特表 2023-538919 ＣＤ２５偏向抗ＩＬ－２抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-12

(54)【発明の名称】ＣＤ２５偏向抗ＩＬ－２抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230905BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20230905BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230905BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20230905BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230905BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/24

A61K39/395 N

A61K38/20

A61P37/02

A61P29/00

A61P37/08

A61P3/00

A61P19/02

A61P19/08

A61P1/16

A61P21/00

A61P3/10

A61P9/10 101

A61P25/00

A61P21/04

A61P17/14

A61P17/06

A61P1/04

A61P37/06

A61K47/68

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023512084

(86)(22)【出願日】2021-08-18

(85)【翻訳文提出日】2023-04-14

(86)【国際出願番号】 EP2021072960

(87)【国際公開番号】W WO2022038193

(87)【国際公開日】2022-02-24

(31)【優先権主張番号】20191635.0

(32)【優先日】2020-08-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】20195863.4

(32)【優先日】2020-09-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】20191638.4

(32)【優先日】2020-08-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515098691

【氏名又は名称】ウニヴェルズィテート チューリッヒ

(74)【代理人】

【識別番号】100149032

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 敏明

(74)【代理人】

【識別番号】100181906

【弁理士】

【氏名又は名称】河村 一乃

(72)【発明者】

【氏名】ボーイマン，オヌール

(72)【発明者】

【氏名】カラカス，ウフク

(72)【発明者】

【氏名】レイバー，ミロ

(72)【発明者】

【氏名】メレディン，ローマン

(72)【発明者】

【氏名】マカ，ロバート

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC07

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA02

4C084BA44

4C084DA14

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA45

4C084ZA68

4C084ZA75

4C084ZA89

4C084ZA92

4C084ZA94

4C084ZA96

4C084ZB07

4C084ZB08

4C084ZB11

4C084ZB13

4C084ZC21

4C084ZC35

4C085AA14

4C085AA25

4C085BB11

4C085BB31

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA76

4H045EA22

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）特異的モノクローナル抗体を提供し、ここでｈＩＬ－２と前記モノクローナル抗体との複合体は、ＣＤ２５及び三量体ＩＬ－２Ｒを介して優先的にＩＬ－２シグナル伝達を誘導する。本発明は、炎症性疾患を治療する使用のための、ｈＩＬ－２及び前記ｈＩＬ－２－ｍＡｂを含む医薬組成物をさらに提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトインターロイキン－２（ｈＩＬ－２）特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、又はその抗原結合断片であって、前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂは、エピトープを提供するｈＩＬ－２のアミノ酸残基と相互作用し、かつ
前記エピトープは、前記ｈＩＬ－２残基の：
－ Ｈ１６、Ｄ２０、
－ Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６１、Ｌ６３、Ｋ６４、Ｅ６７、Ｅ６８、及び
－ Ｌ８０、Ｒ８１、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｉ８６、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ９０、Ｖ９１、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｍ１０４、
を含み、
前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片は、Ｖ_Ｈ相補性決定領域ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２、及びＣＤＲ_Ｈ３を含む重鎖可変（Ｖ_Ｈ）領域と、Ｖ_Ｌ相補性決定領域ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２、及びＣＤＲ_Ｌ３を含む可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）領域とを含み、かつここで
ａ． ＣＤＲ_Ｈ１は、配列番号００１を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｂ． ＣＤＲ_Ｈ２は、配列番号００２を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｃ． ＣＤＲ_Ｈ３は、配列番号００３を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｄ． ＣＤＲ_Ｌ１は、配列番号００４を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｅ． ＣＤＲ_Ｌ２は、配列番号００５を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｆ． ＣＤＲ_Ｌ３は、配列番号００６を含むか、又はそれと同一である、
前記ヒトインターロイキン－２（ｈＩＬ－２）特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、又はその抗原結合断片。

【請求項2】

前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂのｈＩＬ－２への結合は：
－ （≦）４．３×１０^－９以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）、特に（≦）５．１３×１０^－９以下のＫ_Ｄ、
－ （≧）４．１２×１０^５Ｍｓ^－１以上のオンレート（Ｋ_ｏｎ）、特に（≧）４．６６×１０^５Ｍｓ^－１以上のＫ_ｏｎ、及び
－ （≦）２．２０×１０^－３ｓ^－１以下のオフレート（Ｋ_ｏｆｆ）、特に（≦）２．３９×１０^－３ｓ^－１以下のＫ_ｏｆｆ、
によって特徴づけられる、
請求項１に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片。

【請求項3】

前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂとｈＩＬ－２とを、２：１～１：２の間の比率で組み合わせた複合体、特に１：１の比率で組み合わせた複合体は：
－ 中間親和性ｈＩＬ－２受容体と比較した、高親和性ｈＩＬ－２受容体への結合の比率は、２０～１２１の間であること、特に比率は７１～１２１の間であること、及び／又は
－ 中間親和性ｈＩＬ－２受容体と比較した、ＣＤ２５単独の結合親和性の比率は、２７７～４８３の間であること、特に比率は３８０～４８３の間であること、及び／又は
－ 高親和性ｈＩＬ－２受容体への複合体の結合におけるｈＩＬ－２からのｈＩＬ－２ ｍＡｂの解離、及び／又は
－ ヒトＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^ｌｏｗＦｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞をＥＣ５０が（≦）０．１５４以下で、かつヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞をＥＣ５０が（≧）４４２．９以上で活性化させること、
によって特徴づけられる、請求項１又は２に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片。

【請求項4】

ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片であって、Ｖ_Ｈ相補性決定領域ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２、及びＣＤＲ_Ｈ３を含む重鎖可変（Ｖ_Ｈ）領域と、Ｖ_Ｌ相補性決定領域ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２、及びＣＤＲ_Ｌ３を含む可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）領域とを含み、かつここで
ａ． ＣＤＲ_Ｈ１は、配列番号００１を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｂ． ＣＤＲ_Ｈ２は、配列番号００２を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｃ． ＣＤＲ_Ｈ３は、配列番号００３を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｄ． ＣＤＲ_Ｌ１は、配列番号００４を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｅ． ＣＤＲ_Ｌ２は、配列番号００５を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｆ． ＣＤＲ_Ｌ３は、配列番号００６を含むか、又はそれと同一である、
前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片。

【請求項5】

ａ． 前記ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２、及びＣＤＲ_Ｈ３は、配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、配列番号０１０、配列番号０１１、配列番号０１２、配列番号０１３、及び配列番号０１４から選択されるＶ_Ｈ配列に含まれ、特に前記ＣＤＲ_Ｈは、配列番号００７に含まれ、かつ
ｂ． 前記ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２、及びＣＤＲ_Ｌ３は、配列番号０１５、及び配列番号０１６から選択されるＶ_Ｌ配列に含まれ、特に前記ＣＤＲ_Ｌは、配列番号０１５に含まれる、
請求項１～４のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片。

【請求項6】

ａ．
－ ７４位及び／又は８４位がセリンであり、及び／又は
－ ９３位がメチオニンであり、及び／又は
－ １２２位がアラニンである；
配列番号００７と（≧）９６％以上同一であるＶ_Ｈ領域配列、
及び
ｂ．
－ ６９位がイソロイシンである、
配列番号０１５と（≧）９９％以上同一であるＶ_Ｈ領域配列、
を含む、
ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片、特に請求項１～５のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ。

【請求項7】

ａ． Ｖ_Ｈ領域は、配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、配列番号０１０、配列番号０１１、配列番号０１２、配列番号０１３、及び配列番号０１４から選択される配列、又は以下に示す置換規則によってこれらの参照配列のいずれか１つから導かれる機能的に類似する配列を含み；かつ
ｂ． Ｖ_Ｌ領域は、配列番号０１５及び配列番号０１６から選択される配列、又は以下に示す置換規則によってこれらの参照配列のいずれか１つから導かれる機能的に類似する配列を含み、
ここで、それぞれの参照配列から機能的に類似する配列を導く前記置換規則は：
ｉ． グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）とは入れ替え可能であり；バリン（Ｖ）と、ロイシン（Ｌ）と、イソロイシン（Ｉ）とは入れ替え可能であり、ＡとＶとは入れ替え可能であり；
ｉｉ． トリプトファン（Ｗ）とフェニルアラニン（Ｆ）とは入れ替え可能であり、チロシン（Ｙ）とＦとは入れ替え可能であり；
ｉｉｉ． セリン（Ｓ）とスレオニン（Ｔ）とは入れ替え可能であり；
ｉｖ． アスパラギン酸（Ｄ）とグルタミン酸（Ｅ）とは入れ替え可能であり；
ｖ． アスパラギン（Ｎ）とグルタミン（Ｑ）とは入れ替え可能であり、ＮとＳとは入れ替え可能であり、ＮとＤとは入れ替え可能であり、ＥとＱとは入れ替え可能であり；
ｖｉ． メチオニン（Ｍ）とＱとは入れ替え可能であり；
ｖｉｉ． システイン（Ｃ）と、Ａと、Ｓとは入れ替え可能であり；
ｖｉｉｉ． プロリン（Ｐ）と、Ｇと、Ａとは入れ替え可能であり；
ｉｘ． アルギニン（Ｒ）とリジン（Ｋ）とは入れ替え可能であり；
特に、上記の置換規則によって、多くとも２つのアミノ酸が交換され、より特に多くとも１つのアミノ酸が交換される、
ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片、特に請求項１～５のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ。

【請求項8】

ａ． 配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、配列番号０１０、配列番号０１１、配列番号０１２、配列番号０１３、配列番号０１４、及び配列番号０１７のうちの少なくとも１つと（≧）９０％以上同一の第１の配列、特に（≧）９４％以上、（≧）９６％以上、又はさらに（≧）９８％以上同一の第１の配列；及び
ｂ． 配列番号０１５、配列番号０１６、及び配列番号０１８のうちの少なくとも１つと（≧）９０％以上同一の第２の配列、特に（≧）９４％以上、（≧）９６％以上、又はさらに（≧）９８％以上同一の第２の配列、
をさらに含む、
請求項１～３のいずれか一項に記載の特徴を有する、
ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片。

【請求項9】

前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂは：
ａ． 重鎖であり、配列番号０１７を含むか、又はそれからなる前記重鎖；及び
ｂ． 軽鎖であり、配列番号０１８を含むか、又はそれからなる前記軽鎖、
を含む、
請求項１～８のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項に記載の、ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片をコードする核酸分子。

【請求項11】

ｃ． 請求項１～９のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片、及び
ｄ． ｈＩＬ－２、
を含む、医薬品としての使用のための医薬組成物、特にＩＬ－２免疫療法に適している免疫介在性疾患の治療における使用のための医薬組成物、より特に同種移植関連障害、慢性炎症、アレルギー、自己免疫疾患、及び代謝性疾患から選択される、免疫介在性疾患の治療における使用のための医薬組成物。

【請求項12】

前記ＩＬ－２と前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂとが共有結合的に会合している、請求項１１に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項13】

前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、強直性脊椎炎、自己免疫肝炎、筋萎縮性側索硬化症、１型真性糖尿病、２型真性糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、炎症性及び自己免疫性ミオパシー、円形脱毛症、乾癬、又は炎症性腸疾患から選択される、請求項１１又は１２に記載の使用のためのｈＩＬ－２特異的ｍＡｂを含む医薬組成物。

【請求項14】

前記同種移植片関連障害は、固形臓器移植処置を受ける患者において診断される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の使用のためのｈＩＬ－２特異的ｍＡｂを含む医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＩＬ－２の効果を、ＣＤ１２２介在性免疫反応ではなく寛容原性ＣＤ２５介在性免疫反応に偏らせる（偏向させる（ｂｉａｓｉｎｇ））ことができる、ヒトＩＬ－２に特異的に反応する抗体に関する。本発明は、本発明の抗体を用いた特異的な医薬組成物及び治療法をさらに提供する。

【背景技術】

【0002】

インターロイキン２（ＩＬ－２）は、１５．５ｋＤａの４－α－ヘリックスバンドルのサイトカインであり、重要なＴ細胞成長因子であり、特異的なＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）を介してシグナルを伝達する。ＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒの結合により、ヤヌスキナーゼ（Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅ）シグナル伝達物質及び転写活性化因子（ＳＴＡＴ）、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）－ＡＫＴ、及び分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ：ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）経路を含む下流のシグナル伝達経路が開始される（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５，３６：７６３）。シグナル伝達が可能なＩＬ－２Ｒには、二量体ＩＬ－２Ｒと三量体ＩＬ－２Ｒとの２種類がある（Ｒｏｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８，３６：４１１）。二量体ＩＬ－２Ｒは、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）と共通γ鎖（γｃ；ＣＤ１３２）とから形成され、ＩＬ－２に対して中間の親和性を示す（解離定数［Ｋ_ｄ］≒１０^－９Ｍ）。三量体ＩＬ－２Ｒは、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２、及びＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）からなり、ＣＤ２５はＩＬ－２Ｒの親和性をさらに１００倍高める役割を果たし、そのため三量体ＩＬ－２Ｒ（Ｋ^ｄ≒１０^－１１Ｍ）は高親和性ＩＬ－２Ｒとも呼ばれる（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ、２０１５）。その結果、フォークヘッドボックスｐ３（Ｆｏｘｐ３）^＋ＣＤ２５^ｈｉｇｈＣＤ４^＋制御性Ｔ（Ｔ_ｒｅｇ）細胞など、高レベルの三量体ＩＬ－２Ｒを強固に発現する細胞は、ＣＤ２５^－細胞に対して競争優位性を持ち、ただし、両細胞サブセットがＣＤ１２２とＣＤ１３２とを同様に発現していることが条件となる。しかしながら、ＩＬ－２免疫療法を複雑にする、ＣＤ４^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞は高レベルのＣＤ２５を保持するが、ＣＤ１２２のレベルは低から中程度にとどまり、一方で、抗原経験性（記憶性）ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、定常状態にて、高レベルのＣＤ１２２を発現するが、ＣＤ２５はバックグラウンドレベルにとどまる。したがって、ＣＤ４^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、ＩＬ－２免疫療法時にＩＬ－２について競合する可能性がある（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１６，８：３６７；Ｒａｅｂｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２０１８，２８３：１７６）。

【0003】

免疫抑制性Ｔ_ｒｅｇ細胞と免疫刺激性エフェクター免疫細胞との両方に対するＩＬ－２の多面的な作用は、その治療的使用を困難なものにする。ＩＬ－２の治療特性を改善するために、複数のアプローチが追求されてきた。ＩＬ－２に変異を導入すること（ＩＬ－２変異タンパク質とも呼ばれる）、又は特異的な部位でＩＬ－２をＰＥＧ化すること、又はＩＬ－２／抗－ＩＬ－２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）複合体（簡潔には、ＩＬ－２ｃｘ）を用いることによって、ＩＬ－２は二量体又は三量体のＩＬ－２Ｒに偏ること（偏向すること）が可能である。抗マウスＩＬ－２特異的ｍＡｂクローンＪＥＳ６－１は、この目的のために開発されたプロトタイプ抗体である。組換え野生型（ＷＴ：ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）マウスＩＬ－２とＪＥＳ６－１とを複合化することで、ＩＬ－２／ＪＥＳ６－１ｃｘが得られ、これは、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ２５^ｈｉｇｈＴ_ｒｅｇ細胞を強力に刺激するが、一方で、静止ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞はこのＩＬ－２ｃｘによる影響をほとんど受けない（Ｂｏｙｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００６，３１１：１９２４；Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ，ＰＮＡＳ ２０１０，１０７：２１７１）。それらのｉｎ ｖｉｖｏでの効果から、ＩＬ－２／ＪＥＳ６－１ｃｘ及び同様のＩＬ－２ｃｘは、ＣＤ２５指向（ＣＤ２５－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）又はＣＤ２５偏向（ＣＤ２５－ｂｉａｓｅｄ）ＩＬ－２ｃｘと呼ばれている。

【0004】

ＣＤ２５偏向ＩＬ－２ｃｘは、マウスにおいて、固形同種移植片の移植の複数のモデル、並びに自己免疫性糖尿病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（多発性硬化症のモデル）、コラーゲン誘発関節炎、炎症性大腸炎、及び全身性エリテマトーデス様症候群を含む慢性炎症疾患及び自己免疫疾患で評価されてきた（Ｔａｎｇ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００８，２８：６８７；Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００９，２０６：７５１；Ｌｅｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，１３７：３０５；Ｓｐａｎｇｌｅｒ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１５，４２：８１５；Ｙａｎ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．２０１７，９１：６０３）。ＩＬ－２ｃｘの受容体偏向機能は、高親和性又は中間親和性の受容体のいずれかのＩＬ－２結合部位をｍＡｂが覆い隠すことによって達成されると考えられていた。ＩＬ－２／ＪＥＳ６－１ｃｘの構造解析により、ＪＥＳ６－１はＩＬ－２のＣＤ１３２への結合を立体的に阻害し、さらにＩＬ－２の構造に軽度のアロステリックな変化を起こしてＩＬ－２とＣＤ２５との相互作用に影響を与えることが示唆された（Ｓｐａｎｇｌｅｒ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１５）。逆に、抗ヒトＩＬ－２ ｍＡｂ Ｆ５１１１．２で作られたＣＤ２５偏向ヒトＩＬ－２ｃｘでは、エピトープはＣＤ１２２結合部位に係属するＦ５１１１．２により覆われ、ＣＤ２５エピトープの穏やかなアロステリック変化を誘導した（Ｔｒｏｔｔａ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１８，２４：１００５）。ＩＬ－２がＣＤ１２２－ＣＤ１３２二量体に結合してシグナル伝達を開始するためには、ＣＤ２５偏向性抗ＩＬ－２ ｍＡｂが、ＣＤ２５に結合したＩＬ－２ｃｘから解離する必要があるのかどうかは知られていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５，３６：７６３

【非特許文献2】Ｒｏｓｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８，３６：４１１

【非特許文献3】Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１６，８：３６７

【非特許文献4】Ｒａｅｂｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２０１８，２８３：１７６

【非特許文献5】Ｂｏｙｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００６，３１１：１９２４

【非特許文献6】Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ，ＰＮＡＳ ２０１０，１０７：２１７１

【非特許文献7】Ｔａｎｇ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００８，２８：６８７

【非特許文献8】Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００９，２０６：７５１

【非特許文献9】Ｌｅｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，１３７：３０５

【非特許文献10】Ｓｐａｎｇｌｅｒ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１５，４２：８１５

【非特許文献11】Ｙａｎ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．２０１７，９１：６０３

【非特許文献12】Ｔｒｏｔｔａ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１８，２４：１００５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

上記の技術水準に基づいて、本発明の目的は、炎症を阻害するために、ＩＬ－２シグナルを高親和性ＩＬ－２受容体、特にＴ_ｒｅｇ上に発現する前記受容体に偏向させる、改善された手段及び方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

この目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成される。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1A】図１（Ａ）ｉｎ ｖｉｖｏでアゴニスティックな特性を持つＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）偏向性抗ｈＩＬ－２ｍＡｂを同定するためのスクリーニング設計について示す。ＣＤ２５、ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２、又はＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２を発現する細胞を、それらの蛍光の「バーコード」に基づいてゲーティングした細胞ベースのＩＬ－２Ｒ結合アッセイ及びフローサイトメトリープロットである。ＣＤ２５－ＣｙＰｅｔ、ＣＤ１２２－ＹＰｅｔ、ＣＤ１３２－ＲＦＰの発光スペクトルを、それぞれＡＦ４８８、ＢＶ４２１、ＡＰＣのチャネルで検出した。ＩＬ－２複合体（ＩＬ－２ｃｘ）結合は、ラット抗マウスＩｇＧ－ＢＶ６０５を用いてＢＶ６０５チャネルで記録した。ヒストグラム（右）は、ＩＬ－２／抗ＩＬ－２ｍＡｂ_ＣＤ２５（中）、ＩＬ－２／抗ＩＬ－２ｍＡｂ_{ＣＤ１２２}（下）及び陰性対照（上）の結合を示す。

【図1BC】図１（Ｂ）は、（Ａ）と同様にＩＬ－２ｃｘ結合を定量した。リードアウトは、ＣＤ２５（白棒）又はＣＤ１２２＋ＣＤ１３２（灰色棒）を発現する細胞にて定量したＢＶ６０５の幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）であり、各抗ＩＬ－２ ｍＡｂについて個別にプロットした。３～４回の実験から得られたプールデータ±ＳＥＭ。ｇＭＦＩバックグラウンドは差し引いた。対応のない両側ｔ検定。図１（Ｃ）は、（Ａ）と同様にゲーティングしたＣＤ２５－ＣｙＰｅｔ、ＣＤ１２２－ＹＰｅｔ＋ＣＤ１３２^－ＲＦＰ、又はＣＤ２５－ＣｙＰｅｔ＋ＣＤ１２２－ＹＰｅｔ＋ＣＤ１３２－ＲＦＰを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＩＬ－２_Ｒｈｏｄ（ＰＥチャネル）と抗ＩＬ－２ ｍＡｂ（ラット抗マウスＩｇＧ－ＢＢ６０５）との結合に対するフローサイトメトリーの定量である。対照細胞は、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄなしでインキュベートした。棒グラフは、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ陽性画分（色なし）又はＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／抗ＩＬ－２ ｍＡｂの二重陽性画分（色あり）の頻度±ＳＥＭを示す。３～４回の実験から得られたデータをプールした。

【図1DEFGH】図１（Ｄ）は、ＣＤ２５（Ｙ軸）又はＣＤ１２２＋ＣＤ１３２（Ｘ軸）（左プロット）、及びＣＤ２５（Ｙ軸）又はＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２（Ｘ軸）（右プロット）への結合に基づいてクラスタ化したＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／抗ＩＬ－２ ｍＡｂ複合体のマトリックスを示す。ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／抗ＩＬ－２ ｍＡｂ複合体の陽性集団の平均パーセンテージは（Ｃ）で得た。図１（Ｅ）は、三量体高親和性ＩＬ－２Ｒを発現する細胞とのインキュベーション時における複合型ＩＬ－２_Ｒｈｏｄと遊離型ＩＬ－２_Ｒｈｏｄの比較を示す。ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ対ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／抗ＩＬ－２ｍＡｂ複合体の陽性集団の平均パーセンテージは（Ｃ）で得た。図１（Ｆ）は、記載の抗ＩＬ－２ ｍＡｂクローンの「ＣＤ２５偏向」と「ＩＬ－２送達」のマトリックスを示す。クラスタは、ＣＤ２５結合に対するＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／抗ＩＬ－２ ｍＡｂ複合体の結合（Ｙ軸）対ＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２に対する遊離ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ結合（Ｘ軸）を示している。（Ｃ）で得たＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／抗ＩＬ－２ ｍＡｂ複合体の陽性集団とＩＬ－２_Ｒｈｏｄ陽性集団の平均パーセンテージを表示する。図１（Ｇ）は、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／抗ＩＬ－２複合体のＣＤ２５と、ＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２とへの結合の差又は比率により、抗ＩＬ－２ ｍＡｂ放出を示す。図１（Ｈ）は、試験した抗ＩＬ－２ ｍＡｂクローンの概要を示す。

【図2ABC】図２（Ａ）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＩＬ－２（１．５μｇ又は３０μｇ）及びＩＬ－２／抗ＩＬ－２複合体（１．５μｇ／１５μｇ）を０、１、２日目に注入して４日目に安楽死させ、フローサイトメトリーを用いてリンパ節（ＬＮ）及び脾臓におけるＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋Ｔ細胞の頻度分析を行った。（Ａ）４日目に定量した脾臓及びＬＮにおけるＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞の頻度とカウント数を示す。２～３の実験の平均値±ＳＥＭが示され、ＩＬ－２（３０μｇ）及びＵＦＫＡ－５０についてはｎ＝２；ＩＬ－２（１．５μｇ）、ＵＦＫＡ－１０、ＵＦＫＡ－３０、ＵＦＫＡ－４０、ＮＡＲＡ１についてはｎ＝５；ＰＢＳ及びＵＦＫＡ－２０についてはｎ＝６。対応のない両側ｔ検定。（Ｂ）脾臓からのＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋Ｔ細胞、及びＣＤ３^－ＮＫ１．１^＋ＣＤ１２２^＋の平均細胞数をＰＢＳ治療マウスに対する倍率変化として示す。（Ｃ）脾臓のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋Ｔ細胞のカウント数の比率をプロットした。平均値±ＳＥＭ。対応のない両側ｔ検定。赤の破線は、ＩＬ－２（１．５μｇ）治療済み動物から得られた平均値を示す。

【図3AB】図３は、野生型（ＷＴ：Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０、１、２日目にＩＬ－２（１．５μｇ又は３０μｇ）及びＩＬ－２／抗ＩＬ－２複合体（１．５μｇ／１５μｇ）を注入し、４日目に安楽死させてフローサイトメトリーによりリンパ節及び脾臓の細胞サブセット頻度を測定したものを示す。（Ａ）４日目のリンパ節及び脾臓におけるＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋Ｔ細胞の頻度を示す。（Ｂ）脾臓ＣＤ３^－ＮＫ１．１^＋ＣＤ１２２^＋ＮＫ細胞の頻度を示す。２～３の実験の平均値±ＳＥＭであり、ＩＬ－２（３０μｇ）及びＵＦＫＡ－５０についてはｎ＝２；ＩＬ－２（１．５μｇ）、ＵＦＫＡ－１０、ＵＦＫＡ－３０、ＵＦＫＡ－４０、及びＮＡＲＡ１についてはｎ＝５；ＰＢＳ及びＵＦＫＡ－２０についてはｎ＝６。赤の破線はＩＬ－２（１．５μｇ）治療済み動物で得られた平均値を示す。

【図4AB】図４は、ＩＬ－２（１μｇ又は３０μｇ）又はＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０複合体（１μｇ／１０μｇ）をＣ５７ＢＬ／６に単回注入した。（Ａ）マウスを安楽死させ、脾臓ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞のうちリン酸化ＳＴＡＴ５^＋（ｐＳＴＡＴ５）細胞の頻度をフローサイトメトリーで、２時間後（２ｈｒ）に、ＰＢＳ（灰色）、ＩＬ－２（１μｇ、白）、ＩＬ－２（３０μｇ、黒）又はＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０複合体（濃い灰色）を注入後１日目（ｄ１）、２日目（ｄ２）、４日目（ｄ４）及び８日目（ｄ８）に測定した。データは３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭで示し、１群あたりｎ＝５マウスである。一元配置分散分析とテューキ多重比較検定。（Ｄ）脾臓一元配置分散分析Ｔ細胞及びＮＫ細胞の細胞数をＰＢＳに対する倍率変化で表した。データは３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭで示し、１群あたりｎ＝５マウスである。一元配置分散分析とテューキの多重比較検定。

【図5】図５は、野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＩＬ－２（１．５μｇ；色なしシンボル）、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０複合体（ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘ；黒シンボル）又はＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２複合体（ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘ；赤シンボル）を単回注入した。ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘ及びＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘは、ヒトＩＬ－２（１．５μｇ）とそれぞれＵＦＫＡ－２０（１５μｇ）、ＵＦＫＡ－２２（１５μｇ）を１：１のモル比で複合化することにより生成した。注入後、指示された時点（時間単位：ｈｒ）で血液試料を採取し、サンドイッチ酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて血清中のヒトＩＬ－２を検出した。半減期（ｔ_１／２）値は、指数関数的な一相減衰曲線に適合させて算出した。ＩＬ－２はｎ＝７の平均値、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘはｎ＝９の平均値、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘはｎ＝３の平均値で示している。

【図6】図６は、フローサイトメトリーで測定したＣＤ４^＋ＣＤ１２７^ｌｏｗＦｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５のＩＬ－２複合体の刺激の定量を示す。１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２をＵＦＫＡ－２０又はＵＦＫＡ－２２と１：１モル比で複合化した。滴定したＩＬ－２（左グラフ）、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘ（中グラフ）、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘ（右グラフ）に応答する、表示のヒトＴ細胞サブセットのｐＳＴＡＴ５レベルを示す。ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^ｌｏｗＦｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞（色なしシンボル）及びＣＤ８^＋Ｔ細胞（色ありシンボル）の両方において、半数最大効果濃度（ＥＣ５０）を各条件で算出した。適合した用量反応曲線は線で示す。データは３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭで示す。

【図7AB】図７（Ａ）は図２に記載のとおりの実験設定を示す。マウスは、ＰＢＳ、ＩＬ－２（１μｇ）単独又はキメラＵＦＫＡ－２０ ｍＡｂ（ｃｈＵＦＫＡ－２０）又はヒト化ＵＦＫＡ－２０バリアントＵＦＫＡ－２２－００（ＵＦＫＡ－２２と呼ぶ）、ＵＦＫＡ－２２－０２及びＵＦＫＡ－２２－０７との複合体（１：１モル比）の注入を３回受けた。マウスは４日目に安楽死させ、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーにより脾臓で分析した。４日目に脾臓ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞の頻度と数を定量した。（Ｂ）脾臓ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋Ｔ細胞の数の比率をプロットした。３回の実験による平均値±ＳＥＭを示し、ＰＢＳ、ＩＬ－２、及びＵＦＫＡ－２２－０７はｎ＝３であり、ＵＦＫＡ－２０、ｃｈＵＦＫＡ－２０、ＵＦＫＡ－２２－０２、及びＵＦＫＡ－２２－０７はｎ＝５である。

【図8A】図８（Ａ）は、アカゲザルに、６日目までＩＬ－２を毎日注入するか、又は０日目と３日目にＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２複合体又はＵＦＫＡ－２２ ｍＡｂのみを２回注入した。血液を採取し、表示の時点で分析した。ＩＬ－２及びＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２複合体治療群は、低用量（ＬＤ：ｌｏｗ－ｄｏｓｅ）又は高用量（ＨＤ：ｈｉｇｈ－ｄｏｓｅ）治療を受ける２つの群に細分化され、これは、それぞれ１０μｇ／ｋｇ又は３３μｇ／ｋｇのＩＬ－２に対応しており、一方で、ＵＦＫＡ－２２ ｍＡｂ単独は３３０μｇ／ｋｇの用量で注入した。ヒトＩＬ－２及びアカゲザルＩＬ－２に対するＵＦＫＡ－２０（左表）及びＵＦＫＡ－２２（右表）のＥＣ５０は、ＩＬ－２サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。

【図8B】図８（Ｂ）は、血中ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５^＋細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。－８日目に測定したベースラインでのｐＳＴＡＴ５レベル（上）、及び１日目にＬＤ ＩＬ－２（中）及びＬＤ ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２（下）治療時のｐＳＴＡＴ５レベルのヒストグラムであり、各群につきｎ＝３である。

【図8C】図８（Ｃ）は、フローサイトメトリーで測定した試験期間中の血液中のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の集団の頻度を示す。

【図8DE】図８（Ｄ）は、フローサイトメトリーで測定した血液中の示された時点のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３、ＣＴＬＡ－４及びＫｉ－６７のｇＭＦＩを示す。（Ｃ）及び（Ｄ）については、平均値±ＳＥＭを白色点（ＩＬ－２治療群）、灰色点（ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２複合体治療群）、及び濃灰色点（ＵＦＫＡ－２２ ｍＡｂ治療群）でプロットした。有意性は、６日目に対応のないｔ検定（両側）で判定した。ｎｓは、有意性なし（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）を表す。図８（Ｅ）は、６日目のＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞の数に対するＴ_ｒｅｇ（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４ Ｔ）細胞の比率を示す。平均値±ＳＥＭ及び個々の値をプロットする。有意性は一元配置分散分析、ダネットの多重比較により判定した。ｎｓは、有意性なし（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）を示す。

【図9A】図９（Ａ）は、ＩＬ－２（紫）、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα、薄橙）、ＣＤ１２２（ＩＬ－２Ｒβ、白）、及びＣＤ１３２（ＩＬ－２Ｒγ、灰色）から構成されるヒト四元ＩＬ－２Ｒ複合体に重ねられるＩＬ－２／抗ＩＬ－２ ｍＡｂ複合体構造の正面及び９０°回転した側面図を示す。ＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒ複合体（ＰＤＢ：２Ｂ５Ｉ）；ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０複合体（ＰＤＢ：６ＹＥ３）；ＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体（ＰＤＢ：５ＵＴＺ）；ＩＬ－２／ＪＥＳ６－１複合体（ＰＤＢ：４ＹＱＸ）；ＩＬ－２／ＮＡＲＡ１複合体（ＰＤＢ：５ＬＱＢ）での比較を示す。

【図9B-1】図９（Ｂ）は、ＩＬ－２／抗ＩＬ－２複合体とのＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒ結合エピトープのオーバーラップの平衡表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）定量を示す。ＣＤ２５結合部位、ＣＤ１２２結合部位、及びＣＤ１３２結合部位。棒グラフは、ＰＤＢｅＰＩＳＡを用いて埋没表面積（Å^２）に基づいて算出した、抗体と受容体エピトープとの相対的なオーバーラップを示す。

【図9B-2】図９（Ｂ）は、ＩＬ－２／抗ＩＬ－２複合体とのＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒ結合エピトープのオーバーラップの平衡表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）定量を示す。ＣＤ２５結合部位、ＣＤ１２２結合部位、及びＣＤ１３２結合部位。棒グラフは、ＰＤＢｅＰＩＳＡを用いて埋没表面積（Å^２）に基づいて算出した、抗体と受容体エピトープとの相対的なオーバーラップを示す。

【図9B-3】図９（Ｂ）は、ＩＬ－２／抗ＩＬ－２複合体とのＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒ結合エピトープのオーバーラップの平衡表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）定量を示す。ＣＤ２５結合部位、ＣＤ１２２結合部位、及びＣＤ１３２結合部位。棒グラフは、ＰＤＢｅＰＩＳＡを用いて埋没表面積（Å^２）に基づいて算出した、抗体と受容体エピトープとの相対的なオーバーラップを示す。

【図9CD】図９（Ｃ）は、示されるとおりの、固定化したＵＦＫＡ－２０又はＮＡＲＡ１によって捕捉されたＩＬ－２上のＣＤ２５及びＣＤ１２２のＳＰＲ滴定を示す。データは３回の実験の代表値である。ＲＵは、レゾナンスユニットを示す。図９（Ｄ）は、ＵＦＫＡ－２０及びＣＤ２５発現、ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２発現及びＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２発現のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の間のＩＬ－２の競合を示す。一定の濃度のＩＬ－２_Ｒｈｏｄ（０．２μｇ／ｍｌ）を滴定量のＵＦＫＡ－２０と混合し、ＩＬ－２Ｒ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と共にインキュベートした。２回の実験の平均値±ＳＥＭをプロットする。

【図10-1】図１０は、ヒトＩＬ－２と、ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２、ＵＦＫＡ－２０－００、Ｆ５１１１、及びＮＡＲＡ１との間の埋没表面積（ＢＳＡ）を平方オングストローム（Å^２）で示す。ＰＤＢｅＰＩＳＡサーバーを使用し、ＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒ四元複合体（ＰＤＢ：２Ｂ５Ｉ）、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０－００複合体（ＰＤＢ：６ＹＥ３）、及びＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体（ＰＤＢ：５ＵＴＺ）の結晶構造を使用して計算した。ヘリックスＡ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、及びＤの注釈付きのヒト ＩＬ－２タンパク質配列の３文字アミノ酸コード（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚら，２０１５）。ヒトＩＬ－２及びそのリガンド（ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２、ＵＦＫＡ－２０－００、Ｆ５１１１、ＮＡＲＡ１）のアミノ酸残基のＢＳＡ値（０．００Å^２超過）を示す。さらに、作用を受けるアミノ酸残基の１文字アミノ酸コードも表示する。

【図10-2】図１０は、ヒトＩＬ－２と、ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２、ＵＦＫＡ－２０－００、Ｆ５１１１、及びＮＡＲＡ１との間の埋没表面積（ＢＳＡ）を平方オングストローム（Å^２）で示す。ＰＤＢｅＰＩＳＡサーバーを使用し、ＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒ四元複合体（ＰＤＢ：２Ｂ５Ｉ）、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０－００複合体（ＰＤＢ：６ＹＥ３）、及びＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体（ＰＤＢ：５ＵＴＺ）の結晶構造を使用して計算した。ヘリックスＡ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、及びＤの注釈付きのヒト ＩＬ－２タンパク質配列の３文字アミノ酸コード（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚら，２０１５）。ヒトＩＬ－２及びそのリガンド（ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２、ＵＦＫＡ－２０－００、Ｆ５１１１、ＮＡＲＡ１）のアミノ酸残基のＢＳＡ値（０．００Å^２超過）を示す。さらに、作用を受けるアミノ酸残基の１文字アミノ酸コードも表示する。

【図10-3】図１０は、ヒトＩＬ－２と、ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２、ＵＦＫＡ－２０－００、Ｆ５１１１、及びＮＡＲＡ１との間の埋没表面積（ＢＳＡ）を平方オングストローム（Å^２）で示す。ＰＤＢｅＰＩＳＡサーバーを使用し、ＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒ四元複合体（ＰＤＢ：２Ｂ５Ｉ）、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０－００複合体（ＰＤＢ：６ＹＥ３）、及びＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体（ＰＤＢ：５ＵＴＺ）の結晶構造を使用して計算した。ヘリックスＡ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、及びＤの注釈付きのヒト ＩＬ－２タンパク質配列の３文字アミノ酸コード（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚら，２０１５）。ヒトＩＬ－２及びそのリガンド（ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２、ＵＦＫＡ－２０－００、Ｆ５１１１、ＮＡＲＡ１）のアミノ酸残基のＢＳＡ値（０．００Å^２超過）を示す。さらに、作用を受けるアミノ酸残基の１文字アミノ酸コードも表示する。

【図11】図１１は、ｈＩＬ－２上の予測されるＵＦＫＡ２０結合部位を示す平方オングストローム（Å^２）の埋没表面積の予測を示す。

【図12ABC】図１２は、最適なＵＦＫＡ－２０の親和性が、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞を刺激する能力に影響を与えることを示している。（Ａ）標記のＵＦＫＡ－２０バリアントの結合親和性解離定数（Ｋ_Ｄ）をシングルサイクル表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定により測定した。（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスは、ＩＬ－２／抗ＩＬ－２ｃｘ（１μｇ ＩＬ－２：１０μｇ ＵＦＫＡ－２０バリアント）の単回注入を受けた。脾臓におけるＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞の頻度の平均値±ＳＤは、４日目にフローサイトメトリーで測定した。点線はＰＢＳ治療マウスによる平均値を示す。（Ｃ）抗体のＫ_ＤとＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞を誘導する能力との相関を示す（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋の頻度の平均値±ＳＤ）。

【図13ABCD】図１３は、ＰｙＭＯＬソフトウェアを使ってオングストローム（Å）で測定した、ＩＬ－２のカルボキシ（Ｃ）末端とＵＦＫＡ－２０の可変重鎖（ｖＨ）又は可変軽鎖（ｖＬ）のアミノ（Ｎ）末端との間の距離を示す。（Ａ）ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ Ｆａｂ複合体の結晶構造（ＰＤＢ：６ＹＥ３）。（Ｂ）ＩＬ－２のＣ末端とＵＦＫＡ－２０ ｖＨ（上段）及びＵＦＫＡ－２０ ｖＬ（下段）のＮ末端との間の距離（黒点線）。ＵＦＫＡ－２０ ｖＨは黒で示し、ＵＦＫＡ－２０ ｖＬは灰色で示し、ＩＬ－２は白で示す。（Ｃ）ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２融合タンパク質（ＦＰ：ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の模式図であり、ここでＩＬ－２はＵＦＫＡ－２２軽鎖又は重鎖にＮ末端で結合している。（Ｄ）２つの異なる状態でのＵＦＫＡ－２２ＦＰ ｖＬ（Ｇ_４Ｓ）_６を示す。（左）ＩＬ－２はＵＦＫＡ－２２の結合ポケットに会合していないか、又はＩＬ－２はＵＦＫＡ－２２の結合ポケットに会合している（右）。

【図14ABCD】図１４は、マウスのｉｎ ｖｉｖｏでのＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２とＵＦＫＡ－２２ＦＰとの比較を示す。（Ａ）実験設計：Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０、１、２日目にＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘ（１２μｇ［２μｇ ＩＬ－２及び１０μｇ ＵＦＫＡ－２２］）、ＵＦＫＡ－２２ＦＰ ｖＨ（Ｇ_４Ｓ）_５（１２μｇ又は２４μｇ）及びＵＦＫＡ－２２ＦＰ ｖＬ（Ｇ_４Ｓ）_６（１２μｇ又は２４μｇ）を注入した。マウスは４日目に安楽死させ、脾臓におけるＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔｒｅｇ細胞及びＣＤ８^＋ＣＤ１２２^＋ＣＤ４４^ｈｉＴ細胞の頻度をフローサイトメトリーで分析した。（Ｂ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞中のＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋、（Ｃ）ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔｒｅｇ細胞上のＫｉ－６７^＋、及び（Ｄ）ＰＢＳ、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２及びＵＦＫＡ－２２ＦＰ治療マウスの、（Ａ）と同様の脾臓におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示し、平均値±ＳＥＭである。Ｐ値は一元配置分散分析とテューキの多重比較検定を用いて算出した；ｎｓは有意ではないことを示す。

【図15ABCD】図１５は、（Ａ）形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）及び従来のＩ型及びＩＩ型ＤＣ（ｃＤＣ１及びｃＤＣ２）を含むマウス脾臓ＤＣサブセットに対するフローサイトメトリーゲーティング戦略を示す。（Ｂ）ＩＬ－２、ＣＤ２５偏向ＩＬ－２／５３４４複合体、又はＣＤ１２２偏向ＩＬ－２ｃｘ（ＩＬ－２／ＮＡＲＡ１複合体）で治療したマウスからの脾臓ｃＤＣの増大を示す（１群あたりｎ＝７～９マウス）。（Ｃ）は、（Ｂ）で示した治療を受けたマウスの脾臓ｃＤＣの増殖を、３日間のＢｒｄＵ取り込みで測定した（１群あたりｎ＝７～９マウス）。（Ｄ）未治療及びＩＬ－２ｃｘ治療（ＩＬ－２／ＮＡＲＡ１複合体）のマウスの脾臓ｃＤＣ上のＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩの存在量を代表的なヒストグラム（左パネル）で示し、未治療に正規化したｇＭＦＩの倍数変化（右パネル）を示した。データは平均＋／－ＳＥＭで示される（１群あたりｎ＝９マウス）。

【図16AB】図１６（Ａ）は、１５０万国際単位（ＩＵ）のアルデスロイキンを５日間連続で毎日皮下注入し、アルデスロイキン注入前後に採血を行う試験である治験責任医師主導型（ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ）臨床試験の試験設計（上段）を示す。ヒトｃＤＣサブセットの対応するゲーティング戦略は、ＣＤ１４１^＋ｃＤＣ１及びＣＤ１ｃ^＋ｃＤＣ２を同定する（下段）。図１６（Ｂ）は、アルデスロイキン治療前後の患者の末梢血におけるＫｉ６７^＋増殖型ｃＤＣ１（ｎ＝８）及びｃＤＣ２（ｎ＝１０）のパーセンテージを示す。

【図17ABCD】図１７（Ａ）は、抑制性ＩＬ－２ｃｘ（ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０複合体）で連続３日間治療した後の脾臓ｃＤＣの定量を示す。図１７（Ｂ）は、３日間のＢｒｄＵ取り込みによって測定される（Ａ）のマウスの脾臓ｃＤＣの増殖を示す。データは平均＋／－ＳＥＭ（１群あたりｎ＝７マウス）である。ｃＤＣ上の（Ｃ）ＭＨＣ－ＩＩ、及び（Ｄ）ＣＤ８０のＵＦＫＡ－２０複合体による表面発現を、未治療及び（Ａ）のとおりのＵＦＫＡ－２０複合体治療のマウスの脾臓ｃＤＣについてフローサイトメトリーにより測定し、未治療に対して正規化した幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）の倍数変化として表示する。データは平均＋／－ＳＥＭで示される（１群あたりｎ＝５～８マウス）。

【図17E】図１７（Ｅ）のとおりの３日間のＵＦＫＡ－２０複合体治療後１日にマウスから単離した、選別された従来型ＤＣ（ｃＤＣ）のＲＮＡシーケンシングである。ＵＦＫＡ－２０複合体治療マウスで濃縮された遺伝子が右側であり、未治療マウスで濃縮された遺伝子が左側である、差次的発現遺伝子のボルケーノプロットを示す。各ドットは単一の遺伝子を表し、明るい灰色は未治療と比較して変化が有意でない遺伝子を表示し、黒いドットは未治療と比較して有意差（Ｐ＜０．０５）を示す遺伝子を表示する。代表的な炎症促進タンパク質又は抗炎症タンパク質をコードする遺伝子を示す。カットオフはｌｏｇ２比が０．５とした。Ｔｇｆｂｉ，トランスフォーミング成長因子β誘導型；Ｉｌ１ｒｎ，インターロイキン１受容体アンタゴニスト；Ｔａｂ１，ＴＧＦ－β活性化キナーゼ１／ＭＡＰ３Ｋ７結合タンパク質１；Ｉｌ６ｓｔ，インターロイキン６シグナルトランスデューサー；Ｌｔｂ，リンパトキシンβ；Ｔｎｆｓｆ１４，腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１４；Ｃｓｆ１，コロニー刺激因子１；Ｆａｓ，ＴＮＦ受容体のスーパーファミリーメンバー６。

【発明を実施するための形態】

【0009】

表１は、既報の抗ＩＬ－２ ｍＡｂ ＪＥＳ６－１、Ｆ５１１１、ＮＡＲＡ１との比較における、抗ＩＬ－２ ｍＡｂ ＵＦＫＡ－２０、ＵＦＫＡ－２２－００（略称：ＵＦＫＡ－２２）、ＵＦＫＡ－２２－０２、及びＵＦＫＡ－２２－０７のＳＰＲ解析である。

【0010】

表２は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定したフレームワーク変異を持つＵＦＫＡ－２２バリアントのＩＬ－２結合特性を示す。

【0011】

表３は、ＵＦＫＡ－２０バリアントにおけるＶＨ（配列番号０１９）及びＶＬ（配列番号０２０）の改変を示す。

【0012】

表４は、表３によるＵＦＫＡ２０バリアントのアミノ酸置換の予測される規則を示す。

【0013】

発明の概要
本発明は、ＩＬ－２ｃｘ形成性ＩＬ－２抗体のＣＤ２５への結合に基づく選択と、その後のＣＤ１２２－ＣＤ１３２二量体ＩＬ－２ＲへのＩＬ－２の送達とを可能にする新規の細胞ベースのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング法の結果に基づき、高い存在量のＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒαとも呼ぶ）を発現する細胞へのＩＬ－２の送達において特に有効な、抗ヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）ｍＡｂを提供する：ここで、これらの細胞は、細胞内シグナル伝達経路を開始するために、ＣＤ１２２（ＩＬ－２Ｒβとも呼ばれる）及びＣＤ１３２（ＩＬ－２Ｒγとも呼ばれる）もまた保持している必要がある。ヒトインターロイキン－２（ｈＩＬ－２）特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）との複合体であるヒトＩＬ－２の投与は、マウス及びサル（ｍａｃａｑｕｅ）のｉｎ ｖｉｖｏでのＴ_ｒｅｇ細胞の優先的な増大をもたらす。

【0014】

本発明の第１の態様は、ｈＩＬ－２分子の規定のアミノ酸残基を含むが、他の残基はカバーしていないままであるエピトープに特異的な、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂ、又は抗体断片である。特定の実施形態では、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂのｈＩＬ－２への結合は、解離定数（Ｋ_Ｄ）≦５．５１×１０^－９、特に≦５．１３×１０^－９、結合速度（オンレート）（Ｋ_ｏｎ）≧４．１２×１０^５Ｌｍｏｌ^－１ｓ^－１、特に≧４．６６×１０^５Ｌｍｏｌ^－１ｓ^－１及び解離速度（オフレート）（Ｋ_ｏｆｆ）≦２．８３×１０^－３ｓ^－１、特に≦２．３９×１０^－３ｓ^－１によって特徴づけられるか、又は本発明による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂとｈＩＬ－２との複合体は、ＣＤ１２２と比較してＣＤ２５に優先的に結合し、かつ前記複合体が、ＣＤ１２２及びＣＤ１３２を発現することに加えてＣＤ２５を高い存在量で発現する細胞と相互作用する場合に、前記抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂはＩＬ－２から解離する。これらの特徴により、ｈＩＬ－２と結合する際に、ＩＬ－２Ｒα＋Ｔ_ｒｅｇに、ＥＣ５０が０．１５４ｎｇ／ｍｌで結合するが、ＩＬ－２Ｒβ＋ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋Ｔ細胞には、ＥＣ５０が４４２．９ｎｇ／ｍｌで結合する、複合体を形成する抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂが提供される。

【0015】

本発明の別の態様は、Ｖ_Ｈ相補性決定領域ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２、及びＣＤＲ_Ｈ３を含む重鎖可変（Ｖ_Ｈ）領域、及びＶ_Ｌ相補性決定領域ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２、及びＣＤＲ_Ｌ３を含む可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）領域を有する、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂであり、特に、本発明の第１の態様による特徴を有する抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂであり、ここで、前記ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２、ＣＤＲ_Ｈ３、ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２、及びＣＤＲ_Ｌ３は、配列番号００１、配列番号００２、配列番号００３、配列番号００４、配列番号００５、及び配列番号００６をそれぞれ含むか、又はそれと同一である。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、配列番号００７のＶ_Ｈ配列に、及び配列番号０１５のＶ_Ｌ配列に、又は特定の機能的に類似した配列に含まれる。

【0016】

本発明の別の態様は、ｈＩＬ－２タンパク質ドメイン、及びペプチドリンカー、特に約３０アミノ酸長のペプチドリンカーによって結合された抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂドメインを含むｈＩＬ－２融合タンパク質である。

【0017】

さらなる態様は、本発明による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂ、若しくはその抗体断片、又はｈＩＬ－２融合タンパク質をコードする核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクター、又は本発明による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂ又は融合タンパク質を含むか、又は産生することができる細胞又はハイブリドーマ株を提供する。

【0018】

本発明のさらなる態様は、医薬品として、特に同種移植関連性疾患、慢性炎症、アレルギー、又は自己免疫などの免疫炎症を治療するための医薬品として、ｈＩＬ－２と共に、任意に非共有結合で会合した、ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又は抗原結合断片を含む医薬組成物に関する。抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂを含む医薬組成物はまた、さらなる免疫抑制剤、又は薬学的に許容される担体を含んでもよい。

【0019】

本発明の別の別個の態様は、ＩＬ－２複合体を含む、樹状細胞（ＤＣ）機能の強化から恩恵を受ける症状の患者において使用するための医薬組成物である。前記ＩＬ－２複合体は、ヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）ポリペプチドと、ｈＩＬ－２特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）との両方を含む。適切なｈＩＬ－２特異的ｍＡｂの例は、米国特許出願公開第２０１７０１１４１３０号（Ａ１）に開示されるものであり、その内容は参照により本明細書に組み込まれるものであるか、又は上記の態様及び実施形態のいずれか１つによるｈＩＬ－２特異的ｍＡｂである。本発明のこの態様によるＩＬ－２複合体は、ＣＤ１２２及びＣＤ１３２を含む中間親和性ＩＬ－２Ｒと比較して、ＣＤ２５に、及び／又はＣＤ１２２、ＣＤ１３２及びＣＤ２５を含む高親和性ＩＬ－２受容体に優先的に結合する。

【0020】

発明の詳細な説明
用語と定義
本明細書の解釈のために、以下の定義が適用され、適切な場合には、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆もまた然りである。以下に定める定義が、参照により本書に組み込まれた文書と矛盾する場合、定められた定義が優先されるものとする。

【0021】

本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び他の同様の形態、並びにそれらの文法的に同等な用語は、意味において同等であること、及びこれらの単語のいずれか１つに続く１つ又は複数の項目が、係る１つ又は複数の項目を網羅的にリストするものではない、又はリストした１つ又は複数の項目のみに限定するものではないことにおいてオープンエンドとすることを意図している。例えば、成分Ａ、Ｂ及びＣを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」品目は、成分Ａ、Ｂ及びＣからなる（すなわち、成分Ａ、Ｂ及びＣのみを含有する）こともできるし、又は成分Ａ、Ｂ及びＣのみならず、１つ又は複数の他の成分を含むこともできる。そのため、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその類似の形態、並びにその文法的に同等な用語には、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の実施形態の開示が含まれることが意図及び理解されている。

【0022】

値の範囲が提供されている場合、文脈上明確に別段の指示がない限り、その範囲の上限と下限の間の下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載の範囲内の他の記載値又は介在値のそれぞれは、記載の範囲内で具体的に除外される限界に従って、本開示内に包含されると理解される。記載された範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除いた範囲もまた開示に含まれる。

【0023】

本明細書において、ある値又はパラメーターに関する「約」の言及は、その値又はパラメーターそれ自体を対象とする変化形を含む（及び記述する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。

【0024】

添付の特許請求の範囲を含み、本明細書で使用されるとおり、単数形の「ａ」、「又は（ｏｒ）」及び「ｔｈｅ」は、文脈によって明らかに指示されない限り、複数の参照語を含む。

【0025】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学）により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。分子、遺伝、生化学的手法（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第４編．（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）第５編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）及び化学的手法には、標準的な技術を使用する。

【0026】

本明細書において、「陽性」という用語は、マーカーの発現の文脈で使用される場合、蛍光標識抗体によってアッセイされる抗原の発現を指し、「陽性」とされる構造（例えば、細胞）上の標識の蛍光は、同じ標的に特異的に結合しないアイソタイプが一致する蛍光標識抗体で染色した場合と比較して、蛍光強度の中央値が少なくとも３０％高く（≧３０％）、特に≧５０％又は≧８０％である。マーカーのこのような発現は、例えばＣＤ２５^＋のようにマーカーの名前の後に上付き文字「プラス」（^＋）で表示される。

【0027】

本明細書において、「陰性」という用語は、マーカーの発現の文脈で使用される場合、蛍光標識抗体によってアッセイされた抗原の発現を指し、蛍光強度の中央値が、同じ標的に特異的に結合しないアイソタイプ一致抗体の蛍光強度の中央値よりも、３０％未満、特に１５％未満で高い。マーカーのこのような発現は、マーカーの名前の後に上付き文字の「マイナス」（^－）で示され、例えばＣＤ２５^－である。

【0028】

マーカーの高発現、例えばＣＤ２５の高発現は、細胞あたりのより低い蛍光強度を特徴とする他の集団と比較して細胞あたりの最高の蛍光強度を示すＦＡＣＳによって検出された明確に区別可能な細胞集団におけるそのようなマーカーの発現レベルを指す。高発現は、例えばＣＤ４４^ｈｉｇｈのように、マーカー名の後に上付き文字で「ｈｉｇｈ」又は「ｈｉ」と表示される。「高く発現される」という用語は、同じ特性に関する。

【0029】

マーカーの低発現、例えばＣＤ２５の低発現は、細胞あたりの蛍光強度がより高いことを特徴とする他の集団と比較して、細胞あたりの蛍光強度が最も低いことを示すＦＡＣＳによって検出された明確に区別可能な細胞集団におけるそのようなマーカーの発現レベルを指す。低発現は、例えばＣＤ２５^ｌｏｗのようにマーカーの名前の後に上付き文字「ｌｏｗ」又は「ｌｏ」で表示される。「低く発現される」という用語は、同じ特性に関する。

【0030】

マーカーの発現は、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、又はマルチプレックス分析などの技術を介して評価することができる。

【0031】

アミノ酸残基の配列はアミノ末端からカルボキシル末端へ記載される。配列位置の大文字は、１文字コードのＬ－アミノ酸を指す（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３編．ｐ．２１）。アミノ酸配列の位置を示す小文字は、対応するＤ－又は（２Ｒ）－アミノ酸を意味する。配列はアミノ末端からカルボキシ末端に向かって左から右に記載される。標準的な命名法に従い、アミノ酸残基の配列は、以下のように３文字又は１文字のコードのいずれかで表記される。アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。

【0032】

「遺伝子」という用語は、転写され翻訳された後に特定のポリペプチド又はタンパク質をコードすることができる、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド配列は、それらが会合する遺伝子のより大きな断片又は完全長のコード配列を同定するために使用することができる。より大きな断片の配列を単離する方法は、当業者に知られている。

【0033】

「遺伝子発現」又は「発現」という用語、あるいは「遺伝子産物」という用語は、核酸（ＲＮＡ）の生成又はペプチド又はポリペプチドの生成のプロセス－及びその産物－のいずれか、又は両方を指す場合があり、それぞれ転写及び翻訳とも呼ばれ、又は遺伝情報のプロセシングを調節してポリペプチド産物をもたらす中間プロセスのいずれかを指す。「遺伝子発現」という用語は、ＲＮＡ遺伝子産物、例えば制御ＲＮＡ又は構造（例えば、リボソーム）ＲＮＡの転写及びプロセッシングにも適用されてもよい。発現したポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含むことができる。発現は、転写と翻訳、すなわち、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質産物の両方のレベルで評価することができる。

【0034】

本明細書の文脈における「ヌクレオチド」という用語は、核酸又は核酸アナログの構成単位に関するもので、そのオリゴマーは、塩基対形成に基づいてＲＮＡオリゴマー又はＤＮＡオリゴマーと選択的ハイブリッドを形成することが可能である。この文脈での「ヌクレオチド」という用語は、古典的なリボヌクレオチドの構成単位であるアデノシン、グアノシン、ウリジン（及びリボシルチミン）、シチジン、古典的なデオキシリボヌクレオチドのデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、及びデオキシシチジンが挙げられる。さらに、ホスホチオエート、２’Ｏ－メチルホスホチオエート、ペプチド核酸（ＰＮＡ；グリシンのα炭素に核酸塩基を結合した、Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位をペプチド結合で連結したもの）又はロック核酸（ＬＮＡ；２’Ｏ，４’Ｃメチレン架橋ＲＮＡ構成単位）などの核酸のアナログが含まれる。

【0035】

本明細書に開示される配列と類似又は相同（例えば、少なくとも約７０％の配列同一性）の配列もまた、本発明の一部である。いくつかの実施形態において、アミノ酸レベルでの配列同一性は、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上であり得る。核酸レベルでは、配列同一性は約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上とすることができる。あるいは、核酸セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件（例えば、非常に高いストリンジェンシーな（厳密な）ハイブリダイゼーション条件）下で、鎖の相補体にハイブリダイズする場合には、実質的な同一性が存在する。核酸は、全細胞、細胞溶解物、又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在することができる。

【0036】

本明細書の文脈において、「配列同一性」及び「配列同一性の割合」という用語は、整列した２つの配列を位置ごとに比較して決定される配列比較の結果を表す１つの定量的パラメーターを意味する。比較用の配列アライメントの方法は、当技術分野でよく知られている。比較用の配列アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索法、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）、又はこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって実行され、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、例えば、アメリカ国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。

【0037】

アミノ酸配列の比較の一例として、デフォルトの設定を使用するＢＬＡＳＴＰアルゴリズムがある：Ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３；Ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１，Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ。核酸配列の比較のためのそのような例の１つは、デフォルトの設定を使用するＢＬＡＳＴＮアルゴリズムである：Ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：２８；Ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｓｃｏｒｅｓ：１．－２；Ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：Ｌｉｎｅａｒ。特に断らない限り、本明細書で提供される配列同一性値は、それぞれタンパク質及び核酸の比較のための上記で特定されたデフォルトパラメータを使用して、ＢＬＡＳＴのプログラム群を用いて得られた値を指す（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））。

【0038】

パーセンテージ値を指定せずに同一の配列を参照する場合、１００％同一の配列（つまり、同じ配列）を意味する。

【0039】

本明細書の文脈では、「抗体」という用語は、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）又はＭ型（ＩｇＭ）、その任意の抗原結合断片又は単鎖、及び関連又は由来の構築物を含むがこれに限定されない全抗体に関する。全抗体は、少なくとも２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）がジスルフィド結合によって相互接続された糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）とで構成されている。ＩｇＧの重鎖定常領域は、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３の３つのドメインで構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｌと略記）と軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）で構成されている。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣ_Ｌから構成されている。重鎖と軽鎖との可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインを含有している。抗体の定常領域は、免疫系のさまざまな細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分など、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。「抗体」という用語はまた、「抗体様分子」を指す場合もある。

【0040】

同様に、「抗原結合抗体断片」又は「抗原結合断片」という用語は、抗原結合能を保持する抗体分子の一部を包含し、例えば、一価又は二価の抗体断片（それぞれＦ（ａｂ）又はＦ（ａｂ）_２）、いわゆるナノボディ又は単一ドメイン抗体、又はＶ_ＨとＶ_Ｌを含む１つ又はいくつかの単一モノマー可変抗体ドメインからなる抗体断片から選択されるが、これらに限定されない。

【0041】

本明細書の文脈において、「ヒト化抗体」とは、元は非ヒト種の免疫細胞によって産生された抗体であって、そのタンパク質配列がヒトで自然に産生される抗体バリアントとの類似性を高めるように改変されたものを指す。本明細書で使用するとおりの「ヒト化抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含む。ヒトフレームワーク配列内だけでなく、別の哺乳類種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列内でも、さらなるフレームワーク領域の改変がなされてもよい。

【0042】

本明細書の文脈での「抗体様分子」という用語は、別の分子又は標的に高い親和性／Ｋｄ≦１０Ｅ－８ｍｏｌ／ｌで特異的に結合できる分子を指す。抗体様分子は、抗体の特異的な結合と同様にその標的に結合する。「抗体様分子」という用語には、リピートタンパク質を包含し、例えば、設計されたアンキリンリピートタンパク質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｚｕｒｉｃｈ）、高特異性及び高親和性の標的タンパク質結合を示す改変抗体模倣タンパク質（米国特許出願公開第２０１２／１４２６１１号、米国特許出願公開第２０１６／２５０３４１号、米国特許出願公開第２０１６／０７５７６７号及び米国特許出願公開第２０１５／３６８３０２号を参照。これらすべては参照により本書に組み込まれる）などがある。抗体様分子という用語は、さらに、アルマジロリピートタンパク質由来のポリペプチド、ロイシンリッチリピートタンパク質由来のポリペプチド、及びテトラトリコペプチドリピートタンパク質由来のポリペプチドを包含するが、これらに限定されない。

【0043】

「抗体様分子」という用語は、以下から誘導される特異的結合ポリペプチドをさらに包含する：
－ プロテインＡドメイン、
－ フィブロネクチンドメイン ＦＮ３、
－ コンセンサスフィブロネクチンドメイン、
－ リポカリン（Ｓｋｅｒｒａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２０００，１４８２（１－２）：３３７－５０）、
－ ジンクフィンガータンパク質由来のポリペプチド（Ｋｗａｎ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２００３，１１（７）：８０３－８１３）、
－ Ｓｒｃホモロジードメイン２（ＳＨ２）又はＳｒｃホモロジードメイン３（ＳＨ３）、
－ ＰＤＺドメイン、
－ γ－クリスタリン、
－ ユビキチン、
－ システインノットポリペプチド又はノッティン、
－ シスタチン、
－ Ｓａｃ７ｄ、
－ 三重らせんコイルドコイル（アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｙ）とも呼ばれる）、
－ クニッツドメイン又はクニッツ型プロテアーゼ阻害剤、及び
－ 炭水化物結合モジュール３２－２。

【0044】

「プロテインＡドメイン由来ポリペプチド」という用語は、プロテインＡの誘導体であり、免疫グロブリンのＦｃ領域とＦａｂ領域とを特異的に結合することができる分子を指す。

【0045】

「アルマジロリピートタンパク質」という用語は、少なくとも１つのアルマジロリピートを含むポリペプチドを指し、アルマジロリピートは、ヘアピン構造を形成する一対のαヘリックスによって特徴づけられるものである。

【0046】

本明細書の文脈における「ヒト化ラクダ抗体」という用語は、重鎖のみ又は重鎖の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）からなり、かつそのアミノ酸配列はヒトで自然に産生される抗体との類似性が増大するように改変され、その結果、ヒトに投与した場合に免疫原性の低下を示す抗体を指す。ラクダ抗体をヒト化するための一般的な戦略は、以下に示されている：Ｖｉｎｃｋｅら、「Ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｈｕｍａｎｉｚｅ ａ ｃａｍｅｌｉｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｎａｎｏｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄ」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００９年１月３０日；２８４（５）：３２７３－３２８４、及び米国特許出願公開第２０１１１６５６２１号（Ａ１）。

【0047】

本発明の文脈における「特異的結合」という用語は、リガンドの特性を指し、リガンドは、ある親和性及び標的特異性でその標的に結合するものである。このようなリガンドの親和性は、リガンドの解離定数によって示される。特異的に反応するリガンドは、その標的に結合した際の解離定数が１０^－７ｍｏｌ／Ｌ以下であるが、標的と化学組成が全体的に同じであるが立体構造が異なる分子との相互作用では、少なくとも３桁高い解離定数を持つ。

【0048】

本明細書の文脈において、「解離定数（ＫＤ）」という用語は、化学及び物理の技術分野で知られている意味で使用される：［主に２つの］異なる成分からなる複合体が、可逆的にその（２つの）構成成分に解離する傾向を測定する、平衡定数を意味する。この複合体は、例えば、抗体Ａｂと抗原Ａｇからなる抗体抗原複合体ＡｂＡｇとすることができる。Ｋ_Ｄは、モル濃度［ｍｏｌ／ｌ］で表され、［Ａｇ］の結合部位の半分が占有される［Ａｂ］の濃度に相当し、言い換えれば、未結合の［Ａｂ］の濃度が［ＡｂＡｇ］複合体の濃度と等しいことに相当する。解離定数は、以下の式により算出することができる：

【数1】

［Ａｂ］：抗体の濃度、［Ａｇ］：抗原の濃度、［ＡｂＡｇ］：抗体抗原複合体の濃度

【0049】

本明細書の文脈において、オフレート（解離速度）（Ｋ_ｏｆｆ；［１／秒］）及びオンレート（結合速度）（Ｋ_ｏｎ；［Ｌ／秒^＊ｍｏｌ］）という用語は、化学及び物理の技術分野で知られている意味で使用される：これらは、抗体とその標的抗原との解離（Ｋ_ｏｆｆ）又は会合（Ｋ_ｏｎ）を測定する速度定数を指す。Ｋ_ｏｆｆとＫ_ｏｎは、当技術分野で十分に確立された方法を用いて実験的に決定することができる。抗体のＫ_ｏｆｆとＫ_ｏｎとを測定する方法には、表面プラズモン共鳴が採用される。これは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）又はＰｒｏｔｅＯｎ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムにおける原理となっている。これらはまた、以下の式を用いて解離定数Ｋ_Ｄを求めるために使用することができる：

【数2】

オンレートＫ_ｏｎの自然の上限は、１０^９Ｌ／秒^＊ｍｏｌである。

【0050】

本明細書で使用されるとおり、「医薬組成物」という用語は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を伴う、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を指す。特定の実施形態では、本発明による医薬組成物は、局所、非経口又は注入投与に適した形態で提供される。

【0051】

本明細書で使用されるとおり、「薬学的に許容される担体」という用語には、当業者に知られているとおり、任意の溶媒、分散媒質、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料など、及びそれらの組み合わせを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、ＩＳＢＮ ０８５７１１０６２４を参照）。

【0052】

本明細書で使用されるとおり、任意の疾患又は障害（例えば、がん）の「治療」又はそれを「治療する」という用語は、一実施形態において、疾患又は障害を改善すること（例えば、疾患又はその臨床症状の少なくとも１つの発生を遅らせること、停止させること、又は低減させること）を指す。別の実施形態では、「治療」又は「治療する」は、患者が識別できない可能性のあるものを含む少なくとも１つの身体的パラメーターを緩和すること又は改善することを指す。さらに別の実施形態では、「治療」又は「治療する」は、身体的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、身体的パラメーターの安定化）、又はその両方のいずれかで、疾患又は障害を調節することを指す。疾患の治療及び／又は予防を評価する方法は、以下に特に記載しない限り、当該技術分野において一般的に知られているものである。

【0053】

本明細書で提供する複合体の文脈における「インターロイキン－２」、「ＩＬ－２」、又は「ｈＩＬ－２」という用語は、特に指示しない限り、ヒトＩＬ－２ポリペプチドを指す。全体を通してのヒトＩＬ－２残基の番号付けは、図１０（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ６０５６８）で示されたものを指す。この用語には、物質であるテセロイキン（００９４２１８－７５－４）、アルデスロイキン（ＣＡＳ １１０９４２－０２－４）、又はそのバリアントＢＡＹ ５０－４７９８などの組換え産生ＩＬ－２タンパク質を包含する。核磁気共鳴分光法では、ＩＬ－２タンパク質は４つの主要なヘリックス（Ａ～Ｄ）を含み、両側に２つの短いヘリックスが配置されていることが示唆されている（Ａｒｋｉｎ Ｍ．Ｒら、ＰＮＡＳ ２００３，１００：１６０３－１６０８）。

【0054】

本明細書の文脈で使用する「三量体ＩＬ－２受容体」、又は「高親和性ＩＬ－２受容体」という用語は、ＣＤ１２２（ＩＬ－２Ｒα）、ＣＤ１３２、及びＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα）から構成される多量体受容体を指す。ＣＤ２５が存在すると、ＩＬ－２ＲのＩＬ－２との親和性が二量体のＩＬ－２Ｒに比べて１００倍に増大するため、三量体のＩＬ－２Ｒ（Ｋ_ｄ≒１０^－１１Ｍ）は高親和性ＩＬ－２Ｒとも呼ばれる。

【0055】

本明細書の文脈における「中間親和性ＩＬ－２受容体」又は「二量体ＩＬ－２受容体」という用語は、ＣＤ１２２（ＩＬ－２Ｒβ）及び共通γ鎖（γｃ；ＣＤ１３２）を含むＩＬ－２受容体を指す。この二量体ＩＬ－２Ｒは、ＩＬ－２に対して、約１０^－９Ｍの解離定数［Ｋ_ｄ］を有する中間的な親和性を示すが、これは、本発明による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂとの複合体の状況でＩＬ－２が受容体と相互作用する場合、ＩＬ－２の結合部位と結合した抗体の立体障害により減少する。

【0056】

本明細書の文脈において、「ペプチドリンカー」という用語は、１本鎖ポリペプチドを生成するために、２本のポリペプチドを接続するために使用される長さが可変のポリペプチドを指す。本明細書で規定する発明の実施に有用なリンカーの例示的な実施形態は、３０、４０又は５０個のアミノ酸からなるオリゴペプチド鎖である。

【0057】

本明細書の文脈における「Ｔ制御細胞」、及び「Ｔ_ｒｅｇ」という用語は、特に、免疫抑制機能又は調節機能を有するＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋免疫細胞を指す。Ｔ_ｒｅｇのマスター転写因子であるフォークヘッドボックス Ｐ３（Ｆｏｘｐ３）の細胞内発現は、免疫抑制機能を持つＴ細胞を識別する。Ｔ_ｒｅｇ細胞に会合するさらなる表面マーカー及び細胞内マーカーは、当技術分野で知られている（Ｍｉｙａｒａ Ｍ．ら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ ２０１１，１０：７４４）。また、細胞表面のＴ_ｒｅｇマーカーの発現を測定するのではなく、抑制機能を測定することで、試料中のＴ_ｒｅｇの数を推定することも可能である。この目的に有用な抑制アッセイには、Ｔ_ｒｅｇ含有試料を活性免疫細胞試料、特にＣＤ８^＋Ｔ細胞と組み合わせること、及び細胞死、増殖、又はグランザイム、パーフォリン、インターフェロンγ（ＩＦＮ）又は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）から選択されるがこれらに限らないエフェクター分子の産生という点からその機能の抑制を測定することを含む。

【0058】

本発明の第１の態様は、ｈＩＬ－２ ｍＡｂ、又はｈＩＬ－２結合抗体断片を提供することであり、ここで、前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂは、以下を含むｈＩＬ－２アミノ酸残基の特定のエピトープと相互作用する：
－ αヘリックスのＨ１６、Ｄ２０；
－ Ｂ及びＢ’ヘリックスのＱ５７、Ｅ６０、Ｅ６１、Ｌ６３、Ｋ６４、Ｅ６７、Ｅ６８；及び
－ ＣヘリックスとＣ－ＤループのＬ８０、Ｒ８１、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｉ８６、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ９０、Ｖ９１、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｍ１０４。

【0059】

結晶構造解析により、この２つの分子が会合している際に、ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ抗体により覆われている、以下のｒｈＩＬ－２残基が、（＞）５Ａ^２超過である：
－ Ｈ１６、Ｄ２０；
－ Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６１、Ｌ６３、Ｋ６４、Ｅ６７、Ｅ６８；及び
－ Ｌ８０、Ｒ８１、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｉ８６、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ９０、Ｖ９１、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｍ１０４。

【0060】

この２つの分子が会合している際に、ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ抗体によって覆われている、以下のｒｈＩＬ－２残基は、（＞）１５Ａ^２超過であるため、以下に概説するような抗体の特徴である重要な生物学的エフェクター機能を媒介する可能性が非常に高くなる：
－ Ｈ１６；
－ Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６１、Ｋ６４、及び
－ Ｌ８０、Ｒ８１、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｉ８６、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ９０、Ｖ９１、Ｌ９４、Ｋ９７、Ｔ１０１、Ｍ１０４。

【0061】

実施例で提供されたデータは、本発明による抗体のエピトープがｈＩＬ－２残基のＭ２３、Ｇ２７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｐ８２を含んでいないため、本発明によるｈＩＬ－２特異的ｍＡｂは、以前の記載のＩＬ－２ ｍＡｂ Ｆ５１１１．２クローンとは異なることを示唆している。

【0062】

実施例で提供される結晶構造解析は、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂとこれらの特異的残基との間の相互作用が、ＩＬ－２と、ＣＤ１２２及びＣＤ１３２からなる中間親和性ＩＬ－２受容体との間の相互作用部位をブロックするか、又は中断することを示している。抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂとＩＬ－２ポリペプチドとの複合体は、ＣＤ２５と、又はＣＤ２５、ＣＤ１２２、及びＣＤ１３２からなる高親和性の三量体ＩＬ－２Ｒと優先的に又は偏向的に会合し、その結果、Ｔ_ｒｅｇなどのこの受容体を有する細胞においてＩＬ－２シグナル伝達が増大する。本発明による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂエピトープは、ｈＩＬ－２残基のＱ５７、Ｅ６０、Ｅ６１、Ｌ６４、及びＫ６４を含む。本明細書（及び実施例の図９及び図１０に要約）で提供される抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂエピトープによって得られるＩＬ－２のＣＤ２５結合の６．３％のオーバーラップは、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂ複合体からＩＬ－２を放出し、妨げられずに受容体に送達する一助となり、これによりエピトープにこれらの残基を含んでいない他の抗体クローンに比べてＩＬ－２シグナル伝達を改善する結果となる。

【0063】

本発明の文脈におけるｈＩＬ－２の「エピトープ」とは、本発明によるｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又は抗体断片が特異的に結合するか、又は付着する、ｈＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸残基を指す。ｈＩＬ－２エピトープは、親マウス抗体ＵＦＫＡ－２０のＦａｂバリアントと複合体として結晶化したｈＩＬ－２の構造解析によって定義され、そのＣＤＲを、ヒト化ＵＦＫＡ－２２クローンと本発明による他のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂとを生成するために使用した（表１、図９、図１０、図１１）。固定化したＵＦＫＡ－２０に捕捉されたＩＬ－２について平衡表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を行い、複合体の結晶構造を決定した。本発明によるエピトープを含むアミノ酸残基は、ソフトウェアＰＤＢｅＰＩＳＡ（Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００７ ３７２，７７４－７９７）を用いて計算した埋没表面積（平方オングストローム又はÅ^２で測定）が０超過のものと定義される。言い換えれば、ｈＩＬ－２エピトープは、ＵＦＫＡ－２０抗体の重鎖及び軽鎖ポリペプチド、特に相補的決定領域（ＣＤＲ）が、接触する、相互作用する、カバーする（覆う）、又はオーバーラップするＩＬ－２アミノ酸を含むか、又はそれからなるだけでなく、抗体がカバーしない、又は受容体相互作用の妨げとならない残基もまた含むか、又はそれからなる。

【0064】

実施例のデータは、三量体ＩＬ－２ＲへのｈＩＬ－２シグナル伝達を増大させるｈＩＬ－２との複合体を形成するための、上記で特定したｈＩＬ－２エピトープを有する完全な抗体分子の有用性を実証する。以前の研究において、抗体のＦｃ部分を欠いたＦ（ａｂ’）２抗体断片も、特異的なシグナル伝達の偏向を有するｈＩＬ－２／ｍＡｂ複合体を形成できることが示されたが、しかし、これらの断片の半減期が短いため、より頻繁に投与する必要がある。ＩＬ－２単独ではなく、ＩＬ－２を伴うＩＬ－２特異的Ｆ（ａｂ’）２複合体を繰り返し注入したところ、ＩＬ－２／ｍＡｂ ＣＤ１２２標的複合体の強力な活性を模倣できたことから、特異的に結合する抗ＩＬ－２ ｍＡｂのＣＤＲ含有部分がｉｎ ｖｉｖｏ活性に重要であることが示された（Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ，ＰＮＡＳ ２０１０，１０７（５）：２１７１）。さらに、本発明者らは、ＩＬ－７／抗ＩＬ－７（クローンＭ２５）ｍＡｂ複合体を用いた関連研究において、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片が、全抗体分子と同様に機能することを示した（Ｂｏｙｍａｎ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８，１８０（１１）：７２６５）。したがって、Ｆｃ部分を欠いた抗体断片、例えばＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片、並びにｓｃＦｖ断片は、本発明による「抗体」、又は「抗体断片」という用語に包含される。

【0065】

本発明の第２の態様は、抗ｈＩＬ－２抗体とｈＩＬ－２ポリペプチドとの相互作用の特徴によって定義される抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂ、又は抗原結合抗体断片である。本発明のこの態様は、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂ、又はｈＩＬ－２結合抗体断片を提供し、ここで、前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂのｈＩＬ－２への結合は、以下のように特徴づけられる：
－ 解離定数（Ｋ_Ｄ）≦５．５１×１０^－９ｍｏｌＬ^－１、特にＫ_Ｄ≦５．１３×１０^－９ｍｏｌＬ ^－１（クローンＵＦＫＡ－２２－００のＫ_Ｄ）；
－ オンレート（Ｋ_ｏｎ）≧４．１２×１０^５Ｌｍｏｌ^－１ｓ^－１（クローンＵＦＫＡ－２２－０２のＫ_ｏｎ）、特にＫ_ｏｎ≧４．６６×１０^５Ｌｍｏｌ^－１ｓ^－１（クローンＵＦＫＡ－２２－００のＫ_ｏｎ）；
－ オフレート（Ｋ_ｏｆｆ）≦２．８３×１０^－３ｓ^－１（クローンＵＦＫＡ－２２－１０のＫ_ｏｆｆ）、特にＫ_ｏｆｆ≦２．３９×１０^－３ｓ^－１（クローンＵＦＫＡ－２２－００のＫ_ｏｆｆ）。

【0066】

本発明のこの態様によるｈＩＬ－２ ｍＡｂは、Ｋ_Ｄ値≦５．５１×１０^－９ｍｏｌＬ^－１を有し、これは、同様のｈＩＬ－２結合特性を有し、かつ同じＣＤＲ配列を共有することが実証されたＵＦＫＡ－２０由来のクローンの選択における抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂ ＵＦＫＡ－２２－０２の最大のＫＤ値である。特定の実施形態において、本発明による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂは、Ｋ_Ｄ値≦５．１３×１０^－９ｍｏｌＬ^－１を有するものであり、このｈＩＬ－２特異的クローンＵＦＫＡ－２２－００のＫ_Ｄ値は、医薬品の成分としてこのｍＡｂを投与される患者で免疫応答を生成する可能性のあるマウスのフレームワーク領域への復帰突然変異を有さない。第２に、本発明のこの態様による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂは、Ｋ_ｏｎ値が（≧）４．１２×１０^５Ｌｍｏｌ^－１ｓ^－１以上であり（クローンＵＦＫＡ－２２－０２由来）、特にＫ_ｏｎ値が（≧）４．６６×１０^５Ｌｍｏｌ^－１ｓ^－１以上（ＵＦＫＡ－２２－００由来）である。最後に、本発明のこの態様による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂは、Ｋ_ｏｆｆ≦２．８３×１０^－３ｓ^－１（クローンＵＦＫＡ－２２－０５由来）により、特にＫ_ｏｆｆ≦２．３９×１０^－３ｓ^－１（ＵＦＫＡ－２２－００のＫ_ｏｆｆ）により特徴づけられる。本発明者らは、上記で概説した特徴を有するＩＬ－２に結合する抗体が、実施例の前臨床試験で使用したマウスＵＦＫＡ－２０クローン（ＨＣの配列番号０１９及びＬＣの配列番号０２０）と同様のＩＬ－２結合及び受容体送達の動力学を有することを見出した。ｈＩＬ－２と複合体を形成した上記の特徴を有する抗体は、ＩＬ－２シグナルを高親和性ＩＬ－２Ｒに優先的に送達するであろう。重要なことは、抗体による立体障害なしに、妨げのない最適なシグナル伝達刺激の送達を可能にするために、受容体への結合時に、抗体はまた、複合体から解離し、換言すれば、ＩＬ－２ポリペプチドから分離するであろう。

【0067】

他の実施形態では、ｈＩＬ－２と本発明によるｈＩＬ－２ ｍＡｂ、又はその断片との相互作用は、Ｋ_Ｄ≦５．５１×１０^－９ｍｏｌＬ^－１、特にＫ_Ｄ≦５．１３×１０^－９ｍｏｌＬ^－１によって特徴づけられ、これはまた１．８５６^－１０の親和性上限を超過するものである。ＩＬ－２に最も高い親和性で結合する変異重鎖及び軽鎖の５＋９抗体では、ｉｎ ｖｉｖｏ活性の低下がＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞の刺激に関して観察された。特定の実施形態において、前記相互作用のＫ_Ｄは、約１０^－１０Ｍである。

【0068】

いくつかの実施形態において、本発明による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏの実験方法によって測定される、ｈＩＬ－２と抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂとの間の複合体の生物学的機能によって特徴づけられる。本発明によるｈＩＬ－２と抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂとの複合体は、本発明による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂと非共有結合的に会合した、ｈＩＬ－２ポリペプチドが含まれる。これらのｈＩＬ－２ ｍＡｂ複合体は、これらの要素を２：１の比率で組み合わせた場合（Ｂｏｙｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００６，３１１：１９２４；Ｋｒｉｅｇ，ＰＮＡＳ ２０１０，１０７：１１９０６；Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１６，８，：３６７ｒａ１６６）、又は１：１の比率で組み合わせた場合（Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ，ＰＮＡＳ ２０１０，１０７：１１９０６；Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１６，８，：３６７ｒａ１６６０）に有効に機能すると実証されている。複合体の２成分の結合（組み合わせ）は、溶液中で行われ、この組み合わせ手順の時間、温度、及び条件は、本発明によって特に限定されない。複合体は、例えば、ｈＩＬ－２と抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂとをリン酸緩衝生理食塩水などの生理的溶液中で室温で１５分間、結合することにより形成することができる。ＩＬ－２シグナル伝達をＩＬ－２Ｒα又はＩＬ－２Ｒβの方へ偏向させ、したがってＴ_ｒｅｇ又はＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を増加させる他のｍＡｂを用いたＩＬ－２ ｍＡｂ複合体の調製及び活性が実現されている（Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ，ＰＮＡＳ ２０１０，１０７：１１９０６；Ｋｒｉｅｇ，ＰＮＡＳ ２０１０，１０７：１１９０６，；Ｔｒｏｔｔａ，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１８，２４：１００５）。

【0069】

特定の実施形態において、ｈＩＬ－２と本発明による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂとの複合体は、ＣＤ２５、ＣＤ１２２及びＣＤ１３２からなる高親和性ＩＬ－２Ｒに対する結合親和性が、ＣＤ１２２及びＣＤ１３２からなる中間親和性ＩＬ－２Ｒに対する結合親和性と比較して増大したことを示す。換言すれば、高親和性受容体への結合の比率が、中間親和性ＩＬ－２Ｒへの結合と比較して、１より大きい。特に、この比率は、２、４、又はさらに８よりも大きい。より特に、高親和性受容体への結合は、中間親和性受容体への結合よりも２０倍～１２１倍大きく、なおさらに特に７１倍大きい。受容体とｈＩＬ－２複合体との相互作用を評価した実施例のデータは、倍率変化が７１で異なり、誤差範囲は±５０であった。

【0070】

特定の実施形態において、本発明によるｈＩＬ－２と抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂの複合体は、中間親和性受容体と比較して、ＣＤ２５単独に対する結合親和性の増大を示し、特に親和性の倍率変化がＣＤ２５について２７７倍～４８３倍の間で高く、より特に中間親和性受容体よりも３８０倍高い。受容体とｈＩＬ－２複合体との相互作用を評価した実施例のデータは、倍率変化が３８０で異なり、誤差範囲は±１０３であった。

【0071】

実施例に示したデータでは、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／ＵＦＫＡ－２０ｃｘはＣＤ２５と優先的に会合し、測定された相互作用の約３分の２はＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／ＵＦＫＡ_－２０ｃｘによってなされ、一方、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ単独ではＣＤ２５で検出されたのは３分の１未満である。ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／ＵＦＫＡ－２０ｃｘのＣＤ１２２＋ＣＤ１３２への結合は、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄに比べてＵＦＫＡ－２０の存在によって不利になり（図１Ｄ）、これによりＵＦＫＡ－２０がＩＬ－２_Ｒｈｏｄに「ＣＤ２５偏向性」を付与することが実証された。

【0072】

抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂの特定の実施形態では、複合体が高親和性ｈＩＬ－２受容体に結合すると、ｈＩＬ－２と抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂの複合体から抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂは解離する。換言すれば、受容体に結合する前にこの２つの成分が会合し、結合時に遊離ｈＩＬ－２が放出され、受容体を介した最適なシグナル伝達が可能になる。

【0073】

実施例の図１Ｄにおいて、ＣＤ２５偏向及び抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂのｈＩＬ－２からの解離は、各成分が蛍光標識されるフローサイトメトリーを用いて観察されるとおり、ＨＥＫ細胞によって発現されるＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２、又はＣＤ２５へ複合体を偏向送達し、受容体に結合するＩＬ－２をその場に残すことによって実施される。ｈＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／ＵＦＫＡ－２０ｃｘは、三量体ＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２と相互作用すると急速に解離し、これは、この相互作用は、ＩＬ_－２_Ｒｈｏｄ／ＵＦＫＡ－２０ｃｘにより形成される相互作用が８．４％未満であり、複合体でない遊離ＩＬ－２_ＲｈｏｄがＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２に結合するものが９１．６％となったことから明らかである（図１Ｄ～１Ｆ）。「送達」とは、本発明による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂとのｈＩＬ－２の複合体で送達した場合に、遊離ＩＬ２ローダミンがＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２^＋細胞の４０％を超えて結合することを指す。ＵＦＫＡ－３０とＵＦＫＡ－４０は、ＩＬ－２_ＲｈｏｄのＣＤ２５への偏向を強くしたが、ＩＬ－２を三量体ＩＬ－２Ｒに解離又は送達することができなかった（図１ＤからＨ）。

【0074】

特定の実施形態において、本発明による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂは、ｈＩＬ－２との複合体で細胞に送達された場合、ＥＣ５０＜０．１５４ｎｇ／ｍｌでヒトＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞を活性化し、かつＥＣ５０＞４４２．９ｎｇ／ｍｌでヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化する。複合体のＥＣ５０を算出するために、Ｔ_ｒｅｇ又はＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化を測定する方法論は、本発明により特に限定されない。本明細書にて実施例に示されるデータでは、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂとのｈＩＬ－２複合体によるＴ_ｒｅｇ活性化は、細胞培養後にフローサイトメトリーで測定した図６のヒトＴ細胞で誘導されるリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）レベルによって測定されているが、増殖、又はエフェクターサイトカイン産生などの他の活性化特徴によって測定してもよい。

【0075】

あるいは、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂの他の実施形態において、Ｔ_ｒｅｇ増殖の優先的促進は、複合体による治療後のＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋メモリーＴ細胞に対するＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞の比率を確認することにより決定される。実施例では、この治療により、サルの脾臓又はリンパ節（図８）、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したヒト細胞（図６）におけるＣＤ８^＋メモリーＴ細胞の増加に比べて、Ｔ_ｒｅｇが２～３倍大きく増加する結果となった。言い換えれば、本発明による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂをＩＬ－２との複合体でヒト又はサルの細胞に送達した場合、ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋Ｔ細胞の増加率と比較したＴ_ｒｅｇ細胞の増加率の比率は、未治療、又は前治療の試料のいずれと比較して１よりも大きい。このＴ_ｒｅｇ活性化の比率は、代替的に、次に限定されないが、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、及び／又はＢ細胞などのＩＬ２Ｒα－細胞の総数又は割合と比較し計算することができる。

【0076】

本発明の第３の態様は、ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２及びＣＤＲ_Ｈ３により特徴づけられるＶ_Ｈ領域と、ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２及びＣＤＲ_Ｌ３を含む軽鎖可変領域、特にカッパ軽鎖（Ｖ_Ｌ）領域とを含む、ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ又はその抗原結合抗体断片である。本発明のこの態様によれば、ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２、ＣＤＲ_Ｈ３、ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２及びＣＤＲ_Ｌ３は、それぞれ配列番号００１、配列番号００２、配列番号００３、配列番号００４、配列番号００５、及び配列番号００６を含むか、又はこれと同一である。本発明のこの態様による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂは、任意に、本発明の前記の態様のいずれかによるエピトープ又は結合特性によって特徴づけられてもよい。

【0077】

別の実施形態では、本発明による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂ、又はその抗原結合断片、特に、前記の態様のいずれかによって特徴づけられる抗体は、以下によって特徴づけられる：
ａ． 配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、配列番号０１０、配列番号０１１、配列番号０１２、配列番号０１３、又は配列番号０１４から選択されるＶ_Ｈ配列に含まれるＣＤＲ_Ｈ１，ＣＤＲ_Ｈ２、及びＣＤＲ_Ｈ３、並びに、
ｂ． 配列番号０１５、又は配列番号０１６から選択されるＶ_Ｌ配列に含まれるＣＤＲ_Ｌ１，ＣＤＲ_Ｌ２、及びＣＤＲ_Ｌ３。特にここで、前記ＣＤＲ_Ｌは、配列番号０１５に含まれる。

【0078】

実施例に示されるデータにおいて、表２では、上記配列に対応する一連のｈＩＬ－２抗体において同様のＫ_ｏｆｆ、Ｋ_ｏｎ、Ｋ_Ｄ値が示され、これらが機能的な代替物であることを実証している。これらの生化学的な値は、本発明の前記の態様で記載した他のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏの測定による機能及び性能の予測可能な指標である。配列番号００７の重鎖と配列番号０１５の軽鎖を持つＵＦＫＡ－２２－００クローンは、他の選択肢がマウスＩｇ分子に似ている「復帰」変異を含み、かつヒト患者において抗薬物免疫を生成するリスクがより高い可能性がある場合にのみ、最も望ましいと考えられる。

【0079】

本発明によるｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、特に前記いずれかの態様によるｈＩＬ－２特異的ｍＡｂの第４の態様は、配列番号００７と（≧）９６％以上同一のＶ_Ｈ領域配列によって特徴づけられる抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂであり、特に、
－ ７４位及び／又は８４位がセリンであり、及び／又は
－ ９３位がメチオニンであり、及び／又は
－ １２２位がアラニンである、
配列番号００７と（≧）９６％以上同一のＶ_Ｈ領域配列によって特徴づけられる抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂである。

【0080】

さらに、本発明のこの態様によるｍＡｂは、配列番号０１５と（≧）９９％以上同一のＶ_Ｌ領域によって特徴づけられ、特に、
－ ６９位はイソロイシンである、
配列番号０１５と（≧）９９％以上同一のＶ_Ｌ領域により特徴づけられる。

【0081】

実施例の表２のデータは、最も大きい範囲の機能アッセイで試験された、必須ＣＤＲ領域と、一次の重鎖配列及び軽鎖配列の配列番号００７及び配列番号０１５と同様のｈＩＬ－２との相互作用を有するさらなるフレームワーク変異を有するクローンを示す。ａ．に記載した重鎖のすべての位置が異なる場合、配列は、配列番号００７とは５．７４％異なり、言い換えれば、配列番号００７と９６％超過同一である。軽鎖の６９位をイソロイシンに交換する場合、得られる配列番号０１６の配列は、親の配列番号１５の配列と０．８８％異なり、言い換えれば、配列番号０１５と９９％超過同一である。

【0082】

ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片、特に本発明の任意の前記の態様又は実施形態によって特徴づけられるものの第５の態様は、多くとも２つ、又は特に１つの、保存的アミノ酸置換を有するＶ_Ｈ配列又はＶ_Ｌ配列を有する抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂである。換言すれば、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂのＶ_Ｈ領域は、配列番号００７（Ｖ_Ｈ１）、配列番号００８（Ｖ_Ｈ２）、配列番号００９（Ｖ_Ｈ３）、配列番号０１０（Ｖ_Ｈ４）、配列番号０１１（Ｖ_Ｈ５）、配列番号０１２（Ｖ_Ｈ６）、配列番号０１３（Ｖ_Ｈ７）、又は配列番号０１４（Ｖ_Ｈ８）、又はこれらの参照配列のいずれか１つから以下に示す置換規則により導かれる機能的に類似の配列、から選択される配列を含む。さらに、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂのＶ_Ｌ領域は、配列番号０１５（Ｖ_Ｌ１）、配列番号０１６（Ｖ_Ｌ２）、又はこれらの参照配列から置換規則に従って導かれる機能的に類似の配列、から選択される配列を含む。この可能な保存的アミノ酸変化をもたらすための規則により、交換されることが可能であり、かつそれぞれの参照配列と機能的に類似の配列に結果としてなる、同様の生化学的特性を持つアミノ酸が記載される。この置換規則は：
Ｉ． グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）とは入れ替え可能であり；バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、及びイソロイシン（Ｉ）は入れ替え可能であり、ＡとＶとは入れ替え可能であり；
ＩＩ． トリプトファン（Ｗ）とフェニルアラニン（Ｆ）とは入れ替え可能であり、チロシン（Ｙ）とＦとは入れ替え可能であり；
ＩＩＩ． セリン（Ｓ）とスレオニン（Ｔ）とは入れ替え可能であり；
ＩＶ． アスパラギン酸（Ｄ）とグルタミン酸（Ｅ）とは入れ替え可能であり；
Ｖ． アスパラギン（Ｎ）とグルタミン（Ｑ）とは入れ替え可能であり、ＮとＳとは入れ替え可能であり、ＮとＤとは入れ替え可能であり、ＥとＱとは入れ替え可能であり；
ＶＩ． メチオニン（Ｍ）とＱとは入れ替え可能であり；
ＶＩＩ． システイン（Ｃ）、Ａ、及びＳは入れ替え可能であり；
ＶＩＩＩ． プロリン（Ｐ）、Ｇ、及びＡは入れ替え可能であり；
ＩＸ． アルギニン（Ｒ）とリジン（Ｋ）とは入れ替え可能である；

【0083】

本発明のさらなる態様は、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂを提供することであり、ここで、前記抗体又は抗体断片は、本発明の第１の態様によるエピトープによって特徴づけられるか、又は本発明の第２の態様によって提供される特徴でｈＩＬ－２に結合し、かつ以下を含む：
ａ． 配列番号００７（Ｖ_Ｈ１）、配列番号００８（Ｖ_Ｈ２）、配列番号００９（Ｖ_Ｈ３）、配列番号０１０（Ｖ_Ｈ４）、配列番号０１１（Ｖ_Ｈ５）、配列番号０１２（Ｖ_Ｈ６）、配列番号０１３（Ｖ_Ｈ７）、配列番号０１４（Ｖ_Ｈ８）、又は配列番号０１７（ＨＣ）、のうちの少なくとも１つと、（≧）９０％以上同一、特に（≧）９４％以上、（≧）９６％以上、又はさらに（≧）９８％以上同一である、第１の配列；及び
ｂ． 配列番号０１５（Ｖ_Ｌ１）、配列番号０１６（Ｖ_Ｌ２）、又は配列番号０１８（ＬＣ）、のうちの少なくとも１つと、（≧）９０％以上同一、特に（≧）９４％以上、（≧）９６％以上、又はさらに（≧）９８％以上同一である第２の配列。

【0084】

抗ｈＩＬ－２モノクローナル抗体の特定の実施形態では、前記抗体は、配列番号０１８に指定された配列の軽鎖と会合する、配列番号０１７に指定された配列を有する重鎖からなる。

【0085】

本発明の次の態様は、本明細書の本発明のいずれか１つの態様によるｈＩＬ－２特異的ｍＡｂと、ｈＩＬ－２ポリペプチドとを含み、これら２つの構成要素がペプチドリンカーによって結合されている、ｈＩＬ－２融合タンパク質を提供する。

【0086】

ｈＩＬ－２融合タンパク質は、Ｎ末端とＣ末端とを有する抗体重鎖と、Ｎ末端とＣ末端を有する抗体軽鎖とから構成されるｈＩＬ－２特異的ｍＡｂを含む。前記抗体重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、それぞれ、配列番号００１、配列番号００２、配列番号００３と指定された配列を有する、ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２、及びＣＤＲ_Ｈ３を含む。特定の実施形態では、これらのＣＤＲは、配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、配列番号０１０、配列番号０１１、配列番号０１２、配列番号０１３、又は配列番号０１４、から選択されるＶ_Ｈ配列に含まれる。より特定の実施形態において、この３つのＣＤＲ_Ｈは、配列番号００７に含まれる。同様に、抗体軽鎖は、それぞれ、配列番号００４、配列番号００５、配列番号００６の配列を有する相補的決定領域ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２、及びＣＤＲ_Ｌ３を含む。特定の実施形態では、これらは、配列番号０１５、又は配列番号０１６から選択されるＶ_Ｌ配列に含まれる。より特定の実施形態では、これらのＣＤＲ_Ｌは、配列番号０１５に含まれる。

【0087】

本発明によるｈＩＬ－２融合タンパク質のｈＩＬ－２ポリペプチド部分はまた、Ｎ末端とＣ末端とを有して、任意の天然ＩＬ－２ポリペプチド、又はテセロイキン又はアルデスロイキンなどの組換えＩＬ－２タンパク質であってもよい。特定の実施形態において、融合タンパク質のｈＩＬ－２部分のポリペプチド配列は、ｈＩＬ－２タンパク質Ｐ６０５６８の配列である。

【0088】

本発明による融合タンパク質のＩＬ－２部分に抗体を接合するペプチドリンカーは、好ましくは３０～５０個の間のアミノ酸長である。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、３０～４０個のアミノ酸長である。より特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、３０～３５個の間のアミノ酸長である。さらにより特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０個のアミノ酸長である。特定の実施形態において、本発明によるｈＩＬ－２融合タンパク質のペプチドリンカーは、ｈＩＬ－２ポリペプチドのＣ末端を抗体重鎖のＮ末端、又は抗体軽鎖のＮ末端のいずれかに接合する。より特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号０２８に指定したｈＩＬ－２融合タンパク質ｍＡｂのＬＣ成分の実施形態で示されるように、ｈＩＬ－２ポリペプチドのＣ末端を抗体軽鎖のＮ末端に接合する。

【0089】

本発明によるｈＩＬ－２融合タンパク質の特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、約８５％のグリシン及び約１５％のセリンのアミノ酸残基から構成されており、これらが免疫原性の低下をもたらす残基であるためである。ｈＩＬ－２融合タンパク質の特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号０２７の配列を有する。なおさらに特定の実施形態では、ｈＩＬ－２融合タンパク質は、各重鎖、又は各軽鎖が、独立して前記ペプチドリンカーによってｈＩＬ－２に融合される、二価の分子である。他の実施形態において、ｈＩＬ－２融合タンパク質は、組換えタンパク質の分泌を許容するシグナルペプチド、例えば、配列番号０２７の配列を有するシグナルペプチドを含む。なおさらなる特定の実施形態において、ｈＩＬ－２融合タンパク質は、Ｖ_Ｈ鎖の配列番号０１７にさらに会合する、配列番号０２８と指定される配列を提供するｈＩＬ－２に融合したＬＣからなる。

【0090】

本発明の次の態様は、上記で規定した前記の態様又は実施形態のいずれか１つに記載の、ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又は抗原結合抗体断片をコードする核酸分子を提供する。本発明の別の態様は、本発明によるｈＩＬ－２融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明の別の態様は、前記核酸を含むベクターを提供し、一方で、さらなる態様は、本発明の上記態様に記載の説明に従った、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂ又はその断片、ｈＩＬ－２融合タンパク質、核酸、又はベクターを含む、細胞、又はモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を提供する。

【0091】

本発明の別の態様は、医薬品として使用するための医薬製剤であり、特に有害な免疫介在性炎症、より特に同種移植関連障害、血管炎などの慢性炎症、又はアレルギー、又は自己免疫疾患に由来する有害な免疫介在性浸潤を有する患者の治療に用いるための医薬製剤である。本発明のこの態様による医薬製剤は、少なくとも２つの成分：
ａ． 上記の本発明の態様又は実施形態のいずれか１つに記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片、及び
ｂ． ｈＩＬ－２、
を含む。

【0092】

本発明者らは、ｈＩＬ－２ポリペプチドと複合した本発明によるＩＬ－２特異的ｍＡｂによって送達される改善されたＩＬ－２Ｒα偏向が、現在のＩＬ－２投与アプローチによって治療され得る医療適応において治療効果の改善を提供することが可能であると考えている。ＩＬ－２免疫療法は、ヒト臨床試験において、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、炎症性腸疾患、自己免疫性肝炎、筋萎縮性側索硬化症、ＨＣＶ関連血管炎、Ｉ型糖尿病、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ：ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）、ループス、円形脱毛症、及び全身性エリテマトーデスの緩和、及び肝移植プロトコルの改善が示されている（Ｙｅ，Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｔｈｅｒ ２０１８，３：２；Ｓｈａｒａｂｉ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１８，１７：８２３）。ヒト疾患のマウスモデルは、ＩＬ－２Ｒαシグナル伝達を改善するＩＬ－２ベースの免疫療法が、多発性硬化症、炎症性又は自己免疫性ミオパシー、炎症性大腸炎、ループス、異種ＧＶＨＤ、アレルギー性喘息、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病を特徴づける肥満関連炎症及びインスリン抵抗性などの代謝疾患、並びにアテローム性硬化症及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーの臨床特徴を改善できることを示している（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５，３６：７６３，Ｔａｎｇ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００８，２８：６８７；Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００９，２０６：７５１；Ｌｅｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，１３７：３０５；Ｓｐａｎｇｌｅｒ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１５，４２：８１５；Ｙａｎ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．２０１７，９１：６０３，Ｔｒｏｔｔａ，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１８，２４：１００５）。

【0093】

例えば、低用量ＩＬ－２、組換えＩＬ－２分子、又はＩＬ－２含有医薬製剤によって達成される、ＩＬ－２強化免疫療法により臨床結果が改善された免疫介在性病状も、本発明によるｈＩＬ－２ ｍＡｂ及びｈＩＬ－２複合体による治療を検討することができる。このような免疫介在性の医療適応には、例えば、ＩＬ－２免疫療法に適応可能な慢性炎症疾患、アレルギー、又は自己免疫疾患、及び代謝性疾患などが含まれる。さらに、同種移植関連障害の治療は、例えば、全臓器移植、組織移植、又は骨髄移植を包含し、調整アプローチとして移植処置の前及び／又は移植処置の後に、ＩＬ－２と会合するＩＬ－２特異的ｍＡｂの適用を含み得る。特定の実施形態において、同種移植関連障害は、臓器全体の移植、例えば、腎臓移植、又は肺移植である。

【0094】

実施例で提供されるデータでは、ｉｎ ｖｉｖｏで医薬品として使用される抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂとＩＬ－２とは、１：１の比率で会合し、実質的に遊離ｈＩＬ－２を含まないが、成分を組み合わせる比率は異なってよく、例えば、２：１、１：１、あるいはさらに１：２であってもよい。この種類の複合体を非経口的に、あるいは局所的に注入することで、炎症細胞に対してＴ_ｒｅｇの比率を高め、アレルギー、感染症、又は自己免疫疾患において有害な組織病理を引き起こす免疫活性化を抑制する。

【0095】

いくつかの実施形態では、本医薬製剤に含まれるｈＩＬ－２及び抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂは、共有結合で会合している。実施例のデータは、抗ｈＩＬ－２ｍＡｂからのＩＬ－２の解離が本発明によるｍＡｂの際立つ特徴であることを示唆しており、本実施形態によるｈＩＬ－２とｈＩＬ－２ｍＡｂとの間のいかなる連結も、高親和性ＩＬ－２Ｒを介して最適なシグナルを送達するｈＩＬ－２の能力を阻害してはならないことを示唆している。特定の実施形態において、共有結合的に会合したｈＩＬ－２及び抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂは、本発明によるｈＩＬ－２融合タンパク質の形態を有する。

【0096】

他の実施形態では、本発明の前記の態様によるｈＩＬ－２含有医薬組成物は、以下のものをさらに含む複合医薬である：
－ ｍＴＯＲ阻害剤、特にラパマイシン（シロリムス）、エベロリムスから選択されるｍＴＯＲ阻害剤、
－ 抗炎症性ｍＡｂ、特に抗ＴＮＦ、抗ＩＬ－６、又は抗ＯＸ４０Ｌ遮断剤から選択されるｍＡｂ、
－ コルチコステロイド薬、
－ スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）経路阻害剤、特にＦＴＹ７２０又はＳ１Ｐ受容体遮断剤から選択されるＳ１Ｐ経路阻害剤、
－ 抗炎症性抗酸化薬、特にメトホルミン又はＮ－アセチルシステインから選択される抗炎症性抗酸化薬、
－ カルモジュリンキナーゼＩＩ型又はＩＶ型阻害剤、
－ ＰＩ３Ｋ阻害剤、又はピラゾピラミジン誘導体、
－ ＨＤＡＣ６などのＴ_ｒｅｇ細胞特異的ヒストン脱アセチル化酵素、
－ Ｔ_ｒｅｇ細胞療法、例えば、キメラ抗原受容体又はトランスジェニックＴ細胞受容体Ｔ_ｒｅｇ療法、及び／又は
－ 低用量ＩＬ－２、Ｉｇ融合ＩＬ－２、又はペグ化ＩＬ－２。

【0097】

本発明によるｈＩＬ－２及び抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂの複合体と上記の医薬品との相乗効果は、ＩＬ－２生物学及び腫瘍学の分野の専門家からのレビュー（Ｓｈａｒａｂｉ Ａ．ら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１８，１７：８２３）によればそれらの補完作用メカニズムに起因する。

【0098】

本発明の別の態様は、免疫性炎症を治療する方法であり、前記方法は以下を含む：
ｉ． 有害な炎症、特に同種移植関連障害、慢性炎症、アレルギー、又は自己免疫、によって特徴づけられる症状であると診断された患者を選択すること、及び
ｉｉ． 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂと、ｈＩＬ－２とを、２：１又は１：２の複合体、特に１：１の割合で組み合わせた複合体で投与すること。

【0099】

さらなる態様は、免疫介在性疾患の治療、特に同種移植関連疾患、慢性炎症、アレルギー、又は自己免疫疾患の治療に使用するための医薬の製造における、本発明の前記の態様のいずれかによるｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又は抗原結合断片、又はｈＩＬ－２融合タンパク質の使用を提供する。

【0100】

本発明の別の態様は、ｈＩＬ－２残基Ｈ１６、Ｄ２０、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６１、Ｌ６３、Ｋ６４、Ｅ６７、Ｅ６８、Ｌ８０、Ｒ８１、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｉ８６、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ９０、Ｖ９１、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｍ１０４を含み、ｈＩＬ－２残基Ｍ２３、Ｇ２７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｐ８２は除く、ｈＩＬ－２エピトープに結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0101】

本発明の最後の態様は、上記に提供された説明のいずれかによる抗体又は分子と同等のエピトープ認識特性を有する抗原認識表面を含む、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0102】

医療、剤形、及び塩
同様に、本発明の範囲内には、上記の説明によるｈＩＬ－２及び抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂを含む医薬組成物を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における炎症性障害を治療すること、又はその方法が含まれる。

【0103】

特定の実施形態では、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂは、抗体、抗体断片、抗体様分子、又はプロテインＡドメイン由来ポリペプチドである。

【0104】

いくつかの実施形態において、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂは、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる免疫グロブリンである。いくつかの実施形態において、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂは、重鎖又は軽鎖から単離された可変ドメインからなる単一ドメイン抗体である。

【0105】

特定の実施形態では、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂは、抗体断片である。特定の実施形態において、抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂは、Ｆａｂ断片、すなわち、抗体の抗原結合断片、又は単鎖可変断片、すなわち、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域がペプチドリンカーで接続された融合タンパク質である。抗原特異性が同じか、又は異なる複数の単鎖可変断片を、２つ以上の個別のエピトープ結合領域を形成する多量体フォーマットに結合してもよい。

【0106】

他の実施形態では、組成物は、共有結合的に連結されたｈＩＬ－２及び抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂを含む。特定の実施形態では、前記組成物は、ｈＩＬ－２融合タンパク質を含む。

【0107】

同様に、本発明の上記態様又は実施形態のいずれかによる抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂ及びＩＬ－２の複合体を含む、炎症症状の予防又は治療のための剤形が提供される。

【0108】

当業者は、いずれの具体的に言及された薬物が、該薬物の薬学的に許容される塩として存在し得ることを認識している。薬学的に許容される塩には、イオン化された薬物及び逆荷電の対イオンが含まれる。薬学的に許容されるアニオン性塩形態の非限定的な例としては、酢酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、酒石酸水素塩（ｂｉｔａｔｒａｔｅ）、臭化物、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エンボン酸塩、エストール酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化物、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル、硫酸メチル、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、サリチル酸塩、ジサリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド及び吉草酸塩が挙げられる。薬学的に許容されるカチオン塩形態の非限定的な例としては、アルミニウム、ベンザチン、カルシウム、エチレンジアミン、リジン、マグネシウム、メグルミン、カリウム、プロカイン、ナトリウム、トロメタミン及び亜鉛が挙げられる。

【0109】

Ｉｌ－２複合体は、実験モデルにおいて皮下、静脈内、及び腹腔内の経路での適用が成功しており、それ故、皮下、静脈内、肝内、又は筋肉内の注入形態など、非経口投与を用いることができる。しかし、本発明者らは、局所投与、又は鼻腔、口腔、直腸、経皮、又は経口投与などの経腸投与の剤形を予測している。あるいは吸入形態又は座薬としての投与形態も、望ましい生理学的結果をもたらし得る。任意に、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤が存在してもよい。

【0110】

局所投与もまた、本発明の有利な用途の範囲内である。当業者は、以下の内容によって例示されるように、局所製剤を提供するための可能な広い範囲の処方について理解している：Ｂｅｎｓｏｎ及びＷａｔｋｉｎｓｏｎ（編），Ｔｏｐｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第１編，Ｗｉｌｅｙ ２０１１，ＩＳＢＮ－１３：９７８－０４７０４５０２９１）；及びＧｕｙ及びＨａｎｄｃｒａｆｔ：Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｒｅｖｉｓｅｄ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｄｅｄ（第２編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ２００２，ＩＳＢＮ－１３：９７８－０８２４７０８６１０）；Ｏｓｂｏｒｎｅ及びＡｍａｎｎ（編）：Ｔｏｐｉｃａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（第１編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９；ＩＳＢＮ－１３：９７８－０８２４７８１８３５）。

【0111】

医薬組成物及び投与
本発明の別の態様は、本発明の化合物、又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。さらなる実施形態では、該組成物は、本明細書に記載されるものなどの少なくとも２つの薬学的に許容される担体を含む。

【0112】

本発明の特定の実施形態において、本発明の化合物は、典型的には、薬物の制御された投与量を提供するために、医薬用剤形に製剤化される。

【0113】

本発明の化合物の局所的使用に関する本発明の実施形態では、医薬組成物は、水溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、ゲル又は噴霧可能な製剤、例えばエアゾール等による送達用のものなど、局所投与に適した方法で製剤化され、活性成分を、当業者に知られている１つ又は複数の可溶化剤、安定剤、等張化増強剤、緩衝液及び防腐剤と共に含んでいる。

【0114】

医薬組成物は、経口投与、非経口投与、又は直腸投与用に製剤化することができる。さらに、本発明の医薬組成物は、固体形態（限定されないが、カプセル、錠剤、丸薬、顆粒、粉末又は坐剤を含む）、又は液体形態（限定されないが、溶液、懸濁液又は乳濁液を含む）において構成することができる。

【0115】

本発明の化合物の投与計画は、特定の薬剤の薬力学的特性及びその投与の様式及び経路などの既知の要因：レシピエントの種、年齢、性別、健康状態、病状、及び体重；症状の性質と程度；同時治療の種類；治療の頻度；投与経路、患者の腎機能及び肝機能、並びに所望の効果、に応じて変化するであろう。特定の実施形態において、本発明の化合物は、１日１回の用量で投与されてもよいし、又は１日の総用量が、１日２回、３回、又は４回に分割した用量で投与されてもよい。

【0116】

特定の実施形態では、本発明の医薬組成物又は組み合わせは、約５０～７０ｋｇの対象に対して約１～１０００ｍｇの活性成分（複数可）の単位用量であり得る。化合物、医薬組成物、又はそれらの組み合わせの治療上有効な投与量は、対象の種、体重、年齢及び個人の状態、治療される障害又は疾患又はその重篤度に依存する。通常の技術を有する医師、臨床医又は獣医師であれば、障害又は疾患の予防、治療又は進行抑制に必要な各有効成分の有効量を容易に決定することができる。

【0117】

本発明の医薬組成物は、滅菌などの従来の医薬操作にかけることができ、及び／又は従来の不活性希釈剤、潤滑剤、又は緩衝剤、並びに保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤及び緩衝剤などのアジュバントを含有することができる。これらは、標準的なプロセス、例えば、従来の混合、造粒、溶解又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。医薬組成物を調製するための多くのそのような手順及び方法は、当技術分野で知られており、例えば、Ｌ．Ｌａｃｈｍａｎら、Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第４編，２０１３（ＩＳＢＮ ８１２３９２２８９２）を参照されたい。

【0118】

本明細書において、例えばアイソタイプタンパク質又はコード配列、リガンドの種類又は医療適応などの単一の分離可能な特徴の代替形態が「実施形態」として記載されている場合、そのような代替形態は自由に組み合わせて、本明細書に開示した発明の別個の実施形態を形成してもよいと理解されたい。したがって、抗体に関する代替的な実施形態のいずれもが、本明細書に記載される任意の医学的適応と組み合わされ得る。

【0119】

本発明は、さらに以下の項目を包含する：
項目１． ヒトインターロイキン－２（ｈＩＬ－２）特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、又はその抗原結合断片であって、前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂは、エピトープを提供するｈＩＬ－２のアミノ酸残基と相互作用し、かつ
前記エピトープは、ｈＩＬ－２残基の：
－ Ｈ１６、Ｄ２０、
－ Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６１、Ｌ６３、Ｋ６４、Ｅ６７、Ｅ６８、及び
－ Ｌ８０、Ｒ８１、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｉ８６、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ９０、Ｖ９１、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｍ１０４、
を含む、
前記ヒトインターロイキン－２（ｈＩＬ－２）特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、又はその抗原結合断片。
項目２． 前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂのｈＩＬ－２への結合は：
－ 解離定数（Ｋ_Ｄ）は、（≦）４．３×１０^－９以下であり、特にＫ_Ｄは（≦）５．１３×１０^－９以下であること、
－ オンレート（結合速度）（Ｋ_ｏｎ）は、（≧）４．１２×１０^５Ｍｓ^－１以上であり、特にＫ_ｏｎは、（≧）４．６６×１０^５Ｍｓ^－１以上であること、及び
－ オフレート（解離速度）（Ｋ_ｏｆｆ）は、（≦）２．２０×１０^－３ｓ^－１以下であり、特にＫ_ｏｆｆは、（≦）２．３９×１０^－３ｓ^－１以下であること、
によって特徴づけられる、
ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片、特に項目１に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片。
項目３． 前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂとｈＩＬ－２とを、２：１～１：２の間の比率で組み合わせた複合体、特に１：１の比率で組み合わせた複合体は：
－ 中間親和性ｈＩＬ－２受容体と比較した高親和性ｈＩＬ－２受容体への結合の比率は、２０～１２１の間であること、特に比率は７１～１２１の間であること、及び／又は
－ 中間親和性ｈＩＬ－２受容体と比較したＣＤ２５単独の結合親和性の比率は、２７７～４８３の間であること、特に比率は３８０～４８３の間であること、及び／又は
－ 高親和性ｈＩＬ－２受容体への複合体の結合におけるｈＩＬ－２からのｈＩＬ－２ ｍＡｂの解離、及び／又は
－ ヒトＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^ｌｏｗＦｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞を、ＥＣ５０が（≦）０．１５４以下で、かつヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＥＣ５０が（≧）４４２．９以上で活性化させること、
によって特徴づけられる、項目１又は２に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片。
項目４． Ｖ_Ｈ相補性決定領域ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２、及びＣＤＲ_Ｈ３を含む重鎖可変（Ｖ_Ｈ）領域と、Ｖ_Ｌ相補性決定領域ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２、及びＣＤＲ_Ｌ３を含む可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）領域とを含み、かつここで
ａ． ＣＤＲ_Ｈ１は、配列番号００１を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｂ． ＣＤＲ_Ｈ２は、配列番号００２を含むか、又はそれと同一であり、及び
ｃ． ＣＤＲ_Ｈ３は、配列番号００３を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｄ． ＣＤＲ_Ｌ１は、配列番号００４を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｅ． ＣＤＲ_Ｌ２は、配列番号００５を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｆ． ＣＤＲ_Ｌ３は、配列番号００６を含むか、又はそれと同一である、
ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片、特に項目１～３のいずれか一項に記載の前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ。
項目５．
ａ． ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２、及びＣＤＲ_Ｈ３は、配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、配列番号０１０、配列番号０１１、配列番号０１２、配列番号０１３、及び配列番号０１４から選択されるＶ_Ｈ配列に含まれ、特に前記ＣＤＲ_Ｈは、配列番号００７に含まれ、かつ
ｂ． ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２、及びＣＤＲ_Ｌ３は、配列番号０１５、及び配列番号０１６から選択されるＶ_Ｌ配列に含まれ、特に前記ＣＤＲ_Ｌは、配列番号０１５に含まれる、
ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片、特に項目１～４のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ。
項目６．
ａ．
－ ７４位及び／又は８４位がセリンであり、及び／又は
－ ９３位がメチオニンであり、及び／又は
－ １２２位がアラニンである；
配列番号００７と（≧）９６％以上同一であるＶ_Ｈ領域配列、
及び
ｂ．
－ ６９位がイソロイシンである、
配列番号０１５と（≧）９９％以上同一であるＶ_Ｌ領域、
を含む、
ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片、特に項目１～５のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ。
項目７．
ａ． Ｖ_Ｈ領域は、配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、配列番号０１０、配列番号０１１、配列番号０１２、配列番号０１３、及び配列番号０１４から選択される配列、又は以下に示す置換規則によってこれらの参照配列のいずれか１つから導かれる機能的に類似する配列を含み；かつ
ｂ． Ｖ_Ｌ領域は、配列番号０１５及び配列番号０１６から選択される配列、又は以下に示す置換規則によってこれらの参照配列のいずれか１つから導かれる機能的に類似する配列を含み、
それぞれの参照配列から機能的に類似する配列を導く前記置換規則は：
ｉ． グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）とは入れ替え可能であり；バリン（Ｖ）と、ロイシン（Ｌ）と、イソロイシン（Ｉ）とは入れ替え可能であり、ＡとＶとは入れ替え可能であり；
ｉｉ． トリプトファン（Ｗ）とフェニルアラニン（Ｆ）とは入れ替え可能であり、チロシン（Ｙ）とＦとは入れ替え可能であり；
ｉｉｉ． セリン（Ｓ）とスレオニン（Ｔ）とは入れ替え可能であり；
ｉｖ． アスパラギン酸（Ｄ）とグルタミン酸（Ｅ）とは入れ替え可能であり；
ｖ． アスパラギン（Ｎ）とグルタミン（Ｑ）とは入れ替え可能であり、ＮとＳとは入れ替え可能であり、ＮとＤとは入れ替え可能であり、ＥとＱとは入れ替え可能であり；
ｖｉ． メチオニン（Ｍ）とＱとは入れ替え可能であり；
ｖｉｉ． システイン（Ｃ）と、Ａと、Ｓとは入れ替え可能であり；
ｖｉｉｉ． プロリン（Ｐ）と、Ｇと、Ａとは入れ替え可能であり；
ｉｘ． アルギニン（Ｒ）とリジン（Ｋ）とは入れ替え可能であり；
特に、上記の置換規則によって多くとも２つのアミノ酸が交換され、より特に多くとも１つのアミノ酸が交換される、
ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片、特に項目１～５のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ。
項目８．
ａ． 配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、配列番号０１０、配列番号０１１、配列番号０１２、配列番号０１３、配列番号０１４、及び配列番号０１７のうちの少なくとも１つと（≧）９０％以上同一、特に（≧）９４％以上、（≧）９６％以上、又はさらに（≧）９８％以上同一の第１の配列；及び
ｂ． 配列番号０１５、配列番号０１６、及び配列番号０１８のうちの少なくとも１つに（≧）９０％以上同一、特に（≧）９４％以上、（≧）９６％以上、又はさらに（≧）９８％以上同一である第２の配列、
をさらに含む、項目１～３のいずれか一項に記載の特徴を有する、
ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片。
項目９． 前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂは：
ａ． 重鎖であり、配列番号０１７を含むか、又はそれからなる前記重鎖；及び
ｂ． 軽鎖であり、配列番号０１８を含むか、又はそれからなる前記軽鎖、
を含む、
項目１～８のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ。
項目１０． ｈＩＬ－２融合タンパク質であって：
ａ．
ｉ． 抗体重鎖；及び
ｉｉ． 抗体軽鎖；
を含むか、それからなる項目１～９のいずれか一項に記載のヒトインターロイキン－２（ｈＩＬ－２）特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）；及び
ｂ． ｈＩＬ－２ポリペプチド；
ｃ． ２５～５０の間のアミノ酸長のペプチドリンカー、特に２５～３５アミノ酸長、より特に３０アミノ酸長のペプチドリンカー、
を含む、ｈＩＬ－２融合タンパク質であって、
前記ペプチドリンカーは、前記ｈＩＬ－２ポリペプチドのＣ末端を前記抗体重鎖のＮ末端、又は前記抗体軽鎖のＮ末端のいずれかに接合しており、特に前記ペプチドリンカーは、前記ｈＩＬ－２ポリペプチドのＣ末端を前記抗体軽鎖のＮ末端に接合している、
前記ｈＩＬ－２融合タンパク質。
項目１１． 前記ペプチドリンカーは、約８５％のグリシン及び約１５％のセリンから構成され、特に前記ペプチドリンカーは、配列番号０２６の配列を有する、項目１０に記載のｈＩＬ－２融合タンパク質。
項目１２． 請求項１～９のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片、あるいは項目１０又は１１に記載のｈＩＬ－２融合タンパク質、をコードする核酸分子。
項目１３．
ａ． 項目１～９のいずれか一項に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ、又はその抗原結合断片、及び
ｂ． ｈＩＬ－２、
を含む、医薬品としての使用のための医薬組成物、特にＩＬ－２免疫療法に適している免疫介在性疾患の治療における使用のための医薬組成物、より特に同種移植関連障害、慢性炎症、アレルギー、自己免疫性及び代謝性疾患から選択される、免疫介在性疾患の治療における使用のための医薬組成物。
項目１４． 前記ＩＬ－２及び前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂが共有結合的に会合しており、特に項目１０又は１１に記載のｈＩＬ－２融合タンパク質内に前記ＩＬ－２及び前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂが含まれている、項目１３に記載の使用のための医薬組成物。
項目１５． 前記自己免疫性疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、強直性脊椎炎、自己免疫肝炎、筋萎縮性側索硬化症、１型真性糖尿病、２型真性糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、炎症性及び自己免疫性ミオパシー、円形脱毛症、乾癬、又は炎症性腸疾患から選択される、項目１３又は１４に記載の使用のためのｈＩＬ－２特異的ｍＡｂを含む医薬組成物。
項目１６． 前記同種移植片関連障害は、固形臓器移植処置を受ける（受けている）患者において診断される、項目１３～１５のいずれか一項に記載の使用のためのｈＩＬ－２特異的ｍＡｂを含む医薬組成物。
項目１７． ｈＩＬ－２残基のＨ１６、Ｄ２０、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６１、Ｌ６３、Ｋ６４、Ｅ６７、Ｅ６８ Ｌ８０、Ｒ８１、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｉ８６、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ９０、Ｖ９１、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｍ１０４を含むｈＩＬ－２エピトープに結合する、単離抗体、又はその抗原結合断片であって、前記エピトープは、ｈＩＬ－２残基のＭ２３、Ｇ２７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｐ８２を含まない、前記単離抗体、又はその抗原結合断片。
項目１８． 項目１～１１のいずれか一項に記載の抗体又は分子と同等のエピトープ認識特性を有する抗原認識表面を含む、単離抗体、又はその抗原結合断片。

【0120】

ＩＬ－２による樹状細胞刺激の技術背景
樹状細胞（ＤＣ：Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）は、細胞内病原体及び腫瘍に対するＴ細胞応答の編成に不可欠と考えられている、プロフェッショナル抗原提示細胞の亜群である（Ｍｉｌｄｎｅｒ Ａ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１４，３０：１；Ｄｕｒｅｉ Ｖ．及びＭｕｒｐｈｙ Ｋ．Ｍ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１４，４０：６４２）。ヒトの血中ＤＣは従来、従来型ＤＣ（ｃＤＣ：ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＤＣ）と形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ：ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ＤＣ）に細分化されていたが、単細胞ＲＮＡ及びタンパク質解析の結果、マウスとヒトにおいてインターフェロン調節因子８（ＩＲＦ８：ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ８）と塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様３（ＢＡＴＦ３：ｂａｓｉｃ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒ ＡＴＦ－ｌｉｋｅ ３）によって制御されている１型ｃＤＣ（ｃＤＣ１）とＩＲＦ４によって制御されている２型ｃＤＣ（ｃＤＣ２）への分化が特定された（Ｖｉｌｌａｎｉ Ａ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１７，３５６：６３３５；Ｄｕｔｅｒｔｒｅ Ｃ．Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１９，５１：５７３，Ｓｃｈｒａｍｌ Ｂ．Ｕ．及びＲｅｉｓ ｅ Ｓｏｕｓｅ Ｃ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５，３２：１３）。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を含む非リンパ系組織におけるＤＣサブセットは、表現型及び機能的特性の点で非常に異なる（Ｗｏｒｂｓ Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７，１７：３０；Ｂｒｏｚ Ｍ．Ｌ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０１４，２６：６３８）。しかし、抗腫瘍反応におけるｃＤＣの必要に応じた生成及び増大を促進する上流の分子及び細胞の因子は未解明である。

【0121】

２つの研究では、ＮＫ細胞が、腫瘍でのＤＣ浸潤を促進し、ヒトの生存期間の延長と相関することを含意している（Ｂｏｔｔｃｈｅｒ Ｊ．Ｐ．ら，Ｃｅｌｌ ２０１８，１７２：１０２２；Ｂａｒｒｙ Ｋ．Ｃ．ら，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１８，２４：１１７８）。ＮＫ細胞はリンパ系細胞であり、その生存及び恒常性（ホメオスタシス）は、Ｉｌ２ｒｇがコードする共通のγ鎖サイトカイン受容体（γｃ、ＣＤ１３２とも呼ばれる）を介して介在されるシグナルに依存する。このＣＤ１３２サイトカインファミリーのメンバーには、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１が含まれる（Ｒａｅｂｅｒ Ｍ．Ｅ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０１８，２８３：１７６）。ＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）とＣＤ１３２で構成される中間親和性の二量体ＩＬ－２Ｒ、又はＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）をさらに含む三量体ＩＬ－２Ｒのいずれかを介してシグナルを伝達する。この二量体の受容体は主にメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞に存在するが、一方で三量体受容体は定常状態では主にＴｒｅｇ細胞に存在し、直近に活性化したエフェクターＴ細胞で一過性に発現がアップレギュレーションされる（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ Ｊ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５，３６：７６３）。Ｔ細胞及びＮＫ細胞に対する作用に加えて、ＩＬ－２はまた、自然リンパ球（ＩＬＣ：ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌ）、特に２型ＩＬＣ（ＩＬＣ２）、ＮＫＴ細胞、及び活性化Ｂ細胞、並びに特定の非免疫細胞も刺激することができる（Ｍａｌｅｋ Ｒ．Ｔ及びＣａｓｔｒｏ Ｉ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１０，３３：１５３）；Ａｂｂａｓ Ａ．Ｋ．ら，Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１８，３（２５）：ｅａａｔ１４８２）。しかし、ＩＬ－２はｉｎ ｖｉｖｏでのＤＣの恒常性に影響を与えることは知られていない。

【0122】

ｈＩＬ－２ ｍＡｂ組成物による樹状細胞刺激の概要
実施例５は、免疫寛容を誘導するためにＩＬ－２療法を受ける全身性エリテマトーデス患者の免疫応答を研究する臨床試験に関するもので、本発明者らは、複数のＤＣサブセットの顕著な増加を観察したことは予想外であった。マウスとヒトとの両方で行われたＩＬ－２免疫療法の研究では、ＩＬ－２と、三量体ＩＬ－２Ｒ偏向ｍＡｂ若しくはＩＬ－２Ｒα偏向ｍＡｂとを含む複合体によるＤＣの増大及び活性化が実証された。この経路はＩＬ－２によって駆動され、ＤＣ集団とＤＣプロセスとの両方の増大を刺激する。

【0123】

本発明の第１の態様は、樹状細胞機能の強化を必要とする患者における使用のためのＩＬ－２複合体医薬組成物であって、前記ＩＬ－２複合体は、ヒトｈＩＬ－２とｈＩＬ－２特異的ｍＡｂとの両方を含み、かつ前記ＩＬ－２複合体は、中間親和性ＩＬ－２Ｒよりもむしろ高親和性ＩＬ－２Ｒ又はＣＤ２５に優先的に結合する。

【0124】

いくつかの実施形態において、使用のための医薬組成物は、Ｖ_Ｈ相補性決定領域ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２及びＣＤＲ_Ｈ３を有する重鎖可変（Ｖ_Ｈ）領域と、Ｖ_Ｌ相補性決定領域ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２及びＣＤＲ_Ｌ３を有する可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）領域とを含むｈＩＬ－２特異性ｍＡｂを含み、ここで前記ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２、ＣＤＲ_Ｈ３、ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２、及びＣＤＲ_Ｌ３が、それぞれ配列番号００１、配列番号００２、配列番号００３、配列番号００４、配列番号００５、及び配列番号００６を含むか、又はそれと同一である。さらなる実施形態では、前記ＣＤＲは、配列番号００７のＶ_Ｈ配列及び配列番号０１５のＶ_Ｌ配列に、又は機能的に類似する配列に含まれる。他の実施形態では、ＤＣ機能を高めるために患者に使用するための医薬組成物は、Ｔ_ｒｅｇの活性化の増加に偏向しており、患者におけるＤＣの活性化又は増殖を促進する。

【0125】

本発明はさらに、自己免疫疾患又は炎症性疾患と診断された患者を、本発明によるＩＬ－２複合体を用いて治療する方法を提供する。

【0126】

ｈＩＬ－２ ｍＡｂ組成物による樹状細胞刺激の詳細な説明
本明細書の解釈にあたっては、「用語と定義」の項に記載された定義が引き続き適用され、適宜、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆もまた然りである。

【0127】

本発明の第１の態様は、ＤＣ機能の強化により恩恵を受ける症状を有する患者で使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、ヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）ポリペプチド、及びｈＩＬ－２特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の両方を含むＩＬ－２複合体自体を含む。適切なｈＩＬ－２特異的ｍＡｂの例は、米国特許出願公開第２０１７／０１１４１３０号（Ａ１）に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明のこの態様によるＩＬ－２複合体は、ＣＤ１２２及びＣＤ１３２を含む中間親和性ＩＬ－２Ｒと比較して、ＣＤ２５に、及び／又はＣＤ１２２、ＣＤ１３２及びＣＤ２５を含む高親和性ＩＬ－２受容体に、優先的に結合する。

【0128】

実施例の図１５及び図１７のデータは、市販のＣＤ２５偏向抗ＩＬ－２抗体クローン５３４４、又は本明細書に記載のＵＫＦＡ－２０クローンの両方を、ＩＬ－２と複合化した状態で、ＣＤ１２２偏向抗ＩＬ－２ ＮＡＲＡ１クローンを用いて調製したＩＬ－２複合体と同等のレベルで脾臓のＤＣ総数を拡大できることを実証している。このデータは、医薬組成物が、寛容原性な表現型を持つＤＣの数を増やすことによって、炎症性疾患又は自己免疫疾患と診断された患者に有益であることを示唆している。

【0129】

ＣＤ２５偏向ｍＡｂを含むＩＬ－２複合体は、ＩＬ－１０及びトランスフォーミング成長因子βなどの免疫寛容原性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ）分子を分泌するＴ_ｒｅｇなどのＣＤ２５を豊富に発現する細胞に優先的にＩＬ－２シグナルを送達するであろう。したがって、本医薬組成物は、免疫寛容原性ＤＣ機能の強化により恩恵を受ける疾患と診断された患者において特に使用することが期待される。寛容原性ＤＣは、例えば、以下の遺伝子又はその産物の発現を含む免疫寛容原性シグネチャーによって同定することができる：ＣＤ２７４、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＣＤ２００、ＣＤ２０５、ＦＡＳ、ＡＬＤＨ１Ａ２、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ４Ｉ１、ＩＬ１０、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、ＴＮＦＲＳＦ４、及びＢＣＬ２Ｌ１（Ｍａｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ２０２０，５８０：２５７）。

【0130】

特定の実施形態では、本発明によるｈＩＬ－２と抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂとの複合体は、本発明による抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂと非共有結合的に会合した、ｈＩＬ－２ポリペプチドが含まれる。本発明によれば、ＩＬ－２複合体に含まれるｈＩＬ－２及びｈＩＬ－２特異的ｍＡｂを組み合わせる比率は特に限定されない。これらのｈＩＬ－２ ｍＡｂ複合体は、要素を２：１の比率で組み合わせた場合（Ｂｏｙｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００６，３１１：１９２４；Ｋｒｉｅｇ，ＰＮＡＳ ２０１０，１０７：１１９０６；Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１６，８，：３６７ｒａ１６６）、又は１：１の比率で組み合わせた場合（Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ，ＰＮＡＳ ２０１０，１０７：１１９０６；Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１６，８，：３６７ｒａ１６６０）に有効に機能すると実証されている。複合体のこの２成分の結合（組み合わせ）は、溶液中で行われ、この組み合わせ手順の時間、温度、及び条件はまた、本発明によって特に限定されない。複合体は、例えば、ｈＩＬ－２と抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂとをリン酸緩衝生理食塩水などの生理的溶液中で室温で１５分間、結合することにより形成することができる。ＩＬ－２シグナル伝達をＩＬ－２Ｒα又はＩＬ－２Ｒβへ偏向させ、したがってＴ_ｒｅｇ又はＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を増大させるｍＡｂを用いたＩＬ－２ ｍＡｂ複合体の調製及び活性が実施されてきた（Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ，ＰＮＡＳ ２０１０，１０７：１１９０６；Ｋｒｉｅｇ，ＰＮＡＳ ２０１０，１０７：１１９０６，；Ｔｒｏｔｔａ，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１８，２４：１００５）。他の実施形態では、本発明による医薬組成物のｈＩＬ－２と抗ｈＩＬ－２ ｍＡｂとは、共有結合的に会合し、特にペプチドリンカーによって接合されている。

【0131】

使用のためのＩＬ－２複合体を含む医薬組成物の特定の実施形態では、例えばＳＴＡＴ５リン酸化によって測定される活性化、及び／又は増殖を、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも制御性Ｔ（Ｔ_ｒｅｇ）細胞において大幅に増加させる。特定の実施形態では、上記で規定された使用のための医薬組成物は、ヒト、又は霊長類の免疫細胞に適用された場合、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、及び／又はＢ細胞に対するＴ_ｒｅｇ細胞の比率を増加させる。

【0132】

本発明者らは、新規のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂであるＵＦＫＡ－２０及びそのヒト化誘導体であるＵＦＫＡ－２２を開発した。ｍＡｂを用いて形成されたＩＬ－２複合体は、ＣＤ２５を発現するＴ細胞を高効率かつ特異的に刺激する。本発明者らは、本発明のこの態様によるｈＩＬ－２特異的ｍＡｂが、以前に記載の他のＣＤ１２２標的抗体クローンと比較して、免疫寛容原性のＤＣ集団を効率的に増大することを実証している。特定の実施形態では、患者に使用するためのＩＬ－２複合体医薬組成物のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂは、ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２及びＣＤＲ_Ｈ３を含むＶ_Ｈ領域、並びにＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２及びＣＤＲ_Ｌ３を含むＶ_Ｌ領域を含む。本実施形態によれば：
ＣＤＲ_Ｈ１は、配列番号００１を含むか、又はそれと同一であり；及び
ＣＤＲ_Ｈ２は、配列番号００２を含むか、又はそれと同一であり；及び
ＣＤＲ_Ｈ３は、配列番号００３を含むか、又はそれと同一であり；及び
ＣＤＲ_Ｌ１は、配列番号００４を含むか、又はそれと同一であり；及び
ＣＤＲ_Ｌ２は、配列番号００５を含むか、又はそれと同一であり；及び
ＣＤＲ_Ｌ３は、配列番号００６を含むか、又はそれと同一である。

【0133】

別の実施形態では、ＤＣ増強を必要とする患者に使用するためのＩＬ－２複合体医薬複合体に含まれるｈＩＬ－２ ｍＡｂのＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２及びＣＤＲ_Ｈ３は、配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、配列番号０１０、配列番号０１１、配列番号０１２、配列番号０１３、又は配列番号０１４、又は配列番号０１７から選択される少なくとも１つのＶＨ配列に含まれ、特に前記ＣＤＲ_Ｈは、配列番号００７に含まれる。また、ｈＩＬ－２ ｍＡｂのＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２、及びＣＤＲ_Ｌ３は、配列番号０１５、配列番号０１６、又は配列番号００１８から選択される少なくとも１つのＶＬ配列に含まれており、特に前記ＣＤＲ_Ｌは、配列番号０１５に含まれる。本発明のこの態様による単離された抗体ｈＩＬ－２特異的抗体又はその抗原結合断片は、ｈＩＬ－２残基 Ｈ１６、Ｄ２０、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６１、Ｌ６３、Ｋ６４、Ｅ６７、Ｅ６８、Ｌ８０、Ｒ８１、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｉ８６、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ９０、Ｖ９１、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｍ１０４を含むが、ｈＩＬ－２残基 Ｍ２３、Ｇ２７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｐ８２は除く、ｈＩＬ－２エピトープに結合する。ｈＩＬ－２と複合体を形成した上記の特徴を有する抗体は、ＩＬ－２シグナルを高親和性ＩＬ－２Ｒに優先的に送達するであろう。重要なことは、抗体による立体障害なしに、妨げられずに最適なシグナル伝達刺激の送達を可能にするために、受容体への結合時に、抗体はまた、複合体から解離し、換言すれば、ＩＬ－２ポリペプチドから分離するであろう。

【0134】

別の実施形態によれば、本発明による使用のためのＩＬ－２複合体を含む医薬組成物は、患者のＤＣの増殖及び／又は活性化を促進する。ＤＣの増殖は、Ｂｒｄｕ、７ＡＡＤなどの検出可能なＤＮＡ挿入剤の取り込み、あるいは経時的な数の増加、あるいはＫｉ６７などの細胞周期への進入を示す表面マーカーのアップレギュレーションによって測定することができる。活性化とは、ＭＨＣ又は共刺激分子など、成熟した樹状細胞が産生する因子の測定値の上昇と定義することができる。あるいは、活性化は、実施例において樹状細胞の活性化及び増殖を駆動することが示されている分子、特に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、ＴＮＦＡ、ＴＮＦＳＦ２、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１３７５）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３ｌ、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ４９７７１）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＣＳＦ２、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０４１４１）の増加によって定義してもよい。

【0135】

図１５及び図１７に示すデータは、ＣＤ２５偏向抗体を含むＩＬ－２複合体の非経口投与により、マウスのレシピエントの脾臓のＤＣ集団が増大することを実証し、ＩＬ－２複合体刺激により、ＢｒｄＵ組み込みにより測定される成熟樹状細胞の増殖と、活性マーカーの調節によって測定される抑制性へのＤＣ前駆体の成熟の両方が誘導される（図１５及び図１７参照）。

【0136】

本発明による使用のためのＩＬ－２複合体を含む医薬組成物の特定の実施形態では、組成物は、免疫介在性疾患と診断された患者に投与される。ＤＣベースの治療が患者に利益をもたらすことが可能な自己免疫疾患及び自己炎症性疾患には、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、シェーグレン病、Ｉ型糖尿病、乾癬、白斑、炎症性腸疾患、多発性硬化症、血球貪食性リンパ組織球症が含まれるが、これらに限定されない。さらに、Ｔ細胞応答のプライミング及び持続において樹状細胞が重要であることは、喘息又はアトピー性皮膚炎などのアレルギー性又はアトピー性疾患と診断された患者もまた、本発明によるＩＬ－２複合体を含む医薬組成物の投与から利益を得る可能性があることを示唆している。

【0137】

別の実施形態では、本発明による使用のためのＩＬ－２複合体を含む医薬組成物は、同種移植関連障害（例えば、急性及び慢性の移植片対宿主病、又は多発血管炎を伴う肉芽腫症などの血管炎）と診断された患者に投与される。さらに、移植において将来の同種移植片の受け入れを促すために投与されてもよい。ＩＬ－２複合体を含む医薬組成物の投与は、したがって、同種組織移植片若しくは臓器移植処置の前、若しくは同時に、あるいは患者が以前に組織移植片若しくは臓器移植処置を受けた後に行われてもよい。

【0138】

実施例の図１６は、アルデスロイキンを用いたＩＬ－２免疫療法が、ヒト全身性エリテマトーデス患者の樹状細胞を増大させ、特にｃＤＣ１及びｃＤＣ２の数を増強することを実証するものである。図１５及び図１７は、ＮＡＲＡ１を含むＩＬ－２複合体、又は本発明によるＩＬ－２複合体を含むＣＤ２５偏向医薬組成物による治療が、マウスにおいて同様の急性ＤＣ増大を達成することを示す。さらに、本発明によって提供されるＩＬ－２複合体は、有効性、副作用の低減、及び応答の寿命の点で、ＩＬ－２免疫療法よりも優れていることが知られている（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ Ｊ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５，３６：７６３）。ＣＤ２５偏向ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂ複合体は、ＣＤ８０とＭＨＣ ＩＩの発現が減少し、チェックポイント阻害分子のＰＤ－１ファミリーの発現が上昇することにより特徴づけられる免疫寛容原性の表現型を持つＤＣを増強することが実証された。

【0139】

本発明のさらなる態様は、ＤＣ機能の増強を必要とする患者、例えば、がん、又は自己免疫性、炎症性若しくは同種移植片関連の症状を治療する方法であり、前記方法は、本発明の明細書による有効量のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂと会合したｈＩＬ－２ポリペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む。

【0140】

本発明は、以下のさらなる項目をさらに包含する：
項目Ａ． 樹状細胞（ＤＣ）機能の強化により恩恵を受ける症状を有する患者における使用のための、ＩＬ－２複合体を含む医薬組成物であって、
前記ＩＬ－２複合体は、ｈＩＬ－２特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に会合したヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）ポリペプチドを含み、かつ
前記ＩＬ－２複合体は、ＣＤ２５に、及び／又はＣＤ１２２、ＣＤ１３２及びＣＤ２５を含む高親和性ＩＬ－２受容体に、ＣＤ１２２及びＣＤ１３２を含む中間親和性ＩＬ－２受容体と比較して、優先的に結合する、
前記医薬組成物。
項目Ｂ． 前記ＩＬ－２複合体は、
ａ． ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を増大させるよりも、制御性Ｔ（Ｔ_ｒｅｇ）細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化をより大幅に増大させ、及び／又は
ｂ． ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を増大させるよりも、Ｔ_ｒｅｇ細胞の増殖を大幅に増加させ、及び／又は
ｃ． ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、及び／又はＢ細胞に対するＴ_ｒｅｇ細胞の比率を増加させる、
項目Ａに記載の使用のためのＩＬ－２複合体を含む医薬組成物。
項目Ｃ． 前記ｈＩＬ－２特異的ｍＡｂは、Ｖ_Ｈ相補性決定領域（ＣＤＲ_Ｈ）ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２及びＣＤＲ_Ｈ３を含む重鎖可変（Ｖ_Ｈ）領域、並びにＶ_Ｌ相補性決定領域（ＣＤＲ_Ｌ）ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２及びＣＤＲ_Ｌ３を含む軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）領域を含み、ここで：
ａ． ＣＤＲ_Ｈ１は、配列番号００１を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｂ． ＣＤＲ_Ｈ２は、配列番号００２を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｃ． ＣＤＲ_Ｈ３は、配列番号００３を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｄ． ＣＤＲ_Ｌ１は、配列番号００４を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｅ． ＣＤＲ_Ｌ２は、配列番号００５を含むか、又はそれと同一であり；及び
ｆ． ＣＤＲ_Ｌ３は、配列番号００６を含むか、又はそれと同一である、
項目Ａ又はＢに記載の使用のためのＩＬ－２複合体を含む医薬組成物。
項目Ｄ．
ｃ． 前記ｈＩＬ－２ ｍＡｂのＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２及びＣＤＲ_Ｈ３は、配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、配列番号０１０、配列番号０１１、配列番号０１２、配列番号０１３、又は配列番号０１４から選択されるＶ_Ｈ配列に含まれており、特に前記ＣＤＲ_Ｈは、配列番号００７に含まれており、かつ
ｄ． 前記ｈＩＬ－２ ｍＡｂのＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２及びＣＤＲ_Ｌ３は、配列番号０１５、又は配列番号０１６から選択されるＶ_Ｌ配列に含まれており、特に前記ＣＤＲ_Ｌは、配列番号０１５に含まれている、
項目Ａ～Ｃのいずれか一項に記載の使用のためのＩＬ－２複合体を含む医薬組成物。
項目Ｅ． 前記医薬組成物は、患者におけるＤＣの増殖及び／又は活性化を促進する、項目Ａ～Ｄのいずれか一項に記載の使用のためのＩＬ－２複合体を含む医薬組成物。
項目Ｆ． 前記医薬組成物は、免疫介在性症状と診断された患者に投与される、項目Ａ～Ｅのいずれか一項に記載の使用のためのＩＬ－２複合体を含む医薬組成物。
項目Ｇ． 前記医薬組成物は、同種組織移植片若しくは臓器移植の処置の前に患者に、又は組織移植片若しくは臓器移植の処置を以前に受けたことのある患者に投与される、項目Ａ～Ｆのいずれか一項に記載の使用のためのＩＬ－２複合体を含む医薬組成物。
項目Ｈ． 項目Ａ～Ｇのいずれか一項に記載のｈＩＬ－２特異的ｍＡｂと会合しているｈＩＬ－２ポリペプチドを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む、がん、自己免疫疾患、炎症疾患、又は同種移植関連疾患を有する患者を治療するための方法。

【0141】

本発明は、以下の実施例及び図によってさらに説明され、そこからさらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0142】

材料と方法
細胞株と初代細胞
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手したＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、子牛胎児血清（１０％ｖ／ｖ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地で維持した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、事前のインフォームドコンセントの後、チューリッヒ州倫理委員会の承認（ＢＡＳＥＣ番号２０１６－０１４４０）を得て、健常者から採取したヒト末梢血からＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケア）勾配遠心分離により単離した。

【0143】

蛍光タグ付きＩＬ－２Ｒサブユニットの生成
ＩＬ－２Ｒサブユニットは、柔軟な１５個のアミノ酸（ＧＧＧＧＳ）_３スペーサー（モチーフ配列番号０２１）を有する蛍光タンパク質にＣ末端で連結した。ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、又はＲＦＰ６５７（ＲＦＰ）をコードする配列は、プラスミドであるｐＣＥＰ４ＣｙＰｅｔ－ＭＡＭＭ及びｐＣＥＰ４ｙＰＥＴ－ＭＡＭＭ（それぞれＰ．Ｄａｕｇｈｅｒｔｙから贈与された、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１４０３３及び１４０３２）及びｐＳＧ４ＯＣ－ＲＦＰ６５７（ハノーファー医科大学のＤ．Ｈｅｃｋｉからの贈与）から誘導した。ＣｙＰｅｔは、以下の特定のプライマーを用いて増幅した：フォワード５’－ＣＧＴＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣ－ＴＧＴＧＡＣＡＡＧＧ－３’（配列番号０２２）及びリバース５’－ＧＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＧＴＡＣＡ－ＧＴＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ ＴＧ－３’（配列番号０２３）。ヒトＣＤ２５の遺伝子配列を、ヒトＰＢＭＣ ＲＮＡから増幅し（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓミニキット、Ｑｉａｇｅｎ）、ヒトＣＤ２５の特異的プライマー対を用いてＰＣＲ増幅した後にＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写した：フォワード５’－ＣＴＡＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＣＴＡＴＧＧＡＴＴＣＡＴＡＣＣＴＧＣＴＧ－３’（配列番号０２４）及びリバース５’－ＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＧＡＴＴＧＴＴＣＴＴＣＴＡ－ＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧ－３’（配列番号０２５）。ＰＣＲ産物をゲル抽出（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）により０．５～１％アガロースゲルにより精製し、断片を、オーバーラップ伸長ＰＣＲを用いてアニールし、哺乳類発現ベクターｐＣＳＣＭＶ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド３０５３０、Ｇ．Ｒｙｆｆｅｌによる贈与）にクローニングした。ヒトＣＤ１２２－ＣｙＰｅｔ及びヒトＣＤ１３２－ＲＦＰ６５７（ＣＤ１３２－ＲＦＰと呼ぶ）を、ＧｅｎｅＡｒｔサービス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により合成し、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１へクローニングした。

【0144】

細胞ベースのＩＬ－２Ｒ結合アッセイ
０．７５×１０^６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、ＤＮＡ：ＶｉａＦｅｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が１：３の比率を用いて、各々１．３μｇのｐＣＤ２５－ＣｙＰｅｔ、ｐＣＤ１２２－ＹＰｅｔ及びｐＣＤ１３２－ＲＦＰを用いて６ウェルプレートで共トランスフェクションした。１つ又は２つのＩＬ－２Ｒサブユニットをトランスフェクトし、３７℃、５％ＣＯ_２で培養する場合、空ベクターｐｃＤＮＡ３．１を用いて総ＤＮＡ量を３．９μｇに調整した。トランスフェクション後４８時間に酵素フリーの細胞解離バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞を剥離し、ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳと２ｍＭ ＥＤＴＡとを含むＰＢＳ）中で回収した。ローダミン標識ＩＬ－２（ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ）と抗ＩＬ－２ ｍＡｂを１：１のモル比で混合し、室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした。ＩＬ－２_Ｒｈｏｄを生成するために、ヒトＩＬ－２を滅菌水で再構成し、５０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ＝６．５）で透析して好ましいＮ末端ローダミン結合を最適化し、続いてＮ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ：Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）－ローダミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と氷上で２時間インキュベートした。非反応のＮＨＳ－ローダミンはゲルろ過（Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラム、７Ｋ ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により除去した。ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／抗ＩＬ－２ ｍＡｂ複合体は、Ｖ底、９６ウェルプレート中で０．３×１０^６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＩＬ－２Ｒサブユニット又はモック対照を発現）と３７℃で１０分間インキュベートし、冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、冷蔵庫でＢＶ６０５ラット抗マウスＩｇＧ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＸ５６）と２０分間インキュベートした。表面染色後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した（いずれもＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。

【0145】

マウス
Ｃ５７Ｂｌ／６ＪマウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。雌マウスは２～５ヶ月齢で実験に使用した。実験はチューリッヒ州獣医局の承認（ライセンス２４６／２０１６）を受け、スイス連邦及び州の法律に従って実施した。マウスは非盲検の治験責任医師によって無作為化され、機関ガイドラインに従ってチューリッヒ大学病院の特定の無菌施設で飼育した。

【0146】

アカゲザル
アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）を用いた試験は、生物医学霊長類研究センター（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ）（ＢＰＲＣ）で、４～１５歳、体重５～１５ｋｇの１５匹の健常な雌の成体を対象に実施した。動物はＳＴＬＶ又はＳＲＶに特異的な循環抗体を示さず、試験前に免疫抑制療法又は抗体療法を受けていなかった。すべての手順とプロトコルは、ＢＰＲＣの動物実験委員会の動物実験に関するすべての関連倫理規定を遵守した。動物を３匹ずつの５群に無作為に分けた：群１：ＬＤ ＩＬ－２（１０μｇ／ｋｇ）；群２：ＨＤ ＩＬ－２（３３μｇ／ｋｇ）；群３：ＬＤ ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘ（１０／１００μｇ／ｋｇ）；群４：ＨＤ ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘ（３３／３３０μｇ／ｋｇ）；及び群５：ＵＦＫＡ－２２（３３０μｇ／ｋｇ）。ＩＬ－２を毎日皮下注入で投与し、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘ及びＵＦＫＡ－２２は０日目及び３日目に静脈注入した。注入及び出血時には、動物を鎮静化した。

【0147】

臨床試験及びヒト試料
ヒト試料は、臨床試験「インターロイキン２治療性全身性エリテマトーデスにおける免疫学的パラメーターの公正な特性評価に関するオープンラベル、モノセントリック、第ＩＩ相、治験責任医師主導の臨床試験」（Ｃｈａｒａｃｔ－ＩＬ－２、臨床試験識別子：ＮＣＴ０３３１２３３５）及び「健康個体及び疾患個体の異なる白血球サブセットの表現型及び機能の特性評価に関する基礎研究プロジェクト」（ＰＦＣＬ－１、ＢＡＳＥＣ番号２０１６－０１４４０）において収集した。両プロジェクトは、スイスの管轄当局による審査と承認を受け、ヘルシンキ宣言の最新版、Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅのガイドライン、及びスイスの法的要件に準拠して実施した。臨床試験への登録又は試料採取の前に、書面によるインフォームドコンセントを得た。ヒト血液をＥＤＴＡバキュテナチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に採取し、続いてＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の勾配遠心分離により末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。単離したＰＢＭＣは、１０％ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ）含有胎児子牛血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ）中で凍結し、分析前に液体窒素中で１年未満で保存した。血清は、Ｃｌｏｔ Ａｃｔｉｖａｔｏｒバキュテナチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて採取した血液から単離し、分析前に－８０℃で１８ヶ月未満で保存した。ＩＬ－２を介したｃＤＣ及びリンパ球の増大を評価するため、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ：ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）患者の血液を、試験プロトコルに従って、毎日１５０万国際単位（ＩＵ）のアルデスロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ）の５日間コースの投与前と後に採取した。

【0148】

ＩＬ－２ ｍＡｂ複合体形成
ＨＥＫ細胞に基づくアッセイでは、ＩＬ－２_ＲｈｏｄをＦＡＣＳバッファー（１×ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で抗ｈＩＬ－２抗体と１：１の割合で混合し、室温で少なくとも１５分間インキュベートした。ｉｎ ｖｉｖｏでの適用には、ｈＩＬ－２を、抗ｈＩＬ－２抗体と滅菌ＰＢＳ中で１：１の割合で混合し、室温で少なくとも１５分間インキュベートした。注入容量は１回の腹腔内注入あたり２００マイクロリットルであった。組換えヒトＩＬ－２（ｔｅｃｅｌｅｕｋｉｎ、Ｒｏｃｈｅ）は、国立衛生研究所の国立がん研究所から入手した。抗体複合体は、以前の記載のとおり（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｅｒｉｚ Ｎ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１６，８：３６７ｒａ１６６）、１回の注入あたり１５，０００ＩＵのＩＬ－２と１５μｇの抗ＩＬ－２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とを混合することにより調製した。ＩＬ－２ｃｘ、又は２００，０００ＩＵのＩＬ－２を毎日、３日間連続して注入した。ＢｒｄＵ取り込み細胞は、ＦＩＴＣ ＢｒｄＵフローキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、製造者の指示に従って測定した。

【0149】

フローサイトメトリー
リンパ節（ＬＮ）及び脾臓の単細胞懸濁液を調製し、Ｆｏｘｐ３／転写因子細胞内染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、表面マーカー及び細胞内Ｆｏｘｐ３及びＫｉ－６７を製造者の指示に従って染色した。マウス又はサルのｐＳＴＡＴ５を検出するために、Ｐｈｏｓｆｌｏｗ Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は溶解液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞を直ちに固定化し、さらに製造者の指示に従い細胞内染色処理を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏでｐＳＴＡＴ５を測定するために、１０^６個の磁気精製したヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を９６ウェル、Ｖ底プレートに播種し、ＩＬ－２、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘ、又はＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘを使用して３７℃で１５分間刺激した。細胞内ｐＳＴＡＴ５は、抗ＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４）ｍＡｂ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて前述と同様に染色した。サルの細胞の表面染色には、標準的なプロトコルに従って、２００μｌのＥＤＴＡ血液でｍＡｂをインキュベートし、その後、赤血球の溶解、固定化、及び透過処理を行い、Ｆｏｘｐ３及びＫｉ－６７の細胞内染色を行った。試料はＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで取得し、ＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。フローサイトメトリーに使用する抗体及び蛍光色素は、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、又はＭｉｌｔｅｎｙｉから購入した。

【0150】

ＥＬＩＳＡ
平底Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＮＡＲＡ１抗ヒトＩＬ－２ ｍＡｂ（捕捉）で４℃にて一晩コーティングした。ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でプレートを洗浄した後、ウェルをＰＢＳ、１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０溶液で４５０ｒｐｍにて振とうしながら、１時間超過、室温でブロッキングした。細胞上清又は精製ＵＦＫＡ ｍＡｂをプレート上で１～２時間インキュベートし、ＩＬ－２を直接コーティングするか、プレートコーティングしたＮＡＲＡ１により捕捉した。プレートを洗浄した後、抗マウスＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）又はビオチン化抗ＩＬ－２検出ｍＡｂ（クローン５３４４．１１１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に室温で４５０ｒｐｍにて１時間インキュベートすることによりＩＬ－２又は競合結合を評価した。さらに洗浄後、プレートをストレプトアビジン標識ワサビペルオキシダーゼ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に、暗所で室温にて４５分間インキュベートした。最後に、最終洗浄後、プレートをＴＭＢペルオキシダーゼＥＩＡ基質（ＢｉｏＲａｄ）で２～５分間進展させ、Ｈ_２ＳＯ_４（１．８Ｍ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて停止させた。ｉＭａｒｋマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、４５０ｎｍの吸光度を読み取った。ＩＬ－２又はＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘの血清半減期は、ＮＡＲＡ１が捕捉として、ビオチン化抗ＩＬ－２ ｍＡｂ（ｃｌｏｎｅ ５３３４、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が検出ｍＡｂとして機能するサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定し、その後上記と同様に進展させた。

【0151】

表面プラズモン共鳴
ＳＰＲ試験では、ＵＦＫＡ－２０又はＮＡＲＡ１をＣＭＤ２００チップ（ＸａｎＴｅｃ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ）に直接固定し、３００ｎＭから開始して滴定したＩＬ－２濃度を注入し、続いて２倍希釈を注入した。ＣＤ２５及びＣＤ１２２の結合を測定するために、ＩＬ－２（１０００ｎＭ）を抗ＩＬ－２ ｍＡｂコーティングチップ上で６０秒間捕捉し、続いて組換えＣＤ２５又はＣＤ１２２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を３３３ｎＭから開始して連続注入し、続いて３倍希釈を注入した。チップ表面は、グリシンバッファーｐＨ １．５を用いてサイクルごとに再生した。測定値は２０℃で取得し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分析した。

【0152】

ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘの構造解析
ＵＦＫＡ－２０のＦａｂ断片は、全長ｍＡｂをパパインで切断した後、プロテインＡで精製して作製した。１．５ｍｌのＵＦＫＡ－２０（ｐＨ ７．０の９０ｍＭ ＮａＣｌ含有の５０ｍＭにおいて１５．３ｍｇ／ｍｌ）を、ジクロロジフェニルトリクロロエタン（ＤＤＴ）及びパパイン（Ｒｏｃｈｅ）と混合して、それぞれ最終濃度が５ｍＭ及び１．５ｍｇ／ｍｌになるようにした。室温で１６時間消化した後、５６ｍＭ Ｅ６４溶液（Ｒｏｃｈｅ）を用いてパパインを失活させ、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ８．０）で１０倍希釈した。この混合物をＴｒｉｓ／ＮａＣｌバッファーで平衡化したプロテインＡカラムにロードし、Ｆａｂ断片を保有するフロースルー画分を回収し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）でさらに精製した。精製したＵＦＫＡ－２０ Ｆａｂを水に溶かした１０倍モル過剰のヒトＩＬ－２と混合することにより形成したＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ Ｆａｂ複合体を、Ａｋｔａ ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラムを用いてＳＥＣにより精製した。複合体を含む画分をプールし、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌバッファー（ｐＨ ７．４）に対して４℃で一晩透析し、Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルターユニット１０－ｋＤａ、ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮して最終タンパク質濃度を１０ｍｇ／ｍｌとし、２８０ｎｍでの吸収により測定した。さまざまな結晶化バッファーをスクリーニングし、最適な結晶化条件を見出すように精製した。最後に、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ Ｆａｂ複合体溶液を、１０．８６％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ ８０００、５．７６％（ｖ／ｖ）エチレングリコール、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４８）を含む結晶化バッファーと１：１で混合した。結晶は、２０℃で９６ウェルプレートにシッティングドロップ蒸気拡散法で成長させ、３０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールを添加したリザーバー溶液を用いて回収及び凍結保護し、直ちに液体窒素で凍結した。回折データは、Ｐｉｌａｔｕｓ ２Ｍ検出器（Ｄｅｃｔｒｉｓ、バーデン－ヴァットヴィル、スイス）を備えたビームラインＸ０６ＤＡ（スイス光源、ポール・シェラー研究所、ウィリゲン、スイス）において、波長１Åで収集した。データ処理は、ＸＤＳ及びＡｉｍｌｅｓｓを使用した。ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０のＦａｂ複合体構造は、最初は抗ロイコトリエン抗体のＦａｂ断片の構造（ＰＤＢ：５Ｂ６Ｆ）を、その後にヒトＩＬ－２の構造（ＰＤＢ：１Ｍ４７）を検索モデルとして、ＭＯＬＲＥＰを用いて分子置換により解いた（Ａｒｋｉｎ Ｍ．Ｒ．ら，ＰＮＡＳ ２００３ １００：１６０３）。モデル構築はＣｏｏｔで行い、ＲＥＦＭＡＣ５、 ＢＵＳＴＥＲ、及びＰＨＥＮＩＸを用いて精密化した。各ドメインを個別のＴＬＳ群として定義するＴＬＳ精密化を使用した。最終的な構造は、非対称単位の３つのＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０複合体を含有するものであった。ＩＬ－２Ｒサブユニットと抗ＩＬ－２ ｍＡｂのエピトープの重複（オーバーラップ）は、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｄｂｅ／ｐｒｏｔ＿ｉｎｔ／ｐｉｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ）のタンパク質界面、表面、及び集合のサービス（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，ｓｕｒｆａｃｅｓ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ’ ｓｅｒｖｉｃｅ）（ＰＩＳＡ）を使用して定量し、さらにＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用して計算した。

【0153】

ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）
未治療及びＵＦＫＡ２０複合体治療した野生型マウスから得られる４万個の脾臓マウスｃＤＣを、１％の２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＲＬＴ Ｐｌｕｓ溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ）中でＦＡＣＳにより分離した。その後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを単離した。選別した細胞から抽出されたＲＮＡは、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ ＲＮＡ好感度キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて品質及び濃度を定量した。ＳＭＡＲＴｅｒ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｓｅｑ Ｋｉｔ ｖ２（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いて、ユニバーサルプライミングによりｃＤＮＡを調製し（３分間の断片化を含む）、ＺａｐＲ ｖ２及びＲ Ｐｒｏｂｅｓ ｖ２を用いてリボソームｃＤＮＡを枯渇させた。このライブラリーをＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎ Ｄ１０００（Ａｇｉｌｅｎｔ）測定により定量し、ＨｉＳｅｑ ４０００プラットフォームで１試料あたり約４０Ｍリードを対象として１２５サイクルのシングルリードを使用して配列決定した。リードアライメントを行う前に、リードからアダプター及び低品質のテールを取り除いた。ＳＴＡＲ ａｌｉｇｎｅｒ（ｖ２．５．４ｂ）を用いて、ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットのＥｎｓｅｍｂｌ ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｉｌｄ ＧＲＣｈ３８．ｐ１０（Ｒｅｌｅａｓｅ ９１）へのアライメントを行った。遺伝子発現数は、ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＲｓｕｂｒｅａｄ（ｖ１．３２．１）のｆｅａｔｕｒｅ ｃｏｕｎｔで算出した。少なくとも１つの比較の群において、半数超過の試料で１０カウント超過であった場合、その遺伝子を発現しているとみなした。ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＥｄｇｅＲ（ｖ３．２０．６）を用いて差分発現遺伝子を検出した。遺伝子セットの濃縮解析は、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｅｒ ｆｏｒ ＲＮＡ－ｓｅｑ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｌｅｎｇｔｈ ｂｉａｓｅｄ ｄａｔａ（ｇｏｓｅｑ，ｖ１．３０．０）で行った。

【0154】

定量及び統計解析
統計検定は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて実施した。図の凡例に示されているとおり、ほとんどの実験は、テューキ又はダネットの多重比較を用いた一元配置分散分析、又は両側の対応のないスチューデントのｔ検定によって分析した。カウント数が正規性検定には小さすぎるデータセットについては、データ分布に基づいて正規分布を仮定した。ｐ＜０．０５は有意とみなした。

【0155】

実施例１：抗ヒトＩＬ－２モノクローナル抗体の生成及び選択
Ｂａｌｂ／ｃマウスを完全フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中のヒトＩＬ－２で免疫し、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で乳化したＩＬ－２で２回ブーストした。初回免疫後４～５週間にマウスを殺処分して脾臓を採取した。脾臓細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて５：１の割合で混合した。クローンは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０ｍＭメルカプトエタノール、１：１００インスリン－トランスフェリン－セレニウム、２％ＩＬ－６調整培地、ペニシリン－ストレプトマイシン、ゲンタマイシン（すべてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ：ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地で培養した。Ｂ細胞ハイブリドーマの上清では、ＩＬ－２結合ＥＬＩＳＡを用いたＩＬ－２反応性についてのスクリーニングを行い、かつ競合ＥＬＩＳＡを用いた特異性についてのスクリーニングを行い、その後、陽性ヒットをサブクローニングした。ｍＡｂを、ヒポキサンチン・チミジン（ＨＴ）培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖した。再試験後、プロテインＧアガロース精製（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、細胞上清から抗ＩＬ－２ ｍＡｂを精製した。抗体は、一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞により産生し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてアフィニティー精製し、分画した。純度は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。

【0156】

実施例２：偏向性抗ＩＬ－２ｍＡｂは、ＩＬ－２Ｒへの結合及びＩＬ－２の送達という明確な特性を有する
競合酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、実施例１で生成したもの、特許抗体、及びマウスハイブリドーマライブラリーから公的に入手できるクローンを含む、１万以上の抗ヒトＩＬ－２ ｍＡｂについて、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒとの結合特性を評価した。特に指定がない限り、実施例中のすべてのＩＬ－２及びＩＬ－２Ｒのサブユニットはヒト分子を指す。ＣＤ２５偏向性抗ＩＬ－２ｍＡｂを同定及び比較するために、単量体ＣＤ２５、二量体ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２、及び三量体ＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２をヒト細胞上に発現させた新規細胞ベースのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングプラットフォームを開発した。蛍光タグ付きＩＬ－２Ｒサブユニットを生成し、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ：ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）２９３Ｔ細胞で一過性に発現させて、これによりフローサイトメトリーにより定義した、ＩＬ－２Ｒサブセットを発現する細胞を正確に同定し、かつ単独又は抗ＩＬ－２ ｍＡｂとの複合体のいずれかでローダミン標識化ＩＬ－２（ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ）の結合を定量することが可能になる。ＣＤ２５偏向ＩＬ－２複合体（ｃｘ）はＣＤ２５と会合するがＣＤ１２２＋ＣＤ１３２とは会合せず、一方でＣＤ１２２偏向ＩＬ－２ｃｘは逆のパターンを示した（図１Ａ）。５種の抗ＩＬ－２ ｍＡｂをその結合パターンの違いから選択し、ＵＦＫＡ－１０、ＵＦＫＡ－２０（重鎖配列番号０１９、軽鎖配列番号０２０）、ＵＦＫＡ－３０、ＵＦＫＡ－４０、及びＵＦＫＡ－５０と称し、これらは大きく３つのカテゴリーに分けられる：非偏向（ＵＦＫＡ－１０）、ＣＤ２５偏向（ＵＦＫＡ－２０、ＵＦＫＡ－３０、及びＵＦＫＡ－４０）、及びＣＤ１２２偏向（ＵＦＫＡ－５０）（図１Ｂ）。予想のとおり、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ単独ではＣＤ２５との結合は低く、ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２との結合は中間であり、ＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２とは強い結合を示した（図１Ｃ）。次に、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄを本発明者らのさまざまな抗ＩＬ－２ ｍＡｂと１：１の比率で複合化し、ＩＬ－２Ｒサブユニット発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で試験した。ＩＬ－２_Ｒｈｏｄと比較して、ＵＦＫＡ－１０とＩＬ－２_Ｒｈｏｄの複合体はＣＤ２５及びＣＤ１２２＋ＣＤ１３２への結合がわずかな減少を示したことは、ＵＦＫＡ－１０のこれらの受容体サブユニットとの軽度の干渉を示唆しており、一方で、ＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２とのＩＬ－２_Ｒｈｏｄの会合はこのｍＡｂにより変化しなかった（図１Ｃ）。ｍＡｂであるＵＦＫＡ－２０、ＵＦＫＡ－３０、及びＵＦＫＡ－４０を試験すると、これらのｍＡｂ間には別個の違いがあるが、ＣＤ２５偏向の明確なパターンが明らかに現れた（図１Ｃ及び図１Ｄ）。このように、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／ＵＦＫＡ－３０ｃｘ及びＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／ＵＦＫＡ－４０ｃｘは、ＣＤ２５及びＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２に優先的に結合し、複合体としてそれぞれ７４．５％及び９３．２％結合したままであり、一方でＣＤ１２２＋ＣＤ１３２との会合はわずかに減少するか（ＵＦＫＡ－３０と同様）又は変化しないか（ＵＦＫＡ－４０と同様）のいずれかであった（図１Ｃ～１Ｅ）。特に、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／ＵＦＫＡ－２０ｃｘはＣＤ２５と優先的に会合し、測定された相互作用の約３分の２はＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／ＵＦＫＡ－２０ｃｘによってなされ、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ単独がＣＤ２５で検出されるのは３分の１未満であった。しかしながら、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／ＵＦＫＡ－２０ｃｘは三量体ＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２と相互作用すると急速に解離するようであり、これは、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／ＵＦＫＡ－２０ｃｘが形成するこの相互作用が８．４％未満であり、ＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２に結合している複合体でない遊離ＩＬ－２_Ｒｈｏｄが形成する相互作用がと９１％になることから明らかである（Ｆｉｇ．１Ｃ～１Ｅ）；しかし、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／ＵＦＫＡ－２０ｃｘのＣＤ１２２＋ＣＤ１３２への結合は、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄと比較してＵＦＫＡ－２０の存在によって損なわれ（図１Ｃ）、このことは、ＵＦＫＡ－２０がＩＬ－２_Ｒｈｏｄに「ＣＤ２５偏向」を付与し、それと同時に、ＩＬ－２_ＲｈｏｄがＵＦＫＡ－２０から解離して三量体ＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２に結合することを可能にし、それによりシグナル伝達するＩＬ－２Ｒ複合体への「ＩＬ－２送達」を可能にすることを示唆した（図１Ｆ～１Ｈ）。逆に、ＵＦＫＡ－３０及びＵＦＫＡ－４０は、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄにさらに強いＣＤ２５偏向をもたらしたが、ＩＬ－２を三量体ＩＬ－２Ｒから解離し送達することはできなかった（図１Ｆ～１Ｈ）。前述のＣＤ２５偏向性抗ＩＬ－２ ｍＡｂとは異なり、ＩＬ－２_Ｒｈｏｄ／ＵＦＫＡ－５０ｃｘは、ＣＤ２５結合が減少し、かつ二量体ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２及び三量体ＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２のＩＬ－２Ｒとの会合を明らかに有利にし（図１Ｃ－１Ｈ）、十分に特性評価されたＣＤ１２２偏向性のＮＡＲＡ１ ｍＡｂ（Ａｒｅｎａ－Ｒａｍｉｒｅｚら，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２００６ ８：３６７）によるＩＬ－２ｃｘと類似している。以上のことから、ＣＤ２５偏向性ｍＡｂのメカニズムにおいて、ＣＤ２５偏向、及びシグナルを伝達するＩＬ－２ＲへのＩＬ－２送達という２つの特徴の観点で明確な違いを観察した。

【0157】

実施例３：マウスＴ_ｒｅｇ細胞の選択的刺激には、ＣＤ２５偏向及びＩＬ－２送達が重要である
次に、本発明者らのＣＤ２５偏向性ｍＡｂのマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウスにＩＬ－２単独又はＵＦＫＡ－１０、ＵＦＫＡ－２０、ＵＦＫＡ－３０、ＵＦＫＡ－４０及びＮＡＲＡ１との複合体のものを３日間毎日注入し、続いて治療した動物のリンパ節（ＬＮ）及び脾臓のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞、ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋メモリーＴ細胞、及びＣＤ３^－ＮＫ１．１^＋ＣＤ１２２^＋ＮＫ細胞のフローサイトメトリー解析を行った（図２Ａ、図３Ａ、及び図３Ｂ）。生理食塩水を投与した対照では、ＬＮに平均８．７％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞及び７％のＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋メモリーＴ細胞、並びに脾臓に８．６％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞、１３．４％のＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋メモリーＴ細胞、２．８％のＮＫ細胞が認められた（図２Ａ、図３Ａ、及び図３Ｂ）。低用量（ＬＤ：ｌｏｗ－ｄｏｓｅ）ＩＬ－２治療（マウス１匹につき毎日１．５μｇ）により、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞及びＣＤ８^＋ＣＤ１２２^＋メモリーＴ細胞の割合及び数は、ＬＮと脾臓との両方で約２～３倍増加した（図２Ａ、図２Ｂ及び図３Ａ）。ＵＦＫＡ－１０、ＵＦＫＡ－３０、及びＵＦＫＡ－４０で作成したＩＬ－２ｃｘは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞の刺激を、ＬＤ ＩＬ－２で観察されたものよりもわずかに改善しただけであったが（図２Ａ及び図２Ｂ）、これらのＩＬ－２ｃｘはＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋メモリーＴ細胞の増大を抑制できた（図２Ａ～図２Ｃ）。しかしながら、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞の活発な増大を誘導し、ＬＮと脾臓のＴ_ｒｅｇ細胞の合計がほぼ２０×１０^６に達したのに対し、生理食塩水処理動物では１．５×１０^６、ＬＤ ＩＬ－２治療動物では３×１０^６であり、一方で、ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋メモリーＴ細胞の割合及び数はＩＬ－２単独と比較して変化しないままであった（図２Ａ～図２Ｃ）。予想のとおり、ＣＤ１２２偏向ＩＬ－２／ＮＡＲＡ１ｃｘは、ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋メモリーＴ細胞の優先的な刺激を誘導したが、おそらくＩＬ－２のＮＡＲＡ１からの解離に起因する、一部のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞の増大が観察された（図２Ａ～図２Ｃ）（Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ Ｎ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５ ３６：７６３）。総合すると、これらのデータは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ－２／ＵＦＫＡ－３０ｃｘ及びＩＬ－２／ＵＦＫＡ－４０ｃｘで見られたようなＣＤ２５偏向だけでは、ｉｎ ｖｉｖｏでＴ_ｒｅｇ細胞を刺激するには不十分であることを実証する。むしろ、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘのように、軽度のＣＤ２５偏向を付与し、ＩＬ－２を三量体ＩＬ－２Ｒに効率的に送達するＩＬ－２ｃｘの能力が、ｉｎ ｖｉｖｏでの選択性及び有効性に必要な特徴であると考えられる。したがって、これらのスクリーニングアッセイにより、炎症を抑制するＴ_ｒｅｇ細胞へのＩＬ－２シグナル伝達を増加させる改善した方法として、さらなる特性評価のための候補ｍＡｂとしてＵＦＫＡ－２０を同定した。

【0158】

実施例４：ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘは、ｉｎ ｖｉｖｏでマウスＴ_ｒｅｇ細胞へのシグナル伝達を改善する
タイムコース実験では、マウスの脾臓のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、及びＮＫ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）の細胞内染色により測定されるとおり、シグナル伝達を誘導する、ＬＤ ＩＬ－２（１μｇ）対ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘ（１μｇ／１０μｇ）の単回腹腔内注入の能力を比較した（図４）。ＬＤ ＩＬ－２を投与したマウスでは、注入後２時間でＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の優先的な刺激を観察したが、この効果は１日目には既に消失した（図４Ａ）。ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、ＬＤ ＩＬ－２に応答してＳＴＡＴ５をリン酸化しなかったが、ＨＤ ＩＬ－２（３０μｇ）の単回注入を用いると、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む３つのリンパ球サブセットすべてで強固なシグナル伝達が生じた（図４Ａ）。ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞に対して高い選択性を示し、この選択性は注入後２時間で明らかになり、少なくとも２日間持続したが、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞のｐＳＴＡＴ５レベルはこの治療による影響を受けないままであった（図４Ａ）。結果として、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の細胞数は、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘの単回注入後、２日目に増加し、４日目にピークに達し、８日目にベースラインに戻ったが、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の数は、ＩＬ－２と比較して、実験期間中に有意な変化はおこらなかった（図４Ｂ）。ｐＳＴＡＴ５シグナル伝達のプロファイルは、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘのＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞に対する選択性を確認するだけでなく、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘがＩＬ－２よりはるかに長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有することも示唆した。これを検証するために、ＩＬ－２又はＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘをマウスに単回注入し、その後、ＮＡＲＡ１を捕捉ｍＡｂとして、及びＭＡＢ２０２を検出ｍＡｂとして用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって遊離ＩＬ－２又はＵＦＫＡ－２０複合化ＩＬ－２を測定した。ＩＬ－２は注入後３０分で検出され、４時間以内に消失しただけであったが、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘは注入後４時間でピークに達し、注入後２４時間以上存在した（図５）。ｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、ＩＬ－２が約３０分であるのに対し、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘは３０時間であると推定した。ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘの血清半減期は約２１時間であった。

【0159】

実施例５：ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＴ_ｒｅｇ細胞を選択的に刺激する
ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘの活性は、以前の記載のとおり、三量体ＩＬ－２Ｒを保持するＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞及び二量体（ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２）ＩＬ－２Ｒを備えるＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む、新たに単離した休止ヒトＴ細胞サブセットで評価した（Ａｒｅｎａ－Ｒａｍｉｒｅｚ，２００６）。健康なヒトドナーの末梢血からＣＤ３^＋Ｔ細胞を精製し、滴定したＩＬ－２及びＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘ（ＩＬ－２とＵＦＫＡ－２０とのモル比は１：１にて）で１５分間刺激した後、ゲートしたＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^ｌｏＦｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞について細胞内ｐＳＴＡＴ５のフローサイトメーター評価を行った。０．１ｎｇ／ｍｌという低濃度のＩＬ－２は、ＣＤ４^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞において最大半量のＳＴＡＴ５活性化を誘導できたが、ＣＤ８^＋Ｔ細胞において同等のＳＴＡＴ５活性化を達成するには約１０００倍高い濃度が必要であり（図６）、このことは以前の公表と一致している（Ｙｕ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２０１５ ６４：２１７２）。ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘは、ヒトＣＤ４^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞におけるｐＳＴＡＴ５の刺激において、ＩＬ－２と同等の効率を示した（図６）。反対に、５０％のｐＳＴＡＴ５^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞を達成するためには、半数効果濃度（ＥＣ５０）に基づき、およそ１７倍高い濃度のＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘが必要であった（図６）。ＵＦＫＡ－２０のＣＤ２５偏向の選択性及び有効性の向上を、ヒトＩＬ－２Ｒ保有細胞株を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでの測定、マウスでのさまざまなｉｎ ｖｉｖｏ実験、及びさまざまな健康なドナーから新たに単離された初代Ｔ細胞サブセットを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでの測定において実証し、その後にＵＦＫＡ－２０のいくつかのヒト化バージョンを生成した。ＵＦＫＡ－２０のＶ_Ｌ（配列番号０２０）及びＶ_Ｈ（配列番号０１９）のフレームワーク配列と最高レベルの同一性を共有するヒト生殖細胞系列遺伝子を同定し、コドン最適化し、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ Ｃｕｓｔｏｍ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓにより合成して、Ｆｃ－ｓｉｌｅｎｔ（Ｎ２９７Ａ）ヒトＩｇＧ１を含有する発現ベクターへクローニングした。ＵＦＫＡ－２０の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、Ｎ２９７Ａ変異を有するヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）骨格に転写し、これにより、この部位でのグリコシル化を防ぎ、したがってＦｃ γ受容体結合及びエフェクター機能を大きく低下させる（Ｐａｒｋ Ｈ．Ｉ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｎｃｈｏｌ ２０１６ ３４：８９５；Ａｒｎｏｌｄ Ｊ．Ｎ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ ２５：２１）。最良のヒト化候補は、配列番号０１７の重鎖と配列番号０１８の軽鎖とを保有するＵＦＫＡ－２２－００と名付けられ、短くはＵＦＫＡ－２２と称する。ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘ、及び同じＣＤＲを共有するがフレームワーク変異を持つ類似のクローンは、新たに単離したヒトＴ細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ（図６）でのＩＬ－２、又はマウスに注入（図７）したＩＬ－２の速度論的結合解析（表２）において、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘと同等の刺激活性及び選択性を示した。総じて、ＩＬ－２とＵＦＫＡ－２０及びそのヒト化バージョンＵＦＫＡ－２２との複合体は、ヒトＴ_ｒｅｇ細胞に対して強いｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示すが、ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する活性は、複合化されていない遊離ＩＬ－２と比較して著しく低下した。

【0160】

実施例６：ヒト化ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘは、アカゲザルのＴ_ｒｅｇ細胞に対してｉｎ ｖｉｖｏで選択性を示す
ＩＬ－２Ｒサブユニットは、ヒトとアカゲザルとの間で高度の相同性を有する。したがって、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を用いてアメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）の相同性検索を行ったところ、ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２の同一性は、この２種間でそれぞれ９１．９％（アクセッション番号 ＮＰ ００１０２８０８９．１）、９４．２％（ＮＰ ００１２４４９８９．１）、９７．３％（ＮＰ００１０３０６０６．１）であることがわかった。マウス抗体ＵＦＫＡ－２０とヒト化ＵＦＫＡ－２２クローンは、いずれも、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるサル又はヒトのいずれのＩＬ－２への結合が類似することがわかった（データは示さず）。ＩＬ－２とＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘとの間のｉｎ ｖｉｖｏ半減期の差を補償するために、動物に１０μｇ／ｋｇ（ＬＤ）又は３３μｇ／ｋｇ（ＨＤ）のＩＬ－２（アルデスロイキン）を０～６日目に毎日注入し、一方で、１０μｇ／ｋｇ ＩＬ－２と１００μｇ／ｋｇ ｍＡｂ（ＬＤ）又は３３μｇ／ｋｇ ＩＬ－２と３３０μｇ／ｋｇ ｍＡｂ（ＨＤ）のＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘを０及び３日目に投与した（図８Ａ）。０日目と３日目に３３０μｇ／ｋｇのＵＦＫＡ－２２（ＩＬ－２なし）の注入により、これが内因性サルＩＬ－２と結合するかどうかを評価した。－８日目のパラメーターの評価は、ベースライン及び未治療の対照として機能させた。最初の注入後１日にｐＳＴＡＴ５レベルを測定し、ＨＤのＩＬ－２、並びにＬＤ及びＨＤのＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘの後にＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞でｐＳＴＡＴ５レベルの有意な増加を観察し（図８Ｂ）、一方でＬＤのＩＬ－２又はＵＦＫＡ－２２単独では、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞のｐＳＴＡＴ５レベルは、－８日のベースラインで測定された値を超えて変化しなかった（図８Ｂ）。全体として、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５レベルの増加は、ＩＬ－２よりもＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘでより顕著であった。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞とは対照的に、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^－Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞、及びＣＤ８^＋ＣＤ２５^－Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５レベルは、ベースラインと比較してＩＬ－２、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘ又はＵＦＫＡ－２２によって有意に変化しなかった（図８Ｂ）。ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘのＴ_ｒｅｇ細胞に対する選択性を評価するために、サルの血液中のＴ_ｒｅｇ細胞の用量及び時間依存的な変化を定量した。６日目に最も強い変化を観察し、ここではＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の割合が、ＬＤ ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘを受けた動物においてＬＤ ＩＬ－２と比較して有意に高かった（図８Ｃ）。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞は、ＬＤ ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘを２回注入の後、ＣＤ４^＋Ｔ細胞全体の平均２９％まで増加したが、低用量（ＬＤ）ＩＬ－２を毎日７回注入しても、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞は４．８％のみの結果となった（図８Ｃ）。ＨＤ ＩＬ－２及びＨＤ ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘは、ＬＤ ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘで見られた効果を上回ることはなかったものの、同等のＴ_ｒｅｇ細胞応答をもたらした（図８Ｃ）。ＬＤのＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘの注入後３日目及び６日目のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞において、Ｆｏｘｐ３と細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）のレベルはＬＤ ＩＬ－２と比較して著しく増加したが、ＨＤ ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘ及びＨＤ ＩＬ－２ではそれ以上の利点はなかった（図８Ｄ）。同様に、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞は２日目からＫｉ－６７^＋となり、Ｋｉ－６７レベルは３日目と６日目にピークに達し（図８Ｄ）、これはＩＬ－２シグナル伝達が誘導される細胞周期及び増殖を反映している可能性が最も高い。ＩＬ－２を含まないＵＦＫＡ－２２の注入は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の頻度の、小さいが明確な減少をもたらし（図８Ｃ）、これはおそらくＵＦＫＡ－２２による内因性のサルＩＬ－２の穏やかな中和によって引き起こされたと考えられる。Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ－４、及びＫｉ－６７の発現量は、ＵＦＫＡ－２２群で変化がないままであった（図８Ｄ）。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞のＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＢ細胞に対する比率を計算すると、ＬＤ ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘが最良のＴ_ｒｅｇ細胞選択性を達成した（図８Ｅ）。アカゲザルのヒト化ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘでは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞に対するこれらのＩＬ－２ｃｘの選択性、及びＩＬ－２に対する優位性を確認した。

【0161】

実施例７：ＵＦＫＡ－２０は、ＣＤ１２２及びＣＤ２５へのＩＬ－２の結合を立体的に干渉する
ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０の相互作用の構造的及びさらに機構的な洞察を得るために、ＵＦＫＡ－２０の断片抗原結合（Ｆａｂ）バリアントを作成し、ＩＬ－２と複合化した。その後、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ Ｆａｂ複合体を結晶化し、構造解析を行った。生理的ｐＨ（ｐＨ ７．４８）で結晶を成長させ、２．８９Åの分解能で回折させた。この構造は分子置換法によって解かれ、３つのＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ Ｆａｂ複合体が非対称ユニットで含まれた。ＵＦＫＡ－２０は、ヒトＩＬ－２四元系の結晶構造と比較して、ＩＬ－２を背側に、縦軸に対して反時計回りに約５５°の角度で結合しており、ＩＬ－２と、Ｆ５１１１（国際タンパク質構造データバンク（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｎｋ）ＰＤＢ：５ＵＴＺ）、ＪＥＳ６－１（ＰＤＢ：４ＹＱＸ）、又はＮＡＲＡ１（ＰＤＢ：５ＬＱＢ）との複合体のものとは著しく異なっていた（図９Ａ）。次に、ＣＤ２５結合部位、ＣＤ１２２結合部位、及びＣＤ１３２結合部位の綿密な解析を行った。抗ＩＬ－２ ｍＡｂとＩＬ－２Ｒサブユニットとの間のエピトープのオーバーラップ（重なり）を評価し、タンパク質界面、表面、及び集合のソフトウェアツールを用いてＩＬ－２ｃｘ及び四元ＩＬ－２Ｒ複合体内の埋没表面積に基づいて定量した。ＵＦＫＡ－２０はＩＬ－２のＣＤ１２２結合部位と強く重なり、オーバーラップは４０％と計算されたが、ＵＦＫＡ－２０のＩＬ－２のＣＤ２５結合部位への干渉はむしろ軽度で、わずか６．３％であった（図９Ｂ）。ＵＦＫＡ－２０とＩＬ－２のＣＤ１３２結合部位とのオーバーラップは明らかではなかった。このように、ＵＦＫＡ－２０は、可変重鎖（Ｖ_Ｈ）のＣＤＲ１～３、及び可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）のＣＤＲ１及びＣＤＲ３を介して、主にＩＬ－２のＣへリックス及びＢへリックスに接触し、Ｃへリックスの周りに「クランプ」を形成していた（図９Ｂ）。通常ＣＤ１２２の相互作用に関与するＩＬ－２残基Ｄ８４、Ｎ８８、及びＶ９１は、ＵＦＫＡ－２０と密接に係合していた（図９Ａ）。これらの相互作用は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定で示されるとおり、ＩＬ－２のＣＤ１２２への結合を阻止する可能性が非常に高い（図９Ｃ）。さらに、ＵＦＫＡ－２０のＶ_Ｈ鎖は、ＩＬ－２－ＣＤ２５界面に位置するＩＬ－２残基Ｅ６０、Ｅ６１、及びＫ６４と密接に接触することにより、ＣＤ２５と小さいが有意な程度でぶつかっていた（図９Ｂ）。しかしながら、ＳＰＲにより測定したところ、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘは用量依存的に組換えヒトＣＤ２５と効率的に結合していた（図９Ｃ）。その複数の接触の結果として、ＵＦＫＡ－２０はＩＬ－２と高い親和性で会合し、約１０^－９ＭのＫ_ｄであった（表１）。Ｆ５１１１はＵＦＫＡ－２０とは異なる角度でＩＬ－２に結合し、Ｆ５１１１とＣＤ１２２のエピトープが有意にオーバーラップしたのに対し（４８．５％と計算）、ＣＤ１３２エピトープについてはこのオーバーラップは非常に軽度（２．５％）で、ＣＤ２５エピトープとの有意なオーバーラップはなかった（０．８５％）（図９Ａ及び図９Ｂ）。ＪＥＳ６－１は、ＵＦＫＡ－２０及びＦ５１１１とは全く異なる様式で、マウスＩＬ－２と相互作用した。ＵＦＫＡ－２０と比較して、ＪＥＳ６－１はＩＬ－２の反対側に結合し、ＣＤ１３２（１８％）、次いでＣＤ２５（１６％）、及びＣＤ１２２（８％）を主に干渉した（図９Ａ及び図９Ｂ）。マウスＩＬ－２Ｒ四元複合体は入手できないため、マウスＩＬ－２／ＪＥＳ６－１ｃｘのＩＬ－２Ｒオーバーラップは、四元ヒトＩＬ－２Ｒ結晶を用いて計算した。ＩＬ－２／ＮＡＲＡ１はＣＤ２５と完全にオーバーラップし、したがって、これはＣＤ２５のＩＬ－２との結合を「模倣」している。詳細な観察では、ＮＡＲＡ１は、ＩＬ－２のＣＤ２５結合部位と大部分オーバーラップしていたが（５２．５％）、ＣＤ１２２結合部位及びＣＤ１３２結合部位は完全にアクセス可能なままであった（０％）（図９Ａ及び図９Ｂ）。結果、ＳＰＲでは、ＩＬ－２／ＮＡＲＡ１ｃｘは非常に効率よく組換えヒトＣＤ１２２に結合したが、ＣＤ２５には結合しなかった（図９Ｃ）。

【0162】

構造解析から示唆されるとおり、ＵＦＫＡ－２０がＩＬ－２のＣＤ１２２結合部位及びＣＤ２５結合部位と機能的に競合するかどうかを評価するために、異なるＩＬ－２Ｒサブユニットを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞で、設定濃度のＩＬ－２_Ｒｈｏｄ及び滴定濃度のＵＦＫＡ－２０を用いる競合アッセイを実施した。ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２へのＩＬ－２_Ｒｈｏｄ結合は、ＩＬ－２とＵＦＫＡ－２０のモル比が１０：１及び１：１にて既に減少しており、したがってＵＦＫＡ－２０のＣＤ１２２との機能的な干渉を確認した（図９Ｄ、中段）。逆に、ＩＬ－２_ＲｈｏｄのＣＤ２５への結合は、ＩＬ－２とＵＦＫＡ－２０のモル比が１０：１及び１：１にて干渉されず、ＣＤ２５結合と競合するには５～５０倍高いＵＦＫＡ－２０濃度が必要だった（９Ｄ、左パネル）；同様のパターンは、ＣＤ２５＋ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞で現れた（図９Ｄ、右パネル）。ＵＦＫＡ２０エピトープの重なりと、ＩＬ－２ｃｘとＩＬ－２Ｒ四元複合体内の埋没表面積との結果から、ｈＩＬ－２配列の以下の３つの部位で結合がおこっていることが示唆された：
Ｈ１６、Ｄ２０を含むエピトープＡ。
Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６１、Ｌ６３、Ｋ６４、Ｅ６７、Ｅ６８を含むエピトープＢ。
Ｌ８０、Ｒ８１、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｉ８６、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ９０、Ｖ９１、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｍ１０４を含むエピトープＣ。

【0163】

エピトープＡとＣとは、ＣＤ１２２及びＣＤ１３２との結合に重要なＩＬ－２の（Ｆ５１１１により標的される）領域と重なるが、ＣＤ２５結合部位と重なるエピトープＢは、既存の抗体クローンと比較してＵＦＫＡ－２０によって固有に標的され（図９、図１０、図１１）、スクリーニングした１００００を超える代替物と比較して、このクローンによってもたらされる効果の増強と関連している可能性が高い。

【0164】

実施例８：ｈＩＬ－２エピトープへのＵＦＫＡ２０の結合を変化させるＣＤＲ変異
ＶＨ鎖（配列番号０１９）及びＶＬ鎖（配列番号０２０）に特定のアミノ酸置換を含有するＵＦＫＡ－２０バリアントを作成し、特定のＣＤＲループとｈＩＬ－２の提案エピトープとの間の極性及び非極性相互作用を弱めたり、強めたりする効果を調査した（表３及び表４）。７種のＶＨ鎖バリアントには、２～４個のアミノ酸置換を有する１～３及び～４種の間のＶＬ鎖バリアントが含まれた。まとめて、元のＵＦＫＡ－２０ ｍＡｂを含む１２種のＵＦＫＡ－２０バリアントを発現させ、精製し、その後、親和性とｉｎ ｖｉｖｏ活性（図１２）を測定した。バリアント抗体の親和性は６．４０３×１０^－８Ｍ～１．８５６×１０^－１０Ｍの範囲で、試験したバリアントの中で２＋９が最も低く、５＋９が最も高かった。ほとんどの抗体バリアントは１０^－１０Ｍの範囲で結合し、未修飾の元の１＋６（ＵＦＫＡ－２０）の抗体の親和性の周辺にクラスタ化している。Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスに、ＵＦＫＡ－２０バリアントのＩＬ－２／抗ＩＬ－２ｃｘを単回投与した。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞の頻度は、バリアント５＋９；４＋９；４＋１０；２＋９を含む抗体によって有意に変化せず（図１２Ｂ）、これは、これらのバリアントがこれらのバリアントの鎖における残基の置換によって影響を受けるｈＩＬ－２エピトープＢ（例えばＥ６１、Ｑ５７、Ｒ８３）及びＣ（Ｌ９４及びＥ９５）の残基との最適相互作用を欠いており（表４）、両方との相互作用が本発明による抗体と形成されるｈＩＬ－２複合体の高い有効性に必須であることを示している。注目すべきことに、エピトープＢは、ＣＤ２５標的複合体を形成する能力を持つ既知のクローンと比較して、ＵＦＫＡ－２０由来の抗体によって固有に標的される（図１０）。１０５＋６、１０５＋９、２＋９、１０３＋６、及び１０３＋９を含む試験抗体のほとんどは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞刺激に関してＵＦＫＡ－２０（１＋６）と非常に類似していたことから、配列は、ＣＤＲ領域における特定のアミノ酸変化に対して寛容であることが示され、ただし、配列番号０１９に由来するヒト化抗体の残基Ｓ５６、Ｍ１００、Ｙ１０２、及び配列番号０２０のＫ３６、Ｆ５６、Ｓ３２、Ａ３３、及びＡ１００が、ＩＬ－２エピトープＢ及びＣと相互作用するためにそれらの最適な配向を維持することを条件とする。

【0165】

Ｋ_Ｄ値と、Ｔ_ｒｅｇ細胞刺激によって媒介されるＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞の頻度を増加させる能力との間には、相関関係が観察された（図１２Ｃ）。抗体２＋９及び４＋１０を除いて、抗体の活性はＵＦＫＡ－２０（１＋６）抗体を中心にクラスタ化し、これは最適な親和性は１０^－１０Ｍの範囲にあることを示唆した。しかしながら、ＩＬ－２と最も高い親和性で結合した５＋９の抗体は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞刺激に関してｉｎ ｖｉｖｏの活性が低下したことは、親和性の上限が１．８５６^－１０であることを示唆した。

【0166】

実施例９：ＩＬ－２とＵＦＫＡ－２２抗体との融合タンパク質
ＣＤ２５偏向免疫複合体は優れた免疫調節の可能性を有しているが、いくつかの生物学的な側面が問題を引き起こして臨床開発を妨げているため、ヒトの炎症反応を阻害する使用としてはまだ承認されていない。第１に、ＩＬ－２と抗ＩＬ－２抗体とを３７度でインキュベートすることにより形成されたＩＬ－２抗体複合体は、別々の成分に分解されないように、投与直前に調製する必要がある。これは臨床の場では不便であり、ロット間のわずかな活性差につながる可能性がある。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでこの複合体が解離し、可溶性ＩＬ－２が生成され、望ましくないオフターゲットのシグナル伝達を生成する可能性がある。これらの問題を解決するために、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘ療法（組換えヒトＩＬ－２とヒト化ＣＤ２５偏向抗ＩＬ－２抗体ＵＦＫＡ－２２からなる２成分免疫療法）を、ＣＤ２５を介する最適なシグナル伝達を保持し、安定性が改善された組み合わされたＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２融合タンパク質（ＵＦＫＡ－２２ＦＰ）に置き換える単剤薬物化合物を開発した。

【0167】

ＵＦＫＡ－２２ＦＰ設計では、ＩＬ－２タンパク質とＵＦＫＡ－２２抗体とを柔軟なリンカーで接続する必要があり、これにより、ＩＬ－２会合だけでなく、重要なことに、二量体ＩＬ－２Ｒ（ＣＤ１２２＋ＣＤ１３２）を介したＩＬ－２シグナル伝達が結合された抗体構造によって妨げられないように、ＩＬ－２結合溝からのＵＦＫＡ－２２抗体の解離が最適な速度で促進される。ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２０ｃｘの結晶構造（ＰＤＢ：６ＹＥ３）を分析して、ＵＦＫＡ－２０の可変重鎖（Ｖ_Ｈ）及び可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）のＮ末端からＩＬ－２のＣ末端までの距離をそれぞれ３２．２Å及び４３．５Åと測定した（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。その後、どのリンカーがＩＬ－２Ｒを介したＣＤ２５標的シグナル伝達を最適にすることができるか試験するために、Ｎ末端ＩＬ－１２ポリペプチド（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ６０５６８）をＵＦＫＡ－２２ ＶＨ（配列番号０１７）に、又はＶＬ鎖（配列番号０１８）に、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ（配列番号０２３）（繰り返しのｎの数が３～６の範囲である）からなる柔軟なグリシン（Ｇ）セリン（Ｓ）リンカーで接合するＵＦＫＡ－２２ＦＰを生成した（図１３Ｃ及びＤ、及び図１４）。ＵＦＫＡ－２２ＦＰ ｖＨ（Ｇ_４Ｓ）_３、ＵＦＫＡ－２２ＦＰ ｖＨ（Ｇ_４Ｓ）_４、ＵＦＫＡ－２２ＦＰ ｖＨ（Ｇ_４Ｓ）_５及びＵＦＫＡ－２２ＦＰ ｖＬ（Ｇ_４Ｓ）_６を、分泌シグナル（配列番号０２７）の下流で発現し、ＨｉＴｒａｐ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムで精製したＨＥＫ２９３ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞の懸濁培養により得た。ＵＦＫＡ－２２ＦＰを、ＥＬＩＳＡでＣＤ２５ミニボディー（ＮＡＲＡ１）との結合について試験した。４つのＵＦＫＡ－２２ＦＰバリアントすべてがＮＡＲＡ１と結合したことは、ＵＦＫＡ－２２ＦＰのＩＬ－２ドメインが正しく折り畳まれていたことを示唆した。ＩＬ－２の生理活性は、３つのＩＬ－２Ｒサブユニットすべてを発現するマウスＣＴＬＬ－２細胞を用いた細胞増殖アッセイ、ヒトＩＬ－２Ｒαβγを発現するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２レポーター細胞でのＳＴＡＴ５シグナル伝達アッセイ、ヒトＰＢＭＣでのＴ_ｒｅｇ刺激において測定した。一度、融合タンパク質の活性及びＴ_ｒｅｇ選択性をすべての融合タンパク質について確認し、最も有望な候補をさらなるマウスでの試験のために選択した。

【0168】

Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスは、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘ、ＵＦＫＡ－２２ＦＰ ｖＨ（Ｇ_４Ｓ）_５及びＵＦＫＡ－２２ＦＰ ｖＬ（Ｇ_４Ｓ）_６（ｈＩＬ－２ ＬＣ融合の配列番号０２８を含む）を３日間毎日注入し、続いて、治療した動物の脾臓における、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞、ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＣＤ１２２^＋メモリーＴ細胞、及びＣＤ３^－ＮＫ１．１^＋ＣＤ１２２^＋ＮＫ細胞についてフローサイトメトリー分析を行った。ＵＦＫＡ－２２ＦＰ分子は１つのＵＦＫＡ－２２抗体と２つのＩＬ－２分子を構成するため、２：１のＩＬ－２とＵＦＫＡ－２２抗体のモル比を、ＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘ製剤に使用した。ＵＦＫＡ－２２ＦＰ ｖＨ（Ｇ_４Ｓ）_５を３回注入すると、ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞画分がわずかに増加したが、その変化は適用用量では有意ではなかった。一方、ＵＦＫＡ－２２ＦＰ ｖＬ（Ｇ_４Ｓ）_６は、ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞の頻度を１２μｇの用量にて脾臓で１５．２±１．２％に有意に増加させ、２４μｇの用量では２０．６±１．４％に達した。ＵＦＫＡ－２２ＦＰ ｖＬ（Ｇ_４Ｓ）_６を用いる治療は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞のＫｉ－６７発現の用量依存的な増加を誘導し、１２μｇ及び２４μｇのＵＦＫＡ－２２ＦＰ ｖＬ（Ｇ_４Ｓ）_６に対して、それぞれ４２．０±５．５％及び６４．１±３．７％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞がＫｉ－６７をアップレギュレーションした。Ｋｉ－６７^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞の有意な増加は、２４μｇ ＵＦＫＡ－２２ＦＰ ｖＬ（Ｇ_４Ｓ）_６を受けたマウスで観察され、１２μｇのＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘを注入したマウスで観察された７０．９±１．１％ Ｋｉ－６７^＋と非常に匹敵するものであった。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度に有意な変化が観察されなかったことは、融合タンパク質が細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対してオフターゲット効果を生じないことを実証した。ＵＦＫＡ－２２ＦＰの活性はＩＬ－２／ＵＦＫＡ－２２ｃｘに比べて低下したが、ＵＦＫＡ－２２ＦＰ ｖＬ（Ｇ_４Ｓ）_６はやや高い用量で同様の活性に達した（図１４）。まとめると、軽鎖に対するペプチドリンカーの長さは３０アミノ酸が好ましい。ＩＬ－２の抗体重鎖への結合も実現可能である。これらの結果は、製造上及び医薬安全上望ましい特性を有する融合タンパク質が、中程度の増量ではあるが、２成分のＩＬ－２ｃｘと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏで同等の効果を達成できることを示唆している。

【0169】

実施例１０：ＩＬ－２免疫療法により、マウス及びヒトのｃＤＣを増大させる
ＤＣは、系統（Ｌｉｎ：ｌｉｎｅａｇｅ）マーカーがなく、ＣＤ１１ｃが中間（ｉｎｔ：ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）又は高（ｈｉ）であることによって特徴づけられ、かつＣＤ１１ｃ^ｉｎｔＢ２２０^ｈｉｐＤＣ、ＣＤ１１ｃ^ｈｉ主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）^ｈｉｃＤＣ、ＣＤ１１ｂ^ｌｏｗＸＣＲ１^＋ＣＤ８α^＋ＤＮＧＲ－１（ＣＬＥＣ９Ａ）^＋ｃＤＣ１、ＣＤ１１ｂ^ｈｉＸＣＲ１^－ｃＤＣ２にさらに細分化できる（図１５Ａ）。組換えヒトＩＬ－２（ＩＬ－２；テセロイキン）を３回注入する短期コースは、野生型（ＷＴ）成体マウスの脾臓におけるｃＤＣの総カウント数を増加させた（図１５Ｂ）。この増大は、ｃＤＣへのチミジンアナログであるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みの増加によって明らかなように、ｃＤＣの活発な増殖に起因していた（図１５Ｃ）。このＩＬ－２効果がＣＤ２５^ｈｉ又はＣＤ１２２^ｈｉ細胞へのＩＬ－２の結合によって引き起こされたかどうかを評価するために、ＣＤ２５偏向ＩＬ－２／抗ＩＬ－２（５３４４）抗体複合体（ＩＬ－２／５３４４）及びＣＤ１２２偏向ＩＬ－２／抗ＩＬ－２（ＮＡＲＡ１）抗体複合体（ＩＬ－２／ＮＡＲＡ１）を試験した（Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ Ｅ．Ｍ．ＰＮＡＳ ２０１０，１０７：１１９０６；Ｋｒｉｅｇ Ｃ．ＰＮＡＳ ２０１０，１０７：１１９０６，Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ Ｎ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１６）。ＩＬ－２／５３４４及びＩＬ－２／ＮＡＲＡ１のマウスＩＬ－２／抗体複合体の両方は、偏向なしのＩＬ－２と定量的に同等の脾臓ＤＣの増大及び増殖を刺激した（図１５Ｂ、Ｃ）：炎症性ＣＤ１２２標的ＩＬ－２抗体を含むＩＬ－２ｃｘでのマウスの治療は、ｃＤＣ上のＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）のアップレギュレーションを誘導したが、ＭＨＣ－ＩＩは誘導せず（図１５Ｄ）、これは、Ｔ細胞活性化のための交差提示及び共刺激の可能性が増加したｃＤＣの成熟を示している。

【0170】

ヒトＣＤ１１ｃ^＋ＭＨＣ－ＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲ）^＋ＤＣは、組換えｈＩＬ－２（アルデスロイキン）免疫療法を用いた治験責任医師主導型臨床試験（Ｃｈａｒａｃｔ－ＩＬ－２と呼ばれる、ＮＣＴ ０３３１２３３５）において試験した（図１６Ａ）。アルデスロイキンを試験した臨床試験では、アルデスロイキン免疫療法によりＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞、及びＮＫ細胞の増殖が報告されている（Ｋｌａｔｚｍａｎｎ Ｄ．ら，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５，１５：２８３；Ｈｕｍｒｉｃｈ Ｊ．Ｙら，Ｌａｎｃｅｔ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２０１９，１：ｅ４４）。しかしながら、アルデスロイキン連日投与５日間コースの０日目（投与前）と５日目（最終投与後１日）のＫｉ６７^＋ＤＣを比較すると、ｃＤＣ１及びｃＤＣ２の増殖の増加を観察した（図１６Ｂ）。

【0171】

ＵＦＫＡ２０複合体（ＣＤ２５偏向抗体ＵＦＫＡ２０に結合したＩＬ－２）の非経口投与はまた、マウスレシピエントの脾臓のｃＤＣが増大し（図１７Ａ）、ＢｒｄＵ取り込みによって測定されるとおりｃＤＣの増殖を誘発した（図１７Ｂ）。ＵＦＫＡ２０複合体を含む医薬組成物での治療により、ＭＨＣ－ＩＩ及びＣＤ８０がダウンレギュレートされ（図１７Ｃ及びＤ）、これは、ＣＤ２５標的抗体との複合体が、ｃＤＣの抗原提示の能力及びＴ細胞への共刺激シグナルを伝達する能力を低減することを示す。ＵＦＫＡ２０複合体を用いる治療は、さらに、ｃＤＣに発現する免疫制御タンパク質プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）及びＰＤ－Ｌ２のアップレギュレーションを誘導する（図１７Ｅ）。ＵＦＡ２０複合体治療したマウスでは、トランスフォーミング成長因子β誘導型（Ｔｇｆｂｉ）、インターロイキン１受容体拮抗型（Ｉｌ１ｒｎ）、ＴＧＦ－β活性化キナーゼ１／ＭＡＰ３Ｋ７結合タンパク質１（Ｔａｂ１）などの免疫調節遺伝子がアップレギュレーションされた（ｘ軸の正の値）。インターロイキン６シグナルトランスデューサー（Ｉｌ６ｓｔ）、リンパトキシンβ（Ｌｔｂ）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１４（Ｔｎｆｓｆ１４）、及びコロニー刺激因子１（Ｃｓｆ１）を含む免疫賦活遺伝子は、ＵＦＫＡ２０複合体治療したマウスにおいてダウンレギュレーションされた（Ｘ軸の負の値）。さらに、ＵＦＫＡ２０複合体治療したｃＤＣは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー６（Ｆａｓ）をダウンレギュレーションし、これは生存期間の延長を示唆している（図１７Ｆ）。以上のことから、ＵＦＫＡ２０を含む医薬化合物は、免疫寛容原性の表現型及び免疫調節特性を有するｃＤＣの増殖を促進することが示された。

【0172】

【表1】

【0173】

【表2】

【0174】

【表3】

【0175】

【表4】

【0176】

【図1A】

【図1BC】

【図1DEFGH】

【図2ABC】

【図3AB】

【図4AB】

【図5】

【図6】

【図7AB】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8DE】

【図9A】

【図9B-1】

【図9B-2】

【図9B-3】

【図9CD】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図11】

【図12ABC】

【図13ABCD】

【図14ABCD】

【図15ABCD】

【図16AB】

【図17ABCD】

【図17E】

【配列表】

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【国際調査報告】