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特表2023-539501抗ＶＥＧＦ－抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体、その医薬組成物およびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-14
(54)【発明の名称】抗ＶＥＧＦ－抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体、その医薬組成物およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230907BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230907BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230907BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20230907BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230907BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230907BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230907BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230907BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230907BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230907BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20230907BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230907BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230907BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20230907BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230907BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230907BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C07K16/46
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61K47/68
A61P1/00
A61P1/16
A61P13/12
A61P15/00
A61P35/00
G01N33/53 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023513787
(86)(22)【出願日】2021-08-30
(85)【翻訳文提出日】2023-04-25
(86)【国際出願番号】 CN2021115308
(87)【国際公開番号】W WO2022042719
(87)【国際公開日】2022-03-03
(31)【優先権主張番号】202010897917.1
(32)【優先日】2020-08-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521530738
【氏名又は名称】普米斯生物技術（珠海）有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＴＨＥＵＳ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１０Ｂ， ＢＵＩＬＤＩＮＧ ４， ＮＯ １ ＫＥＪＩ ７ＴＨ ＲＯＡＤ， ＴＡＮＧＪＩＡＷＡＮ ＴＯＷＮ， ＸＩＡＮＧＺＨＯＵ ＤＩＳＴＲＩＣＴ， ＺＨＵＨＡＩ， ＧＵＡＮＧＤＯＮＧ ５１９０８０， ＰＥＯＰＬＥ’Ｓ ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲ミアオ▼ 小 牛
(72)【発明者】
【氏名】陳 乗
(72)【発明者】
【氏名】袁 志 軍
(72)【発明者】
【氏名】黄 威 峰
(72)【発明者】
【氏名】ツン，アンディ
(72)【発明者】
【氏名】孫 左 宇
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA41
4H045BA72
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、生物医学の分野に関し、具体的には、抗ＶＥＧＦ－抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体、その医薬組成物、およびその使用に関する。具体的には、本発明は、ＶＥＧＦを標的とする第１のタンパク質機能性領域およびＰＤ－Ｌ１を標的とする第２のタンパク質機能性領域を含み、第１のタンパク質機能性領域が抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその抗原結合性断片であるか、または、第１のタンパク質機能性領域がＶＥＧＦ受容体もしくはＶＥＧＦ受容体機能を有する断片を含み、第２のタンパク質機能性領域が抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体である、二重特異性抗体に関する。本発明の二重特異性抗体は、免疫系の活性化および腫瘍の血管新生の遮断を同時に行うことができ、抗腫瘍の大いなる見通しがもたらされる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＶＥＧＦを標的とする第１のタンパク質機能性領域、およびＰＤ－Ｌ１を標的とする第２のタンパク質機能性領域
を含む二重特異性抗体であって；
前記第１のタンパク質機能性領域が、抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその抗原結合性断片であるか、または、前記第１のタンパク質機能性領域が、ＶＥＧＦ受容体もしくはＶＥＧＦ受容体機能を有する断片を含み；
前記第２のタンパク質機能性領域が、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体である、二重特異性抗体。
【請求項2】
前記抗ＶＥＧＦ抗体が、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有するか；または、前記抗ＶＥＧＦ抗体が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有し；
前記抗ＶＥＧＦ抗体が、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を有する、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項3】
前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体が重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み；好ましくは、前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体が、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１～２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項4】
前記抗ＶＥＧＦ抗体が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するか；または前記抗ＶＥＧＦ抗体が、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項5】
前記抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および二重抗体からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項6】
前記抗ＶＥＧＦ抗体が、ヒト抗体に由来する定常領域を有し；好ましくは、前記定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の定常領域からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項7】
前記抗ＶＥＧＦ抗体が、ヒトＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域またはヒトＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域である重鎖定常領域を有し、ヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域である軽鎖定常領域を有し；好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を有し；
好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体が、配列番号８または配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項8】
前記抗ＶＥＧＦ抗体が、ＥＵ番号付けシステムに従って、Ｌ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異をさらに含み；任意に、Ｇ２３７Ａ変異をさらに含む、重鎖定常領域を有し；好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項9】
前記ＶＥＧＦがＶＥＧＦ－Ａであり；前記ＶＥＧＦ受容体がＶＥＧＦＲ１および／またはＶＥＧＦＲ２である、請求項１～８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項10】
前記シングルドメイン抗体が、前記第１のタンパク質機能性領域のＣ末端またはＮ末端にライゲーションされており、例えば、前記シングルドメイン抗体の数が２であり、各シングルドメイン抗体の一端が、前記抗ＶＥＧＦ抗体の２つの重鎖のＣ末端もしくはＮ末端にライゲーションされるか、または前記ＶＥＧＦ受容体もしくはＶＥＧＦ受容体機能を有する前記断片のＣ末端もしくはＮ末端にライゲーションされ；前記シングルドメイン抗体が、直接、または連結断片を介して、前記第１のタンパク質機能性領域にライゲーションされ；
好ましくは、前記連結断片が、配列番号６および配列番号７から独立して選択されるアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記シングルドメイン抗体を前記第１のタンパク質機能性領域に連結することによって得られるペプチド鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号１１または配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項11】
前記第１のタンパク質機能性領域が、ＶＥＧＦ受容体またはＶＥＧＦ受容体機能を有する断片、およびＩｇＧ１のＦｃセグメントを含み；好ましくは、ＶＥＧＦ受容体機能を有する前記断片が、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、ＩｇＧ１の前記Ｆｃセグメントが、ＥＵ番号付けシステムに従って、Ｌ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異を含み；
好ましくは、ＩｇＧ１の前記Ｆｃセグメントが、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項12】
前記第１のタンパク質機能性領域がＶＥＧＦ受容体またはＶＥＧＦ受容体機能を有する断片である場合、前記二重特異性抗体が二量体であり；好ましくは、配列番号１６または配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの二量体である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードする、単離された核酸分子。
【請求項14】
請求項１３に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項15】
請求項１３に記載の単離された核酸分子、または請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項16】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を調製する方法であって、請求項１５に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養するステップ、および前記細胞培養物から前記二重特異性抗体を回収するステップを含む、方法。
【請求項17】
二重特異性抗体およびカップリング部分を含むコンジュゲートであって、前記二重特異性抗体が、請求項１～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であり、前記カップリング部分が検出可能な標識であり、好ましくは、前記カップリング部分が放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色物質、または酵素である、コンジュゲート。
【請求項18】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、または請求項１７に記載のコンジュゲートを含む、キットであって；好ましくは、前記キットが、前記二重特異性抗体に特異的に結合することができる第２の抗体をさらに含み、任意に、前記第２の抗体が、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色物質または酵素等の検出可能な標識をさらに含む、キット。
【請求項19】
試料中のＶＥＧＦおよび／またはＰＤ－Ｌ１の存在またはレベルを検出するためのキットの製造における、請求項１～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の使用。
【請求項20】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項１７に記載のコンジュゲートを含み、任意に、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、医薬組成物。
【請求項21】
悪性腫瘍の予防および／または治療のための医薬の製造における、請求項１～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項１７に記載のコンジュゲートの使用であって；好ましくは、前記悪性腫瘍が、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がんおよび頭頸部がんからなる群から選択される、使用。
【請求項22】
悪性腫瘍を治療および／または予防する方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項１７に記載のコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与するステップを含み；好ましくは、前記悪性腫瘍が、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がんおよび頭頸部がんからなる群から選択される、方法。
【請求項23】
悪性腫瘍の治療および／または予防に使用される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項１７に記載のコンジュゲートであって；好ましくは、前記悪性腫瘍が、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がんおよび頭頸部がんからなる群から選択される、二重特異性抗体またはコンジュゲート。
【請求項24】
（ａ）抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体；および（ｂ）抗ＶＥＧＦ抗体またはエレメント
を含むことを特徴とする、二重特異性抗体。
【請求項25】
前記二重特異性抗体が、式Ｉおよび式ＩＩＡ１－Ｌ１－ＣＨ－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ２－Ｌ３－ＣＬ（式ＩＩ）
に示される構造を有するポリペプチドを含むことを特徴とし、
式中、
Ａ１は、前記抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域ＶＨを表し；
Ａ２は、前記抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域ＶＬを表し；
Ｂは、前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体を表し；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、存在しないか、または連結エレメントであり；
ＣＨは、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域ＣＨ（好ましくはＬＡＬＡ変異体）を表し；
ＣＬは、ヒトκ軽鎖定常領域ＣＬを表し；
「－」は、ペプチド結合を表し；
式Ｉで表される前記ポリペプチドおよび式ＩＩで表される前記ポリペプチドが、ジスルフィド結合相互作用を介してヘテロ二量体を形成する、請求項２４に記載の二重特異性抗体。
【請求項26】
前記二重特異性抗体が、式ＩＩＩまたは式ＩＶＡ３－Ｌ４－Ｆｃ－Ｌ５－Ｂ（式ＩＩＩ）
Ｂ－Ｌ６－Ｆｃ－Ｌ７－Ａ３（式ＩＶ）
に示される構造を有するポリペプチドであることを特徴とし、
式中、
Ａ３は、ＶＥＧＦと結合し、その活性を遮断することができるドメインを表し；
Ｂは、前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体を表し；
Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６およびＬ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または連結エレメントであり；
Ｆｃは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域（好ましくはＬＡＬＡ変異体）を表し；
「－」は、ペプチド結合を表す、請求項２４に記載の二重特異性抗体。
【請求項27】
請求項２４に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項28】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項29】
請求項２８に記載のベクターを含むか、または請求項２７に記載のポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれている；または、請求項２４に記載の二重特異性抗体を発現する
ことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項30】
請求項２４に記載の二重特異性抗体を産生する方法であって：（ａ）請求項２９に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、それにより前記二重特異性抗体を含む培養物を得るステップ；ならびに
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記培養物の精製および／または分離を行って、前記二重特異性抗体を得るステップ
を含む、方法。
【請求項31】
（ａ）請求項２４に記載の二重特異性抗体；ならびに（ｂ）検出可能な標識、薬剤、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、およびその組合せからなる群から選択されるカップリング部分
を含むことを特徴とする、免疫コンジュゲート。
【請求項32】
医薬、試薬、検出プレートまたはキットの製造における、請求項２４に記載の二重特異性抗体、または請求項３１に記載の免疫コンジュゲートの使用であって、前記試薬、検出プレートまたはキットが：試料中のＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦを検出するために用いられ；前記医薬が、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性）またはＶＥＧＦを発現する腫瘍を治療または予防するために使用される、使用。
【請求項33】
（ｉ）請求項２４に記載の二重特異性抗体、または請求項３１に記載の免疫コンジュゲート；および（ｉｉ）薬学的に許容される担体
を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本発明は、生物医学の分野に属し、具体的には、抗ＶＥＧＦ－抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体、その医薬組成物およびその使用に関する。
本発明は、生物医学の分野に属し、具体的には、抗ＶＥＧＦ－抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体、その医薬組成物およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
背景技術
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管透過性因子（ＶＰＦ）または血管オプソニン（バスキュロトロピン）としても知られ、血管内皮細胞の増殖を促進する高度に特異的なホモ二量体タンパク質である。ＶＥＧＦファミリータンパク質としては、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ－Ｆおよび胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）が挙げられ、中でもＶＥＧＦ－Ａは、血管の早期形成に重要な役割を果たす。１９８３年に最初にモルモットの肝細胞からＳｅｎｇｅｒらによって単離され、細静脈および小静脈の透過性を増大させる、血管内皮細胞の分裂および増殖を促進する、および血管新生を誘導する等の機能を有する。同時に、ＶＥＧＦは多くの血管新生依存性疾患、例えばがん、いくつかの炎症性疾患および糖尿病性網膜症の病因および進行に関与している。したがって、ＶＥＧＦは抗腫瘍薬の研究において重要な標的である。
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管透過性因子（ＶＰＦ）または血管オプソニン（バスキュロトロピン）としても知られ、血管内皮細胞の増殖を促進する高度に特異的なホモ二量体タンパク質である。ＶＥＧＦファミリータンパク質としては、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ－Ｆおよび胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）が挙げられ、中でもＶＥＧＦ－Ａは、血管の早期形成に重要な役割を果たす。１９８３年に最初にモルモットの肝細胞からＳｅｎｇｅｒらによって単離され、細静脈および小静脈の透過性を増大させる、血管内皮細胞の分裂および増殖を促進する、および血管新生を誘導する等の機能を有する。同時に、ＶＥＧＦは多くの血管新生依存性疾患、例えばがん、いくつかの炎症性疾患および糖尿病性網膜症の病因および進行に関与している。したがって、ＶＥＧＦは抗腫瘍薬の研究において重要な標的である。
【0003】
ＶＥＧＦタンパク質の主要な受容体は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２ ＮＲＰ３である。しかし、ＶＥＧＦ受容体に対するＶＥＧＦファミリータンパク質メンバーの結合は選択的であり、この中で、ＶＥＧＦＡはＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２に結合して内在性キナーゼの活性化を活性化し、新血管新生を促進し得る。ＶＥＧＦの受容体への結合を遮断することは、種々のがん、例えば乳がん、結腸がん、肺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、中皮腫、子宮頸がん、腎臓がんの治療に適用し得る（Ｒａｋｅｓｈ Ｒ． Ｒａｍｊｉａｗａｎ， Ａｒｊａｎ Ｗ． Ｇｒｉｆｆｉｏｅｎ， ａｎｄ Ｄａｎ Ｇ． Ｄｕｄａ， Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．２０１７ ２０（２）： １８５－２０４）。
【0004】
現在、世界的な市場において４５の効能をカバーする２３の市販または承認されているＶＥＧＦ薬剤があり、この中ではベバシズマブが最も多くの効能が承認されている。ベバシズマブは、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、乳がん、悪性神経膠腫、および腎細胞癌等の疾患の治療について、米国、欧州連合および他の場所で承認されている。ラニビズマブは、ベバシズマブと同じ親マウス抗体から得られた第２世代のヒト化抗ＶＥＧＦ組換えマウスモノクローナル抗体断片Ｆａｂ部分である。これは加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）を有する患者の治療について、２００６年６月３０日に米国ＦＤＡから承認された。ラニビズマブはベバシズマブと比較して、ＶＥＧＦＡとの高い親和性を維持しており、より血管新生を抑制でき、胃がん、直腸がんおよび他の適応症の治療について開発されている。
【0005】
アフリベルセプトは、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の細胞外断片から構成されるヒトＩｇＧ－Ｆｃ組換えタンパク質であり、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦＡへの結合を同時に遮断することによって、血管上皮細胞からの血管新生を遮断することができる。アフリベルセプトは、主に血管新生型（湿潤）加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の患者の治療に適応される。同時に、これは臨床において進行した大腸がんの治療にも使用される（Ｃａｅｍｅｎ Ｓｔａｎｃａｎら、Ｒｏｍ Ｊ Ｍｏｒｐｈｏｌ Ｅｍｂｒｙｏｌ．２０１８ ５９ （２）： ４５５ － ４６７）。アフリベルセプトはＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の機能性断片を有するため、抗体と同様の、ＶＥＧＦの受容体への結合を遮断する機能を有する。
【0006】
プログラム死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、ＣＤ２７４としても知られ、Ｂ７ファミリーの一員であり、ＰＤ－１のリガンドである。ＰＤ－Ｌ１は、ＩｇＶ様領域、ＩｇＣ様領域、膜貫通疎水性領域、および３０アミノ酸からなる細胞内領域を含む総アミノ酸数２９０のＩ型膜貫通タンパク質である。他のＢ７ファミリー分子とは異なり、ＰＤ－Ｌ１は免疫応答を負に制御する。研究により、ＰＤ－Ｌ１は主に活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞で発現していることが明らかになっている。ＰＤ－Ｌ１は、リンパ球に加えて胸腺、心臓、胎盤等の多くの組織の他の内皮細胞、および黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がん、頭頸部がん等の様々な非リンパ系で発現している（Ａｋｉｎｔｕｎｄｅ Ａｋｉｎｌｅｙｅ ＆ Ｚｏａｉｂ Ｒａｓｏｏｌ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １２巻、記事番号：９２（２０１９））。ＰＤ－Ｌ１は、自己応答性Ｔ細胞およびＢ細胞ならびに免疫寛容を制御する一定の汎用性を持ち、末梢組織のＴ細胞およびＢ細胞の応答に関与している。腫瘍細胞におけるＰＤ－Ｌ１の高発現は、がん患者の予後不良と関連している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
二機能性抗体は、抗体医薬の開発における一つの方向性であるが、前臨床評価モデル、低発現、安定性の低さ、工程の複雑さ、および品質管理の大きな差等、多くの課題に直面している。そのため、二機能性抗体の開発は常に困難とされてきた。
【0008】
そこで、ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦの２つの標的に対して、特異性が高く、治癒効果が高く、かつ調製が容易な二重特異性抗体を開発することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の内容
本発明者らは、綿密な研究および創造的な研究により、抗ＶＥＧＦ－抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体（以下、抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体とも称する）を開発した。本発明者らは、驚くべきことに、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体が、ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦの二重標的に対して高い親和性を有し、２つの標的の共通の生物学的活性を有し、かつ分子量が小さいことを見出した。腫瘍領域に柔軟に浸透することができ、安全性も良好である。したがって、以下の発明が提供される：
本発明の一態様は、
ＶＥＧＦを標的とする第１のタンパク質機能性領域、および
ＰＤ－Ｌ１を標的とする第２のタンパク質機能性領域
を含む二重特異性抗体であって；
第１のタンパク質機能性領域が、抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその抗原結合性断片であるか、または、第１のタンパク質機能性領域は、ＶＥＧＦ受容体もしくはＶＥＧＦ受容体機能を有する断片を含み；
第２のタンパク質機能性領域が、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体である、二重特異性抗体に関する。
本発明者らは、綿密な研究および創造的な研究により、抗ＶＥＧＦ－抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体（以下、抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体とも称する）を開発した。本発明者らは、驚くべきことに、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体が、ＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦの二重標的に対して高い親和性を有し、２つの標的の共通の生物学的活性を有し、かつ分子量が小さいことを見出した。腫瘍領域に柔軟に浸透することができ、安全性も良好である。したがって、以下の発明が提供される：
本発明の一態様は、
ＶＥＧＦを標的とする第１のタンパク質機能性領域、および
ＰＤ－Ｌ１を標的とする第２のタンパク質機能性領域
を含む二重特異性抗体であって；
第１のタンパク質機能性領域が、抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその抗原結合性断片であるか、または、第１のタンパク質機能性領域は、ＶＥＧＦ受容体もしくはＶＥＧＦ受容体機能を有する断片を含み；
第２のタンパク質機能性領域が、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体である、二重特異性抗体に関する。
【0010】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、第１のタンパク質機能性領域および第２のタンパク質機能性領域、ならびに任意のリンカーからなる。
【0011】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、
抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有するか；
あるいは、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有し；
抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を有する。
抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有するか；
あるいは、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有し；
抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を有する。
【0012】
軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原への結合を決定し；各鎖の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域を含み、ここで、重鎖（Ｈ）は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含むＣＤＲ、軽鎖（Ｌ）は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含むＣＤＲを有する。本発明において、ＣＤＲはＩＭＧＴ番号付けシステムによって定義され、Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ Ｆ， Ｋａａｓ Ｑ， Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ Ｐ． ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ ａｎｄ ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ： ａ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， ＭＨＣ， ＩｇＳＦ ａｎｄ ＭｈｃＳＦ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００９； ３８（ｓｕｐｐｌ＿１）： Ｄ３０１－Ｄ３０７を参照されたい。
【0013】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、
抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は重鎖可変領域を有し、重鎖可変領域は、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み；
好ましくは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、配列番号５に記載されるようなアミノ酸配列を有する。
抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は重鎖可変領域を有し、重鎖可変領域は、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、および配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み；
好ましくは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、配列番号５に記載されるようなアミノ酸配列を有する。
【0014】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、
抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するか；または
抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する。
抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するか；または
抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する。
【0015】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、
抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するか；または
抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し；
抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する。
抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するか；または
抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し；
抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する。
【0016】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、
抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および二重抗体からなる群から選択される。
抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および二重抗体からなる群から選択される。
【0017】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、
抗ＶＥＧＦ抗体は、ヒト抗体に由来する定常領域を有し；
好ましくは、定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の定常領域からなる群から選択される。
抗ＶＥＧＦ抗体は、ヒト抗体に由来する定常領域を有し；
好ましくは、定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の定常領域からなる群から選択される。
【0018】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、
抗ＶＥＧＦ抗体は、ヒトＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域またはヒトＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域である重鎖定常領域を有し、ヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域である軽鎖定常領域を有し；
好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を有し；
好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号８または配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する。
抗ＶＥＧＦ抗体は、ヒトＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域またはヒトＩｇガンマ－４鎖Ｃ領域である重鎖定常領域を有し、ヒトＩｇカッパ鎖Ｃ領域である軽鎖定常領域を有し；
好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を有し；
好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号８または配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する。
【0019】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、
抗ＶＥＧＦ抗体は、ＥＵ番号付けシステムに従って、Ｌ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異をさらに含み；任意に、Ｇ２３７Ａ変異をさらに含む、重鎖定常領域を有し；
好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を有する。
抗ＶＥＧＦ抗体は、ＥＵ番号付けシステムに従って、Ｌ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異をさらに含み；任意に、Ｇ２３７Ａ変異をさらに含む、重鎖定常領域を有し；
好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を有する。
【0020】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において：
ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ－Ａであり；
ＶＥＧＦ受容体は、ＶＥＧＦＲ１および／またはＶＥＧＦＲ２である。
ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ－Ａであり；
ＶＥＧＦ受容体は、ＶＥＧＦＲ１および／またはＶＥＧＦＲ２である。
【0021】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、
シングルドメイン抗体は、第１のタンパク質機能性領域のＣ末端またはＮ末端にライゲーションされ、例えば、２つのシングルドメイン抗体が存在し、各シングルドメイン抗体の一端が、抗ＶＥＧＦ抗体の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端もしくはＮ末端、またはＶＥＧＦ受容体のＣ末端もしくはＮ末端、またはＶＥＧＦ受容体機能を有する断片にライゲーションされ；
および、シングルドメイン抗体は、直接、または連結断片を介して、第１のタンパク質機能性領域にライゲーションされ；
好ましくは、連結断片は、配列番号６および配列番号７から独立して選択されるアミノ酸配列を有し；
好ましくは、シングルドメイン抗体を第１のタンパク質機能性領域にライゲーションすることによって得られるペプチド鎖は、配列番号１、配列番号２、配列番号１１または配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する。
シングルドメイン抗体は、第１のタンパク質機能性領域のＣ末端またはＮ末端にライゲーションされ、例えば、２つのシングルドメイン抗体が存在し、各シングルドメイン抗体の一端が、抗ＶＥＧＦ抗体の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端もしくはＮ末端、またはＶＥＧＦ受容体のＣ末端もしくはＮ末端、またはＶＥＧＦ受容体機能を有する断片にライゲーションされ；
および、シングルドメイン抗体は、直接、または連結断片を介して、第１のタンパク質機能性領域にライゲーションされ；
好ましくは、連結断片は、配列番号６および配列番号７から独立して選択されるアミノ酸配列を有し；
好ましくは、シングルドメイン抗体を第１のタンパク質機能性領域にライゲーションすることによって得られるペプチド鎖は、配列番号１、配列番号２、配列番号１１または配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する。
【0022】
本発明は、
ＶＥＧＦを標的とする第１のタンパク質機能性領域、および
ＰＤ－Ｌ１を標的とする第２のタンパク質機能性領域
を含む二重特異性抗体であって；
第１のタンパク質機能性領域の数が１であり、第２のタンパク質機能性領域の数が２であり；
第１のタンパク質機能性領域が、抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合性断片であり、第２のタンパク質機能性領域が、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体であり；
シングルドメイン抗体が、連結断片を介して抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖のＣ末端にライゲーションされ；ライゲーション後に得られるペプチド鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号１１または配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有し；
抗ＶＥＧＦ抗体が、配列番号８または配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する、二重特異性抗体に関する。
ＶＥＧＦを標的とする第１のタンパク質機能性領域、および
ＰＤ－Ｌ１を標的とする第２のタンパク質機能性領域
を含む二重特異性抗体であって；
第１のタンパク質機能性領域の数が１であり、第２のタンパク質機能性領域の数が２であり；
第１のタンパク質機能性領域が、抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合性断片であり、第２のタンパク質機能性領域が、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体であり；
シングルドメイン抗体が、連結断片を介して抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖のＣ末端にライゲーションされ；ライゲーション後に得られるペプチド鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号１１または配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有し；
抗ＶＥＧＦ抗体が、配列番号８または配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する、二重特異性抗体に関する。
【0023】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、
第１のタンパク質機能性領域は、ＶＥＧＦ受容体またはＶＥＧＦ受容体機能を有する断片、およびＩｇＧ１のＦｃセグメントを含み；
好ましくは、ＶＥＧＦ受容体機能を有する断片は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、ＩｇＧ１のＦｃセグメントは、ＥＵ番号付けシステムに従って、Ｌ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異を含み；
好ましくは、ＩｇＧ１のＦｃセグメントは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する。
第１のタンパク質機能性領域は、ＶＥＧＦ受容体またはＶＥＧＦ受容体機能を有する断片、およびＩｇＧ１のＦｃセグメントを含み；
好ましくは、ＶＥＧＦ受容体機能を有する断片は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、ＩｇＧ１のＦｃセグメントは、ＥＵ番号付けシステムに従って、Ｌ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異を含み；
好ましくは、ＩｇＧ１のＦｃセグメントは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する。
【0024】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、
第１のタンパク質機能性領域がＶＥＧＦ受容体またはＶＥＧＦ受容体機能を有する断片である場合、二重特異性抗体は二量体であり；好ましくは、配列番号１６または配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの二量体である。
第１のタンパク質機能性領域がＶＥＧＦ受容体またはＶＥＧＦ受容体機能を有する断片である場合、二重特異性抗体は二量体であり；好ましくは、配列番号１６または配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの二量体である。
【0025】
本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体は、悪性腫瘍の治療および／または予防のために使用され；好ましくは、悪性腫瘍は、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がんおよび頭頸部がんからなる群から選択される。
【0026】
本発明の他の態様は、本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体をコードする、単離された核酸分子に関する。
【0027】
本発明の他の態様は、本発明の単離された核酸分子を含む、ベクターに関する。
本発明の他の態様は、本発明の単離された核酸分子、または本発明のベクターを含む、宿主細胞に関する。
本発明の他の態様は、本発明の単離された核酸分子、または本発明のベクターを含む、宿主細胞に関する。
【0028】
本発明の他の態様は、本発明の宿主細胞を適切な条件下で培養する工程、および細胞培養物から二重特異性抗体を回収する工程を含む、本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体を調製する方法に関する。
【0029】
本発明の他の態様は、二重特異性抗体およびカップリング部分を含むコンジュゲートに関し、ここで、二重特異性抗体は、本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体であり、かつカップリング部分は検出可能な標識であり；好ましくは、カップリング部分は、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色物質、または酵素である。
【0030】
本発明のコンジュゲートによれば、これは悪性腫瘍の治療および／または予防に用いられ；好ましくは、悪性腫瘍は、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がんおよび頭頸部がんからなる群から選択される。
【0031】
本発明の他の態様は、本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体を含むか、または本発明のコンジュゲートを含むキットに関し；
好ましくは、キットは、二重特異性抗体に特異的に結合することができる第２の抗体をさらに含み；任意に、第２の抗体は、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色物質、または酵素等の検出可能な標識をさらに含む。
好ましくは、キットは、二重特異性抗体に特異的に結合することができる第２の抗体をさらに含み；任意に、第２の抗体は、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色物質、または酵素等の検出可能な標識をさらに含む。
【0032】
本発明の他の態様は、キットの製造における本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体の使用に関し、ここで、キットは、試料中のＶＥＧＦおよび／またはＰＤ－Ｌ１の存在またはレベルを検出するために使用される。
【0033】
本発明の他の態様は、医薬組成物に関し、これは、本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体または本発明のコンジュゲートを含み；任意に、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【0034】
本発明の他の態様は、悪性腫瘍の予防および／または治療のための医薬の製造における、本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体または本発明のコンジュゲートの使用に関し；好ましくは、悪性腫瘍は、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がんおよび頭頸部がんからなる群から選択される。
【0035】
本発明の他の態様は、悪性腫瘍を治療および／または予防するための方法であって、有効量の本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体または本発明のコンジュゲート抗体を、それを必要とする対象に投与することを含み；好ましくは、悪性腫瘍が、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がんおよび頭頸部がんからなる群から選択される、方法に関する。
【0036】
本発明のいくつかの実施形態において、前記方法において、有効量の本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体を、それを必要とする対象に投与する工程は、外科的治療の前または後、および／または放射線療法の前または後である。
【0037】
本発明のいくつかの実施形態において、前記方法において、
本発明の二重特異性抗体の単回投与量は、体重１ｋｇあたり０．１～１００ｍｇ、好ましくは４．８～２４ｍｇまたは１～１０ｍｇであり；または、本発明の二重特異性抗体の単回投与量は、対象あたり１０～１０００ｍｇ、好ましくは５０～５００ｍｇ、１００～４００ｍｇ、１５０～３００ｍｇ、１５０～２５０ｍｇまたは２００ｍｇであり；
好ましくは、投与は、３日間、４日間、５日間、６日間、１０日間、１週間、２週間または３週間毎に１回行われ；
好ましくは、投与は、静脈内滴下または静脈内注射の方法によって実施される。
本発明の二重特異性抗体の単回投与量は、体重１ｋｇあたり０．１～１００ｍｇ、好ましくは４．８～２４ｍｇまたは１～１０ｍｇであり；または、本発明の二重特異性抗体の単回投与量は、対象あたり１０～１０００ｍｇ、好ましくは５０～５００ｍｇ、１００～４００ｍｇ、１５０～３００ｍｇ、１５０～２５０ｍｇまたは２００ｍｇであり；
好ましくは、投与は、３日間、４日間、５日間、６日間、１０日間、１週間、２週間または３週間毎に１回行われ；
好ましくは、投与は、静脈内滴下または静脈内注射の方法によって実施される。
【0038】
本明細書で使用する場合、ＥＣ５０という用語は、最大効果の５０％のための濃度を指し、最大効果の５０％を引き起こし得る濃度を指す。
【0039】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、一般的に２対のポリペプチド鎖から構成される免疫グロブリン分子を指し、各対は１つの「軽」（Ｌ）鎖と１つの「重」（Ｈ）鎖とを有する。抗体軽鎖は、κ軽鎖とλ軽鎖に分類し得る。重鎖はμ、δ、γ、α、またはεに分類されてもよく、抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義される。軽鎖および重鎖内では、可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はさらに約３以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）によって構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬからなる。抗体定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典補体系の第１の構成要素（Ｃｌｑ）を含む、宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介する。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる可変性の高い領域に細分化することができ、その中でフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存性の高い領域が散在している。ＶＨとＶＬは、それぞれ３つのＣＤＲと４つのＦＲからなり、これらは以下の順序：アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４で配置されている。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、それぞれ抗体結合部位を形成している。領域またはドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍ．ｄ．， Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， （１９８７ ａｎｄ １９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８７；１９６：９０１－９１７； Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ １９８９；３４２：８７８－８８３の定義、またはＩＭＧＴ番号付けシステムに従う、Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ Ｆ， Ｋａａｓ Ｑ， Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ Ｐ． ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ ａｎｄ ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ： ａ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， ＭＨＣ， ＩｇＳＦ ａｎｄ ＭｈｃＳＦ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００９；３８（ｓｕｐｐｌ＿１）：Ｄ３０１－Ｄ３０７の定義を参照のこと。
【0040】
「抗体」という用語は、特定の抗体産生方法に限定されるものではない。例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体が挙げられる。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体であってもよい。
【0041】
本明細書で使用する場合、「ｍＡｂ」および「モノクローナル抗体」という用語は、高度に相同性の抗体分子群、すなわち、自発的に起こり得る天然の変異を除いて、同一の抗体分子群に由来する抗体または抗体断片を指す。ｍＡｂは、抗原上の単一のエピトープに対して高度に特異的である。モノクローナル抗体と比較して、ポリクローナル抗体は通常、少なくとも２つ以上の異なる抗体を含み、これらの異なる抗体は通常、抗原上の異なるエピトープを認識する。モノクローナル抗体は、通常、Ｋｏｈｌｅｒらによって最初に報告されたハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ， Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ． Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ［Ｊ］， ｎａｔｕｒｅ， １９７５； ２５６（５５１７）：４９５）を用いて得ることができ、組換えＤＮＡ技術（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）により得ることもできる。
【0042】
本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）のＣＤＲ領域の全部または一部を非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域で置換することによって得られる抗体または抗体断片を指し、ここで、ドナー抗体は、所望の特異性、親和性および反応性を有する非ヒト（例えばマウス、ラット、またはウサギ）抗体であり得る。さらに、レシピエント抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）の一部のアミノ酸残基は、抗体の性能をさらに改善または最適化するように、非ヒト抗体の対応するアミノ酸残基、または他の抗体のアミノ酸残基で置換してもよい。ヒト化抗体の詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ １９８６； ３２１：５２２ ５２５； Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ， １９８８； ３３２：３２３３２９； Ｐｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．１９９２；２：５９３－５９６；およびＣｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ２０００； ２１： ３９７－４０２を参照されたい。場合によっては、抗体の抗原結合性断片はダイアボディであり、この場合、ＶＨおよびＶＬドメインは単一ポリペプチド鎖上に発現するが、使用されるリンカーは短すぎるために同一鎖の２つのドメイン間の対合が可能にならず、それによりドメインは他の鎖の相補的ドメインと対合することになり、２つの抗原結合部位を形成する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９３； ９０：６４４４ ６４４８およびＰｏｌｊａｋ Ｒ． Ｊ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １９９４； ２：１１２１－１１２３を参照のこと）。
【0043】
本明細書に記載の融合タンパク質は、ＤＮＡ組換えにより２つの遺伝子によって共発現されるタンパク質産物である。抗体および抗原結合性断片を産生および精製する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ’ｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｇｕｉｄｅ、第５章～第８章および第１５章）。
【0044】
本明細書で使用する場合、「単離」または「単離された」という用語は、人工的な手段による天然状態からの取得を意味する。「単離された」物質または構成要素が天然で生じる場合、それは、存在する自然環境が変化しているか、物質が自然環境から単離されているか、またはその両方が起こっている。例えば、生体動物に天然で存在する単離されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドについて、天然状態から単離された高純度の同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されたと呼ばれる。「単離」または「単離された」という用語は、人工または合成物質の混合、および物質活性に影響を与えない他の不純物の存在を排除するものではない。
【0045】
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸送達ビヒクルを指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を達成することができる場合、ベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入、またはトランスフェクションによって宿主細胞に導入されてよく、それが有する遺伝物質要素を宿主細胞で発現させることができる。ベクターは当技術分野の当業者に周知であり、プラスミド；ファージミド；コスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体；λファージまたはＭ１３ファージ等のファージ、および動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして使用できる動物ウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）等が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、およびレポーター遺伝子を含むがこれらに限定されない、発現を制御する種々のエレメントを含むことができる。さらに、ベクターは、複製起点を含むこともできる。
【0046】
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、ベクターの導入に使用できる細胞を指し、大腸菌（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））または枯草菌（バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））等の原核細胞、酵母細胞またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）等の真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞またはＳｆ９等の昆虫細胞、または線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＳ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞もしくはヒト細胞等の動物細胞等があるがこれに限定されない。
【0047】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、対象および活性成分と薬学的および／または生理学的に適合する担体および／または賦形剤を指し、これらは当技術分野で周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ編、１９版． Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９５を参照）、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤を含むがこれらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤は、リン酸緩衝剤を含むが、これに限定されず；界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ－８０等のカチオン性、アニオン性または非イオン性界面活性剤を含むが、これに限定されず；イオン強度増強剤は、塩化ナトリウムを含むが、これに限定されない。
【0048】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、所望の効果を達成する、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指す。例えば、疾患（例えば、腫瘍）を予防するための有効量は、疾患（例えば、腫瘍）の発症を予防、阻止、または遅延するのに十分な量を指し、疾患を治療するための有効量は、疾患を有する患者において疾患およびその合併症を治癒または少なくとも部分的に予防するのに十分な量を指す。このような有効量を決定することは、十分に当技術分野の当業者の能力の範囲内である。例えば、治療的使用のための有効量は、治療すべき疾患の重症度、患者自身の免疫系の一般的状態、年齢、体重、および性別等の患者の一般的状態、薬剤の投与様式、併用して投与される他の治療等に依存するであろう。
【0049】
本発明において、特に記載がない場合、「第１」（例えば、第１のタンパク質機能性領域）および「第２」（例えば、第２のタンパク質機能性領域）は、参照上の区別または表現の明確化の目的で使用され、典型的な順序の意味を有するものではない。
【0050】
また、本発明は、以下の項目１～１０のいずれか１つに関する：
１．二重特異性抗体であって：
（ａ）抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体；および
（ｂ）抗ＶＥＧＦ抗体またはエレメント
を含むことを特徴とする、二重特異性抗体。
２．二重特異性抗体が、式Ｉおよび式ＩＩ
Ａ１－Ｌ１－ＣＨ－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ２－Ｌ３－ＣＬ（式ＩＩ）
に示される構造を有するポリペプチドを含むことを特徴とし、
式中、
Ａ１は、抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域ＶＨであり；
Ａ２は、抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域ＶＬであり；
Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、存在しないか、または連結エレメントであり；
ＣＨは、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域ＣＨ（好ましくは、ＬＡＬＡ変異体）であり；
ＣＬは、ヒトκ軽鎖定常領域ＣＬであり；
「－」は、ペプチド結合であり；
式Ｉで表されるポリペプチドおよび式ＩＩで表されるポリペプチドが、ジスルフィド結合相互作用を介してヘテロ二量体を形成する、項目１に記載の二重特異性抗体。
３．二重特異性抗体が、式ＩＩＩまたは式ＩＶ
Ａ３－Ｌ４－Ｆｃ－Ｌ５－Ｂ（式ＩＩＩ）
Ｂ－Ｌ６－Ｆｃ－Ｌ７－Ａ３（式ＩＶ）
に示される構造を有するポリペプチドであることを特徴とし、
式中、
Ａ３は、ＶＥＧＦに結合し、その活性を阻害することができるドメインであり；
Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体であり；
Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６およびＬ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または連結エレメントであり；
Ｆｃは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域（好ましくは、ＬＡＬＡ変異体）であり；
「－」はペプチド結合である、項目１に記載の二重特異性抗体。
４．項目１に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
５．項目４に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
６．項目５に記載のベクターを含むか、または項目４に記載のポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれている、
あるいは、項目１に記載の二重特異性抗体を発現することを特徴とする、宿主細胞。
７．項目１に記載の二重特異性抗体を産生する方法であって：
（ａ）項目６に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、それにより二重特異性抗体を含む培養物を得るステップ；ならびに
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた培養物の精製および／または分離を行って、二重特異性抗体を得るステップ
を含むことを特徴とする、方法。
８．（ａ）項目１に記載の二重特異性抗体；ならびに
（ｂ）検出可能な標識、薬剤、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、およびその組合せからなる群から選択されるカップリング部分を含むことを特徴とする、免疫コンジュゲート。
９．医薬、試薬、検出プレートまたはキットの製造における、項目１に記載の二重特異性抗体、または項目８に記載の免疫コンジュゲートの使用であって；試薬、検出プレートまたはキットが：試料中のＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦを検出するために用いられ；医薬が、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性）またはＶＥＧＦを発現する腫瘍を治療または予防するために用いられる、二重特異性抗体、または使用。
１０．（ｉ）項目１に記載の二重特異性抗体、または項目８に記載の免疫コンジュゲート；および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体
を含むことを特徴とする、医薬組成物。
１．二重特異性抗体であって：
（ａ）抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体；および
（ｂ）抗ＶＥＧＦ抗体またはエレメント
を含むことを特徴とする、二重特異性抗体。
２．二重特異性抗体が、式Ｉおよび式ＩＩ
Ａ１－Ｌ１－ＣＨ－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ２－Ｌ３－ＣＬ（式ＩＩ）
に示される構造を有するポリペプチドを含むことを特徴とし、
式中、
Ａ１は、抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域ＶＨであり；
Ａ２は、抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域ＶＬであり；
Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、存在しないか、または連結エレメントであり；
ＣＨは、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域ＣＨ（好ましくは、ＬＡＬＡ変異体）であり；
ＣＬは、ヒトκ軽鎖定常領域ＣＬであり；
「－」は、ペプチド結合であり；
式Ｉで表されるポリペプチドおよび式ＩＩで表されるポリペプチドが、ジスルフィド結合相互作用を介してヘテロ二量体を形成する、項目１に記載の二重特異性抗体。
３．二重特異性抗体が、式ＩＩＩまたは式ＩＶ
Ａ３－Ｌ４－Ｆｃ－Ｌ５－Ｂ（式ＩＩＩ）
Ｂ－Ｌ６－Ｆｃ－Ｌ７－Ａ３（式ＩＶ）
に示される構造を有するポリペプチドであることを特徴とし、
式中、
Ａ３は、ＶＥＧＦに結合し、その活性を阻害することができるドメインであり；
Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体であり；
Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６およびＬ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または連結エレメントであり；
Ｆｃは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域（好ましくは、ＬＡＬＡ変異体）であり；
「－」はペプチド結合である、項目１に記載の二重特異性抗体。
４．項目１に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
５．項目４に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
６．項目５に記載のベクターを含むか、または項目４に記載のポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれている、
あるいは、項目１に記載の二重特異性抗体を発現することを特徴とする、宿主細胞。
７．項目１に記載の二重特異性抗体を産生する方法であって：
（ａ）項目６に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、それにより二重特異性抗体を含む培養物を得るステップ；ならびに
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた培養物の精製および／または分離を行って、二重特異性抗体を得るステップ
を含むことを特徴とする、方法。
８．（ａ）項目１に記載の二重特異性抗体；ならびに
（ｂ）検出可能な標識、薬剤、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、およびその組合せからなる群から選択されるカップリング部分を含むことを特徴とする、免疫コンジュゲート。
９．医薬、試薬、検出プレートまたはキットの製造における、項目１に記載の二重特異性抗体、または項目８に記載の免疫コンジュゲートの使用であって；試薬、検出プレートまたはキットが：試料中のＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦを検出するために用いられ；医薬が、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性）またはＶＥＧＦを発現する腫瘍を治療または予防するために用いられる、二重特異性抗体、または使用。
１０．（ｉ）項目１に記載の二重特異性抗体、または項目８に記載の免疫コンジュゲート；および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体
を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【0051】
本発明はさらに、以下の第１から第１４の態様のいずれか１つに関する：
本発明の第１の態様において、二重特異性抗体が提供され、二重特異性抗体は：
（ａ）抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体；および
（ｂ）抗ＶＥＧＦ抗体またはエレメント
を含む。
本発明の第１の態様において、二重特異性抗体が提供され、二重特異性抗体は：
（ａ）抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体；および
（ｂ）抗ＶＥＧＦ抗体またはエレメント
を含む。
【0052】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、１つ～３つの抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体を含み、好ましくは、１つ、または２つの抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体を含む。
【0053】
他の好ましい実施形態において、ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断することができる。
【0054】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、Ｆｃセグメントをさらに含む。
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体のＦｃセグメントは、ヒトＩｇＧドメイン、ＣＨ１＋ＣＬ１ドメイン、およびその組合せからなる群から選択される。
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体のＦｃセグメントは、ヒトＩｇＧドメイン、ＣＨ１＋ＣＬ１ドメイン、およびその組合せからなる群から選択される。
【0055】
他の好ましい実施形態において、ヒトＩｇＧドメインは、改変変異体ＩｇＧドメイン、好ましくはＬＡＬＡ変異体ＩｇＧドメインである。
【0056】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、式Ｉおよび式ＩＩ
Ａ１－Ｌ１－ＣＨ－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ２－Ｌ３－ＣＬ（式ＩＩ）
に示される構造を有するポリペプチドを含み、
式中、
Ａ１は、抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域ＶＨであり；
Ａ２は、抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域ＶＬであり；
Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、存在しないか、または連結エレメントであり；
ＣＨは、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域ＣＨ（好ましくは、ＬＡＬＡ変異体）であり；
ＣＬは、ヒトκ軽鎖定常領域ＣＬであり；
「－」は、ペプチド結合であり；
ここで、式Ｉで表されるポリペプチド、および式ＩＩで表されるポリペプチドは、ジスルフィド結合相互作用を介してヘテロ二量体を形成する。
Ａ１－Ｌ１－ＣＨ－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ２－Ｌ３－ＣＬ（式ＩＩ）
に示される構造を有するポリペプチドを含み、
式中、
Ａ１は、抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域ＶＨであり；
Ａ２は、抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域ＶＬであり；
Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、存在しないか、または連結エレメントであり；
ＣＨは、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域ＣＨ（好ましくは、ＬＡＬＡ変異体）であり；
ＣＬは、ヒトκ軽鎖定常領域ＣＬであり；
「－」は、ペプチド結合であり；
ここで、式Ｉで表されるポリペプチド、および式ＩＩで表されるポリペプチドは、ジスルフィド結合相互作用を介してヘテロ二量体を形成する。
【0057】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、式ＩＩＩまたは式ＩＶ
Ａ３－Ｌ４－Ｆｃ－Ｌ５－Ｂ（式ＩＩＩ）
Ｂ－Ｌ６－Ｆｃ－Ｌ７－Ａ３（式ＩＶ）
で示される構造を有するポリペプチドであり、
Ａ３は、ＶＥＧＦに結合し、その活性を遮断することができるドメインであり；
Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体であり；
Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６およびＬ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または連結エレメントであり；
Ｆｃは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域（好ましくは、ＬＡＬＡ変異体）であり；
「－」は、ペプチド結合である。
Ａ３－Ｌ４－Ｆｃ－Ｌ５－Ｂ（式ＩＩＩ）
Ｂ－Ｌ６－Ｆｃ－Ｌ７－Ａ３（式ＩＶ）
で示される構造を有するポリペプチドであり、
Ａ３は、ＶＥＧＦに結合し、その活性を遮断することができるドメインであり；
Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体であり；
Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６およびＬ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または連結エレメントであり；
Ｆｃは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域（好ましくは、ＬＡＬＡ変異体）であり；
「－」は、ペプチド結合である。
【0058】
他の好ましい実施形態において、抗ＶＥＧＦ重鎖可変領域ＶＨは、ベバシズマブに由来する重鎖可変領域アミノ酸配列を有し、アミノ酸配列は、配列番号３に記載されるか、または配列番号３に記載の配列と８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0059】
他の好ましい実施形態において、抗ＶＥＧＦ軽鎖可変領域ＶＬは、ベバシズマブに由来する軽鎖可変領域アミノ酸配列を有し、アミノ酸配列は、配列番号９に記載されるか、または配列番号９に記載の配列と８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0060】
他の好ましい実施形態において、抗ＶＥＧＦ重鎖可変領域ＶＨは、ラニビズマブに由来する重鎖可変領域アミノ酸配列を有し、アミノ酸配列は、配列番号１３に記載されるか、または配列番号１３に記載の配列と８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0061】
他の好ましい実施形態において、抗ＶＥＧＦ軽鎖可変領域ＶＬは、ラニビズマブに由来する軽鎖可変領域アミノ酸配列を有し、アミノ酸配列は、配列番号１５に記載されるか、または配列番号１５に記載の配列と８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0062】
他の好ましい実施形態において、ＶＥＧＦに結合し、その活性を遮断することができるドメインは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号１７に記載の配列と８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0063】
他の好ましい実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号５に記載の配列と８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0064】
他の好ましい実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域ＣＨは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＬＡＬＡ変異を有するか、または配列番号４に記載の配列と８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0065】
他の好ましい実施形態において、ヒトκ軽鎖定常領域ＣＬは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号１０に記載の配列と８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0066】
他の好ましい実施形態において、ヒトＩｇＧのＦｃセグメントは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するＬＡＬＡ変異を有するか、または配列番号１８に記載の配列と８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0067】
他の好ましい実施形態において、リンカーエレメントは、（Ｇ４Ｓ）ｎの配列を有し、式中、ｎは正の整数（例えば、１、２、３、４、５または６）であり、好ましくは、ｎは２または４である。
【0068】
他の好ましい実施形態において、リンカーエレメントは、配列番号６または７に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号６または７に記載の配列と８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0069】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、式Ｉおよび式ＩＩに示される構造を有するポリペプチドを含み、式Ｉに示される構造を有するポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、式ＩＩに示される構造を有するポリペプチドは、配列番号８に記載のアミノ酸配列、すなわちＡｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤ）を有する。
【0070】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、式Ｉおよび式ＩＩに示される構造を有するポリペプチドを含み、式Ｉに示される構造を有するポリペプチドは配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、式ＩＩに示される構造を有するポリペプチドは配列番号８に記載のアミノ酸配列、すなわちＡｖａ－４ＧＳ－ＮＳＤ）を有する。
【0071】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、式Ｉおよび式ＩＩに示される構造を有するポリペプチドを含み、式Ｉに示される構造を有するポリペプチドは配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有し、式ＩＩに示される構造を有するポリペプチドは配列番号１４に記載のアミノ酸配列、すなわちＬｕｃ－２ＧＳ－ＮＳＤ）を有する。
【0072】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、式Ｉおよび式ＩＩに示される構造を有するポリペプチドを含み、式Ｉに示される構造を有するポリペプチドは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有し、式ＩＩに示される構造を有するポリペプチドは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列、すなわちＬｕｃ－４ＧＳ－ＮＳＤ）を有する。
【0073】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、式ＩＩＩで示される構造を有するポリペプチドであり、そのアミノ酸配列は、配列番号１６に記載されている、すなわちＮＳＤ－Ｅｌｙｅａ）である。
【0074】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、式ＩＩＩに示される構造を有するポリペプチドであり、そのアミノ酸配列は、配列番号１９に記載されている、すなわちＥｌｙｅａ－ＮＳＤ）である。
【0075】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、式Ｉおよび式ＩＩに示される構造のポリペプチドを同時に含み、式Ｉに示されるポリペプチドおよび式ＩＩに示されるポリペプチドは、ジスルフィド結合作用を介してヘテロ二量体ｉを形成し；
かつ、ヘテロ二量体ｉは、ＣＨドメイン間のジスルフィド結合相互作用を介してホモ二量体ｉｉを形成する。
かつ、ヘテロ二量体ｉは、ＣＨドメイン間のジスルフィド結合相互作用を介してホモ二量体ｉｉを形成する。
【0076】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、式ＩＩＩまたは式ＩＶに示される構造を有するポリペプチドであり、式ＩＩＩまたは式ＩＶに示される構造を有するポリペプチドは、Ｆｃセグメント間のジスルフィド結合作用を介してホモ二量体を形成する。
【0077】
本発明の第２の態様において、本発明の第１の態様による二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【0078】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体が式Ｉおよび式ＩＩに示される構造を有するポリペプチドを含む場合、ポリヌクレオチドにおいて、式Ｉに示される構造のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および式ＩＩに示される構造のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は１：１の比率である。
【0079】
本発明の第３の態様において、本発明の第２の態様によるポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【0080】
他の好ましい実施形態において、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスベクター、プラスミド、トランスポゾン、他の遺伝子導入系、およびその組合せからなる群から選択され、好ましくは、発現ベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶウイルス、レトロウイルス、またはその組合せ等の、ウイルスベクターを含む。
【0081】
本発明の第４の態様において、宿主細胞が提供され、宿主細胞は、本発明の第３の態様によるベクターを含む、または本発明の第２の態様によるポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれているか；
あるいは、宿主細胞は、本発明の第１の態様による二重特異性抗体を発現する。
あるいは、宿主細胞は、本発明の第１の態様による二重特異性抗体を発現する。
【0082】
他の好ましい実施形態において、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞を含む。
他の好ましい実施形態において、宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、および哺乳動物細胞からなる群から選択される。
他の好ましい実施形態において、宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、および哺乳動物細胞からなる群から選択される。
【0083】
本発明の第５の態様において、本発明の第１の態様による二重特異性抗体を産生する方法であって：
（ａ）二重特異性抗体を含む培養物を得るように、本発明の第４の態様による宿主細胞を適切な条件下で培養するステップ；ならびに
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた培養物の精製および／または分離を行って、二重特異性抗体を得るステップを含む、方法が提供される。
（ａ）二重特異性抗体を含む培養物を得るように、本発明の第４の態様による宿主細胞を適切な条件下で培養するステップ；ならびに
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた培養物の精製および／または分離を行って、二重特異性抗体を得るステップを含む、方法が提供される。
【0084】
他の好ましい実施形態において、精製は、プロテインＡアフィニティーカラム精製および分離によって実施され、標的抗体を得ることができる。
【0085】
他の好ましい実施形態において、精製および分離後の標的抗体は、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、好ましくは１００％の純度を有する。
【0086】
本発明の第６の態様において、免疫コンジュゲートが提供され、これは：
（ａ）本発明の第１の態様による二重特異性抗体；ならびに
（ｂ）検出可能な標識、薬剤、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、およびその組合せからなる群から選択されるカップリング部分を含む。
（ａ）本発明の第１の態様による二重特異性抗体；ならびに
（ｂ）検出可能な標識、薬剤、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、およびその組合せからなる群から選択されるカップリング部分を含む。
【0087】
他の好ましい実施形態において、放射性核種は：
（ｉ）診断用同位体であって、Ｔｃ－９９ｍ、Ｇａ－６８、Ｆ－１８、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｃｕ－６４、Ｚｒ－８９、Ｃ－１１、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８８、およびその組合せからなる群から選択される同位体；および／または
（ｉｉ）治療用同位体であって、Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｃｓ－１３７、Ｃｒ－５１、Ｃｏ－６０、Ｄｙ－１６５、Ｅｒ－１６９、Ｆｍ－２５５、Ａｕ－１９８、Ｈｏ－１６６、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｒ－１９２、Ｆｅ－５９、Ｐｂ－２１２、Ｍｏ－９９、Ｐｄ－１０３、Ｐ－３２、Ｋ－４２、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ－１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ－１４９、Ｔｈ－２２７、Ｘｅ－１３３ Ｙｂ－１６９、Ｙｂ－１７７、およびその組合せからなる群から選択される同位体を含む。
（ｉ）診断用同位体であって、Ｔｃ－９９ｍ、Ｇａ－６８、Ｆ－１８、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｃｕ－６４、Ｚｒ－８９、Ｃ－１１、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８８、およびその組合せからなる群から選択される同位体；および／または
（ｉｉ）治療用同位体であって、Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｃｓ－１３７、Ｃｒ－５１、Ｃｏ－６０、Ｄｙ－１６５、Ｅｒ－１６９、Ｆｍ－２５５、Ａｕ－１９８、Ｈｏ－１６６、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｒ－１９２、Ｆｅ－５９、Ｐｂ－２１２、Ｍｏ－９９、Ｐｄ－１０３、Ｐ－３２、Ｋ－４２、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ－１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ－１４９、Ｔｈ－２２７、Ｘｅ－１３３ Ｙｂ－１６９、Ｙｂ－１７７、およびその組合せからなる群から選択される同位体を含む。
【0088】
他の好ましい実施形態において、カップリング部分は、薬剤または毒素である。
他の好ましい実施形態において、薬剤は、細胞毒性薬剤である。
他の好ましい実施形態において、薬剤は、細胞毒性薬剤である。
【0089】
他の好ましい実施形態において、細胞毒性薬剤は、抗チューブリン薬剤、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、葉酸アンタゴニスト、代謝拮抗剤、化学療法感作剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、およびその組合せからなる群から選択される。
【0090】
特に有用なクラスの細胞毒性薬剤の例としては、例えば、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤、ＤＮＡアルキル化剤、およびチューブリン阻害剤が挙げられる。典型的な細胞毒性薬剤としては、例えば、オーリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシンおよびメイタンシノイド（例えば、ＤＭ１およびＤＭ４）、タキサン、ベンゾジアゼピン、またはベンゾジアゼピン含有薬剤（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピン、およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン）、ビンカアルカロイドまたはその組合せが挙げられる。
【0091】
他の好ましい実施形態において、毒素は、以下：
アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ＭＭＡＥ、およびＭＭＡＦ）、アウレオマイシン、メイタンシノイド、リシン、リシンＡ鎖、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α－サーチナ、ゲロニン、ミトジェリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン、クロチン、カリケアマイシン、サポナリア オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、グルココルチコイドおよびその組合せからなる群から選択される。
アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ＭＭＡＥ、およびＭＭＡＦ）、アウレオマイシン、メイタンシノイド、リシン、リシンＡ鎖、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α－サーチナ、ゲロニン、ミトジェリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン、クロチン、カリケアマイシン、サポナリア オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、グルココルチコイドおよびその組合せからなる群から選択される。
【0092】
他の好ましい実施形態において、カップリング部分は、検出可能な標識である。
他の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、以下：蛍光または発光標識、放射性標識、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）またはＣＴ（コンピュータＸ線断層撮影）造影剤、または検出可能な生成物を生成することができる酵素、放射性核種、生体毒素、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ磁性粒子、プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ダイアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質（ＢＰＨＬ））、化学療法剤（例えば、シスプラチン）からなる群から選択される。
他の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、以下：蛍光または発光標識、放射性標識、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）またはＣＴ（コンピュータＸ線断層撮影）造影剤、または検出可能な生成物を生成することができる酵素、放射性核種、生体毒素、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ磁性粒子、プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ダイアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質（ＢＰＨＬ））、化学療法剤（例えば、シスプラチン）からなる群から選択される。
【0093】
他の好ましい実施形態において、免疫コンジュゲートは：本発明の第１の態様に記載の多価（例えば、２価）二重特異性抗体を含む。
【0094】
他の好ましい実施形態において、多価とは、本発明の第１の態様による二重特異性抗体が、免疫コンジュゲートのアミノ酸配列の複数の反復を含むことを指す。
【0095】
本発明の第７の態様において、医薬、試薬、検出プレートまたはキットの製造における、本発明の第１の態様による二重特異性抗体、または本発明の第６の態様による免疫コンジュゲートの使用が提供され；ここで、試薬、検出プレートまたはキットは：試料中のＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦを検出するために用いられ；ここで、医薬は、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性）またはＶＥＧＦを発現する腫瘍を治療または予防するために使用される。
【0096】
他の好ましい実施形態において、免疫コンジュゲートのカップリング部分は、診断用の同位体である。
【0097】
他の好ましい実施形態において、試薬は、同位体トレーサー、造影剤、フロー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、磁性ナノ粒子およびイメージング剤からなる群から選択される１つまたは複数の試薬である。
【0098】
他の好ましい実施形態において、試料中のＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦを検出するための試薬は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦ分子を（ｉｎ ｖｉｖｏ）検出するための造影剤である。
【0099】
他の好ましい実施形態において、検出は、ｉｎ ｖｉｖｏ検出またはｉｎ ｖｉｔｒｏ検出である。
【0100】
他の好ましい実施形態において、検出は、フロー検出および細胞免疫蛍光検出を含む。
他の好ましい実施形態において、薬剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断し、同時にＶＥＧＦとＶＥＧＦＲとの間の相互作用を遮断するために使用される。
他の好ましい実施形態において、薬剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断し、同時にＶＥＧＦとＶＥＧＦＲとの間の相互作用を遮断するために使用される。
【0101】
他の好ましい実施形態において、腫瘍は、以下：急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄症、非ホジキンリンパ腫、結腸直腸がん、乳がん、結腸直腸がん、胃がん、肝臓がん、白血病、腎臓腫瘍、肺がん、小腸がん、骨がん、前立腺がん、前立腺がん、子宮頸がん、リンパ腫、副腎腫瘍、膀胱腫瘍を含むが、これらに限定されない。
【0102】
本発明の第８の態様において、医薬組成物が提供され、これは：
（ｉ）本発明の第１の態様による二重特異性抗体、または本発明の第６の態様による免疫コンジュゲート；および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む。
（ｉ）本発明の第１の態様による二重特異性抗体、または本発明の第６の態様による免疫コンジュゲート；および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む。
【0103】
他の好ましい実施形態において、免疫コンジュゲートのカップリング部分は、薬剤、毒素、および／または治療用同位体である。
【0104】
他の好ましい実施形態において、医薬組成物は、細胞毒性薬剤等の、腫瘍を治療するための追加の薬剤をさらに含む。
【0105】
他の好ましい実施形態において、腫瘍を治療するための追加の薬剤は、パクリタキセル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、アキシチニブ、レンバチニブ、およびペムブロリズマブを含む。
【0106】
他の好ましい実施形態において、薬剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断し、同時に、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲとの間の相互作用を遮断するために使用される。
【0107】
他の好ましい実施形態において、医薬組成物は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲシグナル伝達経路を遮断するために使用される。
【0108】
他の好ましい実施形態において、医薬組成物は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を発現する（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性）および／またはＶＥＧＦタンパク質を発現する（すなわち、ＶＥＧＦ陽性）腫瘍を治療するために使用される。
【0109】
他の好ましい実施形態において、医薬組成物は、注射剤の形態である。
他の好ましい実施形態において、医薬組成物は、腫瘍を予防および治療するための医薬の製造において使用される。
他の好ましい実施形態において、医薬組成物は、腫瘍を予防および治療するための医薬の製造において使用される。
【0110】
本発明の第９の態様において、
（ｉ）ヒトＰＤ－Ｌ１分子および／またはＶＥＧＦ分子を検出するための使用；（ｉｉ）フロー検出のための使用；（ｉｉｉ）細胞免疫蛍光検出のための使用；（ｉｖ）腫瘍を治療するための使用；（ｖ）腫瘍診断のための使用；（ｖｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断するための使用；および（ｖｉｉ）ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲとの間の相互作用を遮断するための使用
からなる群から選択される、本発明の第１の態様による二重特異性抗体の１つまたは複数の使用が提供される。
（ｉ）ヒトＰＤ－Ｌ１分子および／またはＶＥＧＦ分子を検出するための使用；（ｉｉ）フロー検出のための使用；（ｉｉｉ）細胞免疫蛍光検出のための使用；（ｉｖ）腫瘍を治療するための使用；（ｖ）腫瘍診断のための使用；（ｖｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断するための使用；および（ｖｉｉ）ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲとの間の相互作用を遮断するための使用
からなる群から選択される、本発明の第１の態様による二重特異性抗体の１つまたは複数の使用が提供される。
【0111】
他の好ましい実施形態において、腫瘍は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を発現する（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性）および／またはＶＥＧＦタンパク質を発現する（すなわち、ＶＥＧＦ陽性）腫瘍である。
【0112】
他の好ましい実施形態において、使用は、非診断用および非治療用の使用である。
本発明の第１０の態様において、組換えタンパク質が提供され、この組換えタンパク質は：（ｉ）本発明の第１の態様による二重特異性抗体；ならびに（ｉｉ）任意に、発現および／または精製を補助することができるタグ配列を有する。
本発明の第１０の態様において、組換えタンパク質が提供され、この組換えタンパク質は：（ｉ）本発明の第１の態様による二重特異性抗体；ならびに（ｉｉ）任意に、発現および／または精製を補助することができるタグ配列を有する。
【0113】
他の好ましい実施形態において、タグ配列は、６Ｈｉｓタグ、ＨＡタグおよびＦｃタグを含む。
【0114】
他の好ましい実施形態において、組換えタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦに特異的に結合する。
【0115】
本発明の第１１の態様において、試料中のＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦを検出する方法が提供され、この方法は：（１）試料を本発明の第１の態様による二重特異性抗体と接触させるステップ；（２）抗原抗体複合体が形成されるかどうかを検出し、ここで、複合体の形成は、試料中のＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦの存在を示すステップを含む。
【0116】
本発明の第１２の態様において、疾患を治療するための方法が提供され、この方法は：本発明の第１の態様による二重特異性抗体、または本発明の第６の態様による免疫コンジュゲート、または本発明の第８の態様による医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0117】
他の好ましい実施形態において、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトを含む。
本発明の第１３の態様において、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦ検出試薬が提供され、検出試薬は、本発明の第６の態様による免疫コンジュゲートおよび検出許容可能な担体を含む。
本発明の第１３の態様において、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦ検出試薬が提供され、検出試薬は、本発明の第６の態様による免疫コンジュゲートおよび検出許容可能な担体を含む。
【0118】
他の好ましい実施形態において、免疫コンジュゲートのカップリング部分は、診断用の同位体である。
【0119】
他の好ましい実施形態において、検出許容可能な担体は、非毒性で不活性な水性担体媒体である。
【0120】
他の好ましい実施形態において、検出試薬は、同位体トレーサー、造影剤、フロー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、磁性ナノ粒子およびイメージング剤からなる群から選択される１つまたは複数の試薬である。
【0121】
他の好ましい実施形態において、検出試薬は、ｉｎ ｖｉｖｏ検出のために使用される。
【0122】
他の好ましい実施形態において、検出試薬は、液体または粉末の剤形（例えば、水性液剤、注射、凍結乾燥散剤、錠剤、頬剤、吸入可能エアロゾル）である。
【0123】
本発明の第１４の態様において、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦを検出するためのキットが提供され、このキットは、本発明の第６の態様による免疫コンジュゲートまたは本発明の第１３の態様による検出試薬、ならびに指示書を含む。
【0124】
他の好ましい実施形態において、指示書は、キットが、対象におけるＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦの発現の非侵襲的検出に有用であることを記載する。
【0125】
他の好ましい実施形態において、キットは、ＰＤ－Ｌ１タンパク質（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性）および／またはＶＥＧＦタンパク質（すなわち、ＶＥＧＦ陽性）を発現する腫瘍の検出において有用である。
用語
本開示をより容易に理解できるようにするために、まず、特定の用語を最初に定義する。本出願で使用する場合、本明細書で明示的に別段の記載がない限り、以下の各用語は、以下に示す意味を有するものとする。他の定義は、本出願を通じて記載される。
二重特異性抗体
本明細書において、「本発明の二重特異性抗体」、「本発明の二重抗体」、および「抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体」という用語は同じ意味を持ち、これらは全てＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦを特異的に認識し結合できる二重特異性抗体を指す。ＶＥＧＦ結合活性を有するタンパク質機能性領域については、ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ１および／またはＶＥＧＦＲ２）またはその機能性断片である場合、これは抗体と同様にＶＥＧＦの受容体への結合を遮断する機能を有するため、この場合の融合タンパク質も本発明では広く二重特異性抗体と称する。
用語
本開示をより容易に理解できるようにするために、まず、特定の用語を最初に定義する。本出願で使用する場合、本明細書で明示的に別段の記載がない限り、以下の各用語は、以下に示す意味を有するものとする。他の定義は、本出願を通じて記載される。
二重特異性抗体
本明細書において、「本発明の二重特異性抗体」、「本発明の二重抗体」、および「抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体」という用語は同じ意味を持ち、これらは全てＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦを特異的に認識し結合できる二重特異性抗体を指す。ＶＥＧＦ結合活性を有するタンパク質機能性領域については、ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ１および／またはＶＥＧＦＲ２）またはその機能性断片である場合、これは抗体と同様にＶＥＧＦの受容体への結合を遮断する機能を有するため、この場合の融合タンパク質も本発明では広く二重特異性抗体と称する。
【0126】
本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体を提供し、これは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体および抗ＶＥＧＦ抗体またはエレメントを含む。
【0127】
好ましくは、二重特異性抗体は、式Ｉおよび式ＩＩ
Ａ１－Ｌ１－ＣＨ－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ２－Ｌ３－ＣＬ（式ＩＩ）
に示される構造を有するポリペプチドを含み、
式中、
Ａ１は、抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域ＶＨであり；
Ａ２は、抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域ＶＬであり；
Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、存在しないか、または連結エレメントであり；
ＣＨは、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域ＣＨ（好ましくは、ＬＡＬＡ変異体）であり；
ＣＬは、ヒトκ軽鎖定常領域ＣＬであり；
「－」は、ペプチド結合であり；
式Ｉで表されるポリペプチドおよび式ＩＩで表されるポリペプチドは、ジスルフィド結合相互作用を介してヘテロ二量体を形成する。
Ａ１－Ｌ１－ＣＨ－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ２－Ｌ３－ＣＬ（式ＩＩ）
に示される構造を有するポリペプチドを含み、
式中、
Ａ１は、抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域ＶＨであり；
Ａ２は、抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域ＶＬであり；
Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、存在しないか、または連結エレメントであり；
ＣＨは、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域ＣＨ（好ましくは、ＬＡＬＡ変異体）であり；
ＣＬは、ヒトκ軽鎖定常領域ＣＬであり；
「－」は、ペプチド結合であり；
式Ｉで表されるポリペプチドおよび式ＩＩで表されるポリペプチドは、ジスルフィド結合相互作用を介してヘテロ二量体を形成する。
【0128】
あるいは、二重特異性抗体は、式ＩＩＩまたは式ＩＶ
Ａ３－Ｌ４－Ｆｃ－Ｌ５－Ｂ（式ＩＩＩ）
Ｂ－Ｌ６－Ｆｃ－Ｌ７－Ａ３（式ＩＶ）
で示される構造を有するポリペプチドであり、
式中、
Ａ３は、ＶＥＧＦに結合し、その活性を遮断することができるドメインであり；
Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体であり；
Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６およびＬ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または連結エレメントであり；
Ｆｃは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域（好ましくは、ＬＡＬＡ変異体）であり；
「－」は、ペプチド結合である。
Ａ３－Ｌ４－Ｆｃ－Ｌ５－Ｂ（式ＩＩＩ）
Ｂ－Ｌ６－Ｆｃ－Ｌ７－Ａ３（式ＩＶ）
で示される構造を有するポリペプチドであり、
式中、
Ａ３は、ＶＥＧＦに結合し、その活性を遮断することができるドメインであり；
Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体であり；
Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６およびＬ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または連結エレメントであり；
Ｆｃは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域（好ましくは、ＬＡＬＡ変異体）であり；
「－」は、ペプチド結合である。
【0129】
一実施形態において、二重特異性抗体は、式Ｉおよび式ＩＩで示される構造のポリペプチドを同時に含み、式Ｉで示されるポリペプチドおよび式ＩＩで示されるポリペプチドは、ヘテロの二量体ｉを形成し；
さらに、ヘテロ二量体ｉは、ＣＨドメイン間のジスルフィド結合相互作用を介してホモ二量体ｉｉを形成する。
さらに、ヘテロ二量体ｉは、ＣＨドメイン間のジスルフィド結合相互作用を介してホモ二量体ｉｉを形成する。
【0130】
他の実施形態において、二重特異性抗体は、式ＩＩＩまたは式ＩＶで示される構造を有するポリペプチドであり、式ＩＩＩまたは式ＩＶで示される構造を有するポリペプチドは、Ｆｃセグメント間のジスルフィド結合相互作用を介してホモ二量体を形成する。
【0131】
本明細書で使用する場合、「シングルドメイン抗体」、「ナノボディＶＨＨ」、および「ナノボディ」という用語は同じ意味を有し、完全な機能を有する最小の抗原結合性断片である抗体重鎖可変領域をクローニングすることによって構築された、１つの重鎖可変領域（ＶＨＨ）のみからなるナノボディを指す。通常、軽鎖と重鎖の定常領域１（ＣＨ１）を天然に欠く抗体を得た後、抗体重鎖可変領域をクローニングし、１つの重鎖可変領域のみからなるナノボディ（ＶＨＨ）を構築する。
【0132】
本明細書において、「可変」という用語は、抗体可変領域の特定の部分が配列において異なり、これが各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合性および特異性に寄与することを意味する。しかし、可変性は抗体可変ドメイン全体に均一に分布しているわけではない。それは、軽鎖および重鎖の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブの重鎖と軽鎖の可変領域はそれぞれ、４つのＦＲ領域を含み、これらは近似的にβフォールド構成であり、結合ループを形成する３つのＣＤＲによって接続されているが、場合によっては部分的にβフォールド構造を形成することもある。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって近接し、他の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ．９１－３２４２， Ｉ巻、ｐｐ．６４７－６６９（１９９１）を参照）。定常領域は、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、例えば抗体の抗体依存性細胞傷害に関与する等の、異なるエフェクター機能を示す。
【0133】
本明細書で使用する場合、「フレームワーク領域」（ＦＲ）という用語は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列、すなわち、単一種の異なる免疫グロブリン間で比較的保存的である免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域の一部を指す。免疫グロブリン軽鎖および重鎖の各々は、それぞれＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－ＬおよびＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈと称される４つのＦＲを有する。したがって、軽鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲ１－Ｌ）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲ２－Ｌ）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲ３－Ｌ）－（ＦＲ４－Ｌ）と称してよく、重鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲ１－Ｈ）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲ２－Ｈ）－（ＦＲ３－Ｈ）－（ＣＤＲ３－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ）と表してもよい。好ましくは、本発明のＦＲはヒト抗体ＦＲまたはその誘導体であり、ヒト抗体ＦＲ誘導体は天然に存在するヒト抗体ＦＲと実質的に同一であり、すなわち、配列同一性は８５％、９０％、９５％、または９６％、９７％、９８％、または９９％に達する。
【0134】
ＣＤＲのアミノ酸配列を知れば、当技術分野の当業者はフレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌおよび／またはＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈを容易に決定できる。
【0135】
本明細書で使用する場合、「ヒトフレームワーク領域」という用語は、天然に存在するヒト抗体フレームワーク領域と実質的に（約８５％以上、具体的には９０％、９５％、９７％、９９％または１００％）同一であるフレームワーク領域である。
【0136】
本明細書で使用する場合、「親和性」という用語は、インタクトな抗体と抗原との間の平衡会合によって理論的に定義される。本発明の二重特異性抗体の親和性は、ＫＤ値（解離定数）または他の測定方法によって評価または決定、例えば、ＦｏｒｔｅｂｉｏＲｅｄ９６装置を用いた生体層干渉法（ＢＬＩ）によって決定し得る。
【0137】
本明細書で使用する場合、「リンカー」という用語は、軽鎖および重鎖のドメインが交換された二重可変領域を有する免疫グロブリンに折り畳まれるのに十分な移動度を提供するように免疫グロブリンドメインに挿入される１つまたは複数のアミノ酸残基を指す。
【0138】
当技術分野の当業者に知られているように、免疫コンジュゲートおよび融合発現産物は、薬剤、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素および他の診断用または治療用分子を本発明の抗体またはその断片に結合させることによって形成されるコンジュゲートを含む。本発明はまた、ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体、またはその断片に結合する細胞表面マーカーまたは抗原を含む。
【0139】
本明細書で使用する場合、「可変領域」および「相補性決定領域（ＣＤＲ）」という用語は、互換的に使用される。
【0140】
本発明の好ましい実施形態において、抗体の重鎖可変領域は、３つの相補性決定領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【0141】
本発明の好ましい実施形態において、抗体の重鎖は、上記の重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
【0142】
本発明において、「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、または「本発明のポリペプチド」という用語は、互換的に使用され、これらは全て、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦタンパク質に特異的に結合するポリペプチド、例えば、重鎖可変領域を有するタンパク質またはポリペプチドを指す。これらは、開始メチオニンを含んでいても含んでいなくてもよい。
【0143】
本発明はさらに、本発明の抗体を有する他のタンパク質または融合発現産物を提供する。具体的には、本発明は、可変領域が本発明の抗体の重鎖可変領域と同一または少なくとも９０％相同、好ましくは少なくとも９５％相同である限り、可変領域を含む重鎖を有する任意のタンパク質またはタンパク質コンジュゲートおよび融合発現産物（すなわち、免疫コンジュゲートおよび融合発現産物）を含む。
【0144】
一般的に、抗体の抗原結合特性は、重鎖可変領域に位置する３つの特定の領域によって説明することができ、これらはＣＤＲと称され、セグメントを４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分離し、４つのＦＲのアミノ酸配列は比較的保存的であり、結合反応に直接関与していない。これらのＣＤＲは環構造を形成し、その間のＦＲが形成するβフォールドは空間構造上互いに近接しており、重鎖上のＣＤＲと対応する軽鎖上のＣＤＲは抗体の抗原結合部位を構成する。同種の抗体のアミノ酸配列を比較することによって、どのアミノ酸がＦＲ領域またはＣＤＲ領域を構成するかを判断することが可能である。
【0145】
本発明の抗体の重鎖の可変領域は、その少なくとも一部が抗原との結合に関与しているため、特に注目される。したがって、本発明は、ＣＤＲが本明細書で同定したＣＤＲと９０％超（好ましくは９５％超、最も好ましくは９８％超）相同である限り、ＣＤＲを有する抗体重鎖可変領域を有するこれらの分子を含む。
【0146】
本発明は、インタクトな抗体だけでなく、免疫学的活性を有する抗体断片、または抗体と他の配列とで形成される融合タンパク質をも含む。したがって、本発明は、抗体の断片、誘導体およびアナログをさらに含む。
【0147】
本明細書で使用する場合、「断片」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、本発明の抗体の同じ生物学的機能もしくは活性を実質的に保持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド断片、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたは複数の置換された保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）を有するポリペプチドであってよく、そのような置換アミノ酸残基は遺伝コードによってコードされていてもいなくてもよい、または（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドを他の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を延長する化合物、例えば、ポリエチレングリコール）、または（ｉｖ）追加のアミノ酸配列をポリペプチド配列に融合することによって形成されるポリペプチド（例えば、リーダー配列もしくは分泌配列、またはポリペプチドを精製するための配列もしくはプロタンパク質配列、または６Ｈｉｓタグによって形成される融合タンパク質）であってもよい。本明細書の教示に照らして、このような断片、誘導体およびアナログは、当技術分野の当業者の範囲内である。
【0148】
本発明の抗体は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦタンパク質に結合する活性を有する二重抗体を指す。本用語は、本発明の抗体と同じＣＤＲ領域を含み、同じ機能を有するポリペプチドバリアントも指す。このようなバリアント形態には、（これらに限定されないが）：Ｃ末端および／またはＮ末端の１つまたは複数（通常１～５０、好ましくは１～３０、より好ましくは１～２０、最も好ましくは１～１０）のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、ならびに１つまたはいくつか（通常２０以内、好ましくは１０以内、より好ましくは５以内）のアミノ酸の付加が含まれる。例えば、当技術分野では、より近いまたは類似の特性を有するアミノ酸の置換は、一般的に、タンパク質の機能を変化させない。他の例として、Ｃ末端および／またはＮ末端における１つまたはいくつかのアミノ酸の付加は、通常、タンパク質の機能を変化させない。本用語は、本発明の抗体の活性断片および活性誘導体をさらに指す。
【0149】
ポリペプチドのバリアントとしては、相同配列、保存的バリアント、対立遺伝子バリアント、天然変異体、誘導変異体、本発明の抗体のＤＮＡと高度または低度にストリンジェントな条件でハイブリダイズできるＤＮＡがコードするタンパク質、または本発明の抗体に対する抗血清を使用することによって得られるポリペプチドまたはタンパク質が挙げられる。
【0150】
本発明は、さらに他のポリペプチド、例えば、シングルドメイン抗体またはその断片を含む融合タンパク質を提供する。実質的に全長のポリペプチドに加えて、本発明はさらに、本発明のシングルドメイン抗体の断片を含む。典型的には、断片は、本発明の抗体の少なくとも約５０の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０の連続したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００の連続したアミノ酸を有する。
【0151】
本発明において、「本発明の抗体の保存的バリアント」は、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較して、類似または近い特性を有するアミノ酸で、多くとも１０、好ましくは多くとも８、より好ましくは多くとも５、および最も好ましくは多くとも３のアミノ酸配列を置換することにより形成されるポリペプチドを指す。これらの保存的バリアントポリペプチドは、好ましくは、表Ａに記載のアミノ酸置換によって産生される。
【0152】
本発明は、さらに、上記の抗体もしくはその断片またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡの形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード化鎖または非コード化鎖のいずれかであり得る。
【0153】
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列および種々の追加コード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および任意の追加コード配列）および非コード配列を含む。
【0154】
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいても、または追加のコード配列および／もしくは非コード配列を含んでいてもよい。
【0155】
本発明はさらに、上記の配列にハイブリダイズし、２つの配列の間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本発明のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能であるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「ストリンジェントな条件」は：（１）例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃の低いイオン強度および高温でのハイブリダイゼーションおよび溶出、または（２）例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、４２℃等の変性剤存在下でのハイブリダイゼーション；または（３）２つの配列間の同一性が少なくとも９０％、好ましくは９５％超となる場合にのみ起こるハイブリダイゼーションを指す。さらに、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
【0156】
本発明の抗体の全長ヌクレオチド配列またはその断片は、通常、ＰＣＲ増幅、組換えまたは人工合成により得ることができる。実現可能な方法は、特に断片の長さが短い場合に、人工合成を用いて関連配列を合成することである。通常、非常に長い配列を有する断片は、複数の小さな断片を合成し、それらをライゲーションすることによって得られる。さらに、重鎖のコード配列を発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）と融合させて融合タンパク質を形成することもできる。
【0157】
関連配列が得られると、組換え法を用いて大量に関連配列を得ることができる。通常、ベクターにクローニングした後、細胞を形質転換し、増殖した宿主細胞から従来法により関連配列を単離する。本発明に関わる生体分子（核酸、タンパク質等）には、単離された形態の生体分子が含まれる。
【0158】
現時点では、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列（またはその断片、もしくはその誘導体）は、化学合成により完全に得ることができる。その後、このＤＮＡ配列は、当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（例えば、ベクター）および細胞に導入することができる。また、化学合成により、本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
【0159】
本発明はまた、上記の適切なＤＮＡ配列と適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように適切な宿主細胞を形質転換するために使用することができる。
【0160】
宿主細胞は、細菌細胞等の原核細胞；または酵母細胞等の下等真核細胞；または哺乳動物細胞等の高等真核細胞であってもよい。代表的な例としては大腸菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）等の細菌細胞；酵母等の真菌細胞；ショウジョウバエＳ２またはＳｆ９等の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ７、２９３細胞等の動物細胞等が挙げられる。
【0161】
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当技術分野の当業者に周知の従来技術により行うことができる。宿主が大腸菌のような原核生物である場合、ＤＮＡを取り込むことができるコンピテントセルは、指数関数的成長期後に採取し、当技術分野の当業者に周知の手順を用いてＣａＣｌ２で処理することができる。他の方法は、ＭｇＣｌ２を使用することである。また、所望により、エレクトロポレーションにより形質転換を行うことができる。宿主が真核生物である場合、以下のＤＮＡトランスフェクション法：リン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームパッケージング等の従来の機械的方法等を用いることができる。
【0162】
得られた形質転換体は、従来法により培養し、本発明の遺伝子にコードされるポリペプチドを発現させることができる。培養に用いる培地は、使用する宿主細胞に応じて、従来の種々の培地から選択することができる。培養は、宿主細胞の増殖に適した条件下で行われる。宿主細胞が適当な細胞密度まで増殖した後、選択したプロモーターを適当な方法（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）によって誘導し、細胞をさらに一定期間培養する。
【0163】
上記方法において組換えポリペプチドは、細胞内、または細胞膜上で発現させることができ、または細胞外に分泌させることができる。組換えタンパク質は、所望により、その物理的、化学的、およびその他の特性を利用して、種々の分離方法によって単離および精製することができる。これらの方法は、当技術分野の当業者にはよく知られている。これらの方法の例としては、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧破壊、上清処理、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および他の液体クロマトグラフィー技術およびこれらの方法の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【0164】
本発明の抗体は、単独で、または検出可能な標識（診断目的）、治療剤、ＰＫ（プロテインキナーゼ）改変部分、またはこれらの物質いずれかの組合せで結合またはコンジュゲートして用いることができる。
【0165】
診断目的の検出可能な標識としては、蛍光または発光標識、放射性標識、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）またはＣＴ（コンピュータ断層撮影）造影剤、または検出可能な生成物を産生することができる酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
【0166】
本発明の抗体と組み合わせるまたはコンジュゲートすることができる治療剤としては、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：１．放射性核種；２．生物学的毒性；３．ＩＬ－２等のサイトカイン；４．金ナノ粒子／ナノロッド；５．ウイルス；６．リポソーム；７．ナノ磁性粒子；８．プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ダイアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質（ＢＰＨＬ））；１０．化学療法剤（例えばシスプラチン）または任意の形式のナノ粒子等。
医薬組成物
本発明は、組成物も提供する。好ましくは、組成物は医薬組成物であり、これは、上記抗体もしくはその活性断片もしくはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む。一般的に、これらの物質は、非毒性で不活性かつ薬学的に許容される水性担体媒体中で製剤化することができ、そのｐＨは、通常、約５～８、好ましくは約６～８であるが、製剤化する物質の性質および治療する状態に応じてｐＨ値を変化させてもよい。調製された医薬組成物は、腫瘍内投与、腹腔内投与、静脈内投与、または局所的投与を含む従来の経路で投与することができる（これらに限定されない）。
医薬組成物
本発明は、組成物も提供する。好ましくは、組成物は医薬組成物であり、これは、上記抗体もしくはその活性断片もしくはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む。一般的に、これらの物質は、非毒性で不活性かつ薬学的に許容される水性担体媒体中で製剤化することができ、そのｐＨは、通常、約５～８、好ましくは約６～８であるが、製剤化する物質の性質および治療する状態に応じてｐＨ値を変化させてもよい。調製された医薬組成物は、腫瘍内投与、腹腔内投与、静脈内投与、または局所的投与を含む従来の経路で投与することができる（これらに限定されない）。
【0167】
本発明の医薬組成物は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦタンパク質分子の結合に直接使用することができ、したがって、腫瘍を治療するために使用することができる。さらに、追加の治療剤を併用することもできる。
【0168】
本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記のシングルドメイン抗体（またはそのコンジュゲート）と薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。このような担体としては、生理食塩水、緩衝液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、またはその組合せが挙げられるが、これらに限定されない。医薬製剤は、投与様式に適合させるべきである。本発明の医薬組成物は、例えば、生理的食塩水またはグルコースおよび他のアジュバントを含む水溶液を用いて従来法により、注射剤の形態で調製することができる。注射剤または液剤等の医薬組成物は、好ましくは無菌条件下で製造される。有効成分は、治療上有効量、例えば１日あたり約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重で投与される。さらに、本発明のポリペプチドは、追加の治療剤と共に使用することもできる。
【0169】
医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の免疫コンジュゲートが哺乳動物に投与されるが、その安全かつ有効な量は、通常少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重、多くの場合約５０ｍｇ／ｋｇ体重以下であり、好ましくは、投与量は約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。それにもかかわらず、具体的な投与量については、投与経路および患者の健康状態等の要因も考慮する必要があり、これらは当業者の医師の技量の範囲内である。
標識化抗体
本発明の好ましい実施形態において、抗体は検出可能な標識を有する。より好ましくは、標識は、同位体、コロイド状金標識、有色標識および蛍光標識からなる群から選択される。
標識化抗体
本発明の好ましい実施形態において、抗体は検出可能な標識を有する。より好ましくは、標識は、同位体、コロイド状金標識、有色標識および蛍光標識からなる群から選択される。
【0170】
コロイド状金標識は、当技術分野の当業者に公知の方法を用いて実施することができる。本発明の好ましい実施形態において、ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体をコロイド状金で標識し、コロイド状金標識化抗体を得ることができる。
検出方法
本発明はまた、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦタンパク質を検出する方法に関する。本方法は、大別すると、以下：細胞および／または組織の試料を得るステップ；試料を媒体に溶解するステップ；溶解した試料中のＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦタンパク質のレベルを検出するステップを含む。
検出方法
本発明はまた、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦタンパク質を検出する方法に関する。本方法は、大別すると、以下：細胞および／または組織の試料を得るステップ；試料を媒体に溶解するステップ；溶解した試料中のＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦタンパク質のレベルを検出するステップを含む。
【0171】
本発明の検出方法において、使用する試料は特に限定されず、代表例は、細胞保存溶液中に存在する細胞含有試料である。
キット
また、本発明は、本発明の抗体（またはその断片）または検出プレートを含むキットを提供する。本発明の好ましい実施態様において、キットは、容器、使用指示書、緩衝剤等をさらに含む。
キット
また、本発明は、本発明の抗体（またはその断片）または検出プレートを含むキットを提供する。本発明の好ましい実施態様において、キットは、容器、使用指示書、緩衝剤等をさらに含む。
【0172】
また、本発明は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦのレベルを検出するための検出キットを提供し、このキットは、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦタンパク質を認識する抗体、試料を溶解するための溶解媒体、および各種緩衝剤、検出標識、検出基質等の一般的な検出試薬および緩衝剤を含む。なお、検出キットはｉｎ ｖｉｔｒｏ診断用デバイス中にあってもよい。
使用
実験の結果、本発明の二重特異性抗体は、高い特異性でヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を標的とし、腫瘍微小環境における中和ＶＥＧＦを標的とすることに基づいてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を阻害し、Ｔ細胞の活性を回復させて免疫応答を高め、それによって腫瘍発生および発達の阻害効果をより効果的に改善できることがわかった。
使用
実験の結果、本発明の二重特異性抗体は、高い特異性でヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を標的とし、腫瘍微小環境における中和ＶＥＧＦを標的とすることに基づいてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を阻害し、Ｔ細胞の活性を回復させて免疫応答を高め、それによって腫瘍発生および発達の阻害効果をより効果的に改善できることがわかった。
【0173】
以上のように、本発明のシングルドメイン抗体は、生物学的および臨床的応用価値が広く、その使用は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦに関連する疾患の診断および治療、基礎医学研究、生物学研究等の多くの分野に関連する。好ましい使用は、臨床診断、または腫瘍治療等のＰＤ－Ｌ１および／またはＶＥＧＦに対する標的治療のための使用である。
【発明の効果】
【0174】
本発明による有益な効果
本発明は、以下の技術的効果のうち１つまたは複数を達成する：
（１）本発明の二重特異性抗体は、強い親和性を有する。
（２）腫瘍微小環境におけるＶＥＧＦを標的として中和することに基づいてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を阻害し、Ｔ細胞の活性を回復させ、免疫応答を高め、腫瘍の発生および発達の阻害効果をより有効に向上させることができ、抗がん薬剤の調製において優れた可能性を示す。
（３）本発明の二重特異性抗体の産生は、簡単かつ簡便である。
（４）本発明の二重特異性抗体は、第１のタンパク質機能性領域と第２のタンパク質機能性領域との間で相乗効果を示す可能性が高く、例えば、ＶＥＧＦとの親和性は抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体よりも優れていることが多く、ＰＤ－Ｌ１との親和性は抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体よりも優れていることが多く；また、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体や抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体よりも、混合リンパ球にＩＬ２またはＩＮＦを分泌させることを誘導することにおいて優れており、本発明の二重特異性抗体がＴ細胞をより活性化できることを示している。
本発明は、以下の技術的効果のうち１つまたは複数を達成する：
（１）本発明の二重特異性抗体は、強い親和性を有する。
（２）腫瘍微小環境におけるＶＥＧＦを標的として中和することに基づいてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を阻害し、Ｔ細胞の活性を回復させ、免疫応答を高め、腫瘍の発生および発達の阻害効果をより有効に向上させることができ、抗がん薬剤の調製において優れた可能性を示す。
（３）本発明の二重特異性抗体の産生は、簡単かつ簡便である。
（４）本発明の二重特異性抗体は、第１のタンパク質機能性領域と第２のタンパク質機能性領域との間で相乗効果を示す可能性が高く、例えば、ＶＥＧＦとの親和性は抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体よりも優れていることが多く、ＰＤ－Ｌ１との親和性は抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体よりも優れていることが多く；また、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体や抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体よりも、混合リンパ球にＩＬ２またはＩＮＦを分泌させることを誘導することにおいて優れており、本発明の二重特異性抗体がＴ細胞をより活性化できることを示している。
【図面の簡単な説明】
【0175】
【図2】二重特異性抗体のＣＨＯ－ＰＤＬ１細胞への結合曲線を示す。
【図4A】図４Ａは、混合リンパ球培養物におけるＩＮＦ－ガンマの分泌を遮断するための二重特異性抗体の濃度を示す。各二重特異性抗体試料について、その濃度は左から右に、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭおよび０．０１ｎＭである。
【発明を実施するための形態】
【0176】
本発明に関わるいくつかの配列を以下の表Ｂに示す。
【0177】
【0178】
【0179】
【0180】
【0181】
【0182】
本発明を実施するための具体的なモデル
本発明は、特定の実施例と組み合わせてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するために使用されるに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図していないことは理解されるべきである。以下の実施例において具体的な条件を示さない実験方法は、通常、従来の条件に従って、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載されている条件に従って、または製造業者が推奨する条件に従って実施される。パーセンテージおよび部は、特に指示しない限り、重量によるものである。
本発明は、特定の実施例と組み合わせてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するために使用されるに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図していないことは理解されるべきである。以下の実施例において具体的な条件を示さない実験方法は、通常、従来の条件に従って、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載されている条件に従って、または製造業者が推奨する条件に従って実施される。パーセンテージおよび部は、特に指示しない限り、重量によるものである。
【0183】
実施例１：抗ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のクローニングおよび発現
１．１ 抗体構造設計
本実施例では、６つの抗ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体を構築した、すなわち：
Ａｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤ／Ａｖａ－４ＧＳ－ＮＳＤ：４本のポリペプチド鎖（Ｃ－Ｙｅ－１８－５にそれぞれライゲーションした２本の重鎖、および２本の軽鎖）から構成され、その模式図は図１Ａおよび図７Ａに示され、両ペプチド鎖＃１は配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ（特許番号：国際公開第１９９８０４５３３２号）に由来するＶＨアミノ酸配列（配列番号３）を含み、ＶＨアミノ酸配列のＣ末端はヒトＩｇＧ１に由来するＣＨアミノ酸配列に直接ライゲーションされ（Ｆｃ機能を低下させるためにＬＡＬＡ変異を導入、配列番号４）、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ Ｃ－Ｙｅ－１８－５（特許出願番号：第２０１９１０８６３１０９０号）（配列番号５）のＮ末端を、１１アミノ酸残基（Ｇ４Ｓ）２Ｇ（配列番号６）（Ａｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤ）または２１アミノ酸残基（Ｇ４Ｓ）４Ｇ（配列番号７）（Ａｖａ－４ＧＳ－ＮＳＤ）の可撓性ペプチドを介して重鎖のＣ末端にライゲーションした。両ペプチド鎖＃２は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有し、これは抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブに由来するＶＬアミノ酸配列（配列番号９）、およびＶＬアミノ酸配列のＣ末端にライゲーションしたヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列（配列番号１０）を含む。
１．１ 抗体構造設計
本実施例では、６つの抗ＶＥＧＦ／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体を構築した、すなわち：
Ａｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤ／Ａｖａ－４ＧＳ－ＮＳＤ：４本のポリペプチド鎖（Ｃ－Ｙｅ－１８－５にそれぞれライゲーションした２本の重鎖、および２本の軽鎖）から構成され、その模式図は図１Ａおよび図７Ａに示され、両ペプチド鎖＃１は配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ（特許番号：国際公開第１９９８０４５３３２号）に由来するＶＨアミノ酸配列（配列番号３）を含み、ＶＨアミノ酸配列のＣ末端はヒトＩｇＧ１に由来するＣＨアミノ酸配列に直接ライゲーションされ（Ｆｃ機能を低下させるためにＬＡＬＡ変異を導入、配列番号４）、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ Ｃ－Ｙｅ－１８－５（特許出願番号：第２０１９１０８６３１０９０号）（配列番号５）のＮ末端を、１１アミノ酸残基（Ｇ４Ｓ）２Ｇ（配列番号６）（Ａｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤ）または２１アミノ酸残基（Ｇ４Ｓ）４Ｇ（配列番号７）（Ａｖａ－４ＧＳ－ＮＳＤ）の可撓性ペプチドを介して重鎖のＣ末端にライゲーションした。両ペプチド鎖＃２は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有し、これは抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブに由来するＶＬアミノ酸配列（配列番号９）、およびＶＬアミノ酸配列のＣ末端にライゲーションしたヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列（配列番号１０）を含む。
【0184】
Ｌｕｃ－２ＧＳ－ＮＳＤ／Ｌｕｃ－４ＧＳ－ＮＳＤ：４本のポリペプチド鎖（Ｃ－Ｙｅ－１８－５にそれぞれライゲーションした２本の重鎖、および２本の軽鎖）から構成され、その模式図は図１Ｂおよび図７Ｂに示され、両ペプチド鎖＃１が配列番号１１または配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有し、これは抗ＶＥＧＦ抗体ラニビズマブ（特許番号：国際公開第２０１８１７５７５２号）に由来するＶＨアミノ酸配列（配列番号１３）を含んでおり、ＶＨアミノ酸配列のＣ末端がヒトＩｇＧ１に由来するＣＨアミノ酸配列に直接ライゲーションし（Ｆｃ機能を低下させるためにＬＡＬＡ変異を導入、配列番号４）、Ｎ末端を抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－１８－５（配列番号５）を、１１アミノ酸残基（Ｇ４Ｓ）２Ｇ（配列番号６）（Ｌｕｃ－２ＧＳ－ＮＳＤ）または２１アミノ酸残基（Ｇ４Ｓ）４Ｇ（配列番号７）（Ｌｕｃ－４ＧＳ－ＮＳＤ）の可撓性ペプチドを介して重鎖のＣ末端にライゲーションした。両ペプチド鎖＃２は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有しており、これは抗ＶＥＧＦ抗体ラニビズマブに由来するＶＬアミノ酸配列（配列番号１５）、およびＶＬアミノ酸配列のＣ末端にライゲーションしたヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）（配列番号１０）を含んでいた。
【0185】
ＮＳＤ－Ｅｌｙｅａ：２本の同一のポリペプチド鎖（二量体）から構成され、その模式図は図１Ｃおよび図７Ｃに示され、ペプチド鎖は配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有し、これは抗ＶＥＧＦ融合タンパク質アフリベルセプト（特許番号：米国特許第７０７０９５９号）に由来するＶＥＧＦ結合領域（Ｅｌｙｅａ、配列番号１７）を含み、アミノ酸配列のＣ末端をヒトＩｇＧ１に由来するＦｃアミノ酸配列に直接ライゲーションし（Ｆｃ機能を低下させるためにＬＡＬＡ変異が導入された、配列番号１８）、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－１８－５のＮ末端を２１アミノ酸残基（Ｇ４Ｓ）４Ｇ（配列番号７）の可撓性ペプチドを介して重鎖のＣ末端にライゲーションした。
【0186】
Ｅｌｙｅａ－ＮＳＤ：２つの同一のポリペプチド鎖（二量体）から構成され、その構造模式図は図１Ｄおよび図７Ｄに示され、ペプチド鎖は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有し、これは、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－１８－５（配列番号５）を含み、ナノボディ配列のＣ末端はヒトＩｇＧ１に由来するＦｃアミノ酸配列に直接ライゲーションされ（Ｆｃ機能を低下させるためにＬＡＬＡ変異が導入された、配列番号１８）、抗ＶＥＧＦ融合タンパク質アフリベルセプトに由来するＶＥＧＦ結合領域（Ｅｌｙｅａ、配列番号１７）のＮ末端を、２１アミノ酸残基の可撓性ペプチド（Ｇ４Ｓ）４Ｇ（配列番号７）を介して重鎖のＣ末端にライゲーションした。
１．２ 遺伝子クローニングおよびタンパク質の調製
表Ｂの配列を参照し、対応するアミノ酸配列をコードする遺伝子断片をｐＣＤＮＡ３．１ベクターに構築した。Ａｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤのペプチド鎖＃１およびペプチド鎖＃２については、これら２つの配列は一過性のトランスフェクション中に２つの異なるプラスミドで発現し、細胞発現手順の間にジスルフィドが自動的に形成されるであろう。
１．２ 遺伝子クローニングおよびタンパク質の調製
表Ｂの配列を参照し、対応するアミノ酸配列をコードする遺伝子断片をｐＣＤＮＡ３．１ベクターに構築した。Ａｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤのペプチド鎖＃１およびペプチド鎖＃２については、これら２つの配列は一過性のトランスフェクション中に２つの異なるプラスミドで発現し、細胞発現手順の間にジスルフィドが自動的に形成されるであろう。
【0187】
ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏより購入）を用いてプラスミドをＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション方法は製造者の指示に従って実施した。細胞を５日間培養した後、上清を回収し、プロテインＡ磁気ビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔより購入）を用いたソーティング法に供し、標的タンパク質を精製した。磁気ビーズを適当な体積の結合緩衝剤（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）で再懸濁し（磁気ビーズの１～４倍の体積）、次いで精製する試料に添加し、室温で穏やかに振とうしながら１時間インキュベートした。試料を磁気スタンド（Ｂｅａｖｅｒより購入）に置き、上清を廃棄し、磁気ビーズを結合緩衝剤で３回洗浄した。溶出緩衝剤（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．２）を磁気ビーズの３～５倍の体積になるように添加し、室温で５～１０分間振とうし、磁気スタンドに置き、溶出緩衝剤を回収し、中和緩衝剤（１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５４）を加えた回収管に移し、よく混合した。これを次の実験に使用した。
【0188】
実施例２：二重特異性抗体の抗体親和性の決定
ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は、既存の方法（Ｅｓｔｅｐ， Ｐら、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ， ＭＡｂｓ， ２０１３．５（２）：ｐ．２７０－８）に従って実施した。簡単に説明すると、センサーをアッセイ緩衝剤中で３０分間オフラインで平衡化し、次にベースラインを確立するために６０秒間オンラインで測定し、上記のように得られた精製された抗体をオンラインでＡＨＣセンサーにローディングした。その後、センサーを１００ｎＭのＰＤ－Ｌ１またはＶＥＧＦ抗原に５分間静置し、その後センサーをＰＢＳに移し５分間解離させた。動態解析は、１：１結合モデルを用いて行った。
ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は、既存の方法（Ｅｓｔｅｐ， Ｐら、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ， ＭＡｂｓ， ２０１３．５（２）：ｐ．２７０－８）に従って実施した。簡単に説明すると、センサーをアッセイ緩衝剤中で３０分間オフラインで平衡化し、次にベースラインを確立するために６０秒間オンラインで測定し、上記のように得られた精製された抗体をオンラインでＡＨＣセンサーにローディングした。その後、センサーを１００ｎＭのＰＤ－Ｌ１またはＶＥＧＦ抗原に５分間静置し、その後センサーをＰＢＳに移し５分間解離させた。動態解析は、１：１結合モデルを用いて行った。
【0189】
結果は以下の表１および表２に示した。
【0190】
【0191】
結果から、本発明の二重特異性抗体試料は、全てＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦタンパク質に対する結合活性を有することが示された。対照抗体Ｃ－Ｙｅ－１８－５（ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体）と比較して、本発明の二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１に対する結合活性は同等またはさらに良好であり；および／または、対照抗体ラニビズマブおよびベバシズマブと比較して、本発明の二重特異性抗体のＶＥＧＦに対する結合活性は同等またはさらに良好だった。
【0192】
実施例３：精製された二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１に対する結合
ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞）は、ＭＣＳにクローニングしたヒトＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌより購入）をｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入）にトランスフェクションすることによって作製した。増殖させたＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞は、細胞密度２×１０６細胞／ｍｌに調整し、９６ウェルフロープレートに１００μｌ／ウェルを添加し、遠心分離して後に使用した。精製されたＰＤ－Ｌ１抗体をＰＢＳで４００ｎＭから３倍希釈し、合計１２点を得た。上記希釈試料を上記の細胞保有９６ウェルフロープレートに１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００倍に希釈したヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＰＥ）（Ａｂｃａｍより購入）を１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを、１００μｌ／ウェルで添加して細胞を再懸濁し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ）フローサイトメーターを用いて検出し、対応するＭＦＩを算出した。
ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞）は、ＭＣＳにクローニングしたヒトＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌより購入）をｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入）にトランスフェクションすることによって作製した。増殖させたＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞は、細胞密度２×１０６細胞／ｍｌに調整し、９６ウェルフロープレートに１００μｌ／ウェルを添加し、遠心分離して後に使用した。精製されたＰＤ－Ｌ１抗体をＰＢＳで４００ｎＭから３倍希釈し、合計１２点を得た。上記希釈試料を上記の細胞保有９６ウェルフロープレートに１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００倍に希釈したヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＰＥ）（Ａｂｃａｍより購入）を１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを、１００μｌ／ウェルで添加して細胞を再懸濁し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ）フローサイトメーターを用いて検出し、対応するＭＦＩを算出した。
【0193】
結果は図２に示した。本発明の精製された試料は全てＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞に対する結合活性を有し、精製された試料の結合活性は対照抗体Ｃ－Ｙｅ－１８－５と同等かそれ以上であった。
【0194】
実施例４：ＥＬＩＳＡベースのＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ遮断活性の検出
ヒトＶＥＧＦＲタンパク質をＥＬＩＳＡコーティング溶液で適切な濃度に希釈してＥＬＩＳＡプレートに添加し、４℃で一晩コーティングした。ブロッキングは５％ＢＳＡで室温で１時間行った。試験する試料を連続希釈し、ビオチン標識化ヒトＶＥＧＦタンパク質と共に室温で１時間共インキュベートした。インキュベートした試料を密封したＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で２時間反応させた。ＰＢＳ洗浄液で３回洗浄した後、希釈したストレプトアビジン（ＨＲＰ）を添加し、室温で１時間反応させ、ＰＢＳ洗浄液で３回洗浄した後、ＥＬＩＳＡ発色溶液を添加し、室温で３分放置した後、ＥＬＩＳＡ停止溶液を添加し、４５０ｎｍの吸光値を読み取った。
ヒトＶＥＧＦＲタンパク質をＥＬＩＳＡコーティング溶液で適切な濃度に希釈してＥＬＩＳＡプレートに添加し、４℃で一晩コーティングした。ブロッキングは５％ＢＳＡで室温で１時間行った。試験する試料を連続希釈し、ビオチン標識化ヒトＶＥＧＦタンパク質と共に室温で１時間共インキュベートした。インキュベートした試料を密封したＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で２時間反応させた。ＰＢＳ洗浄液で３回洗浄した後、希釈したストレプトアビジン（ＨＲＰ）を添加し、室温で１時間反応させ、ＰＢＳ洗浄液で３回洗浄した後、ＥＬＩＳＡ発色溶液を添加し、室温で３分放置した後、ＥＬＩＳＡ停止溶液を添加し、４５０ｎｍの吸光値を読み取った。
【0195】
結果は図３Ａから図３Ｂに示した。
その結果により、Ａｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤ、Ｌｕｃ－２ＧＳ－ＮＳＤ、Ａｖａ－４ＧＳ－ＮＳＤ、Ｌｕｃ－４ＧＳ－ＮＳＤ（図３Ａ）およびＮＳＤ－Ｅｌｙｅａ、Ｅｌｙｅａ－ＮＳＤ（図３Ｂ）によりＶＥＧＦとＶＥＧＦＲタンパク質間の相互作用を完全に遮断し得ることが示された。
その結果により、Ａｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤ、Ｌｕｃ－２ＧＳ－ＮＳＤ、Ａｖａ－４ＧＳ－ＮＳＤ、Ｌｕｃ－４ＧＳ－ＮＳＤ（図３Ａ）およびＮＳＤ－Ｅｌｙｅａ、Ｅｌｙｅａ－ＮＳＤ（図３Ｂ）によりＶＥＧＦとＶＥＧＦＲタンパク質間の相互作用を完全に遮断し得ることが示された。
【0196】
実施例５：混合リンパ球反応実験
本実施例において、二重特異性抗体試料によるＴ細胞の活性化を、混合リンパ球反応実験（ＭＬＲ）により検出した。具体的な実験方法は、以下の通りであった。
本実施例において、二重特異性抗体試料によるＴ細胞の活性化を、混合リンパ球反応実験（ＭＬＲ）により検出した。具体的な実験方法は、以下の通りであった。
【0197】
ＰＢＭＣ細胞（ＳＡＩＬＹ ＢＩＯ、ＳＬＢ－ＨＰＢより購入）を蘇生させ、遠心分離し、ＰＢＭＣ細胞を１０ｍｌのＸ－ＶＩＶＯ－１５培地（ＬＯＮＺＡより購入）で再懸濁し、３７℃の細胞培養インキュベーターで２時間培養し、ピペッティングにより非接着細胞を取り除いた。ＤＣ培地（１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄより購入）、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４を含むＸ－ＶＩＶＯ－１５培地に）１０ｍｌを添加し、３日間培養した。ＤＣ培地５ｍｌを補充し、６日目まで培養を続け、ＤＣ成熟培地（１０００Ｕ／ｍｌ ＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄより購入）、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６（Ｒ＆Ｄより購入）、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１β（Ｒ＆Ｄより購入）、１μＭ ＰＧＥ２（Ｔｏｃｒｉｓより購入）を含むＸ－ＶＩＶＯ－１５培地）を添加し、２日間培養した。成熟ＤＣ細胞を採取し、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５培地で細胞密度２×１０５細胞／ｍｌになるように調整した。
【0198】
他のドナー由来のＰＢＭＣ細胞（ＳＡＩＬＹ ＢＩＯ、ＳＬＢ－ＨＰＢより購入）を蘇生させ、遠心分離した。ＰＢＭＣ細胞を１０ｍｌのＸ－ＶＩＶＯ－１５培地で再懸濁した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞をＣＤ４＋ Ｔ細胞ソーティングキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌより購入）で濃縮し、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５に再懸濁し、細胞密度を２×１０６細胞／ｍｌに調整した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞と上記で採取した成熟ＤＣ細胞を１：１の割合で混合し、９６ウェルＵ底プレートに１００μｌ／ウェルで添加した。
【0199】
精製された二重特異性抗体試料をＸ－ＶＩＶＯ－１５培地で２００ｎＭから３倍希釈して合計９点を得、上記混合細胞ウェルに１００μｌ／ウェルで添加し、５日間培養した。上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅより購入）によりＩＦＮ－γ（図４Ａ）およびＩＬ２（図４Ｂ）の発現レベルを検出した。
【0200】
結果を図４Ａおよび図４Ｂに示し、ここで、Ａｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤ、Ｌｕｃ－２ＧＳ－ＮＳＤ、Ａｖａ－４ＧＳ－ＮＳＤ、Ｌｕｃ－４ＧＳ－ＮＳＤ、ＮＳＤ－Ｅｌｙｅａ、Ｅｌｙｅａ－ＮＳＤは全てＭＬＲ実験において良好な生物学的活性を示し、その活性レベルは対照抗体Ｃ－Ｙｅ－１８－５と同等またはそれ以上だった。例えば、いくつかの濃度では、二重特異性抗体試料は対照抗体よりも高いＩＬ２またはＩＮＦの分泌を誘導し、これは本発明の二重特異性抗体がよりよくＴ細胞を活性化できることを示す。
【0201】
実施例６：加速安定性試験
６．１ 加速安定性試験試料の純度決定
本実験では、４０℃で３０日間静置した後の二重特異性抗体の純度および生物学的活性の変化を検出することによって、二重特異性抗体の長期熱安定性を評価した。４０℃で０日、１４日、および３０日間保存した後の標的抗体の純度は、ＳＥＣにより決定した。
６．１ 加速安定性試験試料の純度決定
本実験では、４０℃で３０日間静置した後の二重特異性抗体の純度および生物学的活性の変化を検出することによって、二重特異性抗体の長期熱安定性を評価した。４０℃で０日、１４日、および３０日間保存した後の標的抗体の純度は、ＳＥＣにより決定した。
【0202】
実験結果は表３に示した。
【0203】
この結果により、二重特異性抗体Ａｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤ、Ｌｕｃ－２ＧＳ－ＮＳＤ、ＮＳＤ－Ｅｌｙｅａ、およびＥｌｙｅａ－ＮＳＤの純度は有意に変化しないことが示された。
６．２ 加速安定性試験試料の活性決定
本実験では、ＣＨＯ－ＰＤＬ１細胞への加速安定性試験試料の結合をＦＡＣＳ法により検出し、その方法は実施例３と同様であった。また、加速安定性試験試料のＶＥＧＦへの結合は、以下のＥＬＩＳＡ法により検出した：ＶＥＧＦＡ組換えタンパク質をＥＬＩＳＡコーティング溶液で１μｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で一晩コーティングした。コーティング溶液を廃棄し、ＰＢＳＴを２５０μｌ／ウェルで添加して３回洗浄し、５％ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングを行った。精製された試料を１％ＢＳＡで連続希釈した。ブロッキング溶液をＥＬＩＳＡプレートから廃棄し、上記の希釈した試料をブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルで添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴを２５０μｌ／ウェルで添加して３回洗浄し、１％ＢＳＡで希釈したヤギ抗ヒトＦｃ－ＨＲＰを１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴを２５０μｌ／ウェルで添加して３回洗浄し、ＥＬＩＳＡ発色溶液を、１００μｌ／ウェルで添加し、３分間室温で静置した。ＥＬＩＳＡ停止溶液を５０μｌ／ウェルで添加し、４５０ｎｍの吸光値を読み取った。
６．２ 加速安定性試験試料の活性決定
本実験では、ＣＨＯ－ＰＤＬ１細胞への加速安定性試験試料の結合をＦＡＣＳ法により検出し、その方法は実施例３と同様であった。また、加速安定性試験試料のＶＥＧＦへの結合は、以下のＥＬＩＳＡ法により検出した：ＶＥＧＦＡ組換えタンパク質をＥＬＩＳＡコーティング溶液で１μｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で一晩コーティングした。コーティング溶液を廃棄し、ＰＢＳＴを２５０μｌ／ウェルで添加して３回洗浄し、５％ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングを行った。精製された試料を１％ＢＳＡで連続希釈した。ブロッキング溶液をＥＬＩＳＡプレートから廃棄し、上記の希釈した試料をブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルで添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴを２５０μｌ／ウェルで添加して３回洗浄し、１％ＢＳＡで希釈したヤギ抗ヒトＦｃ－ＨＲＰを１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴを２５０μｌ／ウェルで添加して３回洗浄し、ＥＬＩＳＡ発色溶液を、１００μｌ／ウェルで添加し、３分間室温で静置した。ＥＬＩＳＡ停止溶液を５０μｌ／ウェルで添加し、４５０ｎｍの吸光値を読み取った。
【0204】
実験結果を図５Ａ～図５Ｈに示すが、二重特異性抗体のＣＨＯ－ＰＤＬ１細胞への結合のＥＣ５０値（図５Ａ～図５Ｄ）およびＶＥＧＦタンパク質への結合のＥＣ５０値（図５Ｅ～図５Ｈ）は有意に変化しなかった。この結果から、本発明の二重特異性抗体は熱安定性が良好であることが示された。
【0205】
実施例７：ラットにおける薬物動態評価
この実験では、抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体の薬物動態特性をラットにおいて試験し、ＳＤラット（雄と雌が半々、１２／１２時間明暗調整、温度２４±２℃、湿度４０－７０％、水と食事への自由アクセス）６匹をＺｈｅｊｉａｎｇ Ｗｅｉｔｏｎｇ Ｌｉｈｕａ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄから購入した。実験当日、Ａｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤまたはＥｌｙｅａ－ＮＳＤ分子を１０ｍｇ／ｋｇの用量でＳＤラットの尾静脈に１回注射した。
この実験では、抗ＰＤ－Ｌ１／ＶＥＧＦ二重特異性抗体の薬物動態特性をラットにおいて試験し、ＳＤラット（雄と雌が半々、１２／１２時間明暗調整、温度２４±２℃、湿度４０－７０％、水と食事への自由アクセス）６匹をＺｈｅｊｉａｎｇ Ｗｅｉｔｏｎｇ Ｌｉｈｕａ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄから購入した。実験当日、Ａｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤまたはＥｌｙｅａ－ＮＳＤ分子を１０ｍｇ／ｋｇの用量でＳＤラットの尾静脈に１回注射した。
【0206】
採血時点：血液試料を、投与後３分、４時間、１０時間、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間、１６８時間、２４０時間、３３６時間、５０４時間および６７２時間の時点でラットの頸静脈から回収した。全血試料を２～８℃で３０分間静置した後、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、血清を回収した。得られた血清を２－８℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、－８０℃で保存し、血清中の遊離Ａｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤまたはＥｌｙｅａ－ＮＳＤ分子をＥＬＩＳＡにより検出した。
実験結果は、表４に示した。
実験結果は、表４に示した。
【0207】
結果によって、ＳＤラットにおける本発明のＡｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤ分子の半減期は約３２０．６時間であり、ＳＤラットにおけるＥｌｙｅａ－ＮＳＤ分子の半減期は約３８．１時間であることが示された。
【0208】
実施例８：二重特異性抗体の腫瘍抑制活性
本実験では、ヒト結腸がんＬＯＶＯ細胞／ＮＯＧマウスにヒトＰＢＭＣを注射したモデルを用いて、二重特異性抗体の抗腫瘍効果を決定した。十分なＬＯＶＯ細胞（Ａｄｄｅｘｂｉｏより購入）をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養および増殖させ、トリプシン処理後に回収し、ＰＢＳで３回洗浄した後にカウントし、８週齢の雌ＮＯＧ重症免疫不全マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗｅｉｔｏｎｇ Ｌｉｈｕａ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄより購入）に２×１０６細胞／マウスの量でマウス右腹部に皮下接種した。皮下腫瘍形成を毎日観察し、接種８日後に６×１０６個のＰＢＭＣを各マウスの尾静脈に注射した。ＰＢＭＣ注射３日後に、各動物の右腹部の皮下腫瘍の最大軸幅Ｗと最大軸長Ｌをノギスで測定し、各マウスの体重を電子天秤で測定した。各マウスの右腹部の皮下腫瘍体積は、式：腫瘍体積Ｔ＝１／２×Ｗ×Ｗ×Ｌに従って算出した。腫瘍体積が大きすぎるマウス、または小さすぎるマウスを除外し、ＮＯＧマウスを平均腫瘍体積に応じて４群に分け、各群６匹ずつとした。分類は下記表５に示す分類レジメンに従って行い、対応する用量のＡｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤを注射した。
本実験では、ヒト結腸がんＬＯＶＯ細胞／ＮＯＧマウスにヒトＰＢＭＣを注射したモデルを用いて、二重特異性抗体の抗腫瘍効果を決定した。十分なＬＯＶＯ細胞（Ａｄｄｅｘｂｉｏより購入）をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養および増殖させ、トリプシン処理後に回収し、ＰＢＳで３回洗浄した後にカウントし、８週齢の雌ＮＯＧ重症免疫不全マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗｅｉｔｏｎｇ Ｌｉｈｕａ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄより購入）に２×１０６細胞／マウスの量でマウス右腹部に皮下接種した。皮下腫瘍形成を毎日観察し、接種８日後に６×１０６個のＰＢＭＣを各マウスの尾静脈に注射した。ＰＢＭＣ注射３日後に、各動物の右腹部の皮下腫瘍の最大軸幅Ｗと最大軸長Ｌをノギスで測定し、各マウスの体重を電子天秤で測定した。各マウスの右腹部の皮下腫瘍体積は、式：腫瘍体積Ｔ＝１／２×Ｗ×Ｗ×Ｌに従って算出した。腫瘍体積が大きすぎるマウス、または小さすぎるマウスを除外し、ＮＯＧマウスを平均腫瘍体積に応じて４群に分け、各群６匹ずつとした。分類は下記表５に示す分類レジメンに従って行い、対応する用量のＡｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤを注射した。
【0209】
マウスの腫瘍体積および体重を１週間に２回測定した。腫瘍細胞接種後３１日目にマウスの体重および腫瘍体積を最後に測定し、マウスを安楽死させた。
【0210】
【0211】
結果より、ＰＢＳ群と比較して、Ａｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤは用量依存的に腫瘍の成長を阻害することができ、１ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、および２４ｍｇ／ｋｇ投与時のＴＧＩ値はそれぞれ１６．７％、４４．９％、５５．６％であった。４．８ｍｇ／ｋｇ群および２４ｍｇ／ｋｇ群の腫瘍体積は、ＰＢＳ群と有意に異なっていた。平均腫瘍重量、腫瘍成長阻害率および腫瘍体積の結果は、実質的に同様の傾向を示した（図６Ａおよび表６）。
【0212】
各群のマウスの日常観察は異常を示さず、マウスの体重を週２回測定したが、各群のマウスの体重は有意には減少せず、実験終了時、各用量群のマウスの体重は投与および治療開始時の体重と比較して１３％を超える変化はなく、ＰＢＳ群のマウスの体重は６％減少し；このため、実験後期には、マウスにＰＢＭＣを再構成したことによるＧｖＨＤにより、各群のマウスの体重が減少した可能性が高いと考えられた（図６Ｂ参照）。実験終了時に、各群のマウスを解剖し、肝臓、腎臓、肺および他の主要臓器を検査した。明らかな病変は見られず、これにより、この実験で使用した用量では、各群の薬剤はマウスに対して明らかな毒性を示さないことが示された。
【0213】
実験結果により、Ａｖａ－２ＧＳ－ＮＳＤは用量依存的にＬＯＶＯ皮下移植腫瘍の増殖を阻害し、有効用量は４．８ｍｇ／ｋｇであり、３つの用量（１ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、および２４ｍｇ／ｋｇ）においてマウスに対する明らかな毒性は観察されないことが示された。
【0214】
本出願で言及された全ての文書は、それぞれが個別に参照により組み込まれるかのように、本出願に参照により組み込まれる。さらに、本発明の上記教示内容を読んだ後、当技術分野の当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等形態も本出願の添付の請求項によって定義される範囲に入ることは理解されるべきである。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【配列表】
【国際調査報告】