特表 2023-539581 ヘテロポリペプチドの末端異質性を低減するためのシグナルペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-15

(54)【発明の名称】ヘテロポリペプチドの末端異質性を低減するためのシグナルペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230908BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20230908BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230908BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230908BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230908BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230908BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230908BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230908BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20230908BHJP

   C07K 16/26 20060101ALI20230908BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/00 ZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C07K16/28

C07K16/24

C07K16/26

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023512724

(86)(22)【出願日】2021-08-27

(85)【翻訳文提出日】2023-02-21

(86)【国際出願番号】 CN2021114911

(87)【国際公開番号】W WO2022042673

(87)【国際公開日】2022-03-03

(31)【優先権主張番号】202010882873.5

(32)【優先日】2020-08-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202110958128.9

(32)【優先日】2021-08-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516174219

【氏名又は名称】江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司

(71)【出願人】

【識別番号】516174208

【氏名又は名称】上海恒瑞医薬有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ

【住所又は居所原語表記】ＮＯ． ２７９ ＷＥＮＪＩＮＧ ＲＯＡＤ， ＭＩＮＨＡＮＧ ＤＩＳＴＲＩＣＴ， ＳＨＡＮＧＨＡＩ ２００２４５， ＣＨＩＮＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100218268

【弁理士】

【氏名又は名称】及川 健太郎

(72)【発明者】

【氏名】周 松涛

(72)【発明者】

【氏名】劉 洵

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA06

4B064CA08

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ヘテロポリペプチドの末端異質性を低減するためのシグナルペプチドに関する。具体的には、タンパク質発現用のシグナルペプチドに関し、更に、組換えポリペプチド、その調製方法及び組換えポリペプチドを含む組成物に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法であって、
（１）抗体の重鎖及び当該重鎖のＮ末端と効果的に連結する、配列番号５５又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む第１のシグナルペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／又は
（２）抗体の軽鎖及び当該軽鎖のＮ末端と効果的に連結する、配列番号５５又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む第２のシグナルペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む宿主細胞の培養と、
前記抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖の発現と、
を含む、方法。

【請求項2】

発現して得られた前記抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖は、３％未満の末端伸び率を有し、好ましくは、発現して得られた前記抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖は、１％未満の末端伸び率を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１のシグナルペプチド又は前記第２のシグナルペプチドは、それぞれ独立的に配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４６、配列番号１４７又は配列番号１４８のアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記第１のシグナルペプチドは配列番号５７又は配列番号１０５のアミノ酸配列を含み、及び／又は前記第２のシグナルペプチドは配列番号５７又は配列番号１０５のアミノ酸配列を含む、
請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、親和性成熟抗体又は多重特異性抗体である、請求項１～３の何れか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記抗体は、抗ＴＬＲ７抗体、抗ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）抗体、抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体、抗ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）抗体、抗ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ａ３３抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＳＯＳＴ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣｌ抗体、抗Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗トロンビン抗体、抗Ａβ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＩＬ－５抗体、抗ＩＬ－１５抗体、抗ＩＬ－４Ｒ抗体、抗ＩＬ－６Ｒ抗体、抗ＴＩＧＨＴ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗ＣＴＧＦ抗体、抗ＴＳＬＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体及び抗ＦｃＲｎ抗体から選ばれ、
好ましくは、前記抗体は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ、Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ、Ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ、Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ、Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ、Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ、Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ、Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ、Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ、ｃＢＲ９６、Ｇｌｅｍａｔｕｍａｍａｂ、抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体及び抗ＦｃＲｎ抗体から選ばれ、そのうち、前記抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体は、重鎖が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号４７のアミノ酸配列を含み、前記抗ＦｃＲｎ抗体は、重鎖が配列番号１６７のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号１６８のアミノ酸配列を含む、
請求項１～４の何れか一項に記載の方法。

【請求項6】

配列番号５５又は配列番号５６のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含む、ポリペプチド。

【請求項7】

前記ポリペプチドは、前記シグナルペプチドと効果的に連結するヘテロポリペプチドを更に含み、
好ましくは、前記ヘテロポリペプチドは抗体の重鎖又は抗体の軽鎖であり、
より好ましくは、前記シグナルペプチドは、抗体の重鎖又は抗体の軽鎖のＮ末端と効果的に連結する、
請求項６に記載のポリペプチド。

【請求項8】

前記シグナルペプチドは配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４６、配列番号１４７又は配列番号１４８のアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記シグナルペプチドは、配列番号５７又は配列番号１０５のアミノ酸配列を含む、
請求項６又は７に記載のポリペプチド。

【請求項9】

前記ポリペプチドは、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１７１及び配列番号１７２からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項６～８の何れか一項に記載のポリペプチド。

【請求項10】

請求項６～９の何れか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。

【請求項11】

請求項１０に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。

【請求項12】

前記宿主細胞は真核宿主細胞であり、好ましくは、前記真核宿主細胞はＣＨＯ細胞又は酵母である、請求項１１に記載の宿主細胞。

【請求項13】

重鎖が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体を含む組成物であって、当該組成物中の抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体は末端異質性を有し、且つ前記抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖及び／又は軽鎖は３％未満の末端伸び率を有し、
好ましくは、前記抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖は１％未満の末端伸び率を有する、
組成物。

【請求項14】

重鎖が配列番号１６７のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号１６８のアミノ酸配列を含む抗ＦｃＲｎ抗体を含む組成物であって、当該組成物中の抗ＦｃＲｎ抗体は末端異質性を有し、且つ前記抗ＦｃＲｎ抗体の重鎖及び／又は軽鎖は３％未満の末端伸び率を有し、
好ましくは、前記抗ＦｃＲｎ抗体の重鎖は１％未満の末端伸び率を有する、
組成物。

【請求項15】

請求項１～３の何れか一項に記載の方法により調製されて得られた、請求項１３又は１４に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、分子生物学とタンパク質工学分野に関し、具体的には、ヘテロポリペプチドの末端異質性を低減する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ここでの記載は、必ずしも従来技術を構成するものではなく、本開示に関連する背景情報のみを提供している。

【0003】

シグナルペプチドは、新たに合成されたタンパク質の分泌経路への移転を誘導する短いペプチド鎖である。シグナルペプチドは、分泌タンパク質のＮ末端にある。一般的に１５個～３０個のアミノ酸からなる。通常、３つの領域、即ち、塩基性アミノ末端と呼ばれる正電付きのＮ末端と、中性アミノ酸を主にして、１本のαヘリックス構造を形成することができ、シグナルペプチドの主要機能領域である中間疎水性配列と、低分子アミノ酸を含み、シグナル配列切断部位であり、加工領域とも呼ばれる負電荷付きの長いＣ末端とを含む。シグナルペプチド配列が合成された後、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）に認識され、タンパク質の合成が中止又は減速され、シグナル認識粒子によりリボソームが小胞体に持ち込まれ、タンパク質の合成が改めて開始する。シグナルペプチドの誘導下で、新たに合成されたタンパク質は小胞体内腔に入り込むが、シグナルペプチド配列はシグナルペプチダーゼの作用下で切除される。

【0004】

通常、シグナルペプチドの高効率な切断により、抗体の軽・重鎖のポリペプチドが何れも正確に切断されることを確保することができ、これは、哺乳動物細胞により仲介される抗体発現に非常に重要である。しかし、シグナルペプチドの切断中に、切断部位は変化することで、組換え抗体の軽・重アミノ酸鎖の延長又は截断を引き起こす可能性がある。截断又は延長された抗体は、その構造の変化によってその親和性が変わることで、抗体の活性に影響を及ぼすので、抗体の産生中にアミノ酸鎖の延長又は截断の発生を回避しなければならない。更に、一部の生成物の截断又は延長によって、産生中にそれぞれのロットの製品に差異が発生され、追加の品質検査が必要となり、また、プロセスでは、このような問題の解決が困難である。従って、Ｎ末端同質性を有する軽・重鎖抗体の産生は、現在、産業界における普遍的な共通認識である。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、ヘテロポリペプチドの末端異質性を低減するためのシグナルペプチド及びその用途に関する。

【0006】

本開示は、抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法を提供し、それは、
（１）抗体の重鎖及び当該重鎖のＮ末端と効果的に連結する、配列番号５５又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む第１のシグナルペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／又は
（２）抗体の軽鎖及び当該軽鎖のＮ末端と効果的に連結する、配列番号５５又は配列番号５６のアミノ酸配列を含む第２のシグナルペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む宿主細胞の培養と、
上記抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖の発現と、
を含み、
そのうち、配列番号５５はＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＸ_１ＨＸ_２で示され、そのうち、Ｘ_１はＶ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｌ又はＩであり、Ｘ_２はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｃ、Ｔ又はＱであり、
配列番号５６はＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＸ_３ＲＸ_４で示され、そのうち、Ｘ_３はＶ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｌ又はＩであり、Ｘ_４はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｃ、Ｔ又はＱであり、且つＸ_３がＡから選ばれる時に、Ｘ_４はＣではない。

【0007】

幾つかの実施形態では、上記のような抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法において、発現して得られた上記抗体の重鎖は、３％、２．５％、２％、１．５％又は１％未満の末端伸び率を有し、及び／又は抗体の軽鎖は、３％、２．５％、２％、１．５％又は１％未満の末端伸び率を有し、幾つかの実施形態では、発現して得られた上記抗体の重鎖は１％未満の末端伸び率を有し、及び／又は抗体の軽鎖は１％未満の末端伸び率を有する。幾つかの実施形態では、当該末端伸び率は、ペプチドマッピング検出法により測定されて算出される。幾つかの実施形態では、発現して得られた上記抗体重鎖は末端残基が基本的に残っておらず、及び／又は抗体の軽鎖は末端残基が基本的に残っておらず、幾つかの実施形態では、発現して得られた上記抗体の重鎖は０％の末端伸び率を有し、及び／又は抗体の軽鎖は０％の末端伸び率を有する。

【0008】

幾つかの実施形態では、上記のような抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法において、上記第１のシグナルペプチド又は第２のシグナルペプチドは、それぞれ独立的に、
配列番号５７：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＡ；
配列番号５８：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＧ；
配列番号５９：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＳ；
配列番号６０：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＣ；
配列番号６１：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＴ；
配列番号６２：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＱ；
配列番号６３：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＡＨＡ；
配列番号６４：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＡＨＧ；
配列番号６５：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＡＨＳ；
配列番号６６：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＡＨＣ；
配列番号６７：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＡＨＴ；
配列番号６８：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＡＨＱ；
配列番号６９：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＳＨＡ；
配列番号７０：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＳＨＧ；
配列番号７１：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＳＨＳ；
配列番号７２：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＳＨＣ；
配列番号７３：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＳＨＴ；
配列番号７４：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＳＨＱ；
配列番号７５：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＴＨＡ；
配列番号７６：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＴＨＧ；
配列番号７７：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＴＨＳ；
配列番号７８：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＴＨＣ；
配列番号７９：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＴＨＴ；
配列番号８０：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＴＨＱ；
配列番号８１：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＧＨＡ；
配列番号８２：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＧＨＧ；
配列番号８３：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＧＨＳ；
配列番号８４：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＧＨＣ；
配列番号８５：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＧＨＴ；
配列番号８６：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＧＨＱ；
配列番号８７：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＣＨＡ；
配列番号８８：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＣＨＧ；
配列番号８９：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＣＨＳ；
配列番号９０：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＣＨＣ；
配列番号９１：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＣＨＴ；
配列番号９２：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＣＨＱ；
配列番号９３：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＬＨＡ；
配列番号９４：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＬＨＧ；
配列番号９５：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＬＨＳ；
配列番号９６：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＬＨＣ；
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配列番号９８：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＬＨＱ；
配列番号９９：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＩＨＡ；
配列番号１００：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＩＨＧ；
配列番号１０１：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＩＨＳ；
配列番号１０２：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＩＨＣ；
配列番号１０３：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＩＨＴ；
配列番号１０４：ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＩＨＱ；
配列番号１０５：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＶＲＡ；
配列番号１０６：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＶＲＧ；
配列番号１０７：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＶＲＳ；
配列番号１０８：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＶＲＣ；
配列番号１０９：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＶＲＴ；
配列番号１１０：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＶＲＱ；
配列番号１１１：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＡ；
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配列番号１１３：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＳ；
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配列番号１２０：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＳＲＴ；
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配列番号１３１：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＧＲＣ；
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配列番号１３３：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＧＲＱ；
配列番号１３４：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＣＲＡ；
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配列番号１３６：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＣＲＳ；
配列番号１３７：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＣＲＣ；
配列番号１３８：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＣＲＴ；
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配列番号１４０：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＬＲＡ；
配列番号１４１：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＬＲＧ；
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配列番号１４４：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＬＲＴ；
配列番号１４５：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＬＲＱ；
配列番号１４６：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＩＲＡ；
配列番号１４７：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＩＲＧ；
配列番号１４８：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＩＲＳ；
配列番号１４９：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＩＲＣ；
配列番号１５０：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＩＲＴ、及び
配列番号１５１：ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＩＲＱ
から選ばれるペプチドを含む。

【0009】

幾つかの実施形態では、上記のような抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法において、上記第１のシグナルペプチド又は第２のシグナルペプチドは、それぞれ独立的に配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４６、配列番号１４７又は配列番号１４８のアミノ酸配列を含む。

【0010】

幾つかの実施形態では、上記のような抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法において、第１のシグナルペプチドは配列番号５７又は配列番号１０５のアミノ酸配列を含み、及び／又は第２のシグナルペプチドは配列番号５７又は配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。

【0011】

幾つかの実施形態では、上記のような抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法において、第１のシグナルペプチドは配列番号５７のアミノ酸配列を含み、及び／又は第２のシグナルペプチドは配列番号５７のアミノ酸配列を含む。

【0012】

幾つかの実施形態では、上記のような抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法において、第１のシグナルペプチドは配列番号５７のアミノ酸配列を含み、及び／又は第２のシグナルペプチドは配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。

【0013】

幾つかの実施形態では、上記のような抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法において、第１のシグナルペプチドは配列番号１０５のアミノ酸配列を含み、及び／又は第２のシグナルペプチドは配列番号５７のアミノ酸配列を含む。

【0014】

幾つかの実施形態では、上記のような抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法において、第１のシグナルペプチドは配列番号１０５のアミノ酸配列を含み、及び／又は第２のシグナルペプチドは配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。

【0015】

幾つかの実施形態では、上記のような抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法において、上記第１のポリヌクレオチド又は第２のポリヌクレオチドは、それぞれ独立的にポリペプチドをコードし、上記ポリペプチドは配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１７１と配列番号１７２から選ばれるアミノ酸配列を含む。

【0016】

幾つかの実施形態では、上記のような抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法において、上記宿主細胞は真核宿主細胞であり、幾つかの実施形態では、上記真核宿主細胞はＣＨＯ細胞又は酵母である。

【0017】

幾つかの実施形態では、上記のような抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法において、上記抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、親和性成熟抗体又は多重特異性抗体である。

【0018】

幾つかの実施形態では、上記のような抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法において、上記抗体は抗ＴＬＲ７抗体、抗ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）抗体、抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体、抗ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）抗体、抗ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ａ３３抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＳＯＳＴ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣｌ抗体、抗Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗トロンビン抗体、抗Ａβ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＩＬ－５抗体、抗ＩＬ－１５抗体、抗ＩＬ－４Ｒ抗体、抗ＩＬ－６Ｒ抗体、抗ＴＩＧＨＴ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗ＣＴＧＦ抗体、抗ＴＳＬＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体と抗ＦｃＲｎ抗体から選ばれる。

【0019】

幾つかの実施形態では、上記のような抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法において、上記抗体はＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ、Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ、Ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ、Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ、Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ、Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ、Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ、Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ、Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ、ｃＢＲ９６、Ｇｌｅｍａｔｕｍａｍａｂ、抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体と抗ＦｃＲｎ抗体から選ばれ、そのうち、上記抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体は、重鎖が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号４７のアミノ酸配列を含み、上記抗ＦｃＲｎ抗体は、重鎖が配列番号１６７のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号１６８のアミノ酸配列を含む。

【0020】

幾つかの実施形態では、上記のような抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法であって、上記方法は、軽鎖プラスミドを重鎖プラスミドにクローニングして全長抗体プラスミドを構築することを含む。幾つかの実施形態では、上記方法は、エレクトロポレーションによりプラスミドを宿主細胞に導入する。

【0021】

本開示は、配列番号５５又は配列番号５６のアミノ酸配列を含み、或いはそれらで構成されるシグナルペプチドを更に提供する。幾つかの実施形態では、上記ポリペプチドはシグナルペプチドであり、そのアミノ酸配列は配列番号５５から配列番号１５１の何れか１つで示される。

【0022】

配列番号５５又は配列番号５６のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドを含むポリペプチドである。

【0023】

幾つかの実施形態では、上記のようなポリペプチドにおいて、上記ポリペプチドは、上記シグナルペプチドと効果的に連結するヘテロポリペプチドを更に含み、幾つかの実施形態では、上記ヘテロポリペプチドは抗体の重鎖又は抗体の軽鎖であり、幾つかの実施形態では、上記シグナルペプチドは、抗体の重鎖又は抗体の軽鎖のＮ末端と効果的に連結する。

【0024】

幾つかの実施形態では、上記のようなポリペプチドにおいて、上記シグナルペプチドは、配列番号５７から配列番号１５１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。

【0025】

幾つかの実施形態では、上記のようなポリペプチドにおいて、上記シグナルペプチドは、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４６、配列番号１４７又は配列番号１４８のアミノ酸配列を含む。

【0026】

幾つかの実施形態では、上記のようなポリペプチドにおいて、上記シグナルペプチドは、配列番号５７と配列番号１０５で示されるアミノ酸配列から選ばれるものを含む。

【0027】

幾つかの実施形態では、上記のようなポリペプチドにおいて、ポリペプチドは、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１と配列番号１７２からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。

【0028】

本開示は、上記の何れか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子を更に提供する。

【0029】

本開示は、上記のような核酸分子を含む宿主細胞を更に提供する。

【0030】

幾つかの実施形態では、上記のような宿主細胞において、上記宿主細胞は真核宿主細胞であり、幾つかの実施形態では、上記真核宿主細胞はＣＨＯ細胞又は酵母である。

【0031】

本開示は、３％、２．５％、２％、１．５％又は１％未満の末端伸び率を有するヘテロポリペプチドを含む組成物を更に提供し、幾つかの実施形態では、発現して得られた上記ヘテロポリペプチドは１％未満の末端伸び率を有し、幾つかの実施形態では、発現して得られた上記ヘテロポリペプチドは１％未満の末端伸び率を有し、且つ当該末端伸び率は、ペプチドマッピング検出法により測定されて算出され、幾つかの実施形態では、発現して得られた上記ヘテロポリペプチドは、末端残基が基本的に残っておらず、幾つかの実施形態では、発現して得られた上記ヘテロポリペプチドは０％の末端伸び率を有する。

【0032】

幾つかの実施形態では、上記のような組成物において、上記ヘテロポリペプチドは抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖であり、幾つかの実施形態では、上記抗体は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体と抗ＦｃＲｎ抗体から選ばれ、そのうち、上記抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体は、重鎖が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号４７のアミノ酸配列を含む。

【0033】

幾つかの実施形態では、上記抗体は抗ＦｃＲｎ抗体から選ばれ、そのうち、上記抗ＦｃＲｎ抗体は、重鎖が配列番号１６７のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号１６８のアミノ酸配列を含む。

【0034】

幾つかの実施形態では、上記のような抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖のＮ末端異質性を低減する方法において、発現して得られた上記抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖は、３％、２．５％、２％、１．５％又は１％未満の末端伸び率を有し、幾つかの実施形態では、発現して得られた上記抗体重鎖及び／又は抗体の軽鎖は１％未満の末端伸び率を有し、幾つかの実施形態では、発現して得られた上記抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖は１％未満の末端伸び率を有し、且つ当該末端伸び率はペプチドマッピング検出法により測定されて算出され、幾つかの実施形態では、発現して得られた上記抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖は、末端残基が基本的に残っておらず、幾つかの実施形態では、発現して得られた上記抗体の重鎖及び／又は抗体の軽鎖は、０％の末端伸び率を有する。

【0035】

幾つかの実施形態では、上記のような組成物は、上記の何れか一項に記載の方法により調製されて得られる。

【0036】

本開示により提供されるシグナルペプチドは、ヘテロポリペプチドの末端異質性を安定して低減する効果を有し、ヘテロポリペプチドの大規模発現に適用される。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】細胞レベルにおいて、ヒト化抗体のヒトＣｌａｕｄｉｎ１８．２との結合のＦＡＣＳ検出結果である。

【図2】ヒト化抗体のＮＵＧＣ４細胞エンドサイトーシス実験である。

【図3A】異なるＣｌａｕｄｉｎ１８．２発現程度のＮＵＧＣ４細胞における、抗体のＡＤＣＣ効果検出であり、図３Ａは、抗体の野生型ＮＵＧＣ４細胞（Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２低発現）におけるＡＤＣＣ効果検出であり、図３Ｂは、抗体のＣｌａｕｄｉｎ１８．２中等度発現ＮＵＧＣ４細胞におけるＡＤＣＣ効果検出であり、図３Ｃは、抗体のＣｌａｕｄｉｎ１８．２高発現ＮＵＧＣ４細胞におけるＡＤＣＣ効果検出である。

【図3B】異なるＣｌａｕｄｉｎ１８．２発現程度のＮＵＧＣ４細胞における、抗体のＡＤＣＣ効果検出であり、図３Ａは、抗体の野生型ＮＵＧＣ４細胞（Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２低発現）におけるＡＤＣＣ効果検出であり、図３Ｂは、抗体のＣｌａｕｄｉｎ１８．２中等度発現ＮＵＧＣ４細胞におけるＡＤＣＣ効果検出であり、図３Ｃは、抗体のＣｌａｕｄｉｎ１８．２高発現ＮＵＧＣ４細胞におけるＡＤＣＣ効果検出である。

【図3C】異なるＣｌａｕｄｉｎ１８．２発現程度のＮＵＧＣ４細胞における、抗体のＡＤＣＣ効果検出であり、図３Ａは、抗体の野生型ＮＵＧＣ４細胞（Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２低発現）におけるＡＤＣＣ効果検出であり、図３Ｂは、抗体のＣｌａｕｄｉｎ１８．２中等度発現ＮＵＧＣ４細胞におけるＡＤＣＣ効果検出であり、図３Ｃは、抗体のＣｌａｕｄｉｎ１８．２高発現ＮＵＧＣ４細胞におけるＡＤＣＣ効果検出である。

【図4A】図４ＡはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図４ＢはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－３抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図４ＣはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図４ＤはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－３抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【図4B】図４ＡはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図４ＢはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－３抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図４ＣはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図４ＤはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－３抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【図4C】図４ＡはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図４ＢはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－３抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図４ＣはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図４ＤはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－３抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【図4D】図４ＡはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図４ＢはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－３抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図４ＣはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図４ＤはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－３抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【図5A】図５ＡはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－２抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図５ＢはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－４抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図５ＣはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－２抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図５ＤはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－４抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【図5B】図５ＡはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－２抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図５ＢはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－４抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図５ＣはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－２抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図５ＤはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－４抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【図5C】図５ＡはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－２抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図５ＢはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－４抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図５ＣはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－２抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図５ＤはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－４抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【図5D】図５ＡはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－２抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図５ＢはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－４抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図５ＣはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－２抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図５ＤはＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－４抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【図6A】図６Ａはｈ１９０２－５－１抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図６Ｂはｈ１９０２－５－２抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図６Ｃはｈ１９０２－５－１抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図６Ｄはｈ１９０２－５－２抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【図6B】図６Ａはｈ１９０２－５－１抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図６Ｂはｈ１９０２－５－２抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図６Ｃはｈ１９０２－５－１抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図６Ｄはｈ１９０２－５－２抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【図6C】図６Ａはｈ１９０２－５－１抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図６Ｂはｈ１９０２－５－２抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図６Ｃはｈ１９０２－５－１抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図６Ｄはｈ１９０２－５－２抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【図6D】図６Ａはｈ１９０２－５－１抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図６Ｂはｈ１９０２－５－２抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図６Ｃはｈ１９０２－５－１抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図６Ｄはｈ１９０２－５－２抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【図7A】図７ＡはＦｃＲｎ－１抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図７ＢはＦｃＲｎ－２抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図７ＣはＦｃＲｎ－１抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図７ＤはＦｃＲｎ－２抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【図7B】図７ＡはＦｃＲｎ－１抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図７ＢはＦｃＲｎ－２抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図７ＣはＦｃＲｎ－１抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図７ＤはＦｃＲｎ－２抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【図7C】図７ＡはＦｃＲｎ－１抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図７ＢはＦｃＲｎ－２抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図７ＣはＦｃＲｎ－１抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図７ＤはＦｃＲｎ－２抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【図7D】図７ＡはＦｃＲｎ－１抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図７ＢはＦｃＲｎ－２抗体軽鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図７ＣはＦｃＲｎ－１抗体重鎖鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図であり、図７ＤはＦｃＲｎ－２抗体重鎖の脱グリコシル化還元分子量マススペクトル図である。

【発明を実施するための形態】

【0038】

発明の詳細
用語
本開示が更に容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を具体的に定義する。本明細書で別途明示的に定義されていない限り、本明細書に使用される他の技術・科学用語の全ては、当業者に通常理解されている意味を持っている。

【0039】

本開示に用いられるアミノ酸の３文字コードと１文字コードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）に記載された通りである。

【0040】

本開示に記載される「抗体」は、本明細書において最も広い意味で使用されており、且つ異なる抗体構造を含み、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）と抗体断片を含むが、これらに限定されず、それらが所望の抗原結合活性と特異性を示せばよい。

【0041】

「抗体断片」という用語は、完全抗体とは異なる分子を指し、完全抗体と特異的に結合する抗原と特異的に結合する、完全抗体の一部を含む。抗体断片の実例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、二重抗体、線形抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖやｓｃＦａｂ）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。

【0042】

本開示に記載される「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合してなる抗体であり、マウス抗体により誘発される免疫応答反応を低減することができる。

【0043】

本開示に記載される「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、マウスのＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域フレームワーク、即ち、異なる種類のヒト生殖細胞系の抗体フレームワーク配列に移植して産生された抗体を指す。キメラ抗体が大量のマウスタンパク質成分を持つことにより誘導された異種反応性を克服することができる。免疫原性の低下と共に引き起こされる活性の低下を回避するために、上記ヒト抗体可変領域フレームワーク配列に対して最も少ない逆変異又は復帰変異を行うことにより、活性を保ったり、向上させたりすることができる。本開示のヒト化抗体は、更に酵母菌で提示される、ＣＤＲに対して親和性成熟変異を行ったヒト化抗体も含む。

【0044】

本開示における「ヒト抗体（ＨｕＭＡｂ）」、「ヒト抗体」、「全ヒト抗体」、「完全ヒト抗体」は、互いに交換して使用されてもよく、そのアミノ酸配列は、ヒト又はヒト細胞から産生された抗体のアミノ酸配列に対応し、又は、ヒト抗体ライブラリーや他のヒト抗体で配列がコードされた非ヒト由来のアミノ酸配列から誘導される。当該ヒト抗体についての定義には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が明確に除外されている。

【0045】

本開示に記載される「抗体断片」は、完全抗体とは異なる分子を指し、完全抗体と特異的に結合する抗原と特異的に結合する、完全抗体の一部を含む。抗体断片の実例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、二重抗体、線形抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖやｓｃＦａｂ）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。本開示に係る「抗体」は、「完全抗体」及びその「結合断片」を含む。それに応じて、本開示に記載される抗体の重鎖又は抗体の軽鎖は、完全な重鎖又は完全な軽鎖を含み、抗体断片中の重鎖断片又は軽鎖断片も含む。

【0046】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」という用語は、相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を除く可変領域残基を指す。可変領域のＦＲは、一般的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４という４つのＦＲ領域から構成される。従って、ＣＤＲ及びＦＲ配列は、一般的に以下の順にＶＨ（又はＶＬ）に現れる：
ＦＲ１－ＨＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）－ＦＲ２－ＨＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）－ＦＲ３－ＨＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）－ＦＲ４。

【0047】

「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」又は「超可変領域」という用語は、抗体の可変ドメインにおいて抗原結合を促進する主な６つの超可変領域の１つを指す。通常、それぞれの重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）があり、それぞれの軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）がある。「Ｋａｂａｔ」番号付け規則（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤを参照）、「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付け規則（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．、（１９９７）ＪＭＢ ２７３：９２７－９４８を参照）及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番号付け規則（Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ、７、１３２－１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７、５５－７７（２００３）を参照）などを含む種々の公知方法の何れか１つによって、ＣＤＲのアミノ酸配列境界を決定することができる。例えば、典型的な書式では、Ｋａｂａｔ規則によれば、上記重鎖可変領域（ＶＨ）におけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）で、軽鎖可変領域（ＶＬ）におけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）である。Ｃｈｏｔｈｉａ規則によれば、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸の番号は２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）で、ＶＬにおけるアミノ酸残基の番号は２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）及び９１～９６（ＬＣＤＲ３）である。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方を組み合わせたＣＤＲ定義によって、ＣＤＲは、ヒトＶＨにおけるアミノ酸残基である２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）と９５～１０２（ＨＣＤＲ３）及びヒトＶＬにおけるアミノ酸残基である２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）と８９～９７（ＬＣＤＲ３）から構成される。ＩＭＧＴ規則によれば、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は大体、２６～３５（ＣＤＲ１）、５１～５７（ＣＤＲ２）及び９３～１０２（ＣＤＲ３）で、ＶＬにおけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は大体、２７～３２（ＣＤＲ１）、５０～５２（ＣＤＲ２）及び８９～９７（ＣＤＲ３）である。ＩＭＧＴ規則によれば、抗体のＣＤＲ領域は、プログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎによって決定することができる。特に説明のない限り、本開示の実施例に係る抗体可変領域及びＣＤＲ配列は何れも、「Ｋａｂａｔ」番号付け規則に適用する。

【0048】

「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合」及び「特異的に結合」という用語は、予め決定された抗原上のエピトープへの抗体の結合を指す。通常、抗体は、約１０^－８ Ｍ未満、例えば、約１０^－９ Ｍ、１０^－１０ Ｍ、１０^－１１ Ｍ、１０^－１２ Ｍ未満又はそれ以下の親和性（ＫＤ）で結合される。

【0049】

「ＫＤ」という用語は、特定の抗体－抗原が互いに作用する解離平衡定数を指す。通常、本開示の抗体は、約１０^－７ Ｍ未満、例えば、約１０^－８ Ｍ又は１０^－９ Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）で抗原に結合し、例えば、本開示において、抗体の細胞表面抗原との親和性は、ＦＡＣＳ法によりＫＤ値が測定される。

【0050】

本開示における互いに交換して使用可能な「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、任意の長さのヌクレオチドポリマーを指し、且つＤＮＡとＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はその類似体であってもよく、或いはＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼによって、又は合成反応によってポリマーに組み込める任意の基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びその類似体などの修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーへの組み込みの前後に行うことができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分で中断することができる。
本開示に記載される「効果的に連結」は２種又は複数種の成分の並列を指し、そのうち、上記成分は、その所望の方式で機能することが許容される関係にある。例えば、プロモーターのシス作用によって連結した配列の転写を制御又は調節する場合、それは、コード配列と効果的に連結する。必ずしもそうではないが、通常、「効果的に連結する」ＤＮＡ配列は隣接のものであり、且つ２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある時、又は分泌リーダー配列の場合には、隣接すると共にオープンリーディングフレームに当てはまるものである。しかし、効果的に連結するプロモーターは、通常、コード配列の上流にあるが、必ずしもそれに隣接するわけではない。効果的に連結するエンハンサーは、コード配列の上流、コード配列内又はコード配列の下流にあり、且つプロモーターからかなり離れていてもよい。本分野で知られている組換え方法により連結が実現され、例えば、ＰＣＲ方法を利用し、アニールにより、又は便利な制限部位で連結する。便利な制限部位がないと、通常の実施のように、合成したオリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを利用する。本開示において、シグナルペプチドとヘテロポリペプチドの連結方式の一つは、直接的連結である。

【0051】

本開示に記載される「宿主細胞」は、遺伝的変化が行われた、又は外因性ポリヌクレオチド（例えば、組換えプラスミド又はベクター）を導入することで遺伝的変化を行うことができる細胞を指す。このような用語は、具体的な個々の細胞だけでなく、その細胞の子孫も指すことを意図すると理解すべきである。連続的な世代において突然変異又は環境影響による幾つかの修飾を発生する可能性があるため、このような子孫は実質的に親細胞と異なり得るが、依然として本開示に使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。宿主細胞は微生物（例えば、真核微生物）又は動物細胞であってもよく、好適な微生物は出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含み、好適な動物宿主細胞系はＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）、２９３細胞とＮＳ０細胞を含む。

【0052】

本開示に記載される「ポリペプチド」は、任意の細胞に由来する、約１０個以上のアミノ酸を有するペプチドとタンパク質を総括して指す。「ヘテロ」ポリペプチドは、利用される宿主細胞にとってそれらの外来ポリペプチドであり、例えば、宿主細胞により産生されたヒトタンパク質である。ヘテロポリペプチドは、原核又は真核のものであってもよく、例えば、哺乳動物又はヒトのものである。ヘテロポリペプチドは、組換えて産生されたポリペプチド又は組換えポリペプチドであってもよい。

【0053】

例示的なヘテロポリペプチドは、膜貫通分子（例えば、受容体型チロシンキナーゼなどの受容体）又は成長因子などのリガンドを含む。示例性ヘテロポリペプチドは、例えば、以下の分子を含む：レニン、ヒト成長ホルモンとウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、α１－抗トリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体化ホルモン、グルカゴン様ペプチド、因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子（ＴＦ）とｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｓ因子などの血液凝固因子、タンパク質Ｃなどの抗血液凝固因子、心房性ナトリウム利尿ペプチド、肺表面活性剤、ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織プラスミノゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）などのプラスミノゲン活性化物質、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、腫瘍壊死因子－αと－β、ネプリライシン、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－α）、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ抑制物質、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、β－ラクタマーゼなどの微生物タンパク質、デオキシリボヌクレアーゼ、ＩｇＥ、ＣＴＬＡ－４などの細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、インヒビン、活性化タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ホルモン又は成長因子の受容体、タンパク質Ａ又はＤ、リウマチ因子、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経栄養タンパク質－３、－４、－５又は－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５又はＮＴ－６）、又はＮＧＦβなどの神経成長因子などの神経栄養因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ａＦＧＦとｂＦＧＦなどの線維芽細胞成長因子、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ－α及びＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４やＴＧＦ－β５を含むＴＧＦ－βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子－Ｉと－ＩＩ（ＩＧＦ－ＩとＩＧＦ－ＩＩ）、ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０とＣＤ４０などのＣＤタンパク質、エリトロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン－α、－βと－γなどのインターフェロン、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦとＧ－ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＩＬ－１～ＩＬ－１０などのインターロイキン（ＩＬ）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ－細胞受容体、表面膜タンパク質、分解促進因子、ＡＩＤＳエンベロープの部分などのウィルス抗原、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４とＶＣＡＭなどのイテグリン、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３やＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連抗原、及び何れかの上記ポリペプチドの断片。

【0054】

ヘテロポリペプチドは抗体であってもよく、例示的に、上記抗体の標的は、Ａ３３、ＢＭＰＩ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦＩＯ）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ－ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦＩ（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡＩ、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＢＩ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷＩ、ＦＥＬＩ、ＦＥＬＩ（ＥＰＳＥＬＯＮ）、ＦＥＬＩ（ＺＥＴＡ）、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ－ｂ）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ－ａ）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦＩＯ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１Ｉ（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬＩＲ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬＩＯＲＡ、ＩＬＩＯＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦＩ、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、ＴＨＰＯ、ＣＣＬＩ（Ｉ－３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－ｌａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－ｌｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）、ＣＣＬＨ（ｅｏｔａｘｉｎ）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ－ｌｄ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＤＰ－３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３ａ）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／ｅｘｏｄｕｓ－２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－Ｉ）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－Ｉ）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／ｅｏｔａｘｉｎ－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（ｅｏｔａｘｉｎ－３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ １０）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）、ＳＣＹＥＩ、ＸＣＬＩ（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－ｌｂ）、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲ１（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲＩ／ＣＫＲ－ＬＩ）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）、ＣＣＲＬＩ（ＶＳＨＫＩ）、ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）、ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲＩ）、ＣＭＫＬＲＩ、ＣＭＫＯＲＩ（ＲＤＣＩ）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲＩＯ）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒａ）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒｂ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰＩＯ、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣＩＯ（ＣＩＯ）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＤＦＩＡ、ＤＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭＩ、ＴＲＥＭ２、ＶＨＬ、ＡＢＣＦＩ、ＡＣＶＲＩ、ＡＣＶＲＩＢ、ＡＣＶＲ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲＬＩ、ＡＤ０ＲＡ２Ａ、Ａｇｇｒｅｃａｎ、ＡＧＲ２、ＡＩＣＤＡ、ＡＩＦＩ、ＡＩＧＩ、ＡＫＡＰＩ、ＡＫＡＰ２、ＡＭＨ、ＡＭＨＲ２、ＡＮＧＰＴＩ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＰＥＰ、ＡＰＣ、ＡＰＯＣＩ、ＡＲ、ＡＺＧＰＩ（亜鉛－ａ－糖タンパク質）、Ａβ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７Ｈ３、ＢＡＤ、ＢＡＦＦ（ＢＬｙｓ）、ＢＡＧＩ、ＢＡＨ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＤＮＦ、ＢＬＮＫ、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＢＭＰＩ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦＩＯ）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＢＭＰＲＩＡ、ＢＭＰＲＩＢ、ＢＭＰＲ２、ＢＰＡＧＩ（プレクチン）、ＢＲＣＡＩ、Ｃ１９ｏｒｆｌＯ（ＩＬ２７ｗ）、Ｃ３、Ｃ４Ａ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＡＮＴＩ、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ４、ＣＡＶＩ、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＬＩ（１－３０９）、ＣＣＬＩＩ（ｅｏｔａｘｉｎ）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１５（ＭｌＰ－ｌｄ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ－３ｂ）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＭＣＡＦ、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３ａ）、ＣＣＬ２１（ＭＴＰ－２）、ＳＬＣ、ｅｘｏｄｕｓ－２、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－Ｉ）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／ｅｏｔａｘｉｎ－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（ｅｏｔａｘｉｎ－３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３（ＭＴＰ－ｌａ）、ＣＣＬ４（ＭＤＰ－ｌｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）、ＣＣＮＡＩ、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＤＩ、ＣＣＮＥＩ、ＣＣＮＥ２、ＣＣＲＩ（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲＩ／ＣＫＲ－ＬＩ）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）、ＣＣＲＬＩ（ＶＳＨＫＩ）、ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）、ＣＤ１６４、ＣＤ１９、ＣＤ１０５、ＣＤＩＣ、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤＨＩ（Ｅ－カドヘリン）、ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１３、ＣＤＨ１８、ＣＤＨ１９、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＨ７、ＣＤＨ８、ＣＤＨ９、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ９、ＣＤＫＮＩＡ（ｐ２１Ｗａｐｌ／Ｃｉｐｌ）、ＣＤＫＮＩＢ（ｐ２７Ｋｉｐｌ）、ＣＤＫＮＩＣ、ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６ＩＮＫ４ａ）、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫＮ３、ＣＥＡ、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＲＩ、ＣＨＧＡ、ＣＨＧＢ、キチナーゼ、ＣＨＳＴ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ７、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＬＮ３、ＣＬＵ（クラステリン）、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＭＫＬＲＩ、ＣＭＫＯＲＩ（ＲＤＣＩ）、ＣＮＲＩ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＬＩＡＩ、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＲ２、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲＰ、ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ４、ＣＴＮＮＢＩ（ｂ－カテニン）、ＣＴＳＢ（組織プロテアーゼＢ）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）、ＣＸＣＬＩＩ（ｌ－ＴＡＣ／ＩＰ－９）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８／ＬＩＸ）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＣＹＢ５、ＣＹＣＩ、ＣＹＳＬＴＲＩ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＥＳ、ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１ １８、ＤＮＣＬＩ、ＤＰＰ４、Ｅ２Ｆ１、ＥＣＧＦＩ、ＥＤＧＩ、ＥＦＮＡＩ、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＬＡＣ２、ＥＮＧ、ＥＮ０１、ＥＮ０２、ＥＮ０３、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ－２）、ＥＲＢＢ３（Ｈｅｒ－３）、ＥＲＢＢ４（Ｈｅｒ－４）、ＥＲＥＧ、ＥＲＫ８、ＥＳＲＩ、ＥＳＲ２、Ｆ３（ＴＦ）、ＦＡＤＤ、ＦａｓＬ、ＦＡＳＮ、ＦＣＥＲＩＡ、ＦＣＥＲ２、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＧＦ、ＦＧＦＩ（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦＲ３、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＦＥＬＩ（ＥＰＳＩＬＯＮ）、ＦＩＬＩ（ＺＥＴＡ）、ＦＬＪ１２５８４、ＦＬＪ２５５３０、ＦＬＲＴＩ（フィブロネクチン）、ＦＬＴＩ、ＦＯＳ、ＦＯＳＬＩ（ＦＲＡ－Ｉ）、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、Ｇ２５０、ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）、ＧＡＧＥＢＩ、ＧＡＧＥＣＩ、ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ－６ＳＴ、ＧＡＴ Ａ３、ＧＤＦ５、ＧＦＩ １、ＧＧＴ１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＮＡＳＩ、ＧＮＲＨＩ、ＧＰＲ２（ＣＣＲＩＯ）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ４４、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＧＲＣＣＩＯ（ＣＩＯ）、ＧＲＰ、ＧＰＮＭＢ、ＧＳＮ（ビリン）、ＧＳＴＰＩ、ＨＡＶＣＲ２、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ＨＧＦ、ＨＩＦＩＡ、ＨＤＰＩ、ヒスタミンとヒスタミン受容体、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＭ７４、ＨＭＯＸＩ、ＨＵＭＣＹＴ２Ａ、ＩＣＥＢＥＲＧ、ＩＣＯＳＬ、ＩＤ２、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮＡＩ、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮγ、ＤＦＮＷＩ、ＩＧＢＰＩ、ＩＧＦＩ、ＩＧＦＩＲ、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＩＬ－Ｉ、ＩＬ１０、ＭＯＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ－１２、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ１９、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬＩＦ１０、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９
、ＩＬ１ＨＹＩ、ＩＬ１Ｒｌ、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬＩＲＮ、ＩＬ２、ＩＬ２０、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３、ＩＬ３０、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）、ＥＬ７、ＥＬ７Ｒ、ＥＬ８、ＥｐｈＡ２、ＩＬ８ＲＡ、ＤＬ８ＲＢ、ＩＬ８ＲＢ、ＤＬ９、ＤＬ９Ｒ、ＤＬＫ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＲＡＫＩ、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ＥＲＡＫ２、ＩＴＧＡＩ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６（ａ６イテグリン）、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４（ｂ４イテグリン）、ＪＡＧＩ、ＪＡＫＩ、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、Ｋ６ＨＦ、ＫＡＮ、ＫＤＲ、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＦ５（ＧＣ Ｂｏｘ ＢＰ）、ＫＬＦ６、ＫＬＫＩＯ、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ１５、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ９、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１９（角タンパク質１９）、ＫＲＴ２Ａ、ＫＨＴＨＢ６（毛髪特異性Ｈ型ケラチン）、ＬＡＧ３、ＬＡＭＡＳ、ＬＥＰ（レプチン）、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｌｉｎｇｏ－ｐ７５、Ｌｉｎｇｏ－Ｔｒｏｙ、ＬＰＳ、ＬＴＡ（ＴＮＦ－ｂ）、ＬＴＢ、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＴＢＲ、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＧ又はＯ ｍｇｐ、ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ－Ｊｕｎ）、ＭＤＫ、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＩＢＩ、ＭＵＣｌ、ミッドカイン、ＭＥＦ、ＭＩＰ－２、ＭＫＩ６７、（Ｋｉ－６７）、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＭＢ、ＭＴ３（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｃｔｉｎ－ｌｌｌ）、ＭＴＳＳＩ、ＭＵＣＩ（ムコタンパク質）、ＭＹＣ、ＭＹＤ８８、ＮＣＫ２、ｎｅｕｒｏｃａｎ、ＮＦＫＢＩ、ＮＦＫＢ２、ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮｇＲ－Ｌｉｎｇｏ、ＮｇＲ－Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）、ＮｇＲ－ｐ７５、ＮｇＲ－Ｔｒｏｙ、ＮＭＥＩ（ＮＭ２３Ａ）、Ｎ０Ｘ５、ＮＰＰＢ、ＮＲＯＢＩ、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲＩＤＩ、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ１Ｉ３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲＰＩ、ＮＲＰ２、ＮＴ５Ｅ、ＮＴＮ４、ＯＤＺＩ、ＯＰＲＤＩ、Ｐ２ＲＸ７、ＰＡＰ、ＰＡＲＴＩ、ＰＡＴＥ、ＰＡＷＲ、ＰＣＡ３、ＰＣＮＡ、ＰＣＳＫ９、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＥＣＡＭＩ、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＧＦ、ＰＧＲ、ｐｈｏｓｐｈａｃａｎ、ＰＩＡＳ２、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）、ＰＬＧ、ＰＬＸＤＣＩ、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＰＰＩＤ、ＰＲＩ、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＤＩ、ＰＲＬ、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＫ２、ＰＳＡＰ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＡＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ－２）、ＰＴＮ、ＲＡＣ２（ｐ２１Ｒａｃ２）、ＲＡＲＢ、ＲＧＳＩ、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ３、ＲＮＦＩＩＯ（ＺＮＦ１４４）、ＲＯＢ０２、Ｓ１００Ａ２、ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）、ＳＣＧＢ２Ａ１（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ２）、ＳＣＧＢ２Ａ２（ｍａｍｎｎａｇｌｏｂｉｎ １）、ＳＣＹＥＩ（内皮単球活性化サイトカイン）、ＳＤＦ２、ＳＥＲＰＩＮＡＩ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）、ＳＥＲＰＩＮＥＩ（ＰＡＩ－Ｉ）、ＳＥＲＰＤＭＦ１、ＳＨＢＧ、ＳＬＡ２、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ３３Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＩＴ２、ＳＯＳＴ、ＳＰＰＩ、ＳＰＲＲＩＢ（Ｓｐｒｌ）、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴＡＢＩ、ＳＴＡＴ６、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ２、ＴＢ４Ｒ２、ＴＢＸ２１、ＴＣＰＩＯ、ＴＤＧＦＩ、ＴＥＫ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＩＩＩ、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨＩＬ、ＴＨＢＳＩ（トロンボスポンジン－１）、ＴＨＢＳ２、ＴＨＢＳ４、ＴＨＰＯ、ＴＩＥ（Ｔｉｅ－１）、ＴＩＧＨＴ、Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ、ＴＭＰ３、組織因子、ＴＬＲＩＯ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＮＦ、ＴＮＦ－ａ、ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４）、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦＩＩＡ、ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＮＦＲＳＦＩＢ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦＩＯ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦＩ １（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ＢＢリガンド）、ＴＯＬＬＩＰ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）、ＴＰ５３、ＴＰＭＩ、ＴＰＭ２、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦＩ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＴＲＥＭＩ、ＴＲＥＭ２、ＴＲＰＣ６、ＴＳＬＰ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＲ、バーシカン、ＶＨＬ Ｃ５、ＶＬＡ－４、ＸＣＬＩ（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－ｌｂ）、ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲＩ）、ＹＹＩ、ＺＦＰＭ２とトロンビンを含むが、これらに限定されない。

【0055】

例示的に、抗体は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ、Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ、Ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ、Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ、Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ、Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ、Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ、Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ、Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ、ｃＢＲ９６、Ｇｌｅｍａｔｕｍａｍａｂと抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体から選ばれ、そのうち、上記抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体は、重鎖が配列番号４９で示され、軽鎖が配列番号４７で示される。

【0056】

「保存的修飾」又は「保存的置換又は置換」は、類似の特徴（例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性／親水性、主鎖の立体配座と剛性など）を有する他のアミノ酸でタンパク質中のアミノ酸を置換することで、タンパク質の生物学的活性を変えずに頻繁に変化可能にすることを意味する。当業者に知られているように、一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は、基本的に生物学的活性を変えない（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、第２２４頁、（４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照）。また、構造又は機能が類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性が低い。例示的な保存的置換は、以下のように記載される。

【0057】

【表1】

【0058】

本開示に記載される「末端伸び率」は、発現生成物集団における、末端延長配列を有する発現生成物の占める割合を指す。末端延長配列を有する発現生成物は、目標発現生成物の変異体であり、所望の目標配列を有する以外、更に他のアミノ酸残基に連結している。例示的に、抗体軽鎖発現生成物には、１％の軽鎖配列変異体のＮ末端が、更に他のアミノ酸残基に連結している場合、当該発現生成物の末端伸び率が１％である。発現生成物集団に末端延長配列を有する発現生成物が含まれると、当該発現生成物集団は末端異質性を有することが示される。例示的に、本開示中の末端延長配列は、シグナルペプチドアミノ酸の残留に由来する。

【0059】

本開示中の組成物は、所望の目標発現生成物及び末端延長配列を有する発現生成物を含む。組成物におけるアミノ末端延長の存在は、種々の分析技術によって検出可能であり、当該分析技術は、Ｎ－末端配列分析、電荷異質性の測定法（例えば、カチオン交換クロマトグラフィー又はキャピラリゾーン電気泳動）、マススペクトル、ペプチドマッピング検出などを含むが、これらに限定されない。組成物における抗体変異体の量は、一般的に、変異体を検出するための何れかの測定法（例えば、カチオン交換分析）の検出下限を構成する量から、主な種類の抗体量よりも少ない量までの範囲内にある。組成物中の約３％又はそれ以下（例えば約３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％、０％）の抗体軽鎖又は抗体重鎖は、アミノ末端延長を含む。このようなパーセント量は、マススペクトル、ペプチドマッピング検出法により測定することができる。サンプルにおいて末端延長を含むヘテロポリペプチドの割合が全量の１％を超える場合、ペプチドマッピング検出法によりそれを効果的に同定すると共に、還元分子量マススペクトル検出ピーク図における対応するピークを定量的に標識することができる。

【0060】

上記の明細書には、本開示の１つ又は複数の実施形態の詳細が提出されている。本開示は、本明細書の記載と類似又は同様の任意の方法と材料により実施又は試験することができるが、以下、その方法と材料を説明する。明細書と特許請求の範囲により、本開示の他の特徴、目的及び利点は明らかになる。明細書と特許請求の範囲において、文脈で特に明記のない限り、単数形は複数の指示対象のことを含む。特に定義しない限り、本明細書に用いられる技術・科学用語の全ては、本開示の属する分野の当業者により理解されている一般的な意味を持っている。明細書に引用される特許と出版物の全ては、引用により組み込まれている。以下の実施例は、本開示の選択可能な実施形態を更に全面的に説明するために提出される。これらの実施例は、何れかの方式で、本開示の範囲を限定するものと理解すべきではなく、本開示の範囲は、特許請求の範囲により限定される。

【実施例】

【0061】

以下、実施例と合わせて本開示を更に説明するが、これらの実施例は、本開示の範囲を制限するものではない。本開示の実施例において具体的な条件が明記されていない実験方法は、一般的に、例えば冷泉港の抗体技術実験マニュアル、分子クローニングマニュアルなどの通常の条件、又は原料や商品のメーカーにより推薦された条件に従う。具体的な供給源が明示されていない試薬は、市販される通常の試薬である。

【0062】

実施例１：抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の調製
実施例１－１：Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を高発現する細胞株の構築
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａ ｍｉｎｅ ３０００トランスフェクション試薬により、ｐＣＤＨ－ｈＣｌａｕｄｉｎ１８．２レンチウイルス発現ベクタープラスミドとｐＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＭＶ－ｄＲ８．９１レンチウイルス系パッケージングベクターを、ウィルスパッケージング細胞２９３Ｔにトランスフェクションし、ウィルスを含有する培地上清を収集し、ろ過して超高速で遠心分離し、濃縮されたウィルスでヒト胃印環細胞がん細胞株ＮＵＧＣ４を感染させ、ピューロマイシンで２週間～３週間選別してから、ＦＡＣＳシングルセルソーティングを行った。

【0063】

腫瘍ＩＨＣ評価点数に基づき、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現レベルを区別した。腫瘍ＩＨＣ評価点数が３点である腫瘍Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現レベルに相当する細胞は、高発現細胞であり、腫瘍ＩＨＣ評価点数が２点である腫瘍Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現レベルに相当する細胞は、中等度発現細胞である。ＦＡＣＳによりレンチウイルスに感染したＮＵＧＣ４細胞表面のＣｌａｕｄｉｎ１８．２発現を検出することによって、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現量が高いＮＵＧＣ４／ｈＣｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル細胞株を選び出した。同時に、ＦＡＣＳにより野生型ＮＵＧＣ４細胞表面のＣｌａｕｄｉｎ１８．２発現を検出することによって、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現量が中等度であるＮＵＧＣ４クローナル細胞株を選び出し、野生型ＮＵＧＣ４は、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現量が低い細胞である。

【0064】

選び出したモノクローナル細胞株を拡大培養し、冷蔵庫に凍結保存して後続の実験に備えた。

【0065】

Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２ 配列Ｇｅｎｂａｎｋ：ＮＰ＿００１００２０２６：（配列番号１）
ＭＡＶＴＡＣＱＧＬＧＦＶＶＳＬＩＧＩＡＧＩＩＡＡＴＣＭＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＧＹＦＴＬＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲＡＬＭＩＶＧＩＶＬＧＡＩＧＬＬＶＳＩＦＡＬＫＣＩＲＩＧＳＭＥＤＳＡＫＡＮＭＴＬＴＳＧＩＭＦＩＶＳＧＬＣＡＩＡＧＶＳＶＦＡＮＭＬＶＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＴＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦＧＡＡＬＦＶＧＷＶＡＧＧＬＴＬＩＧＧＶＭＭＣＩＡＣＲＧＬＡＰＥＥＴＮＹＫＡＶＳＹＨＡＳＧＨＳＶＡＹＫＰＧＧＦＫＡＳＴＧＦＧＳＮＴＫＮＫＫＩＹＤＧＧＡＲＴＥＤＥＶＱＳＹＰＳＫＨＤＹＶ。

【0066】

Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２ ＤＮＡ配列：（配列番号２）
１ ＡＧＡＡＴＴＧＣＧＣ ＴＧＴＣＣＡＣＴＴＧ ＴＣＧＴＧＴＧＧＣＴ ＣＴＧＴＧＴＣＧＡＣ ＡＣＴＧＴＧＣＧＣＣ ＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧ
６１ ＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧ ＴＣＡＧＧＧＣＴＴＧ ＧＧＧＴＴＣＧＴＧＧ ＴＴＴＣＡＣＴＧＡＴ ＴＧＧＧＡＴＴＧＣＧ ＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧ
１２１ ＣＴＧＣＣＡＣＣＴＧ ＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧ ＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣ ＡＡＧＡＣＴＴＧＴＡ ＣＡＡＣＡＡＣＣＣＣ ＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧ
１８１ ＴＴＴＴＣＡＡＣＴＡ ＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧ ＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴ ＧＴＧＴＣＣＧＡＧＡ ＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣ ＴＴＣＡＣＣＧＡＧＴ
２４１ ＧＣＣＧＧＧＧＣＴＡ ＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧ ＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣ ＣＡＧＣＣＡＴＧＣＴ ＧＣＡＧＧＣＡＧＴＧ ＣＧＡＧＣＣＣＴＧＡ
３０１ ＴＧＡＴＣＧＴＡＧＧ ＣＡＴＣＧＴＣＣＴＧ ＧＧＴＧＣＣＡＴＴＧ ＧＣＣＴＣＣＴＧＧＴ ＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴ ＧＣＣＣＴＧＡＡＡＴ
３６１ ＧＣＡＴＣＣＧＣＡＴ ＴＧＧＣＡＧＣＡＴＧ ＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧ ＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡ ＣＡＴＧＡＣＡＣＴＧ ＡＣＣＴＣＣＧＧＧＡ
４２１ ＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴ ＴＧＴＣＴＣＡＧＧＴ ＣＴＴＴＧＴＧＣＡＡ ＴＴＧＣＴＧＧＡＧＴ ＧＴＣＴＧＴＧＴＴＴ ＧＣＣＡＡＣＡＴＧＣ
４８１ ＴＧＧＴＧＡＣＴＡＡ ＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧ ＴＣＣＡＣＡＧＣＴＡ ＡＣＡＴＧＴＡＣＡＣ ＣＧＧＣＡＴＧＧＧＴ ＧＧＧＡＴＧＧＴＧＣ
５４１ ＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡ ＧＡＣＣＡＧＧＴＡＣ ＡＣＡＴＴＴＧＧＴＧ ＣＧＧＣＴＣＴＧＴＴ ＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧ ＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧ
６０１ ＧＣＣＴＣＡＣＡＣＴ ＡＡＴＴＧＧＧＧＧＴ ＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴ ＧＣＡＴＣＧＣＣＴＧ ＣＣＧＧＧＧＣＣＴＧ ＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧ
６６１ ＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡ ＣＡＡＡＧＣＣＧＴＴ ＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧ ＣＣＴＣＡＧＧＣＣＡ ＣＡＧＴＧＴＴＧＣＣ ＴＡＣＡＡＧＣＣＴＧ
７２１ ＧＡＧＧＣＴＴＣＡＡ ＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴ ＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴ ＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡ ＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧ ＡＴＡＴＡＣＧＡＴＧ
７８１ ＧＡＧＧＴＧＣＣＣＧ ＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣ ＧＡＧＧＴＡＣＡＡＴ ＣＴＴＡＴＣＣＴＴＣ ＣＡＡＧＣＡＣＧＡＣ ＴＡＴＧＴＧＴＡＡＴ
８４１ ＧＣＴＣＴＡＡＧＡＣ ＣＴＣＴＣＡＧＣＡＣ ＧＧＧＣＧＧＡＡＧＡ ＡＡＣＴＣＣＣＧＧＡ ＧＡＧＣＴＣＡＣＣＣ ＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧ
９０１ ＧＡＧＡＴＣＣＣＡＴ ＣＴＡＧＡＴＴＴＣＴ ＴＣＴＴＧＣＴＴＴＴ ＧＡＣＴＣＡＣＡＧＣ ＴＧＧＡＡＧＴＴＡＧ ＡＡＡＡＧＣＣＴＣＧ
９６１ ＡＴＴＴＣＡＴＣＴＴ ＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣ ＡＡＡＴＧＧＴＣＴＴ ＡＧＣＣＴＣＡＧＴＣ ＴＣＴＧＴＣＴＣＴＡ ＡＡＴＡＴＴＣＣＡＣ
１０２１ ＣＡＴＡＡＡＡＣＡＧ ＣＴＧＡＧＴＴＡＴＴ ＴＡＴＧＡＡＴＴＡＧ ＡＧＧＣＴＡＴＡＧＣ ＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣ ＡＡＴＣＣＴＣＴＡＴ
１０８１ ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴ ＡＡＡＴＡＴＡＡＣＴ ＴＴＣＴＡＣＴＣＴＧ ＡＴＧＡＧＡＧＡＡＴ ＧＴＧＧＴＴＴＴＡＡ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ
１１４１ ＡＣＡＴＴＴＴＧＡＴ ＧＡＴＴＴＡＧＡＣＡ ＧＡＣＴＣＣＣＣＣＴ ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡ ＧＴＣＡＡＴＡＡＡＣ ＣＣＡＴＴＧＡＴＧＡ
１２０１ ＴＣＴＡＴＴＴＣＣＣ ＡＧＣＴＴＡＴＣＣＣ ＣＡＡＧＡＡＡＡＣＴ ＴＴＴＧＡＡＡＧＧＡ ＡＡＧＡＧＴＡＧＡＣ ＣＣＡＡＡＧＡＴＧＴ
１２６１ ＴＡＴＴＴＴＣＴＧＣ ＴＧＴＴＴＧＡＡＴＴ ＴＴＧＴＣＴＣＣＣＣ ＡＣＣＣＣＣＡＡＣＴ ＴＧＧＣＴＡＧＴＡＡ ＴＡＡＡＣＡＣＴＴＡ
１３２１ ＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡ ＡＧＣＡＡＴＡＡＧＡ ＧＡＡＡＧＡＴＡＴＴ ＴＧＴＡＡＴＣＴＣＴ ＣＣＡＧＣＣＣＡＴＧ ＡＴＣＴＣＧＧＴＴＴ
１３８１ ＴＣＴＴＡＣＡＣＴＧ ＴＧＡＴＣＴＴＡＡＡ ＡＧＴＴＡＣＣＡＡＡ ＣＣＡＡＡＧＴＣＡＴ ＴＴＴＣＡＧＴＴＴＧ ＡＧＧＣＡＡＣＣＡＡ
１４４１ ＡＣＣＴＴＴＣＴＡＣ ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣ ＡＴＣＴＴＣＴＴＡＴ ＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡ ＣＣＡＴＴＣＴＡＧＧ ＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡ
１５０１ ＧＣＴＣＴＣＣＡＣＴ ＧＧＡＧＴＣＣＴＣＴ ＴＴＣＴＧＴＣＧＣＧ ＧＧＴＣＡＧＡＡＡＴ ＴＧＴＣＣＣＴＡＧＡ ＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡ
１５６１ ＡＡＴＴＡＴＴＴＴＴ ＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡ ＧＴＣＣＴＡＡＡＴＡ ＴＡＧＴＴＡＡＡＡＴ ＡＡＡＴＡＡＴＧＴＴ ＴＴＡＧＴＡＡＡＡＴ
１６２１ ＧＡＴＡＣＡＣＴＡＴ ＣＴＣＴＧＴＧＡＡＡ ＴＡＧＣＣＴＣＡＣＣ ＣＣＴＡＣＡＴＧＴＧ ＧＡＴＡＧＡＡＧＧＡ ＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡ
１６８１ ＴＡＡＴＴＧＣＴＴＴ ＧＡＣＡＴＴＧＴＣＴ ＡＴＡＴＧＧＴＡＣＴ ＴＴＧＴＡＡＡＧＴＣ ＡＴＧＣＴＴＡＡＧＴ ＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡ
１７４１ ＴＧＡＡＡＡＧＣＴＣ ＡＣＴＧＡＴＣＣＴＡ ＡＴＴＣＴＴＴＣＣＣ ＴＴＴＧＡＧＧＴＣＴ ＣＴＡＴＧＧＣＴＣＴ ＧＡＴＴＧＴＡＣＡＴ
１８０１ ＧＡＴＡＧＴＡＡＧＴ ＧＴＡＡＧＣＣＡＴＧ ＴＡＡＡＡＡＧＴＡＡ ＡＴＡＡＴＧＴＣＴＧ ＧＧＣＡＣＡＧＴＧＧ ＣＴＣＡＣＧＣＣＴＧ
１８６１ ＴＡＡＴＣＣＴＡＧＣ ＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧ ＧＣＴＧＡＧＧＡＧＧ ＡＡＧＧＡＴＣＡＣＴ ＴＧＡＧＣＣＣＡＧＡ ＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣ
１９２１ ＴＡＧＣＣＴＧＧＧＣ ＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡ ＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴ ＣＴＡＣＡＡＡＡＴＡ ＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡ ＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡ
１９８１ ＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧ ＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧ ＴＡＧＴＣＣＣＡＧＣ ＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧ ＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧ ＧＡＧＧＡＴＣＡＣＴ
２０４１ ＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧ ＧＡＧＧＴＴＧＧＧＧ ＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧ ＣＣＡＴＧＡＴＣＡＣ ＡＣＣＡＣＴＧＣＡＣ ＴＣＣＡＧＣＣＡＧＧ
２１０１ ＴＧＡＣＡＴＡＧＣＧ ＡＧＡＴＣＣＴＧＴＣ ＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡ ＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴ ＡＡＴＧＧＡＡＣＡＣ ＡＧＣＡＡＧＴＣＣＴ
２１６１ ＡＧＧＡＡＧＴＡＧＧ ＴＴＡＡＡＡＣＴＡＡ ＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＧＴＴＧＡＧＣＣＴＧ ＡＡＴＴＡＡＡＴＧＴ
２２２１ ＡＡＴＧＴＴＴＣＣＡ ＡＧＴＧＡＣＡＧＧＴ ＡＴＣＣＡＣＡＴＴＴ ＧＣＡＴＧＧＴＴＡＣ ＡＡＧＣＣＡＣＴＧＣ ＣＡＧＴＴＡＧＣＡＧ
２２８１ ＴＡＧＣＡＣＴＴＴＣ ＣＴＧＧＣＡＣＴＧＴ ＧＧＴＣＧＧＴＴＴＴ ＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴ ＧＣＴＴＴＧＴＴＴＡ ＧＡＧＡＣＧＧＧＧＴ
２３４１ ＣＴＣＡＣＴＴＴＣＣ ＡＧＧＣＴＧＧＣＣＴ ＣＡＡＡＣＴＣＣＴＧ ＣＡＣＴＣＡＡＧＣＡ ＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣ ＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣ
２４０１ ＣＡＡＧＴＡＧＣＴＧ ＧＡＡＴＴＡＣＡＧＧ ＴＧＴＧＣＧＣＣＡＴ ＣＡＣＡＡＣＴＡＧＣ ＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧ ＴＴＴＴＧＴＴＡＣＴ
２４６１ ＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧ ＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣ ＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣ ＴＡＧＡＧＴＧＧＴＴ ＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧ ＡＴＧＴＴＴＧＧＧＣ
２５２１ ＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡ ＧＣＴＣＴＴＴＧＣＡ ＡＣＣＡＣＡＣＡＣＣ ＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣ ＴＴＡＣＡＴＣＡＣＴ ＧＣＣＣＴＴＴＴＧＡ
２５８１ ＧＣＡＧＡＡＡＧＴＣ ＴＡＡＡＴＴＣＣＴＴ ＣＣＡＡＧＡＣＡＧＴ ＡＧＡＡＴＴＣＣＡＴ ＣＣＣＡＧＴＡＣＣＡ ＡＡＧＣＣＡＧＡＴＡ
２６４１ ＧＧＣＣＣＣＣＴＡＧ ＧＡＡＡＣＴＧＡＧＧ ＴＡＡＧＡＧＣＡＧＴ ＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣ ＴＡＣＣＣＡＣＡＧＣ ＡＧＣＡＴＴＧＧＴＧ
２７０１ ＣＡＧＧＧＧＡＡＣＴ ＴＧＧＣＣＡＴＴＡＧ ＧＴＴＡＴＴＡＴＴＴ ＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧ ＴＣＣＴＣＡＣＡＴＣ ＡＡＴＡＧＴＡＣＡＴ
２７６１ ＡＴＧＡＡＡＧＴＧＡ ＣＣＴＣＣＡＡＧＧＧ ＧＡＴＴＧＧＴＧＡＡ ＴＡＣＴＣＡＴＡＡＧ ＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧ ＣＴＧＡＡＣＡＧＡＣ
２８２１ ＴＡＴＧＴＣＴＧＧＧ ＧＡＡＡＧＡＡＣＧＧ ＡＴＴＡＴＧＣＣＣＣ ＡＴＴＡＡＡＴＡＡＣ ＡＡＧＴＴＧＴＧＴＴ ＣＡＡＧＡＧＴＣＡＧ
２８８１ ＡＧＣＡＧＴＧＡＧＣ ＴＣＡＧＡＧＧＣＣＣ ＴＴＣＴＣＡＣＴＧＡ ＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡ ＴＴＴＡＡＡＣＣＡＡ ＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡ
２９４１ ＧＴＡＴＴＴＧＴＧＧ ＡＡＣＴＣＡＣＴＧＣ ＣＴＣＡＧＴＴＴＧＧ ＧＴＡＡＡＧＧＡＴＧ ＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧ ＴＣＡＡＣＴＡＡＡＧ
３００１ ＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡ ＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧ ＡＧＧＧＴＴＧＡＧＣ ＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣ ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧ ＴＴＡＡＧＴＧＣＴＣ
３０６１ ＴＣＴＧＧＡＴＴＴＧ ＡＧＴＴＧＡＡＧＡＧ ＣＡＴＣＣＡＴＴＴＧ ＡＧＴＴＧＡＡＧＧＣ ＣＡＣＡＧＧＧＣＡＣ ＡＡＴＧＡＧＣＴＣＴ
３１２１ ＣＣＣＴＴＣＴＡＣＣ ＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴ ＣＣＣＴＧＧＴＣＡＧ ＧＴＣＴＣＡＧＧＴＡ ＧＴＧＣＧＧＴＧＴＧ ＧＣＴＣＡＧＣＴＧＧ
３１８１ ＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴ ＡＧＣＧＣＡＴＴＣＴ ＣＴＡＴＣＣＡＡＣＡ ＴＴＴＡＡＴＴＧＴＴ ＴＧＡＡＡＧＣＣＴＣ ＣＡＴＡＴＡＧＴＴＡ
３２４１ ＧＡＴＴＧＴＧＣＴＴ ＴＧＴＡＡＴＴＴＴＧ ＴＴＧＴＴＧＴＴＧＣ ＴＣＴＡＴＣＴＴＡＴ ＴＧＴＡＴＡＴＧＣＡ ＴＴＧＡＧＴＡＴＴＡ
３３０１ ＡＣＣＴＧＡＡＴＧＴ ＴＴＴＧＴＴＡＣＴＴ ＡＡＡＴＡＴＴＡＡＡ ＡＡＣＡＣＴＧＴＴＡ ＴＣＣＴＡＣＡＧＴＴ

【0067】

実施例１－２：抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体の産生
１ 免疫
マウスを免疫することにより抗ヒトＣｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体を産生した。

【0068】

実験用ＳＪＬ白いマウスは、雌で、６週齢～８週齢（北京維通利華実験動物技術有限公司、動物生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（京）２０１２－０００１）であった。飼育環境：ＳＰＦグレード。マウスを購入した後、実験室環境で１週間飼育し、１２／１２時間の明／暗周期で調節し、温度が２０℃～２５℃、湿度が４０％～６０％であった。環境に馴れたマウスは、以下の方案で免疫された。免疫抗原は、ｈｕＣｌａｕｄｉｎ１８．２－ＨＥＫ２９３細胞（ヒトＣｌａｕｄｉｎ１８．２プラスミドをトランスフェクションしたＨＥＫ－２９３安定トランスフェクション細胞株）であった。

【0069】

免疫方案：細胞を初回免疫する前に、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標） Ｇｏｌｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ Ｎｏ． Ｔ２６８４）を０．１ ｍＬ／匹でマウスの腹膜内（ＩＰ）に注射し、３０分間後に、各マウスの腹膜内（ＩＰ）に、０．１ ｍＬの生理食塩水で１×１０^８／ｍＬの濃度に希釈した細胞液を注射した。細胞を均一に吹き散らした後、０日目、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目に接種した。２１日目、３５日目、４９日目、６３日目に採血し、ＥＬＩＳＡ方法でマウス血清中の抗体価を確定した。４回目～５回目の免疫後に、血清中の抗体価が高くて安定する傾向があるマウスを選択して脾細胞の融合を行った。脾細胞融合の３日前に追加免疫を行い、腹膜内（ＩＰ）に１×１０^７の細胞を注射した。

【0070】

２ 脾細胞の融合
ＰＥＧ媒介性の融合工程により、脾リンパ球と骨髄腫細胞Ｓｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－８２８７（商標））を融合してハイブリドーマ細胞を得た。ハイブリドーマ細胞は、０．５×１０^６／ｍＬ～１×１０^６／ｍＬの密度で、完全培地（２０％のＦＢＳ、１×ＨＡＴ、１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）で再懸濁し、１００ μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％のＣＯ_２で３日間～４日間インキュベートした後、ＨＡＴ完全培地を１００ μＬ／ウェルで補充し、クローンが形成されるまで３日間～４日間培養し続けた。上清を除去し、２００ μＬ／ウェルのＨＴ完全培地（２０％のＦＢＳ、１×ＨＴ、１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）を加え、３７℃、５％のＣＯ_２で３日間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡ検出を行った。

【0071】

３ ハイブリドーマ細胞の選別
ハイブリドーマ細胞の成長密度によって、結合ＥＬＩＳＡ方法で培養上清を検出した。ｈｕＣｌａｕｄｉｎ１８．２－ＨＥＫ２９３細胞との結合能力が強いと共にＨＥＫ２９３細胞との結合がない細胞を選択し、適時に増幅して凍結保存し、単細胞クローンが得られるまで２回～３回サブクローニングした。

【0072】

細胞をサブクローニングするたびに、細胞結合実験を行う必要があった。以上の実験により選別してハイブリドーマクローンを得て、無血清細胞培養法で抗体を更に調製し、抗体を精製し、検出例での使用に備えた。

【0073】

実施例１－３：マウス抗体のヒト化
体外活性が高いモノクローナルハイブリドーマ細胞株ｍＡｂ１９０１、ｍＡｂ１９０２を選び出し、その中のモノクローナル抗体配列をクローニングし、更にヒト化、組換え発現及び活性評価を行った。

【0074】

ハイブリドーマから配列をクローニングするプロセスは、以下の通りである。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を収集し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６－０１８）でＲＮＡを抽出し（試薬キットの取扱説明書でのステップに従う）、逆転写した（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標） Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｔａｋａｒａ、ｃａｔ ＃ ２６８０Ａ）。逆転写で得られたｃＤＮＡを、ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＴＢ３２６ Ｒｅｖ．Ｂ ０５０３）でＰＣＲ増幅し、シークエンシング社に送ってシークエンシングした。得られたＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列は、配列番号３～配列番号６で示される。

【0075】

ｍＡｂ１９０１マウス重鎖可変領域（配列番号３）
ＥＶＱＬＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＧＩＨＷＶＲＱＡＰＥＭＧＬＥＷＩＡＹＩＳＲＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＧＹＤＴＲＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ。

【0076】

ｍＡｂ１９０１マウス軽鎖可変領域（配列番号４）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＨＣＱＮＤＬＹＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ。

【0077】

ｍＡｂ１９０２マウス重鎖可変領域（配列番号５）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＮＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＬＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＰＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＬＫＴＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ。

【0078】

ｍＡｂ１９０２マウス軽鎖可変領域（配列番号６）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＹＣＱＮＡＹＴＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ。

【0079】

上記マウス重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、それぞれ、後述するヒトＩｇＧ１抗体の重鎖定常領域とヒトκ軽鎖定常領域に接続してキメラ抗体であるｃｈ１９０１とｃｈ１９０２を形成した。

【0080】

定常領域は、以下の配列から選ばれる。

【0081】

ヒトＩｇＧ１抗体の重鎖定常領域：（配列番号７）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。

【0082】

ヒトκ軽鎖定常領域：（配列番号８）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。

【0083】

本分野での多くの文献に開示された方法に従って、マウスモノクローナル抗体をヒト化した。つまり、親（マウス抗体）定常ドメインの代わりにヒト定常ドメインを用い、マウス抗体とヒト抗体の相同性に基づき、ヒト生殖細胞系配列を選択し、ＣＤＲ移植を行った。本開示は、活性の良い候補分子を選択してヒト化し、その結果は以下の通りである。

【0084】

１． マウス抗体のＣＤＲ領域
表２において、ＶＨ／ＶＬ ＣＤＲのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって決定されて注釈されている。

【0085】

マウス抗体のＣＤＲ配列は、表２に示す通りである。

【0086】

【表2】

【0087】

２． ヒト生殖細胞系ＦＲ領域配列の選択
得られたマウス抗体ＶＨ／ＶＬ ＣＤＲの典型的な構造を基にして、重・軽鎖可変領域配列を抗体Ｇｅｒｍｌｉｎｅデータベースと比較し、相同性の高いヒト生殖細胞系テンプレートを得た。その中で、ヒト生殖細胞系軽鎖フレームワーク領域は、ヒトκ軽鎖遺伝子から由来する。

【0088】

２．１ ｍＡｂ１９０１のヒト化改変及び復帰変異の設計
適切なヒト抗体生殖細胞系を選択し、ｍＡｂ１９０１マウス抗体のヒト化改変を行い、マウス抗体ｍＡｂ１９０１のＣＤＲ領域を、選択されたヒト化テンプレートに移植し、ヒト化重鎖可変領域配列が配列番号２４で、軽鎖可変領域配列が配列番号２１であるヒト化可変領域を得て、更にＩｇＧ定常領域と組換え、完全抗体を形成した。同時に、ヒト化抗体のＶ領域におけるＦＲ領域を復帰変異し、例示的な復帰変異形態及び組合せは、以下の通りである。

【0089】

【表3-1】

【表3-2】

＊表中、全てのアミノ酸位置番号は、Ｋａｂａｔ番号付け規則による番号であり、重鎖可変領域のＮ８２Ｔにおいて、８２はＫａｂａｔ規則での第８２Ａ位である。

【0090】

【表4】

【0091】

上記の表において、重鎖可変領域は、配列番号７で示されるヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に接続して全長抗体の重鎖を形成することができるのに対して、軽鎖可変領域は、配列番号８で示されるヒトκ軽鎖定常領域に接続して全長抗体の軽鎖を形成する。他の実施形態において、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、他の重鎖定常領域と軽鎖定常領域にそれぞれ接続して全長抗体を形成してもよい。

【0092】

２．２ ｍＡｂ１９０２のヒト化改変及び復帰変異の設計
適切なヒト抗体生殖細胞系を選択し、ｍＡｂ１９０２マウス抗体のヒト化改変を行い、マウス抗体ｍＡｂ１９０２のＣＤＲ領域を、選択されたヒト化テンプレートに移植し、ヒト化重鎖可変領域配列が配列番号３１で、軽鎖可変領域配列が配列番号２８であるヒト化可変領域を得て、更にＩｇＧ定常領域と組換え、完全抗体を形成した。同時に、ヒト化抗体のＶ領域におけるＦＲ領域を復帰変異し、例示的な復帰変異形態及び組合せは、以下の通りである。

【0093】

【表5】

＊表中、全てのアミノ酸位置番号は、Ｋａｂａｔ番号付け規則による番号である。

【0094】

【表6】

上記の表において、重鎖可変領域は、配列番号７で示されるヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に接続して全長抗体の重鎖を形成するのに対して、軽鎖可変領域は、配列番号８で示されるヒトκ軽鎖定常領域に接続して全長抗体の軽鎖を形成する。

【0095】

例示的に、抗体全長配列は、以下の通りである。

【0096】

キメラ抗体ｃｈ１９０１：
ｃｈ１９０１重鎖：（配列番号３５）
ＥＶＱＬＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＧＩＨＷＶＲＱＡＰＥＭＧＬＥＷＩＡＹＩＳＲＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＧＹＤＴＲＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。

【0097】

ｃｈ１９０１軽鎖（配列番号３６）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＨＣＱＮＤＬＹＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。

【0098】

キメラ抗体ｃｈ１９０２：
ｃｈ１９０２重鎖（配列番号３７）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＮＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＬＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＰＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＬＫＴＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。

【0099】

ｃｈ１９０２軽鎖（配列番号３８）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＹＣＱＮＡＹＴＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。

【0100】

【表7】

【0101】

全長抗体の軽重鎖配列は、以下の通りである。

【0102】

【表8-1】

【表8-2】

【表8-3】

【0103】

【表9】

【0104】

全長抗体の軽重鎖配列は、以下の通りである。

【0105】

【表10-1】

【表10-2】

【表10-3】

【0106】

本開示の陽性対照抗体は、ＩＭＡＢ－３６２（ＷＯ２０１６１６６１２２による）である。

【0107】

ＩＭＡＢ－３６２重鎖（配列番号５３）
１ ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥ ＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＳＹＷＩＮＷＶＫＱＲ ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮ
５１ ＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹ ＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬ ＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹ ＭＱＬＳＳＰＴＳＥＤ ＳＡＶＹＹＣＴＲＳＷ
１０１ ＲＧＮＳＦＤＹＷＧＱ ＧＴＴＬＴＶＳＳＡＳ ＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ ＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴ ＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹ
１５１ ＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ ＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴ ＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ ＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰ ＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩ
２０１ ＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴ ＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳ ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ
２５１ ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ
３０１ ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ
３５１ ＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴ ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ
４０１ ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ ＳＬＳＬＳＰＧＫ。

【0108】

ＩＭＡＢ－３６２軽鎖（配列番号５４）
１ ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳ ＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴ ＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬ ＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰ
５１ ＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲ ＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴ ＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡ ＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹ
１０１ ＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬ ＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳ ＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱ ＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣ ＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡ
１５１ ＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬ ＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴ ＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳ ＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡ ＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣ
２０１ ＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰ ＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。

【0109】

通常の遺伝子クローニング、組換え発現の方法により、上記抗体をそれぞれクローニング、発現、精製した。

【0110】

試験例１：抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の体外活性の生物学的評価
試験例１－１：Ｃｅｌｌレベル ＥＬＩＳＡ結合実験
細胞に基づくＥＬＩＳＡ実験は、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の結合特性の検出に利用された。Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を安定的にトランスフェクションして発現したＮＵＧＣ４細胞を、９６ウェル細胞プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５９９）に培養し、９０％の密度に成長した時に、４％のパラホルムアルデヒドを加えて細胞を１時間固定し、ＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ ７．４のＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０が含まれる）でプレートを３回洗浄した後、ＰＢＳで希釈された５％の脱脂乳（光明脱脂粉乳）ブロッキング液を２００ μＬ／ウェルで加え、３７℃のインキュベータで２．５時間インキュベートし、又は４℃で一晩（１６時間～１８時間）放置してブロッキングした。ブロッキング終了後に、ブロッキング液を捨て、ＰＢＳＴ緩衝液でプレートを３回洗浄した後、５０ μＬ／ウェルでサンプル希釈液（ｐＨ ７．４のＰＢＳに１％の脱脂乳が含まれる）で希釈された異なる濃度の検出待ち抗体を加え、３７℃のインキュベータに入れて２時間インキュベートした。インキュベートが終了した後、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、１００ μＬ／ウェルでサンプル希釈液で希釈されたＨＲＰで標識したヤギ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９－０３５－００３）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを６回洗浄した後、５０ μＬ／ウェルでＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ、５２－００－０３）を加え、室温で１０ ｍｉｎ～１５ ｍｉｎインキュベートし、５０ μＬ／ウェルで１ ＭのＨ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させ、ＭＤ Ｖｅｒｓａ Ｍａｘ ＴＭマイクロプレートリーダーで４５０ ｎｍでの吸収値を読み取り、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体のＣｌａｕｄｉｎ１８．２に対する結合ＥＣ５０値を算出した（結果は下記の表を参照）。

【0111】

【表11】

【0112】

【表12】

【0113】

【表13】

【0114】

試験例１－２：抗体細胞レベル結合実験
Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を安定的にトランスフェクションして発現したＮＵＧＣ４細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、１００９９１４１）ｐＨ ７．４のＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４４１７－１００ＴＡＢ））で１×１０^６／ｍＬの細胞懸濁液に調製し、１００ μＬ／ウェルで９６ウェル円底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７９５）に加えた。遠心分離して上清を除去した後、５０ μＬ／ウェルでＦＡＣＳ緩衝液で希釈された異なる濃度の検出待ちＣｌａｕｄｉｎ１８．２抗体を加え、４℃の冷蔵庫に置いて暗所で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液３００ ｇで３回遠心分離して洗浄した後、作業濃度のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で被覆した抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ－１１０１３）を加え、４℃の冷蔵庫に置いて暗所で４０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液３００ ｇで３回遠心分離して洗浄した後、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターで幾何平均蛍光強度を検出し、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を安定的にトランスフェクションして発現したＮＵＧＣ４細胞に対する結合ＥＣ５０値を算出し、その結果は図１に示されている。

【0115】

試験例１－３：抗体エンドサイトーシス実験
ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、４６４０３）が予め標識された検出待ちＣｌａｕｄｉｎ１８．２抗体を、５ μｇ／ｍＬの最終濃度で１×１０^６／ｍＬのＣｌａｕｄｉｎ１８．２を安定的にトランスフェクションして発現したＮＵＧＣ４細胞に加え、氷上に置いて暗所で１時間インキュベートし、予冷したＦＡＣＳ緩衝液（ｐＨ ７．４のＰＢＳ、２％のウシ胎児血清）で３回遠心分離して洗浄し、上清を除去した後、予熱した完全培地を加え、３７℃で５％のＣＯ_２細胞培養器に置いた。それぞれ０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間後に細胞を取り出し、氷上に置いて暗所で保存した。サンプルを全部収集した後、３００ ｇを低温で遠心分離して上清を除去し、溶離緩衝液（ｐＨ １．７の０．０５ Ｍのグリシン、０．１ Ｍの塩化ナトリウム）を加えた後、室温で７分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液３００ ｇで１回遠心分離して洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターで幾何平均蛍光強度を検出し、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を安定的にトランスフェクションして発現したＮＵＧＣ４細胞に対するエンドサイトーシス効率を算出した。その結果（図２を参照）、ヒト化抗体は良い細胞エンドサイトーシス効率を有することが示されている。

【0116】

試験例１－４：フローサイトメトリーによる抗体の親和性の測定
実験当日、ＨＥＫ２９３／ｈＣｌａｕｄｉｎ１８．２細胞をＵ底９６ウェルプレートに収集し、各ウェルに１×１０^５個～２×１０^５個の細胞を入れた。初期濃度５ μｇ／ｍＬ、２×勾配希釈（１２個の濃度点）のＣｌａｕｄｉｎ１８．２抗体を加え、４℃で１時間インキュベートし、陽性対照をＩＭＡＢ３６２とすると共に、抗体を加えない陰性対照を設置した。遠心分離して抗体を除去してから、１００ μＬ／ウェルでＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（２００×）を加え、４℃で暗所で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％のＦＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメトリーによる検出に備えた。ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩを起動し、予熱が完了した後、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを起動し、新しい実験を確立し、ＨＥＫ２９３／ｈＣｌａｕｄｉｎ１８．２陰性対照サンプルを検出し、ＦＳＣ及びＳＳＣ電圧を適切な数値に調整して保存した。Ｑｕａｎｔｕｍ（商標） ＦＩＴＣ－５ ＭＥＳＦ Ｋｉｔの取扱説明書によって、ブランクサンプルＢ及び標準曲線１をそれぞれ検出し、ＦＩＴＣ電圧を適切な数値に調整して保存した。保存した電圧で、Ｕ底９６ウェルプレートにおけるサンプルを検出し、データを記録した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアで実験データを解析してＧｅｏ Ｍｅａｎ値を取得し、Ｑｕａｎｔｕｍ（商標） ＦＩＴＣ－５ ＭＥＳＦ Ｋｉｔの取扱説明書によってＭＥＳＦ－Ｇｅｏ Ｍｅａｎ標準曲線をフィッティングし、ＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体の濃度蛍光値によって、ＨＥＫ２９３／ｈＣｌａｕｄｉｎ１８．２細胞と結合したＣｌａｕｄｉｎ１８．２抗体のモル濃度及び遊離抗体濃度を算出し、Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット法で抗体のＢｍａｘと解離定数ＫＤを算出した。その結果は、表１３に示されている。

【0117】

【表14】

【0118】

試験例１－５：抗体のＡＤＣＣ効果の評価
各種のＮＵＧＣ４細胞（Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２高／中等度／低発現）を消化し、１０００ ｒｐｍで遠心分離した後、再懸濁してカウントした。細胞を３×１０^５細胞／ｍＬの密度で、１０％のＦＢＳ（ニュージーランド超低ＩｇＧウシ胎児血清、Ｇｉｂｃｏ、１９２１００５ＰＪ）が加えられたフェノールレッドフリーＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ、１１８３５－０３０）に再懸濁した。９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０３）において、各ウェルに２５ μＬの細胞（７５００個／ウェル）を加えた。抗体を上記フェノールレッドフリー培地において希釈し、３×の抗体希釈液に調製し、細胞プレートに２５ μＬ／ウェルの抗体を加えた。３７℃、５％のＣＯ_２培養器において０．５時間インキュベートした。

【0119】

エフェクター細胞（ＦｃｒＲ３Ａ－Ｖ１５８－ＮＦＡＴ－ＲＥ－Ｊｕｒｋａｔ細胞）を収集し、１０００ ｒｐｍで遠心分離した後、再懸濁してカウントした。細胞を３×１０^６細胞／ｍＬの密度で、１０％のＦＢＳ（ニュージーランド超低ＩｇＧウシ胎児血清）が加えられたフェノールレッドフリーＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、実験プレートにおいて各ウェルに２５ μＬの細胞（７．５×１０^４個の細胞／ウェル）を加えた。３７℃、５％のＣＯ_２培養器において６時間インキュベートした。

【0120】

実験プレートの各ウェルに７５ μＬ／ウェルのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２６１０）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＶＩＴＯＲ３）で化学発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を検出した。

【0121】

その結果（表１４と図３Ａ～図３Ｃを参照）、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を低／中等度／高という異なるレベルで発現したＮＵＧＣ４細胞において、抗体ｈ１９０１－１１とｈ１９０２－５は、何れも非常に強いＡＤＣＣ活性を示すことが示されている。

【0122】

【表15】

【0123】

実施例２：シグナルペプチドの設計と応用
実施例２－１：様々なシグナルペプチドを融合したＰｅｒｔｕｚｕｍａｂの設計と発現
下記のシグナルペプチドを融合した抗体を設計し、そのシグナルペプチド配列の組み合わせは以下の通りである。

【0124】

ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１５２）及び
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号１５３）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１５２）及び
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１５２）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＡ（配列番号５７）及び
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＶＲＡ（配列番号１０５）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＡ（配列番号５７）及び
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＡ（配列番号５７）
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＶＲＡ（配列番号１０５）及び
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＡ（配列番号５７）
上記シグナルペプチドの組み合わせを、それぞれＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ抗体重・軽鎖アミノ酸Ｎ末端に置き、且つ対応する新しい重・軽鎖配列を設計した。設計した配列は、以下の通りである。

【0125】

Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１のシグナルペプチド含有の抗体重鎖アミノ酸配列（配列番号１５４）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＴＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１のシグナルペプチド含有の抗体軽鎖アミノ酸配列（配列番号１５５）
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＩＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－２のシグナルペプチド含有の抗体重鎖アミノ酸配列（配列番号１５４）
Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－２のシグナルペプチド含有の抗体軽鎖アミノ酸配列（配列番号１５６）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＩＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－３のシグナルペプチド含有の抗体重鎖アミノ酸配列（配列番号１５７）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＴＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－３のシグナルペプチド含有の抗体軽鎖アミノ酸配列（配列番号１５８）
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＶＲＡＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＩＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－４のシグナルペプチド含有の抗体重鎖アミノ酸配列（配列番号１５７）
Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－４のシグナルペプチド含有の抗体軽鎖アミノ酸配列（配列番号１５９）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＡＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＩＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－５のシグナルペプチド含有の抗体重鎖アミノ酸配列（配列番号１６０）
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＶＲＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＴＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧＲＦＴＬＳＶＤＲＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－５のシグナルペプチド含有の抗体軽鎖アミノ酸配列（配列番号１５９）
（備考：下線部はシグナルペプチドである。）
上記Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１～Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－４の配列に基づいて各重鎖と軽鎖の遺伝子断片を合成し、重鎖遺伝子をＰＸＣ１８．４にクローニングして重鎖プラスミドを形成し、軽鎖遺伝子をＰＸＣ１７．４にクローニングして軽鎖プラスミドを形成した。プラスミドにおける同じ酵素切断部位により、軽鎖プラスミドを重鎖プラスミドにクローニングし、全長抗体プラスミドを構築した。全長抗体プラスミドを直接的にＣＨＯ細胞にエレクトロポレーションし、選別した後に当該プラスミドを含む安定形質転換細胞を得た。安定形質転換細胞を培養し、培養後の上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ親和性カラムにより精製し、発現生成物を得た。

【0126】

実施例２－２：様々なシグナルペプチドを融合したｈ１９０２－５の設計と発現
下記のシグナルペプチドを融合した抗体を設計し、そのシグナルペプチド配列の組み合わせは以下の通りである。

【0127】

ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１５２）及び
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１５２）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＡ（配列番号５７）及び
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＶＲＡ （配列番号１０５）
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＶＲＡ（配列番号１０５）及び
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＡ（配列番号５７）及び
上記シグナルペプチドの組み合わせを、それぞれｈ１９０２－５抗体重鎖、軽鎖Ｎ末端に置き、且つ対応する新しい重・軽鎖配列を設計した。設計した配列は、以下の通りである。

【0128】

ｈ１９０２－５－１のシグナルペプチド含有の抗体重鎖アミノ酸配列（配列番号１６１）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＭＩＨＰＮＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＴＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ｈ１９０２－５－１のシグナルペプチド含有の抗体軽鎖アミノ酸配列（配列番号１６２）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＡＹＴＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ｈ１９０２－５－２のシグナルペプチド含有の抗体重鎖アミノ酸配列（配列番号１６３）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＡＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＭＩＨＰＮＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＴＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ｈ１９０２－５－２のシグナルペプチド含有の抗体軽鎖アミノ酸配列（配列番号１６４）
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＶＲＡＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＡＹＴＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ｈ１９０２－５－３のシグナルペプチド含有の抗体重鎖アミノ酸配列（配列番号１６５）
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＶＲＡＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＭＩＨＰＮＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＫＴＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ｈ１９０２－５－３のシグナルペプチド含有の抗体軽鎖アミノ酸配列（配列番号１６６）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＡＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＡＹＴＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
（備考：下線部はシグナルペプチドである。）
上記ｈ１９０２－５－１又はｈ１９０２－５－２の配列に基づいて各重鎖と軽鎖の遺伝子断片を合成し、それを発現ベクターに構築して全長抗体プラスミドを得た。全長抗体プラスミドを直接的にＣＨＯ細胞にエレクトロポレーションし、選別した後に当該プラスミドを含む安定形質転換細胞を得た。安定形質転換細胞を培養し、培養後の上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ親和性カラムにより精製し、発現生成物を得た。

【0129】

実施例２－３：様々なシグナルペプチドを融合したＦｃＲｎの設計と発現
抗ＦｃＲｎ抗体の重・軽鎖アミノ酸配列は、以下の通りである。

【0130】

重鎖（配列番号１６７）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＮＦＮＫＨＹＩＡＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＤＮＳＮＴＩＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＦＧＧＰＴＦＡＱＷＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
軽鎖（配列番号１６８）
ＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＧＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＮＱＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＳＳＨＮＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＮＰＴＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＧＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＫＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
下記のシグナルペプチドを融合した抗体を設計し、そのシグナルペプチド配列の組み合わせは以下の通りである。

【0131】

ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１５２）及び
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１５２）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＡ（配列番号５７）及び
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＡ（配列番号５７）
設計した配列は、以下の通りである。

【0132】

ＦｃＲｎ－１のシグナルペプチド含有の抗体重鎖アミノ酸配列（配列番号１６９）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＮＦＮＫＨＹＩＡＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＤＮＳＮＴＩＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＦＧＧＰＴＦＡＱＷＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
ＦｃＲｎ－１のシグナルペプチド含有の抗体軽鎖アミノ酸配列（配列番号１７０）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＧＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＮＱＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＳＳＨＮＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＮＰＴＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＧＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＫＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
ＦｃＲｎ－２のシグナルペプチド含有の抗体重鎖アミノ酸配列（配列番号１７１）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＡＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＮＦＮＫＨＹＩＡＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＤＮＳＮＴＩＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＦＧＧＰＴＦＡＱＷＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
ＦｃＲｎ－２のシグナルペプチド含有の抗体軽鎖アミノ酸配列（配列番号１７２）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＬＴＧＶＨＡＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＧＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＮＱＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＳＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＫＴＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＳＳＨＮＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＮＰＴＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＧＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＫＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
上記ＦｃＲｎ－１及びＦｃＲｎ－２の配列に基づいて各重鎖と軽鎖の遺伝子断片を合成し、それを発現ベクターに構築して全長抗体プラスミドを得た。全長抗体プラスミドを直接的にＣＨＯ細胞にエレクトロポレーションし、選別した後に当該プラスミドを含む安定形質転換細胞プールを得た。安定形質転換細胞プールを培養し、培養後の上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ親和性カラムにより精製し、発現生成物を得た。

【0133】

試験例２：様々なシグナルペプチドを用いた発現生成物の末端異質性
試験例２－１：様々なシグナルペプチドを融合したＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ脱グリコシル化還元分子量及びアミノ酸配列の検出
ＰＮＧａｓｅ Ｆグリコシダーゼ（ＮＥＢ、Ｐ０７０８）によりサンプルＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－２、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－３、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－４に持たれたＮ－グリコシルを切除し、そしてＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ、４３８１５）で軽・重鎖に還元し、最後にＬＣ－ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ／ＸｅＶｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴＯＦ）によりサンプルの脱グリコシル化還元分子量を検出し、且つＵＮＩＦＩソフトフェアによりデータの処理及び分析を行った。

【0134】

Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１及びＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－３の検出結果は図４Ａ～図４Ｄに示すように、サンプルＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１は、軽鎖に４．７％のシグナルペプチドアミノ酸（ＲＣ）の残留が含まれていることを検出したが、サンプルＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－３は、軽鎖にシグナルペプチドアミノ酸の残留がなかった。Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１及びＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－３の重鎖は、何れもシグナルペプチドアミノ酸の残留が検出されておらず、少量のグリコシル化修飾しかなかった。

【0135】

Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１を尿素で変性処理した後、ＤＴＴを加えて軽・重鎖に還元し、そしてＧｌｕ Ｃ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ１６５１）を加えて酵素切断し、得られたサンプルをＬＣ－ＭＳにより分子量データを採取し、得られたデータをＵＮＩＦＩソフトフェアにより分析し、サンプルのアミノ酸配列情報を得た。

【0136】

その結果、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－１は、脱グリコシル化還元分子量検出に現れた異常ピークが、ペプチドマッピング分析検証により、ＲＣアミノ酸の残留であると確認された。具体的な結果は、表１５に示す通りである。

【0137】

【表16】

【0138】

注：本試験例は、Ｇｌｕ Ｃ酵素により酵素切断することで配列ＲＣ中のアミノ酸Ｒが切断され、当該残留アミノ酸Ｃは、ＲＣアミノ酸の残留を表示する。

【0139】

Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－２及びＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－４の検出結果は図５Ａ～図５Ｄに示すように、サンプルＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－２は、軽鎖に５．８％のシグナルペプチドアミノ酸（ＶＨＳ）の残留が含まれていることを検出したが、サンプルＰｅｒｔｕｚｕｍａｂ－４は、軽鎖にシグナルペプチドアミノ酸の残留がなかった。２つの抗体の重鎖は、何れもシグナルペプチドアミノ酸の残留が検出されておらず、少量のグリコシル化修飾しかなかった。

【0140】

Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－２を尿素で変性処理した後、ＤＴＴを加えて軽・重鎖に還元し、そしてＧｌｕ Ｃ酵素を加えて酵素切断し、得られたサンプルをＬＣ－ＭＳにより分子量データを採取し、得られたデータをＵＮＩＦＩソフトフェアにより分析し、サンプルのアミノ酸配列情報を得た。

【0141】

その結果、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ－２は、脱グリコシル化還元分子量検出に現れた異常ピークが、ペプチドマッピング分析検証により、ＶＨＳアミノ酸の残留であると確認された。具体的な結果は、表１６に示す通りである。

【0142】

【表17】

【0143】

試験例２－２：様々なシグナルペプチドを融合したｈ１９０２－５脱グリコシル化還元分子量及びアミノ酸配列の検出
ＰＮＧａｓｅ Ｆグリコシダーゼ（ＮＥＢ、Ｐ０７０８）によりサンプルｈ１９０２－５－１、ｈ１９０２－５－２に持たれたＮ－グリコシルを切除し、そしてＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ、４３８１５）で軽・重鎖に還元し、最後にＬＣ－ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ／ＸｅＶｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴＯＦ）によりサンプルの脱グリコシル化還元分子量を検出し、且つＵＮＩＦＩソフトフェアによりデータの処理及び分析を行った。

【0144】

その結果、図６Ａ～図６Ｄに示すように、サンプルｈ１９０２－５－１は、重鎖に３．１％のシグナルペプチドアミノ酸（ＶＨＳ）の残留が含まれていることを検出したが、サンプルｈ１９０２－５－２は、重鎖にシグナルペプチドアミノ酸の残留がない。２つの抗体の軽鎖は、何れもシグナルペプチドアミノ酸の残留が検出されておらず、少量のグリコシル化修飾しかない。

【0145】

ｈ１９０２－５－１を尿素で変性処理した後、ＤＴＴを加えて軽・重鎖に還元し、そしてＧｌｕ Ｃ酵素を加えて酵素切断し、得られたサンプルをＬＣ－ＭＳにより分子量データを採取し、得られたデータをＵＮＩＦＩソフトフェアにより分析し、サンプルのアミノ酸配列情報を得た。

【0146】

その結果、ｈ１９０２－５－１は、脱グリコシル化還元分子量検出に現れた異常ピークが、ペプチドマッピング分析検証により、ＶＨＳアミノ酸の残留であると確認された。具体的な結果は、下記の表１７に示す通りである。

【0147】

【表18】

【0148】

試験例２－３：様々なシグナルペプチドを融合した抗ＦｃＲｎ抗体の脱グリコシル化還元分子量及びアミノ酸配列の検出
ＰＮＧａｓｅ Ｆグリコシダーゼ（ＮＥＢ、Ｐ０７０８）によりサンプルＦｃＲｎ－１、ＦｃＲｎ－２に持たれたＮ－グリコシルを切除し、そしてＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ、４３８１５）で軽・重鎖に還元し、最後にＬＣ－ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ／ＸｅＶｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴＯＦ）によりサンプルの脱グリコシル化還元分子量を検出し、且つＵＮＩＦＩソフトフェアによりデータの処理及び分析を行った。

【0149】

その結果、図７Ａ～図７Ｄに示すように、サンプルＦｃＲｎ－１は、重鎖に３．４％のシグナルペプチドアミノ酸（ＶＨＳ）の残留が含まれていることを検出したが、サンプルＦｃＲｎ－２は、重鎖にシグナルペプチドアミノ酸の残留がない。２つの抗体の軽鎖は、何れもシグナルペプチドアミノ酸の残留が検出されておらず、少量のグリコシル化修飾しかない。

【0150】

ＦｃＲｎ－１を尿素で変性処理した後、ＤＴＴを加えて軽・重鎖に還元し、そしてＧｌｕ Ｃ酵素を加えて酵素切断し、得られたサンプルをＬＣ－ＭＳにより分子量データを採取し、得られたデータをＵＮＩＦＩソフトフェアにより分析し、サンプルのアミノ酸配列情報を得た。

【0151】

その結果、ＦｃＲｎ－１は、脱グリコシル化還元分子量検出に現れた異常ピークが、ペプチドマッピング分析検証により、ＶＨＳアミノ酸の残留であると確認された。具体的な結果は、下記の表に示す通りである。

【0152】

【表19】

【0153】

明らかに理解されるように、図面と実例によって上記の発明を詳しく説明したが、説明と実例は、本開示の範囲を制限するものと解釈すべきではない。本明細書に引用された特許と科学文献の開示内容の全ては、引用により完全且つ明らかに組み込まれている。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【配列表】

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【国際調査報告】