特表 2023-539596 細胞においてポリペプチドを発現させるための核酸構築物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-15

(54)【発明の名称】細胞においてポリペプチドを発現させるための核酸構築物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20230908BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230908BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230908BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20230908BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20230908BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230908BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230908BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230908BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230908BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20230908BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230908BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20230908BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230908BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230908BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20230908BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230908BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230908BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20230908BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230908BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20230908BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20230908BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20230908BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20230908BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20230908BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20230908BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20230908BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20230908BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230908BHJP

   A61K 38/16 20060101ALN20230908BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/113 100Z

C12N15/86 Z

C12N15/867 Z

C12N5/10

C12N1/21

C12N1/19

C12N1/15

A61K35/12

A61K35/17

A61K35/545

A61K48/00

A61K35/76

A61P31/00

A61P25/00

A61P29/00

A61P37/06

A61P37/02

A61P37/08

A61P17/06

A61P17/00

A61P1/04

A61P17/04

A61P11/06

A61P19/02

A61P13/12

A61P3/10

A61K38/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023513414

(86)(22)【出願日】2021-08-27

(85)【翻訳文提出日】2023-04-24

(86)【国際出願番号】 EP2021073714

(87)【国際公開番号】W WO2022043483

(87)【国際公開日】2022-03-03

(31)【優先権主張番号】2013477.1

(32)【優先日】2020-08-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522164226

【氏名又は名称】クウェル セラピューティックス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000040

【氏名又は名称】弁理士法人池内アンドパートナーズ

(72)【発明者】

【氏名】マクガヴァン、ジェニー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AA97X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA02

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA01

4C084ZA02

4C084ZA59

4C084ZA68

4C084ZA81

4C084ZA89

4C084ZA96

4C084ZB07

4C084ZB08

4C084ZB11

4C084ZB13

4C084ZB31

4C084ZC35

4C087AA01

4C087AA02

4C087BA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZA02

4C087ZA59

4C087ZA68

4C087ZA81

4C087ZA89

4C087ZA96

4C087ZB07

4C087ZB08

4C087ZB11

4C087ZB13

4C087ZB31

4C087ZC35

(57)【要約】

本明細書において、自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、ＦＯＸＰ３をコードする第２のヌクレオチド配列と、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列とを５’から３’へ含む核酸分子であって、特に、前記第１、第２および第３のヌクレオチド配列が自己切断配列をコードするヌクレオチド配列によって分離されている、核酸分子が提供される。また、前記核酸分子を含む構築物、ベクターおよび細胞、ならびに、細胞内、特に養子細胞療法（ＡＣＴ）に有用な免疫細胞内で、前記コードされたポリペプチドを発現させるための方法および使用も提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

５’から３’へ、以下（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む核酸分子：
（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードする第２のヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列。

【請求項2】

前記安全スイッチポリペプチド、前記ＦＯＸＰ３および前記ＣＡＲが、別個のポリペプチド実体として前記核酸分子から発現可能である、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項3】

前記第１、第２および第３のヌクレオチド配列が、自己切断配列をコードするヌクレオチド配列によって分離されている、請求項１または請求項２に記載の核酸分子。

【請求項4】

前記核酸分子は、他のいかなるコードヌクレオチド配列も含まない、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項5】

前記安全スイッチポリペプチドが、抗体によって認識される自殺部分を含み、
前記安全スイッチポリペプチドが細胞の表面に発現すると、前記抗体が前記安全スイッチポリペプチドに結合することにより前記細胞の消失が起こり、
任意選択的に、前記自殺部分は、抗体リツキシマブによって認識されるＣＤ２０エピトープである、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項6】

前記安全スイッチポリペプチドが下記式の配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸部分：
Ｒ１－Ｌ－Ｒ２－Ｓｔ
式中、Ｒ１およびＲ２は、リツキシマブ結合エピトープであり、
Ｓｔは、前記ポリペプチドが細胞の表面に発現すると、前記Ｒ１エピトープおよび前記Ｒ２エピトープを前記細胞表面から突出させるストーク配列であり、
Ｌは、リンカー配列である。

【請求項7】

前記安全スイッチポリペプチドが、以下（ｉ）または（ｉｉ）である、請求項６に記載の核酸分子：
（ｉ）配列番号１の配列もしくは当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するポリペプチドＲＱＲ８；
（ｉｉ）配列番号９２もしくは９３の配列または配列番号９２もしくは９３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するポリペプチド。

【請求項8】

前記各自己切断配列が、２Ａ配列であり、
任意選択的に、前記安全スイッチポリペプチドと前記ＦＯＸＰ３との間の自己切断配列がＰ２Ａ配列であり、前記ＦＯＸＰ３と前記ＣＡＲとの間の自己切断配列がＴ２Ａ配列である、請求項３から７のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項9】

前記ＦＯＸＰ３が、配列番号２もしくは７に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、または、配列番号２もしくは７に対してアミノ酸７２位～１０６位もしくはアミノ酸２４６位～２７２位の欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、好ましくは、前記ＦＯＸＰ３が、配列番号２を含むか、または配列番号２からなる、ポリペプチドである、請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項10】

前記ＣＡＲが、ＨＬＡ分子に対して向けられたものであり、任意選択的に、前記ＨＬＡ分子がＨＬＡ－Ａ２である、請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項11】

前記ＣＡＲが、ＭＨＣクラスＩＩに対して向けられたものではない、請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項12】

（ｉ）前記ＣＡＲが、配列番号１１、１２、および１３にそれぞれ記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３配列と、配列番号１４、１５、および１６にそれぞれ記載のＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列とを含む抗原結合ドメインを含むか、または、
（ｉｉ）前記ＣＡＲが、配列番号２０、２１、および２２にそれぞれ記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３配列と、配列番号２３、２４、および２５にそれぞれ記載のＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列とを含む抗原結合ドメインを含み、
（ｉ）または（ｉｉ）の前記ＣＤＲ配列の１つ以上が、該ＣＤＲ配列に対してアミノ酸の改変を１～３個任意選択的に含んでいてもよく、特に、前記ＣＤＲ配列の１つ以上が、１～３個のアミノ酸の置換、付加、もしくは欠失によって任意選択的に改変されていてもよい、請求項１から１１のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項13】

（ｉ）前記ＣＡＲの抗原結合ドメインが、配列番号１７に記載の配列もしくは当該配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むＶＨドメインと、配列番号１８に記載の配列もしくは当該配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むＶＬドメインとを含むか、または、
（ｉｉ）前記ＣＡＲの抗原結合ドメインが、配列番号２６に記載の配列もしくは当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＶＨドメインと、配列番号２７に記載の配列もしくは当該配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むＶＬドメインとを含む、請求項１２に記載の核酸分子。

【請求項14】

前記ＣＡＲが、ｓｃＦｖの形態の抗原結合ドメインを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項15】

前記ＣＡＲの抗原結合ドメインが、以下（ｉ）または（ｉｉ）を含む、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の核酸分子：
（ｉ）配列番号１９もしくは８８に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；
（ｉｉ）配列番号２８に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列。

【請求項16】

前記ＣＡＲが、以下（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の核酸分子：
（ｉ）ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ７もしくは免疫グロブリン、またはそれらの一部もしくは変異体のヒンジ領域から選択される、ヒンジドメイン；
（ｉｉ）ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）もしくはＣＤ１５４の膜貫通ドメイン、またはそれらの一部もしくはそれらの変異体から選択される、膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）任意選択的に、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＩＣＯＳまたはＴＮＦＲＳＦ２５の細胞内ドメインから選択される、共刺激ドメイン；
（ｉｖ）Ｔ細胞受容体のζ鎖のエンドドメインもしくはその相同体のいずれか、ＣＤ３ポリペプチドエンドドメイン、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ、ＣＤ２、ＣＤ５、およびＣＤ２８、ＦｃｙＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質尾部、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）をもつ細胞質受容体、またはこれらの組み合わせから選択される、細胞内シグナル伝達ドメイン。

【請求項17】

（ｉ）前記ＣＡＲが、ヒトＣＤ８ヒンジドメインもしくはその変異体とヒトＣＤ８膜貫通ドメインとを含み、かつ／または、
（ｉｉ）前記ＣＡＲが、ヒトＣＤ２８共刺激ドメインとヒトＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとを含むエンドドメインを含み、かつ／または、
（ｉｉｉ）前記ＣＡＲが、ＳＴＡＴ５会合モチーフと、ＪＡＫ１および／もしくはＪＡＫ２結合モチーフと、任意選択的にＪＡＫ３結合モチーフと、を含むエンドドメインを含み、好ましくは、該ＣＡＲのエンドドメインが、インターロイキン受容体（ＩＬ）受容体のエンドドメイン由来の１つ以上の配列を含む、
請求項１から１６のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項18】

請求項１からのいずれか一項に記載の核酸であって、
前記核酸分子が、５’から３’へ、以下（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖｉ）を含み：
（ｉ）配列番号１０、９４もしくは９５の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む安全スイッチポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）Ｐ２Ａ切断配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）配列番号２の配列または当該配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列；
（ｉｖ）Ｔ２Ａ切断配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｖｉ）ＨＬＡ－Ａ２に対して作られたＣＡＲをコードする第３のヌクレオチド配列、
前記ＣＡＲは、以下（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）を含む：
（ａ）配列番号６６に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいはこのような配列からなる、リーダー配列；
（ｂ）配列番号１９もしくは８８に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいはこのような配列からなる、抗原結合ドメイン；
（ｃ）配列番号６８に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいはこのような配列からなる、ＣＤ８αヒンジ・膜貫通ドメイン配列；
（ｄ）配列番号７１に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいはこのような配列からなる、ＣＤ２８共刺激ドメイン；
（ｅ）配列番号７２に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいはこのような配列からなる、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン。

【請求項19】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現構築物であって、前記第１、第２および第３のポリヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結されており、任意選択的に、前記プロモーターが、ウイルスプロモーターであり、任意選択的にＬＴＲプロモーターである、発現構築物。

【請求項20】

前記プロモーターが、プロモーターＳＦＦＶである、請求項１９に記載の発現構築物。

【請求項21】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項１９もしくは請求項２０に記載の発現構築物を含むベクター。

【請求項22】

前記ベクターが、ウイルスベクターであり、任意選択的にレンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、請求項２１に記載のベクター。

【請求項23】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１９もしくは請求項２０に記載の発現構築物、または請求項２１もしくは請求項２２に記載のベクターを含む、細胞であって、任意選択的に生産宿主細胞である、細胞。

【請求項24】

前記細胞が、前記安全スイッチポリペプチドと前記ＣＡＲとを細胞表面に共発現する、請求項２３に記載の細胞。

【請求項25】

前記細胞が、以下（ｉ）または（ｉｉ）である、請求項２３または請求項２４に記載の細胞：
（ｉ）免疫細胞またはその前駆細胞もしくは前駆体、好ましくはＴ細胞またはその前駆体、より好ましくはＴｒｅｇ細胞もしくはＴｃｏｎ細胞またはその前駆体；
（ｉｉ）幹細胞、好ましくはｉＰＳＣ細胞。

【請求項26】

前記細胞が、Ｔｒｅｇ細胞である、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項27】

請求項２３から２６のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞集団。

【請求項28】

請求項２３から２６のいずれか一項に記載の細胞、請求項２７に記載の細胞集団、または請求項２１もしくは請求項２２に記載のベクターを含む、医薬組成物。

【請求項29】

治療に使用するための、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の細胞、請求項２７に記載の細胞集団、または請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項30】

養子細胞移入療法に使用するための、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の細胞、請求項２７に記載の細胞集団、または請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項31】

感染症、神経変性疾患、もしくは炎症性疾患を治療するための、または免疫抑制を誘導するための、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の細胞、請求項２７に記載の細胞集団、または請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項32】

移植片に対する寛容の誘導；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患、もしくはアレルギー疾患の治療および／または予防；組織修復および／または組織再生の促進；あるいは、対象における炎症の寛解、に使用するための、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の細胞、請求項２７に記載の細胞集団、または請求項２８に記載の医薬組成物であって、
特に、前記細胞がＴｒｅｇ細胞である、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の細胞、請求項２７に記載の細胞集団、または請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項33】

移植片に対する寛容を誘導する、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患、もしくはアレルギー疾患を治療および／または予防する、組織修復および／または組織再生を促進する、あるいは、炎症を寛解させる方法であって、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の細胞、特にＴｒｅｇ細胞、請求項２７に記載の細胞集団、または、請求項２８に記載の医薬組成物、特にＴｒｅｇ細胞を含む医薬組成物を、対象に投与する工程を含む、方法。

【請求項34】

以下の工程を含む、請求項３３に記載の方法：
（ｉ）Ｔｒｅｇ富化細胞試料を単離または用意する工程であって、任意選択的に対象から単離または用意する工程；
（ｉｉ）前記Ｔｒｅｇ細胞に、請求項１から１８のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１９もしくは請求項２０に記載の発現構築物、または請求項２１もしくは請求項２２に記載のベクターを導入する工程；および
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で得られた前記Ｔｒｅｇ細胞を前記対象に投与する工程。

【請求項35】

移植片に対する寛容を誘導するため、細胞性移植拒絶反応および／または液性移植拒絶反応を治療および／または予防するため、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患、もしくはアレルギー疾患を治療および／または予防するため、組織修復および／または組織再生を促進するため、あるいは、対象における炎症を寛解させるための薬剤の製造における、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の細胞または請求項２７に記載の細胞集団の使用であって、特に、前記細胞がＴｒｅｇ細胞である、使用。

【請求項36】

前記対象が、免疫抑制療法を受けている移植レシピエントであり、任意選択的に、前記移植が、肝臓移植、腎臓移植、心臓移植、肺移植、膵臓移植、腸管移植、胃移植、骨髄移植、血液柄付複合組織移植、および皮膚移植から選択される移植であり、特に、前記移植が肝臓移植である、請求項３２に記載の使用のための細胞、細胞集団もしくは医薬組成物、請求項３３もしくは請求項３４に記載の方法、または、請求項３５に記載の使用。

【請求項37】

（ｉ）前記ＣＡＲが、下記から選択される抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインを含み：
移植された肝臓には存在するが前記レシピエントには存在しないＨＬＡ抗原、ＮＴＣＰ等の肝臓特異的抗原、または、拒絶反応時もしくは組織炎症時に発現が上昇する抗原であって、ＣＣＬ１９、ＭＭＰ９、ＳＬＣ１Ａ３、ＭＭＰ７、ＨＭＭＲ、ＴＯＰ２Ａ、ＧＰＮＭＢ、ＰＬＡ２Ｇ７、ＣＸＣＬ９、ＦＡＢＰ５、ＧＢＰ２、ＣＤ７４、ＣＸＣＬ１０、ＵＢＤ、ＣＤ２７、ＣＤ４８、ＣＸＣＬ１１等の抗原、かつ／あるいは、
（ｉｉ）前記ＣＡＲが、移植片ドナーには存在するが移植片レシピエントには存在しないＨＬＡ抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインを含み、特に、前記抗原はＨＬＡ－Ａ２であり、かつ／あるいは、
（ｉｉｉ）前記ＣＡＲが、配列番号１９、８８もしくは２８に記載の配列または配列番号１９、８８もしくは２８に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む抗原結合ドメインを含む、請求項３６に記載の、使用のための細胞、細胞集団もしくは医薬組成物、方法、または、使用。

【請求項38】

前記自己免疫疾患またはアレルギー疾患が、乾癬および皮膚炎を含む炎症性皮膚疾患；クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患に関連付けられる応答；皮膚炎；食物アレルギー、湿疹、および喘息を含むアレルギー状態；関節リウマチ；ループス腎炎および皮膚ループスを含む全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；１型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病を含む真性糖尿病；ＣＩＰＤ、多発性硬化症、ＡＬＳを含む神経変性疾患；ならびに若年性糖尿病から選択される、請求項３２から３７のいずれかに記載の、使用のための細胞、細胞集団もしくは医薬組成物、方法、または使用。

【請求項39】

請求項２３から２６のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、請求項１から１８のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１９もしくは請求項２０に記載の発現構築物、または、請求項２１もしくは請求項２２に記載のベクターを、細胞に導入する工程を含む、方法。

【請求項40】

前記細胞がＴｒｅｇ細胞であり、前記方法がＴｒｅｇを含む細胞含有試料を単離または用意することを含み、かつ／あるいは、前記核酸分子、前記発現構築物もしくは前記ベクターを前記細胞に導入する工程の前または後に、Ｔｒｅｇを前記細胞含有試料から富化および／または生成する、請求項４０に記載の方法。

【請求項41】

細胞において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と安全スイッチとＦＯＸＰ３とをコードする核酸分子からのＦＯＸＰ３の発現を増強する方法であって、請求項１から１８のいずれか一項に記載の核酸分子を選択すること、および前記核酸分子を前記細胞に導入することを含む、方法。

【請求項42】

前記細胞において、前記核酸分子からの前記ＣＡＲの発現も増強させる、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

細胞内に、自殺部分、ＦＯＸＰ３およびＣＡＲを発現させるための、請求項１から１８のいずれか一項に記載の核酸分子の使用であって、前記ＦＯＸＰ３の発現を増強させる、使用。

【請求項44】

前記細胞における前記ＣＡＲの発現も増強させる、請求項４３に記載の使用。

【請求項45】

前記第１、第２および第３のヌクレオチド配列を前記指定の順序で含む核酸分子を製造することを含む、請求項４１もしくは請求項４２に記載の方法、または、請求項４３もしくは請求項４４に記載の使用。

【請求項46】

リツキシマブによって認識される少なくとも１つのＣＤ２０エピトープの自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドを発現する細胞のリツキシマブに対する感受性を増加させる方法であって、前記細胞に、前記安全スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であってＳＦＦＶプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む核酸分子を導入することを含む、方法。

【請求項47】

リツキシマブに対する細胞の感受性を増加させるための、ＳＦＦＶプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む核酸分子の使用であって、前記ヌクレオチド配列が、リツキシマブによって認識される少なくとも１つのＣＤ２０エピトープの自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードする、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示および本発明は、細胞、特に養子細胞療法（ＡＣＴ）に有用な免疫細胞においてポリペプチドを発現させるのに有用な、分子および構築物を含む核酸に関する。この核酸は、１つの分子内に３つの構成要素、すなわち、自殺部分（ｓｕｉｃｉｄｅ ｍｏｉｅｔｙ）、転写因子ＦＯＸＰ３およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、該核酸を細胞内で発現させると、自殺部分、ＦＯＸＰ３およびＣＡＲが当該細胞内または当該細胞上に個々のポリペプチドとして別個に発現する。

【背景技術】

【0002】

養子細胞療法（ＡＣＴ）は、様々な状態（最も注目すべきは、細胞傷害性細胞の投与が行われてきた悪性疾患および感染症を含む）に対する臨床的応用での使用や試験が増加しつつあり、最近では、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、それらの免疫抑制効果に基づき、不要な免疫応答を制御するために使用することが提案されている。

【0003】

ＣＤ１９を認識するように遺伝子操作されたＴ細胞が、濾胞性リンパ腫の治療に用いられており、抗腫瘍Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝子改変された自己リンパ球を用いるＡＣＴが、転移性黒色腫の治療に用いられている。黒色腫およびＥＢＶ関連悪性腫瘍におけるＡＣＴの成功を受け、他の腫瘍の治療のためにエフェクターＴ細胞を再標的化する取り組みが盛んに行われるようになり、新たな特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるようなＴ細胞の操作が行われてきた。

【0004】

Ｂ細胞系悪性腫瘍、成人リンパ腫、および播種性黒色腫の免疫療法のためのＣＡＲ改変型Ｔリンパ球が報告されている。

【0005】

別の種類の免疫細胞、例えば、ＣＡＲを発現するように操作されたＮＫ細胞をはじめとするＮＫ細胞もまた、ＡＣＴに使用されているか、使用が提案されている。より最近では、ＡＣＴのための制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が開発されている。Ｔｒｅｇは、免疫抑制機能を有する。Ｔｒｅｇは、細胞障害性免疫応答を制御するように作用し、免疫寛容の維持に不可欠である。Ｔｒｅｇの抑制特性は、例えば、炎症性障害、自己免疫疾患もしくは自己免疫状態またはアレルギー疾患もしくはアレルギー状態、および移植において、免疫介在性の臓器障害の改善および／または予防のため、治療的に利用することができる。エフェクター免疫細胞に関しては、Ｔｒｅｇは、細胞上に発現する所定の分子、例えば、ＣＡＲを介して標的化される抗原を標的とするように、同様に遺伝子操作され得る。実際、抗原特異的Ｔｒｅｇは、標的免疫抑制を実現するという利点があり、いくつかのグループが、ポリクローナルＴｒｅｇと比較して抑制能が高いことを報告している。

【0006】

よって、ＡＣＴのためには、多くの場合、細胞内に異種受容体またはターゲティング分子、特にキメラ受容体つまりＣＡＲを発現させることが望ましい。

【0007】

しかしながら、養子免疫療法の有効性が高くなるほど、重篤な有害事象の報告が伴うことがわかっている。操作したエフェクターＴ細胞の注入後におけるサイトカインストーム等の急性の有害事象が報告されている。これに加え、慢性の有害事象が発生しており、また、別の事象も動物モデルにより予測されている。例えば、腎癌により発現される抗原である炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）にリダイレクトしたエフェクターＴ細胞は、数名の患者において、胆道上皮での予期せぬＣＡＩＸの発現により、肝毒性を生じた。黒色腫に対するネイティブＴ細胞受容体移入の研究では、複数の患者において、皮膚および虹彩における標的抗原の発現により、白斑および虹彩炎が起こった。ＴＣＲの交差対形成（ＴＣＲ ｃｒｏｓｓ－ｐａｉｒｉｎｇ）に起因する移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）様症候群が、ネイティブＴＣＲ移入後のマウスで報告されている。共刺激を組み込んだいくつかのＣＡＲの養子移入後の動物モデルにおいて、リンパ増殖性障害が報告されている。最後に、ベクター挿入による突然変異誘発のリスクは常に存在する。急性毒性は投薬を慎重に行うことで対処できるが、慢性毒性は、細胞用量非依存性である可能性が高い。

【0008】

操作され投与されたＴ細胞は、投与後何年にもわたって増殖および存続する可能性があり、さらに、Ｔｒｅｇ細胞は、ある一定の環境下でサプレッサーを失ってＴエフェクター細胞になり得る。このことと、また、どのような免疫療法であっても患者への投与後に有害事象が発生するリスクは常に存在することとを考慮すると、場合によっては、また、特定の疾患状態については、養子注入したＴ細胞およびその他の免疫細胞を、毒性に直面した場合に、または実際にそれらが治療効果を発揮した後に、選択的に除去することを可能にする安全機構を備えておくことが望ましい場合がある。

【0009】

自殺遺伝子は、形質導入細胞のインビボでの選択的除去を可能にする。典型的には、自殺遺伝子は、安全対策として、細胞を消失させるかまたは消失の標的とすることを可能にする自殺部分をコードし、それによって、当該細胞の安全スイッチとして働く。２種類の自殺遺伝子／部分、ＨＳＶ－ＴＫおよびｉＣａｓｐ９について、臨床試験が既に行われている。Ｔ細胞に単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）を発現させると、ガンシクロビルに対する感受性が付与される。ＨＳＶ－ＴＫの使用は、このウイルスタンパク質が高い免疫原性を有することから、ハプロタイプ一致骨髄移植等、高度に免疫抑制された臨床状況に限定される。さらに、これにより、サイトメガロウイルス治療へのガンシクロビルの使用が不可能となる。誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）は、小分子医薬（ＡＰ２０１８７）の投与により活性化することができる。ｉＣａｓｐ９の使用は、臨床グレードのＡＰ２０１８７の利用可能性に依存する。さらに、遺伝子操作された細胞生成物に加えて実験的な小分子を使用することで、規制上の問題が生じる可能性がある。
他の安全スイッチも開発中であり、特許文献１では、溶解性抗体リツキシマブによって認識される、抗原ＣＤ２０の最小エピトープに基づくポリペプチド構築物が報告されている。リツキシマブは、主としてＢ細胞の表面に存在するタンパク質ＣＤ２０に対する免疫治療用キメラ型モノクローナル抗体である。リツキシマブは、ＣＤ２０に結合すると細胞死を誘発するものであり、よって、細胞表面にＣＤ２０を発現している細胞を標的とし死滅させるために使用し得る。リツキシマブによって認識されるエピトープを模倣したペプチド（いわゆるミモトープ）が開発されており、これらは、特許文献１において、マーカー部位としてＣＤ３４最小エピトープをさらに含む自殺－マーカーポリペプチド複合化構築物における自殺部分として使用されていた。具体的には、特許文献１には、配列番号１に記載の配列を有する、ＲＱＲ８と呼ばれるポリペプチドが開示されている。このポリペプチドは、スペーサー配列とそれらの間に介在するＣＤ３４マーカー配列とによって互いに分離された２つのＣＤ２０最小エピトープを含み、２つのＣＤ２０最小エピトープはさらに、このポリペプチドをそれが発現する細胞の表面から突出させるストーク配列（ｓｔａｌｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に連結されている。

【0010】

よって、ＡＣＴのためにＣＡＲを発現するように操作した細胞に安全スイッチを備えておくことは、より多くの場合において望ましい。

【0011】

上記のように、Ｔｒｅｇ細胞は、その抑制機能を考慮すると、ＡＣＴに有用な細胞のカテゴリーである。Ｔｒｅｇ細胞はＦＯＸＰ３を発現し、従来のＴ細胞（Ｔｃｏｎ細胞）は、それらの細胞内にＦＯＸＰ３を発現させることによってエクスビボで制御性の表現型へ分化させることができる。ＦＯＸＰ３発現の喪失は、制御性Ｔ細胞の抑制機能の低下とエフェクター表現型への復帰の可能性に関連付けられる。よって、ＦＯＸＰ３発現は、Ｔｒｅｇの機能およびＴｒｅｇ表現型の維持に重要であると思われ、本明細書では、ＡＣＴ用の免疫細胞、特にＴｒｅｇ細胞においてＦＯＸＰ３を発現させることをさらに提案する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】国際公開第２０１３／１５３３９号パンフレット

【発明の概要】

【0013】

本発明者らは、細胞、特にＡＣＴ用の免疫細胞、より詳細にはＴｒｅｇ細胞またはその前駆体において、ＣＡＲと安全スイッチとＦＯＸＰ３とを共発現させるための核酸分子および構築物を開発した。上記のように、特に、安定したＴｒｅｇ表現型を有するＴｒｅｇ細胞を提供するために、または、細胞にＴｒｅｇ表現型を付与するために、ＣＡＲおよび安全スイッチと一緒にＦＯＸＰ３を発現させることを提案する。

【0014】

前記核酸分子および構築物は、１つの核酸分子または構築物内にこれらの３つの構成要素をコードするように設計され、コードされたポリペプチドが細胞内で個々の構成要素、すなわち別々の実体として産生され得るようになっている。よって、核酸分子によってコードされた３つの構成要素は、発現後、別個の異なる、または別々の機能的ポリペプチドとして、細胞内または細胞上に別個に位置し得る。これは、核酸分子内に切断配列、特に自己切断配列を、それぞれの構成要素をコードするヌクレオチド配列の間にコードすることによって達成することができる。

【0015】

本発明者らは、驚くべきことに、前記３つの構成要素が核酸分子内でコードされる順序が重要であることを見出した。特に、ＣＡＲ、ＦＯＸＰ３および安全スイッチを別個の個々のポリペプチドとして発現させることは、核酸構築物においてそれらを次の順序：安全スイッチポリペプチド－ＦＯＸＰ３ポリペプチド－ＣＡＲで５’から３’へコードすることによって改善し得ることがわかった。比較核酸構築物において前記構成要素が異なる順序でコードされていると、安全スイッチ－ＦＯＸＰ３－ＣＡＲの順序と比較して、個々の構成要素のレベルが低下することがわかった。最も注目すべきは、安全スイッチ－ＦＯＸＰ３－ＣＡＲの構築物では、ＦＯＸＰ３産生のレベルが、予想外にかつ予測できないほどに、非常に高かったことである。下記の実施例に示すように、本明細書中の構築物は、形質導入細胞におけるＦＯＸＰ３タンパク質のレベルを、比較可能な構築物または対照の構築物よりも著しく増強した。形質導入されたＦＯＸＰ３がＴｒｅｇ細胞に安定性を付与し、該細胞はそのＴｒｅｇ表現型を維持し、さらに、ＦＯＸＰ３レベルの増加は増殖または細胞生存に悪影響を及ぼさなかった。その上、観察された非常に高いＦＯＸＰ３産生レベルは、様々なウイルスベクターを用いて実現可能であることが示された。

【0016】

したがって、第１の態様において、本明細書では、５’から３’へ、以下（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む核酸分子が提供される：
（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードする第２のヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列。

【0017】

特に、前記安全スイッチポリペプチド、前記ＦＯＸＰ３、および前記ＣＡＲは、別個のポリペプチド実体として前記核酸分子から発現され得る。

【0018】

この点に関して、本明細書では、５’から３’へ、以下（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む核酸分子であって、
（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードする第２のヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列、
前記第１、第２、および第３のヌクレオチド配列が、自己切断配列をコードするヌクレオチド配列によって分離されている、核酸分子が提供される。

【0019】

前記自己切断配列は、前記安全スイッチポリペプチド、前記ＦＯＸＰ３、および前記ＣＡＲを別個のポリペプチドとして発現または産生することを可能にする。

【0020】

ある実施形態では、前記自己切断配列（自己切断ペプチドともいう）は、２Ａ切断配列または２Ａ様切断配列（言い換えれば、２Ａペプチドまたは２Ａ様ペプチド）である。

【0021】

ある実施形態では、前記安全スイッチは、下記でさらに説明するように、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドＲＱＲ８もしくはその変異体、または類似のポリペプチドである。

【0022】

前記ＣＡＲは、任意の所望の標的分子、特に、標的細胞上に発現した標的分子に対するものであってもよい。好適なＣＡＲについては後述する。ある実施形態では、前記ＣＡＲは、ＨＬＡ抗原、例えばＨＬＡ－Ａ２に対して向けられたものである。さらなる実施形態では、前記ＣＡＲは、ＭＨＣ ＩＩに対して向けられたものでなくてもよい。

【0023】

前記核酸分子は、前記第１、第２、および第３のコードヌクレオチド配列を含む核酸構築物とみなしてもよい。特定の実施形態において、前記核酸分子は、他のポリペプチド配列をコードしなくてもよい（すなわち、ある実施形態では、前記項目（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の第１、第２、および第３のコードヌクレオチド配列以外のコードヌクレオチド配列を含まない）。言い換えれば、ある実施形態では、前記核酸分子に存在するコード配列は、前記（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉｉ）のヌクレオチド配列のみである。よって、代替的な見方によれば、前記核酸分子は、安全スイッチポリペプチド、ＦＯＸＰ３、およびＣＡＲをコードするだけよい。前記核酸分子は、これらのコードされたポリペプチドの発現を可能にするようにプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。よって、前記第１、第２、および第３のヌクレオチド配列は、同じプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。このようにすることで、３つのコードされたポリペプチド構成要素は、同じプロモーターから、個々の別個の構成要素として発現し得る。特に、前記プロモーターはＳＦＦＶプロモーターであってもよい。

【0024】

したがって、さらなる態様において、本明細書では、本明細書中で定義する核酸分子を含む発現構築物であって、前記第１、第２、および第３のポリヌクレオチド配列が同じプロモーターに作動可能に連結された、発現構築物が提供される。

【0025】

代替的な見方によれば、前記発現構築物は、上記で定義した第１、第２、および第３のヌクレオチド配列を含む発現構築物であって、前記第１、第２、および第３のヌクレオチド配列が切断配列をコードするヌクレオチド配列によって分離された発現構築物であって、前記第１、第２、および第３のポリヌクレオチド配列が同じプロモーターに作動可能に連結された発現構築物と定義することができる。前記切断配列は、安全スイッチポリペプチド、ＦＯＸＰ３、およびＣＡＲを別個のポリペプチドとして発現させることを可能にする。

【0026】

第３の態様は、本明細書中で定義する核酸分子または発現構築物を含むベクターを提供する。

【0027】

ある実施形態では、前記ベクターはウイルスベクターである。

【0028】

第４の態様において、本明細書では、本明細書中で定義する核酸分子、発現構築物またはベクターを含む細胞が提供される。

【0029】

よって、前記細胞は、操作された細胞であり、代替的な見方によれば、本明細書中で定義する核酸分子、構築物またはベクターを導入するように改変された細胞である。前記細胞は、前記核酸分子を組換え発現する。前記細胞は、ポリペプチドの産生のための細胞であってもよく、または、核酸分子、構築物もしくはベクターの産生のための細胞、例えば、ベクターを産生するための細胞であってもよい。したがって、前記細胞は生産宿主細胞であってもよい。あるいは、前記細胞は、治療、特にＡＣＴに使用することを目的とした細胞であってもよい。よって、前記細胞は、免疫細胞、特に、Ｔ細胞、より詳細にはＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔｒｅｇ細胞等のＴｒｅｇ細胞、または、例えば誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等の幹細胞も含む、その前駆細胞もしくは前駆体であってもよい。前記ＣＡＲは、治療用途を目的とした細胞の表面に発現／局在する。前記安全スイッチポリペプチドは、当該安全スイッチポリペプチドの性質および種類に応じて、細胞内または細胞表面に発現／局在し得る。ある実施形態では、前記安全スイッチポリペプチドは、細胞表面に（前記ＣＡＲとは別個に）発現／局在する。ＦＯＸＰ３は、細胞内部に発現／局在する。特に、ＦＯＸＰ３は、核および／または細胞質に発現する。

【0030】

本発明は、本明細書中で定義する細胞を含む細胞集団をさらに提供する。

【0031】

第５の態様において、本明細書では、本明細書中で定義する細胞、細胞集団またはベクターを含む医薬組成物が提供される。ある実施形態では、前記細胞は、その細胞表面に前記ＣＡＲと前記安全スイッチとを発現する。本明細書中で定義する細胞、細胞集団および医薬組成物は、治療、特にＡＣＴまたは遺伝子治療（前記組成物がベクターを含む場合）に使用することができる。

【0032】

したがって、第６の態様において、治療に使用するための、本明細書中で定義する細胞、細胞集団または医薬組成物が提供される。

【0033】

第７の態様は、養子細胞移入療法（ＡＣＴ）または遺伝子治療に使用するための、本明細書中で定義する細胞、細胞集団または医薬組成物を提供する。

【0034】

第８の態様は、感染症、神経変性疾患もしくは炎症性疾患の治療に使用するための、または免疫抑制を誘導するための、本明細書中で定義する細胞、細胞集団または医薬組成物を提供する。前記使用または免疫抑制は、不要なまたは望ましくない免疫応答を抑制するためであってもよい。前記使用は、炎症、または炎症状態、つまり炎症を伴う状態もしくは炎症に関連する状態を治療するためであってもよい。

【0035】

第９の態様は、養子細胞移入療法（ＡＣＴ）に使用するための薬剤、感染症、神経変性疾患もしくは炎症性疾患の治療に使用するための薬剤、または、免疫抑制を誘導するための薬剤の製造のための、本明細書中で定義する細胞または細胞集団の使用を提供する。

【0036】

第１０の態様は、治療の方法、特にＡＣＴの方法、より詳細には、感染症、神経変性疾患、もしくは炎症性疾患を治療するための方法または免疫抑制を誘導するための方法であって、対象、特にこのような治療を必要としている対象に、本明細書中で定義する細胞または細胞集団を投与すること、特に、治療上有効量の該細胞または細胞集団を投与することを含む、方法を提供する。

【0037】

ある実施形態では、本明細書では、移植片（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）に対する寛容の誘導に使用するための；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患、またはアレルギー疾患を治療および／または予防するための；組織修復および／または組織再生を促進するための；あるいは、炎症を寛解させるための、細胞、細胞集団または医薬組成物が提供される。特に、このような実施形態において、前記細胞はＴｒｅｇ細胞であり得る。

【0038】

同様に、移植片に対する寛容を誘導する、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患、もしくはアレルギー疾患を治療および／または予防する；組織修復および／または組織再生を促進する；あるいは、炎症を寛解させる方法であって、前記対象に、本明細書中で定義する、Ｔｒｅｇ等の細胞、細胞集団、または、Ｔｒｅｇ細胞等の細胞を含む医薬組成物を投与する工程を含む、方法も提供される。

【0039】

このような方法は、以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含み得る：
（ｉ）Ｔｒｅｇ富化細胞試料を、対象から単離または用意すること；
（ｉｉ）前記Ｔｒｅｇ細胞に、本明細書中で定義する核酸分子、発現構築物またはベクターを導入すること；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られたＴｒｅｇ細胞を前記対象に投与すること。

【0040】

さらに、本明細書では、移植片に対する寛容を誘導するための；細胞性移植拒絶反応および／または液性移植拒絶反応を治療および／または予防するため；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患、またはアレルギー疾患を治療および／または予防するため；組織修復および／または組織再生を促進するため；あるいは炎症を寛解させるための薬剤の製造における、本明細書中で定義する、Ｔｒｅｇ細胞等の細胞、または細胞集団の使用も提供される。

【0041】

このような状態や疾患の治療のために、前記ＣＡＲは、ＨＬＡ抗原、例えばＨＬＡ－Ａ２に対して向けられたものであってもよい。

【0042】

第１１の態様は、本明細書中で定義する細胞を作製する方法であって、本明細書中で定義する核酸分子、発現構築物またはベクターを、細胞、例えば、Ｔｒｅｇ細胞に導入（例えば、細胞に形質導入またはトランスフェクト）する工程を含む、方法を提供する。

【0043】

このような方法は、当該方法で使用する細胞を、単離、富化、用意または生成する先行工程をさらに含んでもよい。さらに、細胞の単離または富化または生成を、前記核酸分子を導入する工程の後で行ってもよい。例えば、前記核酸分子を前駆体または前駆細胞、例えば幹細胞に導入し、その後、その細胞を、所望の細胞型へと分化もしくは変化するよう誘導してもよく、または分化もしくは変化させてもよい。例えば、ｉＰＳＣ細胞を免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔｒｅｇまたは他のＴ細胞）へと分化させてもよく、あるいはＴｃｏｎ細胞をＴｒｅｇ細胞等へと変換させてもよい。

【0044】

第１２の態様において、第４の態様に記載の細胞を除去するための方法であって、リツキシマブの結合特異性を有する抗体に細胞を曝露する工程を含む、方法が提供される。一態様において、本方法はインビトロの方法であってもよい。

【0045】

代替的な見方によれば、この態様は、本明細書中で定義する第４の態様の細胞が投与された対象の治療において、当該細胞を除去するために使用する、リツキシマブの結合特異性を有する抗体を含んでもよい。

【0046】

さらにこの態様では、（ａ）本明細書中で定義する核酸分子、構築物、ベクター、または細胞と、（ｂ）リツキシマブの結合特異性を有する抗体と、を含む、キットまたは組み合わせ製品が提供される。前記キットまたは製品は、ＡＣＴまたは遺伝子治療に使用するためのものであってもよい。特に、前記キットまたは製品は、前記細胞を用いたＡＣＴによる対象の治療、あるいは、本発明の細胞の使用のための製造、ならびに、その後に行われる対象からの当該細胞の除去に使用するものであってもよい。あるいは、前記キットは、前記コードされたポリペプチドをインビボで対象の細胞内に発現させるために、ベクターを用いる遺伝子治療のためのものであってもよい。抗体は、細胞またはベクターの投与後、例えば一定期間後に、対象に投与してもよいし、あるいは、対象が細胞または遺伝子治療の望ましくないまたは有害な症状または効果を示した場合に、対象に投与してもよい。

【0047】

ある実施形態では、前記抗体はリツキシマブであってもよい。

【0048】

本発明はまた、細胞の安定性および／または抑制機能を増加させるための方法であって、本明細書中で提供する核酸分子、発現構築物またはベクターを細胞に導入する工程を含む、方法も提供する。

【0049】

さらなる態様において、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、安全スイッチおよびＦＯＸＰ３をコードする核酸分子からのＦＯＸＰ３の発現を、細胞において増強する方法であって、５’から３’へ、下記（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む核酸分子を選択すること、ならびに
（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；、
（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードする第２のヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）ＣＡＲをコードする第３のヌクレオチド配列；
前記核酸分子を前記細胞に導入すること、を含む方法を提供する。

【0050】

上述のように、ＦＯＸＰ３、ＣＡＲ、および安全スイッチをコードする核酸分子からのＦＯＸＰ３の発現は、核酸分子内で前記各コードヌクレオチド配列を、安全スイッチ、ＦＯＸＰ３およびＣＡＲの順に配置することによって増強することができる。特に、前記核酸分子からのＦＯＸＰ３の発現は、ＣＡＲ、安全スイッチおよびＦＯＸＰ３（好ましくは同じＣＡＲ、安全スイッチ、およびＦＯＸＰ３）をコードする核酸分子であって上記で定義した（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が異なる順序で配置された核酸分子からの発現と比較して、例えば、５’から３’へ（ｉｉｉ）、（ｉｉ）、（ｉ）を含む核酸分子または５’から３’へ（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉ）を含む核酸分子と比較して、増強し得る。

【0051】

さらなる態様において、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、安全スイッチおよびＦＯＸＰ３をコードする核酸分子からのＦＯＸＰ３の発現とキメラ抗原受容体の発現とを、細胞において増強する方法であって、５’から３’へ、下記（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む核酸分子を選択すること、ならびに
（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードする第２のヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）ＣＡＲをコードする第３のヌクレオチド配列；
前記発現構築物を前記細胞に導入すること、を含む方法をさらに提供する。

【0052】

この態様に関連して、前記核酸分子からのＦＯＸＰ３およびＣＡＲの発現は、ＣＡＲ、安全スイッチおよびＦＯＸＰ３（好ましくは同じＣＡＲ、安全スイッチ、およびＦＯＸＰ３）をコードする核酸分子であって上記で定義した（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）が異なる順序で配置された核酸分子からの発現と比較して、例えば、５’から３’へ（ｉｉｉ）、（ｉｉ）、（ｉ）を含む核酸分子または５’から３’へ（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉ）を含む核酸分子と比較して、増強される。

【0053】

追加の態様において、本発明は、５’から３’へ、下記（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む核酸分子の使用であって、
（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードする第２のヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列；
細胞内で自殺部分、ＦＯＸＰ３およびＣＡＲを発現させるための、当該核酸分子の使用であり、前記ＦＯＸＰ３の発現を増強させる、使用を提供する。

【0054】

この態様に関連して、本発明は、５’から３’へ、下記（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む核酸分子の使用であって、
（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードする第２のヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列；
細胞内で自殺部分、ＦＯＸＰ３およびＣＡＲを発現させるための、当該核酸分子の使用であり、前記ＦＯＸＰ３および前記ＣＡＲの発現を増強させる、使用をさらに提供する。

【0055】

代替的な見方によれば、本発明は、５’から３’へ、下記（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む核酸分子の使用であって、
（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードする第２のヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列；
細胞内での自殺部分およびＣＡＲの発現のためのならびにＦＯＸＰ３の増強された発現のための、当該核酸分子の使用を提供する。

【0056】

特定の実施形態では、前記ＣＡＲの発現が追加的に増強される。

【図面の簡単な説明】

【0057】

【図1】図１は、下記の実施例に記載の、作製して試験した核酸構築物の設計を示す図である。構築物Ｉ～ＶＩは、実験構築物であり、構築物Ｉが本発明および本開示に係る構築物であり、構築物ＩＩ～ＶＩが比較構築物である。構築物ＶＩＩ～Ｘは、実験（試験）構築物の３つの構成要素のうちの２つのみを含む対照構築物である。Ｒ＝安全スイッチポリペプチド、Ｆ＝ＦＯＸＰ３、Ｃ＝ＣＡＲである。

【図2-1】図２は、Ｔ－エフェクター（Ｔｅｆｆ）における実験構築物と対照構築物の発現を示す。非形質導入細胞（モック）および形質導入細胞を回収し、固定可能な生死判別色素（ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ）と、ＣＤ４、ＣＤ３、デキストラマー、ＲＱＲ８およびＦＯＸＰ３に対する抗体とでフローサイトメトリー用に染色した。上段のパネルは、Ｌｉｖｅ／ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞にゲート設定したものである。各パネルはデキストラマー（ｘ軸）の発現を示す。下段のパネルは、Ｌｉｖｅ／ＣＤ３＋ＣＤ４＋デキストラマー＋細胞にゲート設定したものであり、ＲＱＲ８（ｙ軸）とＦＯＸＰ３（ｘ軸）の発現を示す。下側のパネルは、形質導入細胞のみにおける発現を示す。構築物の名称は遺伝子の順序を示しており、Ｒ＝ＲＱＲ８、Ｆ＝ＦＯＸＰ３、Ｃ＝ＣＡＲである。

【図2-2】図２の続き

【図3A】図３Ａおよび図３Ｂは、ガンマレトロウイルスにより形質導入したＴｒｅｇにおける実験構築物の発現を示す。１５日間の増殖後、形質導入細胞を回収し、固定可能な生死判別色素と、ＣＤ４、ＣＤ３、デキストラマー、ＲＱＲ８およびＦＯＸＰ３に対する抗体とでフローサイトメトリー用に染色した。図３ＡのＦＡＣＳプロットは、代表的な染色プロファイルを示す。上段のパネルは、Ｌｉｖｅ／ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞を示す。各パネルは、デキストラマー（ｘ軸）の発現を示す。下段のパネルは、Ｌｉｖｅ／ＣＤ３＋ＣＤ４＋デキストラマー＋細胞にゲート設定したものであり、ＲＱＲ８（ｙ軸）とＦＯＸＰ３（ｘ軸）の発現を示す。

【図3B】図３Ｂのグラフは、ＣＡＲ、ＦＯＸＰ３およびＲＱＲ８を発現している細胞、ＣＡＲおよびＦＯＸＰ３を発現しているがＲＱＲ８を発現していない細胞、ＣＡＲおよびＲＱＲ８を発現しているがＦＯＸＰ３を発現していない細胞、ならびに、ＣＡＲを発現しているがＦＯＸＰ３もＲＱＲ８も発現していない細胞の割合を描写するＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて行った各構築物のブール代数分析の結果である。３つの独立したドナーの代表である。

【図4】図４は、レンチウイルスベクターにより形質導入した細胞におけるモジュール発現を示す。Ｔｒｅｇを４８時間活性化し、濃縮されていないレンチウイルス上清によって形質導入した。４日後、形質導入細胞と活性化した非形質導入細胞（モック）とを回収し、固定可能な生死判別色素と、ＣＤ４、ＣＤ３、デキストラマー、ＲＱＲ８およびＦＯＸＰ３に対する抗体とでフローサイトメトリー用に染色した。上側のパネルは、Ｌｉｖｅ／ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞にゲート設定したものであり、デキストラマー（ｘ軸）の発現を示す。下側のパネルは、Ｌｉｖｅ／ＣＤ３＋ＣＤ４＋デキストラマー＋細胞にゲート設定したものであり、ＲＱＲ８（ｙ軸）とＦＯＸＰ３（ｘ軸）の発現を示す。ｎ＝３～４のドナーの代表である。下側のパネルは、形質導入細胞のみにおける発現を示す。構築物の名称は遺伝子の順序を示しており、Ｒ＝ＲＱＲ８、Ｆ＝ＦＯＸＰ３、Ｃ＝ＣＡＲである。

【図5】図５Ａおよび図５Ｂは、構築物Ｉ（図５Ａ）および構築物ＩＶ（図５Ｂ）について、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターによる形質導入の直接比較を示す。同じドナー由来のＴｒｅｇを４８時間活性化し、構築物Ｉをパッケージングしたレンチウイルス上清またはレトロウイルス上清によって形質導入した。４日後、細胞を回収し、固定可能な生死判別色素と、ＣＤ４、ＣＤ３、デキストラマー、ＲＱＲ８およびＦＯＸＰ３に対する抗体とでフローサイトメトリー用に染色した。表は、Ｌｉｖｅ ＣＤ４＋集団内の導入遺伝子発現細胞の割合と、平均蛍光強度（ＭＦＩ）とを示す。デキストラマーとＦＯＸＰ３のＭＦＩは、デキストラマー＋細胞から得られたものである。ＲＱＲ８のＭＦＩは、ＲＱＲ８＋細胞から得られたものである。

【図6】図６は、ＦＯＸＰ３を含有する実験構築物（構築物ＩおよびＶＩ）とＦＯＸＰ３を含有しない対照構築物（ＣＶＩＩＩ）とについての、ＣＡＲ陰性細胞（薄灰色－非形質導入）およびＣＡＲ＋細胞（濃灰色－形質導入）におけるＦＯＸＰ３の発現を示す。図６Ａは、ＦＡＣＳプロットを示し、図６Ｂは、ＦＯＸＰ３発現を示すヒストグラムを提示する。構築物ＩおよびＶＩのヒストグラムについては、薄灰色のピークを左側のピークとして見ることができ、濃灰色のピークを右側のピークとして見ることができる。構築物ＶＩＩＩについては、ピークが重なっている。

【図7】図７は、外因性ＦＯＸＰ３の発現によってＦＯＸＰ３－ＣＡＲ＋Ｔｒｅｇの蓄積が防止されることを示している。表示した構築物について、レトロウイルス上清によってＴｒｅｇに形質導入した。Ｔｒｅｇを回収し、固定可能な生死判別色素と、ＣＤ４、ＣＤ３、デキストラマー、ＲＱＲ８およびＦＯＸＰ３に対する抗体とでフローサイトメトリー用に染色した。上段のパネルは、形質導入から７日後のデキストラマー＋細胞上のＦＯＸＰ３（ｘ軸）およびＲＱＲ８（ｙ軸）の発現を示す。下側のパネルは、抗ＣＤ３／２８ビーズによる再刺激の後で形質導入を行ってから１１日後のデキストラマー＋細胞上のＦＯＸＰ３（ｘ軸）およびＲＱＲ８（ｙ軸）の発現を示す。

【図8-1】図８は、４８時間活性化し、非濃縮レトロウイルス上清によって形質導入したＴｒｅｇを示す。７日後に、形質導入細胞と活性化した非形質導入細胞（モック）とを回収し、固定可能な生死判別色素と、ＣＤ４、ＣＤ３、デキストラマー、ＲＱＲ８およびＦＯＸＰ３に対する抗体とでフローサイトメトリー用に染色した。上側のパネルは、Ｌｉｖｅ／ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞にゲート設定したものであり、デキストラマー（ｘ軸）の発現を示す。下側のパネルは、Ｌｉｖｅ／ＣＤ３＋ＣＤ４＋デキストラマー＋細胞にゲート設定したものである。プロットは、ＲＱＲ８（ｙ軸）とＦＯＸＰ３（ｘ軸）の発現を示す。ｎ＝７のドナーの代表である。構築物の名称は遺伝子順序を示しており、Ｒ＝ＲＱＲ８、Ｆ＝ＦＯＸＰ３、Ｃ＝ＣＡＲである。

【図8-2】図８の続き

【図9-1】図９は、４８時間活性化し、濃縮レンチウイルス上清によって形質導入したＴｒｅｇを示す。７日後に、形質導入（Ｔｄ）細胞と活性化した非形質導入（ｎｔｄ）細胞（モック）とを回収し、固定可能な生死判別色素と、ＣＤ４、ＣＤ３、デキストラマー、ＲＱＲ８およびＦＯＸＰ３に対する抗体とでフローサイトメトリー用に染色した。Ｌｉｖｅ／ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞にゲート設定した。上段のパネルは、デキストラマー（ｘ軸）の発現を示し、中段のパネルは、表示したように、ＦＯＸＰ３（ｘ軸）とＲＱＲ８（ｘ軸）の発現を示す。ヒストグラムは、同じ試料中の非形質導入Ｔｒｅｇ（薄灰色）およびデキストラマー＋Ｔｒｅｇ（濃灰色）のＦＯＸＰ３発現を示す。薄灰色のピークのみを有するモック細胞についての最初のヒストグラムを除いて、薄灰色のピークは各ヒストグラムの左側のピークとして見られ、濃灰色のピークは各ヒストグラムの右側のピークとして見られる。

【図9-2】図９の続き

【図9-3】図９の続き

【図10A】図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＣＡＲ＋ＦＯＸＰ３またはＣＡＲ単独を形質導入した細胞を含有するＴｒｅｇ培養物が、全体的に似たような増殖および生存を有することを示す。ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔｒｅｇを活性化し、レトロウイルスまたはレンチウイルスにより形質導入し、「材料および方法」に概略を示したプロトコルに従って成長させた。５日目、７日目、９日目、１２日目および１４日目に、マルチウェル使い捨て血球計を用いて細胞を計数した。図１０Ａのグラフは、非形質導入Ｔｒｅｇ細胞培養物（モック）と、ＦＯＸＰ３を含む構築物（ＣＩおよびＣＶＩ）を形質導入したＴｒｅｇ細胞培養物と、ＦＯＸＰ３を含まない構築物（ＣＶＩＩＩおよびＣＸ）を形質導入したＴｒｅｇ細胞培養物の、０日目からの増殖倍率を示す。ｎ＝３～４である。エラーバーは標準偏差を示す。培養１６日目に、ＲＱＲ８＋細胞を、磁気ビーズ分離を用いて富化し、濃度を漸減させたＩＬ－２の存在下でビーズと１：１で７日間培養した。固定可能な生死判別色素とデキストラマーとで細胞を染色した。

【図10B】図１０Ｂのグラフは、ＦＯＸＰ３を含む構築物（ＣＩ）を形質導入したＴｒｅｇと、ＦＯＸＰ３を含まない構築物（ＣＶＩＩＩ）を形質導入したＴｒｅｇとを示す。左のｙ軸は、生死判別色素によって決定された生細胞の百分率（円形の印で値を示した青線）を示し、右のＹ軸は、デキストラマー＋細胞の百分率（正方形の印で値を示した黒線）を示す。レトロウイルスによって形質導入したＴｒｅｇからの３つの実験の代表である。

【図11-1】図１１は、形質導入ＴｒｅｇがＴｒｅｇ表現型を維持することを示している。外因性の形質導入を行ったバルクＴｒｅｇとＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔｒｅｇとについて、フローサイトメトリーにより、表示したマーカー発現のアッセイを行った。各試料において、形質導入（ＴＤ）細胞をデキストラマー＋と同定し、残りの細胞を非形質導入（ＮＴＤ）とみなした。マーカーごとの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＴＤ細胞およびＮＴＤ細胞において測定した。２⁰は、変化なしを表し、２¹は、発現が倍増したことを表す。グラフのバーは、平均値を表し、エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝３～４）。

【図11-2】図１１の続き

【図12】図１２は、プロモーターとしてＥＦＳまたはＳＦＦＶのいずれかを用いてＣＩまたはＣＶＩＩＩを形質導入したときのＴｒｅｇの形質導入効率を示す。Ｑｂｅｎｄ（ＲＱＲ８）とデキストラマー（ＣＡＲ）とを調べるために細胞を染色した。ＥＦＳおよびＳＦＦＶの両方で類似の形質導入効率が得られた。ＣＩというよりもＣＶＩＩＩを形質導入した細胞において、より高いレベルの形質導入が見られ、形質導入効率は構築物のサイズ（３遺伝子というよりも２遺伝子）により依存していることが示された。

【図13】図１３は、ＣＡＲ Ｔｒｅｇの活性化アッセイを示し、このアッセイでは、ＨＬＡ Ａ１もしくはＨＬＡ Ａ２のいずれかを発現するＫ５６２細胞を用いた細胞の活性化、または抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いた細胞の活性化を調査した。ＨＬＡ Ａ２を発現する（すなわち、この実験で使用したＣＡＲによって認識される抗原を発現する）Ｋ５６２細胞は、ＥＦＳプロモーターまたはＳＦＦＶプロモーターのいずれかを使用した場合、ＣＩを形質導入した細胞とＣＶＩＩＩを形質導入した細胞との両方においてＣＡＲを活性化することが可能である（ＣＤ６９によって測定）。しかしながら、活性化のレベルは、ＳＦＦＶプロモーターを使用した方が高い。陽性対照として機能し、かつ内因性ＴＣＲを用いて細胞を活性化するＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて、全ての細胞を活性化することができる。

【図14-1】図１４は、発現を制御するためにＥＦＳプロモーターまたはＳＦＦＶプロモーターのいずれかを用いてＣＩを形質導入したＴｒｅｇのＣＡＲ活性化および増殖を示す。活性化は、Ｋ５６２ Ａ１、Ｋ５６２ Ａ２、または抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズのいずれかと共に細胞をインキュベートすることによって調査されている。データは、ＣＡＲ－Ｔｒｅｇが抗原特異的な刺激を受けると増殖できることと、ＳＦＦＶがＣＡＲ活性化後の増殖率を高めることとを示している。

【図14-2】図１４の続き

【図15-1】図１５は、ＣＩを形質導入したＴｒｅｇのインビボ評価と、リツキシマブの、マウスモデルに投与した場合に肝臓でＲＱＲ８安全スイッチを発現する細胞を枯渇させる能力とを示す。１５日目、リツキシマブで処理していない場合は、形質導入細胞がマウスの血液、脾臓および肝臓にはっきりと確認できる。しかしながら、リツキシマブで処理したマウスでは、細胞が効率的に枯渇している。

【図15-2】図１５の続き

【図16-1】図１６は、形質導入Ｔｒｅｇをウサギ血清と用量を漸増させたリツキシマブと共に４時間インキュベートしたリツキシマブ滴定実験を示す。ＲＱＲ８の発現のために使用したプロモーターは、ＥＦＳまたはＳＦＦＶのいずれかであった。データは、リツキシマブが用量依存的にＣＡＲ Ｔｒｅｇの細胞死を誘発できることと、ＳＦＦＶがリツキシマブ媒介性枯渇に対する感受性を増加させることとを示している。

【図16-2】図１６の続き

【0058】

＜詳細な説明＞
本発明は、ＡＣＴ用の細胞、具体的にはＣＡＲを発現するように細胞を改変するという観点において、該細胞での発現に有用であるポリペプチドをコードする核酸分子または構築物であって、かつ、単一の核酸分子によって当該ポリペプチドがコードされることを可能にする核酸分子または構築物を提供し、当該単一の核酸分子は、該ポリペプチドが別個のまたは別々の構成要素として発現および／または産生されることを可能にする自己切断配列をさらにコードしてもよい。これはつまり、前記ポリペプチドは、単一の核酸分子によってコードされているが、前記コードされた切断部位での翻訳中または翻訳後の「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」により、別個のポリペプチドとして発現または産生することができ、そのため、細胞内のタンパク質産生プロセスの終了時には、別個の実体もしくは別個のポリペプチド鎖として細胞に存在し得ることを意味している。以下に詳細に説明するように、自己切断ペプチド配列としては、特に２Ａペプチドおよび２Ａ様ペプチドをはじめとする自己切断ペプチド配列を使用してもよい。「自己切断（ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇ）」と表現しているが、このようなペプチドは、２Ａ配列のＣ末端にペプチド結合が形成されない（スキップされる）ようにリボソームスキッピングを可能にすることによって機能し、２Ａ配列とその下流の次のポリペプチドとの分離を導くと考えられる。よって、本明細書中で使用する「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」という用語は、ペプチド結合形成をスキップすることを含む。

【0059】

「別々の（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）」または「別個の（ｓｅｐａｒａｔｅ）」ポリペプチドとは、これらのポリペプチドが互いに連結されておらず、物理的に別であることを意味している。言い換えれば、これらのポリペプチドは、細胞において別個の実体として発現または産生される。実際に、これらのポリペプチドは、発現後は、細胞において異なるまたは別個の位置にある。よって、ＣＡＲ、ＦＯＸＰ３、および安全スイッチポリペプチドは、最終的に、単一の別個の構成要素として発現する。ＣＡＲは、細胞表面分子として発現する。安全スイッチポリペプチドは、細胞内部に発現してもよく、細胞表面上に発現してもよい。特定の実施形態では、安全スイッチポリペプチドとＣＡＲとは、ＡＣＴに使用することを目的とした細胞の表面に発現する。ＦＯＸＰ３は、細胞内部に発現し、その場所で、以下に詳細に説明するように、細胞の発達および／または活性を調節する転写因子としての効果を発揮することができる。

【0060】

安全スイッチポリペプチドは、当該安全スイッチポリペプチドが発現している細胞内または該細胞上に自殺部分を提供する。これは、対象に投与された細胞を、万一必要が生じた場合に、実際には、より一般的には希望または必要に応じて、例えば、細胞がその治療効果を発揮または完了したら、除去することを可能にする安全機構として有用である。

【0061】

自殺部分は、細胞死、またはより一般的には細胞の消失もしくは除去、を導く誘導能を有する。自殺部分の一例は、自殺遺伝子によってコードされる自殺タンパク質であり、これは、所望の導入遺伝子、この場合はＣＡＲ、と一緒に細胞内または細胞上に発現し得、発現すると、細胞を除去させて導入遺伝子（ＣＡＲ）の発現をオフにする。本明細書中の自殺部分は、許容条件下、すなわち、誘導またはオンされた条件下で細胞を除去させることができるポリペプチドである自殺ポリペプチドをいう。

【0062】

前記自殺部分は、対象に投与される活性化剤によって細胞除去活性を発揮するように活性化されてもよいポリペプチドもしくはアミノ酸配列であってもよく、または対象に投与され得る基質の存在下で細胞除去活性を発揮するための活性であってもよいポリペプチドもしくはアミノ酸配列であり得る。特定の実施形態では、前記自殺部分は、対象に投与される別個の細胞除去剤の標的となってもよい。細胞除去剤が自殺部分に結合することにより、除去されるべき細胞を標的とすることができる。特に、前記自殺部分は、抗体によって認識され得、安全スイッチポリペプチドが細胞の表面に発現すると、その安全スイッチポリペプチドに抗体が結合することによって、当該細胞が消失する、または除去される。

【0063】

前記自殺部分は、上述のＨＳＶ－ＴＫまたはｉＣａｓｐ９であってもよい。しかしながら、前記自殺部分が、細胞除去抗体もしくは細胞の除去を誘発可能な他の結合分子によって認識されるエピトープであるか、またはこのようなエピトープを含むことが好ましい。このような実施形態では、安全スイッチポリペプチドは、細胞の表面に発現する。

【0064】

本明細書中において細胞の除去という文脈で使用する「除去する（ｄｅｌｅｔｅ）」という用語は、「取り除く（ｒｅｍｏｖｅ）」または「切除する（ａｂｌａｔｅ）」または「消失させる（ｅｌｉｍｉｎａｔｅ）」と同義である。この用語は、対象における細胞数を減少させ得るような細胞の死滅または細胞増殖の阻害を包含するために使用される。１００％完全に取り除くことが望ましい場合もあるが、必ずしも達成されなくてもよい。対象における細胞数を減少させること、または細胞増殖を阻害することが、有益な効果を得るのに十分な場合もある。

【0065】

特に、前記自殺部分は、抗体リツキシマブによって認識されるＣＤ２０エピトープであってもよい。よって、前記安全スイッチポリペプチドにおいて、前記自殺部分は、抗体リツキシマブによって認識されるＣＤ２０由来のエピトープに基づく最小エピトープを含み得る。より詳細には、このポリペプチドは、リンカーＬによって離隔された２つのＣＤ２０エピトープＲ１およびＲ２を含み得る。

【0066】

したがって、ある実施形態では、前記安全スイッチポリペプチドは、下記式の配列を含む。
Ｒ１－Ｌ－Ｒ２－Ｓｔ
式中、Ｒ１およびＲ２は、リツキシマブ結合エピトープであり、
Ｓｔは、前記ポリペプチドが細胞の表面に発現すると、Ｒ１エピトープおよびＲ２エピトープを前記細胞表面から突出させるストーク配列であり、
Ｌは、リンカー配列である。

【0067】

この配列を含む安全スイッチポリペプチドを発現する細胞は、抗体リツキシマブ、またはリツキシマブの結合特異性を有する抗体を用いて、選択的に死滅させることができる。安全スイッチポリペプチドが細胞表面に発現し、発現したポリペプチドがリツキシマブまたは同じ結合特異性を有する抗体に曝露されるかまたは接触すると、結果として細胞死が起こる。

【0068】

リツキシマブ結合エピトープとは、抗体リツキシマブ、またはリツキシマブの結合特異性を有する抗体、言い換えれば、リツキシマブが結合するのと同じ天然のエピトープに結合する抗体、に結合するアミノ酸配列である。リツキシマブは、ヒトＣＤ２０に結合するキメラ型マウス／ヒトモノクローナルκＩｇＧ１抗体である。ＣＤ２０由来のリツキシマブ結合エピトープ配列は、ＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣ（配列番号３３）である。リツキシマブは、欧州特許第０６６９８３６号明細書に最初に記載され（ハイブリドーマ）、重鎖配列および軽鎖配列が欧州特許第２０００１４９号明細書に示されている（次の文献も参照されたい：Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｔ， ２０１３， １３８， ３０５８（重鎖配列および軽鎖配列が図１中に示されている）、およびＲｉｔｕｘｉｍａｂ－ＣＡＳ １７４２２－３１－７， ｃａｔｏｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ： Ｂ００８４－０６１０４３， ＢＯＣ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。さらに、米国特許出願第２００９／０２８５７９５（Ａ１）号明細書、欧州特許出願第１６３３３９８（Ａ２）号明細書、および国際公開第２００５／０００８９８号パンフレットを参照してもよい。リツキシマブおよびそのバイオシミラーは、世界中の様々な商業的供給源から広く入手可能である。

【0069】

したがって、Ｒ１およびＲ２は、リツキシマブに結合する任意のペプチドであってもよく、または言い換えれば、リツキシマブに結合可能な任意のペプチドであってもよい。ＣＤ２０に関連して述べた前記天然のエピトープに加え、リツキシマブに結合する、または、より詳細には前記天然のエピトープを模倣する、様々なペプチドが公知であり、報告されている。したがって、Ｒ１およびＲ２は、リツキシマブエピトープのミモトープであってもよい。

【0070】

このようなミモトープは、例えば、Ｐｅｒｏｓａら（２００７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １７９：７９６７－７９７４）に記載されており、当該文献には、システイン拘束７塩基長環状ペプチド（ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ７－ｍｅｒ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の系統が開示されており、これらはリツキシマブによって認識される抗原モチーフを有するが、モチーフの周囲のアミノ酸が異なっている。Ｐｅｒｏｓａは、下記表１に示すように、配列番号３４～４４の１１個のペプチドを記載している。表中、モチーフを挟むアミノ酸を小文字で示し、モチーフを大文字で示した。最初のアミノ酸「ａ」はペプチドから除去されていてもよく、機能的エピトープ（またはミモトープ）が保持さていればよいと判断されている。最初の「ａ」を欠いた配列番号４５～５５のペプチドも、表１に示されている。

【表1】

【0071】

本発明に係るＲ１および／またはＲ２として使用し得るリツキシマブエピトープの円形（または環状）ミモトープは、配列番号５６のコンセンサスアミノ酸配列で表すことができ、
Ｘ１－Ｃ－Ｘ２－Ｘ３－（Ａ／Ｓ）－Ｎ－Ｐ－Ｓ－Ｘ４－Ｃ
ここで、Ｘ１はＡもしくは存在せず、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は任意のアミノ酸である。

【0072】

より詳細には、Ｘ２は、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｍ、Ｗ、またはＥから選択されるアミノ酸であってもよく、Ｘ３は、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ａ、またはＨから選択されるアミノ酸であってもよく、Ｘ４は、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＱから選択されるアミノ酸であってもよい。

【0073】

リツキシマブエピトープの非円形（または非環状）ペプチドミモトープも開発されている。Ｌｉら（２００６ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３９：１３６－４３）にも、配列ＱＤＫＬＴＱＷＰＫＷＬＥ（配列番号５７）のペプチドを含む、リツキシマブのミモトープが記載されている。

【0074】

前記ポリペプチドは、配列番号３４～５７からなる群より選択されるアミノ酸配列をそれぞれ独立して含むリツキシマブ結合エピトープＲ１およびＲ２を含んでもよく、またはリツキシマブ結合活性を保持するその変異体を含んでもよい。

【0075】

２つのエピトープＲ１およびＲ２は、同じであっても異なっていてもよいが、好ましい一実施形態では、これらは同じである。

【0076】

ある実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、配列番号３３～５７からなる群より選択されるアミノ酸配列またはリツキシマブ結合活性を保持するその変異体から本質的になるか、あるいは、それぞれこのようなアミノ酸配列または変異体からなる。

【0077】

代表的な実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号４６として示すアミノ酸配列またはリツキシマブ結合活性を保持するその変異体を含むリツキシマブ結合エピトープＲ１およびＲ２を含んでいてもよく、本質的にこのようなアミノ酸配列または変異体からなるリツキシマブ結合エピトープＲ１およびＲ２を含んでいてもよく、あるいはこのようなアミノ酸配列または変異体からなるリツキシマブ結合エピトープＲ１およびＲ２を含んでいてもよい。

【0078】

変異体リツキシマブ結合エピトープは、配列番号３３～５５または５７からなる群より選択される配列に基づくものであってもよいが、当該エピトープがリツキシマブ結合活性を保持することを条件として、前記配列に対し、アミノ酸の挿入、置換、または欠失等のアミノ酸変異を１つ以上含むものである。特に、前記配列は、一方または両方の末端において短くなっていてもよく、例えば、１個または２個のアミノ酸分、短くなっていてもよい。

【0079】

エピトープのリツキシマブ結合活性が保持される限り、意図的なアミノ酸の置換を、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行ってもよい。例えば、負の電荷を有するアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正の電荷を有するアミノ酸としてはリシンおよびアルギニンが挙げられ、親水性値が類似する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としてはロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。

【0080】

保存的置換を、例えば、下記表２に従って行ってもよい。

【表2】

【0081】

第２カラムの同一ブロックおよび第３カラムの同じ行にあるアミノ酸を、互いに置換してもよい。

【0082】

リツキシマブ結合エピトープは、配列番号３３～５７からなる群より選択される配列と比較して、例えば、３個以下、２個以下、または１個のアミノ酸変異を含んでもよい。

【0083】

リツキシマブ結合エピトープの変異体は、配列番号３３～５５または５７のいずれか１つに対し、少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこのようなアミノ酸配列からなってもよく、より詳細には、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこのようなアミノ酸配列からなってもよい。

【0084】

２つの同一（または類似）のリツキシマブ結合アミノ酸配列を使用する場合、異なるヌクレオチド配列を用いて２つのＲエピトープをコードすることが有利となる場合がある。多くの発現系において、相同配列は、望ましくない組換え事象を引き起こす可能性がある。遺伝コードの縮重を用い、代替コドンを使用してタンパク質配列を変更することなくヌクレオチド配列の変異を達成し、これにより相同組換え事象を防いでもよい。

【0085】

リンカー配列Ｌは、２つの「Ｒ」エピトープを、抗体がそれらを認識してそれらに結合するように、連結する、もしくはつなげるように機能する任意のアミノ酸配列であり得る。特に、前記Ｒエピトープは間隔をあけて配置され、それぞれが別個の抗体分子によって結合される。よって、リンカー配列Ｌは、２つのＲエピトープを同時に同じ抗体分子に結合させない長さであり、または別の言い方をすれば、リンカーＬは、前記安全スイッチポリペプチドが１つのリツキシマブ分子の両方の抗原結合部位に同時に結合できないほど長い。リンカーＬは、２つのＲエピトープがそれぞれ別個のリツキシマブ分子に結合できるような長さである。

【0086】

リンカー配列は、単にＲエピトープを離隔しながらつなげる機能を果たすだけでもよい。あるいは、またはさらに、リンカー配列は、さらなる機能的ドメインまたは配列を含んでもよい。例えば、マーカー配列を含有してもよい。マーカー配列は、抗体によって認識されるエピトープであってもよい（この文脈では、これはリツキシマブによって認識されるエピトープとは異なるエピトープであることが理解されるであろう。）。マーカー配列は、それ自体がスペーサー配列として機能し得るため、マーカー配列に加えて別個のスペーサー配列が必要でない場合がある。

【0087】

上記のように、特許文献１の自殺構築物は、ＣＤ３４マーカー配列を含むリンカーによって間隔をあけて配置され、さらにストーク配列に連結された最小ＣＤ２０エピトープ（具体的には、上記の配列番号３４～４４および５７に基づく）を含んでいる。詳細には、特許文献１の自殺ポリペプチドは、同文献において、一般式Ｓｔ－Ｒ１－Ｓ１－Ｑ－Ｓ２－Ｒ２を有すると定義されている。式中、Ｒ１およびＲ２はリツキシマブ結合エピトープであり、Ｓｔはストーク配列であり、Ｓ１およびＳ２はスペーサー配列であり、Ｑは、配列番号５８（ＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳ）の配列を有するＣＤ３４エピトープまたはその変異体である。

【0088】

配列番号５８のエピトープは、モノクローナル抗体ＱＢＥｎｄ１０によって認識される。このことは、臨床現場で細胞の単離に広く用いられているＭｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ磁気細胞選択システムにＱＢＥｎｄ１０抗体が用いられているため、重要である。したがって、Ｑエピトープをマーカーとして含めることで、このポリペプチドを発現するように改変された細胞を、一般的に利用可能な選択システムを用いて容易に選択できるようになる。

【0089】

ある実施形態では、前記安全スイッチポリペプチドは、特許文献１に開示されるポリペプチドからなってもよく、またはこのようなポリペプチドを含んでいてもよい。そのような実施形態では、上記式Ｒ１－Ｌ－Ｒ２－Ｓｔにおいて、Ｌを下記のように定義し得る。
Ｓ１－Ｑ－Ｓ２
式中、Ｑは、配列番号５８の配列を有するＣＤ３４エピトープ、またはＱＢＥｎｄ１０結合活性を有するその変異体を含み（例えば、このようなＣＤ３４エピトープまたは変異体であり）、
Ｓ１およびＳ２は、任意選択のスペーサー配列であり、互いに同じであっても異なっていてもよい。

【0090】

上記のように、リンカーＬは、２つのＲエピトープを間隔をあけて配置させるように機能するため、２つのＲエピトープは、リツキシマブの細胞除去剤としての効果を引き出すことができるような方法でリツキシマブに結合でき、すなわち、２つのＲエピトープがそれぞれ別個のリツキシマブ分子に結合できる。よって、Ｓ１－Ｑ－Ｓ２の長さ、つまりＲ１とＲ２との間の距離は、安全スイッチポリペプチドが１つのリツキシマブ分子の両方の抗原結合部位に同時に結合できないような長さまたは距離である。

【0091】

スペーサー配列Ｓ１およびＳ２は、組み合わせた長さが少なくとも約１０アミノ酸であってもよい。

【0092】

Ｒ１とＲ２との間の距離は、７６．５７Åを超えていてもよい。例えば、前記スペーサー配列の長さおよび構成は、Ｒ１とＲ２との間の距離が少なくとも７８Å、８０Å、または８５Åであるような長さおよび構成であってもよい。この計算のために、直鎖状のバックボーン中の別個のアミノ酸間の分子距離をアミノ酸１個当たり約３Åと仮定することができる。前記スペーサー配列（１つまたは複数）は、実質的に直鎖状であってもよい。スペーサー配列は、下記に定義する可動性リンカー配列の配列を有していてもよく、特に、下記で詳細に説明するように、セリン残基およびグリシン残基を含むか、またはこれらの残基からなる配列を有していてもよい。前記スペーサー配列（１つまたは複数）は、一般式Ｓ－（Ｇ）ｎ－Ｓを有していてもよく、式中、Ｓはセリンであり、Ｇはグリシンであり、ｎは２から８の間の数である。前記リンカーもしくは各リンカーは、配列ＳＧＧＧＳ（配列番号６２）を含んでもよく、この配列からなってもよい。しかしながら、他のスペーサー配列を使用してもよい。スペーサーのアミノ酸配列は重要ではない。Ｑエピトープとスペーサー（１つまたは複数）を組み合わせた長さ（すなわち、Ｓ１－Ｑ－Ｓ２リンカー配列の長さ）は、少なくとも２８アミノ酸であってもよい。

【0093】

ＱＢＥｎｄ１０結合活性を保持する配列番号５８の変異体は、配列番号５８に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、例えば、配列番号５８に対して、少なくとも８５％、９０％、または９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。

【0094】

配列番号５８のＱＢＥｎｄ１０結合変異体は、上述した保存的置換を含む、アミノ酸の置換、付加、欠失、または挿入等のアミノ酸配列改変を１つ以上含んでいてもよい。

【0095】

抗体ＱＢＥｎｄ１０は、Ａｂｃａｍ社、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、およびＢｉｏ－Ｒａｄ社を含む、様々な供給元から入手可能である。この抗体の詳細は、欧州特許出願公開第３２４３８３８（Ａ１）号明細書およびＣｈｉａ－Ｙｕ Ｆａｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｐ． ２０１７ Ｍａｒ； ９： ５１－６０に提供されている。ＱＢＥｎｄ１０への結合活性を測定するための方法は、当該技術分野で周知の技術に従って容易に実施することができる。

【0096】

他の実施形態では、リンカー配列Ｌは、マーカー配列を含まない。ある実施形態では、リンカー配列Ｌは、上記に定義し説明したＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを含まない。

【0097】

そのような実施形態では、リンカー配列は、上記のように、Ｒエピトープ同士を離隔してＲエピトープのそれぞれが別個のリツキシマブ抗体分子に結合することを可能にする機能を果たす任意のアミノ酸配列であり得る。前記配列の性質は、そのアミノ酸組成および／またはアミノ酸の配列という点では、様々であってよく、限定されない。しかしながら、ある実施形態では、リンカーが可動性リンカーであってもよい。よって、リンカーは、（剛性（ｒｉｇｉｄ）リンカーとは対照的に、）リンカーに可動性を付与することが知られているアミノ酸を含んでもよく、またはこのようなアミノ酸からなってもよい。

【0098】

可動性リンカーは、当該技術分野で周知であり、記載されているリンカー配列のカテゴリーに属する。リンカー配列は、タンパク質同士もしくはタンパク質ドメイン同士を連結または結合して、例えば、融合タンパク質もしくはキメラタンパク質、または多機能タンパク質もしくは多機能ポリペプチドを作るために使用し得る配列として一般的に知られている。リンカーは異なる特徴を備えることができ、例えば、可動性、剛性、または切断可能であってもよい。タンパク質リンカーは、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６５， １３５７－１３６９において考察されており、当該文献では、可動性リンカーのカテゴリーを、剛性リンカーおよび切断可能リンカーのカテゴリーと比較している。可動性リンカーは、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ２７（１０）， ３２５－３３０、ｖａｎ Ｒｏｓｍａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５６，６５６５－６５７４、およびＣｈｉｃｈｉｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２， １５３－１６７にも記載されている。

【0099】

可動性リンカーとは、連結されたドメインまたは構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）間の動きをある程度許容するリンカーを指す。可動性リンカーは、一般的には、小さな非極性アミノ酸残基（例えば、Ｇｌｙ）または小さな極性アミノ酸残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）で構成されている。小さいサイズのアミノ酸は、可動性をもたらし、かつつながれた部分（ドメインまたは構成要素）の移動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）を付与する。極性アミノ酸を組み込むことで、水分子と水素結合を形成し、これにより、水性環境下でのリンカーの安定性を維持することができる。

【0100】

最も一般的に使用されている可動性リンカーは、主にＳｅｒ残基およびＧｌｙ残基から構成される配列（いわゆる「ＧＳリンカー」）を有する。しかしながら、多くの他の可動性リンカーも記載されており（例えば、前述のＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ，．２０１３参照）、これらのリンカーは、追加のアミノ酸、例えば、溶解性を改善し得るアミノ酸、Ｔｈｒおよび／もしくはＡｌａ、ならびに／または、Ｌｙｓおよび／もしくはＧｌｕ等を含み得る。当該技術分野で公知の報告されている任意の可動性リンカーを使用し得る。

【0101】

ＧＳリンカー、より詳細には、リンカーにおけるＧＳ（「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」）ドメインの使用により、ＧＳドメインリピートの数を変更することによってリンカーの長さを容易に変更することができ、よって、このようなリンカーは、１つの好適なクラスのリンカーである。しかしながら、可動性リンカーは、「ＧＳ」リピートに基づくものに限定されず、リンカー配列全体に分散されたＳｅｒ残基およびＧｌｙ残基を含む他のリンカーが、前述のＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．をはじめとする文献に報告されている。

【0102】

一実施形態では、リンカー配列は、Ｓｅｒ残基およびＧｌｙ残基のみからなるＧｌｙ－Ｓｅｒドメインを少なくとも１つ含む。このような実施形態では、前記リンカーは、他のアミノ酸残基を１５以下含んでもよく、好ましくは他のアミノ酸残基を１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、６以下、７以下、５以下、または４以下含んでもよい。

【0103】

Ｇｌｙ－Ｓｅｒドメインは、下記式を有してもよく、
（Ｓ）ｑ－［（Ｇ）ｍ－（Ｓ）ｍ］ｎ－（Ｇ）ｐ
式中、ｑは０または１であり、ｍは１～８の整数であり、ｎは１以上（例えば、１～８、特に１～６）の整数であり、ｐは０または１～３の整数である。

【0104】

より詳細には、Ｇｌｙ－Ｓｅｒドメインは、下記式を有してもよく、
（ｉ）Ｓ－［（Ｇ）ｍ－Ｓ］ｎ；
（ｉｉ）［（Ｇ）ｍ－Ｓ］ｎ；または
（ｉｉｉ）［（Ｇ）ｍ－Ｓ］ｎ－（Ｇ）ｐ
式中、ｍは２～８（例えば、３～４）の整数であり、ｎは１以上（例えば、１～８、特に１～６）の整数であり、ｐは０または１～３の整数である。

【0105】

代表的な例では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒドメインは、下記式を有してもよく、
Ｓ－［Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ］ｎ
式中、ｎは１以上（好ましくは、１～８、または１～６、１～５、１～４、もしくは１～３）の整数である。上記式中、配列ＧＧＧＧＳは、配列番号６３である。

【0106】

代表的な例示的リンカー配列を以下に示す。
ＥＴＳＧＧＧＧＳＲＬ（配列番号９０）
ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９１）
Ｓ（ＧＧＧＧＳ）_1-5（ここで、ＧＧＧＧＳは配列番号６３である。）

【0107】

他の実施形態では、リンカー配列は、可動性リンカー配列ではない。

【0108】

前記安全スイッチポリペプチドにおいて、リンカーＬの機能はＲ１とＲ２をつなぐことである。前記リンカーは、Ｒ１とＲ２とを直接つないでもよい。すなわち、Ｒ１のＣ末端をＲ２のＮ末端へとつないでもよい。よって、前記ポリペプチドは、Ｒ１とＲ２との間に、リンカー配列Ｌ以外の他の構成要素または配列を含まなくてもよい。前記ポリペプチドは、細胞表面に発現されるものであり、かつ、Ｒ１がＲ２につなげられてＲ１とＲ２との両方が細胞表面に発現されるようになっているため、リンカーＬは切断可能リンカーでないことがわかるであろう。

【0109】

リンカーの長さは重要ではないが、いくつかの実施形態では、より短いリンカー配列を有することが望ましい場合がある。例えば、リンカー配列の長さは、２５アミノ酸以下、好ましくは２４アミノ酸以下、２３アミノ酸以下、２２アミノ酸以下、または２１アミノ酸以下であってもよい。

【0110】

他の実施形態では、より長いリンカー配列が望まれる場合があり、例えば、ＧＳドメインの複数のリピートから構成されるか、またはＧＳドメインの複数のリピートを含んでもよく、かつ／あるいは、上述のエピトープのようなマーカー配列を含んでもよい。

【0111】

いくつかの実施形態では、リンカーの長さは、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、または６アミノ酸のいずれか１つから、２４アミノ酸、２３アミノ酸、２２アミノ酸、または２１アミノ酸のいずれか１つまでの長さであってもよい。他の実施形態では、リンカーの長さは、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、または６アミノ酸のいずれか１つから、２１アミノ酸、２０アミノ酸、１９アミノ酸、１８アミノ酸、１７アミノ酸、１６アミノ酸、または１５アミノ酸のいずれか１つまでの長さであってもよい。他の実施形態では、前記長さはこれらの範囲の中間、例えば、６～２１、６～２０、７～２０、８～２０、９～２０、１０～２０、８～１８、９～１８、１０～１８、９～１７、１０～１７、９～１６、１０～１６等であってもよい。したがって、先に列挙した整数のいずれかからなる範囲内であってもよい。

【0112】

前記安全スイッチポリペプチドはストーク配列（Ｓｔ）を含み、当該ポリペプチドが標的細胞の表面で発現すると、当該ストーク配列は、Ｒエピトープを標的細胞の表面から遠ざけるように突出させる。

【0113】

前記ストーク配列は、Ｒエピトープを細胞表面から十分に遠ざけ、例えば、リツキシマブまたは同等の抗体の結合を促進する。前記ストーク配列は、前記エピトープを細胞表面から上昇させる。

【0114】

前記ストーク配列は、実質的に直鎖状のアミノ酸配列であってもよい。ストーク配列は、Ｒエピトープを標的細胞の表面から遠ざけるのに十分な長さであればよいが、そのコード配列がベクターのパッケージングや形質導入の効率を損なわない程度の長さとすればよい。ストーク配列の長さは、例えば、３０アミノ酸から１００アミノ酸の間であってもよい。

【0115】

ストーク配列の長さは、およそ４０アミノ酸～５０アミノ酸であってもよい。前記ストーク配列は、高度にグリコシル化されていてもよい。

【0116】

前記ストーク配列は、当該ストーク配列を上記式中のエピトープＲ２に連結する、もしくはつなげるリンカー配列を含んでいてもよい。

【0117】

哺乳動物細胞の表面で発現し、かつ、本明細書に記載のストーク配列を提供するために使用できる、またはストーク配列のベースとして使用できる、多種多様なタンパク質が知られている。このような表面発現タンパク質は、ストーク配列として使用可能またはストーク配列を得るために使用可能な天然型配列を含んでいる。例えば、このようなタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をストーク配列として使用してもよいし、あるいは、細胞外および膜貫通（ＴＭ）ドメインを使用してもよく、または細胞外ドメインと膜貫通ドメイン（ＥＣＤとＴＭＤ）に、前記ストークを膜内に保持し、前記ストークが細胞表面から突出することを可能にする細胞内アンカーとして機能する細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を設けたものを使用してもよい。

【0118】

このようなタンパク質としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ｚ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＩｇＧ１、またはＩｇＧ２が挙げられる。

【0119】

よって、ストーク配列Ｓｔは、当該ストーク配列ＳｔをＲ２につなぐ任意選択のリンカー配列と、細胞外ドメインと、任意選択の膜貫通ドメインと、任意選択の細胞内ドメインとを含んでもよい。

【0120】

ある実施形態では、ストーク配列は、当該ストーク配列ＳｔをＲ２につなぐリンカー配列と、細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含んでもよい。

【0121】

ストーク配列、またはその細胞外ドメインは、下記配列を含んでもよく、または下記配列とほぼ同等の長さであってもよく、
ＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号５９）
当該配列は、ＣＤ８由来の細胞外配列である。

【0122】

上述のように、ストーク配列はさらに、膜貫通ドメインを、任意選択的に細胞内ドメインと共に含んでもよく、前記細胞内ドメインは細胞内アンカー配列として機能し得るものである。膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、細胞外ドメインと同じタンパク質由来であってもよいし、あるいは、これらの一方または両方（ｉｔ／ｔｈｅｙ）が異なるタンパク質由来であってもよい。膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、ＣＤ８から得ることができるものであってもよい。

【0123】

ストーク配列Ｓｔは、細胞外ストーク配列と、膜貫通ドメインと、ＣＤ８由来細胞内ドメインとを含んでもよい。

【0124】

膜貫通ドメインおよび細胞内アンカーを含むＣＤ８ストーク配列は、以下の配列を有してもよいし、

【化1】

または、その配列に対して、少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を有してもよく、特に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を有してもよい。

【0125】

この配列内で、下線部分が細胞外ＣＤ８ａ軸（ストーク）に相当し、中央部分が膜貫通ドメインに相当し、太字部分が細胞内ドメインに相当する。

【0126】

ストーク配列中のリンカー配列は、上述したようなリンカーであってもよい。特に、Ｓｅｒ（Ｓ）残基および／またはＧｌｙ（Ｇ）残基を含むか、またはこれら残基からなるリンカー配列であってもよい。リンカー配列（１つまたは複数）は、実質的に直鎖状であってもよい。ストークという観点では、リンカー配列は、より短い配列であってもよい。例えば、リンカー配列（１つまたは複数）は、下記の一般式を有していてもよく、
Ｓ－（Ｇ）ｎ－Ｓ
式中、ｎは２から８の間の数である。

【0127】

リンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳ（配列番号６１）を含んでいてもよいし、この配列からなってもよい。

【0128】

安全スイッチポリペプチドの代表的な例示的実施形態としては、配列番号４６および／もしくは配列番号３５または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のリツキシマブ結合エピトープを含み、該エピトープが、ＣＤ８由来の細胞外配列、膜貫通配列および細胞内配列を含むストーク配列にリンカーを介して連結された、ポリペプチドが挙げられる。特に、ストーク配列は、配列番号６０の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有していてもよい。Ｒ１とＲ２との間のリンカーＬは、上述のリンカーのいずれかであってもよい。例えば、リンカーＬは、上記のように可動性リンカーであってもよく、または上述のようにＱＢＥｎｄエピトープを含むリンカーであってもよい。ある実施形態では、リンカーは、下記の配列、

【化2】

または、この配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有していてもよい。上記配列において、エピトープＱは太字で示され、隣接している配列はスペーサーＳ１およびＳ２をそれぞれ表す。ストーク配列は、Ｒ２につながっているリンカー配列を含んでもよい。ストークにおけるリンカー配列は、ＳＧＧＧＳ（配列番号６２）であってもよい。

【0129】

したがって、安全スイッチポリペプチドは、配列番号１として示したアミノ酸配列、またはこの配列に対して少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、あるいはこのような配列からなってもよい。

【0130】

他の実施形態では、安全スイッチポリペプチドは、配列番号９２もしくは配列番号９３に記載のアミノ酸配列、またはこれらの配列に対して少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、あるいはこのような配列からなってもよい。
ＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＥＴＳＧＧＧＧＳＲＬＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号９２）
ＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号９３）
配列番号９２および９３はそれぞれ、配列番号９０または９１のリンカーをそれぞれ介して配列番号４６のリツキシマブ結合エピトープに連結された配列番号３５のリツキシマブ結合エピトープを含んでいる。

【0131】

前記ポリペプチドはまた、アミノ末端にシグナルペプチド（リーダー配列としても知られている）を含んでもよく、またはアミノ末端のシグナルペプチドと共に発現されてもよい。多数の異なるシグナル配列が当該技術分野で公知であり、報告されており、シグナルペプチドを選択することは日常的に行われている事項であると思われる。シグナルペプチドは、例えば、配列番号６５（ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤ）として示した配列を含んでもよいし、または当該配列からなってもよい。

【0132】

このようなシグナルペプチドと配列番号１のアミノ酸配列とを含むポリペプチドは、配列番号１０で表される。このようなシグナルペプチドと配列番号９２のアミノ酸配列とを含むポリペプチドは、配列番号９４で表される。このようなシグナルペプチドと配列番号９３のアミノ酸配列とを含むポリペプチドは、配列番号９５で表される。

【0133】

前記ポリペプチドが標的細胞（当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が導入された細胞）によって発現されると、前記ポリペプチドは細胞表面へのトランスロケーションのために細胞内で処理され、前記シグナルペプチドが切断され、成熟した安全スイッチポリペプチド産物を生じる。

【0134】

安全スイッチポリペプチドは、配列番号１、９２、または９３のポリペプチドの機能的活性を保持する限り、配列番号１、９２、または９３として示した配列に対して少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％または９０％）の同一性を有する、配列番号１、９２、または９３として示した配列の変異体を含んでもよく、あるいはこのような変異体からなってもよい。例えば、前記変異体の配列は、（ｉ）リツキシマブに結合し、かつ（ｉｉ）細胞の表面に発現すると、リツキシマブの存在下で当該細胞の死滅を誘発する、ものとする。さらに、配列番号１の変異体の場合は、前記変異体の配列は、抗体ＱＢＥｎｄ１０に結合するものとする。

【0135】

配列同一性の比較は、目視で行ってもよいし、または、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ等、容易に入手可能な配列比較プログラムを利用して行ってもよい。

【0136】

ある実施形態では、安全スイッチポリペプチドは、先に挙げて説明した要素Ｒ１、Ｌ、Ｒ２、およびＳｔのみからなる。しかしながら、他の実施形態では、当該ポリペプチドは、さらなる配列またはドメインをさらに含んでもよい。例えば、リンカーＬがマーカー配列を含有しない場合、または２つ以上のマーカーが望ましい場合は、別のマーカー配列が他の場所に含まれてもよく、例えば、マーカー配列は、ストーク配列に含まれてもよいし、あるいはストークとＲ２との間に導入されてもよい。

【0137】

安全スイッチポリペプチドは、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０６４０５３号明細書に記載されており、その内容を参照により本明細書に組み込む。同文献に記載されている安全スイッチポリペプチドはいずれも本明細書中で使用することができる。

【0138】

前記核酸分子は、ＦＯＸＰ３をコードするヌクレオチド配列（前記第２のヌクレオチド配列）を細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）に導入することによって、当該細胞においてＦＯＸＰ３発現を増加させるように設計される。「ＦＯＸＰ３」という用語は「ＦＯＸＰ３ポリペプチド」という用語と同義である。よって、前記核酸分子、ならびに前記核酸分子を含む構築物およびベクターは、細胞において、例えば、ＴｒｅｇまたはＣＤ４＋細胞において、ＦＯＸＰ３を増加させるための手段を提供する。さらに、前述のように、本発明の核酸分子内の安全スイッチ、ＦＯＸＰ３およびＣＡＲをコードする各ヌクレオチド配列の順序により、細胞内で当該核酸分子からのＦＯＸＰ３の発現が増強される。したがって、本発明の核酸分子は、ＦＯＸＰ３の発現（ならびに安全スイッチおよびＣＡＲの発現）をもたらし、それにより細胞内でのＦＯＸＰ３の発現レベルを増加させるものであるが、さらに、前記ヌクレオチド配列の順序は、同じ３つのポリペプチド産物をコードする他の核酸分子と比較して、核酸分子内で異なる順序で存在するヌクレオチド配列からのものよりもＦＯＸＰ３発現の増強をもたらす。よって、本発明の核酸分子内の安全スイッチ、ＦＯＸＰ３およびＣＡＲをコードするヌクレオチド配列の順序は、当該核酸分子が導入された細胞内でのＦＯＸＰ３の発現レベルを最適に増加させる。

【0139】

「ＦＯＸＰ３」は、フォークヘッドボックスＰ３タンパク質の略称である。ＦＯＸＰ３は、転写因子のＦＯＸタンパク質ファミリーのメンバーであり、制御性Ｔ細胞の発達および機能における調節経路の主要制御因子として機能する。本明細書中で使用する「ＦＯＸＰ３」は、ＦＯＸＰ３の変異体、アイソフォーム、および機能的断片を包含する。

【0140】

「ＦＯＸＰ３発現を増加させる」とは、ある細胞（または細胞の集団）におけるＦＯＸＰ３ ｍＲＮＡおよび／またはＦＯＸＰ３タンパク質のレベルを、前記核酸分子、構築物またはベクターの導入によって改変されていない対応する細胞（または細胞の集団）と比較して増加させることを意味する。例えば、本発明に係る改変を加えた細胞（またはこのような細胞の集団）におけるＦＯＸＰ３ ｍＲＮＡおよび／またはＦＯＸＰ３タンパク質のレベルは、本発明に係る改変を加えていない対応する細胞（またはこのような細胞の集団）におけるレベルの、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍に高くなっていてもよい。好ましくは、前記細胞はＴｒｅｇである、または、前記細胞の集団はＴｒｅｇの集団である。好適には、改変細胞（またはこのような細胞の集団）におけるＦＯＸＰ３ ｍＲＮＡおよび／またはＦＯＸＰ３タンパク質のレベルは、そのように改変されていない対応する細胞（またはこのような細胞の集団）におけるレベルの、少なくとも１．５倍、２倍または５倍、高くてもよい。好ましくは、前記細胞はＴｒｅｇである、または、前記細胞の集団はＴｒｅｇの集団である。

【0141】

「核酸分子からのＦＯＸＰ３発現を増強する（または、代替的な見方によれば、増加させるもしくは改善する）」とは、前記核酸分子（外因性核酸分子）（または、構築物もしくはベクター）（すなわち、本発明に係る核酸分子）を含む細胞（または、細胞の集団）（例えば、ＴｒｅｇもしくはＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔｒｅｇ）におけるＦＯＸＰ３ ｍＲＮＡおよび／またはＦＯＸＰ３タンパク質のレベルを、（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードするヌクレオチド配列および（ｉｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含むが、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が５’から３’へ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の順序で配置されていない核酸分子、構築物、またはベクターの導入によって改変された対応する細胞（または細胞の集団）と比較して、増加させることを意味する。

【0142】

前述のように、核酸分子からのＦＯＸＰ３の発現の増強、増加、または改善は、核酸分子内の安全スイッチポリペプチド、ＦＯＸＰ３およびＣＡＲをコードするヌクレオチド配列の順序付けに関連するため、本発明の核酸分子を含む細胞は、ヌクレオチド配列が核酸分子内で異なる順序で設けられた核酸分子を含む同じ細胞型と比較すると、ＦＯＸＰ３ ｍＲＮＡおよび／またはＦＯＸＰ３タンパク質のレベルが増強されている。

【0143】

特に、対応する比較細胞に導入される核酸、構築物、またはベクターは、５’から３’へ以下を含んでもよい。
１）（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードするヌクレオチド配列、（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列
２）（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列、および（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
３）（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードするヌクレオチド配列
４）（ｉｉｉ）ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードするヌクレオチド配列、および（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
５）（ｉｉｉ）ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列、（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードするヌクレオチド配列

【0144】

特に、対応する比較細胞に導入される核酸分子、構築物、またはベクターは、本発明の細胞に導入される核酸分子、構築物、またはベクターと同じ安全スイッチポリペプチド、ＦＯＸＰ３ポリペプチド、およびＣＡＲポリペプチドをコードするものであってもよい。

【0145】

例えば、本発明に係る改変を加えた細胞（またはこのような細胞の集団）におけるＦＯＸＰ３ ｍＲＮＡおよび／またはＦＯＸＰ３タンパク質のレベルは、（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードするヌクレオチド配列および（ｉｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含むが、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が５’から３’へ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の順序で配置されていない核酸分子、構築物、ベクターの導入によって改変された対応する細胞（またはこのような細胞の集団）におけるレベルの、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍に高くなっていてもよい。好ましくは、前記細胞はＴｒｅｇである、または、前記細胞の集団はＴｒｅｇの集団である。好適には、改変細胞（またはこのような細胞の集団）におけるＦＯＸＰ３ ｍＲＮＡおよび／またはＦＯＸＰ３タンパク質のレベルは、（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードするヌクレオチド配列および（ｉｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含むが、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が５’から３’へ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の順序で配置されていない核酸分子、構築物、またはベクターの導入によって改変された対応する細胞（またはこのような細胞の集団）におけるレベルの、少なくとも１．５倍、２倍、または５倍、高くてもよい。好ましくは、前記細胞はＴｒｅｇである、または、前記細胞の集団はＴｒｅｇの集団である。

【0146】

特定のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルを測定するための技術は、当該技術分野において周知である。Ｔｒｅｇ等の細胞の集団におけるｍＲＮＡのレベルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＰｒｉｍｅＦｌｏｗ ＲＮＡアッセイ、ノーザンブロッティング、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、または定量的ポリメラーゼ連鎖反応法（ｑＰＣＲ）等の技術によって測定してもよい。細胞の集団におけるタンパク質のレベルは、フローサイトメトリー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）、ウェスタンブロッティング、または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等の技術によって測定してもよい。

【0147】

「ＦＯＸＰ３ポリペプチド」は、ＦＯＸＰ３活性を有するポリペプチド、すなわち、ＦＯＸＰ３標的ＤＮＡに結合し、かつＴｒｅｇの発達と機能を調節する転写因子として機能することができるポリペプチドである。特に、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、野生型ＦＯＸＰ３（配列番号２）と同じまたは類似の活性を有していてもよく、例えば、野生型ＦＯＸＰ３ポリペプチドの活性の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、または１５０％を有していてもよい。よって、本明細書に記載の核酸、構築物またはベクター中の第２のヌクレオチド配列によってコードされるＦＯＸＰ３ポリペプチドは、野生型ＦＯＸＰ３と比較して活性が増加していてもよく、減少していてもよい。転写因子活性を測定するための技術は、当該技術分野において周知である。例えば、転写因子ＤＮＡ結合活性を、ＣｈＩＰによって測定してもよい。転写因子の転写調節活性を、それが調節する遺伝子の発現レベルを定量化することによって測定してもよい。遺伝子発現は、ノーザンブロッティング、ＳＡＧＥ、ｑＰＣＲ、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ウェスタンブロッティング、またはＥＬＩＳＡ等の技術を使用して、遺伝子から産生されるｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルを測定することによって定量化してもよい。ＦＯＸＰ３によって調節される遺伝子としては、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＦＮ－γ等のサイトカインが挙げられる（Ｓｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００６， ２４： ２０９－２６、参照により本明細書に組み込む）。以下で詳細に述べるように、ＦＯＸＰ３またはＦＯＸＰ３ポリペプチドは、その機能的断片、変異体およびアイソフォームを含み、例えば配列番号２の、機能的断片、変異体およびアイソフォームを含む。

【0148】

「ＦＯＸＰ３の機能的断片」とは、ＦＯＸＰ３ポリペプチドの一部もしくは領域、またはＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）の一部もしくは領域であって、全長ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと同じまたは類似の活性を有するものを指し得る。前記機能的断片は、全長ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性の、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％を有していてもよい。当業者であれば、ＦＯＸＰ３の既知の構造的および機能的特徴に基づいて機能的断片を生成することができるであろう。これらは、例えば、Ｓｏｎｇ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ．， ２０１２． Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ， １（６）， ｐｐ．６６５－６７５；Ｌｏｐｅｓ， Ｊ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， ２００６． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １７７（５）， ｐｐ．３１３３－３１４２；およびＬｏｚａｎｏ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ， ２０１３． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ３， ｐ．２９４に記載されている。さらに、Ｎ末端およびＣ末端が短縮されたＦＯＸＰ３断片が、国際公開第２０１９／２４１５４９号パンフレット（参照により本明細書に組み込む）に記載されており、例えば後述する配列番号６の配列を有する。

【0149】

「ＦＯＸＰ３変異体」は、ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号２、に対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の同一性、好ましくは、少なくとも９５％または少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を含んでもよい。ＦＯＸＰ３変異体は、野生型ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと同じまたは類似の活性を有していてもよく、例えば、野生型ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％または１５０％を有していてもよい。当業者であれば、ＦＯＸＰ３の既知の構造的および機能的特徴に基づいて、かつ／または保存的置換を使用して、ＦＯＸＰ３変異体を生成することができるであろう。ＦＯＸＰ３変異体は、野生型ＦＯＸＰ３と比較して、Ｔｒｅｇ細胞内の代謝回転時間（もしくは分解速度）が類似または同じであってもよく、例えば、Ｔｒｅｇにおける野生型ＦＯＸＰ３の代謝回転時間（もしくは分解速度）の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％であってもよい。いくつかのＦＯＸＰ３変異体は、野生型ＦＯＸＰ３と比較して、代謝回転時間（もしくは分解速度）が減少していてもよく、例えば、配列番号２のアミノ酸４１８位および／または４２２位にアミノ酸置換を有するＦＯＸＰ３変異体、例えば、国際公開第２０１９／２４１５４９号パンフレット（参照により本明細書に組み込む）に記載のＳ４１８Ｅおよび／またはＳ４２２Ａが挙げられ、配列番号３～５に記載する。これらの配列番号３～５は、ａａ４１８変異体、ａａ４２２変異体、ならびにａａ４１８およびａａ４２２変異体をそれぞれ表す。

【0150】

好適には、本明細書に記載の核酸分子、構築物またはベクターよってコードされるＦＯＸＰ３ポリペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッションＱ９ＢＺＳ１（配列番号２）等のヒトＦＯＸＰ３のポリペプチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含んでもよく、あるいは、このようなポリペプチド配列またはその機能的断片もしくは変異体からなってもよい。

【0151】

本発明のいくつかの実施形態では、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列またはその機能的断片を含むか、あるいは、このようなアミノ酸配列またはその機能的断片からなる。好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列またはその機能的断片を含むか、あるいは、このようなアミノ酸配列またはその機能的断片からなる。いくつかの実施形態では、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２またはその機能的断片を含むか、あるいは、配列番号２またはその機能的断片からなる。

【0152】

いくつかの実施形態では、上述のとおり、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に記載のように、配列番号２の残基４１８および／または残基４２２にミューテーションを含んでもよい。

【0153】

本発明のいくつかの実施形態では、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドがＮ末端および／またはＣ末端で短縮され、それにより機能的断片が得られてもよい。特に、Ｎ末端およびＣ末端が短縮されたＦＯＸＰ３の機能的断片は、配列番号６のアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するその機能的変異体を含んでもよく、あるいは、このようなアミノ酸またはその機能的変異体からなってもよい。

【0154】

好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２の変異体、例えば自然変異体であってもよい。好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２のアイソフォームである。例えば、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２に対して、アミノ酸７２位～１０６位の欠失を含んでいてもよい。あるいは、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２に対して、アミノ酸２４６位～２７２位の欠失を含んでいてもよい。

【0155】

好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号７またはその機能的断片を含む。配列番号７は、例示的なＦＯＸＰ３ポリペプチドを表す。

【0156】

好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号７に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列またはその機能的断片を含むか、あるいは、このようなアミノ酸配列またはその機能的断片からなる。好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列またはその機能的断片を含むか、あるいは、このようなアミノ酸配列またはその機能的断片からなる。いくつかの実施形態では、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号７またはその機能的断片を含むか、あるいは、配列番号７またはその機能的断片からなる。

【0157】

好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号７の変異体、例えば自然変異体であってもよい。好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号７のアイソフォームまたはその機能的断片である。例えば、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号７に対して、アミノ酸７２位～１０６位の欠失を含んでいてもよい。あるいは、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号７に対して、アミノ酸２４６位～２７２位の欠失を含んでいてもよい。

【0158】

好適には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８に記載のヌクレオチド配列を含むか、または、配列番号８に記載のヌクレオチド配列からなる。配列番号８は、例示的なＦＯＸＰ３ヌクレオチド配列を表す。

【0159】

本発明のいくつかの実施形態では、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または機能的ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするその断片を含む。好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列、または機能的ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするその断片を含む。本発明のいくつかの実施形態では、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８または機能的ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするその断片を含むか、あるいは、配列番号８または機能的ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするその断片からなる。
好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号９に記載のポリヌクレオチド配列を含むか、または、配列番号９に記載のポリヌクレオチド配列からなる。配列番号９は、別の例示的なＦＯＸＰ３ヌクレオチドを表す。

【0160】

本発明のいくつかの実施形態では、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または機能的ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするその断片を含む。好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列、または機能的ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするその断片を含む。本発明のいくつかの実施形態では、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９または機能的ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするその断片を含むか、あるいは、配列番号９または機能的ＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードするその断片からなる。

【0161】

好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化されていてもよい。好適には、前記ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドは、ヒトの細胞での発現のためにコドン最適化されていてもよい。

【0162】

前記第３のヌクレオチド配列によってコードされる、第３の構成要素は、ＣＡＲである。本明細書中で使用する「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、抗原特異性を細胞（例えばＴｒｅｇ）に付与できる、操作された受容体を指す。ＣＡＲは、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体としても知られている。ＣＡＲは、典型的には、本明細書において抗原結合ドメインと称する抗原特異的ターゲティング領域を含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の共刺激ドメインを任意選択的に含むエンドドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。抗原結合ドメインは、典型的には、ヒンジドメインによって膜貫通ドメインに結合される。ＣＡＲおよびＣＡＲが含み得る種々のドメインの設計は、当該技術分野において周知である。

【0163】

ＣＡＲがその標的抗原に結合すると、ＣＡＲが発現している細胞に活性化シグナルが伝達される。これにより、ＣＡＲは、操作された細胞の特異性を、標的抗原に向けさせ、特に、標的抗原を発現している細胞に向けさせる。

【0164】

ＣＡＲの抗原結合ドメインは、所望の標的抗原、より一般的には所望の標的分子に結合する（すなわち、親和性を有する）任意のタンパク質もしくはポリペプチドに由来してもよく、またはこのようなタンパク質もしくはポリペプチドから得られてもよい。これは、例えば、リガンドもしくは受容体、または、標的分子に対する生理学的結合タンパク質、もしくはその一部、または、合成タンパク質もしくは誘導タンパク質（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）であってもよい。標的分子は、一般には、細胞、例えば、標的細胞または標的細胞近傍の細胞（バイスタンダー効果のため）の表面に発現していればよく、必ずしもそうである必要はない。抗原結合ドメインの性質および特異性に応じて、ＣＡＲは、可溶性分子を認識してもよく、例えば、抗原結合ドメインが細胞受容体に基づくかまたは由来する場合に、可溶性分子を認識してもよい。

【0165】

抗原結合ドメインは、最も一般的には抗体可変鎖に由来する（例えば、一般にｓｃＦｖの形態をとる）が、Ｔ細胞受容体可変ドメイン、または、上記のように、リガンドもしくは他の結合分子のための受容体等の、他の分子から生成されてもよい。

【0166】

ＣＡＲは、典型的には、シグナル配列（リーダー配列としても知られる）を含む、ポリペプチドとして発現し、特に、ＣＡＲを細胞の原形質膜に向かわせるシグナル配列を含むポリペプチドとして発現する。これは、一般に、概して抗原結合ドメインの上流で、抗原結合ドメインの隣または近くに配置される。よって、ＣＡＲの細胞外ドメイン、つまりエクトドメインは、シグナル配列と抗原結合ドメインとを含んでいてもよい。

【0167】

抗原結合ドメインは、ＣＡＲに、目的の所定の抗原に結合する能力を与える。抗原結合ドメインは、臨床的に目的とする抗原、または疾患部位の抗原を標的とすることが好ましい。

【0168】

上記のように、抗原結合ドメインは、生体分子（例えば、細胞表面受容体またはその構成要素）を特異的に認識して結合する能力を有する任意のタンパク質またはペプチドであってもよい。抗原結合ドメインは、目的の生体分子に対する任意の自然発生の（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）結合パートナー、合成結合パートナー、半合成結合パートナー、または組換え産生結合パートナーを含む。例示的な抗原特異的ターゲティングドメインとしては、抗体または抗体断片もしくは誘導体、受容体の細胞外ドメイン、細胞表面分子／細胞表面受容体に対するリガンド、またはその受容体結合ドメイン、および、腫瘍結合タンパク質が挙げられる。後述するように、抗原特異的ターゲティングドメインは、好ましくは抗体または抗体由来であってもよく、他の抗原特異的ターゲティングドメインも包含され、例えば、抗原特異的ペプチドとＭＨＣまたはＨＬＡとの組み合わせであって、移植部位、炎症部位または疾患部位において活性なＴｃｏｎ細胞のＴＣＲに結合することができる組み合わせから形成される抗原特異的ターゲティングドメインが包含される。

【0169】

ある実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体であるか、または抗体由来である。抗体由来の結合ドメインとは、抗体の断片、または抗体の１つ以上の断片の遺伝子操作産物であり得、断片は抗原との結合に関与する。例として、可変領域（Ｆｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）₂、または、単鎖において（例えば、ＳｃＦｖとして）どちらかの向きで（例えば、Ｖ_L－Ｖ_HまたはＶ_H－Ｖ_L）結合することができる軽鎖可変領域および重鎖可変領域が挙げられる。Ｖ_Lおよび／またはＶ_H配列は改変されていてもよい。特に、フレームワーク領域が改変されていてもよい（例えば、置換されていてもよく、例えば抗原結合ドメインをヒト化するために置換されていてもよい）。他の例としては、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、ラクダ抗体（ＶＨＨ）、および単一ドメイン抗体（ｓＡｂ）が挙げられる。

【0170】

好ましい実施形態において、前記結合ドメインは単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、マウスｓｃＦｖであってもよく、ヒトｓｃＦｖであってもよく、ヒト化ｓｃＦｖであってもよい。

【0171】

抗体またはその抗原結合断片に関して「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の中の超可変ループ（ｈｉｇｈｌｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐ）をいう。ＣＤＲは、抗原の高次構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）と相互作用でき、抗原への結合を大きく決定する（ただし、いくつかのフレームワーク領域が結合に関与することが知られている）。重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ３つのＣＤＲを含有する。「重鎖可変領域」または「ＶＨ」とは、フレームワーク領域として知られるフランキングストレッチ（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）間に挿入された３つのＣＤＲを含有する抗体の重鎖の断片をいう。フレームワーク領域は、ＣＤＲよりもよく保存され、ＣＤＲを支持する足場を形成する。「軽鎖可変領域」または「ＶＬ」とは、フレームワーク領域間に挿入された３つのＣＤＲを含有する抗体の軽鎖の断片をいう。
「Ｆｖ」とは、完全な抗原結合部位をもつ、抗体の最も小さい断片をいう。Ｆｖ断片は、単一の重鎖の可変領域に結合した単一の軽鎖の可変領域からなる。「単鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」とは、直接またはペプチドリンカー配列を介してどちらかの向きで互いにつながった軽鎖可変領域および重鎖可変領域からなる、操作された抗体をいう。

【0172】

所定の抗原に特異的に結合する抗体は、当該技術分野で周知の方法を用いて調製できる。このような方法には、ファージディスプレイ、ヒト抗体もしくはヒト化抗体を生成する方法、またはヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニック動物もしくは植物を使用する方法が含まれる。部分的合成抗体または完全合成抗体のファージディスプレイライブラリーが利用可能であり、標的分子に結合できる抗体またはその断片を求めてスクリーニングすることができる。ヒト抗体のファージディスプレイライブラリーも利用可能である。同定後、前記抗体をコードするアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を単離および／または決定することができる。

【0173】

ＣＡＲは、任意の所望の標的抗原または標的分子に向けられてもよい。この抗原または分子は、意図する療法や、治療が望まれる状態に応じて、選択してもよい。例えば、特定の状態に関連付けられる抗原または分子であってもよく、当該状態を治療するために標的としたい細胞に関連付けられる抗原または分子であってもよい。典型的には、前記抗原または分子は、細胞表面抗原または細胞表面分子である。

【0174】

「に対して向けられた（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ）」という用語は、「に特異的な（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ）」または「抗（ａｎｔｉ）」と同義である。別の言い方をすれば、ＣＡＲは標的分子を認識する。したがって、指定された抗原または所与の抗原、つまり標的に対してＣＡＲが特異的に結合可能であることを意味する。特に、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、標的分子または標的抗原に対して特異的に結合可能である（より詳細には、ＣＡＲが細胞の表面、特に免疫エフェクター細胞の表面に発現した場合）。特異的結合は、非標的分子または非標的抗原に対する非特異的結合と区別することができる。よって、ＣＡＲを発現している細胞は、標的分子または標的抗原を発現している標的細胞、特に、標的抗原または標的分子を細胞表面に発現している標的細胞に対して特異的に結合するように向けられる、またはリダイレクトされる。

【0175】

本ＣＡＲの標的とされ得る抗原としては、移植された臓器、自己免疫疾患、アレルギー疾患および炎症性疾患（例えば、神経変性疾患）に関連付けられる細胞上に発現した抗原が挙げられるが、これらに限定されない。核酸分子を発現するように操作された細胞がＴｒｅｇ細胞またはその前駆体である場合、Ｔｒｅｇ細胞のバイスタンダー効果により、前記抗原が、移植部位、炎症部位または疾患部位に単に存在および／または発現しているものであってもよいことは当業者に理解されるであろう。

【0176】

神経変性疾患に関連付けられる細胞上に発現する抗原としては、グリア細胞上に提示されるもの、例えば、ＭＯＧが挙げられる。

【0177】

臓器移植に関連付けられる抗原および／または移植された臓器に関連付けられる細胞としては、移植された臓器には存在するが患者には存在しないＨＬＡ抗原、または、移植拒絶反応時に発現が上昇する抗原、たとえばＣＣＬ１９、ＭＭＰ９、ＳＬＣ１Ａ３、ＭＭＰ７、ＨＭＭＲ、ＴＯＰ２Ａ、ＧＰＮＭＢ、ＰＬＡ２Ｇ７、ＣＸＣＬ９、ＦＡＢＰ５、ＧＢＰ２、ＣＤ７４、ＣＸＣＬ１０、ＵＢＤ、ＣＤ２７、ＣＤ４８、ＣＸＣＬ１１等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0178】

ある実施形態では、ＣＡＲは、ＨＬＡ抗原、特にＨＬＡ－Ａ２抗原に対して向けられたものである。

【0179】

ある実施形態では、ＣＡＲは、ＭＨＣ ＩＩに対して向けられたものではない。

【0180】

このような抗原に対する抗体は当該技術分野において公知であり、好都合なことに、公知のまたは入手可能な抗体に基づいてｓｃＦｖを取得または生成することができる。この点に関して、ＶＨ配列およびＶＬ配列、ならびにＣＤＲ配列は、このような抗体結合ドメインの調製を支援するために公開されており、例えば国際公開第２０２０／０４４０５５号パンフレットにおいて、公開されている。この文献の開示を参照により本明細書に組み込む。国際公開第２０２０／０４４０５５号パンフレットに開示されている抗原結合ドメイン、またはＣＤＲ配列、ＶＨ配列、および／もしくはＶＬ配列のいずれをも使用することができる。

【0181】

例として、ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２（本明細書中、ＨＬＡ－Ａ２をＨＬＡ－Ａ^*０２、ＨＬＡ－Ａ０２、およびＨＬＡ－Ａ^*２ともいう）に結合可能な抗原結合ドメインを含んでいてもよい。ＨＬＡ－Ａ^*０２は、ＨＬＡ－Ａ座にある、１つの特定のクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）対立遺伝子群である。

【0182】

抗原認識ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２内の１つ以上の領域またはエピトープに結合してもよく、好適には特異的に結合してもよい。抗原決定基としても知られるエピトープは、抗原認識ドメイン（例えば、抗体）によって認識される抗原の一部である。言い換えれば、エピトープは、抗体が結合する抗原の特定の部分である。好適には、抗原認識ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２内の１つの領域またはエピトープに結合し、好適には特異的に結合する。

【0183】

抗原認識ドメインは、抗原、例えばＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体から予測できる少なくとも１個のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）（または、このような予測されたＣＤＲの変異体（例えば、１個、２個、もしくは３個のアミノ酸置換を有する変異体））を含んでもよい。３個以下のＣＤＲ領域（例えば、単一のＣＤＲまたはさらにはその一部）を含有する分子は、ＣＤＲの由来元である抗体の抗原結合活性を保持することが可能であり得ることを理解されたい。２個のＣＤＲ領域を含有する分子は、当該技術分野において、標的抗原、例えば、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）の形態の標的抗原に結合可能であると記載されている（Ｖａｕｇｈａｎ ａｎｄ Ｓｏｌｌａｚｚｏ， ２００１， Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ， ４， ４１７－４３０）。標的に対する強力な結合活性を示すことができる、単一のＣＤＲを含有する分子が記載されている（Ｎｉｃａｉｓｅ ｅｔ ａｌ， ２００４， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １３： １８８２－９１）。

【0184】

この点において、抗原結合ドメインは、１つ以上の可変重鎖ＣＤＲ、例えば、１個、２個、または３個の可変重鎖ＣＤＲを含んでもよい。あるいは、またはさらに、抗原結合ドメインは、１つ以上の可変軽鎖ＣＤＲ、例えば、１個、２個、または３個の可変軽鎖ＣＤＲを含んでもよい。抗原結合ドメインは、３個の重鎖ＣＤＲおよび／または３個の軽鎖ＣＤＲ（より詳細には、３個のＣＤＲを含む重鎖可変領域および／または３個のＣＤＲを含む軽鎖可変領域）を含んでもよく、ここで、少なくとも１個のＣＤＲ、好ましくは全てのＣＤＲが、抗原、例えばＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体に由来するものであってもよく、国際公開第２０２０／０４４０５５号パンフレットに開示されているＣＤＲ配列のうちの１つから選択されたものであってもよい。

【0185】

抗原結合ドメインは、可変重鎖ＣＤＲと可変軽鎖ＣＤＲとの任意の組み合わせを含んでもよく、例えば、１個の可変重鎖ＣＤＲと１個の可変軽鎖ＣＤＲとの組み合わせ、２個の可変重鎖ＣＤＲと１個の可変軽鎖ＣＤＲとの組み合わせ、２個の可変重鎖ＣＤＲと２個の可変軽鎖ＣＤＲとの組み合わせ、３個の可変重鎖ＣＤＲと１個または２個の可変軽鎖ＣＤＲとの組み合わせ、１個の可変重鎖ＣＤＲと２個または３個の可変軽鎖ＣＤＲとの組み合わせ、３個の可変重鎖ＣＤＲと３個の可変軽鎖ＣＤＲとの組み合わせを含んでもよい。好ましくは、前記抗原結合ドメインは、３個の可変重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）ならびに／または３個の可変軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）の組み合わせを含んでもよい。

【0186】

抗原結合ドメイン内に存在する１個以上のＣＤＲは、前記ドメインが所望の結合活性を有している限り、全てが同じ抗体由来である必要はない。よって、１個のＣＤＲが、抗原、例えばＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体の重鎖または軽鎖から予測され、その他のＣＤＲが、同じ抗原（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）に結合する異なる抗体から予測されてもよい。この場合、ＣＤＲ３は、抗原、例えばＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体から予測されることが好ましいであろう。しかしながら、特に、２個以上のＣＤＲが抗原結合ドメインに存在する場合、それらのＣＤＲは、同じ抗原、例えばＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体から予測されることが好ましい。ＣＤＲの組み合わせとしては、異なる抗体に由来するＣＤＲの組み合わせが使用されてもよく、特に、同じ所望の領域またはエピトープに結合する抗体に由来するＣＤＲの組み合わせが使用されてもよい。

【0187】

特に好ましい実施形態において、抗原結合ドメインは、抗原、例えばＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体の可変重鎖配列から予測される３個のＣＤＲ、および／または、抗原、例えばＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体（好ましくは同じ抗体）の可変軽鎖配列から予測される３個のＣＤＲを含む。
ある実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１１、１２、および１３にそれぞれ記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３配列と、配列番号１４、１５、および１６にそれぞれ記載のＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列とを含み、あるいは、前記ＣＤＲは、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、または１６のいずれか１つ以上に記載のＣＤＲ配列に対して１個～３個、特に、１個または２個のアミノ酸配列改変を含んでもよい。

【0188】

より詳細には、そのような実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号１７に記載の配列または当該配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むＶＨドメインと、配列番号１８に記載の配列または当該配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むＶＬドメインとを含む。
別の実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号２０、２１、および２２にそれぞれ記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３配列と、配列番号２３、２４、および２５にそれぞれ記載のＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列とを含み、あるいは、前記ＣＤＲは、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、または２５のいずれか１つ以上に記載のＣＤＲ配列に対して１個～３個、特に、１個または２個のアミノ酸配列改変を含んでもよい。

【0189】

ＣＤＲがアミノ酸配列改変を含む場合、これは、上述の配列番号に記載のＣＤＲ配列のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換であってもよい。より詳細には、前記改変は、アミノ酸置換、例えば、上記に記載したもの等の保存的アミノ酸置換であってもよい。ＣＤＲが長いほど、許容されるアミノ酸残基の改変が多くなる。５アミノ酸残基長または７アミノ酸残基長のＣＤＲの場合、１残基または２残基、例えば１残基が改変対象となり得る。一般に、任意の特定のＣＤＲ配列に対して０個、１個、２個、または３個の改変が加えられ得る。さらに、ある実施形態では、ＣＤＲ１とＣＤＲ２とが改変されて、ＣＤＲ３が改変されなくてもよい。別の実施形態では、３個のＣＤＲの全てが改変されてもよい。別の実施形態では、３個のＣＤＲの全てが改変されない。

【0190】

より詳細には、そのような実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号２６に記載の配列または当該配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むＶＨドメインと、配列番号２７に記載の配列または当該配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0191】

前記抗原結合ドメインは、上記のＶＨドメイン配列とＶＬドメイン配列とをどちらかの順序、例えばＶＨ－ＶＬの順序で含むｓｃＦＶの形態であってもよい。ＶＨ配列とＶＬ配列とはリンカー配列によって連結されてもよい。

【0192】

好適なリンカーは、容易に選択することができ、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）から３０アミノ酸までなどの任意の好適な長さとすることができる。例えば、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、または１０アミノ酸のいずれか１つから、１２アミノ酸、１５アミノ酸、１８アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、２５アミノ酸、または３０アミノ酸のいずれか１つまでの長さであってもよく、例えば、５～３０、５～２５、６～２５、１０～１５、１２～２５、１５～２５などであってもよい。
リンカーは、例えば、安全スイッチポリペプチドに関連して上記に述べたようなリンカーであってもよい。例示的な可動性リンカーとしては、上述のように、グリシンポリマー（Ｇ）、グリシン－セリンポリマー（ｎは１以上の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、および当該技術分野において公知の他の可動性リンカーが挙げられる。リンカーは、上述のように１個以上の「ＧＳ」ドメインを含んでいてもよい。

【0193】

したがって、一実施形態では、抗原結合ドメインは、配列（Ｘ）ｎ（Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１５から２５の間の整数である）のリンカーを介して互いに連結された配列番号１７のＶＨ配列と配列番号１８のＶＬ配列とを含む配列番号１９に記載の配列を含んでもよく、または配列番号１９に記載の配列からなっていてもよい。特定の実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号１９の配列に対応する配列番号８８に記載の配列を含むか、または、このような配列からなり、前記配列のリンカーは配列番号８９（ＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴ）の配列を有する。抗原結合ドメインは、配列番号１９または８８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列番号１９または８８の変異体である配列を含んでもよく、または、このような配列からなってもよい。

【0194】

別の実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号２８に記載の配列または当該配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するその変異体を含んでもよい。

【0195】

変異体ＶＨ配列、変異体ＶＬ配列、および変異体抗原結合ドメイン配列をはじめとする本明細書中に開示および記載する変異体配列は、指定された配列番号に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。

【0196】

また、好ましくは、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、特に抗原結合ドメインを細胞表面から遠ざけて保持するためのヒンジドメインも含み、かつ、膜貫通ドメインを含む。ヒンジドメインおよび膜貫通ドメインは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型の膜貫通タンパク質のうちのいずれかをはじめとする、ヒンジドメインおよび／または膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質に由来するヒンジ配列および膜貫通配列を含み得る。典型的には、ヒンジは、ＣＤ８由来、特にＣＤ８アルファ由来であってもよい。

【0197】

ＣＡＲの膜貫通ドメインは、人工疎水性配列も含み得る。ＣＡＲの膜貫通ドメインは、二量体化しないように選択してもよい。さらなる膜貫通ドメインは当業者に明らかであろう。ＣＡＲ構築物において使用される膜貫通（ＴＭ）領域の例としては、以下が挙げられる：１）ＣＤ２８ ＴＭ領域（Ｐｕｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２００５， Ｎｏｖ；１２（５）：９３３－４１； Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ， ＣＣＲ， ２００７， Ｓｅｐ １５；１３（１８ Ｐｔ １）：５４２６－３５； Ｃａｓｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ， ２０１３， Ｎｏｖ １４；１２２（２０）：３４６１－７２．）、２）ＯＸ４０ ＴＭ領域（Ｐｕｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２００５， Ｎｏｖ；１２（５）：９３３－４１）、３）４１ＢＢ ＴＭ領域（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ， ＣＣＲ， ２００７， Ｓｅｐ １５；１３（１８ Ｐｔ １）：５４２６－３５）、４）ＣＤ３ゼータＴＭ領域（Ｐｕｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２００５， Ｎｏｖ；１２（５）：９３３－４１； Ｓａｖｏｌｄｏ Ｂ， Ｂｌｏｏｄ， ２００９， Ｊｕｎ １８；１１３（２５）：６３９２－４０２．）、５）ＣＤ８ａ ＴＭ領域（Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２００２， Ｊａｎ；２０（１）：７０－５．； Ｉｍａｉ Ｃ， Ｌｅｕｋｅｍｉａ， ２００４， Ａｐｒ；１８（４）：６７６－８４； Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ， ＣＣＲ， ２００７， Ｓｅｐ １５；１３（１８ Ｐｔ １）：５４２６－３５； Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２００９， Ａｕｇ；１７（８）：１４５３－６４．）。使用し得るその他の膜貫通ドメインとしては、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはＣＤ１５４に由来するものが挙げられる。

【0198】

ヒンジドメインは、膜貫通ドメインと同じタンパク質から便利に得ることができるが、これは必須ではない。

【0199】

例として、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン由来であって、配列番号７３として示すアミノ酸配列、または配列番号７３に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。前記変異体は、配列番号７３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有していてもよい。

【0200】

あるいは、ＣＡＲは、ＣＤ８α膜貫通ドメインに由来するドメインを含んでいてもよい。よって、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８αのアミノ酸１８３位～２０３位を表す配列番号６７として示すアミノ酸配列、または配列番号６７に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は、配列番号６７に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有していてもよい。

【0201】

ＣＤ８α膜貫通ドメインをＣＤ８αヒンジドメインと組み合わせてもよい。ある実施形態では、ＣＡＲは、配列番号６８に示すように、組み合わせたＣＤ８αヒンジ・膜貫通ドメイン配列、または、当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異体を含む。前記変異体は、配列番号６８に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有していてもよい。配列番号６８は、野生型ＣＤ８αヒンジ配列に対してシステイン残基のアミノ酸置換を２個含む、改変されたヒンジドメインを含んでいる。改変されたＣＤ８αヒンジドメイン配列を配列番号６９に示す。野生型ＣＤ８αヒンジドメイン配列を配列番号７０に示す。配列番号６９または７０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するこのようなヒンジ配列の変異体を使用してもよい。

【0202】

使用し得るＣＤ２８ヒンジ・膜貫通配列の一例は、配列番号７４、または配列番号７４に対して少なくとも８０％の同一性を有するその変異体である。前記変異体は、配列番号７４に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有していてもよい。
さらなる例として、ＣＡＲは、例えば上記の配列に基づいて、ネイティブＣＤ８αヒンジドメインまたは改変されたＣＤ８αヒンジドメインと、ＣＤ２８膜貫通ドメインとを含んでもよいし、またはＣＤ２８ヒンジドメインとＣＤ８α膜貫通ドメインとを含んでもよい。

【0203】

使用し得る他のヒンジドメインとしては、ＣＤ４、ＣＤ７、または免疫グロブリン、またはその一部もしくは変異体に由来するヒンジドメインが挙げられる。

【0204】

ＣＡＲは、ＣＡＲを細胞表面での発現のための小胞体経路へ向かわせるシグナル（またはリーダーとも呼称される）配列をさらに含んでいてもよい。例示的なシグナル／リーダー配列は、配列番号６６に示すＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＡＰである。この配列は、配列番号７５に示す野生型ＣＤ８α配列ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰと比較して、単一のアミノ酸置換を含んでいる。どちらかの配列、または当該配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する変異体配列を使用することができる。

【0205】

本明細書に記載のＣＡＲのエンドドメインは、抗原結合時に、エフェクター機能シグナルを伝達し、ＣＡＲを発現している細胞にその特殊な機能を実行するように指示するのに必要なモチーフを含んでいる。特に、エンドドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を１つまたは複数（例えば、２つもしくは３つ）含み得、ＩＴＡＭは、典型的にはアミノ酸配列ＹＸＸＬ／Ｉ（Ｘは任意のアミノ酸である。）を含む。細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、Ｔ細胞受容体のζ鎖エンドドメイン、またはその相同体（例えば、η鎖、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖等）のいずれか、ＣＤ３ポリペプチドドメイン（Δ、δ、およびε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０等）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ等）、ならびに、ＣＤ２、ＣＤ５、およびＣＤ２８等のＴ細胞形質導入に関与する他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータ鎖エンドドメイン、ＦｃｙＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質尾部、細胞質受容体をもつ免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。

【0206】

一般的に、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる。ヒトＣＤ３ゼータ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインの配列は配列番号７６に記載されている。野生型に対してアミノ酸欠失を含む、改変されたヒトＣＤ３ζ細胞内ドメイン配列を配列番号７２に示す。ＣＡＲは、配列番号７２もしくは７６に記載の配列、または配列番号７２もしくは７６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含むＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、またはこのような配列からなるＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含んでもよい。ある実施形態では、前記シグナル伝達ドメインは、配列番号７２を含むか、または配列番号７２からなる。

【0207】

使用し得る他のシグナル伝達ドメインとしては、ＣＤ２８もしくはＣＤ２７またはその変異体のシグナル伝達ドメインが挙げられる。さらなる細胞内シグナル伝達ドメインは、当業者には明らかであり、本発明の代替的な実施形態に関連して使用され得る。一実施形態では、本ＣＡＲは、エンドドメイン内に４１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含まなくてもよい。

【0208】

本ＣＡＲは、例えばＣＤ３ζの細胞内部分に対してＴ細胞共刺激分子の細胞内部分が融合したものを含む複合エンドドメイン（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ）を含んでもよい。このような複合エンドドメインは、抗原認識後に活性化および共刺激シグナルを同時に伝達できる第２世代ＣＡＲと称してもよい。最も一般的に使用されている共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、Ｔ細胞の増殖を誘発する最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給する。ＣＡＲエンドドメインはまた、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、またはＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達ドメイン等のＴＮＦ受容体ファミリーシグナル伝達ドメインを１つ以上含んでもよい。但し、好ましくは、ＣＡＲは、ＣＤ２８および４１ＢＢの両方のシグナル伝達ドメインを含むエンドドメインを含まくてもよない。

【0209】

共刺激ドメインとして使用し得るＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを配列番号７７に示す。ＣＤ２８の膜貫通ドメインに由来する、追加の２個のアミノ酸（ＷＶ）をＮ末端に含む変異体ＣＤ２８共刺激ドメインを配列番号７１に示す。ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳおよびＴＮＦＲＳＦ２５シグナル伝達ドメインの例示的な配列を配列番号７９～８１にそれぞれ示す。ＣＡＲは、配列番号７１、７７、７９～８１のうちのいずれか１つの配列、または当該配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するその変異体を含むか、あるいはこのような配列または変異体からなる、共刺激ドメインを、１つ以上含んでいてもよい。

【0210】

ある実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７１を含むかまたは配列番号７１からなる共刺激ドメインを含む。

【0211】

一実施形態では、ＣＡＲは、ヒトＣＤ８ヒンジドメインまたはその変異体と、ヒトＣＤ８膜貫通ドメインとを含む。あるいは、またはさらに、ＣＡＲは、ヒトＣＤ２８共刺激ドメインとヒトＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとを含むエンドドメインを含む。

【0212】

好ましい一実施形態において、ＣＡＲは、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン（またはエンドドメイン）を以下のように含む：
（ｉ）配列番号６８に記載の配列もしくは当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、またはこのような配列からなる、ＣＤ８αヒンジ・膜貫通ドメイン配列；
（ｉｉ）配列番号７１に記載の配列もしくは当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、またはこのような配列からなる、ＣＤ２８共刺激ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号７２に記載の配列もしくは当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、またはこのような配列からなる、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン。

【0213】

コードされ、発現されるＣＡＲは、配列番号６６に記載の配列もしくは当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、またはこのような配列からなる、リーダー配列をさらに含んでいてもよい。

【0214】

ＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号１９、８８、もしくは２８に記載の配列、または、ＨＬＡ－Ａ２に結合することができる、当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでいてもよく、あるいはこのような配列からなっていてもよい。

【0215】

よって、１つの好ましい代表的なＣＡＲは、全体として、以下を含んでもよい：
（ｉ）配列番号６６に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいはこのような配列からなる、リーダー配列；
（ｉｉ）配列番号１９もしくは８８に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいはこのような配列からなる、抗原結合ドメイン；
（ｉｖ）配列番号６８に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいはこのような配列からなる、ＣＤ８αヒンジ・膜貫通ドメイン配列；
（ｖ）配列番号７１に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいはこのような配列からなる、ＣＤ２８共刺激ドメイン；
（ｖｉ）配列番号７２に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいはこのような配列からなる、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン。このＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２に結合可能となり、ＣＡＲが発現している細胞内にシグナルを伝達可能となる。

【0216】

本明細書中のＣＡＲのエンドドメインは、さらなるドメインを含有していてもよい。例えば、ＳＴＡＴ５会合モチーフと、ＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２結合モチーフと、任意選択的にＪＡＫ３結合モチーフとを含むドメインを含んでいてもよい。このような実施形態では、エンドドメインは、サイトカイン受容体、例えばインターロイキン受容体（ＩＬ）受容体のエンドドメイン由来の配列を１つ以上含んでもよい。そのようなＣＡＲは、国際公開第２０２０／０４４０５５号（これも参照により本明細書に組み込む）に記載されている。このようなドメインを含むことで、外因性ＩＬの投与を必要とすることなく、ＣＡＲが抗原特異的に自身が発現する細胞に産生性ＩＬシグナルを提供する能力がＣＡＲに付与される。例えば、ＩＬ－２はＴｒｅｇ細胞の生存、増殖、および持続に重要であるが、治療が必要な患者ではＩＬ２レベルが低いかまたは損なわれていることがしばしばあり得る。よって、ＣＡＲは、ＩＬ受容体またはＩＬ２受容体等のその変異体のβ鎖エンドドメインの全部または一部に対応する配列を含んでいてもよく、任意選択的にＩＬ受容体またはＩＬ２受容体等のその変異体のγ鎖エンドドメインと組み合わせて含んでいてもよい。

【0217】

例として、ＣＡＲエンドドメインは、ヒトＩＬ－２受容体β鎖またはその変異体に由来する配列を含むドメインを、以下のように含んでもよい：

【0218】

ヒトＩＬ－２受容体β鎖のアミノ酸番号２６６～５５１（ＮＣＢＩ ＲＥＦＳＥＱ：ＮＰ＿０００８６９．１）を表す配列番号８４に記載の配列、または配列番号８４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；あるいは、
配列番号８４の短縮され配列改変された変異体（置換Ｙ５１０）を表す配列番号８５に記載の配列、または配列番号８５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；あるいは、
配列番号８４の短縮され配列改変された変異体（置換Ｙ５１０およびＹ３９２）を表す配列番号８６に記載の配列、または配列番号８６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列。

【0219】

前記核酸分子は、前記３つのコードされたポリペプチドの間に、自己切断配列をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。特に、自己切断配列は自己切断ペプチドである。このような配列は、タンパク質産生中に自動切断する。使用し得る自己切断ペプチドは、２Ａペプチドまたは２Ａ様ペプチドであり、これらは、当該技術分野において公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込むＤｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２００１， ８２， １０２７－１０４１に記載されている。上記のように、２Ａペプチドおよび２Ａ様ペプチドは、リボソームスキッピングを生じさせ、２Ａペプチドの末端と下流のアミノ酸配列との間のペプチド結合の形成をスキップする切断形態をもたらすと考えられている。「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」は、２ＡペプチドのＣ末端のグリシン残基とプロリン残基との間で起こる。つまり、上流のシストロンはその末端に付加されたいくつかの残基を有することになり、下流のシストロンはプロリンから始まることになる。

【0220】

好適な自己切断ドメインとしては、配列番号２９～３２にそれぞれ示すＰ２Ａ配列、Ｔ２Ａ配列、Ｅ２Ａ配列およびＦ２Ａ配列が挙げられる。これらの配列は、２ＡペプチドのＮ末端にアミノ酸ＧＳＧを含むように改変されていてもよい。よって、配列番号２９～３２に対応する配列であってＮ末端にＧＳＧを有する配列も、可能な選択肢に含まれる。このような改変された代替的な２Ａ配列は、当該技術分野において公知であり、報告されている。使用し得る代替的な２Ａ様配列は、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ（上記）に示されており、例えばＴａＶ配列である。
前記核酸分子に含まれる各自己切断配列は、同じであっても異なっていてもよい。ある実施形態では、それらは両方とも２Ａ配列、特にＰ２Ａ配列および／またはＴ２Ａ配列である。ある実施形態では、安全スイッチポリペプチドとＦＯＸＰ３との間の自己切断配列がＰ２Ａ配列であり、ＦＯＸＰ３とＣＡＲとの間の自己切断配列がＴ２Ａ配列である。

【0221】

自己切断配列は、細胞に存在する一般的な酵素によって切断され得る追加の切断部位を含んでいてもよい。これは、翻訳後に２Ａ配列の完全な除去を達成することを支援し得る。このような追加の切断部位は、例えば、フューリン切断部位ＲＸＸＲ（配列番号８２）、例えばＲＲＫＲ（配列番号８３）を含んでもよい。

【0222】

代表的な実施形態では、前記核酸分子は５’から３’へ以下を含む：
（ｉ）配列番号１０の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む安全スイッチポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号２９の配列を有するＰ２Ａ切断配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）配列番号２の配列または当該配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むＦＯＸＰ３ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列；
（ｉｖ）配列番号３０の配列を含むＴ２Ａ切断配列をコードするヌクレオチド配列；および
（ｖｉ）ＨＬＡ－Ａ２に対して向けられたＣＡＲをコードする第３のヌクレオチド配列。

【0223】

このような実施形態では、ＣＡＲは以下を含んでもよい：
（ａ）配列番号６６に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいはそのような配列からなる、リーダー配列；
（ｂ）配列番号１９もしくは８８に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいはそのような配列からなる、抗原結合ドメイン；
（ｃ）配列番号６８に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいはそのような配列からなる、ＣＤ８αヒンジ・膜貫通ドメイン配列；
（ｄ）配列番号７１に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいはそのような配列からなる、Ｃ２８共刺激ドメイン；
（ｅ）配列番号７２に記載の配列または当該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいはそのような配列からなる、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン。

【0224】

上記の説明から明らかなように、本明細書に記載の特定のポリペプチド配列およびヌクレオチド配列に加えて、それらの変異体、または誘導体および断片の使用も包含される。

【0225】

本発明のタンパク質またはポリペプチドに関連して本明細書中で同義に使用される「誘導体」または「変異体」という用語は、結果として得られるタンパク質またはポリペプチドが所望の機能を保持することを条件として、配列からの、または配列への、１つ（または複数）のアミノ酸残基の任意の置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、変異、改変、置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、欠失、および／または付加を含む。例えば、誘導体または変異体が抗原結合ドメインである場合は、前記所望の機能は、当該抗原結合ドメインがその標的抗原に結合する能力であってもよく（例えば、ＨＬＡ－Ａ２に結合する抗原結合ドメインの変異体は、ＨＬＡ－Ａ２に結合する能力を保持する）、誘導体または変異体がシグナル伝達ドメインである場合は、前記所望の機能は、当該ドメインがシグナル伝達する（例えば、下流の分子を活性化または不活性化する）能力であってもよく、誘導体または変異体が転写因子（例えば、ＦＯＸＰ３）である場合は、前記所望の機能は、当該転写因子が標的ＤＮＡに結合する能力および／または転写を誘導する能力であってもよく、誘導体または変異体が安全スイッチポリペプチドである場合は、前記所望の機能は、例えば当該ポリペプチドに対して分子が結合すると、当該ポリペプチドが細胞死を誘導する能力であってもよい。代替的な見方によれば、本明細書中でいうところの変異体または誘導体は、機能的変異体または機能的誘導体である。例えば、変異体または誘導体は、対応する参照配列と比較して、少なくとも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の機能を有していてもよい。変異体または誘導体は、対応する参照配列と比較して、類似のレベルまたは同じレベルの機能を有していてもよく、高いレベルの機能（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％高い）を有していてもよい。

【0226】

典型的には、アミノ酸の置換は、改変後の配列が所要の活性または能力を保持することを条件として、例えば、１個、２個、または３個から１０個または２０個までの置換が行われてもよい。アミノ酸の置換は、非天然の類似体の使用を含み得る。例えば、変異体または誘導体は、対応する参照配列と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の活性または能力を有していてもよい。変異体または誘導体は、対応する参照配列と比較して、類似のレベルまたは同じレベルの活性または能力を有していてもよく、高いレベルの活性または能力（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％高い）を有していてもよい。

【0227】

タンパク質またはペプチドはまた、サイレント変化を生じてその結果として機能的に同等なタンパク質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を有していてもよい。内因性機能が保持される限り、意図的なアミノ酸の置換を、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行ってもよい。例えば、負の電荷を有するアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正の電荷を有するアミノ酸としてはリシンおよびアルギニンが挙げられ、親水性値が類似する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としてはアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシンが挙げられる。

【0228】

保存的置換を、例えば、上記表２に従って行ってもよい。

【0229】

誘導体は相同体であってもよい。本明細書中で使用する「相同体」という用語は、野生型アミノ酸配列および野生型ヌクレオチド配列とある一定の相同性を有する実体を意味する。「相同性」という用語は、「同一性」と同等視することができる。

【0230】

相同配列または変異体配列は、対象の配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８５％、または９０％の同一性を有し得るアミノ酸配列を含み得、好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し得るアミノ酸配列を含み得る。典型的には、変異体は、対象のアミノ酸配列と同じ活性部位等を含む。相同性は、類似性（すなわち、化学的特性／機能が類似するアミノ酸残基）の観点から考えることもできるが、本明細書の文脈においては、配列同一性の観点で相同性を表現することが好ましい。

【0231】

相同性の比較は、目視で実施することもでき、または、より一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムを利用して実施することもできる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列の相同率（％）または同一率（％）を計算することができる。

【0232】

相同率または配列同一率は、連続する配列にわたって計算してもよい。すなわち、一方の配列を他方の配列と整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と一残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップなし（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このようなギャップなしアラインメントは、比較的短い残基数に対してのみ行われる。
これは、非常に単純かつ一貫した方法ではあるが、例えば、他の点では同一である配列のペアにおいて、ヌクレオチド配列中の１個の挿入または欠失により、後続のコドンがそろわなくなる場合があり、よって、大域アラインメント（ｇｌｏｂａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を行ったときに相同率が大幅に低下する可能性があるということを考慮できない。したがって、ほとんどの配列比較方法は、全体的な相同性スコアを過度に不利にすることなく、起こり得る挿入や欠失を考慮した最適なアラインメントを作成するように設計される。これは、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入して局所相同性を最大化することによって達成される。
しかしながら、これらのより複雑な方法は、アラインメントに生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当て、それにより、同数の同一のアミノ酸に関して、比較される２つの配列間の関連性がより高いことを反映する、可能な限りギャップの少ない配列アラインメントが、ギャップの多い配列アラインメントよりも高いスコアを達成するようにする。通常、ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、そのギャップ内の後続の各残基に対してはより低いコストを課す「アフィンギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。ギャップペナルティが高いと、当然ながら、よりギャップの少ない最適化されたアラインメントが作成される。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティを変更することができる。しかしながら、このようなソフトウェアを配列比較に使用する場合には、デフォルト値を用いることが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列に対するデフォルトのギャップペナルティは、ギャップについては－１２、各伸長部については－４である。

【0233】

したがって、最大相同率／最大配列同一率の計算には、まず、ギャップペナルティを考慮した最適なアラインメントを作成することが必要である。このようなアラインメントを実行するための１つの好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｕ．Ｓ．Ａ．； Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２： ３８７）である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアとしては、例えば、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）、同書－第１８章を参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４０３－４１０）、およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ社の比較ツール一式が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは、両方とも、オフライン検索およびオンライン検索に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）、同書、７－５８から７－６０頁を参照）。しかしながら、用途によっては、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる別のツールも、タンパク質配列およびヌクレオチド配列を比較するために利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．（１９９９） １７４： ２４７－５０； ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．（１９９９） １７７： １８７－８を参照）。

【0234】

最終的な相同率は同一性の観点から測定することができるが、アラインメントプロセス自体は、典型的には、オール・オア・ナッシングのペア比較に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性または進化的距離に基づいてそれぞれの対比較にスコアを割り当てる、調整された（ｓｃａｌｅｄ）類似性スコアマトリクスが一般に使用される。一般的に使用されているこのようなマトリクスの一例として、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスがある。これは、一連のＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトマトリクスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、公開デフォルト値または供給されている場合はカスタムシンボル比較表のいずれかが使用される（詳細はユーザーマニュアルを参照）。用途によっては、ＧＣＧパッケージ用の公開デフォルト値を使用することが好ましく、または、他のソフトウェアの場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２等のデフォルトマトリクスを使用することが好ましい。好適には、同一率は、参照配列および／または問い合わせ配列の全体にわたって決定される。 ソフトウェアが最適なアラインメントを作成すると、相同率、好ましくは配列同一率を計算することが可能になる。ソフトウェアは、典型的には、これを配列比較の一部として行い、数値結果を生成する。

【0235】

「断片」は、典型的には、機能の点で着目される、例えば、機能的であるかまたは機能的断片をコードする、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの選択された領域を指す。よって、「断片」は、全長ポリペプチドまたは全長ポリヌクレオチドの一部（または部分）であるアミノ酸配列または核酸配列をいう。

【0236】

このような誘導体、変異体、および断片は、部位特異的変異誘発等の標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して調製することができる。挿入を行う場合には、インサート（挿入部分）をコードする合成ＤＮＡを、挿入位置の両側の天然の配列に対応する５’フランキング領域および３’フランキング領域とともに作製してもよい。各フランキング領域には、前記天然の配列中の部位に対応する便利な制限部位が含まれ、それにより、当該配列が適切な酵素（１つまたは複数）で切断されて前記合成ＤＮＡがその切断部にライゲーションされるようになっている。次に、本発明に従ってＤＮＡを発現させ、コードされたタンパク質を作製する。これらの方法は、ＤＮＡ配列操作のための当該技術分野で公知の多数の標準的技術の例示に過ぎず、他の公知の技術を使用してもよい。

【0237】

本明細書中で定義する核酸分子およびポリヌクレオチド／核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。それらは、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。当業者には、遺伝コードの縮重の結果として、多数の異なる核酸分子／ポリヌクレオチドが同じポリペプチドをコードし得ることが理解されるであろう。これに加えて、当業者であれば、本発明のポリペプチドを発現させる任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映させるために、常法を用いて、本明細書中で定義する核酸分子／ポリヌクレオチド／ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行い得るということを理解されたい。

【0238】

前記核酸分子／ポリヌクレオチドは、当該技術分野において利用可能な任意の方法を用いて改変することができる。このような改変は、本明細書中で定義する核酸分子／ポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために実施されてもよい。

【0239】

ＤＮＡ核酸分子／ポリヌクレオチド／配列等の、核酸分子／ポリヌクレオチド／ヌクレオチド配列は、組換え、合成、または当業者が利用可能な任意の手段により、作製することができる。標準的な技術によってクローニングすることもできる。
より長い核酸分子／ポリヌクレオチド／ヌクレオチド配列は、一般に組換え手段を用いて作製され、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を用いて作製される。これは、クローニングしたい標的配列を挟むプライマー対（例えば、約１５～３０ヌクレオチド）を作成し、当該プライマーを動物細胞またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させ、所望の領域の増幅を起こさせる条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅断片を単離し（例えば、アガロースゲルで反応混合物を精製することにより）、増幅ＤＮＡを回収することを含む。前記プライマーは、増幅ＤＮＡを適切なベクターにクローニングできるように、適切な制限酵素認識部位を含有するように設計されてもよい。

【0240】

本核酸分子／ポリヌクレオチドは、選択可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含んでもよい。好適な選択可能なマーカーは、当該技術分野において周知であり、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。好適には、前記選択可能なマーカーは、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｄｓＲｅｄ、またはそれらの変異体であり得る。いくつかの実施形態において、蛍光タンパク質は、ＧＦＰまたはＧＦＰ変異体である。選択可能なマーカーをコードする核酸配列は、本明細書中の核酸分子と組み合わせて核酸構築物の形態で提供されてもよい。そのような核酸構築物は、ベクター中で提供され得る。

【0241】

好適には、選択可能なマーカー／レポータードメインは、ルシフェラーゼベースのレポーター、ＰＥＴレポーター（例えば、ナトリウム・ヨウ素共輸送体（ＮＩＳ））、または膜タンパク質（例えば、ＣＤ３４、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ））であってもよい。

【0242】

１つ以上の選択可能なマーカーをコードする核酸配列は、各ポリペプチドが別々の実体として発現することを可能にする１つ以上の共発現部位によって、本核酸分子から、かつ／または互いに、分離されていてもよい。好適な共発現部位は、当該技術分野において公知であり、例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）や、本核酸分子に含まれる、上記で定義したものを含む自己切断部位が挙げられる。ある実施形態では、これは、上述のように、２Ａ切断部位であってもよい。

【0243】

選択可能なマーカーを使用すると有利であり、それは、本発明の核酸分子、構築物、またはベクターが首尾よく導入された（コードされた安全スイッチポリペプチド、ＦＯＸＰ３、ＣＡＲが発現するように）細胞（例えばＴｒｅｇ）を、一般的な方法、例えばフローサイトメトリーを用いて出発細胞集団から選択および単離することが可能になるためである。

【0244】

本発明で使用される核酸分子／ポリヌクレオチドは、コドン最適化されていてもよい。コドン最適化は、これまでに、国際公開第１９９９／４１３９７号パンフレットおよび国際公開第２００１／７９５１８号パンフレットにおいて記載されている。細胞が異なれば、特定のコドンの使用頻度が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的存在量の偏りに対応する。配列中のコドンを変更して、対応するｔＲＮＡの相対的存在量と一致するように適合させるようにすることにより、発現を増加させることができる。同様に、対応するｔＲＮＡが当該特定の細胞型では稀であることが知られているコドンを意図的に選択することにより、発現を減少させることができる。よって、さらに高度な翻訳制御が可能である。

【0245】

第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、および第３のヌクレオチド配列は、それらが同じプロモーターに作動可能に連結された構築物中で提供されてもよい。「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始を導くＤＮＡの領域である。プロモーターは、ＤＮＡの上流側（センス鎖の５’領域寄り）で、遺伝子の転写開始点付近に位置する。任意の好適なプロモーターを使用することができ、その選択は、当業者によって容易になされ得る。プロモーターは、どのような供給源からのものでもよく、ウイルスプロモーター、または、哺乳動物もしくはヒトのプロモーター（すなわち、生理学的プロモーター）を含む真核生物プロモーターであってもよい。ある実施形態では、前記プロモーターはウイルスプロモーターである。具体的なプロモーターとしては、ＬＴＲプロモーター、ＥＦＳ（またはその機能的短縮物（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ））、ＳＦＦＶ、ＰＧＫ、およびＣＭＶが挙げられる。ある実施形態では、プロモーターは、ＳＦＦＶまたはウイルスＬＴＲプロモーターである。特に、ＳＦＦＶプロモーターが、本発明の核酸分子、構築物、またはベクター内で、（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列の転写開始を可能にするために使用されてもよい。よって、代替的な見方によれば、（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列は、ＳＦＦＶプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。前記ＳＦＦＶプロモーターは、配列番号８７に記載のヌクレオチド配列を含んでもよい。「同じプロモーターに作動可能に連結された」とは、前記各ポリヌクレオチド配列の転写が同じプロモーターから開始され得る（例えば、前記第１、第２、および第３のポリヌクレオチド配列の転写が同じプロモーターから開始される）ことと、転写が当該プロモーターから開始されるように前記各ヌクレオチド配列が位置決めおよび方向付けされていることとを意味する。あるプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドは、そのプロモーターの転写調節下にある。

【0246】

ベクターは、ある実体の、１つの環境から別の環境への移入を可能にする、または容易にするツールである。本明細書中で使用するように、また、例として、組換え核酸技術で用いられるいくつかのベクターは、核酸のセグメント（例えば、異種性のｃＤＮＡセグメント等の異種性のＤＮＡセグメント）等の実体を標的細胞に移入させることを可能にする。ベクターは、非ウイルスベクターであってもよく、ウイルスベクターであってもよい。組換え核酸技術で用いられるベクターの例としては、プラスミド、ｍＲＮＡ分子（例えば、インビトロ転写ｍＲＮＡ）、染色体、人工染色体、およびウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、例えば、裸の核酸（例えば、ＤＮＡ）であってもよい。最も単純な形態では、ベクター自体が目的のヌクレオチドであってもよい。

【0247】

本明細書中で使用するベクターは、例えば、プラスミド、ｍＲＮＡ、またはウイルスベクターであってもよく、核酸分子／ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター（上記の通り）と、任意選択的に、当該プロモーターの制御因子とを含み得る。

【0248】

ある実施形態では、前記ベクターはウイルスベクターであり、例えば、レトロウイルスベクターであり、また、例えば、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである。

【0249】

ベクターは、追加のプロモーターをさらに含んでもよく、例えば、一実施形態において、前記プロモーターは、ＬＴＲ、例えば、レトロウイルスＬＴＲまたはレンチウイルスＬＴＲであってもよい。長末端反復（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＬＴＲ）とは、レトロウイルスＲＮＡの逆転写によって形成されたレトロトランスポゾンまたはプロウイルスＤＮＡの両端に見られる、数百回または数千回繰り返すＤＮＡの同一配列である。ＬＴＲは、ウイルスによって、遺伝物質を宿主ゲノムに挿入するために利用される。ＬＴＲには、エンハンサー、プロモーター（転写エンハンサーと調節エレメントとの両方を有し得る）、転写開始（キャッピング等）、転写ターミネーター、およびポリアデニル化シグナル等の、遺伝子発現のシグナルが存在する。

【0250】

好適には、前記ベクターは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲを含み得る。

【0251】

前記ベクターは、転写前または転写後に作用し得る１つ以上の追加の制御配列を含んでもよい。「制御配列」とは、前記ポリペプチドの発現を促進する、例えば、転写物の発現を増加させるかまたはｍＲＮＡ安定性を増強するように作用する、任意の配列である。好適な制御配列としては、例えば、エンハンサーエレメント、転写後調節エレメント、およびポリアデニル化部位が挙げられる。好適には、前記追加の制御配列は、ＬＴＲ（１つまたは複数）に存在し得る。

【0252】

好適には、前記ベクターは、例えばプロモーターに作動可能に連結された、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含んでもよい。

【0253】

本核酸分子／ポリヌクレオチドを含むベクターは、形質転換および形質導入等の当該技術分野で公知の種々の技術を使用して細胞に導入することができる。いくつかの技術が当該技術分野において公知であり、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクター等の組換えウイルスベクターへの感染、核酸の直接注入、およびバイオリスティック法による形質転換が挙げられる。

【0254】

非ウイルス送達系にはＤＮＡトランスフェクション法が含まれるが、これらに限定されない。ここで、トランスフェクションは、非ウイルスベクターを使用して遺伝子を標的細胞に送達するプロセスを含む。非ウイルス送達系は、好ましくは核酸分子または構築物と複合体を形成した、リポソームを用いた細胞膜透過性ペプチドまたは両親媒性細胞膜透過性ペプチドを含み得る。
典型的なトランスフェクション法としては、エレクトロポレーション法、ＤＮＡバイオリスティック法、脂質媒介トランスフェクション法、圧縮ＤＮＡ媒介トランスフェクション法、リポソーム法、イムノリポソーム法、リポフェクチン法、カチオン性薬剤媒介トランスフェクション法、カチオン性界面両親媒性物質法（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｆａｃｉａｌ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ）（ＣＦＡ）（Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６） １４： ５５６）、およびこれらの組み合わせが挙げられる。

【0255】

本核酸分子は単一構築物として使用されるように設計されており、これは単一ベクターに含まれることになると考えられるが、そのような単一構築物が他のベクターと組み合わせて細胞に導入されること、例えば、当該細胞への導入がやはり望まれる他のポリペプチドをコードするベクターと組み合わせて導入されることが排除されるわけではない。

【0256】

操作された細胞は、ウイルスベクターによる形質導入やＤＮＡまたはＲＮＡを用いたトランスフェクションをはじめとする多くの手段のうちの１つによって本明細書中で定義する核酸分子、構築物、またはベクターを導入することによって生成することができる。

【0257】

本細胞は、本明細書中で定義する核酸分子／ポリヌクレオチド、構築物、またはベクターを細胞に導入する（例えば、形質導入またはトランスフェクションによって）ことによって作製してもよい。

【0258】

好適な細胞については以下で詳細を述べるが、前記細胞は、対象から単離された試料に由来するものであってもよい。前記対象は、ドナー対象であってもよく、治療の対象であってもよい（すなわち、前記細胞は、自己由来細胞であってもよく、別のレシピエントに導入するためのドナー細胞、例えば同種細胞であってもよい。）。

【0259】

前記細胞は、以下の工程を含む方法によって生成することができる：
（ｉ）細胞含有試料を対象から単離する工程、または、細胞含有試料を用意する工程；および
（ｉｉ）前記細胞含有試料に、本明細書中で定義する核酸分子、構築物、またはベクターを導入し（例えば、形質導入またはトランスフェクションによって）、操作された細胞の集団を得る工程。

【0260】

標的細胞が富化された試料を、本方法の工程（ｉｉ）の前および／または後に、前記細胞含有試料から単離、富化、および／または生成することができる。例えば、工程（ｉｉ）の前および／または後にＴｒｅｇ（または他の標的細胞）の単離、富化、および／または生成を行い、Ｔｒｅｇ富化試料を単離、富化、または生成してもよい。工程（ｉｉ）の後に細胞含有試料からの単離および／または富化を行い、本明細書に記載のＣＡＲ、核酸分子／ポリヌクレオチド、構築物、および／またはベクターを含む細胞および／またはＴｒｅｇ（もしくは他の標的細胞）を富化してもよい。

【0261】

Ｔｒｅｇ富化試料は、当業者に公知の任意の方法、例えば、ＦＡＣＳおよび／または磁気ビーズソーティングによって単離または富化することができる。Ｔｒｅｇ富化試料は、当業者に公知の任意の方法によって細胞含有試料から生成されてもよく、例えば、ＦＯＸＰ３をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡを導入することによってＴｃｏｎ細胞から、および／または、誘導性前駆細胞もしくは胚性前駆細胞のエクスビボ分化から、生成されてもよい。その他の標的細胞を単離および／または富化する方法は、当該技術分野において公知である。

【0262】

好適には、操作された標的細胞は、以下の工程を含む方法によって生成することができる：
（ｉ）標的細胞が富化された試料を単離する工程、または、標的細胞が富化された試料を用意する工程；および
（ｉｉ）前記標的細胞が富化された試料に、本明細書中で定義する核酸、構築物、またはベクターを導入し（例えば、形質導入またはトランスフェクションによって）、操作された標的細胞の集団を得る工程。

【0263】

前記標的細胞は、Ｔｒｅｇ細胞、またはその前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。

【0264】

「操作された細胞」とは、その細胞によって天然にコードされていないポリヌクレオチドを含むかまたは発現するように改変された細胞を意味する。細胞を操作するための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、上記のように、レトロウイルス形質導入またはレンチウイルス形質導入等の形質導入法、リポフェクション法をはじめとするトランスフェクション法（ＤＮＡまたはＲＮＡベースの一過性トランスフェクション等）、ポリエチレングリコール法、リン酸カルシウム法、およびエレクトロポレーション法による細胞の遺伝子改変が挙げられるが、これらに限定されない。任意の好適な方法を使用して核酸配列を細胞に導入することができる。両親媒性細胞膜透過性ペプチド等の非ウイルス技術を使用して核酸を導入してもよい。

【0265】

したがって、本明細書に記載の核酸分子は、対応する非改変細胞によって天然に発現されるものではない。実際、前記ＣＡＲをコードする核酸分子は人工構築物であり、ある実施形態では、前記安全スイッチポリペプチドは人工構築物であり、そのため、それらは天然には発生または発現しない。好適には、操作された細胞は、例えば形質導入またはトランスフェクションによって改変された細胞である。好適には、操作された細胞は、例えば形質導入またはトランスフェクションによって、改変されたか、またはゲノムが改変された細胞である。好適には、操作された細胞は、レトロウイルス形質導入によって、改変されたか、またはゲノムが改変された細胞である。好適には、操作された細胞は、レンチウイルス形質導入によって、改変されたか、またはゲノムが改変された細胞である。

【0266】

本明細書中で使用する「導入された（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）」という用語は、外来の核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に挿入するための方法を指す。本明細書中で使用するこの「導入された」という用語は、形質導入法およびトランスフェクション法の両方を含む。トランスフェクションは、核酸を非ウイルス的方法によって細胞に導入するプロセスである。形質導入は、外来のＤＮＡまたはＲＮＡをウイルスベクターを介して細胞に導入するプロセスである。操作された細胞は、ウイルスベクターによる形質導入やＤＮＡまたはＲＮＡを用いたトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つによって、本明細書に記載の核酸を導入することにより、生成され得る。本明細書に記載の核酸の導入前または導入後に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理または抗ＣＤ３モノクローナル抗体と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体との両方での処理によって、細胞を活性化および／または増殖させてもよい。前記細胞は、また、ＩＬ－２と組み合わせた抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の存在下で、増殖させてもよい。好適には、ＩＬ－２をＩＬ－１５と置き換えてもよい。細胞（例えばＴｒｅｇ）増殖プロトコルで使用し得る他の構成要素としては、ラパマイシン、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、およびＴＧＦβが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する「活性化された（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」という用語は、細胞の増殖が起こるように細胞が刺激されたことを意味する。本明細書中で使用する「増殖させた（ｅｘｐａｎｄｅｄ）」という用語は、細胞または細胞の集団が増殖するように誘導されたことを意味する。細胞の集団の増殖は、例えば、集団内に存在する細胞の数を数えることによって測定することができる。細胞の表現型は、フローサイトメトリー等の当該技術分野において公知の方法によって決定することができる。

【0267】

前記細胞は、免疫細胞、またはその前駆体であってもよい。前駆体細胞は、前駆細胞でもあり得る。よって、代表的な免疫細胞としては、Ｔ細胞、特に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）、および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が挙げられる。Ｔ細胞の他の集団もまた、ここでは有用であり、例えば、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞が挙げられる。その他の免疫細胞としては、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、ＭＤＳＣ、好中球、およびマクロファージが挙げられる。免疫細胞の前駆体としては、多能性幹細胞が挙げられ、例えば、誘導性ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）、または複能性幹細胞を含む、分化の指向性がより高い（ｍｏｒｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）前駆細胞、またはある系統へと分化する細胞が挙げられる。前駆細胞は、インビボまたはインビトロで免疫細胞に分化するよう誘導することができる。一態様において、前駆細胞は、目的の免疫細胞へと分化転換可能な体細胞であってもよい。

【0268】

最も注目すべきは、免疫細胞が、ＮＫ細胞、樹状細胞、ＭＤＳＣ、または、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）もしくはＴｒｅｇ細胞等のＴ細胞であってもよいことである。

【0269】

好ましい実施形態では、免疫細胞はＴｒｅｇ細胞である。「制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）またはＴ制御性細胞」は、細胞障害性免疫応答を制御する免疫抑制機能を有する免疫細胞であり、免疫寛容の維持に不可欠である。本明細書中で使用するＴｒｅｇという用語は、免疫抑制機能を有するＴ細胞を指す。

【0270】

本明細書中で使用するＴ細胞とは、αβＴ細胞（例えば、ＣＤ８またはＣＤ４＋）、γδＴ細胞、メモリーＴ細胞、Ｔｒｅｇ細胞等の任意のタイプのＴ細胞を含むリンパ球である。

【0271】

好適には、免疫抑制機能とは、病原体、同種抗原、または自己抗原等の刺激に反応して免疫系によって促進される多数の生理学的効果および細胞効果の１つ以上を低減または阻害するＴｒｅｇの能力を指す場合がある。このような効果の例としては、従来のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）の増殖の強化および炎症性サイトカインの分泌が挙げられる。このような効果はいずれも、免疫応答の強さの指標として使用し得る。Ｔｒｅｇの存在下でＴｃｏｎｖによる免疫応答が相対的に弱くなることは、Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能を示していると考えられる。例えば、サイトカイン分泌の相対的な減少は、免疫応答が弱まることを示すものと考えられ、よって、Ｔｒｅｇの免疫応答抑制能を示していると考えられる。Ｔｒｅｇはまた、Ｂ細胞、樹状細胞、およびマクロファージ等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の共刺激分子の発現を調節することによっても免疫応答を抑制することができる。ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現レベルを使用し、活性化Ｔｒｅｇの共培養後のインビトロでの抑制効力を評価することができる。

【0272】

免疫応答の強さの指標を測定し、これによりＴｒｅｇの抑制能を測定するためのアッセイは、当該技術分野において公知である。具体的には、抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞をＴｒｅｇと共培養し、対応する抗原のペプチドを共培養物に添加してＴｃｏｎｖ細胞からの応答を刺激すればよい。Ｔｃｏｎｖ細胞の増殖の程度および／またはペプチドの添加に反応してＴｃｏｎｖ細胞が分泌するサイトカインＩＬ－２の量を、共培養したＴｒｅｇの抑制能の指標として使用し得る。
本明細書中に記載のようにＴｒｅｇと共培養された抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞は、Ｔｒｅｇの非存在下で培養された同Ｔｃｏｎｖ細胞と比べて、その増殖が５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、９５％、または９９％少ない場合がある。例えば、本Ｔｒｅｇと共培養された抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞は、非操作Ｔｒｅｇの存在下で培養された同Ｔｃｏｎｖ細胞と比べて、その増殖が５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、９５％、または９９％少ない場合がある。本明細書中で定義する核酸、発現構築物、またはベクターを含む細胞、例えばＴｒｅｇは、非操作Ｔｒｅｇ、または、前記３つのポリペプチド（すなわち、安全スイッチポリペプチド、ＦＯＸＰ３、およびＣＡＲ）をコードする前記３つのポリヌクレオチド配列の配置が異なる核酸構築物を含むＴｒｅｇと比べて、例えば、ＦＯＸＰ３、安全スイッチポリペプチド、およびＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを５’から３’へ含む構築物と比べて、その抑制活性が高い（例えば、抑制活性が少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い）場合がある。

【0273】

本明細書においてＴｒｅｇと共培養された抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞は、Ｔｒｅｇの非存在下で（例えば、非操作Ｔｒｅｇ、つまり、前記３つのポリペプチド（すなわち、安全スイッチポリペプチド、ＦＯＸＰ３、およびＣＡＲ）をコードする前記３つのポリヌクレオチド配列の配置が異なる核酸構築物を含むＴｒｅｇの存在下で）培養された対応するＴｃｏｎｖ細胞と比べて、例えば、ＦＯＸＰ３、安全スイッチポリペプチド、およびＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを５’から３’へ含む構築物と比べて、エフェクターサイトカインの発現が少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％少ない場合がある。エフェクターサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１７、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、およびＩＬ－１３から選択されてもよい。好適には、エフェクターサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１７、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮ－γから選択されてもよい。

【0274】

いくつかの異なるＴｒｅｇの亜集団が同定されているが、これらは異なる特定のマーカーまたは異なるレベルの特定のマーカーを発現する場合がある。Ｔｒｅｇは、一般的には、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦＯＸＰ３というマーカーを発現するＴ細胞である（ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦＯＸＰ３⁺）。

【0275】

Ｔｒｅｇはさらに、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子－４）またはＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体）を発現する場合もある。

【0276】

Ｔｒｅｇ細胞は、末梢血、リンパ節、および組織に存在し、本明細書中で使用するＴｒｅｇは、胸腺由来の天然Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）細胞、末梢で産生されたＴｒｅｇ、および誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞を含む。

【0277】

Ｔｒｅｇは、細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ２５を、表面タンパク質ＣＤ１２７の非存在下で、または低発現レベルのＣＤ１２７と組み合わせて（ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＣＤ１２７^-またはＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＣＤ１２７^low）使用することで同定し得る。Ｔｒｅｇを同定するためのこのようなマーカーの使用は、当該技術分野では公知であり、例えば、Ｌｉｕら（ＪＥＭ； ２００６； ２０３； ７（１０）； １７０１－１７１１）に記載されている。

【0278】

Ｔｒｅｇは、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦＯＸＰ３⁺Ｔ細胞、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＣＤ１２７^-Ｔ細胞、またはＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦＯＸＰ３⁺ＣＤ１２７^-/lowＴ細胞であってもよい。

【0279】

好適には、Ｔｒｅｇは、天然Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）であってもよい。本明細書中で使用する「天然Ｔｒｅｇ」という用語は、胸腺由来Ｔｒｅｇを意味する。天然Ｔｒｅｇは、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦＯＸＰ３⁺Ｈｅｌｉｏｓ⁺ニューロピリン１⁺である。ｉＴｒｅｇと比較して、ｎＴｒｅｇは、ＰＤ－１（プログラム細胞死－１、ｐｄｃｄ１）、ニューロピリン１（Ｎｒｐ１）、Ｈｅｌｉｏｓ（Ｉｋｚｆ２）、およびＣＤ７３が高発現である。ｎＴｒｅｇは、Ｈｅｌｉｏｓタンパク質またはニューロピリン１（Ｎｒｐ１）の個別の発現に基づいて、ｉＴｒｅｇと区別され得る。

【0280】

Ｔｒｅｇは、脱メチル化されたＴｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）を有してもよい。ＴＳＤＲは、Ｆｏｘｐ３の発現を調節する重要なメチル化感受性因子である（Ｐｏｌａｎｓｋｙ， Ｊ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ， ２００８．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３８（６）， ｐｐ．１６５４－１６６３）。

【0281】

さらに好適なＴｒｅｇとしては、Ｔｒ１細胞（Ｆｏｘｐ３を発現せず、ＩＬ－１０産生が高い）、ＣＤ８⁺ＦＯＸＰ３⁺Ｔ細胞、およびγδＦＯＸＰ３⁺Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0282】

Ｔｒｅｇには、ナイーブＴｒｅｇ（ＣＤ４５ＲＡ⁺ＦｏｘＰ３^low）、エフェクター／メモリーＴｒｅｇ（ＣＤ４５ＲＡ^-ＦｏｘＰ３^high）、およびサイトカイン産生Ｔｒｅｇ（ＣＤ４５ＲＡ^-ＦｏｘＰ３^low）を含む、異なる亜集団が存在することが知られている。「メモリーＴｒｅｇ」は、ＣＤ４５ＲＯを発現するＴｒｅｇであり、ＣＤ４５ＲＯ⁺であると考えられる。これらの細胞は、ナイーブＴｒｅｇと比較して、ＣＤ４５ＲＯのレベルを増加させ（例えば、ＣＤ４５ＲＯが少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％多い）、好ましくは、ナイーブＴｒｅｇと比較して、ＣＤ４５ＲＡ（ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質）を発現しないか、あるいはそのレベルが低い（例えば、ナイーブＴｒｅｇと比較して、ＣＤ４５ＲＡが少なくとも８０％、９０％、または９５％少ない）。「サイトカイン産生Ｔｒｅｇ」とは、ナイーブＴｒｅｇと比較して、ＣＤ４５ＲＡ（ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質）を発現しないか、あるいはそのレベルが非常に低く（例えば、ナイーブＴｒｅｇと比較して、ＣＤ４５ＲＡが少なくとも８０％、９０％、または９５％少ない）、かつ、メモリーＴｒｅｇと比較して、ＦＯＸＰ３のレベルが低い、例えば、メモリーＴｒｅｇと比較して、ＦＯＸＰ３が５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満であるＴｒｅｇである。サイトカイン産生Ｔｒｅｇは、インターフェロンガンマを産生し得るＴｒｅｇであり、かつ、ナイーブＴｒｅｇと比較して、インビトロでの抑制力が低い（例えば、ナイーブＴｒｅｇと比較した抑制力が５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満である）Ｔｒｅｇでもよい。本明細書中での発現レベルとは、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を指す場合がある。特に、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ等の細胞表面マーカーに関しては、発現とは、細胞表面発現、すなわち、細胞表面に発現されるマーカータンパク質の量または相対量を指す場合がある。発現レベルは、当該技術分野で公知の方法により決定し得る。例えば、ｍＲＮＡの発現レベルは、ノーザンブロッティング／アレイ解析によって決定してもよく、また、タンパク質の発現は、ウェスタンブロッティングによって、または好ましくは細胞表面発現用抗体染色を用いたＦＡＣＳによって決定してもよい。

【0283】

特に、Ｔｒｅｇは、ナイーブＴｒｅｇであってもよい。本明細書中で同義に用いられる「ナイーブ制御性Ｔ細胞、ナイーブＴ制御性細胞、またはナイーブＴｒｅｇ」とは、ＣＤ４５ＲＡを発現する（特に、ＣＤ４５ＲＡを細胞表面に発現する）Ｔｒｅｇ細胞を指す。よって、ナイーブＴｒｅｇは、ＣＤ４５ＲＡ⁺と記載される。ナイーブＴｒｅｇが、一般に、ペプチド／ＭＨＣによって内因性ＴＣＲを介して活性化されていないＴｒｅｇを表すのに対し、エフェクター／メモリーＴｒｅｇは、刺激により内因性ＴＣＲを介して活性化されたＴｒｅｇに関する。典型的には、ナイーブＴｒｅｇは、ナイーブ以外のＴｒｅｇ細胞（例えば、メモリーＴｒｅｇ細胞）よりも、ＣＤ４５ＲＡを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％多く発現しうる。代替的な見方によれば、ナイーブＴｒｅｇ細胞は、非ナイーブＴｒｅｇ細胞（例えば、メモリーＴｒｅｇ細胞）と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍の量のＣＤ４５ＲＡを発現しうる。ＣＤ４５ＲＡの発現のレベルは、当該技術分野の方法、例えば、市販の抗体を用いたフローサイトメトリーによって、容易に決定することができる。典型的には、非ナイーブＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４５ＲＡを発現しないか、もしくはＣＤ４５ＲＡを低レベルで発現する。
特に、ナイーブＴｒｅｇはＣＤ４５ＲＯを発現しなくてもよく、ＣＤ４５ＲＯ^-と考えられてもよい。よって、ナイーブＴｒｅｇは、メモリーＴｒｅｇと比較して、ＣＤ４５ＲＯの発現が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％少なくてもよく、あるいは、代替的な見方によれば、メモリーＴｒｅｇ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＯの発現が少なくとも１／２、１／３、１／４、１／５、１／１０、１／５０、または１／１００であってもよい。

【0284】

ナイーブＴｒｅｇは、上述の通り、ＣＤ２５を発現するが、ナイーブＴｒｅｇの由来によっては、ＣＤ２５の発現レベルが、メモリーＴｒｅｇにおける発現レベルと比べて低くなってもよい。例えば、末梢血から単離されたナイーブＴｒｅｇの場合、ＣＤ２５の発現レベルは、メモリーＴｒｅｇと比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低くてもよい。このようなナイーブＴｒｅｇは、中レベルから低レベルのＣＤ２５を発現すると考えてもよい。しかしながら、当業者であれば、臍帯血から単離されたナイーブＴｒｅｇでは、このような差異が見られない場合があることを理解するであろう。

【0285】

本明細書中で定義するナイーブＴｒｅｇは、典型的には、ＣＤ４⁺、ＣＤ２５⁺、ＦＯＸＰ３⁺、ＣＤ１２７^low、ＣＤ４５ＲＡ⁺であってもよい。

【0286】

本明細書中で使用するＣＤ１２７の低発現とは、同一の対象またはドナーからのＣＤ４⁺非制御性細胞またはＴｃｏｎ細胞と比較して、ＣＤ１２７の発現レベルが低いことを指す。詳細には、ナイーブＴｒｅｇは、同一の対象またはドナーからのＣＤ４⁺非制御性またはＴｃｏｎ細胞と比較して、ＣＤ１２７の発現が９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％未満であってもよい。ＣＤ１２７のレベルは、抗ＣＤ１２７抗体で染色した細胞のフローサイトメトリーを含む、当該技術分野で標準的な方法によって評価することができる。

【0287】

典型的には、ナイーブＴｒｅｇは、ＣＣＲ４、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸＣＲ３、および／またはＣＣＲ６を発現しないか、または低レベルで発現する。詳細には、ナイーブＴｒｅｇは、メモリーＴｒｅｇと比較して、ＣＣＲ４、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸＣＲ３、およびＣＣＲ６をより低いレベルで発現してもよく、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低いレベルで発現してもよい。

【0288】

ナイーブＴｒｅｇは、さらに、ＣＣＲ７⁺およびＣＤ３１⁺を含む、さらに別のマーカーを発現してもよい。

【0289】

単離されたナイーブＴｒｅｇは、当該技術分野で公知の方法によって同定すればよく、そのような方法としては、単離された細胞の細胞表面における、上述のマーカーのいずれか１つ以上の一団の有無を決定することが挙げられる。例えば、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７ｌｏｗを使用して、ある細胞がナイーブＴｒｅｇであるかどうかを決定することができる。単離された細胞がナイーブＴｒｅｇであるか、または所望の表現型を有するか否かを決定する方法は、実施してもよい追加の工程に関連して後述するように実施することができ、また、細胞マーカーの存在および／または発現レベルを決定する方法は、当該技術分野では周知であり、例えば、市販の抗体を用いたフローサイトメトリーが挙げられる。

【0290】

好適には、Ｔｒｅｇ等の細胞は、対象から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。好適には、前記ＰＢＭＣを得る対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。好適には、前記細胞は、操作された細胞が投与される対象に対し、一致（例えば、ＨＬＡ一致）しているか、または、自己由来である。好適には、前記治療される対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。前記細胞は、患者自身の末梢血（第１当事者）、または、造血幹細胞移植の場合、ドナーの末梢血（第２当事者）、もしくは血縁関係のない（ｕｎｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）ドナー（第三者）からの末梢血、のいずれかから、エクスビボで生成されてもよい。好適には、前記細胞は、操作された細胞が投与される対象に対し、自己由来である。

【0291】

好適には、Ｔｒｅｇは、細胞の集団の一部である。好適には、前記Ｔｒｅｇの集団は、Ｔｒｅｇを少なくとも７０％含み、例えば、Ｔｒｅｇを少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％含む。このような集団を「富化Ｔｒｅｇ集団」とも称する。

【0292】

いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、誘導性前駆細胞（例えば、ｉＰＳＣ）または胚性前駆細胞のＴｒｅｇへのエクスビボ分化に由来していてもよい。Ｔｒｅｇへの分化前または分化後の前記誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞に本明細書に記載の核酸分子またはベクターが導入されてもよい。分化の好適な方法は、当該技術分野で公知であり、Ｈａｑｕｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．， ２０１６， １１７， ５４７２０（参照により本明細書に組み込む）に開示されている方法が挙げられる。

【0293】

本明細書中で使用する「従来のＴ細胞」またはＴｃｏｎもしくはＴｃｏｎｖ（本明細書中で同義に用いられる）という用語は、αβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ならびに分化抗原群４（ＣＤ４）または分化抗原群８（ＣＤ８）であってもよい共受容体を発現し、かつ免疫抑制機能を有さないＴリンパ球細胞を意味する。従来のＴ細胞は、末梢血、リンパ節、および組織に存在する。好適には、前記操作されたＴｒｅｇは、ＦＯＸＰ３をコードする配列を含む核酸を導入することによってＴｃｏｎから生成されてもよい。あるいは、前記操作されたＴｒｅｇは、ＩＬ－２およびＴＧＦ－βの存在下でのＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦＯＸＰ３－細胞のインビトロ培養によってＴｃｏｎから生成されてもよい。

【0294】

本明細書中のＴｒｅｇは、外因性のＦＯＸＰ３を含まないＴｒｅｇ細胞と比較して、高い持続性を有し得る。本明細書中で使用する「持続性」は、Ｔｒｅｇが特定の環境、例えばインビボ（例えば、ヒト患者または動物モデル）において生存できる時間の長さを定義するものである。本明細書中に開示するＴｒｅｇは、本明細書中の核酸分子を含まないＴｒｅｇと比較して、持続性が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い場合がある。

【0295】

別の実施形態では、核酸分子、構築物、またはベクターが導入される標的細胞は、治療のための細胞ではない。ある実施形態では、前記細胞は生産宿主細胞である。前記細胞は、核酸の産生、例えばクローニング、またはベクターの産生、またはポリペプチドの産生のための細胞であってもよい。

【0296】

本発明はまた、本明細書中で定義または記載する細胞を含む細胞集団も提供する。ある細胞集団は、本明細書中で定義する核酸分子、発現構築物、またはベクターを含む本発明の細胞と、本発明の核酸分子、発現構築物、またはベクターを含まない細胞、例えば、形質導入されていない細胞もしくはトランスフェクトされていない細胞と、の両方を含む場合があることが理解されるであろう。好ましい実施形態では集団中の全ての細胞が本発明の核酸、発現構築物、またはベクターを含んでいてもよいが、本発明の核酸、発現構築物、またはベクターを含む細胞を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％有する細胞集団が提供される。

【0297】

また、本明細書中で定義または記載する細胞または細胞集団と本明細書中で定義するベクターとを含む医薬組成物も提供される。ベクターは、遺伝子治療に使用されてもよい。よって、細胞を投与するのではなく、代わりにベクターを投与して、対象における内因性細胞を改変し、導入された核酸分子を発現させるようにしてもよい。遺伝子治療に使用するのに適したベクターは、当該技術分野で公知であり、ウイルスベクターが挙げられる。

【0298】

医薬組成物とは、治療上有効量の薬学的に活性な薬剤、すなわち、前記細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）、細胞集団、もしくはベクターを含むか、またはこのような薬剤からなる組成物である。医薬組成物は、製薬上許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤（それらの組み合わせを含む）を含むことが好ましい。治療用途のための許容可能な担体または希釈剤は、製薬分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． （Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。薬学的担体、賦形剤、または希釈剤の選択は、意図する投与経路と標準的な薬務とを考慮して選択できる。前記医薬組成物は、担体、賦形剤、もしくは希釈剤として、またはそれらに加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、または可溶化剤を含んでもよい。

【0299】

「製薬上許容可能」には、製剤が無菌かつパイロジェンフリー（発熱物質を含まない）であることが含まれる。担体、希釈剤、および／または賦形剤は、前記細胞またはベクターと適合し、そのレシピエントに対して有害でないという意味で、「許容可能」なものである必要がある。典型的には、前記担体、希釈剤、および賦形剤は、無菌かつパイロジェンフリーである生理食塩水または輸液媒体であるが、他の許容可能な担体、希釈剤、および賦形剤を使用してもよい。

【0300】

製薬上許容可能な担体の例としては、例えば、水、塩類溶液、アルコール、シリコーン、ワックス、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、ペトロエスラル脂肪酸エステル（ｐｅｔｒｏｅｔｈｒａｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒｓ）、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドン等が挙げられる。

【0301】

前記細胞、細胞集団、または医薬組成物は、所望の疾患または状態を治療および／または予防するのに適した方法で投与することができる。投与量および投与頻度は、対象の状態ならびに対象の疾患または状態の種類および重症度等の各種要因によって決定されるが、適切な用量は臨床試験によって決定されてもよい。医薬組成物はそれに応じて配合され得る。
本明細書に記載の細胞、細胞集団、または医薬組成物は、非経口投与、例えば、静脈内投与することもできるし、輸液技術により投与してもよい。前記細胞、細胞集団、または医薬組成物は、無菌水溶液の形態で投与されてもよく、該無菌水溶液は、他の物質、例えば、該溶液を血液と等張にするのに十分な塩類またはグルコースを含んでもよい。前記水溶液は、適切に緩衝（好ましくは、ｐＨ３～９に）されてもよい。医薬組成物はそれに応じて配合され得る。無菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に成し遂げられる。

【0302】

前記医薬組成物は、輸液媒体中、例えば無菌等張液中に、細胞を含んでもよい。前記医薬組成物は、ガラス製またはプラスチック製の、アンプル、使い捨て注射器、または複数回投与バイアルに封入してもよい。

【0303】

前記細胞、細胞集団、または医薬組成物は、単回投与で投与してもよく、複数回投与で投与してもよい。特に、前記細胞、細胞集団、または医薬組成物は、単回で、１回限りで投与されてもよい。医薬組成物はそれに応じて配合され得る。

【0304】

前記医薬組成物は、１種以上の活性剤をさらに含んでもよい。医薬組成物はさらに、リンパ球枯渇剤（例えば、サイモグロブリン、キャンパス－１Ｈ、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、シクロホスファミド、フルダラビン）、ｍＴＯＲの阻害剤（例えば、シロリムス、エベロリムス）、共刺激経路を阻害する薬剤（例えば、抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＣＴＡＬ４Ｉｇ）、および／または特異的なサイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１７、ＴＮＦａｌｐｈａ、ＩＬ１８）を阻害する薬剤等の、１つ以上の他の治療薬を含んでもよい。

【0305】

治療する疾患／状態および対象、ならびに投与経路に応じて、前記細胞、細胞集団、または医薬組成物を様々な投与量（例えば、細胞数／ｋｇまたは細胞数／対象で測定）で投与し得る。いずれにしても、医師が、任意の個々の対象に最も適した実際の用量を決定し、その用量は、当該特定の対象の年齢、体重および反応によって異なる。しかしながら、典型的には、本明細書中の細胞については、１対象当たり５×１０⁷～３×１０⁹個の細胞、または１０⁸～２×１０⁹個の細胞が投与され得る。

【0306】

前記細胞は、医薬組成物において使用するために適宜改変されてもよい。例えば、細胞は、凍結保存されて適切な時に解凍されてから、対象に注入されてもよい。

【0307】

本発明は、本明細書中の細胞、細胞集団、および／または医薬組成物を含むキットの使用をさらに含む。好ましくは、前記キットは、本明細書に記載の方法および使用、例えば、本明細書に記載の治療方法において用いるためのものである。好ましくは、前記キットは、当該キットの構成要素の使用説明書を含む。

【0308】

本明細書中の細胞、細胞集団、組成物、およびベクターは、疾患または状態、とりわけ、ＣＡＲによって、またはＣＡＲを用いて治療され得る疾患または状態の治療または予防に用いるためのものであってもよい。前記細胞およびそれらを含む組成物は、養子細胞療法（ＡＣＴ）のためのものである。本開示に係るＣＡＲを発現する、特にＴｒｅｇ細胞をはじめとする細胞の投与によって、様々な状態を治療し得る。上記のように、これは、免疫抑制、特にＴｒｅｇ細胞の免疫抑制効果に応答する状態であってもよい。よって、本明細書に記載の細胞、細胞集団、組成物、およびベクターは、対象において免疫抑制を誘導または達成するために使用されてもよい。投与されたＴｒｅｇ細胞、またはインビボで改変されたＴｒｅｇ細胞は、ＣＡＲの発現によって標的化され得る。このような治療に適した状態としては、感染症、神経変性疾患、または炎症性疾患、あるいはより広範には、任意の望ましくないもしくは不必要なもしくは有害な免疫応答に関連付けられる状態が挙げられる。
治療または予防されるべき状態としては、炎症、別の言い方をすれば、炎症に関連付けられる状態または炎症を含む状態が挙げられる。炎症は、慢性であってもよく、急性であってもよい。さらに、炎症は、低レベルの炎症であってもよく、全身性炎症であってもよい。例えば、炎症は、代謝障害、例えばメタボリックシンドロームに関連して起こる炎症であってもよく、インスリン抵抗性またはＩＩ型糖尿病もしくは肥満等に関連して起こる炎症であってもよい。

【0309】

特に、前記細胞、細胞集団、ベクター、および医薬組成物は、移植片に対する寛容を誘導する手段、細胞性移植拒絶反応および／または液性移植拒絶反応を治療および／または予防する手段、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患、またはアレルギー疾患を治療および／または予防する手段、組織修復および／または組織再生を促進する手段、あるいは、炎症を寛解させる手段を提供する。前記細胞、細胞集団、ベクター、および医薬組成物は、本明細書に記載の細胞、細胞集団、ベクター、または医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法において使用されてもよい。

【0310】

本明細書中、「移植片に対する寛容を誘導する」とは、レシピエントにおいて移植された臓器に対する寛容を誘導することを指す。言い換えれば、移植片に対する寛容を誘導するとは、ドナーの移植臓器に対するレシピエントの免疫応答のレベルを低下させることを意味する。移植された臓器に対する寛容を誘導することによって、移植レシピエントが必要とする免疫抑制薬の量を減少させ得、あるいは、免疫抑制薬の使用を中止することが可能になり得る。

【0311】

例えば、前記操作された細胞、例えばＴｒｅｇは、黄疸、暗色尿、痒み、腹部膨隆、腹部圧痛、疲労、吐き気、嘔吐、および／または食欲不振等の疾患のうちの少なくとも１つの症状を軽減、減少、または改善させるために、疾患を有する対象に投与されてもよい。上記少なくとも１つの症状は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％軽減、低減、または改善され得、あるいは、上記少なくとも１つの症状は完全に緩和され得る。

【0312】

前記操作された細胞、例えばＴｒｅｇは、疾患の進行を遅延、減少、または阻止するために、疾患を有する対象に投与されてもよい。疾患の進行は、前記操作された細胞が投与されない対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％遅延、減少、または阻止され得、あるいは、疾患の進行は完全に停止され得る。

【0313】

一実施形態では、前記対象は、免疫抑制療法を受けている移植レシピエントである。

【0314】

好適には、前記対象は哺乳動物である。好適には、前記対象はヒトである。

【0315】

移植は、肝臓移植、腎臓移植、心臓移植、肺移植、膵臓移植、腸管移植、胃移植、骨髄移植、血液柄付複合組織移植（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒａｆｔ）、および皮膚移植から選択され得る。

【0316】

好適には、ＣＡＲは、移植片（ｇｒａｆｔ（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ））のドナーには存在するが移植片のレシピエントには存在しないＨＬＡ抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインを含んでもよい。

【0317】

好適には、移植は肝臓移植である。移植が肝臓移植である実施形態では、前記抗原は、移植された肝臓には存在するが患者には存在しないＨＬＡ抗原、ＮＴＣＰ等の肝臓特異的抗原、または、ＣＣＬ１９、ＭＭＰ９、ＳＬＣ１Ａ３、ＭＭＰ７、ＨＭＭＲ、ＴＯＰ２Ａ、ＧＰＮＭＢ、ＰＬＡ２Ｇ７、ＣＸＣＬ９、ＦＡＢＰ５、ＧＢＰ２、ＣＤ７４、ＣＸＣＬ１０、ＵＢＤ、ＣＤ２７、ＣＤ４８、ＣＸＣＬ１１等の拒絶反応時に発現が上昇する抗原であってもよい。

【0318】

上述の通り、代表的な好ましい一実施形態では、前記抗原はＨＬＡ－Ａ２である。

【0319】

疾患または状態を治療するためのある方法は、本明細書中の細胞の治療的使用に関する。この点に関して、細胞は、既存の疾患または状態を有する対象に対して、その疾患または状態に関連付けられる少なくとも１つの症状を軽減、減少、または改善させるため、かつ／あるいは、疾患の進行を遅延、減少、または阻止するために、投与されてもよい。

【0320】

好適には、細胞性移植拒絶反応および／または液性移植拒絶反応を治療および／または予防するとは、移植レシピエントに必要な免疫抑制薬の量が減少するように有効量の細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）を投与することを指す場合もあり、免疫抑制薬の使用を中止することを可能にする場合もある。

【0321】

疾患または状態を予防することは、本明細書中の細胞の予防的使用に関する。この点に関して、細胞は、疾患または状態にまだ罹患していないか、または、疾患または状態をまだ発症しておらず、かつ／あるいは、疾患または状態の症状を示していない対象に対して、当該疾患または状態を予防するため、または、当該疾患または状態に関連付けられる少なくとも１つの症状の発症を低減または防止するために、投与されてもよい。前記対象は、疾患または状態の素因を有している場合もあり、疾患または状態を発症するリスクがあると考えられる場合もある。

【0322】

自己免疫疾患またはアレルギー疾患は、乾癬および皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）を含む炎症性皮膚疾患；炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎等）に関連付けられる応答；皮膚炎；食物アレルギー、湿疹、および喘息等のアレルギー症状；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（ループス腎炎および皮膚ループスを含む）；真性糖尿病（例えば、１型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病）；多発性硬化症；神経変性疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＰＤ）、ならびに若年性糖尿病から選択され得る。

【0323】

本明細書中の医療的使用または方法は、以下の工程を含み得る：
（ｉ）細胞含有試料を単離するか、または、細胞含有試料を用意する工程；
（ｉｉ）前記細胞に、本明細書中で定義する核酸分子、構築物、またはベクターを導入する工程；
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で得られた細胞を対象に投与する工程。
前記細胞は、本明細書中で定義するＴｒｅｇであってもよい。本方法の前記工程（ｉｉ）の前および／または後に、前記細胞含有試料から富化Ｔｒｅｇ集団を単離および／または生成してもよい。例えば、工程（ｉｉ）の前および／または後に単離および／または生成を行って、富化Ｔｒｅｇ試料を単離および／または生成してもよい。工程（ｉｉ）の前に富化を行って、本明細書に記載のＣＡＲ、ポリヌクレオチド、および／またはベクターを含む細胞および／またはＴｒｅｇを富化してもよい。

【0324】

好適には、前記細胞は、自己由来であってもよい。好適には、前記細胞は、同種異系であってもよい。

【0325】

好適には、前記細胞（例えば、前記操作されたＴｒｅｇ）は、リンパ球枯渇剤（例えば、上述の通り）等の１種以上の他の治療薬と組み合わせて投与されてもよい。前記操作された細胞、例えばＴｒｅｇは、前記１種以上の他の治療薬と同時に投与されてもよく、前記１種以上の他の治療薬と順番に（例えば、その前または後で）投与されてもよい。

【0326】

好適には、前記対象は哺乳動物である。好適には、前記対象はヒトである。

【0327】

細胞、例えばＴｒｅｇは、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体または抗ＣＤ３モノクローナル抗体と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体との両方で処理することによって、本明細書に記載の核酸分子の導入前または導入後に、活性化および／または増殖させてもよい。増殖プロトコルは上述の通りである。

【0328】

前記細胞、例えばＴｒｅｇは、本方法の各工程後、特に増殖後に、洗浄されてもよい。

【0329】

前記操作された細胞、例えばＴｒｅｇ細胞の集団は、当業者に公知の任意の方法、例えばＦＡＣＳまたは磁気ビーズソーティングによって、さらに富化されてもよい。

【0330】

本製造方法の各工程は、閉鎖された無菌細胞培養系で行われてもよい。

【0331】

本発明はさらに、本明細書中で定義する安全スイッチポリペプチドを、例えば細胞表面に、発現している細胞を除去するための方法または手段を提供する。前記細胞は、本明細書中で定義または記載する核酸分子またはベクターまたは組換え構築物を含む細胞、すなわち、当該核酸分子またはベクターまたは構築物が導入された細胞、例えば、本明細書に記載のベクターによって形質導入された細胞であってもよい。

【0332】

一般に、本方法は、標的細胞を、安全スイッチポリペプチドがその効果を引き出すことを可能にする条件または薬剤に曝露することを含む。このような条件は、本明細書中でいうところの許容的条件である。これは、細胞に、前記安全スイッチポリペプチドと共に細胞の除去を起こすように作用する薬剤を接触させること（対象への投与を含む）を含んでもよい。例えば、前記薬剤は、安全スイッチポリペプチドのための活性化分子または活性化基質であってもよい。上記のリツキシマブ－エピトープ含有スイッチの文脈では、本方法は、細胞を、リツキシマブまたはリツキシマブの結合特異性を有する抗体（すなわち、同等の抗体）に曝露する工程を含む。

【0333】

典型的には、リツキシマブは、補体媒介性の細胞死滅を起こすことでその効果を発揮するが、他の機構、例えばＡＤＣＣが関与してもよい。したがって、一実施形態では、前記細胞は、補体と、リツキシマブ、または同等の抗体とに曝露されてもよい。

【0334】

前記方法には、細胞を除去させるためにインビトロで行われる方法、例えば、培養中に行われる方法が含まれる。ただし、主な用途は、インビボで細胞を除去すること、すなわち、以前に対象に投与された細胞を除去することである。
これは、インビボにおいて、以前に前記細胞が投与された対象、言い換えれば、前記安全スイッチポリペプチドを発現する本明細書中で定義する細胞、または前記安全スイッチポリペプチドを発現させるために内因性細胞を改変するためのベクターを用いたＡＣＴを以前に受けた対象に、前記リツキシマブまたは同等の抗体を投与することによって達成し得ることが理解されるであろう。補体は、対象に内因的に存在してもよい。

【0335】

よって、リツキシマブ、またはその結合特異性を有する抗体を、本発明の細胞と組み合わせてＡＣＴに使用するために提供してもよい。前記細胞または核酸またはベクターまたは前記細胞の製造のための構築物と、前記リツキシマブまたは同等の抗体とを、キットで提供してもよいし、組み合わせ製品として提供してもよい。
前記安全スイッチポリペプチドが細胞の表面に発現すると、リツキシマブまたは同等の抗体が当該ポリペプチドのＲエピトープに結合することにより、細胞の溶解が起こる。

【0336】

リツキシマブの結合特異性を有する抗体とは、リツキシマブと同じ天然のエピトープに結合することが可能な抗体である。詳細には、前記抗体は、エピトープＲ１およびＲ２に結合可能である。
リツキシマブの結合特異性を有する抗体は、リツキシマブの抗原結合ドメインまたはリツキシマブ由来の抗原結合ドメインを含んでもよい。より詳細には、リツキシマブ由来のＶＬおよびＶＨドメイン、またはリツキシマブのＣＤＲを含んでもよい。さらに、リツキシマブの抗原結合ドメインは、リツキシマブの結合特異性が保持される限り、（例えば、アミノ酸の置換、欠失、または挿入によって）改変されてもよい。

【0337】

上述のように、リツキシマブのバイオシミラーが入手可能であり、これらを使用してもよい。当業者であれば、リツキシマブの結合特異性を有する抗体を、当該抗体のための利用可能なアミノ酸配列を使用して、日常的に使用される方法を用いて容易に調製することができる。

【0338】

ある実施形態では、リツキシマブの結合特異性を有する抗体は、従来の免疫グロブリン形式である。すなわち、前記抗体は、軽鎖と重鎖、および定常領域と可変領域との両方を含み得る。前記抗体は２価であってもよい、すなわち、２つの抗原結合部位を含んでもよい。他の抗体形式を使用してもよく、例えば、単鎖形式または１価形式を使用してもよい。このように、前記抗体は、どのようなクラスもしくはタイプ、または形式であってもよい。

【0339】

細胞表面に発現する安全スイッチポリペプチド１つにつき、リツキシマブまたは同等の抗体の分子２つ以上が結合し得る。ポリペプチドの各Ｒエピトープは、リツキシマブまたは同等の抗体の別々の分子に結合し得る。

【0340】

移入された細胞を除去するという決定は、対象において検出される、これら移入された細胞が原因と考えられる望ましくない作用を理由になされる場合がある。例えば、許容できないレベルの毒性が検出される場合がある。

【0341】

ＣＤ２０発現細胞を、抗体リツキシマブを用いた治療により、選択的に除いてもよい。ＣＤ２０発現は、形質細胞には存在しないため、Ｂ細胞区画を除去したとしても、リツキシマブ治療後も液性免疫は保たれる。

【0342】

本発明はまた、細胞の安定性および／または抑制機能を増加させるための方法であって、本明細書中で提供する核酸分子、発現構築物、またはベクターを細胞に導入する工程を含む方法も提供し得る。抑制機能の増加は、上述のようにして、例えば、活性化された抗原特異的Ｔｃｏｎｖ細胞を本発明の細胞と共培養し、例えば前記Ｔｃｏｎｖ細胞によって産生されるサイトカインのレベルを測定することによって、測定することができる。抑制機能の増加は、非操作Ｔｒｅｇ、または、前記３つのポリペプチド（すなわち、安全スイッチポリペプチド、ＦＯＸＰ３、およびＣＡＲ）をコードする３つのポリヌクレオチド配列の配置が異なる核酸構築物、例えば、ＦＯＸＰ３、安全スイッチポリペプチド、およびＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを５’から３’へ含む構築物を含むＴｒｅｇと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の増加であってもよい。

【0343】

本明細書中で定義する細胞、例えばＴｒｅｇの安定性の増加とは、非操作Ｔｒｅｇ、または、前記３つのポリペプチド（すなわち、安全スイッチポリペプチド、ＦＯＸＰ３、およびＣＡＲ）をコードする３つのポリヌクレオチド配列の配置が異なる核酸構築物、例えば、ＦＯＸＰ３、安全スイッチポリペプチド、およびＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを５’から３’へ含む構築物を含むＴｒｅｇと比較して、それらの細胞の持続性もしくは生存率が高いこと、または、ある期間にわたってＴｒｅｇ表現型を保持する細胞の（例えば、ＦＯＸＰ３およびＨｅｌｉｏｓ等のＴｒｅｇマーカーを保持する細胞に対する）割合が高いことを指す。安定性の増加は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の安定性の増加であってもよく、当該技術分野で公知の技術、例えば、ある細胞集団内のＴｒｅｇ細胞マーカーの染色とＦＡＣＳによる分析とによって測定してもよい。

【0344】

本発明はまた、細胞内でキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、安全スイッチ、およびＦＯＸＰ３をコードする核酸分子からのＦＯＸＰ３の発現を増強する方法であって、
（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードする第２のヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）ＣＡＲをコードする第３のヌクレオチド配列と、を５’から３’へ含む核酸分子を選択することと、
前記核酸分子を前記細胞に導入することと、を含む方法も提供し得る。

【0345】

本方法は、前記核酸分子を製造する工程（例えば、ＦＯＸＰ３をコードするヌクレオチド配列を、自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流、かつＣＡＲをコードするヌクレオチド配列の上流に位置決めする工程）をさらに含んでもよい。よって、前記細胞への核酸分子の導入後にＦＯＸＰ３の発現の増強をもたらすのは、核酸分子内の上記のように５’から３’への方向に（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の順序である。特に、前述の通り、ＣＡＲはＨＬＡ Ａ２を標的とし得る。さらに、またはあるいは、前記核酸分子がＳＦＦＶプロモーターを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉ）が前記プロモーターに作動可能に連結されていてもよい。

【0346】

さらなる態様において、本発明は、５’から３’へ、
（ｉ）自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）ＦＯＸＰ３をコードする第２のヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第３のヌクレオチド配列、を含む核酸分子の、細胞内で自殺部分、ＦＯＸＰ３、およびＣＡＲを発現させるための使用であって、ＦＯＸＰ３の発現が増強される、使用を提供する。

【0347】

本方法または本使用は、安全スイッチとＣＡＲとＦＯＸＰ３とをコードする核酸分子からのＦＯＸＰ３の発現を「増強」することに関する。この点に関して、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」または「改善する（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ）」は、「増強する（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」と同義に使用される場合があり、前述のように、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）が本発明の核酸分子とは異なる順序で位置する（すなわち、５’から３’への方向に（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の順序ではない）核酸分子を用いて形質導入された細胞において得られるＦＯＸＰ３ｍＲＮＡまたはＦＯＸＰ３タンパク質の発現レベルと比較して、形質導入細胞内のＦＯＸＰ３ｍＲＮＡまたはＦＯＸＰ３タンパク質のレベルが高いことに関する。よって、本発明の核酸分子は、安全スイッチポリペプチド、ＦＯＸＰ３、およびＣＡＲをコードする同じヌクレオチド配列を含むがそれらのヌクレオチド配列が異なる遺伝子順序で存在する他の比較核酸分子と比較して、細胞におけるＦＯＸＰ３の発現を増強するために用いることができる。

【0348】

別の態様において、本発明者らは、前記安全スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列がＳＦＦＶプロモーターに作動可能に連結されている場合、リツキシマブによって認識される少なくとも１つのＣＤ２０エピトープの自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドを発現する核酸分子（例えば、本発明の核酸分子）を形質導入した細胞のリツキシマブに対する感受性が増加し得ることをさらに示した。この点に関して、本発明は、リツキシマブによって認識される少なくとも１つのＣＤ２０エピトープの自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドを発現する細胞のリツキシマブに対する感受性を増加させる方法であって、前記細胞に、前記安全スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であってＳＦＦＶプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む核酸分子を導入する工程を含む、方法をさらに提供する。

【0349】

代替的な見方によれば、本発明は、リツキシマブによって認識される少なくとも１つのＣＤ２０エピトープの自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドを発現する細胞のリツキシマブに対する感受性を増加させる方法であって、ＳＦＦＶプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列から前記安全スイッチポリペプチドを発現させる工程を含む、方法を提供する。リツキシマブによって認識されるＣＤ２０エピトープを含む特定の安全スイッチポリペプチドは、前述した通りである。

【0350】

本発明は、ＳＦＦＶプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む核酸分子の使用であって、前記ヌクレオチド配列が、リツキシマブに対する細胞の感受性を増加させるために、リツキシマブによって認識される少なくとも１つのＣＤ２０エピトープの自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードする、使用をさらに提供する。

【0351】

本明細書において「リツキシマブに対する細胞の感受性を増加させる」とは、細胞がリツキシマブによって欠失または枯渇させられる能力を高めることを意味する。よって、リツキシマブに対する感受性を増加させるとは、１つの態様においては、リツキシマブが特定の濃度で細胞を欠失または枯渇させる能力の増加（例えば、より多数の細胞またはより高い割合の細胞を欠失または枯渇させる能力、あるいは、特定の数の細胞または特定の割合の細胞をより短時間で欠失または枯渇させる能力）を指す。代替的な見方によれば、リツキシマブに対する感受性を増加させるとは、リツキシマブがより低い濃度で細胞を欠失または枯渇させる能力を指し得る。典型的には、リツキシマブによる欠失または枯渇に対する細胞の感受性の増加は、リツキシマブによって認識される少なくとも１つのＣＤ２０エピトープの自殺部分を含む安全スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（特に、上記核酸と同じヌクレオチド配列）であってＳＦＦＶではないプロモーター、例えば、ＥＦＳまたはＰＧＳであるプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む核酸分子を形質導入した細胞との比較である。よって、詳細には、感受性の増加とは、特定の濃度のリツキシマブでの処理後にＳＦＦＶプロモーターの制御下で安全スイッチポリペプチドを発現する細胞集団において得られる欠失率（％）または枯渇率（％）が、同じ濃度のリツキシマブでの処理後にＳＦＦＶではないプロモーター（例えば、ＥＦＳまたはＰＧＳ）の制御下で安全スイッチポリペプチドを発現する細胞集団において得られる欠失率または枯渇率と比較して、より高いことを指す場合がある。典型的には、この、より高い欠失率または枯渇率とは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％である場合がある。あるいは、リツキシマブに対する感受性の増加とは、ＳＦＦＶではないプロモーター（例えば、ＥＦＳまたはＰＧＳ）の制御下で安全スイッチポリペプチドを発現する細胞集団において細胞を欠失または枯渇させるのに必要なリツキシマブの濃度と比較して、リツキシマブの濃度がより低い（例えば、リツキシマブの濃度が１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低い）場合でもＳＦＦＶプロモーターの制御下で安全スイッチポリペプチドを発現する細胞集団において同レベル（すなわち、同量）の欠失または枯渇を達成する能力を指す場合がある。

【0352】

細胞の欠失または枯渇は、前述したように決定および測定することができる。
本開示は、本明細書中で開示する例示的な方法および材料に限定されず、本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を、本開示の実施形態の実施または試験において用いることが可能である。数値範囲は、当該範囲を定義する数を含む。特に断らない限り、いずれの核酸配列も左から右へ５’から３’の方向に、また、アミノ酸配列は左から右へアミノからカルボキシの方向に、それぞれ書かれている。

【0353】

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間にある、文脈上明らかにそうでない場合を除き下限の単位の１０分の１までの、各介在値も具体的に開示されていると理解される。記載された範囲内の任意の記載値または介在値とその記載された範囲内の任意の他の記載値または介在値との間にある、より小さい範囲は、それぞれ、本開示に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、当該範囲に含まれてもよく、当該範囲から除外されてもよく、上限および下限のどちらかがより小さい範囲に含まれる場合、上限および下限がどちらもより小さい範囲に含まれない場合、または上限および下限の両方がより小さい範囲に含まれる場合の各範囲も、記載された範囲における任意の具体的に除外された上限または下限を除いて、本開示に包含される。記載された範囲が上限および下限の一方または両方を含む場合、それらの含まれる上限および下限の一方または両方を除外した範囲も、本開示に含まれる。

【0354】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数の指示対象を含むことに留意されたい。

【0355】

本明細書中で使用する「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であって、包括的またはオープンエンド（ｏｐｅｎ－ｅｎｄｅｄ）であり、記載されていない追加の部材、要素、または方法の工程を除外するものではない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」という用語には、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語も含まれる。

【0356】

本明細書に記載の刊行物は、単に本願の出願日以前の開示内容を示すものである。本明細書中のいかなる内容も、そのような刊行物が添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成すると認めるものと解釈されるべきではない。

【0357】

ここで、本発明を、実施例によりさらに説明するが、これらの実施例は、当該技術分野の通常の技術者による本発明の実施を助けることを意図したものであり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。

【0358】

ここで、本発明を、実施例によりさらに説明するが、これらの実施例は、当該技術分野の通常の技術者による本発明の実施を助けることを意図したものであり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。

【実施例】

【0359】

＜実施例１＞
＜材料および方法＞
［クローニング］
１０種の構築物（図１）を社内で設計し、全配列をヒト細胞での発現にコドン最適化し、製造した。構築物をｐＭＰ７１バックボーンにクローニングし、Ｄ５ａ高効率細菌をプラスミドで形質転換し、選択剤アンピシリンで生育させた。Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出した。ＰＣＲクローニングによりインサートをレンチウイルスバックボーンに移入した。構築物１は、特許請求の範囲に記載される本開示の構築物を表す。構築物ＩＩ～ＶＩは比較構築物であり、構築物ＶＩＩ～Ｘは対照構築物である。

【0360】

［ＰＢＭＣの回収］
白血球コーン（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｃｏｎｅｓ）は、ＮＨＳ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔによって供給された。密度遠心分離プロトコルを用いてＰＢＭＣを単離した。簡単に説明すると、血液を１ｘＰＢＳで１：１希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に重ねた。試料を遠心分離し、白血球層を取り除いてＰＢＳで洗浄した。

【0361】

［ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖの単離プロトコル］
ＨＬＡ－Ａ^*０２陰性ドナー由来の血液コーンを用いてＴｒｅｇ集団およびＴｅｆｆ集団を得た。血液コーンを、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌを用いたネガティブセレクションによるＣＤ４富化に供した。その後、密度遠心分離を用いてＣＤ４＋細胞を単離した。次いで、ＣＤ２５ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いたポジティブセレクションにより、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を単離した。細胞のＣＤ４＋ＣＤ２５－画分を保持し、従来のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）集団とした。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋画分を、フローサイトメトリー抗体ＣＤ４ ＦＩＴＣ（ＯＫＴ４，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５ ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＣ９６，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１２７ ＢＶ４２１（Ａ０１９Ｄ５，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４５ＲＡ ＢＶ５１０（ＨＩ１００，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色した後、ＦＡＣＳソーティングを行った。指示のある場合、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ（バルクＴｒｅｇ）またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ ＣＤ４５ＲＡ＋（ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔｒｅｇ）を選別し、使用した。

【0362】

［Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞］
レトロウイルスパッケージング細胞株Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＧＰ（Ｇａｇ Ｐｏｌを安定発現）をＡＴＣＣから購入し、培養した。

【0363】

［Ｔｃｏｎｖ培地］
１０％熱不活性化ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中で、ヒトＴｃｏｎｖを生育させた。

【0364】

［Ｔｒｅｇ培地および増殖］
ＩＬ－２を添加したＴｅｘｍａｃｓ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中でヒトの制御性Ｔ細胞を培養し、Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）で活性化した。ＩＬ－２添加Ｔｒｅｇ培地を２～３日ごとに細胞に再供給した。Ｔｒｅｇ細胞のさらなる増殖を促進するために、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）による２回目の刺激を行った。

【0365】

［トランスフェクションおよびウイルス粒子作製］
（レトロウイルス）
Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＧＰ細胞を播種し、２４時間培養した。１日目に培地交換した後、該当するプラスミドＤＮＡとエンベローププラスミドとでトランスフェクトした。トランスフェクション混合物を接着Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞の表面全体に滴下し、さらに２４時間インキュベートした。２日目に培地交換し、さらに２４時間インキュベートした。３日目に、Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞からレトロウイルスを含有する上清を取り出し、遠心分離して細胞破片を除去した。
（レンチウイルス）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で２４時間培養した。トランスフェクション試薬を室温に戻し、目的のＤＮＡ構築物／プラスミド、パッケージングプラスミド（ｐＤ８．９１）、およびウイルスエンベロープ（ｐＶＳＶ－Ｇ）と混合した。希釈したＤＮＡにＰＥＩを加えて混合し、ＨＥＫ２９３Ｔに添加した。トランスフェクションの４８時間後に上清を回収し、ろ過し、ウイルスを濃縮した。

【0366】

［Ｔ細胞の形質導入］
Ｔｃｏｎｖを抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）で活性化し、Ｔ細胞培地に再懸濁した。非組織培養処理した２４ウェルプレートをＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（タカラバイオ（Ｔａｋａｈａｒａ－ｂｉｏ）、大津、日本）でコーティングして調製し、細胞懸濁液をレトロウイルス上清／レンチウイルス上清と共に添加した。細胞をインキュベートし、１日おきに培地交換を行った。形質導入の７日後に細胞を実験に使用した。

【0367】

［ＣＡＲおよびＲＱＲ８の発現を測定するためのフローサイトメトリー染色］
培養物からＴ細胞を取り出し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中のＨＬＡ－Ａ^*０２特異的デキストラマー（ＷＢ２７２０－ＡＰＣ，Ｉｍｍｕｄｅｘ）を用いてＨＬＡ－Ａ^*０２特異的ＣＡＲについて染色した。その後、細胞を、まずＰＢＳ中のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色し、次いで、ＦＡＣＳ染色緩衝液中で抗ＣＤ４ ＡＦ７００（ＲＰＡ－Ｔ４，ＢＤ）、抗ＣＤ３４ ＦＩＴＣ（ＱＢＥＮＤ／１０，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、および抗ＣＤ３ ＰＥ－Ｃｙ７で染色した。ＦＯＸＰ３の細胞内染色のために、細胞を固定し、透過処理し、抗Ｆｏｘｐ３ ＰＥ（１５０Ｄ／Ｅ４，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）抗体で染色した。ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで細胞を解析した。

【0368】

［フローサイトメトリーによる形質導入細胞の表現型決定］
培養物からＴ細胞を取り出し、上記のデキストラマーとＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎとを用いて、ＣＡＲと生細胞について染色した。抗ＣＤ４ ＡＦ７００、抗ＣＤ２５ ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＣ９６，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ３９ ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（Ａ１，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、抗－ＣＤ６２Ｌ ＰＥ－ＣＦ５９４（ＤＲＥＧ－５６，ＢＤ）、抗ＴＩＭ３ ＢＶ７８６（７Ｄ３，ＢＤ）、抗ＴＩＧＩＴ ＢＶ６０５（Ａ１５１５３Ｇ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４５ＲＯ ＢＵＶ３９５（ＵＣＨＬ１，ＢＤ）、抗ＣＤ２７９ ＢＵＶ７３７（ＥＨ１２．１，ＢＤ）、および抗ＣＤ２２３ ＢＶ７１１（１１Ｃ３Ｃ６５，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて、細胞の表面染色を行った。細胞を透過処理し、抗Ｆｏｘｐ３ ＰＥ（１５０Ｄ／Ｅ４，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色した。

【0369】

＜ＩＬ－２飢餓アッセイ＞
培養物中で１５日目まで増殖させた形質導入Ｔｒｅｇ細胞を培養物から取り出し、磁気活性化細胞選別（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて富化した。簡単に説明すると、細胞を、まず抗ＣＤ３４（ＱＢＥＮＤ／１０）－ＦＩＴＣで染色した後、Ａｎｔｉ－ＦＩＴＣ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で染色した。次に、これらの細胞をｏｃｔｏＭＡＣＳ ｍａｇｎｅｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に沿ってＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に通し、ＲＱＲ８発現細胞を分離した。これらの富化Ｔ細胞を、Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）と様々な濃度のＩＬ－２と共に培養した。試験したＩＬ－２濃度は、３００ＩＵ／ｍｌ、１５０ＩＵ／ｍｌ、７５ＩＵ／ｍｌ、３０ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、および１ＩＵ／ｍｌであった。インキュベーション後、細胞を取り出し、上記のようにＣＡＲおよびＲＱＲ８の発現を測定するために染色した。記載通りに死細胞染色剤を用いて死細胞を同定した。

【0370】

＜ＣＡＲ特異的Ｔｒｅｇ活性化アッセイ＞
形質導入Ｔｒｅｇを培養物中で１４日間増殖させ、２４時間休ませた後、抗ＣＤ３／２８ビーズとＨＬＡ－Ａ１（Ａ１）またはＨＬＡ－Ａ２（Ａ２）を発現するＫ５６２細胞とでさらに１８時間培養した。固定可能な生死判別色素と、ＣＤ４、ＲＱＲ８およびＣＤ６９とで細胞を染色した。
＜ＣＡＲ特異的活性化および増殖アッセイ＞
Ｔｒｅｇを単離し、構築物Ｉを形質導入し、１４日間増殖させた。アッセイを行うために、細胞を２４時間休ませた後、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で染色し、抗ＣＤ３／２８ビーズと、ＨＬＡ－Ａ１（Ａ１）またはＨＬＡ－Ａ２（Ａ２）を発現するＫ５６２細胞と共に５日間培養した。固定可能な生死判別色素、ＣＤ４、およびＲＱＲ８で細胞を染色した。

【0371】

＜ＲＱＲ８機能評価＞
ＣＤ４５．１マウスの脾臓およびリンパ節からＣＤ３＋リンパ球を単離し、ＲＱＲ８を発現する構築物を形質導入した。雄のＣＤ４５．２マウスに放射線照射し、２４時間後、１０×１０^-6個の形質導入細胞を静脈内注射で移入した。移入後７日目に、該マウスから尾静脈出血により採血した。その後、８日目、１１日目、および１３日目に、半数のマウスをマウスＣＤ２０抗体で処理した（１５０μｇ／匹）。１５日目に、全てのマウスを安楽死させ、肝臓、脾臓、および血液の組織を採取した。組織を単一細胞懸濁液にし、ＣＤ４５．１およびＲＱＲ８（Ｑｂｅｎｄ）で染色することにより、フローサイトメトリー解析用に準備した。

【0372】

＜リツキシマブ媒介ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ除去＞
１４日間の増殖後、ＳＦＦＶまたはＥＦＳによって形質導入したＴｒｅｇを、補体と濃度を漸減させたリツキシマブ抗体と共に４時間インキュベートした。固定可能な生死判別色素（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｄｙｅ）、ＣＤ４、およびＲＱＲ８で細胞を染色した。

【0373】

＜データ解析＞
フローサイトメトリー解析用ソフトウェアＦｌｏｗＪｏ（Ｆｌｏｗｊｏ，ＬＬＣ）を用いて、フローサイトメトリーデータを解析した。全ての統計解析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．５（Ｇｒａｐｈｐａｄ，Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて実施した。

【0374】

＜結果＞
図２は、Ｔ－エフェクター細胞（γ－レトロウイルス（γＲＶ）による形質導入後）における、図１の実験構築物および対照構築物によってコードされた構成要素の発現差異（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を示し、これは、各構築物のコードされた構成要素の発現によって検出されたものである。デキストラマーの検出（すなわち、存在）によってＣＡＲの発現が確認され、ＦＯＸＰ３および安全スイッチポリペプチド（ＲＱＲ８）の発現が示される。構築物Ｉは、ＣＡＲ（デキストラマーの検出）、安全スイッチポリペプチド、およびＦＯＸＰ３の発現を示す。デキストラマーレベルは、構築物ＩＩおよびＩＶと比較すると、構築物Ｉで特に高く、構築物ＩのＦＯＸＰ３レベルは著しく増加している。

【0375】

図３Ａおよび図３Ｂは、γＲＶで低形質導入されたＴｒｅｇにおいて、発現パターンが維持されることを示す。図２に示され、図３で確認されるように、安全スイッチの発現、特にＦＯＸＰ３の発現は、他の構築物と比較して、構築物Ｉから増加する。特に、構築物Ｉは、図３Ｂに示されるように、Ｃ＋Ｆ＋Ｒ＋の強い発現、つまり３つの所望の構成要素の全ての強い発現を示し、Ｃ＋Ｆ＋Ｒ－等の望ましくない変異体の発現を伴わない。構築物Ｉからは所望の発現パターンの発現が増加する。各構成要素を異なる順序でコードするその他の構築物では、前記所望の発現パターンは減少し、望ましくない発現パターンの増加が見られる場合もある。

【0376】

次のステップでは、形質導入効率を調査した。図４は、レンチウイルスベクターでの形質導入後の発現結果を示している。良好な発現レベルが示されており、特に構築物ＩからのＦＯＸＰ３発現が良好である。構築物Ｉでは、その他の実験構築物と比較して、非常に高いデキストラマーを確認できる。図５は、γＲＶとレンチウイルスの性能との比較を示している（構築物Ｉ（図５Ａ）および構築物ＩＶ（図５Ｂ）の場合のレンチウイルスベクターとγＲＶベクターとの対照比較を示している）。これは、レンチウイルスベクターが効率的な細胞形質導入と遺伝子発現とを提供することを示している。これらの結果は、さらに、形質導入された構成要素の発現差異が構築物の遺伝子順序に依存し、使用されたウイルスベクターには依存しないことを示している。特に、構築物Ｉ内での遺伝子の順序が、構築物ＩＶと比較して３つの構成要素の全てについて高い発現をもたらす。

【0377】

図６は、ＦＯＸＰ３含有構築物が形質導入細胞においてＦＯＸＰ３タンパク質のレベルを増加させることを示しており、このことは、構築物Ｉの図６Ｂにおいて特に見られる。構築物ＶＩおよびＶＩＩＩ（対照構築物ＶＩＩＩはＦＯＸＰ３をコードせず）と比較して形質導入ピークの右へのシフトによって示されているように、構築物Ｉの図６Ｂは、形質導入細胞（外因性および内因性のＦＯＸＰ３）におけるＦＯＸＰ３が、非形質導入細胞（内因性のＦＯＸＰ３のみを発現）と比較して高いことを示している。

【0378】

図７は、系統不安定性（ｌｉｎｅａｇｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）下の形質導入Ｔｒｅｇ細胞における外因性ＦＯＸＰ３発現、および形質導入されたＦＯＸＰ３がＴｒｅｇに安定性を付与することを示している。構築物Ｉは、特に、内因性ＦＯＸＰ３発現とは無関係に持続的なＦＯＸＰ３発現を実現する。１１日目でもまだ発現を確認できる。

【0379】

図８は、γＲＶ発現構築物（Ｐｈｏｅｎｉｘ ＧＰ産生／ｐＭＰ７１バックボーン／ＲＤ１１４ａエンベロープ／ＬＴＲプロモーター）のさらなる検証研究の結果を提示している。これもやはり、構築物間の各モジュール（コードされた各構成要素）の発現差異を示している。構築物Ｉは、発現レベルの改善とモジュールの収束が見られることに基づいて選択した。構築物Ｉで得られたＦＯＸＰ３発現レベルは、その他の実験構築物について見られるレベルよりも著しく高くなっている。

【0380】

図９は、レンチウイルスベクター（ＨＥＫ２９３Ｔ産生／ｐＬＮＴバックボーン／ＶＳＶｇエンベロープ／ＳＦＦＶプロモーター）を用いた構築物からの各モジュールの発現パターンを確認したものである。ここでもやはり、発現差異が示され、構築物Ｉで最良の発現が達成されていることがわかる。

【0381】

構築物Ｉによってもたらされる高いＦＯＸＰ３発現レベルがＴｒｅｇ恒常性に及ぼし得る影響を調査した。図１０は、ＦＯＸＰ３発現が増殖および細胞生存に影響を及ぼさないようであることを示しており、ＣＡＲおよびＦＯＸＰ３を発現する細胞とＣＡＲのみを発現する細胞とで、ＩＬ－２飢餓時の増殖および生存が全体的に類似していた。したがって、構築物Ｉによって達成される高いＦＯＸＰ３発現レベルは、細胞にとって有害なものではない。

【0382】

ＦＯＸＰ３発現がＴｒｅｇ表現型に及ぼす影響を研究するため、種々のマーカー（ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、およびＣＤ４５ＲＯ）の発現を調査した。結果を図１１に示す。これは、構築物Ｉを形質導入したＴｒｅｇ細胞が、ＦＯＸＰ３発現の増強を示しながら、Ｔｒｅｇ表現型系統を維持することを示している。ＦＯＸＰ３の発現の改善以外に、Ｔｒｅｇ表現型への影響はない。

【0383】

図１２は、異なるプロモーターを構築物Ｉまたは構築物ＶＩＩＩと共に使用した場合に見られた形質導入効率を示す。ＦＡＣＳプロットは、ＣＤ４＋細胞上のＲＱＲ８発現（ｙ軸）とデキストラマー発現（ｘ軸）とを示している（構築物Ｉを左に、構築物ＶＩＩＩを右に示す）。データは、ＥＦＳプロモーターまたはＳＦＦＶプロモーターを使用して各構築物を発現させた場合に、類似の形質導入効率が得られたことを示している。構築物Ｉと構築物ＶＩＩＩとの間で形質導入レベルを見ると、構築物ＶＩＩＩの方が高い形質導入を示し、形質導入効率が構築物のサイズ（構築物Ｉは３つの遺伝子を持つが、構築物ＶＩＩＩは２つの遺伝子を持つ）にどのように影響されるかを示している。

【0384】

発現がＥＦＳプロモーターまたはＳＦＦＶプロモーターによって制御されている場合の、構築物Ｉまたは構築物ＶＩＩＩのいずれかからＣＡＲを発現するＴｒｅｇの活性化を調査した。図１３は、ＥＦＳプロモーターまたはＳＦＦＶプロモーターのいずれかを使用した場合に、構築物Ｉまたは構築物ＶＩＩＩのいずれかを形質導入したＴｒｅｇが、ＨＬＡ－Ａ２抗原存在下でＣＡＲを介して活性化されることを示している。しかしながら、Ｔｒｅｇ活性化は、ＳＦＦＶプロモーターを使用した場合の方がはるかに高い。形質導入Ｔｒｅｇ（構築物Ｉ）の増殖評価を実施したところ、図１４に見られる結果が得られた。代表的なＦＡＣＳプロットは、ＥＦＳ形質導入細胞（上段のパネル）とＳＦＦＶ形質導入細胞（下段のパネル）とについての、ＣＴＶおよびＲＱＲ８の共染色を示している。グラフは、５日後のＲＱＲ８＋細胞の頻度とＲＱＲ８細胞の総数を示している。灰色の棒グラフは、ＥＦＳ形質導入細胞を示し、黒色の棒グラフは、ＳＦＦＶ形質導入細胞を示す。ドットは、個々のドナーを表し、エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝４～５）。データは、ＣＡＲ－Ｔｒｅｇが抗原特異的刺激後に増殖できること、およびＳＦＦＶプロモーターの使用によって増殖が増強されることを示している。

【0385】

ＲＱＲ８は、構築物Ｉ内で安全スイッチとして使用される。肝臓におけるその有効性を実証するために、マウスＴ細胞にＲＱＲ８を発現する構築物を形質導入し、ＣＤ４５．２マウスで追跡した。ＦＡＣＳプロット（図１５）は、ＣＤ２０非存在下（上段のパネル）およびＣＤ２０存在下（下段のパネル）の、７日目と１５日目の表示した各組織におけるＲＱＲ８抗体での染色を示す。グラフは、血液については７日目と１５日目、脾臓およびリンパ節については１５日目の、ＣＤ４５．１ゲート内のＱｂｅｎｄ画分の累積データを示している。ドットは、個々のマウスを示す。よって、リツキシマブの非存在下では１５日目に肝臓で細胞が検出されるが、リツキシマブを添加すると、細胞が肝臓から首尾よく除去されることがわかる。

【0386】

さらに、ＥＦＳプロモーターまたはＳＦＦＶプロモーターのいずれかを用いて構築物Ｉを形質導入した細胞を使用したインビトロアッセイによると、リツキシマブが細胞を有効に枯渇させることができるが、構築物ＩがＳＦＦＶプロモーターから発現した場合には感受性が増加することが示されている（図１６）。ＦＡＣＳプロットは、ＥＦＳ形質導入細胞（上段のパネル）とＳＦＦＶ形質導入細胞（下段のパネル）とについて、表示した各リツキシマブ濃度における生ＲＱＲ８（Ｑｂｅｎｄ＋）細胞の百分率を示している。グラフは、補体のみで処理した細胞に対する、各条件における生ＲＱＲ８＋細胞の割合に基づいて算出した死滅率を示している。各グラフは、４回の個別の実験の平均値±標準偏差を示す。

【0387】

＜結論＞
結論として、図２～図１６に提示した結果により、前記所望の構成要素ＣＡＲ（Ｃ）、安全スイッチ（Ｒ）およびＦＯＸＰ３（Ｆ）の発現は、これらの構成要素をＲ－Ｆ－Ｃの順序でコードする構築物Ｉを用いることによって、当該構成要素を異なる順序、例えば構築物ＩＶ（Ｆ－Ｃ－Ｒ）または構築物ＩＩ（Ｆ－Ｒ－Ｃ）等でコードする構築物と比較して改善させることができうるとともに、望ましくない発現パターンの発生頻度が減少すること、例えば、当該構成要素のうちの１つの発現が著しく減少するかまたは見られない等が減少するということが確認された。著しくそして驚くほど高いＦＯＸＰ３発現レベルが達成され、かつ、これらはＴｒｅｇの増殖および生存にとって有害ではないことが示されている。

【0388】

さらに、データは、構築物の発現にＳＦＦＶプロモーターを使用することには、抗原の存在下でのＣＡＲの活性化の予想外の改善や、形質導入Ｔｒｅｇの増殖の予想外の増加や、リツキシマブ媒介性枯渇に対する形質導入細胞の感受性の予想外の増加をはじめとする、明らかな追加の利点があることを示している。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図10A】

【図10B】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13】

【図14-1】

【図14-2】

【図15-1】

【図15-2】

【図16-1】

【図16-2】

【配列表】

2023539596000001.app

【国際調査報告】