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特表2023-538666閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）の改善された製造のための改変バキュロウイルス系
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-08
(54)【発明の名称】閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）の改善された製造のための改変バキュロウイルス系
(51)【国際特許分類】
C12N 15/866 20060101AFI20230901BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230901BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20230901BHJP
C12N 15/35 20060101ALN20230901BHJP
A61K 38/37 20060101ALN20230901BHJP
A61P 7/04 20060101ALN20230901BHJP
【ＦＩ】
C12N15/866 Z ZNA
C12N15/12
C12N5/10
C12N15/35
A61K38/37
A61P7/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023513100
(86)(22)【出願日】2021-08-23
(85)【翻訳文提出日】2023-04-14
(86)【国際出願番号】 US2021047202
(87)【国際公開番号】W WO2022046665
(87)【国際公開日】2022-03-03
(31)【優先権主張番号】63/069,115
(32)【優先日】2020-08-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
(71)【出願人】
【識別番号】512147244
【氏名又は名称】バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】アジャイ・メゴディア
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA03
4B065CA43
4B065CA44
4C084AA06
4C084BA44
4C084CA01
4C084CA49
4C084CA53
4C084DC15
4C084NA20
4C084ZA531
(57)【要約】
本開示は、昆虫細胞における閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）の製造のための組み換えバキュロウイルス発現ベクター（ｒＢＥＶ）に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ） バキュロウイルス複製に必要なバキュロウイルス遺伝子のバリアント、［ここでバリアント遺伝子は、そのコード化タンパク質の減少した発現を示す］；（ｉｉ） 細菌複製起点（ｏｒｉ）；及び
（ｉｉｉ） 導入遺伝子を含む異種ＤＮＡ配列の組み込みのための少なくとも１つの組み込み部位
を含む、組み換えバクミド。
【請求項2】
バキュロウイルス遺伝子はカプシド又はカプシド関連遺伝子である、請求項１に記載のバクミド。
【請求項3】
バキュロウイルス遺伝子は、ＶＰ８０、ＶＰ３９、ＧＰ４１、Ｐ３３３、ＶＰ１－５４、ＶＬＦ－１、及びＰＰ７８／８３からなる群から選択される、請求項１に記載のバクミド。
【請求項4】
バキュロウイルス遺伝子はＶＰ８０である、請求項１に記載のバクミド。
【請求項5】
必須遺伝子のバリアントは、その発現を不活化する破壊又は変異に起因して発現されない、請求項１～４のいずれか１項に記載のバクミド。
【請求項6】
バリアント遺伝子は、その発現を破壊する挿入及び／又は欠失（「インデル」）を含む、請求項５に記載のバクミド。
【請求項7】
インデルは、標的化されたヌクレアーゼシステムにより生成される、請求項６に記載のバクミド。
【請求項8】
複製起点は、ミニ－Ｆ－レプリコン、ＣｏｌＥ１、ｏｒｉＣ、ＯｒｉＶ、ＯｒｉＴ又はＯｒｉＳである、請求項１～７のいずれか１項に記載のバクミド。
【請求項9】
レポーター遺伝子をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のバクミド。
【請求項10】
選択マーカー発現遺伝子カセットをさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のバクミド。
【請求項11】
Ｒｅｐタンパク質をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のバクミド。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか１項に記載のバクミドの組み込み部位への異種ＤＮＡ配列の部位特異的組み込みにより生成された、組み換えバキュロウイルス発現ベクター（ｒＢＥＶ）。
【請求項13】
異種核酸配列は、末端逆位配列（ＩＴＲ）と隣接している導入遺伝子を含む、請求項１２に記載のｒＢＥＶ。
【請求項14】
異種核酸は閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）として発現される、請求項１２又は１３に記載のｒＢＥＶ。
【請求項15】
（ｉ） 請求項１２～１４のいずれか１項に記載のｒＢＥＶ；及び（ｉｉ） バリアント必須遺伝子を補完することができ、かつｒＢＥＶに対してトランスに供給される、機能性タンパク質の供給源
を含む、バキュロウイルス発現系。
【請求項16】
機能性タンパク質は、機能性タンパク質をトランスに発現する別個の発現ベクターとして供給される、請求項１５に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項17】
機能性タンパク質は、変異カプシドタンパク質に対応する機能性カプシドタンパク質を発現する昆虫細胞により供給される、請求項１５に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項18】
昆虫細胞は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｓ２、イラクサギンウワバ、Ｅ４ａ、又はＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞である、請求項１７に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項19】
昆虫細胞においてバキュロウイルス発現ベクターを増殖させる方法であって：（ａ） 請求項１２～１４のいずれか１項に記載の組み換えバキュロウイルス発現ベクター（ｒＢＥＶ）で昆虫細胞をトランスフェクトすること；
（ｂ） バリアント必須遺伝子を補完することができる機能性タンパク質を供給すること［ここで、機能性タンパク質はｒＢＥＶに対してトランスに供給される］；及び
（ｃ） 昆虫細胞を培養し、それによりバキュロウイルス発現系ベクターを増殖させること
を含む、上記方法。
【請求項20】
機能性タンパク質は、機能性カプシドタンパク質を用いて昆虫細胞を電気穿孔することにより供給される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
機能性タンパク質を安定に組み込み、そしてトランスに発現する別個の発現ベクターで昆虫細胞をトランスフェクトすることにより、機能性タンパク質が供給される、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
機能性カプシド遺伝子は、昆虫細胞において変異カプシドタンパク質に対応する機能性カプシドタンパク質を発現させることにより供給される、請求項１９に記載の方法。
【請求項23】
機能性カプシド遺伝子は、誘導性又はトランス活性化プロモーターの制御下で細胞において発現される、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
誘導性プロモーターは、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）３９Ｋプロモーターである、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
導入遺伝子を含む異種ＤＮＡ配列を製造する方法であって、（ａ） 請求項１９～２４のいずれか１項に記載の方法に従って組み換えバキュロウイルス発現ベクター（ｒＢＥＶ）を増殖させること；
（ｂ） ｒＢＥＶを収集すること；
（ｃ） 昆虫細胞を感染させて異種ＤＮＡ配列を発現させること；及び
（ｄ） 昆虫細胞から異種ＤＮＡ配列を精製すること
を含む、上記方法。
【請求項26】
異種ＤＮＡ配列はバキュロウイルスゲノムＤＮＡを実質的に含まない、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
異種ＤＮＡ配列は、末端逆位配列（ＩＴＲ）と隣接している導入遺伝子を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
ＩＴＲはパルボウイルス由来である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
パルボウィルスは、Ｂ１９、ＧＰＶ、及びＡＡＶからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
異種核酸分子は閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）として発現される、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
異種核酸分子は配列番号１５のヌクレオチド配列を含み、そしてここでヌクレオチド配列は、第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドをコードする、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
異種核酸分子は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットを含む、請求項２７～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
請求項２５～３３のいずれか１項に記載の方法により製造された、治療的タンパク質をコードする導入遺伝子を含む異種ＤＮＡ配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、米国仮特許出願第６３／０６９，１１５号（２０２０年８月２３日）に対して優先権を主張し、その開示はそれら全体として参照により本明細書に加入される。
本出願は、米国仮特許出願第６３／０６９，１１５号（２０２０年８月２３日）に対して優先権を主張し、その開示はそれら全体として参照により本明細書に加入される。
【0002】
電子的に提出された配列表の参照
ＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：ＳＡ９－４７５ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：４５ｋＢ；及びデータ作成日：２０２１年８月２３日）で電子的に提出された配列表の内容は、その全体として参照により本明細書に加入される。
ＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：ＳＡ９－４７５ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：４５ｋＢ；及びデータ作成日：２０２１年８月２３日）で電子的に提出された配列表の内容は、その全体として参照により本明細書に加入される。
【背景技術】
【0003】
背景
遺伝子治療は、様々な疾患を処置する持続的な手段を提供する。過去において、遺伝子治療は典型的にはウイルスベクターの使用に依存していた。ＡＡＶベクターは、ウイルスベクターのより一般的な種類の１つとして明らかになってきた。しかし、カプシドの存在は、遺伝子治療におけるＡＡＶベクターの有用性を制限する。特に、カプシド自体は、ベクター中に含まれる導入遺伝子のサイズを４．５ｋｂ未満程度に低く制限し得る。遺伝子治療において有用であり得る様々な治療的タンパク質は、発現制御配列が加えられる前でさえ、容易にこのサイズを超えることができる。さらに、カプシドを構成するタンパク質は、対象の免疫系により標的化され得る抗原として役立ち得る。ＡＡＶは一般集団において非常によく見られ、大部分の人々が一生の間にＡＡＶに曝露されたことがある。結果として、大部分の潜在的な遺伝子治療レシピエントが、ＡＡＶに対する免疫応答をすでに生じた可能性があり、従って、治療を拒絶する可能性がより高い。さらに、哺乳動物細胞におけるウイルスベクター製造は、低い収量、及び大規模商業製造のためのスケールアップにおける困難性に悩まされ得る。
遺伝子治療は、様々な疾患を処置する持続的な手段を提供する。過去において、遺伝子治療は典型的にはウイルスベクターの使用に依存していた。ＡＡＶベクターは、ウイルスベクターのより一般的な種類の１つとして明らかになってきた。しかし、カプシドの存在は、遺伝子治療におけるＡＡＶベクターの有用性を制限する。特に、カプシド自体は、ベクター中に含まれる導入遺伝子のサイズを４．５ｋｂ未満程度に低く制限し得る。遺伝子治療において有用であり得る様々な治療的タンパク質は、発現制御配列が加えられる前でさえ、容易にこのサイズを超えることができる。さらに、カプシドを構成するタンパク質は、対象の免疫系により標的化され得る抗原として役立ち得る。ＡＡＶは一般集団において非常によく見られ、大部分の人々が一生の間にＡＡＶに曝露されたことがある。結果として、大部分の潜在的な遺伝子治療レシピエントが、ＡＡＶに対する免疫応答をすでに生じた可能性があり、従って、治療を拒絶する可能性がより高い。さらに、哺乳動物細胞におけるウイルスベクター製造は、低い収量、及び大規模商業製造のためのスケールアップにおける困難性に悩まされ得る。
【0004】
ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子発現がない場合、ＡＡＶベクターゲノムは非効率的な複製を受け、そして両末端のＩＴＲを介して共有結合で連結された分子内中間体の相補鎖は、閉端（ｃｌｏｓｅｄ－ｅｎｄｅｄ）線状二本鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）の新しい立体構造で蓄積することが示されている。ｃｅＤＮＡは、ウイルスカプシド内の空間を限定することにより課せられたパッケージング制約を有していない。従って、ｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスベクター遺伝子治療の代替として使用され得る。制御エレメント、大きな導入遺伝子、及び複数の導入遺伝子が、サイズ制限を気にせずにｃｅＤＮＡ構築物中に含まれ得る。
【0005】
バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）は、目的の外来遺伝子を含むように遺伝子改変された二本鎖環状ＤＮＡゲノムを含む組み換えバキュロウイルスである。ＢＥＶは生存可能であり、そして感受性宿主、通常は培養された昆虫細胞に感染することができる。遺伝子治療のための閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）を製造するためにＢＥＶを使用することができ、そしてそれによりウイルスベクターの必要性を避けることができる。しかし、ｃｅＤＮＡのような目的の核酸が、ＢＥＶを用いて形質転換された後に昆虫細胞から精製された場合、バキュロウイルスゲノムＤＮＡが目的の核酸と共に同時精製されることが見られ得るということがわかってきた。これは生成されたウイルス粒子に起因するようである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
従って、バキュロウイルス系において目的の精製された核酸を効率的に製造し、そして子孫ウイルス粒子の数を減少させ、そして最終的に、精製された核酸調製物中のバキュロウイルスゲノムＤＮＡの混入を減少させる必要性が当該分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
開示の要旨
本開示は、少なくとも部分的に、（１）バキュロウイルス複製に必須である不活化又は弱毒化されたバキュロウイルス遺伝子（例えば、不活化カプシド遺伝子、例えば不活化ＶＰ８０遺伝子）を用いて編集されたゲノムを含む組み換えバクミド又は組み換えバキュロウイルス発現ベクター（ｒＢＥＶ）及び目的の核酸（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）；並びに（２）宿主細胞（例えば、昆虫細胞）がｒＢＶを用いた宿主細胞の感染後にｒＢＥＶを増殖することができるような、トランスに供給される不活化又は弱毒化された必須バキュロウイルス遺伝子の機能的カウンターパート、を含む発現系に関する。
本開示は、少なくとも部分的に、（１）バキュロウイルス複製に必須である不活化又は弱毒化されたバキュロウイルス遺伝子（例えば、不活化カプシド遺伝子、例えば不活化ＶＰ８０遺伝子）を用いて編集されたゲノムを含む組み換えバクミド又は組み換えバキュロウイルス発現ベクター（ｒＢＥＶ）及び目的の核酸（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）；並びに（２）宿主細胞（例えば、昆虫細胞）がｒＢＶを用いた宿主細胞の感染後にｒＢＥＶを増殖することができるような、トランスに供給される不活化又は弱毒化された必須バキュロウイルス遺伝子の機能的カウンターパート、を含む発現系に関する。
【0008】
本開示の発現系は、明らかなレベルのＢＶゲノムＤＮＡが混入することなく、目的の核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）の産生を可能にすることが発見された。従って、ゲノム編集されたｒＢＥＶに感染した宿主細胞（例えば、昆虫細胞）から単離されたＤＮＡは、必須バキュロウイルス遺伝子の機能的カウンターパートを含有するゲノムを有するｒＢＶに感染した宿主細胞よりも高い力価のＤＮＡを生じる。これらの発見を利用して本開示を開発し、本開示は、部分的に、組み換えバキュロウイルス系、その構成要素、及び異種ＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）の産生のために特異的に編集されたｒＢＶを使用する方法に関する。
【0009】
一局面において、本開示は、（ｉ）バキュロウイルス複製に必要なバキュロウイルス遺伝子のバリアント、［ここでバリアント遺伝子は、そのコード化タンパク質の減少した発現を示す］；（ｉｉ）細菌複製起点（ｏｒｉ）；及び（ｉｉｉ）導入遺伝子を含む異種ＤＮＡ配列の組み込みのための少なくとも１つの組み込み部位を含む組み換えバクミドを提供する。
【0010】
一実施形態において、バキュロウイルス遺伝子はカプシド又はカプシド関連遺伝子である。
【0011】
一実施形態において、バキュロウイルス遺伝子は、ＶＰ８０、ＶＰ３９、ＧＰ４１、Ｐ３３３、ＶＰ１－５４、ＶＬＦ－１、及びＰＰ７８／８３からなる群から選択される
一実施形態において、バキュロウイルス遺伝子はＶＰ８０である。
一実施形態において、バキュロウイルス遺伝子はＶＰ８０である。
【0012】
一実施形態において、必須遺伝子のバリアントは、その発現を不活化する破壊又は変異に起因して発現されない。
【0013】
一実施形態において、必須遺伝子のバリアントは、その発現を破壊する挿入及び／又は欠失（「インデル」）を含む。
【0014】
一実施形態において、インデルは、標的化されたヌクレアーゼ系により生成される。
【0015】
一実施形態において、複製起点は、ミニ－Ｆ－レプリコン、ＣｏｌＥ１、ｏｒｉＣ、ＯｒｉＶ、ＯｒｉＴ又はＯｒｉＳである。
【0016】
一実施形態において、バクミドはレポーター遺伝子をさらに含む。
【0017】
一実施形態において、バクミドは選択マーカー発現遺伝子カセットをさらに含む。
【0018】
一実施形態において、バクミドはＲｅｐタンパク質をさらに含む。
【0019】
別の局面において、本開示は、前の請求項のいずれか１つのバクミドの組み込み部位への異種ＤＮＡ配列の部位特異的組み込みにより生成された、組み換えバキュロウイルス発現ベクター（ｒＢＥＶ）を提供する。
【0020】
一実施形態において、異種ＤＮＡ配列はＲｅｐタンパク質である。
【0021】
別の実施形態において、異種核酸配列は、末端逆位配列（ＩＴＲ）と隣接している導入遺伝子を含む。
【0022】
一実施形態において、異種核酸は閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）として発現される。
【0023】
別の局面において、本開示は、（ｉ）本明細書に開示されるｒＢＥＶ；及び（ｉｉ）機能性タンパク質の供給源、［機能性タンパク質は、バリアント必須遺伝子を補完することができ、かつｒＢＥＶに対してトランスに供給される］を含む、バキュロウイルス発現系を提供する。
【0024】
一実施形態において、機能性タンパク質は、機能性タンパク質をトランスに発現する別個の発現ベクターとして供給される。
【0025】
一実施形態において、機能性タンパク質は、変異カプシドタンパク質に対応する機能性カプシドタンパク質を発現する昆虫細胞により供給される。
【0026】
一実施形態において、昆虫細胞は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｓ２、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、Ｅ４ａ、又はＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞である。
【0027】
別の実施形態において、昆虫細胞は、異種核酸配列をコードする安定な細胞株である。
【0028】
別の実施形態において、異種ＤＮＡ配列は、末端逆位配列（ＩＴＲ）と隣接している導入遺伝子を含む。
【0029】
別の実施形態において、異種核酸は閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）として発現される。
別の局面において、本開示は、昆虫細胞においてバキュロウイルス発現ベクターを増殖させる方法を提供し、該方法は：（ａ）本明細書に開示される組み換えバキュロウイルス発現ベクター（ｒＢＥＶ）で昆虫細胞をトランスフェクトすること；（ｂ）バリアント必須遺伝子を補完することができる機能性タンパク質を供給すること［ここで、機能性タンパク質はｒＢＥＶに対してトランスに供給される］；及び（ｃ）昆虫細胞を培養し、それによりバキュロウイルス発現系ベクターを増殖させることを含む。
別の局面において、本開示は、昆虫細胞においてバキュロウイルス発現ベクターを増殖させる方法を提供し、該方法は：（ａ）本明細書に開示される組み換えバキュロウイルス発現ベクター（ｒＢＥＶ）で昆虫細胞をトランスフェクトすること；（ｂ）バリアント必須遺伝子を補完することができる機能性タンパク質を供給すること［ここで、機能性タンパク質はｒＢＥＶに対してトランスに供給される］；及び（ｃ）昆虫細胞を培養し、それによりバキュロウイルス発現系ベクターを増殖させることを含む。
【0030】
一実施形態において、機能性タンパク質は、機能性カプシドタンパク質を用いて昆虫細胞を電気穿孔することにより供給される。
【0031】
一実施形態において、機能性タンパク質を安定に組み込み、そしてトランスに発現する別個の発現ベクターで昆虫細胞をトランスフェクトすることにより、機能性タンパク質が供給される。
【0032】
一実施形態において、機能性カプシド遺伝子は、昆虫細胞において変異カプシドタンパク質に対応する機能性カプシドタンパク質を発現させることにより供給される。
【0033】
一実施形態において、機能性カプシド遺伝子は、誘導性又はトランス活性化プロモーターの制御下で細胞において発現される。
【0034】
一実施形態において、誘導性プロモーターは、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）３９Ｋプロモーターである。
【0035】
別の局面において、本開示は、導入遺伝子を含む異種ＤＮＡ配列を製造する方法を提供し、（ａ）本明細書に開示される組み換えバキュロウイルス発現ベクター（ｒＢＥＶ）を増殖させること；（ｂ）ｒＢＥＶを収集すること；（ｃ）収集したｒＢＥＶに安定な昆虫細胞を感染させること、［ここで、安定な昆虫細胞株は異種核酸配列をコードする］；及び（ｄ）安定な昆虫細胞株において発現された異種ＤＮＡ配列を精製すること。
【0036】
別の局面において、本開示は、導入遺伝子を含む異種ＤＮＡ配列を製造する方法を提供し、（ａ）本明細書に開示される組み換えバキュロウイルス発現ベクター（ｒＢＥＶ）を増殖させること；（ｂ）ｒＢＥＶを収集すること；（ｃ）昆虫細胞を感染させて異種ＤＮＡ配列を発現させること；及び（ｄ）昆虫細胞から異種ＤＮＡ配列を精製すること。
【0037】
一実施形態において、異種ＤＮＡ配列はバキュロウイルスゲノムＤＮＡを実質的に含まない。
【0038】
一実施形態において、異種ＤＮＡ配列は、末端逆位配列（ＩＴＲ）と隣接している導入遺伝子を含む。
【0039】
一実施形態において、異種核酸は閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）として発現される。
【0040】
別の局面において、本開示は、治療的タンパク質をコードする導入遺伝子を含む、本明細書において開示される方法により製造された異種ＤＮＡ配列を提供する。
【0041】
本開示の前述の及び他の目的、その様々な特徴、さらには本開示それ自体は、添付の図面と併せて読まれた場合、以下の記載からより十分に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図3】図３及び図４は、各ｓｇＲＮＡにより誘導されるインデルを決定するための２つの別個のクローンのＴＩＤＥ（分解によるインデルトラッキング（Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ））分析を説明する。
【図5B】図５Ｂは、前に転写エンハンサーｈｒ５エレメント及び後ろにＡｃＭＮＰＶ ｐ１０ポリアデニル化シグナルを有する、ＡｃＭＮＰＶ前初期（ｉｅ１）プロモーター下にネオマイシン耐性マーカーをコードするプラスミドの概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【0043】
詳細な説明
本開示は、遺伝子治療目的のための異種ＤＮＡ調製物において混入を防止するための、バキュロウイルスゲノム由来のカプシド遺伝子の発現の下方調節を記載する。
本開示は、遺伝子治療目的のための異種ＤＮＡ調製物において混入を防止するための、バキュロウイルスゲノム由来のカプシド遺伝子の発現の下方調節を記載する。
【0044】
定義
別の定義がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中の群又は用語に提供される最初の定義は、別の指示がなければ、個別に又は別の群の一部として、本明細書全体をとおしてその群又は用語に当てはまる。
別の定義がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中の群又は用語に提供される最初の定義は、別の指示がなければ、個別に又は別の群の一部として、本明細書全体をとおしてその群又は用語に当てはまる。
【0045】
用語「ａ」又は「ａｎ」実体は、１つ又はそれ以上のその実体を指すということに注意するべきである：例えば、「ヌクレオチド配列（ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、１つ又はそれ以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。同様に、「治療的タンパク質（ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）」及び「バキュロウイルス発現ベクター（ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」は、それぞれ１つ又はそれ以上の治療的タンパク質及び１つ又はそれ以上のバキュロウイルス発現ベクターを表すと理解される。このようにして、用語「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ又はそれ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において交換可能に使用することができる。
【0046】
用語「約」は、およそ、大体、おおよそ、又は～の領域内を意味するように本明細書において使用される。用語「約」が数値範囲と併せて使用される場合、それは境界を示される数値の上下に拡張することによりその範囲を変更する。一般に、用語「約」は、数値を記載される値より１０パーセントの変動分上下に（より高く又はより低く）変更するために本明細書において使用される。
【0047】
また本明細書において使用されるように、「及び／又は」は、付随するリストに挙げられた項目の１つ又はそれ以上の任意かつ全ての組み合わせに加えて、選択肢（「又は」）で説明される場合の組み合わせの欠如も指し、かつ包含する。
【0048】
「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」及び「ポリヌクレオチド」は交換可能に使用され、そしてリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン；「ＲＮＡ分子」）又はデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、又はデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、又はホスホロチオアート及びチオエステルのようなそれらの任意のリン酸エステルアナログの、一本鎖形態、又は二重らせんのいずれかのリン酸エステルポリマー形態を指す。一本鎖核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を指す。二本鎖ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ及びＲＮＡ－ＲＮＡらせんも可能である。用語核酸分子、及び特にＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、分子の一次構造及び二次構造のみを指し、いずれかの特定の三次形態にそれを限定しない。従って、この用語は、とりわけ、線状又は環状ＤＮＡ分子で見出された二本鎖ＤＮＡ（例えば、制限フラグメント）、プラスミド、高次コイルＤＮＡ及び染色体を含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を考察する際、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向でのみ配列を示す通常の慣例に従って本明細書に記載され得る。「組み換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。ＤＮＡとしては、限定されないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び半合成ＤＮＡが挙げられる。本開示の「核酸組成物」は、本明細書に記載される１つ又はそれ以上の核酸を含む。
【0049】
本明細書で使用されるように、用語「異種ヌクレオチド配列」は、所定のポリヌクレオチド配列で天然に存在しないヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は導入遺伝子を含む。
【0050】
本明細書において使用されるように、用語「導入遺伝子」は、核酸分子、例えば、本明細書において開示されるようなｃｅＤＮＡベクターに組み込まれ、そして送達されて発現され得る目的の核酸（カプシドポリペプチドをコードする核酸以外）を指す。目的の導入遺伝子としては、限定されないが、ポリペプチド、好ましくは治療的（例えば、医療的、診断、又は獣医学的使用のため）又は免疫原性のポリペプチド（例えば、ワクチン用）をコードする核酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、目的の核酸は、治療的ＲＮＡに転写される核酸を含む。本開示の核酸分子（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）における使用のために含まれる導入遺伝子としては、限定されないが、１つ又はそれ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、アプタマー、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、アンチセンスオリゴ－又はポリヌクレオチド、抗体、抗原結合フラグメント、又はそれらの任意の組み合わせを発現するか又はコードするものが挙げられる。
【0051】
本明細書において使用されるように、「末端逆位配列」（又は「ＩＴＲ」）は、一組のヌクレオチド（初期配列）とその下流に続くその逆相補鎖、すなわち回文配列とを含む、一本鎖核酸配列（例えば、発現カセット又は導入遺伝子）の５’末端又は３’末端のいずれかに位置する核酸部分配列を指す。初期配列と逆相補鎖との間に介在するヌクレオチド配列は、ゼロを含めて任意の長さであってよい。一実施形態において、本開示に有用なＩＴＲは、１つ又はそれ以上の「回文配列」を含む。従って、本明細書において使用される「ＩＴＲ」は、それ自身の上で折り返すことができ、そして二本鎖セグメントを形成することができる。例えば、配列ＧＡＴＣＸＸＸＸＧＡＴＣは、折りたたまれた場合に二重らせんを形成する初期配列ＧＡＴＣ及びその相補鎖（３’ＣＴＡＧ５’）を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは、初期配列と逆相補鎖との間に連続した回文配列（例えば、ＧＡＴＣＧＡＴＣ）を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは、初期配列と逆相補鎖との間に中断された回文配列（例えば、ＧＡＴＣＸＸＸＸＧＡＴＣ；配列番号１１）を含む。いくつかの実施形態において、連続した又は中断された回文配列の相補セクションは、互いに相互作用して「ヘアピンループ」構造を形成する。本明細書において使用される「ヘアピンループ」構造は、一本鎖ヌクレオチド分子塩基対上の少なくとも２つの相補性配列が二本鎖セクションを形成する場合に生じる。いくつかの実施形態において、ＩＴＲの一部のみがヘアピンループを形成する。他の実施形態において、ＩＴＲ全体がヘアピンループを形成する。いくつかの実施形態において、ＩＴＲはＴ字形ヘアピン構造を形成する。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは非Ｔ字形ヘアピン構造、例えばＵ字形ヘアピン構造を形成する。
【0052】
ＩＴＲは任意の数の機能を有し得る。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは細胞の核における核酸分子の長期生存を促進する。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは細胞の核における核酸分子の永続的生存を促進する（例えば、細胞の全生存の間）。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは細胞の核における核酸分子の安定性を促進する。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは細胞の核における核酸分子の保持を促進する。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは細胞の核における核酸分子の持続を促進する。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは、細胞の核における核酸分子の分解を阻害するか又は防止する。ウイルスの状況では、ＩＴＲは複製、ウイルスパッケージング、組み込み及びプロウイルスレスキューを媒介する。カプシド遺伝子を欠いており、かつＩＴＲ配列と隣接している核酸分子（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の状況では、ＩＴＲは、核酸分子（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の複製を媒介することができる。
【0053】
特定の実施形態において、ＩＴＲは、少なくとも１つの最小の必要な複製起点と、回文ヘアピン構造を含む領域とを含むウイルス末端反復又は合成配列である。Ｒｅｐ結合配列（「ＲＢＳ」）（ＲＢＥ（Ｒｅｐ結合エレメント）とも呼ばれる）及び末端分離（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）部位（「ＴＲＳ」）は、「最小の必要な複製起点」を一緒に構成する。
【0054】
当然のことながら、２つより多くのＩＴＲ又は非対称なＩＴＲ対が存在していてもよい。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲでも非ＡＡＶ ＩＴＲでもよく、又はＡＡＶ ＩＴＲ由来でも非ＡＡＶ ＩＴＲ由来でもよい。例えば、ＩＴＲはパルボウイルス科由来であってもよく、これはパルボウイルス及びディペンドウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ－１９）を包含する。パルボウイルス科のウイルスは、２つの亜科からなる：脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）、及び無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ）。ディペンドパルボウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）は、限定されないが、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ及びヒツジ種を含む脊椎動物宿主における複製の能力を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスファミリーを含む。
【0055】
特定の実施形態において、少なくとも１つのＩＴＲは、非アデノウイルス随伴ウイルス（非ＡＡＶ）のＩＴＲである。特定の実施形態において、ＩＴＲは、パルボウイルス科のウイルスの非ＡＡＶメンバーのＩＴＲである。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは、ディペンドウイルス属又はエリスロウイルス属の非ＡＡＶメンバーのＩＴＲである。特定の実施形態において、ＩＴＲは、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、バリケンパルボウイルス（ＭＤＰＶ）、又はエリスロウイルス・パルボウイルスＢ１９（パルボウイルスＢ１９、霊長類エリスロパルボウイルス１、Ｂ１９ウイルス、及びエリスロウイルスとしても知られる）のＩＴＲである。特定の実施形態において、２つのＩＴＲのうちの一方のＩＴＲはＡＡＶのＩＴＲである。他の実施形態において、構築物中の２つのＩＴＲのうちの一方のＩＴＲは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及びそれらの任意の組み合わせから選択されるＡＡＶ血清型のＩＴＲである。１つの特定の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２由来、例えば、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲである。
【0056】
特定の実施形態において、ＩＴＲは、短縮化、置換、欠失、挿入及び／又は付加によりさらに改変され得る。一実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約２～６００ヌクレオチド、約２～５５０ヌクレオチド、約２～５００ヌクレオチド、約２～４５０ヌクレオチド、約２～４００ヌクレオチド、約２～３５０ヌクレオチド、約２～３００ヌクレオチド、又は約２～２５０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約５～６００ヌクレオチド、約１０～６００ヌクレオチド、約１５～６００ヌクレオチド、約２０～６００ヌクレオチド、約２５～６００ヌクレオチド、約３０～６００ヌクレオチド、約３５～６００ヌクレオチド、約４０～６００ヌクレオチド、約４５～６００ヌクレオチド、約５０～６００ヌクレオチド、約６０～６００ヌクレオチド、約７０～６００ヌクレオチド、約８０～６００ヌクレオチド、約９０～６００ヌクレオチド、約１００～６００ヌクレオチド、約１５０～６００ヌクレオチド、約２００～６００ヌクレオチド、約３００～６００ヌクレオチド、約３５０～６００ヌクレオチド、約４００～６００ヌクレオチド、約４５０～６００ヌクレオチド、約５００～６００ヌクレオチド、又は約５５０～６００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約５～５５０ヌクレオチド、約５～５００ヌクレオチド、約５～４５０ヌクレオチド、約５～４００ヌクレオチド、約５～３５０ヌクレオチド、約５～３００ヌクレオチド、又は約５～２５０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約１０～５５０ヌクレオチド、約１５～５００ヌクレオチド、約２０～４５０ヌクレオチド、約２５～４００ヌクレオチド、約３０～３５０ヌクレオチド、約３５～３００ヌクレオチド、又は約４０～２５０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約５２５ヌクレオチド、約５５０ヌクレオチド、約５７５ヌクレオチド又は約６００ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約４００ヌクレオチドを含む。
【0057】
他の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約２～２００ヌクレオチド、約５～２００ヌクレオチド、約１０～２００ヌクレオチド、約２０～２００ヌクレオチド、約３０～２００ヌクレオチド、約４０～２００ヌクレオチド、約５０～２００ヌクレオチド、約６０～２００ヌクレオチド、約７０～２００ヌクレオチド、約８０～２００ヌクレオチド、約９０～２００ヌクレオチド、約１００～２００ヌクレオチド、約１２５～２００ヌクレオチド、約１５０～２００ヌクレオチド、又は約１７５～２００ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約２～１５０ヌクレオチド、約５～１５０ヌクレオチド、約１０～１５０ヌクレオチド、約２０～１５０ヌクレオチド、約３０～１５０ヌクレオチド、約４０～１５０ヌクレオチド、約５０～１５０ヌクレオチド、約７５～１５０ヌクレオチド、約１００～１５０ヌクレオチド、又は約１２５～１５０ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約２～１００ヌクレオチド、約５～１００ヌクレオチド、約１０～１００ヌクレオチド、約２０～１００ヌクレオチド、約３０～１００ヌクレオチド、約４０～１００ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、又は約７５～１００ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約２～５０ヌクレオチド、約１０～５０ヌクレオチド、約２０～５０ヌクレオチド、約３０～５０ヌクレオチド、約４０～５０ヌクレオチド、約３～３０ヌクレオチド、約４～２０ヌクレオチド、又は約５～１０ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、又は２０ヌクレオチドからなる。他の実施形態において、初期配列と逆相補鎖との間に介在するヌクレオチドは、０ヌクレオチド、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、又は２０ヌクレオチドである（例えば、これらからなる）。
【0058】
本開示の特定の局面において、核酸分子は、２つのＩＴＲ、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを含み、ここで５’ＩＴＲは核酸分子の５’末端に位置し、そして３’ＩＴＲは核酸分子の３’末端に位置する。５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、同じウイルス由来でも異なるウイルス由来でもよい。特定の実施形態において、５’ＩＴＲはＡＡＶ由来であり、そして３’ＩＴＲはＡＡＶウイルス由来ではない（例えば、非ＡＡＶ）。いくつかの実施形態において、３’ＩＴＲはＡＡＶ由来であり、そして５’ＩＴＲはＡＡＶウイルス由来ではない（例えば、非ＡＡＶ）。他の実施形態において、５’ＩＴＲはＡＡＶウイルス由来ではなく（例えば、非ＡＡＶ）、そして３’ＩＴＲは同じ非ＡＡＶウイルス由来でも異なる非ＡＡＶウイルス由来でもよい。
【0059】
特定の実施形態において、ＩＴＲの対は非対称ＩＴＲである。本明細書で使用されるように、用語「非対称ＩＴＲ」は、それらの全長にわたって逆相補鎖ではないＩＴＲの対を指す。２つのＩＴＲ間の配列の差異は、ヌクレオチドの付加、欠失、短縮、又は点変異に起因するものであり得る。一実施形態において、対の一方のＩＴＲは野生型ＡＡＶ配列でも非ＡＡＶ配列でもよく、そして他方は非野生型配列でも合成配列でもよい。別の実施形態において、対のＩＴＲはいずれも野生型配列ではなく、かつ２つのＩＴＲは互いに配列が異なる。本明細書では便宜上、発現カセットに対して５’（上流）に位置するＩＴＲは「５’ＩＴＲ」又は「左ＩＴＲ」と呼ばれ得、そして発現カセットに対して３’（下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」又は「右ＩＴＲ」と呼ばれ得る。
【0060】
本明細書において使用されるように、用語「Ｒｅｐ結合部位」、「Ｒｅｐ結合エレメント」、「ＲＢＥ」及び「ＲＢＳ」は交換可能に使用され、そしてＲｅｐタンパク質に対する結合部位を指し（例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐ ７８又はＡＡＶ Ｒｅｐ ６８）、これらは、Ｒｅｐタンパク質による結合の際に、ＲＢＳを組み込んだ配列でＲｅｐタンパク質がその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を行うことを可能にする。ＲＢＳ配列及びその逆相補鎖は、単一ＲＢＳを一緒に形成する。天然の公知のＲＢＳ配列又は合成ＲＢＳ配列を含めて任意の公知のＲＢＳ配列が本発明の実施形態において使用され得る。Ｒｅｐタンパク質は、各鎖上の窒素塩基及びホスホジエステル骨格の両方と相互作用する。窒素塩基との相互作用は配列特異性をもたらすが、ホスホジエステル骨格との相互作用は、非配列特異的であるか又はより低い配列特異性であり、そしてタンパク質－ＤＮＡ複合体を安定化する。
【0061】
本明細書で使用されるように、用語「遺伝子カセット」又は「発現カセットは、目的のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、適切な宿主細胞における特定のポリヌクレオチド配列の発現を方向づけることができるＤＮＡ配列を意味する。遺伝子カセットは、コード領域の上流（５’非コード配列）、コード領域内、又はコード領域の下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を包含し得、そしてこれは関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。コード領域が真核生物細胞における発現を意図される場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終止配列は、通常はコード配列に対して３’に位置する。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは、ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは、異種ポリヌクレオチド配列を含む。
【0062】
産物、例えば、ｍｉＲＮＡ又は遺伝子産物（例えば、治療的タンパク質のようなポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、１つ又はそれ以上のコード領域と作動可能に結合されたプロモーター及び／又は他の発現（例えば、転写又は翻訳）制御配列を含み得る。作動可能な結合において、遺伝子産物、例えばポリペプチドについてのコード領域は、遺伝子産物の発現を調節領域の影響下又は制御下に置くようなやり方で１つ又はそれ以上の調節領域と結合される。例えば、コード領域及びプロモーターは、プロモーター機能の誘導が、コード領域によりコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を生じる場合、及びプロモーターとコード領域との間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を方向づけるプロモーターの能力を妨害せず、ＤＮＡテンプレートが転写される能力も妨害しない場合に「作動可能に結合される」。プロモーターに加えて、他の発現制御配列、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルもまた、遺伝子産物発現を方向づけるようにコード領域と作動可能に結合され得る。
【0063】
「発現制御配列」は、宿主細胞におけるコード配列の発現をもたらす制御性ヌクレオチド配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを指す。発現制御配列は、一般には、それが作動可能に連結されているコード核酸の効率的な転写及び翻訳を促進する任意の制御性ヌクレオチド配列を包含する。発現制御配列の非限定的な例としては、プロモーター、エンハンサー、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、又はステムループ構造が挙げられる。様々な発現制御配列が当業者に公知である。これらとしては、限定することなく、脊椎動物細胞において機能する発現制御配列、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（最初期プロモーター、イントロン－Ａと併せて）、サルウイルス４０（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の発現制御配列としては、脊椎動物遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ－グロビン、さらには真核生物細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。さらなる適切な発現制御配列としては、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、さらにはリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロン又はインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）が挙げられる。他の発現制御配列としては、イントロン配列、転写後調節エレメント、及びポリアデニル化シグナルが挙げられる。さらなる例となる発現制御配列は、本開示の他所で考察される。
【0064】
同様に、様々な翻訳制御エレメントは、当業者に公知である。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにピコルナウイルス由来のエレメント（特に配列内リボソーム進入部位又はＩＲＥＳ）が挙げられる。
【0065】
本明細書において使用されるように、用語「発現」は、それによりポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えばＲＮＡ又はポリペプチドを産生するプロセスを指す。それらとしては、限定することなく、ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は任意の他のＲＮＡ産物、及びｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が挙げられる。発現は「遺伝子産物」を生じる。本明細書において使用されるように、遺伝子産物は、核酸、例えば遺伝子の転写により生成されたメッセンジャーＲＮＡ、又は転写物から翻訳されたポリペプチドのいずれであってもよい。本明細書において記載される遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化もしくはスプライシングを有する核酸、又は翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの結合、もしくはタンパク質分解切断を有するポリペプチドをさらに含む。本明細書において使用されるように用語「収量」は、遺伝子の発現により産生されたポリペプチドの量を指す。
【0066】
「ベクター」は、核酸のクローニング及び／又は核酸の宿主細胞への転移のための任意の媒介物を指す。ベクターは、別の核酸セグメントが、付着したセグメントの複製を引き起こすように付着され得るレプリコンであり得る。用語「ベクター」は、インビトロ、エクスビボ又はインビボで核酸を細胞に導入するための媒介物を含む。多数のベクターが当該分野で公知であり、そして使用されており、それらとしては、例えば、プラスミド、改変真核生物ウイルス、又は改変細菌ウイルスが挙げられる。適切なベクター中へのポリヌクレオチドの挿入は、適切なポリヌクレオチドフラグメントを、相補性付着末端を有する選択されたベクター中に連結することにより達成され得る。
【0067】
ベクターを組み込んだ細胞の選択又は同定をもたらす選択可能マーカー又はレポーターをコードするようにベクターを操作することができる。選択可能マーカー又はレポーターの発現は、ベクター上に含有される他のコード領域を組み込み、そして発現する宿主細胞の同定及び／又は選択を可能にする。当該分野で公知であり、かつ使用される選択可能マーカー遺伝子の例としては：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する耐性を与える遺伝子；及び表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。当該分野で公知でありそして使用されるレポーターの例としては：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）等が挙げられる。選択可能マーカーもまたレポーターとみなされ得る。
【0068】
本明細書において使用されるように、用語「閉端ＤＮＡベクター」、「ｃｅＤＮＡベクター」及び「ｃｅＤＮＡ」は、交換可能に使用され、そして少なくとも１つの共有結合で閉じた末端（すなわち、分子内二本鎖）を有する非ウイルスカプシド非含有ＤＮＡベクターを指す。いくつかの実施形態において、ｃｅＤＮＡは２つの共有結合で閉じた末端を含む。特定の実施形態において、ｃｅＤＮＡは、少なくとも１つのＩＴＲをさらに組み込むテンプレートＤＮＡ又は発現カセットから製造される。特定の実施形態において、ｃｅＤＮＡは、本明細書に記載されるバキュロウイルス発現ベクターにおいてＤＮＡの分子内二本鎖ポリヌクレオチドとして組み込まれる。ｃｅＤＮＡベクターは、多数の方法でプラスミドベースの発現ベクターとは区別され得る。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、以下の特徴の１つ又はそれ以上を有し得る：（１）元の細菌ＤＮＡが無い（すなわち、挿入されていない）、（２）原核生物複製起点が無い、（３）自己自制（ｓｅｌｆ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）である、すなわち、ＩＴＲ以外のいずれの配列も必要としない、（４）ヘアピンを形成するＩＴＲ配列の存在、（５）真核生物起源である（すなわち、真核生物細胞において製造される）、及び（６）細菌型ＤＮＡメチル化が存在しないこと。ｃｅＤＮＡベクターをプラスミド発現ベクターと区別する別の重要な特徴は、ｃｅＤＮＡベクターは閉端を有する一本鎖線状ＤＮＡであるが、プラスミドは常に二本鎖ＤＮＡであることである。特定の実施形態において、ｃｅＤＮＡベクターは、制限酵素消化アッセイにより決定して、非連続的な構造ではなく線状の連続的な構造を有する。プラスミドの相補鎖は、変性後に分離されて、２つの核酸分子を生じ得るが、対照的に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが一本鎖ＤＮＡ分子であり、したがって変性されても単一の分子のままである。特定の実施形態において、ｃｅＤＮＡベクターは、１つ又はそれ以上の共有結合で閉じた末端が存在するので、例えば３７℃で１時間超の間のエキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ又はエキソヌクレアーゼＩＩＩ）消化に対して耐性である。
【0069】
用語「宿主細胞」は、本明細書において使用されるように、ｓｓＤＮＡ又はベクターのレシピエントとして使用することができるか又は使用された、例えば微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を指す。この用語は、形質転換された元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書において使用されるような「宿主細胞」は、一般的には、外来ＤＮＡ配列を用いて形質転換された細胞を指す。単一の親細胞の子孫は、天然の、偶発的な、又は計画的な変異に起因して、必ずしも形態学的にもしくはゲノム的に完全に同一でないか、又は元の親細胞に対する完全なＤＮＡ相補体ではないかもしれないということが理解される。いくつかの実施形態において、宿主細胞はインビトロ宿主細胞であってもよい。
【0070】
用語「選択可能マーカー」は、マーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生物質への耐性、除草剤への耐性、比色分析マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択されることが可能な同定因子、通常は抗生物質耐性遺伝子又は化学的耐性遺伝子を指し、ここでこの効果は、目的の核酸の遺伝を追跡するため、かつ／又は目的の核酸を受け継いだ細胞又は生物を同定するために使用される。当該分野において公知でありかつ使用される選択可能マーカー遺伝子の例としては：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する耐性をもたらす遺伝子；及び表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
【0071】
用語「レポーター遺伝子」は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定することができる同定因子をコードする核酸を指し、ここでこの効果は、目的の核酸の遺伝を追跡するため、目的の核酸を受け継いだ細胞もしくは生物を同定するため、かつ／又は遺伝子発現誘導もしくは転写を測定するために使用される。当該分野において公知でありかつ使用されるレポーター遺伝子の例としては：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などが挙げられる。選択可能マーカー遺伝子もまたレポーター遺伝子とみなされ得る。
【0072】
「プロモーター」及び「プロモーター配列」は交換可能に使用され、そしてコード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、それら全体として、天然遺伝子由来であっても、天然に見出されるプロモーター由来の様々なエレメントから構成されていてもよく、合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型における遺伝子発現、又は異なる発生段階での遺伝子発現、又は異なる環境もしくは生理的条件に応じた遺伝子発現を方向づけることができるということは、当業者に理解される。大部分の細胞型において大抵の場合に遺伝子を発現させるプロモーターは、一般には「構成的プロモーター」と呼ばれる。特定の細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「細胞特異的プロモーター」又は「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。発生又は細胞分化の特定の段階で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に「発生特異的プロモーター」又は「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。誘導され、そして薬剤、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などを用いた細胞の曝露又は処理の後に遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「誘導性プロモーター」又は「調節可能プロモーター」呼ばれる。大抵の場合に、制御配列の正確な境界は完全に定義されていないので、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有することができるということがさらに認められている。
【0073】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞中への挿入後に、挿入された核酸配列の発現を可能にするよう設計された媒介物を指す。挿入された核酸配列は、上記のような調節領域と作動可能に結合して配置される。
【0074】
当該分野で周知の方法、例えば、トランスフェクション、電気穿孔法、微量注入法、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション法（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、又はＤＮＡベクター輸送体により、ベクターが宿主細胞中に導入される。本明細書において使用されるように、「培養する」、「培養すること」及び「培養」は、細胞増殖もしくは分化を可能にするインビトロ条件下で細胞をインキュベートすること、又は細胞を生存状態で維持することを意味する。本明細書において使用されるような「培養された細胞」は、インビトロで増殖された細胞を意味する。
【0075】
本明細書において使用されるように、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」だけでなく複数の「ポリペプチド」も包含することを意図され、そしてアミド結合（ペプチド結合としても知られる）により線状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ又はそれ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、そして特定の長さの産物を指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」又は２つもしくはそれ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される他の用語はいずれも、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、そして用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、又はこれらの用語のいずれとも交換可能に使用され得る。用語「ポリペプチド」はまた、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことを意図され、この発現後修飾としては、限定することなく、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、又は天然に存在しないアミノ酸による改変が挙げられる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源由来でも、組み換え技術により生成されてもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。これは化学合成によるものを含めて任意の方法で生成され得る。
【0076】
本明細書において使用される用語「連結される」は、それぞれ第二のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列に共有結合で又は非共有結合で結合された第一のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を指す。第一のアミノ酸又はヌクレオチド配列は、第二のアミノ酸又はヌクレオチド配列に直接結合されても並置されてもよく、またあるいは、介在する配列が第一の配列を第二の配列に共有結合で結合してもよい。用語「連結された」は、Ｃ末端又はＮ末端での第一のアミノ酸配列の第二のアミノ酸配列への融合だけではなく、第二のアミノ酸配列（又はそれぞれ第一のアミノ酸配列）中のいずれか２つのアミノ酸中への第一のアミノ酸配列（又は第二のアミノ酸配列）全体の挿入も含む。一実施形態において、第一のアミノ酸配列は、ペプチド結合又はリンカーにより第二のアミノ酸配列に連結され得る。第一のヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合又はリンカーにより第二のヌクレオチド配列に連結され得る。リンカーは、ペプチドもしくはポリペプチドで（ポリペプチド鎖について）、又はヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖（ヌクレオチド鎖について）でも、任意の化学部分（ポリペプチド及びポリヌクレオチド鎖の両方について）でもよい。用語「連結される」はハイフン（－）でも示される。
【0077】
本明細書において使用されるように、用語「治療的タンパク質」は、対象に投与することができる当該分野で公知の任意のポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、治療的タンパク質は、凝固因子、増殖因子、抗体、それらの機能性フラグメント、又はそれらの組み合わせから選択されるタンパク質を含む。
【0078】
本明細書において使用されるように、用語「異種」又は「外来」は、例えば細胞又はポリペプチドにおいて通常は所定の条件で見出されないような分子を指す。例えば、外来又は異種分子は細胞中に導入され得、そして例えば、トランスフェクション又は遺伝子操作の他の形態による細胞の操作の後にしか存在せず、又は異種アミノ酸配列は、天然ではそのタンパク質中で見出されないタンパク質中に存在し得る。
【0079】
本明細書において使用されるように、用語「遺伝子編集」は、ポリヌクレオチド又は核酸の発現を改変するように編集されたそのポリヌクレオチド又は核酸を指す。ポリヌクレオチド又は核酸はタンパク質をコードし得る。遺伝子編集は、ゲノムの特定の遺伝子もしくは遺伝子座又はバキュロウイルス発現ベクターのような異種核酸を標的にし得る。
【0080】
用語「バクミド」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び昆虫細胞において増殖され得るシャトルベクターを指す。ゲノム編集されたバクミドは、不活化又は減弱化されたカプシド遺伝子を有するバクミドである。
【0081】
ゲノム編集されたバクミド
特定の局面において、本開示は、バキュロウイルス（ＢＶ）複製のために必須であるバキュロウイルス遺伝子の減弱化又は不活化された発現に起因して、複製をする能力がないか又は減少した複製を示す変異組み換えバクミドを提供する。例えば、本開示の組み換えバクミドは、野生型（ＷＴ）バキュロウイルスゲノムの一部を含むが、バキュロウイルス複製に必須の少なくとも１つのバキュロウイルス遺伝子を欠失している。ＢＶ複製のために必須の遺伝子はゲノムに存在しないか又はその発現が防止されるかもしくは減弱化され得る。特定の実施形態において、遺伝子は、例えば欠失もしくは短縮されるか又は別の方法で不活化されることにより変異している。
特定の局面において、本開示は、バキュロウイルス（ＢＶ）複製のために必須であるバキュロウイルス遺伝子の減弱化又は不活化された発現に起因して、複製をする能力がないか又は減少した複製を示す変異組み換えバクミドを提供する。例えば、本開示の組み換えバクミドは、野生型（ＷＴ）バキュロウイルスゲノムの一部を含むが、バキュロウイルス複製に必須の少なくとも１つのバキュロウイルス遺伝子を欠失している。ＢＶ複製のために必須の遺伝子はゲノムに存在しないか又はその発現が防止されるかもしくは減弱化され得る。特定の実施形態において、遺伝子は、例えば欠失もしくは短縮されるか又は別の方法で不活化されることにより変異している。
【0082】
特定の実施形態において、本開示の組み換えバクミドは、バキュロウイルスの複製に必要な少なくとも１つのバキュロウイルス遺伝子が、ゲノム編集により不活化されるか又は減弱されたＤＮＡ骨格を含む。他の実施形態において、バキュロウイルス遺伝子は、バクミド上に供給される発現制御システムにより又はバキュロウイルスに感染した宿主細胞（例えば、昆虫細胞）中で減少する。
【0083】
タンパク質及び生物学的製剤の組み換え発現のために一般的に使用されるバキュロウイルス由来の任意のゲノムは、ゲノム編集され得る。例えば、バキュロウイルスゲノムは、例えば、ＡｃＭＮＰＶ、ＢｍＮＰＶ、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）（ＨｅａｒＮＰＶ）又はシロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）ＭＮＰＶ、好ましくはＡｃＭＮＰＶ又はＢｍＮＰＶに由来し得る。特に、バキュロウイルスゲノムは、ＡｃＭＮＰＶクローンＣ６（ゲノム配列：Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＮＣ＿００１６２３．１）由来であり得る。特定の実施形態において、ゲノム編集された骨格は、ＷＴバキュロウイルスゲノム（ＡｃＭＮＰＶ （ＮＣ＿００１６２３）を含むバクミドから、ＷＴバキュロウイルスゲノム中のバキュロウイルス複製に必要な必須遺伝子を編集することにより作製され得る。
【0084】
特定の実施形態において、バキュロウイルス遺伝子は、バキュロウイルスビリオン集合に必須の遺伝子である。特定の実施形態において、この遺伝子の欠損又は不活化は、ＢＶ感染細胞から産生されたＢＶビリオンに悪影響を与える。特定の実施形態において、本開示のバクミドは、以下のタンパク質のいずれかをコードする不活化又は減弱化されたバキュロウイルス遺伝子を含む：Ａｃ１００（Ｐ６．９ ＤＮＡ結合タンパク質）；ＡＣ８９（ＶＰ３９カプシド）；Ａｃ８０（Ｇｐ４１外被）、Ａｃ１４２、Ａｃ１４４、Ａｃ６６、Ａｃ９２（Ｐ３３）、ｐ６．９、Ａｃ５４（ＶＰ１０５４）、Ａｃ７７（ＶＬＦ－１）、Ａｃ１０４（ＶＰ８０）、及びＡｃ９（ＰＰ７８／８３）。特定の例となる実施形態において、標的にしようとするバキュロウイルス遺伝子はＶＰ８０である。
【0085】
特定の実施形態において、バキュロウイルス遺伝子は、機能性の必須遺伝子産物の完全な不在をもたらす上記遺伝子の改変を導入することにより不活化され得る。したがって、上記変異は、必須遺伝子から転写されたｍＲＮＡのオープンリーディングフレームにおける１つ又は数個の終結コドンの導入をもたらし得るか、又は必須遺伝子の完全な又は部分的な欠失に対応し得る。あるいは、遺伝子は、野生型遺伝子の全て又は一部の配列におけるヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失を用いて変異され得る。この変異は、遺伝子の完全な欠失、又は上記遺伝子の一部のみに対応し得る。例えば、遺伝子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％を欠失してもよい。特定の実施形態において、変異バキュロウイルスゲノムは、部位特異的変異誘発により製造され得る。
【0086】
特定の実施形態において、編集された遺伝子は、ＷＴバキュロウイルス遺伝子のリーディングフレームを破壊する異種配列の「ノックイン」により生成され得る。例えば、２つのフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）と隣接している選択マーカー発現カセット（ＦＲＴ）をＰＣＲ増幅することができ、カプシド遺伝子中に組み換えて、ラムダレッドシステムを介してカプシドを破壊することができる。バクミドＤＮＡの選択及び欠失の確認の後に、選択マーカー発現カセットを、ＦＬＰ－ＦＲＴ組み換え技術を用いて除去し、バクミド中に１つのＦＲＴ部位のみを残すことができる。
【0087】
いくつかの実施形態において、編集されたカプシド配列は、遺伝子制御システムを用いて生成される。本明細書において、用語「遺伝子制御システム」は、標的ＤＮＡ配列を改変することができ、それによりコードされる遺伝子産物の発現又は機能を調節するタンパク質、核酸、又はそれらの組み合わせを指す。本発明の方法における使用に適した多数の遺伝子制御システムが当該分野で公知であり、これらとしては、限定されないが、亜鉛フィンガーヌクレアーゼシステム、ＴＡＬＥＮシステム、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが挙げられる。本明細書において使用されるように、遺伝子制御システムの標的遺伝子に対する効果に関連して使用される場合の「調節する」は、内在性標的遺伝子の配列における任意の変化、及び／又は内在性標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現もしくは機能の任意の変化を包含する。
【0088】
いくつかの実施形態において、遺伝子制御システムは、例えば、１つ又はそれ以上の核酸の挿入及び／又は欠失によるような、遺伝子へ１つ又はそれ以上の変異を導入することにより、バキュロウイルス遺伝子の配列における変化を媒介し得る。カプシド遺伝子の変更を媒介することができる例となる機序としては、限定されないが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）（例えば、古典的又は代替）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、相同配列指向性修復（例えば、内在性ドナーテンプレート媒介）、ＳＤＳＡ（合成依存的鎖対合）、一本鎖アニーリング又は一本鎖侵入が挙げられる。
【0089】
いくつかの実施形態において、遺伝子制御システムは、バキュロウイルスカプシド遺伝子によりコードされるタンパク質の発現における変化を媒介し得る。このような実施形態において、遺伝子制御システムは、ＤＮＡ配列の改変により、又はＤＮＡ配列によりコードされるｍＲＮＡ産物に対して作用することにより、コードされるカプシド遺伝子の発現を調節し得る。いくつかの実施形態において、遺伝子制御システムは、改変されたバキュロウイルス遺伝子の発現をもたらし得る。いくつかの実施形態において、改変バキュロウイルス遺伝子の発現レベルは、未改変バキュロウイルス遺伝子の発現レベルと比較して減少し得る。
【0090】
いくつかの実施形態において、遺伝子制御システムは、核酸ベースの遺伝子制御システムである。本明細書において、核酸ベースの遺伝子制御システムは、外来タンパク質を必要とすることなく、バキュロウイルス遺伝子の発現を調節することができる１つ又はそれ以上の核酸分子を含むシステムである。
【0091】
いくつかの実施形態において、遺伝子制御システムは、タンパク質ベースの遺伝子制御システムである。本明細書において、タンパク質ベースの遺伝子制御システムは、核酸ガイド分子を必要とすることなく、配列特異的なやり方でバキュロウイルス遺伝子の発現を調節することができる１つ又はそれ以上のタンパク質を含むシステムである。
【0092】
いくつかの実施形態において、タンパク質ベースの遺伝子制御システムは、１つ又はそれ以上の亜鉛フィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。亜鉛フィンガー結合ドメインは、最適な配列に結合するように操作され得る。例えば、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１；Ｐａｂｏら（２００１） Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０；Ｉｓａｌａｎら（２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０；Ｓｅｇａｌら（２００１） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７；Ｃｈｏｏら（２０００） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６を参照のこと。
【0093】
いくつかの実施形態において、タンパク質ベースの遺伝子制御システムは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。このような実施形態は本明細書において「ＴＡＬＥＮ」と呼ばれる。ＴＡＬＥＮベースのシステムは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。これらは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）を融合することにより製造される。上に記載されるＦｏｋＩ制限酵素は、ＴＡＬＥＮベースの遺伝子制御システムにおける使用に適した例となる酵素ドメインである。
【0094】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼシステムが、カプシド遺伝子を編集するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（「Ｃａｓ」エンドヌクレアーゼ）及び核酸ガイド分子（例えば、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ）が使用される。Ｃａｓポリペプチドは、核酸ガイド分子と相互作用することができ、かつ核酸ガイド分子と協調して、標的ＤＮＡに誘導されるか又は局在化するポリペプチドを指し、そしてこれには、天然に存在するＣａｓタンパク質、及び天然に存在するＣａｓ配列とは１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が異なる操作、変更、又はその他の方法で改変されたＣａｓタンパク質が含まれる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｓ９は、ＤＮＡの標的鎖を切断するためにＨＮＨヌクレアーゼドメイン、そして非標的鎖を切断するためにＲｕｖＣ様ドメインを使用するマルチドメイン酵素である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡを切断することができない酵素的に不活性な変異体（例えば、ｄＣａｓ９）へのＷＴ Ｃａｓ９の変換を可能にする選択可能ドメイン不活化、又は標的もしくは非標的鎖の１つもしくは他方を切断することにより一本鎖ＤＮＡ中断を生成することができるニッカーゼ変異体により、Ｃａｓ９の変異体を生成することができる。標的改変部位の正確な位置は、（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡ配列との間の塩基対合相補性；及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ配列中の、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの位置の両方により決定される。ＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡ配列に対するＣａｓ結合に必要である。様々なＰＡＭ配列が当該分野で公知であり、そして特定のＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）との使用に適しており、当該分野で公知である（例えば、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｎｏｖ；１０（１１）：１１１６-１１２１及びＳｃｉ Ｒｅｐ．２０１４；４：５４０５を参照のこと）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質又はＣａｓ９オルソログであり、そしてＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ４、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ、ＦｎＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９、及びＮｍｅＣａｓ９からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１ （Ｃａｓ１２ａとも呼ばれる）、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎｌ及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、及びＣｓｆ４からなる群から選択される。さらなるＣａｓ９オルソログは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ２０１５／０７１４７４号に記載される。
【0095】
本開示に従う例となるゲノム編集されたバキュロウイルスＤＮＡ骨格は、ＶＰ８０遺伝子座における挿入及び／又は欠失に起因して不活化されたＶＰ８０を含む（図２～４を参照のこと）。特定の実施形態において、ＶＰ８０遺伝子座における挿入及び／又は欠失に起因して不活化されたＶＰ８０遺伝子は、ＶＰ８０遺伝子座を標的とする１つ又はそれ以上のｇＲＮＡにより媒介される。特定の実施形態において、ＶＰ８０遺伝子座における挿入及び／又は欠失に起因して不活化されたＶＰ８０は、配列ＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＴ（配列番号９）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を含むｇＲＮＡにより媒介される。特定の実施形態において、ＶＰ８０遺伝子座における挿入及び／又は欠失に起因して不活化されたＶＰ８０は、配列ＧＡＣＧＴＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧＡＴ（配列番号１０）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を含むｇＲＮＡにより媒介される。
【0096】
特定の例となる実施形態において、本開示に従うゲノム編集されたバキュロウイルスＤＮＡ骨格は、配列番号９又は配列番号１０に示される配列を含む、ＶＰ８０遺伝子座における挿入及び／又は欠失に起因して不活化されたＶＰ８０遺伝子を含む。特定の例となる実施形態において、本開示に従うゲノム編集されたバキュロウイルスＤＮＡ骨格は、配列番号９又は配列番号１０に示される配列を含む、ゲノム配列における挿入及び／又は欠失に起因して不活化されたＶＰ８０遺伝子を含む。特定の例となる実施形態において、本開示に従うゲノム編集されたバキュロウイルスＤＮＡ骨格は、配列番号９又は配列番号１０において示される配列からなる、ゲノム配列における挿入及び／又は欠失に起因して不活化されたＶＰ８０遺伝子を含む。
【0097】
特定の実施形態において、本開示の組み換えバクミドは、発現カセット（例えば、ｃｅＤＮＡベクターテンプレート）の骨格中への組み込みを可能にする少なくとも１つ組み込み部位（例えば、ｍｉｎｉ－ａｔｔ Ｔｎ７部位）をさらに含む。特定の実施形態において、組み換えバクミドは、「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」と表題をつけられた米国特許出願第６３／０６９，０７３号（これは参照により本明細書に加入される）に記載されるような「ＢＩＶＶＢａｃ」である。特定の実施形態において、これは、少なくとも２つの組み込み部位を含み、そして生成されるために必要なバキュロウイルス発現ベクターの総数の減少を可能にする。特定の実施形態において、バクミドは、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ媒介組み換えによるさらなる遺伝子の組み込みのためのｌｏｘＰ部位をさらに含む。
【0098】
特定の実施形態において、組み換えバクミドはＲｅｐ遺伝子（例えば、Ｂ１９ Ｒｅｐ遺伝子）を含む。特定の実施形態において、Ｒｅｐ遺伝子は、対称又は非対称のＡＡＶ又は非ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）と隣接している異種核酸セグメント（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の複製を促進するために発現される。
【0099】
組み換えバクミドは、細菌細胞（例えば、大腸菌）及び昆虫細胞の両方において増殖されるその能力に必要な他のエレメントをさらに含み得る。特定の実施形態において、組み換えバクミドは、細菌複製起点又は細菌レプリコンを含む。様々な細菌レプリコンが当業者に公知であり、そしてこれらとしては、例えば、Ｆプラスミド由来起源のレプリコンが挙げられる。特定の実施形態において、適切な細菌レプリコンはミニ－Ｆレプリコンであり、これは複製及び調節に必要とされるＤＮＡ領域ｏｒｉＳ及びｉｎｃＣから構成されるＦプラスミドの誘導体である。特定の実施形態において、細菌レプリコンは、低コピー数レプリコンである。特定の実施形態において、低コピー数レプリコンはミニ－Ｆレプリコンである。
【0100】
本開示の組み換えバクミドの他のエレメントとしては、１つ又はそれ以上の選択可能マーカー配列、及び他のレポーター遺伝子が挙げられる。当該分野で公知でありかつ使用される選択可能マーカー遺伝子の例としては：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する耐性を与える遺伝子；及び表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。特定の実施形態において、組み換えバクミドは、抗生物質耐性遺伝子を含む選択可能マーカー配列を含む。特定の実施形態において、抗生物質耐性遺伝子はカナマイシン耐性遺伝子であり、カナマイシンに対する耐性を付与する。当該分野で公知でありかつ使用されるレポーターの例としては：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などが挙げられる。いくつかの場合、選択可能マーカーはレポーターであるともみなされる。特定の実施形態において、組み換えバクミドは、蛍光性タンパク質をコードするレポーター遺伝子を含む。特定の実施形態において、蛍光性タンパク質は赤色蛍光タンパク質である。
【0101】
当業者は、本明細書に記載される組み換えバクミドの様々なエレメントが互いに作動可能に連結していることを認識するだろう。バクミド中の様々なコード配列の各々は、例えばプロモーター配列を含む調節領域と作動可能に連結し得る。当該分野で公知のいずれのプロモーター配列も適切であり得る。特定の実施形態において、プロモーターはバキュロウイルス誘導性プロモーターである。
【0102】
ゲノム編集された組み換えバキュロウイルス発現ベクター（ｒＢＥＶ）
特定の実施形態において、本開示は、外来配列（例えば、異種ＤＮＡ配列）が、上記のゲノム編集されたバクミドの組み込み部位の１つ又はそれ以上に組み込まれている、ゲノム編集された組み換えバキュロウイルス発現ベクター（ｒＢＥＶ）を提供する。特定の実施形態において、外来配列は、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ組み換えを介してバクミドのＬｏｘ Ｐ部位に導入される。他の実施形態間で、外来配列は、Ｔｎ７媒介転位を介してバクミド中に挿入される。本開示のゲノム編集されたｒＢＥＶを生成するために、任意の外来配列（減弱化又は不活化されたバキュロウイルス遺伝子の機能的カウンターパート以外）を、ゲノム編集されたバクミド中に導入することができる。特定の実施形態において、組み換えバキュロウイルス発現ベクターは、以下に記載されるｃｅＤＮＡ発現カセットの１つ又はそれ以上を含む。
特定の実施形態において、本開示は、外来配列（例えば、異種ＤＮＡ配列）が、上記のゲノム編集されたバクミドの組み込み部位の１つ又はそれ以上に組み込まれている、ゲノム編集された組み換えバキュロウイルス発現ベクター（ｒＢＥＶ）を提供する。特定の実施形態において、外来配列は、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ組み換えを介してバクミドのＬｏｘ Ｐ部位に導入される。他の実施形態間で、外来配列は、Ｔｎ７媒介転位を介してバクミド中に挿入される。本開示のゲノム編集されたｒＢＥＶを生成するために、任意の外来配列（減弱化又は不活化されたバキュロウイルス遺伝子の機能的カウンターパート以外）を、ゲノム編集されたバクミド中に導入することができる。特定の実施形態において、組み換えバキュロウイルス発現ベクターは、以下に記載されるｃｅＤＮＡ発現カセットの１つ又はそれ以上を含む。
【0103】
特定の実施形態において、外来配列を含む組み換えバキュロウイルス発現ベクターは、細菌レプリコン、第一の選択可能マーカー配列、第一のレポーター遺伝子に挿入された外来配列（例えば、異種配列）、［ここで、挿入された外来配列は、第一のレポーター遺伝子のリーディングフレームを破壊する］、バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された第二のレポーター遺伝子を含む。
【0104】
特定の実施形態において、ｒＢＥＶは、１つのＡＡＶ又は非ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｂ１９ Ｒｅｐ）を含む。特定の実施形態において、ｒＢＥＶは：ミニ－Ｆレプリコン；第一の抗生物質耐性遺伝子；ＬａｃＺα又はその機能性部分に挿入されたＲｅｐ（例えば、Ｂ１９ Ｒｅｐ）をコードする配列、［ここで、挿入されたＢ１９ Ｒｅｐは、ＬａｃＺα又はその機能性部分のリーディングフレームを破壊する］；バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【0105】
特定の実施形態において、ｒＢＥＶは：ミニ－Ｆレプリコン；第一の抗生物質耐性遺伝子；ＬａｃＺα又はその機能性部分に挿入されたＧＰＶ Ｒｅｐをコードする配列、［ここで、挿入されたＧＰＶ Ｒｅｐは、ＬａｃＺα又はその機能性部分のリーディングフレームを破壊する］；及びバキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。特定の実施形態において、組み換えバクミドは：ミニ－Ｆレプリコン；第一の抗生物質耐性遺伝子；ＬａｃＺα又はその機能性部分に挿入されたＡＡＶ２ Ｒｅｐをコードする配列、［ここで、挿入されたＡＡＶ２ Ｒｅｐは、ＬａｃＺα又はその機能性部分のリーディングフレームを破壊する］；及びバキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【0106】
特定の例となる実施形態において、遺伝子治療ベクターを製造する目的のために、ｒＢＥＶは、対称又は非対称のＡＡＶ又は非ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）と隣接している導入遺伝子を含む。特定の実施形態において、組み換えバクミドは：ミニ－Ｆレプリコン；抗生物質耐性遺伝子；ＬａｃＺα又はその機能性部分；対称又は非対称のＡＡＶ又は非ＡＡＶ ＩＴＲと隣接している導入遺伝子を含む。
【0107】
特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターを製造する目的のために、ｒＢＥＶは：ＬａｃＺα又はその機能性部分に挿入されたＢ１９ Ｒｅｐをコードする配列、［ここで、挿入されたＢ１９ Ｒｅｐは、ＬａｃＺα又はその機能性部分のリーディングフレームを破壊する］；及び異種配列を含む多重クローニング部位、［ここで、異種配列は５’から３’へ：パルボウイルスＢ１９由来の野生型又は短縮型５’末端逆位配列；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つ又はそれ以上の発現制御配列；及びパルボウイルスＢ１９由来の野生型又は短縮型３’末端逆位配列を含む］を含む。
【0108】
他の実施形態において、遺伝子治療ベクターを製造する目的のために、ｒＢＥＶは：ＬａｃＺα又はその機能性部分に挿入されたＧＰＶ Ｒｅｐをコードする配列、［ここで、挿入されたＧＰＶ Ｒｅｐは、ＬａｃＺα又はその機能性部分のリーディングフレームを破壊する］；及び異種配列を含む多重クローニング部位、［ここで、異種配列は、５’から３’へ：ＧＰＶ由来の野生型又は短縮型５’末端逆位配列；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つ又はそれ以上の発現制御配列；及びＧＰＶ由来の野生型又は短縮型３’末端逆位配列を含む］を含む。
【0109】
他の実施形態において、遺伝子治療ベクターを製造する目的のために、ｒＢＥＶは：ＬａｃＺα又はその機能性部分に挿入されたＡＡＶ２ Ｒｅｐをコードする配列、［ここで、挿入されたＡＡＶ２ Ｒｅｐは、ＬａｃＺα又はその機能性部分のリーディングフレームを破壊する］；及び異種配列を含む多重クローニング部位、［ここで、異種配列は、５’から３’へ：ＡＡＶ２由来の野生型又は短縮型５’末端逆位配列；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つ又はそれ以上の発現制御配列；及びＡＡＶ２由来の野生型又は短縮型３’末端逆位配列を含む］を含む。
【0110】
機能性遺伝子をトランスに供給すること
上記の改変バクミド又はｒＢＥＶの複製を修復又は「レスキュー」するために、本開示は、上記の組み換えバクミド又はバキュロウイルス発現ベクター、及び組み換えバクミド又はｒＢＥＶ発現ベクターの不活化又は減弱化された遺伝子（例えば、不活化されたカプシド遺伝子）を補完する機能性タンパク質（例えば、機能性カプシドタンパク質）を含むバキュロウイルス発現系を提供する。
上記の改変バクミド又はｒＢＥＶの複製を修復又は「レスキュー」するために、本開示は、上記の組み換えバクミド又はバキュロウイルス発現ベクター、及び組み換えバクミド又はｒＢＥＶ発現ベクターの不活化又は減弱化された遺伝子（例えば、不活化されたカプシド遺伝子）を補完する機能性タンパク質（例えば、機能性カプシドタンパク質）を含むバキュロウイルス発現系を提供する。
【0111】
従って、特定の実施形態において、機能性遺伝子（例えば、機能性カプシド遺伝子）は、組み換えバクミド又はバキュロウイルス発現ベクターに対してトランスに供給される。特定の実施形態において、機能性遺伝子は宿主細胞により発現され得る。従って、特定の実施形態において、本開示は、その遺伝子を補完するコピーをトランスに発現することにより欠失したバキュロウイルス遺伝子をレスキューする能力を有する宿主昆虫細胞を提供する。特定の実施形態において、本開示は、バキュロウイルスにおいて欠損している適切なバキュロウイルスビリオン集合体に必須の少なくとも１つの遺伝子を補完するコピーを発現する昆虫細胞を提供する。例えば、特定の実施形態において、本開示は、バキュロウイルスビリオンの適切な集合体が確立され得るように機能性遺伝子の産物を構成的に産生するＳｆ９由来細胞株を提供する。この組み換え細胞株は、バキュロウイルスシードストックの製造に使用されるが、Ｓｆ９、Ｓｆ２１又はＨｉｇｈ－ｆｉｖｅ細胞株のような従来の昆虫細胞株を、核酸分子（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の異種発現のために産生されたバキュロウイルスに感染させることができる。従って、本発明のバキュロウイルス発現系はまた、適切なバキュロウイルス集合体に必須のバキュロウイルス遺伝子の機能性カウンターパートを発現するように改変された昆虫細胞に関し、ここで機能性遺伝子のカウンターパートは、バクミド又はバキュロウイルス発現ベクターにおいて不活化されている。
【0112】
特定の実施形態において、バキュロウイルスの製造のために使用される昆虫細胞は、適切なバキュロウイルスビリオン集合体に必須の遺伝子の機能性カウンターパートをコードする発現カセットを用いたトランスフェクションにより改変される。一実施形態において、上記発現カセットは、上記細胞のゲノムに組み込まれる。発現カセットを含む少なくとも１つのプラスミドを用いて一過性にトランスフェクトされた昆虫細胞を使用してもよい。このような発現カセットは、選択された昆虫細胞において機能性のプロモーターの制御下に置かれた適切なバキュロウイルスビリオン集合体に必須の遺伝子のＯＲＦを含むプラスミドであり得、そして適切なバキュロウイルスビリオン集合体が補完されるために必須の遺伝子以外のバキュロウイルスゲノム配列を含有せず、そして場合により、プロモーター配列は上記遺伝子の発現を可能にする（特に、発現カセットはバクミドでも他のバキュロウイルスゲノム全体のいずれでもない）。例となる発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、インスレーターなどの中から選択され得る。一実施形態において、補完遺伝子は、適切なバキュロウイルスビリオン集合体に必須の遺伝子を欠損させたバキュロウイルスのゲノムに由来する。別の実施形態において、補完遺伝子は、異なるバキュロウイルス種のゲノムを起源とする。
【0113】
さらに別の実施形態において、適切なバキュロウイルスビリオン集合体に必須の遺伝子の機能性カウンターパートは、誘導性プロモーターの制御下に置かれ、制御された条件下での上記遺伝子の発現又は抑圧のいずれかを可能にする。特定の実施形態において、誘導性プロモーターはバキュロウイルス誘導性プロモーターである。特定の実施形態において、誘導性プロモーターは、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）３９Ｋプロモーターである。特定の実施形態において、昆虫細胞は、組み換えバクミド又はｒＢＥＶにおいて欠損したバキュロウイルスビリオン集合体に必須の遺伝子の機能性カウンターパートをコードする発現カセットを含む。
【0114】
ｃｅＤＮＡ発現カセット
特定の実施形態において、本明細書において記載されるバキュロウイルス発現ベクター系を、遺伝子治療のために有用なプラスミド様カプシド非含有核酸分子の製造に使用することができる。従って、特定の実施形態において、本開示のバキュロウイルス発現ベクターは、１つ又はそれ以上の共有結合で結合された閉じた末端を有する非ウイルス性カプシド非含有ＤＮＡベクター（本明細書では「閉端ＤＮＡベクター」又は「ｃｅＤＮＡベクター」と呼ばれる、「閉端線状二本鎖ＤＮＡベクター」又は「ＣＥＬｉＤ ＤＮＡベクター」としても知られる）である異種核酸分子のためのテンプレートＤＮＡを含む。ｃｅＤＮＡベクターは、それを必要とする対象の送達のための導入遺伝子をさらに含み得る。
特定の実施形態において、本明細書において記載されるバキュロウイルス発現ベクター系を、遺伝子治療のために有用なプラスミド様カプシド非含有核酸分子の製造に使用することができる。従って、特定の実施形態において、本開示のバキュロウイルス発現ベクターは、１つ又はそれ以上の共有結合で結合された閉じた末端を有する非ウイルス性カプシド非含有ＤＮＡベクター（本明細書では「閉端ＤＮＡベクター」又は「ｃｅＤＮＡベクター」と呼ばれる、「閉端線状二本鎖ＤＮＡベクター」又は「ＣＥＬｉＤ ＤＮＡベクター」としても知られる）である異種核酸分子のためのテンプレートＤＮＡを含む。ｃｅＤＮＡベクターは、それを必要とする対象の送達のための導入遺伝子をさらに含み得る。
【0115】
特定の実施形態において、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）間に作動可能に位置づけられた異種核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから入手可能である。特定の実施形態において、ｃｅＤＮＡベクターは、５’逆医末端配列（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲ配列を含む、共有結合で閉じられた末端を有する相補的ＤＮＡの連続した鎖から形成される（線状、連続的及び非カプシド形成構造）。特定の実施形態において、ＩＴＲは互いに関して対称的であり得る。他の実施形態において、ＩＴＲは、互いに関して異なるか又は非対称であり得る。特定の実施形態において、ＩＴＲの少なくとも１つは、末端分離部位及び複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）（複製的タンパク質結合部位と呼ばれることもある）、例えば、Ｒｅｐ結合部位を含み、そしてＩＴＲの１つは、他方のＩＴＲに関して欠失、挿入、又は置換を含む。特定の実施形態において、ＩＴＲの少なくとも１つはＡＡＶ ＩＴＲ、例えば、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ又は改変ＡＡＶ ＩＴＲである。特定の実施形態において、ＩＴＲの少なくとも１つは非ＡＡＶ ＩＴＲ、例えば、野生型非ＡＡＶ ＩＴＲ又は改変非ＡＡＶ ＩＴＲである。他の実施形態において、ＩＴＲの少なくとも１つは、他方のＩＴＲと比較して改変されたＩＴＲである。一実施形態において、ＩＴＲの少なくとも１つは非機能性ＩＴＲである。いくつかの実施形態において、ＩＴＲの１つは、野生型ＩＴＲ配列と比較して欠失、挿入及び／又は置換により改変されており；そしてＩＴＲの少なくとも１つは、機能性末端分離部位（ｔｒｓ）及びＲｅｐ結合部位を含む。
【0116】
特定の実施形態において、本開示は、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、及び異種ポリヌクレオチド配列、例えば導入遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含むｃｅＤＮＡベクターテンプレートに関する。いくつかの実施形態において、第一のＩＴＲ及び第二のＩＴＲは、遺伝子発現カセットと隣接している。いくつかの実施形態において、発現カセットは、シス－調節エレメント、プロモーター及び少なくとも１つの導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、カプシドタンパク質、複製タンパク質、及び／又は集合体タンパク質をコードする遺伝子を含まない。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは、治療的タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、治療的タンパク質は凝固因子を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットはｍｉＲＮＡをコードする。特定の実施形態において、遺伝子カセットは、第一のＩＴＲと第二のＩＴＲとの間に位置づけられる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、１つ又はそれ以上の非コード領域をさらに含む。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の非コード領域は、プロモーター配列、イントロン、転写後調節エレメント、３’ＵＴＲポリ（Ａ）配列、又はそれらの任意の組み合わせを含む。一実施形態において、発現カセットは一本鎖核酸である。別の実施形態において、遺伝子カセットは二本鎖核酸である。
【0117】
特定の実施形態において、ｃｅＤＮＡベクターをコードするテンプレートは、５’から３’の方向に：第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット又は導入遺伝子）及び第二のＩＴＲを含み、ここで第一のＩＴＲ及び第二のＩＴＲは互いに関して非対称であり、 － すなわち、これらは互いに異なる。例となる実施形態として、第一のＩＴＲは野生型ＩＴＲであり得、かつ第二のＩＴＲは変異又は改変されたＩＴＲであり得る。いくつかの実施形態において、第一のＩＴＲは変異又は改変されたＩＴＲであり得、かつ第二のＩＴＲは野生型ＩＴＲであり得る。別の実施形態において、第一のＩＴＲ及び第二のＩＴＲは両方とも改変されているが、異なる配列であるか、又は異なる改変を有するか、又は同一の改変ＩＴＲではない。
【0118】
いくつかの実施形態において、導入遺伝子を有する発現カセットを含む本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター、これは、例えば、調節配列、核酸をコードする配列（例えば、ｍｉＲ又はアンチセンス配列）、又はポリペプチド（例えば、導入遺伝子）をコードする配列であり得る。一実施形態において、導入遺伝子は、治療的タンパク質をコードし、ここで治療的タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを含む。一実施形態において、導入遺伝子は、導入遺伝子の発現を可能にするか又は制御する１つ又はそれ以上の調節配列に作動可能に連結され得る。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、第一のＩＴＲ配列及び第二のＩＴＲ配列を含み、ここで目的のヌクレオチド配列は第一及び第二のＩＴＲ配列と隣接しており、そして第一及び第二のＩＴＲ配列は互いに関して非対称である。
【0119】
これらの局面の各々における一実施形態において、発現カセットは、以下の１つ又はそれ以上とともに以下の順序で含まれる２つのＩＴＲの間に位置する：導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター、転写後調節エレメント、並びにポリアデニル化及び終結シグナル。一実施形態において、プロモーターは、調節可能、誘導性又は抑制可能である。転写後調節エレメントは、導入遺伝子の発現を調節する配列であり、非限定的例として、導入遺伝子の発現を増強する三次構造を生じる任意の配列である。
【0120】
ｃｅＤＮＡ発現カセットは、４０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチドもしくは２０，０００ヌクレオチド、もしくは３０，０００ヌクレオチド、もしくは４０，０００ヌクレオチドもしくは５０，０００ヌクレオチドより多く、又は約４０００～１０，０００ヌクレオチドもしくは１０，０００～５０，０００ヌクレオチドの間の任意の範囲、又は５０，０００ヌクレオチドより多くを含み得る。いくつかの実施形態において、発現カセットは、５００～５０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子又は核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、発現カセットは、５００～７５，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子又は核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、発現カセットは、５００～１０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子又は核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、発現カセットは、１０００～１０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子又は核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、発現カセットは、５００～５，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子又は核酸を含み得る。
【0121】
いくつかの実施形態において、核酸分子は、治療的タンパク質をコードする発現カセットを含む。いくつかの実施形態において、治療的タンパク質は凝固因子を含む。いくつかの実施形態において、発現カセットはｍｉＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、発現カセットは少なくとも１つの非コード領域を含む。特定の実施形態において、非コード領域はプロモーター配列、イントロン、転写後調節エレメント、３’ＵＴＲポリ（Ａ）配列、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
【0122】
いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは、ｍＴＴＲプロモーターにより駆動されるコドン最適化されたＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍＴＴＲプロモーターは、配列番号１７の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットはＡ１ＭＢ２エンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、Ａ１ＭＢ２エンハンサーエレメントは、配列番号１６の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは、キメラ又は合成のイントロンをさらに含む。いくつかの実施形態において、キメライントロンは、ニワトリベータ－アクチン／ウサギベータ－グロビンイントロンからなり、そして偽翻訳開始を減らすために５つの既存のＡＴＧ配列を除去するように改変されている。いくつかの実施形態において、イントロン配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする核酸配列に対して５’に位置づけられる。いくつかの実施形態において、キメライントロンは、ｍＴＴＲプロモーターのようなプロモーター配列に対して５’に位置づけられる。いくつかの実施形態において、キメライントロンは配列番号１８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子セットは、マーモット転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＷＰＲＥは配列番号１９の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナルをさらに含む。いくつかの実施形態において、ｂＧＨｐＡシグナルは配列番号２０の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは、配列番号１４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。
【0123】
末端逆位配列
本明細書において開示されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）間に位置づけられた異種遺伝子を含有する。特定の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ又は非ＡＡＶ ＩＴＲである。特定の実施形態において、非ＡＡＶ ＩＴＲは、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーから得られたＩＴＲである。適切なＩＴＲ配列としては、当業者に公知のＡＡＶ血清型のＡＡＶ ＩＴＲが挙げられる。ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のための例となるＡＡＶ及び非ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＷＯ２０１９／０５１２５５、ＷＯ２０１９０３２８９８Ａ１、ＷＯ２０２００３３８６３Ａ１、及びＷＯ２０１７１５２１４９Ａ１、並びに米国特許出願第６３／０６９，１１４号に開示され、これらの開示はそれら全体として参照により本明細書に加入される。
本明細書において開示されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）間に位置づけられた異種遺伝子を含有する。特定の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ又は非ＡＡＶ ＩＴＲである。特定の実施形態において、非ＡＡＶ ＩＴＲは、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーから得られたＩＴＲである。適切なＩＴＲ配列としては、当業者に公知のＡＡＶ血清型のＡＡＶ ＩＴＲが挙げられる。ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のための例となるＡＡＶ及び非ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＷＯ２０１９／０５１２５５、ＷＯ２０１９０３２８９８Ａ１、ＷＯ２０２００３３８６３Ａ１、及びＷＯ２０１７１５２１４９Ａ１、並びに米国特許出願第６３／０６９，１１４号に開示され、これらの開示はそれら全体として参照により本明細書に加入される。
【0124】
本開示のｃｅＤＮＡベクターは、任意の公知のパルボウイルス、例えばＡＡＶのようなディペンドウイルス（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈｌＯ、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８ゲノム。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ ００２０７７；ＮＣ ００１４０１；ＮＣ００１７２９；ＮＣ００１８２９；ＮＣ００６１５２；ＮＣ ００６２６０；ＮＣ ００６２６１）、キメラＩＴＲ、又は任意の合成ＡＡＶからのＩＴＲからのＩＴＲ配列を使用し得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、温血動物、例えば、トリ（ＡＡＡＶ）、ウシ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルスに感染し得る。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは。Ｂ１９パルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：ＮＣ ０００８８３）、マウス由来の微小ウイルス（ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号 ＮＣ ００１５１０）；ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号 ＮＣ ００１７０１）；ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号 ＮＣ ００６１４８）に由来する。
【0125】
いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列はパルボウイルス科のウイルス由来であり得、これは２つの亜科を含む：脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）、及び昆虫に感染するデンソウイルス亜科（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ）。パルボウイルス亜科（パルボウイルスと呼ばれる）はディペンドウイルス属を含み、そのメンバーは、大部分の条件下で、増殖性感染のためにアデノウイルス又はヘルペスウイルスのようなヘルパーウイルスとの同時感染を必要とする。ディペンドウイルス属は、通常はヒト（例えば、血清型２、３Ａ、３Ｂ、５、及び６）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に感染するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及び他の温血動物に感染する関連ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ及びヒツジアデノ随伴ウイルス）を含む。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のメンバーは、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、ＦＩＥＬＤＳ ＶＩＲＯＬＯＧＹ ６９章（第３版１９９６年）に広く記載される。
【0126】
特定の実施形態において、ＩＴＲはパルボウイルス科ウイルスのメンバーから得られる。例えば、非ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）又はパルボウイルスＢ１９由来であり得る。いくつかの実施形態において、ＩＴＲはＡＡＶゲノム由来ではない。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは非ＡＡＶのＩＴＲである。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは、限定されないが、ボカウイルス、ディペンドウイルス、エリスロウイルス、アムドウイルス、パルボウイルス、デンソウイルス、イテラウイルス（Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ）、コントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）、アベパルボウイルス（Ａｖｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、コピパルボウイルス（Ｃｏｐｉｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、プロトパルボウイルス（Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、テトラパルボウイルス（Ｔｅｔｒａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、アンビデンソウイルス（Ａｍｂｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ブレビデンソウイルス（Ｂｒｅｖｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ヘパンデンソウイルス（Ｈｅｐａｎｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ペンスティルデンソウイルス（Ｐｅｎｓｔｙｌｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるパルボウイルス科ウイルス由来の非ＡＡＶゲノムのＩＴＲである。特定の実施形態において、ＩＴＲはエリスロウイルスパルボウイルスＢ１９（ヒトウイルス）に由来する。別の実施形態において、ＩＴＲはバリケン（Ｍｕｓｃｏｖｙ ｄｕｃｋ）パルボウイルス（ＭＤＰＶ）系統に由来する。特定の実施形態において、ＭＤＰＶ系統は弱毒化されている、例えば、ＭＤＰＶ系統ＦＺ９１－３０。他の実施形態において、ＭＤＰＶ系統は病原性である、例えば、ＭＤＰＶ系統ＹＹ。いくつかの実施形態において、ＩＴＲはブタパルボウイルス、例えば、ブタパルボウイルスＵ４４９７８に由来する。いくつかの実施形態において、ＩＴＲはマウス微小ウイルス、例えばマウス微小ウイルスＵ３４２５６に由来する。いくつかの実施形態において、ＩＴＲはイヌパルボウイルス、例えばイヌパルボウイルスＭ１９２９６に由来する。いくつかの実施形態において、ＩＴＲはミンク腸炎ウイルス、例えば、ミンク腸炎ウイルスＤ００７６５に由来する。いくつかの実施形態において、ＩＴＲはディペンドパルボウイルスに由来する。一実施形態において、ディペンドパルボウイルスは、ディペンドウイルス ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）系統である。特定の実施形態において、ＧＰＶ系統は減弱化されている、例えば、ＧＰＶ系統８２－０３２１Ｖ。別の特定の実施形態において、ＧＰＶ系統は病原性である、例えばＧＰＶ系統Ｂ。適切なパルボウイルスＩＴＲ配列の例を表１に示す。
【0127】
【表1-1】
【表1-2】
【0128】
本明細書において提供される野生型又は変異又は他の方法で改変されたＩＴＲ配列は、ｃｅＤＮＡベクターの製造のためのバキュロウイルス発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡテンプレートＤＮＡ）に含まれるＤＮＡ配列を表す。従って、バキュロウイルス発現構築物により産生されるｃｅＤＮＡベクター中に実際に含有されるＩＴＲ配列は、産生過程の間に起こる天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果として、本明細書において提供されるＩＴＲ配列と同一であるかもしれないし、同一でないかもしれない。
【0129】
導入遺伝子
特定の実施形態において、核分子（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）は、標的細胞において１つ又はそれ以上の導入遺伝子を送達し、そしてコードすることができる。導入遺伝子は、タンパク質をコードする転写物、非コード転写物、又はその両方であり得る。核酸分子は、タンパク質をコードする転写物、非コード転写物、又は両方を発現するために、多重コード配列、及び非標準翻訳開始部位又は１つより多くのプロモーターを含み得る。導入遺伝子は、１つより多くのタンパク質をコードする配列を含み得、又は非コード転写物の配列であってもよい。
特定の実施形態において、核分子（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）は、標的細胞において１つ又はそれ以上の導入遺伝子を送達し、そしてコードすることができる。導入遺伝子は、タンパク質をコードする転写物、非コード転写物、又はその両方であり得る。核酸分子は、タンパク質をコードする転写物、非コード転写物、又は両方を発現するために、多重コード配列、及び非標準翻訳開始部位又は１つより多くのプロモーターを含み得る。導入遺伝子は、１つより多くのタンパク質をコードする配列を含み得、又は非コード転写物の配列であってもよい。
【0130】
発現カセットは、任意の目的の導入遺伝子を含み得る。目的の導入遺伝子としては、限定されないが、ポリペプチドをコードする核酸、又は非コード核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲｓなど）、好ましくは治療的（例えば、医療、診断、又は獣医学用途のため）又は免疫原性（例えば、ワクチン用）ポリペプチドが挙げられる。特定の実施形態において、発現カセット中の導入遺伝子は、１つ又はそれ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合フラグメント、又はそれらの任意の組み合わせをコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、治療的遺伝子、又はマーカータンパク質である。いくつかの実施形態において、導入遺伝子はアゴニスト又はアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、模倣物又は抗体、又はその抗体フラグメント、もしくは抗原結合フラグメント、例えば、中和抗体又は抗体フラグメントなどである。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、本明細書において定義されるように、全長抗体又は抗体フラグメントを含む抗体をコードする。いくつかの実施形態において、抗体は、抗原結合ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列である。
【0131】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される導入遺伝子は、宿主細胞についてコドン最適化され得る。本明細書で使用されるように、用語「コドン最適化される」又は「コドン最適化」は、天然配列（例えば、原核生物配列）の少なくとも１つ、１つより多く、又は相当数のコドンを、その脊椎動物の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることにより、目的の脊椎動物、例えば、マウス又はヒト（例えば、ヒト化された）の細胞における増強された発現のために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種が、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定の偏りを示す。典型的には、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。公開で利用可能なデータベースを使用して最適化されたコドン決定することができる。
【0132】
特定の実施形態において、発現構築物は、治療的タンパク質をコードする導入遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは１つの治療的タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは、１つより多くの治療的タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは、同じ治療的タンパク質の２つ又はそれ以上のコピーをコードする。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは同じ治療的タンパク質の２つ又はそれ以上の変異体をコードする。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは２つ又はそれ以上の異なる治療的タンパク質をコードする。
【0133】
本開示のバキュロウイルス発現ベクター系により、任意の治療的タンパク質を製造することができ、これらとしては、限定することなく、凝固因子の製造が挙げられる。いくつかの実施形態において、凝固因子は、ＦＩ、ＦＩＩ、ＦＩＩＩ、ＦＩＶ、ＦＶ、ＦＶＩ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ、ＶＷＦ、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、アルファ２－抗プラスミン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子－１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子－２（ＰＡＩ－２）、その任意の酵素前駆体、その任意の活性形態、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。一実施形態において、凝固因子はＦＶＩＩＩ又はその変異体もしくはフラグメントを含む。別の実施形態において、凝固因子はＦＩＸ又はその変異体もしくはフラグメントを含む。別の実施形態において、凝固因子はＦＶＩＩ又はその変異体もしくはフラグメントを含む。別の実施形態において、凝固因子はＶＷＦ又はその変異体もしくはフラグメントを含む。
【0134】
増殖因子
いくつかの局面において、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、及び標的配列をコードする遺伝子カセットを含む核酸分子の製造が本明細書において提供され、ここで標的配列は治療的タンパク質をコードし、そしてここで治療的タンパク質は増殖因子を含む。増殖因子は、当該分野において公知の任意の増殖因子から選択され得る。いくつかの実施形態において、増殖因子はホルモンである。他の実施形態において、増殖因子はサイトカインである。いくつかの実施形態において、増殖因子はケモカインである。
いくつかの局面において、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、及び標的配列をコードする遺伝子カセットを含む核酸分子の製造が本明細書において提供され、ここで標的配列は治療的タンパク質をコードし、そしてここで治療的タンパク質は増殖因子を含む。増殖因子は、当該分野において公知の任意の増殖因子から選択され得る。いくつかの実施形態において、増殖因子はホルモンである。他の実施形態において、増殖因子はサイトカインである。いくつかの実施形態において、増殖因子はケモカインである。
【0135】
いくつかの実施形態において、増殖因子はアドレノメデュリン（ＡＭ）である。いくつかの実施形態において、増殖因子はアンジオポエチン（Ａｎｇ）である。いくつかの実施形態において、増殖因子は自己分泌型細胞運動刺激因子である。いくつかの実施形態において、増殖因子は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）である。いくつかの実施形態において、ＢＭＰはＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、及びＢＭＰ７から選択される。いくつかの実施形態において、増殖因子は毛様体神経栄養因子ファミリーメンバーである。いくつかの実施形態において、毛様体神経栄養因子ファミリーメンバーは、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）から選択される。いくつかの実施形態において、増殖因子はコロニー刺激因子である。いくつかの実施形態において、コロニー刺激因子は、マクロファージコロニー刺激因子（ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）から選択される。いくつかの実施形態において、増殖因子は上皮増殖因子（ＥＧＦ）である。いくつかの実施形態において、増殖因子はエフリンである。いくつかの実施形態において、エフリンはエフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、及びエフリンＢ３から選択される。いくつかの実施形態において、増殖因子はエリスロポエチン（ＥＰＯ）である。いくつかの実施形態において、増殖因子は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）である。いくつかの実施形態において、ＦＧＦは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、及びＦＧＦ２３から選択される。いくつかの実施形態において、増殖因子はウシ胎仔ソマトトロピン（ＦＢＳ）である。いくつかの実施形態において、増殖因子はＧＤＮＦファミリーメンバーである。いくつかの実施形態において、ＧＤＮＦファミリーメンバーは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、パーセフィン、及びアルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）から選択される。いくつかの実施形態において、増殖因子は増殖分化因子－９（ＧＤＦ９）である。いくつかの実施形態において、増殖因子は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である。いくつかの実施形態において、増殖因子は肝癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）である。いくつかの実施形態において、増殖因子はインスリンである。いくつかの実施形態において、増殖因子はインスリン様増殖因子である。いくつかの実施形態において、インスリン様増殖因子はインスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）又はＩＧＦ－２である。いくつかの実施形態において、増殖因子はインターロイキン（ＩＬ）である。いくつかの実施形態において、ＩＬは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、及びＩＬ－７から選択される。いくつかの実施形態において、増殖因子はケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）である。いくつかの実施形態において、増殖因子は遊走刺激因子（ＭＳＦ）である。いくつかの実施形態において、増殖因子はマクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ又は肝細胞増殖因子様タンパク質（ＨＧＦＬＰ））である。いくつかの実施形態において、増殖因子はミオスタチン（ＧＤＦ－８）である。いくつかの実施形態において、増殖因子はニューレグリンである。いくつかの実施形態において、ニューレグリンは、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、及びＮＲＧ４から選択される。いくつかの実施形態において、増殖因子はニューロトロフィンである。いくつかの実施形態において、増殖因子は脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である。いくつかの実施形態において、増殖因子は神経成長因子（ＮＧＦ）である。いくつかの実施形態において、ＮＧＦはニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）又はＮＴ－４である。いくつかの実施形態において、増殖因子は胎盤増殖因子（ＰＧＦ）である。いくつかの実施形態において、増殖因子は血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）である。いくつかの実施形態において、増殖因子はレナラーゼ（ＲＮＬＳ）である。いくつかの実施形態において、増殖因子はＴ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）である。いくつかの実施形態において、増殖因子はトロンボポエチン（ＴＰＯ）である。いくつかの実施形態において、増殖因子は形質転換増殖因子である。いくつかの実施形態において、形質転換増殖因子は形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ－α）又はＴＧＦ－βである。いくつかの実施形態において、増殖因子は腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）である。いくつかの実施形態において、増殖因子は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である。
【0136】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、翻訳を阻害するか又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分解を誘導することにより遺伝子発現を負に調節する小さい非コードＲＮＡ分子（約１８～２２ヌクレオチド）である。それらの発見以来、ｍｉＲＮＡは、アポトーシス、分化及び細胞増殖を含む様々な細胞プロセスに関与しており、そしてそれらは発がんにおいて鍵となる役割を果たすことが示された。遺伝子発現を調節するｍｉＲＮＡの能力は、インビボでのｍｉＲＮＡの発現を遺伝子治療における価値あるツールにする。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、翻訳を阻害するか又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分解を誘導することにより遺伝子発現を負に調節する小さい非コードＲＮＡ分子（約１８～２２ヌクレオチド）である。それらの発見以来、ｍｉＲＮＡは、アポトーシス、分化及び細胞増殖を含む様々な細胞プロセスに関与しており、そしてそれらは発がんにおいて鍵となる役割を果たすことが示された。遺伝子発現を調節するｍｉＲＮＡの能力は、インビボでのｍｉＲＮＡの発現を遺伝子治療における価値あるツールにする。
【0137】
いくつかの局面において、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、及び標的配列をコードする遺伝子カセットを含む核酸分子の製造が本明細書において提供され、ここで標的配列はｍｉＲＮＡをコードし、そして第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは非アデノ随伴ウイルスのＩＴＲである（例えば、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは非ＡＡＶに由来する）。ｍｉＲＮＡは当該分野で公知のいずれのｍｉＲＮＡでもよい。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは標的遺伝子の発現を下方調節する。特定の実施形態において、標的遺伝子は、ＳＯＤ１、ＨＴＴ、ＲＨＯ、又はそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0138】
いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは１つのｍｉＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは１つより多くのｍｉＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは２つ又はそれ以上の異なるｍｉＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは同じｍｉＲＮＡの２つ又はそれ以上のコピーをコードする。いくつかの実施形態において、遺伝子カセットは同じ治療的タンパク質の２つ又はそれ以上の変異体をコードする。特定の実施形態において、遺伝子カセットは１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡ及び１つ又はそれ以上の治療的タンパク質をコードする。
【0139】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは天然に存在するｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは操作されたｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは人工ｍｉＲＮＡである。特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、Ｅｖｅｒｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２６（９）：１－１５ （印刷物の前に電子出版２０１８年６月）により開示されるｍｉＨＴＴ操作されたｍｉＲＮＡを含む。特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、Ｄｉｒｒｅｎら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２（２）：１６７－８４ （２０１５年２月）により開示されたｍｉＲ ＳＯＤ１人工ｍｉＲＮＡを含む。特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ－７０８を含み、これはＲＨＯを標的とする（Ｂｅｈｒｍａｎら、ＪＣＢ １９２（６）：９１９－２７ （２０１１）を参照のこと）。
【0140】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、遺伝子の阻害剤の発現を下方調節することにより遺伝子の発現を上方調節する。いくつかの実施形態において、阻害剤は、天然の、例えば野生型の阻害剤である。いくつかの実施形態において、阻害剤は、変異した、異種の、かつ／又は異所性発現された遺伝子から生じる。
【0141】
発現制御エレメント
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるバキュロウイルス発現ベクター系により製造された核酸分子又はベクターは、少なくとも１つの発現制御配列をさらに含む。本明細書において使用されるような発現制御配列は、それが作動可能に連結しているコード核酸の効率的な転写及び翻訳を促進する、プロモーター配列又はプロモーターーエンハンサー組み合わせのような任意の制御性ヌクレオチド配列である。例えば、本開示の方法により製造された単離された核酸分子は、少なくとも１つの転写制御配列に作動可能に連結され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるバキュロウイルス発現ベクター系により製造された核酸分子又はベクターは、少なくとも１つの発現制御配列をさらに含む。本明細書において使用されるような発現制御配列は、それが作動可能に連結しているコード核酸の効率的な転写及び翻訳を促進する、プロモーター配列又はプロモーターーエンハンサー組み合わせのような任意の制御性ヌクレオチド配列である。例えば、本開示の方法により製造された単離された核酸分子は、少なくとも１つの転写制御配列に作動可能に連結され得る。
【0142】
遺伝子発現制御配列は、例えば、構成的又は誘導性プロモーターのような哺乳動物又はウイルスプロモーターであり得る。構成的哺乳動物プロモーターとしては、限定されないが、以下の遺伝子についてのプロモーターが挙げられる：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータ－アクチンプロモーター、及び他の構成的プロモーター。真核生物細胞において構成的に機能する例となるウイルスプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、及び他のレトロウイルス由来のプロモーター、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。
【0143】
他の構成的プロモーターは当業者に公知である。本開示の遺伝子発現配列として有用なプロモーターはまた誘導性プロモーターも含む。誘導性プロモーターは誘導剤の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは特定の金属イオンの存在下で転写及び翻訳を促進するために誘導される。他の誘導性プロモーターは当業者に公知である。
【0144】
一実施形態において、本開示は、組織特異的プロモーター及び／又はエンハンサーの制御下での導入遺伝子の発現を含む。別の実施形態において、プロモーター又は他の発現制御配列は、肝細胞における導入遺伝子の発現を選択的に増強する。肝臓特異的プロモーターの例としては、限定されないが、マウストランスサイレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、天然ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター、天然ヒト第ＩＸ因子プロモーター、ヒトアルファ－１－アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミンミニマルプロモーター、及びマウスアルブミンプロモーターが挙げられる。特定の実施形態において、プロモーターはｍＴＴＲプロモーターを含む。ｍＴＴＲプロモーターは、Ｒ．Ｈ．Ｃｏｓｔａら、１９８６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：４６９７に記載される。ＦＶＩＩＩプロモーターは、Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ及びＢｒｏｗｎｌｅｅ、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１８２８－１１８３８に記載される。特定の実施形態において、プロモーターは、米国特許公開第ＵＳ２０１９／００４８３６２号（参照によりその全体として本明細書に加入される）に開示されるようなｍＴＴＲプロモーターのいずれか（例えば、ｍＴＴＲ２０２プロモーター、ｍＴＴＲ２０２ｏｐｔプロモーター、ｍＴＴＲ４８２プロモーター）を含む。
【0145】
いくつかの実施形態において、核酸分子は組織特異的プロモーターを含む。特定の実施形態において、組織特異的プロモーターは、肝臓において、例えば、肝細胞及び／又は内皮細胞において、治療的タンパク質、例えば、凝固因子の発現を駆動する。特定の実施形態において、プロモーターは、マウストランスサイレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、天然ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター、ヒトアルファ－１－アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミンミニマルプロモーター、マウスアルブミンプロモーター、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）プロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、肝臓特異的プロモーター（例えば、α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ））、筋肉特異的プロモーター（例えば、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ミオシン重鎖アルファ（αＭＨＣ）、ミオグロビン（ＭＢ）、及びデスミン（ＤＥＳ））、合成プロモーター（例えば、ＳＰｃ５－１２、２Ｒ５Ｓｃ５－１２、ｄＭＣＫ、及びｔＭＣＫ）及びそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0146】
発現レベルは、１つ又はそれ以上のエンハンサーを使用して治療有効性を達成するためにさらに増強され得る。１つ又はそれ以上のエンハンサーは、単独で又は１つもしくはそれ以上のプロモーターエレメントと一緒に供給され得る。典型的には、発現制御配列は、複数のエンハンサーエレメント及び組織特異的プロモーターを含む。一実施形態において、エンハンサーは、α－１－ミクログロブリン／ビクニン（ｂｉｋｕｎｉｎ）エンハンサーの１つ又はそれ以上のコピーを含む（Ｒｏｕｅｔら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０７６５－２０７７３；Ｒｏｕｅｔら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３９５－４０４；Ｒｏｕｅｔら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３４：５７７－５８４；Ｉｌｌら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ８：Ｓ２３－Ｓ３０）。別の実施形態において、エンハンサーは、ＥＢＰ、ＤＢＰ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６のような肝臓特異的転写因子結合部位由来であり、Ｅｎｈ１は、ＨＮＦ１、（センス）－ＨＮＦ３、（センス）－ＨＮＦ４、（アンチセンス）－ＨＮＦ１、（アンチセンス）－ＨＮＦ６、（センス）－ＥＢＰ、（アンチセンス）－ＨＮＦ４（アンチセンス）を含む。
【0147】
特定の例において、本開示に有用なプロモーターはＥＴプロモーターであり、これはＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＹ６６１２６５としても知られる。Ｖｉｇｎａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（５）：７６３ （２００５）も参照のこと。他の適切なベクター及び発現制御配列の例は、ＷＯ ０２／０９２１３４、ＥＰ１３９５２９３、又は米国特許第６，８０８，９０５号、同第７，７４５，１７９号、又は同第７，１７９，９０３号（これらは参照によりそれら全体として本明細書に加入される）に記載される。
【0148】
一般に、発現制御配列は、必要に応じて、それぞれ転写及び翻訳の開始に関与する５’非転写及び５’非翻訳配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含むはずである。特に、このような５’非転写配列は、作動可能に結合されたコード核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。遺伝子発現配列は、場合により、エンハンサー配列又は所望の場合、上流活性化因子配列を含む。
【0149】
さらなるシス－調節エレメントとしては、限定されないが、リボスイッチ、インシュレーター、ｍｉｒ－調節可能エレメント、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、並びにポリアデニル化及び終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ）が挙げられる。特定の実施形態において、発現カセットはまた、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）及び／又は２Ａエレメントを含み得る。いくつかの実施形態において、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するさらなる構成要素、例えば、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするためのキルスイッチである調節スイッチを含む。
【0150】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるバキュロウイルス発現ベクター系により産生される核酸分子は、例えば導入遺伝子に作動可能に連結された１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。
【0151】
いくつかの実施形態において、標的配列は、骨髄関連（ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）前駆細胞において、及び少なくとも部分的により原始的なＨＳＰＣにおいて発現を最も有効にブロックすることが報告されてるｍｉＲ－２２３標的である。ｍｉＲ－２２３標的は、顆粒球、単球、マクロファージ、骨髄樹状細胞を含む分化骨髄細胞における発現をブロックすることができる。ｍｉＲ－２２３標的はまた、リンパ又は赤血球系列における堅固な導入遺伝子発現に依存する遺伝子治療適用にも適している。ｍｉＲ－２２３標的はまた、ヒトＨＳＣにおいて発現を非常に有効にブロックすることができる。
【0152】
いくつかの実施形態において、標的配列はｍｉＲ－１４２標的である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１４２（１４２Ｔ）のような造血特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡの相補配列は、導入遺伝子を含む核酸分子中に組み込まれ、導入遺伝子をコードする転写物を、ｍｉＲＮＡ媒介下方調節に対して感受性にする。この方法により、導入遺伝子発現は、非造血細胞において維持されながら、造血系列抗原提示細胞（ＡＰＣ）において防止され得る。この方針は、導入遺伝子発現に対して厳しい転写後制御を課すことができ、従って、導入遺伝子の安定な送達及び長期発現を可能にする。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１４２調節は、形質転換された細胞の免疫媒介クリアランスを防止し、かつ／又は抗原特異的調節性Ｔ細胞（Ｔレグ）を誘導し、そして導入遺伝子にコードされる抗原に対する堅固な免疫学的耐性を媒介する。
【0153】
いくつかの実施形態において、標的配列はｍｉＲ１８１標的である。Ｃｈｅｎ Ｃ－Ｚ及びＬｏｄｉｓｈ Ｈ、ＳｅｍｉｎａｒｓはＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （２００５） １７（２）：１５５－１６５において、マウス骨髄内のＢ細胞において特異的に発現されるｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１８１を開示する（Ｃｈｅｎ及びＬｏｄｉｓｈ、２００５年）。いくつかのヒトｍｉＲＮＡが白血病と関連していることも開示される。
【0154】
標的配列は、ｍｉＲＮＡに対して完全に又は部分的に相補的であり得る。用語「完全に相補的」は、標的配列が、それを認識するｍｉＲＮＡの配列に対して１００％相補的である核酸配列を有することを意味する。用語「部分的に相補的」は、標的配列が、それを認識するｍｉＲＮＡの配列に対して部分的にしか相補的でないことを意味し、それにより部分的に相補的な配列は、ｍｉＲＮＡによってなお認識される。換言すれば、本開示の文脈における部分的に相補的な標的配列は、対応するｍｉＲＮＡを認識し、そしてそのｍｉＲＮＡを発現する細胞において導入遺伝子発現の防止又は減少を達成する際に有効である。ｍｉＲＮＡ標的配列の例は、ＷＯ２００７／０００６６８、ＷＯ２００４／０９４６４２、ＷＯ２０１０／０５５４１３、又はＷＯ２０１０／１２５４７１（これらはそれら全体として参照により本明細書に加入される）に記載される。
【0155】
宿主細胞
本開示のバキュロウイルス発現系は、非ウイルス性カプシドを含まないｃｅＤＮＡ分子を産生するために増殖され得、許容宿主細胞において産生され得る。
本開示のバキュロウイルス発現系は、非ウイルス性カプシドを含まないｃｅＤＮＡ分子を産生するために増殖され得、許容宿主細胞において産生され得る。
【0156】
適切な宿主細胞は当業者に公知である。「宿主細胞」は、目的の任意の物質を内部に有するか又は内部に有する能力を有する任意の細胞を指す。
【0157】
いくつかの実施形態において、使用に適した宿主細胞は昆虫起源のものである。いくつかの実施形態において、適切な昆虫宿主細胞としては、例えば、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）から単離された細胞株又はイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）から単離された細胞株が挙げられる。例となる昆虫宿主細胞としては、限定することなく、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｆ＋細胞、及びツマジロクサヨトウ（Ｆａｌｌ Ａｒｍｙ ｗｏｒｍ）（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、又はイラクサギンウワバ（ｃａｂｂａｇｅ ｌｏｏｐｅｒ）（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）（鱗翅類）由来のＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞）、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のＳ２細胞、並びに他の細胞株が挙げられる。１つの特定の実施形態において、昆虫宿主細胞はＳｆ９細胞である。これらの細胞は多数の供給源（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＴＣＣ、及びＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から市販されている。他の適切な宿主昆虫細胞は当業者に公知である。
【0158】
例えば、接触した細胞を約２８℃で約３日間、外来タンパク質の発現を促す培地において、例えば、Ｇｉｂｃｏ昆虫培地（ＥｘｐｉＳｆ ＣＤ培地、Ｓｆ－９００ ＩＩＩ ＳＦＭ、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ ＳＦＭ、又はＳＦ－９００ ＩＩ ＳＥＭ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＥＳＦ９２１又はＥＳＦ ＡＦ培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）において培養することにより、ウイルスからの細胞への侵入をもたらす条件下で、ｒＢＶは昆虫細胞に接触した際に感染する。例えば、視覚的に検出可能な選択マーカータンパク質の発現により、又はｒＢＶゲノム中に組み込まれた遺伝子の発現により、成功した感染をモニタリングすることができる。
【0159】
本開示のベクターを含む宿主細胞を、適切な増殖培地中で増殖させる。本明細書において使用されるように、用語「適切な増殖培地」は、細胞の増殖に必要な栄養分を含有する培地を意味する。細胞の増殖に必要な栄養分は、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン類、ミネラル類、及び増殖因子を含み得る。場合により、培地は１つ又はそれ以上の選択因子を含有し得る。場合により、培地は仔ウシ血清又はウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有し得る。昆虫細胞は、限定されないが、Ｇｉｂｃｏ昆虫培地ＥｘｐｉＳｆ ＣＤ培地、Ｓｆ－９００ ＩＩＩ ＳＦＭ、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ ＳＦＭ、又はＳＦ－９００ ＩＩ ＳＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＥＳＦ９２１及びＥＳＦＡＦ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のような、維持及び増殖の助けとなる培地中で培養され得る。増殖培地は、一般に、例えばベクター上の選択可能なマーカーにより補完される薬物選択又は必須栄養素の欠損により、ベクターを含有する細胞について選択する。
【0160】
ｃｅＤＮＡベクター発現及び単離
特定の局面において、本開示は、本明細書に記載されるバキュロウイルス発現ベクターを増殖させることによる、本明細書に記載される核酸分子（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の製造に関する。特定の実施形態において、カプシド非含有非ウイルスＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）は、この順序で：第一の５’ＩＴＲ；発現カセット；及び３’ＩＴＲを含むポリヌクレオチド発現構築物テンプレートを含むバキュロウイルス発現ベクターを増殖させることにより得られる。一実施形態において、５’及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは改変されたＩＴＲであるか、又はここで５’及び３’ＩＴＲの両方が改変される場合、それらは互いに異なる改変を有し、かつ同じ配列ではなく、すなわち、それらは非対称である。特定の実施形態において、ＩＴＲ配列は、パルボウイルス、ディペンドウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する。特定の実施形態において、ＩＴＲは異なるウイルス血清型に由来する。
特定の局面において、本開示は、本明細書に記載されるバキュロウイルス発現ベクターを増殖させることによる、本明細書に記載される核酸分子（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の製造に関する。特定の実施形態において、カプシド非含有非ウイルスＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）は、この順序で：第一の５’ＩＴＲ；発現カセット；及び３’ＩＴＲを含むポリヌクレオチド発現構築物テンプレートを含むバキュロウイルス発現ベクターを増殖させることにより得られる。一実施形態において、５’及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは改変されたＩＴＲであるか、又はここで５’及び３’ＩＴＲの両方が改変される場合、それらは互いに異なる改変を有し、かつ同じ配列ではなく、すなわち、それらは非対称である。特定の実施形態において、ＩＴＲ配列は、パルボウイルス、ディペンドウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する。特定の実施形態において、ＩＴＲは異なるウイルス血清型に由来する。
【0161】
特定の実施形態において、バキュロウイルス発現ベクターは、許容宿主細胞（例えば、昆虫細胞）において、Ｒｅｐタンパク質の存在下で増殖する。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドテンプレートは、宿主細胞において複製してｃｅＤＮＡベクターを産生する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、２つの段階を経る：最初に、Ｒｅｐタンパク質を介したテンプレート骨格からのテンプレートの切除（「レスキュー」）、そして、２番めに、切除されたｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介複製。Ｒｅｐタンパク質及び特定のＩＴＲ配列のためのＲｅｐ結合部位は、当業者に周知である。当業者は、少なくとも１つの機能的ＩＴＲに基づいて核酸配列に結合しそして複製する血清型からＲｅｐタンパク質を選択することを理解する。例えば、複製能のあるＩＴＲがＡＡＶ血清型２に由来する場合、対応するＲｅｐは、ＡＡＶ２又はＡＡＶ４ ＲｅｐではＡＡＶ２ ＩＴＲのようなその血清型で機能するＡＡＶ血清型に由来するが、機能しないＡＡＶ５ Ｒｅｐには由来しないだろう。複製の際に、末端が共有結合で閉じたＤＮＡベクターは、許容細胞において蓄積し続け、そしてｃｅＤＮＡベクターは好ましくは標準的複製条件下でＲｅｐタンパク質の存在下で時が経っても十分に安定であり、例えば、少なくとも１ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも２ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも３ｐｇ／細胞、より好ましくは少なくとも４ｐｇ／細胞、なおより好ましくは少なくとも５ｐｇ／細胞である量で蓄積する。
【0162】
従って、一局面において、製造方法は：ａ）本明細書に記載されるバキュロウイルス発現ベクターとともに、Ｒｅｐタンパク質の存在下で、有効な条件下で宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために十分な時間の間、宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベートする工程、及びｂ）宿主細胞からｃｅＤＮＡベクターを回収及び単離する工程を含む。Ｒｅｐタンパク質の存在は、改変ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞においてｃｅＤＮＡベクターを生じる。
【0163】
特定の実施形態において、Ｒｅｐは宿主細胞にＭＯＩ約３で加えられる。特定の実施形態において、バキュロイウイルス発現ベクターを使用して、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドとｃｅＤＮＡのための非ウイルスＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートとの両方を送達する。他の実施形態において、宿主細胞はＲｅｐタンパク質を発現するように操作される。
【0164】
細胞を溶解させてｃｅＤＮＡベクターを回収することにより感染した昆虫細胞からｃｅＤＮＡベクターを得ることができる。溶解は、物理的な力（例えば、フレンチプレス又は超音波処理を用いる）、界面活性剤含有溶解緩衝液、又は例えばバキュロイウイルスゲノムにより天然で発現されるキチナーゼを用いる細胞マトリックスの酵素的消化を用いて達成され得る。Ｑｉａｇｅｎエンドトキシンフリープラスミドキットのようなプラスミド精製キットを使用して、ｃｅＤＮＡベクターを単離することができる。プラスミド単離のために開発された他の方法もＤＮＡベクターに適合可能である。一般に、いずれの核酸精製方法も適合され得る。
【0165】
使用方法
本明細書において提供されるバキュロイウイルス発現ベクター系は、本明細書において記載される組み換えバクミドに挿入された外来配列によりコードされる生成物の製造において使用される。生成物の拡張可能な製造は、当該分野で公知のいくつかのアプローチにより達成可能である。
本明細書において提供されるバキュロイウイルス発現ベクター系は、本明細書において記載される組み換えバクミドに挿入された外来配列によりコードされる生成物の製造において使用される。生成物の拡張可能な製造は、当該分野で公知のいくつかのアプローチにより達成可能である。
【0166】
１つのアプローチは、バキュロイウイルスの増殖を支持する適切な昆虫宿主細胞の感染を含む。特定の実施形態において、外来配列を含む組み換えバクミドは本明細書に記載されており、最初に適切な細菌宿主細胞（例えば、大腸菌）で増殖される。次いで組み換えバクミドを、宿主細胞から単離し、そして適切なトランスフェクション試薬（例えば、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ）を使用して、適切な昆虫宿主細胞にトランスフェクトする。昆虫宿主細胞は組み換えバキュロウイルス粒子を生成し、次いでこれが外来配列のウイルス増幅のための宿主昆虫細胞に感染し得る。
【0167】
特定の実施形態において、外来配列によりコードされる生成物を製造する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載される組み換えバクミドを、適切な条件下で適切な昆虫細胞にトランスフェクトして組み換えバキュロウイルスを生成すること；及び組み換えバキュロウイルスを用いて適切な条件下で第二の適切な昆虫細胞感染させ、外来配列によりコードされる生成物を製造する工程を含む。特定の実施形態において、遺伝子治療剤を製造する目的のために、組み換えバクミドは、Ｒｅｐコード配列及びＩＴＲと両側で隣接したタンパク質をコードする配列を含む。
【0168】
特定の実施形態において、核酸分子を製造する方法が本明細書において提供され、該方法は、本明細書に記載される組み換えバクミドを適切な昆虫細胞中に適切な条件下でトランスフェクトして組み換えバキュロウイルスを生成すること；及び第二の適切な昆虫細胞を組み換えバキュロウイルスに適切な条件下で感染させて核酸分子を製造することを含む。特定の実施形態において、ｃｅＤＮＡを製造する方法が本明細書において提供され、該方法は、本明細書に記載される組み換えバクミドを適切な昆虫細胞中に適切な条件下でトランスフェクトして組み換えバキュロウイルスを生成すること；及び第二の適切な昆虫細胞を組み換えバキュロウイルスに適切な条件下で感染させてｃｅＤＮＡを製造することを含む。
【0169】
別のアプローチにおいて、安定な細胞株は、タンパク質をコードする配列を、バキュロウイルス遺伝子プロモーター（例えば、バキュロウイルス構成的遺伝子プロモーター）の制御下で安定に組み込むことにより生成され得る。特定の実施形態において、安定な細胞株は安定な昆虫細胞株である。配列の安定な組み込みは、当業者に公知の任意の方法により行われ得る。様々な宿主細胞株への核酸の安定な組み込みのための方法は、当該分野で公知である（核酸の安定な組み込みにより作製される例となる産生細胞株のより詳細な記載については以下の実施例を参照のこと）。例えば、反復選択（例えば、選択可能なマーカーの使用による）を使用して、選択可能なマーカーを含有する核酸（並びにＡＡＶ ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子、及び／又はｒＡＡＶゲノム）が組み込まれた細胞を選択し得る。他の実施形態において、核酸は、部位特異的なやり方で細胞株に組み込まれて、産生細胞株を生成し得る。ＦＬＰ／ＦＲＴ（例えば、Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ、Ｓ．ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：１３５１－１３５５を参照のこと）、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ（例えば、Ｓａｕｅｒ、Ｂ．ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５１６６－５１７０を参照のこと）、及びｐｈｉ Ｃ３１－ａｔｔ（例えば、Ｇｒｏｔｈ、Ａ．Ｃ．ら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：５９９５－６０００を参照のこと）のような、いくつかの部位特異的組み換えシステムが当該分野で公知である。
【0170】
安定細胞株アプローチにおいて、一実施形態において、タンパク質をコードする配列の正常な発現のために必要な相補的タンパク質をコードするＢＥＶは、安定細胞株に導入される。特定の実施形態において、遺伝子治療剤の製造の目的のために、安定細胞株は、そこに安定に組み込まれた対称又は非対称のＡＡＶ又は非ＡＡＶ ＩＴＲと隣接している治療的タンパク質をコードする遺伝子を含む。次いで、適切なＲｅｐを含みコードするＢＥＶを、遺伝子治療剤の産生のために必要な条件下で安定細胞株に導入する。
【0171】
特定の安定細胞株を生成する例となる方法は、米国特許出願第６３／０６９，０７３号に記載される。
【0172】
さらに別のアプローチにおいて、外来配列によりコードされる生成物の製造は、バキュロウイルスを用いない方法で安定な細胞株を使用して達成され得る。特定の実施形態において、遺伝子治療剤を製造する目的のために、安定な細胞株は、そこで安定に組み込まれた対称又は非対称のＡＡＶ又は非ＡＡＶ ＩＴＲと隣接している治療的タンパク質をコードする遺伝子を含む。特定の実施形態において、安定細胞株におけるバキュロウイルスを含まない製造は、安定な細胞株においてバキュロウイルス遺伝子プロモーターの制御下でのＲｅｐタンパク質の一過性発現を含む。適切なバキュロウイルス遺伝子プロモーターは、当業者に公知である。特定の実施形態において、バキュロウイルス遺伝子プロモーターは、オルギイア・プソイドツガタ（Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ）核多角体病ウイルス（ＯｐＭＮＰＶ）の最初期（ｉｅ）遺伝子プロモーターである。特定の実施形態において、バキュロウイルス遺伝子プロモーターは、ＯｐＭＮＰＶのＯｐＩＥ２プロモーターである。一過性遺伝子発現を媒介する様々な方法は、当業者に公知である。特定の実施形態において、一般性遺伝子発現は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクションにより達成され得る。
【0173】
生成物の下流精製は、当業者に公知の任意の方法を含み得る。例えば、遺伝子治療目的のためのウイルスベクター又は非ウイルスベクターについては、イオン交換クロマトグラフィーにより低分子量ＤＮＡをＲＮＡ、高分子量ＤＮＡ、タンパク質、及び他の不純物から分離するシリカベースのカラムを含むプラスミドＤＮＡ単離キットにより精製され得る。
【0174】
本明細書において記載される様々な局面、実施形態及び選択肢を全て、任意かつ全ての変形で組み合わせることができる。
【0175】
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、まるで各個々の刊行物、特許又は特許出願が参照により加入されると具体的かつ個別に示されると同じ程度まで、参照により本明細書に加入される。
【実施例】
【0176】
前述の開示を提供したが、本明細書において提供される実施例を参照することによりさらなる理解を得ることができる。これらの実施例は、説明の目的のみのためのものであり、限定することは意図されない。
【0177】
実施例１：閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター収量改良
バキュロウイルス昆虫細胞系において、組み換えＢＥＶは強力なプロモーター下で目的の遺伝子を送達し、そして昆虫細胞におけるウイルス複製に必須の転写複合体を生じる。典型的には、バキュロウイルスＤＮＡゲノムは核において複製し、そしてそれぞれが全長ＤＮＡゲノムを含有する数千万の子孫ウイルス粒子を生じる。シリカゲルカラムのようなプラスミドＤＮＡベースの精製方法を使用して昆虫細胞からＤＮＡを単離する間に、バキュロウイルスゲノムＤＮＡがｃｅＤＮＡと同時精製されるということが実証された。市販のプラスミドＤＮＡキットカラムは、一般にそれらの分子量に基づいてＤＮＡを分離するようには設計されておらず、従って、典型的には、サンプル中に存在するＤＮＡの全ての形態は、これらのカラムに結合し得る。さらに、大きな分子量のＤＮＡの結合能は、低分子量ＤＮＡとは異なり得、そしてアニオン交換ベースのキットカラムは、異なるサイズのＤＮＡの結合有効性について最適化されない。
バキュロウイルス昆虫細胞系において、組み換えＢＥＶは強力なプロモーター下で目的の遺伝子を送達し、そして昆虫細胞におけるウイルス複製に必須の転写複合体を生じる。典型的には、バキュロウイルスＤＮＡゲノムは核において複製し、そしてそれぞれが全長ＤＮＡゲノムを含有する数千万の子孫ウイルス粒子を生じる。シリカゲルカラムのようなプラスミドＤＮＡベースの精製方法を使用して昆虫細胞からＤＮＡを単離する間に、バキュロウイルスゲノムＤＮＡがｃｅＤＮＡと同時精製されるということが実証された。市販のプラスミドＤＮＡキットカラムは、一般にそれらの分子量に基づいてＤＮＡを分離するようには設計されておらず、従って、典型的には、サンプル中に存在するＤＮＡの全ての形態は、これらのカラムに結合し得る。さらに、大きな分子量のＤＮＡの結合能は、低分子量ＤＮＡとは異なり得、そしてアニオン交換ベースのキットカラムは、異なるサイズのＤＮＡの結合有効性について最適化されない。
【0178】
ｃｅＤＮＡ調製物中に見られる高分子量ＤＮＡ（＞２０ｋｂ）は、低分子量ｃｅＤＮＡ（約７ｋｂ）と同時精製されたバキュロウイルスゲノムＤＮＡである可能性が最も高いという仮説を立てた。仮説を試験するために、昆虫細胞（Ｓｆ９）において感染性ウイルス粒子を産生するために必要なバキュロイウイルスゲノムの必須遺伝子をノックアウトする間接的アプローチを使用した。このアプローチは、産生された子孫ウイルス粒子の数を減らし、そして最終的には、ｃｅＤＮＡ調製物中のバキュロウイルスゲノムＤＮＡ混入を減らす。Ｓｆ９細胞における子孫（発芽型（ｂｕｄｄｅｄ）ウイルス）ウイルス産生及び感染に必須であるＡｃＭＮＰＶ ｖｐ８０カプシド遺伝子を標的とした。概念実証として、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．ＲｅｐＴｎ７ ＢＥＶ（図１）（「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」と題されたＵＳＳＮ ６３／０６９，０７３（参照により本明細書に加入される）を参照のこと）を使用して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系によりｖｐ８０遺伝子をノックアウトした。続いて、ＡｃＭＮＰＶ誘導性３９Ｋプロモーター下でＶＰ８０を発現してｖｐ８０ノックアウト（ＫＯ）ウイルスのＢＥＶ作業ストック（Ｐ２）を生じる補完Ｓｆ９細胞株も作製した。これにより、ｖｐ８０ＫＯ ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．ＲｅｐＴｎ７ ＢＥＶが１回の複製を受けることが可能になり、Ｓｆ９細胞におけるＡＡＶ ＩＴＲ媒介ｃｅＤＮＡベクターゲノム複製を開始することができた。
【0179】
実施例２：ＡｃＭＮＰＶ ＶＰ８０のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓノックアウト
ＡｃＭＮＰＶ ｖｐ８０遺伝子をノックアウトするために、コード配列を標的とする２つのｃｒＲＮＡを設計し、そして製造者の指示書に従ってＡｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＴＭ）を使用して機能性ｓｇＲＮＡを生成するために使用した（図２及び表２）。
ＡｃＭＮＰＶ ｖｐ８０遺伝子をノックアウトするために、コード配列を標的とする２つのｃｒＲＮＡを設計し、そして製造者の指示書に従ってＡｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＴＭ）を使用して機能性ｓｇＲＮＡを生成するために使用した（図２及び表２）。
【0180】
【表2】
【0181】
次いで、各ｓｇＲＮＡを、Ｔ２５フラスコ中で無血清ＥＳＦ－９２１培地中に１ｍＬあたり０．５ｘ１０６で播種されたＳｆ９において、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｒ）（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）トランスフェクション試薬を使用してＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼ、及びＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．ＲｅｐＴｎ７ バクミドＤＮＡと同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４～５日後に、細胞を蛍光顕微鏡下で可視化し、そして結果は、ｓｇＲＮＡ標的の両方について約１０％ ＲＦＰ＋細胞を示し、これはウイルス感染が単一細胞に制限されたことを示唆し、変異ｖｐ８０コード配列による可能性が最も高い。各ｓｇＲＮＡに誘導されたインデルを決定するために、子孫バキュロウイルスを回収し、そして以前に記載されたように（Ｊａｒｖｉｓ、２０１４年）、プラークを補完Ｓｆ．３９Ｋ．ＶＰ８０細胞株において精製した。感染の５～６日後に、１０％ ＦＢＳを添加したＥＳＦ－９２１培地中でＴ２５フラスコにて１ｍＬあたり０．５ ｘ １０６個で播種されたＳｆ．３９Ｋ．ＶＰ８０細胞において、１０のプラーク精製したＲＦＰ＋クローンをＰ１まで増幅した。増幅されたクローンの蛍光顕微鏡観察は約８０％ ＲＦＰ＋細胞を示し、これはＳｆ．３９Ｋ．ＶＰ８０細胞株が子孫ウイルス産生に必要なＶＰ８０機能をトランスで補完する能力を有するということを示唆する。各クローンウイルスを低速遠心分離により採取し、次いでアリコートを、ＱｉａｇｅｎのＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ＴｉｓｓｕｅゲノムＤＮＡ単離キット（カタログ番号６９５０６）により製造者の指示に従ってバキュロウイルスＤＮＡ単離のために使用した。得られたＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＡｃＭＮＰＶ ｖｐ８０コード配列に特異的なプライマーを用いて各標的配列をＰＣＲ増幅した。次いでＰＣＲ増幅プライマー（ａｍｐｌｉｍｅｒｓ）をゲル精製し、そしてＧｅｎｅｗｉｚ配列決定設備により直接配列決定した。得られた配列を、ＴＩＤＥ（分解によるインデルトラッキング（Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ ＤＥｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ））プログラム（ｔｉｄｅ．ｄｅｓｋｇｅｎ．ｃｏｍ）によりデフォルト設定を使用して分析し、各ｓｇＲＮＡにより誘導されたインデルを決定した。ＴＩＤＥ分析は、ｓｇＲＮＡについて２／１０クローンにおいてフレームシフト変異を示した。Ｔ１は－２ｂｐ欠失が最も多く（９１％）（図３）、そしてｓｇＲＮＡ．Ｔ２についての１／１０クローンは、ｖｐ８０コード配列における－１０ｂｐ欠失が最も多く（８９％）、検出可能な挿入は無かった（図４）。ｓｇＲＮＡ．Ｔ１のクローンの１つを増幅して作業ＢＥＶストック（継代２）を生成し、続いて以前に記載されたように（Ｊａｒｖｉｓ、２０１４年）Ｓｆ．３９Ｋ．ＶＰ８０細胞において滴定した。次いで、滴定したＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．ＲｅｐＴｎ７ ｖｐ８０ＫＯ ＢＥＶの作業ストックを、ｃｅＤＮＡベクター産生のために安定細胞株における感染のために使用した
実施例３：Ｓｆ３９Ｋ．ＶＰ８０補完細胞株の生成
ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．ＲｅｐＴｎ７ ｖｐ８０ＫＯ ＢＥＶの作業ストックを製造するために、ＶＰ８０機能をトランスで補完するためにＳｆ．３９Ｋ．ＶＰ８０安定細胞株を生成した。以前に観察されたように（Ｍａｒｅｋら、２０１１年）、Ｓｆ９細胞増殖でのＶＰ８０過剰発現の毒性効果を回避するために、ＡｃＭＮＰＶ誘導性３９Ｋプロモーターをｖｐ８０について使用した。補完細胞株を生成するために、ＡｃＭＮＰＶ ３９Ｋプロモーター下のＡｃＭＮＰＶ ｖｐ８０遺伝子、続いてｐ１０ポリアデニル化シグナルをコードするトランスファーベクターを製造した（図５Ａ）。次いで、このトランスファーベクターを、ＡｃＭＮＰＶ ｉｅ１プロモーター下のネオマイシン耐性遺伝子と、その前の転写エンハンサーｈｒ５エレメントと、その後に続くｐ１０ポリアデニル化シグナルとをコードするプラスミドを用いて、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｒ）（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）トランスフェクション試薬を使用して上に記載されるように同時トランスフェクトした（図５Ｂ）。ＡＡＶの対称及び非対称ＩＴＲと隣接したｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットをコードするプラスミドも同時トランスフェクトした（図５Ｃ）。
実施例３：Ｓｆ３９Ｋ．ＶＰ８０補完細胞株の生成
ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．ＲｅｐＴｎ７ ｖｐ８０ＫＯ ＢＥＶの作業ストックを製造するために、ＶＰ８０機能をトランスで補完するためにＳｆ．３９Ｋ．ＶＰ８０安定細胞株を生成した。以前に観察されたように（Ｍａｒｅｋら、２０１１年）、Ｓｆ９細胞増殖でのＶＰ８０過剰発現の毒性効果を回避するために、ＡｃＭＮＰＶ誘導性３９Ｋプロモーターをｖｐ８０について使用した。補完細胞株を生成するために、ＡｃＭＮＰＶ ３９Ｋプロモーター下のＡｃＭＮＰＶ ｖｐ８０遺伝子、続いてｐ１０ポリアデニル化シグナルをコードするトランスファーベクターを製造した（図５Ａ）。次いで、このトランスファーベクターを、ＡｃＭＮＰＶ ｉｅ１プロモーター下のネオマイシン耐性遺伝子と、その前の転写エンハンサーｈｒ５エレメントと、その後に続くｐ１０ポリアデニル化シグナルとをコードするプラスミドを用いて、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｒ）（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）トランスフェクション試薬を使用して上に記載されるように同時トランスフェクトした（図５Ｂ）。ＡＡＶの対称及び非対称ＩＴＲと隣接したｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットをコードするプラスミドも同時トランスフェクトした（図５Ｃ）。
【0182】
トランスフェクションの２４時間後に、細胞を蛍光顕微鏡下で可視化して、トランスフェクション有効性を決定し、そして結果は＞８０％ ＧＦＰ＋細胞を示し、より高いトランスフェクション効率を示唆した。トランスフェクション７２時間後に、最終濃度１．０ｍｇ／ｍＬで完全ＴＮＭＦＨ培地（１０％ ＦＢＳ ＋ ０．１％プルロニックＦ６８を添加したＧｒａｃｅ昆虫培地）中に懸濁されたＧ４１８抗生物質（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて細胞を選択した。選択の約１週間後に、形質転換された細胞約５０％が回収され、これはネオマイシン耐性マーカーがこの細胞集団に安定に組み込まれたことを示唆する。生き残り細胞を選択培地から取り、そしてコンフルエンス増殖になるまで新鮮な完全ＴＮＭＦＨ培地を供給した。コンフルエントな細胞を、それらが分裂し続けるにつれて、より大きな培養容器中に付着培養として次第に拡大させた。その後、各細胞株を、完全ＴＮＭＦＨ中で１継代及び１０％ ＦＢＳを添加したＥＳＦ－９２１培地中で１継代、振盪フラスコ中での増殖により懸濁培養に適合させた。最後に、各細胞株を、懸濁培養として振盪フラスコ中の無血清ＥＳＦ－９２１に適合させた。これらの振盪フラスコ培養を、４日ごとに継代して無血清ＥＳＦ－９２１培地中で定期的に維持し、そして細胞増殖をモニタリングした。最後に、実施例２に記載されるように、Ｓｆ．３９Ｋ．ＶＰ８０細胞株のポリクローナル細胞集団を、プラーク精製及びＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．ＲｅｐＴｎ７ ｖｐ８０ＫＯ ＢＥＶの増幅のために使用した。
【0183】
実施例４：ＶＰ８０ＫＯ ＢＥＶを使用したヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ産生
ｖｐ８０ＫＯウイルスを使用したアプローチがヒトＦＶＩＩＩ導入遺伝子をコードするｃｅＤＮＡ調製物におけるバキュロウイルスＤＮＡ混入を減少し得るか否かを決定するために、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．ＲｅｐＴｎ７ ｖｐ８０ＫＯ ＢＥＶを、インタクトなｖｐ８０を含有する対応する野生型ＢＥＶと比較して試験した。
ｖｐ８０ＫＯウイルスを使用したアプローチがヒトＦＶＩＩＩ導入遺伝子をコードするｃｅＤＮＡ調製物におけるバキュロウイルスＤＮＡ混入を減少し得るか否かを決定するために、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．ＲｅｐＴｎ７ ｖｐ８０ＫＯ ＢＥＶを、インタクトなｖｐ８０を含有する対応する野生型ＢＥＶと比較して試験した。
【0184】
各組み換えＢＥＶの滴定した作業ストックに３ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で細胞を感染させた。次いで、室温で１．５時間細胞を穏やかに回転し、５００ｘｇで５分間ペレット化し、上清を吸引し、そして細胞を新鮮なＥＳＦ－９２１培地１０ｍＬで１回洗浄した。次いで細胞をＥＳＦ－９２１培地５０ｍＬ中に懸濁し、次いで７２時間２８℃で振盪インキュベーターでインキュベートした。感染７２時間後に、感染した細胞を回収し、そしてペレットを１ｘ ＰＢＳで１回洗浄して、残留バキュロイウイルス粒子及び／又は培地を除去した。次いで細胞ペレットを処理して、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者の指示に従ってｃｅＤＮＡベクターを精製した。溶出フラクションを、０．８～１．２％アガロースゲル電気泳動により分析して、各ｃｅＤＮＡベクターの収量及び純度を決定した。ゲルアッセイ結果は、ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットのサイズ（約７．０ｋｂ）の単一の濃いバンドを示し、野生型ＢＥＶと比較してｖｐ８０ＫＯ ＢＥＶ感染サンプルにおいて検出可能な高分子量（＞２０ｋｂ）バキュロウイルスゲノムＤＮＡ混入は無かった（図７）。結果は、ｖｐ８０ＫＯアプローチが、バキュロウイルスゲノムＤＮＡ混入を減少させ、そして同時にｃｅＤＮＡ収量を改善する能力を有していたことを示唆する。このアプローチにより、５ｘ１０８細胞からｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ（約７．０ｋｂ）をコードするｃｅＤＮＡベクター０．５ｍｇまで得ることができる
実施例５：ヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ特徴づけ
最後に、我々は、ｖｐ８０ＫＯウイルス感染後に安定な細胞株から得られた線状ＩＴＲ隣接ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮベクターＤＮＡの生化学的特徴づけを行った。我々は、このベクターＤＮＡが、様々な条件下で、共有結合で閉じた末端、二本鎖立体構造、及びコンカテマー化した（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚｅｄ）多量体形態を有するか否かを決定した。最初に我々は、ＤＮＡ（約８．５μｇ）を９５℃で１０分間熱処理し、次いでそれらを３０分間氷上で復元した。続いて、熱処理した又は未処理のベクターＤＮＡを、ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮコード配列に単一の認識部位を有する独特の制限エンドヌクレアーゼＡｓｃＩを用いて消化した。消化したサンプルを、ネイティブアガロースゲル電気泳動で様々な体積で分析した。未切断ベクターＤＮＡゲノムのゲルアッセイは、６．５ｋｂの主要なバンド並びに１３．０ｋｂ及び２１．０ｋｂの２つの小さいバンドを示した。６．５ｋｂバンドは単量体に期待されるとおりであり、そして１３．０ｋｂ及び２１．０ｋｂバンドは、二量体又は三量体のコンカテマー化ベクターゲノムと一致していた（図７、未切断）。しかし、熱処理したサンプルについては、熱処理がＤＮＡを変性させ、そして単量体形態以外のコンカタマー化した多量体形態を分裂し、これが二本鎖ＤＮＡとして復元することが予期された。実際に、熱処理されたベクターＤＮＡが、ＡｓｃＩ消化後に、検出可能な高分子量ＤＮＡバンドは無く３．６ｋｂ及び２．９ｋｂの２つの主要なバンドとして分割されるということが観察された（図７、左パネル、及び図８、単量体）。３．６ｋｂ及び２．９ｋｂバンドは、氷上でのインキュベーション後に復元される消化された線状単量体二本鎖分子について期待されるとおりであった。高分子量ＤＮＡバンドが無いことは、氷上でのインキュベーション後に復元できない、熱処理の際のコンカタマー化多量体形態の変性と一致していた。対照的に、ＡｓｃＩ消化未処理ベクターＤＮＡのゲル分析は、３．６ｋｂ及び２．９ｋｂの２つの主要なバンド並びに７．２ｋｂ及び５．８ｋｂの２つの小さなバンドとして分割した（図７、右パネル）。３．６ｋｂ及び２．９ｋｂバンドは、ベクターゲノム単量体のＡｓｃＩｄを用いた消化について期待されるとおりであったが（図８、単量体）、一方で７．２ｋｂ及び５．８ｋｂバンドは、それぞれ多量体ベクターゲノムのテール－トゥー－テール及びヘッド－トゥー－ヘッドコンカタマーと一致していた（図８、二量体）。＞２０ｋｂの別の主要なバンドが観察され、これはベクターゲノムの三量体又は四量体であり得、単純な制限消化分析では説明が困難であった。それにもかかわらず、これらの結果は、ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターが、天然条件下では多量体形態でコンカタマー化した線状の共有結合で閉じた二本鎖ＤＮＡであることを示唆する。
実施例５：ヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ特徴づけ
最後に、我々は、ｖｐ８０ＫＯウイルス感染後に安定な細胞株から得られた線状ＩＴＲ隣接ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮベクターＤＮＡの生化学的特徴づけを行った。我々は、このベクターＤＮＡが、様々な条件下で、共有結合で閉じた末端、二本鎖立体構造、及びコンカテマー化した（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚｅｄ）多量体形態を有するか否かを決定した。最初に我々は、ＤＮＡ（約８．５μｇ）を９５℃で１０分間熱処理し、次いでそれらを３０分間氷上で復元した。続いて、熱処理した又は未処理のベクターＤＮＡを、ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮコード配列に単一の認識部位を有する独特の制限エンドヌクレアーゼＡｓｃＩを用いて消化した。消化したサンプルを、ネイティブアガロースゲル電気泳動で様々な体積で分析した。未切断ベクターＤＮＡゲノムのゲルアッセイは、６．５ｋｂの主要なバンド並びに１３．０ｋｂ及び２１．０ｋｂの２つの小さいバンドを示した。６．５ｋｂバンドは単量体に期待されるとおりであり、そして１３．０ｋｂ及び２１．０ｋｂバンドは、二量体又は三量体のコンカテマー化ベクターゲノムと一致していた（図７、未切断）。しかし、熱処理したサンプルについては、熱処理がＤＮＡを変性させ、そして単量体形態以外のコンカタマー化した多量体形態を分裂し、これが二本鎖ＤＮＡとして復元することが予期された。実際に、熱処理されたベクターＤＮＡが、ＡｓｃＩ消化後に、検出可能な高分子量ＤＮＡバンドは無く３．６ｋｂ及び２．９ｋｂの２つの主要なバンドとして分割されるということが観察された（図７、左パネル、及び図８、単量体）。３．６ｋｂ及び２．９ｋｂバンドは、氷上でのインキュベーション後に復元される消化された線状単量体二本鎖分子について期待されるとおりであった。高分子量ＤＮＡバンドが無いことは、氷上でのインキュベーション後に復元できない、熱処理の際のコンカタマー化多量体形態の変性と一致していた。対照的に、ＡｓｃＩ消化未処理ベクターＤＮＡのゲル分析は、３．６ｋｂ及び２．９ｋｂの２つの主要なバンド並びに７．２ｋｂ及び５．８ｋｂの２つの小さなバンドとして分割した（図７、右パネル）。３．６ｋｂ及び２．９ｋｂバンドは、ベクターゲノム単量体のＡｓｃＩｄを用いた消化について期待されるとおりであったが（図８、単量体）、一方で７．２ｋｂ及び５．８ｋｂバンドは、それぞれ多量体ベクターゲノムのテール－トゥー－テール及びヘッド－トゥー－ヘッドコンカタマーと一致していた（図８、二量体）。＞２０ｋｂの別の主要なバンドが観察され、これはベクターゲノムの三量体又は四量体であり得、単純な制限消化分析では説明が困難であった。それにもかかわらず、これらの結果は、ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターが、天然条件下では多量体形態でコンカタマー化した線状の共有結合で閉じた二本鎖ＤＮＡであることを示唆する。
【0185】
配列
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表3-5】
【表3-6】
【表3-7】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】