▶ インスティチュート・オブ・ズーロジー、チャイニーズ・アカデミー・オブ・サイエンシズの特許一覧 ▶ ベイジン・インスティチュート・フォー・ステム・セル・アンド・リジェネラティヴ・メディスンの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-14
(54)【発明の名称】神経細胞の拡大培養培地及び培養法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0793 20100101AFI20230907BHJP
C12N 5/0797 20100101ALI20230907BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230907BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230907BHJP
A61K 35/30 20150101ALI20230907BHJP
A61K 35/545 20150101ALN20230907BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0793
C12N5/0797
A61P25/00
A61P25/16
A61K35/30
A61K35/545
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023512000
(86)(22)【出願日】2021-08-17
(85)【翻訳文提出日】2023-04-11
(86)【国際出願番号】 CN2021112986
(87)【国際公開番号】W WO2022037570
(87)【国際公開日】2022-02-24
(31)【優先権主張番号】202010824749.3
(32)【優先日】2020-08-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522110751
【氏名又は名称】インスティチュート・オブ・ズーロジー、チャイニーズ・アカデミー・オブ・サイエンシズ
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＺＯＯＬＯＧＹ， ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ
【住所又は居所原語表記】１ Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１０１， Ｃｈｉｎａ
(71)【出願人】
【識別番号】522110740
【氏名又は名称】ベイジン・インスティチュート・フォー・ステム・セル・アンド・リジェネラティヴ・メディスン
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＩＪＩＮＧ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＲＥＧＥＮＥＲＡＴＩＶＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ
【住所又は居所原語表記】３Ａ， Ｄａｔｕｎ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， １００１０１， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100110423
【弁理士】
【氏名又は名称】曾我 道治
(74)【代理人】
【識別番号】100111648
【弁理士】
【氏名又は名称】梶並 順
(74)【代理人】
【識別番号】100122437
【弁理士】
【氏名又は名称】大宅 一宏
(74)【代理人】
【識別番号】100209495
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 さおり
(72)【発明者】
【氏名】シュウ、チ
(72)【発明者】
【氏名】リ、ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ハオ、ジェ
(72)【発明者】
【氏名】ワン、ユカイ
(72)【発明者】
【氏名】フェン、リン
(72)【発明者】
【氏名】ワン、リウ
(72)【発明者】
【氏名】フ、バォヤン
(72)【発明者】
【氏名】サン、ユン
(72)【発明者】
【氏名】ティアン、ヤオ
(72)【発明者】
【氏名】ヘ、ジェンクァン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065BB40
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB45
4C087BB57
4C087BB65
4C087CA04
4C087DA32
4C087NA14
4C087ZA02
(57)【要約】
神経細胞のための培養培地及び培養方法、特に、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路アゴニスト、Ｗｎｔシグナル伝達経路アゴニスト、及びミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤を含み、任意にＲＯＣＫ阻害剤を更に含む組成物、又はＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路アゴニスト、Ｗｎｔシグナル伝達経路アゴニスト、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤、及び任意にＲＯＣＫ阻害剤からなる組成物に関する。中脳ドーパミン神経細胞前駆体等の神経細胞の同一のバッチを、上記組成物に基づいて設計された培養方法及び培養培地を用いることによって効率的に得ることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＭＡＤシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路アゴニスト、Ｗｎｔシグナル伝達経路アゴニスト、及びミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤を含み、任意にＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）を更に含むか、或いは、ＳＭＡＤシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路アゴニスト、Ｗｎｔシグナル伝達経路アゴニスト、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤、及び任意にＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）からなる、組成物。
【請求項2】
前記ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤が、ブレビスタチン及びその誘導体（例えば、（Ｓ）－（－）－ブレビスタチンＯ－ベンゾエート）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記ＳＭＡＤシグナル伝達経路阻害剤が、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、前記ＢＭＰ阻害剤が、ＤＭＨ－１、ドルソモルフィン、ノギン、ＬＤＮ１９３１８９及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、
好ましくは、前記ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、Ａ８３－０１及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、
請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＳＨＨシグナル伝達経路アゴニストが、ＳＨＨタンパク質、スムーズンド（Smoothend）アゴニスト及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、前記ＳＨＨタンパク質が、組換えＳＨＨ及び末端修飾ＳＨＨ（例えば、ＳＨＨ Ｃ２５ＩＩ）からなる群から選択され、
好ましくは、前記スムーズンド（Smoothend）アゴニストが、ＳＡＧ、Ｈｈ－Ａｇ１．５、２０α－ヒドロキシコレステロール、プルモルファミン及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、
請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記Ｗｎｔシグナル伝達経路アゴニストが、ＧＳＫ３β阻害剤、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ１及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、前記ＧＳＫ３β阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＧＳＫ３β阻害剤ＩＸ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム、ＢＩＯ）、ＧＳＫ３β阻害剤ＶＩＩ（４－ジブロモアセトフェノン）、インジルビン、Ｌ８０３－ｍｔｓ、ＴＷＳ１１９、ＡＺＤ２８５８、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＴＤＺＤ－８、ＬＹ２０９０３１４、２－Ｄ０８、ＩＭ－１２、１－アザケンパウロン、ＳＢ２１６７６３、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される、
請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記組成物が、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤、ＳＨＨタンパク質、スムーズンドアゴニスト、ＧＳＫ３β阻害剤、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤、及び任意にＲＯＣＫ阻害剤を含み、好ましくは、前記組成物が、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、組換えＳＨＨ、ＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１、ブレビスタチン、及び任意にＹ－２７６３２を含むか、或いは、前記組成物が、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤、ＳＨＨタンパク質、スムーズンドアゴニスト、ＧＳＫ３β阻害剤、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤、及び任意にＲＯＣＫ阻害剤からなり、好ましくは、前記組成物が、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、組換えＳＨＨ、ＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１、ブレビスタチン及び任意にＹ－２７６３２からなる、
請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物と、基本培養培地、好ましくは、神経細胞の培養に適している基本培養培地とを含む培養培地。
【請求項8】
前記基本培養培地が、以下の物質：１つ以上の無血清代用物、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチドを補充した基本培養培地であり、好ましくは、前記基本培養培地が、以下の物質：Ｎ２サプリメント及びＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチドを補充した基本培養培地であり、
好ましくは、前記基本培養培地が、以下の成分：４９％ＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ－１２＋４９％ＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋１％ＣＴＳ（商標）Ｎ２サプリメント＋１％ＣＴＳ－ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉを含む、
請求項７に記載の培養培地。
【請求項9】
前記培養培地において、前記組成物の各成分の含有量が次の通りである、請求項７又は８に記載の培養培地：０．０５μＭ～１μＭ ＢＭＰ阻害剤、５μＭ～２０μＭ ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤、５０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬ ＳＨＨタンパク質、０．５μＭ～３μＭ スムーズンドアゴニスト、０．５μＭ～１．０μＭ ＧＳＫ３β阻害剤、及び５μＭ～２０μＭミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤；
好ましくは、１０μＭ ＳＢ４３１５４２、１００ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＨＨ、２μＭ ＳＡＧ、０．５μＭ～１．０μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、及び１０μＭブレビスタチン。
【請求項10】
請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物と基本培養培地とを含む培養培地であって、培地が以下から選択され、（１）請求項７～９のいずれか一項に記載の培養培地；
（２）以下の物質：１つ以上の無血清代用物、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＴＧＦβ１、及びブレビスタチン又はその誘導体を補充した基本培養培地；
好ましくは、以下の物質：Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＴＧＦβ１及びブレビスタチンを補充した基本培養培地；
好ましくは、前記培養培地は、以下の成分：４８％ＤＭＥＭ／Ｆ－１２＋４８％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋１％Ｎ２＋２％Ｂ２７＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２＋１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１＋１０μｍブレビスタチンを含む；
（３）以下の物質：１つ以上の無血清代用物、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤、及びブレビスタチン又はその誘導体を補充した基本培養培地；
好ましくは、以下の物質：Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＳＨＨ、プルモルファミン及びブレビスタチンを補充した基本培養培地；
好ましくは、前記培養培地は、以下の成分：４８％ＤＭＥＭ／Ｆ－１２＋４８％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋１％Ｎ２＋２％Ｂ２７＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１００ｎｇ／ｍＬ ＳＨＨ＋１μＭプルモルファミン＋１０μｍブレビスタチンを含む；
（４）以下の物質：グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＩＬ－３４、Ｍ－ＣＳＦ、及びブレビスタチン又はその誘導体を補充した基本培養培地；
好ましくは、以下の物質：Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＩＬ－３４、Ｍ－ＣＳＦ、及びブレビスタチン又はその誘導体を補充した基本培養培地；
好ましくは、前記培養培地は、以下の成分：Ｘ－ＶＩＶＯ１５＋×Ｇｌｕｔａｍａｘ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３４＋５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ＋１０μＭブレビスタチンを含む；並びに、
（５）以下の物質：１つ以上の無血清代用物、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ヘパリン、及びブレビスタチン又はその誘導体を補充した基本培養培地；
好ましくは、以下の物質：Ｂ２７サプリメント、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ヘパリン及びブレビスタチンを補充した基本培養培地；
好ましくは、前記培養培地は、以下の成分：ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２０μｇ／ｍＬ ＥＧＦ＋２０μｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ＋５μｇ／ｍｌヘパリン＋２％Ｂ２７＋１×ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０μＭブレビスタチンを含む；
好ましくは、上記項目のいずれかに記載される基本培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、神経誘導培地(Neural Induction Media)、又はＸ－ＶＩＶＯからなる群から選択される、
培養培地。
【請求項11】
請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項７～１０のいずれか一項に記載の培養培地を含み、任意に使用説明書を更に含む、キット。
【請求項12】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の数を維持又は増加させる方法であって、請求項７～１０のいずれか一項に記載の培養培地中で細胞を培養する工程を含み、好ましくは、前記細胞が、運動ニューロン前駆細胞、皮質ニューロン前駆体、ＧＡＢＡ作動性前駆体、セロトニン作動性前駆体、中脳ドーパミン作動性前駆体、星状膠細胞、神経幹細胞、又はミクログリア細胞から選択され、
好ましくは、前記培養を行う方法が、前記細胞を単一細胞懸濁液に調製すること、前記単一細胞懸濁液を２×１０４／ｃｍ２～６×１０４／ｃｍ２の密度で前記培養培地に接種すること、接着培養又は懸濁培養を行うこと、及び前記細胞を５日～８日ごとに１回継代することであり、各継代の培養条件は同じである、方法。
【請求項13】
請求項１２に記載の方法により調製された、細胞又は細胞集団。
【請求項14】
前記細胞が神経細胞又は神経関連細胞から選択される、請求項１３に記載の細胞又は細胞集団。
【請求項15】
前記細胞が、運動ニューロン前駆細胞、皮質ニューロン前駆体、ＧＡＢＡ作動性前駆体、セロトニンニューロン前駆体、中脳ドーパミン神経細胞前駆体、星状膠細胞、神経幹細胞、又はミクログリア細胞からなる群から選択される、請求項１３又は１４に記載の細胞又は細胞集団。
【請求項16】
６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超又は９９％超の前記細胞が、少なくとも１つ以上の以下のマーカー：ＰＣＤＨＧＢ１、ＳＯＸ３、ＳＥＭＡ３Ｄ、ＶＧＦ、ＮＥＦＬ、ＮＴＲＫ２、ＰＣＤＨＧＡ３、ＣＮＴＮ１、ＢＤＮＦ、ＳＴＭＮ１、ＴＮＣ、ＦＡＩＭ２、ＣＨＧＢ、ＧＡＰ４３、ＡＲＰＰ２１、ＡＬＣＡＭ、ＯＴＰ、ＫＣＮＦ１、ＦＯＸＰ１、ＲＴＮ１、ＭＡＰＴ、ＩＧＦＢＰ５、ＮＮＡＴ、ＣＨＲＮＡ６、Ｃ１ＱＬ１、ＩＮＡ、ＴＮＲ、ＰＨＬＤＡ１、ＥＬＡＶＬ３、ＴＥＮＭ１、ＮＲＮ１、ＣＲＭＰ１、ＳＣＧ２、ＰＭＰ２２、及びＮＳＧ１を特異的に発現し、好ましくは、前記マーカーの発現レベルが、初代細胞の発現レベルよりも少なくとも約１．５倍、２．０倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍又は１００倍高い、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の細胞又は細胞集団。
【請求項17】
６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超又は９９％超の前記細胞が、少なくとも１つ以上の以下のマーカー：ＭＴＮＤ４ＬＰ７、ＡＬ０３１７７７．３、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＳＹＮＰＯ２、ＬＭＯ２、ＭＧＡＴ２、ＰＤＸＰ、ＤＮＡＪＣ６、ＤＮＡＪＣ２２、ＥＬＮ、ＭＩＲ５６８、ＭＩＲ１１７９、ＭＩＲ６８９２、ＭＩＲ７－３ＨＧ、ＡＮＧＰＴＬ１、ＨＳＰＥ１－ＭＯＢ４、ＩＮＯ８０Ｂ－ＷＢＰ１、Ｒ３ＨＤＭＬ、ＰＭＦ１－ＢＧＬＡＰ、ＰＬＰ１、ＡＰ００２７４８．４、ＭＤＦＩ、ＲＣＮ３、ＦＳＴ、ＨＳＰＨ１、ＰＣＢＰ１、ＡＳＰＮ、ＴＳＰＡＮ８、ＬＩＮＣ０１８６６、ＬＥＦＴＹ２、ＧＭＮＣ、ＡＴＰ５ＭＦ－ＰＴＣＤ１、ＣＣＤＣ９６、ＡＬＧ１４、ＩＬ１１、Ａ２Ｍ、Ｃ４Ｂ、ＩＴＧＢ４、ＳＴＣ１、ＴＭＥＭ２２９Ｂ、ＭＵＣ５ＡＣ、ＴＡＣ１、ＣＲＡＢＰ１、ＣＲＡＢＰ２、Ｈ１９、Ｃ２２ｏｒｆ４２、ＲＣＡＮ２、ＰＣＳＫ１、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＸＣＬ１２、ＤＣＮ、ＳＳＴＲ１、ＭＡＰ７Ｄ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｃ、ＬＲＦＮ５、ＤＩＲＡＳ３、ＣＡ１０、Ｃ４Ａ、ＡＰ００２３７３．１、ＡＭＩＧＯ３、ＧＤＡ、ＥＤＩＬ３、ＣＦＨ、ＴＧＦＢＩ、ＣＬＳＴＮ２、ＦＢＬＮ５、ＨＰＣＡＬ４、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１、ＮＮＭＴ、ＣＤ４４、ＳＭＯＣ１、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＤＬＸ５、ＬＹＮＸ１、ＳＹＮＣ、ＴＣＡＦ１Ｐ１、ＣＤ９、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＡＶＩＮ１、ＬＭＯ４、ＴＣＦ１２、ＧＤＥ１、ＧＮＧ３、ＰＥＧ１０、ＴＦＰＩ２、ＣＥＮＰＦ、ＣＡＭＫ２Ｎ１、ＭＬＬＴ１１を特異的に発現し、好ましくは、前記マーカーの発現レベルが、初代細胞の発現レベルよりも少なくとも約１．５倍、２．０倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍又は１００倍高い、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の細胞又は細胞集団。
【請求項18】
前記初代細胞から少なくとも約１．５倍、２．０倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、５００倍、１０００倍、１００００倍又は１０００００倍に拡大される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の細胞又は細胞集団。
【請求項19】
細胞又は細胞集団であって、前記細胞が中脳ドーパミン神経細胞前駆体であり、
好ましくは、前記細胞の少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば１００％）が、前記中脳ドーパミン神経細胞前駆体の少なくとも１つのマーカー、例えばＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、及びＯＴＸ２を発現する、細胞又は細胞集団。
【請求項20】
前記細胞がＴＵＪ１を発現しない、請求項１９に記載の細胞又は細胞集団。
【請求項21】
前記細胞が、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の特徴のいずれか１つ以上を有する、請求項１９又は２０に記載の細胞又は細胞集団。
【請求項22】
前記細胞がＴＵＪ１を発現する、請求項１９に記載の細胞又は細胞集団。
【請求項23】
前記細胞が、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の特徴の１つ以上を有する、請求項２２に記載の細胞又は細胞集団。
【請求項24】
請求項１３～２３のいずれか一項に記載の細胞又は細胞集団を含む、医薬組成物。
【請求項25】
神経系疾患（例えば、ドーパミン神経細胞損傷によって引き起こされる疾患（例えば、パーキンソン病））を治療するための医薬の製造における請求項１３～２３のいずれか一項に記載の細胞又は細胞集団の使用。
【請求項26】
神経系疾患（例えば、ドーパミン神経細胞損傷によって引き起こされる疾患（例えば、パーキンソン病））を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項１３～２３のいずれか一項に記載の細胞又は細胞集団を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、中国特許出願第２０２０１０８２４７４９．３号及び２０２０年８月１７日の出願日を基礎とし、その優先権を主張する。本中国特許出願の開示内容は、その全体が引用することにより本願の一部をなす。
【0002】
本願は、神経細胞培養技術に関し、特に神経細胞の拡大培養培地及び培養方法に関する。この培養培地及び培養方法を用いることにより、多数の神経細胞を効率よく得ることができ、その後の分化に際して安定した質の神経細胞を得ることで神経細胞欠損による疾患（パーキンソン病）に対する細胞療法を実現することができる。
【背景技術】
【0003】
パーキンソン病は中枢神経系の変性疾患であり、中年及び高齢者によくみられる。主な病因は、黒質における中脳ドーパミン作動性ニューロンの大量死であり、その結果、脳におけるドーパミン伝達物質の合成が減少し、それによって行動に影響を及ぼす。黒質の中脳ドーパミン作動性ニューロンは、胚期に中脳底板細胞から分化し、線条体に投射してループを形成する。中脳ドーパミン作動性ニューロンは成熟後にドーパミン伝達物質を放出し、個体の運動の調節に重要な役割を果たす。
【0004】
中脳底板細胞は初期胚から単離することができ、多能性幹細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏ分化により得ることもできる。既存の分化方法は、ＢＭＰ及びＴＧＦの阻害剤を用いてＳＭＡＤシグナル伝達経路を二重に阻害し、Ｗｎｔシグナル伝達及びＳＨＨシグナル伝達を活性化して多能性幹細胞を中脳底板細胞へと特殊化することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて初期胚発生のシグナル伝達経路をシミュレートする。次いで、ＦＧＦ８、ＤＡＰＴ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ等の処理下で、中脳底板細胞は更にドーパミン作動性ニューロンに分化する。
【0005】
中脳ドーパミン作動性ニューロンは、ニューロンの特定の亜集団である。培養過程の間、前駆体期に少量のＷｎｔシグナルと高用量のＳＨＨが必要であり、その後、成熟を促進するためにＦＧＦ８を加える必要がある。他の細胞と比較して、培養条件は非常に独特である。現在、培養過程に存在する問題は主に次に見られる：１）ｉｎ ｖｉｔｒｏで多能性幹細胞から分化した中脳底板細胞の質が不均一である；２）分化バッチの安定性が不良である；３）中脳ドーパミン作動性神経細胞の産生は中間細胞の安定したバルク拡大過程を欠いている。
【0006】
さらに、他の神経細胞、又はＧＡＢＡ前駆細胞、星状膠細胞及びミクログリア細胞等の神経関連細胞もパーキンソン病に重要な役割を果たしているが、これらは不安定な拡大の問題にも直面している。
【発明の概要】
【0007】
多くの創造的研究の後、本発明者らは、培地の組成を調整し、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤ブレビスタチンを加えることにより、中脳ドーパミン作動性前駆体、ＧＡＢＡ前駆体、星状膠細胞及びミクログリア細胞等の神経細胞又は神経関連細胞の拡大効率を著しく増加させることができ、バッチ拡大用に高品質の細胞を選択することができ、これにより高品質の神経細胞又は神経関連細胞（例えば、ドーパミン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ前駆体、星状膠細胞、ミクログリア細胞等）を得るための安定した方法が提供され、ドーパミン作動性細胞の欠損によって引き起こされるパーキンソン病及び他の疾患のための細胞治療の基礎が築かれることを見出した。
【0008】
第１の態様において、本願は、神経細胞の活性及び／又は機能を維持及び／又は改善するための１つ以上の添加剤、及びミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤を含む組成物を提供する。
【0009】
幾つかの実施の形態において、組成物は、ＳＭＡＤシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路アゴニスト、Ｗｎｔシグナル伝達経路アゴニスト、及びミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤を含み、任意にＲＯＣＫ阻害剤を更に含むか、
或いは、組成物は、ＳＭＡＤシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路アゴニスト、Ｗｎｔシグナル伝達経路アゴニスト、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤、及び任意にＲＯＣＫ阻害剤からなる。
或いは、組成物は、ＳＭＡＤシグナル伝達経路阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路アゴニスト、Ｗｎｔシグナル伝達経路アゴニスト、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤、及び任意にＲＯＣＫ阻害剤からなる。
【0010】
本願の実施の形態において、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤は、ミオシンＩＩ型ＡＴＰアーゼ阻害剤を指す。或る特定の実施の形態において、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤は、ブレビスタチン及びその誘導体、例えば、ブレビスタチン、すなわち、
の構造を有する（Ｓ）－（－）－ブレビスタチン、例えば、
の構造を有する（Ｓ）－（－）－ブレビスタチン－Ｏ－ベンゾエートから選択される。
【化1】
【化2】
【0011】
或る特定の実施の形態において、ＳＭＡＤシグナル伝達経路阻害剤は、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤、及びそれらの組合せから選択される。
【0012】
本願の実施の形態において、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）阻害剤は、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤である。或る特定の実施の形態において、ＢＭＰ阻害剤は、ＤＭＨ－１、ドルソモルフィン、ノギン、ＬＤＮ１９３１８９、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。その中で、ＬＤＮ１９３１８９は低分子ＤＭ－３１８９を指し、その化学式はＣ２５Ｈ２２Ｎ６であり、その化学名は４－（６－（４－（ピペリジン－１－イル）フェニル）－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）キノリンである。ＬＤＮ１９３１８９は、ＳＭＡＤシグナル伝達経路の阻害剤として作用し、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６及びＰＴＫの強力な低分子阻害剤でもある。ＬＤＮ１９３１８９は、ＴＧＦβ１受容体ＡＬＫ１及びＡＬＫ３ファミリーメンバーのシグナル伝達経路を阻害することができ、その結果、ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７）及びアクチビンを含む複数の生物学的シグナル伝達、並びにその後のＳＭＡＤ（例えば、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５及びＳｍａｄ８）のリン酸化を阻害する。
【0013】
本願の実施の形態において、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤は、ＴＧＦβがその受容体と結合し、継続的にＳＭＡＤにシグナルを伝達する経路を妨げる物質であり、これは、受容体としてのＡＬＫファミリーとの結合を妨げる物質、又はＡＬＫファミリーによって引き起こされるＳＭＡＤのリン酸化を妨げる物質から選択することができる。或る特定の実施の形態において、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、Ａ８３－０１、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。その中で、ＳＢ４３１５４２は、ＣＡＳ番号３０１８３６－４１－９、分子式Ｃ２２Ｈ１８Ｎ４Ｏ３、及び化学名４－［４－（１，３－ベンゾジオキサン－５－イル）－５－（２－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミドを有する、ＴＧＦ／アクチビン－ノーダルシグナル伝達経路の転写を減少又は遮断することができる小分子を指す。
【0014】
本願の実施の形態において、ＳＨＨシグナル伝達経路アゴニストは、ＳＨＨを、受容体であるパッチド（Ｐｔｃｈ１）に結合させ、その結果、スムーズンド(Smoothenod)（Ｓｍｏ）の脱阻害を生じ、更にＧｌｉ２活性化を引き起こす物質を指す。或る特定の実施の形態において、ＳＨＨシグナル伝達経路アゴニストは、ＳＨＨタンパク質、スムーズンド(Smoothend)アゴニスト及びそれらの組合せからなる群から選択される。或る特定の実施の形態において、ＳＨＨタンパク質は、組換えＳＨＨ及び末端修飾ＳＨＨ（例えば、ＳＨＨ Ｃ２５ＩＩ）からなる群から選択される。或る特定の実施の形態において、スムーズンド(Smoothend)アゴニストは、ＳＡＧ、Ｈｈ－Ａｇ１．５、２０α－ヒドロキシコレステロール、プルモルファミン及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。ＳＡＧは、分子式Ｃ２８Ｈ２８ＣｌＮ３ＯＳ、及びＣＡＳ番号９１２５４５－８６－９を有する。プルモルファミンはＣＡＳ番号４８３３６７－１０－８を有するプリン誘導体であり、スムーズンドを標的とすることを含むヘッジホッグシグナル伝達経路を活性化することができる。
【0015】
本願の実施の形態において、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、Ｗｎｔファミリーリガンド及びＷｎｔファミリー受容体で構成されるシグナル伝達経路を指す。或る特定の実施の形態において、Ｗｎｔシグナル伝達経路アゴニストは、ＧＳＫ３β阻害剤、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ１及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【0016】
本願の実施の形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βを阻害する化合物を指す。本願におけるＧＳＫ３β阻害剤は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化することができる。或る特定の実施の形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＧＳＫ３β阻害剤ＩＸ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム、ＢＩＯ）、ＧＳＫ３β阻害剤ＶＩＩ（４－ジブロモアセトフェノン）、インジルビン、Ｌ８０３－ｍｔｓ、ＴＷＳ１１９、ＡＺＤ２８５８、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＴＤＺＤ－８、ＬＹ２０９０３１４、２－Ｄ０８、ＩＭ－１２、１－アザケンパウロン、ＳＢ２１６７６３、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。その中で、ＣＨＩＲ９９０２１は、６－（２－（４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）ピリミジン－２－アミノ）エチルアミノ）ニコチノニトリルを指す。これはＧＳＫ３βの低分子阻害剤であり、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化することができる。
【0017】
本願の実施の形態において、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を阻害する物質、例えばＹ－２７６３２、ＨＡ１００又はＨＡ１１５２である。或る特定の実施の形態において、ＲＯＣＫ阻害剤はＹ－２７６３２である。
【0018】
幾つかの実施の形態において、組成物は、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤、ＳＨＨタンパク質、スムーズンドアゴニスト、ＧＳＫ３β阻害剤、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤、及び任意にＲＯＣＫ阻害剤を含むか、
或いは、組成物は、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤、ＳＨＨタンパク質、スムーズンドアゴニスト、ＧＳＫ３β阻害剤、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤、及び任意にＲＯＣＫ阻害剤からなる。
或いは、組成物は、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤、ＳＨＨタンパク質、スムーズンドアゴニスト、ＧＳＫ３β阻害剤、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤、及び任意にＲＯＣＫ阻害剤からなる。
【0019】
或る特定の実施の形態において、組成物は、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨ、ＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１、ブレビスタチン、及び任意にＹ－２７６３２を含むか、
或いは、組成物は、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨ、ＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１、ブレビスタチン、及び任意にＹ－２７６３２からなる。
或いは、組成物は、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨ、ＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１、ブレビスタチン、及び任意にＹ－２７６３２からなる。
【0020】
或る特定の実施の形態において、組成物は、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、ｂＦＧＦ（組換え塩基性線維芽細胞成長因子）及びブレビスタチンを含むか、
或いは、組成物は、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、ｂＦＧＦ及びブレビスタチンからなる。
或いは、組成物は、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、ｂＦＧＦ及びブレビスタチンからなる。
【0021】
第２の態様において、本願は、前述の組成物と基本培養培地とを含む培養培地を提供する。
【0022】
或る特定の実施の形態において、基本培養培地は、神経細胞の培養に適している。
【0023】
幾つかの実施の形態において、基本培養培地は、Ｎ２培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培養培地又は／及びＳｃｉｅｎｃｅｌｌ １８０１培地からなる群から選択される。
【0024】
或る特定の実施の形態において、基本培養培地はＮ２培地である。
【0025】
或る特定の実施の形態において、基本培養培地は、以下の物質：１つ以上の無血清代用物、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチドを補充した基本培養培地である。
【0026】
或る特定の実施の形態において、基本培養培地は、以下の物質：Ｎ２サプリメント、及びＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチドを補充した基本培養培地である。
【0027】
或る特定の実施の形態において、基本培養培地は、以下：４９％ＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ－１２＋４９％ＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋１％ＣＴＳ（商標）Ｎ２サプリメント＋１％ＣＴＳ－ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉで構成される。
【0028】
或る特定の実施の形態において、Ｎ２培地の成分は以下の通りである：４９％ＫＯＤＭＥＭ＋４９％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋１％Ｎ２サプリメント＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ。
【0029】
幾つかの実施の形態において、培地中の各成分の濃度は、そのそれぞれの生物学的機能を実現するための有効な濃度である。
【0030】
幾つかの実施の形態において、ＢＭＰ阻害剤の濃度は、例えば、０．０５μＭ～１μＭであり得るが、これに限定されない。幾つかの具体的な実施の形態において、ＢＭＰ阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１８９）の濃度は、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、又は１０００ｎＭであり得る。好ましい濃度は１００ｎＭである。
【0031】
或る特定の実施の形態において、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤の濃度は、５μＭ～２０μＭであり得るが、これに限定されない。幾つかの具体的な実施の形態において、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）の濃度は、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、又は２０μＭであり得る。好ましい濃度は１０μＭである。
【0032】
或る特定の実施の形態において、ＳＨＨタンパク質の濃度は、５０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬであり得るが、これに限定されない。幾つかの具体的な実施の形態において、ＳＨＨタンパク質（例えば、組換えＳＨＨ）の濃度は、例えば、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、又は２００ｎｇ／ｍＬである。好ましい濃度は１００ｎｇ／ｍＬである。
【0033】
或る特定の実施の形態において、スムーズンドアゴニストの濃度は、０．５μＭ～３μＭであり得るが、これに限定されない。幾つかの具体的な実施の形態において、スムーズンドアゴニスト（例えば、ＳＡＧ）の濃度は、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１．０μＭ、１．２μＭ、１．４μＭ、１．６μＭ、１．８μＭ、２．０μＭ、２．５μＭ、又は３．０μＭである。好ましい濃度は２．０μＭである。
【0034】
或る特定の実施の形態において、ＧＳＫ３β阻害剤の濃度は、０．５μＭ～１．０μＭであり得るが、これに限定されない。幾つかの具体的な実施の形態において、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）の濃度は、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ又は１．０μＭである。
【0035】
或る特定の実施の形態において、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤の濃度は、５μＭ～２０μＭであり得るが、これに限定されない。幾つかの具体的な実施の形態において、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤（例えば、ブレビスタチン）の濃度は、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ又は２０μＭである。好ましい濃度は１０μＭである。
【0036】
或る特定の実施の形態において、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、１μＭ～５０μＭであり得るが、これに限定されない。或る特定の実施の形態において、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、１μＭ～３０μＭ、例えば５μＭ～３０μＭである。幾つかの具体的な実施の形態において、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）の濃度は、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２１μＭ、２２μＭ、２３μＭ、２４μＭ、２５μＭ、２６μＭ、２７μＭ、２８μＭ、２９μＭ、又は３０μＭである。好ましい濃度は１０μＭである。
【0037】
幾つかの実施の形態において、培地は、Ｎ２培地、１０μＭ ＳＢ４３１５４２、１００ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＨＨ、２μＭ ＳＡＧ、０．５μＭ～１．０μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、及び１０μＭブレビスタチンを含む。
【0038】
幾つかの実施の形態において、培養培地は、例えば、中脳ドーパミンニューロン前駆体を拡大するための培養に適している。
【0039】
或る特定の実施の形態において、基本培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＮｅｕｒｏｂａｓａｌである。
【0040】
幾つかの実施の形態において、培地は、４９．２５％ＤＭＥＭ／Ｆ１２、４９．２５％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、０．５％Ｎ２サプリメント、１％Ｂ２７サプリメント、１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（組換え塩基性線維芽細胞成長因子）及び５μＭ～２０μＭブレビスタチンを含む。
【0041】
或る特定の実施の形態において、培地は、例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロン前駆体を拡大するための培養に適している。
【0042】
幾つかの実施の形態において、基本培養培地は、ＮＩＭ（Neural Induction Media：神経誘導培地）である。
【0043】
幾つかの実施の形態において、培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、及びＧｌｕｔａｍａｘ１０、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＴＧＦｂ１、及び５μＭ～２０μＭブレビスタチンを含む。
【0044】
或る特定の実施の形態において、培地は、例えば、星状膠細胞を拡大するための培養に適している。
【0045】
幾つかの実施の形態において、基本培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＫＯＳＲ、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、１×ＮＥＡＡ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｘ－ＶＩＶＯ、ＩＬ－３４、Ｙ－２７６３２及び５μＭ～２０μＭブレビスタチンである。
【0046】
或る特定の実施の形態において、培養培地は、例えば、ミクログリア細胞を拡大するための培養に適している。
【0047】
幾つかの実施の形態において、培地は、４９．２５％ＤＭＥＭ／Ｆ１２、４９．２５％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、０．５％Ｎ２サプリメント、１％Ｂ２７サプリメント、１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（組換え塩基性線維芽細胞成長因子）及び５μＭ～２０μＭブレビスタチンを含む。
【0048】
或る特定の実施の形態において、培地は、例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロン前駆体を拡大するための培養に適している。
【0049】
或る特定の実施の形態において、基本培養培地は、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ １８０１である。
【0050】
或る特定の実施の形態において、培地は５μＭ～２０μＭのブレビスタチンを含む。
【0051】
或る特定の実施の形態において、培養培地は、例えば、グリア細胞を拡大するための培養に適している。
【0052】
或る特定の実施の形態において、培地は、以下の物質：１つ以上の無血清代用物、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＴＧＦβ１、及びブレビスタチン又はその誘導体を補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、基本培養培地は、以下の物質：Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＴＧＦβ１及びブレビスタチンを補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、培地は、以下のもので構成される：４８％ＤＭＥＭ／Ｆ－１２＋４８％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋１％Ｎ２＋２％Ｂ２７＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２＋１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１＋１０μＭブレビスタチン。幾つかの実施の形態において、培地は、星状膠細胞の拡大培養に特に適している。
【0053】
或る特定の実施の形態において、培地は、以下の物質：１つ以上の無血清代用物、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤、及びブレビスタチン又はその誘導体を補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、基本培養培地は、以下の物質：Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＳＨＨ、プルモルファミン、及びブレビスタチンを補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、培地は、以下のもので構成される：４８％ＤＭＥＭ／Ｆ－１２＋４８％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋１％Ｎ２＋２％Ｂ２７＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１００ｎｇ／ｍＬ ＳＨＨ＋１μＭプルモルファミン＋１０μＭブレビスタチン。或る特定の実施の形態において、培地は、ＧＡＢＡ作動性神経前駆細胞の拡大培養に特に適している。
【0054】
或る特定の実施の形態において、培地は、以下の物質：グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＩＬ－３４、Ｍ－ＣＳＦ、及びブレビスタチン又はその誘導体を補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、基本培養培地は、以下の物質：Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＩＬ－３４、Ｍ－ＣＳＦ、及びブレビスタチン又はその誘導体を補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、培地は、以下のもので構成される：Ｘ－ＶＩＶＯ１５＋ＸＧｌｕｔａｍａｘ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３４＋５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ＋１０μＭブレビスタチン。幾つかの実施の形態において、培地は、ミクログリア細胞の拡大培養に特に適している。
【0055】
或る特定の実施の形態において、培地は、以下の物質：１つ以上の無血清代用物、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ヘパリン、及びブレビスタチン又はその誘導体を補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、基本培養培地は、以下の物質：Ｂ２７サプリメント、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ヘパリン、及びブレビスタチンを補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、培地は、以下のもので構成される：ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２０μｇ／ｍＬ ＥＧＦ＋２０μｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ＋５μｇ／ｍｌヘパリン＋２％Ｂ２７＋１×ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０μＭブレビスタチン。幾つかの実施の形態において、培養培地は、神経幹細胞の拡大培養に特に適している。
【0056】
或る特定の実施の形態において、上記項目のいずれかに記載されている基本培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、神経誘導培地(Neural Induction Media)、及びＸ－ＶＩＶＯからなる群から選択される。
【0057】
別の態様において、本願は、上述の組成物又は培養培地を含み、また任意に使用説明書を更に含むキットを提供する。
【0058】
別の態様において、本願は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで神経細胞又は神経関連細胞の数を維持又は増加させるためのミオシン阻害剤（例えば、ブレビスタチン、又はその誘導体（例えば、（Ｓ）－（－）－ブレビスタチンＯ－ベンゾエート））、又はミオシン阻害剤を含有する培養培地の使用を提供する。
【0059】
或る特定の実施の形態において、神経細胞又は神経関連細胞は、神経前駆細胞、運動ニューロン前駆体、皮質ニューロン前駆体、ＧＡＢＡ作動性ニューロン前駆体、セロトニンニューロン前駆体、中脳ドーパミン神経細胞前駆体、又は神経幹細胞、又はグリア細胞（例えば、星状膠細胞又はミクログリア細胞）からなる群から選択される。
【0060】
幾つかの実施の形態において、培地は、上記の第２の態様に記載される培地である。これは、中脳ドーパミン神経前駆細胞の数をｉｎ ｖｉｔｒｏで維持又は増加させるのに特に有用である。
【0061】
或る特定の実施の形態において、培地は、以下の物質：１つ以上の無血清代用物、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＴＧＦβ１、及びブレビスタチン又はその誘導体を補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、基本培養培地は、以下の物質：Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＴＧＦβ１及びブレビスタチンを補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、培地は、以下のもので構成される：４８％ＤＭＥＭ／Ｆ－１２＋４８％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋１％Ｎ２＋２％Ｂ２７＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２＋１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１＋１０μＭブレビスタチン。これは、中脳ドーパミン神経前駆細胞の数をｉｎ ｖｉｔｒｏで維持又は増加させるのに特に有用である。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで星状膠細胞の数を維持又は増加させるのに特に有用である。
【0062】
或る特定の実施の形態において、培地は、以下の物質：１つ以上の無血清代用物、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤、及びブレビスタチン又はその誘導体を補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、基本培養培地は、以下の物質：Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＳＨＨ、プルモルファミン、及びブレビスタチンを補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、培地は、以下のもので構成される：４８％ＤＭＥＭ／Ｆ－１２＋４８％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋１％Ｎ２＋２％Ｂ２７＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１００ｎｇ／ｍＬ ＳＨＨ＋１μＭプルモルファミン＋１０μＭブレビスタチン。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＡＢＡ作動性神経前駆細胞の数を維持又は増加させるのに特に有用である。
【0063】
或る特定の実施の形態において、培地は、以下の物質：グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＩＬ－３４、Ｍ－ＣＳＦ、及びブレビスタチン又はその誘導体を補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、基本培養培地は、以下の物質：Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＩＬ－３４、Ｍ－ＣＳＦ、及びブレビスタチン又はその誘導体を補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、培地は、以下のもので構成される：Ｘ－ＶＩＶＯ１５＋ＸＧｌｕｔａｍａｘ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３４＋５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ＋１０μＭブレビスタチン。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでミクログリア細胞の数を維持又は増加させるのに特に有用である。
【0064】
或る特定の実施の形態において、培地は、以下の物質：１つ以上の無血清代用物、グルタミン又はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ヘパリン、及びブレビスタチン又はその誘導体を補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、基本培養培地は、以下の物質：Ｂ２７サプリメント、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの安定化ジペプチド、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ヘパリン、及びブレビスタチンを補充した基本培養培地である。或る特定の実施の形態において、培地は、以下のもので構成される：ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２０μｇ／ｍＬ ＥＧＦ＋２０μｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ＋５μｇ／ｍｌヘパリン＋２％Ｂ２７＋１×ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０μＭブレビスタチン。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで神経幹細胞の数を維持又は増加させるのに特に適している。
【0065】
或る特定の実施の形態において、上記のいずれかに記載されている基本培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、神経誘導培地(Neural Induction Media)、及びＸ－ＶＩＶＯからなる群から選択される。
【0066】
別の態様において、本願は、前述の培地中で細胞を培養する工程を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の数を維持又は増加させる方法、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の数を維持又は増加させるための前述の培地の使用を提供する。
【0067】
幾つかの実施の形態において、培養を行う方法は、細胞を単一細胞懸濁液に調製すること、単一細胞懸濁液を２×１０４／ｃｍ２～６×１０４／ｃｍ２（好ましくは４×１０４／ｃｍ２）の密度で培養培地に接種すること、接着培養又は懸濁培養を行うこと、及び細胞を５日～８日ごとに１回継代することであり、各継代の培養条件は同じである。或る特定の実施の形態においては、４×１０４／ｃｍ２の密度で接種する。
【0068】
幾つかの実施の形態において、接着培養の条件は、細胞を単一細胞懸濁液に調製すること、単一細胞懸濁液を２×１０４／ｃｍ２～６×１０４／ｃｍ２の密度で培養培地中に接種すること、接着培養を行うこと、及び５日～８日ごとに１回細胞を継代することであり、各継代の培養条件は同一である。或る特定の実施の形態においては、４×１０４／ｃｍ２の密度で接種する。
【0069】
幾つかの実施の形態において、懸濁培養の条件は、細胞を単一細胞懸濁液に調製すること、単一細胞懸濁液を２×１０５／ｍＬ～６×１０５／ｍＬの密度で培養培地中に接種すること、懸濁培養を行うこと、及び５日～８日ごとに１回細胞を継代することであり、各継代の培養条件は同一である。或る特定の実施の形態においては、４×１０５／ｍＬの密度で接種する。
【0070】
或る特定の実施の形態において、細胞は、運動ニューロン前駆細胞である。或る特定の実施の形態において、細胞は、皮質神経前駆体である。或る特定の実施の形態において、細胞は、ＧＡＢＡ作動性ニューロン前駆体である。或る特定の実施の形態において、細胞は、セロトニン神経前駆体である。或る特定の実施の形態において、細胞は、星状膠細胞である。或る特定の実施の形態において、細胞は、神経幹細胞である。或る特定の実施の形態において、細胞は、ミクログリア細胞である。
【0071】
或る特定の実施の形態において、拡大された細胞は、初代細胞とゲノム同一である。
【0072】
別の態様において、本願は、上に記載される方法のいずれかによって調製又は拡大される細胞又は細胞集団を提供する。別の態様において、本願は、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超又は９９％超の細胞が、少なくとも１つ以上の以下のマーカー：ＰＣＤＨＧＢ１、ＳＯＸ３、ＳＥＭＡ３Ｄ、ＶＧＦ、ＮＥＦＬ、ＮＴＲＫ２、ＰＣＤＨＧＡ３、ＣＮＴＮ１、ＢＤＮＦ、ＳＴＭＮ１、ＴＮＣ、ＦＡＩＭ２、ＣＨＧＢ、ＧＡＰ４３、ＡＲＰＰ２１、ＡＬＣＡＭ、ＯＴＰ、ＫＣＮＦ１、ＦＯＸＰ１、ＲＴＮ１、ＭＡＰＴ、ＩＧＦＢＰ５、ＮＮＡＴ、ＣＨＲＮＡ６、Ｃ１ＱＬ１、ＩＮＡ、ＴＮＲ、ＰＨＬＤＡ１、ＥＬＡＶＬ３、ＴＥＮＭ１、ＮＲＮ１、ＣＲＭＰ１、ＳＣＧ２、ＰＭＰ２２、及びＮＳＧ１を特異的に発現し、好ましくは、マーカーの発現レベルが、初代細胞の発現レベルよりも少なくとも約１．５倍、２．０倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍又は１００倍高い、細胞又は細胞集団を提供する。
【0073】
或る特定の実施の形態において、細胞又は細胞集団において、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超又は９９％超の細胞が、少なくとも１つ以上の以下のマーカー：ＭＴＮＤ４ＬＰ７、ＡＬ０３１７７７．３、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＳＹＮＰＯ２、ＬＭＯ２、ＭＧＡＴ２、ＰＤＸＰ、ＤＮＡＪＣ６、ＤＮＡＪＣ２２、ＥＬＮ、ＭＩＲ５６８、ＭＩＲ１１７９、ＭＩＲ６８９２、ＭＩＲ７－３ＨＧ、ＡＮＧＰＴＬ１、ＨＳＰＥ１－ＭＯＢ４、ＩＮＯ８０Ｂ－ＷＢＰ１、Ｒ３ＨＤＭＬ、ＰＭＦ１－ＢＧＬＡＰ、ＰＬＰ１、ＡＰ００２７４８．４、ＭＤＦＩ、ＲＣＮ３、ＦＳＴ、ＨＳＰＨ１、ＰＣＢＰ１、ＡＳＰＮ、ＴＳＰＡＮ８、ＬＩＮＣ０１８６６、ＬＥＦＴＹ２、ＧＭＮＣ、ＡＴＰ５ＭＦ－ＰＴＣＤ１、ＣＣＤＣ９６、ＡＬＧ１４、ＩＬ１１、Ａ２Ｍ、Ｃ４Ｂ、ＩＴＧＢ４、ＳＴＣ１、ＴＭＥＭ２２９Ｂ、ＭＵＣ５ＡＣ、ＴＡＣ１、ＣＲＡＢＰ１、ＣＲＡＢＰ２、Ｈ１９、Ｃ２２ｏｒｆ４２、ＲＣＡＮ２、ＰＣＳＫ１、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＸＣＬ１２、ＤＣＮ、ＳＳＴＲ１、ＭＡＰ７Ｄ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｃ、ＬＲＦＮ５、ＤＩＲＡＳ３、ＣＡ１０、Ｃ４Ａ、ＡＰ００２３７３．１、ＡＭＩＧＯ３、ＧＤＡ、ＥＤＩＬ３、ＣＦＨ、ＴＧＦＢＩ、ＣＬＳＴＮ２、ＦＢＬＮ５、ＨＰＣＡＬ４、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１、ＮＮＭＴ、ＣＤ４４、ＳＭＯＣ１、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＤＬＸ５、ＬＹＮＸ１、ＳＹＮＣ、ＴＣＡＦ１Ｐ１、ＣＤ９、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＡＶＩＮ１、ＬＭＯ４、ＴＣＦ１２、ＧＤＥ１、ＧＮＧ３、ＰＥＧ１０、ＴＦＰＩ２、ＣＥＮＰＦ、ＣＡＭＫ２Ｎ１、及びＭＬＬＴ１１を特異的に発現し、好ましくは、マーカーの発現レベルが、初代細胞の発現レベルよりも少なくとも約１．５倍、２．０倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍又は１００倍高い。
【0074】
或る特定の実施の形態において、細胞又は細胞集団を調製する方法は、上記の態様で記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の数を維持又は増加させる方法において規定される工程を含む。
【0075】
或る特定の実施の形態において、細胞は、神経細胞又は神経関連細胞である。
【0076】
或る特定の実施の形態において、細胞は、運動ニューロン前駆体、皮質ニューロン前駆体、ＧＡＢＡ作動性前駆体、セロトニンニューロン前駆体、中脳ドーパミン作動性前駆体、星状膠細胞、神経幹細胞、及びミクログリア細胞からなる群から選択される。
【0077】
或る特定の実施の形態において、細胞は、初代細胞から少なくとも約１．５倍、２．０倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、５００倍、１０００倍、１００００倍又は１０００００倍に拡大される。
【0078】
別の態様において、本願において提供される細胞又は細胞集団は、中脳ドーパミン作動性前駆体である。或る特定の実施の形態において、細胞の少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば１００％）は、中脳ドーパミン神経細胞前駆体の少なくとも１つのマーカー、例えばＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、及びＯＴＸ２を発現する。或る特定の実施の形態において、細胞は、ＴＵＪ１を発現しない。或る特定の実施の形態において、細胞は、ＴＵＪ１を発現する。或る特定の実施の形態において、中脳ドーパミン神経細胞前駆体では、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超又は９９％超の細胞が、少なくとも１つ以上の以下のマーカー：ＰＣＤＨＧＢ１、ＳＯＸ３、ＳＥＭＡ３Ｄ、ＶＧＦ、ＮＥＦＬ、ＮＴＲＫ２、ＰＣＤＨＧＡ３、ＣＮＴＮ１、ＢＤＮＦ、ＳＴＭＮ１、ＴＮＣ、ＦＡＩＭ２、ＣＨＧＢ、ＧＡＰ４３、ＡＲＰＰ２１、ＡＬＣＡＭ、ＯＴＰ、ＫＣＮＦ１、ＦＯＸＰ１、ＲＴＮ１、ＭＡＰＴ、ＩＧＦＢＰ５、ＮＮＡＴ、ＣＨＲＮＡ６、Ｃ１ＱＬ１、ＩＮＡ、ＴＮＲ、ＰＨＬＤＡ１、ＥＬＡＶＬ３、ＴＥＮＭ１、ＮＲＮ１、ＣＲＭＰ１、ＳＣＧ２、ＰＭＰ２２、及びＮＳＧ１を特異的に発現し、好ましくは、マーカーの発現レベルが、初代細胞の発現レベルよりも少なくとも約１．５倍、２．０倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍又は１００倍高い。
【0079】
或る特定の実施の形態において、中脳ドーパミン神経細胞前駆体では、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超又は９９％超の細胞が、少なくとも１つ以上の以下のマーカー：ＭＴＮＤ４ＬＰ７、ＡＬ０３１７７７．３、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＳＹＮＰＯ２、ＬＭＯ２、ＭＧＡＴ２、ＰＤＸＰ、ＤＮＡＪＣ６、ＤＮＡＪＣ２２、ＥＬＮ、ＭＩＲ５６８、ＭＩＲ１１７９、ＭＩＲ６８９２、ＭＩＲ７－３ＨＧ、ＡＮＧＰＴＬ１、ＨＳＰＥ１－ＭＯＢ４、ＩＮＯ８０Ｂ－ＷＢＰ１、Ｒ３ＨＤＭＬ、ＰＭＦ１－ＢＧＬＡＰ、ＰＬＰ１、ＡＰ００２７４８．４、ＭＤＦＩ、ＲＣＮ３、ＦＳＴ、ＨＳＰＨ１、ＰＣＢＰ１、ＡＳＰＮ、ＴＳＰＡＮ８、ＬＩＮＣ０１８６６、ＬＥＦＴＹ２、ＧＭＮＣ、ＡＴＰ５ＭＦ－ＰＴＣＤ１、ＣＣＤＣ９６、ＡＬＧ１４、ＩＬ１１、Ａ２Ｍ、Ｃ４Ｂ、ＩＴＧＢ４、ＳＴＣ１、ＴＭＥＭ２２９Ｂ、ＭＵＣ５ＡＣ、ＴＡＣ１、ＣＲＡＢＰ１、ＣＲＡＢＰ２、Ｈ１９、Ｃ２２ｏｒｆ４２、ＲＣＡＮ２、ＰＣＳＫ１、ＶＡＴ１Ｌ、ＣＸＣＬ１２、ＤＣＮ、ＳＳＴＲ１、ＭＡＰ７Ｄ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｃ、ＬＲＦＮ５、ＤＩＲＡＳ３、ＣＡ１０、Ｃ４Ａ、ＡＰ００２３７３．１、ＡＭＩＧＯ３、ＧＤＡ、ＥＤＩＬ３、ＣＦＨ、ＴＧＦＢＩ、ＣＬＳＴＮ２、ＦＢＬＮ５、ＨＰＣＡＬ４、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１、ＮＮＭＴ、ＣＤ４４、ＳＭＯＣ１、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＤＬＸ５、ＬＹＮＸ１、ＳＹＮＣ、ＴＣＡＦ１Ｐ１、ＣＤ９、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＡＶＩＮ１、ＬＭＯ４、ＴＣＦ１２、ＧＤＥ１、ＧＮＧ３、ＰＥＧ１０、ＴＦＰＩ２、ＣＥＮＰＦ、ＣＡＭＫ２Ｎ１、及びＭＬＬＴ１１を特異的に発現し、好ましくは、マーカーの発現レベルが、初代細胞の発現レベルよりも少なくとも１．５倍、２．０倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍又は１００倍高い。
【0080】
別の態様において、本願は、以下の方法：
（１）第１の培養培地において、拡大された中脳ドーパミン神経細胞前駆体を６日間培養すること；
（２）工程（１）で得た細胞を第２の培養培地で８日間培養し、細胞又は細胞集団を得ること；
によって調製される細胞又は細胞集団を提供し、
第１の培養培地は、以下の物質：ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦ－β３、ＦＧＦ８、ＡＡ、及びＹ－２７６３２を添加した基本培養培地であり、好ましくは、第１の培養培地は、以下の物質：１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ、０．５ｎｇ／ｍｌ～５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ－β３、５０ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ８、０．１ｍＭ～１ｍＭ ＡＡ、及び１ｍＭ～３０ｍＭ Ｙ－２７６３２を補充した基本培養培地であり、好ましくは、第１の培養培地は、以下の物質：２０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ、１ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ－β３、１００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ８、０．２ｍＭ ＡＡ、及び１０ｍＭ Ｙ－２７６３２を補充した基本培養培地であり、
第２の培養培地は、以下の物質：ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦ－β３、ＦＧＦ８、ＡＡ、ｄｂ－ｃＡＭＰ、及びＤＡＰＴを補充した基本培養培地であり、好ましくは、第２の培養培地は、以下の物質：１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ、０．５ｎｇ／ｍｌ～５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ－β３、５００～２００ ＦＧＦ８、０．１ｍＭ～１ｍＭ ＡＡ、２００μＭ～１０００μＭ ｄｂ－ｃＡＭＰ、及び５μＭ～２０μＭ ＤＡＰＴを補充した基本培養培地であり、好ましくは、第２の培養培地は、２０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ、１ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ－β３、１００ ＦＧＦ８、０．２ｍＭ ＡＡ、５００μＭ ｄｂ－ｃＡＭＰ、及び１０μＭ ＤＡＰＴを補充した基本培養培地である。
（１）第１の培養培地において、拡大された中脳ドーパミン神経細胞前駆体を６日間培養すること；
（２）工程（１）で得た細胞を第２の培養培地で８日間培養し、細胞又は細胞集団を得ること；
によって調製される細胞又は細胞集団を提供し、
第１の培養培地は、以下の物質：ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦ－β３、ＦＧＦ８、ＡＡ、及びＹ－２７６３２を添加した基本培養培地であり、好ましくは、第１の培養培地は、以下の物質：１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ、０．５ｎｇ／ｍｌ～５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ－β３、５０ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ８、０．１ｍＭ～１ｍＭ ＡＡ、及び１ｍＭ～３０ｍＭ Ｙ－２７６３２を補充した基本培養培地であり、好ましくは、第１の培養培地は、以下の物質：２０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ、１ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ－β３、１００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ８、０．２ｍＭ ＡＡ、及び１０ｍＭ Ｙ－２７６３２を補充した基本培養培地であり、
第２の培養培地は、以下の物質：ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦ－β３、ＦＧＦ８、ＡＡ、ｄｂ－ｃＡＭＰ、及びＤＡＰＴを補充した基本培養培地であり、好ましくは、第２の培養培地は、以下の物質：１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ、０．５ｎｇ／ｍｌ～５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ－β３、５００～２００ ＦＧＦ８、０．１ｍＭ～１ｍＭ ＡＡ、２００μＭ～１０００μＭ ｄｂ－ｃＡＭＰ、及び５μＭ～２０μＭ ＤＡＰＴを補充した基本培養培地であり、好ましくは、第２の培養培地は、２０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ、１ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ－β３、１００ ＦＧＦ８、０．２ｍＭ ＡＡ、５００μＭ ｄｂ－ｃＡＭＰ、及び１０μＭ ＤＡＰＴを補充した基本培養培地である。
【0081】
或る特定の実施の形態において、基本培養培地はＢ２７である。
【0082】
或る特定の実施の形態において、上記で得られた拡大された中脳ドーパミン神経細胞前駆体を単一細胞懸濁液に調製し、１×１０４／ｃｍ２～１×１０６／ｃｍ２（例えば、１×１０４／ｃｍ２、５×１０４／ｃｍ２、１×１０５／ｃｍ２、５×１０４／ｃｍ２又は１×１０６／ｃｍ２）の密度で単一細胞懸濁液を第１の培養培地に接種する。
【0083】
別の態様において、本願は、更に、上記態様のいずれか１つに記載される細胞又は細胞集団を含む、医薬組成物を提供する。
【0084】
別の態様において、本願は、神経系疾患（例えば、ドーパミン作動性ニューロン損傷によって引き起こされる疾患（例えば、パーキンソン病））を治療するための医薬の製造における上記態様のいずれかに１つに記載される細胞又は細胞集団の使用を更に提供する。
【0085】
用語の定義
本明細書で使用される場合、「ドーパミン」という用語は、脳における運動及び協調を制御するニューロンにメッセージを送信するドーパミン作動性ニューロンによって産生される化学物質を指す。
本明細書で使用される場合、「ドーパミン」という用語は、脳における運動及び協調を制御するニューロンにメッセージを送信するドーパミン作動性ニューロンによって産生される化学物質を指す。
【0086】
本明細書で使用される場合、「神経前駆細胞」という用語は、例えば、運動ニューロン前駆体、皮質ニューロン前駆体、ＧＡＢＡ作動性ニューロン前駆体、セロトニンニューロン前駆体等の種々のタイプの神経前駆細胞を含む未成熟神経細胞を指す。
【0087】
本明細書で使用される場合、「中脳ドーパミン作動性前駆体」という用語は、「中脳底板細胞」と同じ意味を有し、未だ胚発生段階にある中脳ドーパミン作動性ニューロンを含む、ドーパミン作動性ニューロンに発達することができる中脳に位置する細胞を指す。或る特定の実施の形態において、中脳ドーパミン作動性前駆体は、以下の細胞マーカー：ＥＮ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＯＴＸ２等のうち１つ以上を発現する。
【0088】
本明細書で使用される場合、「ドーパミン作動性ニューロン」という用語は、一般に、ドーパミンを放出する細胞を指す。「中脳ドーパミン作動性ニューロン」は、ドーパミンを放出する前脳の細胞を指す。この細胞は、以下のマーカー：ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＴＨ、ＴＵＪ１等のうちの１つ以上を発現する。本明細書で使用される場合、「シグナル伝達経路」という用語は、膜タンパク質へのリガンド結合又は他の何らかの刺激によって活性化されるか、又は他の形の影響を受けるその効果を発揮するための下流タンパク質に対する一連の反応を指す（例えばＳＭＡＤ経路、Ｗｎｔ経路）。Ｗｎｔ経路の調節因子は、β－カテニン、ＧＳＫ３β等を含む。多くの細胞表面又は細胞内の受容体タンパク質では、リガンド－受容体相互作用は細胞応答に直接関連していない。リガンドによって活性化される受容体は、リガンドが細胞の挙動に生理学的効果を発揮し得る前に、他の細胞内タンパク質と相互作用しなければならない。典型的には、連鎖的に相互作用する幾つかの細胞タンパク質の挙動は、受容体の活性化又は阻害により変化する。受容体の活性化によって誘導される全体的な細胞の変化は、細胞の形質導入機構又はシグナル伝達経路と呼ばれる。
【0089】
本明細書で使用される場合、「阻害する」、「遮断する」又は「妨げる」という用語は、化合物（すなわち、阻害剤）で処理された細胞における特定のシグナル伝達経路の活性の低下を指す。
【発明の効果】
【0090】
本発明の有益な効果
本願は、培養培地の成分を調整すること、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤ブレビスタチンを加えること、及び中脳ドーパミン作動性前駆体等の種々の神経細胞又は神経関連細胞を得るために拡大培養することにより、以下の技術的効果のうちの少なくとも１つを達成した。
本願は、培養培地の成分を調整すること、ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤ブレビスタチンを加えること、及び中脳ドーパミン作動性前駆体等の種々の神経細胞又は神経関連細胞を得るために拡大培養することにより、以下の技術的効果のうちの少なくとも１つを達成した。
【0091】
１．神経細胞又は神経関連細胞の拡大効率、特に中脳底板細胞又は中脳ドーパミン作動性前駆体の拡大効率が大幅に向上し、それにより、大規模な細胞拡大を実現し、科学的研究又は商業化に有用な細胞株の樹立を実現する。
【0092】
２．拡大効率の改善に基づき、神経前駆細胞の分化過程において、中間体生成物を拡大させるための技術的手順を設計し、それにより、同じバッチから多数のシード細胞を得て、シード細胞バンクを樹立することが可能である。
【0093】
３．幾つかの実施の形態において、拡大された中脳ドーパミン作動性前駆体は、依然として底板細胞マーカーＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＯＴＸ２等を発現することができ、その後の凍結保存のために依然として使用することができる。
【0094】
４．製造コスト、特に多能性幹細胞培養期におけるコストを低減することができ、その結果、調製過程をより制御しやすくなる。
【0095】
５．拡大された中脳ドーパミン神経細胞前駆体から分化した細胞は、種々の新しいマーカーを特異的に発現し、ラットＰＤモデルにおいて良好な治療活性を示す。
【0096】
図面の簡単な説明
本明細書に記載される図面は、本発明の更なる理解を提供するために使用され、本願の一部を構成する。本発明の概略例及びその記載は、本発明を説明するために用いられ、本発明に対する不適切な限定を構成するものではない。図面は以下の通りである。
本明細書に記載される図面は、本発明の更なる理解を提供するために使用され、本願の一部を構成する。本発明の概略例及びその記載は、本発明を説明するために用いられ、本発明に対する不適切な限定を構成するものではない。図面は以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【0097】
【図1】ヒト胚性幹細胞由来の底板細胞の誘導及び拡大の過程を示す図である。
【図2】底板拡大培地１及び２の各継代の細胞増殖曲線を示す図である。
【図3】底板細胞拡大培地１を用いて１０継代の継代培養により得られた底板細胞の底板細胞マーカーＬＭＸ１Ａ及びＦＯＸＡ２の発現を示す図である。
【図4】底板細胞拡大培地１を用いて１０継代培養した底板細胞の分化により得られた細胞のドーパミンニューロンマーカーＦＯＸＡ２、ＴＨ、及びＴＵＪ１の発現を示す図である。
【図5】底板細胞拡大培地２を用いた１０継代の継代培養後の細胞マーカーＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１Ａの発現を示す図である。
【図6】底板細胞拡大培地２を用いて１２継代培養した底板細胞の分化により得られた細胞のドーパミン作動性ニューロンマーカーＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＴＨ、及びＴＵＪ１の発現を示す図である。
【図7】回転実験で検出されたラットＰＤモデルにおける２．５×１０５細胞の線条体注射の治療効果を示す図である。
【図8】実験群及び対照群、＋ＳＭＩ：ＮＰＭ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２＋１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１＋１０μｍブレビスタチン；－ＳＭＩ：ＮＰＭ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２＋１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１の培養条件下でのｐ１からｐ６までの星状膠細胞の細胞量を示す図である。
【図9】実験群及び対照群、＋ＳＭＩ：ＮＰＭ＋１００ｎｇ／ｍＬ ＳＨＨ＋１μＭプルモルファミン＋１０μＭブレビスタチン；－ＳＭＩ：ＮＰＭ＋１００ｎｇ／ｍＬ ＳＨＨ＋１μＭプルモルファミンの培養条件下におけるｐ４からｐ５までのＧＡＢＡ前駆細胞の細胞量を示す図である。
【図10】ミクログリア分化培地（収集１）、対照：Ｘ－ＶＩＶＯ１５＋１×Ｇｌｕｔａｍａｘ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３４＋５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ；ＳＭＩ：Ｘ－ＶＩＶＯ１５＋１×Ｇｌｕｔａｍａｘ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３４＋５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ＋１０μＭブレビスタチンにおいて４日目～１１日目に培養したＥＢから収集した懸濁細胞の量を示す図である。
【図11】ミクログリア分化培地（収集２）、対照：Ｘ－ＶＩＶＯ１５＋１×Ｇｌｕｔａｍａｘ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３４＋５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ；ＳＭＩ：Ｘ－ＶＩＶＯ１５＋１×Ｇｌｕｔａｍａｘ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３４＋５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ＋１０μＭブレビスタチンにおいて１１日目～１８日目に培養したＥＢから収集した懸濁細胞の量を示す図である。
【図12】ミクログリア分化培地（収集３）、対照：Ｘ－ＶＩＶＯ１５＋１×Ｇｌｕｔａｍａｘ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３４＋５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ；ＳＭＩ：Ｘ－ＶＩＶＯ１５＋１×Ｇｌｕｔａｍａｘ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３４＋５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ＋１０μＭブレビスタチンにおいて１８日目～２５日目に培養したＥＢから収集した懸濁細胞の量を示す図である。
【図13】各種拡大継代でのＮＳＣの総量を示す図である。図中、Ａ：ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２０μｇ／ｍＬ ＥＧＦ＋２０μｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ＋５μｇ／ｍｌヘパリン＋２％Ｂ２７＋１×ＧｌｕｔａＭＡＸ；Ｂ：ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２０μｇ／ｍＬ ＥＧＦ＋２０μｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ＋５μｇ／ｍｌヘパリン＋２％Ｂ２７＋１×ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０μＭブレビスタチン。
【発明を実施するための形態】
【0098】
本発明を実施するための具体的な形態
本発明の実施例における技術的解決策は、本発明の実施例における添付図面と共に明確かつ完全に説明される。明らかに、記載される実施例は、本発明の実施例の一部にすぎず、全てではない。少なくとも１つの例示的な実施例の以下の説明は、本質的に単に例示的なものであり、本発明、その適用又は使用のいかなる限定としても解釈されない。本発明の実施例に基づき、当業者が創造的努力なしに得た他の実施例はいずれも、本発明の保護範囲に含まれる。
本発明の実施例における技術的解決策は、本発明の実施例における添付図面と共に明確かつ完全に説明される。明らかに、記載される実施例は、本発明の実施例の一部にすぎず、全てではない。少なくとも１つの例示的な実施例の以下の説明は、本質的に単に例示的なものであり、本発明、その適用又は使用のいかなる限定としても解釈されない。本発明の実施例に基づき、当業者が創造的努力なしに得た他の実施例はいずれも、本発明の保護範囲に含まれる。
【実施例】
【0099】
実施例１．底板細胞の拡大実験
１．底板細胞の拡大実験に使用した試薬：
（１）各因子の調製及び作業濃度：
１）ＬＤＮ１９３１８９溶液：作業濃度は１００ｎＭであった。これを４℃で２週間保存することができた。
２）ＳＢ４３１５４２溶液：作業濃度は１０μＭであった。これを４℃で２週間保存することができた。
３）ＳＡＧ溶液：作業濃度は２μＭであった。これを４℃で２週間保存することができた。
４）ＳＨＨ（ソニックヘッジホッグ）溶液：作業濃度は１００ｎｇ／ｍＬであった。これを４℃で２週間保存することができた。
５）ＣＨＩＲ９９０２１溶液：作業濃度は０．５μＭ～１．０μＭであった。これは一度のみ使用可能であった。
６）ブレビスタチン液：作業濃度は１０μＭであった。これを４℃で２週間保存することができた。
１．底板細胞の拡大実験に使用した試薬：
（１）各因子の調製及び作業濃度：
１）ＬＤＮ１９３１８９溶液：作業濃度は１００ｎＭであった。これを４℃で２週間保存することができた。
２）ＳＢ４３１５４２溶液：作業濃度は１０μＭであった。これを４℃で２週間保存することができた。
３）ＳＡＧ溶液：作業濃度は２μＭであった。これを４℃で２週間保存することができた。
４）ＳＨＨ（ソニックヘッジホッグ）溶液：作業濃度は１００ｎｇ／ｍＬであった。これを４℃で２週間保存することができた。
５）ＣＨＩＲ９９０２１溶液：作業濃度は０．５μＭ～１．０μＭであった。これは一度のみ使用可能であった。
６）ブレビスタチン液：作業濃度は１０μＭであった。これを４℃で２週間保存することができた。
【0100】
（２）基本培養培地Ｎ２培地の調製：
４９％ＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ－１２＋４９％ＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋１％ＣＴＳ（商標）Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ＋１％ＣＴＳ－ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉ
４９％ＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ－１２＋４９％ＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋１％ＣＴＳ（商標）Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ＋１％ＣＴＳ－ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉ
【0101】
（３）底板細胞拡大培地１：
Ｎ２培地＋ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ）＋ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）＋ＳＨＨ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＳＡＧ（２μＭ）＋ＣＨＩＲ９９０２１（０．５μＭ～１．０μＭ）；
Ｎ２培地＋ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ）＋ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）＋ＳＨＨ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＳＡＧ（２μＭ）＋ＣＨＩＲ９９０２１（０．５μＭ～１．０μＭ）；
【0102】
（４）底板細胞拡大培地２：
Ｎ２培地＋ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ）＋ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）＋ＳＨＨ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＳＡＧ（２μＭ）＋ＣＨＩＲ９９０２１（０．５μＭ～１．０μＭ）＋ブレビスタチン（１０μＭ）；
Ｎ２培地＋ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ）＋ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）＋ＳＨＨ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＳＡＧ（２μＭ）＋ＣＨＩＲ９９０２１（０．５μＭ～１．０μＭ）＋ブレビスタチン（１０μＭ）；
【0103】
２．拡大された底板細胞からのドーパミンニューロンの分化実験に用いられる試薬：
（１）各因子の調製及び作業濃度：
１）ＦＧＦ８溶液：作業濃度は１００ｎｇ／ｍＬであった。これを４℃で２週間保存することができた。
２）ＴＧＦβ３溶液：作業濃度は１ｎｇ／ｍＬであった。これを４℃で２週間保存することができた。
３）アスコルビン酸（ＡＡ）溶液：作業濃度は０．２ｍＭであった。これを４℃で２週間保存することができた。
４）ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂ－ｃＡＭＰ）溶液：作業濃度は０．５ｍＭであった。これを４℃で２週間保存することができた。
５）ＢＤＮＦ溶液：作業濃度は２０ｎｇ／ｍＬであった。これを４℃で２週間保存することができた。
６）ＧＤＮＦ溶液：作業濃度は２０ｎｇ／ｍＬであった。これを４℃で２週間保存することができた。
（１）各因子の調製及び作業濃度：
１）ＦＧＦ８溶液：作業濃度は１００ｎｇ／ｍＬであった。これを４℃で２週間保存することができた。
２）ＴＧＦβ３溶液：作業濃度は１ｎｇ／ｍＬであった。これを４℃で２週間保存することができた。
３）アスコルビン酸（ＡＡ）溶液：作業濃度は０．２ｍＭであった。これを４℃で２週間保存することができた。
４）ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂ－ｃＡＭＰ）溶液：作業濃度は０．５ｍＭであった。これを４℃で２週間保存することができた。
５）ＢＤＮＦ溶液：作業濃度は２０ｎｇ／ｍＬであった。これを４℃で２週間保存することができた。
６）ＧＤＮＦ溶液：作業濃度は２０ｎｇ／ｍＬであった。これを４℃で２週間保存することができた。
【0104】
（２）基本培養培地Ｂ２７培地の調製：
９７％ＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋２％Ｂ２７－ＣＴＳ（商標）＋１％ＣＴＳ－ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉ
９７％ＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋２％Ｂ２７－ＣＴＳ（商標）＋１％ＣＴＳ－ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉ
【0105】
（３）ドーパミンニューロン分化培地１の調製：
Ｂ２７培地＋ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋ＧＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋ＴＧＦ－β３（１ｎｇ／ｍＬ）＋ＡＡ（０．２ｍＭ）＋ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍＬ）、各因子溶液をよく混合した後、少しずつ加え、分化培地１を得て、これを繰り返しピペッティングした。
Ｂ２７培地＋ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋ＧＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋ＴＧＦ－β３（１ｎｇ／ｍＬ）＋ＡＡ（０．２ｍＭ）＋ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍＬ）、各因子溶液をよく混合した後、少しずつ加え、分化培地１を得て、これを繰り返しピペッティングした。
【0106】
（４）ドーパミンニューロン分化培地２の調製：
Ｂ２７培地＋ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋ＧＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋ＴＧＦ－β３（１ｎｇ／ｍＬ）＋ＡＡ（０．２ｍＭ）＋ｄｂ－ｃＡＭＰ（５００μＭ）＋ＤＡＰＴ（１０μＭ）、各因子溶液をよく混合した後、少しずつ加え、分化培地２を得て、これを繰り返しピペッティングした。
Ｂ２７培地＋ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋ＧＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋ＴＧＦ－β３（１ｎｇ／ｍＬ）＋ＡＡ（０．２ｍＭ）＋ｄｂ－ｃＡＭＰ（５００μＭ）＋ＤＡＰＴ（１０μＭ）、各因子溶液をよく混合した後、少しずつ加え、分化培地２を得て、これを繰り返しピペッティングした。
【0107】
３．底板細胞拡大実験の方法：
図１の方法を参照すると、ヒト胚性幹細胞を誘導分化に供し、底板細胞を得て、これをその後の拡大、凍結保存及び分化実験に使用した。ヒト胚性幹細胞は、National Stem Cell Resource Bankに由来し、市販のヒト胚性幹細胞株も使用することができた。ヒト胚性幹細胞から底板細胞を誘導する方法については、従来技術、例えばdoi:10.1038/nprot.2017.078を参照されたい。
図１の方法を参照すると、ヒト胚性幹細胞を誘導分化に供し、底板細胞を得て、これをその後の拡大、凍結保存及び分化実験に使用した。ヒト胚性幹細胞は、National Stem Cell Resource Bankに由来し、市販のヒト胚性幹細胞株も使用することができた。ヒト胚性幹細胞から底板細胞を誘導する方法については、従来技術、例えばdoi:10.1038/nprot.2017.078を参照されたい。
【0108】
（１）底板細胞を得る方法：
１）ビトロネクチンマトリックスの調製：室温で、６ｍＬのＤＰＢＳを１５ｍＬの遠心管にピペットで入れ、次いで、６０μＬのビトロネクチンを上記ＤＰＢＳにピペットで入れ、ピペットガンで１０回ピペッティングしてよく混合し、ビトロネクチンマトリックスを得た（使用時に調製）。調製したマトリックス１ｍＬを６ウェルプレートの各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートして使用した。
１）ビトロネクチンマトリックスの調製：室温で、６ｍＬのＤＰＢＳを１５ｍＬの遠心管にピペットで入れ、次いで、６０μＬのビトロネクチンを上記ＤＰＢＳにピペットで入れ、ピペットガンで１０回ピペッティングしてよく混合し、ビトロネクチンマトリックスを得た（使用時に調製）。調製したマトリックス１ｍＬを６ウェルプレートの各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートして使用した。
【0109】
２）ヒト胚性幹細胞をＴｒｙｐＬＥ又はａｃｃｕｔａｓｅで単一細胞に消化し、上記懸濁液１０μＬをトリパンブルー溶液１０μＬに加えてよく混合し、ｃｏｕｎｔｅｓｓ細胞カウンターで計数を行った。次いで、ビトロネクチンマトリックスをピペッティングして廃棄し、ＴｒｙｐＬＥ又はａｃｃｕｔａｓｅを用いて消化して単一細胞を得て、これを１０μＭ Ｒｏｃｋ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）を含有する分化培地中２×１０４／ｃｍ２の密度で接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。分化培地はＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦ阻害剤、Ｗｎｔ活性化因子及びＳＨＨ活性化因子を含み、数日後にヒト胚性幹細胞から分化した中脳底細胞を得ることができた。
【0110】
（２）底板細胞拡大実験：
１）ビトロネクチンマトリックスの調製：室温で、６ｍＬのＤＰＢＳを１５ｍＬの遠心管にピペットで入れ、次いで、６０μＬのビトロネクチンを上記ＤＰＢＳ中にピペットで入れ、ピペットガンで１０回ピペッティングしてよく混合し、ビトロネクチンマトリックスを得た（使用時に調製）。調製したマトリックス１ｍｌを６ウェルプレートの各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートして使用した。
１）ビトロネクチンマトリックスの調製：室温で、６ｍＬのＤＰＢＳを１５ｍＬの遠心管にピペットで入れ、次いで、６０μＬのビトロネクチンを上記ＤＰＢＳ中にピペットで入れ、ピペットガンで１０回ピペッティングしてよく混合し、ビトロネクチンマトリックスを得た（使用時に調製）。調製したマトリックス１ｍｌを６ウェルプレートの各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートして使用した。
【0111】
２）底板細胞をＴｒｙｐＬＥ又はａｃｃｕｔａｓｅで単一細胞に消化し、上記懸濁液１０μＬをトリパンブルー溶液１０μＬに加え、よく混合し、ｃｏｕｎｔｅｓｓ細胞カウンターで計数を行った。次いで、ビトロネクチンマトリックスをピペッティングして廃棄し、細胞を底板細胞拡大培地１及び底板細胞拡大培地２（いずれも１０μＭ Ｒｏｃｋ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）を補充）における２Ｄ法により、４×１０４／ｃｍ２の密度で再接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【0112】
３）細胞を５日～８日ごとに継代し、接種密度、培地及び各継代の条件は同じであった。
【0113】
各継代で、ｃｏｕｎｔｅｓｓ細胞カウンターを用いて細胞の総数を計算し、細胞増殖曲線を作成した。
【0114】
底板細胞拡大培地１及び２で行った拡大の増殖効率を図２に示した。拡大培地１及び拡大培地２の処理下では、細胞継代数の増加に伴い、細胞１及び細胞２の細胞数が増加し続け、増殖速度は徐々に低下した。細胞１は１０継代まで拡大することができ、細胞２は１２継代まで拡大することができ、同時に細胞２の細胞数は細胞１の細胞数の４８倍であった。結果は、拡大培地２が、細胞の拡大能を大幅に増加させることができたことを証明した。
【0115】
底板細胞拡大培地１において、細胞継代数の増加に伴い、細胞数が徐々に増加し、増殖速度は徐々に低下した。１０継代後、細胞を１０００倍に拡大させることができ、免疫蛍光染色は、細胞が依然として底板細胞マーカーＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１Ａを安定に発現することを示した（図３）。
【0116】
底板細胞拡大培地２において、継代の増加に伴い、細胞数が徐々に増加し、増殖速度は徐々に低下した。１０継代後、細胞を５００００倍に拡大させることができ、免疫蛍光染色は、細胞が依然として底板細胞マーカーＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１Ａを安定に発現することを示した（図５）。
【0117】
４．拡大後の底板細胞の凍結保存実験：
１）プログラムされた冷却ボックス及び凍結溶液を、使用のために４℃で予冷した。
１）プログラムされた冷却ボックス及び凍結溶液を、使用のために４℃で予冷した。
【0118】
２）細胞の状態を倒立顕微鏡下で観察し、細胞が良好な状態にあり、汚染がないことを確認した。
【0119】
３）培養培地を生物学的安全性キャビネットで廃棄し、６ウェルプレートの各ウェルに１ｍＬのＤＰＢＳを加えて細胞を洗浄した。
【0120】
４）ＤＰＢＳを廃棄し、各ウェルに１ｍＬのＴｒｙｐｌｅを加え、３７℃のインキュベーターで３分～４分間消化を行った（Ｔｒｙｐｌｅを用いた消化時間は、細胞の消化の程度に応じて調整することができた）。
【0121】
５）Ｔｒｙｐｌｅを廃棄し、基本培養培地Ｎ２培地１ｍＬを各ウェルに加えて終結させ、細胞をピペットガンで穏やかにピペッティングして均一なサイズの小片にした後、遠心管に集め、室温にて１２００ｒ／分で３分間遠心分離した。
【0122】
６）上清を廃棄し、予冷した凍結溶液を加えて細胞を再懸濁した（細胞懸濁液の１／６ウェルごとに１本の凍結保存チューブ、１ｍＬ／チューブ）。
【0123】
７）細胞懸濁液を凍結保存チューブ（１ｍＬ／チューブ）にサブパッケージングした。次いで、凍結保存チューブを予冷したフリーザーボックスに入れ、－８０℃の冷蔵庫に一晩保管した。翌日に長期保存のため液体窒素に移した。
【0124】
５．拡大された底板細胞をドーパミン前駆細胞に分化させる実験：
１）ビトロネクチンマトリックスの調製：室温で、６ｍＬのＤＰＢＳを１５ｍＬの遠心管にピペットで入れ、次いで、６０μＬのビトロネクチンを上記ＤＰＢＳ中にピペットで入れ、ピペットガンで１０回ピペッティングしてよく混合し、ビトロネクチンマトリックスを得た（使用時に調製）。調製したマトリックス１ｍＬを６ウェルプレートの各ウェルに加え、後の使用のため室温で１時間インキュベートした。
１）ビトロネクチンマトリックスの調製：室温で、６ｍＬのＤＰＢＳを１５ｍＬの遠心管にピペットで入れ、次いで、６０μＬのビトロネクチンを上記ＤＰＢＳ中にピペットで入れ、ピペットガンで１０回ピペッティングしてよく混合し、ビトロネクチンマトリックスを得た（使用時に調製）。調製したマトリックス１ｍＬを６ウェルプレートの各ウェルに加え、後の使用のため室温で１時間インキュベートした。
【0125】
２）底板細胞拡大培地１及び２を用いて１０継代培養して得た底板細胞をＴｒｙｐＬＥ又はａｃｃｕｔａｓｅで消化して単一細胞にし、Ｒｏｃｋ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）を含有するドーパミンニューロン分化培地１（均等に混合した後）において２Ｄ法により、それぞれ５×１０５／ｃｍ２の密度で再接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【0126】
３）ドーパミンニューロン分化培地１で６日間培養した後、培地をドーパミンニューロン分化培地２に置き換えて、細胞を更に８日間培養した。
【0127】
【0128】
結果は、マーカーの免疫蛍光法により、底板細胞拡大培地１において１０継代の拡大で得られた細胞１の更なる分化によって得られたドーパミン神経細胞が同定されたことを示し、また結果は、１０継代の拡大後に得られた細胞１がドーパミン神経細胞への分化能をまだ有しており、ドーパミン神経細胞のマーカーＦＯＸＡ２、ＴＨ、及びＴＵＪ１を安定して発現できることを証明した。
【0129】
マーカーの免疫蛍光法により、底板細胞拡大培地２において１２継代の拡大で得られた細胞２の更なる分化によって得られたドーパミン神経細胞が同定され、また結果は、１２継代の拡大後に得られた細胞２がドーパミン神経細胞への分化能をまだ有しており、ドーパミン神経細胞のマーカーＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＴＨ、ＴＵＪ１を安定して発現できることを証明した。
【0130】
免疫蛍光による同定方法：
ａ）細胞接種：清潔で無菌の円形カバースリップを２４ウェル細胞培養皿の底部中央に置き、３０分間ビトロネクチンでコーティングした後、細胞を接種した。
ａ）細胞接種：清潔で無菌の円形カバースリップを２４ウェル細胞培養皿の底部中央に置き、３０分間ビトロネクチンでコーティングした後、細胞を接種した。
【0131】
ｂ）細胞固定：細胞が適切な密度に成長した後、培養培地を廃棄し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、４％ＰＦＡを用いて室温で１５分～３０分間固定し、次いでＰＢＳで３回洗浄した。
【0132】
ｃ）ブロッキング：２％ＢＳＡと０．３％Ｔｒｉｔｏｎの混合溶液３２０μＬを各ウェルに加え、室温で２時間ブロッキングを行った。
【0133】
ｄ）一次抗体の添加：一次抗体を、２％ＢＳＡと０．３％Ｔｒｉｔｏｎの混合溶液（使用比については一次抗体の取扱説明書を参照）で希釈し、ピペッティングしてよく混合し、ブロッキング溶液を廃棄し、希釈した一次抗体溶液を各ウェルに対して３２０μＬ加え、パラフィルムで密封後、４℃で一晩放置した。
【0134】
ｅ）二次抗体の添加：一次抗体をピペッティングにより廃棄し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２％ＢＳＡと０．３％Ｔｒｉｔｏｎの混合溶液で希釈した二次抗体３２０μＬを各ウェルに加え（使用比については一次抗体の取扱説明書を参照）、室温で２時間暗所に放置した。
【0135】
ｆ）核の染色：二次抗体を廃棄し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、希釈したＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液（１ｍｌのＰＢＳ中の１μｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２）３２０μＬを各ウェルに加え、細胞を１５分間インキュベートした。
【0136】
ｇ）密封：希釈したＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液をピペッティングにより廃棄し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで、抗クエンチャー１０μＬを各スライドに加え、その上に成長している細胞を有するスライドガラスを、湾曲したピンセットと協働して注射針を用いて慎重に拾い上げ、細胞を有する側を、気泡を避けて、抗クエンチャーを加えたスライドガラス上に置き、最後に、スライドガラスを固定するためにカバーガラスの端部に無色のマニキュアを軽く置いた後、５分間乾燥させ、スライドボックスに入れた。
【0137】
５）分化した細胞を、ＲＮＡ抽出及び発現プロファイルシーケンシングに供し、具体的な方法は、Kim et al., Biphasic Activation of WNT Signaling Facilitates the Derivation of Midbrain Dopamine Neurons from hESCs for Translational Use. 2021, Cell Stem Cell 28, 343－355の公開された文献を参照した。
【0138】
結果は、拡大培地で培養した底板細胞を分化させて得たドーパミン神経細胞の発現レベルが、非拡大細胞の１０倍超であったことを示し（表１～表２）、マーカーを表に示した。
【0139】
【表1】
【0140】
【表2-1】
【0141】
【表2-2】
【0142】
【表2-3】
【0143】
【表2-4】
【0144】
６．ＰＤモデルの挙動検出方法（回転実験）：
実験装置：回転レコーダー、カウンター、計量スケール。
実験用試薬：アポモルヒネ（sigma、Ａ４３９３）。
実験装置：回転レコーダー、カウンター、計量スケール。
実験用試薬：アポモルヒネ（sigma、Ａ４３９３）。
【0145】
回転実験工程は以下の通りである：
ａ）動物の体重を測定した。
ｂ）体重に応じて５％抱水クロラールを腹腔内注射することにより、動物を麻酔した。
ｃ）アポモルヒネの調製及び注射：粉末アポモルヒネを生理食塩水に溶解して１ｍｇ／ｍｌとし、０．５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射した。
ｄ）アポモルヒネの注射から５分～１０分後、又はモデルラットがぐるぐると円を描いて回りを始めたときに計数を開始し、３０分間記録し、１分当たりの平均回転数を算出した。
ａ）動物の体重を測定した。
ｂ）体重に応じて５％抱水クロラールを腹腔内注射することにより、動物を麻酔した。
ｃ）アポモルヒネの調製及び注射：粉末アポモルヒネを生理食塩水に溶解して１ｍｇ／ｍｌとし、０．５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射した。
ｄ）アポモルヒネの注射から５分～１０分後、又はモデルラットがぐるぐると円を描いて回りを始めたときに計数を開始し、３０分間記録し、１分当たりの平均回転数を算出した。
【0146】
細胞注入工程は、以下の通りであった：
実験装置：脳定位固定装置、電動注入ポンプ、頭蓋ドリル、外科用はさみ、ピンセット、持針鉗子、針付き５－０縫合糸、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ７０１シリンジ、保温パッド、ウルトラクリーンワークベンチ等。
実験用試薬：ポビドンヨード、生理食塩水、消毒用アルコール、Ｂａｙｔｒｉｌ、シクロスポリン。
ａ）免疫抑制剤の注射：移植４８時間前に免疫抑制剤シクロスポリンを１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射し、実験終了まで毎日注射を行った。
ｂ）細胞懸濁液の調製：移植する細胞の培養上清を廃棄し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いでｔｒｙｐｌｅを加え、５分～８分間消化した。細胞懸濁液を遠心管に収集し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を細胞注射液で１．２５×１０５／μＬに再懸濁した。
ｃ）細胞懸濁液の注入：２μＬの上記の細胞懸濁液（２．５×１０５細胞）を、モデル化側の各動物の線条体に注入し、線条体の座標を以下の通りとした：Ａ、＋１．０ｍｍ；Ｌ、－３．０ｍｍ；Ｖ、－６．０ｍｍ、－５．０ｍｍ；針路１本、深度２、各深度に１μＬを注入し、注入速度は１μＬ／分であり、注入後に創傷部を縫合した。
ｄ）術後管理：手術後、Ｂａｙｔｒｉｌを毎日０．５ｍＬ／２００ｇ体重で３日間連続して皮下注射した。回転実験を注入後毎月実施し、５ヵ月間の回転回数の変化をプロットし、３ヵ月目で有意な機能改善が観察された（図７）。
実験装置：脳定位固定装置、電動注入ポンプ、頭蓋ドリル、外科用はさみ、ピンセット、持針鉗子、針付き５－０縫合糸、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ７０１シリンジ、保温パッド、ウルトラクリーンワークベンチ等。
実験用試薬：ポビドンヨード、生理食塩水、消毒用アルコール、Ｂａｙｔｒｉｌ、シクロスポリン。
ａ）免疫抑制剤の注射：移植４８時間前に免疫抑制剤シクロスポリンを１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射し、実験終了まで毎日注射を行った。
ｂ）細胞懸濁液の調製：移植する細胞の培養上清を廃棄し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いでｔｒｙｐｌｅを加え、５分～８分間消化した。細胞懸濁液を遠心管に収集し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を細胞注射液で１．２５×１０５／μＬに再懸濁した。
ｃ）細胞懸濁液の注入：２μＬの上記の細胞懸濁液（２．５×１０５細胞）を、モデル化側の各動物の線条体に注入し、線条体の座標を以下の通りとした：Ａ、＋１．０ｍｍ；Ｌ、－３．０ｍｍ；Ｖ、－６．０ｍｍ、－５．０ｍｍ；針路１本、深度２、各深度に１μＬを注入し、注入速度は１μＬ／分であり、注入後に創傷部を縫合した。
ｄ）術後管理：手術後、Ｂａｙｔｒｉｌを毎日０．５ｍＬ／２００ｇ体重で３日間連続して皮下注射した。回転実験を注入後毎月実施し、５ヵ月間の回転回数の変化をプロットし、３ヵ月目で有意な機能改善が観察された（図７）。
【0147】
実施例２．星状膠細胞の拡大実験
１．分化及び培養の方法：
（１）ｈＥＳＣを培養し、約８０％コンフルエンスまで分化を行った。０日目に、細胞をＤｉｓｐａｓｅ（１Ｕ／ｍＬ）で解離させ、底部細胞塊を回収し、超低吸着１０ｃｍ培養皿に播種した。
１．分化及び培養の方法：
（１）ｈＥＳＣを培養し、約８０％コンフルエンスまで分化を行った。０日目に、細胞をＤｉｓｐａｓｅ（１Ｕ／ｍＬ）で解離させ、底部細胞塊を回収し、超低吸着１０ｃｍ培養皿に播種した。
【0148】
（２）１日目から、神経誘導分子１００ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９及び１０μＭ ＳＢ４３１５４２を補充したＮＩＭ培地で置き換えることにより神経誘導を開始した。培地を７日目まで毎日交換した。
【0149】
（３）細胞球を、７日目にＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングした６ウェルプレート上に広げた。
【0150】
（４）９日目から、培地をＮＰＭ培地に置き換え、１３日目まで２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を加えた。
【0151】
（５）１３日目に、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して解離することで単一細胞を得て、１．２×１０５細胞／ｃｍ２の密度で、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした６ウェルプレート上に再び広げた。
【0152】
（６）１４日目に、培地を星状膠細胞誘導培地に置き換え、ＮＰＭ培地に１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２＋１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１を加え、同時に１０μｍブレビスタチン（対照群には加えず、１：１０００）を加え、１日おきに培地を交換した。
【0153】
（７）星状膠細胞の密度コンフルエンスが１００％に達した後、それらをＡｃｃｕｔａｓｅで単一細胞に解離し、計数し、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした６ウェルプレート上に３．０×１０５細胞／ｃｍ２の密度で再び広げた。
【0154】
（８）細胞を連続して５回継代し、各継代の初期細胞密度は３．０×１０５細胞／ｃｍ２であり、ブレビスタチンを添加した場合の星状膠細胞の増殖を比較した。
【0155】
【表3】
【0156】
【表4】
【0157】
２．実験結果：
Ｐ２からＰ６まで、実験群における星状膠細胞の拡大能は有意に改善された（図８）。
Ｐ２からＰ６まで、実験群における星状膠細胞の拡大能は有意に改善された（図８）。
【0158】
実施例３．ＧＡＢＡ前駆細胞の増殖
１．分化及び培養の方法：
（１）ｈＥＳＣを培養し、約８０％コンフルエンスまで分化を行った。０日目に、細胞をＤｉｓｐａｓｅ（１Ｕ／ｍＬ）で解離させ、底部細胞塊を回収し、超低吸着１０ｃｍ培養皿上に広げた。
１．分化及び培養の方法：
（１）ｈＥＳＣを培養し、約８０％コンフルエンスまで分化を行った。０日目に、細胞をＤｉｓｐａｓｅ（１Ｕ／ｍＬ）で解離させ、底部細胞塊を回収し、超低吸着１０ｃｍ培養皿上に広げた。
【0159】
（２）１日目から、１００ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９、１０μＭ ＳＢ４３１５４２、及び２μＭ ＸＡＶ９３９を補充したＮＩＭ培地を用いて神経誘導を開始した。培地を７日目まで毎日交換した。
【0160】
（３）細胞球を、７日目にＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングした６ウェルプレート上に広げた。
【0161】
（４）９日目から、培地をＮＰＭ培地に置き換え、１３日目まで２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を加えた。
【0162】
（５）１３日目に、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して解離することで単一細胞を得て、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした６ウェルプレート上に３．０×１０５細胞／ｃｍ２の密度で再び広げた。
【0163】
（６）１４日目に、培地をＧＡＢＡ細胞誘導培地に置き換え、ＮＰＭ培地に１００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨ及び１μＭのプルモルファミンを加え、同時に１０μｍのブレビスタチンを加え（対照群には加えず）、１日おきに培地を交換した。
【0164】
（７）ＧＡＢＡ前駆細胞の密度コンフルエンスが１００％に達した後、それらをＡｃｃｕｔａｓｅで単一細胞に解離し、計数し、次いでＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングした６ウェルプレート上に３．０×１０５細胞／ｃｍ２の密度で再び広げた。
【0165】
（８）細胞を５回継代し、各継代の初期細胞密度は３．０×１０５細胞／ｃｍ２であり、ブレビスタチンの有無によるＧＡＢＡ前駆細胞の増殖を比較した。
【0166】
２．実験結果：
Ｐ４からＰ５まで、実験群におけるＧＡＢＡ前駆細胞の拡大能は有意に改善された（図９）。
Ｐ４からＰ５まで、実験群におけるＧＡＢＡ前駆細胞の拡大能は有意に改善された（図９）。
【0167】
実施例４．ミクログリア前駆体の増殖
１．分化及び培養の方法：
（１）０日目に、ＥＳＣをＡｃｃｕｔａｓｅで消化して単一細胞にし、計数し、１００００／ウェルの濃度でＶ底９６ウェルプレートに接種し、静置培養した。
１．分化及び培養の方法：
（１）０日目に、ＥＳＣをＡｃｃｕｔａｓｅで消化して単一細胞にし、計数し、１００００／ウェルの濃度でＶ底９６ウェルプレートに接種し、静置培養した。
【0168】
（２）０日目から４日目まで、培地はミクログリア誘導培地であった：ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％ＫＯＳＲ、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、１×ＮＥＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、１０μＭ Ｙ－２７６３２。
【0169】
（３）４日目に、懸濁ＥＢを６ウェルプレートで接着培養に供し、４日目に培養培地を交換し、その後１１日目まで静置培養を行った。４日目から１１日目まで、培養培地はミクログリア分化培地であった：Ｘ－ＶＩＶＯ１５、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３４、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ。この段階で、ブレビスタチンを１０μＭの濃度で添加した。
【0170】
（４）１１日目に、培地中に懸濁した単一細胞を収集して計数し、ＥＢをミクログリア分化培地で培養し続け、上清中の懸濁細胞を７日ごとに計３回収集した。
【0171】
（５）ミクログリア細胞の成熟：遠心分離後、上清を廃棄し、細胞をミクログリア成熟培地に再懸濁し、Ｍａｔｒｉｇｅｌで予めコーティングした培養プレートに接種した。ミクログリア細胞は１４日間連続培養した後に成熟した。ミクログリア成熟培地：Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆ１２、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３４、５ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ。
【0172】
２．実験結果：
分化の１１日目に、培養培地中に懸濁した単一細胞を収集して計数し、ＥＢをミクログリア分化培地中で培養し続け、上清中の懸濁細胞を７日ごと計３回収集した。実験群と対照群の間の各収集時における細胞数を比較した（図１０～図１２）。実験群の最初の２回の収集における細胞数は有意に増加し、小分子がミクログリア前駆体の増殖を促進し、分化効率を改善することを証明した。
分化の１１日目に、培養培地中に懸濁した単一細胞を収集して計数し、ＥＢをミクログリア分化培地中で培養し続け、上清中の懸濁細胞を７日ごと計３回収集した。実験群と対照群の間の各収集時における細胞数を比較した（図１０～図１２）。実験群の最初の２回の収集における細胞数は有意に増加し、小分子がミクログリア前駆体の増殖を促進し、分化効率を改善することを証明した。
【0173】
実施例５．神経幹細胞の増殖
１．分化及び培養の方法：
分化法は、Tchieu et al., A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. 2017, Cell Stem Cell 21, 399－410を参照した。
１．分化及び培養の方法：
分化法は、Tchieu et al., A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. 2017, Cell Stem Cell 21, 399－410を参照した。
【0174】
ＮＳＣを接着後に拡大培地で培養し、２０μｇ／ｍＬヒト（ＥＧＦ）（R&D）、２０μｇ／ｍＬ（ｂＦＧＦ）（R&D）、５μｇ／ｍｌヘパリン（Sigma）、２％Ｂ２７（Gibco）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、及び１０μＭブレビスタチンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１×、Gibco）を実験群に添加した。培養培地の半分を毎日交換した。
【0175】
２．実験結果：
小分子はＮＳＣのＰ４からＰ６までの拡大を有意に促進した（図１３を参照されたい）。
小分子はＮＳＣのＰ４からＰ６までの拡大を有意に促進した（図１３を参照されたい）。
【0176】
本発明の種々の変更形態は、本明細書に記載されるものに加えて、前述の説明から当業者には明らかである。かかる変更形態はまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されている。全ての特許、特許出願、雑誌論文、書籍、及び任意の他の刊行物を含む、本願に引用された各参考文献は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】