▶ エムセラ ファーマ カンパニー リミテッドの特許一覧 ▶ アファーマの特許一覧
特表2023-539507エゾオヤマリンドウ抽出物を含むインスリン敏感性改善用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-14
(54)【発明の名称】エゾオヤマリンドウ抽出物を含むインスリン敏感性改善用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 36/515 20060101AFI20230907BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230907BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230907BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230907BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230907BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230907BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20230907BHJP
A23K 10/30 20160101ALI20230907BHJP
【ＦＩ】
A61K36/515
A61P3/10
A61P27/02
A61P13/12
A61P25/00
A61P43/00 111
A23L33/105
A23K10/30
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023513880
(86)(22)【出願日】2021-08-27
(85)【翻訳文提出日】2023-02-24
(86)【国際出願番号】 KR2021011530
(87)【国際公開番号】W WO2022045834
(87)【国際公開日】2022-03-03
(31)【優先権主張番号】10-2020-0109373
(32)【優先日】2020-08-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522135628
【氏名又は名称】エムセラ ファーマ カンパニー リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】523066842
【氏名又は名称】アファーマ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100137626
【弁理士】
【氏名又は名称】田代 玄
(72)【発明者】
【氏名】ソン ミ ウォン
(72)【発明者】
【氏名】キム シニョン
(72)【発明者】
【氏名】チェ ジン ギュ
(72)【発明者】
【氏名】キム セ ウン
(72)【発明者】
【氏名】パク サン チョル
(72)【発明者】
【氏名】チェ ジ ソン
(72)【発明者】
【氏名】リ ジン ス
【テーマコード（参考）】
2B150
4B018
4C088
【Ｆターム（参考）】
2B150AB10
2B150AE01
2B150AE13
2B150AE40
2B150AE49
2B150BA01
2B150BC06
2B150BD01
2B150BD06
2B150BE01
2B150CE30
2B150CJ01
2B150CJ02
2B150CJ05
2B150DD44
2B150DD57
4B018MD61
4B018ME03
4B018MF01
4C088AB67
4C088AC01
4C088AC11
4C088ZA01
4C088ZA33
4C088ZA81
4C088ZC35
4C088ZC41
(57)【要約】
本発明はエゾオヤマリンドウ抽出物を含むインスリン敏感性改善用組成物に関する。本発明に係る組成物はＩＴＩＨ１の発現を減少させることによってインスリン敏感性を改善させるので、糖尿病、糖尿合併症、耐糖能異常およびインスリン抵抗性症候群（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）等の治療剤として有用に使われ得る。
【選択図】図３
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エゾオヤマリンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａ ｔｒｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ）抽出物を含む、インスリン敏感性改善用薬学組成物。
【請求項2】
インスリン感受性上昇およびインスリン抵抗性減少効果を有することを特徴とする、請求項１に記載のインスリン敏感性改善用薬学組成物。
【請求項3】
糖尿病、糖尿合併症、耐糖能異常、およびインスリン抵抗性症候群（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）で構成された群から選択された一つ以上の疾患の予防または治療用であることを特徴とする、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項4】
前記糖尿合併症は糖尿病網膜症、糖尿病性白内障、糖尿病性腎症、および糖尿病性神経障害で構成された群から選択された一つ以上の疾患であることを特徴とする、請求項３に記載の薬学組成物。
【請求項5】
前記インスリン抵抗性症候群はインスリン抵抗性による肥満、高血圧、動脈硬化、高脂血症、高インスリン血症、非アルコール性脂肪肝、および２型糖尿病で構成された群から選択された一つ以上の疾患であることを特徴とする、請求項３に記載の薬学組成物。
【請求項6】
前記エゾオヤマリンドウ抽出物はエゾオヤマリンドウ全草抽出物またはエゾオヤマリンドウ根抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項7】
前記エゾオヤマリンドウ抽出物はＩＴＩＨ１（Ｉｎｔｅｒ－ａｌｐｈａ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ １）ｍＲＮＡまたは蛋白質の発現を減少させることを特徴とする、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項8】
前記エゾオヤマリンドウ抽出物はｏｇｔ（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ｍＲＮＡの発現を減少させることを特徴とする、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項9】
エゾオヤマリンドウ抽出物を含む、インスリン敏感性改善用食品組成物。
【請求項10】
インスリン感受性上昇およびインスリン抵抗性減少効果を有することを特徴とする、請求項９に記載のインスリン敏感性改善用食品組成物。
【請求項11】
糖尿病、糖尿合併症、耐糖能異常、およびインスリン抵抗性症候群（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）で構成された群から選択された一つ以上の疾患の予防または改善用であることを特徴とする、請求項９に記載の食品組成物。
【請求項12】
エゾオヤマリンドウ抽出物を含む、インスリン敏感性改善用動物用飼料組成物。
【請求項13】
インスリン感受性上昇およびインスリン抵抗性減少効果を有することを特徴とする、請求項１２に記載のインスリン敏感性改善用動物用飼料組成物。
【請求項14】
糖尿病、糖尿合併症、耐糖能異常、およびインスリン抵抗性症候群（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）で構成された群から選択された一つ以上の疾患の予防または改善用であることを特徴とする、請求項１２に記載の動物用飼料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はエゾオヤマリンドウ抽出物を含むインスリン敏感性改善用組成物に関し、さらに詳細にはＩＴＩＨ１（Ｉｎｔｅｒ－ａｌｐｈａ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ １）の発現を減少させることによってインスリン敏感性を改善することを特徴とする組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
正常な場合、体内では血中ブドウ糖濃度を調節することによって恒常性を維持するが、代謝性疾患、インスリン抵抗性を伴う疾患では血糖が過度に増加し、このような高血糖が持続する場合、組織の損傷を起こして機能障害を誘発する。
【0003】
インスリン抵抗性はインスリンに対する敏感性が正常な基準に比べて減少したもので、筋肉と脂肪組織でインスリンの増加を感知できないか、感知してもインスリンの作用が効果的に起きない場合をいう。この場合、血糖を下げることができないため細胞代謝および物質代謝のバランスが効果的に維持されなくなる。
【0004】
インスリン敏感性を改善させるために、膵臓のベータ（β）細胞でインスリン自体の分泌を増加させるか、物質代謝経路でインスリン受容体がインスリンと結合して伝達する信号（ｓｉｇｎａｌ）を増幅させる方法が主に考慮されるが、高血糖を誘発する生物学的メカニズムに基づいて、これに関与する蛋白質自体の活性を調節することによって高血糖を制御する方法に対する研究は不備であるのが実情である。
【0005】
ＩＴＩＨ１（Ｉｎｔｅｒ－ａｌｐｈａ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ １）は肝細胞で生成されて血液に分泌される蛋白質であり、ブドウ糖の刺激によって細胞内濃度およびその分泌量が増加する（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．１１、Ｉｓｓｕｅ ５１３、ｅａａｎ４７３５、２０１９）。具体的には、ＩＴＩＨ１増加は高血糖でＧ蛋白質の一種であるＧ１３の減少とＯＧＴ（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）酵素の発現量増加によってなされる。高血糖環境でＯＧＴがＩＴＩＨ１のセリン残基にＯ－ＧｌｃＮＡｃｙｌａｔｉｏｎ変形を起こしてＩＴＩＨ１の安定性が増加し、これに伴いＩＴＩＨ１の濃度が増加するとＩＴＩＨ１はヒアルロン酸に結合して筋肉および脂肪細胞でインスリン敏感性を低下させる。
【0006】
一方、エゾオヤマリンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａ ｔｒｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ）はリンドウ科の多年草で、花は７－８月に空色で咲き、根茎は太く元の幹はまっすぐに立って毛はない。韓国、満州、日本、東部シベリアなどの地に分布し、リンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａ ｓｃａｂｒａ）と類似しているが、幹と葉の下面の主脈に突起がなく、花がぱあっと咲かず、花冠裂片が反り返らない点でリンドウとは区別される。秋に根を掘って乾燥したものを消化不良、胆嚢炎、黄疸、頭痛、脳炎、膀胱炎、尿道炎などに使うが、エゾオヤマリンドウのインスリン敏感性改善効果については知られていない。
【0007】
これと関連して、本発明の発明者らはエゾオヤマリンドウ抽出物がＩＴＩＨ１の発現を抑制することによってインスリン敏感性を改善させる可能性があることを発見して、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．１１、Ｉｓｓｕｅ ５１３、ｅａａｎ４７３５（２０１９．１０．０９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明はＩＴＩＨ１の発現を減少させることによってインスリン敏感性を改善可能な、エゾオヤマリンドウ抽出物を含む組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前記目的を達成するために、本発明はエゾオヤマリンドウ抽出物を含むインスリン敏感性改善用組成物を提供する。
【0011】
前記組成物は薬学組成物、食品組成物、または動物用飼料組成物であり得る。
【0012】
一実施態様において、前記組成物はインスリン感受性上昇およびインスリン抵抗性減少効果を有するものである。
【0013】
一実施態様において、前記組成物は糖尿病、糖尿合併症、耐糖能異常、およびインスリン抵抗性症候群（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）で構成された群から選択された一つ以上の疾患の予防、治療または改善用であり得る。
【0014】
一実施態様において、前記糖尿合併症は糖尿病網膜症、糖尿病性白内障、糖尿病性腎症、および糖尿病性神経障害で構成された群から選択された一つ以上の疾患であり得る。
【0015】
一実施態様において、前記インスリン抵抗性症候群はインスリン抵抗性による肥満、高血圧、動脈硬化、高脂血症、高インスリン血症、非アルコール性脂肪肝、および２型糖尿病で構成された群から選択された一つ以上の疾患であり得る。
【0016】
一実施態様において、前記エゾオヤマリンドウ抽出物はエゾオヤマリンドウ全草抽出物、根抽出物、葉抽出物、花抽出物または茎抽出物であり得、好ましくはエゾオヤマリンドウ全草抽出物またはエゾオヤマリンドウ根抽出物であり得る。
【0017】
一実施態様において、前記エゾオヤマリンドウ抽出物はｉｔｉｈ１（Ｉｎｔｅｒ－ａｌｐｈａ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ １）ｍＲＮＡまたはＩＴＩＨ１蛋白質の発現を減少させるものであり得る。
【0018】
一実施態様において、前記エゾオヤマリンドウ抽出物はｏｇｔ（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ｍＲＮＡの発現を減少させるものであり得る。
【0019】
一実施態様において、前記抽出物は水、Ｃ1～Ｃ6のアルコール、およびこれらの混合溶媒からなる群から選択される溶媒で抽出されたものであり得、メタノール抽出物であり得る。
【0020】
一実施態様において、前記抽出物はエゾオヤマリンドウ重量対比１０倍数のメタノール水溶液で抽出したものであり得るが、これに限定されない。
【0021】
一実施態様において、前記抽出物は４０～５０℃で超音波抽出したものであり得るが、これに限定されない。
【発明の効果】
【0022】
本発明に係るエゾオヤマリンドウ抽出物を含む組成物は、ＩＴＩＨ１の発現を減少させることによってインスリン敏感性を改善させる効果を有する。したがって、本発明の組成物は糖尿病、糖尿合併症、耐糖能異常およびインスリン抵抗性症候群（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）等の治療剤として有用に使われ得る。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】エゾオヤマリンドウ抽出物の細胞毒性を示す。
【図2】高濃度ブドウ糖条件でｉｔｉｈ１ ｍＲＮＡ発現増加を示す。
【図3】エゾオヤマリンドウ抽出物を処理した時ｉｔｉｈ１ ｍＲＮＡ発現抑制効果を示す。
【図4】エゾオヤマリンドウ抽出物を処理した時ＩＴＩＨ１蛋白質発現抑制効果を示す。
【図5】高濃度ブドウ糖条件でＭＧＯ処理時ｏｇｔ ｍＲＮＡ発現増加を示す。
【図6】エゾオヤマリンドウ抽出物を処理した時ｏｇｔ ｍＲＮＡ発現抑制効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下、添付した図面を参照して本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できるように、本願の実施態様および実施例を詳細に説明する。しかし、本願は多様な形態で具現され得、ここで説明する実施態様および実施例に限定されない。
【0025】
本願明細書全体において、或る部分が何らかの構成要素を「含む」とする時、これは特に反対の記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく他の構成要素をさらに含み得ることを意味する。
【0026】
本発明はエゾオヤマリンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａ ｔｒｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ）抽出物を含むインスリン敏感性改善用組成物に関する。
【0027】
本発明のエゾオヤマリンドウ抽出物は、エゾオヤマリンドウ全草抽出物、根抽出物、葉抽出物、花抽出物または茎抽出物であり得る。全草は花、根、葉、茎などを有する草のすべてを意味する。
【0028】
前記組成物はＩＴＩＨ１（Ｉｎｔｅｒ－ａｌｐｈａ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ １）の発現を抑制する効能がある。ＩＴＩＨ１は肝細胞で生成されて血液に分泌される蛋白質であり、ブドウ糖の刺激によって細胞内濃度およびその分泌量が増加し、ヒアルロン酸に結合して筋肉および脂肪細胞でインスリン敏感性を低下させる。
【0029】
また、前記組成物はＯＧＴ（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の発現を抑制する。ＯＧＴはＩＴＩＨ１蛋白質のセリン残基にＯ－ＧｌｃＮＡｃｙｌａｔｉｏｎ変形を起こすことによってＩＴＩＨ１の安定性および濃度を増加させる。したがって、本発明の組成物はＩＴＩＨ１およびＯＧＴの発現を減少させることによってインスリン敏感性改善効果を有する。
【0030】
前記インスリン敏感性改善効果は、インスリン感受性（ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）の上昇およびインスリン抵抗性（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の減少を意味する。インスリン感受性はインスリンに対して反応する程度を意味し、インスリン感受性の低下すなわち、インスリン抵抗性はインスリンに対する反応が正常な基準に比べて減少することによって、血糖を下げるインスリンの機能が低下して細胞がブドウ糖を効果的に燃焼させないことを意味する。
【0031】
本発明のエゾオヤマリンドウ抽出物の抽出方法としては、撹はん抽出、濾過法、熱水抽出、浸漬抽出、還流冷却抽出および超音波抽出など、当業界の通常の方法を利用することができる。
【0032】
本発明の薬学組成物は目的とする方法により非経口投与または経口投与することができ、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによりその範囲が多様である。また、前記組成物の治療的に有効な量は投与方法、目的部位、患者の状態により変わり得、人体に使用時投与量は安全性および効率性を共に考慮して適正量で決定されなければならない。
【0033】
本発明の薬学組成物は、それぞれ通常の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、軟質または硬質のカプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、軟膏、クリームなどの皮膚外用剤、座剤、注射剤および滅菌注射溶液などをはじめとして、薬剤学的製剤に適合ないかなる形態であれ、剤形化して使われ得る。
【0034】
前記製剤化のために通常的に使う充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、希釈剤などの賦形剤を追加で含むことができる。例えば、本発明の薬学組成物に含まれ得る賦形剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油などを使うことができるが、これに制限されない。また、単純な賦形剤の他にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使われ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤および座剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われ得る。座剤の基剤としては、ウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トウイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われ得る。
【0035】
本発明の食品組成物は健康機能食品であり得、前記「健康機能食品」は人体に有用な機能性を有する原料や成分を使って製造および加工した食品を意味し、「機能性」は人体の構造および機能に対して栄養素を調節したり生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得る目的で摂取することを意味する。
【0036】
食品組成物はティーバッグ製、浸出茶、健康飲料などの形態である健康機能食品に製造および加工が可能であり、その他パン類、菓子類、アイスクリーム類、麺類などへの加工も可能である。また、前記食品組成物は健康補助食品または食品添加物であり得、「食品添加物」としての適合有無は他の規定がない限り、食品医薬品安全処に承認された食品添加物規準の総則および一般試験法などにより該当品目に関する規格および基準によって判定する。
【0037】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、下記の実施例は単に説明の目的のためのものに過ぎず、本願発明の範囲を限定しようとするものではない。
【実施例】
【0038】
［製造例］
エゾオヤマリンドウ抽出物の製造
韓国植物抽出物行で分譲を受けたエゾオヤマリンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａ ｔｒｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ）全草および根の部位別に乾燥された粉末１００ｇに、９９．９％メタノール１０倍数を加えて４５℃で超音波抽出を進めた。超音波抽出機を１５分間稼動後２時間の間停止する過程を１回と規定して、３日間総３０回進めて抽出液を得た。この抽出液を濾過した後、４５℃で減圧濃縮して粉末を収得して以下の実験を進めた。
エゾオヤマリンドウ抽出物の製造
韓国植物抽出物行で分譲を受けたエゾオヤマリンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａ ｔｒｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ）全草および根の部位別に乾燥された粉末１００ｇに、９９．９％メタノール１０倍数を加えて４５℃で超音波抽出を進めた。超音波抽出機を１５分間稼動後２時間の間停止する過程を１回と規定して、３日間総３０回進めて抽出液を得た。この抽出液を濾過した後、４５℃で減圧濃縮して粉末を収得して以下の実験を進めた。
【0039】
［実施例１］
エゾオヤマリンドウ抽出物の細胞毒性（ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）確認
エゾオヤマリンドウ抽出物の細胞毒性の有無を確認するために、次のようにＭＴＴ分析を進めた。ＨｅｐＧ２細胞を９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに４×１０4ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように分注した後、２４時間の間培養して付着化および安定化を進めた。２４時間培養後、エゾオヤマリンドウ全草、根抽出物の最終抽出濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように培養液に希釈して細胞株に供給し、２４時間の間培養した。２４時間後、培地を除去し、ＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ ｉｎ ＰＢＳ）を１００μｌずつ分注して３７℃、５％条件の二酸化炭素湿潤培養器（ＣＯ2 Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）でＭＴＴが還元されるように３０分間反応させた。各ウェル（ｗｅｌｌ）に生成されたホルマザン結晶（ｆｏｒｍａｚａｎ ｃｒｙｓｔａｌ）をＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）２００μｌで溶解させた。各サンプルを多重モードプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｖａｎｔａａ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を利用して５７０ｎｍで吸光度を測定し、未処理群を陰性対象群（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）として細胞生存率（Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を確認し図１に示した。
エゾオヤマリンドウ抽出物の細胞毒性（ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）確認
エゾオヤマリンドウ抽出物の細胞毒性の有無を確認するために、次のようにＭＴＴ分析を進めた。ＨｅｐＧ２細胞を９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに４×１０4ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように分注した後、２４時間の間培養して付着化および安定化を進めた。２４時間培養後、エゾオヤマリンドウ全草、根抽出物の最終抽出濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように培養液に希釈して細胞株に供給し、２４時間の間培養した。２４時間後、培地を除去し、ＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ ｉｎ ＰＢＳ）を１００μｌずつ分注して３７℃、５％条件の二酸化炭素湿潤培養器（ＣＯ2 Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）でＭＴＴが還元されるように３０分間反応させた。各ウェル（ｗｅｌｌ）に生成されたホルマザン結晶（ｆｏｒｍａｚａｎ ｃｒｙｓｔａｌ）をＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）２００μｌで溶解させた。各サンプルを多重モードプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｖａｎｔａａ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を利用して５７０ｎｍで吸光度を測定し、未処理群を陰性対象群（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）として細胞生存率（Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を確認し図１に示した。
【0040】
図１に示した通り、ＨｅｐＧ２細胞株で細胞毒性を測定した結果、エゾオヤマリンドウ抽出物はいずれも対照群と比較して９０％以上の細胞生存率を示して細胞毒性がないことを確認した。
【0041】
［実施例２］
高濃度ブドウ糖条件でｉｔｉｈ１ ｍＲＮＡの発現増加確認
ＩＴＩＨ１はヒアルロン酸に結合して肝細胞に沈着し、細胞のインスリン敏感性を低下させると知られており、次のようにＩＴＩＨ１抑制効能の評価方法を確認した。
高濃度ブドウ糖条件でｉｔｉｈ１ ｍＲＮＡの発現増加確認
ＩＴＩＨ１はヒアルロン酸に結合して肝細胞に沈着し、細胞のインスリン敏感性を低下させると知られており、次のようにＩＴＩＨ１抑制効能の評価方法を確認した。
【0042】
細胞株または動物から分離した１次細胞を低濃度（５ｍＭ）と高濃度（２５ｍＭ）ブドウ糖が含まれた細胞培養培地にそれぞれ２４時間培養した。この時、高濃度のブドウ糖が含まれた培地でＯ－ＧｌｃＮＡｃ変形（ＣＴＤ １１０．６ ｃｌｏｎｅ）が増加しながら、ＩＴＩＨ１の発現が増加することを確認した。
【0043】
追加で、ＨｅｐＧ２細胞をブドウ糖、果糖、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）、グリオキサール（ＧＯ）、グリセルアルデヒド３－燐酸（Ｇ３Ｐ）、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒドが含まれた細胞培養培地にそれぞれ２４時間培養し、ｉｔｉｈ１ ｍＲＮＡの発現量を測定して図２に示した。
【0044】
図２に示した通り、正常群に比べて高濃度（２５ｍＭ）ブドウ糖が含まれた細胞培養培地で培養した細胞でｉｔｉｈ１ ｍＲＮＡ発現が約１．５倍増加した。したがって、以下では高濃度ブドウ糖培地で生長したＨｅｐＧ２細胞でエゾオヤマリンドウ抽出物の処理によるＩＴＩＨ１の発現をｍＲＮＡおよび蛋白質水準で確認した。
【0045】
［実施例３］
エゾオヤマリンドウ抽出物のｉｔｉｈ１ ｍＲＮＡ発現抑制効果確認
ＨｅｐＧ２細胞にエゾオヤマリンドウ抽出物を処理した後、ｉｔｉｈ１ ｍＲＮＡ発現抑制効果を確認するために、次のようにリアルタイム重合酵素連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ、ｑＰＣＲ）を進めた。
エゾオヤマリンドウ抽出物のｉｔｉｈ１ ｍＲＮＡ発現抑制効果確認
ＨｅｐＧ２細胞にエゾオヤマリンドウ抽出物を処理した後、ｉｔｉｈ１ ｍＲＮＡ発現抑制効果を確認するために、次のようにリアルタイム重合酵素連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ、ｑＰＣＲ）を進めた。
【0046】
高濃度（２５ｍＭ）ブドウ糖が含まれた細胞培養培地で細胞を２４時間培養した後、エゾオヤマリンドウ全草、根抽出物の最終抽出濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように培養液に希釈して細胞株に供給し、２４時間の間培養した。２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳでウォッシング（ｗａｓｈｉｎｇ）を進めた後、スクレーパ（ｓｃｒａｐｅｒ）で付着された細胞をかき出して遠心分離機で収集した。ｍｉＲＮＡ抽出キット（ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を利用して前記細胞から全体ＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒを利用してｃＤＮＡを合成した後、これを鋳型ＤＮＡとして転写体発現水準を確認するために使った。ｉｔｉｈ１ ｍＲＮＡの発現の有無を確認するために、ｉｔｉｈ１－ｑｐｃｒ１およびｉｔｉｈ１－ｑｐｃｒ２のプライマー対を使ったし、基準遺伝子（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ）としてｇａｐｄｈ－ｑｐｃｒ１およびｇａｐｄｈ－ｑｐｃｒ２のプライマー対を使ってそれぞれｑＰＣＲ反応を遂行し、転写体水準で該当遺伝子配列の増幅有無を確認した。各プライマー対の配列を下記の表１に示した。
【0047】
【表1】
【0048】
エゾオヤマリンドウ全草および根抽出物を処理した細胞でのｉｔｉｈ１ ｍＲＮＡ発現量を図３に示した。
【0049】
図３で確認されるように、エゾオヤマリンドウ抽出物を処理した場合のｉｔｉｈ１ ｍＲＮＡ発現は、抽出物を処理しなかった高濃度ブドウ糖条件に比べて顕著に減少したし、高濃度ブドウ糖を処理しなかった正常群と類似する水準に回復することを確認した。
【0050】
［実施例４］
エゾオヤマリンドウ抽出物のＩＴＩＨ１蛋白質発現抑制効果確認
実施例３で確保した細胞を対象にウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を通じてＩＴＩＨ１蛋白質発現の有無を確認した。具体的には、細胞溶解バッファー（ＲＩＰＡ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ－４０、１％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ ＳＤＳ）、１２０ｍＭ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＡＥＢＳＦ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｂｅｓｔａｔｉｎ、Ｅ６４、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、ａｎｄ Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ）、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、β－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ａｎｄ ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ））で細胞を溶解することによって細胞溶解液を確保し、細胞溶解液をサンプルバッファー（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ６．８）、２５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％ ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ、２％ ＳＤＳ、２％ ｍｅｒｃａｐｔｏ ｅｔｈａｎｏｌ）と混ぜて１００℃のヒーティングブロックで１０分間培養した。１３，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離を進めて上清液を収集し、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル（１２％）を作って各サンプルをローディングして１２０Ｖで電気泳動した。ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル内分離された全体蛋白質をＮＣ膜に移した後、ＩＴＩＨ１（ｍａｔｕｒｅｄ ｆｏｒｍ）とβ－ａｃｔｉｎに対する抗体を利用してＩＴＩＨ１蛋白質発現を確認し、その結果を図４に示したし、図４の蛋白質バンドを数値化した結果を下記の表２に示した。
エゾオヤマリンドウ抽出物のＩＴＩＨ１蛋白質発現抑制効果確認
実施例３で確保した細胞を対象にウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を通じてＩＴＩＨ１蛋白質発現の有無を確認した。具体的には、細胞溶解バッファー（ＲＩＰＡ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ－４０、１％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ ＳＤＳ）、１２０ｍＭ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＡＥＢＳＦ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｂｅｓｔａｔｉｎ、Ｅ６４、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、ａｎｄ Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ）、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、β－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ａｎｄ ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ））で細胞を溶解することによって細胞溶解液を確保し、細胞溶解液をサンプルバッファー（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ６．８）、２５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％ ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ、２％ ＳＤＳ、２％ ｍｅｒｃａｐｔｏ ｅｔｈａｎｏｌ）と混ぜて１００℃のヒーティングブロックで１０分間培養した。１３，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離を進めて上清液を収集し、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル（１２％）を作って各サンプルをローディングして１２０Ｖで電気泳動した。ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル内分離された全体蛋白質をＮＣ膜に移した後、ＩＴＩＨ１（ｍａｔｕｒｅｄ ｆｏｒｍ）とβ－ａｃｔｉｎに対する抗体を利用してＩＴＩＨ１蛋白質発現を確認し、その結果を図４に示したし、図４の蛋白質バンドを数値化した結果を下記の表２に示した。
【0051】
【表2】
【0052】
図４および表２に示した通り、高濃度ブドウ糖が含まれた培地でＩＴＩＨ１蛋白質発現が１．５倍以上増加した細胞株に各１、１０μｇ／ｍｌ濃度でエゾオヤマリンドウ根抽出物を処理した場合、いずれもＩＴＩＨ１蛋白質量が顕著に減少したことを確認した。
【0053】
結果として、エゾオヤマリンドウ抽出物は高血糖環境でインスリン敏感性を低下させるＩＴＩＨ１のｍＲＮＡ発現および蛋白質発現をいずれも優秀に抑制することによって、インスリン敏感性改善効果およびインスリン抵抗性関連疾患の治療効果を有することが分かる。
【0054】
［実施例５］
高濃度ブドウ糖条件でｏｇｔ ｍＲＮＡの発現増加確認
高血糖状態でＧ１３（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ－１３）の減少によるＯＧＴ（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の増加はＩＴＩＨ１の安定性を増加させてＩＴＩＨ１の細胞内濃度および分泌量が増加すると知られており、次のようにｏｇｔ ｍＲＮＡ抑制効能の評価方法を確認した。
高濃度ブドウ糖条件でｏｇｔ ｍＲＮＡの発現増加確認
高血糖状態でＧ１３（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ－１３）の減少によるＯＧＴ（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の増加はＩＴＩＨ１の安定性を増加させてＩＴＩＨ１の細胞内濃度および分泌量が増加すると知られており、次のようにｏｇｔ ｍＲＮＡ抑制効能の評価方法を確認した。
【0055】
ＨｅｐＧ２細胞をブドウ糖、果糖、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）、グリオキサール（ＧＯ）、グリセルアルデヒド３－燐酸（Ｇ３Ｐ）、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒドが含まれた細胞培養培地にそれぞれ２４時間培養してｏｇｔ ｍＲＮＡの発現量を測定して図５に示した。
【0056】
図５に示した通り、終末糖化産物の前駆体であって糖尿および糖尿合併症を誘発するものと知られているＭＧＯを処理した場合、ｏｇｔ ｍＲＮＡ発現が対照群に比べて２倍近く増加した。したがって、以下では高濃度ブドウ糖およびＭＧＯ処理条件のＨｅｐＧ２細胞で、エゾオヤマリンドウ抽出物の処理によるｏｇｔ ｍＲＮＡ発現を確認した。
【0057】
［実施例６］
エゾオヤマリンドウ抽出物のｏｇｔ ｍＲＮＡ発現抑制効果確認
ＨｅｐＧ２細胞にエゾオヤマリンドウ抽出物を処理した後、ｏｇｔ ｍＲＮＡ発現抑制効果があるかどうかを確認するために、次のようにリアルタイム重合酵素連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ、ｑＰＣＲ）を進めた。
エゾオヤマリンドウ抽出物のｏｇｔ ｍＲＮＡ発現抑制効果確認
ＨｅｐＧ２細胞にエゾオヤマリンドウ抽出物を処理した後、ｏｇｔ ｍＲＮＡ発現抑制効果があるかどうかを確認するために、次のようにリアルタイム重合酵素連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ、ｑＰＣＲ）を進めた。
【0058】
高濃度（２５ｍＭ）ブドウ糖が含まれた細胞培養培地でＨｅｐＧ２細胞を２４時間培養した後、５００μＭ ＭＧＯを１時間の間誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）させた。処理後、エゾオヤマリンドウ根抽出物の最終抽出濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように培養液に希釈して細胞株に供給し、２４時間の間培養した。２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳでウォッシング（ｗａｓｈｉｎｇ）を進めた後、スクレーパ（ｓｃｒａｐｅｒ）で付着された細胞をかき出して遠心分離機で収集した。ｍｉＲＮＡ抽出キット（ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を利用して前記細胞から全体ＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒを利用してｃＤＮＡを合成した後、これを鋳型ＤＮＡとして転写体発現水準を確認するために使った。ｏｇｔ ｍＲＮＡの発現の有無を確認するためにｏｇｔ－ｑｐｃｒ１およびｏｇｔ－ｑｐｃｒ２のプライマー対を使ったし、基準遺伝子（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ）としてｇａｐｄｈ－ｑｐｃｒ１およびｇａｐｄｈ－ｑｐｃｒ２のプライマー対を使ってそれぞれｑＰＣＲ反応を遂行し、転写体水準で該当遺伝子配列の増幅の有無を確認した。各プライマー対の配列を下記の表３に示した。
【0059】
【表3】
【0060】
エゾオヤマリンドウ根抽出物を処理した細胞でのｏｇｔ ｍＲＮＡ発現量を図６に示した。
【0061】
図６に示した通り、正常群に比べて高濃度ブドウ糖およびＭＧＯ処理群のｏｇｔ ｍＲＮＡ発現が１．４１倍に増加したが、エゾオヤマリンドウ根抽出物を処理した場合にはｏｇｔ ｍＲＮＡ発現が正常群の０．０３倍水準に減少して顕著なＯＧＴ抑制効果を有することを確認した。
【0062】
結果として、エゾオヤマリンドウ抽出物はＩＴＩＨ１を増加させる作用をするＯＧＴを顕著に減少させることによって、インスリン敏感性改善効果およびインスリン抵抗性関連疾患の治療効果を有することが分かる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】