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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-13
(54)【発明の名称】酸素化ジテルペノイド化合物の生成
(51)【国際特許分類】
C12N 15/53 20060101AFI20230906BHJP
C12N 15/60 20060101ALI20230906BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230906BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230906BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230906BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230906BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230906BHJP
C12P 7/00 20060101ALI20230906BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20230906BHJP
【ＦＩ】
C12N15/53 ZNA
C12N15/60
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/63 Z
C12P7/00
C12N9/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023511907
(86)(22)【出願日】2021-08-26
(85)【翻訳文提出日】2023-04-12
(86)【国際出願番号】 EP2021073656
(87)【国際公開番号】W WO2022043461
(87)【国際公開日】2022-03-03
(31)【優先権主張番号】PA202000964
(32)【優先日】2020-08-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DK
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520281963
【氏名又は名称】コペンハーゲン大学
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】アンデルセン－ランバーグ，ヨハン
(72)【発明者】
【氏名】ハンセン，ニコライ，レルヴァド
(72)【発明者】
【氏名】フォーマン，ビクター
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AD99
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA10
4B064DA16
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4B065AA01X
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4B065BA02
4B065CA02
4B065CA44
4B065CA50
4B065CA51
4B065CA60
(57)【要約】
開示されるのは、酸素化ジテルペノイド化合物の合成のために選択された宿主細胞において、特有のシトクロムＰ４５０酵素をコードする遺伝子を挿入すること、および遺伝子を発現させることによるトリプトフェノリド、トリプトニドおよびトリプトリドなどの、酸素化ジテルペノイド化合物の生成のための方法である。さらに開示されるのは、この合成に適した特有のシトクロムＰ４５０酵素である。
【選択図】図５
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
酸素化ジテルペノイド化合物を生成できる組換え宿主細胞であって、ｉ．ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成でき；かつ
ｉｉ．シトクロムＰ４５０活性を有する第一の酵素をコードする第一の異種核酸を含み、シトクロムＰ４５０活性を有する前記第一の酵素が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５で表されるシトクロムＰ４５０酵素ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポチペプチドであり、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエンへとミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを変換できる、組換え宿主細胞。
【請求項2】
シトクロムＰ４５０活性を有する第二の酵素をコードする第二の異種核酸をさらに含み、シトクロムＰ４５０活性を有する前記第二の酵素が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で表されるシトクロムＰ４５０酵素ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポチペプチドである、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項3】
前記第一の異種核酸および前記第二の異種核酸を含みかつ発現し、それにより１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシアベオジエンおよび１４－ヒドロキシ－１８－アルド－アベオジエンを生成できる、請求項２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項4】
シトクロムＰ４５０活性を有する第三の酵素をコードする第三の異種核酸をさらに含み、シトクロムＰ４５０活性を有する前記第三の酵素が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で表されるシトクロムＰ４５０酵素ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポチペプチドである、前記請求項のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項5】
前記第一の異種核酸および前記第三の異種核酸を含みかつ発現し、それにより１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエンを生成できる、請求項４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項6】
前記第一の異種核酸、前記第二の異種核酸および前記第三の異種核酸を含みかつ発現し、それにより１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシアベオジエン、１４－ヒドロキシ－１８－アルド－アベオジエンおよびトリプトフェノリドを生成できる、請求項４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項7】
シトクロムＰ４５０活性を有する第四の酵素をコードする第四の異種核酸をさらに含み、シトクロムＰ４５０活性を有する前記第四の酵素が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６で表されるシトクロムＰ４５０酵素ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポチペプチドである、前記請求項のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項8】
前記第一の異種核酸、前記第二の異種核酸、前記第三の異種核酸、および前期第四の異種核酸を含みかつ発現し、それにより１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシアベオジエン、１４－ヒドロキシ－１８－アルド－アベオジエン、トリプトフェノリドおよびトリプトニドを生成できる、請求項７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項9】
シトクロムＰ４５０活性を有する第五の酵素をコードする第五の異種核酸をさらに含み、シトクロムＰ４５０活性を有する前記第五の酵素が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で表されるシトクロムＰ４５０酵素ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１７、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポチペプチドである、前記請求項のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項10】
シトクロムＰ４５０活性を有する第六の酵素をコードする第六の異種核酸をさらに含み、シトクロムＰ４５０活性を有する前記第六の酵素が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で表されるシトクロムＰ４５０酵素ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７５、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポチペプチドである、前記請求項のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項11】
シトクロムＢ５活性を有する酵素をコードする第七の異種核酸をさらに含み、シトクロムＢ５活性を有する前記酵素が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で表されるシトクロムＢ５酵素 ＴｗＢ５＃１、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポチペプチドである、前記請求項のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項12】
ｉ．ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ；ｉｉ．ミルチラジエンへとゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を変換できるジテルペンシンターゼ；
ｉｉｉ．組み合わせてミルチラジエンへとＧＧＰＰを変換できる２種以上のジテルペンシンターゼの組み合わせ；または
ｉｖ．コパリル二リン酸シンターゼおよびミルチラジエンシンターゼ、
の１つまたは複数を発現し、
それによりミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成できる、前記請求項のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項13】
前記ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する機能的ホモログである、請求項１２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項14】
ミルチラジエンへとＧＧＰＰを変換できる、２種以上のジテルペンシンターゼの前記組み合わせが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７で表されるＣｆＴＰＳ１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８で表されるＣｆＴＰＳ３、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７で表されるＣｆｔＴＰＳ１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８で表されるＣｆｔＴＰＳ３の組み合わせ、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその各機能的ホモログの組み合わせである；あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９で表されるＴｗＴＰＳ９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０で表されるＴｗＴＰＳ２７の組み合わせ、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその各機能的ホモログの組み合わせである、請求項１２～１３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項15】
コパリル二リン酸シンターゼとミルチラジエンシンターゼの前記組み合わせが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１で表されるＳｍＣＰＳとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２で表されるＳｍＫＳＬの組み合わせ、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその各機能的ホモログの組み合わせである、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項16】
原核または真核細胞である、前記請求項のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項17】
サッカロマイセス、シゾサッカロマイセス、クルイベロマイセス、ピキア、カンジダおよびヤロウイアからなる群から選択される種の真核細胞である、前記請求項のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項18】
Ｓ．セレビシエである、前記請求項のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項19】
エシェリヒア、バチルス、ラクトバチルスおよびコリネバクテリウムからなるリストから選択される種の原核細胞である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項20】
植物細胞であるまたは植物中に含まれ、前記植物が、ニコチアナ・タバカムであってよく、および／または別の多細胞宿主からの細胞である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項21】
トリプトニドなどの、酸素化ジテルペノイド化合物の生成のための方法であって、 ｉ．前記請求項のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞を提供するステップと；ｉｉ．前記酸素化ジテルペノイド化合物の生成に適した条件下で前記組換え宿主細胞を培養するステップ、
を含む、方法。
【請求項22】
前記酸素化ジテルペノイド化合物が、１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエン、トリプトフェノリドおよびトリプトニドからなるリストから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記酸素化ジテルペノイド化合物が、トリプトニドである、請求項２１～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記トリプトニドを回収するステップと、場合により、精製するステップをさらに含む、請求項２２～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
トリプトリドの生成のための方法であって、ｉ．請求項２２～２４のいずれか１項に記載の方法に従ってトリプトニドを生成すること、ならびに
ｉｉ．トリプトリドへと前記トリプトニドを変換すること、ならびに
ｉｉｉ．場合により、前記トリプトリドを回収することおよび／または精製すること、
を含む、方法。
【請求項26】
酸素化ジテルペノイド化合物の生成のための請求項１～２０のいずれかに記載の組換え宿主細胞の使用。
【請求項27】
前記酸素化ジテルペノイド化合物が、１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエン、トリプトフェノリドおよびトリプトニドからなるリストから選択される、請求項２６に記載の使用。
【請求項28】
前記酸素化ジテルペノイド化合物が、トリプトニドであり、前記トリプトニドが、トリプトリドへとさらに変換される、請求項２６に記載の使用。
【請求項29】
前記酸素化ジテルペノイド化合物が、１種または複数の分離および／またはクロマトグラフィーステップを用いて回収される、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項30】
シトクロムＰ４５０酵素活性を有するかつ配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の１つに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドあるいはシトクロムＢ５酵素活性を有するかつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項31】
請求項３０に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項32】
請求項３１に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、発現構築物、または組換え宿主細胞。
【請求項33】
化合物１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエン。
【請求項34】
以下の式（１）～（１７）：【化1】
からなる群から選択される化合物。
【請求項35】
式（６）（Ｆ２０Ｐ２）による化合物である、請求項３４に記載の化合物。
【請求項36】
式（１０）（Ｆ１５Ｐ１）による化合物である、請求項３４に記載の化合物。
【請求項37】
式（１５）（Ｆ１５Ｐ２）による化合物である、請求項３４に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表の参照
本出願は、参照により取り込まれるコンピュータ可読形態の配列表を含む。
本出願は、参照により取り込まれるコンピュータ可読形態の配列表を含む。
【0002】
発明の分野
本発明は、酵母細胞などの組換え細胞中の酸素化ジテルペノイド化合物の生成に関する。酸素化ジテルペノイド化合物は、例えば癌などの疾患の医薬処置における使用のための有用な生物活性化合物の合成において中間体または最終化合物として有用である。本発明はさらに、特にそのような化合物の生成に適した、遺伝子、酵素および酵母細胞などの細胞に関する。
本発明は、酵母細胞などの組換え細胞中の酸素化ジテルペノイド化合物の生成に関する。酸素化ジテルペノイド化合物は、例えば癌などの疾患の医薬処置における使用のための有用な生物活性化合物の合成において中間体または最終化合物として有用である。本発明はさらに、特にそのような化合物の生成に適した、遺伝子、酵素および酵母細胞などの細胞に関する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
テルペン類は、基本の５炭素構造であるイソプレン（２－メチル－１，３－ブタジエン）から作製される多様な化合物群である。ジテルペン類は、化合物ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）をジテルペン構造に変換する酵素ジテルペンシンターゼの作用により作製される、２０炭素構造を有する化合物であり、それらは、さらに修飾されて広範囲のジテルペンまたはジテルペノイド化合物を形成することが可能である。ジテルペン類、ジテルペノイド類、それらの誘導体は、例えば医薬品、化粧品、栄養素、香味剤、香料および殺虫剤として広く使用される。天然のまたは操作された細胞においてこれらの化合物の生成を増加させる方法は、当該技術分野に多数存在する。
テルペン類は、基本の５炭素構造であるイソプレン（２－メチル－１，３－ブタジエン）から作製される多様な化合物群である。ジテルペン類は、化合物ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）をジテルペン構造に変換する酵素ジテルペンシンターゼの作用により作製される、２０炭素構造を有する化合物であり、それらは、さらに修飾されて広範囲のジテルペンまたはジテルペノイド化合物を形成することが可能である。ジテルペン類、ジテルペノイド類、それらの誘導体は、例えば医薬品、化粧品、栄養素、香味剤、香料および殺虫剤として広く使用される。天然のまたは操作された細胞においてこれらの化合物の生成を増加させる方法は、当該技術分野に多数存在する。
【0004】
漢方薬の植物であるトリプテリギウム・ウィルフォルディは、ジテルペノイド化合物であるトリプトニドおよびトリプトリドを含む、潜在的な薬理学的特性を有する複数のセスキテルペノイド類、ジテルペノイド類およびトリテルペノイド類を生成することが知られている。酸素化ジテルペノイド化合物であるトリプトリドおよびその誘導体は、潜在的に貴重な薬理学的化合物として同定されており、免疫抑制剤として、および癌の処置のために目下、研究されている。トリプトリドはさらに、ＣＯＶＩＤ－１９に対する処置に用いられ得る。トリプトニドは、男性避妊薬として有用であり得る。
【0005】
再生可能な原料から貴重な分子を生成するために操作された微生物を使用することは、従来の生成手段からの望ましい代替法である。しかし、経済的に実現可能な収率、力価および生成能を実現することが、工業化に向けた重大な障壁である。
【0006】
Ｎ Ｌ Ｈａｎｓｅｎら（２０１７）は、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１７， ８９， ４２９－４４１において、トリプトリドの前駆体であるミルチラジエンというジテルペンにＧＧＰＰを変換できるジテルペンシンターゼを記載した。この知見は、Ｔｈｅ ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒ－ｎａｌ ２０１８， ５０－６５でＰ Ｓｕら（２０１８）により、およびＪ ＧｕｏらのＰＮＡＳ ２０１３， １１０， １２１０８－１２１１３で確認された。
【0007】
ミルチラジエンをトリプトリドなどの他のジテルペノイド化合物に変換するための完全な経路は、未だに解明されていない。
【0008】
シトクロムＰ４５０酵素（ＣＹＰ）は、テルペノイドの生合成に関与し、多くのシトクロムＰ４５０酵素について、それらが作用する基質、それらがどの化合物を作製しているか、または特定の化合物の生合成におけるそれらの役割に関して何も知られていない。
【0009】
米国特許出願公開第２０１９０２７０９７１号は、Ｐ４５０酵素を機能的に発現する微生物宿主細胞の生成能を上昇させるための方法を開示する。この文書は、Ｐ４５０遺伝子が、酵母などの微生物中での性能を改善するためにどのように修飾され得るかを記載し、シトクロムＰ４５０リダクターゼとの共発現が収率を改善するのに有益であり得ることが言及されているが、この文書は、トリプトリドと任意の特異的Ｐ４５０酵素またはシトクロム類の間のなんらかのつながりを提供しない。
【0010】
中国特許第１０８３９５９９７号は、増加されたＧＧＰＰ生成を有する酵母を記載する。この酵母は、ジテルペノイド化合物を合成するために異なるジテルペンシンターゼおよびＰ４５０酵素で形質転換される。この特許を支える科学者のチームは、適切なテルペンシンターゼおよびＰ４５０酵素を用いる異なるジ－およびトリテルペノイド化合物の合成を開示する更なる特許および特許出願、例えば中国特許第１０８８６６０２９号（ｆｒｉｅｄｅｌｉｎ）、中国特許第１０７０５８４１９号（Ｋａｕｒｅｎ－ｔｙｐｅ）およびＷＯ２０２００２９５６４号（Ｆｒｉｄｅｌｉｎ ａｎｄ ａｍｙｒｉｎｓ)も支えている。
【0011】
中国特許第１１０７４７１７８号は、トリプトリド合成において役割を有するシトクロムＰ４５０酵素をコードするとしてＰ４５０遺伝子ＴｗＣＹＰ７２８Ｂ７０を記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
発明の短い説明
本発明者らは、トリプトフェノリド、トリプトニドおよびトリプトリドなどの酸素化ジテルペノイド化合物を生成する改善された方法を提供することの問題を解決した。
本発明者らは、トリプトフェノリド、トリプトニドおよびトリプトリドなどの酸素化ジテルペノイド化合物を生成する改善された方法を提供することの問題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【0013】
第一の態様において、本発明は、酸素化ジテルペノイド化合物を生成するための方法に関し、方法は、
ａ．ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成できる宿主細胞を提供するステップと；
ｂ．シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一の遺伝子で宿主細胞を形質転換するステップと；
ｃ．形質転換された遺伝子の発現に導く条件下で形質転換された細胞を生育し、それにより酸素化されたジテルペノイド化合物が形成されるステップ、
を含み、ここで、
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ３）もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ４）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする。
ａ．ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成できる宿主細胞を提供するステップと；
ｂ．シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一の遺伝子で宿主細胞を形質転換するステップと；
ｃ．形質転換された遺伝子の発現に導く条件下で形質転換された細胞を生育し、それにより酸素化されたジテルペノイド化合物が形成されるステップ、
を含み、ここで、
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ３）もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ４）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする。
【0014】
第二の態様において、本発明は、酸素化ジテルペノイド化合物を生成するための方法に関し、シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一の遺伝子で、さらにシトクロムＰ４５０活性を有する第二の酵素をコードする第二の遺伝子でおよびシトクロムＰ４５０活性を有する第三の酵素をコードする第三の遺伝子で宿主細胞を形質転換することを含み、
ここで、
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第二の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードし、
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第三の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする。
ここで、
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第二の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードし、
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第三の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする。
【0015】
第三の態様において、本発明は、酸素化ジテルペノイド化合物を生成するための方法に関し、上記方法は、宿主細胞が、シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一、第二のおよび第三の遺伝子で形質転換され、さらにシトクロムＰ４５０活性を有する第四の酵素をコードする第四の遺伝子で形質転換されることを含み、ここで、
シトクロムＰ４５０活性を有する第四の酵素をコードする第四の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３ｖ１）もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３ｖ２）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする。
シトクロムＰ４５０活性を有する第四の酵素をコードする第四の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３ｖ１）もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３ｖ２）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする。
【0016】
本発明により、有用な酸素化ジテルペノイド化合物、トリプトフェノリド、トリプトニドまたはトリプトリドが、提供されてよい。
【0017】
本発明はさらに、本発明の方法において有用であるポリペプチド、ポリヌクレオチド、プラスミドおよび発現構築物、ならびに組換え宿主細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】ミルチラジエン生合成遺伝子および選択されたＴ．ウィルフォルディＣＹＰ類を発現するＮ．ベンサミアナの葉からの抽出物のＬＣＭＳプロファイルを示す。ＴｗＣＹＰ類は、ＣｆＤＸＳ、ＣｆＧＧＰＰＳ、ＣｆＴＰＳ１およびＣｆＴＰＳ３と共発現された。「３×ＳＴＤ」は、３種の混合された真の標準（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）：トリプトリド、トリプトニド、およびトリプトフェノリド、の試料のＬＣＭＳの実行を表す。実線は、ｍ／ｚ２８０～３８０の範囲でのイオンクロマトグラムを表す。破線（- ― -）は、トリプトフェノリドの親イオン［Ｍ＋Ｈ］に対応するｍ／ｚ３１３．１８００±０．０１５での抽出されたイオンクロマトグラムを表す。破線（---）は、トリプトニドの親イオン［Ｍ＋Ｈ］に対応するｍ／ｚ３５９３．１４９０±０．０１５での抽出されたイオンクロマトグラムを表す。ＬＣプロトコル１が、用いられた。より詳細には、実施例１を参照されたい。
【図2】遺伝子操作されたサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．セレビシエ）株の抽出物のＬＣＭＳプロファイルを示す。バックルグランド株（－）において、ジテルペン生合成酵素をコードする遺伝子ＳＰＧＧＰＰＳ７、ＣｆｔＴＰＳ１、ＣｆｔＴＰＳ３およびＴｗＣＰＲ１が、野生型Ｓ．セレビシエのゲノムに組み込まれた。ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ１株において、ジテルペン生合成酵素が、ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ１で発現され、灰色で示される１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンとして同定された化合物（３）の形成をもたらした。ＬＣ法１が、分析に用いられた。より詳細には、実施例３を参照されたい。
【図3】５９９．８５ＭＨｚでのＣＤＣｌ３中の１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。より詳細には、実施例４を参照されたい。
【図4】１５０．８３ＭＨｚでのＣＤＣｌ３中の１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンの１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。より詳細には、実施例４を参照されたい。
【図5】示される組み込まれた遺伝子組合わせゲノムを有する酵母の抽出物のＬＣＭＳプロファイルを示す。全ての酵母株は、ｓｐＧＧＰＰｓ７、ＣｆｔＴＰＳ１、ＣｆｔＴＰＳ３およびＴｗＣＰＲ１が組み込まれたゲノムを有する。「０．５ｐｐｍ ３×ＳＴＤ」は、３種の混合された真の標準：トリプトリド、トリプトニド、およびトリプトフェノリド、の試料のＬＣＭＳの実行を表す。非破線（ｎｏｎ－ｄａｓｈｅｄ ｌｉｎｅｓ）は、ｍ／ｚ２８０～３８０の範囲のイオンクロマトグラムを表す。破線は、トリプトニドの親イオン（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対応するｍ／ｚ３５９．１４９０±０．０１５での抽出されたイオンクロマトグラムを表す。ＬＣプロトコル２が、用いられた。より詳細には、実施例５を参照されたい。
【図6】ＴｗＣＹＰ類と、トリプテリギウム・ウィルフォルディから単離されたＢ５タンパク質の異なる変異体の共発現を示す。操作されたＳ．セレビシエ株の培養物から定量されたトリプトフェノリド、トリプトニドおよび１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンのレベル。各列は、操作された酵母株、および選択された化合物のそれらの産出物を表す。個々の株それぞれに組み込まれた遺伝子は、下のパネルに表される。定量は、目的の化合物のそれぞれを表すピークの面積に基づいた。個々のスケールは、化合物のそれぞれに適用される。より詳細には、実施例５を参照されたい。
【図7】Ｎ．ベンサミアナ（パネルＡおよびＤ）およびＳ．セレビシエ（パネルＢおよびＥ、表３に列挙された株）における異種遺伝子発現を介してインビボで確立された場合の、トリプトニドの提案された生合成経路における重要な中間体の相対量（バー）を示す。遺伝子発現は、左側の黒い四角により示され、相対量は、バー（３～４の生物学的反復の平均；黒い菱形）により示され、塗りつぶしの白色および灰色は、それぞれ、Ｔｗｂ５＃１の発現と非発現を識別する。エラーバーは、標準偏差を表す。「ＤｉＴＰＳｓ」は、ＣｆｔＴＰＳ１およびＣｆｔ－ＴＰＳ３を表す。ピーク面積の定量では、指標の質量許容範囲は、ＧＣＭＳでは±０．１ｍ／ｚ（ミルチラジエンおよび１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエン）およびＬＣＭＳでは±０．００５ｍ／ｚ（他の全化合物）であった。パネルＣ：アビエタン炭素骨格内のＣ－１９またはＣ－１８からＣ３へのメチルシフトを説明するワーグナー・メーヤワイン転移反応を含むＮ．ベエンサミアナおよびＳ．セレビシエにおけるインビボでのミルチルジエンからトリプトニドへの仮定された生合成経路。
【図8】バイオリアクターで生育された場合の酵母株ＮＶＪ８．１５で生成されたトリプトフェノリドおよびトリプトニドの７日間にわたる蓄積を示す。トリプトニド（黒い実線）およびトリプトフェノリド（黒い点線）のレベルは、各日に採取された培養物の試料中の絶対量（ｐｐｍ、ｗ／ｖ）を示す。バイオマスは、６００ｎｍでの吸収により定量された（灰色の点線）。
【図9】トリプトニド生合成に必要とされる遺伝子を発現するがＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ１またはＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３ｖ１を置換した遺伝子変異体を有する酵母株が、トリプトフェノリド（パネルＡ）およびトリプトニド（パネルＢ）を生成する能力に関係し、類似のＬＣＭＳプロファイル（パネルＣ）をもたらすことを示す。操作された株に存在する遺伝子は、黒い四角により表される。パネルＡおよびＢ：バーは、平均相対量を表し（２～３の生物学的反復、×印）、エラーバーは、標準誤差を示す。左から右に向かって、バーは、酵母株ＮＶＪ１０－１、ＮＶＪ１０－３、ＮＶＪ１０－６、ＮＶＪ１０－８を表す（表３参照）。パネルＣ：ＬＣＭＳで分析された酵母培養物のＥＩＣ（ｍ／ｚ２８０～３６０）。上から下に向かって、クロマトグラムの対は、酵母株ＮＶＪ１０－１、ＮＶＪ１０－３、ＮＶＪ１０－６、ＮＶＪ１０－８を表す。
【図10】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図11】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図12】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図13】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図14】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図15】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図16】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図17】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図18】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図19】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図20】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図21】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図22】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図23】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図24】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図25】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【図26】生成された化合物のＮＭＲスペクトル。
【発明を実施するための形態】
【0019】
配列の短い説明
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、Ｔ．ウィルフォルディに由来するシトクロムＰ４５０酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ１としても知られる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、Ｔ．ウィルフォルディに由来するシトクロムＰ４５０酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ１としても知られる。
【0020】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、Ｔ．ウィルフォルディに由来するシトクロムＰ４５０酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ２としても知られる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、３つの位置だけがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と異なり、それゆえＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、同じ遺伝子の異なる対立遺伝子を表すと推測される。
【0021】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、Ｔ．ウィルフォルディに由来するシトクロムＰ４５０酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５としても知られる。
【0022】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、Ｔ．ウィルフォルディに由来するシトクロムＰ４５０酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６としても知られる。
【0023】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５は、Ｔ．ウィルフォルディに由来するシトクロムＰ４５０酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３ｖ１としても知られる。
【0024】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は、Ｔ．ウィルフォルディに由来するシトクロムＰ４５０酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１７としても知られる。
【0025】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７は、Ｔ．ウィルフォルディに由来するシトクロムＰ４５０酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７５としても知られる。
【0026】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８は、Ｔ．ウィルフォルディに由来するシトクロムＢ５酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＴｗＢ５＃１としても知られる。
【0027】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９は、Ｔ．ウィルフォルディに由来するシトクロムＰ４５０酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＴｗＣＰＲ１としても知られる。
【0028】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０～６６は、実施例２にさらに記載される通りのＰＣＲプライマーを示す。
【0029】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７は、プレクトランサス・バルバタスに由来するジテルペンシンターゼＴＰＳ１のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＣｆＴＰＳ１としても知られる。
【0030】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８は、プレクトランサス・バルバタスに由来するジテルペンシンターゼＴＰＳ３のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＣｆＴＰＳ３としても知られる。
【0031】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９は、Ｔ．ウィルフォルディに由来するテルペンシンターゼＴＰＳ９のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＴｗＴＰＳ９としても知られる。
【0032】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０は、Ｔ．ウィルフォルディに由来するテルペンシンターゼのアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＴｗＴＰＳ２７としても知られる。
【0033】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１は、サルビア・ミルチオリザに由来するコパリル二リン酸シンターゼＣＰＳ１のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＳｍＣＰＳとしても知られる。
【0034】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２は、サルビア・ミルチオリザに由来するミルチラジエンシンターゼＫＳＬ１のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＳｍＫＳＬとしても知られる。
【0035】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３は、シネココッカス属に由来するゲネラニルゲネラニル二リン酸シンターゼのアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＳｐＧＧＰＰｓ７ｖ１としても知られる。
【0036】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４は、Ｔ．ウィルフォルディに由来するシトクロムＰ４５０酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ３としても知られる。
【0037】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５は、Ｔ．ウィルフォルディに由来するシトクロムＰ４５０酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ４としても知られる。
【0038】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６は、Ｔ．ウィルフォルディに由来するシトクロムＰ４５０酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３ｖ２としても知られる。
【0039】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７は、プレクトランサス・バルバタスに由来するジテルペンシンターゼＴＰＳ１のトランケート型アミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列は、トランジットペプチドを除去するためにトランケートされた。この酵素は、ＣｆｔＴＰＳ１としても知られる。
【0040】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８は、プレクトランサス・バルバタスに由来するジテルペンシンターゼＴＰＳ３のトランケート型アミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列は、トランジットペプチドを除去するためにトランケートされた。この酵素は、ＣｆＴＰＳ３としても知られる。
【0041】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９は、プレクトランサス・バルバタスに由来するＤＸＳ酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＣｆＤＸＳとしても知られる。
【0042】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０は、Ｓ．セレビシエに由来するトランケート型ＨＭＧＲ酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＳｃｔＨＭＧＲとしても知られる。
【0043】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１は、シネココッカス属に由来するゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼのアミノ酸配列を示す。この酵素は、ＳｐＧＧＰＰｓ７ｖ２としても知られる。
【0044】
発明の詳細な記載
本発明の第一の態様により、酸素化ジテルペノイド化合物を生成するための方法が開示され、方法は、
ａ．ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成できる宿主細胞を提供するステップと；
ｂ．シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一の遺伝子で宿主細胞を形質転換するステップと；
ｃ．形質転換された遺伝子の発現をもたらす条件下で形質転換された細胞を生育し、それにより酸素化されたジテルペノイド化合物が形成されるステップ、
を含み、ここで、
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４Ｖ１）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなるポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする。
本発明の第一の態様により、酸素化ジテルペノイド化合物を生成するための方法が開示され、方法は、
ａ．ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成できる宿主細胞を提供するステップと；
ｂ．シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一の遺伝子で宿主細胞を形質転換するステップと；
ｃ．形質転換された遺伝子の発現をもたらす条件下で形質転換された細胞を生育し、それにより酸素化されたジテルペノイド化合物が形成されるステップ、
を含み、ここで、
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４Ｖ１）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなるポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする。
【0045】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を有するポリペプチドは、シトクロムＰ４５０活性を有する第一の遺伝子の好ましい例であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５を有するポリペプチドは、そのようなポリペプチドの他の例である。
【0046】
したがって、第一の遺伝子によりコードされる酵素は、ミルチラジエンのジテルペン骨格の１４位にＯＨ基を挿入することにより、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンに変換する能力を有する。
【0047】
幾つかの実施形態において、１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンの合成は、化合物１４－ＯＨ－ミルチラジエンを介して行われ、それは続いて１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンに変換される。しかし、本発明は、ミルチラジエンを１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンに変換するための任意の特別なメカニズムに限定されない。
【0048】
本発明の第一の態様による方法を使用することは、トリプトフェノリド、トリプトニドおよびトリプトリドなどの周知の化合物を含む、医薬使用の酸素化ジテルペノイド化合物の合成における有用な中間体である酸素化ジテルペノイド化合物１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンの形成をもたらす。
【化1】
【0049】
本発明の第二の態様において、方法ステップｂは、シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一の遺伝子で、さらにシトクロムＰ４５０活性を有する第二の酵素をコードする第二の遺伝子およびシトクロムＰ４５０活性を有する第三の酵素をコードする第三の遺伝子で宿主細胞を形質転換することを含み、ここで
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第二の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなるポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードし、
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第三の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなるポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする。
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第二の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなるポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードし、
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第三の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなるポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする。
【0050】
この第二の態様において、宿主細胞は好ましくは、酸素化ジテルペノイド化合物であるトリプトフェノリド：（３ｂＲ，９ｂＳ）－６－ヒドロキシ－９ｂ－メチル－７－プロパン－２－イル－３，３ｂ，４，５，１０，１１－ヘキサヒドロナフト［２，１－ｅ］イソベンゾフラン－１－オンをさらに生成する。
【化2】
【0051】
トリプトフェノリドは、抗アンドロゲンとして同定された貴重な化合物である。加えてそれは、さらなる生物活性化合物に導くさらなる修飾のための出発点として有用であり得る。
【0052】
本発明の第二の態様の好ましい実施形態において、宿主細胞はさらに、シトクロムＢ５活性を有しかつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＴｗＢ５＃１）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなるポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする第一の遺伝子で形質転換される。驚くべきことに、シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一、第二および第三の遺伝子を発現する同じ細胞中でシトクロムＢ５活性を有するポリペプチドを発現することは、酸素化ジテルペノイド化合物の有意により高い生成をもたらすことが見出された。生成は、シトクロムＢ５活性を有するポリペプチドを含まない類似の細胞の生成と比較して、少なくとも５０％増加され、好ましくは少なくとも１００％、好ましくは少なくとも２００％、またはより多く増加される。
【0053】
本発明の第三の態様において、宿主細胞は、シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一、第二および第三の遺伝子で形質転換され、さらにシトクロムＰ４５０活性を有する第四の酵素をコードする第四の遺伝子で形質転換され、ここで
シトクロムＰ４５０活性を有する第四の酵素をコードする第四の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３ｖ１）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなるポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を有するポリペプチドは、シトクロムＰ４５０活性を有する第四の遺伝子の好ましい例であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６を有するポリペプチドは、そのようなポリペプチドの別の例である。
シトクロムＰ４５０活性を有する第四の酵素をコードする第四の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３ｖ１）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなるポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を有するポリペプチドは、シトクロムＰ４５０活性を有する第四の遺伝子の好ましい例であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６を有するポリペプチドは、そのようなポリペプチドの別の例である。
【0054】
本発明の第三の態様において、形質転換された真核細胞は好ましくは、酸素化ジテルペノイド化合物であるトリプトニドを生成する。
【化3】
【0055】
化合物トリプトニドは、癌において強力な阻害活性を有することが報告された（Ｆｕｌｕ Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１９， Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ， Ｖｏｌｕｍｅ １９， ｉｓｓｕｅ １１， ｐａｇｅｓ １２８４－１２９３）。この化合物はまた、男性避妊薬としても有用である。さらにこの化合物は、さらなる生物活性化合物をもたらすさらなる修飾のための出発点として有用である。
【0056】
本発明の第三の態様の好ましい実施形態において、宿主細胞はさらに、シトクロムＢ５活性を有しかつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＴｗＢ５＃１）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなるポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする第五の遺伝子で形質転換される。驚くべきことに、シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一、第二、第三および第四の遺伝子を発現する同じ細胞中でシトクロムＢ５活性を有するポリペプチドを発現することは、酸素化ジテルペノイド化合物の有意により高い生成をもたらすことが見出された。生成は、シトクロムＢ５活性を有するポリペプチドを含まない類似の細胞の生成と比較して、少なくとも５０％増加され、好ましくは少なくとも１００％、好ましくは少なくとも２００％、またはより多く増加される。
【0057】
本発明の第三の態様のさらに好ましい実施形態において、宿主細胞は、シトクロムＰ４５０活性を有する第五の酵素をコードする第六の遺伝子および／またはシトクロムＰ４５０活性を有する第六の酵素をコードする第七の遺伝子でさらに形質転換され、ここで
シトクロムＰ４５０活性を有する第五の酵素をコードする第六の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなるポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードし、
シトクロムＰ４５０活性を有する第六の酵素をコードする第七の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７５）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなるポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする。驚くべきことに、シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第六および／または第七の遺伝子を発現することは、酸素化ジテルペノイド化合物の有意により高い生成をもたらすことが見出された。好ましくは生成は、シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第六および／または第七の遺伝子を含まない類似の細胞の生成と比較して、少なくとも１０％増加され、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、またはより多く増加される。
シトクロムＰ４５０活性を有する第五の酵素をコードする第六の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなるポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードし、
シトクロムＰ４５０活性を有する第六の酵素をコードする第七の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７５）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなるポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする。驚くべきことに、シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第六および／または第七の遺伝子を発現することは、酸素化ジテルペノイド化合物の有意により高い生成をもたらすことが見出された。好ましくは生成は、シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第六および／または第七の遺伝子を含まない類似の細胞の生成と比較して、少なくとも１０％増加され、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、またはより多く増加される。
【0058】
第一、第二、第三、第四、第五、第六および第七の遺伝子は、１種または複数の異種核酸などの、１種または複数の核酸分子に含まれてよい。シトクロムＰ４５０活性を有する第一の酵素をコードする異種核酸は本明細書において、「第一の異種核酸」と称され得る。シトクロムＰ４５０活性を有する第二の酵素をコードする異種核酸は本明細書において、「第二の異種核酸」と称され得る。シトクロムＰ４５０活性を有する第三の酵素をコードする異種核酸は本明細書において、「第三の異種核酸」と称され得る。シトクロムＰ４５０活性を有する第四の酵素をコードする異種核酸は本明細書において、「第四の異種核酸」と称され得る。シトクロムＰ４５０活性を有する第五の酵素をコードする異種核酸は本明細書において、「第五の異種核酸」と称され得る。シトクロムＰ４５０活性を有する第六の酵素をコードする異種核酸は本明細書において、「第六の異種核酸」と称され得る。シトクロムＢ５活性を有する酵素をコードする異種核酸は本明細書において、「第七の異種核酸」と称され得る。これは、組換え宿主細胞が合計で７種の異種核酸を含まなければならないことを示唆するのではなく、幾つかの実施形態において、細胞は、第一、第二、第三、第四、第五、第六および第七の異種核酸の１つまたは複数のみを含む。
【0059】
本発明の方法により生成された酸素化ジテルペノイド化合物は、生物合成または化学合成によりさらに修飾されてよい。これに関連して、生物合成は、本発明の遺伝子を含む宿主細胞が本発明の方法により生成された酸素化ジテルペノイド化合物を修飾する能力を有するさらなる酵素をコードするよりさらなる追加的遺伝子の１つをさらに提供される方法として理解される。
【0060】
本発明の方法により生成された酸素化ジテルペノイド化合物の化学修飾は、酸素化ジテルペノイド化合物の回収の前に培養ブロスで直接実施されてよく、またはそれは、回収された酸素化ジテルペノイド化合物で実施されてもよい。
【0061】
トリプトリドへのトリプトニドの還元は、有機合成により実現され得る。そのような合成の例は、Ｃ－１４ケトン上の水素化物による求核攻撃による還元である。この理由で、水素化ホウ素ナトリウムは、適当な溶媒、例えば水またはＭｅｔＯＨ中の中和ｐＨでこの反応を触媒するための適切な薬剤である。
【0062】
１つの好ましい実施形態において、本発明の方法により生成されたトリプトニドは、化合物トリプトリドに変換され、トリプトリドは、免疫抑制剤であると報告され、かつ癌治療における使用のために目下、研究されている。
【化4】
【0063】
宿主細胞
ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成できる宿主細胞は、原則として任意のそのような細胞であってよい。細胞は、ミルチラジエンおよび／もしくはデヒドロアビエタジエンを自然に生成する細胞であってよく、またはそれは、これらの化合物の一方もしくは両方を生成するように操作された細胞であってもよい。
ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成できる宿主細胞は、原則として任意のそのような細胞であってよい。細胞は、ミルチラジエンおよび／もしくはデヒドロアビエタジエンを自然に生成する細胞であってよく、またはそれは、これらの化合物の一方もしくは両方を生成するように操作された細胞であってもよい。
【0064】
ミルチラジエンは、少なくとも幾つかの環境下で、デヒドロアビエタジエンへと自然に変換され得ると考えられ、それゆえ本発明は、デヒドロアビエタジエンに自然に変換されるミルチラジエンを生成する細胞を用いて実施されてよく、またはそれは、ミルチラジエンからデヒドロアビエタジエンへの変換を容易にする酵素を含む細胞で実施されてよい（Ｊ． Ｚｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３， １１， ７６５０－７６５２参照）。
【0065】
ミルチラジエンの合成は一般的に、ＧＧＰＰの形成で始まる。ＧＧＰＰは、１つのジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰ）分子と３つのイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）分子の縮合により合成されてよく、典型的にはゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、例えばシネココッカス属に由来し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１で示されたアミノ酸配列を有するＳｐＧＧＰＰｓ７酵素により触媒される。
【0066】
ＧＧＰＰは、ジテルペンシンターゼの作用により、または２種以上のジテルペンシンターゼの組合わされた作用により、例えばプレクトランサス・バルバタス由来でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７および６８のアミノ酸配列を有する２種のジテルペンシンターゼＣｆＴＰＳ１とＣｆＴＰＳ３、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７で表されるＣｆｔＴＰＳ１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８で表されるＣｆｔＴＰＳ３の組合わせ；Ｔ．ウィルフォルディ由来でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９および７０のアミノ酸配列を有する２種のジテルペンシンターゼＴｗＴＰＳ９およびＴｗＴＰＳ２７の組合わせ；またサルビア・ミルチオリザ由来でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１のアミノ酸配列を有するコパリル二リン酸シンターゼＳｍＣＰＳと、サルビア・ミルチオリザ由来でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２のアミノ酸配列を有するミルチラジエンシンターゼＳｍＫＳＬの組合わせ、によりミルチラジエンに変換される。
【化5】
【0067】
ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成する宿主細胞を提供するための１つの好ましい方法は、ＧＧＰＰを生成する宿主細胞を選択すること、およびＧＧＰＰからミルチラジエンへの形質転換を触媒するジテルペンシンターゼで細胞を形質転換すること、である。あるいは、ＧＧＰＰを生成するように遺伝子操作された宿主細胞が、出発点として用いられてもよい。
【0068】
ＧＧＰＰからミルチラジエンへの形質転換を触媒するジテルペンシンターゼで宿主細胞を形質転換するための技術は、先行技術、例えばＮ Ｌ Ｈａｎｓｅｎら（２０１７）のＴｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１７， ８９， ４２９－４４１（参照により本明細書に取り込まれる）、Ｐ Ｓｕら（２０１８）のＴｈｅ ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１８， ５０－６５、およびＪ． Ｇｕｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１３， １１０， １２１０８－１２１１３に記載され、これらの発表に開示された手順および方法は、本発明における使用のための宿主細胞を提供するためにも有用である。
【0069】
宿主細胞は、真正細菌もしくは古細菌などの原核細胞；または植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞もしくは酵母細胞などの真核細胞であってよい。
【0070】
事実上、全ての真核細胞は、それらの生合成のためにＧＧＰＰを生成するが、幾つかの実施形態では真核細胞は、増加された量のＧＧＰＰを生成し、それは、増加された量のＧＧＰＰを生成しない類似の真核生物に比較してミルチラジエンの生成を増加させ得る。真核細胞においてＧＧＰＰを増加させるための方法はまた、先行技術に記載されている。
【0071】
宿主細胞は、単細胞の生物体であってよく、またはそれは、多細胞の生物体、例えば植物内に含まれてもよい。本発明による宿主細胞としての使用に適した植物または植物細胞の例としては、トウモロコシ（ジー・メイズ）、ナタネ（ブラシカ・ナプス、ブラシカ・ラパ亜種）、アルファルファ（メディカゴ・サティバ）、米（オリザ・サティバ）、ライ麦（セカレ・セレール）、ソルガム（ソルガム・バイカラー、ソルファム・ブルガレ）、ヒマワリ（ヘリアンサス・アニュアス）、小麦（トリチカム・エスティバムおよび他の種）、ライ小麦、ライ麦（セカレ）、大豆（グリシン・マックス）、タバコ（ニコチアナ・タバカム）、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロサム）、ピーナッツ（アラキス・ヒポガエア）、綿（ゴシピウム・ヒルスツム）、サツマイモ（イポメア・バタタス）、カッサバ（マニホット・エスクレンタ）、コーヒー（コフィア属）、ココナッツ（ココス・ヌシフェラ）、パイナップル（アナナス・コモスス）、シトラス（カンキツ属）、ココア（テオブロマ・カカオ）、茶（カメリア・シネンシス）、バナナ（バショウ属．）、アボカド（ペルセア・アメリカナ）、イチジク（フィカス・カシカ）、グアバ（サイジウム・グアジャバ）、マンゴー（マンギファー・インディカ）、オリーブ（オレア・オウロパエア）、パパイア（カリカ・パパイア）、カシュー（カシュー亜種）、マカダミア（マカダミア・インテルグリフォリア）、アーモンド（プリムス・アミグダルス）、リンゴ（マルス属）、セイヨウナシ（ナシ属）、プラムおよびサクランボの木（スモモ属）、スグリ（クラント他）、ブドウ、キクイモ（ハンニチバナ属）、非穀物草（イネ科）、糖および飼料用ビート（ベータ・ブルガリス）、チコリ、オーツ麦、大麦、野菜または観賞植物、作物植物（例えば、穀物および豆類、トウモロコシ、小麦、ジャガイモ、タピオカ、米、ソルガム、キビ、カッサバ、大麦、エンドウ、テンサイ、サトウキビ、大豆、ナタネ、ヒマワリおよび他の根、塊茎または種子作物）が挙げられる。他の重要な植物は、果樹、作物樹、森林樹、または香辛料もしくは医薬製品としての使用のために生育された植物（メンサ属、クローブ、ヨモギ属、イブキジャコウソウ属、ラベンデュラ属、ネギ属、ヒペリカム、ニチニチソウ属、ビンカ属、パパベル属、ジギタリス属、インドジャボク属、バニラ属、ペトルシリウム（Ｐｅｔｒｕｓｉｌｉｕｍ）属、ユーカリプツス、ティーツリー、トウヒ属、マツ属、アビエス属、ジュニペルス属であってよい。本発明で使用され得る園芸用植物としては、レタス、エンダイブ、ならびにキャベツ、ブロッコリー、およびカリフラワー、ニンジンおよびカーネーションおよびゼラニウムを含むアブラナ科野菜を挙げることができる。
【0072】
植物はまた、タバコ、ウリ科植物、ニンジン、イチゴ、ヒマワリ、トマト、コショウおよびキクであり得る。
【0073】
植物のさらなる例としては、穀物植物、例えば油糧種子植物またはマメ科植物が挙げられる。目的の種子は、トウモロコシ、小麦、大麦、ソルガム、ライ麦などの穀物の種を含む。油糧種子植物としては、綿、大豆、ベニバナ、ヒマワリ、アブラナ、トウモロコシ、アルファルファ、ヤシ、ココナッツなどが挙げられる。マメ科植物としては、インゲンおよびエンドウが挙げられる。インゲンとしては、グアー、イナゴ豆、コロハ種子、大豆、ソラマメ（ｇａｒｄｅｎ ｂｅａｎｓ）、ササゲ、緑豆、ライマビーン、空豆（ｆａｖａ ｂｅａｎ）、レンズ豆、ヒヨコマメが挙げられる。
【0074】
特別な好ましい植物種としては、フィスコミトレラ・パテンスなどのフィスコミトレラ属；アラビドプシス・サリアナなどのシロイヌナズナ属；ニコチアナ・ベンサミアナなどのタバコ属．；クラミドモナス・レインハルドティなどのクラミドモナス属およびナンノクロロプシス・オセアニカなどのナンノクロロプシス属が挙げられる。
【0075】
本発明による使用のための適切な真核細胞の例としては、アガリクス、アスペルギルス、カンジダ、エレモセシウム、フザリウム／ギベレラ、クルイベロマイセス、レチポルス、レンチヌス、ファフィア、ファネロケーテ、ピキア、フィスコミトレラ、ロドトルラ、サッカロマイセス、シゾサッカロマイセス、スファセロマ、キサントフィロマイセス、またはヤロウイアなどの真菌細胞が挙げられる。そのような属からの例示的種としては、レンチヌス・チグリヌス、レチポルス・スルフレウス、ファネロケーテ・クリソスポリウム、ピキア・パストリス、シベルリンドネラ・ジャディニイ、フィスコミトレラ・パテンス、ロドツルラ・グルチヌス、ロドトルラ・ムキラギノーサ、ファフィア・ロドジーマ、キサントフィロマイセス・デンドロウス、フザリウム・フジクロイ／ギベレラ・フジクロイ、カンンジダ・ウティリス、カンンジダ・グラブラータ、カンジダ・アルビカンス、およびヤロウイア・リポリティカが挙げられる。
【0076】
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、ギベレラ・フジクロイ、クルイベロマイセス・ラクティス、シゾサッカロマイセス・ポンベ、アスペルギルス・ニゲル、ヤロウイア・リポリティカ、アシュブヤ・ゴシピイ（Ａｓｈｂｙａ・ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、またはＳ．セレビシエなどの子嚢菌であり得る。
【0077】
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、ブラケスレア・トリスポラ、デュナリエラ・サリナ、ヘマトコッカス・プルビアリス、クロレラ属、ウンダリア・ピンナティフィダ、サルガッサム、ラミナリア・ジャポニカ、セネデスムス・アルメリエンシスなどの藻類細胞であり得る。
【0078】
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、バチルス細胞、例えばバチルス・サブチリス；エシェリヒア細胞、例えばエシェリヒア・コリ細胞；ラクトバチルス細胞；ラクトコッカス細胞；ストレプトマイセス細胞、ストレプトコッカス細胞、コリネバクテリウム細胞；アセトバクター細胞；アシネトバクター細胞；またはシュードモナス細胞などの原核生物であり得る。
【0079】
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、シネコシスティス属またはシネココッカス属などの藍藻細胞であり得る。
【0080】
一実施形態において、発酵槽での生育に適した宿主細胞が、選択される。本発明により組換え宿主細胞を生育することは、本発明の酸素化ジテルペノイド化合物の生成のために宿主細胞を生育する簡便な方法である。
【0081】
別の実施形態において、宿主細胞は、光屈性細胞であり、細胞は、温室または光バイオリアクタで培養される。
【0082】
遺伝子および酵素
本発明の組換え宿主細胞は、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成できる。ミルチラジエンは、自然にデヒドロアビエタジエンに変換されてよく、またはそれは、ミルチラジエンからデヒドロアビエタジエンへの変換を容易にする酵素により変換されてよい。
本発明の組換え宿主細胞は、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成できる。ミルチラジエンは、自然にデヒドロアビエタジエンに変換されてよく、またはそれは、ミルチラジエンからデヒドロアビエタジエンへの変換を容易にする酵素により変換されてよい。
【0083】
本明細書の先に記載された通り、ミルチラジエンの合成は通常、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼによる１つのジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰ）分子と３つのイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）分子の縮合によるＧＧＰＰの形成で始まる。
【0084】
組換え宿主細胞、および組換え宿主細胞におけるＧＧＰＰの合成を触媒する酵素をコードする異種核酸は一般に、当該技術分野で公知であり、例えばＷＯ２０１５／１１３５７０号を参照されたい。加えて、多くの宿主生物体は、生来ＧＧＰＰを生成でき、異種核酸はしたがって、ＧＧＰＰの生成に必ずしも必要でないかもしれない。
【0085】
幾つかの実施形態において、組換え宿主細胞は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１で表されるゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼＳｐＧＧＰＰｓ７などのゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。
【0086】
次に、ＧＧＰＰは、１種または複数のジテルペンシンターゼ、コパリル二リン酸シンターゼおよび／またはミルチラジエンシンターゼの作用によりミルチラジエンに変換されてよい。
【0087】
幾つかの実施形態において、組換え宿主細胞は、ジテルペンシンターゼＣｆＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）およびＣｆＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）、もしくはＣｆｔＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）およびＣｆｔＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）などの１種もしくは複数のジテルペンシンターゼ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する各機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする１種または複数の異種核酸を含む。
【0088】
幾つかの実施形態において、組換え宿主細胞は、ジテルペンシンターゼＴｗＴＰＳ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９）およびＴｗＴＰＳ２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０）などの１種もしくは複数のジテルペンシンターゼ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する各機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする１種または複数の異種核酸を含む。
【0089】
幾つかの実施形態において、組換え宿主細胞は、コパリル二リン酸シンターゼＳｍＣＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１）とミルチラジエンシンターゼＳｍＫＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）の組合わせなどの１種もしくは複数のコパリル二リン酸シンターゼと１種もしくは複数のミルチラジエンシンターゼの組合わせ、またはそれらに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する各機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドを含む。
【0090】
さらなる態様において、本発明は、シトクロムＰ４５０の酵素活性を有しかつ配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、およびＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の１つに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドに関する。
【0091】
さらなる態様において、本発明は、シトクロムＢ５活性を有しかつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドに関する。
【0092】
本発明はまた、シトクロムＰ４５０の酵素活性を有しかつ配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、およびＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の１つに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする、あるいはシトクロムＢ５活性を有しかつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列または遺伝子に関する。
【0093】
好ましい実施形態において、シトクロムＰ４５０活性を有する第一、第二、第三、第四、第五および第六の酵素の１つまたは複数は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ３）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ４）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３ｖ１）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３ｖ２）の任意の１つによるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する各機能的ホモログ、またはその成熟ポチペプチドを含む、またはそれからなる。
【0094】
幾つかの実施形態において、シトクロムＰ４５０活性を有する第一の酵素をコードする第一の異種核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ３）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４ｖ４）で表されるＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログをコードする。
【0095】
幾つかの実施形態において、シトクロムＰ４５０活性を有する第二の酵素をコードする第二の異種核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で表されるシトクロムＰ４５０酵素ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログをコードする。
【0096】
幾つかの実施形態において、シトクロムＰ４５０活性を有する第三の酵素をコードする第三の異種核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で表されるシトクロムＰ４５０酵素ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログをコードする。
【0097】
幾つかの実施形態において、シトクロムＰ４５０活性を有する第四の酵素をコードする第四の異種核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で表されるシトクロムＰ４５０酵素ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３ｖ１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３ｖ２）で表されるＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３ｖ２、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログをコードする。
【0098】
幾つかの実施形態において、シトクロムＰ４５０活性を有する第五の酵素をコードする第五の異種核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で表されるシトクロムＰ４５０酵素ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１７、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログをコードする。
【0099】
幾つかの実施形態において、シトクロムＰ４５０活性を有する第六の酵素をコードする第六の異種核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で表されるシトクロムＰ４５０酵素ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７５、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログをコードする。
【0100】
幾つかの実施形態において、シトクロムＢ５活性を有する酵素をコードする第七の異種核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で表されるシトクロムＢ５酵素ＴｗＢ５＃１、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログをコードする。
【0101】
幾つかの実施形態において、組換え宿主細胞が提供され、
ｉ．ここで宿主細胞は、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成でき；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ここで上記細胞は、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエンを生成できる。
ｉ．ここで宿主細胞は、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成でき；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ここで上記細胞は、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエンを生成できる。
【0102】
幾つかの実施形態において、組換え宿主細胞が提供され、
ｉ．ここで宿主細胞は、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成でき；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ここで上記細胞は、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシアベオジエンおよび／または１４－ヒドロキシ－１８－アルド－アベオジエンを生成できる。
ｉ．ここで宿主細胞は、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成でき；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ここで上記細胞は、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシアベオジエンおよび／または１４－ヒドロキシ－１８－アルド－アベオジエンを生成できる。
【0103】
幾つかの実施形態において、組換え宿主細胞が提供され、
ｉ．ここで宿主細胞は、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成でき；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ここで上記細胞は、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシアベオジエン、１４－ヒドロキシ－１８－アルド－アベオジエンおよび／またはトリプトフェノリドを生成できる。
ｉ．ここで宿主細胞は、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成でき；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ここで上記細胞は、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシアベオジエン、１４－ヒドロキシ－１８－アルド－アベオジエンおよび／またはトリプトフェノリドを生成できる。
【0104】
幾つかの実施形態において、組換え宿主細胞が提供され、
ｉ．ここで宿主細胞は、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成でき；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
Ｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ここで上記細胞は、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシアベオジエン、１４－ヒドロキシ－１８－アルド－アベオジエン、トリプトフェノリドおよび／またはトリプトニドを生成できる。
ｉ．ここで宿主細胞は、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成でき；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
Ｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ここで上記細胞は、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシアベオジエン、１４－ヒドロキシ－１８－アルド－アベオジエン、トリプトフェノリドおよび／またはトリプトニドを生成できる。
【0105】
幾つかの実施形態において、組換え宿主細胞が提供され、
ｉ．ここで宿主細胞は、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成でき；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
Ｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｖｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のＴｗＢ５＃１、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ここで上記細胞は、上記酵母がＴｗＢ５＃１またはその上記機能的ホモログを発現しないことを除き、同一の酵母細胞の少なくとも２倍、少なくとも３倍など、少なくとも４倍など、少なくとも５倍などである力価を有するトリプトニドを生成できる。
ｉ．ここで宿主細胞は、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成でき；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
Ｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｖｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のＴｗＢ５＃１、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ここで上記細胞は、上記酵母がＴｗＢ５＃１またはその上記機能的ホモログを発現しないことを除き、同一の酵母細胞の少なくとも２倍、少なくとも３倍など、少なくとも４倍など、少なくとも５倍などである力価を有するトリプトニドを生成できる。
【0106】
幾つかの実施形態において、組換え宿主細胞が提供され、
ｉ．ここで宿主細胞は、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成でき；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
Ｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｖｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のＴｗＢ５＃１、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ここで上記細胞は、発酵媒体中で生育でき、発酵の７日後の上記発酵媒体は、
－ 少なくとも３ｐｐｍのトリプトニドおよび／または
－ 少なくとも１ｐｐｍのトリプトフェノリド
を含む。
ｉ．ここで宿主細胞は、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成でき；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｉｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
Ｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ｖｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のＴｗＢ５＃１、またはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、
ここで上記細胞は、発酵媒体中で生育でき、発酵の７日後の上記発酵媒体は、
－ 少なくとも３ｐｐｍのトリプトニドおよび／または
－ 少なくとも１ｐｐｍのトリプトフェノリド
を含む。
【0107】
前述の組換え宿主細胞は、複数の異なる理由のためミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成することが可能であり得る。例えば、宿主細胞は内因的に、ミルチラジエンを生成することが可能であり得る。あるいは組換え宿主細胞は、ジテルペン生合成酵素であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１のＳＰＧＧＰＰＳ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７のＣｆＴＰＳ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７のＣｆｔＴＰＳ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のＣｆＴＰＳ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のＣｆｔＴＰＳ３および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のＴｗＣＰＲ１などの、ミルチラジエンの生成に関与する１種または複数の酵素、あるいはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する各機能的ホモログ、あるいはその成熟ポチペプチドをコードする１種または複数の異種核酸配列を含んでよい。
【0108】
シトクロムＰ４５０活性を有する第一（例えば、ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４)、第二（例えば、ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６)、第三（例えば、ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５)、第四（例えば、ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３)、第五（例えば、ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１７)および第六（例えば、ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７５) の酵素およびシトクロムＢ５活性を有する酵素（例えば、ＴｗＢ５＃１）の機能的ホモログは、酵母細胞において関連のタンパク質を発現すること、およびそれらが本明細書の以下に記載される特異的化合物を生成できるかどうかを評定すること、により検証されてよい。
【0109】
ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）の機能的ホモログを発現し、かつ
ｉ．ジテルペン生合成酵素ＳＰＧＧＰＰＳ７ｖ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ＣｆｔＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）、ＣｆｔＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）およびＴｗＣＰＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、
をさらに発現する酵母細胞は好ましくは、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエンを生成できる。
ｉ．ジテルペン生合成酵素ＳＰＧＧＰＰＳ７ｖ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ＣｆｔＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）、ＣｆｔＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）およびＴｗＣＰＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、
をさらに発現する酵母細胞は好ましくは、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエンを生成できる。
【0110】
ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の機能的ホモログを発現し、かつ
ｉ．ジテルペン生合成酵素ＳＰＧＧＰＰＳ７ｖ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、 ＣｆｔＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）、ＣｆｔＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）およびＴｗＣＰＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ならびに
ｉｉ．ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、
をさらに発現する酵母細胞は好ましくは、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシアベオジエンおよび１４－ヒドロキシ－１８－アルド－アベオジエンを生成できる。
ｉ．ジテルペン生合成酵素ＳＰＧＧＰＰＳ７ｖ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、 ＣｆｔＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）、ＣｆｔＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）およびＴｗＣＰＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ならびに
ｉｉ．ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、
をさらに発現する酵母細胞は好ましくは、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシアベオジエンおよび１４－ヒドロキシ－１８－アルド－アベオジエンを生成できる。
【0111】
ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の機能的ホモログを発現し、かつ
ｉ．ジテルペン生合成酵素ＳＰＧＧＰＰＳ７ｖ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ＣｆｔＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）、ＣｆｔＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）およびＴｗＣＰＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；
ｉｉ．ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ならびに
ｉｉｉ．ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
をさらに発現する酵母細胞は好ましくは、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシアベオジエン、１４－ヒドロキシ－１８－アルド－アベオジエンおよびトリプトフェノリドを生成できる。
ｉ．ジテルペン生合成酵素ＳＰＧＧＰＰＳ７ｖ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ＣｆｔＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）、ＣｆｔＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）およびＴｗＣＰＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；
ｉｉ．ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；ならびに
ｉｉｉ．ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
をさらに発現する酵母細胞は好ましくは、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシアベオジエン、１４－ヒドロキシ－１８－アルド－アベオジエンおよびトリプトフェノリドを生成できる。
【0112】
ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）の機能的ホモログを発現し、かつ
ｉ．ジテルペン生合成酵素ＳＰＧＧＰＰＳ７ｖ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ＣｆｔＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）、ＣｆｔＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）およびＴｗＣＰＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）;
ｉｉ．ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；
ｉｉｉ．ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；ならびに
ｉｖ．ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
をさらに発現する酵母細胞は好ましくは、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシアベオジエン、１４－ヒドロキシ－１８－アルド－アベオジエン、トリプトフェノリドおよびトリプトニドを生成できる。
ｉ．ジテルペン生合成酵素ＳＰＧＧＰＰＳ７ｖ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ＣｆｔＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）、ＣｆｔＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）およびＴｗＣＰＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）;
ｉｉ．ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；
ｉｉｉ．ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；ならびに
ｉｖ．ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
をさらに発現する酵母細胞は好ましくは、１４－ヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシデヒドロアビエタジエン、３，１４－ジヒドロキシアベオジエン、１４－ヒドロキシ－１８－アルド－アベオジエン、トリプトフェノリドおよびトリプトニドを生成できる。
【0113】
ＴｗＢ５＃１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の機能的ホモログを発現し、かつ
ｉ．ジテルペン生合成酵素ＳＰＧＧＰＰＳ７ｖ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ＣｆｔＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）、ＣｆｔＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）およびＴｗＣＰＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；
ｉｉ．ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；
ｉｉｉ．ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；
ｉｖ．ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；ならびに
ｖ．ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）、
をさらに発現する酵母細胞は好ましくは、上記酵母がＴｗＢ５＃１の上記機能的ホモログを発現しないことを除き、同一の酵母細胞の少なくとも２倍、少なくとも３倍など、少なくとも４倍など、少なくとも５倍などである力価を有するトリプトニドを生成できる。
ｉ．ジテルペン生合成酵素ＳＰＧＧＰＰＳ７ｖ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ＣｆｔＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）、ＣｆｔＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）およびＴｗＣＰＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；
ｉｉ．ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；
ｉｉｉ．ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；
ｉｖ．ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；ならびに
ｖ．ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）、
をさらに発現する酵母細胞は好ましくは、上記酵母がＴｗＢ５＃１の上記機能的ホモログを発現しないことを除き、同一の酵母細胞の少なくとも２倍、少なくとも３倍など、少なくとも４倍など、少なくとも５倍などである力価を有するトリプトニドを生成できる。
【0114】
好ましい実施形態において、シトクロムＢ５活性を有する酵素は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＴｗＢ５＃１）によるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する機能的ホモログ、またはその成熟ポチペプチドを含む、またはそれからなる。
【0115】
本発明のポリヌクレオチドは、植物のＴ．ウィルフォルディもしくは密接に関連する植物などのポリペプチドを自然に生成する生物体からのクローニングにより提供されてよく、またはそれは、当該技術分野で公知の技術に基づくポリヌクレオチド配列の化学合成により生成されてよい。ポリヌクレオチドは、自然に見出される配列と同一の配列を有してよく、またはそれは、自然に見出されない配列を有してよく、例えば配列は、特定の選択された宿主細胞のためにコドン最適化されてよい。
【0116】
本発明のポリペプチドは、植物のＴ．ウィルフォルディもしくは関連の生物体などのポリペプチドを自然に生成する生物体から提供されてよく、またはそれらは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に挿入することおよび発現させること、および各遺伝子で形質転換された宿主細胞を含む培養ブロスからポリペプチドを回収すること、により提供されてよい。適切な選択された組換え宿主細胞から本発明のポリペプチドを提供することが、好ましい。
【0117】
適切な宿主細胞中で遺伝子を形質転換し発現させるために、遺伝子は通常、適切な調節エレメントに動作可能に連結され、かつ固有の選択された宿主細胞に適した発現ベクターに挿入される。適切な調節エレメントを選択すること、適切な発現ベクターを構築すること、および選択された宿主細胞を形質転換することは、平均的な実施者の技能の範囲内であり、本発明は、そのようなエレメントの任意の特定の選択に限定されない。
【0118】
本発明の遺伝子を含む作製された宿主細胞は、遺伝子が発現され酸素化ジテルペノイド化合物が形成される条件下で、コンテナ、例えば発酵槽または振とうフラスコ中で適切に生育される。生育が停止したら、または充分に多量の酸素化ジテルペノイド化合物が培養ブロス中に蓄積されたら、酸素化ジテルペノイド化合物は、さらに修飾され培養ブロスから回収されてよい。
【0119】
配列同一性は、２種のアミノ酸またはヌクレオチド配列の間の類似性の尺度として理解される。配列同一性は、最初に２つの配列をアライメントすること、２つの配列が同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを含有する位置の数をカウントすること、およびアライメントの全長で同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する位置の数としての同一性％を計算すること、により計算される。
【0120】
複数のアルゴリズムが、開発されており、当業者に入手可能である。
【0121】
本明細書および特許請求の範囲において、アミノ酸配列の配列同一性は、デフォルトパラメータ（ＢＬＯＳＵＭ ６２マトリックス、ギャップオープンペナルティ １１；ギャップエクステンドペナルティ １、Ｅｘｐ． Ｔｈｒ １０）を用いるＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ＋ペアワイズアライメントアルゴリズムを利用して計算され、ヌクレオチド配列の配列同一性は、デフォルトパラメータ（マッチ／ミスマッチスコア １、－３；ギャップオープンペナルティ ５；ギャップエクステンドペナルティ ２；ｅｘｐ． Ｔｈｒ １０）を用いるＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ＋ペアワイズアライメントアルゴリズムを利用して計算される。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ＋プログラムは、Ｍａｄｅｉｒａ Ｆ ｅｌ ａｔ（２０１９） ＮＡＲ ４７： Ｗ６３６－Ｗ６４１にさらに記載される。
【0122】
実施例
材料と方法
ニコチアナ・ベンサミアナの遺伝子操作
トリプテリギウム・ウィルフォルディＣＹＰ遺伝子が、過去に（１～４）に記載された構築物および方法を用いて、植物材料からクローニングされ、ジテルペン生合成遺伝子ＣｆＤＸＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）またはＳｃｔＨＭＧＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）、ＣｆＧＧＰＰＳまたはＳｐＧＧＰＰＳ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ＣｆＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）またはＣｆｔＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）、およびＣｆＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）またはＣｆｔ－ＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）とニコチアナ・ベンサミアナ中で共発現された。遺伝子サイレンシングのサプレッサｐ１９がまた、共発現された。手短に述べると、それぞれが個々のジテルペン生合成遺伝子またはトリプテリギウム・ウィルフォルディＣＹＰ（ＴｗＣＹＰ）を含有するバイナリベクターが、アグロバクテリウム中に形質転換された。それぞれが特異的プラスミドを含有するアグロバクテリウムの液体培養物が、ＴｗＣＹＰの特異的組合わせの共発現のために混合された。
材料と方法
ニコチアナ・ベンサミアナの遺伝子操作
トリプテリギウム・ウィルフォルディＣＹＰ遺伝子が、過去に（１～４）に記載された構築物および方法を用いて、植物材料からクローニングされ、ジテルペン生合成遺伝子ＣｆＤＸＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）またはＳｃｔＨＭＧＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）、ＣｆＧＧＰＰＳまたはＳｐＧＧＰＰＳ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ＣｆＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）またはＣｆｔＴＰＳ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）、およびＣｆＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）またはＣｆｔ－ＴＰＳ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）とニコチアナ・ベンサミアナ中で共発現された。遺伝子サイレンシングのサプレッサｐ１９がまた、共発現された。手短に述べると、それぞれが個々のジテルペン生合成遺伝子またはトリプテリギウム・ウィルフォルディＣＹＰ（ＴｗＣＹＰ）を含有するバイナリベクターが、アグロバクテリウム中に形質転換された。それぞれが特異的プラスミドを含有するアグロバクテリウムの液体培養物が、ＴｗＣＹＰの特異的組合わせの共発現のために混合された。
【0123】
サッカロマイセス・セレビシエの遺伝子操作および操作されたＳ．セレビシエのための生育条件
培地
ＹＰＤ培地：２０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ（商標）ペプトン、１０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ（商標）酵母エキス、２０ｇ／Ｌグルコース。ウラシル不含合成完全（ＳＣ）培地：１．９２ｇ／Ｌウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ．カタログ番号Ｙ１５０１）、６．７ｇ／Ｌ アミノ酸不含酵母培養用ニトロゲンベース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ．カタログ番号Ｙ０６２６）、２０ｇ／Ｌグルコース。フィード・イン・タイム（ＦＩＴ）は、ＥｎＰｕｍｐ２００（Ｅｎｐｒｅｓｓｏ ＧｍｂＨ）に基づき、製品に同封されたプロトコルに従って作成された。寒天プレート：寒天を含むＳＣ培地（１５ｇ／Ｌ）。
培地
ＹＰＤ培地：２０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ（商標）ペプトン、１０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ（商標）酵母エキス、２０ｇ／Ｌグルコース。ウラシル不含合成完全（ＳＣ）培地：１．９２ｇ／Ｌウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ．カタログ番号Ｙ１５０１）、６．７ｇ／Ｌ アミノ酸不含酵母培養用ニトロゲンベース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ．カタログ番号Ｙ０６２６）、２０ｇ／Ｌグルコース。フィード・イン・タイム（ＦＩＴ）は、ＥｎＰｕｍｐ２００（Ｅｎｐｒｅｓｓｏ ＧｍｂＨ）に基づき、製品に同封されたプロトコルに従って作成された。寒天プレート：寒天を含むＳＣ培地（１５ｇ／Ｌ）。
【0124】
親株におけるウラシル栄養要求性が、５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ、０．７４ｇ／Ｌ）およびウラシル（３０ｍｇ／Ｌ）を含有するウラシル不含ＳＣ培地の寒天プレート上でＵＲＡ３機能の欠如について選択することにより導入された。
【0125】
酵母形質転換体は、ウラシル不含ＳＣ寒天プレートで単離された。
【0126】
ミルチラジエン由来ジテルペノイドの単離のための操作するＳ．セレビシエ株の流加発酵
全ての操作されたＳ．セレビシエ株は、過去に記載されたものと類似のフィード・イン・タイム（ＦＩＴ；ｍ２ｐ－ｌａｂｓ）アプローチ（挿入物の参考資料 Ｆｏｒｍａｎら、２０１８）を利用して、９６ディープウェルプレートで培養された。トリプトニド経路における重要な中間体の単離および精製のために、選択された操作されたＳ．セレビシエ株が、２Ｌ Ｂｉｏｓｔａｔ（登録商標）Ａバイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ）を用いて流加発酵槽で培養された。流加発酵は、バッチグルコース２００ｍＬおよびバッチソルトミックス３００ｍＬを含有してオートクレーブ処理により事前に準備されたリアクタータンク（撹拌羽を有する）への１００ｍＬの開始培養物の添加により開始された。５ｍＬのビタミンミックス、５ｍＬのマイクロエレメント（ｍｉｃｒｏ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）および０．５ｍＬの微量元素もまた、添加された。バイオリアクターでの培養は、以下の条件下（モニタリングされ自動制御された）で開始された：ｐＨ＝５、温度＝３０℃、溶解酸素（ＤＯ）＝２０％。ｐＨは、水酸化アンモニウム（３２％）および硫酸（１０％）の供給により制御された一方で、溶解酸素は、撹拌しながら混和された送気により制御された。発泡レベルもまた、消泡エマルジョン（３５１１９、Ｓｅｒｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＧｍｂＨ）の添加により調整された。バイオリアクターでの１８時間の開始培養後に、１．３％の割合でのフィード溶液の供給が、開始された。発酵工程は７日間継続し、培養物を毎日採取した。
全ての操作されたＳ．セレビシエ株は、過去に記載されたものと類似のフィード・イン・タイム（ＦＩＴ；ｍ２ｐ－ｌａｂｓ）アプローチ（挿入物の参考資料 Ｆｏｒｍａｎら、２０１８）を利用して、９６ディープウェルプレートで培養された。トリプトニド経路における重要な中間体の単離および精製のために、選択された操作されたＳ．セレビシエ株が、２Ｌ Ｂｉｏｓｔａｔ（登録商標）Ａバイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ）を用いて流加発酵槽で培養された。流加発酵は、バッチグルコース２００ｍＬおよびバッチソルトミックス３００ｍＬを含有してオートクレーブ処理により事前に準備されたリアクタータンク（撹拌羽を有する）への１００ｍＬの開始培養物の添加により開始された。５ｍＬのビタミンミックス、５ｍＬのマイクロエレメント（ｍｉｃｒｏ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）および０．５ｍＬの微量元素もまた、添加された。バイオリアクターでの培養は、以下の条件下（モニタリングされ自動制御された）で開始された：ｐＨ＝５、温度＝３０℃、溶解酸素（ＤＯ）＝２０％。ｐＨは、水酸化アンモニウム（３２％）および硫酸（１０％）の供給により制御された一方で、溶解酸素は、撹拌しながら混和された送気により制御された。発泡レベルもまた、消泡エマルジョン（３５１１９、Ｓｅｒｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＧｍｂＨ）の添加により調整された。バイオリアクターでの１８時間の開始培養後に、１．３％の割合でのフィード溶液の供給が、開始された。発酵工程は７日間継続し、培養物を毎日採取した。
【0127】
ＬＣ－ＭＳ分析のための操作されたＳ．セレビシエの抽出
遺伝子操作されたＳ．セレビシエ株が、９６ウェルプレート中の培地０．５ｍＬ中に移され、３５０ｒｐｍのオービタルシェーキングしながら３０℃で３日間生育された。抽出のために、Ｓ．セレビシエ培養物の０．１ｍＬが、１．５ｍＬガラスバイアルに移された。０．４ｍＬのｕＨＰＬＣ等級のＭｅＯＨが、添加された。Ｓ．セレビシエ抽出物は、０．２２μｍ ９６ウェルフィルタープレート（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ ダルムシュタット）を用いることにより濾過され、ＬＣ－ＭＳ分析の前に４℃で貯蔵された。
遺伝子操作されたＳ．セレビシエ株が、９６ウェルプレート中の培地０．５ｍＬ中に移され、３５０ｒｐｍのオービタルシェーキングしながら３０℃で３日間生育された。抽出のために、Ｓ．セレビシエ培養物の０．１ｍＬが、１．５ｍＬガラスバイアルに移された。０．４ｍＬのｕＨＰＬＣ等級のＭｅＯＨが、添加された。Ｓ．セレビシエ抽出物は、０．２２μｍ ９６ウェルフィルタープレート（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ ダルムシュタット）を用いることにより濾過され、ＬＣ－ＭＳ分析の前に４℃で貯蔵された。
【0128】
ＬＣ－ＭＳ分析のためのジテルペノイド代謝産物の抽出
ＬＣＭＳ分析のための酵母培養の試料が、酵母培養物と５ｐｐｍアンドログラホリドが添加されたメタノールを、毎日のバイオリアクター試料では１：１９比（ｖ／ｖ）および９６ディープウェル培養では１：４比（ｖ／ｖ）で混合することにより１．５ｍＬガラスバイアル中で調製された。混合は、室温で振とうしながら３０分進行した。タバコ試料のために、１．５ｍｌガラスバイアルに配置された２枚の円盤状の葉（径＝３ｃｍ）が、室温で１時間振とうしながら、１ｍＬのメタノール抽出溶液により抽出された。ＬＣＭＳ分析の前に、試料は、０．２２μＭ９６ウェルプレートフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ ダルムシュタット）に通され、５℃で貯蔵された。
ＬＣＭＳ分析のための酵母培養の試料が、酵母培養物と５ｐｐｍアンドログラホリドが添加されたメタノールを、毎日のバイオリアクター試料では１：１９比（ｖ／ｖ）および９６ディープウェル培養では１：４比（ｖ／ｖ）で混合することにより１．５ｍＬガラスバイアル中で調製された。混合は、室温で振とうしながら３０分進行した。タバコ試料のために、１．５ｍｌガラスバイアルに配置された２枚の円盤状の葉（径＝３ｃｍ）が、室温で１時間振とうしながら、１ｍＬのメタノール抽出溶液により抽出された。ＬＣＭＳ分析の前に、試料は、０．２２μＭ９６ウェルプレートフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ ダルムシュタット）に通され、５℃で貯蔵された。
【0129】
ＬＣ－ＭＳ分析：
メタノール（ＭｅＯＨ）抽出物が、Ｂｒｕｋｅｒ Ｃｏｍｐａｃｔ ＥＳＩ－ＱＴＯＦ－ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ）システムに連結されたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣ＋ Ｆｏｃｕｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サニーベール）を用いて分析された。試料は、流速０．３ｍＬ／分ならびに水中の０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸（溶媒Ａ）およびアセトニトリル中の０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸（溶媒Ｂ）からなる移動相により４０＿Ｃにて保持されたＫｉｎｅｔｅｘ ＸＢ－Ｃ１８カラム（１００×２．１ｍｍ ＩＤ、１：７μｍ粒子径、１００Å孔径；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州トーランス）で分離された。
メタノール（ＭｅＯＨ）抽出物が、Ｂｒｕｋｅｒ Ｃｏｍｐａｃｔ ＥＳＩ－ＱＴＯＦ－ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ）システムに連結されたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣ＋ Ｆｏｃｕｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サニーベール）を用いて分析された。試料は、流速０．３ｍＬ／分ならびに水中の０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸（溶媒Ａ）およびアセトニトリル中の０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸（溶媒Ｂ）からなる移動相により４０＿Ｃにて保持されたＫｉｎｅｔｅｘ ＸＢ－Ｃ１８カラム（１００×２．１ｍｍ ＩＤ、１：７μｍ粒子径、１００Å孔径；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州トーランス）で分離された。
【0130】
２種のＬＣプロトコルが利用された：
ＬＣ法１：０～０．５分、１０％Ｂ；０．５～２１分、１０％Ｂから８０％Ｂへの直線的増加；２１～３１分、９０％Ｂへ；３１～３４分、１００％Ｂへ；３４～３９分、１００％Ｂ；３９～４０分、１００％Ｂから１０％Ｂへの直線的減少。
ＬＣ法１：０～０．５分、１０％Ｂ；０．５～２１分、１０％Ｂから８０％Ｂへの直線的増加；２１～３１分、９０％Ｂへ；３１～３４分、１００％Ｂへ；３４～３９分、１００％Ｂ；３９～４０分、１００％Ｂから１０％Ｂへの直線的減少。
【0131】
ＬＣ法２：０～０．５分、２０％Ｂ；０．５～１１分、２０％Ｂから８０％Ｂへの直線的増加；１１～２０分、９０％Ｂへ；２０～２２分、１００％Ｂへ；２２～２７分、１００％Ｂ；２７～２８分、１００％Ｂから２０％Ｂへの直線的減少。
【0132】
ＬＣ法３：０～０．５分、２０％Ｂ；０．５～９分、２０％Ｂから１００％Ｂへの直線的増加；９～１１分、１００％Ｂ；１１～１１．５分、１００％Ｂから２０％Ｂへの直線的減少；１１．５～１５分、２０％Ｂ。
【0133】
ＧＣ－ＭＳ分析のためのジテルペノイド代謝産物の抽出
ＧＣＭＳ分析のための酵母培養の試料が、１：４比（ｖ／ｖ）で酵母培養物と純粋なメタノールを混合することにより１．５ｍＬガラスバイアル中で調製された。短時間の混合の後、非極性成分が、ヘキサン中に液－液抽出され、１：１比（ｖ／ｖ）で混合することおよび１時間振とうすることにより、１０ｐｐｍの１－エイコセンを添加された。タバコ試料では、１．５ｍｌガラスバイアル中に配置された２枚の円盤状の葉（径＝３ｃｍ）が、１時間の振とうにより、１ｍＬの同じヘキサン溶液で抽出された。ＧＣＭＳ分析の前に、ヘキサン層は、新しいバイアルに移された。
ＧＣＭＳ分析のための酵母培養の試料が、１：４比（ｖ／ｖ）で酵母培養物と純粋なメタノールを混合することにより１．５ｍＬガラスバイアル中で調製された。短時間の混合の後、非極性成分が、ヘキサン中に液－液抽出され、１：１比（ｖ／ｖ）で混合することおよび１時間振とうすることにより、１０ｐｐｍの１－エイコセンを添加された。タバコ試料では、１．５ｍｌガラスバイアル中に配置された２枚の円盤状の葉（径＝３ｃｍ）が、１時間の振とうにより、１ｍＬの同じヘキサン溶液で抽出された。ＧＣＭＳ分析の前に、ヘキサン層は、新しいバイアルに移された。
【0134】
ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ－ＭＳ）分析
ＧＣ－ＭＳ分析が、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ－５ＭＳカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２０ｍ×０．１８ｍｍ内径、０．１８μｍ膜厚）を有するＳｈｉｍａｄｚｕ ＧＣＭＳ－ＱＰ２０１０ Ｕｌｔｒａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ．）で実行された。水素が、５０ｃｍ／秒の一定の直線速度でキャリアガスとして用いられ、注入容量は、２５０℃で１μＬであった（スプリットレスモード）。オーブンのプログラムは、８０℃で２分間、２０℃／分で１８０℃に上昇させ、１０℃／分の速度で３００℃に上昇させ、２０℃／分の速度で３１０℃に上昇させ、３分間保持した。データは、ＣＤＦフォーマットで保存され、ＭＺｍｉｎｅ２で処理された。
ＧＣ－ＭＳ分析が、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ－５ＭＳカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２０ｍ×０．１８ｍｍ内径、０．１８μｍ膜厚）を有するＳｈｉｍａｄｚｕ ＧＣＭＳ－ＱＰ２０１０ Ｕｌｔｒａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ．）で実行された。水素が、５０ｃｍ／秒の一定の直線速度でキャリアガスとして用いられ、注入容量は、２５０℃で１μＬであった（スプリットレスモード）。オーブンのプログラムは、８０℃で２分間、２０℃／分で１８０℃に上昇させ、１０℃／分の速度で３００℃に上昇させ、２０℃／分の速度で３１０℃に上昇させ、３分間保持した。データは、ＣＤＦフォーマットで保存され、ＭＺｍｉｎｅ２で処理された。
【0135】
ミルチラジエン由来ジテルペノイドの相対的定量
酵母培養物中の相対的化合物量は、特徴的イオンの正規化ピーク面積に基づいた（ＭＺｍｉｎｅ２ソフトウエアで標的とされる特色の検出を利用して得られたデータ）。以下のイオンのシグナルが、定量された：１：ミルチラジエン ｍ／ｚ９１．１、２：１４－ヒドロキシアビエタジエン ｍ／ｚ１８９．１、３：Ｆ１５Ｐ１ ｍ／ｚ３０３．２３１８、４：Ｆ２０Ｐ２ ｍ／ｚ２８３．２０５９、５：Ｆ１５Ｐ２ ｍ／ｚ２９９．２００２、６：トリプトフェノリド ｍ／ｚ３１３．１７９４、８：トリプトニド ｍ／ｚ３５９．１４８１。ＬＣＭＳおよびＧＣＭＳデータの場合、それぞれ、５ｐｐｍおよび１００ｐｐｍの質量偏差が、許容された。
酵母培養物中の相対的化合物量は、特徴的イオンの正規化ピーク面積に基づいた（ＭＺｍｉｎｅ２ソフトウエアで標的とされる特色の検出を利用して得られたデータ）。以下のイオンのシグナルが、定量された：１：ミルチラジエン ｍ／ｚ９１．１、２：１４－ヒドロキシアビエタジエン ｍ／ｚ１８９．１、３：Ｆ１５Ｐ１ ｍ／ｚ３０３．２３１８、４：Ｆ２０Ｐ２ ｍ／ｚ２８３．２０５９、５：Ｆ１５Ｐ２ ｍ／ｚ２９９．２００２、６：トリプトフェノリド ｍ／ｚ３１３．１７９４、８：トリプトニド ｍ／ｚ３５９．１４８１。ＬＣＭＳおよびＧＣＭＳデータの場合、それぞれ、５ｐｐｍおよび１００ｐｐｍの質量偏差が、許容された。
【0136】
内部標準アンドログラホリドのベースピークイオンのピーク面積（ｍ／ｚ３１５．１９４７）が、正規化に用いられた。
【0137】
絶対定量
トリプトフェノリド（ＦＴ６５７３２、ＣａｒｂｏＳｙｎｔｈ）およびトリプトニド（ＦＴ６５１９７、ＣａｒｂｏＳｙｎｔｈ）の絶対定量が、メタノール中で調製された真の標準と、最終濃度５ｐｐｍの内部標準（アンドログラホリド）の同時分析により実行された。定量は、正規化ピーク面積に基づき、標準反応曲線（トリプトフェノリド０．０５、０．５、１、２ｐｐｍ；トリプトニド０．５、１、２、１０、２０ｐｐｍ）の直線外挿の傾きから計算された。
トリプトフェノリド（ＦＴ６５７３２、ＣａｒｂｏＳｙｎｔｈ）およびトリプトニド（ＦＴ６５１９７、ＣａｒｂｏＳｙｎｔｈ）の絶対定量が、メタノール中で調製された真の標準と、最終濃度５ｐｐｍの内部標準（アンドログラホリド）の同時分析により実行された。定量は、正規化ピーク面積に基づき、標準反応曲線（トリプトフェノリド０．０５、０．５、１、２ｐｐｍ；トリプトニド０．５、１、２、１０、２０ｐｐｍ）の直線外挿の傾きから計算された。
【0138】
ＮＭＲ分析のための操作されたＳ．セレビシエ株からのミルチラジエン由来化合物の単離および精製
本発明の化合物は、バイオリアクター培養酵母株ＮＶＪ８．１５およびＮＶＪ３．１０から単離され、ＮＭＲにより構造的に解明された。ブロスとメタノール溶解細胞（細胞：メタノール＝１：４ｖ／ｖ）の組み合わされた酢酸エチル抽出物が最初に、ロータリーエバポレーションを介してＣｅｌｉｔｅ Ｓ（登録商標）（０６８５８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で乾燥された。化合物が次に、ＵＶ吸収による検出および蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）を備えるｐｕｒｉＦｌａｓｈ（登録商標）５．２５０（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス モンリュソン）装置を用いる連続分画により単離された。これは、それぞれ、順相分離および逆相分離のための、カラム（Ｃ１）ＰＦ－１５ＳＩＨＰ－Ｆ００２５（ＯＶ００２Ａ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）および（Ｃ２） ＵＳ５Ｃ１８ＨＱ－１００／３００（ＳＳＰ７５０、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）のどちらかを具備した。
本発明の化合物は、バイオリアクター培養酵母株ＮＶＪ８．１５およびＮＶＪ３．１０から単離され、ＮＭＲにより構造的に解明された。ブロスとメタノール溶解細胞（細胞：メタノール＝１：４ｖ／ｖ）の組み合わされた酢酸エチル抽出物が最初に、ロータリーエバポレーションを介してＣｅｌｉｔｅ Ｓ（登録商標）（０６８５８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で乾燥された。化合物が次に、ＵＶ吸収による検出および蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）を備えるｐｕｒｉＦｌａｓｈ（登録商標）５．２５０（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス モンリュソン）装置を用いる連続分画により単離された。これは、それぞれ、順相分離および逆相分離のための、カラム（Ｃ１）ＰＦ－１５ＳＩＨＰ－Ｆ００２５（ＯＶ００２Ａ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）および（Ｃ２） ＵＳ５Ｃ１８ＨＱ－１００／３００（ＳＳＰ７５０、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）のどちらかを具備した。
【0139】
Ｃｅｌｉｔｅ Ｓ（登録商標）／粗抽出物のドライミックスの最初の予備分画が、手動でパッキングされたドライローディングカラムからロードするカラム（参考資料９）を用いて実現された。分離は、移動相ヘキサン（Ａ）および酢酸エチル（Ｂ）、一定の流速１５ｍＬ／分を利用して行われ、１００％メタノールでの最終的な洗浄ステップが続いた。目的の化合物が、ＵＶおよびＥＬＳＤにより検出され、収集された。収集された画分は、さらなる分画またはＮＭＲ試験に先立ち、ＬＣ－ＭＳ法３を用いるＬＣＭＳおよびＴＬＣ分析により連続して評価された。複数の化合物を含む画分からの目的の化合物の追加的精製が、Ｃ１を用いる追加的順相画分またはＣ２を用いる逆相カラム分画により実行された。
【0140】
Ｃ２での逆相精製のために、試料が、ロータリーエバポレーションを利用して蒸発させられ、２ｍＬのメタノール中に再懸濁された。試料は、事前調整されたカラムＣ２に直接注入された。Ｃ２の移動相は、溶媒Ｃ：脱イオン水および溶媒Ｄ：アセトニトリルからなり、それぞれが、０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸で酸性化された。３２ｍＬ／分の一定の流速が、増加する濃度の溶媒Ｄによる溶媒の直線勾配で、利用された。目的の化合物が、ＥＬＳＤおよびＵＶにより検出され、収集された。
【0141】
追加的な逆相精製が、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ（ＳＰＤ－Ｍ２０Ａダイオードアレイ検出器、ＦＲＣ－１０Ａフラクションコレクター、ＤＧＵ－２０Ａ５脱ガス装置、ＬＣ－２０ＡＴポンプ、ＣＢＭ－２０Ａシステムコントローラ、ＣＴＯ－１０ＡＳ ＶＰカラムオーブン、ＳＩＬ－１０ＡＰオートサンプラ)上のセミ分取Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μｍ Ｃ１８（２） １００Å ２５０ｘ１０ｍｍ（全多孔性）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ， Ｉｎｃ．，米国カリフォルニア州トーランス）カラムへの１００μＬの複数回の注入により実行された。移動相は、５０％から１００％にＤの量を増加させるＣとＤの直線勾配であった。目的の化合物が、２１０ｎｍでのＵＶ吸収により検出され、収集された。
【0142】
質量スペクトル
質量スペクトルが、以下のＥＳＩおよびＭＳ設定によりｍ／ｚ５０～１２００の走査範囲での陽イオンモードで取得された：キャピラリー電圧、４０００Ｖ；エンドプレートオフセット（ｅｎｄ ｐｌａｔｅ ｏｆｆｓｅｔ）、５００Ｖ；乾性ガス温度、２２０℃；８Ｌ／分の乾性ガス流速；ネブライザの圧力、２×１０５Ｐａ（２バール）；インソースＣＩＤエネルギー ０ｅＶ；ヘキサポールＲＦ ５０Ｖｐｐ；四重極イオンエネルギー、４ｅＶ；コリジョンセルエネルギー、７ｅＶ。クロマトグラムの生データは、ギ酸ナトリウム内部標準を用いて較正され、次にＢｒｕｋｅｒのＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ ４．３（Ｂｕｉｌｄ １１０．１０２．１５３２）（６４ビット）を用いてｍｚＭＬフォーマットとしてエクスポートされた。ＭＺｍｉｎｅ ｖｅｒ２．５３が、ＬＣ－ＭＳクロマトグラムを視覚化するために用いられた。
質量スペクトルが、以下のＥＳＩおよびＭＳ設定によりｍ／ｚ５０～１２００の走査範囲での陽イオンモードで取得された：キャピラリー電圧、４０００Ｖ；エンドプレートオフセット（ｅｎｄ ｐｌａｔｅ ｏｆｆｓｅｔ）、５００Ｖ；乾性ガス温度、２２０℃；８Ｌ／分の乾性ガス流速；ネブライザの圧力、２×１０５Ｐａ（２バール）；インソースＣＩＤエネルギー ０ｅＶ；ヘキサポールＲＦ ５０Ｖｐｐ；四重極イオンエネルギー、４ｅＶ；コリジョンセルエネルギー、７ｅＶ。クロマトグラムの生データは、ギ酸ナトリウム内部標準を用いて較正され、次にＢｒｕｋｅｒのＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ ４．３（Ｂｕｉｌｄ １１０．１０２．１５３２）（６４ビット）を用いてｍｚＭＬフォーマットとしてエクスポートされた。ＭＺｍｉｎｅ ｖｅｒ２．５３が、ＬＣ－ＭＳクロマトグラムを視覚化するために用いられた。
【0143】
バイオリアクター出発培地およびフィード培地のための培地レシピ
バッチグルコース：
グルコース一水和物 ５５ｇ／Ｌ
バッチグルコース：
グルコース一水和物 ５５ｇ／Ｌ
【0144】
バッチソルトミックス：
硫酸アンモニウム ２５ｇ／Ｌ
一塩基性リン酸カリウム ５ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム五水和物 １．７ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム ２５ｇ／Ｌ
一塩基性リン酸カリウム ５ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム五水和物 １．７ｇ／Ｌ
【0145】
フィードグルコース：
グルコース一水和物 ８８０ｇ／Ｌ
グルコース一水和物 ８８０ｇ／Ｌ
【0146】
フィードソルトミックス：
一塩基性リン酸カリウム ２１．６ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム五水和物 ２４．２４ｇ／Ｌ
硫酸カリウム ８．４ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ０．６７２ｇ／Ｌ
一塩基性リン酸カリウム ２１．６ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム五水和物 ２４．２４ｇ／Ｌ
硫酸カリウム ８．４ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ０．６７２ｇ／Ｌ
【0147】
調製の注意点：バッチおよびフィードソルトミックスと、バッチおよびフィードグルコースは、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中に成分を溶解すること、およびオートクレーブ処理により滅菌すること、により別個のＢｌｕｅＣａｐボトル中で調製された。
【0148】
フィーディング溶液
フィーディング溶液は、５００ｍＬのフィードグルコースを５００ｍＬのフィードソルトミックス、１０ｍＬのビタミンミックス、１０ｍＬのマイクロエレメントおよび１ｍＬの微量元素と混合することにより作製された。
フィーディング溶液は、５００ｍＬのフィードグルコースを５００ｍＬのフィードソルトミックス、１０ｍＬのビタミンミックス、１０ｍＬのマイクロエレメントおよび１ｍＬの微量元素と混合することにより作製された。
【0149】
実施例１：ニコチアナ・ベンサミアナにおける発現
目的の遺伝子（ＧＯＩ）の特異的組合わせを共発現するＮ．ベンサミアナの葉材料が、アグロバクテリウムインフィルトレーションの７日後に回収された。１ｍＬのメタノール（ＭｅＯＨ）が、２枚の円盤状の葉（径＝２ｃｍ）に添加された。抽出は、２００ｒｐｍでのオービタルシェーキングの下、室温で実行された。２００μＬの抽出物が、０．２２μｍ ９６ウェルフィルタープレート（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ ダルムシュタット）を用いることにより濾過され、ＬＣ－ＭＳ分析の前に４℃で貯蔵された。図１は、得られたＬＣＭＳプロファイルを示す。結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を有する酵素をコードするＣＹＰ８２Ｄ２７４Ｖ１で形質転換されたＮ．ベンサミアナ細胞が１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンの生成をもたらすことを示し；細胞がさらに、それぞれアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を有する酵素をコードするＣＹＰ７１ＢＥ８５およびＣＹＰ７１ＢＥ８６で形質転換された場合、トリプトフェノリドが形成され；および細胞がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有する酵素をコードするＣＹＰ８２Ｄ２１３でさらに形質添加された場合、トリプトニドが形成される。さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の配列を有し、遺伝子ＣＹＰ８２Ｄ２１７によりコードされる酵素は、トリプトフェノリドおよびトリプトニドの生成を増加させることが、認められ得る。
目的の遺伝子（ＧＯＩ）の特異的組合わせを共発現するＮ．ベンサミアナの葉材料が、アグロバクテリウムインフィルトレーションの７日後に回収された。１ｍＬのメタノール（ＭｅＯＨ）が、２枚の円盤状の葉（径＝２ｃｍ）に添加された。抽出は、２００ｒｐｍでのオービタルシェーキングの下、室温で実行された。２００μＬの抽出物が、０．２２μｍ ９６ウェルフィルタープレート（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ ダルムシュタット）を用いることにより濾過され、ＬＣ－ＭＳ分析の前に４℃で貯蔵された。図１は、得られたＬＣＭＳプロファイルを示す。結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を有する酵素をコードするＣＹＰ８２Ｄ２７４Ｖ１で形質転換されたＮ．ベンサミアナ細胞が１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンの生成をもたらすことを示し；細胞がさらに、それぞれアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を有する酵素をコードするＣＹＰ７１ＢＥ８５およびＣＹＰ７１ＢＥ８６で形質転換された場合、トリプトフェノリドが形成され；および細胞がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有する酵素をコードするＣＹＰ８２Ｄ２１３でさらに形質添加された場合、トリプトニドが形成される。さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の配列を有し、遺伝子ＣＹＰ８２Ｄ２１７によりコードされる酵素は、トリプトフェノリドおよびトリプトニドの生成を増加させることが、認められ得る。
【0150】
実施例２：Ｓ．セレビシエ株の構築
株の構築
親酵母株は、Ｓ．セレビシエＳ２８８Ｃ（ＮＣＹＣ ３６０８；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、英国 ノーウィック）であった。
株の構築
親酵母株は、Ｓ．セレビシエＳ２８８Ｃ（ＮＣＹＣ ３６０８；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、英国 ノーウィック）であった。
【0151】
株の遺伝子型および供給源が、表３に列挙される。
【0152】
構築された酵母株は、酢酸リチウム形質転換法を用いて作製された（８）。機能的ＵＲＡ３のない親株は、以下の手順によりコンピテントにされた：グリセロール原液から５ｍｌのＹＰＤ培地中に接種し、３０℃で一夜生育。その後、一夜培養物の３ｍＬを５０ｍＬのＹＰＤ培地に移し、４～５時間生育を続けた後、４０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、その後、上清を廃棄する。細胞はその後、滅菌水での２回の洗浄（１回目は２５ｍＬで、２回目は１ｍＬで）および０．４ｍＬの滅菌水中での再懸濁の後、形質転換できる状態であった。
【0153】
コンピテント酵母細胞の形質転換は、以下の手順により実行された：指定されたＮｏｔＩ消化されたプラスミド（それぞれ２μＬ）の混合物がそれぞれ、１０μＬのコンピテント酵母細胞に添加され、６０μＬのＰＥＧ ３３５０（５０％ｗ／ｖ）、９μＬのＬｉＡｃ（１Ｍ）および１２．５μＬの煮沸されたサケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）と混合された。得られた混合物は次に、４２℃で４０分間インキュベートされ、その後細胞が、遠心分離（３０００ＲＰＭで５分間）および上清の除去により収集された。細胞はその後、１００μＬの滅菌水中に再懸濁され、ウラシル不含ＳＣ寒天プレート上に塗り広げられた。単離された形質転換体は、３０での２日間のインキュベーション後に単一コロニーとして出現した。遺伝子構築物の挿入が、表１に見出される遺伝子および構築物に特異的なプライマーを利用して、コロニーＰＣＲにより確認された。コロニーＰＣＲでは、酵母コロニーが、５０μＬの２０ｍＭ ＮａＯＨ中に再懸濁され、９９℃で15分間インキュベートされた。１μＬのコロニー懸濁液が、ＰＣＲに用いられた。
【表1】
【0154】
Ｓ．セレビシエゲノム操作のための遺伝子構築物の組み立て
プラスミド名およびコードされた遺伝子構築物が、表２に列挙される。全てのプラスミドは、過去に記載されたＵＳＥＲクローニングにより作製された（５）。また、最大で６個の遺伝子構築物の同時ゲノム組み込みのために、およびＡｓｉＳＩ／Ｎｂ．ＢｓｍＩ ＵＳＥＲカセットを含んで、アッセンブラ－１、－２および－３と名付けられた親ベクターが、過去に記載された通りＵＳＥＲクローニングのために調製された（６）。ＵＳＥＲ適合性ＰｆｕＸ７ポリメラーゼ（７）によるＰＣＲ増幅に用いられるプライマーは、表１に列挙される。この作業において使用されおよび作製されたベクターは、表３に列挙される。
プラスミド名およびコードされた遺伝子構築物が、表２に列挙される。全てのプラスミドは、過去に記載されたＵＳＥＲクローニングにより作製された（５）。また、最大で６個の遺伝子構築物の同時ゲノム組み込みのために、およびＡｓｉＳＩ／Ｎｂ．ＢｓｍＩ ＵＳＥＲカセットを含んで、アッセンブラ－１、－２および－３と名付けられた親ベクターが、過去に記載された通りＵＳＥＲクローニングのために調製された（６）。ＵＳＥＲ適合性ＰｆｕＸ７ポリメラーゼ（７）によるＰＣＲ増幅に用いられるプライマーは、表１に列挙される。この作業において使用されおよび作製されたベクターは、表３に列挙される。
【0155】
Ｓ．セレビシエのためのコドン最適化された遺伝子は、米国サンフランシスコのＴＷＩＳＴ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから取得された。以下の表において接頭辞「ＣＯ＿」で表された全ての遺伝子は、コドン最適化された。コドン最適化された遺伝子は、プライマーがコドン最適化された遺伝子中の任意のヌクレオチド変化にハイブリダイゼーションを適応させるように修飾されたこと以外は、先の表１に記載されたものと同一のプライマーを用いて増幅された。コドン最適化された遺伝子の増幅のためのプライマーは、Ｊ． Ａｎｄｅｒｓｅｎ－Ｒａｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ Ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｎ／ａ （２０１６）にも開示される。
【表2】
【表3】
【0156】
実施例３：酵母サッカロマイセス・セレビシエにおける発現
抽出および代謝産物の分析
遺伝子操作されたＳ．セレビシエ株は、９６ウェルプレート中の０．５ｍＬの培地に移され、３５０ｒｐｍでオービタルシェーキングしながら３０℃で３日間生育された。抽出のために、０．１ｍＬのＳ．セレビシエ培養物が、１．５ｍＬガラスバイアルに移された。０．４ｍＬのｕＨＰＬＣ等級のＭｅＯＨが、添加された。Ｓ．セレビシエ抽出物は、０．２２μｍ ９６ウェルフィルタープレート（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ ダルムシュタット）を用いることにより濾過され、ＬＣ－ＭＳ分析の前に４℃で貯蔵された。
抽出および代謝産物の分析
遺伝子操作されたＳ．セレビシエ株は、９６ウェルプレート中の０．５ｍＬの培地に移され、３５０ｒｐｍでオービタルシェーキングしながら３０℃で３日間生育された。抽出のために、０．１ｍＬのＳ．セレビシエ培養物が、１．５ｍＬガラスバイアルに移された。０．４ｍＬのｕＨＰＬＣ等級のＭｅＯＨが、添加された。Ｓ．セレビシエ抽出物は、０．２２μｍ ９６ウェルフィルタープレート（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ ダルムシュタット）を用いることにより濾過され、ＬＣ－ＭＳ分析の前に４℃で貯蔵された。
【0157】
抽出物のＬＣＭＳプロファイルが、図２に見出され得、そこで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する酵素をコードするＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４Ｖ１でバックグランド株を形質転換することが１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンの形成をもたらすことが、観察され得る。
【0158】
実施例４：ＮＭＲ分析による１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンの検出
実施例３において１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンとして同定された化合物が、ＮＭＲにより分析されて、その同一性を確認した。
実施例３において１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンとして同定された化合物が、ＮＭＲにより分析されて、その同一性を確認した。
【0159】
ＮＭＲのための精製
操作された酵母からのトリプトリド中間体の精製
目的の所望の化合物を生成する操作された酵母が、１０ｍＬのＹＤＰ中のＳＣ寒天から接種され、３０℃で一夜生育された。５ｍＬの一夜培養物が、５００ｍＬのＦＩＴ培地に接種され、３０℃で５日間生育された。目的の化合物が、５００ｍＬのＥｔＡｃにより培養物から抽出された。溶媒が、ロータリーエバポレーションにより除去され、分析物は、ヘキサンに再懸濁された。抽出は、３回繰り返された。ヘキサン抽出物は、Ｓｕｐｅｌｃｌｅａｎ（商標） Ｆｌｏｒｉｓｉｌ（登録商標）／Ｎａ２ＳＯ４ ＳＰＥ Ｔｕｂｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）にアプライされ、分析物は、ＥｔＡＣ：ヘキサン１：９９から５：９５への段階的勾配を利用してカラムから溶出された。各画分は、ＬＣ－ＭＳまたはＧＣ－ＭＳのどちらかで分析され、目的の化合物を含有する画分が、ＮＭＲ分析用に選択された。
操作された酵母からのトリプトリド中間体の精製
目的の所望の化合物を生成する操作された酵母が、１０ｍＬのＹＤＰ中のＳＣ寒天から接種され、３０℃で一夜生育された。５ｍＬの一夜培養物が、５００ｍＬのＦＩＴ培地に接種され、３０℃で５日間生育された。目的の化合物が、５００ｍＬのＥｔＡｃにより培養物から抽出された。溶媒が、ロータリーエバポレーションにより除去され、分析物は、ヘキサンに再懸濁された。抽出は、３回繰り返された。ヘキサン抽出物は、Ｓｕｐｅｌｃｌｅａｎ（商標） Ｆｌｏｒｉｓｉｌ（登録商標）／Ｎａ２ＳＯ４ ＳＰＥ Ｔｕｂｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）にアプライされ、分析物は、ＥｔＡＣ：ヘキサン１：９９から５：９５への段階的勾配を利用してカラムから溶出された。各画分は、ＬＣ－ＭＳまたはＧＣ－ＭＳのどちらかで分析され、目的の化合物を含有する画分が、ＮＭＲ分析用に選択された。
【0160】
ＮＭＲ分析
ＮＭＲデータが、１３Ｃおよび１Ｈに最適化された５ｍｍ極低温冷却ＤＣＨプローブを具備したＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＨＤ ６００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計（１Ｈ 動作周波数５９９．８５ＭＨｚ）（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ、ドイツ カールスルーエ）で取得された。ＮＭＲデータは、３００Ｋに温度を平衡化したＣＤＣｌ３（Ｅｕｒｉｓｏ－ｔｏｐ、９９．８原子％Ｄ）中の５ｍｍチューブにおいて記録され、ロックパラメータ（ｌｏｃｋ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）の最適化、グラジエントシミング、およびレシーバゲインの設定は全て、Ｔｏｐｓｐｉｎ ｖｅｒ． ３．２およびＩｃｏｎＮＭＲ ｖｅｒ． ４．７．５（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ、ドイツ カールスルーエ）により自動制御された。１Ｈおよび１３Ｃ化学シフトは、それぞれｐＨ７．２６ｐｐｍおよびｐＣ７７．１６ｐｐｍでの残留溶媒シグナルに参照された。１Ｄ １Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、３０°パルスおよび６４ｋデータポイントで取得され、２５６ｋデータポイントに０埋めされ、１Ｈスペクトルは、１２ｋＨｚのスペクトル幅、遅延時間1秒、およびデータ取得時間２．７秒で取得された。１３Ｃスペクトルは、Ｗａｌｔｚ１６コンポジットパルスデカップリングスキームを利用して１Ｈデカップリングされた。２Ｄ等核および異核実験は、直接次元では４０９６（ＨＭＢＣ）、２０４８（ＤＱＦ－ＣＯＳＹおよびＲＯＥＳＹ）、または１０２４（多重度編集ＨＳＱＣ）データポイントで、および間接次元では２５６（ＤＱＦ－ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣおよびＲＯＥＳＹ）または１２８（多重度編集ＨＳＱＣ）データポイントで取得された。２Ｄ ＮＭＲデータは、Ｆ１では１ｋにゼロ埋めされ、Ｆ２ではポイントの数の２倍にゼロ埋めされ、Ｆ１では前方線形予測に従った（ＬＰＢＩＮ＝０）。ＮＭＲデータの処理は、Ｔｏｐｓｐｉｎ ｖｅｒ． ４．０．９（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ、ドイツ カールスルーエ）を利用して実行された。
ＮＭＲデータが、１３Ｃおよび１Ｈに最適化された５ｍｍ極低温冷却ＤＣＨプローブを具備したＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＨＤ ６００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計（１Ｈ 動作周波数５９９．８５ＭＨｚ）（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ、ドイツ カールスルーエ）で取得された。ＮＭＲデータは、３００Ｋに温度を平衡化したＣＤＣｌ３（Ｅｕｒｉｓｏ－ｔｏｐ、９９．８原子％Ｄ）中の５ｍｍチューブにおいて記録され、ロックパラメータ（ｌｏｃｋ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）の最適化、グラジエントシミング、およびレシーバゲインの設定は全て、Ｔｏｐｓｐｉｎ ｖｅｒ． ３．２およびＩｃｏｎＮＭＲ ｖｅｒ． ４．７．５（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ、ドイツ カールスルーエ）により自動制御された。１Ｈおよび１３Ｃ化学シフトは、それぞれｐＨ７．２６ｐｐｍおよびｐＣ７７．１６ｐｐｍでの残留溶媒シグナルに参照された。１Ｄ １Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、３０°パルスおよび６４ｋデータポイントで取得され、２５６ｋデータポイントに０埋めされ、１Ｈスペクトルは、１２ｋＨｚのスペクトル幅、遅延時間1秒、およびデータ取得時間２．７秒で取得された。１３Ｃスペクトルは、Ｗａｌｔｚ１６コンポジットパルスデカップリングスキームを利用して１Ｈデカップリングされた。２Ｄ等核および異核実験は、直接次元では４０９６（ＨＭＢＣ）、２０４８（ＤＱＦ－ＣＯＳＹおよびＲＯＥＳＹ）、または１０２４（多重度編集ＨＳＱＣ）データポイントで、および間接次元では２５６（ＤＱＦ－ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣおよびＲＯＥＳＹ）または１２８（多重度編集ＨＳＱＣ）データポイントで取得された。２Ｄ ＮＭＲデータは、Ｆ１では１ｋにゼロ埋めされ、Ｆ２ではポイントの数の２倍にゼロ埋めされ、Ｆ１では前方線形予測に従った（ＬＰＢＩＮ＝０）。ＮＭＲデータの処理は、Ｔｏｐｓｐｉｎ ｖｅｒ． ４．０．９（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ、ドイツ カールスルーエ）を利用して実行された。
【0161】
１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンのＮＭＲ分光データが、表４に示される。
【表4】
【0162】
５９９．８５ＭＨｚでのＣＤＣｌ３中の１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンの１Ｈ ＮＭＲスペクトルが、図３に示され、１５０．８３ＭＨｚでのＣＤＣｌ３中の１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンの１３Ｃ ＮＭＲスペクトルが、図４に示され、化合物の同一性を確認する。
【0163】
実施例５：トリプトフェノリドおよびトリプトニドの生成をもたらす遺伝子のＳ．セレビシエにおける発現
これは、Ｓ．セレビシエにおけるトリプトフェノリドおよびトリプトニドの生成をもたらす遺伝子発現の効果を評定するための予備試験であった。
これは、Ｓ．セレビシエにおけるトリプトフェノリドおよびトリプトニドの生成をもたらす遺伝子発現の効果を評定するための予備試験であった。
【0164】
実施例２で作製されたバックグランド酵母株がさらに、それぞれが個々のジテルペン生合成遺伝子またはトリプテリギウム・ウィルフォルディＣＹＰ(ＴｗＣＹＰ)を含有するベクターで形質転換された。
【0165】
抽出物のＬＣＭＳプロファイルが、図５に認められ得、そこで、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有する酵素をコードするＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４Ｖ１、ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５およびＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６を含むバックグランド株を形質転換することがトリプトフェノリドの形成をもたらし、さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有する酵素をコードするＣＹＰ８２Ｄ２１３での形質転換がトリプトニドの形成をもたらすことが、認められ得る。
【0166】
図６は、作製された形質転換体の抽出物中で検出された酸素化ジテルペノイド化合物の含量の概要を示す。
【0167】
左のパネルは、トリプトフェノリドおよびトリプトニドの含量を示し、右のパネルは、１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンの含量を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子ＴｗＢ５＃１の発現は、トリプトフェノリドおよびトリプトニドの有意により高い生成をもたらした。
【0168】
遺伝子ＴｗＢ５＃２～６は、トリプトフェノリドまたはトリプトニドの生成を増加させない他のＴ．ウィルフォルディシトクロムＢ５遺伝子である（配列は提供されない）。
【0169】
実施例６：Ｓ．セレビシエおよびＮ．ベンサミアナにおける酸素化ジテルペノイド化合物の生成
全ての操作されたＳ．セレビシエ株およびＮ．ベンサミアナは、本明細書の先の「材料と方法」の節に記載された通り培養された。同様に、テルペノイド代謝産物が、抽出され、ＬＣ－ＭＳ、ＧＣ－ＭＳおよびＮＭＲにより分析され、また本明細書の先に記載された通り定量された。
全ての操作されたＳ．セレビシエ株およびＮ．ベンサミアナは、本明細書の先の「材料と方法」の節に記載された通り培養された。同様に、テルペノイド代謝産物が、抽出され、ＬＣ－ＭＳ、ＧＣ－ＭＳおよびＮＭＲにより分析され、また本明細書の先に記載された通り定量された。
【0170】
実験の生物体が酵母であること、および異種遺伝子が生物体中で安定にトランスフェクトされていることが、好ましく、なぜならこれが最も正確で再現性のある結果を与えるからである。
【0171】
結果が、図７～９に示される。図から明確に認められ得る通り、酵母細胞とタバコ植物ほど異なる生物体が両者とも、本発明の方法に従って提案されたトリプトニド生合成経路の請求された重要な中間体を高い力価で生成できる。
【0172】
また生成された他の重要な化合物のＮＭＲスペクトルが、図１０～２６に示される。生成された化合物のＮＭＲ分光データが、以下の表５～２１に示される。
参考資料
１． Ｊ． Ａｎｄｅｒｓｅｎ－Ｒａｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ Ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｎ／ａ （２０１６）．
２． Ｉ． Ｐａｔｅｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｏｔａｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｂｏｏｓｔｅｒ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ ｆｒｏｍ Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ． Ｅｌｉｆｅ ６， ｅ２３００１ （２０１７）．
３． Ｉ． Ｐａｔｅｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｎｏｙｌ Ｏｘｉｄｅ （１３Ｒ）、 ｔｈｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｏｆ Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ， Ｉｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｉｎ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ｒｏｏｔ Ｃｏｒｋ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １６４， １２２２－１２３６ （２０１４）．
４． Ｎ． Ｌ． Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｔｅｒｐｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ ｈａｒｂｏｒｓ ａ ｌａｂｄａｎｅ－ｔｙｐｅ ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＴＰＳ－ｂ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ８９， ４２９－４４１ （２０１７）．
５． Ｈ． Ｈ． Ｎｏｕｒ－Ｅｌｄｉｎ， Ｂ． Ｇ． Ｈａｎｓｅｎ， Ｍ． Ｈ． Ｈ． Ｎｏｒｈｏｌｍ， Ｊ． Ｋ． Ｊｅｎｓｅｎ， ｂ． Ａ． Ｈａｌｋｉｅｒ， Ａｄｖａｎｃｉｎｇ ｕｒａｃｉｌ－ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏｗａｒｄｓ ａｎ ｉｄｅａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４， ｅ１２２ （２００６）.
６． Ｎ． Ｂ． Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＥａｓｙＣｌｏｎｅ： ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４， ２３８－２４８ （２０１４）．
７． Ｍ． Ｈ． Ｈ． Ｎｏｒｈｏｌｍ， Ａ ｍｕｔａｎｔ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｕｒａｃｉｌ－ｅｘｃｉｓｉｏｎ ＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ２１ （２０１０）．
８． Ｒ． Ｄ． Ｇｉｅｔｚ， Ｒ． Ｈ． Ｓｃｈｉｅｓｔｌ， Ｈｉｇｈ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＬｉＡｃ／ＳＳ ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ／ＰＥＧ ｍｅｔｈｏｄ． Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２， ３１－３４ （２００７）．
９． Ｈａｎｓｅｎ， Ｎ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｙｅａｓｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｐｏｌｐｕｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｔｈｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｏＤｅｓｉｔｙ ａｇｅｎｔ ｃｅｌａｓｔｒｏｌ． ＭｉｃｒｏＤ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ， ２０２０． １９（１）： ｐ． １５．
１０． Ｖｏｉｎｎｅｔ Ｏ， Ｒｉｖａｓ Ｓ， Ｍｅｓｔｒｅ Ｐ， Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ Ｄ． Ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ ｐ１９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ （ｒｅｔｒａｃｔｅｄ ｉｎ： Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２０１５ Ｎｏｖ；８４（４）：８４６）． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２００３；３３（５）：９４９－９５６． ｄｏｉ：１０．１０４６／ｊ．１３６５－３１３ｘ。２００３．０１６７６．ｘ
項目
１．酸素化ジテルペノイド化合物を生成できる、組換え宿主細胞であって、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成でき、シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一の遺伝子で形質転換されており、この酵素が、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンに変換できる、組換え宿主細胞。
２．第一の遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４Ｖ１）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする、項目１の組換え宿主細胞。
３．さらに、
シトクロムＰ４５０活性を有する第二の酵素をコードする第二の遺伝子と、シトクロムＰ４５０活性を有する第三の酵素をコードする第三の遺伝子、
を含み、ここで
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第二の遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードし、
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第三の遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする、
項目１または２の組換え宿主細胞。
４．シトクロムＢ５活性を有しかつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＴｗＢ５＃１）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、項目３の組換え宿主細胞。
５．シトクロムＰ４５０活性を有する第四の酵素をコードする第四の遺伝子をさらに含み、ここで
シトクロムＰ４５０活性を有する第四の酵素をコードする第四の遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする、
項目３または４の組換え宿主細胞。
６．シトクロムＰ４５０活性を有する第五の酵素をコードする第五の遺伝子および／またはシトクロムＰ４５０活性を有する第六の酵素をコードする第六の遺伝子をさらに含み、ここで
シトクロムＰ４５０活性を有する第五の酵素をコードする第五の遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードし；
シトクロムＰ４５０活性を有する第六の酵素をコードする第六の遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７５）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする、
項目５の組換え宿主細胞。
７．ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成できる宿主細胞が、
ａ．ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ；
ｂ．ＧＧＰＰをミルチラジエンに変換できるジテルペンシンターゼ；
ｃ．組み合わせでＧＧＰＰをミルチラジエンに変換できる２種以上のジテルペンシンターゼの組み合わせ；または
ｄ．コパリル二リン酸シンターゼおよびミルチラジエンシンターゼ、
をコードする１種または複数の遺伝子（複数可）で形質転換された組換え細胞である、上記項目のいずれかによる組換え宿主細胞。
８．ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１を含むポリペプチドである、項目７の組換え宿主細胞。
９．ＧＧＰＰをミルチラジエンに変換できる２種以上のジテルペンシンターゼの組み合わせが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、の組合わせである、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０のアミノ酸配列を含むポリペプチドの組み合わせである、項目７の組換え宿主細胞。
１０．コパリル二リン酸シンターゼとミルチラジエンシンターゼとの組み合わせが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１のアミノ酸配列を含むポリペプチドとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２のポリペプチドを含むポリペプチドの組合わせである、項目７の組換え宿主細胞。
１１．原核細胞および真核細胞から選択される、上記項目のいずれかによる組換え宿主細胞。
１２．エシェリヒア、バチルス、ラクトバチルスおよびコリネバクテリウムの種から選択される原核細胞である、項目１１による組換え宿主細胞。
１３．サッカロマイセス、シゾサッカロマイセス、クルイベロマイセス、ピキア、カンジダおよびヤロウイアの種から選択される真核細胞である、項目１１の組換え宿主細胞。
１４．Ｓ．セレビシエ細胞である、項目１１の組換え宿主細胞。
１５．酸素化ジテルペノイド化合物の生成のための上記項目のいずれかによる組換え宿主細胞の使用。
１６．酸素化ジテルペノイド化合物が、１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエン、トリプトフェノリドおよびトリプトニドから選択される、項目１５の使用。
１７．酸素化ジテルペノイド化合物が、トリプトニドであり、このトリプトニドが、トリプトリドにさらに変換される、項目１６の使用。
１８．酸素化ジテルペノイド化合物が、１種または複数の分離および／またはクロマトグラフィーステップを利用して回収される、項目１５～１７の１つによる使用。
１９．シトクロムＰ４５０酵素活性を有しかつ配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の１つに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチド。
２０．項目１９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
２１．項目２０のポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、発現構築物または組換え宿主細胞。
２２．化合物１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエン。
【表5】
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【表15】
【表16】
【表17】
【表18】
【表19】
【表20】
【表21】
参考資料
１． Ｊ． Ａｎｄｅｒｓｅｎ－Ｒａｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ Ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｎ／ａ （２０１６）．
２． Ｉ． Ｐａｔｅｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｏｔａｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｂｏｏｓｔｅｒ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ ｆｒｏｍ Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ． Ｅｌｉｆｅ ６， ｅ２３００１ （２０１７）．
３． Ｉ． Ｐａｔｅｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｎｏｙｌ Ｏｘｉｄｅ （１３Ｒ）、 ｔｈｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｏｆ Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ， Ｉｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｉｎ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ｒｏｏｔ Ｃｏｒｋ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １６４， １２２２－１２３６ （２０１４）．
４． Ｎ． Ｌ． Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｔｅｒｐｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ ｈａｒｂｏｒｓ ａ ｌａｂｄａｎｅ－ｔｙｐｅ ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＴＰＳ－ｂ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ８９， ４２９－４４１ （２０１７）．
５． Ｈ． Ｈ． Ｎｏｕｒ－Ｅｌｄｉｎ， Ｂ． Ｇ． Ｈａｎｓｅｎ， Ｍ． Ｈ． Ｈ． Ｎｏｒｈｏｌｍ， Ｊ． Ｋ． Ｊｅｎｓｅｎ， ｂ． Ａ． Ｈａｌｋｉｅｒ， Ａｄｖａｎｃｉｎｇ ｕｒａｃｉｌ－ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏｗａｒｄｓ ａｎ ｉｄｅａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４， ｅ１２２ （２００６）.
６． Ｎ． Ｂ． Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＥａｓｙＣｌｏｎｅ： ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４， ２３８－２４８ （２０１４）．
７． Ｍ． Ｈ． Ｈ． Ｎｏｒｈｏｌｍ， Ａ ｍｕｔａｎｔ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｕｒａｃｉｌ－ｅｘｃｉｓｉｏｎ ＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ２１ （２０１０）．
８． Ｒ． Ｄ． Ｇｉｅｔｚ， Ｒ． Ｈ． Ｓｃｈｉｅｓｔｌ， Ｈｉｇｈ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＬｉＡｃ／ＳＳ ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ／ＰＥＧ ｍｅｔｈｏｄ． Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２， ３１－３４ （２００７）．
９． Ｈａｎｓｅｎ， Ｎ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｙｅａｓｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｐｏｌｐｕｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｔｈｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｏＤｅｓｉｔｙ ａｇｅｎｔ ｃｅｌａｓｔｒｏｌ． ＭｉｃｒｏＤ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ， ２０２０． １９（１）： ｐ． １５．
１０． Ｖｏｉｎｎｅｔ Ｏ， Ｒｉｖａｓ Ｓ， Ｍｅｓｔｒｅ Ｐ， Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ Ｄ． Ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ ｐ１９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ （ｒｅｔｒａｃｔｅｄ ｉｎ： Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２０１５ Ｎｏｖ；８４（４）：８４６）． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２００３；３３（５）：９４９－９５６． ｄｏｉ：１０．１０４６／ｊ．１３６５－３１３ｘ。２００３．０１６７６．ｘ
項目
１．酸素化ジテルペノイド化合物を生成できる、組換え宿主細胞であって、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成でき、シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第一の遺伝子で形質転換されており、この酵素が、ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエンに変換できる、組換え宿主細胞。
２．第一の遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７４Ｖ１）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする、項目１の組換え宿主細胞。
３．さらに、
シトクロムＰ４５０活性を有する第二の酵素をコードする第二の遺伝子と、シトクロムＰ４５０活性を有する第三の酵素をコードする第三の遺伝子、
を含み、ここで
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第二の遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８６）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードし、
シトクロムＰ４５０活性を有する酵素をコードする第三の遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（ＴｗＣＹＰ７１ＢＥ８５）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする、
項目１または２の組換え宿主細胞。
４．シトクロムＢ５活性を有しかつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＴｗＢ５＃１）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、項目３の組換え宿主細胞。
５．シトクロムＰ４５０活性を有する第四の酵素をコードする第四の遺伝子をさらに含み、ここで
シトクロムＰ４５０活性を有する第四の酵素をコードする第四の遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１３）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする、
項目３または４の組換え宿主細胞。
６．シトクロムＰ４５０活性を有する第五の酵素をコードする第五の遺伝子および／またはシトクロムＰ４５０活性を有する第六の酵素をコードする第六の遺伝子をさらに含み、ここで
シトクロムＰ４５０活性を有する第五の酵素をコードする第五の遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードし；
シトクロムＰ４５０活性を有する第六の酵素をコードする第六の遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ＴｗＣＹＰ８２Ｄ２７５）に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチドをコードする、
項目５の組換え宿主細胞。
７．ミルチラジエンおよび／またはデヒドロアビエタジエンを生成できる宿主細胞が、
ａ．ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ；
ｂ．ＧＧＰＰをミルチラジエンに変換できるジテルペンシンターゼ；
ｃ．組み合わせでＧＧＰＰをミルチラジエンに変換できる２種以上のジテルペンシンターゼの組み合わせ；または
ｄ．コパリル二リン酸シンターゼおよびミルチラジエンシンターゼ、
をコードする１種または複数の遺伝子（複数可）で形質転換された組換え細胞である、上記項目のいずれかによる組換え宿主細胞。
８．ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１を含むポリペプチドである、項目７の組換え宿主細胞。
９．ＧＧＰＰをミルチラジエンに変換できる２種以上のジテルペンシンターゼの組み合わせが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、の組合わせである、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０のアミノ酸配列を含むポリペプチドの組み合わせである、項目７の組換え宿主細胞。
１０．コパリル二リン酸シンターゼとミルチラジエンシンターゼとの組み合わせが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１のアミノ酸配列を含むポリペプチドとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２のポリペプチドを含むポリペプチドの組合わせである、項目７の組換え宿主細胞。
１１．原核細胞および真核細胞から選択される、上記項目のいずれかによる組換え宿主細胞。
１２．エシェリヒア、バチルス、ラクトバチルスおよびコリネバクテリウムの種から選択される原核細胞である、項目１１による組換え宿主細胞。
１３．サッカロマイセス、シゾサッカロマイセス、クルイベロマイセス、ピキア、カンジダおよびヤロウイアの種から選択される真核細胞である、項目１１の組換え宿主細胞。
１４．Ｓ．セレビシエ細胞である、項目１１の組換え宿主細胞。
１５．酸素化ジテルペノイド化合物の生成のための上記項目のいずれかによる組換え宿主細胞の使用。
１６．酸素化ジテルペノイド化合物が、１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエン、トリプトフェノリドおよびトリプトニドから選択される、項目１５の使用。
１７．酸素化ジテルペノイド化合物が、トリプトニドであり、このトリプトニドが、トリプトリドにさらに変換される、項目１６の使用。
１８．酸素化ジテルペノイド化合物が、１種または複数の分離および／またはクロマトグラフィーステップを利用して回収される、項目１５～１７の１つによる使用。
１９．シトクロムＰ４５０酵素活性を有しかつ配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の１つに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその成熟ポリペプチド。
２０．項目１９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
２１．項目２０のポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、発現構築物または組換え宿主細胞。
２２．化合物１４－ＯＨ－デヒドロアビエタジエン。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【手続補正書】
【提出日】2023-04-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】