特表2023-539215幹細胞由来ベータ様細胞のインビトロ集団およびその新規のマーカーをスクリーニングするための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-13
(54)【発明の名称】幹細胞由来ベータ様細胞のインビトロ集団およびその新規のマーカーをスクリーニングするための方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6881 20180101AFI20230906BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20230906BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230906BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20230906BHJP
A61K 35/39 20150101ALI20230906BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20230906BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230906BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230906BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6881 Z
C12Q1/04
C12Q1/6869 Z
C12N5/071
A61K35/39
A61K35/545
A61P3/10
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023513207
(86)(22)【出願日】2021-08-27
(85)【翻訳文提出日】2023-02-22
(86)【国際出願番号】 EP2021073782
(87)【国際公開番号】W WO2022043518
(87)【国際公開日】2022-03-03
(31)【優先権主張番号】20193349.6
(32)【優先日】2020-08-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509091848
【氏名又は名称】ノヴォ ノルディスク アー／エス
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ジャネット・シュリヒティング・キェルケゴール
(72)【発明者】
【氏名】テス・ツァイ－シュー・ルー
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ53
4B063QR08
4B063QR42
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4C087AA01
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4C087BB64
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZB21
4C087ZC35
(57)【要約】
本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ細胞集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、移植前に当該細胞のインビボ機能性を予測するための、特異的マーカーまたはそれらの組み合わせを発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。本発明はまた、多能性幹細胞由来ベータ様細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞は、天然のヒトベータ細胞中に存在しない１つ以上のマーカーを含むか、または当該マーカーの発現レベルは、天然のヒトベータ細胞とは異なる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法であって、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する前記ベータ様細胞を特定する工程を含む、方法。
【請求項2】
前記ベータ様細胞が、ＲＮＡｓｅｑによってスクリーニングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団であって、前記集団が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含み、前記ベータ様細胞が、移植後にインスリン発現および分泌を維持する、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
【請求項4】
前記ベータ様細胞の少なくとも５５％が、ＳＯＸ１１、ＦＲＥＭ２、ＤＣＣ、ＢＡＳＰ１、ＣＨＲＮＡ３、およびＥＬＡＬＶ２から選択される１つ以上のマーカーを発現し、前記マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、請求項３に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
【請求項5】
前記ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、およびＨＭＧＣＳ１から選択される１つ以上のマーカーを発現し、前記マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ細胞中の前記マーカーの発現よりも平均して少なくとも約１ ｌｏｇ倍の変化である、請求項３に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
【請求項6】
前記ベータ様細胞が、Ｇ６ＰＣ２をさらに発現する、請求項３に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
【請求項7】
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項３～６のいずれか一項に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
【請求項8】
前記ベータ様細胞が、移植後にグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を示す、請求項３～７のいずれか一項に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
【請求項9】
１つ以上のマーカーが、移植後に平均血漿ｃ－ペプチドレベルと正の相関を示す、請求項３～８のいずれか一項に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
【請求項10】
前記ベータ様細胞が、移植後に血中グルコースの低下を示す、請求項３～９のいずれか一項に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
【請求項11】
１型糖尿病の治療に使用するための、請求項３～１０のいずれか一項に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
【請求項12】
請求項３～１０のいずれか一項に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ細胞集団と、細胞培養培地と、を含む、細胞組成物。
【請求項13】
請求項３～１０のいずれか一項に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ細胞集団を含む、埋め込み型装置。
【請求項14】
請求項３～１０のいずれか一項に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団を含む、凍結保存細胞培養物。
【請求項15】
１型糖尿病の治療方法であって、その治療を必要とする人に、請求項３～１０のいずれか一項に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、１つ以上の特異的マーカーを発現するベータ様細胞を特定することによって、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関する。本発明はまた、特異的マーカー、天然のヒトベータ細胞中に存在しないか、または天然のヒトベータ細胞とは異なる発現レベルを有する１つ以上のマーカーを発現するベータ様細胞を含む、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関する。
【背景技術】
【0002】
１型糖尿病患者は、ヒトドナーからの膵島の移植を用いて治療され得、一部の患者は、インスリン非依存性を達成する。しかしながら、ドナー膵島は不足しており、かつ可変品質を有し、したがって、多能性幹細胞由来ベータ様細胞は、膵島の魅力的な代替手段を提供する。
【0003】
インビトロ分化の間、ヒト多能性幹細胞は、様々な化学的および生物学的因子を使用して分化され、異なる内分泌細胞型を含む異種膵島様細胞クラスターをもたらす。
【0004】
古典的なベータ細胞マーカーには、インスリン（ＩＮＳ）、ならびにＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１などの標準転写因子が含まれる。従来、これらのマーカーを使用して、幹細胞由来ベータ様細胞を特定していた。すべての幹細胞由来ベータ様細胞は、インビトロでの古典的なベータ細胞マーカーの発現によって、天然のヒトベータ細胞と表現型的に類似しているように見え得るが、すべての幹細胞由来ベータ様細胞が移植後にインスリンを発現および分泌するわけではないため、それらは異なる。古典的なベータ細胞マーカーは、移植後にインスリン発現および分泌を維持する、インビトロでの幹細胞由来ベータ様細胞を特定するには不十分である。ＰＤＸ１などの古典的なベータ細胞マーカーの一部は、移植前に天然のヒトベータ細胞の表現型に類似し得るが、移植後にそれらの表現型を変化させ得る、望ましくない細胞集団または細胞集団の選択に向かって、幹細胞からベータ様細胞へのインビトロ分化プロトコル最適化をもたらすインビボ機能に負に相関しさえする。
【0005】
移植後にインスリン発現および分泌を維持する幹細胞由来ベータ細胞集団のインビトロ集団の特定は、分化ベータ様細胞の製品性能、評価、および産生に不可欠である。したがって、移植後にインスリン発現および分泌を維持する幹細胞由来ベータ様細胞のインビトロ集団を定義する新しいマーカーを特定する必要がある。
【発明の概要】
【0006】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0007】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも５５％が、ＳＯＸ１１、ＦＲＥＭ２、ＤＣＣ、ＢＡＳＰ１、ＣＨＲＮＡ３、およびＥＬＡＬＶ２から選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーは、天然のヒトベータ細胞中に存在しない。
【0008】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、およびＨＭＧＣＳ１から選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーの発現レベルは、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも約１ ｌｏｇ倍の変化(at least about 1 average log fold change)である。
【0009】
一態様では、本発明は、１型糖尿病の治療に使用するためのベータ様細胞を含む多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関する。
【0010】
一態様では、本発明は、本発明によって得られるベータ様細胞を含む多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団と、細胞培養培地と、を含む、細胞組成物に関する。
【0011】
一態様では、本発明は、本発明によって得られるベータ様細胞を含む多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団を含む埋め込み型装置に関する。
【0012】
一態様では、本発明は、１型糖尿病の治療方法に関し、その治療を必要とする人に、本発明によって得られるベータ様細胞を含む多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団を投与することを含む。
【0013】
一態様では、本発明は、本発明によって得られるベータ様細胞を含む多能性幹細胞由来細胞の凍結保存インビトロ集団に関する。
【0014】
一態様では、本発明は、移植前のベータ様細胞またはインスリン産生細胞を含む多能性幹細胞のインビトロ集団を提供する。
【0015】
本発明はまた、例示的な実施形態の開示から明らかになるであろうさらなる問題も解決し得る。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】図１Ａは、幹細胞由来細胞を得るための８つの異なる（改変された）プロトコルから、および死体ヒト膵島細胞からサンプリングされたすべての細胞のＴ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）投影を示すグラフである。図１Ｂは、２６個の細胞クラスターのｔＳＮＥ投影を示すグラフであり、各クラスターは、類似の遺伝子発現プロファイルを有する細胞からなる。
【図2】図２は、Ｘ軸上に幹細胞由来クラスター番号、およびＹ軸上にベータ細胞スコアを示すグラフである。これは、すべての細胞のヒトベータ細胞遺伝子モジュールスコアリングに基づいて、幹細胞由来ベータ様細胞クラスター番号１４、１５、および２６が、天然のヒトベータ細胞クラスター番号１６にほぼ類似することを示す。
【図4】図４は、幹細胞由来ベータ様細胞のインビトロ集団に特有の遺伝子発現プロファイルを示すグラフである。天然のヒトベータ細胞（クラスター１６）を、幹細胞由来ベータ様細胞（クラスター１４、１５、および２６）と比較した。天然のヒトベータ細胞のＵＰＴ中央値（これは、ＲＮＡ品質の尺度である）は、０に等しい。幹細胞由来ベータ様細胞のＵＰＴ中央値は、天然のヒトベータ細胞よりも大きかった。プロットは、箱ひげ図を使用した初代または天然のヒトベータ細胞と幹細胞由来ベータ様細胞との間の平均発現差、および単一ドットを使用した個々の細胞における発現を示す。各列の下には、発現を示さない細胞のパーセンテージが示される。
【図5】図５は、インビボでの移植前後の幹細胞由来細胞を示す図である。これは、一部の幹細胞由来細胞が、インビボ曝露後にインスリン陽性のままではないことを示す。移植前後の幹細胞由来細胞のＮＫＸ６．１、インスリン、およびグルカゴン染色は、細胞が移植前に天然のヒトベータ細胞と類似しているように見えるが、移植後にインスリン発現および分泌が有意に異なることを示す。
【図6】図６は、Ｘ軸上にクラスター１４、１５、および２６中の細胞のパーセンテージ、ならびにＹ軸上に移植の８週間後の平均ヒトＣ－ペプチドを示すグラフである。これは、幹細胞由来ベータ様細胞と、インビボ曝露の８週間後に分泌されたヒトＣ－ペプチドとの間の正の相関を示す。異なる（改変された）分化プロトコルを使用して生成された細胞を移植されたＳＣＩＤ－ベージュ動物において測定されたＣ－ペプチドレベルは、クラスター１４、１５、および２６の蓄積サイズと正の相関を示す。
【図7】図７は、古典的なベータ細胞マーカーＮＫＸ６．１、ＳＹＴ１３、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋、ＰＡＸ４が、ＳＣＩＤマウスにおける移植の８週間後に、平均ヒトＣ－ペプチドと負の相関を有することを示すグラフである。
【図8】図８ａ）上部パネルは、ＳＬＣ３０Ａ８が幹細胞由来ベータ細胞集団に富んでいることを示すグラフである。図８ａ）下部パネルは、ＰＤＸ１の広範な発現を示すグラフである。図８ｂ）上部パネルは、ＳＬＣ３０Ａ８がＳＣＩＤマウスの移植後８週間後に平均ヒトｃ－ペプチドと正に相関していることを示すグラフである。図８ｂ）下部パネルは、ＰＤＸ１がＳＣＩＤマウスの移植の８週間後に平均ヒトｃ－ペプチドに負に相関していることを示すグラフである。
【図9】図９ａ）は、ＡＣＶＲ１Ｃが天然のヒトベータ細胞中で発現されていないことを示す。図９ｂ）は、ＡＣＶＲ１Ｃが幹細胞由来細胞培養物内の細胞のサブセットをマークすることを示す。図９ｃ）は、ＡＣＶＲ１Ｃ発現がインビボ機能に正に相関することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明は、１つ以上の特異的マーカーを発現するベータ様細胞を特定することを含む、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関する。本発明のマーカーおよび方法は、移植後にインスリン発現および分泌を維持するベータ様細胞の移植前の特定を可能にする。これは、本発明に従って特定された幹細胞由来ベータ様細胞が、古典的なベータ細胞マーカーの発現に基づいて特定された幹細胞由来ベータ様細胞とは異なり、移植後にそれらの表現型を変化させないため、可能である。
【0018】
さらに、本発明は、移植後にインスリン発現および分泌を維持する幹細胞由来ベータ様細胞の特定における、特定の新規のマーカーまたは古典的なベータ細胞マーカーの適用を提供する。
【0019】
さらに、本発明は、天然のヒトベータ細胞中に存在しないか、または天然のヒトベータ細胞よりも幹細胞由来ベータ細胞のインビトロ集団において高い発現レベルを有するマーカーの検出によって、移植後にインスリン発現および分泌を維持するベータ様細胞の特定を可能にする。
【0020】
本発明に従った一態様では、マーカー遺伝子およびそれらの組み合わせは、分化効率、品質、および性能を評価するために、移植後にインスリン発現および分泌を維持する幹細胞由来ベータ細胞を特定または精製するために、プロテオミクス、フローサイトメトリー、免疫組織化学などのタンパク質ベースのアッセイ、またはＲＮＡシークエンシング、ｑＰＣＲプローブベースの検出などであるがこれらに限定されないＲＮＡベースのアッセイ、および他の分析方法またはスクリーニング方法で使用するためのものである。
【0021】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0022】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＤＬＫ１、およびＭＡＦＢから選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0023】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＣＨＲＮＡ３、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＤＬＫ１、およびＭＡＦＢから選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0024】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＣＨＲＮＡ３、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＬＢＨ、およびＤＬＫ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0025】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＡＣＶＲ１Ｃと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0026】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＦＲＥＭ２と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0027】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＣＨＲＮＡ３と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0028】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＤＣＣと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0029】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＳＯＸ１１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0030】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＭＡＲＣＫＳＬ１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0031】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＢＡＳＰ１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0032】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＳＴＡＲＤ１０と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0033】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＡＭＢＰと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0034】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0035】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＨＭＧＣＳ１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0036】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＥＬＡＶＬ２と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0037】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＰＣＰ４と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0038】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＰＣＤＨ７と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0039】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＮＥＦＬと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0040】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＰＬＡＧＬ１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0041】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＥＧＦＬ７と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0042】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＲＡＤ２１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0043】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＲＴＮ１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0044】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＰＬＸＮＡ２と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0045】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＬＢＨと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0046】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＮＥＦＭと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0047】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＳＬＣ３０Ａ８と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0048】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＤＬＫ１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0049】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＭＡＦＢと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0050】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法に関し、方法は、ＩＳＬ１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む。
【0051】
インビトロ細胞集団におけるタンパク質および核酸マーカーの発現を評価するための方法には、定性的逆転写酵素ポリメアーゼ連鎖反応（ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｍｅａｒｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＴ－ＰＣＲ）、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを参照されたい）、および切片材料の免疫組織化学分析などの免疫測定法、ウェスタンブロッティング、ならびにインタクトな細胞中でアクセス可能であるマーカーについては、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照されたい）が含まれる。
【0052】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0053】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のベータ様細胞を含む。
【0054】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含み、当該ベータ様細胞は、移植後にインスリン発現および分泌を維持する。
【0055】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のベータ様細胞を含み、当該ベータ様細胞は、移植後にインスリン発現および分泌を維持する。
【0056】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＤＬＫ１、およびＭＡＦＢから選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0057】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＤＬＫ１、およびＭＡＦＢから選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含み、当該ベータ様細胞は、移植後にインスリン発現および分泌を維持する。
【0058】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＣＨＲＮＡ３、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＤＬＫ１、およびＭＡＦＢから選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0059】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＣＨＲＮＡ３、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＤＬＫ１、およびＭＡＦＢから選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含み、当該ベータ様細胞は、移植後にインスリン発現および分泌を維持する。
【0060】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＣＨＲＮＡ３、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＬＢＨ、およびＤＬＫ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0061】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＣＨＲＮＡ３、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＬＢＨ、およびＤＬＫ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含み、当該ベータ様細胞は、移植後にインスリン発現および分泌を維持する。
【0062】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＡＣＶＲ１Ｃと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0063】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＦＲＥＭ２と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0064】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＣＨＲＮＡ３と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0065】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＤＣＣと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0066】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＳＯＸ１１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0067】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＭＡＲＣＫＳＬ１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0068】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＢＡＳＰ１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0069】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＳＴＡＲＤ１０と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0070】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＡＭＢＰと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0071】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0072】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＨＭＧＣＳ１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0073】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＥＬＡＶＬ２と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0074】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＰＣＰ４と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0075】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＰＣＤＨ７と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0076】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＮＥＦＬと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0077】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＰＬＡＧＬ１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0078】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＥＧＦＬ７と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0079】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＲＡＤ２１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0080】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＲＴＮ１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0081】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＰＬＸＮＡ２と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0082】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＬＢＨと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0083】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＮＥＦＭと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0084】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＳＬＣ３０Ａ８と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0085】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＤＬＫ１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0086】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＭＡＦＢと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0087】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、集団は、ＩＳＬ１と組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む。
【0088】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも５５％が、ＳＯＸ１１、ＦＲＥＭ２、ＤＣＣ、ＢＡＳＰ１、ＣＨＲＮＡ３、およびＥＬＡＬＶ２から選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーは、天然のヒトベータ細胞中に存在しない。
【0089】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも８５％が、ＳＯＸ１１を含み、当該マーカーは、天然のヒトベータ細胞中に存在しない。
【0090】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも７５％が、ＦＲＥＭ２を含み、当該マーカーは、天然のヒトベータ細胞中に存在しない。
【0091】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも８５％が、ＤＣＣを含み、当該マーカーは、天然のヒトベータ細胞中に存在しない。
【0092】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも７５％が、ＢＡＳＰ１を含み、当該マーカーは、天然のヒトベータ細胞中に存在しない。
【0093】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＣＨＲＮＡ３を含み、当該マーカーは、天然のヒトベータ細胞中に存在しない。
【0094】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも５５％が、ＥＬＡＬＶ２を含み、当該マーカーは、天然のヒトベータ細胞中に存在しない。
【0095】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、およびＨＭＧＣＳ１から選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーの発現レベルは、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも約１ ｌｏｇ倍の変化である。
【0096】
一実施形態では、平均したｌｏｇ倍の変化は、目的の細胞クラスターとすべての他の細胞クラスターとの間の平均したｌｏｇ倍の変化と等しい。
【0097】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも９５％が、ＡＣＶＲ１Ｃを含み、当該マーカーの発現レベルは、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも２ ｌｏｇ倍の変化である。
【0098】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも９５％が、ＭＡＲＣＫＳＬ１を含み、当該マーカーの発現レベルは、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも約２ ｌｏｇ倍の変化である。
【0099】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも９５％が、ＳＴＡＲＤ１０を含み、当該マーカーの発現レベルは、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも１ ｌｏｇ倍の変化である。
【0100】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも９０％が、ＡＭＢＰを含み、当該マーカーの発現レベルは、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも２ ｌｏｇ倍の変化である。
【0101】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも８５％が、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５を含み、当該マーカーの発現レベルは、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも約１ ｌｏｇ倍の変化である。
【0102】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＨＭＧＣＳ１を含み、当該マーカーの発現レベルは、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも約１ ｌｏｇ倍の変化である。
【0103】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、およびＨＭＧＣＳ１から選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーの発現レベルは、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％大きい。
【0104】
一実施形態では、本発明は、移植後にインスリン発現および分泌を維持するベータ様細胞を含む、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関する。
【0105】
一実施形態では、本発明は、ベータ様細胞を含む多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、細胞集団は、移植後にグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を示す。
【0106】
一実施形態では、応答は、インビトロＧＳＩＳ応答である。一実施形態では、応答は、インビボＧＳＩＳ応答である。一実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、天然のヒトベータ細胞の応答に類似する。
【0107】
一実施形態では、本発明は、ベータ様細胞を含む多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、１つ以上のマーカーが、移植後に平均血漿ｃ－ペプチドレベルと正の相関を示す。
【0108】
一実施形態では、本発明は、ベータ様細胞を含む多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞は、移植後に血中グルコースの低下を示す。
【0109】
一実施形態では、本発明は、ベータ様細胞を含む多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞は、グルコース応答性である。
【0110】
一実施形態では、本発明は、ベータ様細胞を含む幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞は、移植後にグルコース応答性である。
【0111】
一実施形態では、本発明は、ベータ様細胞を含む幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞は、移植後に強化されたＣ－ペプチドレベルを示す。
【0112】
一実施形態では、本発明は、ベータ様細胞を含む幹細胞由来細胞のインビトロ集団に関し、ベータ様細胞は、移植後に改善されたインスリンレベルを示す。
【0113】
本発明に従った一実施形態では、ベータ様細胞を含む幹細胞由来細胞のインビトロ集団は、移植後に血中グルコースの低下を示す。
【0114】
一態様では、本発明は、少なくとも１５％のベータ様細胞が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する多能性幹細胞由来細胞の細胞集団と、細胞培養培地と、を含む、インビトロ細胞培養物または組成物に関する。
【0115】
一態様では、本発明は、ベータ様細胞の少なくとも５５％が、ＳＯＸ１１、ＦＲＥＭ２、ＤＣＣ、ＢＡＳＰ１、ＣＨＲＮＡ３、およびＥＬＡＬＶ２から選択される１つ以上のマーカーを含む、多能性幹細胞由来細胞の細胞集団と、細胞培養培地と、を含む、インビトロ細胞培養物または組成物に関し、当該マーカーは、天然のヒトベータ細胞中に存在しない。
【0116】
一態様では、本発明は、ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、およびＨＭＧＣＳ１から選択される１つ以上のマーカーを含む、多能性幹細胞由来細胞の細胞集団と、細胞培養培地と、を含む、インビトロ細胞培養物または組成物に関し、当該マーカーの発現レベルは、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも１ ｌｏｇ倍の変化である。
【0117】
一実施形態では、本発明の細胞、幹細胞、幹細胞由来細胞、および／または幹細胞ベータ様細胞は、ヒト細胞である。
【0118】
一実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である。
【0119】
一態様では、本発明は、幹細胞由来細胞のインビトロ集団を含む、埋め込み型装置に関し、少なくとも１５％のベータ様細胞が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する。
【0120】
一態様では、本発明は、幹細胞由来細胞のインビトロ集団を含む、埋め込み型装置に関し、ベータ様細胞の少なくとも５５％が、ＳＯＸ１１、ＦＲＥＭ２、ＤＣＣ、ＢＡＳＰ１、ＣＨＲＮＡ３、およびＥＬＡＬＶ２から選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーは、天然のヒトベータ細胞中に存在しない。
【0121】
一態様では、本発明は、幹細胞由来細胞のインビトロ集団を含む、埋め込み型装置に関し、ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、およびＨＭＧＣＳ１から選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーの発現レベルは、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも１ ｌｏｇ倍の変化である。
【0122】
一態様では、本発明は、１型糖尿病の治療方法に関し、方法は、その治療を必要とする人に、幹細胞由来細胞のインビトロ集団を投与することを含み、少なくとも１５％のベータ様細胞が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する。
【0123】
一態様では、本発明は、１型糖尿病の治療方法に関し、方法は、その治療を必要とする人に、幹細胞由来細胞のインビトロ集団を投与することを含み、ベータ様細胞の少なくとも５５％が、ＳＯＸ１１、ＦＲＥＭ２、ＤＣＣ、ＢＡＳＰ１、ＣＨＲＮＡ３、およびＥＬＡＬＶ２から選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーは、天然のヒトベータ細胞中に存在しない。
【0124】
一態様では、本発明は、１型糖尿病の治療方法に関し、方法は、その治療と必要とする人に、幹細胞由来細胞のインビトロ集団を投与することを含み、ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、およびＨＭＧＣＳ１から選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーの発現レベルは、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも１ ｌｏｇ倍の変化である。
【0125】
一態様では、本発明は、幹細胞由来細胞の凍結保存集団に関し、少なくとも１５％のベータ様細胞が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する。
【0126】
一態様では、本発明は、幹細胞由来細胞の凍結保存集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも５５％が、ＳＯＸ１１、ＦＲＥＭ２、ＤＣＣ、ＢＡＳＰ１、ＣＨＲＮＡ３、およびＥＬＡＬＶ２から選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーは、天然のヒトベータ細胞中に存在しない。
【0127】
一態様では、本発明は、幹細胞由来細胞の凍結保存集団に関し、ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、およびＨＭＧＣＳ１から選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーの発現レベルは、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも１ ｌｏｇ倍の変化である。
【0128】
定義：
別段の定めのない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践は、別段の指示がない限り、当業者に公知の化学、生化学、生物物理学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学、免疫学、および薬理学の従来の方法を用いる。
別段の定めのない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践は、別段の指示がない限り、当業者に公知の化学、生化学、生物物理学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学、免疫学、および薬理学の従来の方法を用いる。
【0129】
すべての見出しおよび小見出しが、本明細書では便宜上使用されているだけであり、決して本発明を限定するものとして解釈されるべきではないことに留意されたい。
【0130】
本明細書で提示する任意およびすべての例または例示的な語句（例えば「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に本発明をより明瞭にするという意図しかなく、別段の請求がない限り、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書中のいずれの語句も、特許請求されないいかなる要素も本発明の実施に必須であることを示すと解釈すべきではない。
【0131】
本出願全体を通して、細胞を分化させるためのプロセスを指す場合の「方法」および「プロトコル」という用語は、互換的に使用され得る。
【0132】
また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する記載された項目のうちの１つ以上のうちのいずれかおよびすべての可能な組み合わせ、ならびに代替（「または」）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、かつそれらを包含する。さらに、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の特徴または特徴の組み合わせが除外または省略され得ることも企図する。
【0133】
本明細書で使用される場合、「ａ」は「１つ以上」を意味する。
【0134】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別段の指示がない限り、プラスまたはマイナス１０％、例えばプラスまたはマイナス５％を意味する。
【0135】
本明細書で使用される場合、「細胞集団」という用語は、インビトロであってもインビボであってもよい細胞の定義された群を指す。好ましい実施形態では、本発明に従った細胞集団は、インビトロ細胞集団である。
【0136】
幹細胞
幹細胞は、自己複製前駆細胞、非複製前駆細胞、および最終分化細胞を含む、子孫細胞を産生するために自己複製および分化の両方を行う単一細胞レベルでの能力によって定義される未分化細胞である。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）からの様々な細胞系統の機能細胞にインビトロで分化し、かつ移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞への注射後に全部ではないが実質的にほとんどの組織に寄与する能力を特徴とする。
幹細胞は、自己複製前駆細胞、非複製前駆細胞、および最終分化細胞を含む、子孫細胞を産生するために自己複製および分化の両方を行う単一細胞レベルでの能力によって定義される未分化細胞である。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）からの様々な細胞系統の機能細胞にインビトロで分化し、かつ移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞への注射後に全部ではないが実質的にほとんどの組織に寄与する能力を特徴とする。
【0137】
幹細胞は、発生能によって次に分類される：（１）全能性（すべての胚および胚体外細胞型を生じさせることができることを意味する）、（２）多能性（すべての胚細胞型を生じさせることができることを意味する）、（３）多分化能性（細胞系統のサブセットを生じさせることができるが、すべて特定の組織、臓器、または生理系内であることを意味する（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己複製）、血液細胞制限少能性前駆細胞、ならびに血液の正常な構成成分であるすべての細胞型および要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生することができる））、（４）少能性（多分化能性幹細胞よりも細胞系統のより制限されたサブセットを生じさせることができることを意味する）、ならびに（５）単能性（単一細胞系統を生じさせることができることを意味する（例えば、精子形成幹細胞））。
【0138】
ヒト多能性幹細胞
本明細書で使用される場合、「ヒト多能性幹細胞」（ｈＰＳＣ）は、任意のヒト源由来であり得、かつ適切な条件下で、３つすべての胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の誘導体である異なる細胞型の子孫を産生することができる細胞を指す。ｈＰＳＣは、８～１２週齢ＳＣＩＤマウスにおいて奇形腫を形成する能力、および／または組織培養中で３つすべての胚葉の特定可能な細胞を形成する能力を有し得る。ヒト多能性幹細胞の定義には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）（例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｈｅｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）を参照されたい、ならびに人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）を参照されたい）が含まれる。本明細書に記載される様々な方法および他の実施形態は、様々な源からのｈＰＳＣを必要または利用し得る。例えば、使用に適したｈＰＳＣは、発生中の胚から得られ得る。加えて、またはあるいは、好適なｈＰＳＣは、樹立細胞株および／またはヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞から得られ得る。
本明細書で使用される場合、「ヒト多能性幹細胞」（ｈＰＳＣ）は、任意のヒト源由来であり得、かつ適切な条件下で、３つすべての胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の誘導体である異なる細胞型の子孫を産生することができる細胞を指す。ｈＰＳＣは、８～１２週齢ＳＣＩＤマウスにおいて奇形腫を形成する能力、および／または組織培養中で３つすべての胚葉の特定可能な細胞を形成する能力を有し得る。ヒト多能性幹細胞の定義には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）（例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｈｅｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）を参照されたい、ならびに人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）を参照されたい）が含まれる。本明細書に記載される様々な方法および他の実施形態は、様々な源からのｈＰＳＣを必要または利用し得る。例えば、使用に適したｈＰＳＣは、発生中の胚から得られ得る。加えて、またはあるいは、好適なｈＰＳＣは、樹立細胞株および／またはヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞から得られ得る。
【0139】
ＥＳ細胞株はまた、子宮外胚を破壊することなく、かつ臨床転帰に影響を及ぼすことなく、単一割球から誘導することもできる（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）およびＫｌｉｍａｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．（２００６））。
【0140】
胚盤胞由来幹細胞
本明細書で使用される場合、「胚盤胞由来幹細胞」という用語は、ＢＳ細胞と表され、ヒト形態は、「ｈＢＳ細胞」と呼ばれる。文献中、細胞はしばしば、胚性幹細胞、より具体的には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と呼ばれる。
したがって、本発明で使用される多能性幹細胞は、例えば、ＷＯ０３／０５５９９２およびＷＯ２００７／０４２２２５に記載されるように、胚盤胞から調製される胚性幹細胞であり得るか、または市販のｈＢＳ細胞もしくは細胞株であり得る。しかしながら、例えば、Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）、およびＹｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）に開示されるようなＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８などの、ある特定の転写因子で成体細胞を処置することによって、多能性細胞に再プログラム化される分化成体細胞を含む、任意のヒト多能性幹細胞が本発明で使用され得ることがさらに想定される。
本明細書で使用される場合、「胚盤胞由来幹細胞」という用語は、ＢＳ細胞と表され、ヒト形態は、「ｈＢＳ細胞」と呼ばれる。文献中、細胞はしばしば、胚性幹細胞、より具体的には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と呼ばれる。
したがって、本発明で使用される多能性幹細胞は、例えば、ＷＯ０３／０５５９９２およびＷＯ２００７／０４２２２５に記載されるように、胚盤胞から調製される胚性幹細胞であり得るか、または市販のｈＢＳ細胞もしくは細胞株であり得る。しかしながら、例えば、Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）、およびＹｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）に開示されるようなＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８などの、ある特定の転写因子で成体細胞を処置することによって、多能性細胞に再プログラム化される分化成体細胞を含む、任意のヒト多能性幹細胞が本発明で使用され得ることがさらに想定される。
【0141】
ヒト胚性幹細胞
本明細書で使用される場合、「ヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳＣ」という用語は、ヒト胚の内部細胞塊に由来する幹細胞を指す。ヒト胚性幹細胞は、未分化状態で無限に自己再生することができる。さらに、ヒト胚性幹細胞は、多能性であり、外胚葉、内胚葉、および中胚葉の３つの主要な胚葉のすべての誘導体に分化することができることを意味する。
本明細書で使用される場合、「ヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳＣ」という用語は、ヒト胚の内部細胞塊に由来する幹細胞を指す。ヒト胚性幹細胞は、未分化状態で無限に自己再生することができる。さらに、ヒト胚性幹細胞は、多能性であり、外胚葉、内胚葉、および中胚葉の３つの主要な胚葉のすべての誘導体に分化することができることを意味する。
【0142】
ヒト人工多能性幹細胞
本明細書で使用される場合、「ヒト人工多能性幹細胞」または「ｈＩＰＳＣ」という用語は、体細胞を再プログラミングして、胚様多能性状態に戻すことによって生成された幹細胞を指す。人工多能性幹細胞は、未分化状態で無限に自己再生することができる。人工多能性幹細胞はまた、外胚葉、内胚葉、および中胚葉の３つの主要な胚葉のすべての誘導体に分化することができる。
本明細書で使用される場合、「ヒト人工多能性幹細胞」または「ｈＩＰＳＣ」という用語は、体細胞を再プログラミングして、胚様多能性状態に戻すことによって生成された幹細胞を指す。人工多能性幹細胞は、未分化状態で無限に自己再生することができる。人工多能性幹細胞はまた、外胚葉、内胚葉、および中胚葉の３つの主要な胚葉のすべての誘導体に分化することができる。
【0143】
分化
本明細書で使用される場合、「分化する」または「分化」は、細胞が未分化状態から分化状態に、または分化状態からより分化した状態に進行するプロセスを指す。細胞は、分化状態にあり得るが、特定の細胞型に完全には分化していない。
本明細書で使用される場合、「分化する」または「分化」は、細胞が未分化状態から分化状態に、または分化状態からより分化した状態に進行するプロセスを指す。細胞は、分化状態にあり得るが、特定の細胞型に完全には分化していない。
【0144】
「分化因子」という用語は、膵臓細胞に添加されて、それらの内分泌細胞への分化を強化する化合物を指し、内分泌細胞は、インスリン産生ベータ細胞も含有する。
【0145】
一実施形態では、細胞の分化は、１つ以上の分化因子を含む培地中で細胞を培養することを含む。
【0146】
胚体内胚葉細胞（ＤＥ細胞）
胚体内胚葉細胞は、マーカーＳＯＸ１７の発現を特徴とする。ＤＥのさらなるマーカーは、ＦＯＸＡ２およびＣＸＣＲ４である。
胚体内胚葉細胞は、マーカーＳＯＸ１７の発現を特徴とする。ＤＥのさらなるマーカーは、ＦＯＸＡ２およびＣＸＣＲ４である。
【0147】
「ＳＯＸ１７」（ＳＲＹ－ボックス１７）は、本明細書で使用される場合、胚発生の制御および細胞運命の決定に関与する転写因子のＳＯＸ（ＳＲＹ関連ＨＭＧ－ボックス）ファミリーのメンバーである。
【0148】
「ＦＯＸＡ２」（フォークヘッドボックスＡ２）は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ結合タンパク質のフォークヘッドクラスのメンバーである。
【0149】
「ＣＸＣＲ４」（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体４）は、本明細書で使用される場合、ストローマ細胞由来因子１に特異的なＣＸＣケモカイン受容体である。
【0150】
ＤＥ誘導プロトコルの非限定的な例は、従来のＤ’Ａｍｏｕｒプロトコル（Ｎｏｖｏｃｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃ ２００６，２００８）、およびＷＯ２０１２／１７５６３３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるプロトコルである。
【0151】
膵臓内胚葉細胞（ＰＥ細胞）
膵臓内胚葉細胞は、少なくとも５％ ＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋二重陽性のマーカーの発現を特徴とする。ＰＥのさらなるマーカーは、ＰＴＦ１ＡおよびＣＰＡ１である。
膵臓内胚葉細胞は、少なくとも５％ ＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋二重陽性のマーカーの発現を特徴とする。ＰＥのさらなるマーカーは、ＰＴＦ１ＡおよびＣＰＡ１である。
【0152】
「ＰＤＸ１」は、本明細書で使用される場合、膵臓発生に関わるホメオドメイン転写因子を指す。
【0153】
「ＮＫＸ６．１」は、本明細書で使用される場合、ＮＫＸ転写因子ファミリーのメンバーである。
【0154】
「ＰＴＦ１Ａ」は、本明細書で使用される場合、膵臓転写因子１複合体（ＰＴＦ１）の構成成分であり、哺乳動物膵臓発生において役割を果たすことが知られているタンパク質である。
【0155】
「ＣＰＡ１」は、本明細書で使用される場合、亜鉛メタロプロテアーゼのカルボキシペプチダーゼＡファミリーのメンバーである。この酵素は、膵臓で産生される。
【0156】
ＷＯ２０１４／０３３３２２に記載されるプロトコルは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0157】
内分泌前駆細胞（ＥＰ細胞）
内分泌前駆細胞は、内分泌細胞運命に委ねられるＥＰ細胞の特徴であるマーカーＮＧＮ３、ＮｅｕｒｏＤ、およびＮＫＸ２．２の発現を特徴とする。
内分泌前駆細胞は、内分泌細胞運命に委ねられるＥＰ細胞の特徴であるマーカーＮＧＮ３、ＮｅｕｒｏＤ、およびＮＫＸ２．２の発現を特徴とする。
【0158】
「ＮＧＮ３」は、本明細書で使用される場合、塩基性ループ－ヘリックス－ループ転写因子のニューロゲニンファミリーのメンバーである。
【0159】
「ＮＫＸ２．２」および「ＮＫＸ６．１」は、本明細書で使用される場合、ＮＫＸ転写因子ファミリーのメンバーである。
【0160】
「ＮｅｕｒｏＤ」は、本明細書で使用される場合、塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子のＮｅｕｒｏＤファミリーのメンバーである。
【0161】
ＷＯ２０１５／０２８６１４に記載されるプロトコルは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0162】
天然のヒトベータ細胞
本明細書で使用される場合、「天然のヒトベータ細胞」または「初代ベータ細胞」という用語は、ヒト体内のグルコースまたは分泌促進剤に応答してインスリンを産生する細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「天然のヒトベータ細胞」または「初代ベータ細胞」という用語は、ヒト体内のグルコースまたは分泌促進剤に応答してインスリンを産生する細胞を指す。
【0163】
幹細胞由来細胞
本明細書で使用される場合、「幹細胞由来細胞」または「多能性幹細胞由来細胞」という用語は、さらなる分化の可能性を有するか、または最終分化細胞であるが、移植後に必ずしもインスリン分泌を示すとは限らない、多能性幹細胞の分化によって得られる細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「幹細胞由来細胞」または「多能性幹細胞由来細胞」という用語は、さらなる分化の可能性を有するか、または最終分化細胞であるが、移植後に必ずしもインスリン分泌を示すとは限らない、多能性幹細胞の分化によって得られる細胞を指す。
【0164】
幹細胞由来ベータ細胞
本明細書で使用される場合、「ベータ様細胞」、または「幹細胞由来ベータ細胞」、または「ＳＣ－β細胞」、または「幹細胞由来ベータ様細胞」、または「インビトロでの幹細胞由来ベータ細胞」は、幹細胞に由来し、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＩＮＳなどの天然のヒトベータ細胞の少なくとも１つのマーカーを発現する細胞を指し、天然のインスリン分泌に類似する、グルコースに応答したインビトロおよび／またはインビボインスリン分泌を示す。ＷＯ２０１７／１４４６９５に記載されるプロトコルは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ベータ様細胞」、または「幹細胞由来ベータ細胞」、または「ＳＣ－β細胞」、または「幹細胞由来ベータ様細胞」、または「インビトロでの幹細胞由来ベータ細胞」は、幹細胞に由来し、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＩＮＳなどの天然のヒトベータ細胞の少なくとも１つのマーカーを発現する細胞を指し、天然のインスリン分泌に類似する、グルコースに応答したインビトロおよび／またはインビボインスリン分泌を示す。ＷＯ２０１７／１４４６９５に記載されるプロトコルは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0165】
スクリーニング
本明細書で使用される場合、「スクリーニング」という用語は、遺伝子型のある特定の表現型を有する１つ以上の細胞の存在に基づいて、細胞または細胞集団を検出、特定、精製、選択、または特徴付けすることを指す。表現型および遺伝子型は、マーカーの発現に基づいて確立されてもよい。一実施形態では、特定することは、細胞を特徴付けるマーカーの発現レベルに従って細胞を分類することを指す。好ましい実施形態では、本発明に従ったスクリーニングは、インビトロで実施される。
本明細書で使用される場合、「スクリーニング」という用語は、遺伝子型のある特定の表現型を有する１つ以上の細胞の存在に基づいて、細胞または細胞集団を検出、特定、精製、選択、または特徴付けすることを指す。表現型および遺伝子型は、マーカーの発現に基づいて確立されてもよい。一実施形態では、特定することは、細胞を特徴付けるマーカーの発現レベルに従って細胞を分類することを指す。好ましい実施形態では、本発明に従ったスクリーニングは、インビトロで実施される。
【0166】
発現レベル
本明細書で使用される場合、「発現レベル」という用語は、細胞中の遺伝子発現および／または遺伝子産物活性の程度を指す。発現レベルは、任意の絶対単位または正規化された単位で（対照参照の公知の発現レベルに対して）決定され得る。
本明細書で使用される場合、「発現レベル」という用語は、細胞中の遺伝子発現および／または遺伝子産物活性の程度を指す。発現レベルは、任意の絶対単位または正規化された単位で（対照参照の公知の発現レベルに対して）決定され得る。
【0167】
マーカー
本明細書で使用される場合、「マーカー」という用語は、細胞によって作製された自然発生の特定可能な発現を指し、これは、細胞のある特定の特性に相関し得、細胞または細胞集団を特定、予測、または特徴付ける働きをする。マーカーは、遺伝子と呼ばれる場合がある。マーカーは、ｍＲＮＡまたはタンパク質、例えば、細胞表面上のタンパク質の形態であってもよい。
本明細書で使用される場合、「マーカー」という用語は、細胞によって作製された自然発生の特定可能な発現を指し、これは、細胞のある特定の特性に相関し得、細胞または細胞集団を特定、予測、または特徴付ける働きをする。マーカーは、遺伝子と呼ばれる場合がある。マーカーは、ｍＲＮＡまたはタンパク質、例えば、細胞表面上のタンパク質の形態であってもよい。
【0168】
本明細書で使用される場合、マーカーに言及する「発現」という用語は、検出され得る分子の細胞における欠如または存在を指す。ある実施形態では、発現される分子は、ｍＲＮＡまたはタンパク質である。マーカーの発現は、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルなど、任意の好適なレベルで検出され得る。当業者であれば、細胞をマーカーの陽性発現または陰性発現によって定義することができること、すなわち、細胞の特性および状態を、ある特定のマーカーの発現およびその欠如に基づいて等しく相互に関連付けてもよいことを容易に理解するであろう。特異的マーカーに言及する場合、発現の存在または欠如は、それぞれ、＋（プラス）または－（マイナス）で示されてもよい。
【0169】
本明細書で使用される場合、「ＡＣＶＲ１Ｃ」は、アクチビンＡ受容体１Ｃ型である。
【0170】
本明細書で使用される場合、「ＡＭＢＰ」は、アルファ－１－ミクログロブリン／ビクニン前駆体である。
【0171】
本明細書で使用される場合、「ＢＡＳＰ１」は、脳豊富膜結合シグナルタンパク質１である。
【0172】
本明細書で使用される場合、「ＣＨＲＮＡ３」は、コリン作動性受容体のニコチン性アルファ３サブユニットである。
【0173】
本明細書で使用される場合、「ＤＣＣ」は、ネトリン１受容体をコードする遺伝子である。
【0174】
本明細書で使用される場合、「ＤＬＫ１」は、デルタ様非標準ノッチリガンドである。
【0175】
本明細書で使用される場合、「ＥＧＦＬ７」は、ＥＧＦ様ドメインマルチプル７である。
【0176】
本明細書で使用される場合、「ＥＬＡＶＬ２」は、胚性致死、異常視覚、ショウジョウバエ様２である。
【0177】
本明細書で使用される場合、「ＦＲＥＭ２」は、ＦＲＡＳ１関連細胞外マトリックス２である。
【0178】
本明細書で使用される場合、「Ｇ６ＰＣ２」は、グルコース－６－ホスファターゼ触媒サブユニット２である。
【0179】
本明細書で使用される場合、「ＨＭＧＣＳ１」は、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ１である。
【0180】
本明細書で使用される場合、「ＩＳＬ１」は、ＩＳＬ ＬＩＭホメオボックス１である。
【0181】
本明細書で使用される場合、「ＬＢＨ」は、ＷＮＴシグナル伝達経路のＬＢＨ調節因子である。
【0182】
本明細書で使用される場合、「ＭＡＦＢ」は、ＭＡＦ ｂＺＩＰ転写因子Ｂである。
【0183】
本明細書で使用される場合、「ＭＡＲＣＫＳＬ１」は、ＭＡＲＣＫＳ様１である。
【0184】
本明細書で使用される場合、「ＮＥＦＬ」は、ニューロフィラメント光である。
【0185】
本明細書で使用される場合、「ＮＥＦＭ」は、ニューロフィラメント媒体である。
【0186】
本明細書で使用される場合、「ＰＣＤＨ７」は、プロトカドヘリン７である。
【0187】
本明細書で使用される場合、「ＰＣＰ４」は、プルキンエ細胞タンパク質４である。
【0188】
本明細書で使用される場合、「ＰＬＡＧＬ１」は、ＰＬＡＧ１様亜鉛フィンガー１である。
【0189】
本明細書で使用される場合、「ＰＬＸＮＡ２」は、プレキシンＡ２である。
【0190】
本明細書で使用される場合、「ＲＡＤ２１」は、ＲＡＤ２１コヘシン複合体成分である。
【0191】
本明細書で使用される場合、「ＲＴＮ１」は、レチクロン１である。
【0192】
本明細書で使用される場合、「ＳＬＣ３０Ａ８」は、溶質担体ファミリー３０メンバー８である。
【0193】
本明細書で使用される場合、「ＳＯＸ１１」は、ＳＲＹ－ボックス転写因子１１である。
【0194】
本明細書で使用される場合、「ＳＴＡＲＤ１０」は、ＳｔＡＲ関連脂質輸送ドメイン含有１０である。
【0195】
本明細書で使用される場合、「ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５」は、ＳＴ６ Ｎ－アセチルガラクトサミニドアルファ－２，６－シアルイルトランスフェラーゼ５である。
【0196】
インスリン発現または産生
インスリン発現または産生は、インスリンタンパク質および／またはインスリンＲＮＡを合成する細胞の能力である。好ましい実施形態では、本発明のベータ様細胞は、移植後にインスリン発現を維持する。
インスリン発現または産生は、インスリンタンパク質および／またはインスリンＲＮＡを合成する細胞の能力である。好ましい実施形態では、本発明のベータ様細胞は、移植後にインスリン発現を維持する。
【0197】
インスリン分泌
インスリン分泌は、インスリンを放出する細胞の能力である。好ましい実施形態では、本発明のベータ様細胞は、移植後にインスリン分泌を維持する。
インスリン分泌は、インスリンを放出する細胞の能力である。好ましい実施形態では、本発明のベータ様細胞は、移植後にインスリン分泌を維持する。
【0198】
培養培地／組成物
細胞の増殖を支持するように設計された固体、液体、または半固体。様々な種類の商業用培地が、様々な種類の細胞を増殖させるために使用される。好ましい実施形態では、本発明に従った細胞培養物または組成物は、インビトロ細胞培養物または組成物である。
細胞の増殖を支持するように設計された固体、液体、または半固体。様々な種類の商業用培地が、様々な種類の細胞を増殖させるために使用される。好ましい実施形態では、本発明に従った細胞培養物または組成物は、インビトロ細胞培養物または組成物である。
【0199】
本明細書に別段の示唆がない限り、単数形で提示される用語は、複数の状況も含む。
【0200】
本発明は、以下の非限定的な実施形態によってさらに説明される。
１． 多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法であって、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む、方法。
２． ベータ様細胞が、ＲＮＡｓｅｑによってスクリーニングされる、実施形態１に記載の方法。
３． ベータ様細胞が、ｑＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、またはそれらの組み合わせを使用してスクリーニングされる、実施形態１または２に記載の方法。
４． 多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団であって、前記集団が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
５． 集団が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含み、当該ベータ様細胞が、移植後にインスリン発現および分泌を維持する、実施形態４に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
６． ベータ様細胞の少なくとも５５％が、ＳＯＸ１１、ＦＲＥＭ２、ＤＣＣ、ＢＡＳＰ１、ＣＨＲＮＡ３、およびＥＬＡＬＶ２から選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４または５に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
７． ベータ様細胞の少なくとも８５％が、ＳＯＸ１１を含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４～６のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
８． ベータ様細胞の少なくとも７５％が、ＦＲＥＭ２を含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４～６のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
９． ベータ様細胞の少なくとも８５％が、ＤＣＣを含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４～６のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
１０． ベータ様細胞の少なくとも７５％が、ＢＡＳＰ１を含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４～６のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
１１． ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＣＨＲＮＡ３を含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４～６のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
１２． ベータ様細胞の少なくとも５５％が、ＥＬＡＬＶ２を含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４～６に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
１３． ベータ様細胞の少なくとも７５％が、ＳＯＸ１１、ＦＲＥＭ２、ＤＣＣを含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４～９のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
１４． ベータ様細胞の少なくとも５５％が、ＢＡＳＰ１、ＣＨＲＮＡ３、ＥＬＡＶＬ２を含む、実施形態１０～１２のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
１５． ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、およびＨＭＧＣＳ１から選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも約１ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態４または５に記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
１６． ベータ様細胞の少なくとも９０％が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰから選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも約１ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態１５に記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
１７． ベータ様細胞の少なくとも９５％が、ＡＣＶＲ１Ｃを含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも２ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態１５または１６に記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
１８． ベータ様細胞の少なくとも９５％が、ＭＡＲＣＫＳＬ１を含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも約２ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態１５または１６に記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
１９． ベータ様細胞の少なくとも９５％が、ＳＴＡＲＤ１０を含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも１ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態１５または１６に記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
２０． ベータ様細胞の少なくとも９０％が、ＡＭＢＰを含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも２ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態１５または１６に記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
２１． ベータ様細胞の少なくとも８５％が、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５を含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも約１ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態１５に記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
２２． ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＨＭＧＣＳ１を含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも約１ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態１５のいずれか１つに記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
２３． 当該細胞が、Ｇ６ＰＣ２をさらに発現する、先行実施形態４～２２のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
２４． 多能性幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、実施形態１～２３のいずれか１つに記載のインビトロ集団。
２５． ベータ様細胞を含む当該集団が、移植後にインスリン発現および分泌を維持する、先行実施形態４～２４のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
２６． ベータ様細胞を含む集団が、移植後にグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を示す、先行実施形態４～２５のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
２７． １つ以上のマーカーが、移植後に平均血漿ｃ－ペプチドレベルと正の相関を示す、先行実施形態４～２６のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
２８． ベータ様細胞を含む集団が、移植後に血中グルコースの低下を示す、先行実施形態４～２７のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
２９． 医薬として使用するための、先行実施形態４～２８のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
３０． 糖尿病の治療に使用するための、先行実施形態４～２８のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
３１． １型糖尿病の治療に使用するための、先行実施形態４～２８のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
３２． 先行実施形態４～２８のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞と、細胞培養培地と、を含む、細胞培養物または組成物。
３３． 先行実施形態４～２８のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団を含む、埋め込み型装置。
３４． １型糖尿病の治療方法であって、その治療を必要とする人に、先行実施形態４～２８のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団を投与することを含む、方法。
３５． 先行実施形態４～２８のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団を含む、凍結保存細胞培養物。
３６． 細胞集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、生存可能である、実施形態３５に記載の多能性幹細胞由来細胞の凍結保存集団。
１． 多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団におけるベータ様細胞をスクリーニングするための方法であって、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現するベータ様細胞を特定する工程を含む、方法。
２． ベータ様細胞が、ＲＮＡｓｅｑによってスクリーニングされる、実施形態１に記載の方法。
３． ベータ様細胞が、ｑＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、またはそれらの組み合わせを使用してスクリーニングされる、実施形態１または２に記載の方法。
４． 多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団であって、前記集団が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含む、多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
５． 集団が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＦＲＥＭ２、ＣＨＲＮＡ３、ＤＣＣ、ＳＯＸ１１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＨＭＧＣＳ１、ＥＬＡＶＬ２、ＰＣＰ４、ＰＣＤＨ７、ＮＥＦＬ、ＰＬＡＧＬ１、ＥＧＦＬ７、ＲＡＤ２１、ＲＴＮ１、ＰＬＸＮＡ２、ＬＢＨ、ＮＥＦＭ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＤＬＫ１、ＭＡＦＢ、およびＩＳＬ１から選択される１つ以上のマーカーと組み合わせて、ＮＫＸ６．１を発現する少なくとも１５％のベータ様細胞を含み、当該ベータ様細胞が、移植後にインスリン発現および分泌を維持する、実施形態４に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
６． ベータ様細胞の少なくとも５５％が、ＳＯＸ１１、ＦＲＥＭ２、ＤＣＣ、ＢＡＳＰ１、ＣＨＲＮＡ３、およびＥＬＡＬＶ２から選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４または５に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
７． ベータ様細胞の少なくとも８５％が、ＳＯＸ１１を含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４～６のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
８． ベータ様細胞の少なくとも７５％が、ＦＲＥＭ２を含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４～６のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
９． ベータ様細胞の少なくとも８５％が、ＤＣＣを含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４～６のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
１０． ベータ様細胞の少なくとも７５％が、ＢＡＳＰ１を含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４～６のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
１１． ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＣＨＲＮＡ３を含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４～６のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
１２． ベータ様細胞の少なくとも５５％が、ＥＬＡＬＶ２を含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４～６に記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
１３． ベータ様細胞の少なくとも７５％が、ＳＯＸ１１、ＦＲＥＭ２、ＤＣＣを含み、当該マーカーが、天然のヒトベータ細胞中に存在しない、実施形態４～９のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
１４． ベータ様細胞の少なくとも５５％が、ＢＡＳＰ１、ＣＨＲＮＡ３、ＥＬＡＶＬ２を含む、実施形態１０～１２のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
１５． ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、およびＨＭＧＣＳ１から選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも約１ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態４または５に記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
１６． ベータ様細胞の少なくとも９０％が、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＳＴＡＲＤ１０、ＡＭＢＰから選択される１つ以上のマーカーを含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも約１ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態１５に記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
１７． ベータ様細胞の少なくとも９５％が、ＡＣＶＲ１Ｃを含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも２ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態１５または１６に記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
１８． ベータ様細胞の少なくとも９５％が、ＭＡＲＣＫＳＬ１を含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ細胞中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも約２ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態１５または１６に記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
１９． ベータ様細胞の少なくとも９５％が、ＳＴＡＲＤ１０を含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも１ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態１５または１６に記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
２０． ベータ様細胞の少なくとも９０％が、ＡＭＢＰを含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも２ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態１５または１６に記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
２１． ベータ様細胞の少なくとも８５％が、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５を含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも約１ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態１５に記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
２２． ベータ様細胞の少なくとも８０％が、ＨＭＧＣＳ１を含み、当該マーカーの発現レベルが、天然のヒトベータ中の当該マーカーの発現よりも平均して少なくとも約１ ｌｏｇ倍の変化である、実施形態１５のいずれか１つに記載のインビトロ集団多能性幹細胞由来細胞。
２３． 当該細胞が、Ｇ６ＰＣ２をさらに発現する、先行実施形態４～２２のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
２４． 多能性幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、実施形態１～２３のいずれか１つに記載のインビトロ集団。
２５． ベータ様細胞を含む当該集団が、移植後にインスリン発現および分泌を維持する、先行実施形態４～２４のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
２６． ベータ様細胞を含む集団が、移植後にグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を示す、先行実施形態４～２５のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
２７． １つ以上のマーカーが、移植後に平均血漿ｃ－ペプチドレベルと正の相関を示す、先行実施形態４～２６のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
２８． ベータ様細胞を含む集団が、移植後に血中グルコースの低下を示す、先行実施形態４～２７のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
２９． 医薬として使用するための、先行実施形態４～２８のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
３０． 糖尿病の治療に使用するための、先行実施形態４～２８のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
３１． １型糖尿病の治療に使用するための、先行実施形態４～２８のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団。
３２． 先行実施形態４～２８のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞と、細胞培養培地と、を含む、細胞培養物または組成物。
３３． 先行実施形態４～２８のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団を含む、埋め込み型装置。
３４． １型糖尿病の治療方法であって、その治療を必要とする人に、先行実施形態４～２８のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団を投与することを含む、方法。
３５． 先行実施形態４～２８のいずれか１つに記載の多能性幹細胞由来細胞のインビトロ集団を含む、凍結保存細胞培養物。
３６． 細胞集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、生存可能である、実施形態３５に記載の多能性幹細胞由来細胞の凍結保存集団。
【0201】
略語リスト
＋ｖｅ：陽性
ＡＧＮ：ＡＧＮ １９３１０９
ＡＬＫ５：アクチビン受容体様キナーゼ、
ＢＣ：ベータ細胞
ＤＥ：胚体内胚葉
ＥＰ：内分泌前駆細胞
ＧＣＧ：グルカゴン
ｈＢＳ：ヒト胚盤胞由来幹
ｈＢＳＣ：ヒト胚盤胞由来幹細胞
ｈＥＳ：ヒト胚性幹
ｈＥＳＣ：ヒト胚性幹細胞
ｈｉＰＳＣ：ヒト人工多能性幹細胞
ｈＰＳＣ：ヒト多能性幹細胞
ＬＤＮ：ＬＤＮ１９３１８９
ＰＡＸ４：ペアードボックス４
ＰＥ：膵臓内胚葉
ＲＴ：室温
ＳＣＩＤ：重症複合免疫不全
ＳＹＴ１３：シナプトタグミン１３
Ｔ３：トリヨードチロニン
＋ｖｅ：陽性
ＡＧＮ：ＡＧＮ １９３１０９
ＡＬＫ５：アクチビン受容体様キナーゼ、
ＢＣ：ベータ細胞
ＤＥ：胚体内胚葉
ＥＰ：内分泌前駆細胞
ＧＣＧ：グルカゴン
ｈＢＳ：ヒト胚盤胞由来幹
ｈＢＳＣ：ヒト胚盤胞由来幹細胞
ｈＥＳ：ヒト胚性幹
ｈＥＳＣ：ヒト胚性幹細胞
ｈｉＰＳＣ：ヒト人工多能性幹細胞
ｈＰＳＣ：ヒト多能性幹細胞
ＬＤＮ：ＬＤＮ１９３１８９
ＰＡＸ４：ペアードボックス４
ＰＥ：膵臓内胚葉
ＲＴ：室温
ＳＣＩＤ：重症複合免疫不全
ＳＹＴ１３：シナプトタグミン１３
Ｔ３：トリヨードチロニン
【0202】
実施例１
幹細胞由来ベータ様細胞の亜集団は、移植後にインスリン分泌に寄与する
幹細胞由来細胞は、遺伝子発現、分子特性、グルコース感知、およびインスリン分泌に基づき異種である。この実験の目的は、移植後にインスリン産生に寄与する幹細胞由来細胞またはベータ様細胞の亜集団を特定することであった。プロトコル関連の細胞異種性を高めるために、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を、以下の表１に提供される段階的分化プロトコルの８つの異なる改変を使用して、内分泌細胞クラスターに分化させた。ｈＥＳＣを、胚体内胚葉（ＤＥ）、続いて膵臓内胚葉（ＰＥ）、次いで内分泌前駆細胞（ＥＰ）に向け、最終的に、特許公報ＷＯ／２０１２／１７５６３３、ＷＯ２０１４／０３３３２２、ＷＯ２０１５／０２８６１４、ＷＯ２０１７／１４４６９５（参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、インスリン産生ベータ様細胞を生成した。
移植後にインスリン発現および分泌に寄与する幹細胞由来細胞またはベータ様細胞の亜集団を特定するために、移植前の単一細胞ＲＮＡシークエンシングを使用して、８つの（改変された）分化プロトコルの各々から得られた細胞クラスターを分析した。細胞を、アクターゼ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単一細胞に解離し、単一細胞についての遺伝子発現プロファイルを、ＲＮＡシークエンシングを使用して、プロトコル当たり２０００～３０００個の細胞について得た。ヒト膵島も、天然のヒトベータ細胞への参照として含んだ。すべての細胞についての遺伝子発現データを、すべての試料にわたって統合して、データを条件間で比較可能にし、類似の遺伝子発現プロファイルを有する細胞が、細胞を生成するために使用されるプロトコルとは独立してグループ化するように、次元削減およびクラスタリングを適用した。合計で２６個の異なる細胞集団を特定し（図１ｂ）、すべてのプロトコルが、非常に異なる比率で類似の細胞集団を生成したことを明らかにした（図１ａ）。天然のヒトベータ細胞（クラスター１６）にほぼ類似した集団を特定するために、２６個の特定されたクラスターの各々を、天然のベータ細胞遺伝子セットと比較し、クラスター１４、１５、および２６は、ヒトベータ細胞クラスター（クラスター１６）に類似したスコアを受け、したがって、最も天然のヒトベータ細胞に類似していたベータ様細胞集団として特定した（図２）。
幹細胞由来ベータ様細胞の亜集団は、移植後にインスリン分泌に寄与する
幹細胞由来細胞は、遺伝子発現、分子特性、グルコース感知、およびインスリン分泌に基づき異種である。この実験の目的は、移植後にインスリン産生に寄与する幹細胞由来細胞またはベータ様細胞の亜集団を特定することであった。プロトコル関連の細胞異種性を高めるために、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を、以下の表１に提供される段階的分化プロトコルの８つの異なる改変を使用して、内分泌細胞クラスターに分化させた。ｈＥＳＣを、胚体内胚葉（ＤＥ）、続いて膵臓内胚葉（ＰＥ）、次いで内分泌前駆細胞（ＥＰ）に向け、最終的に、特許公報ＷＯ／２０１２／１７５６３３、ＷＯ２０１４／０３３３２２、ＷＯ２０１５／０２８６１４、ＷＯ２０１７／１４４６９５（参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、インスリン産生ベータ様細胞を生成した。
【表1】
【0203】
動物における移植後のインスリン発現を決定するために、８つの（改変された）分化プロトコルの各々を用いて得られた多数の分化細胞クラスター（３０００ｐＩＥＱに相当する）を、プロトコル当たり１０匹の動物の群において、免疫不全ＳＣＩＤ－ベージュマウスの腎臓被膜下に移植した。生着したヒト細胞からのインスリン分泌の測定として、ヒトＣ－ペプチドＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）を使用して、移植の８週間後に血清試料中でヒトＣ－ペプチドレベルを測定した。クラスター１４、１５、および２６の細胞のパーセンテージ（総細胞数のうち）に対して、移植された動物における平均循環ヒトＣ－ペプチドレベルをプロットすることによって、これらのクラスターにおける細胞のパーセンテージとインビボでのインスリン分泌との間に、正の相関が見られた（図６）。
【0204】
結論として、幹細胞由来細胞、すなわち、ベータ様細胞の亜集団のみが、天然のヒトベータ細胞に類似し、移植後にインスリン分泌に寄与することがわかった。この亜集団またはベータ様細胞（クラスター１４、１５、および２６）を説明および特定する遺伝子のリストを、表１、２、および３に提供し、以下に提供する実施例２～４を参照されたい。この集団の特定および特徴付けは、幹細胞からベータ細胞への分化プロトコルの最適化、および最終的には高い有効性を有するベータ細胞療法、すなわち、血中グルコースを正常化する細胞の能力を得るために不可欠である。
【0205】
実施例２ 従来のベータ細胞マーカーは、移植後のインスリン分泌を予測しない
従来のベータ細胞マーカーが、それ自体はインビボ有効性を予測しないことを示すために、８つの改変されたプロトコルから得られた細胞集団において、ｍＲＮＡの検出のためのナノストリング、またはタンパク質の検出のためのフローサイトメトリーのいずれかを使用して、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＰＡＸ４、ＮＫＸ２．２、ＳＹＴ１３などの周知のベータ細胞マーカーの発現、ならびにＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋の共発現を測定した。これらのマーカーのいずれも、移植の８週後に動物の平均ｃ－ペプチドレベルに正の相関しなかったことがわかった（図７および図８ｂ、下部パネル）。
従来のベータ細胞マーカーが、それ自体はインビボ有効性を予測しないことを示すために、８つの改変されたプロトコルから得られた細胞集団において、ｍＲＮＡの検出のためのナノストリング、またはタンパク質の検出のためのフローサイトメトリーのいずれかを使用して、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＰＡＸ４、ＮＫＸ２．２、ＳＹＴ１３などの周知のベータ細胞マーカーの発現、ならびにＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋の共発現を測定した。これらのマーカーのいずれも、移植の８週後に動物の平均ｃ－ペプチドレベルに正の相関しなかったことがわかった（図７および図８ｂ、下部パネル）。
【0206】
単一細胞配列分析により、ＳＬＣ３０Ａ８を含むベータ細胞に以前に関連していたいくつかのマーカーを特定した。これらのマーカーを以下の表２に列挙する。
【表2】
【0207】
幹細胞由来細胞において、ＳＬＣ３０Ａ８が別の周知のベータ細胞マーカーであるＰＤＸ１とどのように区別されるかを示すために、すべての特定されたクラスターにわたってそれらの発現を示した（図８ａ）。最もベータ様の細胞（クラスター１４、１５、および２６）、ならびに天然のベータ細胞において、高発現のＳＬＣ３０Ａ８を発見し、クラスター２４および２５においてある程度の発現も発見し、これらは、ＧＣＧも発現する。対照的に、ＰＤＸ１は、ベータ細胞ならびに最もベータ様の細胞（クラスター１４、１５および２６）でも発現されるが、ほぼすべての他のクラスターでも発現される。ＳＬＣ３０Ａ８およびＰＤＸ１が移植後のインスリン分泌にどのように相関するかを示すために、８つの改変されたプロトコルにおいてナノストリング上でＳＬＣ３０Ａ８およびＰＤＸ１ ｍＲＮＡ転写物のレベルを測定し、これを移植の８週間後のインビボでの平均Ｃ－ペプチドレベルに相関させた。移植後の循環ヒトＣ－ペプチドレベルに対して、ＳＬＣ３０Ａ８が正に相関し（図８ｂ、上部パネル）、一方で、ＰＤＸ１が負に相関した（図８ｂ、下部パネル）ことがわかった。ほぼすべての細胞クラスターにおけるＰＤＸ１の発現は、このマーカーがインビボインスリン分泌に負に相関する理由を説明する。ＰＤＸ１は、天然のベータ細胞ならびに幹細胞培養物からの最もベータ様の細胞（クラスター１４、１５、および２６の細胞）で発現されるが、他のクラスターにおける発現は、このマーカーが、移植後に完全に機能的なベータ細胞に成熟する細胞を特定することができないことを示す。ある特定の古典的なベータ細胞マーカーが、それ自体は移植後にインスリン分泌を予測しないことが示されるため、前述した表２に示されたマーカーの適用を新規であると考える。
【0208】
移植前後の細胞組成物をさらに評価するために、移植前のクラスターおよび移植後の生着ヒト細胞を有する腎臓切片に対して免疫組織化学（ＩＨＣ）を行った。アルファ細胞およびベータ細胞を特定するために、従来のマーカーを使用し、Ｃ－ペプチド、ＮＫＸ６．１、およびグルカゴンについて染色した。８つすべてのプロトコルから、高いパーセンテージの細胞が、移植前にＣ－ｐｅｐ／ＮＫＸ６．１を共発現したが（図５、左パネル）、細胞のサブセットのみが、移植後にＣ－ｐｅｐ／ＮＫＸ６．１のこの共発現を維持した（図５、右パネル）ことがわかった。
【0209】
結論として、ほとんどの従来のベータ細胞マーカーが、インビトロ幹細胞由来内分泌細胞培養から、移植後のインスリン分泌を予測しないことが示された。細胞スクリーニングまたは細胞選択のためのそれらの従来のマーカーの使用は、移植前のベータ細胞と類似し得るが、インビボ環境への曝露後にそれらの表現型が変化する、望ましくない細胞亜集団に向かって最適化をもたらす可能性がある。
【0210】
実施例３
幹細胞由来ベータ様細胞は、天然のベータ細胞と類似しているが同一ではない
天然のヒトベータ細胞ではなく、幹細胞由来ベータ様細胞で発現される遺伝子を特定するために、これらの幹細胞由来ベータ様細胞の遺伝子発現を、単一細胞ＲＮＡｓｅｑによって測定し、天然のヒトベータ細胞の遺伝子発現と比較した。
幹細胞由来ベータ様細胞は、天然のベータ細胞と類似しているが同一ではない
天然のヒトベータ細胞ではなく、幹細胞由来ベータ様細胞で発現される遺伝子を特定するために、これらの幹細胞由来ベータ様細胞の遺伝子発現を、単一細胞ＲＮＡｓｅｑによって測定し、天然のヒトベータ細胞の遺伝子発現と比較した。
【0211】
天然のヒトベータ細胞の遺伝子発現を得るために、２つの異なるヒトドナーに由来する２つのヒト膵島試料から、単一細胞遺伝子発現データを一緒にプールした。天然のヒトベータ細胞である膵島内のそれらの細胞を特定するために、これらの試料からの各細胞を、天然の膵島サブタイプであるアルファ、ベータ、デルタ、イプシロン、ガンマ、導管（ｄｕｃｔ）、腺房、内皮、星、導管（ｄｕｃｔａｌ）、マクロファージ、マスト、およびシュワン細胞の遺伝子セットに対してスコアリングした（図３）。ベータ細胞についてスコアが最も高かった細胞を、クラスター１４、１５および２６と比較するために一緒にクラスター化した。２つの群を比較すると、幹細胞由来ベータ様細胞に特有である遺伝子セットの特定につながった（表３）。
【表3】
【0212】
結論として、幹細胞由来ベータ様細胞をヒト天然ベータ細胞と区別する遺伝子を特定し、これらの細胞が、それらの天然の対応物と同一ではないことを示した。
【0213】
実施例４
ＡＣＶＲ１Ｃは、幹細胞由来ベータ細胞に新規の膵臓内分泌細胞のマーカーであり、その発現は、インビボでの成熟後のインスリン分泌に相関する
ＡＣＶＲ１Ｃは、クラスター１４、１５、および２６において発現される新規の遺伝子のリスト上にあり（表４）、これらのクラスターは、すべてのクラスターの間で、天然のヒトベータ細胞に最も類似していると特定された。
ＡＣＶＲ１Ｃは、幹細胞由来ベータ細胞に新規の膵臓内分泌細胞のマーカーであり、その発現は、インビボでの成熟後のインスリン分泌に相関する
ＡＣＶＲ１Ｃは、クラスター１４、１５、および２６において発現される新規の遺伝子のリスト上にあり（表４）、これらのクラスターは、すべてのクラスターの間で、天然のヒトベータ細胞に最も類似していると特定された。
【表4】
【0214】
実施例３に記載される方法を使用することによって、ＡＣＶＲ１Ｃは、クラスター１４、１５、および２６における細胞の９９％超で発現され、天然のヒトベータ細胞の８０％で発現されなかったため、幹細胞由来ベータ様細胞に特有であると特定された。細胞の残りの２０％は、低いＡＣＶＲ１Ｃ発現を示した（図９ａ）。ＡＣＶＲ１Ｃは、クラスター１４、１５、および１６において高度に発現されたが、膵臓アルファ細胞および膵臓ソマトスタチン細胞などの他の膵臓内分泌サブタイプに位置する他のクラスターにおいてもある程度の発現を示した。（図９ｂ）。ＡＣＶＲ１Ｃ発現が、インビボでのインスリン分泌に正に相関したことを示すために、ナノストリング上でＡＣＶＲ１Ｃ ｍＲＮＡ転写物のレベルを測定し、これを移植の８週間後のインビボでのｃ－ペプチドレベルの平均に相関させた（図９ｃ）。
【0215】
結論として、移植の８週間後のインビボＣ－ペプチドレベルに関する幹細胞由来ベータ様細胞の新規かつ特有のマーカーとして、ＡＣＶＲ１Ｃを特定した。Ｃ－ペプチドは、インスリンと等しい。ヒトＣ－ペプチドは、インスリンを用いた潜在的な外部から与えられた治療ではなく、移植細胞のみに由来する可能性があるため、測定される。したがって、ＡＣＶＲ１Ｃは、幹細胞由来ベータ様細胞に対するプロトコルを適格とし、かつ最適化するために使用され得る。
【0216】
実施例５
ＰＣＤＨ７は、最もベータ様の細胞集団に特異的である細胞外マーカーであり、ＰＣＰ４は、細胞内マーカーである
ＰＣＤＨ７およびＰＣＰ４は両方とも、細胞クラスター１４、１５、および２６において発現され（表４）、我々の単一細胞ＲＮＡシークエンシングデータセットにおけるクラスターは、すべてのクラスターの間で、天然のヒトベータ細胞に最も類似していると特定された。ＡＣＶＲ１Ｃと比較して、ＰＣＤＨ７およびＰＣＰ４は、クラスター１４、１５、および２６に特異的である発現を示す。他の特定されたクラスターのいずれにおいても、ＰＣＤＨ７およびＰＣＰ４の発現は全くまたはほとんど見られない（図１０ａ）。これらのマーカーの特異性は、それらのマーカーを移植後のインスリン分泌の予測に適したものにし、それらを品質マーカーとして使用するために、幹細胞由来ベータ様細胞を特定および定量化するために使用されるそれらの能力に溶出する。ＡＣＶＲ１Ｃに関して、ナノストリング上でＰＣＤＨ７およびＰＣＰ４ ｍＲＮＡ転写物のレベルを測定し、これを移植の８週間後のインビボでのマウスにおける平均循環ヒトｃ－ペプチドレベルに相関させた（図１０ｂ）。両方のマーカーが、８週間後にインビボでのインスリン分泌に正に相関したことがわかった。
ＰＣＤＨ７は、最もベータ様の細胞集団に特異的である細胞外マーカーであり、ＰＣＰ４は、細胞内マーカーである
ＰＣＤＨ７およびＰＣＰ４は両方とも、細胞クラスター１４、１５、および２６において発現され（表４）、我々の単一細胞ＲＮＡシークエンシングデータセットにおけるクラスターは、すべてのクラスターの間で、天然のヒトベータ細胞に最も類似していると特定された。ＡＣＶＲ１Ｃと比較して、ＰＣＤＨ７およびＰＣＰ４は、クラスター１４、１５、および２６に特異的である発現を示す。他の特定されたクラスターのいずれにおいても、ＰＣＤＨ７およびＰＣＰ４の発現は全くまたはほとんど見られない（図１０ａ）。これらのマーカーの特異性は、それらのマーカーを移植後のインスリン分泌の予測に適したものにし、それらを品質マーカーとして使用するために、幹細胞由来ベータ様細胞を特定および定量化するために使用されるそれらの能力に溶出する。ＡＣＶＲ１Ｃに関して、ナノストリング上でＰＣＤＨ７およびＰＣＰ４ ｍＲＮＡ転写物のレベルを測定し、これを移植の８週間後のインビボでのマウスにおける平均循環ヒトｃ－ペプチドレベルに相関させた（図１０ｂ）。両方のマーカーが、８週間後にインビボでのインスリン分泌に正に相関したことがわかった。
【0217】
ＰＣＤＨ７は、ほぼ幹細胞由来ベータ様細胞のみにおいて発現される細胞外マーカーとして特定されるため、異種細胞集団から幹細胞由来ベータ細胞を精製するためにさらに使用され得る。これは、さらなる特徴付けのために、または最終細胞療法製品の有効性および安全性を改善するために使用され得る。結論として、ＰＣＤＨ７およびＰＣＰ４を幹細胞由来ベータ細胞に特異的であると特定した。
【0218】
実施例６
Ｇ６ＰＣ２は、インビボインスリン産生ならびにインビトロインスリン放出に相関するマーカーである。幹細胞由来ベータ様細胞の追加の効力評価に使用され得るマーカーを特定するために、８つすべてのプロトコル改変について、インビトロでインスリンを分泌する細胞の能力を測定した。インスリン分泌を、灌流システムを使用して測定し、細胞に１０ｍＭのグルコースを最初に攻撃接種し、１０ｍＭのグルコース＋１０００ｎＭのエキセンジン４での第２の攻撃接種が続き、ＩＢＭＸおよびホルスコリンによる第３の攻撃接種が続いた。攻撃接種中に分泌されたインスリンの総量を、灌流曲線下面積として定義し、インビボインスリン産生に正に相関したマーカーに対してプロットした。Ｇ６ＰＣ２は、天然のヒトベータ細胞およびアルファ細胞（それぞれ、単一細胞ＲＮＡシークエンシングデータセットにおいて、クラスター１６および２２）、ならびに最もベータ様の細胞クラスター１４、１５、および２６内の細胞のサブセットにおいて発現されることがわかった（図１１ａ）。Ｇ６ＰＣ２発現が、インビボでのインスリン産生に正に相関したことを示すために、ナノストリング上でＧ６ＰＣ２ ｍＲＮＡ転写物のレベルを測定し、これを移植の８週間後のインビボでのｃ－ペプチドレベルの平均に相関させた（図１１ｂ）。最後に、インスリン分泌の潜在的な効力マーカーとしてのその使用を検証するために、Ｇ６ＰＣ２発現をインビトロインスリン分泌試験からの曲線下面積と比較した（図１１ｃ）。
Ｇ６ＰＣ２は、インビボインスリン産生ならびにインビトロインスリン放出に相関するマーカーである。幹細胞由来ベータ様細胞の追加の効力評価に使用され得るマーカーを特定するために、８つすべてのプロトコル改変について、インビトロでインスリンを分泌する細胞の能力を測定した。インスリン分泌を、灌流システムを使用して測定し、細胞に１０ｍＭのグルコースを最初に攻撃接種し、１０ｍＭのグルコース＋１０００ｎＭのエキセンジン４での第２の攻撃接種が続き、ＩＢＭＸおよびホルスコリンによる第３の攻撃接種が続いた。攻撃接種中に分泌されたインスリンの総量を、灌流曲線下面積として定義し、インビボインスリン産生に正に相関したマーカーに対してプロットした。Ｇ６ＰＣ２は、天然のヒトベータ細胞およびアルファ細胞（それぞれ、単一細胞ＲＮＡシークエンシングデータセットにおいて、クラスター１６および２２）、ならびに最もベータ様の細胞クラスター１４、１５、および２６内の細胞のサブセットにおいて発現されることがわかった（図１１ａ）。Ｇ６ＰＣ２発現が、インビボでのインスリン産生に正に相関したことを示すために、ナノストリング上でＧ６ＰＣ２ ｍＲＮＡ転写物のレベルを測定し、これを移植の８週間後のインビボでのｃ－ペプチドレベルの平均に相関させた（図１１ｂ）。最後に、インスリン分泌の潜在的な効力マーカーとしてのその使用を検証するために、Ｇ６ＰＣ２発現をインビトロインスリン分泌試験からの曲線下面積と比較した（図１１ｃ）。
【0219】
結論として、インビトロインスリン分泌に相関する幹細胞由来ベータ様細胞中で発現されるマーカーとして、ＧＣＰＣ２を特定し、したがって、インビトロ効力または幹細胞のベータ細胞へのインビトロ分化を測定するのに有用である。
【0220】
本発明のある特定の特徴が本明細書に例証および記載されているが、ここで、多くの修正、代用、変更、および均等物が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が本発明の真の趣旨の範囲内に含まれるすべての修正および変更を包含するよう意図されていることを理解されたい。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【国際調査報告】