用において、アジュバント（ＡＳ０３_Ａとも称される）の単回総用量は、スクアレン１０．６９ｍｇ、アルファ－トコフェロール１１．８６ｍｇ、およびポリソルベート８０ ４．８６ｍｇと、ＰＢＳとを含有する水中油型エマルション０．２５ｍＬである（Ｆｏｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２００９）１４：３２８６～３１２；Ｍｏｒｅｌら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１１）２９：２４６１～７３）。以下の表９もまた参照のこと。

【0094】

ある特定の低減用量のＡＳ０３もまた記載されており（国際公開第２００８／０４３７７４号）、例えばＡＳ０３_Ｂ（１／２用量）、ＡＳ０３_Ｃ（１／４用量）、およびＡＳ０３_Ｄ（１／８用量）が挙げられる（Ｃａｒｍｏｎａ Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２０１４）１０（７）：１９５９～６８）。したがって、所望される場合、水中油型エマルションアジュバントは、ＡＳ０３_Ａとしての（単回）用量当たりわずか１／２、１／４、または１／８の量のスクアレン、アルファ－トコフェロール、およびポリソルベート８０を含有する。これらの低減用量、例えばＡＳ０３_ＢまたはＡＳ０３_Ｃは、低下された反応原性が望ましい場合、例えば小児対象において有用となり得る。例えば、単回アジュバント用量は：（ｉ）スクアレン５．３４ｍｇ、アルファ－トコフェロール５．９３ｍｇ、およびポリソルベート８０ ２．４３ｍｇ（例えば、ＡＳ０３_Ｂ；以下の表９に示す水中油型エマルション１２５μＬ）；（ｉｉ）スクアレン２．６７ｍｇ、アルファ－トコフェロール２．９７ｍｇ、およびポリソルベート８０ １．２２ｍｇ（例えば、ＡＳ０３_Ｃ；以下の表９に示す水中油型エマルション６２．５μＬ）；または（ｉｉｉ）スクアレン１．３４ｍｇ、アルファ－トコフェロール１．４８ｍｇ、およびポリソルベート８０ ０．６１ｍｇ（例えば、ＡＳ０３_Ｄ；すなわち、以下の表９に示す水中油型エマルション３１．２５μＬ）を含有し得る。典型的には、単回用量のＡＳ０３アジュバントの最終容量は０．２５ｍＬまたは０．５ｍＬである。したがって、上記の所望の量のスクアレン、アルファ－トコフェロール、およびポリソルベート８０と調和させるために必要な濃縮水中油型エマルションバルク（例えば、以下の表９の水中油型エマルション）の容量が０．２５ｍＬ未満または０．５ｍＬ未満である場合は、リン酸緩衝生理食塩水を用いて、そのような容量を所望の容量（０．２５ｍＬまたは０．５ｍＬ）にしてもよい。

【0095】

望ましくない分解を制限するために、トコフェロール含有スクアレンエマルションは概して、例えば限定的なヘッドスペースを有する容器においておよび／または窒素下での保存によって、酸素への曝露を制限して保存すべきである。

【0096】

コロナウイルスワクチンに関する潜在的な安全性の問題は、野生型ウイルスへの曝露時にワクチン由来の免疫病態が増強し得ることである（Ｓｍａｔｔｉら、Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１８）９：２９９１）。ウイルス感染の抗体依存性増強または免疫増強と称されるこの現象の分子機構は依然として完全には理解されていない。コロナウイルス感染症の文脈では、様々な因子がこの現象に潜在的に寄与すると示唆されている。これらの因子としては、標的となるエピトープ、抗原の送達方法、免疫応答の規模、結合抗体と機能抗体とのバランス、特定のＦｃ受容体との結合などの機能的特徴を有する抗体の誘発、およびヘルパーＴ細胞応答の性質が挙げられる（Ｔｓｅｎｇら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１２）７（４）；Ｙａｓｕｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００８）１８１（９）：６３３７～４８；Ｃｚｕｂら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００５）２３（１７～１８）：２２７３～９）。ＡＳ０３などのアジュバントを含むアジュバント製剤を含めることは、中和抗体応答の規模をさらに増強し、それによって、大半が非中和抗体によって媒介されると考えられるウイルス感染の抗体依存性増強を緩和すると予想される。

【0097】

ＩＩＩ．組換えＳタンパク質の作製
本免疫原性組成物のウイルス抗原構成成分は、組換え技術によって、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ：Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）に由来するものなどのバキュロウイルス発現ベクターによって形質導入された昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞、またはｅｘｐｒｅｓＳＦ＋細胞）において産生することができる。ＡｃＭＮＰＶなどのバキュロウイルスは、大きなタンパク質の結晶性包埋体を感染細胞の核内に形成し、ポリヘドリンと称される単一ポリペプチドがそのタンパク質塊のおよそ９５％を占める。ポリヘドリンの遺伝子は、単一コピーとしてバキュロウイルスゲノムに存在し、培養細胞におけるウイルス複製に必須ではないため、外来遺伝子と容易に置き換えることができる。組換えＳポリペプチドなどの外来遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスは、バキュロウイルスゲノムＤＮＡと外来遺伝子を含有するトランスファープラスミドとの間での相同組換えによって構築される。

【0098】

ある特定の実施形態では、トランスファープラスミドは組換えＳポリペプチドの発現カセットを含有し、発現カセットは、ＡｃＭＮＰＶにおいてポリヘドリン座位に天然に隣接する配列に隣接する（図１）。トランスファープラスミドはバキュロウイルスゲノムＤＮＡと同時に宿主細胞にトランスフェクトされる。バキュロウイルスゲノムＤＮＡは、ポリヘドリン遺伝子とポリヘドリン座位の下流にある必須遺伝子の一部とを除去する酵素（例えば、Ｂｓｕ３６Ｉ）で線状化されており、そのため親ウイルスＤＮＡ分子は複製することができず、ゲノムＤＮＡは非感染性となっているが；必須遺伝子のこの部分はトランスファープラスミドに存在する。同時トランスフェクション後、トランスファープラスミドと線状化ゲノムＤＮＡとの間での相同組換えにより、ゲノムウイルスＤＮＡは再び環状化し、その複製能を回復する。線状化前の本来のバキュロウイルスゲノムＤＮＡはポリヘドリン遺伝子を含有するため、非組換えウイルスによって形成されたプラークは濁っている（感染細胞における結晶性包埋体のため）が、組換えウイルスによって形成されたプラークは透明である。

【0099】

バキュロウイルス発現ベクターは、組換えタンパク質の収量を増加するように操作してもよい。一部の実施形態では、バキュロウイルスベクターは１つまたはそれ以上の遺伝子がノックアウトされる。バキュロウイルスゲノムは、細胞培養におけるウイルス複製および組換えタンパク質の発現に必須ではない遺伝子を含有している。そのような遺伝子の欠失は、不要な遺伝的荷重を取り除き、より安定なバキュロウイルス発現ベクターを生成するのに役立ち、昆虫細胞感染の確立に必要な時間を減少し、結果として組換えタンパク質のより効率的な発現をもたらし得る。一部の実施形態では、ポリヘドリンプロモーターは、２コピー以上のバースト配列をポリヘドリンプロモーターに含めることによって改変され；例えば、プロモーターは、ヌクレオチド配列ＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡ（配列番号１２）の２つの反復を含有する「二重バースト」（ＤＢ）プロモーターを生じる２つのバースト配列を含むように操作してもよい。例えば、Ｍａｎｏｈａｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．（２０１０）１０７：９０９～１６を参照のこと。ウイルス抗原コード配列をバキュロウイルス発現ベクターに組み込むために、コード配列を有するトランスファープラスミドを、バキュロウイルスゲノムをコードするＤＮＡに相同組換えによって組み込んでもよい。ウイルス同一性は、例えば、精製されたバキュロウイルスＤＮＡ由来のＳタンパク質コード配列挿入断片のサザンブロットまたはサンガー配列決定解析、および感染昆虫細胞において産生された組換えタンパク質のウェスタンブロット解析によって確認することができる。例えば、米国特許第６，２４５，５３２号および同第８，５４１，００３号を参照のこと。

【0100】

ウイルス抗原発現構築物を含有する宿主細胞は、バイオリアクター（例えば、４５Ｌ、６０Ｌ、４５９Ｌ、２０００Ｌ、または２０，０００Ｌ）において、例えば、バッチ法または流加法で培養される。産生されたＳタンパク質は、例えばカラムクロマトグラフィーによって、フロースルーモードまたは結合－溶出モードのいずれかで細胞培養物から単離することができる。例としては、レンズマメレクチンセファロースなどのイオン交換樹脂および親和性樹脂、ならびに混合モードカチオン交換疎水性相互作用カラム（ＣＥＸ－ＨＩＣ）である。タンパク質は、濃縮しても、限外濾過によって緩衝液交換してもよく、限外濾過の保持液は、０．２２μｍフィルターにより濾過してもよい。例えば、Ｓｕｎｉｌ Ｔｈｏｍａｓ（編）、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｖｏｌｕｍｅ １：Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１６におけるＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ＳＡＲＳ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｖａｃｃｉｎｅ ｆｒｏｍ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｌｕｓ Ｄｅｌｔａ Ｉｎｕｌｉｎ Ａｄｊｕｖａｎｔ」、第４章を参照のこと。米国特許第５，７６２，９３９号もまた参照のこと。

【0101】

バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）は、理想的なサブユニットワクチンの開発のための優れた方法を提供する。組換えタンパク質はそのような系によっておよそ８週間で作製可能である。迅速な作製は、パンデミックの脅威が存在する場合にはとりわけ重要である。さらに、バキュロウイルスは、分類学的に関連する数種類の昆虫種に限定される狭い宿主範囲のために安全であり、哺乳動物細胞において複製することが観察されていない。加えて、昆虫細胞と哺乳動物細胞の両方で複製可能であることが公知の微生物はほとんど存在せず；したがって、昆虫細胞によって産生される臨床産物における外来性感染性因子汚染の可能性は非常に低い。さらに、バキュロウイルスの天然宿主である昆虫は非刺咬性であるため、ヒトは概してこれらの昆虫由来のタンパク質に対する既存の免疫を有しておらず；したがって、ＢＥＶ系において産生される臨床産物に対するアレルギー反応は起こらないと考えられる。さらに、昆虫細胞においてタンパク質に付加される炭水化物部分は、哺乳動物細胞において発現される対応物におけるものほど複雑ではないと考えられるが、昆虫細胞発現糖タンパク質の免疫原性と哺乳動物細胞発現糖タンパク質の免疫原性とは同等であると考えられる。バキュロウイルス系において発現される全長タンパク質は、通例、自己組織化して、通常では界面活性剤濃度を調節することによって天然タンパク質がとる、より高次の構造になる。最後に、ＢＥＶＳ系は、ポリヘドリンプロモーターの極度に高い活性のために非常に効率的であり、高レベルの組換えタンパク質の産生を著しく低いコストで可能にする。

【0102】

ＩＶ．ワクチンの製剤化および包装
組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、筋肉内または皮下投与などの非経口を含む様々な好適な経路を介して投与することができる。免疫原性組成物は、上に記載したように一価であっても多価であってもよい。好適には、組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは筋肉内（ＩＭ）注射用に製剤化される。組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、例えば対象の上腕の三角筋へのＩＭ注射によって、混合物として対象に投与してもよい。あるいは、組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、同じかまたは異なる経路によって、同じかまたは異なる場所に、同じかまたは異なる時間に別個に投与してもよい。

【0103】

別個の製剤として投与される場合、組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、望ましくは、アジュバント効果が十分に維持されるように、空間的に十分に近接した場所に投与される。例えば、空間的近接は、同じ場所に投与した場合に見られるアジュバント効果の少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％を維持するのに十分である。同じ場所に投与した場合に見られるアジュバント効果とは、組換えＳタンパク質単独の投与と比較した、組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントの同じ場所への投与の結果として観察される増加のレベルとして定義される。組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、望ましくは、同じ手足または同じ筋肉などの、同じリンパ節に流入する場所に投与される。好適には、組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは同じ筋肉に筋肉内投与される。ある特定の実施形態では、組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは同じ場所に投与される。投与の場所の空間的距離は、少なくとも５ｍｍ、例えば少なくとも１ｃｍであり得る。投与の場所の空間的距離は、１０ｃｍ未満、例えば５ｃｍ未満離れている場合がある。

【0104】

別個の製剤として投与される場合、組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、望ましくは、アジュバント効果が十分に維持されるように、時間的に十分に近接して投与される。例えば、時間的近接は、同時に投与した場合に見られるアジュバント効果の少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％を維持するのに十分である。同時に投与した場合に見られるアジュバント効果とは、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントを伴わない組換えＳタンパク質の投与と比較した、（本質的に）同じ時間での投与の結果として観察される増加のレベルとして定義される。別個の製剤として投与される場合、組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、１２時間以内に投与される。好適には、組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、６時間以内、２時間以内、または１時間以内、例えば３０分以内または１５分以内（例えば、５分以内）に投与される。組換えＳタンパク質の投与とトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントの投与との間の時間は、少なくとも５秒（例えば、１０秒）または少なくとも３０秒であり得る。別個の製剤として投与される場合において、組換えＳタンパク質とトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントとが時間を空けて投与される場合、組換えＳタンパク質が最初に投与され、次にトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントが投与される。あるいは、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントが最初に投与され、次に組換えＳタンパク質が投与される。適切な時間的近接は投与の順番に依存し得る。望ましくは、組換えＳタンパク質とトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントとは、意図的な遅延（複数回投与の実際性を考慮）を伴わずに投与される。

【0105】

組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントの直接投与のための配合剤としての形状または別個の製剤としての形状に加えて、組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、初めに、製造、保存、および流通を容易にする様々な形態で提供することができる。例えば、ある特定の構成成分は液体形態では限定的な安定性を有する場合があり、ある特定の構成成分は乾燥に適していない場合があり、ある特定の構成成分は混合した場合に配合禁忌となる場合がある（短期的または長期的のいずれか）。組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションは、投与時に配合されるか否かにかかわらず、内容物が後に合わせられる別個の容器において提供することができる。組換えＳタンパク質は液体または乾燥（例えば凍結乾燥）形態で提供することができ；選択される形態は、組換えＳタンパク質の詳細な性質、例えば、組換えＳタンパク質が乾燥に適しているか否か、または存在し得る他の構成成分などの因子に依存し得る。トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、典型的には液体形態で提供される。

【0106】

免疫原性組成物は、抗原とアジュバントとが使用直前または使用時に接触する、即時製剤の形態であり得る。例えば、抗原は注射前にアジュバント（エマルション）と同容量で混合することができる。したがって、本開示は、本免疫原性組成物の抗原構成成分とアジュバントとを別個の容器（例えば、予め処理したガラスバイアルまたはアンプル）において提供するキットなどの製造物品を提供し、アジュバントと抗原構成成分とは注射前に混合され；一部の実施形態では、存在する場合、凍結乾燥構成成分の再懸濁に必要な溶液が物品中に提供される。あるいは、抗原構成成分とアジュバントとは同じ容器において混合および提供され、組成物はワクチン接種を必要とする対象に直接投与することができる。製造物品は使用のための説明書も含み得る。場合によっては、各容器の内容物は、第１および第２の製剤としての別個の投与が意図されている。

【0107】

一部の実施形態では、組換えＳタンパク質は乾燥形態であり得、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは液体形態であり得る。そのような場合、第１および第２の容器の内容物は、投与のための配合剤を得るために組み合わせることが意図されている。あるいは、組換えＳタンパク質は、各容器の内容物を第１および第２の製剤としての別個の投与のために使用する前に再構成することが意図されている。

【0108】

再構成のために使用される液体の詳細な組成は、再構成される容器の内容物と、その後の再構成された内容物の使用、例えば、それらは直接投与されることが意図されているのか、または投与前に他の構成成分と組み合わされる場合があるのかということと、の両方に依存し得る。投与前に他の構成成分と組み合わせることが意図されている組成物（例えば組換えＳタンパク質またはトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントを含有するもの）は、それ自体が生理学的に許容されるｐＨを有する必要も生理学的に許容される浸透圧を有する必要もなく；投与が意図されている製剤は、生理学的に許容されるｐＨを有するべきであり、生理学的に許容される重量モル浸透圧濃度を有するべきである。

【0109】

液体調製物のｐＨは、組成物の構成成分とヒト対象への投与に必要な適合性とを考慮して調整される。製剤のｐＨは、概して少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも５．５、例えば少なくとも６である。製剤のｐＨは、概して９もしくはそれ以下、８．５もしくはそれ以下、または８もしくはそれ以下、例えば７．５またはそれ以下である。製剤のｐＨは、４～９、５～８．５、または５．５～８、例えば６．５～７．４（例えば、６．５～７．１、例えば約６．８）であり得る。

【0110】

非経口投与の場合、溶液は、過剰な細胞の歪みまたは溶解を回避するために、生理学的に許容される重量モル浸透圧濃度を有するべきである。生理学的に許容される重量モル浸透圧濃度とは、概して、溶液がほぼ等張性であるかまたはわずかに高張性である重量モル浸透圧濃度を有し得ることを意味する。好適には、投与のための製剤は、２５０～７５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２５０～５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、または２７０～５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば２７０～４００ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の重量モル浸透圧濃度を有し得る。重量モル浸透圧濃度は、当技術分野で公知の技法に従って、例えば、市販の浸透圧計、例えばＡｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から入手可能なＡｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）モデル２０２０の使用によって測定することができる。

【0111】

再構成のために使用される液体は、例えば注射用水、リン酸緩衝生理食塩水など、実質的に水性であり得る。上述したように、緩衝剤および／または浸透圧調整剤に関する要件は、再構成される容器の内容物と、その後の再構成された内容物の使用の両方に依存し得る。緩衝剤は、酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、マレイン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、およびＴＲＩＳから選択することができる。緩衝剤は、Ｎａ／Ｎａ_２ＰＯ_４、Ｎａ／Ｋ_２ＰＯ_４、またはＫ／Ｋ_２ＰＯ_４などのリン酸緩衝液であり得る。好適な緩衝剤は改変リン酸緩衝生理食塩水である。

【0112】

好適には、本発明において使用される製剤は、０．０５ｍＬ～１ｍＬの間、例えば０．１～０．６ｍＬの間の１用量の容量を有するか、または０．４５～０．５５ｍＬ、例えば０．５ｍＬの１用量の容量を有する。使用される組成物の容量は、対象、送達経路および場所に依存する場合があり、より少ない用量は、皮内経路によって投与されるか、または組換えＳタンパク質とトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントの両方が同じ場所に送達される場合に投与される。筋肉内などの経路による投与のための典型的なヒト用量は２００μｌ～７５０μｌ、例えば４００～６００μｌの範囲であるか、または約５００μｌである。

【0113】

組換えＳタンパク質が液体形態であり、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントが液体形態である場合において、２つの液体が例えば配合剤とするために組み合わせることが意図される場合、各液体の容量は同じであっても異なっていてもよい。組み合わされる容量は、典型的には１０：１～１：１０、例えば２：１～１：２の範囲であり得る。好適には、各液体の容量は、実質的に同じ、例えば同じであり得る。例えば、液体形態の組換えＳタンパク質の容量２５０μｌを液体形態のトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントの容量２５０μｌと組み合わせて、５００μｌの容量の配合剤用量を得ることができ、組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントのそれぞれは、組み合わせている間に２倍に希釈される。

【0114】

したがって、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、投与前に液体組換えＳタンパク質含有組成物によって希釈されることを予期して、濃縮物として調製することができる。例えば、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、投与前に等容量の組換えＳタンパク質含有組成物によって希釈されることを予期して、２倍濃度で調製することができる。

【0115】

スクアレンの投与時の濃度は１ｍＬ当たり０．８～１００ｍｇ（例えば、１ｍｌ当たり１．２～４８．４ｍｇ）の範囲であり得る。

【0116】

組換えＳタンパク質とトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントとは、配合剤が意図されているか別個の製剤が意図されているかにかかわらず、バイアルまたは充填済みシリンジなどの様々な物理的容器の形態において提供することができる。

【0117】

一部の実施形態では、組換えＳタンパク質、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバント、または組換えＳタンパク質とトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントとを含むキットは、単回用量の形態で提供される。他の実施形態では、組換えＳタンパク質、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバント、または組換えＳタンパク質とトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントとを含むキットは、例えば２、５、または１０用量を含有する多回用量形態で提供される。１０用量を含むものなどの多回用量形態は、一方の部分（例えば、組換えＳタンパク質）の単回用量を有する複数の容器と、第２の部分（例えば、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバント）の複数回用量を有する単一の容器との形態において提供することも、一方の部分（組換えＳタンパク質）の複数回用量を有する単一の容器と、第２の部分（トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバント）の複数回用量を有する単一の容器との形態において提供することもできる。

【0118】

液体が容器間で、例えばバイアルからシリンジへ移されることが意図されている場合、必要とされる全容量を簡便に移すことができることを保証する「増し仕込み」を設定することが一般的である。必要とされる増し仕込みのレベルは状況に依存し得るが、過剰な増し仕込みは廃棄量を削減するために回避するべきであり、不十分な増し仕込みは実際上の困難を引き起こすおそれがある。増し仕込みは、１用量当たり２０～１００μｌ程度、例えば３０μｌまたは５０μｌであり得る。例えば、２倍濃縮トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバント（１用量当たり２５０μｌ）の典型的な１０用量容器は、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントをおおよそ２．８５～３．２５ｍＬ含有し得る。

【0119】

安定剤または保存剤が存在してもよい。これらは、多回用量容器が提供される場合は、複数用量の最終製剤がある期間にわたり対象に投与される場合があるため、有用となり得る。そのような安定剤／保存剤としては、限定されないが、パラベン、チメロサール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、およびキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）が挙げられる。

【0120】

液体形態の組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、マルチチャンバーシリンジの形態において提供することができる。マルチチャンバーシリンジの使用は、組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントの別個の逐次投与に簡便な方法を実現する。マルチチャンバーシリンジは、組換えＳタンパク質およびトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントの同時だが別個の送達を実現するように構成することも、逐次送達（いずれの順番でも）を実現するように構成することも、組合せ投与前の混合を容易にするように構成することもできる。マルチチャンバーシリンジの他の構成では、組換えＳタンパク質は、一方のチャンバーに乾燥形態（例えば、フリーズドライ）で提供され、他方のチャンバーに含有されるトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントによって再構成された後、投与することができる。マルチチャンバーシリンジの例は、国際公開第２０１６／１７２３９６号などの開示に見出すことができるが、様々な他の構成も可能である。

【0121】

一部の実施形態では、単位投薬量は、１用量当たり０．２５ｍＬまたは０．５ｍＬで提供される組換えＳタンパク質１～５０または５～５０（例えば、２．５、５、１０、１５、３０、または４５）μｇである。

【0122】

一部の実施形態では、単位投薬量（すなわち、単回用量）は、保存剤も抗生物質も含有しない０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）の濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ｑ．ｓ．０．２５ｍＬ）において製剤化された組換えＳタンパク質５または１０μｇに対応する。抗原単位投薬量は多回用量バイアルで供給することができる。これらは、使用前に単回用量のＡＳ０３アジュバント（例えば、ＡＳ０３_Ａ、ＡＳ０３_Ｂ、またはＡＳ０３_Ｃ）と混合される場合がある。

【0123】

一部の実施形態では、１単位投薬量は以下の表Ａに示す成分を含有する。

【0124】

【表1】

【0125】

一部の実施形態では、ＩＭ注射によるヒトワクチン接種ごとに、滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭまたは変異株２．５μｇ（例えば、表Ａ、以下の表８または表１２を参照のこと）を、注射前にＡＳ０３（ＡＳ０３_Ａ；例えば表９を参照のこと）０．２５ｍＬと同容量で混合して、最終注射容量０．５ｍＬを達成する。さらなる実施形態では、変異株はベータ変異株（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１３）である。他の実施形態では、抗原溶液と混合するためのＡＳ０３アジュバントの用量は、表９に示す０．２５ｍＬのエマルションの２分の１（ＡＳ０３_Ｂ）、４分の１（ＡＳ０３_Ｃ）、または８分の１（ＡＳ０３_Ｄ）であり；そのような実施形態では、場合によりリン酸緩衝生理食塩水をＡＳ０３エマルションに添加して、アジュバント用量の最終容量である０．２５ｍＬを達成してもよい（例えば、表９を参照のこと）。

【0126】

一部の実施形態では、ＩＭ注射によるヒトワクチン接種ごとに、滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭまたは変異株５μｇ（例えば、表Ａ、以下の表８または表１２を参照のこと）を、注射前にＡＳ０３（ＡＳ０３_Ａ）０．２５ｍＬと同容量で混合して、最終注射容量０．５ｍＬを達成する。さらなる実施形態では、変異株はベータ変異株（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１３）である。他の実施形態では、抗原溶液と混合するためのＡＳ０３アジュバントの用量は、表９に示す０．２５ｍＬのエマルションの２分の１（ＡＳ０３_Ｂ）、４分の１（ＡＳ０３_Ｃ）、または８分の１（ＡＳ０３_Ｄ）であり；そのような実施形態では、場合によりリン酸緩衝生理食塩水をＡＳ０３エマルションに添加して、アジュバント用量の最終容量である０．２５ｍＬを達成してもよい（例えば、表９を参照のこと）。

【0127】

一部の実施形態では、ＩＭ注射によるヒトワクチン接種ごとに、滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭまたは変異株１０μｇ（例えば、表Ａ、以下の表８または表１２を参照のこと）を、注射前にＡＳ０３（ＡＳ０３_Ａ）０．２５ｍＬと同容量で混合して、最終注射容量０．５ｍＬを達成する。さらなる実施形態では、変異株はベータ変異株（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１３）である。他の実施形態では、抗原溶液と混合するためのＡＳ０３アジュバントの用量は、表９に示す０．２５ｍＬのエマルションの２分の１（ＡＳ０３_Ｂ）、４分の１（ＡＳ０３_Ｃ）、または８分の１（ＡＳ０３_Ｄ）であり；そのような実施形態では、場合によりリン酸緩衝生理食塩水をＡＳ０３エマルションに添加して、アジュバント用量の最終容量である０．２５ｍＬを達成してもよい（例えば、表９を参照のこと）。

【0128】

一部の実施形態では、ＩＭ注射によるヒトワクチン接種ごとに、滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭまたは変異株１５μｇ（例えば、表Ａ、以下の表８または表１２を参照のこと）を、注射前にＡＳ０３（ＡＳ０３_Ａ）０．２５ｍＬと同容量で混合して、最終注射容量０．５ｍＬを達成する。さらなる実施形態では、変異株はベータ変異株（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１３）である。他の実施形態では、抗原溶液と混合するためのＡＳ０３アジュバントの用量は、表９に示す０．２５ｍＬのエマルションの２分の１（ＡＳ０３_Ｂ）、４分の１（ＡＳ０３_Ｃ）、または８分の１（ＡＳ０３_Ｄ）であり；そのような実施形態では、場合によりリン酸緩衝生理食塩水をＡＳ０３エマルションに添加して、アジュバント用量の最終容量である０．２５ｍＬを達成してもよい（例えば、表９を参照のこと）。

【0129】

一部の実施形態では、ＩＭ注射によるヒトワクチン接種ごとに、滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭまたは変異株４５μｇ（例えば、表Ａ、以下の表８または表１２を参照のこと）を、注射前にＡＳ０３（ＡＳ０３_Ａ）０．２５ｍＬと同容量で混合して、最終注射容量０．５ｍＬを達成する。さらなる実施形態では、変異株はベータ変異株（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１３）である。他の実施形態では、抗原溶液と混合するためのＡＳ０３アジュバントの用量は、表９に示す０．２５ｍＬのエマルションの２分の１（ＡＳ０３_Ｂ）、４分の１（ＡＳ０３_Ｃ）、または８分の１（ＡＳ０３_Ｄ）であり；そのような実施形態では、場合によりリン酸緩衝生理食塩水をＡＳ０３エマルションに添加して、アジュバント用量の最終容量である０．２５ｍＬを達成してもよい（例えば、表９を参照のこと）。

【0130】

一部の実施形態では、ＩＭ注射によるヒトワクチン接種ごとに、滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中、２つの異なる組換えＳタンパク質合計１０μｇ（例えば、ｐｒｅＳ ｄＴＭまたはＢ．１．３５１に由来するものなどの変異株（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１３）；各５μｇ）（例えば、表Ａ、以下の表８または表１２を参照のこと）を、注射前にＡＳ０３（ＡＳ０３_Ａ）０．２５ｍＬと同容量で混合して、最終注射容量０．５ｍＬを達成する。他の実施形態では、抗原溶液と混合するためのＡＳ０３アジュバントの用量は、表９に示す０．２５ｍＬのエマルションの２分の１（ＡＳ０３_Ｂ）、４分の１（ＡＳ０３_Ｃ）、または８分の１（ＡＳ０３_Ｄ）であり；そのような実施形態では、場合によりリン酸緩衝生理食塩水をＡＳ０３エマルションに添加して、アジュバント用量の最終容量である０．２５ｍＬを達成してもよい（例えば、表９を参照のこと）。

【0131】

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、一価であり、単一組換えＳタンパク質（例えば、ｐｒｅＳ ｄＴＭまたはｐｒｅＳ ｄＴＭ変異株）を１用量当たり１０μｇ含有する。注射用組成物はＡＳ０３アジュバントを含む（例えば、表９を参照のこと）。さらなる実施形態では、変異株はベータ変異株（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１３）である。

【0132】

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、二価であり、２つの異なる組換えＳタンパク質（例えば、ｐｒｅＳ ｄＴＭおよびｐｒｅＳ ｄＴＭ変異株）を１用量当たりそれぞれ５μｇ含有する。注射用組成物はＡＳ０３アジュバントを含む（例えば、表９を参照のこと）。さらなる実施形態では、変異株はベータ変異株（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１３）である。

【0133】

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、三価であり、３つの異なる組換えＳタンパク質（例えば、ｐｒｅＳ ｄＴＭおよび２つのｐｒｅＳ ｄＴＭ変異株）を１用量当たりそれぞれ３．３μｇ含有する。注射用組成物はＡＳ０３アジュバントを含む（例えば、表９を参照のこと）。さらなる実施形態では、変異株のうちの一方はベータ変異株（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１３）である。

【0134】

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、一価であり、組換えＳタンパク質（例えば、ｐｒｅＳ ｄＴＭ）を１用量当たり２．５μｇ含有する。注射用組成物はＡＳ０３アジュバントを含む（例えば、表９を参照のこと）。

【0135】

一部の実施形態では、本開示のワクチン製品は２～８℃で保存される。

【0136】

Ｖ．ワクチンの使用
本発明は概して、哺乳動物対象、例えばヒト対象が意図されている。

【0137】

対象は任意の年齢であり得る。一実施形態では、対象はヒト乳児（最大１２か月齢）である。一実施形態では、対象はヒト小児（１８歳未満）である。一実施形態では、対象はヒト成人（１８～５９歳）である。一実施形態では、対象は老年のヒト（６０歳またはそれ以上）である。１２歳未満などの若年の小児に投与される用量は、成人等価用量に対して、例えば５０％低減してもよい。一部の実施形態では、２．５μｇ用量の抗原が投与される。一部の実施形態では、５μｇ用量の抗原が投与される。一部の実施形態では、１０μｇ用量の抗原が投与される。一部の実施形態では、１５μｇ用量の抗原が投与される。一部の実施形態では、４５μｇ用量の抗原が投与される。

【0138】

好適には、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していない。ある特定の実施形態では、対象は過去にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したことがない。他の実施形態では、対象は過去にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９を発症した）ことがある。

【0139】

本開示のワクチン組成物によるワクチン接種に好適な対象としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に感受性のヒトが挙げられる。対象に投与されるワクチンの量は、使用されるアジュバントの種類、投与経路、ならびに対象の年齢および体重を含む当業者に周知の標準的な技法に従って決定することができる。一部の実施形態では、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントと混合された２．５μｇ用量の抗原が投与される。一部の実施形態では、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントと混合された５μｇ用量の抗原が投与される。一部の実施形態では、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントと混合された１０μｇ用量の抗原が投与される。一部の実施形態では、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントと混合された１５μｇ用量の抗原が投与される。一部の実施形態では、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントと混合された４５μｇ用量の抗原が投与される。

【0140】

組成物は、単回用量または一連の用量（例えば、その後の「ブースター」用量を含む１～３回の一次用量）で投与することができる。一部の実施形態では、第１の用量と第２の用量とは約１４日（または約２週間）～約６か月空けられる。例えば、用量の間隔は、１４～３５日（例えば、約２１もしくは２８日）、または約２～５週間（例えば、約３もしくは４週間）、または約１か月空けてもよい。

【0141】

一部の実施形態では、単回用量は、表Ａ、表８、または表１２に示す抗原組成物約０．２５ｍＬ（組換えＳタンパク質５または１０μｇを含有）とＡＳ０３アジュバント（例えば、ＡＳ０３_Ａ、ＡＳ０３_Ｂ、またはＡＳ０３_Ｃ）との混合物である。さらなる実施形態では、対象はそのような用量を２回投与され、各用量は２１日または３週間空けられる。他のさらなる実施形態では、対象はそのような用量を２回投与され、各用量は２８日もしくは４週間または１か月空けられる。

【0142】

ワクチン組成物は予防有効量で対象に提供され、これは単回用量で投与しても一連の用量で投与してもよい。「予防有効量」とは、ＣＯＶＩＤ－１９の１つまたはそれ以上の症状の発現を防止もしくは遅延する、ならびに／またはその頻度および／もしくは重症度を低下させるのに十分な免疫応答を誘導するために必要とされる量を指す。一部の実施形態では、上記量は、１つもしくはそれ以上の症状の重症度および／もしくは１つもしくはそれ以上の症状が対象によって経験される時間を部分的もしくは完全に低下させる、チャレンジ後に、確立された感染症を発症する可能性を低下させる、疾病の進行を遅らせ、場合により生存を延長させる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体を産生させる、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質特異的Ｔ細胞応答である免疫応答を誘発する。

【0143】

一部の実施形態では、本開示は、以下の表Ｂに示すようなワクチン接種レジメンを提供する。レジメンは、ＣＯＶＩＤ－１９、例えばその症状のうちの１つもしくはそれ以上を防止もしくは改善するか、またはＣＯＶＩＤ－１９に関連する入院もしくは死亡のリスクを防止もしくは低下する。あるレジメンでは、ＣＯＶＩＤ－１９ナイーブまたは未ワクチン接種対象に、水性抗原構成成分０．２５ｍＬとＡＳ０３アジュバント（例えば、必要に応じてＰＢＳを用いて容量を０．２５ｍＬにしてもよい、ＡＳ０３_Ａ、ＡＳ０３_Ｂ、またはＡＳ０３_Ｃ）０．２５ｍＬとを混合することによって調製された免疫原性組成物をＩＭでワクチン接種する。水性抗原構成成分０．２５ｍＬは、一価（ＭＶ）であり得、表Ａに示すようにＰＢＳにおいて製剤化されたＤ６１４ ｐｒｅＳ ｄＴＭまたはＢ．１．３５１（ベータ）ｐｒｅＳ ｄＴＭ １０μｇを含む。あるいは、水性抗原構成成分は、二価（ＢＶ）であり、表Ａに示すようにＰＢＳにおいて製剤化されたＤ６１４ ｐｒｅＳ ｄＴＭ ５μｇおよびベータｐｒｅＳ ｄＴＭ ５μｇを含む。上記レジメンでは、対象は免疫原性組成物を２回、３週間または４週間空けて投与される。

【0144】

ＶＩ．ブースターとしてのワクチンの使用
本ワクチン組成物は、汎用ブースターとして使用することができる。本ワクチン組成物は、以前に投与されたＣＯＶＩＤ－１９ワクチンのブースターとして、すなわち、プライム－ブーストワクチン接種レジメン、例えば異種または同種プライム－ブーストワクチン接種レジメンの一部として使用することができる。レジメンにおけるプライム用量（すなわち、一次ワクチン）は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または麻疹ウイルスベクター）、ペプチドまたはタンパク質、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、カプシド様粒子（ＣＬＰ）、弱毒生ウイルス、不活化ウイルス（死滅ワクチン）などに基づくワクチンであり得る。一部の実施形態では、一次ワクチンはブースターワクチンと同じ抗原を含有する（すなわち、同種プライム－ブーストワクチン接種レジメン）。プライム－ブーストレジメンは、部分的には、とりわけプライムのウイルスベクターの再利用、ならびにブーストによってもたらされる定性的および定量的に異なる免疫プロファイルのために好都合であり得る。そのようなレジメンは、ワクチン接種された対象における抗ウイルス免疫の幅、効力、および持続性の点で向上した転帰をもたらすと予期される。

【0145】

体内においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原（例えば、Ｓタンパク質抗原）を発現させるための遺伝子材料（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはウイルスベクター）を含むワクチンは、まとめて「遺伝子ワクチン」と称される。例えば、遺伝子ワクチンとしては、化学修飾またはヌクレオチド類似体を有するかまたは有しないｍＲＮＡを含むものが挙げられる。ｍＲＮＡは、封入（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に）されても、担体またはアジュバント（例えば、プロタミンまたはサポニン）と複合体を形成してもよい。ｍＲＮＡは、自己複製型であっても自己複製型でなくてもよい。本ワクチン組成物は、遺伝子ワクチンのブースターとして有用であるが、その理由は、遺伝子ワクチンは、ワクチン接種された対象において、その後の同じワクチンの用量の効能を損なわせる、したがって低下させる抗薬物免疫応答を誘発し得るためである。そのような場合、遺伝子ワクチンは同じ対象に繰り返し（例えば、季節ごとに）投与することができない。

【0146】

本プライム－ブーストレジメンの一部の実施形態では、プライム用量は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の外部ドメインを含み得る組換えＳタンパク質をコードする遺伝子ワクチンであり得る。一部の実施形態では、組換えＳタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２外部ドメインまたは受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）由来の配列および三量体化配列（例えば、天然のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ三量体化ドメイン）を含むポリペプチドの三量体である。一部の実施形態では、コードされる組換えＳタンパク質は、ワクチン接種された対象における産生細胞からの組換えＳタンパク質の分泌を容易にするシグナルペプチド配列（例えば、Ｓタンパク質などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のシグナルペプチド）を含み得る。

【0147】

一部の実施形態では、遺伝子ワクチンは、特異的設計を目的として、参照（例えば、天然に存在する）Ｓタンパク質と比較して１つまたはそれ以上の突然変異を有するＳタンパク質またはその抗原性部分をコードする。例えば、コードされるＳタンパク質は、（ｉ）フーリン切断を防止するためのフーリン切断部位における突然変異（例えば、「ＧＳＡＳ」（配列番号６）突然変異）、（ｉｉ）小胞体（ＥＲ）保留を変更する突然変異、（ｉｉｉ）推定グリコシル化を抑制する突然変異、（ｉｖ）代替シグナルペプチドを導入する突然変異、および／または（ｖ）Ｓポリペプチドの融合前立体構造を安定化する突然変異（例えば、「ＰＰ」突然変異）を含有し得る。

【0148】

一部の実施形態では、遺伝子ワクチンによってコードされるＳタンパク質は、Ｄ６１４Ｇ突然変異などの天然に存在する突然変異および本明細書に記載される他の突然変異を含み得る。ある特定の実施形態では、遺伝子ワクチンは、上に記載したものなどのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２変異株に由来する組換えＳタンパク質をコードする。

【0149】

一部の実施形態では、遺伝子ワクチンは、Ｍｏｄｅｒｎａ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン（ｍＲＮＡ－１２７３）、Ｐｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン（ＢＮＴ１６２ｂ２）、Ｊａｎｓｓｅｎ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン（Ａｄ２６．ＣｏＶ２．Ｓ）、およびＶａｘｚｅｖｒｉａ（以前はＣＯＶＩＤ－１９ワクチンＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）である。

【0150】

本プライム－ブーストレジメンの一部の実施形態では、プライム用量は、Ｓｉｎｏｖａｃ－ＣｏｒｏｎａＶａｃおよびＳｉｎｏｐｈａｒｍ ＢＩＢＰワクチンなどの死滅ワクチンである。

【0151】

プライム－ブーストレジメンは、一次ワクチン（例えば、遺伝子ワクチンまたはサブユニットワクチン）と、その後の本タンパク質ワクチンを用いる１回またはそれ以上のブースター用量を用いるワクチン接種を含む。一部の実施形態では、一次ワクチンは、ワクチンの１回の投与（例えば、筋肉内、皮下、皮内、または鼻腔内投与）、またはある期間（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０週間、またはそれ以上）空けたワクチンの２回の投与を伴う。

【0152】

一部の実施形態では、本組換えタンパク質を用いるブースター用量は、一次ワクチン接種の少なくとも２週間（例えば、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１年、１年半、２年、３年、４年、５年、またはそれ以上）後に投与することができる。例えば、遺伝子ワクチン（例えば、ｍＲＮＡもしくはアデノウイルスに基づくワクチン）またはサブユニットワクチンが投与された後、本タンパク質ワクチンを用いるブースター用量は、毎年または半年ごとに対象に投与することができる。便宜のために、ブースターワクチンは、毎年、インフルエンザワクチンと同時に投与してもよい（例えば、別個の製剤または配合剤として）。

【0153】

一部の実施形態では、ブースターは、アジュバントと共にまたはアジュバントを伴わずに使用される、本明細書に記載される一価または多価免疫原性組成物である。一部の実施形態では、ブースターは一価免疫原性組成物（例えば、武漢株または南アフリカ変異株に由来する組換えＳタンパク質を含有するもの）である。他の実施形態では、ブースターは二価免疫原性組成物（例えば、武漢株に由来する組換えＳタンパク質と南アフリカ変異株に由来する組換えＳタンパク質とを含有するもの）である。

【0154】

ある特定の実施形態では、ブースター用量は、注射前に滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭ ５μｇおよび／または変異株５μｇ（例えば、表Ａ、以下の表８または表１２を参照のこと）をＡＳ０３（ＡＳ０３_Ａ）０．２５ｍＬと同容量で混合することから作製される０．５ｍＬ免疫原性組成物であり得る。さらなる実施形態では、変異株はベータ変異株（例えば、シグナル配列を有する配列番号１３）である。抗原溶液と混合するためのＡＳ０３アジュバントの用量はまた、以下の表９に示す０．２５ｍＬのエマルションの２分の１（ＡＳ０３_Ｂ）、４分の１（ＡＳ０３_Ｃ）、または８分の１（ＡＳ０３_Ｄ）であってもよい。そのような実施形態では、場合によりリン酸緩衝生理食塩水をＡＳ０３エマルションに添加して、アジュバント用量の最終容量である０．２５ｍＬを達成してもよい（例えば、表９を参照のこと）。

【0155】

ある特定の実施形態では、ブースター用量は、注射前に滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭ ２．５μｇおよび／または変異株２．５μｇ（例えば、表Ａ、以下の表８または表１２を参照のこと）をＡＳ０３（ＡＳ０３_Ａ）０．２５ｍＬと同容量で混合することから作製される０．５ｍＬ免疫原性組成物であり得る。さらなる実施形態では、変異株はベータ変異株（例えば、シグナル配列を有する配列番号１３）である。抗原溶液と混合するためのＡＳ０３アジュバントの用量はまた、表９に示す０．２５ｍＬのエマルションの２分の１（ＡＳ０３_Ｂ）、４分の１（ＡＳ０３_Ｃ）、または８分の１（ＡＳ０３_Ｄ）であってもよく；そのような実施形態では、場合によりリン酸緩衝生理食塩水をＡＳ０３エマルションに添加して、アジュバント用量の最終容量である０．２５ｍＬを達成してもよい（例えば、表９を参照のこと）。

【0156】

ある特定の実施形態では、一次ワクチン接種は組換えＳタンパク質を含むサブユニットワクチンを用いて行われ、ブースターワクチンは、一次（非ブースター）ワクチン接種のために使用したワクチンよりも少ない量の組換えＳタンパク質を含有する。例えば、一次ワクチン接種は、接種１回当たり組換えＳタンパク質１０μｇを用いる、間隔（例えば、２、３、４、５、６、７、８週間、またはそれ以上；１４～３５日の間隔）を空けた２回の接種を伴い、ブースター接種は、組換えＳタンパク質をわずか２．５または５μｇ含有し得る。

【0157】

一部の実施形態では、一次ワクチン接種は、注射前に滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭまたは変異株１０μｇ（または二価ワクチンの場合、ｐｒｅＳ ｄＴＭ ５μｇと変異株、例えば、ベータ変異株５μｇ）（例えば、表Ａ、以下の表８または表１２を参照のこと）をＡＳ０３（ＡＳ０３_Ａ）０．２５ｍＬと同容量で混合することによって調製される０．５ｍＬ免疫原性組成物の２回の接種を伴い、２回の接種の間には間隔（例えば、３、４、５、６、７、８週間、またはそれ以上の間隔）が設けられる。抗原溶液と混合するためのＡＳ０３アジュバントの用量はまた、表９に示す０．２５ｍＬのエマルションの２分の１（ＡＳ０３_Ｂ）、４分の１（ＡＳ０３_Ｃ）、または８分の１（ＡＳ０３_Ｄ）であってもよく；そのような実施形態では、場合によりリン酸緩衝生理食塩水をＡＳ０３エマルションに添加して、アジュバント用量の最終容量である０．２５ｍＬを達成してもよい（例えば、表９を参照のこと）。次いで、対象は後の時点（例えば、一次ワクチン接種の２回目の接種の少なくとも３、６、７、９、または１２か月後）においてブースターワクチンを投与され、ここで、ブースターワクチンは、注射前に滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭまたは変異株（例えば、ベータ変異株）２．５または５μｇ（例えば、表Ａ、表８、または表１２を参照のこと）をＡＳ０３（ＡＳ０３_Ａ）０．２５ｍＬと同容量で混合することから作製される０．５ｍＬ免疫原性組成物であり得る。抗原溶液と混合するためのＡＳ０３アジュバントの用量はまた、表９に示す０．２５ｍＬのエマルションの２分の１（ＡＳ０３_Ｂ）、４分の１（ＡＳ０３_Ｃ）、または８分の１（ＡＳ０３_Ｄ）であってもよく；そのような実施形態では、場合によりリン酸緩衝生理食塩水をＡＳ０３エマルションに添加して、アジュバント用量の最終容量である０．２５ｍＬを達成してもよい（例えば、表９を参照のこと）。

【0158】

一部の実施形態では、本開示のワクチン接種レジメンは、以下の表Ｂに記載されるレジメンから選択される：

【0159】

【表2】

【0160】

上の表Ｂにおいて、レジメン２～９は本開示の例示的なプライム－ブーストレジメンである。レジメンは、ＣＯＶＩＤ－１９、例えばその症状のうちの１つもしくはそれ以上を防止もしくは改善するか、または入院もしくは死亡のリスクを防止もしくは低下する。

【0161】

一部の実施形態では、ＣＯＶＩＤ－１９から回復したかまたはＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを接種されたことがある対象は、そのような回復またはワクチン接種の例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月後、またはそれ以上後にブースターを投与される。さらなる実施形態では、ブースターの時期はそのような回復またはワクチン接種の約４～約１０か月後である。ある特定の実施形態では、ブースターの時期はそのような回復またはワクチン接種の約８か月後である。この対象は、水性抗原構成成分０．２５ｍＬとＡＳ０３アジュバント（例えば、ＡＳ０３_ＡまたはＡＳ０３_Ｂ（その容量は、必要である場合、ＰＢＳによって０．２５ｍＬにしてもよい））とを混合することによって調製された免疫原性組成物をＩＭによって投与される。一実施形態では、水性抗原構成成分０．２５ｍＬは、一価（ＭＶ）であり得、表Ａに示すようにＰＢＳにおいて製剤化されたＤ６１４ ｐｒｅＳ ｄＴＭまたはベータｐｒｅＳ ｄＴＭ ２．５μｇを含み、ＡＳ０３アジュバントは、ＡＳ０３_ＡまたはＡＳ０３_Ｂ（その容量は、必要である場合、ＰＢＳによって０．２５ｍＬにしてもよい）である。一実施形態では、水性抗原構成成分０．２５ｍＬは、一価（ＭＶ）であり得、表Ａに示すようにＰＢＳにおいて製剤化されたＤ６１４ ｐｒｅＳ ｄＴＭまたはベータｐｒｅＳ ｄＴＭ ５μｇを含み、ＡＳ０３アジュバントは、ＡＳ０３_ＡまたはＡＳ０３_Ｂ（その容量は、必要である場合、ＰＢＳによって０．２５ｍＬにしてもよい）である。一実施形態では、水性抗原構成成分は、二価（ＢＶ）であり、表Ａに示すようにＰＢＳにおいて製剤化されたＤ６１４ ｐｒｅＳ ｄＴＭ ２．５μｇおよびベータｐｒｅＳ ｄＴＭ ２．５μｇを含み、ＡＳ０３アジュバントはＡＳ０３_ＡまたはＡＳ０３_Ｂ（その容量は、必要である場合、ＰＢＳによって０．２５ｍＬにしてもよい）である。

【0162】

本明細書に別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料は以下に記載されるが、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料もまた本発明の実施または試験において使用することができる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。概して、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、ウイルス学、免疫学、微生物学、遺伝子学、分析化学、合成有機化学、医薬品および創薬化学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法ならびにこれらの技法は、当技術分野において周知であり一般的に使用されるものである。酵素反応および精製技法は、当技術分野において一般的に遂行されるようにまたは本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って実施される。さらに、文脈上別段の要件がない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書および実施形態全体にわたって、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの活用形は、記載された整数または整数群を含むが、任意の他の整数も整数群も除外するものではないということを含意していると理解されるだろう。本明細書で言及される全ての刊行物および他の参考文献は、それらの全体が参照によって組み入れられる。いくつかの文書が本明細書に引用されるが、この引用は、これらの文書のいずれかが当技術分野における通常の一般的知識の一部を形成することを承認するものではない。

【0163】

本明細書で使用する場合、１つまたはそれ以上の目的の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、記載された参照値と類似した値を指す。ある特定の実施形態では、この用語は、別段の記載がなく、別段のことが文脈から明白でもない限り、記載される参照値のいずれかの方向（より大きいかまたはより小さい）の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下に収まる値の範囲を指す。

【0164】

本発明がより良好に理解されるように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は例示のみを目的としており、いかなる点においても、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0165】

実施例１
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓコード配列のバキュロウイルストランスファープラスミドへのクローニング
ギブソン・アセンブリ（ＧＡ）を使用して、ゲノム分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ０４５５１２由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質ＹＰ＿００９７２４３９０．１から改変された適応ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質を保持するトランスファープラスミドを生成した。構築物ごとに３つの遺伝子断片（ｇＢｌｏｃｋ）を、線状化ＳａｐＩ ｐＰＳＣ１２ ＤＢトランスファーベクターへのクローニングのために設計した。ｇＢｌｏｃｋ遺伝子断片は、接合部位に４０ｂｐの重複配列を有し、ｇＢｌｏｃｋ断片１および３のそれぞれ５’および３’にｐＰＳＣ１２と重複する配列を有する。ｇＢｌｏｃｋはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって合成された。ギブソン・アセンブリ反応の描写を（図２Ａおよび２Ｂ）に示す。最終トランスファープラスミドはＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによってサンガー配列決定により確認された。部位特異的突然変異導入もまた、変異タンパク質を生成するために使用することができる。

【0166】

実施例２
組換えＳタンパク質の作製および精製
ポリヘドリンプロモーターの制御下のｐｒｅＳ ｄＴＭをコードする配列を含有する組換えバキュロウイルスを使用して、ツマジロクサヨトウ細胞に感染させた。細胞をＰＳＦＭ培地（ＳＡＦＣ）において２７℃で２．５×１０^６個／ｍＬの密度まで増殖し、２％（容量／容量）の組換えバキュロウイルスを感染させた。細胞を、感染の７２時間後に３，４００×ｇでの１５分間の遠心分離によって回収した。上清を組換えＳタンパク質の精製のために使用した。

【0167】

１つの精製プロセスにおいて、分泌された組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含有する上清を、ＳＵＰＲＡＣＡＰ１００二層Ｋ２５０Ｐ／ＫＳ５０Ｐ ５”フィルター（Ｐａｌｌ、＃ＮＰ５ＬＰＤＧ４１）を使用して深層濾過した。深層濾液を、１００ｋＤａ Ｓａｒｔｏｃｏｎスライスカセット、０．１ｍ^２、１５ｐｓｉにおいて２００ｍＬ／分の流量を使用して１０倍に濃縮し、続いて、２０ｍＭトリス；５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて５倍ダイアフィルトレーションを行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含有するダイアフィルトレーション濾液を、捕捉工程精製として、Ｃａｐｔｏ（商標）レンズマメレクチン（Ｃｙｔｉｖａ）クロマトグラフィーによって精製した。Ｃａｐｔｏ（商標）レンズマメレクチンカラムを、２０ｍＭトリス；５０ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭメチル－α－Ｄ－マンノピラノシド、ｐＨ７．４を用いて平衡化した。これらの条件下において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質はＣａｐｔｏ（商標）レンズマメレクチン樹脂に結合し、夾雑物はカラムを通過した。カラムを、２０ｍＭトリス；５０ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭメチル－α－Ｄ－マンノピラノシド、ｐＨ７．４を用いて洗浄して、未結合タンパク質を除去した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を、２０ｍＭトリス；５００ｍＭメチル－α－Ｄ－マンノピラノシド、ｐＨ７．４を含有する溶出緩衝液を用いてＣａｐｔｏ（商標）レンズマメレクチンカラムから溶出した。

【0168】

Ｃａｐｔｏ（商標）レンズマメレクチン溶出液を、最終精製工程として、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）によってさらに精製した。Ｃａｐｔｏ（商標）レンズマメレクチン溶出液を７５０ｍＭ硫酸アンモニウム濃度、０．０１％トリトンＸ－１００濃度に調整し、５０ｍＭリン酸ナトリウム；７５０ｍＭ硫酸アンモニウム；０．０１％ｖ／ｖトリトンＸ－１００、ｐＨ７．０を含有する緩衝液を用いて平衡化したＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムに充填した。充填後、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムを、５０ｍＭリン酸ナトリウム；７５０ｍＭ硫酸アンモニウム；０．０１％ｖ／ｖトリトンＸ－１００、ｐＨ７．０を用いて洗浄して、未結合夾雑物を除去した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質を、５０ｍＭリン酸ナトリウム；３００ｍＭ硫酸アンモニウム；０．０１％ｖ／ｖトリトンＸ－１００、ｐＨ７．０を含有するＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム溶出緩衝液から溶出した。

【0169】

Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ溶出液を蒸留水で３．２５倍に希釈し、単一Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ ＸＴ Ａｃｒｏｄｉｓｃフィルター（Ｐａｌｌ、＃ＭＳＴＧＸＴ２５Ｑ１６）を使用してＱ膜濾過を実施した。Ｑ膜濾過後、Ｓａｒｔｏｃｏｎスライス５０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ、＃３Ｄ９１４６５０５０ＥＬＬＰＵ）を使用してＴＦＦを実施した。Ｑ濾液を０．２５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８～７．２を用いて１０倍ダイアフィルトレーションを行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含有するＴＦＦ保持液を０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０と共に製剤化し、０．２μｍフィルターを使用して滅菌濾過し、使用まで４℃で保存した。

【0170】

代替的な精製プロセスはＣＥＸ－ＨＩＣを使用する。回収は、深層濾過（最初の遠心分離工程を伴うかまたは伴わない）によって達成してもよい。次いで、捕捉された組換えタンパク質は、限外濾過／ダイアフィルトレーション工程によってさらに精製してもよい。

【0171】

実施例３
エマルションアジュバント製造
スクアレンおよびＤ／Ｌ－アルファトコフェロールから構成される油相を窒素雰囲気下で作製した。改変リン酸緩衝生理食塩水およびポリソルベート８０から構成される水相を別個に調製した。油相および水相を１：９の比（油相の容量対水相の容量）で合わせ、その後、ホモジナイゼーションおよびマイクロフルイダイゼーション（おおよそ１５，０００ｐｓｉのマイクロフルイダイザーによる３パス処理）を行った。得られたエマルションを、重なった２枚の０．５／０．２μｍフィルターに２回連続（すなわち、０．５／０．２／０．５／０．２）で通すことによって滅菌濾過した。

【0172】

スクアレン４２．７６ｍｇ／ｍＬ、トコフェロール４７．４４ｍｇ／ｍＬ、およびポリソルベート８０ １９．４４ｍｇ／ｍＬの最終含量を標的とした（表９を参照のこと）。

【0173】

粒径および多分散性はＤＬＳによって、それぞれ、１４０～１８０ｎｍの範囲内および０．２未満であることが決定された。スクアレンおよびトコフェロール含量はＨＰＬＣ、ポリソルベート８０含量は分光測光法によって、規格の範囲内であることが確認された。

【0174】

実施例４
中枢的マウス研究
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組換えタンパク質ワクチン製剤のマウスにおける研究を記載する。ワクチン製剤は、膜貫通および細胞質領域が欠失したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２融合前安定化Ｓタンパク質（ｐｒｅＳ ｄＴＭ）を含有した。ワクチンはＡＳ０３アジュバントを含有した。このワクチン研究では、液性免疫と細胞性免疫の両方に対する用量反応およびアジュバント効果を検討した。この研究ではまた、非安定化Ｓ外部ドメイン（膜貫通および細胞質領域を欠失；「Ｓ ｄＴＭ」）とｐｒｅＳ ｄＴＭとの間で効果を比較した。Ｓ ｄＴＭは、Ｈｉｓタグを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ＥＣＤ Ｓ１およびＳ２領域（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有した。

【0175】

ここで使用したマウスは、６～８週齢の非近交系雌Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスであった。これらにワクチン製剤５０μＬ（抗原溶液２５μＬおよびＡＳ０３ ２５μＬ）を０日目および２１日目に筋肉内注射した。

【0176】

以下のデータは、標的抗原用量と実際の抗原用量とを示す。実験を行った後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｐｒｅＳタンパク質を検出するために使用した重要なポリクローナル抗体試薬は、グリコシル化宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）も認識することが認められた。結果として、標的の純度およびＨＣＰレベルは不正確であり、製剤化ワクチン製品におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｐｒｅＳタンパク質の濃度は計画よりも有意に低いものであった。表１は投薬レジメンを示し、表２は以下の通りに再度算出した場合の実際の用量を示す。

【0177】

【表3】

【0178】

【表4】

【0179】

新たな定量アッセイに基づいた投薬調整のため、実際の用量は０日目および２１日目の注射において異なっていた。一貫性のため、本文および図面には標的用量のみを示す。

【0180】

血液を－４日目、２１日目、および３６日目に動物から採取した。Ｓ特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａレベルを、Ｓ１およびＳ２領域を含有するスパイクＥＣＤ（Ｓ ｄＴＭ；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）でプレートをコーティングしたＥＬＩＳＡによって測定した。力価は０．２よりも大きいＯＤ値をもたらす最終希釈倍率の逆数として報告した。ＯＤ＝０．２という値は、アッセイバックグラウンドの少なくとも２倍であることを表す。初めに、血清抗体の生ウイルスを中和する能力を、ＢＳＬ３におけるプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＵＳＡ／ＷＡ１／２０２０株のウイルスを使用して評価した。簡潔に述べると、血清サンプルを５６℃で３０分間熱失活させ、希釈剤（ＤＭＥＭ／２％ＦＢＳ）に希釈した。希釈した血清サンプルを、１ウェル当たり３０ＰＦＵを含有するように希釈した等容量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。コンフルエントのＶｅｒｏ Ｅ６細胞のプレートに血清－ウイルス混合物を播種し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートに０．５％メチルセルロース培地１ｍＬを重層し、３７℃／５％ＣＯ_２で３日間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、氷冷メタノールで固定し、０．２％クリスタルバイオレットで染色した。次いで、プレートを洗浄し、乾燥し、中和抗体価を、試験においてウイルスプラークの数を５０％またはそれ以上減少した最も高い血清希釈倍率として決定した。

【0181】

ｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンによって誘発された機能的抗体応答を、偽ウイルス中和アッセイを使用して評価した。血清サンプルを希釈し、５６℃で３０分間熱失活させた。希釈した血清サンプルを、１ウェル当たり３００個の感染性粒子を含有するように希釈したある容量のレポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）－ＧＦＰ（Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。５０％コンフルエントの２９３Ｔ－ｈｓＡＣＥ２クローナル細胞の９６ウェルプレートに血清＋ウイルス混合物を播種し、３７℃で７２時間インキュベートした。プレートをハイコンテントイメージング装置において走査し、個々のＧＦＰ発現細胞を計数した。中和抗体価を、試験においてウイルスプラークの数を５０％減少した希釈倍率の逆数として報告した。

【0182】

アジュバントを含有しない場合、１または２回投与後の非常に低いかまたは存在しないＩｇＧおよび中和抗体応答によって実証されたように、ｐｒｅＳ ｄＴＭおよびＳ ｄＴＭは免疫原性ではなかった。血清Ｓ特異的ＩｇＧレベルは２つの抗原間で類似しており、２１日目～３６日目に統計的に有意な力価変化は存在しなかった（図４）。対照的に、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンは、試験を行った全ての用量にわたって、１回投与（２１日目）後に高いＩｇＧ応答を誘発した（平均は、異なるワクチン用量群において４．１～４．６Ｌｏｇ_１０ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）の範囲であった）。応答は、２回目の注射（３６日目）によってさらに増大し、ＩｇＧ平均はワクチン用量次第では５．１～５．５Ｌｏｇ_１０ＥＵに達した。アジュバント効果（増加倍率およびＰ値）とブースター効果の両方が実証された。ＩｇＧ応答に関して中程度の用量効果が１回投与後（１．５倍、ｐ値＜０．０５）および２回投与後に観察された。したがって、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントは、２１日目と３６日目の両方において、ｐｒｅＳ ｄＴＭを用いた免疫化によって誘導された動物におけるＳ特異的ＩｇＧ価を有意に増加させ、３６日目は２１日目よりも高い力価を示した（図５）。トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントを用いて得られた力価は、アジュバントを含有しない場合に得られたものよりも有意に高かった。要約すると、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバント含有ワクチン製剤の用量反応性効果はｐ＜０．０５で統計的に有意であった。しかしながら、非アジュバント製剤の用量反応効果は統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．７８６６）。手短に述べると、いかなる用量を使用したとしても、有意なαトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバント効果が示され、全ての投薬量は０．００１未満のｐ値を有した。

【0183】

ＩｇＧ応答と一致して、α－トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントワクチンは２回投与後に強固な中和抗体応答を誘発した。ＰＲＮＴ_５０力価は、最低用量群（０．１６７および０．５μｇ）の２匹のマウスを除く全てのマウスにおいて検出された。中和平均は、最低ワクチン用量群（０．１６７μｇ）における２．５Ｌｏｇ_１０から最高ワクチン用量群（４．５μｇ）における３．５Ｌｏｇ_１０の範囲であった。

【0184】

ＰＲＮＴ５０アッセイと一致して、偽ウイルス中和力価は、０．５ｕｇ群の１匹を除く全てのαトコフェロール含有スクアレンエマルションＡＳ０３アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭ免疫化マウスにおいて検出された。平均中和価は、２．６Ｌｏｇ_１０から最高ワクチン用量群（４．５ｕｇ）における３．６Ｌｏｇ_１０の範囲であった。したがって、アジュバント製剤を用いて免疫化した動物は、３６日目までに有意に高い量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を用量依存的に生成した（図６Ａおよび６Ｂ）。

【0185】

実施例５
補助マウス研究
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組換えタンパク質ワクチン製剤のマウスにおける第２の研究を記載する。この研究は、免疫化マウスにおける細胞性免疫（ＣＭＩ）を評価することに焦点を当てた。ここで使用したマウスは６～８週齢の近交系雌ＢＡＬＢ／ｃマウスであった。これらにワクチン製剤５０μＬを０日目および１４日目に筋肉内注射した。１群当たりマウス５匹として、投薬レジメンを以下に示す。注射したｐｒｅＳ ｄＴＭは、トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントの有無にかかわらず、４．５μｇを標的とした。一貫性のため、本文および図面には標的用量のみを示す。

【0186】

【表5】

【0187】

血液を０日目、１４日目、および２４日目に動物から採取した。脾臓を２４日目にＣＭＩ解析のために回収し、脾臓細胞を、１１アミノ酸の重複を有するＳ１＋Ｓ２ １５マーペプチドプール（ＪＰＴ）で刺激した。細胞の表現型をフローサイトメトリー手法によって決定し、サイトカイン産生を細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって評価した。評価したバイオマーカーパネルを以下に示す。

【0188】

【表6】

【0189】

細胞内染色（ＩＣＳ）を実施するために、脾臓をホモジナイズし、赤血球を溶血させ、細胞を３７℃および５％ＣＯ_２で１時間静置した。次いで、脾細胞を計数し、２×１０^６個の細胞をＧｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に３７℃および５％ＣＯ_２で６時間、４つの条件：ペプチド刺激なし（培地のみの対照）、陽性対照刺激、および２つの個々のスパイクペプチドプール（ＪＰＴ製品ＰＭ－ＷＣＰＶ－Ｓ－１）での刺激の下でインキュベートした。個々の各動物からの細胞を、陽性対照としてブレフェルジンＡ含有細胞活性化カクテル（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で刺激した。刺激後、細胞を洗浄し、Ｍｏｕｓｅ ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（商標）（クローン２．４Ｇ２）に４℃で１０分間再懸濁した。次いで、細胞を遠心沈降し、Ｆｃ ｂｌｏｃｋを除去し、細胞を、以下：ＣＤ４（ＲＭ４－５）ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（５３－６．７）ＡＦ７００（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）ＰＥ／Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１４（Ｓａ１４－２）ＰＥ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を染色緩衝液（ＦＢＳ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に含有する抗体カクテルを用いて４℃で３０分間、表面染色および生／死染色した。表面染色後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて４℃で３０分間固定および透過処理した。次いで、細胞を、１倍Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて洗浄し、続いて以下：ＣＤ３ｅ（１７Ａ２）ＢＵＶ３９５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２）ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＴＮＦ－α（ＭＰ６－ＸＴ２２）Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＬ－２（ＪＥＳ６－５Ｈ４）ＢＶ６０５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＬ－４（１１Ｂ１１）ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびＩＬ－５（ＴＲＦＫ５）ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を１倍Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液に含有するカクテルを用いて、遮光して４℃で３０分間、細胞内染色した。次いで、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。サンプルをＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にかけ、解析をＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．６．１）において行った。

【0190】

ＩＣＳ解析は、ＡＳ０３アジュバントワクチン免疫化マウスにおいて、Ｓ１ペプチドプールとＳ２ペプチドプールの両方での脾細胞刺激後のＳ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞が存在しないかまたは少ないことを示した。アジュバント単独免疫化マウスにおいて検出された非特異的シグナルの範囲である０．０５％未満という、類似したＣＤ４^＋Ｔ細胞応答がＳ１およびＳ２ペプチドプールにおいて観察されたため；Ｓ１刺激の結果のみを示す。Ｓ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答は検出されなかった。Ｓ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、αトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントワクチン免疫化マウスにおいて、ＴＮＦ－α分泌細胞（おおよそ０．１％）、および一部のＩＬ－５分泌細胞（おおよそ０．０５％）が主に検出された。組換え抗原に基づくワクチンに関して予期された通り、Ｓ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答は検出されなかった。サイトカインプロファイルは、Ｔｈ１／Ｔｈ２混合応答がトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンによって誘導されたことを示唆する。サイトカインプロファイルは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、Ｔｈ１／Ｔｈ２混合応答がＡＳ０３アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンによって誘導されたことを示唆する（図７）。

【0191】

実施例６
非ヒト霊長類研究
この実施例は、液性免疫およびＣＭＩを評価する非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における研究を記載する。ここで使用した動物は４～１２歳齢のアカゲザルであった。ＮＨＰに、１５μｇの標的用量のα－トコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントと混合したｐｒｅＳ ｄＴＭを０．５ｍＬの容量で０日目および２１日目に筋肉内注射した。血清を４日目、２１日目、２８日目、および３５日目に採取した。一貫性のため、本文および図面には標的用量のみを示す。

【0192】

【表7】

【0193】

Ｓ特異的ＩｇＧレベルを、ＧＣＮ４融合前形態のスパイクタンパク質（ＧｅｎｅＡｒｔ）でプレートをコーティングしたＥＬＩＳＡによって測定した。

【0194】

ｐｒｅＳ ｄＴＭを用いたマウスにおいて観察された抗体応答と一致して、アジュバントの非存在下では応答は検出されなかったかまたは非常に低い応答が検出された（図８）。しかしながら、ＡＳ０３アジュバントにおいて製剤化した場合、１５μｇ ｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンは全ての免疫化サルにおいて、早ければ投与１の２週間後に、融合前Ｓタンパク質に結合する高レベルのＩｇＧを誘発した（３．７Ｌｏｇ_１０ＥＵの平均価）。２回目の免疫化は２８日目におけるＩｇＧ価を強力に増加させた（５．１Ｌｏｇ_１０ＥＵの平均価）。

【0195】

ｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンによって誘発された機能的抗体応答を、偽ウイルス中和アッセイを使用して評価した。血清サンプルを希釈し、５６℃で３０分間熱失活させた。希釈した血清サンプルを、１ウェル当たり３００個の感染性粒子を含有するように希釈したある容量のレポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）－ＧＦＰ（Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。５０％コンフルエントの２９３Ｔ－ｈｓＡＣＥ２クローナル細胞の９６ウェルプレートに血清＋ウイルス混合物を播種し、３７℃で７２時間インキュベートした。プレートをハイコンテントイメージング装置において走査し、個々のＧＦＰ発現細胞を計数した。中和抗体価を、試験においてウイルスプラークの数を５０％減少した希釈倍率の逆数として報告した。

【0196】

投与１の３週間後では、偽ウイルス中和価はいずれの群においても検出されなかった。しかしながら、２回目の注射後では、偽ウイルス中和力価は、αトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントによるアジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭを用いて免疫化したマカクにおいて、１匹を除いて検出された（２．１Ｌｏｇ_１０ＩＣ_５０の平均価）。免疫化アカゲザルの中和力価は、ヒト回復期（Ｃｏｎｖ．）血清のパネルにおいて観察された力価と同等であった（図９）。マイクロ中和（ＭＮ）アッセイのデータもまた、ＡＳ０３が野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する中和性抗体価を有意に増加させたことを示す（図１０）。

【0197】

実施例７．１
ハムスター研究１
これまでの研究は、ハムスターが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でチャレンジした後、嗜眠、被毛の乱れ、呼吸促迫、著しい体重の減少（体重の最大２０％）、および２日目～１４日目の、ヒトにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２肺炎に典型的な、肺におけるびまん性肺胞傷害を含む臨床徴候を一貫して発症することを示している。したがって、ハムスターはＣＯＶＩＤワクチンを研究するのに好適な動物モデルである。この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組換えタンパク質ワクチン製剤の免疫原性およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジ後の効能を評価するハムスターにおける研究を記載する。ワクチン製剤はｐｒｅＳ ｄＴＭとＡＳ０３アジュバントとを含有した。この研究では、ワクチンの１回投与と２回投与との特異的抗体応答および効能、ならびに液性応答に対するアジュバント効果を検討した。

【0198】

ここで使用した動物は６～８週齢のゴールデンシリアンハムスターであった。これらにワクチン製剤７５μＬ（抗原溶液３７．５μＬおよびＡＳ０３ ３７．５μＬ）を１回投与および２回投与コホートにおいて、０日目（２回投与コホート）および２１日目（１および２回投与コホート）に筋肉内注射した。投薬量を以下に示す。

【0199】

【表8】

【0200】

血液を１回目の注射の前（ベースライン）および３５日目に動物から採取した。

【0201】

Ｓ特異的ＩｇＧレベルを、融合前スパイク抗原（ＧＣＮ４安定化）（ＧｅｎｅＡｒｔ）でプレートをコーティングしたＥＬＩＳＡによって測定した。力価は、０．２に等しいＯＤ値をもたらす希釈倍率の逆数として報告した（図１１）。ＯＤ＝０．２という値は、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）で表される希釈倍率の逆数である。

【0202】

非アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭを用いて免疫化した１匹のハムスターを除き、全てのワクチン接種ハムスターは１回の免疫化後にＳ特異的ＩｇＧ応答を示した。ＡＳ０３アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭワクチン（２．２５μｇの標的用量）は、２．２５μｇの標的用量の非アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンと比較して高いＳ特異的ＩｇＧ価を、１回の注射後（平均で３．８Ｌｏｇ_１０ＥＵ対３．３Ｌｏｇ_１０ＥＵ）または２回の注射後（平均で５．２Ｌｏｇ_１０ＥＵ対４．８Ｌｏｇ_１０ＥＵ）に誘導した。非アジュバントおよびＡＳ０３アジュバントワクチンにおいて、２回投与ワクチンレジメンと１回投与ワクチンレジメンとの間で有意差が観察され、Ｓ特異的ＩｇＧ価はそれぞれ３２および２５倍増加した（ｐ値＜０．００１）。

【0203】

ＡＳ０３含有および非含有ｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンによって誘発された機能的抗体応答を、偽ウイルス中和アッセイを使用して評価した（１回投与コホートと２回投与コホートの両方）。偽ウイルス中和アッセイを以下の通りに実施した：血清サンプルを希釈し、５６℃で３０分間熱失活させた。さらに２倍段階希釈した熱失活させた血清サンプルを、１ウェル当たり３００個の感染性粒子を含有するように希釈したある容量のレポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）－ＧＦＰ（Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）と混合し、次いで３７℃で１時間インキュベートした。５０％コンフルエントの２９３Ｔ－ｈｓＡＣＥ２クローナル細胞の９６ウェルプレートに血清＋ウイルス混合物を播種し、３７℃で７２時間インキュベートした。プレートをハイコンテントイメージング装置において走査し、個々のＧＦＰ発現細胞を計数した。偽ウイルス中和抗体価を、試験においてウイルスプラークの数を５０％減少した希釈倍率の逆数として報告した（ＩＤ_５０、ここでＩＤ_５０＝ＩＣ_５０）。

【0204】

偽ウイルス中和抗体応答は、非常に低い力価であったＡＳ０３アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭ群の１匹のハムスターを除き、１回の注射後（１回投与コホート）では測定されなかった（図１２）。非アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭおよびＡＳ０３アジュバントワクチンは、２回の注射後（２回投与コホート）では有意な偽ウイルス中和抗体応答を誘発し、それぞれ２．４Ｌｏｇ_１０および３．１Ｌｏｇ_１０の平均価であった。偽ウイルス中和抗体価は、ＡＳ０３アジュバントワクチンを用いて免疫化した全てのハムスターにおいて検出されたが、非アジュバントワクチン群では、力価はより不均一であり、７／８匹のハムスターにおいて検出された。ＡＳ０３の中程度だが有意なアジュバント効果が観察された（４．６倍の増加；ｐ＝０．０１４）。

【0205】

ワクチン効能を評価するために、ハムスターを２．３×１０^４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０株）で、１００μｌ鼻腔内投与を介してチャレンジした。臨床徴候（体重減少、全身の外観、呼吸数）をチャレンジ後に毎日モニタリングした。剖検時（チャレンジ後４日目（ｎ＝４）またはチャレンジ後７日目（ｎ＝７）のいずれか）に、鼻孔および肺を、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用するウイルス量評価のために採取し、肺病態解析を実施した。体重減少を、１回投与コホートではチャレンジの３日後まで、２回投与コホートではチャレンジの４日後までモニタリングした。対照群は、チャレンジの４日後に約３～４％の予期せぬわずかな体重減少を示した（図１３）。少ない体重減少は、動物のチャレンジのために使用した低病原性ウイルス感染ストックによって説明することができる。体重の減少における変化量が小さいために、対照、非アジュバント、またはＡＳ０３アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭワクチン群の間におけるチャレンジ後の体重減少の差は、免疫化の回数にかかわらず観察することができなかった。

【0206】

鼻孔および肺におけるウイルス量の内容を、２回投与コホートにおいてのみ、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２総ＲＮＡまたはサブゲノム（ｓｇ）ＲＮＡを測定するｑＲＴ－ＰＣＲを使用してチャレンジの４または７日後に評価した。注目すべきことに、ｓｇＲＮＡは活発なウイルス複製に特異的であり、総ウイルスＲＮＡはウイルス投与量と活発な複製の両方を説明する。

【0207】

限定的な体重減少にもかかわらず、対照群は４日目に肺および鼻孔において高いｓｇＲＮＡ力価を呈し（それぞれ９．０および７．６Ｌｏｇ_１０コピー／グラムの平均力価）、これは７日目においても４匹中３匹のハムスターにおいて依然として検出された（それぞれ５．４および４．５Ｌｏｇ_１０コピー／グラムの平均力価）（図１５）。対照群と比較した場合、肺におけるウイルス量（図１４）およびウイルス複製（図１５）の強力な低下が、両方のワクチン群（非アジュバントおよびＡＳ０３アジュバント）において、チャレンジ後４日目および７日目に観察された。４日目では、ウイルス複製は、非アジュバントワクチン群の４匹中２匹の動物においてのみ検出され、ＡＳ０３アジュバントワクチンハムスターにおいては検出されず、肺においてＡＳ０３アジュバントワクチンによる完全な防御を示した。ワクチン群の肺におけるウイルス複製の低下は、チャレンジの７日後では陽性動物がいなかったためにより一層明白となったが、対照群は依然として５．４Ｌｏｇ_１０ｓｇＲＮＡコピー／グラムの平均力価を呈した。鼻孔では、ワクチン群において、対照群と比較してある程度のウイルス量およびウイルス複製の低下がチャレンジ後４日目および７日目に観察された。４日目では、ｓｇＲＮＡ平均力価は、ワクチン群の方が約２Ｌｏｇ_１０低く、７日目では、全てのワクチン接種動物が陰性であり、急速なウイルス排除を示した。これらのデータは、非アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭおよびＡＳ０３アジュバントワクチンを用いた免疫化の、肺および鼻孔におけるウイルス複製に対する明確な防御効果を示唆し、全てのワクチン群において測定された中和抗体応答と矛盾しなかった。

【0208】

肺病態を、１および２回投与コホートの１群当たり４匹のハムスターについて、チャレンジ後４日目または７日目に解析した。この解析により、全てのワクチン製剤において７日目に肺病変の明確な縮小が存在し、これが２．２５μｇ／ＡＳ０３用量においてより一層明白であること、および肺実質においてウイルスタンパク質発現の強力な低下が存在したことが認められた。表７は組織病理学のために使用した基準を示す。

【0209】

対照群は、チャレンジ後４日目および７日目に採取した全てのハムスターの肺において、肺の５０％超が重度の病変を有することを表す、３という高い病態スコアを呈した。（図１６Ａ）。１回投与コホートにおいては、１回免疫化した非アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭ群は、チャレンジ後４日目に１～３の異なる病態スコアを呈し、チャレンジ後７日目では全てのハムスターが３であった。しかしながら、１回免疫化したＡＳ０３アジュバント群では、全ての病態スコアが４日目に２に低下し、７日目ではばらつきがあり（１～３の間）、非アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭ群および対照群と比較して肺病態がより小さいことを示した。２回投与コホートにおいては、対照群と比較して小さい肺病態が、非アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭおよびＡＳ０３アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭ群において、とりわけ７日目に観察された（４日目のスコアは両方の群において１～３の範囲であり、７日目のスコアは、非アジュバント群では１～２、ＡＳ０３アジュバント群では０～１の範囲であった）。ＡＳ０３アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭ群における４日目から７日目の病態スコアの減少は、肺病態の急速な回復を示す。

【0210】

【表9】

【0211】

実施例７．２
ハムスター研究２
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組換えタンパク質ワクチン製剤の免疫原性および効能を評価するハムスターにおける別の研究を記載する。この研究において使用したワクチン製剤は、一価（本来のＤ６１４ ｐｒｅＳ ｄＴＭ（配列番号１０）またはＢ．１．３５１ ｐｒｅＳ ｄＴＭ変異株（配列番号１３）を含有する）または二価（本来のＤ６１４ ｐｒｅＳ ｄＴＭとＢ．１．３５１ ｐｒｅＳ ｄＴＭ変異株とを含有する）のいずれかであり、どちらもＡＳ０３アジュバントと共に製剤化した。２種類の懸念される変異株、すなわちアルファ（Ｂ．１．１．７）およびベータ（Ｂ．１．３５１）に対するワクチンの効能をハムスターにおいて免疫化の３週間後に評価した。

【0212】

この研究では、８匹の６～８週齢の雌シリアンゴールデンハムスターからなる群を、組換えタンパク質構成成分１つ当たり１μｇの用量の３種類のワクチン製剤を用いて、０日目および２１日目にＩＭで免疫化した。血液サンプルを、免疫化前、２１日目、３５日目、およびチャレンジ前に採取して、スパイク結合ＩｇＧおよび中和抗体応答を解析した（表７．１）。２回目の投与の４週間後、全てのハムスターに３種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株（Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．３５１（ベータ）、またはＢ．１．１．７（アルファ））を、１００％の動物を感染させ、チャレンジ後の最初の７日の間に１０％～２０％の間の体重減少を誘導することが以前に決定された用量においてＩＭで接種した。

【0213】

【表10】

【0214】

臨床徴候（体重減少、全身の外観、および呼吸数）をチャレンジ後７日間にわたり毎日モニタリングした。１群当たり４匹の動物をチャレンジ後４日目、残りの４匹をチャレンジ後７日目に屠殺して、肺および鼻甲介（または鼻孔）を採取した。ウイルスゲノムＲＮＡおよびサブゲノムウイルスＲＮＡをｑＲＴ－ＰＣＲによって定量した。肺の組織病理学をチャレンジ後４日目および７日目に評価した。

【0215】

体重を免疫化およびナイーブハムスターにおいて、ベータ（Ｂ．１．３５１）変異株ウイルスでのチャレンジ後に毎日測定した。各ハムスターについて、０日目と比較した体重の変化をチャレンジ後７日目（最終剖検時）まで毎日算出した。体重変化パーセントを図１６Ｂに示す。結果は、ナイーブハムスターにおいて明白な体重減少を示し、増殖性感染および病態を示したが、免疫化ハムスターはベータ変異株でのチャレンジ後にいかなる体重減少も経験しなかった。これらのデータは、試験を行った３種類のワクチン製剤、すなわちＣｏＶ２ ｐｒｅＳ ｄＴＭ－ＡＳ０３（Ｄ６１４）、（Ｂ．１．３５１）、および（Ｄ６１４＋Ｂ．１．３５１）が、ハムスターモデルにおいて、ベータ変異株によって誘導された感染症および関連する病態に対する強力な防御を付与したことを示す。

【0216】

実施例８
臨床研究
この実施例は、本開示のワクチン組成物の安全性および効能を評価するための第Ｉ／ＩＩ相臨床プロトコルを記載する。参加者、転帰評価者、治験責任医師、検査技師、および治験依頼者の大部分の研究スタッフ（ＥＳＤＲおよび関心を持たれた参加者に関与する者のみ除く）はワクチン群割付け群に対して盲検化され（製剤およびアジュバント；注射スケジュールは非盲検化される。研究介入を準備／管理する者はワクチン群割付けに対して非盲検化される。参加者は無作為化され、年齢によって層別化される。

【0217】

組成物は、アジュバントを含有するかまたは含有しないｐｒｅＳ ｄＴＭ（シグナルペプチドを有しない配列番号１０のポリペプチドの三量体）を含む。ワクチン組成物は２つの有効性成分含量：それぞれ５μｇ（低用量）または１５μｇ（高用量）のｐｒｅＳ ｄＴＭ抗原を含有する製剤１および２で提供される。抗原組成物を以下に示す：

【0218】

【表11】

【0219】

アジュバントの効果を評価するために、水中油型エマルションであるＡＳ０３を使用する。アジュバント研究群の単位活性成分含量はｐｒｅＳ ｄＴＭ ５μｇおよび１５μｇである。スクアレンベースαトコフェロール含有スクアレンエマルションアジュバントの各単回用量バイアルは以下に示す成分を含有する。このエマルションは、スクアレンおよびＤ，Ｌ－α－トコフェロールを含有する油相と；改変ＰＢＳおよびポリソルベート８０を含有する水相とを有する。以下に示す成分の量はＡＳ０３バルクエマルション２５０μＬ（すなわち、ＡＳ０３_Ａ）に対応する。

【0220】

【表12】

【0221】

抗原組成物とアジュバント組成物とを使用前に混合し、０．５ｍＬの総容量にする。プラセボは１用量当たり０．５ｍＬの０．９％生理食塩水である。

【0222】

投与経路は、上腕の三角筋への筋肉内注射である。

【0223】

各研究介入は、個々の箱において提供する（抗原およびアジュバント、または抗原および希釈剤（ＰＢＳ）を２バイアル箱に入れて１つのキットにする）。

【0224】

参加者は、１８歳以上の健康な個人であり、複数の年齢群に無作為化される。１８～４９歳の参加者から構成される小規模センチネルコホート（コホート１）は単回用量を投与される。コホート１における０９日目までの安全性データおよび臨床検査値が非盲検データ審査に基づいて許容されるとみなされる場合、コホート１の残っている参加者およびコホート２の全ての参加者を登録する。全ての参加者は、０１日目に、治験ワクチン製剤またはプラセボ対照のいずれか一方の１回の注射を受ける（ワクチン接種［ＶＡＣ］１）。コホート２の参加者は、２２日目に、研究ワクチン製剤またはプラセボの２回目の注射を受ける（ＶＡＣ２）。各参加者の研究への参加期間は、最後の注射からおよそ３６５日である。

【0225】

ＣＯＶＩＤ－１９様疾病は、能動的および受動的サーベイランスによる効能目的の一部である。この研究のために選択したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２候補抗原の設計は、結合抗体を超える強力な中和抗体の生成を促進すると予想される。アジュバント製剤を含めることは、中和抗体応答の規模をさらに増強し、バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ－２ヘルパーＴ細胞応答を誘導すると予想される。総合すると、これらの戦略は、ウイルス感染の免疫増強の理論上のリスクを設計によって軽減する。重度のＣＯＶＩＤ－１９のリスクの増大に関連すると考えられる慢性合併症を有する個人は除外する。

【0226】

本研究の主要目的は、０１日目、２２日目、および３６日目における中和抗体のレベルおよびプロファイルを記載することによってワクチン組成物の免疫原性を評価することである。中和抗体価は、中和アッセイを用いて測定する。２２日目および３６日目におけるワクチン接種後の血清抗体中和価は０１日目に対して約２～４倍増加すると予期される。中和抗体の抗体陽転の発生は、ベースライン時に定量下限（ＬＬＯＱ）未満の値、かつ２２日目および３６日目にアッセイＬＬＯＱを超える検出可能な中和価として定義される。

【0227】

本研究の副次的目的は、各研究介入群の０１日目、２２日目、３６日目、および１８１日目（コホート１）または２０２日目（コホート２）、および３６６日目（コホート１）または３８７日目（コホート２）における結合抗体プロファイルを記載すること、ならびに各研究介入群の１８１日目（コホート１）または２０２日目（コホート２）、および３６６日目（コホート１）または３８７日目（コホート２）における中和抗体プロファイルを記載することによってワクチン組成物の免疫原性を評価することである。全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する結合抗体価は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて研究介入群ごとに測定する。抗Ｓ抗体濃度の上昇倍率［後／前］は、２２日目、３６日目、１８１日目（コホート１）または２０２日目（コホート２）、および３６６日目（コホート１）または３８７日目（コホート２）において２もしくはそれ以上、または４もしくはそれ以上になると予期される。中和抗体価は、中和アッセイを用いて測定する。１８１日目（コホート１）または２０２日目（コホート２）、および３６６日目（コホート１）または３８７日目（コホート２）における、０１日目に対するワクチン接種後の血清中和価の上昇倍率は、２もしくはそれ以上、または４もしくはそれ以上になると予期される。中和抗体の抗体陽転の発生は、ベースライン時にＬＬＯＱ未満のベースライン値、かつ１８１日目（コホート１）または２０２日目（コホート２）、および３６６日目（コホート１）または３８７日目（コホート２）にアッセイ定量下限を超える検出可能な中和価として定義される。

【0228】

本研究の別の副次的な目的は、ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９様疾病および血清学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の発生を記載すること、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組換えタンパク質に対する抗体応答とＣＯＶＩＤ－１９様疾病および／または血清学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症のリスクとの間の相関性／関連性を評価することによって効能を評価することである。ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９様疾病は、規定の臨床症状および徴候によって定義され、核アッセイウイルス検出アッセイによって確認される。血清学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症は、非Ｓ ＥＬＩＳＡにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体の検出によって定義される。リスク／防御相関は、上で定義されたウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９様疾病および／または血清学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を考慮してウイルス中和またはＥＬＩＳＡを使用して評価されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体応答に基づく。

【0229】

本研究の探索的目的は、コホート２の各研究介入群の２２日目および３６日目における細胞免疫応答プロファイルを記載すること、ならびに中和抗体と結合抗体との比を記載することによって免疫原性を評価することである。全長Ｓタンパク質および／またはＳ抗原ペプチドのプールでの刺激後、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカインを全血および／または凍結保存ＰＢＭＣにおいて測定する。結合抗体（ＥＬＩＳＡ）濃度と中和抗体価との比を算出する。

【0230】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を、中和アッセイを使用して測定する。このアッセイでは、血清サンプルを一定濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスと混合する。血清サンプルに存在する抗体による中和に起因するウイルス感染力（ウイルス抗原産生）の低下はＥＬＩＳＡによって検出することができる。洗浄および固定後、細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原産生は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体、ＨＲＰ ＩｇＧコンジュゲート、および発色基質との連続インキュベーションによって検出することができる。得られた光学密度を、マイクロプレートリーダーを使用して測定する。ウイルス対照ウェルにおけるものと比較したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染力の低下は、血清サンプルにおける中和抗体の存在を示す陽性中和反応とみなされる。

【0231】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体血清ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗Ｓタンパク質ＩｇＧ抗体を、ＥＬＩＳＡを使用して測定する。マイクロタイタープレートを、最適濃度までコーティング緩衝液に希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２融合前形態のスパイクタンパク質抗原でコーティングする。ブロッキング緩衝液の全てのウェルへの添加、および定義された期間のインキュベーションによってプレートをブロッキングしてもよい。インキュベーション後、プレートを洗浄する。全ての対照、参照、およびサンプルを、希釈緩衝液を用いて予め希釈する。次いで、予め希釈した対照、参照、およびサンプルを、コーティングした試験プレートのウェルにおいてさらに段階希釈する。プレートを定義された期間インキュベートする。インキュベーション後、プレートを洗浄し、最適化された希釈倍率のヤギ抗ヒトＩｇＧ酵素コンジュゲートを全てのウェルに添加し、プレートをさらにインキュベートする。このインキュベーション後、プレートを洗浄し、酵素基質溶液を全てのウェルに添加する。プレートを定義された期間インキュベートして、基質を発色させる。基質の発色を、各ウェルへの停止溶液の添加によって停止する。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートリーダーを使用し、アッセイ特異的ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏテンプレートを使用して試験プレートを読み取る。プレートのブランクの平均光学密度（ＯＤ）値を各プレートにおける全てのＯＤから減算する。試行における各アッセイプレートに含まれるブランク、対照、および参照の標準曲線の測定値を使用してサンプル力価を導出する。

【0232】

細胞性の免疫（全血および／またはＰＢＭＣを使用）
全長Ｓタンパク質および／またはＳ抗原ペプチドのプールでの刺激後、サイトカインを全血および／または凍結保存ＰＢＭＣにおいて測定する。

【0233】

ＣＯＶＩＤ－１９様疾病
ＣＯＶＩＤ－１９様疾病は、（ｉ）以下のうちのいずれか１つ（少なくとも１２時間にわたって持続するか、もしくは１２時間以内に再発する）：咳（乾性もしくは湿性）；発熱；嗅覚脱失；味覚消失；嗅覚脱失；凍瘡（ＣＯＶＩＤ足指）；呼吸困難もしくは息切れ；臨床上もしくはＸ線検査上の肺炎の証拠；ならびに脳卒中、心筋炎、心筋梗塞、血栓塞栓性事象（例えば、肺塞栓症、深部静脈血栓症、および脳卒中）、および／もしくは電撃性紫斑病の臨床診断を伴う任意の入院；または（ｉｉ）以下のうちのいずれか２つ（少なくとも１２時間にわたって持続するか、もしくは１２時間以内に再発する）：咽頭炎；悪寒；筋肉痛；頭痛；鼻漏；腹痛；ならびに悪心、下痢、および嘔吐のうちの少なくとも１つとして定義される。

【0234】

ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９疾病
ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９疾病は、ＣＯＶＩＤ－１９様疾病との関連における、呼吸器サンプルに対する核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性結果として定義される。

【0235】

血清学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症
血清学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症は、血清における、ＥＬＩＳＡによって検出されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非スパイクタンパク質に特異的な抗体の存在の陽性結果として定義される。

【0236】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核タンパク質抗体血清ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗核タンパク質抗体を、ＥＬＩＳＡを使用して測定する。マイクロタイタープレートを、最適濃度までコーティング緩衝液に希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核タンパク質抗原でコーティングする。ブロッキング緩衝液の全てのウェルへの添加、および定義された期間のインキュベーションによってプレートをブロッキングしてもよい。インキュベーション後、プレートを洗浄する。全ての対照、参照、およびサンプルを、希釈緩衝液を用いて予め希釈する。次いで、予め希釈した対照、参照、およびサンプルを、コーティングした試験プレートのウェルにおいてさらに段階希釈する。プレートを定義された期間インキュベートする。インキュベーション後、プレートを洗浄し、最適化された希釈倍率のヤギ抗ヒトＩｇＧ酵素コンジュゲートを全てのウェルに添加し、プレートをさらにインキュベートする。このインキュベーション後、プレートを洗浄し、酵素基質溶液を全てのウェルに添加する。プレートを定義された期間インキュベートして、基質を発色させる。基質の発色を、各ウェルへの停止溶液の添加によって停止する。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートリーダーを使用し、アッセイ特異的ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏテンプレートを使用して試験プレートを読み取る。プレートのブランクの平均ＯＤ値を各プレートにおける全てのＯＤから減算する。試行における各アッセイプレートに含まれるブランク、対照、および参照の標準曲線の測定値を使用してサンプル力価を導出する。

【0237】

ＣＯＶＩＤ－１９症例検出のための核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）
アッセイにおいて、呼吸器サンプルを採取し、ＲＮＡを抽出する。次いで、精製された鋳型を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的を特異的に増幅するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的プライマーを使用するＮＡＡＴによって評価する。

【0238】

実施例９
１８歳以上の成人におけるＡＳ０３アジュバントを含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組換えタンパク質ワクチンの免疫原性および安全性
この実施例は、１８歳以上の成人において行った、筋肉内（ＩＭ）経路によって投与されたｐｒｅＳ ｄＴＭ／ＡＳ０３アジュバントワクチン（「ＣｏＶ２ ｐｒｅＳ ｄＴＭ－ＡＳ０３」とも称される）の２回注射の安全性、反応原性、および免疫原性を評価するための第ＩＩ相、無作為化、修正二重盲検、多施設、用量設定研究のプロトコルを記載する。この研究（ＶＡＴ００００２）では、固定用量のＡＳ０３アジュバント（ＡＳ０３_Ａ）を含有する３つの異なる抗原用量（ｐｒｅＳ ｄＴＭ ５μｇ、１０μｇ、および１５μｇの有効用量）を評価する。２１日空けて投与される用量を伴う２回注射スケジュールをこの研究において利用する。

【0239】

反応原性を、各ワクチン接種後７日間にわたる非自発的有害事象（ＡＥ）、および最後のワクチン接種後２１日間にわたる自発的ＡＥを収集することによって全ての参加者において評価する。全ての参加者は、研究期間にわたる重篤なＡＥ、診療を要したＡＥ（ＭＡＡＥ）、および特に注目すべき有害事象（ＡＥＳＩ）に関する情報を提供する。中和および結合抗体を、研究期間にわたって複数の時点で全ての参加者において評価する。細胞および粘膜応答を参加者のサブセットにおいて評価する。加えて、ＣＯＶＩＤ－１９の全てのエピソードを研究期間にわたって収集する。

【0240】

この第ＩＩ相研究の安全性、反応原性、および免疫原性中間データを使用して、第ＩＩＩ相に進むか否か、および第ＩＩＩ相に進める抗原用量製剤の選択を決定する。この中間解析は、全ての参加者における、注射２の最大２１日後の反応原性データ、および注射２の１４日後の中和抗体応答を入手した後に行われる。

【0241】

参加者を、これまでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に基づいて、血清学的（Ｒｏｃｈｅ抗ＮイムノアッセイおよびＲｏｃｈｅ抗Ｓイムノアッセイ）またはウイルス学的（核酸増幅検査［ＮＡＡＴ］）に決定したナイーブ（過去に感染していない）および非ナイーブ（過去の感染の証拠がある）に分類する。ナイーブの個人（これまでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の証拠がない）は、登録時点において血清サンプルの抗Ｎイムノアッセイおよび抗Ｓイムノアッセイで陰性であり、かつ呼吸器検体でＮＡＡＴ陰性であると定義され、非ナイーブの個人（これまでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の証拠がある）は、登録時点において血清サンプルの抗Ｎイムノアッセイまたは抗Ｓイムノアッセイで陽性であり、かつ呼吸器検体でＮＡＡＴ陽性であると定義される。

【0242】

目的および評価項目
主要安全性
各年齢群および各研究介入群における全ての参加者の安全性プロファイルを評価するために、以下のパラメータを検査する：
－ 各ワクチン接種から３０分以内に報告された自発的全身性ＡＥの存在；
－ 各ワクチン接種の７日後までに発生した非自発的（参加者の日誌カード［ＤＣ］および［電子］症例報告書［ＣＲＦ］に予め記載の）注射部位反応および全身反応の存在；
－ 最後のワクチン接種の２１日後までに報告された自発的ＡＥの存在；
－ 研究全体にわたる重篤な有害事象（ＳＡＥ）の存在；
－ 研究全体にわたるＡＥＳＩの存在；ならびに
－ 研究全体にわたるＭＡＡＥの存在。

【0243】

主要免疫原性
各研究介入群のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ナイーブ成人における、最後のワクチン接種の１４日後（３６日目）の中和抗体プロファイルを評価するために、Ｄ６１４Ｇ変異株に対する中和抗体価をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ナイーブ参加者において研究介入群ごとに測定し、これには以下を評価することが含まれる：
－ ０１日目および３６日目における個々の血清中和力価；
－ ３６日目における、０１日目に対するワクチン接種後の個々の血清中和価上昇倍率；
－ ３６日目における、０１日目に対する血清中和価の２倍の上昇および４倍の上昇［後／前］（上昇倍率≧２および≧４）；ならびに
－ 定量下限（ＬＬＯＱ）未満のベースライン値を有し、かつ３６日目にアッセイＬＬＯＱを超える定量可能な中和価を有する参加者として定義される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ナイーブにおける応答者。

【0244】

副次的免疫原性
本研究の副次的目的には、（１）各研究介入群におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ナイーブ成人の、２２日目、７８日目、１３４日目、２０２日目、２９２日目、および３８７日目における中和抗体プロファイル；（２）各研究介入群におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２非ナイーブ参加者の、０１日目、２２日目、３６日目、７８日目、１３４日目、２０２日目、２９２日目、および３８７日目における中和抗体プロファイル；ならびに（３）各研究介入群におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ナイーブおよび非ナイーブ参加者の、０１日目、２２日目、３６日目、７８日目、１３４日目、２０２日目、２９２日目、および３８７日目における結合抗体プロファイルを評価することが含まれる。

【0245】

副次的免疫原性目的（１）および（２）の評価項目は、各研究介入群の参加者におけるＤ６１４Ｇ変異株に対する中和抗体価であり、以下を評価することが含まれる：
－ 予め定義された各時点における個々の血清中和力価；
－ 予め定義された各時点における、０１日目に対するワクチン接種後の個々の血清中和価上昇倍率；
－ 予め定義されたワクチン接種後の各時点における血清中和価の２倍の上昇および４倍の上昇［後／前］（上昇倍率≧２および≧４）；ならびに
－ ＬＬＯＱ未満のベースライン値を有し、かつ予め定義されたワクチン接種後の各時点でアッセイＬＬＯＱを超える定量可能な中和価を有する参加者、およびＬＬＯＱを超えるベースライン値を有し、かつ予め定義されたワクチン接種後の各時点で中和抗体価が４倍増加した参加者として定義される応答者。

【0246】

副次的免疫原性目的（３）の評価項目は、各研究介入群の参加者におけるＤ６１４Ｇ変異株に対する結合抗体濃度であり、以下を評価することが含まれる：
－ 予め定義された各時点における個々の抗体濃度；
－ 予め定義されたワクチン接種後の各時点における、０１日目に対するワクチン接種後の個々の抗体上昇倍率；
－ 予め定義されたワクチン接種後の各時点における２倍の上昇および４倍の上昇（抗体濃度の上昇倍率［後／前］≧２および≧４）；ならびに
－ ＬＬＯＱ未満のベースライン値を有し、かつ予め定義されたワクチン接種後の時点でアッセイＬＬＯＱを超える定量可能な抗体濃度を有する参加者、およびＬＬＯＱを超えるベースライン値を有し、かつ予め定義されたワクチン接種後の各時点で結合抗体濃度が４倍増加した参加者として定義される応答者。

【0247】

副次的安全性
本研究の副次的目的には、（１）各研究介入群の全ての参加者における、検査により確認された症候性ＣＯＶＩＤ－１９の発生、および（２）各研究介入群における、血清学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の発生を記載することも含まれる。

【0248】

副次的安全性目的（１）の評価項目は：
－ 検査により確認された症候性ＣＯＶＩＤ－１９の発生（各施設で確認されたかまたはプロトコルにより定義されたＮＡＡＴに基づく）；
－ 入院を伴う症候性ＣＯＶＩＤ－１９エピソードの発生；
－ 重度の症候性ＣＯＶＩＤ－１９の発生；および
－ 症候性ＣＯＶＩＤ－１９に関連する死亡
である。

【0249】

副次的安全性目的（２）の評価項目は、血清学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の発生である。

【0250】

探索的免疫原性
本研究の探索的目的には、（１）中和抗体と結合抗体との比を記載すること；（２）参加者のサブセットの、０１日目、２２日目、および３６日目におけるＴ細胞サイトカインプロファイルを評価すること；（３）参加者のサブセットの、０１日目、２２日目、３６日目、１３４日目、および３８７日目における細胞免疫応答をさらに評価すること；（４）参加者のサブセットの、０１日目、２２日目、３６日目、および１３４日目における粘膜抗体応答を評価すること；ならびに（５）出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型株に対する中和抗体応答を記載することが含まれる。

【0251】

探索的免疫原性目的（１）の評価項目は、結合抗体（酵素連結免疫吸着アッセイ［ＥＬＩＳＡ］）濃度と中和抗体価との比である。

【0252】

探索的免疫原性目的（２）の評価項目は、０１日目、２２日目、および３６日目に全長Ｓタンパク質での刺激後の全血で測定されるＴｈ１およびＴｈ２サイトカインである。

【0253】

探索的免疫原性目的（３）の評価項目は、細胞内サイトカイン染色または／および酵素連結免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイによって実施することができる他の細胞性免疫（ＣＭＩ）評価である。

【0254】

探索的免疫原性目的（５）の評価項目は、研究介入群ごとの参加者において測定される出現した変異型株に対する中和抗体応答であり、以下を評価することが含まれる：
－ 予め定義された各時点における個々の血清中和力価；
－ 予め定義された各時点における、０１日目に対するワクチン接種後の個々の血清中和価上昇倍率；
－ 予め定義されたワクチン接種後の各時点における血清中和価の２倍の上昇および４倍の上昇［後／前］（上昇倍率≧２および≧４）；ならびに
－ ＬＬＯＱ未満のベースライン値を有し、かつ予め定義されたワクチン接種後の各時点でアッセイＬＬＯＱを超える定量可能な中和価を有する参加者、およびＬＬＯＱを超えるベースライン値を有し、かつ予め定義されたワクチン接種後の各時点で中和抗体価が４倍増加した参加者として定義される応答者。

【0255】

全体のデザイン
研究の全体のデザインを表１０に示す。

【0256】

【表13】

【0257】

合計で７２０名の参加者を登録することを計画する。年齢群（１８～５９歳および６０歳以上）、ベースラインＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２迅速血清診断検査陽性（陽性／陰性［登録時に決定］）、ならびに高リスクの医学的状態（あり／なし）による層別化後、参加者を研究群に無作為に割り付ける。

【0258】

全ての研究群について、参加者の半分は１８～５９歳とし、参加者の半分は６０歳以上とする。加えて、各研究群の最大２０％の参加者は、登録時の迅速血清診断検査において検査結果が陽性であり得る。年齢群によって層別化された１２０名の迅速診断検査陰性の参加者の無作為化サブセット（２０名／研究群／年齢群）は、細胞免疫応答および粘膜抗体評価のためのサンプルを提供する。

【0259】

介入群および継続期間
介入群および継続期間を以下の表１１に要約する。使用したｐｒｅＳ ｄＴＭ抗原の量を発明群ごとに示す。

【0260】

【表14】

【0261】

全ての参加者は、３週間空けて投与される２回のワクチン注射を受ける：１回目の注射は０１日目（ワクチン接種［ＶＡＣ］１）であり、２回目の注射は２２日目（ＶＡＣ２）である。血液サンプルを、各注射前、最後の注射の１４日、２か月、４か月、６か月、９か月、および１２か月後に全ての参加者から採取する。全ての参加者から採取した血液サンプルを本研究の血清学的評価のために使用する。全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、および唾液サンプルを参加者のサブセットから採取して、細胞免疫応答および粘膜抗体応答を評価する。

【0262】

研究中の任意の時点でＣＯＶＩＤ－１９様疾病の症状／状態を経験した場合に現場に連絡するように参加者が指示される受動的サーベイランスを通じてＣＯＶＩＤ－１９の発生を捕捉するために、全ての参加者を試験期間にわたり追跡する。加えて、４３日目の連絡から起算して２週間ごとに１回、ＣＯＶＩＤ－１９様疾病の発症について尋ねるために全ての参加者に連絡する能動的サーベイランスを全ての参加者に対して行う。

【0263】

各参加者の研究への参加期間は、注射２からおよそ３６５日（すなわち、合計でおよそ３８６日）である。

【0264】

解析対象集団
０１日目の時点または０１日目と２２日目の両方の時点においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ナイーブおよび非ナイーブの以下の亜群の定義を、全ての無作為化参加者に適用する：

【0265】

参加者解析対象集団は：
１．ベースライン時にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ナイーブ（ナイーブ－Ｄ０１）
－ ０１日目の血清サンプルに対する抗Ｓイムノアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ）で陰性、
－ ０１日目の血清サンプルに対する抗Ｎイムノアッセイで陰性、および
－ ０１日目に採取した呼吸器サンプルにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２についてＮＡＡＴ陰性。
２．ベースライン時にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２非ナイーブ（非ナイーブ－Ｄ０１）
－ ０１日目の血清サンプルに対する抗Ｓイムノアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ）で陽性、
－ ０１日目の血清サンプルに対する抗Ｎイムノアッセイで陽性、または
－ ０１日目に採取した呼吸器サンプルにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２についてＮＡＡＴ陽性。
３．２回目の注射時にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ナイーブ（ナイーブ－Ｄ０１＋Ｄ２２）
－ ０１日目の血清サンプルに対する抗Ｓイムノアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ）で陰性、
－ ０１日目および２２日目の血清サンプルに対する抗Ｎイムノアッセイで陰性、ならびに
－ ０１日目および２２日目に採取した呼吸器サンプルにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２についてＮＡＡＴ陰性。
４．２回目の注射時にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２非ナイーブ（非ナイーブ－Ｄ０１／Ｄ２２）
－ ０１日目の血清サンプルに対する抗Ｓイムノアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ）で陽性、
－ ０１日目もしくは２２日目の血清サンプルに対する抗Ｎイムノアッセイで陽性、または
－ ０１日目もしくは２２日目に採取した呼吸器サンプルにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２についてＮＡＡＴ陽性。

【0266】

定義された集団としては以下が挙げられる：
１．最大の解析対象集団（ＦＡＳ）：少なくとも１回の研究注射を受ける全ての無作為化参加者；参加者は、無作為化された介入に応じて解析される。
２．プロトコル適合解析対象集団（ＰＰＡＳ）：ＦＡＳのサブセット；以下の基準のうちの少なくとも１つを示す参加者はＰＰＡＳから除外される：
－ 参加者がプロトコルに明記された選択基準の全てを満たすことがなかったか、またはプロトコルに明記された除外基準のうちの少なくとも１つを満たした、
－ 参加者が２回の注射を受けなかった、
－ 参加者が無作為化されて受けるもの以外のワクチンを受けた、
－ ワクチンの調製および／または投与がプロトコルに従って行われなかった、
－ 参加者が適切な時間枠内でワクチンを受けなかった、
－ ０１日目または３６日目の血液サンプルを採取しなかった参加者、
－ 参加者が、決定的な禁忌基準のいずれかを満たすにもかかわらず、２回目の注射を受けた、ならびに
－ 参加者が認可／承認されたＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを３６日目の前に受ける。

【0267】

実施例１０
第ＩＩ相データ
上記実施例に記載されているプロトコルに従って実施した第ＩＩ相臨床研究のデータは、ＣｏＶ２ ｐｒｅＳ ｄＴＭ ＡＳ０３が７２０名のボランティアの全ての成人年齢群にわたって強力な免疫応答を成功裏に実証することを示す。

【0268】

本研究では、ＣｏＶ２ ｐｒｅＳ ｄＴＭをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）水溶液において提供した。各用量の抗原（５、１０、または１５μｇ）を０．２５ｍＬの溶液において提供し、ＡＳ０３ ０．２５ｍＬとベッドサイドで混合した。混合後の各ワクチン接種用量は表１２に示す組成を有した。抗原溶液およびアジュバントは２バイアル箱中の別個のバイアルで提供した。バイアルは２～８℃で保存した。

【0269】

【表15】

【0270】

安全性データは、３つの処置群（５、１０、または１５μｇ抗原＋ＡＳ０３）について類似した安全性プロファイルを実証する。本研究では、２つの即時型の関連反応が存在したが；特に注目すべき有害事象（ＡＥＳＩ）、重篤な有害事象（ＳＡＥ）、および研究の中止に至る有害事象（ＡＥ）は、本研究において存在しなかった。グレード３の自発的な関連反応および関連する診療を要した有害事象（ＭＡＡＥ）の数は限定的であった。反応原性は全ての処置群において類似した（図１７）。１８～５９歳群では６０歳以上群と比較して高い頻度および強度の非自発的反応が存在した（図１８）。また、非自発的反応の頻度および強度は注射２の後に増加した（図１９）。

【0271】

免疫原性データは、若年者と老年者の両方において高い抗体陽転率および応答率を示す。プロトコル適合解析対象集団（ＰＰＡＳ）－ナイーブＤ１＋Ｄ２２における投与２の後（３６日目）の応答は、若年者および老年者において９５％を超える抗体陽転率および応答率を示し、３つの処置群間で差を示さなかった（表１３；ＣＩ＝信頼区間）。

【0272】

【表16】

【0273】

ＰＰＡＳ－ナイーブＤ１＋Ｄ２２のＭｏｎｏｇｒａｍ ＰｓＶＮアッセイにおける投与２の後の中和抗体価によって示される全ての処置群の抗体応答データを以下の表１４に示す（「ＧＭＴ」：幾何平均価）。探索的解析において、ヒト回復期血清サンプルのパネルにおける中和抗体価を測定した。回復期サンプルは７９名のドナーから、ＣＯＶＩＤ－１９のＰＣＲ陽性診断の１７～４７日後の間に得た。ドナーは、サンプル採取時点では回復しており（臨床重症度は軽度～重度の範囲であった）、無症候性であった。

【0274】

データは、低用量群において、参加者が回復期血清で観察されたものと類似した中和抗体価に達したことを示す。１８～５９歳の年齢群において、ＧＭＴは回復期血清群のほぼ２倍であった。

【0275】

【表17】

【0276】

上記データは、ナイーブ参加者において、抗体陽転率が若年者と老年者の両方で９５％超であったこと、および処置群間で差が観察されなかったことを示す。抗体価の規模は、６０歳以上と比較して１８～５９歳でより高かった。規模の増大は、６０歳以上群の処置群においても、１８歳以上の処置群においても観察されなかった。増大は、１８～５９歳群において、より高い抗原用量と共に観察された。

【0277】

ＣｏＶ２ ｐｒｅＳ ｄＴＭ ＡＳ０３組成物を非ナイーブ参加者においても評価した。表１５のデータは、低用量群の参加者が１回のみの注射後に中和抗体の著しい増加（Ｍｏｎｏｇｒａｍ ＰｓＶＮアッセイにおいて測定）を有したことを、２２日目における３５，２７５のＧＭＴにおいて示す。このＧＭＴは表１４に示す回復期血清群の１５倍超である。

【0278】

【表18】

【0279】

非ナイーブ参加者のデータは、抗体価の規模が単回注射後の１８～５９歳と６０歳以上の年齢群の両方で５，０００以上であったことを示す。処置群間で差は観察されなかった。

【0280】

これらの結果は、ＣｏＶ２ ｐｒｅＳ ｄＴＭ ＡＳ０３が、６０歳以上の者およびこれまでに感染した者を含む全ての成人年齢群において高い中和抗体応答を惹起したことを示す。免疫原性組成物は、安全性に対する懸念を示さず、３つ全ての試験用量レベルにおいて、安全性プロファイルについて良好な忍容性を示した。第ＩＩ相研究は、全ての年齢群および全ての用量において２回目の注射後に９５％～１００％の抗体陽転率を示した。過去のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の証拠がある参加者では、有意に高い抗体応答が単回ワクチン用量後に生じ、ブースターワクチンとしての開発について強力な可能性を示唆した。

【0281】

ブースターワクチンの必要性だけでなく、多数のワクチンが、とりわけ変異株が出現し続ける場合には必要とされることは十分に認識されているため、第２相データからは、ＣｏＶ２ ｐｒｅＳ ｄＴＭ ＡＳ０３免疫原性組成物の、世界規模の公衆衛生危機に対処する役割を果たす可能性が確認される。これらの良好な第２相の結果に基づいて、１０μｇ用量レベルが、３５，０００名を超える参加者の世界規模の第３相研究においてさらに評価されるだろう。

【0282】

実施例１１
非ヒト霊長類における変異株一価（Ｂ．１．３５１）および二価（Ｄ６１４＋Ｂ．１．３５１）ワクチンの免疫原性
免疫原性研究（ＣｏＶ２－０６＿ＮＨＰ）をナイーブ非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において実施して、変異株一価ワクチン（Ｂ．１．３５１）の免疫原性、および二価製剤においてＤ６１４ ｐｒｅＳ ｄＴＭ抗原と組み合わせた場合（Ｄ６１４＋Ｂ．１．３５１）の潜在的な負の干渉をＡＳ０３の存在下で評価した。抗体応答のピーク時（３４日目）に、２種類のウイルス（Ｄ６１４およびベータ）、ならびに他の懸念される変異株（ＶｏＣ）、すなわち、アルファ、ガンマ、およびデルタに対する中和抗体価を測定した。Ｄ６１４株に対する中和価（ＮｅｘｅｌｉｓのＶＳＶ－偽ウイルス定量アッセイにおいて得られる）を一価製剤と二価製剤との間で比較して、二価製剤における各構成成分の、他の構成成分の免疫原性に対する影響を評価した。

【0283】

研究デザイン
５４匹の２～８歳齢の成体モーリシャス産カニクイザル（雄および雌）を年齢、体重、および性別に関して無作為化した。６匹のマカクからなる９つの群を、ＡＳ０３の存在下で構成成分１つ当たり２．５、５、および１０μｇの用量の３種類のワクチン製剤（Ｄ６１４、Ｂ．１．３５１、および二価）を用いて免疫化した（表１６）。３週間空けた２回の注射を、いずれの投与も同じ側の三角筋にＩＭ経路によって０．５ｍＬ用量未満で投与した。

【0284】

【表19】

【0285】

動物を研究全体にわたって有害事象の任意の臨床徴候についてモニタリングした。血液サンプルを、研究前、ならびに２日目、２１日目、２３日目、および３４日目に血液細胞数および化学パラメータのために採取した。血液サンプルを、２１日目および３４日目に抗体滴定のために採取した。ＧＣＮ４－スパイクタンパク質に対する結合ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡにおいて測定し、Ｄ６１４、Ｄ６１４Ｇ、アルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタ変異株に対する中和性抗体を、ＰｓＶ中和化アッセイ（ＳＰ ＲＥＩ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）を使用して３４日目に測定した。並行して、サンプルを定量Ｄ６１４ ＰｓＶ中和アッセイ（Ｎｅｘｅｌｉｓ）において滴定して、Ｄ６１４価に対する干渉を定量化した。使用した２種類の中和アッセイの特徴を以下の表１７に示す。

【0286】

【表20】

【0287】

結果
研究中に臨床徴候は観察されず、血液学および臨床化学パラメータならびに体温はいかなる安全性に関するシグナルも示さなかった。１回目の注射の３週間後（２１日目）、２．５μｇ Ｂ．１．３５１一価ワクチン群の１匹のマカクを除き、全てのマカクはＥＬＩＳＡによって測定されたＳ結合抗体を増大した。平均ＥＬＩＳＡ価は３．５～４．１Ｌｏｇ_１０ＥＵの範囲であった（データは示していない）。２回目の注射の２週間後（３４日目）、Ｓ結合抗体価は全ての群において２１日目と比較して増加し、４．９～５．４Ｌｏｇ_１０ＥＵの範囲であった。ＥＬＩＳＡ価について、用量間およびワクチン製剤間で統計的有意差は見られなかった。

【0288】

２回目の注射の２週間後（３４日目）に、親株Ｄ６１４に対する中和抗体（ＮＡｂ）を両方の中和アッセイ（定量ＶＳＶ－ＰｓＶおよびレンチウイルス－ＰｓＶ）において（図２０）、ならびに親株Ｄ６１４Ｇ、アルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタ変異株に対する中和抗体（ＮＡｂ）をレンチウイルス－ＰｓＶアッセイにおいて（図２１）測定した。

【0289】

Ｄ６１４ ＶＳＶ－ＰｓＶ ＮＡｂ価は、３４日目に全てのマカクにおいて、ワクチン製剤に応じて様々なレベルで検出された。用量効果は、構成成分１つ当たり２．５～１０μｇの３種類の製剤（一価Ｄ６１４およびＢ．１．３５１製剤、ならびに二価Ｄ６１４＋Ｂ．１．３５１製剤）において観察されなかった。Ｄ６１４ ＶＳＶ－ＰｓＶ中和力価は、一価Ｄ６１４ワクチン群が３つ全ての用量レベルの平均価が３．６Ｌｏｇ_１０で最も高く、Ｂ．１．３５１一価群が２．５Ｌｏｇ_１０の平均価で最も低く、二価ワクチン群が３．１Ｌｏｇ_１０の平均価で中間であった。二価および一価Ｄ６１４ワクチンを構成成分１つ当たりの同じ用量で比較した場合、Ｄ６１４ ＮＡｂ価に関する差は２．５μｇ用量レベル（一価Ｄ６１４ ２．５μｇおよび二価２．５μｇ＋２．５μｇ）において統計的に有意であった（５．４倍、ｐ値＜０．００１）。この差は、他の２つの用量レベル（Ｄ６１４構成成分５μｇおよび１０μｇ）ではより小さく（２倍）、統計的に有意ではなかった。

【0290】

対照的に、一価Ｂ．１．３５１ワクチンと比較した二価ワクチンにおけるＤ６１４ ＶＳＶ－ＰｓＶ ＮＡｂ価の増加は、全ての用量レベルにおいて統計的に有意であった（３．６～５．３倍、ｐ値＜０．０５）。３つ全ての用量レベルを比較した場合、二価ワクチンにおいて観察されたＤ６１４ ＶＳＶ－ＰｓＶ中和力価は、一価Ｄ６１４ワクチン群の力価と比較して３分の１倍であった（ｐ値＜０．００１）が、一価Ｂ．１．３５１ワクチンによって誘導された力価の４．１倍であった（ｐ値＜０．００１）。

【0291】

ＶＳＶ－ＰｓＶアッセイにおいて観察された、二価ワクチンを一価Ｄ６１４ワクチンと比較した場合のＤ６１４ ＮＡｂ価に関する中等度の減少は、レンチウイルス－ＰｓＶ中和アッセイでは、２．５μｇ用量レベルにおいて（３．８倍、ｐ値＜０．０１）、および３つ全ての用量を合わせた場合（２．３倍、ｐ値＜０．００５）に確認された。ＶＳＶ－ＰｓＶアッセイの結果と同様に、一価Ｂ．１．３５１ワクチンと比較したＤ６１４ ＮＡｂ価の増加は、レンチウイルス－ＰｓＶアッセイでは、３つ全ての用量レベルにおいて（２．９～５．３倍、ｐ値＜０．０１）、および３つ全ての用量を合わせた場合（４．３倍、ｐ値＜０．００１）に確認された。一価Ｂ．１．３５１ ５μｇ群の１匹の動物は、検出不能なＤ６１４ ＮＡｂ価を有し、この同じ動物は、ＶＳＶ－ＰｓＶアッセイにおいてＤ６１４に対して低い力価、ならびにＤ６１４Ｇおよび全てのＶｏＣに対して低い力価を有した。

【0292】

ベータ変異株ならびに他の公知のＶｏＣ（アルファ、ガンマ、およびデルタ）の中和もまたレンチウイルス－ＰｓＶ中和化アッセイにおいて評価した。アルファおよびデルタ変異株に対するＮＡｂ価は、各ワクチン製剤において、Ｄ６１４Ｇに対するものと同じパターンを取り：一価Ｄ６１４ワクチンにおいて最も高く、一価Ｂ．１．３５１ワクチンにおいて最も低く、二価ワクチンにおいて中間であった。アルファおよびデルタ変異株に対する力価はＤ６１４Ｇ株に対するものよりもごくわずかに低かった（それぞれ、類似～２．５分の１倍、および１．２分の１～４．９分の１倍）。ベータおよびガンマ変異株に対する力価は一価Ｄ６１４ワクチンにおいて最も低く、一価Ｂ．１．３５１ワクチンにおいて最も高かった。二価ワクチンは、一価Ｂ．１．３５１ワクチンと同じレベルのベータおよびガンマＮＡｂ価を誘導した。

【0293】

全体的に、一価Ｄ６１４ワクチンと比較した場合、二価ワクチンは、親株に対するわずかに低いＮＡｂ価（アッセイに応じて２分の１～３分の１倍）、ベータおよびガンマ変異株に対するはるかに高い力価、ならびに２種類の最も広く流行している変異株アルファおよびデルタの同等の中和を誘導した。一価Ｂ．１．３５１ワクチンと比較した場合、二価ワクチンは、親Ｄ６１４株およびＤ６１４Ｇ株、ならびにアルファおよびデルタ変異株に対するはるかに高いＮＡｂ価を誘導した（表１８）。

【0294】

【表21】

【0295】

結論として、ナイーブＮＨＰにおいて生成されたこれらのデータは、今日までに公知の全ての懸念される変異株のバランスのとれた中和を示した。二価ワクチン（Ｄ６１４＋Ｂ．１．３５１）は、高度に動的な疫学を考慮すると、ワクチン逃避のリスクを軽減し得るため、一次ワクチン接種のためのさらなる臨床治験を正当化する。実際、ワクチン接種ならびにアルファおよびデルタ変異株への自然感染によりＤ６１４様スパイクの血清有病率は高まっているため、今後はベータおよびガンマなどのワクチン逃避変異株が、とりわけ、抗体逃避と関連する突然変異（Ｅ４８４Ｋなど）がデルタ変異株に存在するような伝播性の増加と関連する突然変異と組み合わされる場合は、優性となり得る。

【0296】

実施例１２
ＮＨＰ変異株ブースター研究
この実施例は、異なるワクチンプラットフォームにおける、一価および二価ＣｏＶ２ ｐｒｅＳ ｄＴＭ－ＡＳ０３ワクチン（Ｄ６１４、Ｂ．１．３５１、またはＤ６１４＋Ｂ．１．３５１）の一次ワクチン接種後のブースターとしての使用を評価した研究（ＣｏＶ２－０７＿ＮＨＰおよびＣｏＶ２－０８＿ＮＨＰ）を記載する。強固な免疫応答を誘導するＡＳ０３の利益は一次ワクチン接種において明確に実証されたが、ここでは、ＡＳ０３の免疫応答を増強する役割を評価して、アジュバントがブースターレジメンに有用となり得るか否かを決定した。

【0297】

ブースター免疫化を、ＣＯＶＩＤ－１９ ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチン候補を用いて免疫化したカニクイザル（ＣｏＶ２－０７＿ＮＨＰ、ｍＲＮＡプライミングコホート）、およびＣｏＶ２ ｐｒｅＳ ｄＴＭ－ＡＳ０３ワクチンを用いて免疫化したアカゲザル（ＣｏＶ２－０８＿ＮＨＰ、サブユニットプライミングコホート；武漢株）において評価した。両方のコホートは一次ワクチン接種の約７か月後にブースター注射を受けた。

【0298】

研究デザイン
ＣｏＶ２－０７＿ＮＨＰ研究では、ＣＯＶＩＤ－１９ ｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチン候補（Ｋａｌｎｉｎら、ＮＰＪ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０２１）６（１）：６１）を以前にワクチン接種された１６匹のモーリシャス産カニクイザル（８匹の雄および８匹の雌、４～１０歳齢）を、４匹のマカクからなる４つの群に無作為化した。一次ワクチン接種の２週間後（３５日目）に親Ｄ６１４ウイルスに対する中和抗体応答を示した動物のみを本研究のために選択した。

【0299】

ＣｏＶ２－０８－ＮＨＰ研究では、ＣｏＶ２ ｐｒｅＳ ｄＴＭ－ＡＳ０３（武漢株）を用いて以前に免疫化された２４匹のインド産アカゲザル（雄、２．７～４歳齢）を、４～５匹のマカクからなる５つの群に無作為化した。

【0300】

両方のコホートにおいて、無作為化は、ベースライン特徴（性別および年齢）、ならびに一次免疫化後およびブースターワクチン接種の１か月前の中和応答に基づいた。表１９に記載されるように、種々の群がＣｏＶ２ ｐｒｅＳ ｄＴＭワクチン製剤の１回投与を受けた。

【0301】

【表22】

【0302】

動物を研究全体にわたって有害事象の任意の臨床徴候についてモニタリングした。血液サンプルを、ブースター注射前、注射後の２日目、７日目、１４日目、２１日目、および２８日目に血液細胞数および化学パラメータのために採取した。血液サンプルを、７日目、１４日目、２１日目、および２８日目に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄ６１４Ｇ、アルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタ変異株に対する結合およびレンチウイルス－ＰｓＶ中和抗体滴定のために採取した。

【0303】

結果
研究中に臨床徴候は観察されず、血液学および臨床化学パラメータならびに体温はいかなる安全性に関するシグナルも示さなかった。

【0304】

Ｓ結合ＩｇＧ価ならびにＤ６１４Ｇ株およびＢ．１．３５１変異株に対するＮＡｂ価をブースター後４週間にわたり毎週測定し、一次ワクチン接種後（３５日目）またはベースライン時、すなわち、一次免疫化の７か月後（それぞれ、ｍＲＮＡプライミングコホートでは２０５日目、サブユニットプライミングコホートでは１９６日目）のピーク力価と比較した。Ｓ結合ＩｇＧ価を図２２に示し、Ｄ６１４ＧおよびＢ．１．３５１ ＮＡｂ価を図２３に示す。ヒト回復期血清において測定したＳ結合およびＤ６１４ ＮＡｂ価を対応する図に表す。

【0305】

一次ワクチン接種の７か月後（２０５日目または１９６日目、ベースラインを表す）、Ｓ結合価は、両方のコホートで低下していたが、依然として大半の動物において検出された。ブースター免疫化は、ワクチン製剤とは無関係に、早くも７日目に全ての動物においてＳ結合価を増加した。この増加は、ＡＳ０３の存在下ではより顕著であった（ｍＲＮＡプライミングコホートでは３．５倍で統計的に有意ではなく、サブユニットプライミングコホートでは５．７倍、ｐ＜０．０５）。高いＩｇＧ価は、７日目から解析の最終時点である２８日目の間で安定であった。

【0306】

Ｓ結合価と一致して、Ｄ６１４Ｇ ＮＡｂ価は、一次ワクチン接種の７か月後（２０５日目または１９６日目）に両方のコホートで低下しており、ｍＲＮＡプライミングコホートの一部の動物は陰性力価を有した。この時点において、Ｂ．１．３５１ ＮＡｂ価は、ｍＲＮＡプライミングコホートでは全て検出不能であり、サブユニットプライミングコホートでは検出不能であったかまたは低かった。

【0307】

ブースターの１週間後、ＮＡｂ価は、ＡＳ０３アジュバント一価Ｄ６１４を用いてブーストしたｍＲＮＡプライミングコホートの１匹の動物（Ｂ．１．３５１ ＮＡｂ価は１４日目にのみ検出され、Ｄ６１４Ｇ ＮＡｂ価は他の動物と同じ範囲であった）を除き、両方のコホートの全てのワクチン接種群において、両方の株（Ｄ６１４ＧおよびＢ．１．３５１）に対して強力に増加した。重要なことに、この増加は全ての群および両方のコホートにおいて少なくとも４週間（試験の最終時点）安定であった。

【0308】

中和応答の幅を探索するために、他の公知のＶｏＣ（アルファ、ガンマ、およびデルタ）ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対するＮＡｂ価をブースターの２週間後に解析し、同時点のＤ６１４ＧおよびＢ．１．３５１に対するＮＡｂ価と比較した（図２４）。２種類の原型株（Ｄ６１４ＧおよびＢ．１．３５１）に関する結果を裏付けるように、全てのワクチン製剤において、ブースター免疫化後に他の変異株に対する高いＮＡｂ価が測定された。

【0309】

データは、ワクチンプライミングマカクにおいて、様々なワクチン製剤（アジュバントを有しない一価Ｂ．１．３５１、ＡＳ０３アジュバント一価Ｄ６１４もしくはＢ．１．３５１、または二価）による３回目の注射が、親Ｄ６１４株に対する初期ＮＡｂ応答の強力なリコールを誘導し、ベータ変異株ならびに全ての他の公知のＶｏＣ（アルファ、ガンマ、およびデルタ）ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対する中和を延長したことを示す。

【0310】

ＡＳ０３アジュバント製剤は、アジュバントを有しない一価と比較して高いＮＡｂ価を誘導した（ベースラインに対するＤ６１４Ｇ ＮＡｂ価の増加に関して統計的に有意－ｍＲＮＡプライミングコホートおよびサブユニットプライミングコホートにおいてそれぞれ６．５倍および８．１倍）。

【0311】

ベータおよびガンマ変異株に対するより高い応答傾向が、Ｂ．１．３５１ Ｓ抗原を含有するワクチン（一価または二価）において観察され、ＶｏＣに対する平均ＮＡｂ価は、ブースターの２週間後の両方のコホートにおいて３．５Ｌｏｇ_１０よりも大きく、Ｄ６１４Ｇに対する平均ＮＡｂ価は、４．０Ｌｏｇ_１０よりも大きかった。ＮＡｂ応答に対する干渉（負または正）は、二価ワクチンにおいて、一価Ｄ６１４またはＢ．１．３５１のいずれと比較した場合においても観察されなかった。

【0312】

重要なことに、ブースター後に毎週測定したＡｂ価（Ｓ結合ならびにＤ６１４Ｇおよびベータに対するＮＡｂ）は、７日目～２８日目で安定であるようであり、早くも７日目には定常に達したことを示唆する。この観察結果は、ブースター時点で変異株に対して低～検出不能なＮＡｂ応答であったにもかかわらず、異なるワクチンプラットフォーム（ｍＲＮＡおよびサブユニット）を用いて免疫化したマカクにおいて再現された。

【0313】

配列表

【表23】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23-1】

【図23-2】

【図24】

【配列表】

2023538665000001.app

【国際調査報告】