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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-13
(54)【発明の名称】臓器保存のための装置および方法
(51)【国際特許分類】
A01N 1/02 20060101AFI20230906BHJP
【ＦＩ】
A01N1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023512397
(86)(22)【出願日】2021-08-18
(85)【翻訳文提出日】2023-04-12
(86)【国際出願番号】 IL2021051009
(87)【国際公開番号】W WO2022038607
(87)【国際公開日】2022-02-24
(31)【優先権主張番号】63/066,925
(32)【優先日】2020-08-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．パイレックス
(71)【出願人】
【識別番号】521452991
【氏名又は名称】イチロヴ テック リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】523057770
【氏名又は名称】エー．エー．キャッシュ テクノロジー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】シャニ，ニル
(72)【発明者】
【氏名】グール，エヤル
(72)【発明者】
【氏名】リ，シュジュン
(72)【発明者】
【氏名】フリードマン，オア
(72)【発明者】
【氏名】アラヴ，アミール
【テーマコード（参考）】
4H011
【Ｆターム（参考）】
4H011BB03
4H011BB07
4H011BB23
4H011CA01
4H011CB05
4H011CC01
4H011CD02
4H011CD06
4H011DA13
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体試料を凍結保存するための方法であって、ａ．５０：１～１：１の範囲の体積／体積（ｖ／ｖ）比で生体試料をガラス化溶液（ＶＳ）と接触させる工程と、
ｂ．工程（ａ）の前記生体試料を３～１０秒の期間にわたって－２１０℃～－１９７℃の範囲の温度に供する第１の工程と、
ｃ．工程（ｂ）の前記生体試料を少なくとも３分の期間にわたって前記ＶＳのガラス転移点温度（Ｔｇ）と等しいかそれを超える温度であって－１４０℃～－１００℃の範囲の温度に供する第２の工程と
を含み、
それにより前記生体試料を凍結保存する方法。
【請求項2】
それを必要とする対象への移植のために生体試料を調製するための方法であって、ａ．５０：１～１：１の範囲の体積／体積（ｖ／ｖ）比で生体試料をＶＳと接触させる工程と、
ｂ．工程（ａ）の前記生体試料を３～１０秒の期間にわたって－２１０℃～－１９７℃の範囲の温度に供する第１の工程と、
ｃ．工程（ｂ）の前記生体試料を少なくとも３分の期間にわたって前記ＶＳのＴｇと等しいかそれを超える温度であって－１４０℃～－１００℃の範囲の温度に供する第２の工程と
を含み、
それによりそれを必要とする対象への移植のために前記生体試料を調製する方法。
【請求項3】
前記生体試料は血管化、神経再支配化またはその両方がなされている組織または臓器を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記生体試料は肢を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
肢を凍結保存するための方法、それを必要とする対象への移植のために肢を調製するための方法またはその両方であって、ａ．５０：１～１：１の範囲の体積／体積（ｖ／ｖ）比で前記肢を含む生体試料をＶＳと接触させる工程と、
ｂ．工程（ａ）の前記肢を含む前記生体試料を３～１０秒の期間にわたって－２１０℃～－１９７℃の範囲の温度に供する第１の工程と、
ｃ．工程（ｂ）の前記肢を含む前記生体試料を少なくとも３分の期間にわたって前記ＶＳのＴｇ’と等しいかそれを超える温度であって－１４０℃～－１００℃の範囲の温度に供する第２の工程と
を含み、
それにより肢を凍結保存するか、それを必要とする対象への移植のために肢を調製するかまたはその両方を行う方法。
【請求項6】
前記第２の供する工程の後に、前記生体試料を－１℃／分～－１０℃／分の範囲の速度で前記Ｔｇ未満または－１９７℃～－１５０℃の温度までさらに冷却することを含む、前記生体試料を保存する工程をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
工程（ａ）の後に得られた前記生体試料を前記ＶＳに浸漬するか、前記ＶＳによって覆うか、あるいはその両方を行う、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記接触させる工程は真空条件下におけるものである、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記接触させる工程は弾性袋中におけるものである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
工程（ａ）の後に得られた前記生体試料には本質的に空気は存在しない、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
工程（ｂ）の後に得られた前記生体試料は前記ＶＳに接触している外面を含み、前記外面は－２０℃～０℃の範囲の温度を有することを特徴とする、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記第１の供する工程は－３３０℃／分～－５００℃／分の速度で凍結することである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記第１の供する工程は極低温液体のスラッシュ中または－２２０℃～－１５０℃の極低温条件下におけるものである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記第２の供する工程は－３℃／分～－１０℃／分の速度で凍結することである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記第２の供する工程は（ａ）極低温液体の蒸気中、または（ｂ）－８５℃～－７５℃の範囲の温度下およびその後の極低温液体の蒸気を与える冷却条件下におけるものである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
－８５℃～－７５℃の範囲の温度を与える前記冷却条件は－８５℃～－７５℃の範囲の温度を有する冷却液体を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
工程（ｃ）の少なくとも３分の前記期間は少なくとも３０分である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
工程（ａ）に先行する前記生体試料を前記ＶＳで灌流することを含む工程をさらに含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記灌流する工程は最長５分の期間にわたって室温におけるものある、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ＶＳは浸透性凍結保護剤、非浸透性凍結保護剤またそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含み、かつ任意に巨大分子、抗酸化剤、培地またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記ＶＳは、１５～２５％（ｗ／ｖ）のエチレングリコール、１５～２５％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、１５～２５（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清および０．３～０．７Ｍのトレハロースを含み、それらは全てＷｉｓｃｏｎｓｉｎ静的保存溶液中にある、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記凍結保存された生体試料を少なくとも２４時間の期間にわたって保存することを含む工程（ｄ）をさらに含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
それを必要とする対象において生体試料を移植するための方法であって、（ａ）請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法に従って前記生体試料を凍結保存する工程と、（ｂ）前記凍結保存された生体試料を解凍または加温し、かつ前記対象に移植する工程とを含む方法。
【請求項24】
前記対象は臓器置換を必要としている、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記凍結保存された生体試料を洗浄および灌流する工程をさらに含み、前記工程は前記凍結保存された生体試料の前記対象への移植に先行する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項26】
前記移植する工程は自家移植することまたは同種異系移植することである、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
試料を保持するために構築された第１の容器と、冷却軸に沿った通路を通して前記第１の容器の位置を調整するように構成されたアクチュエータと、
前記第１の容器に接触している加熱要素と、
前記アクチュエータおよび前記加熱要素と動作可能に通信状態にあり、かつ（ａ）前記第１の容器の位置が前記冷却軸に沿った前記通路を通して調整されるような前記アクチュエータの構成、（ｂ）前記第１の容器に所定の量の熱を加えるための前記加熱要素、あるいは（ａ）および（ｂ）を命令することにより前記試料の温度を制御するように構成された制御ユニットと
を備える装置。
【請求項28】
前記軸は前記通路の長手軸に平行である、請求項２７に記載の装置。
【請求項29】
前記加熱要素は前記第１の容器の上に位置決めされており、かつ少なくとも部分的にそこに重なっている、請求項２７または２８に記載の装置。
【請求項30】
少なくとも１つの温度センサをさらに備える、請求項２７～２９に記載の装置。
【請求項31】
前記第１の容器の温度が前記温度センサによって測定可能であるように、前記少なくとも１つの温度センサは前記第１の容器に結合されている、請求項３０に記載の装置。
【請求項32】
前記制御ユニットは前記少なくとも１つの温度センサと動作可能に通信状態にある、請求項３０または３１に記載の装置。
【請求項33】
極低温液体、そのスラッシュ、その蒸気またはそれらの任意の組み合わせを含むために構築された第２の容器をさらに備える、請求項２７～３２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項34】
前記極低温液体は液体窒素（ＬＮ２）を含む、請求項３３に記載の装置。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月１８日に出願された「臓器保存のための装置および方法」という発明の名称の米国仮特許出願第６３／０６６，９２５号の優先権の利益を主張するものであり、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年８月１８日に出願された「臓器保存のための装置および方法」という発明の名称の米国仮特許出願第６３／０６６，９２５号の優先権の利益を主張するものであり、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は生体材料、例えば組織の氷温貯蔵に関し、より詳細にはその目的に適合させた装置およびそれを使用するための方法に関する。
【背景技術】
【0003】
現代の医療再建を導く主要な原理は、「似たもの同士（ｌｉｋｅ ｗｉｔｈ ｌｉｋｅ）」での置換である。従って損傷または変形した体の部分はそれらの同様の損傷していない対応物で置換される。当該分野においてここ数十年間でなされた大きな進歩にも関わらず、再建は利用可能な自家（すなわち「自己」）置換部分の限られた数および複雑性によってなお制限されている。大外傷の間に、この制限は損傷した組織の大きさおよび複雑性と相関して悪化し、供与部位の可用性をさらに制限する。急速に進化している血管化複合同種移植（ＶＣＡ）分野で最近実証されたように、手足の切断または大きな顔面損傷などのいくつかの異なる組織からなる複合欠陥に関わる損傷は自家組織と置換することができず、同種異系の（すなわち「外来の」）供与された組織の使用を必要とする。肢および顔面移植におけるその見事な成功にも関わらず、ＶＣＡ分野は移植された複合組織の強い免疫拒絶（あらゆる他の分野の移植におけるものよりも高い）によって妨げられており、同種移植片生着を保証するために高用量の生涯にわたる免疫抑制管理体制を必要とし、これは深刻な生命を脅かすことさえある有害事象を引き起こす可能性がある。
【0004】
外傷後の切断された組織（すなわち神経、腱および血管化皮弁および骨移植片）を用いた即座の自家肢再移植または顕微手術再建は非常に有益であり、ＶＣＡを必要とすることなく済む場合さえあり、免疫抑制の絶対的使用を不要にする。しかし急性蘇生および救命処置は「肢の前に命」戦略に従って優先を決め、かつ肢虚血の短い治療可能域（４～６時間）により、自家肢もしくは組織の即時再移植が可能となることは稀である。特定の手術室機器および訓練された顕微手術チーム必要とする複雑な顕微手術再移植または顕微手術再建が実際に不可能である戦闘手術条件下では、時間制約はさらに厳しくなる。
【0005】
再建目的のために自家組織の使用を可能にする１つの手法は、患者の状態が再建手術を可能にするまでその生着能を保存することであろう。汚染創などの大部分の現代の外傷および戦闘損傷では、最初の１２時間は被害対策ならびに最も緊急の血管および整形外科介入に専念される。損傷後１日または２日以内に選ばれた患者において若干の再建努力が試みられる場合はあるが、これらの複雑な再建処置の大部分は損傷後数時間から数日してからやっと試みられ得る。エクスビボ灌流および氷点下保存などの技術的改良は、実質臓器の回収と移植との間の時間を引き延ばすのを助けることができる。それにも関わらず、肝臓移植の場合にこれらの技術を用いた移植片生着を引き延ばす楽観的な範囲はそれぞれ、２４時間および９６時間を超えることはない。これまでに長期間（数日から数ヶ月）の臓器もしくは組織保存のために提案されている唯一の方法は、どちらも（－８０℃）未満の温度下での生体組織の凍結保存に基づく一方向凍結（ＤＦ）またはガラス化のいずれかによる低い氷点下凍結保存である。ＤＦを使用してヒツジ卵巣、ヒト卵巣、ラットおよびブタ全肝ならびにラット心臓などの様々な組織を凍結保存することに成功してきた。ガラス化を使用してウサギ腎臓、血管、角膜および弁を凍結保存することに成功してきた。ＤＦおよびガラス化の両方によるその７日間の凍結保存後の完全なラット後肢の移植の成功が最近になって報告されたが、肢生着は７２時間の期間でのみ実証された。
【0006】
凍結保存の主要な課題は、従来の凍結保存方法によって生じる細胞内および細胞外氷晶の形成によって誘発される損傷を予防することにある。
【0007】
ガラス化は液体の固体ガラス相への凝固である。組織のガラス化は、高濃度の凍結保護剤（ＣＰＡ）の存在下での組織の急速冷却および急速加温によって達成される。ガラス化の確率＝ＣＲまたはＷＲ×η×１／Ｖであり、従ってガラス化の確率は、冷却／加温速度（ＣＲまたはＷＲ）の上昇および粘度（η）の増加ならびに体積（Ｖ）の減少に伴って上昇する。これらの条件は、ガラス形態へのそれらの変換前に氷が形成されることなく細胞および組織の凍結保存を可能にし、それにより凍害を劇的に減らす。凍結保存におけるその大きな潜在能力にも関わらず、ガラス化は、（１）大きい組織において最小の氷核および成長のために必要とされる急速均質冷却および加温は非常に難しい、（２）組織のガラス化の成功のために必要とされる高濃度のＣＰＡは、導入されて素早く除去されない場合に不可逆的な組織毒性および浸透圧損傷を引き起こすことがある、および（３）ガラス相転移温度（Ｔｇ’）を超える急速冷却により組織破壊が生じる、という大きい組織／臓器のためのその使用をこれまで妨げてきた３つの主要な欠点を抱えている。最速の利用可能な冷却方法は液体窒素（ＬＮ）スラッシュ（－２０４℃～（－２１０℃））によるものである。ＬＮスラッシュを達成するために、ＬＮはその凝固点（－２１０℃）近くで冷却する必要がある。ＬＮスラッシュは負圧を印加することにより生成され、それによりＬＮの温度を－２０５℃～－２１０℃に低下させる。次いでＬＮスラッシュが形成され、冷却速度が劇的に上昇する。冷却速度は特に室温から０℃に冷却する場合に冷却の第１段階で高められる。冷却速度はＬＮ（－１９６℃）に投入する場合よりも２～６倍高められる。
【0008】
ＣＲまたはＷＲおよびηの上昇がガラス化の確率を上昇させるが、それは破壊の確率も上昇させる。これは、粘度（η）の上昇がＴｇ’も上昇させ、これがΔＴの上昇によりＣＲまたはＷＲを上昇させるからである。ガラス化はこれまで、細胞および小さい組織、卵母細胞、精子、胚および卵巣スライス、血管、角膜、弁およびウサギ腎臓の凍結保存においてのみ成功してきた。
【0009】
複合血管化組織、例えば肢および臓器などの大きい組織の長期凍結保存を可能にし、それにより同系再移植後にそれらの長期生着を可能にするガラス化の装置および／または方法が今なお大いに必要とされている。
【発明の概要】
【0010】
いくつかの実施形態では、本発明は、急速かつ短い低温凍結工程およびその後の徐々に長くなる凍結工程を含む生体試料、例えば組織を凍結保存するための二段階方法に関する。
【0011】
本発明は部分的に、本明細書に開示されている方法に従って凍結保存された組織により同系再移植後に長期生着が得られたという驚くべき発見に基づく。
【0012】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は生体試料を氷点下温度に下げる第１の秒長さの（例えば急速）凍結工程と、生体試料を試料のガラス転移点温度（Ｔｇ’）に低下させるその後の第２の分長さの（例えば漸進的）凍結工程とを含む。同系再移植後の本明細書に記載されている生体試料の長期生着の向上は、最適な長期保存のために生体試料をより低い温度の液体窒素またはその蒸気ではなくＴｇ’に維持すべきことを示唆している。
【0013】
いくつかの実施形態では、本発明は試料を保持するのに適した第１の容器と、冷却軸に沿った通路を通してその容器の位置を調整するように構成されたアクチュエータと、その容器に接触している加熱要素と、アクチュエータおよび加熱要素と動作可能に通信状態にあり、かつ所定の温度を試料に与えるように構成された制御ユニットとを備える装置に関する。
【0014】
第１の態様によれば、生体試料を凍結保存するための方法であって、（ａ）５０：１～１：１の範囲の体積／体積（ｖ／ｖ）比で生体試料をガラス化溶液（ＶＳ）と接触させる工程と、（ｂ）工程（ａ）の生体試料を３～１０秒の期間にわたって－２１０℃～－１９７℃の範囲の温度に供する第１の工程と、（ｃ）工程（ｂ）の生体試料を少なくとも３分の期間にわたってＶＳのガラス転移点温度（Ｔｇ）と等しいかそれを超える温度であって－１４０℃～－１００℃の範囲の温度に供する第２の工程とを含み、それにより生体試料を凍結保存する方法が提供される。
【0015】
別の態様によれば、それを必要とする対象への移植のために生体試料を調製するための方法であって、（ａ）５０：１～１：１の範囲の体積／体積（ｖ／ｖ）比で生体試料をＶＳと接触させる工程と、（ｂ）工程（ａ）の生体試料を３～１０秒の期間にわたって－２１０℃～－１９７℃の範囲の温度に供する第１の工程と、（ｃ）工程（ｂ）の生体試料を少なくとも３分の期間にわたってＶＳのＴｇと等しいかそれを超える温度であって－１４０℃～－１００℃の範囲の温度に供する第２の工程とを含み、それによりそれを必要とする対象への移植のために生体試料を調製する方法が提供される。
【0016】
別の態様によれば、肢を凍結保存するための方法、それを必要とする対象への移植のために肢を調製するための方法またはその両方であって、（ａ）５０：１～１：１の範囲の体積／体積（ｖ／ｖ）比で肢を含む生体試料をＶＳと接触させる工程と、（ｂ）工程（ａ）の肢を含む生体試料を３～１０秒の期間にわたって－２１０℃～－１９７℃の範囲の温度に供する第１の工程と、（ｃ）工程（ｂ）の肢を含む生体試料を少なくとも３分の期間にわたって前記ＶＳのＴｇ’と等しいかそれを超える温度であって－１４０℃～－１００℃の範囲の温度に供する第２の工程とを含み、それにより肢を凍結保存するか、それを必要とする対象への移植のために肢を調製するか、またはその両方を行う方法が提供される。
【0017】
別の態様によれば、それを必要とする対象において生体試料を移植するための方法であって、（ａ）本発明の方法に従って生体試料を凍結保存する工程と、（ｂ）凍結保存された生体試料を解凍または加温し、かつそれを対象に移植する工程とを含む方法が提供される。
【0018】
別の態様によれば、試料を保持するために構築された第１の容器と、冷却軸に沿った通路を通して第１の容器の位置を調整するように構成されたアクチュエータと、第１の容器に接触している加熱要素と、アクチュエータおよび加熱要素と動作可能に通信状態にあり、かつ（ａ）冷却軸に沿った通路を通して第１の容器の位置が調整されるようなアクチュエータの構成、（ｂ）第１の容器に所定の量の熱を加えるための加熱要素、あるいは（ａ）および（ｂ）に命令することにより試料の温度を制御するように構成された制御ユニットとを備える装置が提供される。
【0019】
いくつかの実施形態では、生体試料は血管化、神経再支配化またはその両方がなされている組織または臓器を含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、生体試料は肢を含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、本方法は第２の供する工程の後に、生体試料を－１℃／分～－１０℃／分の範囲の速度でＴｇ未満または－１９７℃～－１５０℃の温度までさらに冷却することを含む生体試料を保存する工程をさらに含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、工程（ａ）の後に得られた生体試料をＶＳに浸漬するか、ＶＳによって覆うか、あるいはその両方を行う。
【0023】
いくつかの実施形態では、接触させる工程は真空条件下におけるものである。
【0024】
いくつかの実施形態では、接触させる工程は弾性袋中におけるものである。
【0025】
いくつかの実施形態では、工程（ａ）の後に得られた生体試料には本質的に空気は存在しない。
【0026】
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の後に得られた生体試料はＶＳに接触している外面を含み、その外面は－２０℃～０℃の範囲の温度を有することを特徴とする。
【0027】
いくつかの実施形態では、第１の供する工程は－３３０℃／分～－５００℃／分の速度で凍結することである。
【0028】
いくつかの実施形態では、第１の供する工程は極低温液体のスラッシュ中または－２２０℃～－１５０℃の極低温条件下におけるものである。
【0029】
いくつかの実施形態では、第２の供する工程は－３℃／分～－１０℃／分の速度で凍結することである。
【0030】
いくつかの実施形態では、第２の供する工程は（ａ）極低温液体の蒸気中、または（ｂ）－８５℃～－７５℃の範囲の温度下およびその後の極低温液体の蒸気を与える冷却条件下におけるものである。
【0031】
いくつかの実施形態では、－８５℃～－７５℃の範囲の温度を与える冷却条件は－８５℃～－７５℃の範囲の温度を有する冷却液体を含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、工程（ｃ）の少なくとも３分の期間は少なくとも３０分である。
【0033】
いくつかの実施形態では、本方法は工程（ａ）に先行する生体試料をＶＳで灌流することを含む工程をさらに含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、灌流する工程は最長５分の期間にわたって室温におけるものである。
【0035】
いくつかの実施形態では、ＶＳは浸透性凍結保護剤、非浸透性凍結保護剤またそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含み、かつ任意に巨大分子、抗酸化剤、培地またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、ＶＳは１５～２５％（ｗ／ｖ）のエチレングリコール、１５～２５％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、１５～２５（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清および０．３～０．７Ｍのトレハロースを含み、それらは全てＷｉｓｃｏｎｓｉｎ静的保存溶液中にある。
【0037】
いくつかの実施形態では、本方法は、凍結保存された生体試料を少なくとも２４時間の期間にわたって保存することを含む工程（ｄ）をさらに含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、対象は臓器置換を必要としている。
【0039】
いくつかの実施形態では、本方法は凍結保存された生体試料を洗浄および灌流する工程をさらに含み、この工程は凍結保存された生体試料の対象への移植に先行する。
【0040】
いくつかの実施形態では、移植する工程は自家移植することまたは同種異系移植することである。
【0041】
いくつかの実施形態では、当該軸は通路の長手軸に平行である。
【0042】
いくつかの実施形態では、加熱要素は第１の容器の上に位置決めされており、かつ少なくとも部分的にそこに重なっている。
【0043】
いくつかの実施形態では、本装置は少なくとも１つの温度センサをさらに備える。
【0044】
いくつかの実施形態では、第１の容器の温度が温度センサによって測定可能であるように、少なくとも１つの温度センサは第１の容器に結合されている。
【0045】
いくつかの実施形態では、制御ユニットは少なくとも１つの温度センサと動作可能に通信状態にある。
【0046】
いくつかの実施形態では、本装置は極低温液体、そのスラッシュ、その蒸気またはそれらの任意の組み合わせを含むために構築された第２の容器をさらに備える。
【0047】
いくつかの実施形態では、極低温液体は液体窒素（ＬＮ２）を含む。
【0048】
特に定めがない限り、本明細書で使用される全ての技術および／または科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料が以下に記載されている。矛盾する場合は定義を含む本特許明細書が優先される。また材料、方法および実施例は単に例示であり、必ずしも限定的であることを意図するものではない。
【0049】
さらなる実施形態および本発明の全適用範囲は、本明細書の下に与えられている詳細な説明から明らかになるであろう。但し当然のことながら、詳細な説明および具体例は本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の趣旨および範囲内の各種変形および修飾がこの詳細な説明から当業者に明らかになるため単に例示として与えられている。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】図１Ａ～図１Ｆは－８０℃での長期凍結保存後の血管化鼠径皮弁の長期生着を示す顕微鏡写真およびグラフを含む。（図１Ａ）血管化鼠径皮弁を凍結保護剤（ＣＰＡ）で室温において灌流し、指示された回数で液体窒素（ＬＮ）スラッシュの中に浸漬し、ＬＮ蒸気に２分間移し、温め、同系レシピエントに再移植し、写真を撮影した。（図１Ｂ）血管化鼠径皮弁を当該スキームに従って凍結保存し、－８０℃で２４時間（図１Ｃ）または９日間（図１Ｄ）の貯蔵後に同系移植した後、指示された回数で写真を撮影するか、手術後（ＰＯＤ１２）に組織学のために取り出した。－８０℃で２４時間（図１Ｅａ～図１Ｅｃ）または９日間（図１Ｅｄ～図１Ｅｆ）貯蔵した皮弁の組織学的切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、写真を撮影した。血管化鼠径皮弁をＣＰＡで灌流し、ＬＮスラッシュの中に３秒間浸漬し、次いでＬＮ蒸気に３０分間移し、皮弁内温度を測定した（図１Ｆ）。
【図2】図２Ａ～図２Ｃは、Ｔｇ’での凍結保存後の血管化鼠径皮弁の長期生着を示すグラフ、図表および顕微鏡写真を含む。（図２ＡのＩ）ガラス化溶液（ＶＳ）のＴｇ’を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析により決定した。（図２ＡのＩＩ）血管化鼠径皮弁をＣＰＡで室温において灌流し、次いでＬＮ蒸気に移した。Ｔｇ’に到達するまで皮弁内温度を測定した。（図２Ｂおよび図２ＣのＩ）血管化鼠径皮弁をＣＰＡで室温において灌流し、ＬＮ蒸気中に３０分間温置し、温め、再移植し、指示された回数で写真を撮影した。（図２ＣのＩＩ）図２Ｂに記載されているように凍結保存され、かつ移植された血管化鼠径皮弁を組織学的分析のためにＰＯＤ１２において取り出した。スライドをＨ＆Ｅで染色し、写真を撮影した。
【図3】図３Ａ～図３Ｃは凍結保存後の後肢の長期安定性を示す図表、グラフを含む。（図３Ａ）二段階肢凍結保存プロトコルのスキーム。（図３ＢのＩ）肢を凍結保護剤（ＣＰＡ）で室温において灌流し、ＬＮスラッシュの中に４秒間浸漬し、次いでＬＮ蒸気に移した。肢内温度を１７分間測定した。（図３ＢのＩＩ）肢をＣＰＡで室温において灌流し、ＬＮスラッシュの中に４秒間浸漬し、ＬＮ蒸気に１０分間移し、温め、再移植し、指示された回数で写真を撮影した。針穿刺により誘発された出血によりＰＯＤ１０およびＰＯＤ３２において末梢四肢灌流が実証された。ＰＯＤ３２において組織学的分析のために肢を取り出し、切片をＨ＆Ｅで染色した（図３Ｃ）。正常な皮膚および筋肉構造が実証された。
【図4】図４Ａ～図４ＥはＴｇ’での凍結保存後の後肢の長期生着を示す図表および顕微鏡写真を含む。肢を凍結保護剤（ＣＰＡ）で室温において灌流し、ＬＮスラッシュの中に４秒間浸漬し、ＬＮ蒸気に２時間移し、温め、再移植し（図４Ａ）、指示された回数で写真を撮影した（図４Ｂ）。（図４Ｃ）ＰＯＤ２８において針穿刺により誘発された出血により末梢四肢灌流が実証された。ＰＯＤ３２において組織学的分析のために肢を取り出し、回収された肢の前側（図４ＤのＩ）および後側（図４ＤのＩＩ）の写真を撮影し、切片をＨ＆Ｅで染色した。正常な皮膚、脂肪および筋肉構造が実証された（図４Ｅ）。
【図5】図５Ａ～図５Ｃは、再移植された凍結保存された肢における神経再生および機能的な感覚を示す図表および顕微鏡写真を含む。（図５ＡのＩ）図３Ａに記載されている二段階凍結保存プロトコルを用いて肢を凍結保存し、次いでレシピエントラットの腰に第５の肢として移植した。（図５ＡのＩＩ）ＰＯＤ１２においてレシピエント肢の膝下切断後に、レシピエントの大腿血管からのその血液供給を止めずに移植された凍結保存された肢をその腰位置から膝下位置まで移動させ、縫合した。レシピエントの脛骨神経を凍結保存された肢に接合して神経再生および感覚の回復を可能にした。（図５Ｂ）膝下移植後２２日目に、ラットは凍結保存された肢を用いて歩行することができた。（図５ＣのＩ）膝下移植後２３日目に、脛骨神経を組織学的分析のために取り出し、神経フィラメント（ＮＦ（軸索全体））およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ（運動軸索）タンパク質について、神経吻合の近位および遠位側からの切片を染色した。核染色のためにＤＡＰＩも施用した。（図５ＣのＩＩ）デジタルシステムを用いて行われた定量的繊維数を示すグラフ。
【図6】図６Ａ～図６Ｃは、移植された凍結保存された新鮮な肢は同様の筋肉完全性を実証していることを示す組織学的顕微鏡写真およびグラフを含む。膝下肢移植体を生理食塩水またはＣＰＡで灌流し、洗浄し、新鮮な対照（それぞれ生理食塩水およびＣＰＡ対照）として即座に移植し、それぞれ図３Ａおよび図４Ａに示されているプロトコルに従って約－８０℃またはＴｇに冷却した同様の移植体と比較した。手術後（ＰＯＤ）１２目以降に、肢を取り出し、固定し、肢の異なる部分から切片を調製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、文書化した。筋肉品質をスコア化し、盲検病理学者によって比較した。（図６Ａ）異なる対照および実験群の筋肉切片の選ばれた提示を示す組織学的顕微鏡写真。（図６ＢのＩ）実験肢の対照の筋肉スコアの比較統計分析を示すグラフ。（図６ＢのＩＩ）新鮮な対照と実験肢との間で筋肉品質において有意差が観察されなかったことを示す垂直棒グラフ（ｐ＝０．６）。（図６Ｃ）一方向凍結（ＤＦ）を用いて凍結させた肢、Ｔｇよりも低い温度までガラス化された肢およびＴｇ以上の温度までガラス化された肢の群間の長期肢生着の比較を示す垂直棒グラフ。
【図7】本発明のいくつかの実施形態に係る装置の第１の容器の全体簡略化図を含む。
【図8】本発明のいくつかの実施形態に係る装置の制御ユニットの背面簡略化図を含む。
【図9】本発明のいくつかの実施形態に係る装置の全体簡略化図を含む。
【図10】本発明のいくつかの実施形態に係る装置の第１の容器の全接続簡略化図を含む。
【図11】本発明のいくつかの実施形態に係る装置の第１の容器の上側拡大簡略化図を含む。
【図12】本発明のいくつかの実施形態に係る装置の制御ユニットパネルの全体簡略化図を含む。
【図13】本発明のいくつかの実施形態に係る装置の第２の容器制御部の全体簡略化図を含む。
【図14】本発明のいくつかの実施形態に係る装置のアクチュエータの全体簡略化図を含む。
【図15】本発明のいくつかの実施形態に係る装置の第２の容器の全体簡略化図を含む。
【発明を実施するための形態】
【0051】
いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存された血管化および／または神経再支配化組織の長期生着を与えるガラス化の装置および方法に関する。
方法
方法
【0052】
いくつかの実施形態によれば、生体試料を凍結保存するための方法が提供される。
【0053】
いくつかの実施形態によれば、例えばそれを必要とする対象への移植のための生体試料を調製するための方法が提供される。
【0054】
いくつかの実施形態によれば、肢を凍結保存するための方法、それを必要とする対象への移植のために肢を調製するための方法またはその両方が提供される。
【0055】
いくつかの実施形態では、本方法は（ａ）５０：１～１：１の範囲の体積／体積（ｖ／ｖ）比で生体試料をガラス化溶液（ＶＳ）と接触させる工程と、（ｂ）生体試料を３～１０秒の期間にわたって－２１０℃～－１９７℃の範囲の温度に供する第１の工程と、（ｂ）工程（ａ）の生体試料を少なくとも３分の期間にわたってＶＳの転移ガラス温度（Ｔｇ）と等しいかそれを超える温度であって－１４０℃～－１００℃の範囲の温度に供する第２の工程とを含む。
【0056】
いくつかの実施形態では、本方法は第２の供する工程の後に、試料を－１℃／分～－１０℃／分の範囲の速度でＶＳのガラス転移点温度未満または－１９７℃～－１５０℃の温度までさらに冷却することを含む生体試料を保存する工程をさらに含む。
【0057】
本明細書で使用される「保存する」および「貯蔵する」という用語は互換可能である。
【0058】
いくつかの実施形態では、凍結保存された生体試料をＶＳのＴｇである温度で貯蔵する。いくつかの実施形態では、凍結保存された生体試料をＶＳのＴｇよりも低い温度で貯蔵する。いくつかの実施形態では、凍結保存された生体試料をＶＳのＴｇよりも高い温度で貯蔵する。
【0059】
いくつかの実施形態では、生体試料は組織または臓器を含む。
【0060】
いくつかの実施形態では、組織または臓器は脈管構造系を含む。いくつかの実施形態では、組織または臓器は少なくとも１つの神経、ニューロン、軸索、樹状突起、神経節またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、組織または臓器は血管化、神経再支配化またはその両方がなされている。
【0061】
いくつかの実施形態では、組織または臓器は肢、腎臓、心臓、肝臓、肺、膵臓、腸、皮膚またはそれらから得られた組織断片から選択される。
【0062】
いくつかの実施形態では、生体試料は肢を含む。
【0063】
いくつかの実施形態では、肢は１本の上肢、１本の下肢あるいは２本の上肢、２本の下肢またはそれらの組み合わせを含む複数の肢を含む。
【0064】
本明細書で使用される「供する」、「冷却する」、「冷蔵する」および「凍結する」という用語は互換可能である。
【0065】
いくつかの実施形態では、生体試料とＶＳは５０：１～１：１、１００：１～１：１、２５０：１～１：１、４０：１～１０：１、２５：１～５：１または４５：１～６：１の範囲の（ｖ／ｖ）比である。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0066】
いくつかの実施形態では、工程（ａ）の後に得られた生体試料をＶＳに浸漬するか、ＶＳによって覆うか、あるいはその両方を行う。
【0067】
いくつかの実施形態では、工程（ａ）の後に得られた生体試料を少なくとも部分的にＶＳに浸漬するか、少なくとも部分的にＶＳによって覆うか、あるいはその両方を行う。
【0068】
いくつかの実施形態では、接触させる工程は真空条件下におけるものである。
【0069】
いくつかの実施形態では、本方法は生体試料を弾性袋に入れる工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は生体試料を弾性袋の中に提供する工程を含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、接触させる工程は弾性袋中におけるものである。いくつかの実施形態では、弾性袋はビニール袋を含む。いくつかの実施形態では、弾性袋は密封性弾性袋を含む。いくつかの実施形態では、生体試料が弾性袋の中にある状態で真空を印加する。いくつかの実施形態では、弾性袋はＶＳに接触している生体試料に真空を印加した後に密封される。
【0071】
いくつかの実施形態では、生体試料を弾性袋中で５０：１～１：１、１００：１～１：１、２５０：１～１：１、４０：１～１０：１、２５：１～５：１または４５：１～６：１の範囲の（ｖ／ｖ）比でＶＳと接触させる。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0072】
いくつかの実施形態では、生体試料およびＶＳを含む弾性袋中に空気が存在しない状態になったか空気が本質的に存在しない状態になった後に、真空の印加を停止、中止、中断するかそれらの任意の組み合わせおよび同等の行為を行う。
【0073】
本明細書で使用される「真空」という用語は大気圧よりも低いあらゆる圧力の印加を包含する。
【0074】
いくつかの実施形態では、工程（ａ）の後に得られた生体試料には空気は存在しない。いくつかの実施形態では、工程（ａ）の後に得られた生体試料には本質的に空気は存在しない。
【0075】
いくつかの実施形態では、例えば真空の印加により生じる工程（ｂ）の後に得られた生体試料はＶＳに接触している外面を含む。いくつかの実施形態では、生体試料の外面は０℃～－２０℃、－１℃～－１５℃、－３℃～－１９℃または０℃～－１７℃の範囲の温度を有することを特徴とする。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0076】
いくつかの実施形態では、第１の供する工程は長くとも７分、長くとも６分、長くとも５分、長くとも４分、長くとも３分、長くとも２分または長くとも１分あるいはその間の任意の値および範囲内で生体試料の温度を摂氏零度以下まで低下させるのに適した任意の条件下におけるものである。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0077】
いくつかの実施形態では、生体試料の温度を摂氏零度以下まで低下させるの適した条件は－５℃／分以上の任意の冷却速度を含む。
【0078】
いくつかの実施形態では、第１の供する工程は－１０℃／分～－２０℃／分、－５℃／分～－４０℃／分、－３０℃／分～－７０℃／分、－６０℃／分～－１２０℃／分、－１３０℃／分～－２７０℃／分、－２３０℃／分～－３５０℃／分、－３３０℃／分～－３７０℃／分、－３１０℃／分～－３９０℃／分、－３００℃／分～－３８５℃／分、－２９５℃／分～－３６５℃／分、－２８０℃／分～－３９５℃／分または－３１５℃／分～－３７５℃／分の速度で凍結することを含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0079】
いくつかの実施形態では、第１の供する工程は極低温液体のスラッシュ中におけるものである。いくつかの実施形態では、第１の供する工程は－２２０℃～－１９０℃の極低温条件下におけるものである。いくつかの実施形態では、第１の供する工程は極低温液体の蒸気中におけるものである。いくつかの実施形態では、第１の供する工程は－１５０℃～－９０℃の極低温液体中または極低温条件下におけるものである。
【0080】
いくつかの実施形態では、第２の供する工程は－６℃／分～－１０℃／分、－３℃／分～－１５℃／分、－２℃／分～－１３℃／分、－４℃／分～－１１℃／分、－５℃／分～－１７℃／分、－６℃／分～－１２℃／分、－６℃／分～－８℃／分の速度で凍結することである。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0081】
いくつかの実施形態では、第２の供する工程は（ａ）極低温液体の蒸気、または（ｂ）－１２０℃～－４０℃の範囲の温度を有する冷却液体中およびその後の極低温液体の蒸気中におけるものである。いくつかの実施形態では、第２の供する工程は（ａ）極低温液体の蒸気中、または（ｂ）－８５℃～－７５℃の範囲の温度下およびその後の極低温液体の蒸気を与える冷却条件下におけるものである。
【0082】
いくつかの実施形態では、－８５℃～－７５℃の範囲の温度を与える冷却条件は、－８５℃～－７５℃の範囲の温度を有する冷却液体を含む。
【0083】
いくつかの実施形態では、少なくとも３分の期間は少なくとも４分、少なくとも５分、少なくとも７分、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも４５分、少なくとも６０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも２日、少なくとも７日、少なくとも１４日、少なくとも１ヶ月または少なくとも３ヶ月あるいはその間の任意の値および範囲を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、少なくとも３分の期間は３～１０分、５～２５分、５～４０分、１０～６０分、１５～９０分、１～３時間、２～１２時間、４～１８時間、８～２４時間、１２～３６時間、１～３日、２～７日、５～１４日、２～５週間または１～３ヶ月を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0084】
いくつかの実施形態では、接触させる工程は生体試料を灌流することを含む。
【0085】
生体試料（例えば血管を含む組織）を灌流するための方法は一般的であり、当業者には明らかであろう。
【0086】
いくつかの実施形態では、灌流する工程は生体試料の少なくとも１つの血管を灌流することを含む。いくつかの実施形態では、灌流する工程は生体試料の少なくとも１つの動脈を灌流することを含む。いくつかの実施形態では、灌流する工程は生体試料の少なくとも１つの血管を（ａ）生理食塩水、ヘパリンまたはそれらの組み合わせを含む溶液、（ｂ）平衡溶液、（ｃ）ガラス化溶液あるいは（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせと接触させることを含む。
【0087】
いくつかの実施形態では、本方法は生体試料を凍結保護剤で灌流することを含む工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は生体試料を生理食塩水、ヘパリンまたはそれらの組み合わせを含む溶液で灌流することを含む工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は生体試料を平衡溶液で灌流することを含む工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は生体試料をＶＳで灌流することを含む工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、生体試料を灌流することを含む工程は、第１の生体試料を３～１０秒の期間にわたって－２１０℃～－１９７℃の範囲の温度に供する工程（例えば工程（ａ））に先行する。
【0088】
いくつかの実施形態では、「平衡溶液」という用語は、生体試料を調製するかその極低温耐久性もしくは安定性を高めるのに適したあらゆる溶液を包含する。いくつかの実施形態では、平衡溶液は生体試料を生理食塩水、ヘパリンまたはそれらの組み合わせを含む溶液で灌流した後に生体試料に与えられる。いくつかの実施形態では、平衡溶液は生体試料をＶＳで灌流する前に生体試料に与えられる。いくつかの実施形態では、平衡溶液はＶＳの凍結保護活性もしくは効果を高めるか上げる。
【0089】
本明細書で使用される「極低温耐久性」または「極低温安定性」とは、最小の組織損傷（例えば凍害、出血など）を有するか有さずに凍結保存に耐え、それによりその後の凍結保存された組織または臓器の操作または利用、例えばその加温／解凍および／または移植を可能にする組織または臓器の能力を指す。
【0090】
一実施形態では、平衡溶液は５～１０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコール（ＥＧ）、２．５～１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯおよび５～２５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含み、それらは全てＷｉｓｃｏｎｓｉｎ静的保存溶液中にある。
【0091】
本明細書で使用される「凍結保護剤」および「凍結防止剤」という用語は互換可能であり、氷形成損傷、例えば氷晶の形成またはあらゆる他の凍結関連の損傷から生体試料、例えば細胞、組織、臓器またはそれらの一部あるいはそれらの任意の組み合わせを保護するために使用することができるあらゆる化合物を包含する。
【0092】
いくつかの実施形態では、灌流する工程は少なくとも１０秒、少なくとも２０秒、少なくとも３０秒、少なくとも４０秒、少なくとも５０秒、少なくとも６０秒、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分または最長５分あるいはその間の任意の値および範囲の期間にわたるものである。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、灌流する工程は５～６０秒、１～３分、１～４分、１～５分、２～３分、２～４分、２～５分、３～４分、３～５分または４～５分の期間にわたるものである。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0093】
いくつかの実施形態では、接触させる工程、灌流する工程またはその両方は室温で行う。いくつかの実施形態では、接触させる工程、灌流する工程またはその両方は周囲温度で行う。いくつかの実施形態では、接触させる工程、灌流する工程またはその両方は１５℃～２８℃の範囲の温度で行う。
【0094】
生体試料および／または組織灌流への凍結保護剤の添加は一般的であり、当業者には明らかであろう。凍結保護剤の非限定的な例としては、限定されるものではないがＤＭＳＯ、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、スクロース、トレハロース、２－メチル－２，４－ペンタンジオール（ＭＰＤ）および／またはその他が挙げられる。
【0095】
いくつかの実施形態では、ＶＳは浸透性凍結保護剤、非浸透性凍結保護剤またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＶＳは巨大分子、抗酸化剤、培地またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＳは浸透性凍結保護剤、非浸透性凍結保護剤またはそれらの組み合わせを含み、任意に巨大分子、抗酸化剤、培地またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＳは浸透性凍結保護剤、非浸透性凍結保護剤、巨大分子、抗酸化剤、培地またはそれらの組み合わせを含む。
【0096】
いくつかの実施形態では、浸透性凍結保護剤はＤＭＳＯ、エチレングリコール、プロピレングリコール（ＰＧ）、グリセリン（ＧＬＹ）またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0097】
いくつかの実施形態では、非浸透性凍結保護剤は二糖、オリゴ糖、多糖またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、非浸透性凍結保護剤はスクロース、トレハロース、デキストランまたはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0098】
本明細書で使用される「巨大分子」という用語はウシ胎児血清、ヒト血清アルブミン、フィコール、それらの任意の組み合わせまたはそれらの任意の等価物を包含する。
【0099】
いくつかの実施形態では、抗酸化剤は没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、アスタキサンチンまたはそれらの組み合わせを含む。
【0100】
いくつかの実施形態では、培地は細胞および／または臓器培養に適したあらゆる増殖培地を含む。いくつかの実施形態では、培地はＰＢＳ、ＨＤＭＩまたはそれらの組み合わせを含む。
【0101】
いくつかの実施形態では、ＶＳは１５～２５％（ｗ／ｖ）のエチレングリコール、１５～２５％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、１５～２５（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清および０．３～０．７Ｍのトレハロースを含み、それらは全てＷｉｓｃｏｎｓｉｎ静的保存溶液中にある。
【0102】
いくつかの実施形態では、本方法は少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、１ヶ月または３ヶ月あるいはその間の任意の値および範囲の期間にわたって凍結保存された試料を保存することを含む工程をさらに含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、本方法は１～３日、２～５日、１～７日、３～１２日、６～１４日、１～３週間、２～５週間、３～６週間または１～４ヶ月、１～１００年の期間にわたって凍結保存された試料を保存することを含む工程をさらに含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0103】
いくつかの実施形態では、保存期間は再移植後の組織の生着が７～２８日間の期間にわたって維持される限りあらゆる期間を含む。いくつかの実施形態では、保存期間は再移植後の組織の生着が少なくとも７日、１４日、２１日、２８日あるいはその間の任意の値および範囲の期間にわたって維持される限りあらゆる期間を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0104】
いくつかの実施形態では、保存する工程は、凍結保存された試料のガラス転移温度（Ｔｇ）±１℃、±２℃、±３℃、±４℃、±５℃、±６℃、±７℃、±８℃、±９℃または±１０℃あるいはその間の任意の値および範囲におけるものである。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0105】
いくつかの実施形態では、ＴｇはＶＳのＴｇを含むかそれからなる。
【0106】
本明細書で使用される「Ｔｇ」および「Ｔｇプライム（Ｔｇ’）」という用語は互換可能である。
【0107】
いくつかの実施形態では、生体試料は少なくとも１ｃｍ３、１５ｃｍ３、５０ｃｍ３、１００ｃｍ３、１５０ｃｍ３、２００ｃｍ３、３００ｃｍ３、５００ｃｍ３、１，０００ｃｍ３、２，０００ｃｍ３、３，０００ｃｍ３、５，０００ｃｍ３、７，０００ｃｍ３、８，５００ｃｍ３、１０，０００ｃｍ３あるいはその間の任意の値および範囲の体積を有する組織または臓器を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、生体試料は３～５０ｃｍ３、３０～２５０ｃｍ３、２５～５００ｃｍ３、５５～６５０ｃｍ３、２００～１，５００ｃｍ３、３００～５，０００ｃｍ３、４５０～６，５００ｃｍ３、３００～７，５００ｃｍ３、１，０００～９，５００ｃｍ３、２，０００～８，５００ｃｍ３、３，０００～１０，０００ｃｍ３または１，０００～１２，０００ｃｍ３の体積を有する組織または臓器を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0108】
いくつかの実施形態では、それを必要とする対象において生体試料を移植するための方法であって、（ａ）本明細書に開示されている方法に従って生体試料を凍結保存する工程と、（ｂ）凍結保存された試料を解凍および／または加温して対象に移植する工程とを含む方法が提供される。
【0109】
「解凍する」および「加温する」という用語は本明細書では互換的に使用される。
【0110】
いくつかの実施形態では、それを必要とする対象において生体試料を移植するための方法であって、（ａ）本明細書に開示されている方法に従って生体試料を凍結保存する工程と、（ｂ）凍結保存された試料を対象に移植する工程とを含む方法が提供される。
【0111】
いくつかの実施形態では、本方法は、凍結保存された試料を対象に移植する工程の前に凍結保存された試料を解凍および／または加温する工程をさらに含む。
【0112】
いくつかの実施形態では、対象は限定されるものではないがヒト対象などの哺乳類対象である。
【0113】
いくつかの実施形態では、対象は臓器置換を必要としている。
【0114】
いくつかの実施形態では、臓器置換は臓器損傷もしくは疾患によるものである。いくつかの実施形態では、臓器損傷は損傷誘発性もしくは損傷関連の臓器損傷を含む。
【0115】
いくつかの実施形態では、損傷は外傷を含む。
【0116】
いくつかの実施形態では、対象は外傷に冒されているか冒されたことがある。
【0117】
いくつかの実施形態では、外傷は切断を含む。
【0118】
いくつかの実施形態では、本方法は凍結保存された試料の解凍の前後に凍結保護剤を洗い流す、除去する、排出する、捨てる工程またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は凍結保存された試料の移植の前後に凍結保護剤を洗い流す、除去する、排出する、捨てる工程またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【0119】
いくつかの実施形態では、本方法は凍結保存された生体試料を灌流する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は凍結保存された生体試料の移植前に凍結保存された生体試料を灌流する工程をさらに含む。
【0120】
いくつかの実施形態では、洗浄する工程および／または灌流する工程はスクロースを含む溶液の使用を含む。いくつかの実施形態では、洗浄する工程および／または灌流する工程は、本明細書に記載されている現在の手順に適した当業者に知られてるあらゆる溶液の使用を含む。いくつかの実施形態では、洗浄する工程および／または灌流する工程はスクロースを含む溶液の使用を含む。いくつかの実施形態では、当該溶液は少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１２５ｍＭ、少なくとも２５０ｍＭ、少なくとも５００ｍＭまたは少なくとも１，０００ｍＭ（１Ｍ）あるいはその間の任意の値および範囲の濃度のスクロースを含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、当該溶液は１００ｍＭ～５００ｍＭ、２５０ｍＭ～７５０ｍＭまたは１００ｍＭ～１，０００ｍＭの範囲の濃度のスクロースを含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0121】
いくつかの実施形態では、移植する工程は自家移植である。
【0122】
いくつかの実施形態では、移植する工程は同種異系移植することである。
【0123】
装置
いくつかの実施形態によれば、試料１０４を保持するために構築された第１の容器１０２と、冷却軸に沿った通路を通して第１の容器１０２の垂直位置を調整するように構成されたアクチュエータ３００と、第１の容器１０２に接触している加熱要素１５２と、アクチュエータ３００および加熱要素１５２と動作可能に通信状態にあり、かつ試料１０４の温度を制御するように構成された制御ユニット２００とを備える装置が提供される。
いくつかの実施形態によれば、試料１０４を保持するために構築された第１の容器１０２と、冷却軸に沿った通路を通して第１の容器１０２の垂直位置を調整するように構成されたアクチュエータ３００と、第１の容器１０２に接触している加熱要素１５２と、アクチュエータ３００および加熱要素１５２と動作可能に通信状態にあり、かつ試料１０４の温度を制御するように構成された制御ユニット２００とを備える装置が提供される。
【0124】
いくつかの実施形態では、冷却軸は通路の長手軸に平行である。
【0125】
いくつかの実施形態では、本装置は少なくとも１つの温度センサをさらに備える。本明細書で使用される「温度センサ」および「熱電対」という用語は互換可能である。
【0126】
いくつかの実施形態では、第１の容器１０２の温度が温度センサによって測定可能であるように、少なくとも１つの温度センサは第１の容器１０２に結合されている。
【0127】
いくつかの実施形態では、制御ユニット２００は少なくとも１つの温度センサと動作可能に通信状態にある。
【0128】
いくつかの実施形態では、生体試料が本明細書に開示されている方法に従って凍結保存されるように、制御ユニット２００は加熱要素を制御するように構成されているかそれと通信状態にある。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法の工程（ａ）の生体試料が３～１０秒の期間にわたって－２１０℃～－１９７℃の範囲の温度に供されるように、制御ユニットは加熱要素を起動させるか制御する。
【0129】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法の工程（ｂ）の生体試料が少なくとも３分の期間にわたって－１４０℃～－１００℃の範囲の温度に供されるように、制御ユニット２００は加熱要素を起動させるか制御する。
【0130】
いくつかの実施形態では、本装置は極低温液体１９０、そのスラッシュ、その蒸気またはそれらの任意の組み合わせを含むために構築された第２の容器１２６をさらに備える。
【0131】
いくつかの実施形態では、極低温液体は液体窒素（ＬＮ２）を含む。いくつかの実施形態では、極低温液体はＬＮ２スラッシュを含む。いくつかの実施形態では、極低温液体はＬＮ２蒸気を含む。
【0132】
試料１０４を保持するために構築された第１の容器１０２と、定位置リミットスイッチ１０６と、制御ユニット２００と、トレイ２０４と、第１の容器ケーブル１１０と、リミットスイッチストッパ１１２と、第１の容器支持ケーブル（短手側）１１４と、第１の容器支持ケーブル１１６と、第１の容器カバー締付ネジ（短手側）１１８と、加熱要素バネケーブル１２０と、熱電対バネケーブル１２２と、第１の容器カバー締付ネジ（長手側）１２４と、極低温液体を含むために構築された第２の容器１２６と、熱電対１２８と備える、本発明のいくつかの実施形態に係る装置の構成要素のいくつかの全体簡略化図である図５を参照する。
【0133】
真空ポンプ電源ソケット４０２と、主電源ソケットと、ヒューズスイッチ２０２とを備える、本発明のいくつかの実施形態に係る装置の制御ユニット２００の背面簡略化図である図６を参照する。
【0134】
制御ユニット２００と、第１の容器１０２と、本装置のハウジング５００と、真空パイプ４０４と、真空ポンプ４０６と、極低温液体／スラッシュ１９０と、極低温液体を含むために構築された第２の容器１２６と、熱電対１２８とを備える、本発明のいくつかの実施形態に係る装置の全体簡略化図である図７を参照する。
【0135】
熱電対１２８の熱電対ソケット１３２と、熱電対ソケット１３４と、熱電対１２８の熱電対プラグ１３０と、熱電対バネケーブル１３４と、熱電対１２８の熱電対ケーブル１３６と、熱電対プラグ１３８と、加熱要素ソケット１４０と、リミットスイッチホルダ１４２と、加熱要素バネケーブル１２０と、第１の容器支持ケーブル（短手側）１１４と、第１の容器カバー締付ネジ（長手側）１２４と、第１の容器吊り下げフック１４４と、リミットスイッチ１４６と、第１の容器吊り下げ金属リング１４８と、第１の容器支持ケーブル１１４と、加熱要素カバープレート１５０と、加熱要素１５２と、試料１０４と、第１の容器カバー締付ネジ（短手側）１１８とを備える、本発明のいくつかの実施形態に係る装置の第１の容器の全体簡略化図である図８を参照する。
【0136】
リミットスイッチホルダ１４２と、リミットスイッチ１４４と、熱電対１２８の熱電対プラグ１３０と、加熱要素ソケット１４０と、加熱要素プラグ１５２と、制御ユニット２００と、トレイ２０４と、第１の容器ケーブル１１０と、リミットスイッチストッパ１１２と、第１の容器吊り下げフック１４４と、第１の容器吊り下げ金属リング１４８とを備える、本発明のいくつかの実施形態に係る装置の上部の上側拡大簡略化図である図９を参照する。
【0137】
制御ユニット前面パネル２０６と、真空ポンプ停止／開始スイッチ２０８と、開始プロセススイッチ２１０と、プログラマブルロジックコントローラ（ＰＬＣ）液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）２１２と、警報赤色インジケータＬＥＤ２１４と、真空ポンプオン緑色インジケータＬＥＤ２１６と、冷却プロセス進行中緑色インジケータＬＥＤ２１８とを備える、本発明のいくつかの実施形態に係る装置の制御ユニット２００パネルの全体簡略化図である図１０を参照する。
【0138】
真空弁多岐管１５４と、真空逃がし弁１５６と、真空供給弁１５８と、真空計１６０と、第２の容器カバーＯリング１６２と、第２の容器１２６と、熱電対通り抜け口１６４と、第２の容器カバー１６６と、熱電対１２８とを備える、本発明のいくつかの実施形態に係る装置の第２の容器制御部の全体簡略化図である図１１を参照する。
【0139】
熱電対１２８の熱電対ソケット１３０と、加熱要素プラグソケット１４０と、熱電対ソケット１３４と、真空ポンプ電源ソケット４０２と、ケーブル回収ホイール３０２と、第１の容器ケーブル１１０と、ステップモータホルダパネル３０４と、一体型駆動装置を備えたステップモータ３０６と、主電源ソケットおよびヒューズスイッチ２０２とを備える、本発明のいくつかの実施形態に係る装置のアクチュエータ３００の全体簡略化図である図１２を参照する。
【0140】
真空弁多岐管１５４と、真空逃がし弁１５６と、真空供給弁１５８と、真空計１６０と、熱電対１２８と、極低温液体／スラッシュ１９０と、第２の容器１２６とを備える、本発明のいくつかの実施形態に係る装置の第２の容器の全体簡略化図である図１３を参照する。
【0141】
いくつかの実施形態では、第２の容器は長手軸を有する。いくつかの実施形態では、長手軸は冷却軸に平行である。いくつかの実施形態では、アクチュエータ３００は冷却軸に沿った通路を通して第１の容器１０２の位置を調整するように構成されている。
【0142】
いくつかの実施形態では、加熱要素１５２は第１の容器１０２に接触している。いくつかの実施形態では、加熱要素１５２は第１の容器１０２の上に位置しており、かつ少なくとも部分的にそこに重なっている。いくつかの実施形態では、加熱要素１５２は第１の容器を加熱し、それにより試料の温度を上げるように構成されている。
【0143】
いくつかの実施形態では、制御ユニット２００はアクチュエータ３００および加熱要素１５２と動作可能に通信状態にある。いくつかの実施形態では、制御ユニット２００は（ａ）第１の容器１０２を冷却軸に沿った通路を通して移動させるようなアクチュエータ３００の構成、（ｂ）第１の容器１０２に所定の量の熱を加えるための加熱要素１５２、または（ａ）および（ｂ）を命令することにより試料１０４の温度を制御するように構成されている。いくつかの実施形態では、アクチュエータ３００は、第１の容器の位置を冷却軸に沿って調整するように構成されている。いくつかの実施形態では、アクチュエータ３００は第１の容器の位置を第２の容器の下部に調整し、それにより試料の温度を下げる。いくつかの実施形態では、アクチュエータ３００は第１の容器の位置を第２の容器の上部に調整し、それにより試料の温度を上げる。いくつかの実施形態では、アクチュエータ３００は、第１の容器が第２の容器の上部の１ｃｍ、２ｃｍ、５ｃｍ、７ｃｍ、１０ｃｍ、１５ｃｍ、２０ｃｍまたは２５ｃｍ上あるいはその間の任意の値および範囲で上に位置決めされるように第１の容器の位置を調整する。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0144】
いくつかの実施形態では、アクチュエータ３００は第１の容器が第２の容器内に貯蔵されているか入れられている極低温液体の表面から１ｃｍ、２ｃｍ、５ｃｍ、７ｃｍ、１０ｃｍ、１５ｃｍ、２０ｃｍまたは２５ｃｍ上あるいはその間の任意の値および範囲で上に位置決めされるように第１の容器の位置を調整する。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0145】
いくつかの実施形態では、温度センサは熱電対であってもよい。いくつかの実施形態では、温度センサは無線温度センサであってもよい。いくつかの実施形態では、温度センサは赤外線センサであってもよい。いくつかの実施形態では、本装置は第１の容器に試料の温度を測定するように構成された少なくとも１つの温度センサを備える。いくつかの実施形態では、本装置は第２の容器にＬＮ２スラッシュの温度を測定するように構成された少なくとも１つの温度センサを備える。いくつかの実施形態では、温度センサは制御ユニットと動作可能に通信状態にある。
【0146】
いくつかの実施形態では、本装置は非熱伝導性部分、例えば断熱部分をさらに備える。いくつかの実施形態では、非導電性部分は非熱伝導性材料、例えば断熱材料を含む。
【0147】
当該技術分野で知られているあらゆる非熱伝導性材料を使用することができる。いくつかの実施形態では、非熱伝導性材料はブタン、ヒドラジン、クロロホルム、ヒドラジン、１，１，２－トリクロロ－トリフルオロエタン、１，２－ジクロロテトラフルオロエタン、テトラフルオロエタン、アルゴン、二酸化炭素、ジエチルエーテル、イソブタン、ペンタン、パーフルオロシクロブタン、プロパン、テトラフルオロメタン、ＣＦＣ－１１、ＨＣＦＣ－１４１ｂ、メタノール、Ｂアルコール、グリセリン、エーテル、アセトン、エチレングリコール、ガラス（ガラス繊維またはガラスビーズなど）を含有する非熱伝導性ポリオキソ含有流体、プロピレングリコール、アクリルガラス、アスファルト、セメント、粘土、コンクリート、コーリアンが充填されたセラミック、コルク、脱脂綿断熱材、珪藻土、エポキシ樹脂、ガラス繊維、泡ガラス、ガラスビーズまたはビーズ、ガラスウール、石膏、マグネサイト、酸化マグネシウム断熱材、ミネラル断熱材、ナイロン、パーライト、発泡プラスチック断熱材、発泡ポリスチレン、ポリウレタン、陶材、ＰＴＦＥ、ＰＶＣ、パイレックスガラス、砂、バーミキュライトエアロゲル、スチレンフォーム、ウレタンフォーム、バーミキュライト、ビニルエステルおよびそれらの組み合わせから選択される。
【0148】
いくつかの実施形態では、非熱伝導性部分は複数の連続層を含む。いくつかの実施形態では、非熱伝導性部分は複数の同心層を含む。
【0149】
本明細書で使用される「複数」という用語は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも７または少なくとも１０の任意の整数あるいはその間の任意の値および範囲を指す。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、複数は２～５、２～７、２～１０、３～８または３～１０を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【0150】
いくつかの実施形態では、複数の連続層の各層は少なくとも別の層に接触している。いくつかの実施形態では、複数の連続層の層は互いに接触していない。いくつかの実施形態では、互いに接触していない複数の連続層の層間の空隙は空気または不活性ガスで満たされている。いくつかの実施形態では、互いに接触していない複数の連続層の層間の空隙にはどんな液体またはガスも存在しない。いくつかの実施形態では、互いに接触していない複数の連続層の層間の空隙には空気は存在しない。
【0151】
一般的事項
本明細書で使用される「約」という用語は±１０％を指す。
本明細書で使用される「約」という用語は±１０％を指す。
【0152】
「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語およびそれらの活用形は、「限定されるものではないが～を含む」を意味する。
【0153】
「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は「～を含み、かつそれらに限定される」を意味する。
【0154】
「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、本組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含んでもよいが、さらなる成分、工程および／または部分が請求項に係る組成物、方法または構造の基本的および新規な特性を実質的に変えない場合にのみそうであることを意味する。
【0155】
「例示的」という言葉は本明細書では、「一例、実例または例示として機能すること」を意味するように使用される。「例示的」なものとして記載されている任意の実施形態は必ずしも、他の実施形態よりも好ましいか有利であるものものとして、および／または他の実施形態からの特徴の組み込みを排除するように解釈されるべきではない。
【0156】
「任意に」という言葉は本明細書では、「いくつかの実施形態では提供され、他の実施形態では提供されない」ことを意味するために使用される。本発明の任意の特定の実施形態は、そのような特徴が矛盾しない限り複数の「任意の」特徴を含み得る。
【0157】
本明細書で使用される単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「前記（その）（ｔｈｅ）」は、その文脈が明らかにそうでないことを示していない限り複数の指示対象を含む。例えば「化合物」または「少なくとも１種の化合物」という用語は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
【0158】
本出願全体を通して、本発明の様々な実施形態は範囲形式で示されている場合がある。当然のことながら、範囲形式での記載は単に便宜および簡潔性のためのものであり、本発明の範囲に対する変更の余地がない限界として解釈されるべきではない。従って、範囲の記載は具体的に開示されている全ての可能な部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値を有するように解釈されるべきである。例えば１～６などの範囲の記載は１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示されている部分範囲など、ならびにその範囲内の個々の数、例えば１、２、３、４、５および６を有するように解釈されるべきできある。これはその範囲の幅に関わらず当てはまる。
【0159】
数の範囲が本明細書に示されている場合は常に、示されている範囲内の任意の列挙されている数（分数または整数）を含むことが意図されている。「第１の指示数と第２の指示数との間の範囲（にある）」という語句および「第１の指示数～第２の指示数の範囲（にある）」は本明細書では互換的に使用され、第１および第２の指示数およびその間の全ての分数および整数を含むことが意図されている。
【0160】
本明細書で使用される「方法」という用語は、限定されるものではないが化学、薬理学、生物学、生化学および医学分野の実施者に知られているか公知の様式、手段、技術および手順から容易に開発される様式、手段、技術および手順を含む、所与の作業を達成するための様式、手段、技術および手順を指す。
【0161】
明確性のために、別個の実施形態の文脈に記載されている本発明の特定の特徴が単一の実施形態において組み合わせで提供される場合もあることが理解される。逆に簡潔性のために、単一の実施形態の文脈に記載されている本発明の様々な特徴は本発明の任意の他の記載されている実施形態において別々に、あるいは任意の好適な部分的組み合わせまたは好適な組み合わせとして提供される場合もある。様々な実施形態の文脈に記載されている特定の特徴は、当該実施形態がそれらの要素なしでは実施できないということがない限り、それらの実施形態の必須の特徴とみなされるべきではない。
【0162】
本発明の様々な実施形態の説明は例示のために提供されており、網羅的であることまたは開示されている実施形態に限定されることは意図されていない。記載されている実施形態の範囲および趣旨から逸脱しない多くの修正および変形が当業者には明らかになるであろう。本明細書で使用される用語は、当該実施形態の原理、実際の適用または市場に存在する技術からの技術的改良を最も良く説明するために、あるいはその他の当業者が本明細書に開示されている実施形態を理解することを可能にするために選択された。
【0163】
本明細書の上に詳述されており、かつ以下の特許請求の範囲の箇所で特許請求されている本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的確証が得られている。
【実施例】
【0164】
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明において利用される研究室手順は、化学的、分子的、生化学的および微生物学的技術ならびに組換えＤＮＡ技術を含む。そのような技術は文献に十分に説明されている。例えば、「分子クローニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）、「分子生物学における現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」第Ｉ～ＩＩＩ巻，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌら，「分子生物学における現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，メリーランド州ボルティモア（１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，「分子クローニングの実践ガイド（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９８８）、Ｗａｔｓｏｎら，「組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ）」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，ニューヨーク、Ｂｉｒｒｅｎら（編），「ゲノム分析：研究室マニュアルシリーズ（Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ）」，第１～４巻，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９９８）、米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号に記載されている方法論、「細胞生物学：研究室ハンドブック（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」，第Ｉ～ＩＩＩ巻，Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）、「動物細胞の培養－基本的技術マニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ－Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ著，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），第３版、「免疫学における現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」第Ｉ～ＩＩＩ巻，Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編（１９９４）、Ｓｔｉｔｅｓら（編），「基本的な臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（第８版），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，コネチカット州ノーウォーク（１９９４）、ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編），「細胞免疫学における選択された方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ニューヨーク（１９８０）」を参照されたく、利用可能な免疫学的検定は特許および科学文献に広範囲に記載されており、例えば米国特許第３，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８５０，５７８号、第３，８５３，９８７号、第３，８６７，５１７号、第３，８７９，２６２号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号、第４，０９８，８７６号、第４，８７９，２１９号、第５，０１１，７７１号および第５，２８１，５２１号、「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」，Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）、「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」，Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）、「転写および翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」，Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓＳ．Ｊ．編（１９８４）、「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）、「固定化細胞および酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）」，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）、「分子クローニングの実践ガイド（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」，Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）および「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），第１～３１７巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、「ＰＣＲプロトコル：方法および応用のガイド（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）、Ｍａｒｓｈａｋら，「タンパク質精製のための戦略および特性評価－実験室コースマニュアル（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ）」，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたく、それらの全ての内容が参照により組み込まれる。他の一般的な参考文献が本明細全体を通して提供されている。
【0165】
材料および方法
動物
１２～１６週齢の雄のドブネズミを従来の条件下に収容し、肢の従属栄養性同系移植のドナーおよびレシピエントの両方として使用した。テルアビブＳｏｕｒａｓｋｙメディカルセンター動物実験委員会（Ｔｅｌ Ａｖｉｖ Ｓｏｕｒａｓｋｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）は全ての動物実験を認可した。
動物
１２～１６週齢の雄のドブネズミを従来の条件下に収容し、肢の従属栄養性同系移植のドナーおよびレシピエントの両方として使用した。テルアビブＳｏｕｒａｓｋｙメディカルセンター動物実験委員会（Ｔｅｌ Ａｖｉｖ Ｓｏｕｒａｓｋｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）は全ての動物実験を認可した。
【0166】
外科的処置
肢の回収
誘導ケージにおいて５Ｌ／分の流速でのイソフルラン２％および酸素の吸入により麻酔を誘導した。１～２％イソフルラン吸入剤により麻酔を維持した。ドナー手術部位を調製し、膝上１ｃｍのレベルで右後肢の外周の周りで皮膚切開を行った。第１に、上側大腿の皮膚を動かして大腿二頭筋および大腿内側の内転筋群を露出させた。大腿に由来するが膝と交わっていない全ての表層筋群を膝関節の周りで切断して膝関節を露出させた。腸靱帯の上で大腿四頭筋の腱を切除した。腓腹筋およびヒラメ筋を除去したが、アキレス腱は保存した。膝関節包を開いた後に、全ての靱帯を切断することにより膝を完全に分離した。これらの筋肉および靱帯は二次修復のために残留組織の十分な縁を残していた。第２に、後膝関節の後ろに坐骨神経を見つけて脛骨神経および共通の腓骨神経を露出させた。１０－０ナイロンの目印縫合を配置した後、脛骨神経をふくらはぎの中央の腓骨神経において切除し、腓骨小頭の上で切り離した。これらの神経は中央神経組織を保存していた。第３に、大腿血管を鼠径靭帯から上腹部の開始レベルまで分離した。次いで大腿血管を先に配置した縫合目印の上でクランプして切除した。２２ゲージの血管カテーテルを用いて、静脈流出液が透明になるまで約５ｍＬの温かい生理食塩水０．９％および５０Ｕのヘパリンを大腿動脈を通して手動で灌流させた。切り離したら、ドナー肢（移植体）をそれがガラス化するまで湿ったガーゼで包んだ。ドナー動物を安楽死させた。
肢の回収
誘導ケージにおいて５Ｌ／分の流速でのイソフルラン２％および酸素の吸入により麻酔を誘導した。１～２％イソフルラン吸入剤により麻酔を維持した。ドナー手術部位を調製し、膝上１ｃｍのレベルで右後肢の外周の周りで皮膚切開を行った。第１に、上側大腿の皮膚を動かして大腿二頭筋および大腿内側の内転筋群を露出させた。大腿に由来するが膝と交わっていない全ての表層筋群を膝関節の周りで切断して膝関節を露出させた。腸靱帯の上で大腿四頭筋の腱を切除した。腓腹筋およびヒラメ筋を除去したが、アキレス腱は保存した。膝関節包を開いた後に、全ての靱帯を切断することにより膝を完全に分離した。これらの筋肉および靱帯は二次修復のために残留組織の十分な縁を残していた。第２に、後膝関節の後ろに坐骨神経を見つけて脛骨神経および共通の腓骨神経を露出させた。１０－０ナイロンの目印縫合を配置した後、脛骨神経をふくらはぎの中央の腓骨神経において切除し、腓骨小頭の上で切り離した。これらの神経は中央神経組織を保存していた。第３に、大腿血管を鼠径靭帯から上腹部の開始レベルまで分離した。次いで大腿血管を先に配置した縫合目印の上でクランプして切除した。２２ゲージの血管カテーテルを用いて、静脈流出液が透明になるまで約５ｍＬの温かい生理食塩水０．９％および５０Ｕのヘパリンを大腿動脈を通して手動で灌流させた。切り離したら、ドナー肢（移植体）をそれがガラス化するまで湿ったガーゼで包んだ。ドナー動物を安楽死させた。
【0167】
肢の移植
凍結および加温後にレシピエント動物を麻酔し、外科手術のために準備した。臀部に約１．５ｃｍの長さの斜めの切開を行って、肢の僅か上で、大腿血管の露出および分割をさらに遠位で行い、ドナー肢と近似する適切な長さを保存した。１０－０ナイロンの単純な結節縫合で血管吻合を行うことによりドナー肢を移植した。筋肉群を腹壁に近づけ、６－０プロリーンを用いて乳酸リンゲル液（５ｍＬ、ＩＰ）を投与した。４－０ナイロンでの結節縫合により皮膚を閉じた。
凍結および加温後にレシピエント動物を麻酔し、外科手術のために準備した。臀部に約１．５ｃｍの長さの斜めの切開を行って、肢の僅か上で、大腿血管の露出および分割をさらに遠位で行い、ドナー肢と近似する適切な長さを保存した。１０－０ナイロンの単純な結節縫合で血管吻合を行うことによりドナー肢を移植した。筋肉群を腹壁に近づけ、６－０プロリーンを用いて乳酸リンゲル液（５ｍＬ、ＩＰ）を投与した。４－０ナイロンでの結節縫合により皮膚を閉じた。
【0168】
膝下位置への肢移植体の再配置
レシピエントの肢の膝下切断
肢を受け取ったラットを麻酔し、その動物の右後肢および腰のくびれた部分を剪毛した。腰から内側大腿領域まで切開を行った。吻合のために膝関節の上で大腿動脈および大腿静脈を分離した。ガラス化の後に、吻合中の安定な状況のためにその肢を最初に固定した。吻合血管は適切な張力を維持している。
レシピエントの肢の膝下切断
肢を受け取ったラットを麻酔し、その動物の右後肢および腰のくびれた部分を剪毛した。腰から内側大腿領域まで切開を行った。吻合のために膝関節の上で大腿動脈および大腿静脈を分離した。ガラス化の後に、吻合中の安定な状況のためにその肢を最初に固定した。吻合血管は適切な張力を維持している。
【0169】
膝下位置決めおよび凍結保存された肢の接合
第５の肢として凍結保存された肢の移植から１０～１４日後に、表層筋を露出させるためにその肢の同じ側で、レシピエントの肢のふくらはぎの前側脛骨領域に切開を行った。次にレシピエントの腓腹筋、ヒラメ筋、アキレス腱および足首位置の約１ｃｍ上で終了している脛骨神経の一部を保持しながらレシピエントの肢の膝下切断を行った。凍結保存された肢瘢痕を元の切開部に沿って切断し、血管茎が完全に自由になるまで皮下筋膜および線維索を分離した。次いで凍結保存された肢を切断された膝関節の下に移動させた。凍結保存されたものをそれに応じて膝下位置において、第１に、膝関節の後側関節包を縫合して接合した。第２に、膝靱帯すなわち１）膝の十字靭帯、２）両側の側副靭帯、３）膝関節の前側および左右の関節包を修復した。第３に、膝蓋靱帯およびアキレス腱を縫合した。第４に、足首の１ｃｍ上でレシピエントおよびドナーの脛骨神経の吻合を行った。第５に、表層筋（内側広筋、外側広筋、大腿二頭筋、半腱様筋、半膜様筋および内転筋群）を修復した。第６に、調整された受け入れ領域の皮膚を凍結保存された肢の皮膚と縫合した。
第５の肢として凍結保存された肢の移植から１０～１４日後に、表層筋を露出させるためにその肢の同じ側で、レシピエントの肢のふくらはぎの前側脛骨領域に切開を行った。次にレシピエントの腓腹筋、ヒラメ筋、アキレス腱および足首位置の約１ｃｍ上で終了している脛骨神経の一部を保持しながらレシピエントの肢の膝下切断を行った。凍結保存された肢瘢痕を元の切開部に沿って切断し、血管茎が完全に自由になるまで皮下筋膜および線維索を分離した。次いで凍結保存された肢を切断された膝関節の下に移動させた。凍結保存されたものをそれに応じて膝下位置において、第１に、膝関節の後側関節包を縫合して接合した。第２に、膝靱帯すなわち１）膝の十字靭帯、２）両側の側副靭帯、３）膝関節の前側および左右の関節包を修復した。第３に、膝蓋靱帯およびアキレス腱を縫合した。第４に、足首の１ｃｍ上でレシピエントおよびドナーの脛骨神経の吻合を行った。第５に、表層筋（内側広筋、外側広筋、大腿二頭筋、半腱様筋、半膜様筋および内転筋群）を修復した。第６に、調整された受け入れ領域の皮膚を凍結保存された肢の皮膚と縫合した。
【0170】
血管化鼠径部皮弁
皮弁の回収
ドナーにおいて、大腿動脈および静脈に基づく３×４ｃｍの皮弁を腹部筋肉の真上の面において下にある皮筋および鼠径部の脂肪組織を含む鼠径部から回収した。回収後に、静脈流出量が透明になるまで皮弁をヘパリン添加された乳酸リンゲル液（１０ｍｌの乳酸リンゲル液中に５０Ｕのヘパリン）で灌流した。
皮弁の回収
ドナーにおいて、大腿動脈および静脈に基づく３×４ｃｍの皮弁を腹部筋肉の真上の面において下にある皮筋および鼠径部の脂肪組織を含む鼠径部から回収した。回収後に、静脈流出量が透明になるまで皮弁をヘパリン添加された乳酸リンゲル液（１０ｍｌの乳酸リンゲル液中に５０Ｕのヘパリン）で灌流した。
【0171】
皮弁移植
同じ大きさの欠陥をレシピエントラットの右側に作り出した。皮弁の挿入物を凍結および解凍した後に、標準的な顕微手術技術を用いて手術用顕微鏡拡大下で１０／０ナイロン縫合糸を用いてレシピエントおよびドナーの大腿動脈の動脈の端々吻合を行う。次に、４／０吸収性縫合糸（バイクリル（Ｖｉｃｒｙｌ）、Ｅｔｈｉｃｏｎ社）を用いて皮弁を欠陥に縫合する。
同じ大きさの欠陥をレシピエントラットの右側に作り出した。皮弁の挿入物を凍結および解凍した後に、標準的な顕微手術技術を用いて手術用顕微鏡拡大下で１０／０ナイロン縫合糸を用いてレシピエントおよびドナーの大腿動脈の動脈の端々吻合を行う。次に、４／０吸収性縫合糸（バイクリル（Ｖｉｃｒｙｌ）、Ｅｔｈｉｃｏｎ社）を用いて皮弁を欠陥に縫合する。
【0172】
肢のガラス化手順
回収した肢を５ｍＬの以下の溶液それぞれで手動で０．５分間灌流した。
１．平衡化溶液（Ｅ．Ｓ）：Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ静的保存溶液（ＳＰＳ－１、臓器保存システム）中に７．５％のエチレングリコール（ＥＧ）＋７．５％のＤＭＳＯ＋２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）。
２．ガラス化溶液（Ｖ．Ｓ）：ＳＰＳ－１中に２０％のＥＧ＋２０％のＤＭＳＯ＋２０％のＦＣＳ＋０．５Ｍのトレハロース。
回収した肢を５ｍＬの以下の溶液それぞれで手動で０．５分間灌流した。
１．平衡化溶液（Ｅ．Ｓ）：Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ静的保存溶液（ＳＰＳ－１、臓器保存システム）中に７．５％のエチレングリコール（ＥＧ）＋７．５％のＤＭＳＯ＋２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）。
２．ガラス化溶液（Ｖ．Ｓ）：ＳＰＳ－１中に２０％のＥＧ＋２０％のＤＭＳＯ＋２０％のＦＣＳ＋０．５Ｍのトレハロース。
【0173】
灌流が終了した後、その肢を空のサイトバッグ（ｃｒｙｏｂａｇ）（クライオマックス（ＣｒｙｏＭＡＣＳ）（登録商標）凍結バッグ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、ベルギッシュグラートバッハ、ドイツ）の中に挿入し、５ｍＬのＶ．Ｓを添加し、そのバッグを真空にし、加熱密封した。次いで、そのバッグをＶｉｔＭａｓｔｅｒ装置（ＩＭＴ、ネスジオナ、イスラエル）を用いてＬＮスラッシュ（－２０５～－２１０℃）の中に４秒間挿入し、その後にそれを指示されたとおりにＬＮ蒸気中のＬＮ表面から１ｃｍの場所に２分間～２時間置いた。
【0174】
肢の加温手順
凍結させたバッグをその肢が解凍するまで（約２～３分間）、３８℃まで加熱された水浴の中に挿入した。そのバッグを開けて肢を取り出し、１Ｍのスクロースを添加したＳＰＳ－１の中に２分間、次いで生理食塩水の中にさらに２分間挿入した。
凍結させたバッグをその肢が解凍するまで（約２～３分間）、３８℃まで加熱された水浴の中に挿入した。そのバッグを開けて肢を取り出し、１Ｍのスクロースを添加したＳＰＳ－１の中に２分間、次いで生理食塩水の中にさらに２分間挿入した。
【0175】
次いで、その肢を以下の洗浄溶液、すなわち洗浄溶液１（ＷＳ１）：ＳＰＳ－１中に１Ｍのスクロースおよび２０％のＦＢＳ、ＷＳ２：ＳＰＳ－１中にＷＳ１の１／１希釈溶液、ＷＳ３：ＳＰＳ－１中にＷＳ２の１／１希釈溶液、ＷＳ４：ＳＰＳ－１中にＷＳ３の１／１希釈溶液で手動で灌流した（溶液ごとに１ｍｌ／０．５分）。ＷＳ４の後に、その肢を１０～２０ｍｌの生理食塩水で洗浄した。
【0176】
血管化鼠径部皮弁のガラス化手順
回収した皮弁を１ｍＬの以下の溶液それぞれで手動で０．５分間灌流した。
１．平衡化溶液（Ｅ．Ｓ）：Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ静的保存溶液（ＳＰＳ－１、臓器保存システム）中に７．５％のエチレングリコール（ＥＧ）＋７．５％のＤＭＳＯ＋２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）。
２．ガラス化溶液（Ｖ．Ｓ）：ＳＰＳ－１中に２０％のＥＧ＋２０％のＤＭＳＯ＋２０％のＦＣＳ＋０．５Ｍのトレハロース。
回収した皮弁を１ｍＬの以下の溶液それぞれで手動で０．５分間灌流した。
１．平衡化溶液（Ｅ．Ｓ）：Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ静的保存溶液（ＳＰＳ－１、臓器保存システム）中に７．５％のエチレングリコール（ＥＧ）＋７．５％のＤＭＳＯ＋２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）。
２．ガラス化溶液（Ｖ．Ｓ）：ＳＰＳ－１中に２０％のＥＧ＋２０％のＤＭＳＯ＋２０％のＦＣＳ＋０．５Ｍのトレハロース。
【0177】
灌流が終了した後に、皮弁を空のサイトバッグ（ｃｒｙｏｂａｇ）（クライオマックス（ＣｒｙｏＭＡＣＳ）（登録商標）凍結バッグ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、ベルギッシュグラートバッハ、ドイツ）の中に挿入し、１ｍＬのＶ．Ｓを添加し、そのバッグを真空にし、加熱密封した。次いで、そのバッグをＶｉｔＭａｓｔｅｒ装置（ＩＭＴ、ネスジオナ、イスラエル）を用いてＬＮスラッシュ（－２０５～－２１０℃）の中に３秒間挿入し、その後にそれをＬＮ蒸気中のＬＮ表面から１ｃｍの場所に２分間置き、次いで２４時間または７～９日間の－８０℃の冷凍庫における貯蔵に移した。あるいは皮弁を含むバッグを加温の前にＬＮ蒸気の中に３０分間即座に置いた。
【0178】
皮弁の加温手順
その肢が解凍するまで（約３０秒間）、凍結させたバッグを３８℃まで加熱された水浴の中に挿入した。そのバッグを開けて、皮弁を取り出し、１Ｍのスクロースを添加したＳＰＳ－１の中に２分間、次いで生理食塩水の中にさらに２分間挿入した。
その肢が解凍するまで（約３０秒間）、凍結させたバッグを３８℃まで加熱された水浴の中に挿入した。そのバッグを開けて、皮弁を取り出し、１Ｍのスクロースを添加したＳＰＳ－１の中に２分間、次いで生理食塩水の中にさらに２分間挿入した。
【0179】
次いで、その肢を以下の洗浄溶液、すなわち洗浄溶液１（ＷＳ１）：ＳＰＳ－１中に１Ｍのスクロースおよび２０％のＦＢＳ、ＷＳ２：ＳＰＳ－１中にＷＳ１の１／１希釈溶液、ＷＳ３：ＳＰＳ－１中にＷＳ２の１／１希釈溶液、ＷＳ４：ＳＰＳ－１中にＷＳ３の１／１希釈溶液で手動で灌流した（溶液ごとに１ｍｌ／０．５分）。ＷＳ４の後に、その肢を１０～２０ｍｌの生理食塩水で洗浄した。
【0180】
移植後の治療
全ての移植されたラットに手術後２日目（ＰＯＤ２）からＰＯＤ３０までエリザベスカラーを付け、クレキサン（７５ＩＵ／ｋｇ）およびバイトリル（５ｍｇ／ｋｇ）の腹膜内注射によりＰＯＤ７まで毎日治療した。
全ての移植されたラットに手術後２日目（ＰＯＤ２）からＰＯＤ３０までエリザベスカラーを付け、クレキサン（７５ＩＵ／ｋｇ）およびバイトリル（５ｍｇ／ｋｇ）の腹膜内注射によりＰＯＤ７まで毎日治療した。
【0181】
組織学
動物の屠殺後に肢および皮弁試料を回収し、パラフィン切片を調製した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、Ｐｈｉｌｉｐｓ画像管理システム３．３．１ＨＦ１によって画像をキャプチャした。
動物の屠殺後に肢および皮弁試料を回収し、パラフィン切片を調製した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、Ｐｈｉｌｉｐｓ画像管理システム３．３．１ＨＦ１によって画像をキャプチャした。
【0182】
神経再生の免疫組織化学染色
近位および遠位癒合部位を含む脛骨神経を取り出し、２．５％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。神経試料を切断して神経吻合の近位（レシピエントの部分）および神経吻合から０．５ｃｍ遠位（ドナーの凍結保存された部分）の２つのセグメントに分けた。次いでこれらの組織をパラフィンブロックの中に埋め込み、約５μｍ厚さの切片にした。スライドを抗コリンアセチルトランスフェラーゼ抗体（運動ニューロン繊維のためのマーカーとしてのＣｈＡＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のヤギ抗ＣｈＡＴ ＡＢ１４４）、および一般的なニューロン繊維マーカーとしての抗神経フィラメント（ＮＦ）抗体（Ｎｏｖｕｓ社製のＣＤ－ＮＢ３００－１３３））で染色した。非特異的細胞核染色のためにＤＡＰＩを使用した。ニューロン繊維の総数と比較してインタクトな運動繊維の数を評価するために、２種類の染色（ＣｈＡＴおよびＮＦ）を別々に行う。染色された切片を調べ、カメラ（ＤＳ－Ｑｉ１、ＮｉＫＯｎ）に接続されたプランフルオール（Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ）対物レンズ（６×、２０×）を備えた蛍光ＯＲ顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｎｉ－Ｕ、Ｎｉｋｏｎ社、東京、日本）を用いて写真を撮影した。病理学者によって盲検のデジタル形態計測分析を行い、デジタルシステムを用いて定量的細胞計数を行った。デジタル画像を回収し、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏソフトウェアを用いて分析した。Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州サンホゼ）を用いて画像を組み立てた。
近位および遠位癒合部位を含む脛骨神経を取り出し、２．５％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。神経試料を切断して神経吻合の近位（レシピエントの部分）および神経吻合から０．５ｃｍ遠位（ドナーの凍結保存された部分）の２つのセグメントに分けた。次いでこれらの組織をパラフィンブロックの中に埋め込み、約５μｍ厚さの切片にした。スライドを抗コリンアセチルトランスフェラーゼ抗体（運動ニューロン繊維のためのマーカーとしてのＣｈＡＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のヤギ抗ＣｈＡＴ ＡＢ１４４）、および一般的なニューロン繊維マーカーとしての抗神経フィラメント（ＮＦ）抗体（Ｎｏｖｕｓ社製のＣＤ－ＮＢ３００－１３３））で染色した。非特異的細胞核染色のためにＤＡＰＩを使用した。ニューロン繊維の総数と比較してインタクトな運動繊維の数を評価するために、２種類の染色（ＣｈＡＴおよびＮＦ）を別々に行う。染色された切片を調べ、カメラ（ＤＳ－Ｑｉ１、ＮｉＫＯｎ）に接続されたプランフルオール（Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ）対物レンズ（６×、２０×）を備えた蛍光ＯＲ顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｎｉ－Ｕ、Ｎｉｋｏｎ社、東京、日本）を用いて写真を撮影した。病理学者によって盲検のデジタル形態計測分析を行い、デジタルシステムを用いて定量的細胞計数を行った。デジタル画像を回収し、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏソフトウェアを用いて分析した。Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州サンホゼ）を用いて画像を組み立てた。
【0183】
実施例１：移植後の凍結保存された血管化鼠径皮弁の長期生着
血管化鼠径部皮弁ラットモデルを用いて大きい組織のガラス化プロトコルの主要パラメータを較正し、これは日常的な形成再建手術治療で使用されている血管化皮弁を刺激する。凍結保護剤灌流時間の較正により、長期灌流（５分超）により移植から最初の３日以内に皮弁壊死が生じるが、５分よりも短い灌流時間により長期鼠径部皮弁生着が可能になることが実証された（データは示さず）。ＣＰＡ曝露をさらに減らすために、ＬＮスラッシュを用いて鼠径部皮弁を零度以下の温度まで急速冷却した。ＬＮスラッシュへの曝露時の組織亀裂／破壊を最小限に抑えるために、鼠径皮弁を増加する間隔にわたってＬＮスラッシュ中で冷却し、損傷を評価した。最長７秒間のスラッシュ曝露および２分間のＬＮ蒸気凍結後に血管化鼠径皮弁の血液再灌流が観察され、出血または損傷の兆候は見られなかった。対照的に、１０秒間のＬＮスラッシュおよびその後の２分間のＬＮ蒸気に曝露された皮弁において血管への損傷を示す複数の出血点が認められた（図１Ａ）。ＬＮスラッシュへの皮弁曝露を２０秒までさらに延長することにより血管の完全な切断が生じ、加温後の皮弁移植を行わなかった（図１Ａ）。従って次の段階では皮弁を灌流し、ＬＮスラッシュ中で短時間（３秒間）で冷却し、ＬＮ蒸気中で約－６０℃まで５分間冷却し、２４時間（図１Ｃ）または９日間（図１Ｄ）の長期冷却のために－８０℃の冷凍庫に即座に移した。凍結保存後に皮弁を温め、洗浄し、同系レシピエントに再移植し、それらの生着を追跡した。図に示すように２４時間または９日間のいずれかで凍結保存された皮弁は、ＰＯＤ２１からの発毛を含む長期生着能を示した。興味深いことに、全ての凍結保存された皮弁は皮膚の「乳白色」を呈し、それは白色の毛の成長を伴う場合もあった。２４時間（図１Ｅａ～図１Ｅｃ）または９日間（図１Ｅｄ～図１Ｅｆ）凍結保存されたＰＯＤ１２皮弁において行われた組織学で異なる皮膚層および皮下脂肪組織の完全性がさらに実証された。それらの良好な生着にも関わらず、９日間凍結保存された皮弁は２４時間凍結保存された皮弁と比較して苦痛の臨床徴候の上昇を示し、これは予測することができるように、凍結保護剤Ｔｇ’よりも高い温度で生組織を保存することに関しての不安定性を示している。
血管化鼠径部皮弁ラットモデルを用いて大きい組織のガラス化プロトコルの主要パラメータを較正し、これは日常的な形成再建手術治療で使用されている血管化皮弁を刺激する。凍結保護剤灌流時間の較正により、長期灌流（５分超）により移植から最初の３日以内に皮弁壊死が生じるが、５分よりも短い灌流時間により長期鼠径部皮弁生着が可能になることが実証された（データは示さず）。ＣＰＡ曝露をさらに減らすために、ＬＮスラッシュを用いて鼠径部皮弁を零度以下の温度まで急速冷却した。ＬＮスラッシュへの曝露時の組織亀裂／破壊を最小限に抑えるために、鼠径皮弁を増加する間隔にわたってＬＮスラッシュ中で冷却し、損傷を評価した。最長７秒間のスラッシュ曝露および２分間のＬＮ蒸気凍結後に血管化鼠径皮弁の血液再灌流が観察され、出血または損傷の兆候は見られなかった。対照的に、１０秒間のＬＮスラッシュおよびその後の２分間のＬＮ蒸気に曝露された皮弁において血管への損傷を示す複数の出血点が認められた（図１Ａ）。ＬＮスラッシュへの皮弁曝露を２０秒までさらに延長することにより血管の完全な切断が生じ、加温後の皮弁移植を行わなかった（図１Ａ）。従って次の段階では皮弁を灌流し、ＬＮスラッシュ中で短時間（３秒間）で冷却し、ＬＮ蒸気中で約－６０℃まで５分間冷却し、２４時間（図１Ｃ）または９日間（図１Ｄ）の長期冷却のために－８０℃の冷凍庫に即座に移した。凍結保存後に皮弁を温め、洗浄し、同系レシピエントに再移植し、それらの生着を追跡した。図に示すように２４時間または９日間のいずれかで凍結保存された皮弁は、ＰＯＤ２１からの発毛を含む長期生着能を示した。興味深いことに、全ての凍結保存された皮弁は皮膚の「乳白色」を呈し、それは白色の毛の成長を伴う場合もあった。２４時間（図１Ｅａ～図１Ｅｃ）または９日間（図１Ｅｄ～図１Ｅｆ）凍結保存されたＰＯＤ１２皮弁において行われた組織学で異なる皮膚層および皮下脂肪組織の完全性がさらに実証された。それらの良好な生着にも関わらず、９日間凍結保存された皮弁は２４時間凍結保存された皮弁と比較して苦痛の臨床徴候の上昇を示し、これは予測することができるように、凍結保護剤Ｔｇ’よりも高い温度で生組織を保存することに関しての不安定性を示している。
【0184】
より信頼性の高い長期凍結保存技術を可能にするという試みにおいて、本発明者らは、皮弁をより安定なガラス化溶液Ｔｇ’まで冷却する効果を評価し、これによりそれが約－１２１℃であると決定した（図２ＡのＩ）。皮弁の比較的薄い性質およびＬＮ蒸気におけるその急速冷却により、本発明者らはＬＮスラッシュ凍結段階を除き、ＬＮ蒸気中での３０分間のその温置により皮弁のＴｇ’への全体凍結を行い、約８０℃／分の冷却速度を可能にし（図２ＡのＩＩ）、これは成功した組織凍結の他の報告に匹敵していた（図２Ｂ）。移植後のその長期生着（図２ＣのＩ）ならびに手術後１２日目（ＰＯＤ１２）での組織学的評価における全ての皮膚層および皮下脂肪の正常な外観（図２ＣのＩＩ）から実証されているように、ガラス化溶液のＴｇ’まで皮弁を冷却することは成功であった。従って、Ｔｇ’への急速冷却およびＴｇ’での長期貯蔵は、ＬＮスラッシュ急速冷却および凍結保存の効率的な代替方法を提供することができる。
【0185】
実施例２：移植後の凍結保存された血管化後肢の長期生着
次に、新規な凍結保存プロトコルをより大きく、かつより複雑な後肢モデルに適用した。鼠径部皮弁と比較した場合により大きい体積の肢により、より漸進的なＬＮ蒸気段階の前に短い（４秒間）ＬＮスラッシュ冷却段階を含めた（図２Ａ）。この２段階冷却戦略により、肢移植後の長期生着（３０日間）、正常な発毛および末梢血灌流から証明されるように、組織損傷または亀裂を生じることなく零度以下の温度（－４℃）への急速冷却およびその後の－７０℃へのより漸進的な冷却（７℃／分）が可能になった（図２Ｂ～図２Ｃ）。重要なことに、正常な皮膚組織学に加えて、肢筋肉の大きい部分は凍結後、移植後（ＰＯＤ０）および移植から最長３０日後に正常な構造を示し（図２ＢのＩＩ）、これは神経再支配が起きた後の機能的肢回復の実現可能性を示している。
次に、新規な凍結保存プロトコルをより大きく、かつより複雑な後肢モデルに適用した。鼠径部皮弁と比較した場合により大きい体積の肢により、より漸進的なＬＮ蒸気段階の前に短い（４秒間）ＬＮスラッシュ冷却段階を含めた（図２Ａ）。この２段階冷却戦略により、肢移植後の長期生着（３０日間）、正常な発毛および末梢血灌流から証明されるように、組織損傷または亀裂を生じることなく零度以下の温度（－４℃）への急速冷却およびその後の－７０℃へのより漸進的な冷却（７℃／分）が可能になった（図２Ｂ～図２Ｃ）。重要なことに、正常な皮膚組織学に加えて、肢筋肉の大きい部分は凍結後、移植後（ＰＯＤ０）および移植から最長３０日後に正常な構造を示し（図２ＢのＩＩ）、これは神経再支配が起きた後の機能的肢回復の実現可能性を示している。
【0186】
実施例３：Ｔｇ’での凍結保存後の長期肢生着
皮弁について実証されているように、次に本発明者らはＬＮ蒸気またはそのような温度を保持することができるあらゆる他の凍結装置に貯蔵した場合にその長期生着を保証することができるより安定なＴｇ’までの凍結に耐える肢の能力を調べた。肢温度をＴｇ’まで下げるのに十分な短い（４秒間）ＬＮスラッシュ冷却段階およびその後の２時間のＬＮ蒸気段階を含むガラス化プロトコル（図３Ａ）に肢を供した。移植後に、凍結保存された肢はＰＯＤ２８での実験の終了まで生着し、これは毛髪再生（図３Ｂ）および良好な末梢血灌流（図３Ｃ）を示した。図３Ｄに示すように、移植中に皮下に埋め込まれた肢の大きい部分は皮下筋肉領域の正常な十分に灌流された外観を示した。屠殺後に採取された生検は正常な皮膚構造を示した（図３Ｅ）。神経再支配が達成されると機能的な肢の回復には筋肉生着が必須であり、筋肉は最も繊細な肢組織であるとみなされているので、凍結保存後の筋肉生着および回復を評価し、凍結させていない移植された対照の筋肉と比較した。９つの肢の異なる肢の部分から採取された生検および組織学的切片をＨ＆Ｅ染色後に評価した。図６Ａおよび図６Ｂに示すように、約－８０℃またはＴｇでの凍結保存後の筋肉状態は、移植前に生理食塩水またはＣＰＡのいずれかで灌流した新鮮な肢移植体における筋肉状態とは有意に異なっていなかった（図６Ａ～図６Ｂ）。全ての標本は正常な皮膚、皮下および筋膜様相を示した。筋肉束の大部分は、正常な構造および末梢核を有する保存された筋線維を示した。数個の束は壊死の兆候および中心核を有する再生を示した。いくつか束は、浮腫ならびにマクロファージおよびリンパ球からなる筋周囲／筋内膜炎症性浸潤を示した。いくつか束は帯状の神経原性萎縮を示した。最終的にいくつか束を脂肪組織で置き換えた。新鮮な対照および凍結保存された肢は移植後に同様の特徴を示し、有意差は認められず、これは筋肉完全性の保存における本発明者らの凍結保存方法の有効性を示している。組織学的発見に一致して、このプロトコルによって凍結保存された肢の長期生着は、ＤＦによって凍結保存されたかガラス化溶液Ｔｇよりも低い温度まで冷却された肢の生着よりも有意に優れていた（図６Ｃ）。
皮弁について実証されているように、次に本発明者らはＬＮ蒸気またはそのような温度を保持することができるあらゆる他の凍結装置に貯蔵した場合にその長期生着を保証することができるより安定なＴｇ’までの凍結に耐える肢の能力を調べた。肢温度をＴｇ’まで下げるのに十分な短い（４秒間）ＬＮスラッシュ冷却段階およびその後の２時間のＬＮ蒸気段階を含むガラス化プロトコル（図３Ａ）に肢を供した。移植後に、凍結保存された肢はＰＯＤ２８での実験の終了まで生着し、これは毛髪再生（図３Ｂ）および良好な末梢血灌流（図３Ｃ）を示した。図３Ｄに示すように、移植中に皮下に埋め込まれた肢の大きい部分は皮下筋肉領域の正常な十分に灌流された外観を示した。屠殺後に採取された生検は正常な皮膚構造を示した（図３Ｅ）。神経再支配が達成されると機能的な肢の回復には筋肉生着が必須であり、筋肉は最も繊細な肢組織であるとみなされているので、凍結保存後の筋肉生着および回復を評価し、凍結させていない移植された対照の筋肉と比較した。９つの肢の異なる肢の部分から採取された生検および組織学的切片をＨ＆Ｅ染色後に評価した。図６Ａおよび図６Ｂに示すように、約－８０℃またはＴｇでの凍結保存後の筋肉状態は、移植前に生理食塩水またはＣＰＡのいずれかで灌流した新鮮な肢移植体における筋肉状態とは有意に異なっていなかった（図６Ａ～図６Ｂ）。全ての標本は正常な皮膚、皮下および筋膜様相を示した。筋肉束の大部分は、正常な構造および末梢核を有する保存された筋線維を示した。数個の束は壊死の兆候および中心核を有する再生を示した。いくつか束は、浮腫ならびにマクロファージおよびリンパ球からなる筋周囲／筋内膜炎症性浸潤を示した。いくつか束は帯状の神経原性萎縮を示した。最終的にいくつか束を脂肪組織で置き換えた。新鮮な対照および凍結保存された肢は移植後に同様の特徴を示し、有意差は認められず、これは筋肉完全性の保存における本発明者らの凍結保存方法の有効性を示している。組織学的発見に一致して、このプロトコルによって凍結保存された肢の長期生着は、ＤＦによって凍結保存されたかガラス化溶液Ｔｇよりも低い温度まで冷却された肢の生着よりも有意に優れていた（図６Ｃ）。
【0187】
実施例４：凍結保存された肢の移植は神経再生および機能的感覚を示す
その機能性を取り戻すための凍結保存された肢の能力を実証するために、新規な二段階移植モデルを開発し、ここでは凍結保存された肢を移植処置からのその回復（約ＰＯＤ１２）まで第５の肢として最初に移植し、次いで膝下切断部を置き換えるために移した（図４Ａ）。重要なことに、肢が最初に移植されていたラットの腰から膝下位置への肢の再配置中に、それは血管に接合されたままであり、血管吻合およびその結果としての肢虚血の必要性がなくなる。レシピエントの膝へのその再配置および接合後に、移植された肢の足首の近くでレシピエントドナーの脛骨神経の吻合を行った。膝下位置への肢の再配置から２１日後までに、ラットはその移植された肢で自由に歩くことができ、その肢は生着可能であった（図４Ｂ）。歩行のための凍結保存された肢の使用は主にレシピエントの筋肉によって支持されていたが、ラットの体重および機能的歩行を支持するためのその肢の能力を実証した。またその肢の使用は、手の移植後の患者の物理療法と同様に神経再生を高めるために重要であり得る。重要なことに、神経再接合から２１日後に、神経は近位足領域において痛感を取り戻した（データは示さず）。神経再生は免疫組織化学分析によってさらに実証され、これは神経吻合部から約０．５ｃｍ遠位において神経フィラメントおよび運動ニューロン染色を示した（図４Ｃ）。
その機能性を取り戻すための凍結保存された肢の能力を実証するために、新規な二段階移植モデルを開発し、ここでは凍結保存された肢を移植処置からのその回復（約ＰＯＤ１２）まで第５の肢として最初に移植し、次いで膝下切断部を置き換えるために移した（図４Ａ）。重要なことに、肢が最初に移植されていたラットの腰から膝下位置への肢の再配置中に、それは血管に接合されたままであり、血管吻合およびその結果としての肢虚血の必要性がなくなる。レシピエントの膝へのその再配置および接合後に、移植された肢の足首の近くでレシピエントドナーの脛骨神経の吻合を行った。膝下位置への肢の再配置から２１日後までに、ラットはその移植された肢で自由に歩くことができ、その肢は生着可能であった（図４Ｂ）。歩行のための凍結保存された肢の使用は主にレシピエントの筋肉によって支持されていたが、ラットの体重および機能的歩行を支持するためのその肢の能力を実証した。またその肢の使用は、手の移植後の患者の物理療法と同様に神経再生を高めるために重要であり得る。重要なことに、神経再接合から２１日後に、神経は近位足領域において痛感を取り戻した（データは示さず）。神経再生は免疫組織化学分析によってさらに実証され、これは神経吻合部から約０．５ｃｍ遠位において神経フィラメントおよび運動ニューロン染色を示した（図４Ｃ）。
【0188】
考察
大きい組織、肢または臓器の凍結保存の成功は、医療再建および臓器移植の分野に革命を起こす可能性を有する。本発明者らは最近になって、一方向凍結またはガラス化のいずれかによる凍結保存後のラット後肢の短期間（３日間）の生着の成功を報告した。本研究は、凍結保存およびラットモデルにおける移植後の血管化鼠径部皮弁および後肢の長期生着の成功を初めて実証した。これは、３つの重要なパラメータにおいて既存のガラス化プロトコルを修正した新規な凍結保存プロトコルを用いて達成された。第１にそれは室温での急速凍結保護剤灌流を含んでいた。第２に零度以下の温度（約３６０℃／分）への急速冷却およびその後のＴｇ’（－１２１℃）へのより漸進的な冷却（約－８℃／分）による二段階で凍結を行った。最後に長期保存温度は、ＬＮを用いたドライシッパーコンテナ中に存在するより低い液体窒素（－１８０℃）または低い液体窒素蒸気凍結条件（＜－１５０℃）下ではなく当該溶液のＴｇ’下におけるものであった。肢の生着能が発毛、末梢血灌流および正常な皮膚、ＰＯＤ２８～３２での脂肪および筋肉組織学によって実証された。さらに肢の神経再支配を含んでいた新規な膝下移植モデルを用いて、神経再生および凍結保存された肢における機能的感覚の回復が実証された。要するに、これらの発見は大きい組織、肢および臓器凍結保存プロトコルの将来的な開発のための強固な基礎を提供する。
大きい組織、肢または臓器の凍結保存の成功は、医療再建および臓器移植の分野に革命を起こす可能性を有する。本発明者らは最近になって、一方向凍結またはガラス化のいずれかによる凍結保存後のラット後肢の短期間（３日間）の生着の成功を報告した。本研究は、凍結保存およびラットモデルにおける移植後の血管化鼠径部皮弁および後肢の長期生着の成功を初めて実証した。これは、３つの重要なパラメータにおいて既存のガラス化プロトコルを修正した新規な凍結保存プロトコルを用いて達成された。第１にそれは室温での急速凍結保護剤灌流を含んでいた。第２に零度以下の温度（約３６０℃／分）への急速冷却およびその後のＴｇ’（－１２１℃）へのより漸進的な冷却（約－８℃／分）による二段階で凍結を行った。最後に長期保存温度は、ＬＮを用いたドライシッパーコンテナ中に存在するより低い液体窒素（－１８０℃）または低い液体窒素蒸気凍結条件（＜－１５０℃）下ではなく当該溶液のＴｇ’下におけるものであった。肢の生着能が発毛、末梢血灌流および正常な皮膚、ＰＯＤ２８～３２での脂肪および筋肉組織学によって実証された。さらに肢の神経再支配を含んでいた新規な膝下移植モデルを用いて、神経再生および凍結保存された肢における機能的感覚の回復が実証された。要するに、これらの発見は大きい組織、肢および臓器凍結保存プロトコルの将来的な開発のための強固な基礎を提供する。
【0189】
血管化組織／肢／臓器の凍結保存の利点の１つは、非血管化組織とは対照的に凍結保護剤の物質移動の限界を動脈灌流によって解決することができ、それらの急速かつ効率的な分布を可能にするという点である。高濃度の凍結保護剤（本明細書に開示されているガラス化溶液中に４０％Ｖ／Ｖ）の毒性により、この研究は灌流時間を最小まで減少させた状態で室温での凍結保護剤灌流の有効性を評価した。この決定は予備実験に基づいており、これは５分超の急速灌流を経た皮弁のみが移植後にそれらの生着能を保持することを実証し、大部分は恐らく凍結保護剤によってそれらの血管に与えられる損傷が少ないことに起因していた。凍結保護剤毒性および冷害をさらに減らすために、ＬＮスラッシュを含む冷却工程が２００℃／分超の肢伝熱のために導入および提供され、これは４秒以内で零度以下の温度に到達した。
【0190】
これまでのガラス化の唯一の実際の使用は小さい組織および細胞（すなわち卵母細胞、精子、胚）の凍結保存においてであり、これは氷晶成長をほぼ伴わない急速冷却および加温ならびに比較的低い凍結保護剤濃度を用いる損傷のない凍結保存から恩恵を受ける。そのような場合、氷晶成長は凍結保護剤の存在下での伝熱の速さによって阻止される。しかしそのような急速冷却および加温は大きい組織では現在のところ不可能である。本発明は、零度以下の温度の素早い達成を可能にする短期間の液体窒素スラッシュ浸漬およびその後の液体窒素蒸気中でのより遅い冷却（７℃／分）を含む二段階冷却プロトコルを提供する。実際に、本明細に開示されている成功した二段階の漸進的凍結（約７℃／分）プロトコルとは対照的に、肢をＬＮスラッシュ浸漬（約４００℃／分）によって約－８０℃に急速冷凍する本発明者らの試みは成功とならず、血餅形成によりＰＯＤ２において肢の壊死が生じた（データは示さず）。
【0191】
－１８６℃のＭＶＥドライシッパー中での肢または皮弁の短期間貯蔵を行うという繰り返しの試みは成功とならず、移植後のそれらの急速壊死が生じた。示された結果により、組織をＴｇ’温度近くに維持した場合に凍結保存が最も成功することが実証された。提案されている二段階ガラス化手順を標準化するために、本発明者らは所定の期間にわたってＬＮスラッシュ中での急速冷却を制御し、かつ次いで長期貯蔵のために温度をＴｇ’まで上昇させる新しいガラス化装置を開発した（図６～図１４）。提案されているプロトコルおよび装置の単純さにより、病院および戦闘環境の両方において切断された肢および組織の即座の凍結保存のための単純な方法が可能になる。
【0192】
現代の再建手術は主に、それらの回収が能力障害を引き起こさない供与部位からの自家の体の部分（例えば、血管化皮弁、骨および神経）に依存している。その大きな成功にも関わらず、損傷が広範囲であり、かつ肢または顔などの複雑な構造において生じる場合にさらにいっそうそうである場合に再建はなお制限される。ＶＣＡの最近の出現は、脳死ドナーからの外来の複合移植片を利用することによる再建の限界を広げた。しかしその成功にも関わらず、ＶＣＡの日常的な臨床用途は、外来の移植片に対するレシピエントが苦しめられる広範囲の免疫拒絶により遅れており、移植片生着を可能にするために生涯にわたる免疫抑制剤の使用を必要とし、深刻な有害事象を生じたり、時には死亡にさえも至ったりすることが多い。本発明者らは、外傷後の切断された肢および血管化組織の即座の凍結保存が患者の安定化後まで、あるいは条件がそのような複雑な処置（熟練の顕微手術チーム＋顕微手術手術室および外傷中に汚染された組織の使用）を可能にするまで自家の再建／再移植の延期を可能にすることを示唆している。さらに需要に対して不足している実質臓器の入手可能性とは異なり、需要がさらに少ない肢は将来的使用のために貯蔵／保存することができる。そのような保存はドナーとレシピエントとの間のＨＬＡ適合性を高めるのを可能にすることによりＶＣＡ分野を進歩させ、これは同種移植片拒絶反応のリスクを低下させる。それは限られた回収後の肢の生着能（最大６時間）によって課される厳しい時間制約もなくし、計画された移植処置を可能にする。さらに実質臓器とは異なり、肢適合は審美的適合も必要とし、これは肢の保存により向上させることができる。
【0193】
この手法に従って、現在の研究は外傷後の複雑な組織再建を高めるために、凍結保存の臨床用途へのさらなる一歩を踏み出した。本明細書に開示されている凍結保存プロトコルを用いて、Ｔｇ’近くの温度（＜－１００℃）への凍結後の肢および血管化皮弁の両方の長期生着ならびに移植を達成した。初めて達成された凍結保存されたこの組織の長期生着は、７２時間よりも長い期間にわたる大きい生体組織の保存のための基礎を築き、救命処置のための治療可能域を広げる。重要なことに、有益な再建は完全な肢再移植に依存する必要がないだけでなく、より小さい組織の構成要素（血管化皮弁および骨移植片、神経、皮膚移植など）を用いる再建にも依存せず、これは多くの場合にその後の広範囲の外傷をなくし、かつ供与部位の罹患を防止する。重要なことに単なる肢の生着に加えて、組織学的分析は凍結保存および長期移植後の生着可能な筋肉を実証することができ、これは筋肉の回復に依存する機能的な凍結保存された肢の回復の実現可能性を示している。筋束全体の良好な保存にも関わらず、ＰＯＤ１０よりも後に組織学的分析は筋肉細胞再生も実証し、これは凍結誘導損傷または手足の切断中の神経障害による除神経に応答したものであり得る。凍結保存後の肢機能回復の実現可能性のさらなる支持が、本発明者らが膝下再移植および神経吻合後に神経の再生および肢感覚を示すのを可能にした本発明者らの新規な二段階移植モデルを用いて達成された。まとめると、ここに提供されている発見は、外傷後の機能的肢再移植または肢同種移植片のクライオバンキングを劇的に向上させるための本発明者らの凍結保存手法の実現可能性を実証している。
【0194】
本発明についてその具体的な実施形態と併せて説明してきたが、多くの代替、修飾および変形が当業者には明らかであることは明白である。従って、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲に含まれる全てのそのような代替、修飾および変形を包含することが意図されている。
【0195】
本明細書において言及されている全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的に、かつ個々に示されているかのように同程度に、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。また本出願における任意の参考文献の引用または特定は、そのような参考文献が先行技術として本発明に利用可能であることを認めるものとして解釈されるべきではない。セクションの見出しが使用されている限り、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【国際調査報告】