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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-13
(54)【発明の名称】抗体を産生するための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0781 20100101AFI20230906BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20230906BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20230906BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20230906BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230906BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230906BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0781 ZNA
C12Q1/04
G01N33/48 N
G01N33/68
C12N15/09 Z
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023513624
(86)(22)【出願日】2021-08-31
(85)【翻訳文提出日】2023-04-24
(86)【国際出願番号】 US2021048447
(87)【国際公開番号】W WO2022047381
(87)【国際公開日】2022-03-03
(31)【優先権主張番号】63/072,794
(32)【優先日】2020-08-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】リャン， ウェイ－チン
(72)【発明者】
【氏名】リン， ウェイユー
(72)【発明者】
【氏名】ウー， ヤン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
2G045AA29
2G045CA18
2G045CA19
2G045CA20
2G045CA26
2G045DA36
2G045DA37
2G045FB01
2G045FB03
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QS33
4B063QX02
4B065AA90X
4B065AC14
4B065BA21
4B065BD14
4B065CA44
(57)【要約】
標的タンパク質の所望の領域に結合する抗体の産生及び同定のための方法が本明細書で提供される。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的タンパク質の所望の領域に結合する１つ以上の抗体を同定する方法であって、（ａ）前記所望の領域を含む前記標的タンパク質又はその断片で免疫化されている動物からの試料を提供することであって、前記試料がＩｇＧ＋Ｂ細胞を含む、試料を提供することと、
（ｂ）前記試料中の１つ以上の望ましくない細胞型から前記ＩｇＧ＋Ｂ細胞を分離することによって前記試料をＩｇＧ＋Ｂ細胞について濃縮することであって、前記分離することが、
（ｉ）前記試料を、前記１つ以上の望ましくない細胞型に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片と接触させることであって、前記１つ以上の抗体又は抗体断片がタグを含む、前記試料を、前記１つ以上の望ましくない細胞型に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片と接触させること、及び
（ｉｉ）前記試料を、前記タグに対する親和性を有する表面と接触させることであって、前記１つ以上の抗体又は抗体断片に結合した前記１つ以上の望ましくない細胞型が前記表面に保持され、それにより、前記ＩｇＧ＋Ｂ細胞を前記１つ以上の望ましくない細胞型から分離し、前記試料をＩｇＧ＋Ｂ細胞について濃縮する、前記試料を、前記タグに対する親和性を有する表面と接触させること
を含む、前記試料をＩｇＧ＋Ｂ細胞について濃縮することと、
（ｃ）工程（ｂ）の分離された前記ＩｇＧ＋Ｂ細胞を個別に培養することと、
（ｄ）前記標的タンパク質の前記所望の領域に結合する抗体を産生する１つ以上のＩｇＧ＋Ｂ細胞を同定することであって、前記同定することが、工程（ｃ）の個別に培養されたＩｇＧ＋Ｂ細胞の上清の親和性を、
（ｉ）前記所望の領域を含む前記標的タンパク質又はその断片、及び
（ｉｉ）前記標的タンパク質又は非標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位を含む対照タンパク質
の両方について評価することを含む、１つ以上のＩｇＧ＋Ｂ細胞を同定することと
を含み、
前記標的タンパク質又はその断片に対する親和性を有し、前記対照タンパク質に対する親和性を有しない上清が、前記標的タンパク質の前記所望の領域に結合する抗体を産生するＩｇＧ＋Ｂ細胞を同定する、方法。
【請求項2】
前記動物が、ウサギ又はラットである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記動物がウサギである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記試料が、血液試料又は血清試料である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記血液試料が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記動物が約８週間免疫化されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記試料が、マクロファージ及び単球を除去するために処理されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記望ましくない細胞型が、ＩｇＭ Ｂ細胞、骨髄細胞、及びＴ細胞のうちの１つ以上である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記望ましくない細胞型が、ＩｇＭ Ｂ細胞、骨髄細胞、及びＴ細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ＩｇＭ Ｂ細胞に結合する前記１つ以上の抗体又は抗体断片が、ＩｇＭに結合する１つ以上の抗ＩｇＭ抗体又はその抗体断片である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項11】
骨髄系細胞に結合する前記１つ以上の抗体又は抗体断片が、ＣＤ１１ｂに結合する１つ以上の抗ＣＤ１１ｂ抗体又はその抗体断片である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項12】
Ｔ細胞に結合する前記１つ以上の抗体又は抗体断片が、Ｔリンパ球に結合する抗Ｔリンパ球抗体又はその抗体断片である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項13】
前記１つ以上の望ましくない細胞型に結合する前記１つ以上の抗体又は抗体断片がビオチンタグを含み、前記表面がストレプトアビジンを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記表面がビーズである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ビーズが磁気ビーズである、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
工程（ｂ）が、（ｉｉｉ）濃縮された前記試料を、第１のマーカーを含み、かつＩｇＧ＋Ｂ細胞に結合する抗体又は抗体断片及び生細胞を同定する薬剤と接触させることを更に含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
ＩｇＧ＋Ｂ細胞に結合する前記抗体又は抗体断片が抗ＩｇＧ抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
生細胞を同定する前記薬剤がヨウ化プロピジウムである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項19】
工程（ｂ）（ｉｉｉ）が、前記試料を、前記所望の領域を含む前記標的タンパク質又はその断片と接触させることを更に含み、前記標的タンパク質又はその断片が第２のマーカーを含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
工程（ｂ）（ｉｉｉ）が、前記試料を、前記標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位を含む対照タンパク質と接触させることを更に含み、前記対照タンパク質が第３のマーカーを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記第１のマーカー、前記第２のマーカー、及び前記第３のマーカーが蛍光マーカーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
工程（ｂ）が、（ｉｖ）生細胞を同定する前記薬剤によって生存可能であると同定され、前記第１のマーカー及び前記第２のマーカーを含むが、前記第３のマーカーを含まない細胞を単離することを更に含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項23】
前記単離することが、マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によるものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
工程（ｄ）において、（ｉ）前記標的タンパク質又はその断片、及び（ｉｉ）前記対照タンパク質の両方に対する前記上清の親和性を評価するためにＥＬＩＳＡが行われる、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
（ｅ）前記標的タンパク質の前記所望の領域に結合する抗体を産生すると同定されている１つ以上のＩｇＧ＋Ｂ細胞のＶＨ領域及びＶＬ領域をクローニングすることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項26】
前記標的タンパク質が、抗体又は抗体断片である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記抗体又は抗体断片の前記所望の領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記動物が、前記所望の領域を含む前記抗体の断片で免疫化されている、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項29】
前記所望の領域を含む前記抗体の前記断片が抗原結合断片（Ｆａｂ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記標的タンパク質の前記１つ以上の望ましくない結合部位が、前記抗体又は抗体断片の１つ以上のフレームワーク領域である、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位を含む前記対照タンパク質が、（ｉ）前記標的タンパク質の軽鎖（ＬＣ）フレームワーク領域に対して少なくとも８５％の同一性を有するフレームワーク領域と、無関係なＬＣ ＣＤＲのセットとを含むＬＣ、及び
（ｉｉ）前記標的タンパク質の重鎖（ＨＣ）フレームワーク領域に対して少なくとも８５％の同一性を有するフレームワーク領域と、無関係なＨＣ ＣＤＲのセットとを含むＨＣ
を含むＦａｂ断片である、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記無関係なＬＣ ＣＤＲ及び前記無関係なＨＣ ＣＤＲが、抗ｇＤモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の前記ＣＤＲである、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記抗ｇＤ ｍＡｂが５Ｂ６である、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記標的タンパク質が、抗体又は抗体断片ではない、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記標的タンパク質の前記所望の領域が、前記標的タンパク質のドメインである、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
工程（ｄ）が、工程（ｃ）の個別に培養されたＩｇＧ＋Ｂ細胞の上清の、前記所望の領域を含む前記標的タンパク質の断片に対する前記親和性を評価することを含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項37】
前記所望の領域を含む前記標的タンパク質の前記断片が、無関係のタンパク質に連結されている、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
工程（ｄ）の前記対照タンパク質が、（ｉ）前記所望の領域を欠く前記標的タンパク質のバージョン、
（ｉｉ）前記標的タンパク質に関連し、前記所望の領域を含まないタンパク質、又は
（ｉｉｉ）無関係な対照タンパク質
である、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
標的タンパク質の所望の領域に結合する複数の抗体が産生される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
少なくとも１００個の抗体が産生される、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
少なくとも５００個の抗体が産生される、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
少なくとも１，０００個の抗体が産生される、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
少なくとも１０，０００個の抗体が産生される、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
少なくとも２０，０００個の抗体が産生される、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
約３０，０００個の抗体が産生される、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
産生された前記抗体の少なくとも５０％がユニークである、請求項３９～４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
前記複数の抗体が、約２００ｎＭ以下のＫＤで前記標的タンパク質の前記所望の領域に結合する、請求項３９～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記複数の抗体が、約５０ｎＭ以下のＫＤで前記標的タンパク質の前記所望の領域に結合する、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記複数の抗体が、約１０ｎＭ以下のＫＤで前記標的タンパク質の前記所望の領域に結合する、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記複数の抗体が、約１ｎＭ以下のＫＤで前記標的タンパク質の前記所望の領域に結合する、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
前記複数の抗体が、約０．１ｎＭ以下のＫＤで前記標的タンパク質の前記所望の領域に結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記複数の抗体が、約０．０１ｎＭ以下のＫＤで前記標的タンパク質の前記所望の領域に結合する、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記標的タンパク質が抗体又は抗体断片であり、前記複数の抗体が少なくとも１つの抗原遮断抗体を含む、請求項３９～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記標的タンパク質が抗体又は抗体断片であり、前記複数の抗体が少なくとも１つの抗原非遮断抗体を含む、請求項３９～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記抗原非遮断抗体が抗原抗体複合体に結合する、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
工程（ｃ）の前記ＩｇＧ＋Ｂ細胞が、請求項１に記載のＩｇＧ＋Ｂ細胞について前記試料を濃縮する工程を含まない方法を用いて単離されているＩｇＧ＋Ｂ細胞と比較して増加した生存率を有する、請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
工程（ａ）～（ｅ）が１２週間以内に行われる、請求項２５～５６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年８月３０日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーの名称は５０４７４－２３７ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿８＿３０＿２１＿ＳＴ２５であり、サイズは６５，０７５バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年８月３０日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーの名称は５０４７４－２３７ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿８＿３０＿２１＿ＳＴ２５であり、サイズは６５，０７５バイトである。
【0002】
発明の分野
標的タンパク質の所望の領域に結合する抗体の産生及び同定のための方法が本明細書で提供される。
標的タンパク質の所望の領域に結合する抗体の産生及び同定のための方法が本明細書で提供される。
【背景技術】
【0003】
多数の抗体治療薬が、前臨床開発及び臨床試験に進められている。高品質抗イディオタイプ試薬抗体（抗ＩＤ）、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）特異的抗ＩＤは、治療用抗体薬物開発のための生物分析アッセイに重要である。これらのタイプの試薬抗体を生成するために使用される一般的なアプローチには、ｉｎ ｖｉｖｏハイブリドーマ技術、ｉｎ ｖｉｔｒｏファージディスプレイ免疫化ライブラリ、及び合成抗体ライブラリが含まれる。これらの技術は、長いタイムラインを必要とし、多くの場合、数が少ないか、エピトープ結合多様性を欠くか、又は弱い親和性を有する抗体のパネルをもたらす。したがって、当技術分野では、明確に定義されたエピトープ結合特異性を有する抗ＩＤの大きなパネルを迅速に製造する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【0004】
一態様では、本開示は、標的タンパク質の所望の領域に結合する１つ以上抗体を同定する方法を特徴とし、本方法は、（ａ）所望の領域を含む標的タンパク質又はその断片で免疫化されている動物からの試料を提供することであって、試料がＩｇＧ＋Ｂ細胞を含む、提供することと、（ｂ）試料中の１つ以上の望ましくない細胞型からＩｇＧ＋Ｂ細胞を分離することによって試料をＩｇＧ＋Ｂ細胞について濃縮することであって、分離することが、（ｉ）試料を、１つ以上の望ましくない細胞型に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片と接触させることであって、１つ以上の抗体又は抗体断片がタグを含む、試料を、１つ以上の望ましくない細胞型に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片と接触させること、及び（ｉｉ）試料を、タグに対する親和性を有する表面と接触させることであって、１つ以上の抗体又は抗体断片に結合した１つ以上の望ましくない細胞型が表面に保持され、それにより、ＩｇＧ＋Ｂ細胞を１つ以上の望ましくない細胞型から分離し、試料をＩｇＧ＋Ｂ細胞について濃縮する、試料を、タグに対する親和性を有する表面と接触させること、を含む、試料をＩｇＧ＋Ｂ細胞について濃縮することと、（ｃ）工程（ｂ）の分離されたＩｇＧ＋Ｂ細胞を個別に培養することと、（ｄ）標的タンパク質の所望の領域に結合する抗体を産生する１つ以上のＩｇＧ＋Ｂ細胞を同定することであって、同定することが、工程（ｃ）の個別に培養されたＩｇＧ＋Ｂ細胞の上清の親和性を、（ｉ）所望の領域を含む標的タンパク質又はその断片、及び（ｉｉ）標的タンパク質又は非標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位を含む対照タンパク質の両方について評価することを含む、１つ以上のＩｇＧ＋Ｂ細胞同定することと、を含み、標的タンパク質又はその断片に対する親和性を有し、対照タンパク質に対する親和性を有しない上清が、標的タンパク質の所望の領域に結合する抗体を産生するＩｇＧ＋Ｂ細胞を同定する。
【0005】
いくつかの態様では、動物はウサギ又はラットである。いくつかの態様では、動物はウサギである。
【0006】
いくつかの態様では、試料は血液試料又は血清試料である。いくつかの態様では、血液試料は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料である。
【0007】
いくつかの態様では、動物は約８週間免疫化されている。
【0008】
いくつかの態様では、試料を処理してマクロファージ及び単球を除去した。
【0009】
いくつかの態様では、望ましくない細胞型は、ＩｇＭ Ｂ細胞、骨髄細胞、及びＴ細胞農地の１つ以上である。いくつかの態様では、望ましくない細胞型は、ＩｇＭ Ｂ細胞、骨髄細胞、及びＴ細胞である。いくつかの態様では、ＩｇＭ Ｂ細胞に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片は、ＩｇＭに結合する１つ以上の抗ＩｇＭ抗体又はその抗体断片である。いくつかの態様では、骨髄細胞に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片は、ＣＤ１１ｂに結合する１つ以上の抗ＣＤ１１ｂ抗体又はその抗体断片である。いくつかの態様では、Ｔ細胞に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片は、Ｔリンパ球に結合する抗Ｔリンパ球抗体又はその抗体断片である。
【0010】
いくつかの態様では、１つ以上の望ましくない細胞型に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片はビオチンタグを含み、表面はストレプトアビジンを含む。
【0011】
いくつかの態様では、表面はビーズである。いくつかの態様では、ビーズは磁気ビーズである。
【0012】
いくつかの態様では、工程（ｂ）は、（ｉｉｉ）濃縮試料を、第１のマーカーを含み、ＩｇＧ＋Ｂ細胞に結合する抗体又は抗体断片及び生細胞を同定する薬剤と接触させることを更に含む。
【0013】
いくつかの態様では、ＩｇＧ＋Ｂ細胞に結合する抗体又は抗体断片は抗ＩｇＧ抗体である。
【0014】
いくつかの態様では、生細胞を同定する薬剤はヨウ化プロピジウムである。
【0015】
いくつかの態様では、工程（ｂ）（ｉｉｉ）は試料を、所望の領域を含む標的タンパク質又はその断片と接触させることを更に含み、標的タンパク質又はその断片が第２のマーカーを含む。
【0016】
いくつかの態様では、工程（ｂ）（ｉｉｉ）は、試料を、標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位を含む対照タンパク質と接触させることを更に含み、対照タンパク質が第３のマーカーを含む。いくつかの態様では、第１のマーカー、第２のマーカー、及び第３のマーカーは蛍光マーカーである。
【0017】
いくつかの態様では、工程（ｂ）は、（ｉｖ）生細胞を同定する薬剤によって生存可能であると同定され、第１のマーカー及び第２のマーカーを含むが、第３のマーカーを含まない細胞を単離することを更に含む。いくつかの態様では、単離することは、マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によるものである。
【0018】
いくつかの態様では、工程（ｄ）において、（ｉ）標的タンパク質又はその断片、及び（ｉｉ）対照タンパク質の両方に対する上清の親和性を評価するためにＥＬＩＳＡが行われる。
【0019】
いくつかの態様では、本方法は、（ｅ）標的タンパク質の所望の領域に結合する抗体を産生すると同定されている１つ以上のＩｇＧ＋Ｂ細胞のＶＨ領域及びＶＬ領域をクローニングすることを更に含む。
【0020】
いくつかの態様では、標的タンパク質は抗体又は抗体断片である。いくつかの態様では、抗体又は抗体断片の所望の領域は相補性決定領域（ＣＤＲ）である。いくつかの態様では、動物は、所望の領域を含む抗体の断片で免疫化されている。いくつかの態様では、所望の領域を含む抗体の断片は抗原結合断片（Ｆａｂ）である。
【0021】
いくつかの態様では、標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位は、抗体又は抗体断片の１つ以上のフレームワーク領域である。いくつかの態様では、標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位を含む対照タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質の軽鎖（ＬＣ）フレームワーク領域に対して少なくとも８５％の同一性を有するフレームワーク領域と、無関係なＬＣ ＣＤＲのセットとを含むＬＣ、及び（ｉｉ）標的タンパク質の重鎖（ＨＣ）フレームワーク領域に対して少なくとも８５％の同一性を有するフレームワーク領域と、無関係なＨＣ ＣＤＲのセットとを含むＨＣ、とを含むＦａｂ断片である。いくつかの態様では、無関係なＬＣ ＣＤＲ及び無関係なＨＣ ＣＤＲは、抗ｇＤモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＣＤＲである。いくつかの態様では、抗ｇＤ ｍＡｂは５Ｂ６である。
【0022】
いくつかの態様では、標的タンパク質は抗体又は抗体断片ではない。いくつかの態様では、標的タンパク質の所望の領域は、標的タンパク質のドメインである。
【0023】
いくつかの態様では、工程（ｄ）は、工程（ｃ）の個別に培養されたＩｇＧ＋Ｂ細胞の上清の、所望の領域を含む標的タンパク質の断片に対する親和性を評価することを含む。いくつかの態様では、所望の領域を含む標的タンパク質の断片は無関係のタンパク質に連結されている。
【0024】
いくつかの態様では、工程（ｄ）の対照タンパク質は、（ｉ）所望の領域を欠く標的タンパク質のバージョン；（ｉｉ）標的タンパク質に関連し、所望の領域を含まないタンパク質；又は（ｉｉｉ）無関係な対照タンパク質である。
【0025】
いくつかの態様では、標的タンパク質の所望の領域に結合する複数の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも１００個の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも５００個の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも１，０００個の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも１０，０００個の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも２０，０００個の抗体が産生される。いくつかの態様では、約３０，０００個の抗体が産生される。
【0026】
いくつかの態様では、産生される抗体の少なくとも５０％がユニークである。
【0027】
いくつかの態様では、複数の抗体は、約２００ｎＭ以下のＫＤで標的タンパク質の所望の領域に結合する。
【0028】
いくつかの態様では、複数の抗体は、約５０ｎＭ以下のＫＤで標的タンパク質の所望の領域に結合する。いくつかの態様では、複数の抗体は、約１０ｎＭ以下のＫＤで標的タンパク質の所望の領域に結合する。いくつかの態様では、複数の抗体は、約１ｎＭ以下のＫＤで標的タンパク質の所望の領域に結合する。いくつかの態様では、複数の抗体は、約０．１ｎＭ以下のＫＤ標的タンパク質の所望の領域に結合する。いくつかの態様では、複数の抗体は、約０．０１ｎＭ以下のＫＤで標的タンパク質の所望の領域に結合する。
【0029】
いくつかの態様では、標的タンパク質は抗体又は抗体断片であり、複数の抗体が少なくとも１つの抗原遮断抗体を含む。
【0030】
いくつかの態様では、標的タンパク質は抗体又は抗体断片であり、複数の抗体が少なくとも１つの抗原非遮断抗体を含む。いくつかの態様では、抗原非遮断抗体は抗原抗体複合体に結合する。
【0031】
いくつかの態様では、工程（ｃ）のＩｇＧ＋Ｂ細胞は、本明細書に提供される方法に従ってＩｇＧ＋Ｂ細胞について試料を濃縮する工程を含まない方法を使用して単離されたＩｇＧ＋Ｂ細胞と比較して増加した生存率を有する。
【0032】
いくつかの態様では、工程（ａ）～（ｅ）は１２週間以内に行われる。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1A】図１Ａは、ウサギからのＣＤＲ特異的抗イディオタイプ抗体（抗ＩＤ）の作製のタイムラインを示すフローチャートである。ウサギを治療用抗体（Ａｂ１）抗原結合断片（Ｆａｂ）で８週間免疫化した；ウサギ末梢血からＩｇＧ＋であり、Ａｂ１ Ｆａｂに結合し（Ａｂ１ Ｆａｂ＋）、対照Ｆａｂに結合しなかった（Ａｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ－）Ｂ細胞のフローサイトメトリー単離培養を１週間行った；一次ＥＬＩＳＡスクリーニング、分子クローニング及びウサギ抗体（ｒＡｂ）発現を２週間で完了した；並びにＡｂ１ ＣＤＲ特異的抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）を１週間で特性評価のために同定した。
【図1B】図１Ｂは、フローサイトメトリーを使用したＡｂ１ Ｆａｂ＋／Ａｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ－／ＩｇＧ＋Ｂ細胞についての免疫ウサギ末梢血からのＩｇＧ＋Ｂ細胞の濃縮を示す一組の散布図である。左パネル：血液由来のＩｇＧ＋Ｂ細胞。中央パネル：ＩｇＧ＋Ｂ細胞濃縮工程後のＩｇＧ＋Ｂ細胞。右パネル：ＩｇＧ＋、Ａｂ１ Ｆａｂ＋、及びＡｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ－であるＢ細胞。
【図1D】図１Ｄは、Ａｂ１ Ｆａｂ及びＡｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂへの培養ウサギＢ細胞上清の結合についてのハイスループット一次ＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を示すプロットである。ＯＤ＞０．２５及びＯＤ＜０．１の光学密度（ＯＤ）閾値を、それぞれ結合上清及び非結合上清を同定するための閾値として使用した。
【図1E】図１Ｅは、２４個のユニークＡｂ２クローンの精製された組換えＩｇＧの、正常ヒト血漿中の天然ＩｇＧに由来するＡｂ１ Ｆａｂ、Ａｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ及び別のヒト対照Ｆａｂ（Ｈｕｃｔｒｌ Ｆａｂ）への結合についてのスクリーニングの結果を示すプロットである。
【図2A】図２Ａは、Ａｂ１軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するＡｂ１軽鎖（ＬＣ）フレームワーク領域（ｈＩＧＫＶ１－１６）の配列及び抗ｇＤ ＬＣ－ＣＤＲを有する４つ全てのヒトＩｇＧカッパＬＣコンセンサスフレームワークの配列を示す配列アラインメント図である。ドットは同一のアミノ酸残基を示し、文字は異なるアミノ酸残基を示す。位置はＫａｂａｔシステムに従ってナンバリングされる。ＣＤＲは、ＩＭＧＴ（登録商標）のＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義に従って示される。
【図2B】図２Ｂは、Ａｂ１重鎖（ＨＣ）フレームワーク領域（ｈＩＧＨＶ３－２３）及びＡｂ１重鎖ＣＤＲの配列、並びに抗ｇＤ ＬＣ－ＣＤＲを有する４つ全てのヒトＩｇＧ ＨＣコンセンサスフレームワークの配列を示す配列アラインメント図である。ドットは同一のアミノ酸残基を示し、文字は異なるアミノ酸残基を示す。位置はＫａｂａｔシステムに従ってナンバリングされる。ＣＤＲは、ＩＭＧＴ（登録商標）のＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義に従って示される。
【図3A】図３Ａは、Ａｂ２が抗原（Ａｇ）遮断又は非遮断エピトープ型を有するかどうかを決定するための実験設定を示す概略図である。Ａｂ２をプロテインＡによって捕捉し、Ａｂ１ Ｆａｂと接触させ、続いて抗原と接触させる。結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して評価する。
【図3B】図３Ｂは、Ａｂ１ Ｆａｂ及び抗原に対するＡｂ２クローン３Ｅ３及び１８Ｃ９の（応答単位（ＲＵ）での）結合を示す一対のセンサーグラムである。３Ｅ３はＡｇ非遮断抗ＩＤであると決定され（左パネル）、１８Ｃ９はＡｇ遮断抗ＩＤであると決定された。
【図3C】図３Ｃは、Ａｂ２がＡｂ１抗原複合体に結合するかどうかを決定するための実験設定を示す概略図である。Ａｂ２をプロテインＡによって捕捉し、ＡｇとＡｂ１のＦａｂ複合体と接触させる。結合を、ＳＰＲを使用して評価する。
【図3D】図３Ｄは、Ａｇ及びＡｂ１ Ｆａｂ複合体に対するＡｂ２クローン３Ｅ３及び２１Ａ６の（応答単位（ＲＵ）での）結合を示す一対のセンサーグラムである。３Ｅ３はＡｇ及びＡｂ１複合体を認識できると決定されたが、２１Ａ６は認識できなかった。
【図4】図４は、３種類の抗ＩＤを示す模式図である。左：Ａｇ遮断抗ＩＤ（Ａｂ２）は薬物抗体（Ａｂ１）のパラトープに結合し、標的（Ａｇ）へのＡｂ１の結合を阻害する。Ａｇ遮断抗ＩＤは、遊離Ａｂ１の検出に有用である。中央：Ａｇ非遮断抗ＩＤ（Ａｂ２）が薬物パラトープの外側に結合する。右：Ａｇ＋Ａｂ１複合体抗ＩＤは、薬物－標的複合体に特異的であり、結合薬物検出にのみ使用される。
【図5A】図５Ａは、マイクロフルイディクスシステムにおける抗ＩＤ（Ａｂ２）のエピトープビニングの実験設定を示す概略図である。固定化されたＡｂ２を最初にＡｂ１ Ｆａｂに結合させ、続いてペアワイズＡｂ２結合を検出する。
【図5B】図５Ｂは、実施例１において本明細書中に記載される、プロジェクトＥからの群２の抗ＩＤ（Ａｂ２）のビニングから推定されるエピトープクラスタを示すネットワークプロットである。Ａｂ２をノードで表す。コードは、ノード間の競合関係を示す。斜線領域は、他のＡｂ２に対して試験した場合に同一の遮断プロファイルを共有するＡｂ２のファミリーを示す。
【図5C】図５Ｃは、プロジェクトＥからの群１抗ＩＤ（Ａｂ２）のビニングから推定されたエピトープクラスタを示すネットワークプロットである。Ａｂ２をノードで表す。コードは、ノード間の競合関係を示す。斜線領域は、他のＡｂ２に対して試験した場合に同一の遮断プロファイルを共有するＡｂ２のファミリーを示す。
【図5D】図５Ｄは、プロジェクトＥからの群３抗ＩＤ（Ａｂ２）のビニングから推定されたエピトープクラスタを示すネットワークプロットである。Ａｂ２をノードで表す。コードは、ノード間の競合関係を示す。斜線領域は、他のＡｂ２に対して試験した場合に同一の遮断プロファイルを共有するＡｂ２のファミリーを示す。
【図5E】図５Ｅは、プロジェクトＥからの２４個の抗ＩＤ（Ａｂ２）のパネルのビニングから推定されたエピトープクラスタを示すネットワークプロットである。Ａｂ２をノードで表す。コードは、ノード間の競合関係を示す。斜線領域は、他のＡｂ２に対して試験した場合に同一の遮断プロファイルを共有するＡｂ２のファミリーを示す。群１（３Ｅ３、１４Ｂ１１）と群２（１９Ｃ４）Ａｂ２との間のエピトープ関係を示す。
【図6A】図６Ａは、サンドイッチＥＬＩＳＡ ＰＫアッセイの実験設定を示す概略図である。各Ａｂ２をＥＬＩＳＡプレートに固定化してＡｂ１捕捉試薬とし、他のＡｂ２抗体をビオチン化してストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートして検出試薬とした。
【発明を実施するための形態】
【0034】
Ｉ． 定義
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、別途示されない限り、複数のものを含む。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、別途示されない限り、複数のものを含む。
【0035】
本明細書で使用される「約」という用語は、この技術分野の当業者であれば容易に理解する、それぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書において、値又はパラメータについての「約」の参照は、それ自体がその値又はパラメータに向けられた態様を含む（及び説明する）。例えば、「約Ｘ」に言及する説明は、「Ｘ」の説明を含む。いくつかの実施形態では、「約」は、当業者によって理解されるように、±１５％、±１０％、±５％、又は±１％を指す場合がある。
【0036】
本明細書に記載される本発明の態様は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」態様を含むことが理解される。
【0037】
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で用いられ、限定はしないが、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片（例えば、ｂｉｓ－Ｆａｂ）を含めた、様々な抗体構造を包含する。「完全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書で、ネイティブ抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、又は本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように同義に使用される。
【0038】
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原を結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、ｂｉｓ－Ｆａｂ；Ｆｖ；Ｆａｂ；Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ；Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ、ＳｃＦａｂ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。抗体断片は、組換え生産され得る。
【0039】
「Ｆａｂ」断片は、抗体のパパイン消化によって作製されるか又は組換え生産された抗原結合断片であり、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と共にＬ鎖全体からなる。抗体のパパイン消化により、２つの同一のＦａｂ断片を生成する。抗体のペプシン処理により単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が生じ、これは二価の抗原結合活性を有するジスルフィドで連結された２つのＦａｂ断片にほぼ対応し、依然として抗原に架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に追加のいくつかの残基を有している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書での命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生されたものであった。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【0040】
「Ｆｖ」は、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインが、堅固な非共有結合をなした二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みにより、抗原結合のためのアミノ酸残基を提供し、かつ抗原結合特異性を抗体に与える６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖から各３つのループ）が生じる。ただし、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも低い親和性であることが多いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
【0041】
本明細書において「Ｆｃ領域」という用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基から又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の産生若しくは精製の間に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することによって取り除かれ得る。したがって、インタクトな抗体の組成物は、全てのＬｙｓ４４７残基が除かれた抗体集団、Ｌｙｓ４４７残基が除かれていない抗体集団、及びＬｙｓ４４７残基を有する抗体と有さない抗体との混合物を有する抗体集団を含み得る。
【0042】
「単一ドメイン抗体」は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、あるいは軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片を指す。特定の態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（例えば、米国特許第６２４８５１６号Ｂ１を参照）。単一ドメイン抗体の例には、ＶＨＨが含まれるが、これに限定されない。
【0043】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖに関するレビューについては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｅｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９－３１５を参照されたい。
【0044】
「ダイアボディ」という用語は、二つの抗原結合部位を持つ抗体断片を指し、その断片は、同一ポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ－ＶＬ）。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成ができないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは二価でも二特異性でもよい。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）において、より完全に記載されている。トリアボディ及びテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）においても記載されている。
【0045】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域の型を指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に更に分類することができる抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【0046】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な変異、例えば、天然に存在する変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。特定の態様では、このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、該標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られたものである。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １４（３）：２５３－２６０（１９９５），Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３－６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）を参照）、及びヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座又は遺伝子の一部又は全てを有するヒト又はヒト様抗体を動物で産生するための技術（例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号；国際公開第１９９６／３４０９６号；国際公開第１９９６／３３７３５号；国際公開第１９９１／１０７４１号；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５－２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；ａｎｄ ５，６６１，０１６；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２－８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５－８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；及びＬｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３（１９９５））を含む様々な技法によって作製され得る。選択された標的結合配列が、例えば、標的への親和性を改善し、標的結合配列をヒト化し、細胞培養におけるその産生を改善し、ｉｎ ｖｉｖｏでのその免疫原性を低減し、多重特異性抗体を作製するように更に改変されてもよく、かつ改変された標的結合配列を含む抗体が本発明のモノクローナル抗体でもあることを理解されたい。様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロブリンによる混入がないという点で有利である。
【0047】
「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列において超可変性であり（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は構造的に所定のループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原に接触する残基（「抗原接触」）を含有する抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般的に、抗体は、６個のＨＶＲを含み、ＶＨに３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）含む。
【0048】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一の結合部位の間の非共有性相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（ＫＤ）によって表し得る。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当技術分野で公知である一般的な方法によって測定し得る。
【0049】
本明細書で使用される場合、「結合する」、「～に特異的に結合する」、又は「～に特異的である」という用語は、標的と抗体との間の結合等、測定可能かつ再生可能な相互作用を指し、これは、生体分子を含む分子の異種集団の存在下において、標的の存在を決定づけるものである。例えば、標的（エピトープであり得る）に結合するか、又はそれに特異的に結合する抗体は、この標的に、他の標的に結合するよりも高い親和性で、結合力で、より容易に、及び／又はより長期間結合する抗体である。いくつかの態様では、抗体が無関係の標的に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定した場合、抗体の標的への結合の約１０％未満である。いくつかの態様では、標的に特異的に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの態様では、抗体は、異なる種由来のタンパク質間で保存されるタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。別の態様では、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、それを必要としない。
【0050】
「ヒト抗体」とは、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体、又はヒト抗体レパートリー等のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト由来の抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む、当技術分野で知られている様々な技法を使用して生成することができる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１，１９９１；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１，１９９１．Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６－９５，１９９１に記載されている方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４，２００１．も参照されたいヒト抗体は、抗原投与に応答してこのような抗体を産生するよう改変されているが、その内在性遺伝子座は無能になっているトランスジェニック動物、例えば、免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによって調製することが可能である（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技法に関する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により産生されるヒト抗体については、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０３：３５５７－３５６２，２００６を参照されたい。
【0051】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３におけるようなサブグループである。一態様では、ＶＬの場合、サブグループは、上述のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に記載のように、サブグループカッパＩである。一態様では、ＶＨの場合、サブグループは、上述のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．におけるようなサブグループカッパＩＩＩである。
【0052】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の態様では、ヒト化抗体は、実質的に少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを含み、全て又は実質的に全てのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）は、非ヒト抗体のものに対応し、全て又は実質的に全てのＦＲはヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体のＦＲの全て又は実質的に全てのＦＲがヒト抗体のＦＲに対応する特定の態様では、ヒト化抗体のＦＲのいずれかは、非ヒトＦＲ（複数可）からの１つ以上のアミノ酸残基（例えば、ＦＲの１つ以上のＶｅｒｎｉｅｒ位置残基）を含んでいてもよい。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【0053】
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原分子上の特定の部位を指す。いくつかの態様では、抗体が結合する抗原分子上の特定の部位は、ヒドロキシルラジカルフットプリントによって決定される。いくつかの態様では、抗体が結合する抗原分子上の特定の部位は、結晶学的に決定される。
【0054】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような一般に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して得ることができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて生成している。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルし得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含め、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変わらない。
【0055】
ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、特定のアミノ酸配列同一性％を有する又は含む、所与のアミノ酸配列Ａとして記述され得る）は、以下のように計算される：
１００ × 分数Ｘ／Ｙ
このとき、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一であるとして一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。
１００ × 分数Ｘ／Ｙ
このとき、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一であるとして一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。
【0056】
本明細書で使用される「試料」という用語は、例えば、物理的、生化学的、化学的、及び／又は生理学的特性に基づいて、特徴付けられ及び／又は同定される細胞及び／又は他の分子実体を含有する、目的の対象及び／又は個体から得られるか、又はそれに由来する組成物を指す。例えば、「疾患試料」という語句及びその変形は、特徴付けられるべき細胞及び／又は分子実体を含有することが期待されるか又は含有することが知られている、目的の対象から得られた任意の試料を指す。試料は、限定されないが、組織試料、初代若しくは培養細胞又は細胞株、細胞上清、細胞溶解物、血小板、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、羊水、乳汁、全血、血漿、血清、血液由来細胞、尿、脳脊髄液、唾液、頬スワブ、痰、涙液、発汗、粘液、腫瘍溶解物、及び組織培養培地、ホモジナイズした組織等の組織抽出物、腫瘍組織、細胞抽出物、及びそれらの組み合わせを含む。試料は、アーカイブ試料、新鮮な試料、又は凍結試料であってよい。いくつかの態様では、試料は血液試料、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料である。
【0057】
ＩＩ． 方法
いくつかの態様では、本開示は、標的タンパク質の所望の領域に結合する１つ以上抗体を同定する方法を特徴とし、本方法は、（ａ）所望の領域を含む標的タンパク質又はその断片で免疫化されている動物からの試料を提供することであって、試料がＩｇＧ＋Ｂ細胞を含む、試料を提供することと、（ｂ）試料中の１つ以上の望ましくない細胞型からＩｇＧ＋Ｂ細胞を分離することによって試料をＩｇＧ＋Ｂ細胞について濃縮することであって、分離することが、（ｉ）試料を、１つ以上の望ましくない細胞型に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片と接触させることであって、１つ以上の抗体又は抗体断片がタグを含む、試料を、１つ以上の望ましくない細胞型に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片と接触させること、及び（ｉｉ）試料を、タグに対する親和性を有する表面と接触させることであって、１つ以上の抗体又は抗体断片に結合した１つ以上の望ましくない細胞型が表面に保持され、それにより、ＩｇＧ＋Ｂ細胞を１つ以上の望ましくない細胞型から分離し、試料をＩｇＧ＋Ｂ細胞について濃縮する、試料を、タグに対する親和性を有する表面と接触させる接触させること、を含む、試料をＩｇＧ＋Ｂ細胞について濃縮することと、（ｃ）工程（ｂ）の分離されたＩｇＧ＋Ｂ細胞を個別に培養することと、（ｄ）標的タンパク質の所望の領域に結合する抗体を産生する１つ以上のＩｇＧ＋Ｂ細胞を同定することであって、同定することが、工程（ｃ）の個別に培養されたＩｇＧ＋Ｂ細胞の上清の親和性を、（ｉ）所望の領域を含む標的タンパク質又はその断片、及び（ｉｉ）標的タンパク質又は非標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位を含む対照タンパク質の両方について評価することを含む、１つ以上のＩｇＧ＋Ｂ細胞を同定することと、を含み、標的タンパク質又はその断片に対する親和性を有し、対照タンパク質に対する親和性を有しない上清が、標的タンパク質の所望の領域に結合する抗体を産生するＩｇＧ＋Ｂ細胞を同定する。
いくつかの態様では、本開示は、標的タンパク質の所望の領域に結合する１つ以上抗体を同定する方法を特徴とし、本方法は、（ａ）所望の領域を含む標的タンパク質又はその断片で免疫化されている動物からの試料を提供することであって、試料がＩｇＧ＋Ｂ細胞を含む、試料を提供することと、（ｂ）試料中の１つ以上の望ましくない細胞型からＩｇＧ＋Ｂ細胞を分離することによって試料をＩｇＧ＋Ｂ細胞について濃縮することであって、分離することが、（ｉ）試料を、１つ以上の望ましくない細胞型に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片と接触させることであって、１つ以上の抗体又は抗体断片がタグを含む、試料を、１つ以上の望ましくない細胞型に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片と接触させること、及び（ｉｉ）試料を、タグに対する親和性を有する表面と接触させることであって、１つ以上の抗体又は抗体断片に結合した１つ以上の望ましくない細胞型が表面に保持され、それにより、ＩｇＧ＋Ｂ細胞を１つ以上の望ましくない細胞型から分離し、試料をＩｇＧ＋Ｂ細胞について濃縮する、試料を、タグに対する親和性を有する表面と接触させる接触させること、を含む、試料をＩｇＧ＋Ｂ細胞について濃縮することと、（ｃ）工程（ｂ）の分離されたＩｇＧ＋Ｂ細胞を個別に培養することと、（ｄ）標的タンパク質の所望の領域に結合する抗体を産生する１つ以上のＩｇＧ＋Ｂ細胞を同定することであって、同定することが、工程（ｃ）の個別に培養されたＩｇＧ＋Ｂ細胞の上清の親和性を、（ｉ）所望の領域を含む標的タンパク質又はその断片、及び（ｉｉ）標的タンパク質又は非標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位を含む対照タンパク質の両方について評価することを含む、１つ以上のＩｇＧ＋Ｂ細胞を同定することと、を含み、標的タンパク質又はその断片に対する親和性を有し、対照タンパク質に対する親和性を有しない上清が、標的タンパク質の所望の領域に結合する抗体を産生するＩｇＧ＋Ｂ細胞を同定する。
【0058】
Ａ． 標的タンパク質
ｉ． 抗体標的タンパク質
いくつかの態様では、標的タンパク質は、抗体又は抗体断片、例えば治療用抗体（薬物抗体）又はその断片である。標的抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体、例えばＴ細胞依存性二重特異性抗体（ＴＤＢ））、及び／又は抗体誘導体であり得る。抗体断片は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の任意の分子を含む。抗体断片の例としては、抗原結合断片（Ｆａｂ）；Ｆａｂ’’；Ｆａｂ’－ＳＨ；Ｆ（ａｂ’）２断片；ビスＦａｂ；可変ドメイン（Ｆｖ）；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これに限定されない。
ｉ． 抗体標的タンパク質
いくつかの態様では、標的タンパク質は、抗体又は抗体断片、例えば治療用抗体（薬物抗体）又はその断片である。標的抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体、例えばＴ細胞依存性二重特異性抗体（ＴＤＢ））、及び／又は抗体誘導体であり得る。抗体断片は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の任意の分子を含む。抗体断片の例としては、抗原結合断片（Ｆａｂ）；Ｆａｂ’’；Ｆａｂ’－ＳＨ；Ｆ（ａｂ’）２断片；ビスＦａｂ；可変ドメイン（Ｆｖ）；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これに限定されない。
【0059】
標的タンパク質が抗体又は抗体断片である態様では、抗体が作製される所望の領域は、標的抗体又は抗体断片の任意の領域であり得る。いくつかの態様では、所望の領域は標的抗体又は抗体断片の相補性決定領域（ＣＤＲ）であり、すなわち、本方法によって作製される抗体は抗イディオタイプ（抗ＩＤ）抗体である。いくつかの態様では、標的抗体又は抗体断片は２つ以上のＣＤＲ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は６つを超えるＣＤＲを含む）を含み、ＣＤＲのいずれかを標的とする抗体が所望され、例えば所望の領域は標的抗体又は抗体断片のＣＤＲの全てを含む。他の態様では、標的抗体又は抗体断片は２つ以上のＣＤＲを含み、ＣＤＲの１つ又はサブセットのみを標的とする抗体が所望され、例えば所望の領域は標的抗体又は抗体断片の選択されたＣＤＲを含む。
【0060】
動物は、標的抗体若しくは抗体断片全体、又は所望の領域の適切に折り畳まれたバージョンを含むその任意の断片で免疫化され得る。いくつかの態様では、動物は、標的抗体又は抗体断片のＦａｂにより免疫化される。
【0061】
ｉｉ． 非抗体標的タンパク質
いくつかの態様では、標的タンパク質は抗体又は抗体断片ではない。標的タンパク質は、任意のタンパク質若しくはペプチド、例えばヒトタンパク質若しくはペプチド、動物タンパク質若しくはペプチド（例えば、カニクイザルタンパク質又はペプチド）、細菌若しくは真菌のタンパク質若しくはペプチド、又は人工タンパク質若しくはペプチドであり得る。抗体が作製される所望の領域は、標的タンパク質の任意の適切な領域、例えば標的タンパク質のドメイン、構造又はモチーフであり得る。例示的なドメインとしては、細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン及び結合ドメインが挙げられる、これらに限定されない。いくつかの態様では、標的タンパク質の所望の領域は、標的タンパク質のドメインである。
いくつかの態様では、標的タンパク質は抗体又は抗体断片ではない。標的タンパク質は、任意のタンパク質若しくはペプチド、例えばヒトタンパク質若しくはペプチド、動物タンパク質若しくはペプチド（例えば、カニクイザルタンパク質又はペプチド）、細菌若しくは真菌のタンパク質若しくはペプチド、又は人工タンパク質若しくはペプチドであり得る。抗体が作製される所望の領域は、標的タンパク質の任意の適切な領域、例えば標的タンパク質のドメイン、構造又はモチーフであり得る。例示的なドメインとしては、細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン及び結合ドメインが挙げられる、これらに限定されない。いくつかの態様では、標的タンパク質の所望の領域は、標的タンパク質のドメインである。
【0062】
動物は、所望の領域の適切に折り畳まれたバージョン（例えば、ドメイン、構造又はモチーフ）を含む標的タンパク質の任意の断片で免疫化され得る。いくつかの態様では、動物を標的タンパク質で免疫化する。いくつかの態様では、動物は、無関係のタンパク質に連結された標的タンパク質の所望の領域（例えば、ドメイン、構造又はモチーフ）を含むタンパク質で免疫化される。無関係なタンパク質としては、標的タンパク質の所望の領域と構造的又は機能的類似性を有するドメイン、構造、又はモチーフを有さないタンパク質が挙げられる。いくつかの態様では、所望の領域を無関係のタンパク質に連結することにより、標的タンパク質の他のドメイン、構造又はモチーフの非存在下で、所望の領域の適切に折り畳まれたバージョンに対する抗体の作製が可能になる。無関係なタンパク質は、それに結合する抗体を排除するための陰性選択スクリーニングとして使用され得る。いくつかの態様では、本明細書中に記載される方法によって作製される抗体は、種特異的であり、例えば、目的とする種の標的タンパク質に特異的に結合し、望ましくない種の関連タンパク質（例えば、標的タンパク質のホモログ）には結合しない。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法によって作製された抗体は、ヒト標的タンパク質に結合するが、関連するマウスタンパク質（例えば、マウスホモログ）には結合しない。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法によって生成された抗体は、ヒト標的タンパク質及び関連するカニクイザル（ｃｙｎｏ）タンパク質（例えば、カニクイザルのホモログ）に結合するが、関連するマウスタンパク質（例えば、マウスホモログ）には結合しない。
【0063】
Ｂ． ＩｇＧ＋Ｂ細胞を含む試料
免疫化は、任意の適切な動物、例えば哺乳動物、例えばラット、ウサギ、ハムスター、又はマウスにおいて実施され得、免疫化された試料が提供され得る。いくつかの態様では、動物はウサギ又はラットである。いくつかの態様では、動物はウサギである。
免疫化は、任意の適切な動物、例えば哺乳動物、例えばラット、ウサギ、ハムスター、又はマウスにおいて実施され得、免疫化された試料が提供され得る。いくつかの態様では、動物はウサギ又はラットである。いくつかの態様では、動物はウサギである。
【0064】
いくつかの態様では、動物は、約６～約１５週間、所望の領域を含む標的タンパク質又はその断片で免疫化されており、例えば、約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、又は１５週間免疫化されている（例えば、約６週間～約１０週間免疫化されている）。いくつかの態様では、動物は約８週間免疫化されている。免疫化は、所望の領域を含む標的タンパク質又はその断片の複数回投与を含み得る。
【0065】
ＩｇＧ＋Ｂ細胞を含有する免疫化動物由来の試料は、例えば、血液試料又は血清試料であり得る。いくつかの態様では、血液試料は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料である。
【0066】
いくつかの態様では、試料（例えば、血液試料、例えば、ＰＢＭＣ試料）は、特定の抗原でワクチン接種されたか、疾患を生き延びたか、又は疾患を有するヒトから提供される。
【0067】
いくつかの態様では、免疫化動物（例えば、血液試料、例えばＰＭＢＣ試料）からの試料は、試料からマクロファージ及び／又は単球を除去するために処理されている。プレート上への非特異的接着によって試料からマクロファージ及び単球を除去するための例示的な方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９：ｅ８６１８４，２０１４に記載されている。
【0068】
Ｃ． ＩｇＧ＋Ｂ細胞について試料を濃縮する方法
いくつかの態様では、本開示は、動物由来の試料を１つ以上の望ましくない細胞型からＩｇＧ＋Ｂ細胞を分離することによってＩｇＧ＋Ｂ細胞について試料を濃縮する方法を特徴とし、分離することは、（ｉ）試料を、１つ以上の望ましくない細胞型に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片と接触させることであって、該１つ以上の抗体又は抗体断片はタグを含む、試料を、１つ以上の望ましくない細胞型に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片と接触させることと、（ｉｉ）該試料を、タグに対する親和性を有する表面と接触させることであって、１つ以上の抗体又は抗体断片に結合した１つ以上の望ましくない細胞型が表面に保持され、それにより、ＩｇＧ＋Ｂ細胞を１つ以上の望ましくない細胞型から分離し、試料をＩｇＧ＋Ｂ細胞について濃縮する、該試料を、タグに対する親和性を有する表面と接触させることとを含む。
いくつかの態様では、本開示は、動物由来の試料を１つ以上の望ましくない細胞型からＩｇＧ＋Ｂ細胞を分離することによってＩｇＧ＋Ｂ細胞について試料を濃縮する方法を特徴とし、分離することは、（ｉ）試料を、１つ以上の望ましくない細胞型に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片と接触させることであって、該１つ以上の抗体又は抗体断片はタグを含む、試料を、１つ以上の望ましくない細胞型に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片と接触させることと、（ｉｉ）該試料を、タグに対する親和性を有する表面と接触させることであって、１つ以上の抗体又は抗体断片に結合した１つ以上の望ましくない細胞型が表面に保持され、それにより、ＩｇＧ＋Ｂ細胞を１つ以上の望ましくない細胞型から分離し、試料をＩｇＧ＋Ｂ細胞について濃縮する、該試料を、タグに対する親和性を有する表面と接触させることとを含む。
【0069】
いくつかの態様では、望ましくない細胞型は、動物由来の試料、例えば血液試料又は血漿試料中に存在する１つ以上の望ましくない細胞型である。いくつかの態様では、望ましくない細胞型としては、ＩｇＭ Ｂ細胞、骨髄細胞、及びＴ細胞のうちの１つ、２つ又は３つ全てが挙げられる。いくつかの態様では、望ましくない細胞型は、ＩｇＭ Ｂ細胞、骨髄細胞、及びＴ細胞である。
【0070】
いくつかの態様では、望ましくない細胞型はＩｇＭ Ｂ細胞を含み、本方法は、試料をＩｇＭ Ｂ細胞に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片、例えばＩｇＭに結合する１つ以上の抗ＩｇＭ抗体又はその抗体断片と接触させることを含む。
【0071】
いくつかの態様では、望ましくない細胞型は骨髄細胞を含み、本方法は、試料を骨髄細胞に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片、例えばＣＤ１１ｂに結合する１つ以上の抗ＣＤ１１ｂ抗体又はその抗体断片と接触させることを含む。
【0072】
いくつかの態様では、望ましくない細胞型はＴ細胞を含み、本方法は、試料をＴ細胞に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片、例えばＴリンパ球に結合する１つ以上の抗Ｔリンパ球抗体又はその抗体断片と接触させることを含む。
【0073】
いくつかの態様では、ＩｇＧ＋Ｂ細胞は、試料中の望ましくない細胞型の細胞（例えば、ＩｇＭ Ｂ細胞、骨髄細胞及び／又はＴ細胞）の少なくとも５％から分離され、例えば、試料中の望ましくない細胞型の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％から分離されるか、又は試料中の望ましくない細胞型の細胞の１００％から分離され、例えば、試料中の望ましくない細胞型の細胞の５％～２５％、２５％～５０％、５０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～９５％、９５％～９８％、若しくは９８％～１００％から分離される。いくつかの態様では、ＩｇＧ＋Ｂ細胞は、試料中の望ましくない細胞型の細胞の少なくとも５０％～７０％から分離される。いくつかの態様では、ＩｇＧ＋Ｂ細胞は、試料中の望ましくない細胞型の細胞の少なくとも９８％から分離される。
【0074】
１つ以上の望ましくない細胞型（例えば、抗ＩｇＭ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗Ｔリンパ球抗体、及び／又はそれらの断片）に結合する１つ以上の抗体又は抗体断片によって含まれるタグは、任意の適切なタグであり得る。いくつかの態様では、タグはビオチンタグである。
【0075】
タグに対して親和性を有する表面は、例えば、タグに対して親和性を有する部分を含む表面であり得る。いくつかの態様では、タグはビオチンタグであり、表面はストレプトアビジンを含む。いくつかの態様では、表面はビーズ、例えば磁気ビーズである。表面（例えばビーズ、例えば磁気ビーズ））は、カラム精製システムの構成要素であり得る。タグに対する親和性を有する表面と試料とを接触させることは、例えば、試料を表面上に流すこと（例えば、表面を含むカラム精製システムに試料を流すこと）を含み得る。
【0076】
Ｄ． 所望の標的特異性を有すＩｇＧ＋Ｂ細胞を選択する方法
ｉ． 生存ＩｇＧ＋細胞を選択する方法
本明細書に記載される方法のいくつかの態様では、本方法の工程（ｂ）は、（ｉｉｉ）濃縮試料を、第１のマーカーを含み、ＩｇＧ＋Ｂ細胞に結合する抗体又は抗体断片及び生細胞を同定する薬剤と接触させることを更に含む。
ｉ． 生存ＩｇＧ＋細胞を選択する方法
本明細書に記載される方法のいくつかの態様では、本方法の工程（ｂ）は、（ｉｉｉ）濃縮試料を、第１のマーカーを含み、ＩｇＧ＋Ｂ細胞に結合する抗体又は抗体断片及び生細胞を同定する薬剤と接触させることを更に含む。
【0077】
いくつかの態様では、第１のマーカーを含み、ＩｇＧ＋Ｂ細胞に結合する抗体又は抗体断片は、抗ＩｇＧ抗体である。第１のマーカーは、例えば、蛍光マーカーであり得る。いくつかの態様では、第１のマーカーはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である。
【0078】
いくつかの態様では、生細胞を同定する薬剤はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）である。ＰＩは非生細胞を染色するため、比較的低レベルのＰＩ染色（例えば、ＰＩ染色の非存在又は基準レベル未満のＰＩ染色レベル）を使用して、細胞を生存可能であると同定することができる。生細胞を同定するために使用され得る他の方法及び薬剤としては、エチジウムホモダイマーアッセイ、ＴＵＮＥＬアッセイ、エバンスブルー染色、フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）加水分解アッセイ、ホルマザン色素染色、ＭＴＴアッセイ、ニュートラルレッド染色、レサズリン染色、ヤヌスグリーンＢ染色、７－ＡＡＤ染色及びトリパンブルー染色が挙げられるが、これらに限定されない。
【0079】
いくつかの態様では、本方法は、第１のマーカーの検出（例えば、基準レベルを上回る第１のマーカーからの蛍光シグナルの検出）に基づいてＩｇＧ＋として同定され、生細胞を（例えば、基準レベル未満であるＰＩ染色のレベルに基づいて生存可能であると同定される）同定する薬剤によって生細胞として同定される細胞を選択すること、例えばそのような細胞を試料から分離することを更に含む。
【0080】
いくつかの態様では、第１のマーカー及び生細胞を同定する薬剤（例えば、ＰＩ）は蛍光マーカーであり、フローサイトメトリーを使用して、個々の細胞のマーカー及び薬剤からの蛍光シグナルを評価する。いくつかの態様では、フローサイトメトリーは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）であり、ＩｇＧ＋として同定され、生存可能な細胞が選択され、ＦＡＣＳを使用して試料から分離される。
【0081】
ｉｉ 所望の標的特異性を有すＩｇＧ＋Ｂ細胞を選択する方法
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、工程（ｂ）（ｉｉｉ）は試料を、所望の領域を含む標的タンパク質又はその断片と接触させることを更に含み、標的タンパク質又はその断片が第２のマーカーを含む。第２のマーカーは、例えば、蛍光マーカーであり得る。いくつかの態様では、第２のマーカーはＲ－フィコエリトリン（ＲＰＥ）である。
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、工程（ｂ）（ｉｉｉ）は試料を、所望の領域を含む標的タンパク質又はその断片と接触させることを更に含み、標的タンパク質又はその断片が第２のマーカーを含む。第２のマーカーは、例えば、蛍光マーカーであり得る。いくつかの態様では、第２のマーカーはＲ－フィコエリトリン（ＲＰＥ）である。
【0082】
いくつかの態様では、本方法は、第１のマーカーの検出に基づいてＩｇＧ＋として同定される；生細胞を同定する薬剤によって生存可能であると同定される；第２のマーカーの検出（例えば、参照レベルを上回る第２のマーカーからの蛍光シグナルの検出）に基づいて標的タンパク質又はその断片に結合すると同定される細胞を選択すること、例えば、そのような細胞を試料から分離することを更に含む。
【0083】
いくつかの態様では、工程（ｂ）（ｉｉｉ）が、試料を、標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位を含む対照タンパク質と接触させることを更に含み、対照タンパク質が第３のマーカーを含む。第３のマーカーは、例えば、蛍光マーカーであり得る。いくつかの態様では、第３のマーカーはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）である。
【0084】
いくつかの態様では、本方法は、第１のマーカーの検出に基づいてＩｇＧ＋として同定される；生細胞を同定する薬剤によって生存可能であると同定される；第２のマーカーの検出に基づいて、標的タンパク質又はその断片に結合すると同定される；第３のマーカーの検出（例えば、第３のマーカーの非存在、又は基準レベル未満である第３のマーカーからの蛍光シグナルの検出）に基づいて、対照タンパク質に結合しないと同定される細胞を選択すること、例えば、そのような細胞を試料から分離することを更に含む。
【0085】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、工程（ｂ）は、（ｉｖ）生細胞を同定する薬剤によって生存可能であると同定され、第１のマーカー及び第２のマーカーを含むが、第３のマーカーを含まない細胞を単離することを更に含む。いくつかの態様では、単離することは、マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によるものである。
【0086】
いくつかの態様では、第１のマーカー、第２のマーカー、第３のマーカー、及び生細胞を同定する薬剤（例えば、ＰＩ）は、識別可能な発光スペクトルを有する蛍光マーカーであり、フローサイトメトリーを使用して、個々の細胞のマーカー及び薬剤からの蛍光シグナルを評価する。いくつかの態様では、フローサイトメトリーは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）であり、ＩｇＧ＋として同定され、生存可能であり、標的タンパク質又はその断片に結合し、対照タンパク質に結合しない細胞が選択され、ＦＡＣＳを使用して試料から分離される。
【0087】
いくつかの態様では、本開示は、所望の標的特異性を有するＩｇＧ＋Ｂ細胞を単離する方法であって、（ａ）所望の領域を含む標的タンパク質又はその断片で免疫化されている動物から試料を提供することであって、試料がＩｇＧ＋Ｂ細胞を含む、試料を提供することと、（ｂ）試料を生細胞を同定する薬剤と接触させることと（第１のマーカーを含み、ＩｇＧ＋Ｂ細胞に結合する抗体又は抗体断片；所望の領域を含む標的タンパク質又はその断片であって、第２のマーカーを含む標的タンパク質又はその断片；及び標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位を含む対照タンパク質であって、第３のマーカーを含む対照タンパク質）、及び（ｃ）生細胞を同定する薬剤によって生細胞であると同定され、第１のマーカー及び第２のマーカーを含むが、第３のマーカーを含まない細胞を単離することを含む。
【0088】
Ｅ． 対照タンパク質
いくつかの態様では、本明細書中に記載される方法は、望ましくない特異性を有する抗体を同定するために、抗体による結合が望まれないタンパク質領域、ドメイン、構造又はモチーフ、例えば、標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位、又は非標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位を含む陰性対照の使用を伴う。いくつかの態様では、望ましくない結合部位は、動物が免疫化されている標的タンパク質又はその断片中に存在する。他の態様では、望ましくない結合部位は、免疫に使用されるタンパク質又はその断片には存在しない。
いくつかの態様では、本明細書中に記載される方法は、望ましくない特異性を有する抗体を同定するために、抗体による結合が望まれないタンパク質領域、ドメイン、構造又はモチーフ、例えば、標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位、又は非標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位を含む陰性対照の使用を伴う。いくつかの態様では、望ましくない結合部位は、動物が免疫化されている標的タンパク質又はその断片中に存在する。他の態様では、望ましくない結合部位は、免疫に使用されるタンパク質又はその断片には存在しない。
【0089】
ｉ． 抗体対照タンパク質
標的タンパク質が抗体又は抗体断片である態様では、標的タンパク質の１以上の望ましくない結合部位は、例えば、抗体又は抗体断片の１つ以上のフレームワーク領域又は１つ以上の定常領域であり得る。
標的タンパク質が抗体又は抗体断片である態様では、標的タンパク質の１以上の望ましくない結合部位は、例えば、抗体又は抗体断片の１つ以上のフレームワーク領域又は１つ以上の定常領域であり得る。
【0090】
いくつかの態様では、標的タンパク質は抗体又は抗体断片であり、標的タンパク質の１つ又は複数の望ましくない結合部位は、抗体又は抗体断片の１つ以上のフレームワーク領域である。いくつかの態様では、標的抗体又は抗体断片は２つ以上のフレームワーク領域を含み（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は８つを超えるフレームワーク領域を含む）、望ましくない結合部位は標的抗体又は抗体断片のフレームワーク領域の全てを含む。他の態様では、望ましくない結合部位は、標的抗体又は抗体断片のフレームワーク領域の１つ又はサブセットを含む。
【0091】
いくつかの態様では、標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位を含む対照タンパク質は、（ｉ）標的抗体又は抗体断片の軽鎖（ＬＣ）フレームワーク領域に対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性又は１００％の同一性）を有するフレームワーク領域と、無関係なＬＣ ＣＤＲのセットとを含むＬＣ、及び（ｉｉ）標的抗体又は抗体断片の重鎖（ＨＣ）フレームワーク領域に対して少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性又は１００％の同一性）を有するフレームワーク領域と、無関係なＨＣ ＣＤＲのセットとを含むＨＣを含むＦａｂ断片である。
【0092】
いくつかの態様では、標的タンパク質の１つ以上の望ましくない結合部位を含む対照タンパク質は、（ｉ）標的タンパク質の軽鎖（ＬＣ）フレームワーク領域に対して少なくとも８５％の同一性を有するフレームワーク領域と、無関係なＬＣ ＣＤＲのセットとを含むＬＣ、及び（ｉｉ）標的タンパク質の重鎖（ＨＣ）フレームワーク領域に対して少なくとも８５％の同一性を有するフレームワーク領域と、無関係なＨＣ ＣＤＲのセットとを含むＨＣ、とを含むＦａｂ断片である。
【0093】
無関係なＬＣ ＣＤＲ及び無関係なＨＣ ＣＤＲは、例えば、標的抗体又は抗体断片のエピトープに結合しない任意の抗体のＣＤＲであり得る。あるいは、無関係なＬＣ ＣＤＲ及び無関係なＨＣ ＣＤＲは、例えば、標的抗体又は抗体断片のエピトープに結合する抗体のＣＤＲであり得、ＣＤＲは、標的抗体のＣＤＲと実質的な配列類似性を共有せず、例えば、標的抗体のＣＤＲと７０％未満の同一性を有する（例えば、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％未満の同一性）。いくつかの態様では、無関係なＬＣ ＣＤＲ及び無関係なＨＣ ＣＤＲは、抗ｇＤモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＣＤＲである。いくつかの態様では、抗ｇＤ ｍＡｂは５Ｂ６である。いくつかの態様では、無関係なＬＣ又はＨＣ ＣＤＲは、表１に提供されるＣＤＲ断片である。
【表1】
【0094】
ｉｉ． 非抗体対照タンパク質
標的タンパク質が抗体又は抗体断片でない態様では、対照タンパク質は、例えば、（ｉ）所望の領域を欠く標的タンパク質のバージョン（例えば、所望の領域を含む１つ以上のドメイン、構造若しくはモチーフを欠く（例えば、欠落するように改変されている）標的タンパク質のバージョン、又は所望の領域を含むアミノ酸が無関係のアミノ酸で置き換えられている標的タンパク質のバージョン）；（ｉｉ）標的タンパク質に関連し、所望の領域を含まないタンパク質（例えば、標的タンパク質のオーソログ又はホモログ）；又は（ｉｉｉ）無関係な対照タンパク質であり得る。無関係な対照タンパク質には、標的タンパク質の所望の領域と構造的又は機能的類似性を有するドメイン、構造、又はモチーフを有しないタンパク質、例えば、そのようなドメイン、構造、又はモチーフを有しない標的タンパク質のファミリーのタンパク質が含まれる。
標的タンパク質が抗体又は抗体断片でない態様では、対照タンパク質は、例えば、（ｉ）所望の領域を欠く標的タンパク質のバージョン（例えば、所望の領域を含む１つ以上のドメイン、構造若しくはモチーフを欠く（例えば、欠落するように改変されている）標的タンパク質のバージョン、又は所望の領域を含むアミノ酸が無関係のアミノ酸で置き換えられている標的タンパク質のバージョン）；（ｉｉ）標的タンパク質に関連し、所望の領域を含まないタンパク質（例えば、標的タンパク質のオーソログ又はホモログ）；又は（ｉｉｉ）無関係な対照タンパク質であり得る。無関係な対照タンパク質には、標的タンパク質の所望の領域と構造的又は機能的類似性を有するドメイン、構造、又はモチーフを有しないタンパク質、例えば、そのようなドメイン、構造、又はモチーフを有しない標的タンパク質のファミリーのタンパク質が含まれる。
【0095】
Ｆ． Ｂ細胞培養
本明細書に記載される方法のいくつかの態様では、本方法は、工程（ｂ）の分離されたＩｇＧ＋Ｂ細胞を個別に培養する工程（ｃ）を含む。いくつかの態様では、細胞は、馴化培地、例えば、ｒｂＴＳＮにおいて培養される。いくつかの態様では、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９：ｅ８６１８４，２０１４及び国際公開第２０１３／０７６１３９号に記載されているように、フィーダー細胞を含む馴化培地で細胞を培養する。
本明細書に記載される方法のいくつかの態様では、本方法は、工程（ｂ）の分離されたＩｇＧ＋Ｂ細胞を個別に培養する工程（ｃ）を含む。いくつかの態様では、細胞は、馴化培地、例えば、ｒｂＴＳＮにおいて培養される。いくつかの態様では、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９：ｅ８６１８４，２０１４及び国際公開第２０１３／０７６１３９号に記載されているように、フィーダー細胞を含む馴化培地で細胞を培養する。
【0096】
いくつかの態様では、培養工程におけるＩｇＧ＋Ｂ細胞の生存率は、少なくとも４０％であり、例えば、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％であるか、又は９５％より大きい。いくつかの態様では、ＩｇＧ＋Ｂ細胞の生存率は約５０％～８０％である。
【0097】
Ｇ． 標的タンパク質の所望の領域に結合する抗体を産生するＩｇＧ＋Ｂ細胞を同定する方法
本明細書に記載される方法のいくつかの態様では、方法の工程（ｄ）は、（ｉ）標的タンパク質又はその断片、及び（ｉｉ）対照タンパク質（例えば、本明細書のセクションＩＩＥに記載の対照タンパク質）の両方に対する上清の親和性を評価するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行うことを含む。個々の実験のための適切なカットオフ閾値（例えば、光学濃度（ＯＤ）閾値）は、例えば、上清中の抗体の濃度、バックグラウンド結合のレベル、及びスクリーニングされるクローンの数に基づいて決定され得る。
本明細書に記載される方法のいくつかの態様では、方法の工程（ｄ）は、（ｉ）標的タンパク質又はその断片、及び（ｉｉ）対照タンパク質（例えば、本明細書のセクションＩＩＥに記載の対照タンパク質）の両方に対する上清の親和性を評価するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行うことを含む。個々の実験のための適切なカットオフ閾値（例えば、光学濃度（ＯＤ）閾値）は、例えば、上清中の抗体の濃度、バックグラウンド結合のレベル、及びスクリーニングされるクローンの数に基づいて決定され得る。
【0098】
Ｈ． ＩｇＧ＋Ｂ細胞のクローニング方法
本明細書に提供される方法のいくつかの態様では、（ｅ）標的タンパク質の所望の領域に結合する抗体を産生すると同定されている１つ以上のＩｇＧ＋Ｂ細胞のＶＨ領域及びＶＬ領域をクローニングすることを更に含む。
本明細書に提供される方法のいくつかの態様では、（ｅ）標的タンパク質の所望の領域に結合する抗体を産生すると同定されている１つ以上のＩｇＧ＋Ｂ細胞のＶＨ領域及びＶＬ領域をクローニングすることを更に含む。
【0099】
Ｉ． 抗体ライブラリの特性
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、標的タンパク質の所望の領域に結合する複数の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００個の抗体（例えば、５～２５、２５～５０、５０～７５、又は７５～１００個の抗体）が産生される。いくつかの態様では、少なくとも１００個の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００個の抗体（例えば、１５０～２５０、２５０～３５０、３５０～４５０、又は４５０～５００抗体）が産生される。いくつかの態様では、少なくとも５００個の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０個又は１０００個の抗体（例えば、５５０～６５０、６５０～７５０、７５０～８５０、８５０～９５０又は９５０～１０００の抗体）が産生される。いくつかの態様では、少なくとも１０００個の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００又は１００００個の抗体（例えば、１５００～２５００、２５００～３５００、３５００～４５００、４５００～５５００、５５００～６５００、６５００～７５００、７５００～８５００、８５００～９５００、又は９５００～１０，０００の抗体）が産生される。いくつかの態様では、少なくとも１０，０００個の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００又は２０，０００個の抗体（例えば、１０，５００～１１，５００、１１，５００～１２，５００、１２，５００～１３，５００、１３，５００～１４，５００、１４，５００～１５，５００、１５，５００～１６，５００、１６，５００～１７，５００、１７，５００～１８，５００、１８，５００～１９，５００、又は１９，５００～２０，０００の抗体）が産生される。いくつかの態様では、少なくとも２０，０００個の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも２０，５００、２１，０００、２１，５００、２２，０００、２２，５００、２３，０００、２３，５００、２４，０００、２４，５００、２５，０００、２５，５００、２６，０００、２６，５００、２７，０００、２７，５００、２８，０００、２８，５００、２９，０００、２９，５００、又は３０，０００個の抗体（例えば、２０，５００～２１，５００、２１，５００～２２，５００、２２，５００～２３，５００、２３，５００～２４，５００、２４，５００～２５，５００、２５，５００～２６，５００、２６，５００～２７，５００、２７，５００～２８，５００、２８，５００～２９，５００、又は２９，５００～３０，０００の抗体）が産生される。いくつかの態様では、少なくとも３０，０００個の抗体が産生される。
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、標的タンパク質の所望の領域に結合する複数の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００個の抗体（例えば、５～２５、２５～５０、５０～７５、又は７５～１００個の抗体）が産生される。いくつかの態様では、少なくとも１００個の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００個の抗体（例えば、１５０～２５０、２５０～３５０、３５０～４５０、又は４５０～５００抗体）が産生される。いくつかの態様では、少なくとも５００個の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０個又は１０００個の抗体（例えば、５５０～６５０、６５０～７５０、７５０～８５０、８５０～９５０又は９５０～１０００の抗体）が産生される。いくつかの態様では、少なくとも１０００個の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００又は１００００個の抗体（例えば、１５００～２５００、２５００～３５００、３５００～４５００、４５００～５５００、５５００～６５００、６５００～７５００、７５００～８５００、８５００～９５００、又は９５００～１０，０００の抗体）が産生される。いくつかの態様では、少なくとも１０，０００個の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００又は２０，０００個の抗体（例えば、１０，５００～１１，５００、１１，５００～１２，５００、１２，５００～１３，５００、１３，５００～１４，５００、１４，５００～１５，５００、１５，５００～１６，５００、１６，５００～１７，５００、１７，５００～１８，５００、１８，５００～１９，５００、又は１９，５００～２０，０００の抗体）が産生される。いくつかの態様では、少なくとも２０，０００個の抗体が産生される。いくつかの態様では、少なくとも２０，５００、２１，０００、２１，５００、２２，０００、２２，５００、２３，０００、２３，５００、２４，０００、２４，５００、２５，０００、２５，５００、２６，０００、２６，５００、２７，０００、２７，５００、２８，０００、２８，５００、２９，０００、２９，５００、又は３０，０００個の抗体（例えば、２０，５００～２１，５００、２１，５００～２２，５００、２２，５００～２３，５００、２３，５００～２４，５００、２４，５００～２５，５００、２５，５００～２６，５００、２６，５００～２７，５００、２７，５００～２８，５００、２８，５００～２９，５００、又は２９，５００～３０，０００の抗体）が産生される。いくつかの態様では、少なくとも３０，０００個の抗体が産生される。
【0100】
本明細書中に記載される方法のいくつかの態様では、産生される抗体の少なくとも５０％（例えば、産生された抗体の少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％）がユニークである。
【0101】
いくつかの態様では、複数の抗体（例えば、複数の抗体の少なくともサブセット、例えば、抗体の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％）は、約２００ｎＭ以下、例えば約１７５ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１２５ｎＭ以下、１００ｎＭ以下又は７５ｎＭ以下のＫＤで標的タンパク質の所望の領域に結合する。いくつかの態様では、複数の抗体のサブセットは、約５０ｎＭ以下、例えば約４５ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３５ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、又は１５ｎＭ以下のＫＤで標的タンパク質の所望の領域に結合する。いくつかの態様では、複数の抗体のサブセットは、約１０ｎＭ以下、例えば約９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、又は１．５ｎＭ以下のＫＤで標的タンパク質の所望の領域に結合する。いくつかの態様では、複数の抗体のサブセットは、約１ｎＭ以下、例えば約０．９ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、又は０．１５ｎＭ以下のＫＤで標的タンパク質の所望の領域に結合する。いくつかの態様では、複数の抗体のサブセットは、約０．１ｎＭ以下、例えば、約０．０９ｎＭ以下、０．０８ｎＭ以下、０．０７ｎＭ以下、０．０６ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、０．０４ｎＭ以下、０．０３ｎＭ以下、０．０２ｎＭ以下、又は０．０１５ｎＭのＫＤで標的タンパク質の所望の領域に結合する。いくつかの態様では、複数の抗体のサブセットは、約０．０１ｎＭ以下、例えば約０．００９ｎＭ以下、０．００８ｎＭ以下、０．００７ｎＭ以下、０．００６ｎＭ以下、０．００５ｎＭ以下、０．００４ｎＭ以下、０．００３ｎＭ以下、０．００２ｎＭ以下、又は０．００１ｎＭ以下のＫＤで標的タンパク質の所望の領域に結合する。
【0102】
標的タンパク質が抗体又は抗体断片であるいくつかの態様では、複数の抗体は少なくとも１つの抗原遮断抗体（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、又は１００を超える抗原遮断抗体）を含む。抗原遮断抗体は、標的抗体又は抗体断片のパラトープに結合し、抗原結合を妨害し、したがって、遊離標的抗体又は抗体断片の検出に有用である。
【0103】
標的タンパク質が抗体又は抗体断片であるいくつかの態様では、複数の抗体は少なくとも１つの抗原非遮断抗体（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、又は１００を超える抗原非遮断抗体）を含む。抗原非遮断抗体は、標的抗体又は抗体断片のパラトープの外側に結合し、抗原の結合を遮断しないため、遊離標的抗体又は抗体断片の検出に有用であり、おそらく抗原によって部分的又は完全に結合した標的抗体又は抗体断片の検出に有用である。いくつかの態様では、抗原遮断抗体は抗原抗体複合体に結合する。他の態様では、抗原遮断抗体は抗原抗体複合体に結合しない。
【0104】
本明細書で提供される方法のいくつかの態様では、工程（ｃ）のＩｇＧ＋Ｂ細胞は、本明細書で提供される方法に従ってＩｇＧ＋Ｂ細胞について試料を濃縮する工程を含まない方法を使用して単離されたＩｇＧ＋Ｂ細胞と比較して増加した生存率を有し、例えば、本明細書で提供される方法に従ってＩｇＧ＋Ｂ細胞について試料を濃縮する工程を含まない方法を使用して単離されたＩｇＧ＋Ｂ細胞と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％増加した生存率を有する。
【0105】
本明細書で提供される方法のいくつかの態様では、工程（ａ）～（ｅ）は、約１０～１４週間以内に行われ、例えば、約１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、又は１４週間以内に行われる。いくつかの態様では、工程（ａ）～（ｅ）は１２週間以内に行われる。
【実施例】
【0106】
ＩＩＩ．実施例
以下は、本発明の方法、使用及び組成物の例である。上記に提供された一般的な記述を考慮すると、様々な他の態様が実施され得ることが理解され、その例は特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。
以下は、本発明の方法、使用及び組成物の例である。上記に提供された一般的な記述を考慮すると、様々な他の態様が実施され得ることが理解され、その例は特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。
【0107】
実施例１．ｉｎ ｖｉｔｒｏクローン増殖培養のためのＡｂ１特異的単一ウサギＩｇＧ＋Ｂ細胞を単離するための効率的なワークフロー
治療用抗体（Ａｂ１）ＣＤＲ特異的抗ＩＤ（Ａｂ２）発見のための最適化ウサギ単一Ｂ細胞選別培養及びクローニング方法が開発され、これは、（１）選別前のＩｇＧ＋細胞濃縮、（２）Ａｂ１フレームワーク特異的Ｂ細胞を排除するための「陰性ゲート」として設計されたＡｂ１フレームワーク対照Ｆａｂ（Ａｂ１ｃｔｒｌＦａｂ）を使用した陰性選択、（３）Ｂ細胞培養上清のスクリーニングスループットを高めるための統合ロボットシステムの使用、及び（４）フォローアップの迅速なクローニング及び組換えＩｇＧ発現のためのスクリーニングにおける保存Ｂ細胞の４つの段階を含んだ。この手法は、抗ＩＤの大きなパネルを日常的にかつ高い成功度で作製することを可能にする。以前の抗体発見アプローチと比較して、新たなプラットフォームは、高い程度のＡｂ１－ＣＤＲ特異性及びより多様なエピトープを有する高親和性抗ＩＤをわずかな時間で一貫して効果的に送達し、組換え治療用抗体（Ａｂ１）プロジェクトを支援する生物分析プログラムに有形の利益を提供する。
治療用抗体（Ａｂ１）ＣＤＲ特異的抗ＩＤ（Ａｂ２）発見のための最適化ウサギ単一Ｂ細胞選別培養及びクローニング方法が開発され、これは、（１）選別前のＩｇＧ＋細胞濃縮、（２）Ａｂ１フレームワーク特異的Ｂ細胞を排除するための「陰性ゲート」として設計されたＡｂ１フレームワーク対照Ｆａｂ（Ａｂ１ｃｔｒｌＦａｂ）を使用した陰性選択、（３）Ｂ細胞培養上清のスクリーニングスループットを高めるための統合ロボットシステムの使用、及び（４）フォローアップの迅速なクローニング及び組換えＩｇＧ発現のためのスクリーニングにおける保存Ｂ細胞の４つの段階を含んだ。この手法は、抗ＩＤの大きなパネルを日常的にかつ高い成功度で作製することを可能にする。以前の抗体発見アプローチと比較して、新たなプラットフォームは、高い程度のＡｂ１－ＣＤＲ特異性及びより多様なエピトープを有する高親和性抗ＩＤをわずかな時間で一貫して効果的に送達し、組換え治療用抗体（Ａｂ１）プロジェクトを支援する生物分析プログラムに有形の利益を提供する。
【0108】
この新規アプローチを使用して、プロセスにおいて同定されているクローンの数にかかわらず、高い配列多様性（＞５５％）及び広い親和性範囲（低ｐＭ～高ｎＭ）を有する抗ＩＤの作製と共に、ユニークＡｂ１を使用する１１個のプロジェクトが首尾よく達成された（表２）。組換え抗ＩＤは、ウサギ免疫化の開始から１２週間以内に薬物動態及び免疫原性研究を支援するためのアッセイ開発に利用可能であった。ここでは、プロジェクトＥに関連する詳細が例示的な例として強調されている。
【表2】
【0109】
Ａ． ウサギ免疫及びポリクローナル血清力価の確認
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｒｅｇｏｎ Ｒａｂｂｉｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（ＷＯＲＣ）から購入したＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ（ＮＺＷ）ウサギを、地元の契約研究機関において標的抗体の抗原結合断片（Ａｂ１ Ｆａｂ）で免疫した。各プロジェクトにおける３匹のウサギを、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と１：１混合物で製剤化したＡｂ１ Ｆａｂ（５００μｇ）で、ウサギの背部に沿った皮下（ＳＣ）注射及び皮内（ＩＤ）注射によって免疫化した。１：１混合物中の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と製剤化したＡｂ１Ｆａｂの３つの更なる追加免疫（２５０μｇ）を、一次免疫の３週間後にＳＣ注射によって投与した。Ｆａｂ免疫原アプローチは、抗原決定基としての定常ＨＣ、ＣＨ２及びＣＨ３の提示を介した抗体の定常領域に対する望ましくない反応性を回避するためだけでなく、Ｆｃ配列がウサギＢ細胞選別中に非特異的相互作用を引き起こすのを防ぐためにも選択された。
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｒｅｇｏｎ Ｒａｂｂｉｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（ＷＯＲＣ）から購入したＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ（ＮＺＷ）ウサギを、地元の契約研究機関において標的抗体の抗原結合断片（Ａｂ１ Ｆａｂ）で免疫した。各プロジェクトにおける３匹のウサギを、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と１：１混合物で製剤化したＡｂ１ Ｆａｂ（５００μｇ）で、ウサギの背部に沿った皮下（ＳＣ）注射及び皮内（ＩＤ）注射によって免疫化した。１：１混合物中の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と製剤化したＡｂ１Ｆａｂの３つの更なる追加免疫（２５０μｇ）を、一次免疫の３週間後にＳＣ注射によって投与した。Ｆａｂ免疫原アプローチは、抗原決定基としての定常ＨＣ、ＣＨ２及びＣＨ３の提示を介した抗体の定常領域に対する望ましくない反応性を回避するためだけでなく、Ｆｃ配列がウサギＢ細胞選別中に非特異的相互作用を引き起こすのを防ぐためにも選択された。
【0110】
標準的なＥＬＩＳＡプロトコルを使用して、以下のように、免疫化期間中に抗Ａｂ１ Ｆａｂポリクローナル血清力価をモニターした：最初に、９６ウェルＮＵＮＣ（商標）ＭＩＣＲＯＷＥＬＬ（商標）マイクロタイタープレートを、コーティング緩衝液（０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中のＡｂ１Ｆａｂ（１μｇ／ｍＬ）で４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートをアッセイバッファー（１×ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ及び０．０５％ポリソルベート２０）でブロッキングした後、ウサギ血清の段階希釈と共に１時間インキュベートした。結合を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（１２－３４８、Ｓｉｇｍａ）に結合体化されたヤギ抗ウサギＩｇＧをＴＭＢ基質（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．）と共に使用して検出し、５分後にＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＳＴＰ－１０００－０１、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．）によって反応を停止させ、６５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）読み取りを行った。
【0111】
プロジェクトＥでは、ワークフローはＡｂ１ Ｆａｂによる８週間の免疫化で開始され（図１Ａ）、３匹のウサギは強力な抗Ａｂ１血清ＩｇＧ力価を示し、最大１：１，０００，０００希釈因子で正の結合を示し、ロバストなＡｂ１免疫化を実証した（図１Ｃ）。
【0112】
Ｂ． ＰＢＭＣ単離及びＩｇＧ＋Ｂ細胞濃縮
この実施例は、マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の前にＧ＋Ｂ細胞を濃縮し、したがって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの抗原特異的ＩｇＧ＋Ｂ細胞の同定効率を改善し、ＦＡＣＳ選別プロセス時間を短縮する方法を記載する。
この実施例は、マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の前にＧ＋Ｂ細胞を濃縮し、したがって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの抗原特異的ＩｇＧ＋Ｂ細胞の同定効率を改善し、ＦＡＣＳ選別プロセス時間を短縮する方法を記載する。
【0113】
このアプローチの目的は、ＭＡＣＳビーズベースの陰性選択戦略を使用して、ＰＢＭＣからＩｇＭ Ｂ細胞、骨髄細胞、及びＴ細胞を含む非ＩｇＧ＋Ｂ細胞を排除することであった。この陰性選択濃縮アプローチは、非ＩｇＧ Ｂ細胞を排除するためにＦＡＣＳ選別中の「ダンプチャネル」選択よりも効率的であり、潜在的な活性化誘導細胞死を回避すると考えられている。この方法は、ＩｇＧ＋Ｂ細胞集団を最大２５倍増加させ、選別時間も短縮し（プレートあたり３～３０分対プレートあたり３０～９０分）、Ｂ細胞生存率を潜在的に改善した。
【0114】
ＬＹＭＰＨＯＬＹＴＥ（登録商標）－Ｍ（ＣＬ５０３０、ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ（登録商標））を用いて、ウサギ耳動脈から採取した血液（ＰＢＳで１：１希釈）の密度遠心分離によりウサギ末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＳで洗浄した後、Ｓｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９：ｅ８６１８４，２０１４に記載されているように、ＰＢＭＣをサプリメントを含む培養培地ＲＰＭＩに再懸濁し、６ウェルプレートに移して、プレート上への非特異的接着を通してマクロファージ及び単球を除去した。次いで、Ｂ細胞濃縮のために非接着細胞を回収した。試料を、高度に選択的なプロファイルを有する市販のビオチン化抗体：抗ウサギＣＤ１１ｂ抗体（ＭＣＡ８０２ＧＡ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、抗ウサギＴリンパ球抗体（ＭＣＡ８００ＧＡ、ＢｉｏＲａｄ）、及び抗ウサギＩｇＭ抗体（５５０９３８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する抗体カクテルと共にインキュベートした。次いで、試料をストレプトアビジン被覆磁気ビーズの存在下でＭＡＣＳ（登録商標）カラム（１３０－０４２－４０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に通した。ビオチン化抗体に結合した細胞のみが、磁場を印加したカラムを通過するときにビーズに結合した：したがって、ウサギ骨髄細胞、Ｔ細胞及びＩｇＭ Ｂ細胞は、このプロセスによって試料から枯渇した。ＩｇＧ＋Ｂ細胞を含む未結合細胞は、カラムを通過することができ、したがってプロセスによって濃縮された（図１Ｂ）。
【0115】
Ｃ． Ａｂ１ ＣＤＲ特異的ＩｇＧ＋Ｂ細胞単一細胞選別及び培養
濃縮ウサギＩｇＧ＋Ｂ細胞をＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＳＴＡＲ１２１Ｆ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で染色し、染色緩衝液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）中でＲＰＥ標識Ａｂ１ Ｆａｂ及びＡＰＣ標識Ａｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ（実施例２）と４℃で２０分間接触させた。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ選別）の前に、細胞を洗浄し、５μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ；５５６４６３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する染色緩衝液に再懸濁して、死細胞と生細胞との間の分化を可能にした。Ａｂ１特異的ＩｇＧ＋単一Ｂ細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ（商標）選別機（ＢＤ）を使用して選別した。試料を最初に生（ＰＩ－）、ＩｇＧ＋（ＦＩＴＣ＋）細胞上でゲートし、次いで、Ｘ軸上にＲＰＥ標識Ａｂ１ Ｆａｂシグナル、及びＹ軸上にＡＰＣ標識Ａｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂシグナルを示すプロット上に表示した（図１Ｂ）。
濃縮ウサギＩｇＧ＋Ｂ細胞をＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＳＴＡＲ１２１Ｆ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で染色し、染色緩衝液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）中でＲＰＥ標識Ａｂ１ Ｆａｂ及びＡＰＣ標識Ａｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ（実施例２）と４℃で２０分間接触させた。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ選別）の前に、細胞を洗浄し、５μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ；５５６４６３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する染色緩衝液に再懸濁して、死細胞と生細胞との間の分化を可能にした。Ａｂ１特異的ＩｇＧ＋単一Ｂ細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ（商標）選別機（ＢＤ）を使用して選別した。試料を最初に生（ＰＩ－）、ＩｇＧ＋（ＦＩＴＣ＋）細胞上でゲートし、次いで、Ｘ軸上にＲＰＥ標識Ａｂ１ Ｆａｂシグナル、及びＹ軸上にＡＰＣ標識Ａｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂシグナルを示すプロット上に表示した（図１Ｂ）。
【0116】
ＲＰＥ＋、ＡＰＣ－集団からの単一Ｂ細胞を、馴化培地（ｒｂＴＳＮ）及びフィーダー細胞を含む９６ウェルプレートに文字通り選別し、以前記載されたように（Ｓｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９：ｅ８６１８４，２０１４）（図１Ａ）、３７℃で７日間培養した（ｉｎ ｖｉｔｒｏクローン増殖）。フィーダー細胞は、ＣＤ４０リガンド結合を提供し、ウサギ胸腺細胞及び単球のマイトジェン－ＰＭＡ刺激共培養から作製されたｒｂＴＳＮは、Ｂ細胞の増殖及び分化に必要なサイトカインを供給した（Ｓｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９：ｅ８６１８４，２０１４）。
【0117】
最適なＢ細胞培養条件は、個々のＢ細胞生存率及び抗体分泌形質細胞への分化を推進する重要な因子の１つであることが観察された。ＩｇＧ＋クローンの全生存率はプロジェクト全体で５０～８０％であり、平均ＩｇＧ上清濃度は約２～３μｇ／ｍＬであった。培養されたウサギＢ細胞に由来する上清は、分子クローニング前に所望のＡｂ１ Ｆａｂ＋及びＡｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ－表現型を有するクローンを確認するための一次ＥＬＩＳＡスクリーニングの以下の工程のための最も不可欠な資源であった（図１Ａ）。
【0118】
実施例２．Ａｂ１及びＡｂ１フレームワーク制御（Ａｂ１ｃｔｒｌ）Ｆａｂの調製及び標識
各Ａｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ（ヒトコンセンサスフレームワーク対照とも呼ばれる）を、所与の位置で最も優勢なアミノ酸残基を選択することによって、ヒトフレームワーク生殖系列遺伝子の個々のセットから誘導した。全てのヒトコンセンサスフレームワーク対照のＣＤＲを無関係な抗ｇＤタグ抗体で模倣して、Ａｂ１ ＣＤＲに特異的に抗ＩＤ選択を誘導した。Ａｂ１フレームワーク対照Ｆａｂ（Ａｂ１ｃｔｒｌＦａｂ）を、無関係の抗ｇＤ ｍＡｂ（５Ｂ６；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）を４つのヒトＬＣ（ｈＩＧＫＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４又はＫ１／Ｋ２／Ｋ３／Ｋ４）及び４つのヒトＨＣ（ｈＩＧＨＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４又はＨ１／Ｈ２／Ｈ３／Ｈ４）コンセンサスフレームワークにそれぞれグラフトすることによって設計した。コンセンサスフレームワークは、天然のヒト抗体レパートリーで最も頻繁に使用されるヒトフレームワーク生殖系列遺伝子の所与の位置で最も優勢なアミノ酸残基を選択することによって決定した（Ｉｐｐｏｌｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７：ｅ３５４９７，２０１２；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２７：２０９－２１２，１９９９）。１６個のＡｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ断片の全組合せ（ＫｎＨｎ、ｎ＝１／２／３／４）をＥＸＰＩ２９３Ｆ（商標）細胞（Ａ１４５２８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で一過性に発現させ、以前に報告されているようにプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー（１７０８８６０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した（Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１１２：１８３２－１８４２，２０１５）。
各Ａｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ（ヒトコンセンサスフレームワーク対照とも呼ばれる）を、所与の位置で最も優勢なアミノ酸残基を選択することによって、ヒトフレームワーク生殖系列遺伝子の個々のセットから誘導した。全てのヒトコンセンサスフレームワーク対照のＣＤＲを無関係な抗ｇＤタグ抗体で模倣して、Ａｂ１ ＣＤＲに特異的に抗ＩＤ選択を誘導した。Ａｂ１フレームワーク対照Ｆａｂ（Ａｂ１ｃｔｒｌＦａｂ）を、無関係の抗ｇＤ ｍＡｂ（５Ｂ６；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）を４つのヒトＬＣ（ｈＩＧＫＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４又はＫ１／Ｋ２／Ｋ３／Ｋ４）及び４つのヒトＨＣ（ｈＩＧＨＶ１／Ｖ２／Ｖ３／Ｖ４又はＨ１／Ｈ２／Ｈ３／Ｈ４）コンセンサスフレームワークにそれぞれグラフトすることによって設計した。コンセンサスフレームワークは、天然のヒト抗体レパートリーで最も頻繁に使用されるヒトフレームワーク生殖系列遺伝子の所与の位置で最も優勢なアミノ酸残基を選択することによって決定した（Ｉｐｐｏｌｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７：ｅ３５４９７，２０１２；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２７：２０９－２１２，１９９９）。１６個のＡｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ断片の全組合せ（ＫｎＨｎ、ｎ＝１／２／３／４）をＥＸＰＩ２９３Ｆ（商標）細胞（Ａ１４５２８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で一過性に発現させ、以前に報告されているようにプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー（１７０８８６０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した（Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１１２：１８３２－１８４２，２０１５）。
【0119】
表２は、各プロジェクト由来のＡｂ１軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）ヒトフレームワーク生殖系列を示す。最も高い配列同一性を有する最も近いヒトコンセンサスフレームワーク対照を選択して、選択を誘導した。例えば、プロジェクトＥでは、Ａｂ１フレームワーク生殖系列のＬＣ（ｈＩＧＫＶ１－１６）及びＨＣ（ｈＩＧＨＶ３－２３）を、それぞれ４つ全ての設計されたヒトＬＣコンセンサスフレームワーク（ｈＩＧＫＶ１～ｈＩＧＫＶ４）、及び４つのヒトＨＣコンセンサスフレームワーク（ｈＩＧＨＶ１～ｈＩＧＨＶ４）と整列させて、配列の差を比較した（図２Ａ及び２Ｂ）。コンセンサスフレームワーク制御の配列を表１に示す。ｈＩＧＫＶ１（Ｋ１）及びｈＩＧＨＶ３（Ｈ３）コンセンサスフレームワークは、Ａｂ１フレームワーク生殖系列ＬＣ及びＨＣ配列に対して最大の配列同一性を有していた（それぞれ１００％及び９８％の同一性）：したがって、Ｋ１Ｈ３コンセンサスフレームワークを、ＦＡＣＳ選別におけるフレームワーク特異的Ｂ細胞を排除するための陰性ゲートとして、及び培養上清一次ＥＬＩＳＡスクリーニングにおける陰性対照として使用するためのプロジェクトＥに対する適切なＡｂ１ｃｔｒｌＦａｂとして選択した（図１Ａ）。
【0120】
リジルエンドペプチダーゼ（１２９－０２５４１、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）消化、続いてプロテインＬ－アガロースカラム精製（Ｗｒａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８７：４３３３１－４３３３９，２０１２）によって、治療用ＩｇＧ抗体の抗原結合断片（Ａｂ１ Ｆａｂ）を調製した。
【0121】
蛍光標識のために、Ａｂ１及びＡｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ断片を、製造業者の説明書に従って、それぞれＲ－フィコエリトリン（ＲＰＥ；７０３－０００３、Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ；７０５－００３０、Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とコンジュゲートさせた。
【0122】
４つのヒトＩｇＧカッパＬＣファミリー（κ１－κ４）及び４つのヒトＨＣファミリー（ＶＨ１－ＶＨ４）を組み合わせたヒトコンセンサスフレームワーク設計を展開する概念は、ここで非常に有益であり、ラムダＬＣ及び他のＨＣ等の他の抗体ファミリーに容易に適用可能であることが示された。
【0123】
実施例３．組換えクローニングのためのＡｂ１特異的クローンを同定するためのハイスループットスクリーニング
Ａｂ１特異的クローンをハイスループット（ＨＴＰ）様式でスクリーニングするために、多機能アッセイを１つのプロトコルに組み込んだロボットシステムを社内で確立した。このシステムにより、複数の抗原結合アッセイを同時に実行して、Ｂ細胞培養上清の大きなパネル（＞５０ ９６ウェルプレート）のスクリーニングを１日で処理することが可能になった。このシステムを構築する利点は、高速でロバストな抗体スクリーニングプラットフォームを提供するだけでなく、下流の処理時間を節約するために不要なクローンを排除することである。
Ａｂ１特異的クローンをハイスループット（ＨＴＰ）様式でスクリーニングするために、多機能アッセイを１つのプロトコルに組み込んだロボットシステムを社内で確立した。このシステムにより、複数の抗原結合アッセイを同時に実行して、Ｂ細胞培養上清の大きなパネル（＞５０ ９６ウェルプレート）のスクリーニングを１日で処理することが可能になった。このシステムを構築する利点は、高速でロバストな抗体スクリーニングプラットフォームを提供するだけでなく、下流の処理時間を節約するために不要なクローンを排除することである。
【0124】
いくつかのプロジェクト（プロジェクトＢ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＩ）では、おそらくそれらの標的に対するＣＤＲの低い免疫原性のために、一次ＥＬＩＳＡスクリーニング後のより低い抗ＩＤ収量が観察された。しかしながら、プロジェクトＥの事例研究で例示されるように、ウサギ単一Ｂ細胞選別培養及びクローニング技術の力により、これらのプロジェクトにおける弱い免疫応答は、多様な機能を有する十分な数の抗ＩＤを送達し、下流アッセイ開発努力を十分に供給することによって補償された。このプラットフォームを使用して生成された抗ＩＤの大部分の強い一価結合親和性は、低ｐＭから低ｎＭに及ぶ１１個のプロジェクト全てにおいて、更なる親和性成熟なしにアッセイ性能要件を満たすのに十分に感受性であった。
【0125】
Ａ． Ａｂ１ ＣＤＲ特異的ＩｇＧ＋Ｂ細胞単一細胞スクリーニング
実施例１Ｃの培養工程の後、Ｂ細胞培養上清をハイスループットロボットシステム（ＢｉｏＣｅｌシステム、Ａｇｉｌｅｎｔ）によって３８４ウェルマイクロプレートに移して、実施例１Ａに記載の標準的ＥＬＩＳＡプロトコルを用いてＡｂ１ Ｆａｂ及びＡｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ結合についてスクリーニングした。Ａｂ１ Ｆａｂに結合し（Ａｂ１ Ｆａｂ＋）、Ａｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂに結合しなかった上清を有するクローン（Ａｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ－）は、Ａｂ１ ＣＤＲ特異的抗イディオタイプクローン（Ａｂ２）であると考えられ、分子クローニングのために元のＲＬＴ溶解緩衝液（７９２１６、Ｑｉａｇｅｎ）処理ソースプレートから慎重に採取した。
実施例１Ｃの培養工程の後、Ｂ細胞培養上清をハイスループットロボットシステム（ＢｉｏＣｅｌシステム、Ａｇｉｌｅｎｔ）によって３８４ウェルマイクロプレートに移して、実施例１Ａに記載の標準的ＥＬＩＳＡプロトコルを用いてＡｂ１ Ｆａｂ及びＡｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ結合についてスクリーニングした。Ａｂ１ Ｆａｂに結合し（Ａｂ１ Ｆａｂ＋）、Ａｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂに結合しなかった上清を有するクローン（Ａｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ－）は、Ａｂ１ ＣＤＲ特異的抗イディオタイプクローン（Ａｂ２）であると考えられ、分子クローニングのために元のＲＬＴ溶解緩衝液（７９２１６、Ｑｉａｇｅｎ）処理ソースプレートから慎重に採取した。
【0126】
治療薬のフレームワークを模倣するように設計されたヒトコンセンサスフレームワークに陰性選択工程を組み込むことにより、治療薬ＣＤＲのユニークアミノ酸配列に対して高度に特異的な抗ＩＤを選択的に産生する能力が大幅に増強される。モノクローナル抗体治療薬（しばしばヒト化抗体又はヒト抗体）のＣＤＲに特異的に向けられた抗ＩＤは、血清等の生物学的マトリックス中に存在するＡｂ１に類似するＩｇフレームワークを有する過剰量の内因性ヒト免疫グロブリンからの干渉を受けにくい。
【0127】
プロジェクトＥでは、数千のクローンの培養上清を一次ＥＬＩＳＡスクリーニングに供し、クローンの大部分がＡｂ１Ｆａｂに対して陽性であったが（ＯＤ＞０．２５）、Ａｂ１ｃｔｒｌＦａｂに対しては陽性でなかった（ＯＤ＜０．１）（図１Ｄ）。Ａｂ１ Ｆａｂ結合についてのアッセイにおいて有意に強いシグナル（ＯＤ＞１）を示し、Ａｂ１ｃｔｒｌ Ｆａｂ結合についてのアッセイにおいて相対的に１０倍低いシグナル（ＯＤ＜０．１）を示した上位３４個のＡｂ２クローンを、以下に記載されるような分子クローニングのために選択した。
【0128】
Ｂ． Ａｂ２分子クローニング、配列分析及び発現
選択したＡｂ２の分子クローニングについて、最初に、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）９６ ＲＮＡ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（７４０４６６．４、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を製造者の説明書に従って使用して、Ａｂ２クローンの全ＲＮＡを単離した。ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（１８０８０４００、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））を用いて、全ＲＮＡからｍＲＮＡを逆転写することによってｃＤＮＡを調製した。個々のウサギＢ細胞のＶ領域を、以前に記載されたように（Ｓｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９：ｅ８６１８４，２０１４）、ＶＬ領域及びＶＨ領域を標的とするように設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマーと共にＡＣＣＵＰＲＩＭＥ（商標）Ｐｆｘ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（１２３４４０４０、ＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））を使用するＰＣＲ反応によって増幅した。次いで、ＶＬ及びＶＨのＰＣＲ産物を、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）９６ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキット（７４０６５８．１、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いてクリーンアップし、ＩＮ－ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）ＨＤ ＥＣＯＤＲＹ（商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（６３８９１５、Ｔａｋａｒａ）を用いて、ウサギＩｇＧ ＬＣ及びＨＣ定常領域をそれぞれコードする発現ベクターにクローニングした。次いで、配列分析（各フレームワーク及びＣＤＲ領域で動的プログラミングアライメントアルゴリズムによって決定される）及びトランスフェクションのためにＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）９６ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（７４０６１６．４、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用してプラスミドＤＮＡを精製して、組換えウサギＩｇＧを発現させた（Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１１２：１８３２－１８４２，２０１５）。
選択したＡｂ２の分子クローニングについて、最初に、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）９６ ＲＮＡ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（７４０４６６．４、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を製造者の説明書に従って使用して、Ａｂ２クローンの全ＲＮＡを単離した。ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（１８０８０４００、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））を用いて、全ＲＮＡからｍＲＮＡを逆転写することによってｃＤＮＡを調製した。個々のウサギＢ細胞のＶ領域を、以前に記載されたように（Ｓｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９：ｅ８６１８４，２０１４）、ＶＬ領域及びＶＨ領域を標的とするように設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマーと共にＡＣＣＵＰＲＩＭＥ（商標）Ｐｆｘ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（１２３４４０４０、ＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））を使用するＰＣＲ反応によって増幅した。次いで、ＶＬ及びＶＨのＰＣＲ産物を、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）９６ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキット（７４０６５８．１、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いてクリーンアップし、ＩＮ－ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）ＨＤ ＥＣＯＤＲＹ（商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（６３８９１５、Ｔａｋａｒａ）を用いて、ウサギＩｇＧ ＬＣ及びＨＣ定常領域をそれぞれコードする発現ベクターにクローニングした。次いで、配列分析（各フレームワーク及びＣＤＲ領域で動的プログラミングアライメントアルゴリズムによって決定される）及びトランスフェクションのためにＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）９６ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（７４０６１６．４、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用してプラスミドＤＮＡを精製して、組換えウサギＩｇＧを発現させた（Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１１２：１８３２－１８４２，２０１５）。
【0129】
プロジェクトＥにおける配列多様性分析のために、２４個のユニークなクローンのＶＨ及びＶＬの両方のＣＤＲ領域を個別に抽出し、続いて、各ユニークなクローンについて連続ストリングに連結した。次いで、２４残基ストリングを、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗを使用して、局所アラインメントと同等のゼロに設定されたギャップ開放及び伸長ペナルティの両方でアラインメントした（Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２３：２９４７－２９４８，２００７）（図２Ａ及び２Ｂ）。２４個のクローンの配列類似性を可視化するために、図８に示されるように、無根系統樹を作成するため、近隣結合法と共に使用するために配列アラインメント結果を参照した。系統樹の下部に向かう２つのクレードは主に群２のクローンからなることが観察でき、これらが共通の祖先クローンに由来する親和性成熟変異体であり得ることを示唆している。一方、群１及び群３の両方のクローンは、独立して誘導される傾向があり、系統樹に沿って散在した位置をもたらす。
【0130】
Ｃ． Ａｂ２結合親和性についてのＥＬＩＳＡアッセイ
クローニング後に発現したＡｂ２クローンの組換えＩｇＧをＥＬＩＳＡによってＡｂ１特異性について再確認した。Ａｂ２ウサギ抗体（ｒＡｂ）クローンの結合親和性を測定するため、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）－Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。Ｓｅｒｉｅｓ ＳセンサーチッププロテインＡ（２９１２７５５５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を適用して、異なるフローセル（ＦＣ）上の各Ａｂ２クローンを捕捉しておよそ１００応答単位（ＲＵ）を達成し、続いてＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０）中のＡｂ１ Ｆａｂの５倍段階希釈物（０．０３ｎＭ～１００ｎＭ）を２５℃で５０μｌ／分の流速で注入した。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１ラングミュア結合モデル（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン２．０）を用いて計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。
プロジェクトＥでは、クローニング後に発現された２４個のユニークＡｂ２クローンの組換えＩｇＧを上記のようにＡｂ１特異性について評価し、Ａｂ１ Ｆａｂに対する正の結合（ＯＤ＞０．３）、
並びに設計されたＡｂ１ｃｔｒｌＦａｂ（Ｋ１Ｈ３）及び正常ヒト血漿ＩｇＧに由来する他の天然ＩｇＧ Ｆａｂ断片（Ｈｕｃｔｒｌ Ｆａｂ；４０１１１６、Ｓｉｇｍａ）を含む、任意の対照Ｆａｂに対するほぼ検出不能な結合（ＯＤ＜０．０５）を示した（図１Ａ及び１Ｅ）。
クローニング後に発現したＡｂ２クローンの組換えＩｇＧをＥＬＩＳＡによってＡｂ１特異性について再確認した。Ａｂ２ウサギ抗体（ｒＡｂ）クローンの結合親和性を測定するため、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）－Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。Ｓｅｒｉｅｓ ＳセンサーチッププロテインＡ（２９１２７５５５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を適用して、異なるフローセル（ＦＣ）上の各Ａｂ２クローンを捕捉しておよそ１００応答単位（ＲＵ）を達成し、続いてＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０）中のＡｂ１ Ｆａｂの５倍段階希釈物（０．０３ｎＭ～１００ｎＭ）を２５℃で５０μｌ／分の流速で注入した。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１ラングミュア結合モデル（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン２．０）を用いて計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。
プロジェクトＥでは、クローニング後に発現された２４個のユニークＡｂ２クローンの組換えＩｇＧを上記のようにＡｂ１特異性について評価し、Ａｂ１ Ｆａｂに対する正の結合（ＯＤ＞０．３）、
並びに設計されたＡｂ１ｃｔｒｌＦａｂ（Ｋ１Ｈ３）及び正常ヒト血漿ＩｇＧに由来する他の天然ＩｇＧ Ｆａｂ断片（Ｈｕｃｔｒｌ Ｆａｂ；４０１１１６、Ｓｉｇｍａ）を含む、任意の対照Ｆａｂに対するほぼ検出不能な結合（ＯＤ＜０．０５）を示した（図１Ａ及び１Ｅ）。
【0131】
実施例４．抗ＩＤ親和性及びエピトープの特性評価
Ａ． 抗ＩＤ親和性
高親和性抗ＩＤは、抗体薬物（Ａｂ１）のアッセイ開発における望ましいツールである。例えば、架橋アッセイでは、両アームでの表面への潜在的なＡｂ１結合を回避するために、捕捉試薬としての抗ＩＤの低いコーティング密度が必要であり、これはアッセイ感度を低下させる。抗ＩＤの親和性は、この要件を満たすための決定因子である。
Ａ． 抗ＩＤ親和性
高親和性抗ＩＤは、抗体薬物（Ａｂ１）のアッセイ開発における望ましいツールである。例えば、架橋アッセイでは、両アームでの表面への潜在的なＡｂ１結合を回避するために、捕捉試薬としての抗ＩＤの低いコーティング密度が必要であり、これはアッセイ感度を低下させる。抗ＩＤの親和性は、この要件を満たすための決定因子である。
【0132】
Ａｂ２ ｒＡｂクローンの結合親和性を測定するため、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）－Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。Ｓｅｒｉｅｓ ＳセンサーチッププロテインＡ（２９１２７５５５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を適用して、異なるフローセル（ＦＣ）上の各Ａｂ２クローンを捕捉しておよそ１００応答単位（ＲＵ）を達成し、続いてＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０）中のＡｂ１ Ｆａｂの５倍段階希釈物（０．０３ｎＭ～１００ｎＭ）を２５℃で５０μｌ／分の流速で注入した。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１ラングミュア結合モデル（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン２．０）を用いて計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。
【0133】
本明細書中に記載される１１個のユニークＡｂ１抗ＩＤプロジェクトのうちの６個は、一桁のｐＭ親和性を有する抗体をもたらし、残りのプロジェクトは、中～高ｐＭ親和性範囲の親和性を有する抗体をもたらした（表２）。プロジェクトＥでは、抗ＩＤの大部分（２４個中２２個）が＜０．５ｎＭのＡｂ１ Ｆａｂに対する親和性を有し、最良のクローン（１４Ｆ９）は４ｐＭの親和性を有していた（表３）。
【表3】
【0134】
Ｂ． エピトープ特性評価
Ａｂ１は血清中の可溶性又は脱落標的分子（抗原；以後Ａｇと呼ぶ）と相互作用し得ることから、循環中に存在するＡｂ１のいくつかの形態、すなわち遊離した、部分的に結合した、又は完全に結合した形態が存在し得る。したがって、特にＡｂ１と比較したＡｇのモル濃度が、プロジェクトＥ等の治療濃度測定の時点で無視できない場合、所与のアッセイにおいてどの形態のＡｂ１を測定すべきかを積極的に確立することが重要である。
Ａｂ１は血清中の可溶性又は脱落標的分子（抗原；以後Ａｇと呼ぶ）と相互作用し得ることから、循環中に存在するＡｂ１のいくつかの形態、すなわち遊離した、部分的に結合した、又は完全に結合した形態が存在し得る。したがって、特にＡｂ１と比較したＡｇのモル濃度が、プロジェクトＥ等の治療濃度測定の時点で無視できない場合、所与のアッセイにおいてどの形態のＡｂ１を測定すべきかを積極的に確立することが重要である。
【0135】
高感度及びハイスループットＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲを使用して、Ａｇ遮断、Ａｇ非遮断、及びＡｇ＋Ａｂ１複合体としてのＡｇの存在下でのそれらの活性に従って抗ＩＤエピトープ型を分類した（図４）。Ａｇ遮断型は、Ａｂ１のパラトープに結合してＡｇ結合を妨害し、それによって遊離Ａｂ１のみの検出を可能にする抗ＩＤである（例えば、図３Ｂの１８Ｃ９）。対照的に、Ａｇ非遮断型抗ＩＤは、Ａｂ１のパラトープの外側に結合し、それでもＡｇがＡｂ１に結合することを可能にすることから、遊離、場合によっては部分的に結合した、及び完全に結合したＡｂ１を検出するために使用することができる（例えば、図３Ｂの３Ｅ３）。
【0136】
各Ａｂ２クローンのエピトープ型を決定するため、上記の形式（図４）を使用して、各ＦＣ上の個々のＡｂ２ウサギＩｇＧを捕捉した。抗原（Ａｇ）遮断又は非遮断エピトープ研究のため、１００ｎＭ Ａｂ１ Ｆａｂを最初に５分間注入して飽和に達し、続いて２回目の５０ｎＭ Ａｇを３分間注入して結合を検出した（図３Ａ）。Ａｂ１ Ｆａｂ～Ａｂ２とその後のＡｇ～Ａｂ１ Ｆａｂとの間の相互作用を別々に記録して、結合応答（Ａｇ－Ａｂ１ Ｆａｂ）の差、並びに理論的Ａｇ結合Ｒｍａｘを計算した。次いで、両方の因子を使用して、実際のＡｇ結合Ｒｍａｘを百分率で決定し、これはＡｇ非遮断エピトープについては＞０であり、Ａｇ遮断エピトープについては≦０である（表４）。Ａｇ及びＡｂ１複合体特異的エピトープ研究のため、５００ｎＭ Ａｇ＋５０ｎＭ Ａｂ１ Ｆａｂ複合体（Ａｂ１ Ｆａｂを飽和させるために１０倍過剰のＡｇと予備混合）及び５０ｎＭ Ａｂ１ Ｆａｂの、プロテインＡによって捕捉された同程度のＡｂ２のみに対する結合Ｒｍａｘを記録し（図３Ｃ）、それらの間の比を百分率として計算した。値が＞１０％である場合、Ａｂ２をＡｇ＋Ａｂ１複合体エピトープ型であると見なし、そうでなければ、非Ａｇ＋Ａｂ１複合体エピトープタイプに属した（表５）。
【0137】
Ａｇ非遮断型の抗ＩＤがＡｂ１の結合形態も認識できるかどうかを確認するため、Ａｇ＋Ａｂ１複合体（Ａｂ１結合部位を飽和させるために１０倍過剰のＡｇを用いる）を生成して、Ａｂ１のみと比較して結合を決定した。１９個中５個の抗ＩＤがＡｇ＋Ａｂ１複合体に結合することができた（例えば、図３Ｄの３Ｅ３）。
【表4】
【表5】
【0138】
Ｃ． Ｃａｒｔｅｒｒａ ＳＰＲを使用したＡｂ２ウサギ抗体エピトープビニング
全体として、プロジェクトＥの２４個全てのユニーク抗ＩＤは、３つの群に分類することができる：群１：Ａｇ＋Ａｂ１複合体に対する特異性を有するＡｇ非遮断（５クローン）；群２：Ａｇ＋Ａｂ１複合体に特異性のないＡｇ非遮断（１４クローン）；第３群：（５クローン）。結果は、群１の抗ＩＤは全Ａｂ１検出に機能上適し得るが、群２及び３の抗ＩＤは遊離Ａｂ１検出にのみ使用することができ、それらがＡｇ結合を妨害するかどうかが異なることを示す。
全体として、プロジェクトＥの２４個全てのユニーク抗ＩＤは、３つの群に分類することができる：群１：Ａｇ＋Ａｂ１複合体に対する特異性を有するＡｇ非遮断（５クローン）；群２：Ａｇ＋Ａｂ１複合体に特異性のないＡｇ非遮断（１４クローン）；第３群：（５クローン）。結果は、群１の抗ＩＤは全Ａｂ１検出に機能上適し得るが、群２及び３の抗ＩＤは遊離Ａｂ１検出にのみ使用することができ、それらがＡｇ結合を妨害するかどうかが異なることを示す。
【0139】
抗ＩＤの各群における微妙なエピトープの違いを解明するため、古典的なサンドイッチ形式（図５Ａ）の下でハイスループットＣａｒｔｅｒｒａ ＳＰＲマイクロフルイディクスによってペアワイズ競合実験を行った。マイクロアレイに基づく９６×９６マイクロ流体システム（ＩＢＩＳ－ＭＸ９６ ＳＰＲｉ、Ｃａｒｔｅｒｒａ、米国）をＡｂ２ｒＡｂエピトープビニング実験に使用した。最初に、各Ａｂ２ウサギＩｇＧ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５中１０μｇ／ｍＬ）を、連続流マイクロスポッター（ＣＦＭ、Ｃａｒｔｅｒｒａ、米国）においてアミンカップリング化学反応を使用して、センサープリズムＣＭＤ ２００Ｍセンサーチップ（ＣＭＤ ２００Ｍ、ＸａｎＴｅｃ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ、ドイツ）に直接固定化した。次に、１００ｎＭ Ａｂ１ Ｆａｂをセンサーチップ上に４分間結合させて注入し、続いて各Ａｂ２ウサギＩｇＧ（ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液中１０μｇ／ｍＬ）を２５℃で更に４分間注入した。１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を使用して各サイクルの間にチップ表面を再生し、結合応答を記録し、ヒートマップ作成及びネットワークプロットのためのＣａｒｔｅｒｒａマイクロフルイディクスのビニングソフトウェアで分析した。Ａｂ２（ノード）間の競合関係（コード）は、抗ＩＤがビン（エンベロープにより内接する）にクラスタリングされることを可能にし、ビンは、他の抗ＩＤに対して試験されたときに同一の遮断プロファイルを共有する抗ＩＤのファミリーを表す（図５Ｂ～５Ｄ）。
【0140】
群１の抗ＩＤでは、この研究によって証明される３つのビンがあり、クローン１４Ｂ１１は、クローン２１Ｅ２、３Ｅ３、及びその他の間の架橋エピトープに結合する（図５Ｃ）。群２の抗ＩＤでは、架橋エピトープ（図５Ｂ）を標的とするはるかに大きな群の抗ＩＤ（１４個のうち１０個）を除いて、同様の結果が観察された。群３の抗ＩＤでは、興味深いことに、１つのビンのみが識別された（図５Ｄ）。
【0141】
実施例５．抗ＩＤを使用したＰＫ及びＡＤＡアッセイの開発
プロジェクトＥにおける薬物動態（ＰＫ）アッセイ及び抗薬物抗体（ＡＤＡ）アッセイの開発のため、Ａｇが測定時に血清試料中のＡｂ１と比較して無視できない濃度で存在したため、５つの抗ＩＤを群１（３Ｅ３及び１４Ｂ１１；全Ａｂ１の検出を目的とする）及び群２（９Ｈ１０、１９Ｃ４及び２４Ｂ４；Ａｇ干渉の存在下で遊離Ａｂ１を検出することを目的とする）から選択的に選んで、機能アッセイ開発の規模を管理した。
プロジェクトＥにおける薬物動態（ＰＫ）アッセイ及び抗薬物抗体（ＡＤＡ）アッセイの開発のため、Ａｇが測定時に血清試料中のＡｂ１と比較して無視できない濃度で存在したため、５つの抗ＩＤを群１（３Ｅ３及び１４Ｂ１１；全Ａｂ１の検出を目的とする）及び群２（９Ｈ１０、１９Ｃ４及び２４Ｂ４；Ａｇ干渉の存在下で遊離Ａｂ１を検出することを目的とする）から選択的に選んで、機能アッセイ開発の規模を管理した。
【0142】
十分に特徴付けられた抗ＩＤのパネルを有することは、いくつかの方法で臨床ＰＫアッセイ及びＡＤＡアッセイの両方の開発に有利であり得る。ＰＫアッセイの場合、複数の抗ＩＤクローンの利用可能性は、本明細書中に記載される抗ＩＤ／抗ＩＤブリッジングフォーマットを含む様々なアッセイ形式間の評価及び比較を可能にする。遊離薬物ＰＫアッセイの開発に好ましいこの形式は、一般的な非薬物特異的試薬の使用よりもアッセイの感度及び特異性の両方を改善することができる（Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＡＡＰＳ Ｊ．，９（２）：Ｅ１５６－Ｅ１６３，２００７）。さらに、特定の試薬の使用は、許容可能な正確性及び精度を維持しながら、アッセイの広いダイナミックレンジをカバーするロバストな用量反応曲線を確実にする。（ＤｅＳｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，２０（１１）：１８８５－１９００，２００３）多くの場合、同様の特徴を共有するクローンは、（クローン９Ｈ１０及び２４Ｂ４で実証されるように）アッセイにおいて異なる性能を示し得る。これは、抗ＩＤ間のプレートコーティング効率の様々な程度、コンジュゲート形成プロセス中に導入された構造変化、又はマトリックス効果（例えば、血液、血漿血清等に存在する干渉因子）に起因し得る。したがって、スクリーニング及び選択に利用可能なクローンの十分に多様なパネルは、抗ＩＤ試薬製造プログラムの成功の重要な要素である。エピトープの特性評価及びグループ化は、アッセイ開発の決定を更に知らせ、全薬物アッセイ又は遊離薬物アッセイの開発の間の選択を提供することができ、したがって研究データの解釈に影響を及ぼす。
【0143】
一方、ＡＤＡアッセイの抗ＩＤの選択基準は、ＰＫアッセイのものほど厳密ではない。代用陽性ＡＤＡ源としてアッセイの性能を経時的に制御することを超えて、抗ＩＤを使用して、感度、特異性、薬物耐性、精度、及び分析物安定性等の重要なアッセイパラメータを検証中に実証及び評価する。さらに、抗ＩＤを使用して、競合アッセイにおける使用を通じて、Ａｂ１上の特定のエピトープに対する抗体応答を特徴付けることもできる。
【0144】
Ａ． ＰＫアッセイのためのＡｂ２開発
ＰＫアッセイの開発のため、サンドイッチＥＬＩＳＡ形式を使用した（図６Ａ）。最初に、９６ウェルマイクロタイタープレートを、４℃で一晩、各Ａｂ２ ｒＡｂクローン（１μｇ／ｍＬ）で別々にコーティングした。次いで、２％プール正常ヒト血清を含有するアッセイ緩衝液（１×ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、及び０．０５％ポリソルベート２０）中の治療用抗体Ａｂ１の２倍連続希釈物（２０ｎｇ／ｍＬ～０．３ｎｇ／ｍＬ）をプレートに添加し、２時間インキュベートした。結合したＡｂ１を検出するため、各Ａｂ２クローンのビオチン化バージョン（０．２μｇ／ｍＬ；１０：１ビオチン化比）を添加し、続いて発色のためにストレプトアビジンＨＲＰコンジュゲート（ＤＹ９９８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＴＭＢ基質（５１２０－００４７，ＫＰＬ，Ｉｎｃ．）を添加した。１Ｍリン酸を添加することによってプレート反応を停止させ、６３０ｎｍの参照波長を用いて４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
ＰＫアッセイの開発のため、サンドイッチＥＬＩＳＡ形式を使用した（図６Ａ）。最初に、９６ウェルマイクロタイタープレートを、４℃で一晩、各Ａｂ２ ｒＡｂクローン（１μｇ／ｍＬ）で別々にコーティングした。次いで、２％プール正常ヒト血清を含有するアッセイ緩衝液（１×ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、及び０．０５％ポリソルベート２０）中の治療用抗体Ａｂ１の２倍連続希釈物（２０ｎｇ／ｍＬ～０．３ｎｇ／ｍＬ）をプレートに添加し、２時間インキュベートした。結合したＡｂ１を検出するため、各Ａｂ２クローンのビオチン化バージョン（０．２μｇ／ｍＬ；１０：１ビオチン化比）を添加し、続いて発色のためにストレプトアビジンＨＲＰコンジュゲート（ＤＹ９９８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＴＭＢ基質（５１２０－００４７，ＫＰＬ，Ｉｎｃ．）を添加した。１Ｍリン酸を添加することによってプレート反応を停止させ、６３０ｎｍの参照波長を用いて４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【0145】
図６Ａに示されるサンドイッチＥＬＩＳＡ形式を使用して、３Ｅ３（群１）及び１９Ｃ４（群２）を、Ａｂ１を捕捉して検出するのに適した抗体対を形成するものとして同定した（図６Ｂ）。この対は、いずれの方向においても高いシグナル対ノイズ比及びロバストな用量反応曲線滴定を示した。エピトープビニング特性評価研究で明らかなように、３Ｅ３及び１９Ｃ４は、別個の重複しないエピトープを有し、両方の試薬がＡｂ１をサンドイッチすることを可能にする（図５Ｅ）。対照的に、クローン１４Ｂ１１（３Ｅ３と同じ群１）、９Ｈ１０及び２４Ｂ４（１９Ｃ４と同じ群２）は、３Ｅ３又は１９Ｃ４のいずれとの適合性も示さなかった。クローン９Ｈ１０及び２４Ｂ４は、クローン３Ｅ３と重複しないエピトープを有するが、１９Ｃ４と同様の特徴を共有しているにもかかわらず、１９Ｃ４が３Ｅ３と対になったときに同じロバストな用量反応曲線を提供しない。これらの結果は、この種の試薬選択プロセスにおける実験的生物分析データの重要性を強調し、試薬特性評価データを補完する。プレートを３Ｅ３又は１９Ｃ４のいずれかでコーティングし、残りのクローンを検出試薬として使用すると許容可能なアッセイが得られるが、３Ｅ３を、その良好なシグナル対ノイズ比のために捕捉抗体として使用するために選択した。より重要なことに、この試薬対はまた、遊離及び結合した薬物（循環標的抗原と複合体化した薬物）のより良好な検出及び定量をもたらした。これは全薬物アッセイと考えられるが、反対向きのアッセイは遊離薬物アッセイと考えられ、循環標的の存在による干渉の増加を受ける。
【0146】
Ｂ． ＡＤＡアッセイのためのＡｂ２開発
治療患者における抗薬物抗体（ＡＤＡ）の存在を検出するための高感度アッセイは、組換え治療薬に対する免疫応答を評価するために極めて重要である。ＡＤＡアッセイの開発のため、抗ＩＤは、好ましくは薬物分子にユニークなエピトープを標的とすべきである。本明細書に記載の産生及び選択戦略を使用してＢ細胞に由来するＡｂ１に対する抗体は、おそらく抗ＩＤである。したがって、上記の５つのクローンを、プロジェクトＥの臨床免疫原性アッセイにおける代用陽性対照としての適合性について調査した。
治療患者における抗薬物抗体（ＡＤＡ）の存在を検出するための高感度アッセイは、組換え治療薬に対する免疫応答を評価するために極めて重要である。ＡＤＡアッセイの開発のため、抗ＩＤは、好ましくは薬物分子にユニークなエピトープを標的とすべきである。本明細書に記載の産生及び選択戦略を使用してＢ細胞に由来するＡｂ１に対する抗体は、おそらく抗ＩＤである。したがって、上記の５つのクローンを、プロジェクトＥの臨床免疫原性アッセイにおける代用陽性対照としての適合性について調査した。
【0147】
ＡＤＡアッセイの開発のため、架橋ＥＬＩＳＡ形式を使用した（図７Ａ）。ＡＤＡ試料は、１０００ｎｇ／ｍＬの個々のＡｂ２クローンを健康なドナーからの純粋なヒト血清に添加することによって調製した。試料を１／２０希釈し、続いて２倍段階希釈して滴定曲線を作成した（１０００ｎｇ／ｍＬ～７．８ｎｇ／ｍＬ）。ビオチン化及びジゴキシゲニン複合化治療用Ａｂ１抗体試薬を添加し（各４μｇ／ｍＬ；１０：１抗原チャレンジ比）、希釈した試料と一晩インキュベートし、Ａｂ２と免疫複合体を形成した。その後、複合体をストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（１１７３４７７６００１、Ｒｏｃｈｅ）上に捕捉し、続いてマウス抗ＤＩＧ ＨＲＰコンジュゲートｍＡｂ（２０００３２１５６、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出し、ＰＫアッセイについて上記のように発色させた。
【0148】
３Ｅ３及び２４Ｂ４の両方が、他の抗ＩＤよりも優れた特徴を有する特異的でロバストな結合曲線をもたらし、したがって、このプロジェクトにおけるＡＤＡアッセイ開発のための好適な抗ＩＤ試薬である（図７Ｂ）。
【0149】
理解を明確にするために、上記発明は図示及び例示によって程度詳細に説明されているが、これらの説明及び例示は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】