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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-13
(54)【発明の名称】Ｄｕｘ４阻害剤およびその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20230906BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230906BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20230906BHJP
C12N 15/115 20100101ALN20230906BHJP
C07K 2/00 20060101ALN20230906BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20230906BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61P21/00
A61K31/713
C12N15/115 Z
C07K2/00
C07K16/28
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023514067
(86)(22)【出願日】2021-09-01
(85)【翻訳文提出日】2023-04-26
(86)【国際出願番号】 US2021048611
(87)【国際公開番号】W WO2022051332
(87)【国際公開日】2022-03-10
(31)【優先権主張番号】63/073,304
(32)【優先日】2020-09-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516134291
【氏名又は名称】ウルトラジェニクス ファーマシューティカル インク．
【氏名又は名称原語表記】ＵＬＴＲＡＧＥＮＹＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＩＮＣ．
(71)【出願人】
【識別番号】509039013
【氏名又は名称】セントルイス ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】ドガーティ，ショーン クリストファー
(72)【発明者】
【氏名】チェン，リーシャン
(72)【発明者】
【氏名】スベルドラップ，フランシス マイケル
【テーマコード（参考）】
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086MA56
4C086MA59
4C086MA63
4C086MA65
4C086NA14
4C086ZA94
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA54
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA20
(57)【要約】
本願は、ＤＵＸ４遺伝子の発現を調節する二本鎖低分子干渉ＲＮＡに関し、該二本鎖低分子干渉ＲＮＡを細胞に接触させてＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害する方法について記載する。本願は、二本鎖低分子干渉ＲＮＡを含む組成物、および対象における顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）または癌などのＤＵＸ４の異常な発現に関連する疾患または障害を予防または処置する方法におけるその使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であって、ここで、前記二本鎖ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２，９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６，２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８，３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４０２、４０４、４０６、４０８、４１０、４１２、４１４、４１６、４１８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２，４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、４９２、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、５１２、５１４、５１６、５１８、５２０、５２２、５２４、５２６、５２８、５３０、５３２、５３４、５３６、５３８、５４０、５４２、５４４、５４６、５４８、５５０、５５２、５５４、５５６、５５８、５６０、５６２、５６４、５６６、５６８、５７０、５７２、５７４、５７６、５７８、５８０、５８２、５８４、５８６、５８８、５９０および５９２からなる群より選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドの核酸塩基配列を含み、かつ前記二本鎖ｓｉＲＮＡが、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む、二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項2】
二本鎖ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号：２１６、２１８、２２０、３１２、３２４、３４０、３４２、３４８、３５０、３５２、３５４、３６４、３７２、３７６、４００、４０２、４０４、４１０、４３４、４４６、４４８、４５０、４６２および５６４からなる群より選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドの核酸塩基配列を含む、請求項１に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項3】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ｓｉＲＮＡであって、ここで、前記二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７，２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９，３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１，４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４６９、４７１、４７３、４７５、４７７、４７９、４８１、４８３、４８５、４８７、４８９、４９１、４９３、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３、５０５、５０７、５０９、５１１、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５２３、５２５、５２７、５２９、５３１、５３３、５３５、５３７、５３９、５４１、５４３、５４５、５４７、５４９、５５１、５５３、５５５、５５７、５５９、５６１、５６３、５６５、５６７、５６９、５７１、５７３、５７５、５７７、５７９、５８１、５８３、５８５、５８７、５８９および５９１からなる群より選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドの核酸塩基配列を含み、かつ前記二本鎖ｓｉＲＮＡが、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む、二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項4】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ｓｉＲＮＡであって、ここで、前記二本鎖ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号５９３の核酸塩基４６０５～７４８５の等長部分のうち少なくとも８個の連続核酸塩基に相補的な核酸塩基配列を含み、前記センス鎖は前記アンチセンス鎖に少なくとも８５％相補性を有し、かつ前記二本鎖ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む、二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項5】
二本鎖ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号５９３の核酸塩基４６０５～４６３８、４６９３～４７２７、４７６５～４７８３、４９３３～４９５１、４９９０～５０１１、５０７５～５０９３、５１２７～５１４８、５１６１～５１９３、５２０１～５２２８、５２４３～５２７９、５３０５～５３２７、５３５３～５３９７、５４３３～５４６１、５４６４～５５０９、５５２２～５５４０、５６５１～５６７０、５８０９～５８３０、５８４２～５８６５、５９６９～５９９０、６０６６～６０８６、６１０９～６１３５、６１８３～６２２９、６３２８～６３６９、６４０３～６４５１、７１２０～７１３８、７１６２～７１９０、７２３９～７２８５、７４０４～７４３７、または７４５２～７４８５の等長部分のうち少なくとも８個の連続核酸塩基に相補的な核酸塩基配列を含む、請求項４に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項6】
二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖の少なくとも１つのヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項7】
二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖の各ヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項8】
修飾糖が、２’－ＯＭｅ修飾糖および２’－Ｆ修飾糖から選択される、請求項６に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項9】
アンチセンス鎖が、３’末端にＴＴオーバーハングを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項10】
センス鎖が、３’末端にＴＴオーバーハングを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項11】
二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項12】
二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、少なくとも５つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１１に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項13】
ヌクレオシド間結合がそれぞれ、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１１に記載の二本鎖siRNA。
【請求項14】
ｓｉＲＮＡが、親油性分子、抗体、アプタマー、リガンド、ペプチドまたはポリマーに結合している、請求項１から１３のいずれか一項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項15】
親油性分子が長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）である、請求項１４に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項16】
抗体が抗トランスフェリン受容体抗体である、請求項１４に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項17】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項18】
医学的治療に用いるための、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項19】
ヒトまたは動物の身体の処置に用いるための、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項20】
それを必要とする対象において、ＤＵＸ４の異常発現に関連する疾患または障害を改善、予防、発症遅延または処置するための医薬を調製または製造するための、請求項１７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項21】
疾患または障害が、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、請求項２０に記載の使用。
【請求項22】
ＦＳＨＤが、ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２からなる群より選択される、請求項２１に記載の使用。
【請求項23】
請求項１７に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象における、ＤＵＸ４の異常発現に関連する疾患または障害を改善、予防、発症遅延または処置するための方法。
【請求項24】
疾患または障害がＦＳＨＤである、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
ＦＳＨＤが、ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
請求項１７に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象における、ＦＳＨＤの改善、予防、発症遅延または処置のための方法。
【請求項27】
ＦＳＨＤがＦＳＨＤ１である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
ＦＳＨＤがＦＳＨＤ２である、請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
請求項１７に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象において癌を改善、予防、発症遅延または処置する方法。
【請求項30】
投与が、静脈内、皮下、肺、筋肉内、腹腔内、皮膚、経口、鼻腔または吸入経由である、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
投与が、１日１回、週１回、２週間に１回、月１回、２ヶ月に１回、３ヵ月に１回、または年１回である、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
投与が、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇの有効量を含む、請求項２３から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
投与が、対象におけるＤＵＸ４の発現を阻害する、請求項２３から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
請求項１～１６のいずれか一項に記載の１以上の二本鎖ｓｉＲＮＡおよび前記二本鎖ｓｉＲＮＡを投与するための器具を含む、キット。
【請求項35】
請求項１～１６のいずれか一項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡを細胞に接触させることを含む、該細胞におけるＤＵＸ４の発現を阻害する方法。
【請求項36】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ｓｉＲＮＡであって、ここで、前記センス鎖が、配列番号：５９７、５９９、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６１１、６１３、６１５、６１７、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１，６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５および６８７からなる群より選択される配列の少なくとも８個の連続ヌクレオチドを含む、二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項37】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ｓｉＲＮＡであって、ここで、前記アンチセンス鎖が、配列番号：５９８、６００、６０２、６０４、６０６、６０８、６１０、６１２、６１４、６１６、６１８、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６および６８８からなる群より選択される配列の少なくとも８個の連続ヌクレオチドを含む、二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項38】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ｓｉＲＮＡであって、ここで、前記センス鎖が、配列番号：５９７、５９９、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６１１、６１３、６１５、６１７、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５および６８７からなる群より選択される配列の少なくとも８個の連続ヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号：５９８、６００、６０２、６０４、６０６、６０８、６１０、６１２、６１４、６１６、６１８、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６および６８８からなる群より選択される配列の少なくとも８個の連続ヌクレオチドを含む、二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項39】
請求項３６から３８のいずれか一項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項40】
医学的治療に用いるための、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項41】
ヒトまたは動物の身体の処置に用いるための、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項42】
それを必要とする対象において、ＤＵＸ４の異常発現に関連する疾患または障害を改善、予防、発症遅延または処置するための医薬を調製または製造するための、請求項３９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項43】
疾患または障害がＦＳＨＤである、請求項４２に記載の使用。
【請求項44】
ＦＳＨＤが、ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２からなる群より選択される、請求項４３に記載の使用。
【請求項45】
請求項１７に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象における、ＤＵＸ４の異常発現に関連する疾患または障害を改善、予防、発症遅延または処置するための方法。
【請求項46】
疾患または障害がＦＳＨＤである、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
ＦＳＨＤが、ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
請求項３９に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象においてＦＳＨＤを改善、予防、発症遅延または処置するための方法。
【請求項49】
ＦＳＨＤがＦＳＨＤ１である、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
ＦＳＨＤがＦＳＨＤ２である、請求項４８に記載の方法。
【請求項51】
請求項３９に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象において癌を改善、予防、発症遅延または処置する方法。
【請求項52】
投与が、静脈内、皮下、肺、筋肉内、腹腔内、皮膚、経口、鼻腔または吸入経由である、請求項４５から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
投与が、１日１回、週１回、２週間に１回、月１回、２ヶ月に１回、３ヵ月に１回、または年１回である、請求項４５から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
投与が、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇの有効量を含む、請求項４５から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
投与が、対象におけるＤＵＸ４の発現を阻害する、請求項４５から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
請求項３６～３８のいずれか一項に記載の１以上の二本鎖ｓｉＲＮＡおよび前記二本鎖ｓｉＲＮＡを投与するための器具を含む、キット。
【請求項57】
請求項３６～３８のいずれか一項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡを細胞に接触させることを含む、該細胞におけるＤＵＸ４の発現を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２０年９月１日出願の米国仮特許出願番号第６３／０７３，３０４号に基づく優先権の利益を主張し、その内容全体は引用により本明細書中に包含される。
本願は、２０２０年９月１日出願の米国仮特許出願番号第６３／０７３，３０４号に基づく優先権の利益を主張し、その内容全体は引用により本明細書中に包含される。
【0002】
配列表への参照
本願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂによりテキストファイルとして電子的に提出された配列表を含む。テキストファイルの名称は「8957-5-PCT_Seq_Listing_ST25.txt」であり、サイズは１９４，０００バイトであって、２０２１年８月２５日に記録された。テキストファイルに含まれる情報は、３７ ＣＦＲ§１．５２（ｅ）（５）に従い、引用によりその内容全体が本明細書に包含される。
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【0003】
発明の技術分野
本発明は、ＤＵＸ４遺伝子の発現を調節する二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および研究、診断および／または治療におけるその適用に関する。いくつかの態様において、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）の予防および／または処置において、前記ｓｉＲＮＡを含む組成物および方法に関する。
本発明は、ＤＵＸ４遺伝子の発現を調節する二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および研究、診断および／または治療におけるその適用に関する。いくつかの態様において、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）の予防および／または処置において、前記ｓｉＲＮＡを含む組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0004】
発明の背景
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）は、世界で約１万人に１人の割合で発症する希少な遺伝病である。ＦＳＨＤ患者は、進行性の非対称の筋力低下を示し、罹患個体の２０％までが重度障害者となる。筋肉以外の症状としては、潜在性感音性難聴毛細血管拡張症が挙げられる。
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）は、世界で約１万人に１人の割合で発症する希少な遺伝病である。ＦＳＨＤ患者は、進行性の非対称の筋力低下を示し、罹患個体の２０％までが重度障害者となる。筋肉以外の症状としては、潜在性感音性難聴毛細血管拡張症が挙げられる。
【0005】
ＤＵＸ４遺伝子の不十分なエピジェネティックな抑制による骨格筋でのＤＵＸ４タンパク質の異常発現は、ＦＳＨＤの原因と考えられている。ＤＵＸ４は、Ｄ４Ｚ４マクロサテライトリピート配列の各ユニットにコードされているレトロ遺伝子である。Ｄ４Ｚ４リピートは体細胞組織で双方向に転写され、エピジェネティックサイレンシングに関与すると考えられる長いＲＮＡおよび低分子ＲＮＡフラグメントを生成する。より一般的なＦＳＨＤ（ＦＳＨＤ１）は、染色体４ｑのサブテロメア領域におけるＤ４Ｚ４マクロサテライトリピートのサブセットの欠失によって引き起こされる。罹患していない個体は、３．３ｋｂのＤ４Ｚ４リピートユニットを１１～１００個有しているが、ＦＳＨＤ１個体は１０個以下のリピートしか有さない。ＦＳＨＤ２は、同じ４ｑＡハプロタイプのＤ４Ｚ４リピートのＤＮＡメチル化の低下と関連している。したがって、ＤＵＸ４遺伝子の発現を抑制する薬剤の投与は、ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２の予防法または処置法として有望である。ＤＵＸ４は、ＭＨＣクラスＩを抑制して癌の免疫回避を促進し、抗ＣＴＬＡ－４療法に対する抵抗性に介在することが分かっているため、ＦＳＨＤの予防または処置における有用性のほか、ＤＵＸ４を標的とした処置により、癌免疫療法の成功率を高め得る。Chew et al., 2019, Dev Cell 50(5):525-6を参照のこと。
【0006】
二本鎖オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を調節するために、研究、診断、および／または治療において用いるために使用されてきた。遺伝子発現を調節する方法のひとつにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）があり、これは一般的に、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を導入して、標的の内因性ｍＲＮＡレベルを配列特異的に減少させることを伴う遺伝子サイレンシングを意味する。標的ｍＲＮＡの減少は、ｄｓＲＮＡの配列または構造に応じて、いくつかの異なる機序のうちの１つによって起こり得る。例えば、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の形成による標的ｍＲＮＡの分解、またはＲＮＡ誘導転写サイレンシング（ＲＩＴＳ）と称されるｍＲＮＡの転写が阻害される転写サイレンシング、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能調節によるものがある。マイクロＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡの発現を制御する低分子非コーディングＲＮＡである。ＲＮＡｉ化合物がマイクロＲＮＡに結合することで、そのマイクロＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡの標的に結合できなくなり、マイクロＲＮＡの機能を阻害できる。ＲＮＡｉ化合物は、その配列特異性から、疾患の発症に関わる遺伝子の発現を選択的に調節する治療薬として有望視されている。
【0007】
当技術分野において、ＦＳＨＤの処置のための方法および薬剤が必要とされている。本発明は、ＤＵＸ４遺伝子の異常な発現を抑制でき、それによりＦＳＨＤを改善、予防または処置できるオリゴヌクレオチド、それらを含む組成物および方法を提供することによって、この必要性に応える。
【発明の概要】
【0008】
発明の概要
本発明は、ＤＵＸ４遺伝子の発現を低減または阻害するための二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を提供する。また、本発明は、ＤＵＸ４を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を細胞に接触させ、それによりＤＵＸ４の発現を低減または阻害することを含む、該細胞におけるＤＵＸ４の発現を低減または阻害する方法を提供する。別の面において、本発明は、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子およびそれを含む組成物を対象に投与することによる、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を含む種々の障害の予防または処置のための組成物および方法を提供する。
本発明は、ＤＵＸ４遺伝子の発現を低減または阻害するための二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を提供する。また、本発明は、ＤＵＸ４を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を細胞に接触させ、それによりＤＵＸ４の発現を低減または阻害することを含む、該細胞におけるＤＵＸ４の発現を低減または阻害する方法を提供する。別の面において、本発明は、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子およびそれを含む組成物を対象に投与することによる、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を含む種々の障害の予防または処置のための組成物および方法を提供する。
【0009】
従って、一面において、本発明は、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子の異常発現を低減または阻害するのに有用な、各分子がセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を含む。いくつかの態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。
【0010】
いくつかの態様において、ＤＵＸ４遺伝子は、配列番号５９３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である核酸塩基配列を含む。特定の態様において、ＤＵＸ４は、配列番号５９３と１００％同一である核酸塩基配列を含む。
【0011】
いくつかの態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号５９３の等長部分に少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％相補的な核酸塩基配列を含む。いくつかの態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号５９３の等長部分に１００％相補的な核酸塩基配列を含む。
【0012】
いくつかの態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号５９３の等長部分の少なくとも８個の連続核酸塩基に相補的な核酸塩基配列を含む。種々の態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号５９３の等長部分の少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個または少なくとも１９個の連続核酸塩基に相補的な核酸塩基配列を含む。
【0013】
一態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号５９３の核酸塩基４６０５～７４８５内の等長部分の少なくとも８個の連続核酸塩基に相補的な核酸塩基配列を含む。例えば、種々の態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号５９３の核酸塩基４６０５－４６３８、４６９３－４７２７、４７６５－４７８３、４９３３－４９５１、４９９０－５０１１、５０７５－５０９３、５１２７－５１４８、５１６１－５１９３、５２０１－５２２８、５２４３－５２７９、５３０５－５３２７、５３５３－５３９７、５４３３－５４６１、５４６４－５５０９、５５２２－５５４０、５６５１－５６７０、５８０９－５８３０、５８４２－５８６５、５９６９－５９９０、６０６６－６０８６、６１０９－６１３５、６１８３－６２２９、６３２８－６３６９、６４０３－６４５１、７１２０－７１３８、７１６２－７１９０、７２３９－７２８５、７４０４－７４３７、または７４５２－７４８５内の等長部分の少なくとも８個の連続核酸塩基に相補的である核酸塩基配列を含み得る。種々の態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号５９３の核酸塩基４６０５－７４８５の、例えば配列番号５９３の核酸塩基４６０５－４６３８、４６９３－４７２７、４７６５－４７８３、４９３３－４９５１、４９９０－５０１１、５０７５－５０９３、５１２７－５１４８、５１６１－５１９３、５２０１－５２２８、５２４３－５２７９、５３０５－５３２７、５３５３－５３９７、５４３３－５４６１、５４６４－５５０９、５５２２－５５４０、５６５１－５６７０、５８０９－５８３０、５８４２－５８６５、５９６９－５９９０、６０６６－６０８６、６１０９－６１３５、６１８３－６２２９、６３２８－６３６９、６４０３－６４５１、７１２０－７１３８、７１６２－７１９０、７２３９－７２８５、７４０４－７４３７または７４５２－７４８５内の等長部分の少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、または少なくとも１９個の連続核酸塩基に相補的な核酸塩基配列を含む。
【0014】
いくつかの態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、表１に列記された核酸塩基配列の何れか、すなわち、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４０２、４０４、４０６、４０８、４１０、４１２、４１４、４１６、４１８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、４９２、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、５１２、５１４、５１６、５１８、５２０、５２２、５２４、５２６、５２８、５３０、５３２、５３４、５３６、５３８、５４０、５４２、５４４、５４６、５４８、５５０、５５２、５５４、５５６、５５８、５６０、５６２、５６４、５６６、５６８、５７０、５７２、５７４、５７６、５７８、５８０、５８２、５８４、５８６、５８８、５９０および５９２からなる群より選択される配列の少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。いくつかの態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号：２１６、２１８、２２０、３１２、３２４、３４０、３４２、３４８、３５０、３５２、３５４、３６４、３７２、３７６、４００、４０２、４０４、４１０、４３４、４４６、４４８、４５０、４６２および５６４からなる群より選択される核酸塩基配列の何れかの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。いくつかの態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号：２１６、２１８、２２０、３１２、３２４、３４０、３４２、３４８、３５０、３５２、３５４、３６４、３７２、３７６、４００、４０２、４０４、４１０、４３４、４４６、４４８、４５０、４６２および５６４のいずれか１つの核酸配列を含むかまたはそれからなる。
【0015】
いくつかの態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、表５に列記された核酸塩基配列の何れか、すなわち、配列番号：５９８、６００、６０２、６０４、６０６、６０８、６１０、６１２、６１４、６１６、６１８、６２０、６２２、６２４、６２６、６２８、６３０、６３２、６３４、６３６、６３８、６４０、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６および６８８からなる群より選択される配列の少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。いくつかの態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号：６０２、６０４、６０６、６１６、６８４、６８６および６８８からなる群より選択される何れかの核酸塩基配列の少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。いくつかの態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号：６０２、６０４、６０６、６１６、６８４、６８６および６８８の何れか１つの核酸配列を含むかまたはそれからなる。
【0016】
いくつかの態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのセンス鎖は、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖に少なくとも８５％相補的な核酸塩基配列を含む。種々の態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのセンス鎖は、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖に少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的な核酸塩基配列を含む。
【0017】
いくつかの態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５９３の核酸塩基４６０５～７４８５内の等長部分の少なくとも８個の連続核酸塩基と同一である核酸塩基配列を含む。例えば、種々の態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５９３の核酸塩基４６０５－４６３８、４６９３－４７２７、４７６５－４７８３、４９３３－４９５１、４９９０－５０１１、５０７５－５０９３、５１２７－５１４８、５１６１－５１９３、５２０１－５２２８、５２４３－５２７９、５３０５－５３２７、５３５３－５３９７、５４３３－５４６１、５４６４－５５０９、５５２２－５５４０、５６５１－５６７０、５８０９－５８３０、５８４２－５８６５、５９６９－５９９０、６０６６－６０８６、６１０９－６１３５、６１８３－６２２９、６３２８－６３６９、６４０３－６４５１、７１２０－７１３８、７１６２－７１９０、７２３９－７２８５、７４０４－７４３７、または７４５２－７４８５内の等長部分の少なくとも８個の連続核酸塩基配列と同一である核酸塩基配列を含む。種々の態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５９３の核酸塩基４６０５～７４８５の、例えば、配列番号５９３の核酸塩基４６０５－４６３８、４６９３－４７２７、４７６５－４７８３、４９３３－４９５１、４９９０－５０１１、５０７５－５０９３、５１２７－５１４８、５１６１－５１９３、５２０１－５２２８、５２４３－５２７９、５３０５－５３２７、５３５３－５３９７、５４３３－５４６１、５４６４－５５０９、５５２２－５５４０、５６５１－５６７０、５８０９－５８３０、５８４２－５８６５、５９６９－５９９０、６０６６－６０８６、６１０９－６１３５、６１８３－６２２９、６３２８－６３６９、６４０３－６４５１、７１２０－７１３８、７１６２－７１９０、７２３９－７２８５、７４０４－７４３７、または７４５２－７４８５の等長部分の少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、または少なくとも１９個の連続核酸塩基配列と同一の核酸塩基配列を含む。
【0018】
いくつかの態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのセンス鎖は、表１に列記された核酸塩基配列のいずれか１つの核酸塩基配列、すなわち、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４６９、４７１、４７３、４７５、４７７、４７９、４８１、４８３、４８５、４８７、４８９、４９１、４９３、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３、５０５、５０７、５０９、５１１、５１３、５１５、５１７、５１９、５２１、５２３、５２５、５２７、５２９、５３１、５３３、５３５、５３７、５３９、５４１、５４３、５４５、５４７、５４９、５５１、５５３、５５５、５５７、５５９、５６１、５６３、５６５、５６７、５６９、５７１、５７３、５７５、５７７、５７９、５８１、５８３、５８５、５８７、５８９および５９１からなる群より選択される配列の少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。いくつかの態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２１５、２１７、２１９、３１１、３２３、３３９、３４１、３４７、３４９、３５１、３５３、３６３、３７１、３７５、３９９、４０１、４０３、４０９、４３３、４４５、４４７、４４９、４６１および５６３からなる群より選択される核酸塩基配列の何れかの少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。いくつかの態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのセンス鎖は、配列番号：２１５、２１７、２１９、３１１、３２３、３３９、３４１、３４７、３４９、３５１、３５３、３６３、３７１、３７５、３９９、４０１、４０３、４０９、４３３、４４５、４４７、４４９、４６１および５６３の核酸塩基配列の何れか１つの核酸塩基配列を含むかまたはそれからなる。
【0019】
いくつかの態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのセンス鎖は、表５に列記された核酸塩基配列の何れか１つの、すなわち、配列番号：５９７、５９９、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６１１、６１３、６１５、６１７、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６３３、６３５、６３７、６３９、６４１、６４３、６４５、６４７、６４９、６５１、６５３、６５５、６５７、６５９、６６１、６６３、６６５、６６７、６６９、６７１、６７３、６７５、６７７、６７９、６８１、６８３、６８５および６８７からなる群より選択される配列の少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。いくつかの態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号：６０１、６０３、６０５、６１５、６８３、６８５および６８７からなる群より選択される何れかの核酸塩基配列の少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または少なくとも１２個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む。いくつかの態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号：６０１、６０３、６０５、６１５、６８３、６８５および６８７の何れか１つの核酸配列を含むかまたはそれからなる。
【0020】
いくつかの態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのセンス鎖は、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのセンス鎖の各ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドを含む。
【0021】
いくつかの態様では、二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖の少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾された糖を含む。いくつかの態様において、二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖の各ヌクレオシドは、修飾糖を含む。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシドは、２’－Ｆ修飾糖および／または２’－ＯＭｅ修飾糖を含む。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシドは、２’－ＯＭｅ修飾糖を含む。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシドは、２’－Ｆ修飾糖を含む。
【0022】
いくつかの態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖および／またはセンス鎖は、３’末端にＴＴオーバーハングを含む。
【0023】
いくつかの態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのセンス鎖は、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。いくつかの態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡのセンス鎖は、少なくとも２個、３個、４個または５個の修飾ヌクレオシド間結合を含む。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【0024】
いくつかの態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡは、親油性分子、抗体、アプタマー、リガンド、ペプチドまたはポリマーに結合される。いくつかの態様において、親油性分子は、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）であってもよい。いくつかの態様において、抗体は、抗トランスフェリン受容体抗体である。
【0025】
別の面では、本発明は、本明細書に記載の二本鎖低分子干渉ＲＮＡまたはその塩、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を含む。医薬組成物は、医学的治療における使用のためのものであり得る。医薬組成物は、ヒトまたは動物の身体の処置における使用のためのものであり得る。別の面において、本発明は、それを必要とする対象において、ＤＵＸ４の異常発現に関連する疾患または障害を改善、予防、発症遅延、または処置するための医薬を調製または製造するための医薬組成物の用途を含む。別の面において、本発明は、医薬組成物を対象に投与することにより、それを必要とする対象においてＤＵＸ４の異常発現に関連する疾患または障害を改善、予防、発症遅延または処置する方法を含む。疾患または障害は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）であり得て、ＦＳＨＤ１またはＦＳＨＤ２であり得る。別の面において、本発明は、医薬組成物を対象に投与することにより、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２を含む）を改善、予防、発症遅延または処置する方法を含む。
【0026】
種々の態様において、投与は、静脈内、皮下、肺、筋肉内、腹腔内、経皮、経鼻または吸入であり得る。いくつかの態様では、投与は、１日１回、週１回、２週間に１回、月１回、２ヶ月に１回、３ヵ月に１回、または年１回であり得る。いくつかの態様において、投与は、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇの有効量を含み得る。いくつかの態様において、投与は、対象におけるＤＵＸ４の発現を阻害する。
【0027】
別の面において、本発明は、１以上の二本鎖ｓｉＲＮＡ、および前記二本鎖ｓｉＲＮＡを投与するための器具を含むキットを提供する。
【0028】
別の面において、本発明は、本明細書に記載の二本鎖低分子干渉ＲＮＡを投与することを含む、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２を含む）を改善、予防、発症遅延または処置する方法を含む。別の面において、本発明は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーの処置のための、本明細書に記載の二本鎖低分子干渉ＲＮＡの使用を含む。
【0029】
別の面では、本発明は、本明細書に記載の二本鎖低分子干渉ＲＮＡを投与することを含む、癌を改善、予防、発症遅延または処置する方法を含む。いくつかの態様において、本方法は、抗ＣＴＬＡ－４剤などのチェックポイント阻害剤の投与をさらに含み得る。
【0030】
別の面において、本発明は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーの処置のための医薬の調製のための、本明細書に記載の二本鎖低分子干渉ＲＮＡの使用を含む。
【0031】
別の面において、本発明は、細胞におけるＤＵＸ４の発現を阻害する方法であって、該細胞を本明細書に記載の二本鎖低分子干渉ＲＮＡと接触させ、それによりＤＵＸ４の発現を阻害することを含む。いくつかの態様において、接触はインビトロで行われる。いくつかの態様において、接触は、インビボで行われる。いくつかの態様において、細胞は動物中にある。いくつかの態様では、動物はヒトである。いくつかの態様において、ＤＵＸ４の発現は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％阻害される。いくつかの態様において、ＤＵＸ４の発現はなくなる。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【発明を実施するための形態】
【0033】
発明の詳細な説明
本明細書には、ＤＵＸ４遺伝子内の配列を標的とする二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を記載している。また、細胞を前記ｓｉＲＮＡ分子と接触させることを含む、細胞におけるＤＵＸ４の発現を低減または阻害する方法も記載される。さらに本明細書では、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子およびそれを含む組成物を対象に投与することによる、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）の予防または処置のための方法が記載される。
本明細書には、ＤＵＸ４遺伝子内の配列を標的とする二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を記載している。また、細胞を前記ｓｉＲＮＡ分子と接触させることを含む、細胞におけるＤＵＸ４の発現を低減または阻害する方法も記載される。さらに本明細書では、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子およびそれを含む組成物を対象に投与することによる、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）の予防または処置のための方法が記載される。
【0034】
定義
上記の一般的な説明および下記の詳細な説明の両方が、例示的かつ説明的なものに過ぎず、特許請求の範囲に記載される本発明を制限するものではないことが理解される。本明細書中、特に別段の記載がない限り、単数形の使用は複数形を含むものとする。本明細書中、“または”の使用は、特に別段の記載がない限り、“および／または”を意味する。さらに、“含む”という用語の使用だけでなく、“含む”および“包含する”などの他の形態の使用も、限定的なものではない。また、“要素”または“構成要素”などの用語は、特に別段の記載がない限り、１つのユニットを含む要素および構成要素と、２以上のサブユニットを含む要素および構成要素の両方を包含する。
上記の一般的な説明および下記の詳細な説明の両方が、例示的かつ説明的なものに過ぎず、特許請求の範囲に記載される本発明を制限するものではないことが理解される。本明細書中、特に別段の記載がない限り、単数形の使用は複数形を含むものとする。本明細書中、“または”の使用は、特に別段の記載がない限り、“および／または”を意味する。さらに、“含む”という用語の使用だけでなく、“含む”および“包含する”などの他の形態の使用も、限定的なものではない。また、“要素”または“構成要素”などの用語は、特に別段の記載がない限り、１つのユニットを含む要素および構成要素と、２以上のサブユニットを含む要素および構成要素の両方を包含する。
【0035】
本明細書で用いる用語“ＤＵＸ４”とは、ＤＵＸ４タンパク質またはＤＵＸ４核酸、すなわち、ＤＵＸ４タンパク質をコードする核酸配列を意味し得る。ＤＵＸ４核酸とは、ＤＵＸ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列、タンパク質をコードしない（すなわち、非コーディング）ＲＮＡ配列を含むＤＵＸ４をコードするＤＮＡ（イントロンおよびエクソンを含むゲノムＤＮＡを含む）から転写されるＲＮＡ配列、およびＤＵＸ４をコードするｍＲＮＡ配列を意味し得る。いくつかの態様において、ＤＵＸ４核酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＦＪ４３９１３３．１（配列番号５９３）を含む。
【0036】
“二本鎖低分子干渉ＲＮＡ”とは、２本の逆平行かつ実質的に相補的な核酸鎖を含む何れかの二重ＲＮＡ構造を意味する。特定の態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、標的核酸に相補的である。
【0037】
“相補性”とは、第１の核酸の核酸塩基と第２の核酸の核酸塩基の間で対になる能力を意味する。
【0038】
“連続する核酸塩基”とは、互いにすぐに隣接する核酸塩基を意味する。
【0039】
“デオキシリボヌクレオチド”とは、ヌクレオチドの糖部分の２’位に水素を有するヌクレオチドをいう。デオキシリボヌクレオチドは、様々な置換基のいずれかで修飾され得る。
【0040】
“発現”には、遺伝子にコードされた情報が、細胞内に存在しかつ作動する構造体に変換されることによる全ての機能が含まれる。このような構造には、転写および翻訳の産物が含まれるが、これらに限定されない。
【0041】
“完全相補”または“１００％相補”とは、第１の核酸の各核酸塩基が、第２の核酸に相補的な核酸塩基を有することを意味する。特定の態様において、第１の核酸はアンチセンス化合物であり、標的核酸は第２の核酸である。
【0042】
“発現または活性を阻害する”とは、発現または活性の減少または遮断を意味し、必ずしも発現または活性の完全な喪失を意味するものではない。
【0043】
“ヌクレオシド間結合”とは、ヌクレオシド間の化学結合を意味する。
【0044】
“連結ヌクレオシド”とは、ヌクレオシド間結合によって共に連結された隣接ヌクレオシドを意味する。
【0045】
“修飾ヌクレオシド間結合”とは、天然ヌクレオシド間結合（すなわち、ホスホジエステルヌクレオシド間結合）からの置換または何れかの変化を意味する。
【0046】
“核酸塩基”とは、他の核酸の塩基と対になることができるヘテロ環式部分を意味する。“修飾核酸塩基”とは、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシルを除く核酸塩基をいう。“非修飾核酸塩基”とは、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を意味する。
【0047】
“ヌクレオシド”とは、糖と結合した核酸塩基を意味する。“修飾ヌクレオシド”とは、それぞれ独立に、修飾糖部分および／または修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。
【0048】
“修飾ヌクレオチド”とは、独立して、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを意味する。
【0049】
“修飾糖”とは、天然の糖部分からの置換および／または何れかの変更を意味する。特定の態様では、修飾糖は、２’－Ｆ修飾糖および２’－ＯＭｅ修飾糖が挙げられる。
【0050】
“核酸塩基相補性”とは、別の核酸塩基と塩基対形成が可能な核酸塩基を意味する。例えば、ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と相補的である。例えば、ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）と相補的である。特定の態様において、相補的核酸塩基とは、標的核酸の核酸塩基と塩基対形成できるアンチセンス化合物の核酸塩基を意味する。例えば、アンチセンス化合物のある位置の核酸塩基が、標的核酸のある位置の核酸塩基と水素結合できる場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の水素結合の位置は、その核酸塩基対で相補的であると考えられる。
【0051】
“核酸塩基配列”とは、糖、連結、および／または核酸塩基の修飾とは独立した連続核酸塩基の順序を意味する。
【0052】
“ホスホロチオエート結合”とは、ホスホジエステル結合が、非架橋酸素原子の１つを硫黄原子で置換することによって修飾されているヌクレオシド間の結合を意味する。ホスホロチオエート結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
【0053】
本明細書で用いる“部位”とは、標的核酸内のユニークな核酸塩基位置として定義される。
【0054】
“対象”とは、処置または治療のために選択されたヒトまたは非ヒト動物を意味する。
【0055】
“標的遺伝子”とは、標的をコードする遺伝子を意味する。
【0056】
“標的核酸”とは、核酸の調節が望まれる核酸のことを意味する。
【0057】
二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子
一面において、本発明は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）化合物のような二本鎖オリゴヌクレオチド、およびそれを含む組成物を含む。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡ化合物は、少なくとも１つの修飾ＲＮＡヌクレオシド（すなわち、独立して、修飾糖部分および／または修飾核酸塩基）、および／または修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。特定の態様において、ｓｉＲＮＡ化合物は、修飾ＲＮＡヌクレオシド、修飾ＤＮＡヌクレオシド、および／または修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。
一面において、本発明は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）化合物のような二本鎖オリゴヌクレオチド、およびそれを含む組成物を含む。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡ化合物は、少なくとも１つの修飾ＲＮＡヌクレオシド（すなわち、独立して、修飾糖部分および／または修飾核酸塩基）、および／または修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。特定の態様において、ｓｉＲＮＡ化合物は、修飾ＲＮＡヌクレオシド、修飾ＤＮＡヌクレオシド、および／または修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。
【0058】
いくつかの態様は、各鎖が、１以上の修飾または非修飾ヌクレオシドの位置によって定義されるモチーフを含む二本鎖分子に関する。
【0059】
いくつかの態様において、二重鎖領域を形成するために完全にまたは少なくとも部分的にハイブリダイズする第１および第２のオリゴマー化合物を含み、核酸標的に相補的でハイブリダイズする領域をさらに含む、組成物が提供される。このような組成物は、核酸標的に対して完全または部分的な相補性を有するアンチセンス鎖である第１のオリゴマー化合物、および第１のオリゴマー化合物と相補性を有し少なくとも１つの二重鎖領域を形成する１以上の領域を有するセンス鎖である第２のオリゴマー化合物を含み得る。
【0060】
いくつかの態様において、本発明の組成物は、その正常な機能の喪失をもたらす核酸標的にハイブリダイズすることによって、遺伝子発現を調節する。いくつかの態様では、標的核酸の分解は、本発明の組成物を用いて形成される活性化ＲＩＳＣ複合体によって促進される。
【0061】
いくつかの態様において、一方の鎖は、例えば、ＲＩＳＣ（または開裂）複合体への反対側の鎖の優先的な負荷に影響を及ぼすのに有用である。いくつかの態様において、本発明の組成物は、標的ＲＮＡの一部にハイブリダイズし、標的ＲＮＡの正常な機能の喪失をもたらす。
【0062】
いくつかの態様は、両鎖がヘミマーモチーフ、完全修飾モチーフ、位置的に修飾されたモチーフまたは交互のモチーフを含む二本鎖組成物に関する。本発明の組成物の各鎖は、例えばｓｉＲＮＡ経路において特定の役割を果たすように修飾できる。各鎖に異なるモチーフを用いるか、同じモチーフでも各鎖に異なる化学修飾を施すことで、アンチセンス鎖をＲＩＳＣ複合体の標的とし、センス鎖の取り込みを阻害できる。このモデルでは、それぞれの鎖は、その特定の役割のために強化されるように独立して修飾され得る。アンチセンス鎖は、ＲＩＳＣのある領域での役割を高めるために５’末端を修飾され、ＲＩＳＣの異なる領域での役割を高めるために３’末端では異なる修飾をされ得る。
【0063】
二本鎖オリゴヌクレオチド分子は、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含んでいてもよく、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部におけるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部と対応するヌクレオチド配列を有する。二本鎖オリゴヌクレオチド分子は、２つの別個のオリゴヌクレオチドから組み立てられ得、ここで、一方の鎖はセンス鎖であり、他方はアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、自己相補的である（すなわち、各鎖は、他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み；例えば、アンチセンス鎖およびセンス鎖が二重鎖または二本鎖構造を形成する場合、二本鎖領域が約１２～約３０塩基対、例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基対であり；アンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその一部におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド分子の約１２～約３０個以上のヌクレオチドが標的核酸またはその一部と相補的である）。あるいは、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡの自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域が核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカー(複数可)によって連結される、単一のオリゴヌクレオチドから構成されてもよい。
【0064】
二本鎖オリゴヌクレオチドは、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を有し、自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有し、ここで、アンチセンス領域は、別の標的核酸分子またはその一部におけるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、かつセンス領域は標的核酸配列またはその一部と対応するヌクレオチド配列を有していてよい。二本鎖オリゴヌクレオチドは、２以上のループ構造ならびに自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであり得て、ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、かつセンス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、そして環状ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉに介在できる活性ｓｉＲＮＡ分子を生成するのに、インビボまたはインビトロの何れでも実施できる。
【0065】
いくつかの態様において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、別個のセンス配列およびアンチセンス配列またはセンス領域およびアンチセンス領域を含み、ここで、センス領域およびアンチセンス領域は、当技術分野で知られているように、ヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合されているか、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および／またはスタッキング相互作用によって代替的に非共有結合されている。いくつかの態様において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の発現阻害を引き起こす態様で標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。
【0066】
本明細書で用いる用語ｓｉＲＮＡは、配列特異的ＲＮＡｉに介在できる核酸分子、例えば短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、短干渉核酸、短干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）などの核酸分子を記載するために用いられる他の用語と同等であると意図される。さらに、本明細書で用いる用語ＲＮＡｉとは、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、またはエピジェネティクスなどの配列特異的ＲＮＡ干渉を記載するために用いられる他の用語と同等であることが意図される。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドは、転写後レベルおよび転写前レベルの両方で遺伝子をエピジェネティックにサイレンシングさせるために用いられ得る。限定されない例としては、本発明のｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティックな調節は、遺伝子発現を変化させるためのクロマチン構造またはメチル化パターンのｓｉＲＮＡ介在修飾により生じ得る（例えば、Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; および、Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237)。
【0067】
本明細書で提供されるいくつかの態様の化合物および組成物は、例えば、自己相補的配列を有する単一のＲＮＡ鎖が二本鎖コンフォメーションを想定できる“ヘアピン”またはステムループ二本鎖ＲＮＡエフェクター分子、またはＲＮＡの二つの別個の鎖を含む二本鎖ｄｓＲＮＡエフェクター分子を含む、ｄｓＲＮＡ介在遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡｉ機序によって標的化できることが企図される。種々の態様において、ｄｓＲＮＡは、完全にリボヌクレオチドからなるか、またはリボヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドの混合物からなり、例えば、２０００年４月１９日出願のＷＯ ００／６３３６４、または１９９９年４月２１日出願の米国特許出願第６０／１３０，３７７によって開示されるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドなどが挙げられる。
【0068】
本明細書で用いる二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡのみを含む分子に限定される必要はなく、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。特定の態様では、短干渉核酸分子は、リボヌクレオチドまたは２’－ヒドロキシ（２’－ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠いていてもよい。しかしながら、ＲＮＡｉをサポートするために分子内にリボヌクレオチドの存在を必要としないかかる二本鎖オリゴヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有する１以上のヌクレオチドを含む結合リンカー（複数可）または他の結合もしくは連結基、部位もしくは鎖を有し得る。いくつかの態様において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド位置の約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％でリボヌクレオチドを含み得る。
【0069】
ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡエフェクター分子は、分子のあるセグメントのヌクレオチドが該分子の別のセグメントのヌクレオチドと塩基対になるような自己相補性の領域を有する単一分子であってもよい。種々の態様において、１分子からなるｄｓＲＮＡは、完全にリボヌクレオチドからなるか、またはデオキシリボヌクレオチドの領域と相補的なリボヌクレオチドの領域を含む。あるいは、ｄｓＲＮＡは、互いに相補的な領域を有する２つの異なる鎖を含み得る。
【0070】
種々の態様において、両方の鎖が完全にリボヌクレオチドからなるか、一方の鎖が完全にリボヌクレオチドからなり、かつ他方の鎖が完全にデオキシリボヌクレオチドからなるか、または一方もしくは両方の鎖がリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの混合物を含む。
【0071】
特定の態様では、相補性の領域は、互いにおよび標的核酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％相補的である。特定の態様では、二本鎖コンフォメーションで存在するｄｓＲＮＡの領域は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、７５、１００、２００、５００、１０００、２０００もしくは５０００ヌクレオチドを含むか、またはｄｓＲＮＡで表されるｃＤＮＡもしくは他の標的核酸配列の全てのヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ｄｓＲＮＡは、一本鎖末端などの一本鎖領域を含まないか、またはｄｓＲＮＡはヘアピンである。他の態様では、ｄｓＲＮＡは、１以上の一本鎖領域またはオーバーハングを有する。特定の態様において、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、アンチセンス鎖または領域（例えば、標的核酸に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％の相補性を有する）であるＤＮＡ鎖または領域、およびセンス鎖または領域（例えば、標的核酸と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％の同一性を有する）であるＲＮＡ鎖または領域を含み、その逆も可である。
【0072】
種々の態様において、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、本明細書に記載のもの、または２０００年４月１９日出願のＷＯ ００／６３３６４号、または１９９９年４月２１日出願の米国特許出願第６０／１３０，３７７号に記載のものなどの酵素合成法または化学合成法を用いてインビトロで製造される。他の態様では、インビトロで合成されたＤＮＡ鎖は、該ＤＮＡ鎖の細胞への形質転換の前、後またはそれと同時に、インビボまたはインビトロで作成されたＲＮＡ鎖と複合体化される。
【0073】
さらに他の態様では、ｄｓＲＮＡは、センス領域およびアンチセンス領域を含む単一の環状核酸であるか、またはｄｓＲＮＡは、環状核酸および第２の環状核酸または線状核酸のいずれかを含む（例えば、２０００年４月１９日出願のＷＯ ００／６３３６４、または１９９９年４月２１日出願の米国特許出願第６０／１３０，３７７号参照）。環状核酸の例としては、ヌクレオチドの遊離５’リン酸基が他のヌクレオチドの２’水酸基にループバック方式で結合したラリアット構造が挙げられる。化学的に合成された２５－３０塩基長のＲＮＡ二重鎖は、より短い２１マーのｓｉＲＮＡと比較して高い効力を示すことが示されており、この効力の増加は、長いｄｓＲＮＡを基質として切断し、切断したｄｓＲＮＡのＲＩＳＣへの負荷を容易にするＤｉｃｅｒエンドヌクレース酵素の作用によるものと考えられている。したがって、いくつかの態様では、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ基質ＲＮＡであり得る。例えば、いくつかの態様において、ｄｓＲＮＡは、２５／２７マーである。
【0074】
修飾ヌクレオチドおよび化学修飾ｓｉＲＮＡ
本明細書に記載の種々の態様において、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、１以上（例えば、２、３、４、５またはそれ以上）の修飾核酸モノマー（すなわち、ヌクレオチド）を含み得る。修飾ヌクレオチドの種々の例は、米国特許出願第９，０３５，０３９号、同第９，９５１，３３８号、同第１０，０３６，０２４号、同第１０，５３８，７６３号、および国際特許公開第ＷＯ／２０１８／２２２９２６号に開示されており、これらの各々は引用によりその内容全体が本明細書に包含される。
本明細書に記載の種々の態様において、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、１以上（例えば、２、３、４、５またはそれ以上）の修飾核酸モノマー（すなわち、ヌクレオチド）を含み得る。修飾ヌクレオチドの種々の例は、米国特許出願第９，０３５，０３９号、同第９，９５１，３３８号、同第１０，０３６，０２４号、同第１０，５３８，７６３号、および国際特許公開第ＷＯ／２０１８／２２２９２６号に開示されており、これらの各々は引用によりその内容全体が本明細書に包含される。
【0075】
本発明での使用に適した修飾ヌクレオチドの例としては、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－デオキシ、５－Ｃ－メチル、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、４’－チオ、２’－アミノまたは２’－Ｃ－アリール基を有するリボヌクレオチドまたはアラビノヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、これらは、２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノグアノシンヌクレオチドを含み得る。
【0076】
例えば、Saenger、Principles of Nucleic Acid Structure、Springer-Verlag Ed.(1984)に記載されているようなコンフォメーションを有する修飾ヌクレオチドも、ｓｉＲＮＡ分子に用いるのに好適である。他の修飾ヌクレオチドには、これ限定されないが、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、アンロックド核酸（ＵＮＡ）ヌクレオチド、Ｇクランプヌクレオチド、またはヌクレオチド塩基類縁体が含まれる。ＬＮＡヌクレオチドとしては、２’－Ｏ、４’－Ｃ－メチレン－（Ｄ－リボフラノシル）ヌクレオチド）、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’－メチルチオ－エチルヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－クロロ（２’－Ｃｌ）ヌクレオチド、２’－アジドヌクレオチド、および（Ｓ）－拘束エチル（ｃＥｔ; constrained ethyl）ヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0077】
いくつかの態様では、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、末端キャップ部位、リン酸骨格修飾などの１以上の化学修飾を含み得る。末端キャップ部分のクラスの例としては、逆デオキシ脱塩基残基、グリセリル修飾、４’，５’－メチレンヌクレオチド、１－（β－Ｄ－エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’－チオヌクレオチド、カルボシクロヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトルヌクレオチド、Ｌ－ヌクレオチド、α－ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオペントフラノシルヌクレオチド、非環状３’，４’－セコ核酸、非環状３，４－ジヒドロキシブチル核酸、非環状３，５－ジヒドロキシペンチル核酸、３’－３’－逆核酸部位、３’－３’－逆脱塩基部位、３’－２ ’－逆核酸部位、３’－２’－逆脱塩基部位、５’－５’－逆脱ヌクレオチド部位、５’－５’－逆脱塩基部位、３’－５’－逆デオキシ脱塩基部位、５’－アミノアルキルリン酸、１，３－ジアミノ－２－プロピルリン酸、３アミノプロピルリン酸、６－アミノヘキシルリン酸、１，２－アミノドデシルリン酸、ヒドロキシプロピルリン酸、１，４－ブタンジオールリン酸、３’－ホスホラミデート、５’－ホスホラミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’－ホスフェート、５’－アミノ、３’－ホスホロチオエート、５’－ホスホロチオエート、フォスフォルジチオエートおよび架橋または非架橋メチルフォスホネートあるいは５’－マーキャプト部分が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸骨格の修飾（すなわち、修飾されたヌクレオシド間結合をもたらす）の限定されない例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセタミデート、ポリアミド、スルホン酸、スルホンアミド、サルバメート、フォーマセタル、チオフォーマセタルおよびアルキルシリル置換が挙げられる。かかる化学修飾は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖の５’末端および／または３’末端で起こり得る。
【0078】
いくつかの態様において、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。修飾ヌクレオシド間結合の例としては、ペプチド結合、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、およびホスホロジアミデートモルフォリノ（ＰＭＯ）結合連結が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、２、３、４、５またはそれ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。いくつかの態様では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方を含み、ここで、すべてのヌクレオシド間結合が修飾されている。いくつかの態様において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【0079】
いくつかの態様では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、１、２、３、４またはそれ以上の２’－デオキシリボヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）、ならびに修飾ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチドの何れかの組合せを有する５’－末端または３’－末端オーバーハングを含み得る。いくつかの態様において、二本鎖ｓｉＲＮＡは、センス鎖の３’末端にＴＴオーバーハングを含み得る。いくつかの態様において、二本鎖ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端にＴＴオーバーハングを含み得る。いくつかの例示的な態様では、二本鎖ｓｉＲＮＡは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端にＴＴオーバーハングを含み得る。
【0080】
複合ｓｉＲＮＡ
いくつかの態様では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの他の分子に複合体化され得る。二本鎖ｓｉＲＮＡを適切な分子と結合させることで、標的細胞へのｓｉＲＮＡの送達を向上させる手段を提供する。このような複合分子は、細胞膜の脂質成分と相互作用したり、特定の細胞表面タンパク質や受容体に結合したり、ｓｉＲＮＡを伴って内因性輸送機構により細胞内に侵入することができる。
いくつかの態様では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの他の分子に複合体化され得る。二本鎖ｓｉＲＮＡを適切な分子と結合させることで、標的細胞へのｓｉＲＮＡの送達を向上させる手段を提供する。このような複合分子は、細胞膜の脂質成分と相互作用したり、特定の細胞表面タンパク質や受容体に結合したり、ｓｉＲＮＡを伴って内因性輸送機構により細胞内に侵入することができる。
【0081】
コンジュゲートは、核酸または非核酸リンカーなどの共有結合を介して、ｓｉＲＮＡのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端および／または３’末端に結合され得る。コンジュゲートは、カルバメート基または他の連結基を介してｓｉＲＮＡに結合できる（例えば、米国特許公開第２００５００７４７７１号、同第２００５００４３２１９号、同第２００５０１５８７２７号を参照）。コンジュゲートは、多くの目的のためにｓｉＲＮＡに添加できる。例えば、コンジュゲートは、細胞へのｓｉＲＮＡの送達を容易にする分子エンティティであってもよいし、薬剤またはラベルを含む分子であってもよい。本発明のｓｉＲＮＡに結合させるのに適したコンジュゲート分子の例としては、親油性分子(例えば、脂肪酸)、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのグリコール、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カロテノイド、テルペン、胆汁酸、葉酸（例えば、葉酸、葉酸類縁体およびその誘導体）、糖（例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、グルコース、マンノース、フルクトース、フコースなど）、リン脂質、ペプチド、細胞への取り込みに介在できる細胞受容体のリガンド、抗体、アプタマー、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、米国特許公開第２００３０１３０１８６号、同第２００４０１１０２９６号、同第２００４０２４９１７８号、米国特許第６，７５３，４２３号参照）。
【0082】
用いられるコンジュゲートの種類およびｓｉＲＮＡへの複合体化の程度は、活性を維持しながらの、薬物動態プロファイル、バイオアベイラビリティ、および／または安定性の改善により評価できる。このように、当業者は、様々なコンジュゲートが結合したｓｉＲＮＡ分子をスクリーニングし、上記のネガティブコントロール発現試験を含む様々な周知のインビトロ細胞培養またはインビボ動物モデルのいずれかを用いて、改善された特性を有するｓｉＲＮＡ複合体を選択できる。ｓｉＲＮＡバイオコンジュゲートの例は、例えば、Chernikov et al., 2019, Front. Pharmacol. 10: 1-25 および Osborn et al., 2018, Nuc. Acid Ther. 28(3): 128-136に記載されている。
【0083】
いくつかの態様では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、親油性分子（例えば、長鎖脂肪酸またはＬＣＦＡ）、抗体（例えば、抗トランスフェリン受容体抗体）、アプタマー、リガンド、ペプチド、またはポリマーに複合体化され得る。
【0084】
一態様では、二本鎖ｓｉＲＮＡは、親油性分子、例えば長鎖脂肪酸に結合させることができる。いくつかの例示的な態様では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、国際特許公開第ＷＯ／２０１９／２３２２５５号に記載の長鎖脂肪酸にコンジュゲートされる。
【0085】
いくつかの態様では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、抗体にコンジュゲートされ得る。いくつかの態様において、抗体は、筋肉標的化抗体である。いくつかの態様において、筋肉標的化抗体は、抗トランスフェリン受容体抗体である。いくつかの例示的な態様では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、国際特許公開第ＷＯ／２０２０／０２８８６４号に記載の抗トランスフェリン受容体抗体にコンジュゲートされる。
【0086】
リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）およびその他の担体を用いたｓｉＲＮＡ送達
いくつかの態様では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、リポソーム、ナノ粒子、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリマー、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ミセル、または細胞外小胞を介して送達され得る。
いくつかの態様では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、リポソーム、ナノ粒子、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリマー、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ミセル、または細胞外小胞を介して送達され得る。
【0087】
いくつかの態様では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を介して送達される。本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを送達できるＬＮＰの例は、国際特許公開番号ＷＯ／２０１５／０７４０８５、ＷＯ／２０１６／０８１０２９、ＷＯ／２０１７／１１７５３０、ＷＯ／２０１８／１１８１０２、ＷＯ／２０１８／１１９１６３、ＷＯ／２０１８／２２２９２６、ＷＯ／２０１９／１９１７８０、およびＷＯ／２０２０／１５４７４６に記載されている。いくつかの態様では、ＬＮＰは、標的化部分、例えば、標的リガンドに結合できる抗体、受容体またはそのフラグメントで修飾され得る。
【0088】
一態様では、本発明で用いる脂質ナノ粒子は、（ａ）核酸（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ）、（ｂ）カチオン性脂質、（ｃ）凝集低減剤（ＰＥＧ－脂質など）、（ｄ）要すれば非カチオン性脂質（中性脂質など）、および（ｅ）要すればステロール、を含む。一態様では、脂質ナノ粒子は、（ｉ）少なくとも１つのカチオン性脂質；（ｉｉ）中性脂質、例えばＤＳＰＣ；（ｉｉｉ）ステロール、例えばコレステロール；および（ｉｖ）ＰＥＧ－脂質を含み、約２０～６５％のカチオン性脂質：５～２５％の中性脂質：２５～５５％のステロール；０．５～１５％のＰＥＧ－脂質というモル比でこれらを含む。いくつかの態様において、カチオン性脂質は、ＷＯ／２０１８／２２２９２６に記載のように、ＡＴＸ－００２、ＡＴＸ－０８１、ＡＴＸ－０９５またはＡＴＸ－１２６から選択される。
【0089】
いくつかの態様では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、特異的な受容体介在エンドソーム取り込みを可能にする分子を含むナノキャリアを介して送達される。一態様では、前記分子は、受容体結合、エンドソームへの取り込み、エンドソーム膜の制御された破壊、および標的細胞へのｓｉＲＮＡの放出を可能にし得る。本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを送達できるナノキャリアの例は、ＷＯ／２００９／１４１２５７に記載されている。いくつかの態様では、ナノキャリアは、脂質ベースのナノキャリア、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。
【0090】
ＤＵＸ４
別の面において、本発明は、ＤＵＸ４を標的とする二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ化合物と細胞を接触させることを含む、細胞におけるＤＵＸ４の発現を低減する方法を含む。特定の態様において、ＤＵＸ４は、配列番号５９３と少なくとも８５％同一の核酸配列を含む。特定の態様において、ＤＵＸ４は、配列番号５９３に少なくとも８５％相補的な核酸配列を含む。
別の面において、本発明は、ＤＵＸ４を標的とする二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ化合物と細胞を接触させることを含む、細胞におけるＤＵＸ４の発現を低減する方法を含む。特定の態様において、ＤＵＸ４は、配列番号５９３と少なくとも８５％同一の核酸配列を含む。特定の態様において、ＤＵＸ４は、配列番号５９３に少なくとも８５％相補的な核酸配列を含む。
【0091】
骨格筋におけるＤＵＸ４の非効率的なエピジェネティック抑制は、ＤＵＸ４タンパク質の異常発現および顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）１および２につながる。ＦＳＨＤ１および２の患者は、進行性の非対称性筋力低下を示す。したがって、特定の態様では、ＤＵＸ４の発現を阻害することが望ましい。特定の態様では、１０個以下のＤ４Ｚ４リピートを有する対象において、ＤＵＸ４の発現を阻害することが望ましい。
【0092】
特定の態様において、ＤＵＸ４発現は、二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ化合物と細胞を接触させることによって阻害される。特定の態様において、ＤＵＸ４発現は、本明細書に記載の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ化合物と細胞を接触させることによって阻害される。
【0093】
医薬組成物
特定の態様において、本発明は、１以上の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ化合物を含む医薬組成物を提供する。特定の態様では、かかる医薬組成物は、適切な薬学的に許容される希釈剤または担体を含む。特定の態様において、医薬組成物は、滅菌生理食塩水および１以上のアンチセンス化合物を含む。特定の態様では、そのような医薬組成物は、滅菌生理食塩水および１以上のアンチセンス化合物からなる。特定の態様では、滅菌生理食塩水は、医薬品グレードの生理食塩水である。特定の態様において、医薬組成物は、１以上のアンチセンス化合物および滅菌水を含む。特定の態様において、医薬組成物は、１以上のアンチセンス化合物および滅菌水からなる。特定の態様において、滅菌生理食塩水は、医薬品グレードの水である。特定の態様において、医薬組成物は、１以上のアンチセンス化合物およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、１以上のアンチセンス化合物および滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）からなる。特定の態様において、滅菌生理食塩水は、医薬品グレードのＰＢＳである。
特定の態様において、本発明は、１以上の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ化合物を含む医薬組成物を提供する。特定の態様では、かかる医薬組成物は、適切な薬学的に許容される希釈剤または担体を含む。特定の態様において、医薬組成物は、滅菌生理食塩水および１以上のアンチセンス化合物を含む。特定の態様では、そのような医薬組成物は、滅菌生理食塩水および１以上のアンチセンス化合物からなる。特定の態様では、滅菌生理食塩水は、医薬品グレードの生理食塩水である。特定の態様において、医薬組成物は、１以上のアンチセンス化合物および滅菌水を含む。特定の態様において、医薬組成物は、１以上のアンチセンス化合物および滅菌水からなる。特定の態様において、滅菌生理食塩水は、医薬品グレードの水である。特定の態様において、医薬組成物は、１以上のアンチセンス化合物およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、１以上のアンチセンス化合物および滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）からなる。特定の態様において、滅菌生理食塩水は、医薬品グレードのＰＢＳである。
【0094】
特定の態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ化合物は、医薬組成物または医薬製剤の調製のために、薬学的に許容される活性物質および／または不活性物質と混和され得る。医薬組成物の剤形化のための組成物および方法は、投与経路、疾患の程度、または投与される量を含むが、これらに限定されない多くの基準によって変わる。
【0095】
二本鎖低分子干渉ＲＮＡ化合物を含む医薬組成物は、何れかの薬学的に許容される塩、エステル、またはそのようなエステルの塩を包含する。特定の態様において、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ化合物を含む医薬組成物は、ヒトを含む動物への投与時に、生物学的に活性な代謝物またはその残基を（直接的または間接的に）提供できる１以上のオリゴヌクレオチドを含む。したがって、例えば、本明細書は、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ化合物の薬学的に許容される塩、プロドラッグ、かかるプロドラッグの薬学的に許容される塩、および他の生物学的同等物も開示する。好適な薬学的に許容される塩としては、ナトリウム塩およびカリウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【0096】
特定の態様において、本明細書で提供される１以上の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ化合物は、プロドラッグとして処方される。プロドラッグは、体内の内因性ヌクレアーゼによって切断され、活性なアンチセンスオリゴマー化合物を形成する二本鎖低分子干渉ＲＮＡ化合物の片端または両端に、追加のヌクレオシドを組み込むことを含み得る。特定の態様では、インビボ投与時に、プロドラッグは化学的または酵素的に、オリゴヌクレオチドの生物学的、薬学的または治療的により活性な形態に変換される。特定の態様では、プロドラッグは、対応する活性型よりも投与が容易であるか、またはＲＩＳＣによって処理されるため、有用である。例えば、特定の例では、プロドラッグは、対応する活性型よりも生物学的利用性（例えば、経口投与による）が高い場合がある。ある例では、プロドラッグは対応する活性型と比較して溶解性が向上している場合がある。特定の態様において、プロドラッグは、対応する活性型よりも水溶性が低い。このようなプロドラッグは、水溶性が移行性に不利となる細胞膜を通過する透過性に優れている場合がある。
【0097】
特定の態様において、本明細書で提供される医薬組成物は、１以上の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ化合物および１以上の賦形剤を含む。特定のそのような態様では、賦形剤は、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンから選択される。
【0098】
投与および投与量
ｓｉＲＮＡ分子およびそれらを含む組成物は、何れかの好適な経路によって対象に投与され得る。例えば、投与は、静脈内、皮下、肺、筋肉内、腹腔内、皮膚、経口、鼻腔内、または吸入を介して行われ得る。
ｓｉＲＮＡ分子およびそれらを含む組成物は、何れかの好適な経路によって対象に投与され得る。例えば、投与は、静脈内、皮下、肺、筋肉内、腹腔内、皮膚、経口、鼻腔内、または吸入を介して行われ得る。
【0099】
例えば、特定の態様において、本明細書で提供される医薬組成物は、経口投与用に調製される。特定の態様において、医薬組成物は、注射（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、皮膚、腹腔内など）による投与のために調製される。そのような態様の特定のものでは、医薬組成物は担体を含み、水またはハンクス液、リンゲル液、または生理的食塩水緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液などの水溶液で剤形化される。特定の態様では、他の成分が含まれる（例えば、溶解を助ける成分または防腐剤としての役割を果たす成分など）。特定の態様では、注射用懸濁液は、適切な液体担体、懸濁化剤などを用いて調製される。注射用の任意の医薬組成物は、単位投与形態、例えばアンプルまたは複数用量用（multi-dose）容器で提示される。注射用の任意の医薬組成物としては、油性または水性ビークル中の懸濁液、溶液または乳濁液であり、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤を含んでもよい。注射用医薬組成物に用いるのに適した特定の溶媒としては、親油性溶媒および脂肪油、例えばゴマ油、合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリド、およびリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなど、懸濁液の粘度を上げる物質を含み得る。要すれば、このような懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能にするために、薬物（pharmaceutical agent）の溶解度を高める適切な安定剤または補助剤を含み得る。
【0100】
特定の態様において、医薬組成物は、経粘膜投与用に調製される。いくつかの態様では、浸透させるべきバリアに適切な浸透剤が製剤に用いられる。このような浸透剤は、当技術分野で一般的に知られているものである。特定の態様において、医薬組成物は、肺送達、例えば、気管内、鼻腔内または吸入を介した送達のために調製される。経鼻製剤に適した組成物は、鼻腔内懸濁液として鼻腔内に投与できる。吸入に適した組成物は、医薬エアロゾル、例えば溶液エアロゾルまたは粉末エアロゾルとして提供されてもよく、吸入器、例えば定量吸入器（ＭＤＩ）または乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、およびネブライザーなどのデバイスを用いて投与できる。粒子の特性および蓄積の機序を制御したり、標的細胞の表面に発現する受容体に結合するリガンドをカップリングするなどして、肺の特定の細胞タイプを特異的に標的とすることで、組成物を気道の特定の領域に送達できる。特定の態様において、医薬組成物は、鼻腔内投与のために調製される。特定の態様では、吸入により投与される。
【0101】
特定の態様において、本明細書で提供される医薬組成物は、治療的有効量の二本鎖低分子干渉ＲＮＡを含む。特定の態様では、治療的有効量は、疾患の症状を予防、緩和もしくは改善するため、または処置される対象の生存期間を延長するために十分である。治療的有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。いくつかの態様において、投与は、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇの有効量を含む。投与は、１日１回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、または３ヵ月に１回、行われ得る。
【0102】
特定の態様において、本発明は、細胞内の標的核酸の量または活性を低減するための組成物および方法を提供する。特定の態様において、細胞は動物内にある。特定の態様では、動物は哺乳動物である。特定の態様では、動物は齧歯類である。特定の態様では、動物は霊長動物である。特定の態様において、動物は、非ヒト霊長動物である。特定の態様では、動物はヒトである。
【0103】
特定の態様において、本発明は、本明細書に記載の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ化合物を含む医薬組成物を、動物に投与する方法を提供する。好適な投与経路としては、経口、直腸、経粘膜、腸管、局所、坐剤、吸入により、髄腔内、脳室内、腹腔内、鼻腔内、腫瘍内、非経腸（例えば、静脈内、筋肉内、髄内、皮下）などがあるが、これらに限定されない。特定の態様では、髄腔内投与用医薬品（pharmaceutical intrathecal）は、全身的な曝露ではなく局所的な曝露を達成するために投与される。例えば、医薬組成物は、所望の効果のある領域（例えば、耳の中）に直接注入できる。
【0104】
本明細書に記載の特定の化合物、組成物および方法を、特定の態様に従って具体的に説明したが、以下の実施例は、本明細書に記載の化合物を例示するためにのみ用いられ、これを限定することを意図するものではない。本明細書に記載された各文献、GenBank受託番号等は、その内容全体が引用により本明細書に包含される。
【0105】
本明細書に添付された配列表において、必要に応じて各配列を“ＲＮＡ”または“ＤＮＡ”のいずれかとして特定しているが、これらの配列は、化学修飾の何れかの組み合わせで修飾できる。当業者であれば、修飾オリゴヌクレオチドを説明するための“ＲＮＡ”または“ＤＮＡ”のような記載は、ある場合には、任意であることを容易に理解し得る。例えば、２’－ＯＨ糖部分を含むヌクレオシドおよびチミン塩基を含むオリゴヌクレオチドは、修飾糖（ＤＮＡの天然２’－Ｈは２’－ＯＨ）を有するＤＮＡとして、または修飾塩基（ＲＮＡの天然ウラシルはチミン（メチル化ウラシル））を有するＲＮＡとして記載され得る。
【0106】
従って、配列表に記載のものを含むがこれに限定されない本明細書で提供される核酸配列は、天然または修飾ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの何れかの組み合わせを含む核酸を包含することを意図しており、それらには修飾核酸塩基を有するそのような核酸が含まれるが、これらに限定されない。限定されないさらなる例としては、核酸塩基配列“ＡＴＣＧＡＴＣＧ”（配列番号６８９）を有するオリゴマー化合物は、修飾または非修飾にかかわらず、そのような核酸塩基配列を有する何れかのオリゴマー化合物を包含し、そのような化合物は、配列“ＡＵＣＧＡＵＣＧ”（配列番号６９０）を有するものなどのＲＮＡ塩基を含む化合物、および“ＡＵＣＧＡＴＣＧ”（配列番号６９１）のようないくつかのＤＮＡ塩基およびいくつかのＲＮＡ塩基を有する化合物、および“ＡＴｍｅＣＧＡＵＣＧ”（配列番号６９２）のような他の修飾または天然由来の塩基を有するオリゴマー化合物、ここでｍｅＣは５位にメチル基を含むシトシン塩基を意味する、が含まれるが、これらに限定されない。
【0107】
特定の定義が記載されない限り、本明細書に記載される分析化学、有機合成化学および医薬化学に関連して用いられる命名法、ならびにその手順および技術は、当技術分野でよく知られ、一般的に使用されているものである。化学合成および化学分析には、標準的な技術を使用できる。許されるなら、本明細書の記載において全体的に引用される全ての特許、特許出願、公開特許出願およびその他の刊行物、GENBANK受託番号およびNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）などのデータベースを通じて取得可能な関連配列情報、ならびにその他のデータは、その内容全体と同様に、本明細書で論じられる部分についても引用により本明細書中に包含される。
【0108】
本明細書で用いるセクションの見出しは、記載整理だけを目的とするものであり、記載される発明の主題を限定するものとして解釈されるものではない。特許、特許出願、刊行物、書籍および論文を含むがこれらに限定されない、本明細書に引用したすべての文書、または文書の一部は、その内容全体と同様に、本明細書で論じた部分についても引用により明示的に本明細書中に包含される。
【0109】
本明細書に記載される各配列番号に記載される配列は、糖部分、ヌクレオシド間結合または核酸塩基に対する何れの修飾とも独立していることが理解される。このように、配列番号によって定義されるアンチセンス化合物は、独立して、糖部分、ヌクレオシド間結合、または核酸塩基に対する１以上の修飾を含み得る。
【実施例】
【0110】
実施例
実施例１：ＤＵＸ４コード領域および上流Ｄ４Ｚ４リピート領域を標的とするｓｉＲＮＡの設計および配列
ヒトＤＵＸ４プロモーター領域およびコード領域を標的とする二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、インシリコで設計した。配列は以下の表１に示す通りである。表１に記載の各ｓｉＲＮＡは、ヒトゲノムＤＵＸ４配列（GENBANK受託番号FJ439133.1、配列番号５９３）に対して標的となる。“Start”は、ゲノムＤＵＸ４配列において、ｓｉＲＮＡが標的とする５’末端のヌクレオシドを示す。“Stop”は、ゲノムＤＵＸ４配列において、ｓｉＲＮＡが標的とする３’末端のヌクレオシドを示す。
実施例１：ＤＵＸ４コード領域および上流Ｄ４Ｚ４リピート領域を標的とするｓｉＲＮＡの設計および配列
ヒトＤＵＸ４プロモーター領域およびコード領域を標的とする二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、インシリコで設計した。配列は以下の表１に示す通りである。表１に記載の各ｓｉＲＮＡは、ヒトゲノムＤＵＸ４配列（GENBANK受託番号FJ439133.1、配列番号５９３）に対して標的となる。“Start”は、ゲノムＤＵＸ４配列において、ｓｉＲＮＡが標的とする５’末端のヌクレオシドを示す。“Stop”は、ゲノムＤＵＸ４配列において、ｓｉＲＮＡが標的とする３’末端のヌクレオシドを示す。
【0111】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【0112】
実施例２：二本鎖ｓｉＲＮＡによるＤＵＸ４遺伝子のサイレンシング
表１に記載された二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、以下に記載のようにインビトロでＤＵＸ４遺伝子発現の阻害について試験した。
表１に記載された二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、以下に記載のようにインビトロでＤＵＸ４遺伝子発現の阻害について試験した。
【0113】
細胞および細胞培養。不死化したヒトＦＳＨＤ１（５４－２）（Kromら、2012）およびＦＳＨＤ２（ＭＢ２００）（Stadlerら、2011）細胞株を用いた。不死化筋芽細胞を、２０％のコーニングのUSDA認可のウシ胎仔血清（Corning, Corning, NY, USA）、１００Ｕ／１００μｇのペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト繊維芽細胞成長因子（Promega Corporation, Madison, WI, USA）および１μＭのデキサメタゾン（Sigma-Aldrich）を添加したハムのＦ－１０栄養素ミックス（Gibco, Waltham, MA, USA）中で培養した。筋芽細胞の筋管への分化は、コンフルエントな筋芽細胞単層体を、２％ノックアウト血清補充液（Gibco）、１００Ｕ／１００μｇペニシリン／ストレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌインスリンおよび１０μｇ／ｍｌトランスフェリンを添加したＤＭＥＭ：Ｆ－１２栄養素混合物（１：１、Gibco）（KSR media)に４０時間かけて切り替えることにより達成した。
【0114】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクション。１９塩基対の相補配列およびｄＴｄＴ ３プライムオーバーハングを含む表１に示す未修飾二重鎖２１マー ｓｉＲＮＡを合成し、Thermo Fisher ScientificまたはIntegrated DNA Technologiesから入手した。ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２筋芽細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、リポフェクトアミン RNAiMAX(Invitrogen)を用いて、メーカーの説明書に従って実施した。概略を説明すると、細胞を１２ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、約２０時間後に２μｌのリポフェクトアミン RNAiMAXおよび１０ｐｍｏｌ以下の遺伝子特異的ｓｉＲＮＡまたは１００μｌ Opti-MEM 低血清培地で希釈したスクランブル非サイレンス対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、４８時間後または７２時間後に、細胞を分化培地で４０時間インキュベートして筋管への分化を誘導し、全ＲＮＡ解析のために採取した。
【0115】
ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２筋管におけるＤＵＸ４標的遺伝子発現の測定。RNeasy Mini Kit （Qiagen、Hilden、Germany）を用いて、製造者の指示に従い全細胞から全ＲＮＡを抽出した。単離したＲＮＡをＤＮａｓｅ Ｉ（Thermo Fisher Scientific）で処理し、熱不活性化した後、Superscript III（Thermo Fisher Scientific）およびオリゴ（ｄＴ）プライマー（Invitrogen）を用いて製造元のプロトコルに従いｃＤＮＡへ逆転写した。ｑＰＣＲをｃＤＮＡで行い、ＤＵＸ４の発現を測定した。ＤＵＸ４の発現は、ＤＵＸ４によって発現が上昇する遺伝子、例えば、ＭＢＤ３Ｌ２、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＭＹＯＧおよびＭＹＨ２の発現をTaqMan Gene Expression Assay ＩＤ番号：ＭＢＤ３Ｌ２、Ｈｓ００５４４７４３_ｍ１；ＭＹＨ２、Ｈｓ００４３００４２_ｍ１；ＭＹＯＧ、Ｈｓ０１０７２２３２_ｍ１；ＲＰＬ３０、Ｈｓ００２６５４９７_ｍ１；ＬＥＵＴＸ、Ｈｓ０１０２８７１８_ｍ１；ＺＳＣＡＮ４、Ｈｓ００５３７５４９_ｍ１；または、プローブの５’末端に結合した蛍光色素（６ＦＡＭ）およびプローブの３’末端に結合したマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）および非蛍光性クエンチャー（ＮＦＱ）を有する、プライマーＧＣＣＧＣＣＣＡＧＧＴＡＣＣＡ（配列番号５９４）およびＣＡＧＣＧＡＧＣＴＣＣＣＴＴＧＣＡ（配列番号５９５）ならびにプローブＣＡＧＴＧＣＧＣＡＣＣＣＣＧ（配列番号５９６）を含むＤＵＸ４で測定することにより測定できる。
【0116】
結果を以下の表２および表３にまとめた。ＭＢ２００または５４－２筋芽細胞は、表１に示すｓｉＲＮＡで上記のようにトランスフェクトされた。ＲＮＡを単離し、ｑＲＴ－ＰＣＲで解析した。ＭＢＤ３Ｌ２の発現についての結果を、対照を導入した細胞での発現に対する相対的な発現率として、以下の表２および表３に示す。その結果は、いくつかのアンチセンスｓｉＲＮＡがＤＵＸ４発現を阻害することを示した。
【0117】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【表2-6】
【0118】
【表3-1】
【表3-2】
【0119】
実施例３：アンチセンスｓｉＲＮＡを用いたＤＵＸ４の阻害
１０ｎＭ、２ｎＭおよび０．４ｎＭの濃度を用いて、さらなる用量応答試験を行った。ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２筋芽細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、リポフェクトアミン RNAiMAX（Invitrogen）を用いて上記と同様に実施した。概略を説明すると、１２ウェル培養プレートで１ｍｌの通常の増殖培地に１×１０５細胞／ウェルで細胞を播種した。約２０時間後、まず２μｌのリポフェクトアミン RNAiMAXおよび１０ｐｍｏｌ、２ｐｍｏｌまたは０．４ｐｍｏｌの遺伝子特異的ｓｉＲＮＡまたはスクランブル非サイレンシング対照ｓｉＲＮＡを１００μｌ Opti-MEM 低血清培地で希釈してリポフェクトアミン／ｓｉＲＮＡ複合体を作製し、細胞をトランスフェクトした。その後、リポフェクタミン／ｓｉＲＮＡ複合体を筋芽細胞を含む培養プレートの１ウェルに滴下添加した。トランスフェクションから２４時間後、細胞を分化培地で４０時間培養して筋管への分化を誘導し、全ＲＮＡ解析のために細胞を採取した。
１０ｎＭ、２ｎＭおよび０．４ｎＭの濃度を用いて、さらなる用量応答試験を行った。ＦＳＨＤ１およびＦＳＨＤ２筋芽細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、リポフェクトアミン RNAiMAX（Invitrogen）を用いて上記と同様に実施した。概略を説明すると、１２ウェル培養プレートで１ｍｌの通常の増殖培地に１×１０５細胞／ウェルで細胞を播種した。約２０時間後、まず２μｌのリポフェクトアミン RNAiMAXおよび１０ｐｍｏｌ、２ｐｍｏｌまたは０．４ｐｍｏｌの遺伝子特異的ｓｉＲＮＡまたはスクランブル非サイレンシング対照ｓｉＲＮＡを１００μｌ Opti-MEM 低血清培地で希釈してリポフェクトアミン／ｓｉＲＮＡ複合体を作製し、細胞をトランスフェクトした。その後、リポフェクタミン／ｓｉＲＮＡ複合体を筋芽細胞を含む培養プレートの１ウェルに滴下添加した。トランスフェクションから２４時間後、細胞を分化培地で４０時間培養して筋管への分化を誘導し、全ＲＮＡ解析のために細胞を採取した。
【0120】
各ｓｉＲＮＡの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を決定するために、まず、水中の濃縮ストックからｓｉＲＮＡの３倍連続希釈液を９６ウェルプレートに作成することによって、７点濃度応答曲線を作成した。その後、上記と同様にトランスフェクションを行った。ＩＣ５０は、４パラメータロジスティック方程式を用いた非線形回帰により決定した（GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA; http://www.graphpad.com）。データは、有効数字２桁のＩＣ５０として表示される。用量応答試験およびＩＣ５０試験のデータを表４にまとめた。
【0121】
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表4-4】
【表4-5】
【0122】
実施例４：ｓｉＲＮＡの修飾
ｓｉＲＮＡ ＵＧＮＸ－１８９８（センス鎖配列 配列番号４１およびアンチセンス鎖配列 配列番号４２を含む）は、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれの３’末端にＴＴオーバーハングを付加し、センス鎖に２’Ｏ－メチル修飾リボース糖を組み込むことにより、以下に示すように改変された（太字－ ＴＴオーバーハング、下線－ ２’Ｏ－メチル化）。
ｓｉＲＮＡ ＵＧＮＸ－１８９８（センス鎖配列 配列番号４１およびアンチセンス鎖配列 配列番号４２を含む）は、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれの３’末端にＴＴオーバーハングを付加し、センス鎖に２’Ｏ－メチル修飾リボース糖を組み込むことにより、以下に示すように改変された（太字－ ＴＴオーバーハング、下線－ ２’Ｏ－メチル化）。
【数1】
【0123】
非修飾および修飾ｓｉＲＮＡによるＤＵＸ４の阻害は、ＭＢＤ３Ｌ２の発現を測定することにより、実施例２に記載のように決定された。このデータは、図１Ａ（非修飾）および図１Ｂ（修飾）にまとめられ、修飾ｓｉＲＮＡがインビトロで最小限の効力損失を示したことを証明している。
【0124】
実施例５：ｓｉＲＮＡの修飾
この実施例では、ＤＵＸ４を標的とする化学修飾ｓｉＲＮＡ化合物を生成するために、様々な化学修飾が行われた。化学修飾されたｓｉＲＮＡを表５に示す。
この実施例では、ＤＵＸ４を標的とする化学修飾ｓｉＲＮＡ化合物を生成するために、様々な化学修飾が行われた。化学修飾されたｓｉＲＮＡを表５に示す。
【0125】
【表5-1】
【表5-2】
【0126】
合成後、表５に示す化学修飾化合物を、効力および安定性について評価した。結果は表６に示すとおりである。
【0127】
ＭＢ２００および５４－２の効力アッセイを実施例２～３に記載したように実施し、一方、培養ヒト肝細胞癌細胞株（ＨｅｐＧ２）における効力を、以下のように測定した。簡単に説明すると、ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２を凍結回復させて播種した。細胞を、９６ウェル培養プレート中に９０ｕｌ ＥＭＥＭ ＋ １０％ ＦＢＳに１ ｘ １０５ 細胞／ウェルで播種した。その後、化学修飾したｓｉＲＮＡ配列を、リポフェクトアミン RNAiMAX（Thermo-Fisher Scientific）を用いて、量を変えながらトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を溶解バッファーで溶解させ、その後のQuantigene Singleplex 遺伝子発現解析（Thermo-Fisher Scientific）のために採取した。ＨｅｐＧ２の効力値を、陰性対照ｓｉＲＮＡに正規化した相対的なＤＵＸ４遺伝子発現として測定し、表６に例示するように、＋＝０．５、＋＋＝＜０．５とした。
【0128】
一方、化学修飾されたｓｉＲＮＡの安定性は、ヒト血清中で以下のように測定した。まず、各ｓｉＲＮＡ配列１ｕＭを１０％ヒト血清と共に３７℃のヒートブロックで２時間インキュベートした。さらに、各ｓｉＲＮＡ配列１ｕＭを同条件で無血清でインキュベートした。インキュベーション後、ｓｉＲＮＡ／血清およびｓｉＲＮＡ単独の混合物をドライアイス上で瞬間凍結した。次に、安定性を判断するために、チップの調製に関するメーカーのプロトコルに従って、サンプルにAgilent Small RNA Assayを実施した。サンプルはAgilent 2100 Bioanalyzer装置で実施した。安定性は、エレクトロフェログラムにおけるピークの存在および遷移電気泳動ゲルにおけるバンドの存在で判断した。定量性は、ピークのサイズ分布で回収率を表し、表６に示すように、５０％＝＋、５０～７５％＝＋＋、７５％以上＝＋＋とした。
【0129】
【表6-1】
【表6-2】
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】