特表 2023-539107 アクチビンＡアンタゴニストによる心機能障害及びＣＯＶＩＤ－１９の予防及び治療方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-13

(54)【発明の名称】アクチビンＡアンタゴニストによる心機能障害及びＣＯＶＩＤ－１９の予防及び治療方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20230906BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20230906BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20230906BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230906BHJP

   C07K 16/24 20060101ALN20230906BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230906BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P9/04

A61P9/00

A61K39/395 D

A61K39/395 N

C07K16/24 ZNA

C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023512094

(86)(22)【出願日】2021-08-19

(85)【翻訳文提出日】2023-03-20

(86)【国際出願番号】 US2021046765

(87)【国際公開番号】W WO2022040461

(87)【国際公開日】2022-02-24

(31)【優先権主張番号】63/068,251

(32)【優先日】2020-08-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/111,394

(32)【優先日】2020-11-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/139,234

(32)【優先日】2021-01-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】デーヴィッド・グラス

(72)【発明者】

【氏名】スコット・マクドネル

(72)【発明者】

【氏名】ジェイク・メグナ

(72)【発明者】

【氏名】ローリ・モートン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA17

4C084NA14

4C084ZB33

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB36

4C085CC23

4H045AA30

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

(57)【要約】

本発明は、心筋症及び心不全を含む心機能障害を予防及び治療するための方法を提供する。本発明の方法は、アクチビンＡのアンタゴニスト、例えば、ヒトアクチビンＡに結合し、その活性を低減又は中和する、治療有効量の抗体の投与を特徴とする。本発明の方法は、ウイルス性疾患、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９を含む、多様な原因による心疾患の予防及び治療において有用である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

心機能障害又は心不全の予防又は治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、アクチビンＡ特異的アンタゴニストを前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項2】

前記アクチビンＡ特異的アンタゴニストが、抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記抗体又はその抗原結合断片が、２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイで測定したとき、約５ｐＭ未満の結合解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）でアクチビンＡに特異的に結合する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記抗体又はその抗原結合断片が、２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイで測定したとき、約４ｐＭ未満のＫ_ＤでアクチビンＡに特異的に結合する、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記抗体又はその抗原結合断片が、約５００ｎＭ未満の結合会合平衡定数（Ｋ_ａ）でアクチビンＡに特異的に結合する、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

前記抗体又はその抗原結合断片が、少なくとも１つのアクチビンＡ受容体のアクチビンＡへの結合を遮断する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記抗体又はその抗原結合断片が、アクチビンＡによる少なくとも１つのアクチビンＡ受容体の活性化を遮断する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記抗体又はその抗原結合断片が、アクチビンＡのアクチビンＩＩ型受容体への結合を顕著に遮断しない、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記抗体又はその抗原結合断片が、２５℃でのインビボ受容体／リガンド結合バイオアッセイにおいて測定したとき、約８０ｐＭ未満のＩＣ_５０値でアクチビンＡのアクチビンＡ受容体への結合を遮断する、請求項６に記載の方法。

【請求項10】

前記抗体又はその抗原結合断片が、２５℃でのインビボ受容体／リガンド結合バイオアッセイにおいて測定したとき、約６０ｐＭ未満のＩＣ_５０値でアクチビンＡのアクチビンＡ受容体への結合を遮断する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記抗体又はその抗原結合断片が、アクチビンＩＩＡ型受容体（ＡｃｔＲＩＩＡ）、アクチビンＩＩＢ型受容体（ＡｃｔＲＩＩＢ）、及びアクチビンＩ型受容体からなる群から選択されるアクチビンＡのアクチビンＡ受容体への結合を阻害する、請求項２に記載の方法。

【請求項12】

前記抗体又はその抗原結合断片が、ＳＭＡＤ複合体シグナル伝達のアクチビンＡ媒介性活性化を阻害する、請求項２に記載の方法。

【請求項13】

前記抗体又は抗原結合断片が、（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１０６、１１４、１２２、１３０、１３８、１５４、１６２、１７０、１７８、１８６、１９４及び２０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１４６及び２１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲと、を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記抗体又は抗原結合断片が、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／９０、１０６／９０、１１４／９０、１２２／９０、１３０／９０、１３８／１４６、１５４／１４６、１６２／１４６、１７０／１４６、１７８／１４６、１８６／１４６、１９４／１４６及び２０２／２１０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記抗体又はその抗原結合断片が、
配列番号４－６－８－１２－１４－１６、２０－２２－２４－２８－３０－３２、３６－３８－４０－４４－４６－４８、５２－５４－５６－６０－６２－６４、６８－７０－７２－７６－７８－８０、８４－８６－８８－９２－９４－９６、１００－１０２－１０４－９２－９４－９６、１０８－１１０－１１２－９２－９４－９６、１１６－１１８－１２０－９２－９４－９６、１２４－１２６－１２８－９２－９４－９６、１３２－１３４－１３６－９２－９４－９６、１４０－１４２－１４４－１４８－１５０－１５２、１５６－１５８－１６０－１４８－１５０－１５２、１６４－１６６－１６８－１４８－１５０－１５２、１７２－１７４－１７６－１４８－１５０－１５２、１８０－１８２－１８４－１４８－１５０－１５２、１８８－１９０－１９２－１４８－１５０－１５２、１９６－１９８－２００－１４８－１５０－１５２及び２０４－２０６－２０８－２１２－２１４－２１６からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記抗体又は抗原結合断片が、（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１０６、１１４、１２２、１３０、１３８、１５４、１６２、１７０、１７８、１８６、１９４及び２０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１４６及び２１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、
を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記抗体又は抗原結合断片が、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／９０、１０６／９０、１１４／９０、１２２／９０、１３０／９０、１３８／１４６、１５４／１４６、１６２／１４６、１７０／１４６、１７８／１４６、１８６／１４６、１９４／１４６及び２０２／２１０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

心機能障害又は心不全の予防又は治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、アクチビンＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を投与することを含み、前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号６８－７０－７２－７６－７８－８０のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む、方法。

【請求項19】

前記抗体又は抗原結合断片が、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

心機能障害又は心不全の予防又は治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、アクチビンＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を投与することを含み、前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１６４－１６６－１６８－１４８－１５０－１５２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む、方法。

【請求項21】

前記抗体又は抗原結合断片が、配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

前記抗体又は抗原結合断片が、ＩｇＧ重鎖定常領域を含むヒト抗体である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記ＩｇＧ重鎖定常領域が、ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記ＩｇＧ重鎖定常領域が、ＩｇＧ４アイソタイプである、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

前記抗体又はその抗原結合断片が、ＧＤＦ８アンタゴニストとの組み合わせで投与される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記ＧＤＦ８アンタゴニストが、ＧＤＦ８阻害融合タンパク質、抗ＧＤＦ８抗体、及び抗ＧＤＦ８抗体の抗原結合断片からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ＧＤＦ８アンタゴニストが、抗ＧＤＦ８抗体又はその抗原結合断片である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記抗ＧＤＦ８抗体又はその抗原結合断片が、配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲと、配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲと、を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記抗ＧＤＦ８抗体又はその抗原結合断片が、配列番号２１８－２１９－２２０－２２２－２２３－２２４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記抗ＧＤＦ８抗体又はその抗原結合断片が、配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記対象が、ウイルス感染を有すると診断されている、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記ウイルス感染が、コロナウイルス感染である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記対象が、重症のＣＯＶＩＤ－１９症状を有する、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記対象が、最重症のＣＯＶＩＤ－１９症状を有する、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

試験により重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染に対して陽性であるとされた対象におけるＣＯＶＩＤ－１９を治療する方法であって、アクチビンＡ特異的アンタゴニストを前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項37】

前記アクチビンＡ特異的アンタゴニストが、抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片である、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記抗体又は抗原結合断片が、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／９０、１０６／９０、１１４／９０、１２２／９０、１３０／９０、１３８／１４６、１５４／１４６、１６２／１４６、１７０／１４６、１７８／１４６、１８６／１４６、１９４／１４６及び２０２／２１０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号４－６－８－１２－１４－１６、２０－２２－２４－２８－３０－３２、３６－３８－４０－４４－４６－４８、５２－５４－５６－６０－６２－６４、６８－７０－７２－７６－７８－８０、８４－８６－８８－９２－９４－９６、１００－１０２－１０４－９２－９４－９６、１０８－１１０－１１２－９２－９４－９６、１１６－１１８－１２０－９２－９４－９６、１２４－１２６－１２８－９２－９４－９６、１３２－１３４－１３６－９２－９４－９６、１４０－１４２－１４４－１４８－１５０－１５２、１５６－１５８－１６０－１４８－１５０－１５２、１６４－１６６－１６８－１４８－１５０－１５２、１７２－１７４－１７６－１４８－１５０－１５２、１８０－１８２－１８４－１４８－１５０－１５２、１８８－１９０－１９２－１４８－１５０－１５２、１９６－１９８－２００－１４８－１５０－１５２及び２０４－２０６－２０８－２１２－２１４－２１６からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記抗体又は抗原結合断片が、（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１０６、１１４、１２２、１３０、１３８、１５４、１６２、１７０、１７８、１８６、１９４及び２０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１４６及び２１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記抗体又は抗原結合断片が、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／９０、１０６／９０、１１４／９０、１２２／９０、１３０／９０、１３８／１４６、１５４／１４６、１６２／１４６、１７０／１４６、１７８／１４６、１８６／１４６、１９４／１４６及び２０２／２１０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号６８－７０－７２－７６－７８－８０のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項43】

前記抗体又は抗原結合断片が、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１６４－１６６－１６８－１４８－１５０－１５２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項45】

前記抗体又は抗原結合断片が、配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記抗体又は抗原結合断片が、ＩｇＧ重鎖定常領域を含むヒト抗体である、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記ＩｇＧ重鎖定常領域が、ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記ＩｇＧ重鎖定常領域が、ＩｇＧ４アイソタイプである、請求項４６に記載の方法。

【請求項49】

前記対象が、酸素補給の投与を必要とする重症のＣＯＶＩＤ－１９症状を有する、請求項３６～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記対象が、人工呼吸器又は集中治療室での治療を必要とする最重症のＣＯＶＩＤ－１９症状を有する、請求項３６～４８のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（配列表の参照）
本出願は、２０２１年８月１９日に作成され、８７，３８３バイトを含むファイル１０７７１ＷＯ０１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を、参照により組み込む。

【0002】

（発明の分野）
本発明は、医薬の分野に属し、抗アクチビンＡ抗体及びその抗原結合断片、又はかかる抗体若しくは抗原結合断片とミオスタチン阻害剤との組み合わせを含むアクチビンＡアンタゴニストにより、心機能障害を予防及び治療するための方法及び医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0003】

アクチビンは、トランスフォーミング増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーに属し、細胞の増殖、分化、及びアポトーシスに対して広範囲な生物学的効果を発揮する。アクチビンは、インヒビンβＡ、インヒビンβＢ、インヒビンβＣ及びインヒビンβＥのホモ二量体又はヘテロ二量体であり、これらの異なる組み合わせがアクチビンタンパク質群の様々なメンバーを作り出す。例えば、アクチビンＡは、インヒビンβＡのホモ二量体であり、アクチビンＢは、インヒビンβＢのホモ二量体である一方で、アクチビンＡＢは、インヒビンβＡとインヒビンβＢのヘテロ二量体であり、アクチビンＡＣは、インヒビンβＡとインヒビンβＣのヘテロ二量体である（Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ Ｓｉｇｎａｌ ７：１５ （２００９））。

【0004】

アクチビンＡは、アクチビンＩＩ型受容体として知られる（ＩＩＡ型及びＩＩＢ型、それぞれＡｃｔＲＩＩＡ及びＡｃｔＲＩＩＢとしても知られる）、細胞表面上の受容体複合体に結合し、活性化する。これらの受容体の活性化は、アクチビンＩ型受容体（例えば、Ａｌｋ４又は７）のリン酸化をもたらし、これは次に、ＳＭＡＤ２及び３タンパク質のリン酸化、（ＳＭＡＤ４との）ＳＭＡＤ複合体の形成、並びにＳＭＡＤ複合体の細胞核内への移行をもたらし、そこでは、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３は、様々な遺伝子の転写を調節するよう機能する（Ｓｏｚｚａｎｉ，Ｓ．ａｎｄ Ｍｕｓｓｏ，Ｔ．，Ｂｌｏｏｄ １１７（１９）：５０１３－５０１５ （２０１１））。

【0005】

ＡｃｔＲＩＩＢに結合して活性化するアクチビンＡ又は他のリガンド（ＧＤＦ８（ミオスタチン）、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、インヒビンＡ、インヒビンＢ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、及びＢＭＰ１０を含む）は、老化及び疾患における筋肉消耗、並びに肺及び心臓の症状を含む、様々な症状と関連している。例えば、マウス気道におけるアクチビンＡの過剰発現は、急性肺障害及び急性呼吸窮迫症候群のような肺病態に関与することが示唆されており、それはヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したアクチビンＩＩ型受容体ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外部分から構成される融合タンパク質によるアクチビンＡの中和を介して減弱される（Ａｐｏｓｔｏｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１８５（４）：３８２－３９１）。同様に、アクチビンＩＩ型受容体（ＡｃｔＲＩＩ）リガンドは、心臓の老化及び心不全に関与することが示唆されている。ＡｃｔＲＩＩＡ及びＡｃｔＲＩＩＢを遮断する抗体（ＣＤＤ８６６）、又は循環ＡｃｔＲＩＩリガンドに結合することによって経路活性化を遮断するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質（ＲＡＰ－０３１）によるＡｃｔＲＩＩ経路の阻害は、心臓機能を回復又は保存しながら、心臓ＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を減少させている（Ｒｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ，１１，ｅａａｕ８６８０，２０１９）。

【0006】

複数のＡｃｔＲＩＩリガンドに結合するか、又は広義にＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を阻害する薬剤は、ヒト患者に投与された場合、様々な有害作用を引き起こすことが知られている。多くのＡｃｔＲＩＩリガンドの明確な役割は、未だ完全に解明されておらず、臨床的利益を提供することができるＡｃｔＲＩＩリガンドの特異的阻害剤が必要とされている。

【発明の概要】

【0007】

一態様では、本発明は、心機能障害又は心不全の予防又は治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、アクチビンＡ特異的アンタゴニストを対象に投与することを含む方法を提供する。

【0008】

いくつかの実施形態では、アクチビンＡ特異的アンタゴニストは、抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの場合では、抗体又はその抗原結合断片は、２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイで測定したとき、約５ｐＭ未満の結合解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）でアクチビンＡに特異的に結合する。いくつかの場合では、抗体又はその抗原結合断片は、２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイで測定したとき、約４ｐＭ未満のＫ_ＤでアクチビンＡに特異的に結合する。いくつかの場合では、抗体又はその抗原結合断片は、約５００ｎＭ未満の結合会合平衡定数（Ｋ_α）でアクチビンＡに特異的に結合する。

【0009】

いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも１つのアクチビンＡ受容体のアクチビンＡとの結合を遮断する。いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、アクチビンＡによる少なくとも１つのアクチビンＡ受容体の活性化を遮断する。いくつかの場合では、抗体又はその抗原結合断片は、アクチビンＡのアクチビンＩＩ型受容体への結合を有意に遮断しない。いくつかの場合では、抗体又はその抗原結合断片は、２５℃でのインビボ受容体／リガンド結合バイオアッセイにおいて測定したとき、約８０ｐＭ未満のＩＣ_５０値でアクチビンＡのアクチビンＡ受容体への結合を遮断する。いくつかの場合では、抗体又はその抗原結合断片は、２５℃でのインビボ受容体／リガンド結合バイオアッセイにおいて測定したとき、約６０ｐＭ未満のＩＣ_５０値でアクチビンＡのアクチビンＡ受容体への結合を遮断する。

【0010】

いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、アクチビンＩＩＡ型受容体（ＡｃｔＲＩＩＡ）、アクチビンＩＩＢ型受容体（ＡｃｔＲＩＩＢ）、及びアクチビンＩ型受容体からなる群から選択されるアクチビンＡのアクチビンＡ受容体への結合を阻害する。いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＳＭＡＤ複合体シグナル伝達のアクチビンＡ媒介性活性化を阻害する。

【0011】

様々な実施形態のいずれかでは、抗体又は抗原結合断片は、（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１０６、１１４、１２２、１３０、１３８、１５４、１６２、１７０、１７８、１８６、１９４及び２０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）と、（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１４６及び２１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（light chain variable region、ＬＣＶＲ）のＣＤＲと、を含む。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／９０、１０６／９０、１１４／９０、１２２／９０、１３０／９０、１３８／１４６、１５４／１４６、１６２／１４６、１７０／１４６、１７８／１４６、１８６／１４６、１９４／１４６及び２０２／２１０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む：配列番号４－６－８－１２－１４－１６、２０－２２－２４－２８－３０－３２、３６－３８－４０－４４－４６－４８、５２－５４－５６－６０－６２－６４、６８－７０－７２－７６－７８－８０、８４－８６－８８－９２－９４－９６、１００－１０２－１０４－９２－９４－９６、１０８－１１０－１１２－９２－９４－９６、１１６－１１８－１２０－９２－９４－９６、１２４－１２６－１２８－９２－９４－９６、１３２－１３４－１３６－９２－９４－９６、１４０－１４２－１４４－１４８－１５０－１５２、１５６－１５８－１６０－１４８－１５０－１５２、１６４－１６６－１６８－１４８－１５０－１５２、１７２－１７４－１７６－１４８－１５０－１５２、１８０－１８２－１８４－１４８－１５０－１５２、１８８－１９０－１９２－１４８－１５０－１５２、１９６－１９８－２００－１４８－１５０－１５２及び２０４－２０６－２０８－２１２－２１４－２１６。

【0012】

様々な実施形態のいずれかでは、抗体又は抗原結合断片は、（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１０６、１１４、１２２、１３０、１３８、１５４、１６２、１７０、１７８、１８６、１９４及び２０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１４６及び２１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／９０、１０６／９０、１１４／９０、１２２／９０、１３０／９０、１３８／１４６、１５４／１４６、１６２／１４６、１７０／１４６、１７８／１４６、１８６／１４６、１９４／１４６及び２０２／２１０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。

【0013】

一態様では、本発明は、心機能障害又は心不全の予防又は治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、アクチビンＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を投与することを含み、抗体又はその抗原結合断片が、配列番号６８、７０、７２、７６、７８、８０のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む。

【0014】

一態様では、本発明は、心機能障害又は心不全の予防又は治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、アクチビンＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を投与することを含み、抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１６４－１６６－１６８－１４８－１５０－１５２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む。

【0015】

様々な実施形態のいずれかでは、抗体又は抗原結合断片は、ＩｇＧ重鎖定常領域を含むヒト抗体であり得る。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ４アイソタイプのものである。

【0016】

様々な実施形態のいずれかでは、本方法は、ＧＤＦ８アンタゴニストと組み合わせた抗体又は抗原結合性断片の投与を更に含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ８アンタゴニストは、ＧＤＦ８阻害融合タンパク質、抗ＧＤＦ８抗体、及び抗ＧＤＦ８抗体の抗原結合断片からなる群から選択される。いくつかの場合では、ＧＤＦ８アンタゴニストは、抗ＧＤＦ８抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体は、配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲと、配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲと、を含む。いくつかの場合では、抗ＧＤＦ８抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２１８－２１９－２２０－２２２－２２３－２２４のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む。

【0017】

上記又は本明細書において考察される様々な実施形態のいずれかでは、対象は、ウイルス感染を有すると診断されている。いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、コロナウイルスへの感染である。いくつかの場合では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。いくつかの場合では、対象は、重症の（severe）ＣＯＶＩＤ－１９症状を有する。いくつかの場合では、対象は、最重症の（critical）ＣＯＶＩＤ－１９症状を有する。

【0018】

別の態様では、本発明は、心機能障害又は心不全の予防又は治療を、それを必要とする対象において行うための、アクチビンＡ特異的アンタゴニスト（例えば、上記又は本明細書で考察される組換えヒト抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片）と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

【0019】

別の態様では、本発明は、心機能障害又は心不全の予防又は治療を、それを必要とする対象において行う方法において使用するための、アクチビンＡ特異的アンタゴニスト（例えば、上記又は本明細書において考察されるような抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片）を提供する。

【0020】

別の態様では、本発明は、試験により重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染に対して陽性であるとされた対象において、ＣＯＶＩＤ－１９を治療する方法であって、アクチビンＡ特異的アンタゴニストを対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、アクチビンＡ特異的アンタゴニストは、抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片である。

【0021】

いくつかの場合では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／９０、１０６／９０、１１４／９０、１２２／９０、１３０／９０、１３８／１４６、１５４／１４６、１６２／１４６、１７０／１４６、１７８／１４６、１８６／１４６、１９４／１４６及び２０２／２１０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの場合では、抗体又はその抗原結合断片は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む：配列番号４－６－８－１２－１４－１６、２０－２２－２４－２８－３０－３２、３６－３８－４０－４４－４６－４８、５２－５４－５６－６０－６２－６４、６８－７０－７２－７６－７８－８０、８４－８６－８８－９２－９４－９６、１００－１０２－１０４－９２－９４－９６、１０８－１１０－１１２－９２－９４－９６、１１６－１１８－１２０－９２－９４－９６、１２４－１２６－１２８－９２－９４－９６、１３２－１３４－１３６－９２－９４－９６、１４０－１４２－１４４－１４８－１５０－１５２、１５６－１５８－１６０－１４８－１５０－１５２、１６４－１６６－１６８－１４８－１５０－１５２、１７２－１７４－１７６－１４８－１５０－１５２、１８０－１８２－１８４－１４８－１５０－１５２、１８８－１９０－１９２－１４８－１５０－１５２、１９６－１９８－２００－１４８－１５０－１５２、及び２０４－２０６－２０８－２１２－２１４－２１６。いくつかの場合では、抗体又は抗原結合断片は、（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１０６、１１４、１２２、１３０、１３８、１５４、１６２、１７０、１７８、１８６、１９４及び２０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１４６及び２１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む。いくつかの場合では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／９０、１０６／９０、１１４／９０、１２２／９０、１３０／９０、１３８／１４６、１５４／１４６、１６２／１４６、１７０／１４６、１７８／１４６、１８６／１４６、１９４／１４６及び２０２／２１０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。いくつかの場合では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６８－７０－７２－７６－７８－８０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む。いくつかの場合では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む。いくつかの場合では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１６４－１６６－１６８－１４８－１５０－１５２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む。いくつかの場合では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＩｇＧ重鎖定常領域を含むヒト抗体である。いくつかの場合では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。いくつかの場合では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ４アイソタイプのものである。

【0023】

いくつかの実施形態では、対象は、酸素補給の投与を必要とする重症のＣＯＶＩＤ－１９症状を有する。いくつかの実施形態では、対象は、人工呼吸器又は集中治療室での治療を必要とする最重症のＣＯＶＩＤ－１９症状を有する。

【0024】

別の態様では、本発明は、心機能障害又は心不全の予防若しくは治療を、それを必要とする対象において行うための、又はＣＯＶＩＤ－１９患者を治療するための医薬の製造における、アクチビンＡ特異的アンタゴニスト（例えば、上記又は本明細書において考察されるような抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合性断片）の使用を提供する。

【0025】

様々な実施形態では、上記又は本明細書で考察される実施形態の特徴又は構成要素のうちのいずれも組み合わされ得、かかる組み合わせは本開示の範囲内に包含される。上記又は本明細書で考察されるいずれの特定の値も、上記又は本明細書で考察される別の関連値と組み合わせられて、それらの値が範囲の上限及び下限を表す範囲を列挙することができ、かかる範囲は本開示の範囲内に包含される。

【0026】

他の実施形態は、後述の発明を実施するための形態の精査から明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1A】アクチビンＡによる単回処理（図１Ａ）後の、培養液中のヒト人工多能性幹細胞のインピーダンス振幅に対するアクチビンＡの負の効果を示すグラフである。

【図1B】アクチビンＡによる複数回処理（図１Ｂ）後の、培養液中のヒト人工多能性幹細胞のインピーダンス振幅に対するアクチビンＡの負の効果を示すグラフである。

【図2】ヒト人工多能性幹細胞におけるアクチビンＡ媒介性の心機能障害の予防に対する抗アクチビンＡ抗体（ｍＡｂ１）の正の効果を示すグラフである。

【図3】対照と比較した、ＣＯＶＩＤ－１９患者由来の血清試料中の、アクチビンＡ、フォリスタチン関連遺伝子（follistatin-related gene、ＦＬＲＧ）及びプラスミノゲン活性化因子阻害剤－１（plasminogen activator inhibitor-1、ＰＡＩ－１）の相対的増加を示す一連のグラフである。

【図4】ＣＯＶＩＤ－１９患者における疾患重篤度とアクチビンＡ及びＦＬＲＧの血清中レベルとの間の相関関係を示す一連のグラフである。

【図5】健康な年齢適合対照と比較した、様々な年齢のＣＯＶＩＤ－１９患者群の血清試料中のアクチビンＡ及びＦＬＲＧの相対レベルを示す一連のグラフである。

【図6】ＣＯＶＩＤ－１９患者における疾患重篤度とＰＡＩ－１の血清中レベルとの間の相関を示すグラフである。

【図7】男性（左パネル）及び女性（右パネル）のＣＯＶＩＤ－１９患者における疾患重篤度とＰＡＩ－１の血清中レベルとの間の相関を示す一連のグラフである。

【図8】健康な年齢適合対照と比較した、様々な年齢のＣＯＶＩＤ－１９患者群の血清試料中のＰＡＩ－１の相対レベルを示すグラフである。

【図9】コルチコステロイドによる処置が、重症又は最重症のＣＯＶＩＤ－１９症状を有する患者におけるアクチビンＡ及びＦＬＲＧの血清中レベルに有意に影響を及ぼさなかったことを示す一連のグラフである。

【図10】アクチビンＡで処理したＩＰＳＣ－心筋細胞における、心臓ストレスの遺伝子マーカー（ＮＰＰＡ－心房性ナトリウム利尿ペプチド、及びＮＰＰＢ－Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド）及びアクチビンＡシグナル伝達遺伝子（ＦＬＲＧとしても知られるＦＳＴＬ３－フォリスタチン様３タンパク質、及びＰＡＩ－１としても知られるセルピン１）の活性化を示す一連のグラフである。

【図11】ＩＫＫ／ＮＦ_ＫＢ経路がＩＬ１β及びＴＮＦαによるアクチビンＡ誘導に主に関与することを示すグラフである。

【図12】アクチビンＡに曝露されたヒト人工多能性幹細胞由来（inducible pluripotent stem cell、ＩＰＳＣ）心筋細胞における、ＳＭＡＤ２／３リン酸化の増加、及び阻害性抗アクチビンＡ抗体（ｍＡｂ２）によるこのＳＭＡＤ２／３リン酸化の増加の遮断を示すウェスタンブロット及びグラフである。対照ｍＡｂは、無関係な非ヒト抗原に結合する抗体である。

【図13A】アクチビンＡに慢性的に曝露された心筋細胞における活動電位の延長、電場電位振幅の減少、及び電場電位下降速度の減少、並びに阻害性抗アクチビンＡ抗体（ｍＡｂ１）の存在下でのこれらの効果の防止を示すグラフである。

【図13B】アクチビンＡに慢性的に曝露された心筋細胞における活動電位の延長、電場電位振幅の減少、及び電場電位下降速度の減少、並びに阻害性抗アクチビンＡ抗体（ｍＡｂ１）の存在下でのこれらの効果の防止を示すグラフである。

【図14A】アクチビンＡに慢性的に曝露された心筋細胞におけるカルシウム流動ピーク振幅の減少、カルシウム流動下降時間の増加、及びカルシウム流動上昇時間の増加、並びに阻害性抗アクチビンＡ抗体（ｍＡｂ１）の存在下でのこれらの効果の防止を示すグラフである。

【図14B】アクチビンＡに慢性的に曝露された心筋細胞におけるカルシウム流動ピーク振幅の減少、カルシウム流動下降時間の増加、及びカルシウム流動上昇時間の増加、並びに阻害性抗アクチビンＡ抗体（ｍＡｂ１）の存在下でのこれらの効果の防止を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本発明が記載される前に、記載される特定の方法及び実験条件が異なり得るため、本発明がかかる方法及び条件に限定されないことを、理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するようには意図されていないことも、理解されたい。

【0029】

別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現は、９９及び１０１並びにそれらの間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。

【0030】

本明細書に記載されるものと同様又は同等のいずれの方法及び材料も本発明の実施又は試験に使用され得るが、好ましい方法及び材料をこれから説明する。本明細書において言及される全ての特許、出願及び非特許刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0031】

心機能障害及び心不全を予防及び治療する方法
本発明は、心機能障害及び心不全を予防及び治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、心不全又は１つ以上の心不全の合併症を治療する、予防する、及びその重篤度若しくは進行を低減するための方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、収縮性及び電気的特性を含むヒト心筋細胞機能を改善するための方法を提供する。

【0032】

本明細書で考察されるように、アクチビンＡ特異的アンタゴニスト（例えば、抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片）は、心機能障害及び心不全の様々な編集物の治療及び予防に対して驚くべき効果を提供することが見出された。例えば、抗アクチビンＡ抗体は、横断大動脈狭窄（transverse aortic constriction、ＴＡＣ）心不全モデルにおいて、心肥大、心臓リモデリング、及び心臓線維症の重篤度を予防又は低減するため、並びに心機能を改善するために使用することができる。加えて、アクチビンＡ特異的アンタゴニストによる治療は、心不全患者の生存時間を増加させることができる。したがって、本開示は、一部において、心不全を治療する、予防する、又はその重篤度を低減するために、特に、心不全の１つ以上の合併症（例えば、心肥大、心臓リモデリング、及び心線維症）を治療する、予防する、又はその重篤度を低減するために、並びに、心機能を改善し、心不全患者の生存時間を増加させるために、アクチビンＡ特異的アンタゴニスト（例えば、抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片）を単独で、又は１つ以上の追加の支持療法及び／若しくは追加の活性薬剤と組み合わせて、使用する方法を提供する。

【0033】

本明細書で使用される場合、障害又は症状を「予防する」治療薬は、統計的試料において、未処理の対照試料に対して、処理された試料における障害若しくは症状の発生を低減するか、又は未処理の対照試料に対して、障害若しくは症状の発症を遅延させる化合物を指す。本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、確立されると、状態の回復又は排除を含む。いずれの場合も、予防又は治療は、医師又は他の医療提供者によって提供される診断、及び治療薬の投与の意図された結果において識別され得る。

【0034】

一般に、本開示に記載される疾患又は状態の治療又は予防は、有効量で１つ以上のアクチビンＡ特異的アンタゴニスト（例えば、抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片）を投与することによって達成される。薬剤の有効量は、所望の治療又は予防結果を達成するために必要な投与量及び期間で有効な量を指す。本開示の薬剤の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重などの要因、並びに個体において所望の応答を誘発する薬剤の能力によって異なり得る。予防有効量は、所望の予防結果を達成するために必要な投与量及び期間で有効な量を指す。

【0035】

心不全は、心臓の特定の構造的又は機能的な異常から生じる典型的な症状及び徴候によって定義される臨床的症候群である（ＥＳＣ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ．ＭｃＭｕｒｒａｙ Ｊ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１２，１４（８）：８０３－６９、２０１３ ＡＣＣＦ／ＡＨＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ，Ｙａｎｚｙ Ｃ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０１３，１２８，ｅ２４０－ｅ３２７）。例えば、心臓異常は、血液を充填又は排出する能力を損ない得、及び／又は、正常な充填圧力にもかかわらず、又は増加した充填圧力を犠牲にしてのみ、代謝組織の要求を満たすのに十分な酸素を送達できないことにつながり得る。本明細書中で使用される場合、用語「心不全」は、左心室機能不全に起因する心不全、正常な駆出率を有する心不全、大動脈弁狭窄に起因する心不全、急性心不全、慢性心不全、うっ血性心不全、先天性心不全、代償性心不全、非代償性心不全、拡張期心不全、収縮期心不全、右側心不全、左側心不全、両心室心不全、前方心不全、後方心不全、高出力心不全、低出力心不全を含むがこれらに限定されない、種々の心臓血管症状を包含する。また、心不全には、心筋浮腫などの心臓内の体液蓄積に関連する心臓症状が含まれる。

【0036】

一般に、心不全の臨床症状としては、例えば、呼吸困難（息切れ）、起坐呼吸、発作性夜間呼吸困難、及び倦怠感（運動負荷を制限し得る）、体液貯留（例えば、肺うっ血及び末端浮腫をもたらし得る）、アンギナ、高血圧症、不整脈、心室性不整脈、心筋障害、心臓肥大、心臓喘息、夜間頻尿、喘息、うっ血性肝障害、凝固障害、腎血流低下、腎機能不全、心筋梗塞、及び卒中が挙げられる。

【0037】

語句「うっ血性心不全」は、上に列挙したタイプを含む全てのタイプの心不全を説明するために使用されることが多いが、うっ血性心不全は、肺における肺うっ血又は体液蓄積に関連する心不全の症状をより正確に説明するものである。このうっ血は、一般的には、収縮期及び左側心不全の症状である。肺系の効率が低下するにつれて、心臓の入力側付近の血液量の増加は、肺胞動脈界面、すなわち肺毛細血管と肺の肺胞腔との間の界面における圧力を変化させる。界面における圧力の変化により、血漿が肺の肺胞腔に押し出される。呼吸困難及び全身疲労は、うっ血性心不全の典型的な知覚される徴候である。

【0038】

心不全を分類するための多くの異なる方法がある。例えば、心不全は、関与する心臓の側（左心不全対右心不全）に基づいて特徴付けられ得る。右心不全は、肺への肺血流を損なう。左心不全は、身体及び脳への大動脈流を損なう。混合プレゼンテーションが一般的であり、左心不全は、しばしば、より長い期間において右心不全をもたらす。心不全はまた、異常が不十分な収縮に起因するものか否か（収縮機能障害、収縮期心不全）、又は心臓の不十分な弛緩によるものか（拡張機能障害、拡張期心不全）、又はそれらの両方である。更に、心不全は、問題が主に増大した静脈背圧（前負荷）であるか、又は適切な動脈灌流を供給できないこと（後負荷）であるかに基づいて分類され得る。心不全は、異常が、高い全身血管抵抗を伴う低心拍出量に起因するのか、又は低い血管抵抗を伴う高い心拍出量に起因するのかに基づいて分類することができる（低心拍出量性心不全対高心拍出量性心不全）。また、心不全は、例えば、心不全／全身性高血圧、心不全／肺高血圧、心不全／糖尿病、及び心不全／腎不全など、併存する疾患の程度に基づいて分類され得る。

【0039】

更に、心不全は、心臓の異常によってもたらされる機能障害の程度に基づいて分類され得る。機能的な分類は、一般に、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）の機能分類に依存する。クラス（Ｉ～ＩＶ）は、クラスＩ：いかなる活動においても制限を受けない、通常の活動においては症状がない、クラスＩＩ：わずかに、若干、活動が制限される、患者が安静時又は軽度の運動時に快適である、クラスＩＩＩ：活動がある程度顕著に制限される、患者が安静時においてのみ快適である、クラスＩＶ：いかなる身体活動も不快感をもたらし、症状が安静時にも生じる。このスコアは、症状の重篤度を記録し、治療に対する応答を評価するために使用することができる。

【0040】

２００１年のガイドラインでは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＣＣ）ワーキンググループは、心不全の４つのステージを紹介している（例えば、Ｈｕｎｔ，Ｓ．，「ＡＣＣ／ＡＨＡ ２００５ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ Ｕｐｄａｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ Ａｄｕｌｔ：Ａ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ （Ｗｒｉｔｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｔｏ Ｕｐｄａｔｅ ｔｈｅ ２００１ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ），」 Ｊ．Ａｍ，Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ，４６：ｅ１－ｅ８２：２００５を参照）。第１のステージであるステージＡは、心不全のリスクが高いが、構造的な心疾患又は心不全症状を有さない対象である（例えば、彼らは、高血圧、アテローム性動脈硬化症、糖尿、肥満、代謝症候群を有する患者、又は心臓毒を使用する患者である）。第２のステージであるステージＢは、構造的な心疾患を有するが、徴候又は心不全症状を有さない対象である（例えば、彼らは、以前に心筋梗塞を有し、肥大及び低駆出率を含む心臓リモデリングを示す患者、並びに無症状の弁膜症を有する患者である）。第３のステージであるステージＣは、以前又は現在の心不全症状を伴う構造的な心疾患を有する対象である（例えば、彼らは、既知の構造的心疾患を有し、息切れ及び倦怠感を示し、運動への耐性が低下している患者である）。第４の最終ステージであるステージＤは、特別な介入を必要とする難治性の心不全である（例えば、最大の薬物療法にもかかわらず安静時に顕著な症状を有する患者、すなわち、再発により入院しているか、又は特別な介入なしに病院から安全に退院することができない患者である）。ＡＣＣステージングシステムは、ステージＡが、「前心不全」、すなわち治療による介入が明白な症状への進行をおそらく予防することができるステージを包含するという点で有用である。ＡＣＣステージＡは、対応するＮＹＨＡクラスを有さない。ＡＣＣステージＢは、ＮＹＨＡクラスＩに対応する。ＡＣＣステージＣはＮＹＨＡクラスＩＩ及びＩＩＩに対応し、一方、ＡＣＣステージＤはＮＹＨＡクラスＩＶと重複する。

【0041】

通常では心不全の臨床徴候に先行する心臓リモデリングは、一般に心臓負荷又は損傷から生じる心臓のサイズ、形状及び機能の変化として臨床的に現れる、分子、細胞及び／又は間質の変化を指す（Ｃｏｈｎ ＪＮ ｅｔ ａｌ．ＪＡＣＣ ２０００．３５（３）：５６９－８２）。心臓リモデリングのトリガーとしては、例えば、心筋梗塞、高血圧、壁ストレス、炎症、圧負荷、及び容量負荷が挙げられる。心筋構造の変化は、損傷の数時間以内に急速に起こり得、数ヶ月及び数年にわたって進行し得る。これらの変化は、最初は有益であるが、時間とともに（数ヶ月から数年で）慢性の難治性の心不全にまで至って心筋機能を損なう可能性がある。心臓リモデリングの顕著な特徴としては、例えば、心室拡張、心室球形度の増加、並びに間質線維症及び血管周囲線維症の発症が挙げられる。増加した球形度は、僧帽弁逆流と明確に相関する。心室拡張は、主に心筋細胞の肥大及び伸長から生じ、また少ない程度ではあるが、心室質量の増加から生じる。

【0042】

いくつかの実施形態では、本開示のアクチビンＡ特異的アンタゴニスト（例えば、抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片）を使用して、心臓リモデリングを治療し、予防し、又はその進行を低減することができる。例えば、アクチビンＡ特異的アンタゴニストは、対象における心臓の心筋構造を維持するか、又は心筋構造の変化を減少させるために使用され得る。心臓リモデリングの進行は、第１の群（治療群）が本発明の方法によって治療され、第２の群（プラセボ群）が本発明の方法による治療の代わりに（in replacement of）又はその代わりに（in lieu of）プラセボを使用することによって治療される、２つの対象群の間で一定期間にわたる心臓の心筋構造の変化を比較することによって評価することができる。治療群の対象における心臓の心筋構造の変化が、プラセボ群の対象における心臓の心筋構造の変化よりも小さい場合、心臓リモデリングの進行の減少があったという判断がなされる。心臓リモデリングなどの疾患の進行又は発達を判断するための方法は、例えば、理学的検査、ドップラフロー検査と組み合わせた２次元心エコー検査、超音波検査、ＭＲＩ検査、コンピュータ断層撮影、心臓カテーテル法、放射線核種撮像（放射線核種脳室撮影など）、並びにそれらの任意の組み合わせを含む周知の方法を用いて評価することができる。

【0043】

一般に、心臓リモデリング及び心不全は、心臓の負荷又は損傷の持続的な増加を引き起こす障害及び症状から生じる。心不全につながる障害及び症状としては、例えば、心筋梗塞後の生存心筋の喪失、冠状動脈疾患、高血圧症、心筋症（例えば、拡張型心筋症、感染又はアルコール／薬物乱用による心筋症など）、大動脈弁疾患（例えば、大動脈弁閉鎖不全症、大動脈弁逆流症、及び大動脈弁狭窄（大動脈弁狭窄症））などの心臓弁疾患及び機能不全、肺障害（例えば肺高血圧）、先天性心臓欠陥、急性虚血性損傷、再灌流損傷、心膜疾患及び異常、心筋疾患、大血管障害、心内膜障害、心房性細動、左心室心筋機能の障害、右心室心筋機能の障害、心不整脈、甲状腺疾患、腎疾患、糖尿、十分な血を送り出すことができないままにする心筋の衰弱、甲状腺疾患、神経ホルモン不均衡、ウイルス感染、及び貧血症が挙げられる。かかる障害及び症状は、心臓リモデリング及び／又は心不全をもたらし得るため、これらの状態のうちの１つ以上を有するか、又は有することが疑われる対象は、本発明に従って、心臓リモデリング及び／又は心不全を治療するための１つ以上の追加の活性薬剤又は支持療法と任意選択で組み合わせた、１つ以上のアクチビンＡ特異的アンタゴニスト（例えば、抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片）による治療に好ましい対象である。いくつかの実施形態では、心臓リモデリングの徴候（例えば、心筋肥大及び心室拡張）を有する対象又は顕性心不全を有する対象も、根底にある病因を検出することができない場合であっても、更なる心臓リモデリングの予防、又は既存の心臓リモデリングの治療、又は心臓リモデリングの低減がこれらの対象において有益であるため、本開示による治療に適している。いくつかの実施形態では、心臓リモデリング及び／又は心不全発症のリスク因子を有する対象（例えば、本明細書に記載の心臓リモデリング及び／又は慢性心不全をもたらし得る症状を有する対象）もまた、本開示による治療に適している。

【0044】

一般に、高血圧（hypertension）又は高血圧（high blood pressure）は、例えば血圧計で測定したときに、１２０ｍｍＨｇ（収縮期）／８０ｍｍＨｇ（拡張期）を超える安静時血圧を指す。１２１～１３９／８１～８９の間の血圧は前高血圧と考えられ、このレベルを超える（１４０／９０ｍｍＨｇ以上）と高（高血圧）と考えられている。別段の指示がない限り、前高血圧及び高血圧の血圧の両方が、本明細書で使用される「高血圧」の意味に含まれる。例えば、１３５ｍｍＨｇ／８７又は１４０ｍｍＨｇ／９０ｍｍＨｇの安静時血圧は、たとえ１３５／８７が一般的に前高血圧カテゴリー内にあると考えられていても、用語「高血圧」の範囲内にあることが意図される。１４５ｍｍＨｇ／９０ｍｍＨｇ、１４０ｍｍＨｇ／９５ｍｍＨｇ、及び１４２ｍｍＨｇ／９３ｍｍＨｇの血圧は、高血圧の更なる例である。血圧は通常、１日を通じて変化することが理解されるであろう。それは、心拍毎にわずかに変化することさえあり得る。通常、活動中に上昇し、安静時に低下する。それはしばしば、寒い天候では高く、ストレス下では上昇し得る。より正確な血圧の読み取り値は、血圧を毎日モニタリングすることによって得ることができ、血圧値は、外部要因の影響を最小限に抑えるために毎日同じ時間に測定される。血圧が高いか否かを決定するために、経時的ないくつかの読み取り値が必要とされ得る。一般に、慢性高血圧は、限定されるものではないが、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも２ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも１０年などの長期間にわたって連続的又は断続的に高血圧を示す対象を指す。

【0045】

一般に、心不整脈とは、心臓の筋収縮が不規則になる症状を指す。異常に速いリズム（例えば、１００拍／分を超える）は、頻脈と呼ばれる。異常に遅いリズム（例えば、６０拍／分未満）は、徐脈と呼ばれる。

【0046】

一般に、心肥大とは、心臓及び個々の心筋細胞、特に心室筋細胞の特に心室筋細胞の大きさの増大、並びに心室の内腔の大きさの増大を特徴とする症状を指す。

【0047】

駆出率は、各心拍で左心室から送り出される血液のパーセンテージである。駆出率は、例えば、心エコーダイアグラム中に測定され得る。駆出率は、心臓がどれだけ良好にポンピングしているかに関する重要な測定値であり、心不全を分類し、治療を導くために使用することができる。心不全は、駆出率が維持された心不全（拡張期心不全とも呼ばれる）又は駆出率が低下した心不全（収縮期心不全とも呼ばれる）として分類することができる。最近の研究は、駆出率が維持された心不全の有病率が１５年の期間にわたって増加し、死亡率の顕著な改善がないことを実証している。これらの傾向が続く場合、駆出率が維持された心不全は、心不全の最も一般的な形態になる可能性があり、一般的な健康問題となりつつあることが示されている（Ｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ；３５５（３）：２５１－９）。

【0048】

いくつかの実施形態では、本開示のアクチビンＡ特異的アンタゴニストを使用して、非致死性又は致死性の心血管イベント（例えば、心筋梗塞、脳卒中、狭心症、不整脈、体液貯留、及び心不全の進行）の発生率を低下させ得る。本明細書で使用される場合、心血管イベントの発生率を減少させることは、ある期間の間、又はある期間にわたって、対象が経験する心血管イベントの数を維持又は減少させることを指す。心血管イベントの発生率の低下は、第１の群（治療群）が本発明の方法によって治療され、第２の群（プラセボ群）が本発明の方法による治療の代わりにプラセボ（すなわち、ダミーピル）を使用することによって治療される、２つの対象の群間で、ある期間にわたる又はその間の心血管イベントの発生率を比較することによって評価又は決定することができる。治療群についての心血管イベントの数がプラセボ群についての心血管イベントの数よりも少ない場合、心血管イベントの発生率の減少があったか又はあったという判断がなされる。あるいは、心血管イベントの発生率の低下は、第１の期間に対象集団について心血管イベントのベースライン数を決定し、次いで、第２の後の期間に対象集団について心血管イベントの数を測定することによって評価又は判断することができる。第２の後の期間における対象集団についての心血管イベントの数が、第１の期間における対象集団についての心血管イベントの数と同じであるか又はそれ未満である場合、当該対象集団についての心血管イベントの発生率の減少があったという判断がなされる。

【0049】

いくつかの実施形態では、本開示のアクチビンＡ特異的アンタゴニスト（例えば、抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片）は、心不全による入院の発生率を低下させるために使用され得る。本明細書で使用される場合、心不全による入院の発生率を減少させることは、ある期間の間、又はある期間にわたって、対象が経験する心不全による入院の数を維持又は減少させることを指す。心不全による入院の発生率の低下は、第１の群（治療群）が本発明の方法によって治療され、第２の群（プラセボ群）が本発明の方法による治療の代わりにプラセボ（すなわち、ダミーピル）を使用することによって治療される、２つの対象の群間で、ある期間にわたる又はその期間中の心不全による入院の発生率を比較することによって評価又は決定することができる。治療群についての心不全による入院の数が、プラセボ群についての心不全による入院の数よりも少ない場合、心不全による入院の発生率の減少があったか又はあったという判断がなされる。あるいは、心不全による入院の発生率の低下は、第１の期間における対象集団の心不全による入院のベースライン数を決定し、次いで、第２の後の期間における対象集団の心不全による入院の数を測定することによって評価又は判断することができる。第２の後の期間における対象集団の心不全による入院の数が、第１の期間における対象集団の心不全による入院の数以下である場合、当該対象集団の心不全による入院の発生率が減少したと判断される。

【0050】

いくつかの実施形態では、本開示のアクチビンＡ特異的アンタゴニスト（例えば、抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片）は、心不全患者の生存を改善するために使用され得る。本明細書で使用される場合、心不全患者の生存を改善することは、ある期間の間、又は期間にわたって、対象集団が経験する致死性の心血管イベントの数を維持又は低減することを指す。心不全患者の生存の改善は、第１の群（治療群）が本発明の方法によって治療され、第２の群（プラセボ群）が本発明の方法による治療の代わりにプラセボ（すなわち、ダミーピル）を使用することによって治療される、２つの対象群間で、ある期間にわたる又はその期間中の致死性心血管イベントの発生率を比較することによって評価又は判断することができる。治療群についての致死性心血管イベントの数がプラセボ群についての致死性心血管イベントの数より少ない場合、心不全患者の生存における改善があったか又はあったという判断がなされる。あるいは、致死性心血管イベントの発生率の低下は、第１の期間に対象集団について致死性心血管イベントのベースライン数を決定し、次いで、第２の後の期間に対象集団について致死性心血管イベントの数を測定することによって評価又は判断することができる。第２の後の期間における対象集団についての致死性心血管イベントの数が、第１の期間における対象集団についての致死性心血管イベントの数と同じであるか又はそれ未満である場合、当該対象集団について心不全患者の生存率の改善があったという判断がなされる。

【0051】

いくつかの実施形態では、本開示のアクチビンＡ特異的アンタゴニスト（例えば、抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片）は、心不全患者における心血管死のリスクを低減するために使用され得る。本明細書で使用される場合、心不全患者の心血管死のリスクを低減することは、ある期間の間、又は期間にわたって、対象集団が経験する致死性心血管イベントの数を維持又は低減することを指す。心不全患者における心血管死の減少は、第１の群（治療群）が本発明の方法によって治療され、第２の群（プラセボ群）が本発明の方法による治療の代わりにプラセボ（すなわち、ダミーピル）を使用することによって治療される、２つの対象の群間で、ある期間にわたる又はその期間中の致死性心血管イベントの発生率を比較することによって評価又は判断することができる。治療群についての致死性心血管イベントの数がプラセボ群についての致死性心血管イベントの数より少ない場合、心不全患者における心血管死の減少があったか又はあったという判断がなされる。あるいは、心不全患者における心血管死の減少は、第１の期間において対象集団について致死性心血管イベントのベースライン数を決定し、次いで、第２の後の期間において対象集団について致死性心血管イベントの数を測定することによって評価又は判断することができる。第２の後の期間における対象集団についての致死性心血管イベントの数が、第１の期間における対象集団についての致死性心血管イベントの数と同じか又はそれ未満である場合、当該対象集団について心不全患者における心血管死の減少があったという判断がなされる。

【0052】

いくつかの実施形態では、本開示のアクチビンＡ特異的アンタゴニスト（例えば、抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片）は、確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染及び発熱、咳、又は息切れなどのＣＯＶＩＤ－１９の１つ以上の症状を有する患者における心機能障害を治療するために使用され得る。ＣＯＶＩＤ－１９及び既存の心臓血管疾患を有する患者は、重篤な疾患及び死亡のリスクが高いことが報告されている。更に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は、急性心筋損傷、心筋炎、不整脈、及び静脈血栓塞栓症を含む複数の直接的及び間接的な心臓血管合併症と関連付けられている（Ｄｒｉｇｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．，７５（１８）：２３５２－２３７１，Ｍａｙ ２０２０）。大量の炎症促進性サイトカイン及びケモカインの産生に関連する炎症亢進応答もまた、ＣＯＶＩＤ－１９患者において報告されている（Ｓｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１００６７－０２０－０５１９０－５，Ｍａｙ ２０２０）。理論に束縛されることを意図するものではないが、サイトカイン産生の増加は、アクチビンＡ発現の増加を活性化し得、これは次に、心筋細胞の収縮振幅を減少させ、収縮動態を遅くし、心筋細胞のカルシウム処理を損ない、心機能障害、場合によっては心不全をもたらす。

【0053】

心不全を有する患者並びに心不全のリスクがある患者（例えば、高血圧、脂質障害、糖尿病、及び血管障害を有する患者）を管理するために現在使用されている多種多様な承認薬及び支持療法が存在する。このような薬物としては、例えば、アドレナリン遮断薬（α遮断薬及びβ遮断薬）、中枢作用性αアゴニスト、アンジオテンシン変換酵素（angiotensin-converting enzyme、ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、陽性変力薬、血管拡張薬、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、抗血栓薬、及び複数の種類の（例えば、ループ、カリウム保持性、チアジド及びチアジド様）利尿薬が挙げられる。心不全を治療又は予防するための外科的治療としては、例えば、バルーン血管形成術又はステント術によって収縮した動脈の内部サイズを増大させる物理的操作が挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示は、心不全又は心不全の１つ以上の合併症を治療する方法であって、アクチビンＡ特異的アンタゴニスト（例えば、抗アクチビンＡ抗体又はその抗原結合断片）を、心不全を治療する、予防する、又はその進行を低減するための追加の活性薬剤又は支持療法（例えば、アドレナリン遮断薬、中枢作用性α－アゴニスト、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、収縮増強薬、利尿薬、及び様々な外科的治療）と組み合わせて投与するステップを含む方法を提供する。

【0054】

アクチビンＡ特異的アンタゴニスト
本発明の方法は、アクチビンＡ特異的結合タンパク質、アクチビンＡの小分子阻害剤、又はアクチビンＡのヌクレオチドアンタゴニストなどの、アクチビンＡ特異的アンタゴニストを利用する。

【0055】

本明細書で使用される場合、「抗原特異的結合タンパク質」という表現は、特定の抗原に特異的に結合する少なくとも１つのドメインを含むタンパク質を意味する。抗原特異的結合タンパク質の例示的なカテゴリーとしては、抗体、抗体の抗原結合部分、特定の抗原と特異的に相互作用するペプチド（例えば、ペプチボディ）、特定の抗原と特異的に相互作用するが他の抗原とは相互作用しない受容体分子、及び特定の抗原と特異的に結合するが他の抗原とは結合しない受容体のリガンド結合部分を含むタンパク質が挙げられる。

【0056】

本発明の方法には、アクチビンＡに特異的に結合する抗原特異的結合タンパク質、すなわち、「アクチビンＡ特異的結合タンパク質」の使用が含まれる。アクチビンは、ベータサブユニット（すなわち、インヒビンβＡ、インヒビンβＢ、インヒビンβＣ、及び／又はインヒビンβＥ）を含むホモ及びヘテロ二量体分子である。βＡサブユニットは、配列番号２２６のアミノ酸配列を含み、βＢサブユニットは、配列番号２２８のアミノ酸配列を含む。アクチビンＡは、２つのβＡサブユニットのホモ二量体である。アクチビンＢは、２つのβＢサブユニットのホモ二量体である。アクチビンＡＢは、１つのβＡサブユニット及び１つのβＢサブユニットのヘテロ二量体であり、アクチビンＡＣは、１つのβＡサブユニット及び１つのβＣサブユニットのヘテロ二量体である。アクチビンＡ特異的結合タンパク質は、βＡサブユニットに特異的に結合する抗原特異的結合タンパク質であり得る。βＡサブユニットは、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、及びアクチビンＡＣ分子において存在するため、「アクチビンＡ特異的結合タンパク質」は、アクチビンＡ並びにアクチビンＡＢ及びアクチビンＡＣに（βＡサブユニットとのその相互作用によって）特異的に結合する抗原特異的結合タンパク質であり得る。したがって、本発明の一実施形態によれば、アクチビンＡ特異的結合タンパク質は、アクチビンＡ；又はアクチビンＡ及びアクチビンＡＢ；又はアクチビンＡ及びアクチビンＡＣ；又はアクチビンＡ、アクチビンＡＢ及びアクチビンＡＣ、に特異的に結合するが、アクチビンＢ、ＧＤＦ３、ＧＤＦ８、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ１１、Ｎｏｄａｌ等の他のＡｃｔＲＩＩＢリガンドには結合しない、したがって、本発明の一実施形態では、アクチビンＡ特異的結合タンパク質は、アクチビンＡに特異的に結合するが、アクチビンＢ又はアクチビンＣには有意に結合しない。別の実施形態では、アクチビンＡ特異的結合タンパク質は、アクチビンＢにも（βＢサブユニット、すなわち、インヒビンβＢとの交差反応によって）結合し得る。別の実施形態では、アクチビンＡ特異的結合タンパク質は、アクチビンＡに特異的に結合するが、ＡｃｔＲＩＩＢの任意の他のリガンドに結合しない結合タンパク質である。別の実施形態では、アクチビンＡ特異的結合タンパク質は、結合タンパク質であり、アクチビンＡに特異的に結合するが、いかなる骨形成タンパク質（Bone Morphogenetic Protein、ＢＭＰ）（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０）にも結合しない。別の実施形態では、アクチビンＡ特異的結合タンパク質は、アクチビンＡに特異的に結合するが、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのいかなる他のメンバーにも結合しない結合タンパク質である。

【0057】

本発明の方法のいくつかの実施形態はまた、ＧＤＦ８に特異的に結合する抗原特異的結合タンパク質（すなわち、「ＧＤＦ８特異的結合タンパク質」）を含む。「ＧＤＦ８」（「増殖分化因子－８」及び「ミオスタチン」とも呼ばれる）という用語は、配列番号２２５のアミノ酸配列を有するタンパク質（成熟タンパク質）を意味する。これらの実施形態によれば、ＧＤＦ８特異的結合タンパク質は、ＧＤＦ８に特異的に結合するが、他のＡｃｔＲＩＩＢリガンド、例えば、ＧＤＦ３、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、Ｎｏｄａｌなどには結合しない。

【0058】

本発明の文脈では、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンド結合部分を含むＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ（例えば、「ＡＣＥ－０３１」又は「ＲＡＰ－０３１」）などの分子は、かかる分子がＧＤＦ８、アクチビンＡ及びアクチビンＡＢに加えて複数のリガンドに結合するので、「アクチビンＡ特異的結合タンパク質」又は「ＧＤＦ８特異的結合タンパク質」とはみなされない。

【0059】

本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、及びタンパク質断片についての全ての言及は、非ヒト種由来であることが明確に特定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、又はタンパク質断片のヒト型を指すことを意図している。

【0060】

特異的結合
「特異的に結合する」などの用語は、本明細書で使用される場合、抗原特異的結合タンパク質又は抗原特異的結合ドメインが、５００ｐＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とし、通常の試験条件下で他の無関係な抗原に結合しない、特定の抗原と複合体を形成することを意味する。「非関連抗原」は、互いに９５％未満のアミノ酸同一性を有するタンパク質、ペプチド、又はポリペプチドである。２つの分子が互いに特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。例えば、本発明との関連で使用される抗原特異的結合タンパク質又は抗原特異的結合ドメインは、表面プラズモン共鳴アッセイで測定したとき、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約９０ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約７０ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、約４ｐＭ未満、約２ｐＭ未満、約１ｐＭ未満、約０．５ｐＭ未満、約０．２ｐＭ未満、約０．１ｐＭ未満、又は約０．０５ｐＭ未満のＫ_Ｄで、特異的な抗原（アクチビンＡ及び／若しくはＡＢ、又はＧＤＦ８）に結合する分子を含む。

【0061】

本明細書で使用される場合、抗原特異的結合タンパク質又は抗原特異的結合ドメインは、表面プラズモン共鳴アッセイにおいて２５℃で分子への結合について試験したときに、５０．０ｎＭ超のＫ_Ｄを示す場合、又はかかるアッセイ若しくはその同等のものにおいていかなる結合も示さない場合に、特定の分子に「結合しない」（例えば「ＧＤＦ１１に結合しない」、「ＢＭＰ９に結合しない」、「ＢＭＰ１０に結合しない」など）という。

【0062】

「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）システム（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、バイオセンサマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によって実時間での相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。

【0063】

「Ｋ_Ｄ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定のタンパク質－タンパク質相互作用（例えば、抗体－抗原相互作用）の平衡解離定数を意味する。別段示されない限り、本明細書に開示されるＫ_Ｄ値は、２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイによって決定されたＫ_Ｄ値を指す。

【0064】

抗体及び抗原結合断片
抗原特異的結合タンパク質は、抗体又は抗体の抗原結合断片を含み得るか、又はそれらからなり得る。更に、２つの異なる抗原特異的結合ドメイン（後述）を含む抗原結合分子の場合、抗原特異的結合ドメインの一方又は両方は、抗体の抗原結合断片を含み得るか、又はそれからなり得る。

【0065】

本明細書で使用される場合、「アクチビンに結合する抗体」又は「抗アクチビンＡ抗体」には、アクチビンＡタンパク質の可溶性断片に結合し、アクチビンβＡサブユニット含有アクチビンヘテロ二量体にも結合し得る抗体及びその抗原結合断片が含まれる。

【0066】

本発明で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の抗原（例えば、アクチビンＡ）に特異的に結合するか又はそれと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子又は分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。重鎖は各々、重鎖可変領域（本明細書でＨＣＶＲ又はＶ_Ｈと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３を含む。軽鎖は各々、軽鎖可変領域（本明細書でＬＣＶＲ又はＶ_Ｌと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ_Ｌ１）を含む。Ｖ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（framework region、ＦＲ）と称されるより保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域に更に細分され得る。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。本発明の異なる実施形態では、抗アクチビンＡ抗体（若しくはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、又は天然に若しくは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。

【0067】

本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合断片を含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」及び同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然の、酵素処理で入手可能な、合成の、又は遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、ＤＮＡコード抗体可変ドメイン及び任意に定常ドメインの操作及び発現を包含するタンパク質消化技法又は組換え遺伝子操作技法などの任意の好適な標準的技法を使用した完全抗体分子に由来し得る。このようなＤＮＡは、知られており、かつ／又は例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、あるいは合成することができる。ＤＮＡは、化学的に、又は分子生物学技法を使用することによって配列決定及び操作されて、例えば、１つ以上の可変ドメイン及び／若しくは定常ドメインを好適な立体配置に配置するか、又はコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、付加、若しくは欠失などすることができる。

【0068】

抗原結合断片の非限定的な例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、又は拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドが挙げられる。ドメイン特異性抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（small modular immunopharmaceutical、ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子もまた、本明細書で使用されるような「抗原結合断片」の表現内に包含される。

【0069】

抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズ又はアミノ酸組成のものであり得、一般に、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか、又はそれとインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。Ｖ_ＨドメインがＶ_Ｌドメインに会合した抗原結合断片では、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインは、任意の好適な配置で互いに対して位置付けられてもよい。例えば、可変領域は二量体であり、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ、又はＶ_Ｌ－Ｖ_Ｌ二量体を含んでもよい。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶ_Ｈドメイン又はＶ_Ｌドメインを含んでもよい。

【0070】

特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含んでもよい。本発明の抗体の抗原結合断片内に見出され得る可変及び定常ドメインの非限定的な例示的な構成としては、（ｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１、（ｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２、（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ３、（ｉｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２、（ｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、（ｖｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、（ｖｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｌ、（ｖｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１、（ｉｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２、（ｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ３、（ｘｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２、（ｘｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、（ｘｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、及び（ｘｉｖ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｌが挙げられる。上に列記される例示的な立体配置のうちのいずれかを含む、可変ドメイン及び定常ドメインのいずれの立体配置でも、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接連結されているか、又は完全若しくは部分的ヒンジ領域若しくはリンカー領域によって連結されているかのいずれかであり得る。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメイン及び／又は定常ドメイン間の可撓性又は半可撓性の結合をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０以上の）アミノ酸からなり得る。更に、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いとの及び／又は１つ以上の単量体Ｖ_Ｈ若しくはＶ_Ｌドメインとの（例えば、ジスルフィド結合による）非共有結合において、上に列記される可変ドメイン立体配置及び定常ドメイン立体配置のうちのいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体（又は他の多量体）を含み得る。

【0071】

完全抗体分子と同様に、抗体結合断片は、単一特異性又は多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別個の抗原に、又は同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体形式を含む任意の多重特異性抗体形式は、当該技術分野で利用可能な通例の技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合断片との関連で使用に適合し得る。

【0072】

本発明のある特定の実施形態では、本発明の抗アクチビンＡ抗体は、ヒト抗体である。本発明で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むように意図される。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的変異誘発によるか、又はインビボでの体細胞変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列へと移植された抗体を含むことを意図するものではない。

【0073】

本発明の抗体は、いくつかの実施形態では、組換えヒト抗体であり得る。「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体など組換え手段によって調製、発現、作製、若しくは単離される全てのヒト抗体（更に後述）、組換え型コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体（更に後述）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０：６２８７－６２９５（１９９２））、又は他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製、若しくは単離される抗体を含むことが意図される。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が使用される際の、インビボ体細胞変異誘発）に供され、したがって、組換え抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列に由来しそれらに関連しているが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。

【0074】

ヒト抗体は、ヒンジの不均一性に関連する２つの形態で存在することができる。第１の形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されているおよそ１５０～１６０ｋＤａの安定した四本鎖構築体を含む。第２の形態では、二量体は鎖間ジスルフィド結合によって連結されておらず、共有結合した軽鎖及び重鎖からなる約７５～８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製後でさえも分離することが極めて困難とされている。

【0075】

様々な無傷のＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造上の相違によるが、それに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルまで第２の形態の出現を著しく低減することができる（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５ １９９３））。本発明は、ヒンジ領域、Ｃ_Ｈ２領域、又はＣ_Ｈ３領域に１つ以上の変異を有する抗体を包含し、例えば、産生において、所望の抗体形態の収率を改善する（improve）のに望ましくあり得る。

【0076】

本発明の抗体は、単離された抗体であってもよい。「単離された抗体」は、本明細書で使用される場合、その天然環境の少なくとも１つの成分から同定され、分離及び／又は回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、又は抗体が天然に存在するか若しくは天然に産生される組織又は細胞から分離又は除去された抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体は、組換え細胞内の原位置の抗体も含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製又は単離ステップに供された抗体である。特定の実施形態によると、単離された抗体は、他の細胞性物質及び／又は化学物質を実質的に含まない場合がある。

【0077】

本発明には、抗アクチビンＡ抗体の中和及び／又は遮断が含まれる。「中和」又は「遮断」抗体は、本明細書で使用される場合、アクチビンＡへのその結合が、以下のようになるものを指すことが意図される：
（ｉ）アクチビンＡとアクチビンＡ受容体との間の相互作用に干渉する（例えば、アクチビンＩＩＡ型受容体、アクチビンＩＩＢ型受容体、アクチビンＩ型受容体など）、（ｉｉ）アクチビン－アクチビン受容体複合体の形成を阻害する、及び／又は、（ｉｉｉ）結果としてアクチビンＡの少なくとも１つの生物学的機能を阻害する。アクチビンＡ中和又は遮断抗体によって引き起こされる阻害は、それが適切なアッセイを使用して検出可能である限り、完全である必要はない。アクチビンＡ阻害を検出するための例示的なアッセイは、本明細書の実施例に記載されている。

【0078】

本明細書に開示される抗アクチビンＡ抗体は、抗体が由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域及び／又はＣＤＲ領域において１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含み得る。かかる変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって、容易に確認され得る。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のうちのいずれかに由来する抗体及びその抗原結合断片を含み、１つ以上のフレームワーク領域及び／又はＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基に変異するか、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基に変異するか、又は対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異する（かかる配列変化は、本明細書で集合的に「生殖系列変異」と称される）。当業者は、本明細書に開示される重鎖及び軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異又はそれらの組み合わせを含む多くの抗体及び抗体結合断片を容易に産生することができる。特定の実施形態において、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌドメイン内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基のうちの全てが、抗体が由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと再び変異する。他の実施形態では、特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基は、ＦＲ１の最初の８つのアミノ酸内に、若しくはＦＲ４の最後の８つのアミノ酸内に見出されるか、又は変異した残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ３内にのみ見出される。他の実施形態では、フレームワーク及び／又はＣＤＲ残基のうちの１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基へ変異する。更に、本発明の抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なる特定の他の残基は、維持されるか、又は異なる生殖系列配列の対応する残基へ変異する。いったん得られれば、１つ以上の生殖系列変異を含有する抗体及び抗体結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性の増加、アンタゴニスト又はアゴニストの生物学的特性の改善又は増強（場合によって）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な方法で得られる抗体及び抗体結合断片は、本発明の範囲内に包含される。

【0079】

本発明にはまた、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗アクチビンＡ抗体が含まれる。例えば、本発明には、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかに関連する、例えば１０個以下、８つ以下、６つ以下、又は４つ以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗アクチビンＡ抗体が含まれる。

【0080】

「エピトープ」という用語は、パラトープとして既知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は２つ以上のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は抗原上の異なる領域に結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体配座又は直鎖状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。特定の状況では、エピトープは、抗原上のサッカリド、ホスホリル基、又はスルホニル基の部分を含み得る。

【0081】

「実質的な同一性」又は「実質的に同一である」という用語は、核酸又はその断片を指す場合、別の核酸（又はその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入又は欠失と最適に整列した場合、以下で考察されるように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧａｐなど、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定される場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、又は９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の場合では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じ又は実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。

【0082】

ポリペプチドへ適用される場合、「実質的な類似性」又は「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列の保存的置換が互いに異なる場合、配列同一性パーセント又は類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４：３０７－３３１ （１９９４）を参照されたい。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに（７）硫黄含有側鎖は、システイン及びメチオニンである、が挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、及びアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５（１９９２）に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。

【0083】

ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、典型的には配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、及び他の修飾に割り当てられた類似性の測定値を使用して類似の配列を一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間又は野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性又は配列同一性を決定するための既定パラメータとともに使用され得るＧａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムである既定パラメータ又は推奨パラメータを用いたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列と検索配列との間の最良の重複領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３２：１８５－２１９（２０００）を参照されたい）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３－４１０（１９９０）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３３８９－４０２（１９９７）を参照されたい。

【0084】

本発明は、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１０６、１１４、１２２、１３０、１３８、１５４、１６２、１７０、１７８、１８６、１９４、及び２０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、又はそれらと実質的に類似する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、抗体又は抗体の抗原結合断片を提供する。

【0085】

本発明は、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１４６及び２１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれに実質的に類似の配列を含む、抗体又は抗体の抗原結合断片を更に提供する。

【0086】

本発明はまた、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／９０、１０６／９０、１１４／９０、１２２／９０、１３０／９０、１３８／１４６、１５４／１４６、１６２／１４６、１７０／１４６、１７８／１４６、１８６／１４６、１９４／１４６、及び２０２／２１０からなる群から選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列対を含む、抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0087】

本発明はまた、は、配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１６０、１６８、１７６、１８４、１９２、２００及び２０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン、又はそれらと実質的に類似する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列と、配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１５２及び２１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメイン、又はそれらと実質的に類似する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列と、を含む、抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0088】

ある特定の実施形態では、抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号８／１６、２４／３２、４０／４８、５６／６４、７２／８０、８８／９６、１０４／９６、１１２／９６、１２０／９６、１２８／９６、１３６／９６、１４４／１５２、１６０／１５２、１６８／１５２、１７６／１５２、１８４／１５２、１９２／１５２、２００／１５２及び２０８／２１６からなる群から選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。

【0089】

本発明はまた、配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１０８、１１６、１２４、１３２、１４０、１５６、１６４、１７２、１８０、１８８、１９６、及び２０４からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン、配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１０、１１８、１２６、１３４、１４２、１５８、１６６、１７４、１８２、１９０、１９８、及び２０６からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン、配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１４８及び２１２からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれに実質的に類似の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン、及び配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１５０及び２１４からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれに実質的に類似の配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメイン、を更に含む抗体又はその断片を提供する。

【0090】

本発明示の特定の非限定的で例示的な抗体及び抗原結合断片は、それぞれ、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む：配列番号４－６－８－１２－１４－１６（例えばＨ４Ｈ１０４２３Ｐ）、２０－２２－２４－２８－３０－３２（例えばＨ４Ｈ１０４２４Ｐ）、３６－３８－４０－４４－４６－４８（例えばＨ４Ｈ１０４２６Ｐ）、５２－５４－５６－６０－６２－６４（例えばＨ４Ｈ１０４２９Ｐ）、６８－７０－７２－７６－７８－８０（例えばＨ４Ｈ１０４３０Ｐ）、８４－８６－８８－９２－９４－９６（例えばＨ４Ｈ１０４３２Ｐ２）、１００－１０２－１０４－９２－９４－９６（例えばＨ４Ｈ１０４３３Ｐ２）、１０８－１１０－１１２－９２－９４－９６（例えばＨ４Ｈ１０４３６Ｐ２）、１１６－１１８－１２０－９２－９４－９６（例えばＨ４Ｈ１０４３７Ｐ２）、１２４－１２６－１２８－９２－９４－９６（例えばＨ４Ｈ１０４３８Ｐ２）、１３２－１３４－１３６－９２－９４－９６（例えばＨ４Ｈ１０４４０Ｐ２）、１４０－１４２－１４４－１４８－１５０－１５２（例えばＨ４Ｈ１０４４２Ｐ２）、１５６－１５８－１６０－１４８－１５０－１５２（Ｈ４Ｈ１０４４５Ｐ２）、１６４－１６６－１６８－１４８－１５０－１５２（Ｈ４Ｈ１０４４６Ｐ２）、１７２－１７４－１７６－１４８－１５０－１５２（Ｈ４Ｈ１０４４７Ｐ２）、１８０－１８２－１８４－１４８－１５０－１５２（Ｈ４Ｈ１０４４８Ｐ２）、１８８－１９０－１９２－１４８－１５０－１５２（Ｈ４Ｈ１０４５２Ｐ２）、１９６－１９８－２００－１４８－１５０－１５２（Ｈ４Ｈ１０４６８Ｐ２）、及び２０４－２０６－２０８－２１２－２１４－２１６（Ｈ２ａＭ１０９６５Ｎ）。いくつかの実施形態では、抗アクチビンＡ抗体は、上記のＣＤＲ配列、並びに配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／９０、１０６／９０、１１４／９０、１２２／９０、１３０／９０、１３８／１４６、１５４／１４６、１６２／１４６、１７０／１４６、１７８／１４６、１８６／１４６、１９４／１４６、及び２０２／２１０からなる群から選択される対応するＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列対と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるＨＣＶＲ及び／又はＬＣＶＲを含む。

【0091】

いくつかの実施形態では、本発明には、アクチビンＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片が含まれ、抗体又は断片は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／９０、１０６／９０、１１４／９０、１２２／９０、１３０／９０、１３８／１４６、１５４／１４６、１６２／１４６、１７０／１４６、１７８／１４６、１８６／１４６、１９４／１４６及び２０２／２１０からなる群から選択される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列内に含有される重鎖及び軽鎖ＣＤＲドメインを含む。ＨＣＶＲアミノ酸配列及びＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法及び技術は、当該技術分野において周知であり、それらを使用して、本明細書に開示される特定のＨＣＶＲアミノ酸配列及び／又はＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定することができる。ＣＤＲの境界を同定するために使用することができる例示的な規則は、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、及びＡｂＭ定義を含む。一般的には、Ｋａｂａｔ定義は配列の可変性に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づいており、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔのアプローチとＣｈｏｔｈｉａのアプローチの間の折衷案である。例えば、Ｋａｂａｔ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，」Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－９４８ （１９９７）；及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ （ＵＳＡ）８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照されたい。抗体内のＣＤＲ配列を同定するために、公開データベースも利用可能である。

【0092】

本発明には、修飾炭化水素を含有する抗アクチビンＡ抗体が含まれる。いくつかの用途では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための改変が有用であり得る。いくつかの用途では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾、又は例えば抗体依存性細胞傷害作用（antibody dependent cellular cytotoxicity、ＡＤＣＣ）機能を増大させるためのオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分の欠失を有する抗体が、有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３ （２００２）を参照）。他の用途では、補体依存性細胞傷害作用（complement dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）を修飾するために、ガラクトシル化の修飾を行うことができる。いくつかの用途では、抗体は、エフェクター機能を最小化するために、改変されたグリコシル化パターンを有し得る。例えば、抗体を改変して、更にグリコシル化又はシアリル化された抗体が得られ得る。

【0093】

抗体の生物学的特徴
本発明には、高い親和性でアクチビンＡに結合する抗アクチビンＡ抗体及びその抗原結合断片が含まれる。例えば、本発明には、本明細書の実施例に定義されるようなアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴により測定したときに、約３０ｎＭ未満のＫ_ＤでアクチビンＡに（例えば、２５℃又は３７℃で）結合する抗体及び抗体の抗原結合断片が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合性断片は、例えば、本明細書の実施例３で定義されるアッセイフォーマット又は実質的に同様のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定したとき、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約５００ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、約２４０ｐＭ未満、約２３０ｐＭ未満、約２２０ｐＭ未満、約２１０ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１９０ｐＭ未満、約１８０ｐＭ未満、約１７０ｐＭ未満、約１６０ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１４０ｐＭ未満、約１３０ｐＭ未満、約１２０ｐＭ未満、約１１０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約９５ｐＭ未満、約９０ｐＭ未満、約８５ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約７５ｐＭ未満、約７０ｐＭ未満、約６５ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約５５ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４５ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３５ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２５ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１５ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約９ｐＭ未満、約８ｐＭ未満、約７ｐＭ未満、約６ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、約４ｐＭ、又は約３ｐＭ未満のＫ_ＤでアクチビンＡに結合する。

【0094】

本発明にはまた、アクチビンＡ媒介性の細胞シグナル伝達を阻害する抗アクチビンＡ抗体及びその抗原結合断片が含まれる。例えば、本発明には、例えば本明細書の実施例において定義されるアッセイフォーマット、又は実質的に同様のアッセイを使用して、細胞ベースのブロッキングバイオアッセイにおいて測定したとき、約４ｎＭ未満のＩＣ_５０値で、アクチビンＡのアクチビンＩ型又はＩＩ型受容体への結合を介するＳＭＡＤ複合体シグナル伝達経路の活性化を阻害する、抗アクチビンＡ抗体が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合性断片は、例えば本明細書の実施例で定義されるアッセイフォーマット、又は実質的に同様のアッセイを使用して、細胞ベースのブロッキングバイオアッセイで測定したとき、アクチビンＡのアクチビンＩ型又はＩＩ型受容体への結合を介するＳＭＡＤ複合体シグナル伝達経路の活性化を、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約５００ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、約２４０ｐＭ未満、約２３０ｐＭ未満、約２２０ｐＭ未満、約２１０ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１９０ｐＭ未満、約１８０ｐＭ未満、約１７０ｐＭ未満、約１６０ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１４０ｐＭ未満、約１３０ｐＭ未満、約１２０ｐＭ未満、約１１０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約９５ｐＭ未満、約９０ｐＭ未満、約８５ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約７５ｐＭ未満、約７０ｐＭ未満、約６５ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約５５ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４９ｐＭ未満、約４８ｐＭ未満、約４７ｐＭ未満、約４６ｐＭ未満、約４５ｐＭ未満、約４４ｐＭ未満、約４３ｐＭ未満、約４２ｐＭ未満、約４１ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、又は約３９ｐＭ未満のＩＣ_５０値で阻害する。ある特定の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合性断片は、アクチビンＢのアクチビンＩ型又はＩＩ型受容体への結合に干渉することによって、アクチビンＢのシグナル伝達を阻害し、そのＩＣ_５０値は、例えば本明細書の実施例で定義されるアッセイフォーマット又は実質的に同様のアッセイを使用して、細胞ベースのブロッキングバイオアッセイで測定したとき、約５０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、又は約１ｎＭ未満である。ある特定の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合性断片は、アクチビンＡＢのアクチビンＩ型又はＩＩ型受容体への結合を介するＳＭＡＤ複合体シグナル伝達経路の活性化を、例えば本明細書の実施例で定義されるアッセイフォーマット又は実質的に同様のアッセイを用いた細胞ベースのブロッキングバイオアッセイで測定したとき、約５００ｐＭ未満、約４５０ｐＭ未満、約４４０ｐＭ未満、約４３０ｐＭ未満、約４２０ｐＭ未満、約４１０ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３９０ｐＭ未満、約３８０ｐＭ未満、約３７０ｐＭ未満、約３６０ｐＭ未満、約３５０ｐＭ未満、約３４０ｐＭ未満、約３２０ｐＭ未満、約３１０ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２９０ｐＭ未満、約２８０ｐＭ未満、約２７０ｐＭ未満、約２６０ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、約２４０ｐＭ未満、約２３０ｐＭ未満、約２２０ｐＭ未満、約２１０ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１９０ｐＭ未満、約１８０ｐＭ未満、約１７０ｐＭ未満、約１６０ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、又は約１４０ｐＭ未満のＩＣ_５０値で阻害する。ある特定の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合性断片は、アクチビンＡＣのアクチビンＩ型又はＩＩ型受容体への結合を介するＳＭＡＤ複合体シグナル伝達経路の活性化を、例えば本明細書の実施例で定義されるアッセイフォーマット又は実質的に同様のアッセイを使用して、細胞ベースのブロッキングバイオアッセイで測定したとき、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７５０ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６５０ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、又は約５８０ｐＭ未満のＩＣ_５０値で阻害する。

【0095】

本発明の抗体は、上述の生物学的特徴の１つ以上、又はこれらの何らかの組み合わせを有することができる。本発明の抗体の他の生物学的特徴は、本明細書における実施例を含む本開示の再吟味から当業者に明らかとなるであろう。

【0096】

Ｆｃ変異体を含む抗アクチビンＡ抗体
本発明の特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強又は減少させる１つ以上の突然変異を含むＦｃドメインを含む、抗アクチビンＡ抗体が提供される。例えば、本発明には、ＦｃドメインのＣ_Ｈ２又はＣ_Ｈ３領域に変異を含む抗アクチビンＡ抗体が含まれ、この変異は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲のエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。そのような変異は、動物に投与したときに抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例としては、例えば、位置２５０（例えば、Ｅ又はＱ）、２５０及び４２８（例えば、Ｌ又はＦ）、２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ又はＴ）、２５４（例えば、Ｓ又はＴ）、及び２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／Ｄ又はＴ）での修飾、あるいは位置４２８及び／若しくは４３３（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑ又はＫ）、並びに／又は４３４（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、又はＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、又はＮ４３４Ｙ］）での修飾、あるいは位置２５０及び／又は４２８での修飾、あるいは位置３０７又は３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４での修飾が挙げられる。一実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾、２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）修飾、２５０Ｑ及び４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ ４２８Ｌ）、並びに３０７及び／又は３０８修飾（例えば、３０８Ｆ又は３０８Ｐ）を含む。更に別の実施形態において、修飾は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）及び／又は２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）修飾を含む。

【0097】

例えば、本発明には、２５０Ｑ及び２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ２４８Ｌ）、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ）、４２８Ｌ及び４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ）、２５７Ｉ及び３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７Ｉ及びＱ３１１Ｉ）、２５７Ｉ及び４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７Ｉ及びＮ４３４Ｈ）、３７６Ｖ及び４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６Ｖ及びＮ４３４Ｈ）、３０７Ａ、３８０Ａ、及び４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、及びＮ４３４Ａ）、並びに４３３Ｋ及び４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される変異の１つ以上の対又は群を含むＦｃドメインを含む、抗アクチビンＡ抗体が含まれる。前述のＦｃドメイン変異、及び本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異の全ての可能な組み合わせが、本発明の範囲内で熟慮される。

【0098】

本発明にはまた、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗アクチビンＡ抗体が含まれ、キメラＣＨ領域は、１つ超の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子、又はヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部又は全部と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子、又はヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部又は全部を含む、キメラＣＨ領域を含み得る。特定の実施形態によると、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵ番号付けによる位置２２８～２３６のアミノ酸残基）と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けによる位置２１６～２２７のアミノ酸残基）を含み得る。特定の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４上部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、ヒトＩｇＧ２下部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、を含む。本明細書に記載されるようなキメラＣＨ領域を含む抗体は、特定の実施形態では、抗体の治療特性又は薬物動態学的特性に悪影響を与えることなく、修飾Ｆｃエフェクター機能を呈し得る。（開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年２月１日出願の米国仮特許出願第６１／７５９，５７８号を参照されたい）。

【0099】

エピトープマッピング及び関連技法
本発明には、アクチビンＡ内（例えば、アクチビンＩＩ型受容体結合部位内）に存在する１つ以上のアミノ酸と相互作用する抗アクチビンＡ抗体が含まれる。抗体が結合するエピトープは、アクチビンβＡサブユニット内に位置する３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）のアミノ酸の単一連続配列からなるものであり得る。あるいは、エピトープは、アクチビンＡ二量体内に位置する複数の非連続アミノ酸（又はアミノ酸配列）からなるものであり得る。

【0100】

当業者に知られている様々な技術を使用して、抗体がポリペプチド又はタンパク質の内部にある「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを判定することができる。例示的な技法としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載されている日常的なクロス遮断アッセイ、アラニンスキャニング変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－４６３（２００４））、及びペプチド切断分析が挙げられる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出、及び抗原の化学修飾などの方法を採用することができる（Ｔｏｍｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７－４９６（２０００））。抗体が相互作用するポリペプチドの内部にあるアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的にいえば、水素／重水素交換法は、関心対象のタンパク質を重水素標識した後、抗体を重水素標識タンパク質へ結合させることを包含する。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移して、抗体によって保護されている残基（重水素標識されたままである）を除く全ての残基で水素－重水素交換を生じさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及び質量分析へ供し、それにより、抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９（１９９９）、Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａ（２００１）を参照されたい。

【0101】

本発明には、本明細書に記載される特定の例示的な抗体のいずれか（例えば、Ｈ４Ｈ１０４２３Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４２４Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４２６Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４２９Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４３０Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４３２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４３３Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４３６Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４３７Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４３８Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４０Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４５Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４６Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４７Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４８Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４５２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４６８Ｐ２、Ｈ２ａＭ１０９６５Ｎなど）と同じエピトープに結合する抗アクチビンＡ抗体が更に含まれる。同様に、本発明にはまた、アクチビンＡへの結合について、本明細書に記載される特定の例示的な抗体のいずれか（例えば、Ｈ４Ｈ１０４２３Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４２４Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４２６Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４２９Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４３０Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４３２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４３３Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４３６Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４３７Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４３８Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４０Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４５Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４６Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４７Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４８Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４５２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４６８Ｐ２、Ｈ２ａＭ１０９６５Ｎなど）と競合する抗アクチビンＡ抗体が含まれる。例えば、本発明には、本明細書に例示される１つ以上の抗体（例えばＨ４Ｈ１０４２３Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４４６Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４６８Ｐ２及びＨ４Ｈ１０４４２Ｐ２）とアクチビンＡへの結合について交差競合する抗アクチビンＡ抗体が含まれる。本発明にはまた、アクチビンＡへの結合について、例えばＨ４Ｈ１０４２９、Ｈ４Ｈ１４３０Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４３２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４３６Ｐ２、及びＨ４Ｈ１０４４０Ｐ２などの１つ以上の抗体と交差競合する抗アクチビンＡ抗体が含まれる。

【0102】

当該技術分野で即知であり、本明細書に例示される通例の方法を使用することによって、抗体が参照抗アクチビンＡ抗体と同じエピトープに結合するか、又は結合について参照抗アクチビンＡ抗体と競合するかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗アクチビンＡ抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和条件下でアクチビンＡ（又はβＡサブユニット含有ヘテロ二量体）に結合させておく。次に、アクチビンＡ分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が、参照抗アクチビンＡ抗体との飽和結合後にアクチビンＡに結合することができる場合、この試験抗体は、参照抗アクチビンＡ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。その一方で、試験抗体が、参照抗アクチビンＡ抗体との飽和結合後にアクチビンＡタンパク質に結合することができない場合、試験抗体は、本発明の参照抗アクチビンＡ抗体によって結合されたエピトープと同じエピトープに結合し得る。次に、試験抗体の結合の観察された欠失が、実際に、参照抗体と同じエピトープへの結合によるものであるか、それとも立体遮断（又は別の現象）が、観察された結合の欠失の原因であるのかを確認するために、更なる通例の実験（例えば、ペプチド変異及び結合分析）を実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリ、又は当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的若しくは定性的な抗体結合アッセイを使用して実施することができる。本発明のある特定の実施形態によると、例えば、１、５、１０、２０、又は１００倍過剰の一方の抗体が、競合的結合アッセイで測定した場合、少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％、更には９９％で他方の抗体の結合を阻害する場合に、２つの抗体は、同じ（又は重複する）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１４９５－１５０２ （１９９０）を参照されたい）。あるいは、一方の抗体の結合を減少又は排除する抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が、もう一方の抗体の結合を減少又は排除する場合、２つの抗体は、同じエピトープと結合するとみなされる。一方の抗体の結合を低減又は排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は「重複エピトープ」を有するとみなされる。

【0103】

抗体が参照抗アクチビンＡ抗体との結合について競合する（又は結合について交差競合する）かを決定するために、上記に記載される結合方法論を２つの向きで実施する。すなわち、第１の向きでは、参照抗体を飽和条件下でアクチビンＡタンパク質（又はβＡサブユニットを含む二量体）と結合させておいた後、アクチビンＡ分子との試験抗体の結合を評価する。第２の向きでは、試験抗体を、飽和条件下でアクチビンＡと結合させ、続いてアクチビンＡに対する参照抗体の結合を評価する。両方の向きのうち、第１の（飽和）抗体のみがアクチビンＡ分子に結合することができる場合、試験抗体及び参照抗体は、アクチビンＡへの結合について競合すると結論付けられる。当業者によって認識されるであろうように、参照抗体との結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合する必要はない場合があるが、重複している又は隣接しているエピトープに結合することによって、参照抗体の結合を立体的に遮断する可能性がある。

【0104】

本発明の抗アクチビンＡ抗体は、アクチビンＩＩ型受容体に対する結合部位内又はその近傍のアクチビンＡ上のエピトープに結合し、アクチビンＡとアクチビンＩＩ型受容体との間の相互作用を直接遮断し、アクチビンＡとアクチビンＩ型受容体との間の相互作用を間接的に遮断し得る。本発明の抗アクチビンＡ抗体は、アクチビンＩ型受容体に対する結合部位内又はその近傍のアクチビンＡ上のエピトープに結合し、アクチビンＡとアクチビンＩ型受容体との間の相互作用を直接遮断し得る。本発明の一実施形態では、アクチビンＩ型受容体結合部位又はその近傍でアクチビンＡに結合する本発明の抗アクチビンＡ抗体は、アクチビンＡとアクチビンＡ ＩＩ型受容体との間の相互作用を遮断しない。

【0105】

ヒト抗体の調製
完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を生成するための方法は、当該技術分野で既知である。ヒトアクチビンＡに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、何らかのこのような既知の方法を本発明の背景において使用することができる。

【0106】

例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術、又は完全ヒトモノクローナル抗体を生成するための任意の他の既知の方法を使用して、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有するヒトアクチビンＡに対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。後述する実験セクションに記載のように、抗体を、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けし選択する。必要ならば、マウス定常領域を所望のヒト定常領域、例えば、野生型又は修飾ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４と置き換えて、完全ヒト抗アクチビンＡ抗体を生成する。選択される定常領域は特異的用途に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特徴及び標的特異性特徴は、可変領域に存在する。ある特定の例では、完全ヒト抗アクチビンＡ抗体は、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離される。

【0107】

生物学的等価物
本発明の抗アクチビンＡ抗体及び抗体断片は、記載される抗体のものとは異なるアミノ酸配列を有するが、アクチビンＡに結合する能力を保持しているタンパク質を包含する。かかる変異抗体及び抗体断片は、親配列と比較して、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、記載される抗体のものと本質的に同等である生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗アクチビンＡ抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較して、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、本発明の抗アクチビンＡ抗体又は抗体断片と本質的に生物学的に等価である抗アクチビンＡ抗体又は抗体断片をコードする配列を包含する。そのような変異体アミノ酸及びＤＮＡ配列の例は、上で議論されている。

【0108】

２つの抗原結合タンパク質又は抗体は、例えば、それらが類似の実験条件下で単回用量又は複数回用量のいずれかで同じモル用量で投与された場合に、吸収速度及び吸収の程度が有意差を示さない医薬的等価物又は医薬的選択肢である場合、生物学的等価物とみなされる。いくつかの抗体は、これらの吸収の程度において等価であるが、吸収速度は等価ではなく、また吸収速度のそのような差が意図的であり、かつ標識する際に反映されているため生物学的に等価とみなされ得る場合、等価物又は医薬代替物とみなされ、例えば長期使用に及ぼす有効な身体薬物濃度の達成に必須ではなく、かつ研究される特定の薬物生成物にとって医学的に有意ではないとみなされる。

【0109】

一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらの安全性、純度、又は有効性において臨床的に有意性のある差がない場合、生物学的に等価である。

【0110】

一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、免疫原性の臨床的に有意な変化又は有効性の減退を含む有害作用のリスクの期待される上昇なしで参照生成物と生物学的生成物との間での切り替えなしで持続される療法と比較して、患者が１回以上切り替えられることができる場合、生物学的に等価である。

【0111】

一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、条件又は使用条件についての共通の機序又は作用機序によって、このような機序が既知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。

【0112】

生物学的等価性は、インビボ及びインビトロの方法によって実証され得る。生物学的等価性尺度には、例えば、（ａ）抗体又はその代謝産物の濃度が、血液、血漿、血清、又は他の生物学的流体において時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験、（ｂ）ヒトインビボバイオアベイラビリティデータと相関しており、かつ合理的に予測的なインビトロ試験、（ｃ）抗体（又はその標的）の適切な急性薬理効果を時間の関数として測定する、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験、及び（ｄ）抗体の安全性、有効性、又はバイオアベイラビリティ若しくは生物学的等価性を確立する十分に制御された臨床試験が含まれる。

【0113】

本発明の抗アクチビンＡ抗体の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基若しくは配列の様々な置換を生じさせること、又は生物活性に必要とされない末端若しくは内部の残基若しくは配列を欠失させることによって構築され得る。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要又は不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失又は他のアミノ酸で置換することができる。他の背景では、生物学的に等価の抗体には、抗アクチビンＡ抗体のグリコシル化特徴を修飾するアミノ酸変化、例えばグリコシル化を排除又は除去する変異を含む、抗体変異体が含まれ得る。

【0114】

種の選択性及び種の交差反応性
本発明は、ある特定の実施形態によると、ヒトアクチビンＡに結合するが、他の種由来のアクチビンＡには結合しない抗アクチビンＡ抗体を提供する。本発明にはまた、ヒトアクチビンＡ及び１つ以上の非ヒト種由来のアクチビンＡに結合する抗アクチビンＡ抗体が含まれる。例えば、本発明の抗アクチビンＡ抗体は、ヒトアクチビンＡに結合し得、いくつかの場合では、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル又はチンパンジーのアクチビンＡのうちの１つ以上に結合得るか、又は結合し得ない。本発明の特定の例示的な実施形態によれば、ヒトアクチビンＡ（例えば、アクチビンＡ又はβＡサブユニット含有ヘテロ二量体）及びカニクイザル（例えば、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）アクチビンＡに特異的に結合する抗アクチビンＡ抗体が提供される。

【0115】

多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、又は多重特異性であってもよい。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、又は２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７：６０－６９ （１９９１）、Ｋｕｆｅｒら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：２３８－２４４（２００４）を参照。本発明の抗アクチビンＡ抗体は、別の機能性分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質に連結するか、又はそれと同時発現させることができる。例えば、抗体又はその断片は、別の抗体又は抗体断片などの１つ以上の他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合、若しくは他の方法により）機能的に連結されて、第２の結合特異性を有する二重特異性抗体又は多重特異性抗体を産生することができる。例えば、本発明には、免疫グロブリンの一方のアームがヒトアクチビンＡ又はその断片に特異的であり、免疫グロブリンの他方のアームが第２の治療標的に特異的であるか、又は治療部分にコンジュゲートしている、二重特異性抗体が含まれる。本発明の一実施形態は、免疫グロブリンの一方のアームがヒトアクチビンＡ又はその断片に特異的であり、免疫グロブリンの他方のアームがＧＤＦ８に特異的である二重特異性抗体を含む。

【0116】

本発明の文脈において使用することのできる例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｃ_Ｈ３ドメイン及び第２のＩｇＣ_Ｈ３ドメインの使用を包含し、第１及び第２のＩｇＣ_Ｈ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸ほど互いに異なっており、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、このアミノ酸の相違を欠失する二重特異性抗体と比較して、プロテインＡへの二重特異性抗体の結合を低減させる（例えば、全内容を参照により本明細書に組み込む米国特許第８，５８６，７１３号明細書を参照）。一実施形態では、第１のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、プロテインＡに結合し、第２のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによるもの、ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を減少又は消失させる突然変異を含む。第２のＣ_Ｈ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによるもの、ＥＵによるＹ４３６Ｆ）を更に含み得る。第２のＣ_Ｈ３内に見出され得る更なる改変としては、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによるもの、ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによるもの、ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）、並びにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、Ｖ８２Ｉ、及びＬ１０５Ｐ（ＩＭＧＴによるもの、ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、Ｖ４２２Ｉ、及びＬ４４５Ｐ）を更に含み得る。上記に記載される二重特異性抗体フォーマットの変形は、本発明の範囲内で熟慮される。

【0117】

本発明の背景において使用することができる他の例示的な二重特異性フォーマットには、例えば、ｓｃＦｖ系フォーマット又はダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（dual variable domain、ＤＶＤ）－Ｉｇ、Ｑｕａｄｒｏｍａ、ノブズ－イントゥ－ホールズ（knobs-into-holes）、共通の軽鎖（例えば、ノブズ－イントゥ－ホールズを有する共通の軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用型Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、及びＭａｂ^２二重特異性フォーマットが含まれるが、これらに限定されない（上述のフォーマットの総説については、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ４：６，１－１１ （２０１２）、及びそこに引用されている参考文献を参照されたい）。二重特異性抗体はまた、ペプチド／核酸接合を使用して構築することもでき、例えば、直交化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異性抗体－オリゴヌクレオチド抱合体を生成し、これが次に、定義される組成物、原子価、及び幾何学的形状を有する多量体複合体へと自己集合する。（例えば、Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１３５（１）：３４０／３４６（２０１３）を参照）。

【0118】

治療製剤及び投与
本発明の方法において使用される抗アクチビンＡ抗体（又は他の抗アクチビンＡ特異的アンタゴニスト）は、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を用いた薬学的組成物における投与のために製剤化され得る。薬学的組成物は、適切な担体、賦形剤、及び改善された移動、送達、耐性などをもたらす他の薬剤とともに製剤化される。多くの適切な製剤は、薬剤師全員に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて認めることができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡなど）を含む脂質（カチオン性又はアニオン性）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト、水中油エマルション及び油中水エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、並びにカーボワックスを含む半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」 ＰＤＡ，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１（１９９８）も参照されたい。

【0119】

患者に投与される抗体の用量は、患者の年齢及び体格、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変わり得る。好ましい用量は、典型的には体重又は体表面積に従って計算される。本発明の抗体が成人患者におけるアクチビンＡの活性に関連する症状又は疾患を治療するために使用される場合、本発明の抗体を通常は約０．０１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２～約７、約０．０３～約５、又は約０．０５～約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で投与することが有利であり得る。いくつかの実施形態では、用量は３ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、用量は１０ｍｇ／ｋｇである。容態の重篤度に応じて、治療の頻度及び期間を調整することができる。「重症」の疾患（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）の患者は、鼻カニューレ、単純なフェースマスク、又は他の同様の酸素送達デバイスによる酸素補給の投与を必要とする。「最重症」の疾患（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）の患者は、高流量鼻カニューレの非再呼吸マスクによって送達される酸素補給、又は侵襲的若しくは非侵襲的換気の使用を必要とするか、又は集中治療室での治療を必要とする。抗アクチビンＡ抗体を投与するための有効投与量及びスケジュールは、実験的に決定され得、例えば、患者の進行は、定期的な評価によってモニタリングされ得、それに応じて用量が調整される。更に、投与量の種間スケーリングは、当該技術分野において周知の方法を用いて実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｒｅｓ ８：１３５１（１９９１））。

【0120】

様々な送達系が既知であり、本発明の薬学的組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム封入、マイクロ粒子、マイクロカプセル、本発明の抗体又は他の治療用タンパク質を発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシスである（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：４４２９－４４３２（１９８７）を参照されたい）。本発明の抗体及び他の治療活性成分はまた、遺伝子療法技術によって送達され得る。導入方法には、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路及び経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば、注入若しくはボーラス注射によって、上皮若しくは粘膜皮膚内層（linings）（例えば、口腔粘膜、直腸、及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与することができ、かつ他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身又は局所であり得る。

【0121】

薬学的組成物は、標準的な針及び注射器を用いて皮下に又は静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の薬学的組成物を送達する際の適用を容易にする。このようなペン型送達デバイスは、再利用可能又は使い捨て可能であり得る。再利用可能なペン型送達デバイスは、概して、薬学的組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。一度、カートリッジ内の薬学的組成物が全て投与され、カートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄することができ、薬学的組成物を含む新しいカートリッジと容易に交換することができる。次に、ペン型送達デバイスは再利用することができる。使い捨てのペン型送達デバイスにおいて、交換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、このデバイス内の貯蔵器の中に保持された薬学的組成物が事前に充填されている。貯蔵器から薬学的組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。

【0122】

数多くの再利用可能なペン型及び自動注射送達デバイスは、本明細書で考察される薬学的組成物の皮下送達の用途を有する。例としては、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されず、ほんの数種類しか挙げていない。本発明の薬学的組成物の皮下送達での用途を有する使い捨てペン型送達デバイスの例としては、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注射器（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）及びＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0123】

ある特定の状況において、薬学的組成物は、徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ、上記、Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１ （１９８７）を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。更に別の実施形態では、徐放系を組成物の標的の近傍に配置することができ、それによって全身用量のほんの一部のみが必要となる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、上記、ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８を参照されたい）。他の徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３（１９９０）による総説で考察されている。

【0124】

注射可能な調製物には、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、及び筋肉内注射、点滴注入などのための剤形が含まれてもよい。これらの注射可能な調製物は、公に知られている方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射用に従来通り使用される滅菌水性媒体又は油性媒体中に上述の抗体又はその塩を溶解、懸濁又は乳化させることによって調製され得る。注射用の水性媒体として、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の助剤を含有する等張溶液がある。

【0125】

併用療法
本発明には、本明細書に記載の抗アクチビンＡ抗体のいずれかを、１つ以上の追加の治療活性成分と組み合わせて使用又は投与することを含む方法が含まれる。いくつかの場合では、本発明の抗アクチビンＡ抗体はまた、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド、ステロイド、酸素、抗酸化剤、金属キレート剤、ＩＦＮ－γ、及び／又はＮＳＡＩＤと組み合わせて投与及び／又は共製剤化され得る。いくつかの場合では、本発明の抗アクチビンＡ抗体はまた、心不全又は心不全の１つ以上の合併症を治療する、予防する、又はその重篤度を低減するための追加の活性薬剤又は他の支持療法と組み合わせて投与又は使用され得る。いくつかの場合では、追加の活性薬剤又は他の支持療法は、ペースメーカー、移植可能細動除去器、心収縮性調節、心臓再同期療法、補助人工心臓、両室心臓再同期療法、心臓移植、アドレナリン作用性ブロッカー（α遮断薬及びβ遮断薬）、中枢性α－アゴニスト、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬、カルシウム拮抗薬、陽性変力薬、血管拡張神経、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、抗血栓薬、様々なタイプの利尿剤、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、ラミプリル、ゾフェノプリル、キナプリル、ペリンドプリル（perinodopril）、リシノプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル及びフォシノプリル、ロサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、イルベサルタン、テルミサルタン、エプロサルタン、オルメサルタン、アジルサルタン、フィマサルタン、プロプラノロール、ブシンドロール、カルテオロール、カルベジロール、ラベタロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、ソタロール、チモロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、セリプロロール、エスモロール、メトプロロール、ネビボロール、ブタキサミン（butazamine）、ＩＣＩ－１１８，５５１、ＳＲ ５９２３０Ａ、フェノキシベンザミン、フェントラミン、トラゾリン、トラゾドン、アルフゾシン、ドキサゾシンメシレート（Ｃａｒｄｕｒａ及びＣａｒｄｕｒａｎ）、プラゾシン、タムスロシン、テラゾシン、シロドシン、アチパメゾール（atipanmezole、例えば、アンチセダン）、イダゾキサン、ミルタザピン、ヨヒンビン、アシドーシス性塩（例えば、ＣａＣｌ_２及びＮＨ_４Ｃｌ）、アルギニンバソプレシン受容体２アンタゴニスト、選択的バソプレッシンＶ２アンタゴニスト、Ｎａ－Ｈ交換体アンタゴニスト、炭酸アンヒドラーゼ阻害剤、ループ利尿薬、浸透圧性利尿薬、カリウム保持性利尿薬、サイアザイド、キサンチン、ジヒドロピリジン、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、イスラジピン、エホニジピン、フェロジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、プラニジピン、フェニルアルキルアミンカルシウム拮抗薬、ベラパミル、ガロパミル、フェンジリン、ベンゾチアゼピンカルシウム拮抗薬、ジルチアゼム、ミベフラジル、ベプリジル、フルナリジン、フルスピリレン、フェンジリン、ガバペンチノイド、ジコノチド、ジゴキシン、アミオダロン、ベルベリン、レボシメンダン、オメカムチブ、カテコールアミン、エイコサノイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、エノキシモン、ミルリノン、アムリノン、テオフィリン、グルカゴン、インスリン、ニトロフェリシアン化ナトリウム、ヒドララジン、硝酸イソソルビド及びイソソルビドモノニトラート、ニトログリセリン、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、クロニジン、グアナベンズ、グァンファシン、メチルドパ及びモキソニジン、ミノキシジル、グアネチジン、メカミラミン、レセルピン、不可逆シクロオキシゲナーゼ阻害剤、アデノシン二リン酸受容体阻害剤、クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロール及びチクロピジン（ホスホジエステラーゼ阻害剤、シロスタゾール、プロテアーゼ活性化受容体－１アンタゴニスト、ボラパキサール、糖タンパク質阻害剤、アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン、アデノシン再取込み阻害剤、ジピリダモール、トロンボキサン阻害剤、トロンボキサンシンターゼ阻害剤及びトロンボキサン受容体アンタゴニスト、組織プラスミノゲン活性化因子、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、アニストレプラーゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ダビガトラン、リバロキサバン）、アピキサバン、クマリン、ヘパリン及びその誘導体、因子Ｘａ阻害剤、リバロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、べトリキサバン、レタキサバン、エリバキサバン、ヒルジン、レピルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、キシメラガトラン、アンチトロンビンタンパク質、バトロキソビン、ヘメンチン及びビタミンＥからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明の抗アクチビンＡ抗体のいずれも、ＧＤＦ８阻害剤（例えば、抗ＧＤＦ８抗体）と組み合わせて投与されてもよくて、及び／又は共製剤化されてもよい。

【0126】

追加の治療活性成分又は支持療法を、本発明の抗アクチビンＡ抗体の投与前に対象に投与又は使用し得る。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与／使用の１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、１５分前、１０分前、５分前、又は１分未満に投与／使用される場合、第１の成分は、第２の成分の「前に」投与／使用されるとみなされ得る。他の実施形態では、追加の治療活性成分又は支持療法を、本発明の抗アクチビンＡ抗体の投与後に対象に投与又は使用し得る。例えば、第１の成分が第２の成分の投与／使用の１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後に投与／使用される場合、第１の成分は、第２の成分の「後に」投与／使用されるとみなされ得る。更に他の実施形態では、追加の治療活性成分又は支持療法を、本発明の抗アクチビンＡ抗体の投与と同時に対象に投与又は使用し得る。本発明の目的のための「同時」投与には、例えば、対象への抗アクチビンＡ抗体及び追加の治療活性成分の、単一剤形での、又は互いに約３０分以内に対象へ投与される別個の剤形での投与が含まれる。別個の剤形で投与される場合、各剤形は、同じ経路を介して投与され得る（例えば、抗アクチビンＡ抗体及び追加の治療活性成分の両方が静脈内、皮下、硝子体内などに投与され得る）。あるいは、各剤形は、異なる経路を介して投与され得る（例えば、抗アクチビンＡ抗体は、局所的に（例えば、硝子体内に）投与され得、追加の治療活性成分は、全身的に投与され得る）。いずれの事象においても、単回剤形で、同じ経路による別個の剤形で、又は異なる経路による別個の剤形でこの成分を投与することは全て、本開示の目的のために、「同時投与」とみなされる。本開示の目的のために、追加の治療活性成分の投与「の前の」、「と同時の」、又は「の後の」抗アクチビンＡ抗体の投与は、追加の治療活性成分「と組み合わせた」抗アクチビンＡ抗体の投与と考えられる。

【0127】

本発明には、本発明の抗アクチビンＡ抗体が、本明細書の他箇所に記載の追加の治療活性成分のうちの１つ以上と共製剤化された医薬組成物が含まれる。

【0128】

投与量
対象に投与され得る活性成分の量（例えば、抗アクチビンＡ抗体、抗ＧＤＦ８抗体、又は抗アクチビンＡ抗体と組み合わせて与えられる他の治療薬、又はアクチビンＡ及びＧＤＦ８に特異的に結合する二重特異性抗体）は、一般に、本明細書の他の箇所で考察されるように、治療有効量である。

【0129】

いくつかの実施形態では、治療有効量は、約０．０５ｍｇ～約６００ｍｇ、例えば、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、約１．０ｍｇ、約１．５ｍｇ、約２．０ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２７０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約２９０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３１０ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３３０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３７０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約３９０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４１０ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４３０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４７０ｍｇ、約４８０ｍｇ、約４９０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５１０ｍｇ、約５２０ｍｇ、約５３０ｍｇ、約５４０ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５６０ｍｇ、約５７０ｍｇ、約５８０ｍｇ、約５９０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６１０ｍｇ、約６２０ｍｇ、約６３０ｍｇ、約６４０ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６６０ｍｇ、約６７０ｍｇ、約６８０ｍｇ、約６９０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７１０ｍｇ、約７２０ｍｇ、約７３０ｍｇ、約７４０ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７６０ｍｇ、約７７０ｍｇ、約７８０ｍｇ、約７９０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８１０ｍｇ、約８２０ｍｇ、約８３０ｍｇ、約８４０ｍｇ、約８５０ｍｇ、約８６０ｍｇ、約８７０ｍｇ、約８８０ｍｇ、約８９０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９１０ｍｇ、約９２０ｍｇ、約９３０ｍｇ、約９４０ｍｇ、約９５０ｍｇ、約９６０ｍｇ、約９７０ｍｇ、約９８０ｍｇ、約９９０ｍｇ、又は約１０００ｍｇの、それぞれの抗体とすることができる。

【0130】

個々の用量に含まれる抗アクチビンＡ抗体又は他の治療薬の量は、患者の体重１キログラム当たりの抗体のミリグラム単位（すなわち、ｍｇ／ｋｇ）で表され得る。例えば、抗アクチビンＡ、抗ＧＤＦ ８、及び／又は抗アクチビンＡ／抗ＧＤＦ ８二重特異性抗体は、患者に、約０．０００１～約５０ｍｇ／ｋｇ患者体重（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、９．５ｍｇ／ｋｇ、１０．０ｍｇ／ｋｇ、１０．５ｍｇ／ｋｇ、１１．０ｍｇ／ｋｇ、１１．５ｍｇ／ｋｇ、１２．０ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、１３．０ｍｇ／ｋｇ、１３．５ｍｇ／ｋｇ、１４．０ｍｇ／ｋｇ、１４．５ｍｇ／ｋｇ、１５．０ｍｇ／ｋｇ、１５．５ｍｇ／ｋｇ、１６．０ｍｇ／ｋｇ、１６．５ｍｇ／ｋｇ、１７．０ｍｇ／ｋｇ、１７．５ｍｇ／ｋｇ、１８．０ｍｇ／ｋｇ、１８．５ｍｇ／ｋｇ、１９．０ｍｇ／ｋｇ、１９．５ｍｇ／ｋｇ、２０．０ｍｇ／ｋｇなど）の用量で投与し得る。

【0131】

投与レジメン
本発明のある特定の実施形態によれば、複数回用量の有効成分（例えば、抗アクチビンＡ抗体、抗アクチビンＡ抗体と組み合わせて投与される抗ＧＤＦ８抗体、抗アクチビンＡ抗体と、例えば抗ＧＤＦ８抗体、又はアクチビンＡ及びＧＤＦ８に特異的に結合する二重特異性抗体を含めた、抗アクチビンＡ抗体と本明細書で言及される追加の治療活性剤のいずれかとの組み合わせを含む医薬組成物）を、規定の時間経過にわたって対象に投与することができる。本発明のこの態様による方法は、本発明の活性成分の複数回用量を対象に連続的に投与することを含む。本発明で使用する場合、「連続的に投与すること」は、活性成分の各用量が、異なる時点、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間、又は数ヶ月）よって分けられた異なる日に、対象に投与されることを意味する。本発明には、活性成分の単回初期用量、続いて活性成分の１回以上の二次用量、続いて任意に活性成分の１回以上の三次用量を患者に連続的に投与することを含む方法が含まれる。

【0132】

「初期用量」、「二次用量」、及び「三次用量」という用語は、活性成分、例えば、本発明の抗アクチビンＡ抗体、又は本発明の併用療法、例えば、抗アクチビンＡ抗体及び抗ＧＤＦ８抗体の投与の時間的順序を指す。したがって、「初期用量」は、治療レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）である。「二次用量」は、初期投与後に投与される用量であり、「三次用量」は、二次用量後に投与される用量である。初期用量、二次用量、及び三次用量は全て、同じ量の活性成分、例えば、抗アクチビンＡ抗体を含み得るが、概して、投与頻度に関して互いに異なり得る。しかしながら、ある特定の実施形態では、初期用量、二次用量、及び／又は三次用量に含まれる抗アクチビンＡ抗体の量は、治療経過中、互いに異なる（例えば、必要に応じて増減調整される）。ある特定の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、又は５回）の用量が治療レジメンの開始時において「負荷用量（loading dose）」として投与され、続いてより低い頻度に基づいて投与される後続用量（例えば、「維持用量」）が投与される。

【0133】

本発明のある特定の例示的な実施形態では、各二次用量及び／又は三次用量は、直前の用量の１～２６（例えば、１、１^１／_２、２、２^１／_２、３、３^１／_２、４、４^１／_２、５、５^１／_２、６、６^１／_２、７、７^１／_２、８、８^１／_２、９、９^１／_２、１０、１０^１／_２、１１、１１^１／_２、１２、１２^１／_２、１３、１３^１／_２、１４、１４^１／_２、１５、１５^１／_２、１６、１６^１／_２、１７、１７^１／_２、１８、１８^１／_２、１９、１９^１／_２、２０、２０^１／_２、２１、２１^１／_２、２２、２２^１／_２、２３、２３^１／_２、２４、２４^１／_２、２５、２５^１／_２、２６、２６^１／_２以上）週間後に投与される。「直前の用量」という句は、本明細書で使用される場合、一連の複数の投与では、介入用量なく順に直後の用量の投与の前に患者に投与される活性成分、例えば、抗アクチビンＡ抗体の用量を意味する。

【0134】

本発明のこの態様による方法は、本発明の活性成分、例えば、抗アクチビンＡ抗体の任意の回数の二次用量及び／又は三次用量を患者に投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態において、単回の二次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回以上）の二次用量が患者に投与される。同様に、特定の実施形態では、単回の三次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回以上）の三次用量が患者に投与される。

【0135】

複数回の二次用量を伴う実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の投与の１～２週間後又は１～２ヶ月後に患者に投与されてもよい。同様に、複数の三次用量を伴う実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各三次用量は、直前の用量の２～１２週間後に患者に投与され得る。本発明のある特定の実施形態において、二次用量及び／又は三次用量が患者に投与される頻度は、治療レジメンの経過にわたって変わり得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療経過中に調整され得る。

【0136】

本発明は、２～６回の負荷用量が患者に第１の頻度（例えば、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回など）で投与され、続いてより少ない頻度で２回以上の維持用量が患者に投与される、投与レジメンを含む。例えば、本発明のこの態様によれば、負荷用量が月に１回の頻度で投与される場合、維持用量は６週間に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回などで患者に投与されてもよい。

【0137】

キット
本発明は更に、包装材料、容器、及び容器内に含まれる医薬品を含む製造品又はキットを提供し、医薬品は、少なくとも１つのアクチビンＡアンタゴニスト（例えば、抗アクチビンＡ抗体）を含み、包装材料は、使用（例えば、心機能障害又は心不全を治療するための抗アクチビンＡ抗体の例えば使用）の使用説明及び指示を示すラベル又は添付文書を含む。

【実施例】

【0138】

以下の実施例は、本発明の方法及び組成物をどのように作製及び使用するかに関する完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を限定することを企図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はなされたが、ある程度の実験上の誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又はそれに近い圧力である。

【0139】

実施例１．アクチビンＡに対するヒト抗体の生成
アクチビンＡタンパク質（インヒビン－βＡ二量体）を含む免疫原を、ヒト免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに、免疫応答を刺激するためのアジュバントとともに直接投与した。抗体の免疫応答を、アクチビンＡ特異的免疫測定法によってモニタリングした。所望の免疫応答が達成されたとき、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニング及び選択して、アクチビンＡ特異的抗体を産生する細胞株を同定した。この技法を使用して、いくつかの抗アクチビンＡキメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びマウス定常ドメインを有する抗体）を得た。このようにして得られる例示的な抗体は、Ｈ２ａＭ１０９６５Ｎである。その後、キメラ抗体由来のヒト可変ドメインをヒト定常ドメイン上にクローニングして、本明細書に記載の完全ヒト抗アクチビンＡ抗体を作製した。

【0140】

更に、米国特許出願公開第２００７／０２８０９４５（Ａ１）号に記載されるように、いくつかの抗アクチビンＡ抗体を、骨髄腫細胞に融合させることなく抗原陽性Ｂ細胞から直接単離した。この方法を使用して、いくつかの完全ヒト抗アクチビンＡ抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びヒト定常ドメインを有する抗体）が得られた。このようにして作製した例示的な抗体を以下のように命名した：Ｈ４Ｈ１０４２３Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４２９Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４３０Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４３２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４０Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４３６Ｐ２、及びＨ４Ｈ１０４４６Ｐ２。

【0141】

本実施例の方法に従って産生された例示的な抗アクチビンＡ抗体の特定の生物学的特性を、以下に示す実施例において詳細に説明する。

【0142】

実施例２．重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列
表１は、選択された抗アクチビンＡ抗体に特異的な抗体及びそれらの対応する抗体識別子の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列対を記載する。対応する核酸配列識別子を表２に示す。

【0143】

【表1】

【0144】

【表2】

【0145】

抗体は、典型的には、本明細書において以下の命名法：Ｆｃ接頭辞（例えば、「Ｈ１Ｍ」、「Ｈ２ａＭ」、「Ｈ４Ｈ」）、続いて数値識別子（例えば、表１及び２に示すように、「１０４２３」、「１０４２４」又は「１０４２６」）、続いて「Ｐ」、「Ｐ２」、又は「Ｎ」接尾辞、に従って記載される。したがって、この命名法によれば、抗体は、本明細書では、例えば、「Ｈ４Ｈ１０４２３Ｐ」、「Ｈ４Ｈ１０４３２Ｐ２」、「Ｈ２ａＭ１０９６５Ｎ」などと言及され得る。本明細書に使用される抗体名のＨ１Ｍ、Ｈ２Ｍ、及びＨ４Ｈの接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを示す。例えば、「Ｈ２ａＭ」抗体はマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃを有するのに対し、「Ｈ４Ｈ」抗体はヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する。当業者によって理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体へ変換することができる（例えば、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ４を有する抗体へ変換することができる、など）が、いずれの事象においても、表１に示す数値識別子によって示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は同じままであることになっており、結合特性はＦｃドメインの性質にかかわらず、同一又は実質的に類似であると期待される。

【0146】

以下の実施例にて使用される対照構築物
抗アクチビンＡ対照分子を、比較目的のために以下の実施例に含めた。本明細書において対照１と称される対照抗体は、米国特許第８，３０９，０８２号に記載される「Ａ１」の重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を有するヒト抗アクチビンＡ抗体である。対照２は、米国特許出願第２０１２／０２３７５２１（Ａ１）号においてＭＯＲ８１５９として開示されている抗ヒトアクチビン受容体ＩＩ型Ｂ抗体（抗ＡｃｔＲ２Ｂ ｍＡｂ）である。対照３は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入したマウス抗アクチビンＡモノクローナル抗体（カタログ番号ＭＡＢ３３８１）である。対照４は、アクチビンＩＩＢ型受容体－Ｆｃ融合分子（Ｃ末端ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質（ＮＰ＿００１０９７のＥ２３－Ｐ１３３、続いてＧｌｙ－Ｓｅｒリンカー、続いてＣ末端ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合物）を用いて産生された可溶性アクチビンＲＩＩＢ受容体細胞外ドメイン）であり、その配列は配列番号２２７として示される。

【0147】

実施例３．表面プラズモン共鳴によって決定されるヒトアクチビンＡへの抗体結合
リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００又はＢｉａｃｏｒｅ ４０００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００又はＢｉａｃｏｒｅ ４０００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）アッセイを２５℃及び３７℃で使用して、選択された精製抗ヒトアクチビンＡモノクローナル抗体に対する抗原結合の結合親和性及び速度定数を測定した。マウスＦｃ（接頭辞Ｈ２ａＭ）又はヒトＦｃ（接頭辞Ｈ４Ｈ）のいずれかとして発現される抗体を、それらのそれぞれの抗Ｆｃセンサー表面上に捕捉した（ｍＡｂ捕捉フォーマット）。Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップへの直接アミンカップリングによって作製された、ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃ＢＲ－１００８－３８）又はマウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃ＢＲ－１００８－３９）表面のいずれかに、抗アクチビンＡ抗体を捕捉した。ＨＢＳ－ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ ７．４）又はＰＢＳ－Ｐ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ ７．４）のいずれかをランニング緩衝液及び試料緩衝液の両方として使用して、動態実験を行った。様々な濃度（５０～０．２ｎＭの範囲の４倍希釈）のアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３３８－ＡＣ－０５０／ＣＦ）、アクチビンＢ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃６５９－ＡＢ－０２５／ＣＦ）、アクチビンＡＢ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１００６－ＡＢ－００５）、アクチビンＡＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃４８７９－ＡＣ／ＣＦ）、又はインヒビンＥ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、＃Ｈ０００８３７２９－Ｐ０１）のいずれかを捕捉された抗体表面に注入することによって、抗原－抗体会合速度を測定した。抗体－抗原の会合を２４０秒間モニタリングし、一方、緩衝液中での解離を６００秒間モニタリングした。動的会合及び解離の速度定数を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェアバージョン２．０ｃを使用してデータを処理及びフィッティングすることによって決定した。次いで、結合平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）及び解離半減期（ｔ_１／２）を、以下のように動態速度定数から計算した：Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａ及びｔ_１／２（分）＝［ｌｎ２／（６０^＊ｋ_ｄ）］。異なる抗アクチビンＡモノクローナル抗体の動的結合パラメータを表３～１０に示す。（ＮＢ＝使用した条件下で結合が観察されなかったＮＴ＝試験しなかった）。

【0148】

【表3】

【0149】

イタリック体のｋｄ値については、これらの実験条件下で分析物の解離は観察されず、したがってｋｄの値は５．０Ｅ－０５ ｓ^－１に固定された。

【0150】

【表4】

【0151】

イタリック体のｋｄ値については、これらの実験条件下で分析物の解離は観察されず、したがってｋｄの値は５．０Ｅ－０５ ｓ^－１に固定された。

【0152】

【表5】

【0153】

【表6】

【0154】

【表7】

【0155】

【表8】

【0156】

【表9】

【0157】

【表10】

【0158】

表３及び４に示されるように、本発明の抗アクチビンＡ抗体は、２５℃で３．１８ｐＭ未満（すなわち、≦３．１８Ｅ－１２）～７４５ｐＭ（すなわち、７．４５Ｅ－１０）までの範囲のＫ_Ｄ値、及び３７℃で２．１８ｐＭ未満（すなわち、≦２．１８Ｅ－１２）～１．７７ｎＭ（１．７７Ｅ－０９）までの範囲のＫ_Ｄ値でアクチビンＡに結合した。表５及び６に示されるように、抗アクチビンＡ抗体のいくつか（すなわち、Ｈ４Ｈ１０４３２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４３０Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４６Ｐ２、及びＨ４Ｈ１０４６８Ｐ２）は、２５℃又は３７℃でアクチビンＢへの測定可能な結合を示さなかった。抗体のいくつかは、２５℃で約１８．５ｐＭ（すなわち、１．８５Ｅ－１１）～３３．１ｎＭ（すなわち、３．３１Ｅ－０８）（表７）、及び３７℃で約４４．３ｐＭ（すなわち、４．４３Ｅ－１１）～２４．２ｎＭ（すなわち、２．４２Ｅ－０８）（表８）の範囲のＫ_Ｄ値で、アクチビンＡＢへの測定可能な結合を示した。抗体のいくつかは、２５℃で約９９．７ｐＭ（すなわち、９．９７Ｅ－１１）～１１．８ｎＭ（すなわち、１．１８Ｅ－０８）（表９）、及び３７℃で約４６２ｐＭ（すなわち、４．６２Ｅ－１０）～２２．５ｎＭ（すなわち、２．２５Ｅ－０８）（表１０）の範囲のＫ_Ｄ値で、アクチビンＡＣへの測定可能な結合を示した。更に、試験した本発明の抗アクチビンＡ抗体のいずれも、インヒビンＥへの測定可能な結合を示さなかった（データ示さず）。

【0159】

実施例４．抗アクチビンＡ抗体による、アクチビンＡ媒介性の受容体活性化及びＳＭＡＤ複合体シグナル伝達の阻害
本明細書において考察される抗アクチビンＡ抗体を更に特徴付けるために、バイオアッセイを開発して、アクチビンＩＩＡ型受容体及びアクチビンＩＩＢ型受容体（それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＡ及びＡｃｔＲＩＩＢ）の活性化、並びにその後のアクチビンＩ型受容体のリン酸化及び活性化を検出した。ＡｃｔＲＩＩＡ及びＡｃｔＲＩＩＢとアクチビンとの間の相互作用は、増殖調節、がん細胞の転移及び胚性幹細胞の分化を含む多様な細胞プロセスの誘導をもたらす（Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ Ｓｉｇｎａｌ ７：１５ （２００９））。Ｉ型受容体のリン酸化及び活性化は、活性化ＳＭＡＤ複合体を形成するＳＭＡＤ ２及び３タンパク質のリン酸化をもたらし、遺伝子の転写調節をもたらす。

【0160】

アクチビンのアクチビンＩＩ型受容体への結合を介したＳＭＡＤ複合体シグナル伝達経路の活性化を検出するために、ヒトＡ２０４横紋筋肉腫細胞株（ＡＴＣＣ、＃ＨＴＢ－８２）を、Ｓｍａｄ ２／３－ルシフェラーゼレポータープラスミド（ＣＡＧＡｘ１２－Ｌｕｃ；Ｄｅｎｎｌｅｒ，１９９８）でトランスフェクトし、Ａ２０４／ＣＡＧＡｘ１２－Ｌｕｃ細胞株を作製した。Ａ２０４／ＣＡＧＡｘ１２－Ｌｕｃ細胞を、１０％ウシ胎児血清（fetal bovine serum、ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン及び２５０μｇ／ｍＬのＧ４１８を補充したＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃９０９０）中で維持した。バイオアッセイのために、Ａ２０４／ＣＡＧＡｘ１２－Ｌｕｃ細胞を、低血清培地、０．５％ＦＢＳ及びＯＰＴＩＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃３１９８５－０７０）中、１０，０００細胞／ウェルで９６ウェルアッセイプレート上に播種し、３７℃及び５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。リガンド用量応答を決定するために、アクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３３８－ＡＣ）、アクチビンＢ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃６５９－ＡＢ）、アクチビンＡＢ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１０６６－ＡＢ）及びアクチビンＡＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃４８７９－ＡＣ／ＣＦ）を１００～０．００２ｎＭまで１：３で連続希釈して細胞に添加し、またアクチビンを含有しない対照を設けた。アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、及びアクチビンＡＣは、それぞれ９９ｐＭ、４７ｐＭ、１９ｐＭ、及び４．４ｎＭのＥＣ_５０値でＡ２０４／ＣＡＧＡｘ１２－Ｌｕｃ細胞株を活性化することが観察された。阻害を測定するために、抗体を、１００～０．００２ｎＭ、１０００～０．０２ｎＭ、又は３００～０．００５ｎＭ（適切なアイソタイプ対照抗体を含有するか又は抗体を含有しない対照試料を含む）へと、１：３で連続希釈し、１００ｐＭアクチビンＡ、５０ｐＭアクチビンＢ、３０ｐＭアクチビンＡＢ、又は４ｎＭアクチビンＡＣを一定濃度で細胞に添加した。このアッセイにおいて陽性ブロッキング対照として対照４（ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃ；配列番号２２７）を使用した。３７℃及び５％ＣＯ_２で５．５時間インキュベートした後、ＯｎｅＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６０５１）を添加し、次いでルシフェラーゼ活性をＶｉｃｔｏｒ Ｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）機器を使用して検出した。Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）で非線形回帰（４パラメータロジスティック）を使用して結果を分析した。

【0161】

表１１に示すように、本発明の抗アクチビンＡ抗体は、３９ｐＭ～３．５ｎＭの範囲のＩＣ_５０値で１００ｐＭのアクチビンＡを遮断したが、対照１は８３ｐＭのＩＣ_５０値で遮断した。本発明の抗アクチビンＡ抗体のサブセットを、アクチビンＢ、ＡＢ、及びＡＣの遮断について試験した。試験した９つの抗体のうち４つは、１３０ｐＭ～１００ｎＭの範囲のＩＣ_５０値で、５０ｐＭのアクチビンＢを遮断した。アクチビンＢ遮断について試験された本発明の５つの抗体は、高い抗体濃度でのみ遮断したが、対照１は、測定可能なアクチビンＢ遮断を示さなかった。試験した本発明の８つの抗体は、１００ｐＭ～８．２ｎＭの範囲のＩＣ_５０値で３０ｐＭのアクチビンＡＢを遮断したが、対照４は５４０ｐＭのＩＣ_５０値で遮断した。１つの抗体、Ｈ４Ｈ１０４２３Ｐのみが、アクチビンＡＢの弱い遮断を示した。試験した８つの抗体のうち７つは、５８０ｐＭ～６．５ｎＭの範囲のＩＣ_５０値で４ｎＭのアクチビンＡＣを遮断したが、対照４は、１．１ｎＭのＩＣ_５０値で遮断した。１つの抗体Ｈ４Ｈ１０４２３Ｐは、アクチビンＡＣのいかなる遮断も実証しなかった。マウスＩｇＧ（ｍＩｇＧアイソタイプ対照）及びヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧアイソタイプ対照）陰性対照は両方とも、受容体のリガンド活性化を遮断しなかった。

【0162】

【表11】

【0163】

Ａ２０４／ＣＡＧＡｘ１２－Ｌｕｃ細胞を使用するバイオアッセイは、ＧＤＦ８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号７８８－Ｇ８／ＣＦ）及びＧＤＦ１１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１９５８－ＧＤ－０１０／ＣＦ）によっても刺激することができた。アクチビンＡ抗体によるこれらのリガンドの機能的阻害について試験するために、上記の条件を使用するが、活性化リガンドをＧＤＦ８又はＧＤＦ１１に置き換えてアッセイを実施したところ、それぞれ１８８ｐＭ及び８４ｐＭのＥＣ５０値が得られた。このアッセイでは、一定濃度の０．５０ｎＭ ＧＤＦ８又は０．４０ｎＭ ＧＤＦ１１による活性化は、対照４によって完全に遮断され、ＩＣ_５０値はそれぞれ２９８ｐＭ及び２１４ｐＭであった。これらの同じ一定濃度のリガンドを使用して、１００ｎＭまでの抗体で試験した場合、アクチビンＡ抗体、Ｈ４Ｈ１０４４６Ｐ２及びＨ４Ｈ１０４３０ＰによるＧＤＦ８又はＧＤＦ１１のいずれの阻害も観察されなかった。別の日に、アクチビンＡ抗体Ｈ４Ｈ１０４２９Ｐ及びＨ４Ｈ１０４３６Ｐ２を、一定濃度の２５０ｐＭ ＧＤＦ８又は２５０ｐＭ ＧＤＦ１１の存在下で、このアッセイにおける阻害について試験し、細胞を１５０ｎＭまでの試験アクチビンＡ抗体とともにインキュベートした後、阻害は観察されなかった。このアッセイにおけるＧＤＦ８及びＧＤＦ１１単独は、それぞれ１２４ｐＭ及び１６６ｐＭのＥＣ５０値を示した。これらのデータは、アクチビンＡ抗体Ｈ４Ｈ１０４４６Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４３０Ｐ、Ｈ４Ｈ１０４２９Ｐ及びＨ４Ｈ１０４３６Ｐ２が、ＧＤＦ８又はＧＤＦ１１を機能的に阻害しないことを実証する。

【0164】

実施例５．アクチビンＡ抗体を用いたアクチビンＡ結合の遮断
選択された抗アクチビンＡ抗体が、アクチビンＡとその受容体であるＡｃｔＲＩＩＢ及びＡｃｔＲＩＩＡ、並びにその内因性アンタゴニストであるフォリスタチンとの相互作用を遮断する能力を、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００機器を使用して測定した。この実験では、対照４（Ｃ末端ヒトＦｃタグ（配列番号２２７）と共発現されたヒトＡｃｔＲＩＩＢ）、Ｃ末端ヒトＦｃタグと共発現されたヒトＡｃｔＲＩＩＡ（ｈＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３４０－Ｒ２－１００）、又はフォリスタチン－２８８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃５８３６－ＦＳ－０２５）を、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサー表面にアミンカップリングした。５ｎＭの固定濃度のアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３３８－ＡＣ）を、単独で、又は最終濃度６０ｎＭ（アクチビンＡに対して１２倍モル過剰）のアクチビンＡ抗体、ｈＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃ、ｈＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ、若しくはアイソタイプ対照抗体と混合して、室温で１時間インキュベートした。次いで、抗体－アクチビンＡ混合物を、２０ｕＬ／分の流速で、アミンカップリング対照４、ｈＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃ、又はフォリスタチン－２８８表面上に注入した。結合シグナル（ＲＵ）を注入開始後１５０秒で測定し、このシグナルを陰性対照参照表面について測定したＲＵ値で減算して、特異的結合シグナルを決定した。各抗アクチビンＡ抗体の存在下での受容体又はアンタゴニスト表面に対する遊離アクチビンＡ結合のパーセンテージを、観察された特異的結合シグナルを、抗体の非存在下での５ｎＭアクチビンＡからの特異的結合シグナルで割った比として計算した。

【0165】

【表12】

【0166】

表１２に示すように、試験した７つの抗アクチビンＡ抗体のうちの６つ、並びに対照１及び対照３の両方が、フォリスタチン－２８８へのアクチンＡの結合を遮断した。１つの抗体Ｈ４Ｈ１０４２３Ｐは、アクチビンＡのフォリスタチン－２８８への結合を妨げなかった。対照４及びｈＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃは、より高い濃度でアクチビンＡのフォリスタチン－２８８への結合を遮断した。

【0167】

【表13】

【0168】

表１３に示すように、試験した７つの抗アクチビンＡ抗体のうちの４つ、並びに対照１及び対照３の両方が、アクチビンＡへのｈＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃの結合を遮断した。３つの抗体、Ｈ４Ｈ１０４４２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１０４４６Ｐ２、及びＨ４Ｈ１０４２３Ｐは、アクチビンＡのｈＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃへの結合を妨げなかった。対照４及びｈＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃは、アクチビンＡのｈＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃへの結合を遮断した。

【0169】

【表14】

【0170】

表１４に示すように、試験した７つの抗アクチビンＡ抗体のうちの４つ、並びに対照１及び対照３の両方が、アクチビンＡのｈＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃへの結合を遮断した。２つの抗体、Ｈ４Ｈ１０４４２Ｐ２及びＨ４Ｈ１０４４６Ｐ２は、アクチビンＡのｈＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃへの結合を妨げなかった。１つの抗体、Ｈ４Ｈ１０４２３Ｐは、試験した抗体のより高い濃度でアクチビンＡのｈＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃへの結合を部分的に遮断する能力を示した。ｈＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ及びｈＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃの両方が、アクチビンＡのｈＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃへの結合を遮断した。

【0171】

実施例６．アクチビンＡは、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞において上流シグナル伝達を誘導し、心臓ストレス遺伝子を活性化する
ヒト人工多能性幹細胞由来（ＩＰＳＣ）心筋細胞の培養のために、組織培養容器を１０μｇ／ｍＬフィブロネクチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で、３７℃で１時間プレコーティングした。ヒトｉＰＳＣ－ＣＭ（ｉＣｅｌｌ心筋細胞^２；Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を製造業者の指示に従って保存し、解凍し、播種した。簡単に説明すると、細胞を急速解凍し（３７℃、３分間）、播種培地でゆっくり希釈した。遺伝子発現分析及びリン酸化アッセイのために、１２ウェルプレートのウェル当り５×１０^５個の細胞を播種した。インピーダンス、電気生理学、及びカルシウムフラックスアッセイのために、細胞を、ウェル当たり５×１０^４細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。細胞を、５％ＣＯ_２を含む加湿３７℃インキュベーター中で維持し、培地を４８時間毎に交換した。各実験を開始する前に、細胞の同期した拍動単層が形成されるまで（約１０～１４日）、細胞を培養液中で維持した。

【0172】

ＳＭＡＤリン酸化の検出のために、細胞を１ｎＭアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）に３０分間曝露した。細胞を冷却したリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、Ｈａｌｔ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＲＩＰＡ Ｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して溶解させた。溶解物を遠心分離し（１４，０００×ｇ、１５分）、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質定量キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して総タンパク質を定量した。細胞溶解物中のタンパク質検出を、キャピラリー電気泳動Ｗｅｓ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）のための１２－２３０ ｋＤａ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅを製造業者の説明書に従って使用して還元条件下で行った。タンパク質試料を５×還元緩衝液で０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈し、変性させ（５分間、９５℃）、氷上に置いた。カートリッジプレートを組み立て、遠心分離し（１０００×ｇ、５分間）、Ｗｅｓ（商標）装置に入れた。一次抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した。ホスホ－ＳＭＡＤ ２（Ｓｅｒ４６５／４６７）／ＳＭＡＤ３（Ｓｅｒ４２３／４２５）を１：５０に希釈し、ＳＭＡＤ２／３を１：５０に希釈し、ＧＡＰＤＨを１：１００に希釈した。抗ウサギ検出モジュール（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）には、抗体希釈剤、１×抗ウサギ二次抗体、ストレプトアビジン－ＨＲＰ結合体、及び化学発光検出試薬が供給される。Ｃｏｍｐａｓｓソフトウェア（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用してタンパク質検出を分析し、対象のタンパク質からのピーク化学発光シグナルの曲線下面積及び高さを定量化した。ＳＭＡＤ２／３リン酸化は、１ｎＭアクチビンＡに３０分間曝露されたｉＰＳＣ－ＣＭにおいて８３％有意に増加した（Ｐ＜０．００１）。阻害性アクチビンＡ抗体（ｍＡｂ２；Ｈ＄Ｈ１０４４６Ｐ２）は、ＳＭＡＤリン酸化におけるこの増加を遮断した（図１２を参照のこと）。これらのデータは、アクチビンＡがｉＰＳＣ－ＣＭにおいてシグナル伝達を誘導することを示す。

【0173】

遺伝子発現の分析のために、１０μＬの２×ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１μＬの２０×ＴａｑＭａｎプローブ、５μＬ（１０ｎｇ）のｃＤＮＡ、及び４μＬの水を含むＰＣＲ反応（合計２０μＬ）を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）３ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で実施した。サーモサイクラーの設定は以下の通りとした：９５℃で１５分間、次いで９５℃で１５秒間を４０サイクル、続いて６０℃で６０秒間。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）３機器ソフトウェアによって増幅プロットを作成し、得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を導出した。ＧＡＰＤＨを内因性対照として使用した。全てのＲＴ－ｑＰＣＲ分析について、デルタ－デルタＣｔ（２^{－ΔΔＣｔ}）法（Ｐｆａｆｆｌ ２００１）を使用して、遺伝子発現の相対倍率変化を計算した。アクチビンＡへのＩＰＳＣ心筋細胞の曝露（急性－２４時間、又は慢性－６回の治療）は、心臓ストレスの一般的なマーカーである、下流アクチビンＡシグナル伝達遺伝子ＦＳＴＬ３（別名ＦＬＲＧ）及びセルピン１（別名ＰＡＩ－１）、並びに心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＮＰＰＡ）及びＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＰＰＢ）の発現を活性化した（図１０を参照）。

【0174】

実施例７．抗アクチビンＡは、抗アクチビンＡ抗体によって遮断されるＩＰＳＣ－心筋細胞の収縮機能不全及び電気生理学的機能不全を誘導する
ＣａｒｄｉｏＥｘｃｙｔｅ ９６（Ｎａｎｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、すなわち、生理的培養条件下の無標識環境において心筋細胞の拍動単層のインピーダンス（収縮性）及び細胞外電場電位（ＥＦＰ）を同時に記録することができるハイブリッドシステムを使用して、ｉＰＳＣ－ＣＭの収縮性（インピーダンス）及び電気生理学を特徴付けた。この試験では、ｉＰＳＣ－ＣＭを、電極を含む９６ウェルプレート（ＮＳＰ－９６；Ｎａｎｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に播種し、４時間毎に３０秒間記録した。インピーダンス及びＥＦＰデータを、Ｄａｔａ Ｃｏｎｔｒｏｌ ９６ソフトウェア（Ｎａｎｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分析した。

【0175】

ＩＰＳＣ－心筋細胞を播種し、培地又は種々の濃度のアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と１回又は連続的に接触させながら、実験全体を通して収縮振幅（インピーダンス）を測定した。図１Ｂに示されるように、アクチビンＡへのＩＰＳＣ心筋細胞の長期曝露（６回の治療）は、用量依存的な様式で振幅の低下傾向をもたらした。単回の曝露の最小限の影響が観察された（図１Ａを参照のこと）。

【0176】

上記のように、播種したヒトＩＰＳＣ心筋細胞を使用して、抗アクチビンＡ抗体（ｍＡｂ１；Ｈ４Ｈ１０４３０Ｐ）は、機能障害を防止した。図２に示すように、ｍＡｂ１の適用は、アイソタイプ対照と比較して、試験した全ての用量にわたって収縮振幅の減少を防止した。

【0177】

ＥＦＰ記録のために、細胞外の一過性の電気的活性を測定し、続いて平均拍動を逆転させて心筋細胞の活動電位に類似させた。振幅、ダウンストローク速度（脱分極中の最大勾配）、及び電場電位持続時間（ＦＰＤＭａｘ：脱分極の最初の偏向と再分極曲線の最大との間の時間）を、各平均拍動について特徴付けた。対照と比較して、アクチビンＡ（１ｎＭ）で慢性的に処理した心筋細胞では、伸長した活動電位が観察された（０．５６±０．０１対０．４９±０．０２秒、Ｐ＜０．０１）。２５ｎＭの阻害抗体（ｍＡｂ１）は、この活動電位持続時間の増加を防止したが、アイソタイプ対照抗体は防止しなかった（０．５１±０．０５対０．５６±０．０２秒）。アクチビンＡへの慢性的曝露は、培地対照と比較して電場電位振幅の減少を引き起こした（４８．５８±６．５２対７４．５２±１１．６６μＶ、Ｐ＜０．０１）。２５ｎＭの阻害抗体（ｍＡｂ１）は、２５ｎＭのアイソタイプ対照抗体と比較して、この減少を防止した（８５．５５±１９．８２対４２．８７±２．００μＶ）。アクチビンＡへの曝露はまた、培地対照と比較して、電場電位ダウンストローク速度を減少させた（０．０１８±０．００６対０．０３４±０．００５ Ｖ／秒、Ｐ＜０．００１）。アクチビンＡ＋２５ｎＭの阻害抗体（ｍＡｂ１）は、ダウンストローク速度のこの低下を防止したが、２５ｎＭのアイソタイプ対照抗体は防止しなかった（０．０３９±０．００９対０．０１９±０．００２ Ｖ／秒）（図１３Ａ及び１３Ｂ参照）。

【0178】

ＥａｒｌｙＴｏｘ心臓毒性キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、カルシウムフラックスを評価した。カルシウム色素ローディングは、製造業者の指示に従い行った。ＥａｒｌｙＴｏｘカルシウム色素を、供給された緩衝液に再懸濁し、心筋維持培地と１：１の比で細胞に添加した。プレートを２時間（３７℃、５％ＣＯ２）インキュベートした後、以下のパラメータを使用して、ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で３７℃で２分間のカルシウムフラックスを記録した：励起：４７０～４９５ｎＭ、発光：５１５～５７５ｎＭ、露光時間：５０ｍｓ、ＬＥＤ強度：５０％、インターバル時間：０．１秒。カルシウムフラックスのトレースを得、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析した。アクチビンＡ（１ｎＭ）の慢性的な処理は、培地対照と比較して、ピークカルシウムフラックス振幅を減少させ（４４７±３３対６０９±９９ ＲＦＵ、ｐ＜０．０５）、カルシウムフラックス下降時間を増加させ（０．７０±０．０４秒対０．５２±０．０５秒、ｐ＜０．０００１）、カルシウムフラックス上昇時間を増加させた（０．４０±０．０６対０．２４±０．０３秒、ｐ＜０．０１）。ピークカルシウム処理振幅は、アクチビンＡ＋アイソタイプ対照抗体で処理した細胞における４８４±３７ ＲＦＵと比較して、アクチビンＡ＋阻害抗体（ｍＡｂ１）で処理した細胞において７５９±１２９ ＲＦＵであった。アイソタイプ対照抗体と比較した場合、アクチビンＡ阻害抗体（ｍＡｂ１）は、カルシウムフラックス下降時間（０．５８±０．０４対０．７５±０．０８秒）及び上昇時間（０．２７±０．１対０．３６±０．０５秒）の増加を防止したが、アイソタイプ対照抗体は防止しなかった（図１４Ａ及び１４Ｂを参照されたい）。

【0179】

これらのデータは、高レベルのアクチビンＡが心筋細胞に直接作用することができ、心不全及び高齢集団における心機能障害に寄与し得ることを示す。

【0180】

実施例８．アクチビンＡ、フォリスタチン関連遺伝子（ＦＬＲＧ）及びプラスミノゲン活性化因子阻害因子－１（ＰＡＩ－１）の血清中レベルは、ＣＯＶＩＤ－１９患者において増加し、疾患重篤度と相関する
血清試料をＣＯＶＩＤ－１９患者から採取し、標準的なプロトコール（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従いＥＬＩＳＡを行い、アクチビンＡ、ＦＬＲＧ及びＰＡＩ－１の濃度を測定した。アクチビンＡ ＥＬＩＳＡ試料を１：１に希釈し、ＦＬＲＧ ＥＬＩＳＡ試料を１：５に希釈した。患者試料を氷上で１日解凍し、凍結融解効果を防ぐために、解凍時に各試料を３つのＥＬＩＳＡ用に等分した。市販の対照血清を使用して、男性及び女性の血清を含むプレート対照を作製し、これを使用してデータを正規化した。ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ ＲｅａｄｅｒでＥＬＩＳＡを読み取った。ＦＬＲＧデータについては、いずれかの試料が標準曲線を上回った場合、結果を標準曲線の最大量（４０００ｐｇ／ｍＬ）で入力した。

【0181】

疾患重篤度及び酸素投与の必要性によって分類される統計データは、連続変数では中央値（四分位数間範囲：ＩＱＲ）、及びカテゴリー変数では頻度（パーセント：％）として表した。クラスカル・ウォリス検定を３つ以上の群にわたる連続変数に使用し、ウィルコクソン符号順位検定を２つの群間の連続変数に使用した。フィッシャーの正確確率検定をカテゴリー変数に使用した。追跡Ｄｕｎｎペアワイズ比較（有意なオムニバス結果について）を伴うＫｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定を使用して、ベースラインにおける疾患重篤度及び酸素必要性による、アクチビンＡ、ＦＬＲＧ、及びＰＡＩ－１の差異について検定した。死亡率及び臨床スコア改善（≧１ポイント）を含む長期的転帰については、共変量の有無において、ベースラインアクチビンＡ、ＦＬＲＧ、及びＰＡＩ－１（標準化）を予測因子として、ロジスティック回帰モデルを使用した。また、利用可能なイベントまでの時間情報を用いて、これらの長期的な結果変数について、Ｆｉｎｅ－Ｇｒａｙ部分分布ハザードモデルを生成した。対象を、個々の各分析物のベースライン値の中央値分割に基づいてウイルス負荷群（低、高）に分割した。低群に対する高群の亜分布ハザード比（ｓＨＲ）を、共変量の有無において計算した。全死因死亡率及びイベントまでの臨床スコア改善時間データは、それぞれ６０日目及び２９日目に打ち切られた。試験中の各結果の発生率を、打ち切り時点で計算した。

【0182】

結果を図３～９に示すが、これらは、対照と比較した、ＣＯＶＩＤ－１９患者におけるアクチビンＡ、ＦＬＲＧ及びＰＡＩ－１の血清中レベルの有意な増加、並びにアクチビンＡ、ＦＬＲＧ及びＰＡＩ－１の血清中レベルと疾患重篤度との間の相関を示すものである。ＦＬＲＧ及びＰＡＩ－１はいずれも、アクチビンＡ経路活性化のバイオマーカーである。

【0183】

アクチビンＡ及びＦＬＲＧのレベルは、それらがＩＣＵ患者において最も高かったため、最も重度に罹患したＣＯＶＩＤ－１９患者と相関していた（図４）。ＣＯＶＩＤ－１９患者におけるアクチビンＡ、ＦＬＲＧ、及びＰＡＩ－１のベースラインを用いて、研究登録時の酸素必要性と全死因死亡率との関係を試験した。ベースラインのアクチビンＡは、死亡した患者（中央値＝５４７．５ｐｇ／ｍＬ）よりも生存した患者（中央値＝３３６．８ｐｇ／ｍＬ）において有意に低かった（ｐ＜０．０００１）。ＦＬＲＧについても同じ傾向が観察され、死亡した患者（中央値＝１７６３３．６ｐｇ／ｍＬ）よりも生存した患者（中央値＝１２１４１．８ｐｇ／ｍＬ）において有意に低かった（ｐ＜０．０００１）。ベースラインＰＡＩ－１レベルは、死亡率によって有意に異ならなかった（ｐ＝０．５２）。

【0184】

ベースラインでの酸素投与状態を、酸素デバイスのタイプに基づいて３つのカテゴリー：低流量、高流量、及び侵襲的人工呼吸（ＩＭＶ）に階層化した。これら３つの群の間の差を、アクチビンＡ（Ｈ（２）＝４８．２；ｐ＜０．０００１）、ＦＬＲＧ（Ｈ（２）＝３７．１；ｐ＜０．０００１）、及びＰＡＩ－１（Ｈ（２）＝１１．３；ｐ＝０．０００４）について観察した。アクチビンＡは、低流量の患者で最も低く（中央値＝２３６．５ｐｇ／ｍＬ）、高流量の患者でより高く（４０３．７ｐｇ／ｍＬ）、ＩＭＶの患者で最も高かった（中央値＝４９９．６ｐｇ／ｍＬ）。しかしながら、アクチビンＡは、高流量患者とＩＭＶ患者との間で有意に異ならなかった（ｚ＝１．８、ｐ＞０．０１６７）。同じ傾向がＦＬＲＧについて観察され、これは低流量の患者について最も低く（中央値＝９３９９．０ｐｇ／ｍＬ）、高流量の患者についてより高く（中央値＝１４１１７．１ｐｇ／ｍＬ）、ＩＭＶの患者について最も高かった（中央値＝１５４２４．３ｐｇ／ｍＬ）。全てのペアワイズ比較は有意であった（ｐ＜０．０１６７）。ＰＡＩ－１はまた、高流量（中央値＝１７．５ｎｇ／ｍＬ）及びＩＭＶ（中央値＝１９．２ｎｇ／ｍＬ）の患者と比較して、低流量（中央値＝１６．７ｎｇ／ｍＬ）の患者においてより低かった。しかしながら、ＰＡＩ－１は、高流量及びＩＭＶ（ｚ＝１．６、ｐ＞０．０１６７）に加えて、低流量及び高流量（ｚ＝２．１、ｐ＞０．０１６７）の患者間で有意に異ならなかった。これらのデータは、アクチビンＡ及びその経路マーカーであるＦＬＲＧが、より高い酸素レベルの必要性と相関するが、ＰＡＩ－１濃度が、全てのＣＯＶＩＤ－１９群においてより高いそれにもかかわらず、酸素の必要性の予測とはならないことを示す。ベースライン酸素補給必要性によって群分けされた患者についての検査結果、試験進行及び臨床転帰の概要を、以下の表１５に示す。

【0185】

【表15】

注：統計処理では、連続変数については中央値（ＩＱＲ）として、カテゴリー変数についてはカウント（％）として表す。

【0186】

表１５に示すように、ＣＯＶＩＤ－１９患者について、アクチビンＡ及びＦＬＲＧ（ＰＡＩ－１などの他の経路マーカーではない）は、より侵襲的な酸素投与の必要性、入院医療に必要な時間、及び死亡の可能性を含む、ＣＯＶＩＤ－１９の最悪の転帰の予測となる。

【0187】

ＣＯＶＩＤ－１９患者における、アクチビンＡ及びその経路マーカーＦＬＲＧと、酸素投与の必要性及び死亡のリスクとの特有の相関を考慮して、炎症性サイトカインがアクチビンＡを誘導する機構を調べた。

【0188】

Ｃｏｏｋ Ｍｙｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ由来細胞（Cook Myosite Human Skeletal Muscle derived cell、ＳＫＭＤＣ）を５日間分化させ、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ１ｂ又はＴＮＦα及びアクチビンＡ誘導で同時処理した後、以下の追加処理のそれぞれを行った：ＤＭＳＯ（陰性対照として、ビヒクルのみを含有する）、ＩＫＫｉ（サイトカイン刺激の下流の、Ｉκキナーゼの阻害剤；３ｕＭウィタフェリンＡ）、ｐ３８ｉ（ｐ３８の阻害剤：０．３ｕＭ ＳＢ２０３５８０）、ＪＮＫｉ（Ｊｎｋの阻害剤；３０ｕＭ ＳＰ６００１２５）、ＩＫＫｉ＋ＪＮＫｉの組み合わせ、又はｐ３８ｉ＋ＪＮＫｉの組み合わせ、２４時間。馴化培地中のアクチビンＡ濃度をＥＬＩＳＡによって定量した。各主要な処理条件内で（ＩＬ１ｂ、ＴＮＦａ）、各同時処理についてのアクチビンＡ誘導を、ペアワイズ検定を使用してＤＭＳＯ同時処理と比較した。結果を図１１に示す。有意な（ｐ＜０．０５）ボンフェローニ補正比較のみを示す。群内で、各ポイントは技術的複製である。ＤＭＳＯ処理と比較して、ＩＬ－１又はＴＮＦα処理後のアクチビンＡ誘導は、ＩＫＫｉ処理細胞において有意に低かった（ｔ（２）＝４１．４、ｐ＝０．０００６）。対照的に、ＪＮＫｉ及びｐ３８ｉ＋ＪＮＫｉのいずれかの条件で処理された細胞は、ＤＭＳＯ処理と比較して、アクチビンＡ誘導の阻害がはるかに少なかった。ＩＫＫｉを用いた併用治療は、ＩＫＫｉ単独による治療と同様の阻害をもたらした。したがって、ＩＬ１及びＴＮＦは、ｐ３８又はＪｎｋとは無関係に、ＩＫＫ／ＮＦ－κＢ経路を介してアクチビンＡを誘導し、サイトカインレベル（例えば、ＩＬ－１及びＴＮＦα）の増加は、ＣＯＶＩＤ－１９患者における酸素補給の必要性の増加及び死亡の危険性と相関する。

【0189】

本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な修正は、前述の記載及び添付の図から当業者には明らかであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されている。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【配列表】

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【国際調査報告】