▶ シャンハイ エースマブ コーポレーション リミテッドの特許一覧 ▶ ヂョンシャン ホンドン バイオファーマシューティカル カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-15
(54)【発明の名称】抗ＯＸ４０抗体、その医薬組成物および応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230908BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230908BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230908BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230908BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230908BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230908BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230908BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230908BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230908BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230908BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230908BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230908BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230908BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C07K16/28
A61P43/00 105
A61P35/00
A61P43/00 111
A61K39/395 G
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K39/395 U
A61P37/08
A61P11/06
A61P11/00
A61P19/02
A61P29/00 101
A61P17/06
A61P37/06
A61P29/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023513916
(86)(22)【出願日】2021-08-26
(85)【翻訳文提出日】2023-04-20
(86)【国際出願番号】 CN2021114831
(87)【国際公開番号】W WO2022042659
(87)【国際公開日】2022-03-03
(31)【優先権主張番号】202010872934.X
(32)【優先日】2020-08-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523067609
【氏名又は名称】シャンハイ エースマブ コーポレーション リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】523067610
【氏名又は名称】ヂョンシャン ホンドン バイオファーマシューティカル カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(72)【発明者】
【氏名】ウォン，シー ホン
(72)【発明者】
【氏名】リ，ジェンリャン
(72)【発明者】
【氏名】リ，フービン
(72)【発明者】
【氏名】ツァイ，ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】イェン，シァオファ
(72)【発明者】
【氏名】ティエン，モン
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，ジュンシァ
(72)【発明者】
【氏名】ビー，イェンシァ
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ツァイホン
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB11
4C085CC02
4C085CC03
4C085CC05
4C085CC31
4C085DD62
4C085DD63
4C085DD88
4C085EE01
4C085GG06
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は抗ＯＸ４０抗体、その医薬組成物および応用に関する。本発明に係る抗ＯＸ４０抗体の配列は明細書に記載される。本発明に係る抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片及びその医薬組成物はＴ細胞関連疾患の治療に利用される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１に示されるＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるＨＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるＨＣＤＲ３を含み、及び／又は配列番号４に示されるＬＣＤＲ１、配列番号５に示されるＬＣＤＲ２及び配列番号６に示されるＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
請求項１に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体は、配列番号７－３８のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ１、配列番号３９－６５のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ２、及び配列番号６６－１１４のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ３を含み、及び／又は配列番号１１５－１４５のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ１、配列番号１４６－１５９のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ２、及び配列番号１６０－１９９のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする。
【請求項3】
請求項１に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体は表１の群ａ１～群ａ７の何れか１群に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、および／または表２の群ｂ１～群ｂ７の何れか１群に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする。
【請求項4】
請求項１に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体は表３の群ｃ１～群ｃ７１の何れか１群に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲを含むことを特徴とする。
【請求項5】
請求項１～４の何れか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体ＶＨの各ＦＲ領域は配列番号２００－２７０に示されるＶＨのいずれか１つのＶＨのＦＲ領域であり、ＶＬの各ＦＲ領域は配列番号２７１－３４１に示されるＶＬのいずれか１つのＶＬのＦＲ領域であり；より好ましくは、前記抗ＯＸ４０抗体ＶＨおよびＶＬの各ＦＲ領域は表４から選ばれるいずれか１つの抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ領域であることを特徴とする。
【請求項6】
請求項１に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体のＶＨのアミノ酸配列は配列番号２００－２７０の何れか１つに示され、および／またはＶＬのアミノ酸配列は配列番号２７１－３４１のいずれか１つに示され、好ましくは、前記抗ＯＸ４０抗体のＶＨのアミノ酸配列およびＶＬのアミノ酸配列は表４から選ばれるいずれか１つの抗体番号に示されることを特徴とする。
【請求項7】
請求項１～６の何れか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体はキメラ抗体又は完全ヒト抗体であり、好ましくは完全ヒト抗体である、ことを特徴とする。
【請求項8】
請求項１～７の何れか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤又はベクターと、を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項9】
核酸分子または当該核酸分子を含む担体であって、（１）請求項１～７の何れか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列、及び
（２）（１）に記載されるポリヌクレオチド配列の相補配列、から選ばれる。
【請求項10】
請求項１～７の何れか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片の、Ｔ細胞関連疾患を治療するためのものの製造における応用において、好ましくは、前記Ｔ細胞関連疾患はＴ細胞に関連する腫瘍又はＯＸ４０媒介性疾患であり、より好ましくは、前記ＯＸ４０媒介性疾患はＯＸ４０媒介性アレルギー、喘息、ＣＯＰＤ、関節リウマチ、乾癬、自己免疫疾患、および炎症関連疾患を含む。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は抗ＯＸ４０抗体、その医薬組成物および応用に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍免疫治療の突破と開発発展は、腫瘍治療分野の大きな進展であり、「サイエンス」誌により２０１３年の「今年のブレークスルー」に選ばれた。現在、免疫システムの力を利用して腫瘍と戦う手段は主に４つあり、１）腫瘍抗原に対する抗体を腫瘍患者の体内に注射して腫瘍細胞を殺し、その一部のメカニズムは、腫瘍細胞が抗体に結合してから、Ｆｃ受容体を発現する免疫細胞に殺されることである；２）腫瘍患者から分離された抗腫瘍免疫細胞をインビトロで増殖させ、それから患者に再注入して抗腫瘍効果を発揮する；３）Ｔ細胞を遺伝子操作して、腫瘍抗原を発現・認識するキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）を腫瘍患者の体内に注射する；４）免疫細胞の活性を制限する免疫抑制シグナル経路の標的（「免疫チェックポイント」と言われる）に対するモノクローナル抗体（例えば抗ＣＴＬＡ－４や抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１）は、免疫抑制シグナルを遮断することによって免疫システムが腫瘍細胞に対して生成されたキラーＴ細胞の応答を強化し腫瘍を殺傷する。
【0003】
上記の方法はすでに臨床的に使用されているが、腫瘍免疫治療の分野において、さまざまなメカニズムを介して機能する新しい免疫療法への要望は依然として大きい。原因として、１）すべての腫瘍種類が既存の腫瘍免疫治療手段に反応するわけではない；２）既存の免疫療法に反応する腫瘍種類であっても、これらの腫瘍種類のすべての患者がこれらの免疫治療に反応するわけではない；３）併用療法はより強い治療効果があると予測される；４）腫瘍は、これらの治療手段を免れる突然変異を発症する可能性が高い。
【0004】
免疫共刺激分子に対するアゴニスト抗体は、免疫細胞の表面に結合することで免疫活性化シグナルの標的分子を伝達し、それらによって制御される免疫活性化シグナル伝達経路を活性化し、さらに抗腫瘍免疫応答を強化して腫瘍細胞を殺すことができ、幅広い活用用途がある治療法である。多くの免疫共刺激分子の中で、ＯＸ４０は、一番最初に抗腫瘍応答に介入できることが発見され、検証された分子の１つである
ＯＸ４０はＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、主に活性化Ｔ細胞の表面に発現され、活性化ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞機能サブセットを含み、例えばＴｈ１、Ｔｈ２、ＴＦＨ、Ｔｈ１７、および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）などがある。ＯＸ４０は、好中球、ＮＫおよびＮＫＴ細胞でわずかに発現することも報告されている。ＯＸ４０はナイーブＴ細胞では発現しないが、活性化Ｔ細胞で特異的に発現する特性があることによって、ＯＸ４０を標的とすることは一定の選択性があり、無差別にすべてのＴ細胞を活性化することはない（例えばより広く発現するＣＤ２８を標的とするなど）。ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ２５２はＯＸ４０の天然リガンドであり、主にＢ細胞、樹状細胞（ＤＣｓ）およびマクロファージなどの抗原提示細胞で発現する。ＯＸ４０ＬとＯＸ４０はどちらも抗原誘導性であり、ＯＸ４０Ｌの発現はＣＤ４０－ＯＸ４０Ｌシグナル、Ｔｏｌｌ様受容（ＴＬＲ）、および炎症性サイトカインによって誘導される。ＯＸ４０の発現は、抗原提示細胞がＴ細胞に抗原を提示して活性化したＴ細胞受容体の下流シグナルによって活性化され、ＣＤ２８－Ｂ７．１／２シグナルによって正に制御され、発現レベルのピークはＴ細胞活性化後の１２時間～６日間に達する。ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌの構造分析は、ＯＸ４０がＯＸ４０Ｌと相互作用して三量体化することを支持し、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌの組み合わせは細胞相互作用に直接関与する可能性がある。Ｏｘ４０の三量体化により、その細胞内ドメインはＴＲＡＦ２／３／５を動員し、ＮＦ－ｋＢシグナルを活性化し、Ｂｃｌ－２やＢｃｌ－ｘＬなどの抗アポトーシス分子の発現をアップレギュレートし、それによってアポトーシスを阻害し、細胞生存を促進する。ＯＸ４０は、ＴＣＲシグナルと連携して、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔを介してＴ細胞の生存と増殖に影響を与え、ＮＦＡＴを介してＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５およびＩＦＮ－ｇなどのサイトカインの発現を調節することも発見されている。したがって、ＯＸ４０の活性化は、活性化Ｔ細胞のアポトーシスを阻害し、その増殖を促進し、サイトカインを産生することができる。これらはいずれも、ＯＸ４０シグナルを活性化できるアゴニスト抗ＯＸ４０の機能である。
ＯＸ４０はＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、主に活性化Ｔ細胞の表面に発現され、活性化ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞機能サブセットを含み、例えばＴｈ１、Ｔｈ２、ＴＦＨ、Ｔｈ１７、および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）などがある。ＯＸ４０は、好中球、ＮＫおよびＮＫＴ細胞でわずかに発現することも報告されている。ＯＸ４０はナイーブＴ細胞では発現しないが、活性化Ｔ細胞で特異的に発現する特性があることによって、ＯＸ４０を標的とすることは一定の選択性があり、無差別にすべてのＴ細胞を活性化することはない（例えばより広く発現するＣＤ２８を標的とするなど）。ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ２５２はＯＸ４０の天然リガンドであり、主にＢ細胞、樹状細胞（ＤＣｓ）およびマクロファージなどの抗原提示細胞で発現する。ＯＸ４０ＬとＯＸ４０はどちらも抗原誘導性であり、ＯＸ４０Ｌの発現はＣＤ４０－ＯＸ４０Ｌシグナル、Ｔｏｌｌ様受容（ＴＬＲ）、および炎症性サイトカインによって誘導される。ＯＸ４０の発現は、抗原提示細胞がＴ細胞に抗原を提示して活性化したＴ細胞受容体の下流シグナルによって活性化され、ＣＤ２８－Ｂ７．１／２シグナルによって正に制御され、発現レベルのピークはＴ細胞活性化後の１２時間～６日間に達する。ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌの構造分析は、ＯＸ４０がＯＸ４０Ｌと相互作用して三量体化することを支持し、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌの組み合わせは細胞相互作用に直接関与する可能性がある。Ｏｘ４０の三量体化により、その細胞内ドメインはＴＲＡＦ２／３／５を動員し、ＮＦ－ｋＢシグナルを活性化し、Ｂｃｌ－２やＢｃｌ－ｘＬなどの抗アポトーシス分子の発現をアップレギュレートし、それによってアポトーシスを阻害し、細胞生存を促進する。ＯＸ４０は、ＴＣＲシグナルと連携して、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔを介してＴ細胞の生存と増殖に影響を与え、ＮＦＡＴを介してＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５およびＩＦＮ－ｇなどのサイトカインの発現を調節することも発見されている。したがって、ＯＸ４０の活性化は、活性化Ｔ細胞のアポトーシスを阻害し、その増殖を促進し、サイトカインを産生することができる。これらはいずれも、ＯＸ４０シグナルを活性化できるアゴニスト抗ＯＸ４０の機能である。
【0005】
抗ＯＸ４０（およびＯＸ４０Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質）は、一部のマウスに腫瘍に対する抵抗力を作り上げることを含め、黒色腫、直腸がん、線維肉腫、Ｂ細胞およびＴ細胞リンパ腫および白血病などさまざまな腫瘍モデルにおいて、腫瘍の増殖を阻害できることが報告されている。これに基づいて、ファイザーのＰＦ０４５１８６００、ブリストル・マイヤーズ スクイブのＢＭＳ－９８６１７８、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅの複数の抗ＯＸ４０抗体など、複数の抗ヒトＯＸ４０モノクローナル抗体が臨床研究に入った。しかし、抗腫瘍薬としての抗ＯＸ４０の研究開発は順調に進まず、２０１３年に最初の臨床試験が報告されて以来、多くの企業の薬物が停滞しており、臨床研究のフェーズ３に入った抗体はまだなく、抗腫瘍抗体の免疫エフェクタ経路と設計原理についてはさらなる研究が必要であることが示唆されている。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、下記配列、即ち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６から選ばれるＣＤＲを少なくとも１つ含む抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
１つまたは複数の実施形態において、前記抗ＯＸ４０抗体は、配列番号１に示されるＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるＨＣＤＲ２、および配列番号３に示されるＨＣＤＲ３、および／または配列番号４に示されるＬＣＤＲ１、配列番号５に示されるＬＣＤＲ２、および配列番号６に示されるＬＣＤＲ３を含む。
１つまたは複数の実施形態において、前記抗ＯＸ４０抗体は、配列番号７－３８のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ１、配列番号３９－６５のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ２、および配列番号６６－１１４のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ３、および／または配列番号１１５－１４５のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ１、配列番号１４６－１５９のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ２および配列番号１６０－１９９のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ３を含む。
１つまたは複数の実施形態において、前記抗ＯＸ４０抗体は、配列番号１に示されるＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるＨＣＤＲ２、および配列番号３に示されるＨＣＤＲ３、および／または配列番号４に示されるＬＣＤＲ１、配列番号５に示されるＬＣＤＲ２、および配列番号６に示されるＬＣＤＲ３を含む。
１つまたは複数の実施形態において、前記抗ＯＸ４０抗体は、配列番号７－３８のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ１、配列番号３９－６５のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ２、および配列番号６６－１１４のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ３、および／または配列番号１１５－１４５のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ１、配列番号１４６－１５９のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ２および配列番号１６０－１９９のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ３を含む。
【0007】
１つまたは複数の実施形態において、前記抗ＯＸ４０抗体は、以下の群ａ１～群ａ７１のいずれか１群に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む：
【0008】
【表1】
【0009】
【表2】
【0010】
１つまたは複数の実施形態において、前記抗ＯＸ４０抗体ＶＨのＦＲ１は、表４の各抗体番号のＶＨのＦＲ１から選ばれることができ、ＶＨのＦＲ２は、表４の各抗体番号のＶＨのＦＲ２から選ばれることができ、ＶＨのＦＲ３は、表４の各抗体番号のＶＨのＦＲ３から選ばれることができ、ＶＨのＦＲ４は、表４の各抗体番号のＶＨのＦＲ４から選ばれることができ、および／またはＶＬのＦＲ１は表４の各抗体番号のＶＬのＦＲ１から選ばれることができ、ＶＬのＦＲ２は、表４の各抗体番号のＶＬのＦＲ２から選ばれることができ、ＶＬのＦＲ３は、表４の各抗体番号のＶＬのＦＲ３から選ばれることができ、ＶＬのＦＲ４は、表４の各抗体番号のＶＬのＦＲ４から選ばれることができる。
１つまたは複数の実施形態において、前記抗ＯＸ４０抗体のＶＨのＦＲ領域は、抗体配列番号２００－２７０から選ばれるのいずれか１つのＶＨのＦＲ領域であり、ＶＬのＦＲ領域は、抗体配列番号２７１－３４１から選ばれるいずれか１つのＶＬのＦＲ領域である。
１つまたは複数の実施形態において、前記抗ＯＸ４０抗体のＶＨのアミノ酸配列は、配列番号２００－２７０のいずれか１つに示され、および／またはＶＬのアミノ酸配列は配列番号２７１－３４１のいずれか１つに示される。好ましくは、抗ＯＸ４０抗体のＶＨのアミノ酸配列およびＶＬのアミノ酸配列は、表４のいずれか１つの行に示される通りである。
幾つかの実施形態において、本発明の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号３４２－３４５のいずれか１つに示され、および／または軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号３４６または３４７に示される。
１つまたは複数の実施形態において、本発明の何れか１つの実施形態による抗ＯＸ４０抗体は、キメラ抗体または完全ヒト抗体であり、好ましくは完全ヒト抗体である。
１つまたは複数の実施形態において、前記抗ＯＸ４０抗体のＶＨのＦＲ領域は、抗体配列番号２００－２７０から選ばれるのいずれか１つのＶＨのＦＲ領域であり、ＶＬのＦＲ領域は、抗体配列番号２７１－３４１から選ばれるいずれか１つのＶＬのＦＲ領域である。
１つまたは複数の実施形態において、前記抗ＯＸ４０抗体のＶＨのアミノ酸配列は、配列番号２００－２７０のいずれか１つに示され、および／またはＶＬのアミノ酸配列は配列番号２７１－３４１のいずれか１つに示される。好ましくは、抗ＯＸ４０抗体のＶＨのアミノ酸配列およびＶＬのアミノ酸配列は、表４のいずれか１つの行に示される通りである。
幾つかの実施形態において、本発明の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号３４２－３４５のいずれか１つに示され、および／または軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号３４６または３４７に示される。
１つまたは複数の実施形態において、本発明の何れか１つの実施形態による抗ＯＸ４０抗体は、キメラ抗体または完全ヒト抗体であり、好ましくは完全ヒト抗体である。
【0011】
本発明はまた、本発明の何れか１つの実施形態による抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片、および薬学的に許容される賦形剤または担体を含有する医薬組成物を提供する。
本発明はまた、本発明の何れか１つの実施形態による抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片の、Ｔ細胞関連疾患の治療および薬物の製造における応用を提供し、好ましくは、前記Ｔ細胞関連疾患はＴ細胞関連腫瘍またはＯＸ４０媒介性障害である。
１つまたは複数の実施形態において、前記ＯＸ４０媒介性障害は、ＯＸ４０媒介性アレルギー、喘息、ＣＯＰＤ、関節リウマチ、乾癬、自己免疫疾患、および炎症関連疾患を含む。
本発明はまた、本発明の何れか１つの実施形態による抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片の、Ｔ細胞関連疾患の治療および薬物の製造における応用を提供し、好ましくは、前記Ｔ細胞関連疾患はＴ細胞関連腫瘍またはＯＸ４０媒介性障害である。
１つまたは複数の実施形態において、前記ＯＸ４０媒介性障害は、ＯＸ４０媒介性アレルギー、喘息、ＣＯＰＤ、関節リウマチ、乾癬、自己免疫疾患、および炎症関連疾患を含む。
【0012】
本発明はまた、Ｔ細胞関連疾患を治療または予防するための方法を提供し、前記方法は、必要な患者に治療有効量の本発明の何れか１つの実施形態による抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片、または本発明の何れか１つの実施形態による抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を投与することを含む。好ましくは、前記Ｔ細胞関連疾患は、Ｔ細胞関連腫瘍または自己免疫疾患である。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法により単細胞シーケンシングに由来する抗ヒトＯＸ４０抗体がヒトＯＸ４０細胞外ドメイン抗原に対する結合能力を測定することを示す。その結果、単細胞シーケンシングに由来する抗ヒトＯＸ４０抗体は、少数の抗体を除いて、特定の濃度で精製された単細胞シーケンシング抗体として、（Ａ）３．１６μｇ／ｍｌの濃度、（Ｂ）０．３１６μｇ／ｍｌの濃度、および（Ｃ）段階希釈（３．１６μｇ／ｍｌ－１ｎｇ／ｍｌ）はいずれも、ヒトＯＸ４０細胞外ドメイン抗原に対して一定の結合能を有することが示された。
【図3】図３は、ハイブリドーマの上清中の抗ヒトＯＸ４０抗体がヒトＯＸ４０細胞外ドメイン抗原に特異的に結合できることを示す抗原結合活性の検出結果である。ハイブリドーマの上清中の抗ヒトＯＸ４０抗体のヒトＯＸ４０細胞外ドメイン抗原への結合をＥＬＩＳＡで分析し、１：１００に希釈した上清中のさまざまな抗体をコーティングされヒトＯＸ４０に結合してから、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ Ｆｃによって検出されたＥＬＩＳＡシグナル（Ａ６５０）が示される。
【図4】図４は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、ハイブリドーマの上清中の抗ヒトＯＸ４０抗体がＴ細胞を活性化し、増殖を促進するアゴニスト活性を検出することを示す。ハイブリドーマの上清を１：５に希釈し、または対照抗体の濃度を１μｇ／ｍｌに調整し、細胞を０．１μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３を含む初代細胞培養液で７２時間培養した後、フローサイトメトリーによりマウスＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＦＳＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を分析した。ＣＦＳＥは細胞の分裂と増殖に伴って蛍光強度を同倍希釈するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＦＳＥのＭＦＩは細胞の増殖と活性化と負の相関があり、つまり抗ＯＸ４０抗体の活性と負の相関がある。
【図5】図５は、ｈＯＸ４０Ｔｇマウスの脾臓細胞において、ハイブリドーマの上清中の抗ヒトＯＸ４０抗体がＴ細胞を活性化し、増殖を促進するアゴニスト活性を検出することを示す。ハイブリドーマの上清を１：４に希釈し、または対照抗体の濃度を１μｇ／ｍｌに調整し、細胞を０．１μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３を含む初代細胞培養液で７２時間培養した後、フローサイトメトリーによりマウスＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）におけるＣＦＳＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）およびＣＦＳＥ ＭＦＩが低いＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｃ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｄ）の比例を分析した。ＣＦＳＥは細胞の分裂と増殖に伴って蛍光強度を同倍希釈するため、ＣＦＳＥのＭＦＩは細胞の増殖と活性化と負の相関があり、ＣＦＳＥが低い細胞の比例は抗ＯＸ４０抗体の活性と正の相関がある。
【図6】図６Ａ－Ｂは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定された、抗ヒトＯＸ４０抗体がヒトＯＸ４０細胞外ドメイン抗原に対する結合能力を示す。その結果、（図６Ａ）３．１６μｇ／ｍｌの単細胞シーケンシングに由来する抗ヒトＯＸ４０組換え抗体（ＰＮ００５／０１２／０１７／０６３／０６４／０６５／０６６／０６７／０７１）と、ハイブリドーマ技術に由来する抗ヒトＯＸ４０組換え抗体（ＰＮ１０１／１０２／１０３／１０４／１０５／１０７／１０８／１０９／１１０／１１１／１１３／１１４／１１５／１１６／１１８／１１９／１２１／１２３／１２５／１２６／１２８／１２９／１３０）はいずれもヒトＯＸ４０細胞外ドメイン抗原に結合でき、Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧおよびＰＢＳは陰性対照であり、（図６Ｂ）スクリーニングされた抗体の一部について濃度勾配（３．１６μｇ／ｍｌ－１ｎｇ／ｍｌ）で希釈し、いずれもヒトＯＸ４０細胞外ドメイン抗原に対する結合能力を示し、Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧは陰性対照である。
【図7】図７は、フローサイトメトリーによって抗ヒトＯＸ４０組換え抗体がｈＯＸ４０安定トランスフェクト２９３Ｔ細胞におけるヒトＯＸ４０に対する結合能力を示す。結果は抗体がｈＯＸ４０安定トランスフェクト２９３Ｔ細胞に結合する抗体のシグナル強度として現れ、組換え抗体ＰＮ０６３／０６４／０６５／０６６／０６７／０７１およびＰＮ１０１／１０２／１０３／１０４／１０５／１０７／１０８／１０９／１１０／１１３／１１４／１１５／１１６／１１８／１１９／１２１／１２３／１２５／１２６／１２８／１２９はいずれもｈＯＸ４０安定トランスフェクト２９３Ｔ細胞におけるＯＸ４０に結合でき、そのうち、ＰＮ０７１／１１３／１１５／１１８の結合能力は比較的弱い。ＰＢＳ、Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧ、ＯＸ８６（抗マウスＯＸ４０ ｈＩｇＧ１）は陰性対照であり、２９３Ｔはレポーター細胞の陰性対照細胞系であった。
【図8】図８は、ＥＬＩＳＡ測定により組換え抗体がサルおよびマウスＯＸ４０タンパク質との交差反応の検出を示す。結果は、スクリーニングされたすべての抗体が、ヒトおよびサル（カニクイザルおよびアカゲザル）両方のＯＸ４０タンパク質に結合でき、ＰＮ１１６を除き、いずれもマウスＯＸ４０を認識しなかったことを示す。ＰＢＳ、Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧ、ＯＸ８６（抗マウスＯＸ４０ ｈＩｇＧ１）は陰性対照であった。
【図9】図９は、組換え抗体がヒトＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０－Ｌ）と競合してＯＸ４０タンパク質に結合する能力を示す。その結果、２μｇ／ｍｌの組換え抗体が０．２μｇ／ｍｌのＯＸ４０－Ｌ－ｍＦｃと競合してＯＸ４０タンパク質に結合する場合、ＰＮ０１２／０６３／０６４／０６５／０６６／０６７、ＰＮ１０１／１０２／１０３／１０４／１０５／１０７／１０８／１１０／１１４／１１６／１１９／１２１／１２３／１２５／１２８はＯＸ４０－Ｌ－ｍＦｃと明らかなエピトープ競合関係があり、一方、ＰＮ００５／０７１／１０９／１１１／１１３／１１５／１１８／１２６／１２９／１３０はＯＸ４０－Ｌ－ｍＦｃよりエピトープ競合能力は弱い。ＯＸ４０－Ｌ－Ｈｉｓは陽性対照であり、Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧおよびＰＢＳは陰性対照であった。
【図10】図１０は、組換え抗体がＯＸ４０／ＮＦκＢレポーター細胞を活性化する能力を示す。その結果は、Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧと比較して、０．０３μｇ／ｍｌの抗ＯＸ４０組換え抗体クローンＰＮ００１／００８／００９／０１２／０１４／０１７／０２７／０２８がレポーター細胞を活性化する能力を有することを示す。Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧは陰性対照であり、ＯＸ４０－Ｌ－ｍＦｃは陽性対照であった。
【図11】図１１Ａ－Ｄは、組換え抗体がインビトロでｈＦＣＧＲＴｇｈＯＸ４０Ｔｇマウスの脾臓細胞におけるＴ細胞を活性化し、それらの増殖を促進する実験結果を示す。その結果、（図１１Ａ）は、割に高濃度（１μｇ／ｍｌ）の場合、単細胞由来の組換え抗体ＰＮ０１２／０２４／０３７／０６３／０６３／０６５／０６６／０６７／０７１がＴ細胞を活性化し、またその増殖を促進する能力を有することを示し；（図１１Ｂ）は、抗体濃度を下げても（０．０１μｇ／ｍｌ）、単細胞由来の組換え抗体ＰＮ０１２／０２４／０３７／０６３／０６４／０６５／０６６／０６７／０７１が依然としてＴ細胞を活性化し、またその増殖を促進する能力を示し；（図１１Ｃ）は割に低い抗体濃度（０．０１μｇ／ｍｌ）の場合、ハイブリドーマ由来の組換え抗体ＰＮ１０１／１０２／１０３／１０４／１０５／１０７／１０８／１０９／１１０／１１３／１１４／１１６／１１８／１１９／１２１／１２３／１２５／１２６／１２８／１２９がＴ細胞を活性化し、またその増殖を促進する能力を有することを示す。Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧは抗体の陰性対照で、ＵＴは未処理群であり、ＣＦＳＥ ｏｎｌｙは細胞についてＣＦＳＥ染色のみをすることを意味し、ＣＤ３ ｏｎｌｙは細胞についてＣＦＳＥ染色をしてから抗マウスＣＤ３抗体で刺激することを意味し、ＣＤ３＋ＣＤ２８は細胞についてＣＦＳＥ染色をしてから、抗マウスＣＤ３および抗マウスＣＤ２８抗体で刺激すること（陽性対照）を意味する。（図１１Ｄ）は異なる濃度の抗体（３．１６ｎｇ／ｍｌ－１μｇ／ｍｌ）の刺激下で、単細胞シーケンシングに由来する組換え抗体ＰＮ００５／０１２／０２４／０３７／０６３／０７１およびハイブリドーマ技術に由来する組換え抗体ＰＮ１０１／１０２／１０３／１０４／１０５／１０７／１０８／１０９／１１０／１１４／１１６／１１８／１１９／１２１／１２３／１２５／１２６／１２８／１２９はいずれもＴ細胞増殖を促進する活性を示し、且つその活性は、陰性対照Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧより有意に高かった。ＣＦＳＥの蛍光強度は、細胞の分裂と増殖に伴って同倍希釈するため、ＣＦＳＥのＭＦＩは細胞の増殖と活性化と負の相関があり、つまり抗ＯＸ４０抗体の活性と負の相関がある。
【発明を実施するための形態】
【0014】
別段の定義がない限り、本発明の実施は、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の通常技術を使用し、これらはいずれも当分野の技術範囲内である。これら技術は文献において十分に解釈されており、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔが編集，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙが編集，１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌらが編集，１９８７版および定期更新されたバージョン）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓが編集，１９９４）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８）；Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｂａｒｂａｓら，２００１）がある。
【0015】
ＯＸ４０は、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２、ＴＮＦＳＦ４）と結合する細胞表面受容体、またはＯＸ４０を含む受容体複合体である。ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０）のアミノ酸配列のＮＣＢＩ登録番号は（ＮＰ＿００３３１８）である。Ｏｘ４０タンパク質は、変異体および断片を含んでもよい。前記断片は、完全に又は部分的に膜を貫通する細胞外ドメイン、及び／又は細胞内ドメイン並びに細胞外ドメインを有さない断片を含む。可溶タイプのｈＯＸ４０は、ＢＡＦＦ及び／又はＡＰＲＩＬとの結合能力を持つ細胞外ドメイン又は細胞外ドメインの断片を含む。「ＯＸ４０」は、ＯＸ４０のアミノ酸配列の翻訳後修飾も含む。翻訳後修飾は、Ｎ－及びＯ－結合型グリコシル化を含むが、これらに限定されない。
ＯＸ４０は、主に活性化効果Ｔ細胞（Ｔｅｆｆｓ）と制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に発現し、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、好中球にも発現する。がんでは、ＯＸ４０を発現する活性化Ｔ細胞が腫瘍浸潤リンパ球に見られる。ＯＸ４０およびそのリガンドＯＸ４０Ｌは、Ｔ細胞応答の誘導と維持において重要な役割を果たしている。抗腫瘍Ｔ細胞機能の増強は、がんおよびその他のＯＸ４０媒介性障害に利用でき、例えば媒介性アレルギー、喘息、ＣＯＰＤ、関節リウマチ、乾癬、自己免疫疾患、および炎症関連疾患などがある。
ＯＸ４０は、主に活性化効果Ｔ細胞（Ｔｅｆｆｓ）と制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に発現し、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、好中球にも発現する。がんでは、ＯＸ４０を発現する活性化Ｔ細胞が腫瘍浸潤リンパ球に見られる。ＯＸ４０およびそのリガンドＯＸ４０Ｌは、Ｔ細胞応答の誘導と維持において重要な役割を果たしている。抗腫瘍Ｔ細胞機能の増強は、がんおよびその他のＯＸ４０媒介性障害に利用でき、例えば媒介性アレルギー、喘息、ＣＯＰＤ、関節リウマチ、乾癬、自己免疫疾患、および炎症関連疾患などがある。
【0016】
抗ＯＸ４０抗体
本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体を提供する。
本明細書において、用語「抗体」は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体を含む）、マルチエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ダイアボディ、一本鎖分子、及び抗体断片（特に、抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）を含む。本明細書において、用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）と「抗体」は互いに代用できる。
基本的な４本鎖抗体ユニットは２本の同じ軽鎖（Ｌ）と２本の同じ重鎖（Ｈ）により構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は５個の基本的なヘテロ四量体ユニット及びＪ鎖と呼ばれるその他のポリペプチドからなり、１０個の抗原結合部位を含む。ＩｇＡ抗体は２～５個の基本的な４本鎖ユニットを含み、Ｊ鎖と重合して、多価集合体が形成できる。ＩｇＧの場合、４本鎖ユニットは通常約１５０，０００ダルトンである。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合により重鎖と連結され、２本の重鎖は１つ又は複数のジスルフィド結合により互いに連結されるが、ジスルフィド結合の数が重鎖のアイソタイプによって決定される。各重鎖と軽鎖との間は規則的な間隔の鎖間ジスルフィド架橋を更に有する。各重鎖はＮ－末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、更に３つ（各α及びγ鎖に対する）及び４つ（μ及びεアイソタイプに対する）の定常ドメイン（ＣＨ）を有する。各軽鎖はＮ－末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、更にその他端の定常ドメインを有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）と整列している。特定のアミノ酸残基は軽鎖と重鎖可変ドメインとの間に界面が形成されると考えられる。対となるＶＨとＶＬは一緒に１つの抗原結合部位を形成する。抗体の種々のクラスの構造及び特性について、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版、Ｄａｎｉｅｌ Ｐ． Ｓｔｉｅｓ、Ａｂｂａ Ｉ． Ｔｅｒｒ及びＴｒｉｓｔｒａｍ Ｇ． Ｐａｒｓｏｌｗ編集、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ、１９９４、７１ページ及び第６章を参照する。任意の脊椎動物種に由来する軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列によって、κ及びλと呼ばれる異なる２種のうちの１種に割り当てることができる。免疫グロブリンは、それらの重鎖定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列によって、種々のクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。γ及びαクラスは、ＣＨ配列及び機能の比較的に小さい相違によって、更に、例えば、ヒトに発現されるＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラスに分けられる。
本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体を提供する。
本明細書において、用語「抗体」は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体を含む）、マルチエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ダイアボディ、一本鎖分子、及び抗体断片（特に、抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）を含む。本明細書において、用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）と「抗体」は互いに代用できる。
基本的な４本鎖抗体ユニットは２本の同じ軽鎖（Ｌ）と２本の同じ重鎖（Ｈ）により構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は５個の基本的なヘテロ四量体ユニット及びＪ鎖と呼ばれるその他のポリペプチドからなり、１０個の抗原結合部位を含む。ＩｇＡ抗体は２～５個の基本的な４本鎖ユニットを含み、Ｊ鎖と重合して、多価集合体が形成できる。ＩｇＧの場合、４本鎖ユニットは通常約１５０，０００ダルトンである。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合により重鎖と連結され、２本の重鎖は１つ又は複数のジスルフィド結合により互いに連結されるが、ジスルフィド結合の数が重鎖のアイソタイプによって決定される。各重鎖と軽鎖との間は規則的な間隔の鎖間ジスルフィド架橋を更に有する。各重鎖はＮ－末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、更に３つ（各α及びγ鎖に対する）及び４つ（μ及びεアイソタイプに対する）の定常ドメイン（ＣＨ）を有する。各軽鎖はＮ－末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、更にその他端の定常ドメインを有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）と整列している。特定のアミノ酸残基は軽鎖と重鎖可変ドメインとの間に界面が形成されると考えられる。対となるＶＨとＶＬは一緒に１つの抗原結合部位を形成する。抗体の種々のクラスの構造及び特性について、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版、Ｄａｎｉｅｌ Ｐ． Ｓｔｉｅｓ、Ａｂｂａ Ｉ． Ｔｅｒｒ及びＴｒｉｓｔｒａｍ Ｇ． Ｐａｒｓｏｌｗ編集、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ、１９９４、７１ページ及び第６章を参照する。任意の脊椎動物種に由来する軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列によって、κ及びλと呼ばれる異なる２種のうちの１種に割り当てることができる。免疫グロブリンは、それらの重鎖定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列によって、種々のクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。γ及びαクラスは、ＣＨ配列及び機能の比較的に小さい相違によって、更に、例えば、ヒトに発現されるＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラスに分けられる。
【0017】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ基末端ドメインである。重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ「ＶＨ」及び「ＶＬ」と呼ばれる。これらのドメインは通常、抗体の最も可変できる部分（同じタイプのその他の抗体）であり、抗原結合部位を含む。
用語「可変」は、可変ドメインにおける特定のセグメントが抗体の間で配列が広範囲に異なることを意味する。可変ドメインは、抗原結合を媒介して、特定抗体の、その特定抗原に対する特異性を限定する。しかしながら、可変性は、可変ドメイン全てのアミノ酸スパンにわたって均一に分布しているわけではない。代わりにに、超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメント（軽鎖及び重鎖可変ドメインのどちらにもある）に集中し、即ち、それぞれ重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３及び軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３である。可変ドメインにおけるより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を含み、通常、βプリーツシート構造を採用するが、環状連結を形成すると共に場合によってβプリーツシート構造の一部を形成する３つのＨＶＲにより連結される。各鎖におけるＨＶＲは、ＦＲ領域により非常に近い距離で保持されており、且つ他方の鎖におけるＨＶＲと一緒に抗体の抗原結合部位の形成を促進する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１を参照する）。通常、軽鎖可変領域の構造はＦＲ１－ＬＣＤＲ１－ＦＲ２－ＬＣＤＲ２－ＦＲ３－ＬＣＤＲ３－ＦＲ４であり、重鎖可変領域の構造はＦＲ１－ＨＣＤＲ１－ＦＲ２－ＨＣＤＲ２－ＦＲ３－ＨＣＤＲ３－ＦＲ４である。定常ドメインは、抗体と抗原との結合に直接的に関与しないが、例えば、抗体依存性細胞に仲介される細胞毒性における抗体の関与などの、様々なエフェクター機能を示している。
用語「可変」は、可変ドメインにおける特定のセグメントが抗体の間で配列が広範囲に異なることを意味する。可変ドメインは、抗原結合を媒介して、特定抗体の、その特定抗原に対する特異性を限定する。しかしながら、可変性は、可変ドメイン全てのアミノ酸スパンにわたって均一に分布しているわけではない。代わりにに、超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメント（軽鎖及び重鎖可変ドメインのどちらにもある）に集中し、即ち、それぞれ重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３及び軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３である。可変ドメインにおけるより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を含み、通常、βプリーツシート構造を採用するが、環状連結を形成すると共に場合によってβプリーツシート構造の一部を形成する３つのＨＶＲにより連結される。各鎖におけるＨＶＲは、ＦＲ領域により非常に近い距離で保持されており、且つ他方の鎖におけるＨＶＲと一緒に抗体の抗原結合部位の形成を促進する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１を参照する）。通常、軽鎖可変領域の構造はＦＲ１－ＬＣＤＲ１－ＦＲ２－ＬＣＤＲ２－ＦＲ３－ＬＣＤＲ３－ＦＲ４であり、重鎖可変領域の構造はＦＲ１－ＨＣＤＲ１－ＦＲ２－ＨＣＤＲ２－ＦＲ３－ＨＣＤＲ３－ＦＲ４である。定常ドメインは、抗体と抗原との結合に直接的に関与しないが、例えば、抗体依存性細胞に仲介される細胞毒性における抗体の関与などの、様々なエフェクター機能を示している。
【0018】
本発明において、一部の抗体はアゴニスト抗体であり、一部の抗体は非アゴニスト抗体である。好ましくは、本発明に係るアゴニスト抗体の各ＣＤＲは、任意に組み合わせて、アゴニスト抗体のＣＤＲ群を構成する、またはアゴニスト抗体可変領域を形成するために使用することができ、本発明に係る非アゴニスト抗体の各ＣＤＲは、任意に組み合わせて有効なＣＤＲ群を形成し、それによって非アゴニスト抗体ＣＤＲ群を構成する、または非アゴニスト抗体可変領域を形成するために使用することができる。
本明細書において、「アゴニスト抗体可変領域」とは、無傷の抗体の形態で抗原に対してＯＸ４０アゴニスト抗体可変領域またはアゴニストＯＸ４０抗体可変領域のようなアゴニスト活性を有する可変領域を指し；「非アゴニスト抗体可変領域」とは、無傷の抗体の形態でＯＸ４０非アゴニスト抗体可変領域または非アゴニストＯＸ４０抗体可変領域のようなアゴニスト活性を持たない抗体可変領域を指す。
本明細書において、「アゴニスト抗体可変領域」とは、無傷の抗体の形態で抗原に対してＯＸ４０アゴニスト抗体可変領域またはアゴニストＯＸ４０抗体可変領域のようなアゴニスト活性を有する可変領域を指し；「非アゴニスト抗体可変領域」とは、無傷の抗体の形態でＯＸ４０非アゴニスト抗体可変領域または非アゴニストＯＸ４０抗体可変領域のようなアゴニスト活性を持たない抗体可変領域を指す。
【0019】
本明細書において、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団により得られた抗体であり、即ち、天然に発生できる少量で存在可能な突然変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除き、集団を構成する各抗体が同様である。モノクローナル抗体は高度的な特異性を持ち、単一の抗原部位に対応するものである。ポリクローナル抗体製剤（異なる決定基（エピトープ）に対応する異なる抗体を代表的に含む）に対して、各モノクローナル抗体は抗原における単一の決定基に対応する。これらの特異性の他に、モノクローナル抗体の優位性は、ハイブリドーマの培養によって合成されるため、その他の免疫グロブリンに汚染されていないことである。修飾語「モノクローナル」は、抗体が実質的に均質な抗体の集団により得られた特徴を示し、任意の特定方法による抗体の産生を要請すると解釈するものではない。例えば、本発明に利用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５－９７（１９７５）や、Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１４（３）：２５３－２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版．１９８８や、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３－６８１、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）、組換えＤＮＡ法（例えば、ＵＳ ４，８１６，５６７）、ファージ提示技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４－６２８（１９９１）や、Ｍａｒｋｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１－５９７（１９９２）や、Ｓｉｄｈｕら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３３８（２）：２９９－３１０（２００４）や、Ｌｅｅら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）や、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）や、ＬｅｅらＪ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４））、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物によりヒト又はヒト様抗体を産生するための技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３や、ＷＯ１９９６／３４０９６や、ＷＯ１９９６／３３７３５や、ＷＯ１９９１／１０７４１や、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）や、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５－２５８（１９９３）や、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：３３（１９９３）や、ＵＳ ５，５４５，８０７や、ＵＳ ５，５４５，８０６や、ＵＳ ５，５６９，８２５や、ＵＳ ５，６２５，１２６や、ＵＳ ５，６３３，４２５や、ＵＳ ５，６６１，０１６や、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９－７８３（１９９２）や、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６－８５９（１９９４）や、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２－８１３（１９９４）や、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：８４５－８５１（１９９６）や、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：８２６（１９９６）や、Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５－９３（１９９５））、単細胞シーケンシング法（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１３ Ｆｅｂ；３１（２）：１６６－９．）を含む様々な技術により産生できる。
【0020】
用語「完全長抗体」、「無傷抗体」又は「全抗体」は互いに代用できるが、（抗体断片に対して）実質的に完全な形式の抗体であることを意味する。具体的に、全抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖および軽鎖を伴うものを含む。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であってもよい。幾つかの様態において、無傷抗体は、１種又は複数種のエフェクター機能を有してもよい。
「抗体断片」は無傷抗体の一部、好ましくは無傷抗体の抗原結合領域及び／又は可変領域を含む。抗体断片は抗体の抗原結合断片が好ましい。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片や、ダイアボディや、線状抗体（アメリカ特許５，６４１，８７０、実施例２や、Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８（１０）：１０５７－１０６２、１９９５を参照）や、一本鎖抗体分子や、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片や、抗体断片により形成される多重特異性抗体や、化学的修飾又はリポソームに組込まれることにより半減期が増加可能な任意の断片が挙げられる。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、ならびに残余「Ｆｃ」断片（この名称は容易に結晶化する能力を反映している）を産生した。Ｆａｂ断片は完全な軽鎖及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と１本の重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）により構成される。各Ｆａｂ断片は抗原結合に関して１価であり、即ち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、１つの大型Ｆ（ａｂ’）２断片を生じるが、これは、異なる抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片におおよそ対応し、依然として抗原に架橋し得る。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ基末端に幾つかのその他の残基（抗体ヒンジ領域に由来する１つ又は複数のシステインを含む）が付加されているため、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来対となるＦａｂ’断片として産生され、Ｆａｂ’断片の間にヒンジシステインがある。抗体断片のその他の化学カップリングは既に知られている。Ｆｃ断片はジスルフィド結合により一体に保持されている２本の重鎖のカルボキシ基末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域における配列によって決定されるが、該領域は幾つかの種類の細胞に発見されたＦｃ受容体（ＦｃＲ）により認識された領域でもある。
「抗体断片」は無傷抗体の一部、好ましくは無傷抗体の抗原結合領域及び／又は可変領域を含む。抗体断片は抗体の抗原結合断片が好ましい。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片や、ダイアボディや、線状抗体（アメリカ特許５，６４１，８７０、実施例２や、Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８（１０）：１０５７－１０６２、１９９５を参照）や、一本鎖抗体分子や、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片や、抗体断片により形成される多重特異性抗体や、化学的修飾又はリポソームに組込まれることにより半減期が増加可能な任意の断片が挙げられる。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、ならびに残余「Ｆｃ」断片（この名称は容易に結晶化する能力を反映している）を産生した。Ｆａｂ断片は完全な軽鎖及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と１本の重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）により構成される。各Ｆａｂ断片は抗原結合に関して１価であり、即ち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、１つの大型Ｆ（ａｂ’）２断片を生じるが、これは、異なる抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片におおよそ対応し、依然として抗原に架橋し得る。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ基末端に幾つかのその他の残基（抗体ヒンジ領域に由来する１つ又は複数のシステインを含む）が付加されているため、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来対となるＦａｂ’断片として産生され、Ｆａｂ’断片の間にヒンジシステインがある。抗体断片のその他の化学カップリングは既に知られている。Ｆｃ断片はジスルフィド結合により一体に保持されている２本の重鎖のカルボキシ基末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域における配列によって決定されるが、該領域は幾つかの種類の細胞に発見されたＦｃ受容体（ＦｃＲ）により認識された領域でもある。
【0021】
「Ｆｖ」は完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。該断片は、強く非共有結合的に会合している１本の重鎖可変ドメイン及び１本の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。これら２つのドメインが折り畳まれると、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を与える６つの超可変ループ（重鎖及び軽鎖にそれぞれ３つのループ）が突出されるしかしながら、結合部位全体よりも親和性は低いものの、単一可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのみのＨＶＲからなる半分のＦｖ）であっても抗原を認識し、結合能力を有する。
「一本鎖Ｆｖ」は「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」と略され、抗体ＶＨ及びＶＬドメインを含むと共に１本のポリペプチド鎖に連結される抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、ｓＦｖを所望の抗原結合構造に形成させる。ｓＦｖの概説について、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照する。
前記断片の「化学修飾」は、例えば、ポリエチレングリコールなどのポリ（アルキレン）グリコールの付加（「ポリエチレングリコール化、ＰＥＧ化」）を含み、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂ’のポリエチレングリコール化断片、即ち、Ｆｖ－ＰＥＧ、ｓｃＦｖ－ＰＥＧ、Ｆａｂ－ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２－ＰＥＧ及びＦａｂ’－ＰＥＧを含む。これらの断片はＥＧＦＲ結合活性を有する。
好ましくは、前記抗体断片、特に抗原結合断片は、その由来抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の一部の配列により構成され、或いはこれらを含む。前記一部の配列は、その由来抗体と同じ結合特異性及び十分な親和力を十分に保持している。ＯＸ４０に対して、好ましくは少なくともその由来抗体の親和力の１／１００に相当する。より好ましい様態において、少なくとも１／１０に相当する。このような抗体断片は、少なくとも５個のアミノ酸、好ましくはその由来抗体の配列の１０、１５、２５、５０及び１００個の連続アミノ酸を含む。
「一本鎖Ｆｖ」は「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」と略され、抗体ＶＨ及びＶＬドメインを含むと共に１本のポリペプチド鎖に連結される抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、ｓＦｖを所望の抗原結合構造に形成させる。ｓＦｖの概説について、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照する。
前記断片の「化学修飾」は、例えば、ポリエチレングリコールなどのポリ（アルキレン）グリコールの付加（「ポリエチレングリコール化、ＰＥＧ化」）を含み、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂ’のポリエチレングリコール化断片、即ち、Ｆｖ－ＰＥＧ、ｓｃＦｖ－ＰＥＧ、Ｆａｂ－ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２－ＰＥＧ及びＦａｂ’－ＰＥＧを含む。これらの断片はＥＧＦＲ結合活性を有する。
好ましくは、前記抗体断片、特に抗原結合断片は、その由来抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の一部の配列により構成され、或いはこれらを含む。前記一部の配列は、その由来抗体と同じ結合特異性及び十分な親和力を十分に保持している。ＯＸ４０に対して、好ましくは少なくともその由来抗体の親和力の１／１００に相当する。より好ましい様態において、少なくとも１／１０に相当する。このような抗体断片は、少なくとも５個のアミノ酸、好ましくはその由来抗体の配列の１０、１５、２５、５０及び１００個の連続アミノ酸を含む。
【0022】
本明細書において、モノクローナル抗体は、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、これは、所望の生物学的活性を示す限りにおいて、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である一方、鎖の残部は、別の種に由来する、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、並びに、このような抗体の断片である（ＵＳ ４，８１６，５６７や、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１：６８５１－６８５５、１９８４を参照）。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最低限の配列を含むキメラ抗体である。従って、「ヒト化抗体」は、通常、可変ドメインフレームワーク領域がヒト抗体に発見された配列と交換した非ヒト抗体である。通常、ヒト化抗体において、抗体全体（ＣＤＲを除く）は、ヒト由来のポリヌクレオチドによりコードされ、又はこのような抗体（ＣＤＲを除く）と同じである。ＣＤＲ（その一部又は全部が非ヒト生体に由来する核酸によりコードされる）がヒト抗体可変領域のβ－プリーツシート骨格に移植されて抗体が産生されるが、その特異性は移植されるＣＤＲによって決定される。このような抗体の産生は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８や、Ｊｏｎｅｓ、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２～５２５や、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４－１５３６などに記載されている。ヒト化抗体は遺伝子工学免疫系を有するマウスを利用して産生してもよい（Ｒｏｑｕｅら、２００４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．、２０：６３９－６５４を参照）。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最低限の配列を含むキメラ抗体である。従って、「ヒト化抗体」は、通常、可変ドメインフレームワーク領域がヒト抗体に発見された配列と交換した非ヒト抗体である。通常、ヒト化抗体において、抗体全体（ＣＤＲを除く）は、ヒト由来のポリヌクレオチドによりコードされ、又はこのような抗体（ＣＤＲを除く）と同じである。ＣＤＲ（その一部又は全部が非ヒト生体に由来する核酸によりコードされる）がヒト抗体可変領域のβ－プリーツシート骨格に移植されて抗体が産生されるが、その特異性は移植されるＣＤＲによって決定される。このような抗体の産生は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８や、Ｊｏｎｅｓ、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２～５２５や、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４－１５３６などに記載されている。ヒト化抗体は遺伝子工学免疫系を有するマウスを利用して産生してもよい（Ｒｏｑｕｅら、２００４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．、２０：６３９－６５４を参照）。
【0023】
「ヒト抗体」は、ヒトから産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、及び／又は本願に開示されたヒト抗体を産生するための任意の技術を利用して産生されるような抗体である。このヒト抗体の定義は非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明らかに排除した。ヒト抗体は、ファージ提示ライブラリーを含む、本分野における様々な既存技術を利用して産生してもよい。このような技術は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、分子生物学誌、２２７：３８１（１９９１）や、Ｍａｒｋｓら、分子生物学誌、２２２：５８１（１９９１）を参照する。得られたヒトモノクローナル抗体の製造方法は、Ｃｏｌｅら、モノクローナル抗体及びがん治療、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ、ｐ．７７（１９８５）や、Ｂｏｅｒｎｅｒら、免疫学誌、１４７（１）：８６－９５（１９９１）に記載されている。ｖａｎ Ｄｉｊｋ及びｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、現代薬学評論、５：３６８－７４（２００１）を更に参照する。ヒト抗体は、下記の方法により製造されてもよい。即ち、抗原を例えば、免疫異種移植マウス（ｘｅｎｏｍｉｃｅ）などの遺伝子組換え動物に投与して、修飾により抗原に応答し、このような抗体を活性化させて産生するが、その内因性遺伝子座が既に能力を失った（例えば、ＵＳ ６，０７５，１８１及び６，１５０，５８４、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関してを参照）。例えば、Ｌｉら、アメリカ国家科学院学報、１０３：３５５７－３５６２（２００６）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により産生されたヒト抗体に関してを更に参照する。
本発明の抗ＯＸ４０抗体は、マイクロ抗体であってもよい。マイクロ抗体は、ＣＨ３ドメインと連結されたｓｃＦｖを含む最小化抗体様タンパク質である（Ｈｕら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５６：３０５５－３０６１）。本発明の抗ＯＸ４０抗体はドメイン抗体であってもよいが、例えば、ＵＳ ６，２４８，５１６を参照する。ドメイン抗体（ｄＡｂ）は抗体の機能的結合ドメインであり、ヒト抗体ｄＡＢの重鎖（ＶＨ）又は軽鎖（ＶＬ）の可変領域に対応するが、約１３ｋＤａの分子量又は無傷抗体の１０分の１のサイズ未満である。ｄＡＢは細菌、酵母及び哺乳動物細胞系を含む様々な宿主に十分に発現される。また、例えば、冷凍乾燥又は熱変性後などの苛酷条件においても、ｄＡｂは依然として高度的に安定であり、且つ活性を保持している。例えば、ＵＳ ６，２９１，１５８、ＵＳ ６，５８２，９１５、ＵＳ ６，５９３，０８１、ＵＳ ６，１７２，１９７、ＵＳ ２００４／０１１０９４１、ＥＰ ０３６８６８４、ＵＳ ６，６９６，２４５、ＷＯ０４／０５８８２１、ＷＯ０４／００３０１９及びＷＯ０３／００２６０９を参照する。
本発明の抗ＯＸ４０抗体は、マイクロ抗体であってもよい。マイクロ抗体は、ＣＨ３ドメインと連結されたｓｃＦｖを含む最小化抗体様タンパク質である（Ｈｕら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５６：３０５５－３０６１）。本発明の抗ＯＸ４０抗体はドメイン抗体であってもよいが、例えば、ＵＳ ６，２４８，５１６を参照する。ドメイン抗体（ｄＡｂ）は抗体の機能的結合ドメインであり、ヒト抗体ｄＡＢの重鎖（ＶＨ）又は軽鎖（ＶＬ）の可変領域に対応するが、約１３ｋＤａの分子量又は無傷抗体の１０分の１のサイズ未満である。ｄＡＢは細菌、酵母及び哺乳動物細胞系を含む様々な宿主に十分に発現される。また、例えば、冷凍乾燥又は熱変性後などの苛酷条件においても、ｄＡｂは依然として高度的に安定であり、且つ活性を保持している。例えば、ＵＳ ６，２９１，１５８、ＵＳ ６，５８２，９１５、ＵＳ ６，５９３，０８１、ＵＳ ６，１７２，１９７、ＵＳ ２００４／０１１０９４１、ＥＰ ０３６８６８４、ＵＳ ６，６９６，２４５、ＷＯ０４／０５８８２１、ＷＯ０４／００３０１９及びＷＯ０３／００２６０９を参照する。
【0024】
本発明による抗ＯＸ４０抗体のＨＣＤＲ１は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号１）を含んでもよく、そのうち、Ｘ１はＧまたはＳであり、Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＶまたはＹであり、Ｘ３はＳ、ＴまたはＩであり、Ｘ４はＩ、Ｌ、またはＦであり、Ｘ５はＩ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、またはＡであり、Ｘ６はＮ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｒ、またはＧであり、Ｘ７はＮ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ａ、ＧまたはＦであり、Ｘ８はＮ、Ｙ、Ａ、Ｇ、Ｗ、Ｓ、Ｉ、Ｋ、Ｆ、ＴまたはＤであり、Ｘ９はＷ、Ｖまたはなしであり、Ｘ１０はＮ、Ｇまたはなしである。例示的に、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号７－３８のいずれか１つに示される。１つまたは複数の実施形態において、Ｘ１はＧまたはＳであり、Ｘ２はＤ、Ｆ、ＧまたはＹであり、Ｘ３はＳまたはＴであり、Ｘ４はＩ、ＬまたはＦであり、Ｘ５はＳ、ＤまたはＴであり、Ｘ６はＮ、Ｓ、ＴまたはＤであり、Ｘ７はＳ、ＴまたはＹであり、Ｘ８はＮ、Ｙ、Ａ、Ｇ、またはＩであり、Ｘ９はＷ、Ｖまたはなしであり、Ｘ１０はＮまたはなしである。好ましくは、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号 ９、１０、１２、１３、１９、２１、２３、３３、３４、３８のいずれか１つに示される。
本発明による抗ＯＸ４０抗体のＨＣＤＲ２は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号２）を含んでもよく、Ｘ１はＭまたはＩであり；Ｘ２はＮ、Ｙ、Ｓ、Ｋ、ＨまたはＦであり；Ｘ３はＰ、Ｗ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｇ、ＡまたはＲであり；Ｘ４はＮ、Ｓ、Ｇ、Ｙ、ＫまたはＤであり；Ｘ５はＳ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、ＡまたはＴであり；Ｘ６はＴ、Ｎ、Ｓ、ＤまたはＧであり；Ｘ７はＮ、Ｋ、Ｔ、Ｓ、Ｄ、Ｙ、Ｈ、Ｇ、Ａ、またはＥであり；Ｘ８はＴ、Ｉ、Ｋ、Ｇまたはなしであり；Ｘ９はＴまたはなしであり；Ｘ１０はＴ、Ｉまたはなしである。１つまたは複数の実施形態において、Ｘ１はＩであり；Ｘ２はＮ、Ｙ、Ｓ、ＨまたはＦであり；Ｘ３はＷ、Ｈ、ＳまたはＡであり；Ｘ４はＮ、Ｓ、ＧまたはＹであり；Ｘ５はＳ、Ｄ、ＧまたはＮであり；Ｘ６はＴ、Ｎ、Ｓ、ＤまたはＧであり；Ｘ７はＮ、Ｋ、Ｔ、ＳまたはＤであり；Ｘ８はＴ、Ｉ、Ｋまたはなしであり；Ｘ９およびＸ１０はなしである。例示的にＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号３９－６５のいずれか１つに示される。好ましくは、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号 ４２、４３、４６、４７、５０、５８、５９、６３、６４のいずれか１つに示される。
本発明による抗ＯＸ４０抗体のＨＣＤＲ２は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号２）を含んでもよく、Ｘ１はＭまたはＩであり；Ｘ２はＮ、Ｙ、Ｓ、Ｋ、ＨまたはＦであり；Ｘ３はＰ、Ｗ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｇ、ＡまたはＲであり；Ｘ４はＮ、Ｓ、Ｇ、Ｙ、ＫまたはＤであり；Ｘ５はＳ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、ＡまたはＴであり；Ｘ６はＴ、Ｎ、Ｓ、ＤまたはＧであり；Ｘ７はＮ、Ｋ、Ｔ、Ｓ、Ｄ、Ｙ、Ｈ、Ｇ、Ａ、またはＥであり；Ｘ８はＴ、Ｉ、Ｋ、Ｇまたはなしであり；Ｘ９はＴまたはなしであり；Ｘ１０はＴ、Ｉまたはなしである。１つまたは複数の実施形態において、Ｘ１はＩであり；Ｘ２はＮ、Ｙ、Ｓ、ＨまたはＦであり；Ｘ３はＷ、Ｈ、ＳまたはＡであり；Ｘ４はＮ、Ｓ、ＧまたはＹであり；Ｘ５はＳ、Ｄ、ＧまたはＮであり；Ｘ６はＴ、Ｎ、Ｓ、ＤまたはＧであり；Ｘ７はＮ、Ｋ、Ｔ、ＳまたはＤであり；Ｘ８はＴ、Ｉ、Ｋまたはなしであり；Ｘ９およびＸ１０はなしである。例示的にＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号３９－６５のいずれか１つに示される。好ましくは、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号 ４２、４３、４６、４７、５０、５８、５９、６３、６４のいずれか１つに示される。
【0025】
本発明による抗ＯＸ４０抗体のＨＣＤＲ３は、ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８（配列番号３）を含んでもよく、そのうち、Ｘ１はＶ、Ｔ、ＳまたはＡであり、Ｘ２はＲ、Ｋ、Ｉ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｈ、Ｑ、ＮまたはＥであり、Ｘ３はＳ、Ｄ、Ｗ、Ｇ、Ｙ、Ａ、Ｅ、Ｒ、Ｌ、Ｖ、Ｔ、ＭまたはＫであり、Ｘ４はＧ、Ｙ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｄ、Ｓ、Ｗ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、ＮまたはＫであり、Ｘ５はＤ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｆ、Ｔ、Ｖ、Ａ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｅ、ＷまたはＮであり、Ｘ６はＷ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｒ、Ｐ、Ｙ、Ｎ、Ｌ、Ａ、Ｔ、ＩまたはＶであり、Ｘ７はＨ、Ｓ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｅ、ＤまたはＭであり、Ｘ８はＣ、Ｇ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｄ、Ｍ、Ｔ、Ｎ、Ｒ、Ｈ、ＶまたはＰであり、Ｘ９はＦ、Ｓ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｇ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｌ、Ｒ、Ｎまたはなしであり、Ｘ１０はＤ、Ｙ、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｗ、Ｖ、Ｐ、Ｅ、Ｌ、Ｇ、Ｓ、Ｑまたはなしであり、Ｘ１１はＹ、Ｇ、Ｄ、Ｗ、Ｆ、Ａ、Ｉ、Ｑ、Ｓ、Ｎまたはなしであり、Ｘ１２はＷ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｇ、Ｒ、Ｐまたはなしであり、Ｘ１３はＩ、Ｗ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ｌまたはなしであり、Ｘ１４はＱ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、Ｆ、Ｄ、Ｖ、Ｈまたはなしであり、Ｘ１５はＨ、Ｗ、Ｍ、Ｄ、Ｙ、Ｆまたはなしであり、Ｘ１６はＷ、Ｄ、Ｓ、Ｙまたはなしであり、Ｘ１７はＶ、Ｗ、Ｙまたはなしであり、Ｘ１８はＷまたはなしである。１つまたは複数の実施形態において、Ｘ１はＶまたはＡであり、Ｘ２はＲ、Ｋ、ＳまたはＱであり、Ｘ３はＳ、Ｄ、Ｇ、Ｙ、ＡまたはＥであり、Ｘ４はＧ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、ＷまたはＮであり、Ｘ５はＹ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ａ、Ｌ、ＩまたはＷであり、Ｘ６はＧ、Ｄ、Ｐ、Ｙ、Ｎ、ＬまたはＴであり、Ｘ７はＳ、Ｌ、Ｔ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、ＥまたはＤであり、Ｘ８はＧ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｍ、ＴまたはＨであり、Ｘ９はＦ、Ｓ、Ｄ、Ｙ、Ｅ、Ｌまたはなしであり、Ｘ１０はＤ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、Ｇまたはなしであり、Ｘ１１はＹ、Ｇ、Ｗ、Ｆ、Ｑ、Ｎまたはなしであり、Ｘ１２－Ｘ１８はなしである。例示的にＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号 ６６－１１４のいずれか１つに示される。好ましくは、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号 ６７、７８、７９、８０、８６、９３、９６、９９、１００、１０７、１０８のいずれか１つに示される。
【0026】
本発明による抗ＯＸ４０抗体のＨＣＤＲ１は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号４）を含んでもよく、そのうち、Ｘ１はＨまたはＱであり、Ｘ２はＧ、Ｄ、ＳまたはＴであり、Ｘ３はＳ、Ｉ、Ｌ、ＴまたはＶであり、Ｘ４はＳ、Ｎ、Ｒ、Ｗ、Ｌ、ＶまたはＦであり、Ｘ５はＴ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＹまたはＧであり、Ｘ６はＹ、Ｄ、Ｗ、Ｓ、Ｒ、Ｎ、ＧまたはＴであり、Ｘ７はＮ、Ｄ、Ｓ、Ｙまたはなしであり、Ｘ８はＧ、Ｎまたはなしであり、Ｘ９はＹ、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ｓまたはなしであり、Ｘ１０はＮ、Ｔ、Ｒ、Ｋまたはなしであり、Ｘ１１はＹ、Ｆ、Ｓ、Ｎまたはなしであり、Ｘ１２はＹまたはなしである。１つまたは複数の実施形態において、Ｘ１はＨまたはＱであり、Ｘ２はＧ、ＤまたはＳであり、Ｘ３はＳ、Ｉ、ＬまたはＶであり、Ｘ４はＳ、Ｎ、Ｗ、ＬまたはＦであり、Ｘ５はＴ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＹまたはＧであり、Ｘ６はＹ、Ｄ、Ｓ、ＲまたはＮであり、Ｘ７はＮ、Ｄ、Ｙまたはなしであり、Ｘ８はＧまたはなしであり、Ｘ９はＹ、Ｎ、Ｄまたはなしであり、Ｘ１０はＮ、Ｔまたはなしであり、Ｘ１１はＹまたはなしであり、Ｘ１２はなしである。例示的にＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１１５－１４５のいずれか１つに示される。好ましくは、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号 １１５、１１６、１２０、１２２、１２４、１２６、１３０、１３４、１３５、１４０、１４１のいずれか１つに示される。
本発明による抗ＯＸ４０抗体のＬＣＤＲ２はＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号５）を含んでもよく、そのうち、Ｘ１はＴ、Ｋ、Ｇ、Ｗ、Ｅ、Ｍ、Ｌ、Ｄ、ＡまたはＱであり；Ｘ２はＶ、Ａ、ＴまたはＧであり；Ｘ３はＳまたはＡである。１つまたは複数の実施形態において、Ｘ１はＫ、Ｇ、Ｌ、ＤまたはＡであり；Ｘ２はＶ、ＡまたはＧであり；Ｘ３はＳである。例示的にＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号 １４６－１５９のいずれか１つに示される。好ましくは、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号 １４７、１４８、１５３、１５４、１５５のいずれか１つに示される。
本発明による抗ＯＸ４０抗体のＬＣＤＲ２はＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号５）を含んでもよく、そのうち、Ｘ１はＴ、Ｋ、Ｇ、Ｗ、Ｅ、Ｍ、Ｌ、Ｄ、ＡまたはＱであり；Ｘ２はＶ、Ａ、ＴまたはＧであり；Ｘ３はＳまたはＡである。１つまたは複数の実施形態において、Ｘ１はＫ、Ｇ、Ｌ、ＤまたはＡであり；Ｘ２はＶ、ＡまたはＧであり；Ｘ３はＳである。例示的にＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号 １４６－１５９のいずれか１つに示される。好ましくは、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号 １４７、１４８、１５３、１５４、１５５のいずれか１つに示される。
【0027】
本発明による抗ＯＸ４０抗体のＬＣＤＲ３は、ＣＸ１ＱＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号６）を含んでもよく、そのうち、Ｘ１はＭ、Ｑ、ＬまたはＨであり、Ｘ２はＧ、Ｙ、Ａ、Ｖ、Ｈ、Ｔ、ＦまたはＳであり、Ｘ３はＴ、Ｇ、Ｙ、Ｎ、Ｌ、ＤまたはＳであり、Ｘ４はＨ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、ＩまたはＲであり、Ｘ５はＷ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＩまたはＮであり、Ｘ６はＰ、Ｓ、Ｍ、Ｉ、ＷまたはＴであり、Ｘ７はＷ、Ｆ、Ｌ、Ｐ、Ｉ、Ｙ、ＲまたはＴであり、Ｘ８はＴ、Ｌ、Ａ、ＦまたはＷであり、Ｘ９はＦ、Ｌ、Ｔまたはなしであり、Ｘ１０はＴ、Ｆまたはなしであり、Ｘ１１はＦまたはなしである。１つまたは複数の実施形態において、Ｘ１はＭ、ＱまたはＬであり、Ｘ２はＧ、Ｙ、ＡまたはＳであり、Ｘ３はＴ、Ｇ、Ｙ、Ｎ、ＬまたはＤであり、Ｘ４はＨ、Ｓ、ＱまたはＮであり、Ｘ５はＷ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＩまたはＮであり、Ｘ６はＰまたはＩであり、Ｘ７はＷ、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、ＲまたはＴであり、Ｘ８はＴまたはＦであり、Ｘ９はＦまたはなしであり、Ｘ１０およびＸ１１はなしである。例示的にＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号 １６０－１９９のいずれか１つに示される。好ましくは、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号 １６０、１６１、１６６、１６８、１７２、１８２、１９２、１９３、１９５、１９８のいずれか１つに示される。
【0028】
幾つかの実施形態において、本発明による抗ＯＸ４０抗体は、配列番号１に示されるＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるＨＣＤＲ２、および配列番号３に示されるＨＣＤＲ３、および／または配列番号４に示されるＬＣＤＲ１、配列番号５に示されるＬＣＤＲ２、および配列番号６に示されるＬＣＤＲ３を含む。好ましくは、本発明による抗ＯＸ４０抗体は、配列番号７－３８のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ１、配列番号３９－６５のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ２、および配列番号６６－１１４のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ３、および／または配列番号１１５－１４５のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ１、配列番号１４６－１５９のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ２および配列番号１６０－１９９のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ３を含む。
より好ましくは、本発明による抗ＯＸ４０抗体は配列番号 ９、１０、１２、１３、１９、２１、２３、３３、３４、３８のいずれか１つ示されるＨＣＤＲ１、配列番号 ４２、４３、４６、４７、５０、５８、５９、６３、６４のいずれか１つ示されるＨＣＤＲ２、および配列番号 ６７、７８、７９、８０、８６、９３、９６、９９、１００、１０７、１０８のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ３、および／または配列番号 １１５、１１６、１２０、１２２、１２４、１２６、１３０、１３４、１３５、１４０、１４１のいずれか１つ示されるＬＣＤＲ１、配列番号 １４７、１４８、１５３、１５４、１５５のいずれか１つ示されるＬＣＤＲ２および配列番号 １６０、１６１、１６６、１６８、１７２、１８２、１９２、１９３、１９５、１９８のいずれか１つ示されるＬＣＤＲ３を含む。
より好ましくは、本発明による抗ＯＸ４０抗体は配列番号 ９、１０、１２、１３、１９、２１、２３、３３、３４、３８のいずれか１つ示されるＨＣＤＲ１、配列番号 ４２、４３、４６、４７、５０、５８、５９、６３、６４のいずれか１つ示されるＨＣＤＲ２、および配列番号 ６７、７８、７９、８０、８６、９３、９６、９９、１００、１０７、１０８のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ３、および／または配列番号 １１５、１１６、１２０、１２２、１２４、１２６、１３０、１３４、１３５、１４０、１４１のいずれか１つ示されるＬＣＤＲ１、配列番号 １４７、１４８、１５３、１５４、１５５のいずれか１つ示されるＬＣＤＲ２および配列番号 １６０、１６１、１６６、１６８、１７２、１８２、１９２、１９３、１９５、１９８のいずれか１つ示されるＬＣＤＲ３を含む。
【0029】
さらに好ましくは、本発明の抗ＯＸ４０抗体は、以下の群ａ１～群ａ７１のいずれか１群に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む：
【0030】
【表3】
および／または以下の群ｂ１～群ｂ７１のいずれか１群に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む：
【0031】
【表4】
【0032】
より好ましくは、本発明による抗ＯＸ４０抗体は、表３の群ｃ１～群ｃ７１のいずれか１群のＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを含む：
【0033】
【表5】
【0034】
本発明による抗ＯＸ４０抗体ＶＨのＦＲ１は、表４の各抗体番号のＶＨのＦＲ１から選ばれることができ、ＦＲ２は、表４の各抗体番号のＶＨのＦＲ２から選ばれることができ、ＦＲ３は、表４の各抗体番号のＶＨのＦＲ３から選ばれることができ、ＦＲ４は、表４の各抗体番号のＶＨのＦＲ４から選ばれることができ、および／またはＶＬのＦＲ１は表４の各抗体番号のＶＬのＦＲ１から選ばれることができ、ＦＲ２は、表４の各抗体番号のＶＬのＦＲ２から選ばれることができ、ＦＲ３は、表４の各抗体番号のＶＬのＦＲ３から選ばれることができ、ＦＲ４は、表４の各抗体番号のＶＬのＦＲ４から選ばれることができる。
【0035】
【表6】
幾つかの実施形態において、本発明による抗ＯＸ４０抗体のＶＨのアミノ酸配列は配列番号 ２００－２７０のいずれか１つに示され、および／またはＶＬのアミノ酸配列は配列番号 ２７１－３４１のいずれか１つに示される。好ましくは、本発明による抗ＯＸ４０抗体のＶＨのアミノ酸配列およびＶＬのアミノ酸配列は、表３のいずれか１つの行に示される通りである。
幾つかの実施形態において、本発明の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号３４２－３４５のいずれか１つに示され、および／または軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号３４６または３４７に示される。幾つかの実施形態において、表４の群ｄ１－ｄ４０の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号３４５に示され、および／または軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号３４７に示される。他の実施形態において、表４の群ｄ４１－ｄ７１の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号３４２－３４５のいずれか１つに示され、および／または軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号３４６または３４７に示される。ここで、各抗体の重鎖および軽鎖定常領域は、抗体の抗原への結合能力に影響を与えることなく、当分野で任意の他の重鎖および軽鎖定常領域を使用することができる。
【0036】
【表7】
【0037】
抗体活性に実質的な影響を与えない前提で、当業者は本発明の配列に対して１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上）のアミノ酸を置換、付加及び／又は欠失して、前記抗体又はその機能性断片配列の変異体を得ることができる。これらは本発明により請求される範囲内に含まれると見なされる。例えば、可変領域のＦＲ及び／又はＣＤＲ領域で類似する特性を有するアミノ酸を置換する。置換は保存的な置換が好ましい。保存的な置換できるアミノ酸残基は本分野で周知されている。幾つかの実施形態において、本発明に係る変異体の配列はその由来配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有してもよい。本発明に係る配列同一性は配列分析ソフトウエアを利用して測定できる。例えば、デフォルト引数を使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮが挙げられる。
本発明の抗ＯＸ４０抗体は機能が影響されるように修飾されてもよい。本発明は修飾を有するグリコシル化様態の抗ＯＸ４０抗体を含む。修飾により望まないグリコシル化部位を除去してもよく、或いはオリゴ糖鎖にフコース部分を存在させないことで抗体の依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を強化してもよく、或いはガラクトシル化修飾により補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改変してもよい。
本発明の抗ＯＸ４０抗体は、通常、約１０－９～約１０－１３Ｍの親和力定数を有してもよい。
本発明の抗ＯＸ４０抗体は機能が影響されるように修飾されてもよい。本発明は修飾を有するグリコシル化様態の抗ＯＸ４０抗体を含む。修飾により望まないグリコシル化部位を除去してもよく、或いはオリゴ糖鎖にフコース部分を存在させないことで抗体の依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を強化してもよく、或いはガラクトシル化修飾により補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改変してもよい。
本発明の抗ＯＸ４０抗体は、通常、約１０－９～約１０－１３Ｍの親和力定数を有してもよい。
【0038】
例えば、本分野でよく知られているハイブリドーマ技術など、本分野の常用方法により本発明の抗ＯＸ４０抗体を製造してもよい。或いは、本発明の抗ＯＸ４０抗体はハイブリドーマ細胞系を除く細胞系に発現してもよい。本発明の抗体をコードする配列で適切な哺乳動物宿主細胞を変換してもよい。変換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス（又はウイルスベクター）にパッケージングしてウイルス（又はベクター）で宿主細胞に対して形質導入を行うことなどを含む、任意の既知方法を採用してもよい。使用される変換工程は変換する宿主によって決定される。ヘテロポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は本分野においてよく知られており、デキストランにより仲介されるトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンにより仲介されるトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、及びＤＮＡの細胞核への直接マイクロインジェクションなどを含む。発現するための宿主として利用できる哺乳動物細胞系は本分野においてよく知られており、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手できる様々な不死化細胞系を含むが、これらに限定されず、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞がん細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）などを含むが、これらに限定されない。特に好ましい細胞系は、高発現レベルを有するとともに、基本的なＯＸ４０結合特性を有する抗体を産生細胞系を特定することで選定する。
【0039】
抗ＯＸ４０抗体をコードするポリヌクレオチド配列
本発明は、本発明に係る抗ＯＸ４０抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本明細書は重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖、軽鎖及び各ＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
本発明の核酸分子は一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡとＲＮＡ、及び対応する相補配列を含む。ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成によるＤＮＡ、ＰＣＲ増幅によるＤＮＡ及びこれらの組合せを含む。本発明の核酸分子は全長遺伝子又はｃＤＮＡ分子及びその断片の組合せを含む。本発明の核酸はヒト由来が好ましいが、本発明において非ヒト由来の核酸も含む。
本発明において、分離された核酸分子は単独断片の形態又は大きい核酸コンストラクトの成分とする核酸分子である。好ましい一実施形態において、核酸には汚染性を持つ内因性物質が殆ど含まない。好ましくは、核酸分子は、ほぼ純粋な形態で少なくとも１回単離され、且つ標準的な生化学方法によりその成分であるヌクレオチド配列を認識、操作及び回収できるような量又は濃度を有するＤＮＡ又はＲＮＡに由来する。好ましくは、前記配列は、内部非翻訳配列又はイントロン（代表的に真核遺伝子に存在）による中断を受けていないオープンリーディングフレーム形態で提供及び／又は構築される。非翻訳ＤＮＡの配列はオープンリーディングフレームの５’又は３’部位に存在してもよく、同様にコード領域の操作又は発現に影響しない。
本発明は、本発明に係る抗ＯＸ４０抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本明細書は重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖、軽鎖及び各ＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
本発明の核酸分子は一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡとＲＮＡ、及び対応する相補配列を含む。ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成によるＤＮＡ、ＰＣＲ増幅によるＤＮＡ及びこれらの組合せを含む。本発明の核酸分子は全長遺伝子又はｃＤＮＡ分子及びその断片の組合せを含む。本発明の核酸はヒト由来が好ましいが、本発明において非ヒト由来の核酸も含む。
本発明において、分離された核酸分子は単独断片の形態又は大きい核酸コンストラクトの成分とする核酸分子である。好ましい一実施形態において、核酸には汚染性を持つ内因性物質が殆ど含まない。好ましくは、核酸分子は、ほぼ純粋な形態で少なくとも１回単離され、且つ標準的な生化学方法によりその成分であるヌクレオチド配列を認識、操作及び回収できるような量又は濃度を有するＤＮＡ又はＲＮＡに由来する。好ましくは、前記配列は、内部非翻訳配列又はイントロン（代表的に真核遺伝子に存在）による中断を受けていないオープンリーディングフレーム形態で提供及び／又は構築される。非翻訳ＤＮＡの配列はオープンリーディングフレームの５’又は３’部位に存在してもよく、同様にコード領域の操作又は発現に影響しない。
【0040】
本発明は、適切な苛酷条件、好ましくは高度な苛酷条件で本明細書に係る抗ＯＸ４０抗体をコードする核酸とハイブリダイゼーションを行う核酸を更に含む。ハイブリダイゼーション条件の選定に影響する基本パラメータ及び設計の適切条件に関する指導は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、第９章及び第１１章、並びにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、２．１０節及び６．３－６．４節）を参照する。
本明細書に記載される通り、通常、カセット変異導入法又はＰＣＲ変異導入法又は本分野でよく知られているその他の技術を利用して、抗ＯＸ４０抗体をコードするＤＮＡでヌクレオチドの部位特異的変異導入により変異体をコードするＤＮＡを産生し、その後細胞培養物で組換えＤＮＡを発現して、本発明に係る変異体を製造した。しかしながら、確定された技術を利用してインビトロで合成することで、約１００～１５０個にも達する残基を含む抗原結合断片を製造してもよい。
当業者に理解されるように、遺伝コードの縮重により大量の核酸を製造できるが、このような核酸の全ては本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片をコードする。従って、特定のアミノ酸配列が既に同定された場合、当業者はタンパク質をコードするアミノ酸配列を改変しない方式で１つ又は複数のコドンを簡単に修飾する配列により、任意数の異なる核酸を製造できる。
本明細書に記載される通り、通常、カセット変異導入法又はＰＣＲ変異導入法又は本分野でよく知られているその他の技術を利用して、抗ＯＸ４０抗体をコードするＤＮＡでヌクレオチドの部位特異的変異導入により変異体をコードするＤＮＡを産生し、その後細胞培養物で組換えＤＮＡを発現して、本発明に係る変異体を製造した。しかしながら、確定された技術を利用してインビトロで合成することで、約１００～１５０個にも達する残基を含む抗原結合断片を製造してもよい。
当業者に理解されるように、遺伝コードの縮重により大量の核酸を製造できるが、このような核酸の全ては本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片をコードする。従って、特定のアミノ酸配列が既に同定された場合、当業者はタンパク質をコードするアミノ酸配列を改変しない方式で１つ又は複数のコドンを簡単に修飾する配列により、任意数の異なる核酸を製造できる。
【0041】
本発明は、上記のようなポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むプラスミド、発現ベクター、転写カセット又は発現カセット方式の発現系及びコンストラクトを更に提供する。また、本発明は、前記発現系又はコンストラクトを含む宿主細胞を提供する。
任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、通常、プラスミドの維持及び外因性ヌクレオチド配列のクローンと発現に使用される配列を含む。前記配列（幾つかの実施形態において「隣接配列」と総称される）は通常、１つ又は複数の下記ヌクレオチド配列、即ち、プロモーター、１つ又は複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、供与体及び受容体スプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌に利用されるリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現しようとする抗体をコードする核酸を挿入するためのマルチコネクソン領域及び任意の標識エレメントを含む。下記によりこれらの配列をそれぞれ記述する。
ベクターは、「タグ」コード配列、即ち、抗ＯＸ４０抗体コード配列の５’又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を任意に含む。オリゴヌクレオチド配列はポリヒスチジン（例えば、６Ｈｉｓ）又は別の「タグ」、例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（インフルエンザウイルス血球凝集素）又はｍｙｃ（（これらについては、市販の抗体に存在する））などをコードする。このタグは、ポリペプチドが発現するときに典型的にポリペプチドに融合され、宿主細胞からのアフィニティ精製または抗ＯＸ４０抗体の検出の手段として使用できる。アフィニティ精製は、例えば、これらのタグに対応する抗体をアフィニティーマトリックスとして利用するカラムクロマトグラフィーにより実施される。タグは、その後、任意に、例えば、切断のために特定のペプチダーゼを利用する様々な方式により、精製されたＯＸ４０抗ＯＸ４０抗体から除去されてもよい。
任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、通常、プラスミドの維持及び外因性ヌクレオチド配列のクローンと発現に使用される配列を含む。前記配列（幾つかの実施形態において「隣接配列」と総称される）は通常、１つ又は複数の下記ヌクレオチド配列、即ち、プロモーター、１つ又は複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、供与体及び受容体スプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌に利用されるリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現しようとする抗体をコードする核酸を挿入するためのマルチコネクソン領域及び任意の標識エレメントを含む。下記によりこれらの配列をそれぞれ記述する。
ベクターは、「タグ」コード配列、即ち、抗ＯＸ４０抗体コード配列の５’又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を任意に含む。オリゴヌクレオチド配列はポリヒスチジン（例えば、６Ｈｉｓ）又は別の「タグ」、例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（インフルエンザウイルス血球凝集素）又はｍｙｃ（（これらについては、市販の抗体に存在する））などをコードする。このタグは、ポリペプチドが発現するときに典型的にポリペプチドに融合され、宿主細胞からのアフィニティ精製または抗ＯＸ４０抗体の検出の手段として使用できる。アフィニティ精製は、例えば、これらのタグに対応する抗体をアフィニティーマトリックスとして利用するカラムクロマトグラフィーにより実施される。タグは、その後、任意に、例えば、切断のために特定のペプチダーゼを利用する様々な方式により、精製されたＯＸ４０抗ＯＸ４０抗体から除去されてもよい。
【0042】
隣接配列は、相同（即ち、宿主細胞と同じ種及び／又は株由来）、異種（即ち、宿主細胞種又は株以外の種由来）、ハイブリッド（即ち、２つ以上の供給源由来の隣接配列の組合せ）、合成又は天然であってもよい。同様に、隣接配列の供給源が、この隣接配列が宿主細胞のメカニズムで機能すると共に宿主細胞のメカニズムにより活性化される前提で、任意の原核又は真核生体、任意の脊椎動物又は無脊椎動物生体又は任意の植物であってもよい。
複製起点は代表的には、市販される原核発現ベクターの一部であり、このような起点はベクターの宿主細胞における増幅に繋がる。選定されるベクターが複製起点部位を含まない場合、既知の配列に基づいて化学合成によりベクターに連結してもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に由来する複製起点は、ほとんどグラム陰性菌に適し、様々なウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）又は例えば、ＨＰＶ又はＢＰＶなどのパピローマウイルス）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。哺乳動物発現ベクターは通常、複製起点の成分を必要としない（例えば、ウイルス初期プロモーターをも含むことから、一般的にＳＶ４０起点は単独で用いられる）。
転写終結配列は代表的にポリペプチドコード領域の３’末端に位置して、転写を終結させる。原核細胞における転写終結配列は、通常、Ｇ－Ｃリッチ断片であり、ポリＴ配列が続く。
複製起点は代表的には、市販される原核発現ベクターの一部であり、このような起点はベクターの宿主細胞における増幅に繋がる。選定されるベクターが複製起点部位を含まない場合、既知の配列に基づいて化学合成によりベクターに連結してもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に由来する複製起点は、ほとんどグラム陰性菌に適し、様々なウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）又は例えば、ＨＰＶ又はＢＰＶなどのパピローマウイルス）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。哺乳動物発現ベクターは通常、複製起点の成分を必要としない（例えば、ウイルス初期プロモーターをも含むことから、一般的にＳＶ４０起点は単独で用いられる）。
転写終結配列は代表的にポリペプチドコード領域の３’末端に位置して、転写を終結させる。原核細胞における転写終結配列は、通常、Ｇ－Ｃリッチ断片であり、ポリＴ配列が続く。
【0043】
選択マーカー遺伝子は、選択性の培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質又はその他の毒素（例えば、原核宿主細胞については、アンピシリン、テトラサイクリン又はカナマイシン）に対する耐性を付与する、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完する、或いは（ｃ）複合物又は決定された培地により得られない重要栄養素を供給する、タンパク質をコードする。特異性の任意の標識はカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利なことに、ネオマイシン耐性遺伝子も原核及び真核宿主細胞における選択に用いることができる。
リボソーム結合部位は、通常ｍＲＮＡの翻訳開始に必要とされ、且つＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核生物）又はＫｏｚａｋ配列（真核生物）により特徴付けられる。このエレメントは代表的にプロモーターの３’部位及び発現されるべきポリペプチドのコード配列の５’部位に位置する。
本発明の発現及びクローニングベクターは代表的に、宿主生体により認識されると共に抗ＯＸ４０抗体をコードする分子と操作可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子（通常、約１００～１０００ｂｐ以内）の開始コドン上流に位置する非転写配列である。
リボソーム結合部位は、通常ｍＲＮＡの翻訳開始に必要とされ、且つＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核生物）又はＫｏｚａｋ配列（真核生物）により特徴付けられる。このエレメントは代表的にプロモーターの３’部位及び発現されるべきポリペプチドのコード配列の５’部位に位置する。
本発明の発現及びクローニングベクターは代表的に、宿主生体により認識されると共に抗ＯＸ４０抗体をコードする分子と操作可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子（通常、約１００～１０００ｂｐ以内）の開始コドン上流に位置する非転写配列である。
【0044】
本分野において、酵母宿主と一緒に使用される適切なプロモーターもよく知られている。酵母エンハンサーは酵母プロモーターとともに有利に用いられる。哺乳動物宿主細胞と一緒に使用される適切なプロモーターはよく知られており、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、牛パピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及び最も好ましいシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスゲノムにより得られたプロモーターを含むが、これらに限定されない。その他の適切な哺乳動物プロモーターは、例えば、熱ショックプロモーター、アクチンプロモーターなどの異種哺乳動物プロモーターを含む。
【0045】
エンハンサー配列をベクターに挿入して、高等真核生物により本発明の抗ＯＸ４０抗体を構成する軽鎖又は重鎖をコードするＤＮＡの転写を増加させる。エンハンサーはプロモーターに作用して転写を増加させるＤＮＡのシス作用エレメントであり、長さが通常約１０～３００ｂｐである。エンハンサーは相対的な方向及びロケーションの独立性を有し、既に転写ユニットの５’及び３’部位に見出されている。哺乳動物遺伝子から得られる幾つかのエンハンサー配列は公知であり、例えば、グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、アルファフェトプロテイン及びインスリンのエンハンサー配列である。しかしながら、代表的にウイルス由来のエンハンサーを使用する。本分野においてよく知られているＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマウイルスエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーは、真核プロモーターを活性化させる例示的なエンハンサーエレメントである。
【0046】
本発明の発現ベクターは開始ベクター（例えば、市販ベクター）により構築されてもよい。このようなベクターは所望の全ての隣接配列を含んでも含まなくてもよい。本明細書に記載される隣接配列の１つ又は複数はベクターに存在していない場合、個々に入手してベクターと連結してもよい。隣接配列の各々を得るために用いた方法は、当業者に周知である。
ベクターを構築して、抗ＯＸ４０抗体を含む軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子をベクターの適切な部位に挿入した後、完成されたベクターを適切な宿主細胞に挿入して、増幅及び／又はポリペプチド発現に利用する。選択された宿主細胞への抗ＯＸ４０抗体についての発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション又はその他の既知技術を含む周知の方法によって達成され得る。選定された方法の一部は使用される宿主細胞のタイプに依存する。
宿主細胞は適切な条件で培養された場合、抗ＯＸ４０抗体を合成して、その後、抗ＯＸ４０抗体は培地から（宿主細胞がこの抗体を培地に分泌した場合）収集され、又は（分泌しない場合）この抗体を産生する宿主細胞から直接的に収集される。適切な宿主細胞は上記に記載される通りである。
ベクターを構築して、抗ＯＸ４０抗体を含む軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子をベクターの適切な部位に挿入した後、完成されたベクターを適切な宿主細胞に挿入して、増幅及び／又はポリペプチド発現に利用する。選択された宿主細胞への抗ＯＸ４０抗体についての発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション又はその他の既知技術を含む周知の方法によって達成され得る。選定された方法の一部は使用される宿主細胞のタイプに依存する。
宿主細胞は適切な条件で培養された場合、抗ＯＸ４０抗体を合成して、その後、抗ＯＸ４０抗体は培地から（宿主細胞がこの抗体を培地に分泌した場合）収集され、又は（分泌しない場合）この抗体を産生する宿主細胞から直接的に収集される。適切な宿主細胞は上記に記載される通りである。
【0047】
治療目的に利用される抗ＯＸ４０抗体の用途
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体の全ての様態は本明細書に記載される様々な病状及び疾患を治療するための薬物の製造に利用できるが、前記病状及び疾患、特に病状はＯＸ４０を発現するＢ細胞（特にＴ細胞、ＮＫ細胞及び好中球細胞）に関連する疾患又は病状である。幾つかの実施形態において、前記病状及び疾患は、Ｔ細胞関連がんであり、膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、胃腸癌、膵臓癌、結腸直腸がん、結腸がん、腎臓がん、頭頸部がん、肺がん、胃がん、生殖細胞がん、骨がん、肝臓がん、甲状腺がん、皮膚がん、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、泌尿生殖器がん、尿路上皮がん、腎細胞がん、胃腺がん、非小細胞肺がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮がん、ホジキンリンパ腫、胃食道接合部腺がん、黒色腫、肉腫、およびウイルス関連のがんを含むが、それらに限定されるものではない。幾つかの実施形態において、癌は、転移性癌、難治性癌、または再発性癌である。前記病状及び疾患は、例えば、ＯＸ４０媒介性アレルギー、喘息、ＣＯＰＤ、関節リウマチ、乾癬、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、および炎症関連疾患を含む、他のＯＸ４０により媒介される疾患であり得る。
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体の全ての様態は本明細書に記載される様々な病状及び疾患を治療するための薬物の製造に利用できるが、前記病状及び疾患、特に病状はＯＸ４０を発現するＢ細胞（特にＴ細胞、ＮＫ細胞及び好中球細胞）に関連する疾患又は病状である。幾つかの実施形態において、前記病状及び疾患は、Ｔ細胞関連がんであり、膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、胃腸癌、膵臓癌、結腸直腸がん、結腸がん、腎臓がん、頭頸部がん、肺がん、胃がん、生殖細胞がん、骨がん、肝臓がん、甲状腺がん、皮膚がん、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、泌尿生殖器がん、尿路上皮がん、腎細胞がん、胃腺がん、非小細胞肺がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮がん、ホジキンリンパ腫、胃食道接合部腺がん、黒色腫、肉腫、およびウイルス関連のがんを含むが、それらに限定されるものではない。幾つかの実施形態において、癌は、転移性癌、難治性癌、または再発性癌である。前記病状及び疾患は、例えば、ＯＸ４０媒介性アレルギー、喘息、ＣＯＰＤ、関節リウマチ、乾癬、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、および炎症関連疾患を含む、他のＯＸ４０により媒介される疾患であり得る。
【0048】
診断用途、測定及び試薬キット
本発明の抗ＯＸ４０抗体は診断測定に利用でき、例えば、測定と合わせて組織（例えば、骨髄）又は細胞（例えば、形質細胞）に発現するＯＸ４０を検出及び／又は定量する。抗ＯＸ４０抗体はＯＸ４０の疾患における作用の鋭意研究に利用できる。抗ＯＸ４０抗体はＯＸ４０の単独重合及び／又はヘテロ重合受容体複合物の形成における作用、及び前記ＯＸ４０受容体複合物の疾患における作用の鋭意研究に利用できる。
ＯＸ４０の血清含有量は、予後のものであってよい。本発明の実施形態は、可溶性ＯＸ４０が腫瘍細胞における膜結合ＯＸ４０の潜在的な代用品であるかを測定するために、診断測定及び試薬キットを含む。
本発明の抗ＯＸ４０抗体はＯＸ４０に関連する疾患及び／又は病状を検出、診断又は監視するための診断目的に利用できる。本発明は当業者によく知られている代表的な免疫組織学方法によりサンプルにおけるＯＸ４０の存在を検出することを提供するインビボ又はインビトロでＯＸ４０を検出できる。ＯＸ４０の存在検出に適する方法の実例はＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＲＩＡなどを含む。
本発明の抗ＯＸ４０抗体は診断測定に利用でき、例えば、測定と合わせて組織（例えば、骨髄）又は細胞（例えば、形質細胞）に発現するＯＸ４０を検出及び／又は定量する。抗ＯＸ４０抗体はＯＸ４０の疾患における作用の鋭意研究に利用できる。抗ＯＸ４０抗体はＯＸ４０の単独重合及び／又はヘテロ重合受容体複合物の形成における作用、及び前記ＯＸ４０受容体複合物の疾患における作用の鋭意研究に利用できる。
ＯＸ４０の血清含有量は、予後のものであってよい。本発明の実施形態は、可溶性ＯＸ４０が腫瘍細胞における膜結合ＯＸ４０の潜在的な代用品であるかを測定するために、診断測定及び試薬キットを含む。
本発明の抗ＯＸ４０抗体はＯＸ４０に関連する疾患及び／又は病状を検出、診断又は監視するための診断目的に利用できる。本発明は当業者によく知られている代表的な免疫組織学方法によりサンプルにおけるＯＸ４０の存在を検出することを提供するインビボ又はインビトロでＯＸ４０を検出できる。ＯＸ４０の存在検出に適する方法の実例はＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＲＩＡなどを含む。
【0049】
診断応用について、通常、検出できる標識基により抗ＯＸ４０抗体を標識する。適切な標識基は、下記のもの、即ち、放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、発蛍光団（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光剤）、酵素団（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光団、ビオチン団又は二次レポーターにより認識された予定ポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー配列、二次抗体に利用される結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、標識基は各長さのサブスペーサーにより抗ＯＸ４０抗体とカップリングして、潜在的な立体障害を低減させる。タンパク質を標識するための各方法は本分野においてよく知られていると共に、本発明を実施できる。
本発明の一様態はＯＸ４０を認識又は発現する細胞を提供する。具体的な一実施形態において、標識基で抗体を標識すると共に、標識された抗体とＯＸ４０との結合を検出する。具体的な別の実施形態において、インビボで抗体とＯＸ４０との結合を検出する。具体的な別の実施形態において、本分野においてよく知られている技術により抗体－ＯＸ４０を分離及び測定する。
本発明の別の様態は本発明の抗体に対してＯＸ４０と競合的に結合する試験分子の存在の検出を提供する。前記測定の実例は、試験分子が存在する、又は存在しない場合の、ＯＸ４０を一定量で含む溶液における遊離抗体の量の検出に関する。遊離抗体（即ち、ＯＸ４０と結合していない抗体）の量の増加は、該抗体に対して試験分子がＯＸ４０と競合的に結合できることを示す。一実施形態において、標識基で抗体を標識する。或いは、試験分子を標識すると共に、抗体が存在する、又は存在しない場合に遊離試験分子の量を監視する。
本発明の一様態はＯＸ４０を認識又は発現する細胞を提供する。具体的な一実施形態において、標識基で抗体を標識すると共に、標識された抗体とＯＸ４０との結合を検出する。具体的な別の実施形態において、インビボで抗体とＯＸ４０との結合を検出する。具体的な別の実施形態において、本分野においてよく知られている技術により抗体－ＯＸ４０を分離及び測定する。
本発明の別の様態は本発明の抗体に対してＯＸ４０と競合的に結合する試験分子の存在の検出を提供する。前記測定の実例は、試験分子が存在する、又は存在しない場合の、ＯＸ４０を一定量で含む溶液における遊離抗体の量の検出に関する。遊離抗体（即ち、ＯＸ４０と結合していない抗体）の量の増加は、該抗体に対して試験分子がＯＸ４０と競合的に結合できることを示す。一実施形態において、標識基で抗体を標識する。或いは、試験分子を標識すると共に、抗体が存在する、又は存在しない場合に遊離試験分子の量を監視する。
【0050】
医薬組成物、投与経路
本発明は、治療有効量の１種又は複数種の本発明の抗ＯＸ４０抗体と、薬学的に許容される希釈剤、ベクター、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び／又はアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。
幾つかの実施形態において、医薬組成物に許容される希釈剤、ベクター、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び／又はアジュバントなどは、好ましくは、採用される用量及び濃度で受験者に対して無毒である。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ値、浸透性、粘度、清澄度、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解又は放出速度、吸収又は浸透を改善、維持又は保留するための物質を含んでもよい。これらの物質は既存技術でよく知られており、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版、Ａ． Ｒ． Ｇｅｎｒｍｏ編集、１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照する。所望の投与経路、送達方式及び必要とされる用量によって最適な医薬組成物を決定する。
本発明の医薬組成物は非経口送達で使用してもよい。或いは、組成物は吸入又は消化器（例えば、経口）送達で使用してもよい。前記薬学的に許容される組成物は本分野の技術により製造する。
その他の医薬組成物は当業者にとって明らかであり、持続的に又は制御的に放出される送達調製物に抗ＯＸ４０抗体が含まれる調製物を含む。幾つかのその他の持続的又は制御可能な送達方式を提供するための技術（例えば、リポソームベクター、生分解性微粒子又は多孔質ビーズ及びデポ注射）も当業者によく知られている。
本発明は、治療有効量の１種又は複数種の本発明の抗ＯＸ４０抗体と、薬学的に許容される希釈剤、ベクター、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び／又はアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。
幾つかの実施形態において、医薬組成物に許容される希釈剤、ベクター、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び／又はアジュバントなどは、好ましくは、採用される用量及び濃度で受験者に対して無毒である。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ値、浸透性、粘度、清澄度、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解又は放出速度、吸収又は浸透を改善、維持又は保留するための物質を含んでもよい。これらの物質は既存技術でよく知られており、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版、Ａ． Ｒ． Ｇｅｎｒｍｏ編集、１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照する。所望の投与経路、送達方式及び必要とされる用量によって最適な医薬組成物を決定する。
本発明の医薬組成物は非経口送達で使用してもよい。或いは、組成物は吸入又は消化器（例えば、経口）送達で使用してもよい。前記薬学的に許容される組成物は本分野の技術により製造する。
その他の医薬組成物は当業者にとって明らかであり、持続的に又は制御的に放出される送達調製物に抗ＯＸ４０抗体が含まれる調製物を含む。幾つかのその他の持続的又は制御可能な送達方式を提供するための技術（例えば、リポソームベクター、生分解性微粒子又は多孔質ビーズ及びデポ注射）も当業者によく知られている。
【0051】
インビボで投与する医薬組成物は、通常、無菌製剤の形態で提供する。無菌ろ過膜によりろ過することで殺菌を実現する。組成物を凍結乾燥する場合、凍結乾燥及び再構成の前に又はその後にこの方法により殺菌する。非経口投与に利用される組成物は凍結乾燥の形態又は溶液で保存できる。非経口組成物は、通常、無菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって穿通可能な栓を有する静脈内溶液バッグ、またはバイアルに入れられる。
医薬組成物は、調製されると、溶液、懸濁液、ゲル、乳液、固体、結晶、或いは脱水又は凍結乾燥粉末の形態で無菌バイアルに保存される。前記調製物はレディー・ツー・ユースの形態又は投与直前再構成の形態（例えば、凍結乾燥）のいずれで保存できる。本発明は単回用量投与単位を生成するための試薬キットを更に提供する。本発明の試薬キットは乾燥タンパク質を有する第１容器と含水調製物を有する第２容器をそれぞれ含む。本発明の幾つかの実施形態において、シングルチャンバー及びマルチチャンバープレフィルドシリンジ（例えば、液体用シリンジ及び凍結乾燥用シリンジ）を含む試薬キットを提供する。
本発明は、本発明の何れか１つの実施形態に係る抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片又はその医薬組成物を投与することで、患者（特に患者のＴ細胞関連疾患、例えば、Ｔ細胞関連がん及び自己免疫疾患）を治療する方法を提供する。
医薬組成物は、調製されると、溶液、懸濁液、ゲル、乳液、固体、結晶、或いは脱水又は凍結乾燥粉末の形態で無菌バイアルに保存される。前記調製物はレディー・ツー・ユースの形態又は投与直前再構成の形態（例えば、凍結乾燥）のいずれで保存できる。本発明は単回用量投与単位を生成するための試薬キットを更に提供する。本発明の試薬キットは乾燥タンパク質を有する第１容器と含水調製物を有する第２容器をそれぞれ含む。本発明の幾つかの実施形態において、シングルチャンバー及びマルチチャンバープレフィルドシリンジ（例えば、液体用シリンジ及び凍結乾燥用シリンジ）を含む試薬キットを提供する。
本発明は、本発明の何れか１つの実施形態に係る抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片又はその医薬組成物を投与することで、患者（特に患者のＴ細胞関連疾患、例えば、Ｔ細胞関連がん及び自己免疫疾患）を治療する方法を提供する。
【0052】
本明細書において、用語「患者」、「被験者」、「個体」、「対象」は互いに交換して使用できるが、任意の生体を含み、好ましくは動物であり、より好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギなど）であり、最も好ましくはヒトである。「治療」は、被験者に対して本明細書に記載される治療方案を採用して、少なくとも１つの陽性治療効果（例えば、がん細胞数減少、腫瘍体積減少、がん細胞の周辺器官への浸潤速度低下又は腫瘍転移又は腫瘍成長の速度低下）を得ることである。患者を有効的に治療する治療方案は様々な要素（例えば、患者の疾患状態、年齢、体重及び療法の被験者の抗がん反応を活性化させる能力）によって変更する。
採用しようとする本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物の治療有効量は、例えば、治療程度及び目標によって決定される。当業者に理解されるように、治療に使用される適切な用量レベルは部分的に送達される分子、適応症、投与経路及び患者の大きさ（体重、体表又は器官の大きさ）及び／又は状況（年齢及び一般健康状況）によって変化する。幾つかの実施形態において、最適の治療効果を得るために、臨床医が投薬量を設定して、投与経路を改変してもよい。
投与頻度は使用される調製物における特定の抗ＯＸ４０抗体の薬物動態パラメータに依存する。代表的には、臨床医は組成物を所望の効果を実現する投薬量まで投与する。従って、組成物は１回用量として投与してもよく、或いは２回以上の用量（必要とされる分子を同じ量で含んでもよく又は含まなくてもよい）として経時的に、または移植デバイス又はカテーテルを介して連続注入として投与してもよい。
医薬組成物の投与経路は、持続放出システムによるかまたは移植デバイスによる、例えば、経口、静脈内、腹膜内、脳内（脳実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈又は病巣内の経路による注射を通じた公知の方法に従う。
採用しようとする本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物の治療有効量は、例えば、治療程度及び目標によって決定される。当業者に理解されるように、治療に使用される適切な用量レベルは部分的に送達される分子、適応症、投与経路及び患者の大きさ（体重、体表又は器官の大きさ）及び／又は状況（年齢及び一般健康状況）によって変化する。幾つかの実施形態において、最適の治療効果を得るために、臨床医が投薬量を設定して、投与経路を改変してもよい。
投与頻度は使用される調製物における特定の抗ＯＸ４０抗体の薬物動態パラメータに依存する。代表的には、臨床医は組成物を所望の効果を実現する投薬量まで投与する。従って、組成物は１回用量として投与してもよく、或いは２回以上の用量（必要とされる分子を同じ量で含んでもよく又は含まなくてもよい）として経時的に、または移植デバイス又はカテーテルを介して連続注入として投与してもよい。
医薬組成物の投与経路は、持続放出システムによるかまたは移植デバイスによる、例えば、経口、静脈内、腹膜内、脳内（脳実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈又は病巣内の経路による注射を通じた公知の方法に従う。
【0053】
本明細書の実施形態
１、配列番号１に示されるＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるＨＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるＨＣＤＲ３を含み、及び／又は配列番号４に示されるＬＣＤＲ１、配列番号５に示されるＬＣＤＲ２及び配列番号６に示されるＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片。
２、上記１に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体は、配列番号７－３８のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ１、配列番号３９－６５のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ２、及び配列番号６６－１１４のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ３を含み、及び／又は配列番号１１５－１４５のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ１、配列番号１４６－１５９のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ２、及び配列番号１６０－１９９のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする。
３、上記１に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体は表１の群ａ１～群ａ７の何れか１群に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、および／または表２の群ｂ１～群ｂ７の何れか１群に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする。
４、前記１に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体は表３の群ｃ１～群ｃ７１の何れか１群に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲを含むことを特徴とする。
５、前記１～４の何れか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体ＶＨの各ＦＲ領域は配列番号２００－２７０に示されるＶＨのいずれか１つのＶＨのＦＲ領域であり、ＶＬの各ＦＲ領域は配列番号２７１－３４１に示されるＶＬのいずれか１つのＶＬのＦＲ領域であり；より好ましくは、前記抗ＯＸ４０抗体ＶＨおよびＶＬの各ＦＲ領域は表４から選ばれるいずれか１つの抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ領域であることを特徴とする。
６、前記１に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体のＶＨのアミノ酸配列は配列番号２００－２７０の何れか１つに示され、および／またはＶＬのアミノ酸配列は配列番号２７１－３４１のいずれか１つに示され、好ましくは、前記抗ＯＸ４０抗体のＶＨのアミノ酸配列およびＶＬのアミノ酸配列は表４から選ばれるいずれか１つの抗体番号に示されることを特徴とする。
７、前記１～６の何れか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体はキメラ抗体又は完全ヒト抗体であり、好ましくは完全ヒト抗体であることを特徴とする。
８、前記１～７の何れか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤又はベクターと、を含むことを特徴とする、医薬組成物。
９、核酸分子または当該核酸分子を含む担体であって、
（１）前記１～７の何れか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列、及び
（２）（１）に記載されるポリヌクレオチド配列の相補配列、から選ばれる。
１０、前記１～７の何れか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片の、Ｔ細胞関連疾患を治療するためのものの製造における応用において、好ましくは、前記Ｔ細胞関連疾患はＴ細胞に関連する腫瘍又はＯＸ４０媒介性疾患であり、より好ましくは、前記ＯＸ４０媒介性疾患はＯＸ４０媒介性アレルギー、喘息、ＣＯＰＤ、関節リウマチ、乾癬、自己免疫疾患、および炎症関連疾患を含む。
１、配列番号１に示されるＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるＨＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるＨＣＤＲ３を含み、及び／又は配列番号４に示されるＬＣＤＲ１、配列番号５に示されるＬＣＤＲ２及び配列番号６に示されるＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片。
２、上記１に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体は、配列番号７－３８のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ１、配列番号３９－６５のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ２、及び配列番号６６－１１４のいずれか１つに示されるＨＣＤＲ３を含み、及び／又は配列番号１１５－１４５のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ１、配列番号１４６－１５９のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ２、及び配列番号１６０－１９９のいずれか１つに示されるＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする。
３、上記１に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体は表１の群ａ１～群ａ７の何れか１群に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、および／または表２の群ｂ１～群ｂ７の何れか１群に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むことを特徴とする。
４、前記１に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体は表３の群ｃ１～群ｃ７１の何れか１群に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲを含むことを特徴とする。
５、前記１～４の何れか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体ＶＨの各ＦＲ領域は配列番号２００－２７０に示されるＶＨのいずれか１つのＶＨのＦＲ領域であり、ＶＬの各ＦＲ領域は配列番号２７１－３４１に示されるＶＬのいずれか１つのＶＬのＦＲ領域であり；より好ましくは、前記抗ＯＸ４０抗体ＶＨおよびＶＬの各ＦＲ領域は表４から選ばれるいずれか１つの抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ領域であることを特徴とする。
６、前記１に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体のＶＨのアミノ酸配列は配列番号２００－２７０の何れか１つに示され、および／またはＶＬのアミノ酸配列は配列番号２７１－３４１のいずれか１つに示され、好ましくは、前記抗ＯＸ４０抗体のＶＨのアミノ酸配列およびＶＬのアミノ酸配列は表４から選ばれるいずれか１つの抗体番号に示されることを特徴とする。
７、前記１～６の何れか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片において、前記抗ＯＸ４０抗体はキメラ抗体又は完全ヒト抗体であり、好ましくは完全ヒト抗体であることを特徴とする。
８、前記１～７の何れか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤又はベクターと、を含むことを特徴とする、医薬組成物。
９、核酸分子または当該核酸分子を含む担体であって、
（１）前記１～７の何れか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列、及び
（２）（１）に記載されるポリヌクレオチド配列の相補配列、から選ばれる。
１０、前記１～７の何れか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合断片の、Ｔ細胞関連疾患を治療するためのものの製造における応用において、好ましくは、前記Ｔ細胞関連疾患はＴ細胞に関連する腫瘍又はＯＸ４０媒介性疾患であり、より好ましくは、前記ＯＸ４０媒介性疾患はＯＸ４０媒介性アレルギー、喘息、ＣＯＰＤ、関節リウマチ、乾癬、自己免疫疾患、および炎症関連疾患を含む。
【0054】
下記は具体的な実施例により本発明を説明する。これらの実施例は説明するためのものであり、意図的に本発明の範囲を限定するものではない。実施例に使用される方法及び材料は別途で断りのない限り、本分野でよく知られている材料及び方法である。
【実施例】
【0055】
材料及び方法
１）免疫グロブリン可変領域遺伝子ヒト化マウスであるＡｃｅＭｏｕｓｅＧＢＴＭは、湖南華康恒健生物技術有限公司から提供されている。マウスはすべて湖南華康恒健生物技術有限公司で飼育され、関連する動物実験はすべて中国の法律および各レベルの規制に準拠して実施され、湖南華康恒健生物技術有限公司の動物管理および使用委員会によって承認された。
２）ＯＸ４０ヒト化マウス（ｈＯＸ４０Ｔｇマウス）：ヒト－マウスキメラＴｎｆｒｓｆ４（ＯＸ４０）ｃＤＮＡ －ｗｐｒｅ－ｐｏｌｙＡ（ただし、ＯＸ４０遺伝子の細胞外領域（約２．３ｋｂ）および膜貫通領域の前半部分がヒト由来であり、Ｅｘｏｎ１－５とＥｘｏｎ６の前半を含み、膜貫通領域の後半と細胞内領域はマウス由来であり、Ｅｘｏｎ７とＥｘｏｎ６の後半を含む。）この系統のマウスは、上海南方モデル動物バイオテクノロジー（株）がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術よって取得されたものである。この遺伝子型のマウスは、マウス抗ヒトＯＸ４０抗体の研究に適している。
３） ｈｕｍａｎ ＦＣＧＲＴｇマウスは、Ｆｃ 受容体ヒト化マウス （マウス ＦｃγＲｓ ノックアウト （ＦｃγＲα－／－） マウスに、ヒトのＦｃγＲｓ （ｈＦｃγＲＩ＋／ｈＦｃγＲＩＩＡＲ１３１＋／ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／ｈＦｃγＲＩＩＩＡＦ１５８＋／ｈＦｃγＲＩＩＩＢ＋）が導入された）である （当該マウスは、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１９ Ｓｅｐ ２７；１０（１）：４２０６． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１４６７－０１９－１２０９７－６．に記載されている）。この遺伝子型のマウスは、ヒトＦｃ受容体を発現する。
４）ＦｃγＲヒト化ＯＸ４０ヒト化マウスｈＦＣＧＲＴｇｈＯＸ４０Ｔｇマウス）：上記のＦｃ受容体ヒト化マウスとＯＸ４０ヒト化マウス（ｈＯＸ４０Ｔｇマウス）を交配して得られ、この遺伝子型のマウスは同時にヒトＦｃ受容体とヒトＯＸ４０分子を発現し、ヒト抗ヒトＯＸ４０抗体の研究に適している。
５）ｈＯＸ４０Ｔｇ ＯＴ１マウス：ＯＴ１マウスとＯＸ４０ヒト化マウス（ｈＯＸ４０Ｔｇマウス）を交配してえられ、この遺伝子型マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞はＯＶＡ特異性を持ちながら、ヒトＯＸ４０分子を発現し、ヒト抗ヒトＯＸ４０抗体の研究に適している。
すべてのマウスは、上海交通大学医学部の動物科学実験センターで飼育され、すべての動物実験は、中国の法律および各レベルの規制に準拠して実施され、上海交通大学医学部の動物管理および使用委員会によって承認された。
１）免疫グロブリン可変領域遺伝子ヒト化マウスであるＡｃｅＭｏｕｓｅＧＢＴＭは、湖南華康恒健生物技術有限公司から提供されている。マウスはすべて湖南華康恒健生物技術有限公司で飼育され、関連する動物実験はすべて中国の法律および各レベルの規制に準拠して実施され、湖南華康恒健生物技術有限公司の動物管理および使用委員会によって承認された。
２）ＯＸ４０ヒト化マウス（ｈＯＸ４０Ｔｇマウス）：ヒト－マウスキメラＴｎｆｒｓｆ４（ＯＸ４０）ｃＤＮＡ －ｗｐｒｅ－ｐｏｌｙＡ（ただし、ＯＸ４０遺伝子の細胞外領域（約２．３ｋｂ）および膜貫通領域の前半部分がヒト由来であり、Ｅｘｏｎ１－５とＥｘｏｎ６の前半を含み、膜貫通領域の後半と細胞内領域はマウス由来であり、Ｅｘｏｎ７とＥｘｏｎ６の後半を含む。）この系統のマウスは、上海南方モデル動物バイオテクノロジー（株）がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術よって取得されたものである。この遺伝子型のマウスは、マウス抗ヒトＯＸ４０抗体の研究に適している。
３） ｈｕｍａｎ ＦＣＧＲＴｇマウスは、Ｆｃ 受容体ヒト化マウス （マウス ＦｃγＲｓ ノックアウト （ＦｃγＲα－／－） マウスに、ヒトのＦｃγＲｓ （ｈＦｃγＲＩ＋／ｈＦｃγＲＩＩＡＲ１３１＋／ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／ｈＦｃγＲＩＩＩＡＦ１５８＋／ｈＦｃγＲＩＩＩＢ＋）が導入された）である （当該マウスは、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１９ Ｓｅｐ ２７；１０（１）：４２０６． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１４６７－０１９－１２０９７－６．に記載されている）。この遺伝子型のマウスは、ヒトＦｃ受容体を発現する。
４）ＦｃγＲヒト化ＯＸ４０ヒト化マウスｈＦＣＧＲＴｇｈＯＸ４０Ｔｇマウス）：上記のＦｃ受容体ヒト化マウスとＯＸ４０ヒト化マウス（ｈＯＸ４０Ｔｇマウス）を交配して得られ、この遺伝子型のマウスは同時にヒトＦｃ受容体とヒトＯＸ４０分子を発現し、ヒト抗ヒトＯＸ４０抗体の研究に適している。
５）ｈＯＸ４０Ｔｇ ＯＴ１マウス：ＯＴ１マウスとＯＸ４０ヒト化マウス（ｈＯＸ４０Ｔｇマウス）を交配してえられ、この遺伝子型マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞はＯＶＡ特異性を持ちながら、ヒトＯＸ４０分子を発現し、ヒト抗ヒトＯＸ４０抗体の研究に適している。
すべてのマウスは、上海交通大学医学部の動物科学実験センターで飼育され、すべての動物実験は、中国の法律および各レベルの規制に準拠して実施され、上海交通大学医学部の動物管理および使用委員会によって承認された。
【0056】
実施例１：マウスに抗ヒトＯＸ４０のモノクローナル抗体を産生させる免疫化
最初の免疫化は、商品化の組換えヒトＯＸ４０抗原タンパク質（６Ｈｉｓタグ、製品番号ＣＫ６０、仕入先Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）及び標準完全フロイントアジュバントを利用して４０μｇヒト組換えＯＸ４０タンパク質抗原／２０ｇマウス体重の用量で行った。２回目から４回目の免疫化では、ヒトＯＸ４０全長タンパク質（配列はＮＣＢＩデータボトムを参照、番号ＮＭ＿００３３２７．２）を利用して、６週齢のマウスに対して免疫化を行った。５回目免疫化は商品化の組換えヒトＯＸ４０抗原タンパク質（６Ｈｉｓタグ、製品番号ＣＫ６０、仕入先Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びＰＢＳを利用して２５μｇヒト組換えＯＸ４０タンパク質抗原／マウスの用量で行った。
最初の免疫化は、商品化の組換えヒトＯＸ４０抗原タンパク質（６Ｈｉｓタグ、製品番号ＣＫ６０、仕入先Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）及び標準完全フロイントアジュバントを利用して４０μｇヒト組換えＯＸ４０タンパク質抗原／２０ｇマウス体重の用量で行った。２回目から４回目の免疫化では、ヒトＯＸ４０全長タンパク質（配列はＮＣＢＩデータボトムを参照、番号ＮＭ＿００３３２７．２）を利用して、６週齢のマウスに対して免疫化を行った。５回目免疫化は商品化の組換えヒトＯＸ４０抗原タンパク質（６Ｈｉｓタグ、製品番号ＣＫ６０、仕入先Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びＰＢＳを利用して２５μｇヒト組換えＯＸ４０タンパク質抗原／マウスの用量で行った。
【0057】
実施例２、酵素結合免疫吸着測定法により免疫後のマウス血清に対する検出
ＰＢＳでヒト組換えＯＸ４０抗原タンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、製品番号ＣＫ６０）を０．５ｎｇ／μＬとなるように希釈させ、Ｍａｘｉｓｏｒｐの９６ウェルフラットボトムＥＬＩＳＡ用プレートに抗原を１００μＬ／ウェルで入れて、ラップで密封してから、４℃で一晩置いた。翌日、抗原を捨ててから、ＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、更にＰＢＳを捨ててから、吸取紙で水分を拭き取り、各ウエルに２００μＬブロッキング液（１０％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）を入れて、室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング終了後、ブロッキング液を捨て、吸取紙で水分を拭き取った。５０μＬ希釈液（５％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）を入れ、血清を濃度勾配希釈させて９６ウェルプレートに入れ、室温で１時間置いた。その後、サンプルを捨て、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。５０μＬ希釈液（５％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）を入れ、ＨＲＰのヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（最終濃度０．４μｇ／ｍＬ、メーカーＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、製品番号４０５３０６）を希釈させて、室温で１時間置いた。その後、液体を捨て、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）で５回洗浄し（２００μＬ／ウェル）、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。ＴＭＢ－過酸化水素尿素溶液（メーカーＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、製品番号３４０２９）基質溶液を５０μＬ／ウェルで入れ、室温で遮光で３～５分間置き、０．２５Ｍ硫酸を５０μＬ／ウェルで入れて、反応を終了させた。その後、多機能マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍ波長における吸光度を検出した。
ＰＢＳでヒト組換えＯＸ４０抗原タンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、製品番号ＣＫ６０）を０．５ｎｇ／μＬとなるように希釈させ、Ｍａｘｉｓｏｒｐの９６ウェルフラットボトムＥＬＩＳＡ用プレートに抗原を１００μＬ／ウェルで入れて、ラップで密封してから、４℃で一晩置いた。翌日、抗原を捨ててから、ＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、更にＰＢＳを捨ててから、吸取紙で水分を拭き取り、各ウエルに２００μＬブロッキング液（１０％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）を入れて、室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング終了後、ブロッキング液を捨て、吸取紙で水分を拭き取った。５０μＬ希釈液（５％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）を入れ、血清を濃度勾配希釈させて９６ウェルプレートに入れ、室温で１時間置いた。その後、サンプルを捨て、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。５０μＬ希釈液（５％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）を入れ、ＨＲＰのヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（最終濃度０．４μｇ／ｍＬ、メーカーＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、製品番号４０５３０６）を希釈させて、室温で１時間置いた。その後、液体を捨て、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）で５回洗浄し（２００μＬ／ウェル）、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。ＴＭＢ－過酸化水素尿素溶液（メーカーＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、製品番号３４０２９）基質溶液を５０μＬ／ウェルで入れ、室温で遮光で３～５分間置き、０．２５Ｍ硫酸を５０μＬ／ウェルで入れて、反応を終了させた。その後、多機能マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍ波長における吸光度を検出した。
【0058】
【表8】
ＩｇＧ可変領域ヒト化マウスをＨｉｓタグ付きヒトＯＸ４０細胞外ドメインタンパク質（ｈＯＸ４０－ＥＣ－Ｈｉｓ，Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃａｔ． Ｎｏ． ＣＫ６０，Ｌｏｔ． Ｎｏ． ０３３１３４８）で免疫化してから、マウスの脾臓、鼠径部、および膝窩リンパ節細胞をフローサイトメトリーにより選別し、得られたＩｇＤ陰性Ｂ系統細胞について単細胞シーケンシング（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を行った。免疫後の抗原特異的なＢ細胞クローン増殖の特徴により、標的配列（軽鎖可変領域および重鎖可変領域配列）を多くの配列から選択し、定常領域（軽鎖はＣκ（配列番号３４７）、重鎖定常領域はＩｇＧ定常領域配列番号３４５）を有する完全組換え抗体に作製する。抗体配列を発現ベクターに挿入し、コトランスフェクションの形で懸濁液２９３細胞に移し、上清を回収し、プロテインＧビーズでアフィニティー精製を行った。精製抗体をモレキュラーシーブ（Ｓｉｚｅ－Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）によりポリマーを除去し、得られたモノクローナル抗体を４℃または－２０℃の冷蔵庫に保存し、使用に備えた。
【0059】
実施例４、ＥＬＩＳＡ測定により単細胞シーケンシング抗体がｈＯＸ４０－ＥＣに結合する能力の検出
１）９６ウェル高吸着ＥＬＩＳＡプレート（ｎｕｎｃ）に１００μｌ ｈＯＸ４０－ＥＣ－Ｈｉｓ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）を２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、４度の冷蔵庫で一晩インキュベートした。
２）プレート内の液体を廃棄し、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄し、２００μｌの１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで調製）を加え、室温で２時間ブロッキングした。
３）精製された単細胞シーケンシング抗体、陰性対照抗体Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧ、および陽性対照抗体ＩＢＩ１０１、Ｐｏｇａｌｉｚｕｍａｂを適切に希釈し（３．１６μｇ／ｍｌ－１ｎｇ／ｍｌ）、それぞれ１００μｌ取り、上記ブロックウェルに入れ（ＰＢＳで３回洗浄し、液体を廃棄）、室温で１時間インキュベートした。
４）プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルに検出抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰ（１：１０００００、Ｂｅｔｈｙｌ）を１００μｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。
５）プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルにＨＲＰ基質であるＴＭＢ（Ａ液とＢ液を等体積で混合、ＫＰＬ）を１００μｌ加え、１０－３０分間発色させてから、マイクロプレートリーダーでＯＤ６５０のシグナル値を読み取った。
図１および図６Ａ－Ｂに示すように、単細胞シーケンシング組換え抗体はＯＸ４０結合能力を持っている。
１）９６ウェル高吸着ＥＬＩＳＡプレート（ｎｕｎｃ）に１００μｌ ｈＯＸ４０－ＥＣ－Ｈｉｓ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）を２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、４度の冷蔵庫で一晩インキュベートした。
２）プレート内の液体を廃棄し、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄し、２００μｌの１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで調製）を加え、室温で２時間ブロッキングした。
３）精製された単細胞シーケンシング抗体、陰性対照抗体Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧ、および陽性対照抗体ＩＢＩ１０１、Ｐｏｇａｌｉｚｕｍａｂを適切に希釈し（３．１６μｇ／ｍｌ－１ｎｇ／ｍｌ）、それぞれ１００μｌ取り、上記ブロックウェルに入れ（ＰＢＳで３回洗浄し、液体を廃棄）、室温で１時間インキュベートした。
４）プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルに検出抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰ（１：１０００００、Ｂｅｔｈｙｌ）を１００μｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。
５）プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルにＨＲＰ基質であるＴＭＢ（Ａ液とＢ液を等体積で混合、ＫＰＬ）を１００μｌ加え、１０－３０分間発色させてから、マイクロプレートリーダーでＯＤ６５０のシグナル値を読み取った。
図１および図６Ａ－Ｂに示すように、単細胞シーケンシング組換え抗体はＯＸ４０結合能力を持っている。
【0060】
実施例５：免疫後のマウス脾臓細胞から電気融合技術によりハイブリドーマ細胞の取得
事前にＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞を蘇生させた。融合当日、ＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞を取って計数した。免疫が正確に行われたＯＸ４０マウス脾臓を輸送培地ＨＢ培地（１％のＰ／Ｓを含む）に置き、すぐに脾臓の細胞を抽出して分離し、計数して使用に備える。１．５ｘ１０８個脾臓細胞と１ｘ１０８個ＳＰ２／０マウス骨髄腫の比率で混合させた。混合してから、２００Ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、２０ｍＬの融合液で２回洗浄して、使用に備える。２００Ｇ及び室温で５分間遠心分離し、上清を捨て、６．４ｍＬ電気融合緩衝液を入れて、沈殿物を再懸濁させた。５０ｍＬ遠心管を用意して、予熱された１３ｍＬＨＢ培地を入れた。混合細胞懸濁液を７５％アルコールで消毒され且つ乾燥されたＣＵＹ４９７Ｘ１０電極に入れ、ＥＣＦＧ２１電気融合マシン（メーカーＮＥＰＡＧＥＮＥ、型番ＥＣＦＧ２１）の標準操作フローにより細胞電気融合を行った。融合終了後、細胞を吸出して、インキュベーターで事前に予熱された１３ｍＬＨＢ培地に入れた。ＨＡＴ培地で細胞を再懸濁させ、５×１０５細胞／ウェルで９６ウェルフラットボトムプレートにプレーティングした。９６ウェルプレートを３７℃インキュベーターに静置して培養し、毎日細胞を観察し、１０日間目に上清を取り、ＥＬＩＳＡ予備スクリーニングを行った。
事前にＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞を蘇生させた。融合当日、ＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞を取って計数した。免疫が正確に行われたＯＸ４０マウス脾臓を輸送培地ＨＢ培地（１％のＰ／Ｓを含む）に置き、すぐに脾臓の細胞を抽出して分離し、計数して使用に備える。１．５ｘ１０８個脾臓細胞と１ｘ１０８個ＳＰ２／０マウス骨髄腫の比率で混合させた。混合してから、２００Ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、２０ｍＬの融合液で２回洗浄して、使用に備える。２００Ｇ及び室温で５分間遠心分離し、上清を捨て、６．４ｍＬ電気融合緩衝液を入れて、沈殿物を再懸濁させた。５０ｍＬ遠心管を用意して、予熱された１３ｍＬＨＢ培地を入れた。混合細胞懸濁液を７５％アルコールで消毒され且つ乾燥されたＣＵＹ４９７Ｘ１０電極に入れ、ＥＣＦＧ２１電気融合マシン（メーカーＮＥＰＡＧＥＮＥ、型番ＥＣＦＧ２１）の標準操作フローにより細胞電気融合を行った。融合終了後、細胞を吸出して、インキュベーターで事前に予熱された１３ｍＬＨＢ培地に入れた。ＨＡＴ培地で細胞を再懸濁させ、５×１０５細胞／ウェルで９６ウェルフラットボトムプレートにプレーティングした。９６ウェルプレートを３７℃インキュベーターに静置して培養し、毎日細胞を観察し、１０日間目に上清を取り、ＥＬＩＳＡ予備スクリーニングを行った。
【0061】
実施例６：酵素結合免疫吸着測定法によりハイブリドーマ抗ヒトＯＸ４０モノクローナル抗体のスクリーニング
ＰＢＳでＯＸ４０抗原（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｔ：ＣＳ７９ＣＫ６０）を０．５ｎｇ／μＬとなるように希釈させた。Ｍａｘｉｓｏｒｐの９６ウェルフラットボトムＥＬＩＳＡ用プレートに抗原を１００μＬ／ウェルで入れて、ラップで密封してから、４℃で一晩置いた。翌日、抗原を捨ててから、ＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、更にＰＢＳを捨ててから、吸取紙で水分を拭き取り、各ウエルに２００μＬブロッキング液を入れて、室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング終了後、ブロッキング液を捨て、吸取紙で水分を拭き取った。５０μＬサンプル（実施例５で得られたＯＸ４０ハイブリドーマ細胞の培養上清）を入れ、室温で１時間置いた。その後、サンプルを捨て、洗浄液で３回洗浄し、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。５０μＬ希釈液（５％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）を入れ、ＨＲＰのヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を希釈させて、室温で１時間置いた。その後、液体を捨て、洗浄液で５回洗浄し（２００μＬ／ウェル）、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。ＴＭＢ－過酸化水素尿素溶液基質溶液を５０μＬ／ウェルで入れ、室温で遮光で３～５分間置き、０．２５Ｍ硫酸を５０μＬ／ウェルで入れて、反応を終了させた。その後、多機能マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍ波長における吸光度を検出した。結果を下表に示す：
ＰＢＳでＯＸ４０抗原（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｔ：ＣＳ７９ＣＫ６０）を０．５ｎｇ／μＬとなるように希釈させた。Ｍａｘｉｓｏｒｐの９６ウェルフラットボトムＥＬＩＳＡ用プレートに抗原を１００μＬ／ウェルで入れて、ラップで密封してから、４℃で一晩置いた。翌日、抗原を捨ててから、ＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、更にＰＢＳを捨ててから、吸取紙で水分を拭き取り、各ウエルに２００μＬブロッキング液を入れて、室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング終了後、ブロッキング液を捨て、吸取紙で水分を拭き取った。５０μＬサンプル（実施例５で得られたＯＸ４０ハイブリドーマ細胞の培養上清）を入れ、室温で１時間置いた。その後、サンプルを捨て、洗浄液で３回洗浄し、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。５０μＬ希釈液（５％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）を入れ、ＨＲＰのヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を希釈させて、室温で１時間置いた。その後、液体を捨て、洗浄液で５回洗浄し（２００μＬ／ウェル）、最後に洗浄液を捨ててから、吸取紙で水分を拭き取った。ＴＭＢ－過酸化水素尿素溶液基質溶液を５０μＬ／ウェルで入れ、室温で遮光で３～５分間置き、０．２５Ｍ硫酸を５０μＬ／ウェルで入れて、反応を終了させた。その後、多機能マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍ波長における吸光度を検出した。結果を下表に示す：
【0062】
【表9】
【0063】
実施例７：フローサイトメータにより抗ヒトＯＸ４０抗体とＯＸ４０過剰発現細胞表面ＯＸ４０との結合分析
２００ＧでＯＸ４０過剰表現細胞を遠心分離して収集し、３％ＦＣＳを含むＰＢＳで１回洗浄してから、３％ＦＣＳを含むＰＢＳ２．５ｍＬに再懸濁させ、細胞を各ウエル２５μＬ細胞（２．５×１０５）で９６ウェルプレートに入れ、それぞれ７５μＬサンプル（実施例５で得られたＯＸ４０ハイブリドーマ細胞の培養上清）を入れ、陽性対照ウエルを設けて、７５μＬ抗－ＯＸ４０抗体（クローンＡＣＴ３５、メーカーＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、最終濃度１μｇ／ｍＬ）を入れた。陰性対照ウエル１に７５μＬＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（クローンＭＧ２ａ－５３、メーカーＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、最終濃度１μｇ／ｍＬ）を入れた。陰性対照ウエル２に３％ＦＣＳを含むＰＢＳ７５μＬを入れ、４℃冷蔵庫で１時間インキュベートしてから、３％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄した。上清を捨ててから、サンプルウエル、陽性対照ウエル、陰性対照ウエル１及び陰性対照ウエル２に５００ ｎｇ／ｍＬ濃度の二次抗体５０μＬ（メーカー商Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＰＥ、製品番号１２－４０１０－８２）を入れた。それからプレートを４℃冷蔵庫に置き、遮光で３０分間インキュベートしてから、３％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、最後に細胞を３％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μＬに再懸濁させ、フローサイトメータにより検出した。結果を下記表および図２Ａ－Ｃに示す。
２００ＧでＯＸ４０過剰表現細胞を遠心分離して収集し、３％ＦＣＳを含むＰＢＳで１回洗浄してから、３％ＦＣＳを含むＰＢＳ２．５ｍＬに再懸濁させ、細胞を各ウエル２５μＬ細胞（２．５×１０５）で９６ウェルプレートに入れ、それぞれ７５μＬサンプル（実施例５で得られたＯＸ４０ハイブリドーマ細胞の培養上清）を入れ、陽性対照ウエルを設けて、７５μＬ抗－ＯＸ４０抗体（クローンＡＣＴ３５、メーカーＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、最終濃度１μｇ／ｍＬ）を入れた。陰性対照ウエル１に７５μＬＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（クローンＭＧ２ａ－５３、メーカーＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、最終濃度１μｇ／ｍＬ）を入れた。陰性対照ウエル２に３％ＦＣＳを含むＰＢＳ７５μＬを入れ、４℃冷蔵庫で１時間インキュベートしてから、３％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄した。上清を捨ててから、サンプルウエル、陽性対照ウエル、陰性対照ウエル１及び陰性対照ウエル２に５００ ｎｇ／ｍＬ濃度の二次抗体５０μＬ（メーカー商Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＰＥ、製品番号１２－４０１０－８２）を入れた。それからプレートを４℃冷蔵庫に置き、遮光で３０分間インキュベートしてから、３％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、最後に細胞を３％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μＬに再懸濁させ、フローサイトメータにより検出した。結果を下記表および図２Ａ－Ｃに示す。
【0064】
【表10】
１）９６ウェル高吸着ＥＬＩＳＡプレート（ｎｕｎｃ）に１００μｌ ｈＯＸ４０－ＥＣ－Ｈｉｓ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）を１μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、４度の冷蔵庫で一晩インキュベートした。
２）プレート内の液体を廃棄し、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄し、２００μｌの１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで調製）を加え、室温で２時間ブロッキングした。
３）ハイブリドーマ上清を勾配希釈し（１：１０／１：１００／１：１０００／１：１００００）、それぞれ１００μｌ上記のブロックウェルに取り（ＰＢＳＴで２回洗浄し、液体を廃棄））、室温で１時間インキュベートした。
４）プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルに検出抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰ（１：５０００，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１００μｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。
５）プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルにＨＲＰ基質であるＴＭＢ（Ａ液とＢ液を等体積で混合、ＫＰＬ）を１００μｌ加え、しばらくしてから、マイクロプレートリーダーでＯＤ６５０のシグナル値を読み取った。
６）結果統計のためにサンプルを１：１００に希釈したときのシグナル値を選択した。
結果を下表、図３および図６Ａ－Ｂに示され、同じ可変領域を有するハイブリドーマ抗体または組換え抗体クローンがＯＸ４０に結合する能力を有することを示している。
【0065】
【表11】
１）ＰＢＭＣ懸濁液の調製：－８０℃の冷蔵庫から凍結した正常献血者由来のＰＢＭＣ（Ｆｉｃｏｌｌ分離で健常人末梢血単核細胞を取得）を取り出し、素早く３７℃の水浴で蘇生・解凍した。予熱したＰＢＳで２回洗浄した後、適量なＰＢＳで細胞を再懸濁し、改良ノイバウエル計算盤で細胞を計数した。
２）ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ：実験の必要に応じて、一部の細胞を取り出し、細胞密度が（２－４）＊１０＾７／ｍｌ、体積が５ｍｌ未満になるようにＰＢＳで希釈し、ＣＦＳＥを加え、最終濃度を５μＭにした。混合後、３７℃のインキュベーターに入れ、１５分間インキュベートした。次いで、細胞を９ｍｌの５％ＦＢＳを含有する洗浄液で２回洗浄し、４００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。適量な初代細胞培養培地（ＲＰＭＩ ＋ １０％ ＦＢＳ ＋ １％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ ＋ １％ ＨＥＰＥＳ ＋ １％ピルビン酸ナトリウム ＋ ０．１％ ２ＭＥ（最終濃度５０ｕＭ））を加えて細胞を再懸濁し、計数した。
３）対照（未処理、ＣＤ３のみ、ＣＤ３＋ＣＤ２８）を除き、０．２μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３（クローン：Ｈ００１、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を含む初代細胞培養培地を使用して、上記のＣＦＳＥ標識細胞を再懸濁し細胞密度を２＊１０＾６／ｍｌにした。実験計画に従って、各ウェルの細胞数が２＊１０＾５になるように、１００μｌの上記細胞を９６ウェル細胞培養フラットボトムプレートに加えた。無処理群にはＣＦＳＥで標識していない細胞を加え、抗ヒトＣＤ３などの抗体を加えなかった。ＣＤ３群のみにＣＦＳＥ標識細胞と抗ヒトＣＤ３を加え、他の抗体は加えなかった。ＣＤ３＋ＣＤ２８群にＣＦＳＥ標識細胞と抗ヒトＣＤ３を加え、２μｇ／ｍｌの濃度の抗ヒトＣＤ２８抗体も加えた（クローン： Ｈ００１、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）（ステップ４で等体積希釈した後、抗マウスＣＤ３およびＣＤ２８の最終濃度はそれぞれ０．１μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌであった）。
４）ハイブリドーマ上清を初代培養培地で希釈し（１：５）、１μｇ／ｍｌのｃｔｒｌ ｈＩｇＧおよびＩＢＩ１０１をそれぞれ抗体の陰性対照および陽性対照とした。それぞれ１００μｌ取り、上記抗ヒトＣＤ３抗体とＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを含むウェルプレートに加えた。対照群にそれぞれ１００μｌの培養液を加えた。
５）上記細胞を３７℃のインキュベーターで３日間培養した。
６）フローサイトメトリーによるＴ細胞増殖の検出：上記培養細胞を９６ウェルＵプレートに移し、ＰＢＳで２回洗浄し、５００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をＰＥ－Ｃｙ７抗ヒトＣＤ４（クローン：ＳＫ３、１：５００、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））およびＡＰＣ抗ヒトＣＤ８（クローン：ＲＰＡ－Ｔ８（ＲＵＯ）、１：５００、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））を含む５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ ＦＢＳ、２ ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に再懸濁し、氷上で暗所で１５分間インキュベートし、それからＰＢＳ緩衝液で細胞を２回洗浄しし、ＤＡＰＩ（０．５μｇ／ｍｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図４に示すように、ハイブリドーマ抗体クローンはインビトロ免疫活性化活性（ＰＢＭＣシステム）を持っている。
【0066】
実施例１０、ハイブリドーマ上清中の抗ヒトＯＸ４０抗体のインビトロ免疫活性化活性分析（脾臓細胞法）
１）ｈＯＸ４０Ｔｇマウス脾臓白血球単細胞懸濁液の調製：無菌条件下でｈＯＸ４０Ｔｇマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で５ｍｌの赤血球溶解液ＡＣＫで５分間溶解し、９ｍｌのＰＢＳを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、４００ｇで５ｍｉｎ遠心し、脾臓細胞を２ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。少量の単細胞懸濁液を取り、１：１００に希釈し、改良ノイバウエル計算盤で細胞を計数した。
２）ＣＦＳＥ標識脾臓細胞：実験の必要に応じて、一部の細胞を取り出し、細胞密度が（２－４）＊１０＾７／ｍｌ、体積が５ｍｌ未満になるようにＰＢＳで希釈し、ＣＦＳＥを加え、最終濃度を５μＭにした。混合後、３７℃のインキュベーターに入れ、１５分間インキュベートした。次いで、細胞を９ｍｌの５％ＦＢＳを含有する洗浄液で２回洗浄し、４００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。２ｍｌの初代細胞培養培地（ＲＰＭＩ ＋ １０％ ＦＢＳ ＋ １％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ ＋ １％ ＨＥＰＥＳ ＋ １％ピルビン酸ナトリウム ＋ ０．１％ ２ＭＥ（最終濃度５０ｕＭ））を加えて細胞を再懸濁し、計数した。
３）対照（未処理、ＣＤ３のみ、ＣＤ３＋ＣＤ２８）を除き、０．２μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３を含む初代細胞培養培地を使用して、上記のＣＦＳＥ標識細胞を再懸濁し細胞密度を２＊１０＾６／ｍｌにした。実験計画に従って、各ウェルの細胞数が２＊１０＾５になるように、１００μｌの上記細胞を９６ウェル細胞培養フラットボトムプレートに加えた。無処理群にはＣＦＳＥで標識していない細胞を加え、抗マウスＣＤ３などの抗体を加えなかった。ＣＤ３群のみにＣＦＳＥ標識細胞と抗マウスＣＤ３を加え、他の抗体は加えなかった。ＣＤ３＋ＣＤ２８群にＣＦＳＥ標識細胞と抗マウスＣＤ３を加え、２μｇ／ｍｌの濃度の抗マウスＣＤ２８抗体も加えた（ステップ４で等体積希釈した後、抗マウスＣＤ３およびＣＤ２８の最終濃度はそれぞれ０．１μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌであった）。
４）ハイブリドーマ上清を初代培養培地で希釈し（１：４）、１μｇ／ｍｌのｃｔｒｌ ｈＩｇＧおよびＩＢＩ１０１をそれぞれ抗体の陰性対照および陽性対照とした。それぞれ１００μｌ取り、上記抗マウスＣＤ３抗体とＣＦＳＥ標識脾臓細胞を含むウェルプレートに加えた。対照群にそれぞれ１００μｌの培養液を加えた。
５）上記細胞を３７℃のインキュベーターで３日間培養した。
６）フローサイトメトリーによるＴ細胞増殖の検出：上記培養細胞を９６ウェルＵプレートに移し、ＰＢＳで２回洗浄し、５００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をＰＥ抗マウスＣＤ４（クローン：ＧＫ１．５，１：５００，ＢＤ）およびＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ（クローン：５３－６．７，１：５００，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ ＦＢＳ、２ ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に再懸濁し、氷上で暗所で１５分間インキュベートし、それからＰＢＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＤＡＰＩ（０．５μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図５に示すように、ハイブリドーマ抗体クローンはインビトロ免疫活性化活性を持っている。
１）ｈＯＸ４０Ｔｇマウス脾臓白血球単細胞懸濁液の調製：無菌条件下でｈＯＸ４０Ｔｇマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で５ｍｌの赤血球溶解液ＡＣＫで５分間溶解し、９ｍｌのＰＢＳを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、４００ｇで５ｍｉｎ遠心し、脾臓細胞を２ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。少量の単細胞懸濁液を取り、１：１００に希釈し、改良ノイバウエル計算盤で細胞を計数した。
２）ＣＦＳＥ標識脾臓細胞：実験の必要に応じて、一部の細胞を取り出し、細胞密度が（２－４）＊１０＾７／ｍｌ、体積が５ｍｌ未満になるようにＰＢＳで希釈し、ＣＦＳＥを加え、最終濃度を５μＭにした。混合後、３７℃のインキュベーターに入れ、１５分間インキュベートした。次いで、細胞を９ｍｌの５％ＦＢＳを含有する洗浄液で２回洗浄し、４００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。２ｍｌの初代細胞培養培地（ＲＰＭＩ ＋ １０％ ＦＢＳ ＋ １％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ ＋ １％ ＨＥＰＥＳ ＋ １％ピルビン酸ナトリウム ＋ ０．１％ ２ＭＥ（最終濃度５０ｕＭ））を加えて細胞を再懸濁し、計数した。
３）対照（未処理、ＣＤ３のみ、ＣＤ３＋ＣＤ２８）を除き、０．２μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３を含む初代細胞培養培地を使用して、上記のＣＦＳＥ標識細胞を再懸濁し細胞密度を２＊１０＾６／ｍｌにした。実験計画に従って、各ウェルの細胞数が２＊１０＾５になるように、１００μｌの上記細胞を９６ウェル細胞培養フラットボトムプレートに加えた。無処理群にはＣＦＳＥで標識していない細胞を加え、抗マウスＣＤ３などの抗体を加えなかった。ＣＤ３群のみにＣＦＳＥ標識細胞と抗マウスＣＤ３を加え、他の抗体は加えなかった。ＣＤ３＋ＣＤ２８群にＣＦＳＥ標識細胞と抗マウスＣＤ３を加え、２μｇ／ｍｌの濃度の抗マウスＣＤ２８抗体も加えた（ステップ４で等体積希釈した後、抗マウスＣＤ３およびＣＤ２８の最終濃度はそれぞれ０．１μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌであった）。
４）ハイブリドーマ上清を初代培養培地で希釈し（１：４）、１μｇ／ｍｌのｃｔｒｌ ｈＩｇＧおよびＩＢＩ１０１をそれぞれ抗体の陰性対照および陽性対照とした。それぞれ１００μｌ取り、上記抗マウスＣＤ３抗体とＣＦＳＥ標識脾臓細胞を含むウェルプレートに加えた。対照群にそれぞれ１００μｌの培養液を加えた。
５）上記細胞を３７℃のインキュベーターで３日間培養した。
６）フローサイトメトリーによるＴ細胞増殖の検出：上記培養細胞を９６ウェルＵプレートに移し、ＰＢＳで２回洗浄し、５００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をＰＥ抗マウスＣＤ４（クローン：ＧＫ１．５，１：５００，ＢＤ）およびＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ（クローン：５３－６．７，１：５００，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ ＦＢＳ、２ ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に再懸濁し、氷上で暗所で１５分間インキュベートし、それからＰＢＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＤＡＰＩ（０．５μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図５に示すように、ハイブリドーマ抗体クローンはインビトロ免疫活性化活性を持っている。
【0067】
実施例１１、ＥＬＩＳＡ測定により抗ヒトＯＸ４０抗体がｈＯＸ４０－ＥＣに競合的に結合する能力の検出
１）９６ウェル高吸着ＥＬＩＳＡプレート（ｎｕｎｃ）に１００μｌ ｈＯＸ４０－ＥＣ－Ｈｉｓ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ， ＣＫ６０）を２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、４度の冷蔵庫で一晩インキュベートした。
２）プレート内の液体を廃棄し、プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ ｗｉｔｈ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回洗浄し、２００μｌの１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで調製）を加え、室温で２時間ブロッキングした。
３）精製された抗ヒトＯＸ４０抗体、陰性対照抗体Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧ ｈｕｍａｎ ＯＸ４０－Ｌ－６Ｈｉｓ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＪ４５）を０．２μｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ＯＸ４０－Ｌ－ｍＦｃ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＷ２５）を含む溶液で２μｇ／ｍｌに希釈し（抗体とリガンドの比例は１０：１）、それぞれ１００μｌを取り、上記ブロックウェルに入れ（ＰＢＳで３回洗浄し、液体を廃棄）、室温で１時間インキュベートした。
４）プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルに検出抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ１ ＨＲＰ（１：５０００，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１１５－０３５－２０５）を１００μｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。
５）プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルにＨＲＰ基質であるＴＭＢ（Ａ液とＢ液を等体積で混合、ＫＰＬ）を１００μｌ加え、１０－３０分間発色させてから、マイクロプレートリーダーでＯＤ６５０のシグナル値を読み取った。
図９に示すように、一部の抗ヒトＯＸ４０抗体は、リガンドの結合エピトープを競合する能力を持っている。
１）９６ウェル高吸着ＥＬＩＳＡプレート（ｎｕｎｃ）に１００μｌ ｈＯＸ４０－ＥＣ－Ｈｉｓ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ， ＣＫ６０）を２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、４度の冷蔵庫で一晩インキュベートした。
２）プレート内の液体を廃棄し、プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ ｗｉｔｈ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回洗浄し、２００μｌの１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで調製）を加え、室温で２時間ブロッキングした。
３）精製された抗ヒトＯＸ４０抗体、陰性対照抗体Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧ ｈｕｍａｎ ＯＸ４０－Ｌ－６Ｈｉｓ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＪ４５）を０．２μｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ＯＸ４０－Ｌ－ｍＦｃ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＷ２５）を含む溶液で２μｇ／ｍｌに希釈し（抗体とリガンドの比例は１０：１）、それぞれ１００μｌを取り、上記ブロックウェルに入れ（ＰＢＳで３回洗浄し、液体を廃棄）、室温で１時間インキュベートした。
４）プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルに検出抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ１ ＨＲＰ（１：５０００，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１１５－０３５－２０５）を１００μｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。
５）プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルにＨＲＰ基質であるＴＭＢ（Ａ液とＢ液を等体積で混合、ＫＰＬ）を１００μｌ加え、１０－３０分間発色させてから、マイクロプレートリーダーでＯＤ６５０のシグナル値を読み取った。
図９に示すように、一部の抗ヒトＯＸ４０抗体は、リガンドの結合エピトープを競合する能力を持っている。
【0068】
実施例１２、抗ヒトＯＸ４０抗体がｈＯＸ４０安定トランスフェクト２９３Ｔ細胞に結合する能力
１）ｈＯＸ４０安定トランスフェクト２９３Ｔ細胞は、ヒトＯＸ４０細胞外ドメインタンパク質を構成的に発現する。実験計画に従って、ウェルあたりの細胞数が１＊１０＾６になるように、１００μｌのｈＯＸ４０安定トランスフェクト２９３Ｔ細胞またはＯＸ４０を発現しない２９３Ｔ細胞（ＰＢＳで調製）を９６ウェルＵプレートに加え、４００ｇで５分間遠心分離させ、上清を捨てた。
２）抗体の希釈：抗ヒトＯＸ４０組換え抗体、Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）および抗マウスＯＸ４０抗体ＯＸ８６（ｈＩｇＧ１）をＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈した。
３）上記の各抗体をそれぞれ５０μｌ 吸引し、上記細胞を再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。
４）ＰＢＳで２回洗浄し、４００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。
５）フローサイトメトリーによる細胞結合の検出：抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ＰＥ（クローン：Ｍ１３１０Ｇ０５、１：２００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（０．５％のＦＢＳ、２ ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に細胞を再懸濁し、氷上で暗所で１５分間インキュベートし、それからＰＢＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＤＡＰＩ（０．５μｇ／ｍｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図７に示すように、抗ヒトＯＸ４０抗体は、安定トランスフェクト細胞のＯＸ４０に結合する能力を持っている。
１）ｈＯＸ４０安定トランスフェクト２９３Ｔ細胞は、ヒトＯＸ４０細胞外ドメインタンパク質を構成的に発現する。実験計画に従って、ウェルあたりの細胞数が１＊１０＾６になるように、１００μｌのｈＯＸ４０安定トランスフェクト２９３Ｔ細胞またはＯＸ４０を発現しない２９３Ｔ細胞（ＰＢＳで調製）を９６ウェルＵプレートに加え、４００ｇで５分間遠心分離させ、上清を捨てた。
２）抗体の希釈：抗ヒトＯＸ４０組換え抗体、Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）および抗マウスＯＸ４０抗体ＯＸ８６（ｈＩｇＧ１）をＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈した。
３）上記の各抗体をそれぞれ５０μｌ 吸引し、上記細胞を再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。
４）ＰＢＳで２回洗浄し、４００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。
５）フローサイトメトリーによる細胞結合の検出：抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ－ＰＥ（クローン：Ｍ１３１０Ｇ０５、１：２００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（０．５％のＦＢＳ、２ ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に細胞を再懸濁し、氷上で暗所で１５分間インキュベートし、それからＰＢＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＤＡＰＩ（０．５μｇ／ｍｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図７に示すように、抗ヒトＯＸ４０抗体は、安定トランスフェクト細胞のＯＸ４０に結合する能力を持っている。
【0069】
実施例１３、ＥＬＩＳＡ測定により抗ヒトＯＸ４０抗体がヒト、マウス、サルＯＸ４０－ＥＣたんぱく質に結合する能力の検出
１）９６ウェル高吸着ＥＬＩＳＡプレート（ｎｕｎｃ）にそれぞれ１００μｌのｈＯＸ４０－ＥＣ－Ｈｉｓ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＫ６０）、マウス（ｍｏｕｓｅ） ＯＸ４０－ＥＣ（ＣＫ５２）、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ） ＯＸ４０－ＥＣ（ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，９０８４６－Ｃ０８Ｈ）、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ） ＯＸ４０－ＥＣ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＢ１７）を２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、４度の冷蔵庫で一晩インキュベートした。
２）プレート内の液体を廃棄し、プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ ｗｉｔｈ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回洗浄し、２００μｌの１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで調製）を加え、室温で２時間ブロッキングした。
３）精製された抗ヒトＯＸ４０抗体および陰性対照抗体Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧを適切に希釈し（３．１６μｇ／ｍｌ）、それぞれ１００μｌを取り、上記ブロックウェルに入れ（ＰＢＳで３回洗浄し、液体を廃棄）、室温で１時間インキュベートした。
４）プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルに検出抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰ（１：５００００，Ｂｅｔｈｙｌ，Ａ８０－１０４ｐ）を１００μｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。
５）プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルにＨＲＰ基質であるＴＭＢ（Ａ液とＢ液を等体積で混合、ＫＰＬ）を１００μｌ加え、１０－３０分間発色させてから、マイクロプレートリーダーでＯＤ６５０のシグナル値を読み取った。
図８に示されるように、抗ヒトＯＸ４０組換え抗体は、ヒトおよびサルＯＸ４０タンパク質に特異的に結合する能力を有するが、一般にマウスＯＸ４０には結合しない。
１）９６ウェル高吸着ＥＬＩＳＡプレート（ｎｕｎｃ）にそれぞれ１００μｌのｈＯＸ４０－ＥＣ－Ｈｉｓ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＫ６０）、マウス（ｍｏｕｓｅ） ＯＸ４０－ＥＣ（ＣＫ５２）、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ） ＯＸ４０－ＥＣ（ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，９０８４６－Ｃ０８Ｈ）、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ） ＯＸ４０－ＥＣ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＢ１７）を２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、４度の冷蔵庫で一晩インキュベートした。
２）プレート内の液体を廃棄し、プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ ｗｉｔｈ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回洗浄し、２００μｌの１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで調製）を加え、室温で２時間ブロッキングした。
３）精製された抗ヒトＯＸ４０抗体および陰性対照抗体Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧを適切に希釈し（３．１６μｇ／ｍｌ）、それぞれ１００μｌを取り、上記ブロックウェルに入れ（ＰＢＳで３回洗浄し、液体を廃棄）、室温で１時間インキュベートした。
４）プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルに検出抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰ（１：５００００，Ｂｅｔｈｙｌ，Ａ８０－１０４ｐ）を１００μｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。
５）プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、液体を拭き取り、各ウェルにＨＲＰ基質であるＴＭＢ（Ａ液とＢ液を等体積で混合、ＫＰＬ）を１００μｌ加え、１０－３０分間発色させてから、マイクロプレートリーダーでＯＤ６５０のシグナル値を読み取った。
図８に示されるように、抗ヒトＯＸ４０組換え抗体は、ヒトおよびサルＯＸ４０タンパク質に特異的に結合する能力を有するが、一般にマウスＯＸ４０には結合しない。
【0070】
実施例１４、ＯＸ４０／ＮＦ－κＢレポーター細胞による抗ヒトＯＸ４０抗体のインビトロ活性の検出
１）ＯＸ４０／ＮＦ－κＢ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ－ＨＥＫ２９３は、ヒトＯＸ４０たんぱく質を構成的に発現し、活性化されるとＮＦ－κＢシグナル経路を活性化する一方、ＮＦ－κＢ応答要素はホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現を制御する。つまり、ホタルルシフェラーゼの活性を検出することによってＯＸ４０の活性化を間接的に指示することができる。実験計画に従って、各ウェルの細胞数が８＊１０＾５になるように、９０μｌのＯＸ４０／ＮＦ－κＢ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ－ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェル透明底白色細胞培養フラットボトムプレートに加え、３７℃のインキュベーターに入れ、一晩インキュベートした。
２）ｈｕｍａｎ ＦＣＧＲＴｇマウス脾臓白血球単細胞懸濁液の調製：無菌条件下でｈｕｍａｎ ＦＣＧＲＴｇマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で５ｍｌの赤血球溶解液ＡＣＫで５分間溶解し、９ｍｌのＰＢＳを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、４００ｇで５ｍｉｎ遠心し、脾臓細胞を２ｍｌの細胞培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋１％非必須アミノ酸＋１ ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）で再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。少量の単細胞懸濁液を取り、１：１００に希釈し、改良ノイバウエル計算盤で細胞を計数した。
３）抗体の希釈：細胞培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋１％非必須アミノ酸＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）で抗ヒトＯＸ４０抗体、Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびヒトＯＸ４０－Ｌ－ｍＦｃ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＷ２５）を０．１μｇ／ｍｌに希釈した。
４）５０μｌのＯＸ４０／ＮＦ－κＢ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ－ＨＥＫ２９３細胞上清を捨て、２０μｌのｈｕｍａｎ ＦＣＧＲＴｇマウス脾臓白血球単細胞懸濁液（２＊１０＾７／ｍｌ）および３０μｌの上記抗体溶液をウェルの壁に沿って加え、３７℃のインキュベーターで６時間インキュベートした。
５）１００μｌのＯｎｅ－ｓｔｅｐ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ６１２０）を各ウェルに加え、室温で３０分間振盪し、化学発光検出計で発光強度を検出した。
図１０に示すように、抗ヒトＯＸ４０抗体はインビトロ活性を持っている（ＯＸ４０／ＮＦ－κＢレポーター細胞系）。
１）ＯＸ４０／ＮＦ－κＢ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ－ＨＥＫ２９３は、ヒトＯＸ４０たんぱく質を構成的に発現し、活性化されるとＮＦ－κＢシグナル経路を活性化する一方、ＮＦ－κＢ応答要素はホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現を制御する。つまり、ホタルルシフェラーゼの活性を検出することによってＯＸ４０の活性化を間接的に指示することができる。実験計画に従って、各ウェルの細胞数が８＊１０＾５になるように、９０μｌのＯＸ４０／ＮＦ－κＢ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ－ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェル透明底白色細胞培養フラットボトムプレートに加え、３７℃のインキュベーターに入れ、一晩インキュベートした。
２）ｈｕｍａｎ ＦＣＧＲＴｇマウス脾臓白血球単細胞懸濁液の調製：無菌条件下でｈｕｍａｎ ＦＣＧＲＴｇマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で５ｍｌの赤血球溶解液ＡＣＫで５分間溶解し、９ｍｌのＰＢＳを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、４００ｇで５ｍｉｎ遠心し、脾臓細胞を２ｍｌの細胞培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋１％非必須アミノ酸＋１ ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）で再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。少量の単細胞懸濁液を取り、１：１００に希釈し、改良ノイバウエル計算盤で細胞を計数した。
３）抗体の希釈：細胞培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋１％非必須アミノ酸＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）で抗ヒトＯＸ４０抗体、Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびヒトＯＸ４０－Ｌ－ｍＦｃ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＷ２５）を０．１μｇ／ｍｌに希釈した。
４）５０μｌのＯＸ４０／ＮＦ－κＢ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ－ＨＥＫ２９３細胞上清を捨て、２０μｌのｈｕｍａｎ ＦＣＧＲＴｇマウス脾臓白血球単細胞懸濁液（２＊１０＾７／ｍｌ）および３０μｌの上記抗体溶液をウェルの壁に沿って加え、３７℃のインキュベーターで６時間インキュベートした。
５）１００μｌのＯｎｅ－ｓｔｅｐ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ６１２０）を各ウェルに加え、室温で３０分間振盪し、化学発光検出計で発光強度を検出した。
図１０に示すように、抗ヒトＯＸ４０抗体はインビトロ活性を持っている（ＯＸ４０／ＮＦ－κＢレポーター細胞系）。
【0071】
実施例１５、抗ヒトＯＸ４０抗体のインビトロ免疫活性化活性分析
１）ｈＦＣＧＲＴｇｈＯＸ４０Ｔｇマウス脾臓白血球単細胞懸濁液の調製：無菌条件下でｈＦＣＧＲＴｇｈＯＸ４０Ｔｇマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で５ｍｌの赤血球溶解液ＡＣＫで５分間溶解し、９ｍｌのＰＢＳを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、４００ｇで５ｍｉｎ遠心し、脾臓細胞を２ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。少量の単細胞懸濁液を取り、１：１００に希釈し、改良ノイバウエル計算盤で細胞を計数した。
２）ＣＦＳＥ標識脾臓細胞：実験の必要に応じて、一部の細胞を取り出し、細胞密度が（２－４）＊１０＾７／ｍｌ、体積が５ｍｌ未満になるようにＰＢＳで希釈し、ＣＦＳＥを加え、最終濃度を５μＭにした。混合後、３７℃のインキュベーターに入れ、１５分間インキュベートした。次いで、細胞を９ｍｌの５％ＦＢＳを含有する洗浄液で２回洗浄し、４００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。２ｍｌの初代細胞培養培地（ＲＰＭＩ ＋ １０％ ＦＢＳ ＋ １％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ ＋ １％ ＨＥＰＥＳ ＋ １％ピルビン酸ナトリウム ＋ ０．１％ ２Ｍｅ（最終濃度５０ｕＭ）＋ １％ Ｌ－グルタミン＋ １％非必須アミノ酸））を加えて細胞を再懸濁し、計数した。
３）対照（未処理、ＣＦＳＥのみ、ＣＤ３のみ、ＣＤ３＋ＣＤ２８）を除き、０．２μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３ｅ（クローン：１４５－２Ｃ１１，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））を含む初代細胞培養培地を使用して、上記のＣＦＳＥ標識細胞を再懸濁し細胞密度を２＊１０＾６／ｍｌにした。実験計画に従って、各ウェルの細胞数が２＊１０＾５になるように、１００μｌの上記細胞を９６ウェル細胞培養フラットボトムプレートに加えた。無処理群にはＣＦＳＥで標識していない細胞を加え、抗マウスＣＤ３などの抗体を加えなかった。ＣＦＳＥのみ群にＣＦＳＥ標識細胞を加え、抗マウスＣＤ３などの抗体を加えなかった。ＣＤ３群のみにＣＦＳＥ標識細胞と抗マウスＣＤ３を加え、他の抗体は加えなかった。ＣＤ３＋ＣＤ２８群にＣＦＳＥ標識細胞と抗マウスＣＤ３を加え、２μｇ／ｍｌの濃度の抗マウスＣＤ２８抗体（クローン３７．５１（ＲＵＯ），ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））も加えた（ステップ４で等体積希釈した後、抗マウスＣＤ３およびＣＤ２８の最終濃度はそれぞれ０．１μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌであった）。
４）異なる濃度の抗体を調製：初代培養培地で抗ヒトＯＸ４０抗体およびＣｔｒｌ ｈＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を最終濃度の２倍に希釈し、それぞれ１００μｌ取り、上記抗マウスＣＤ３抗体とＣＦＳＥ標識脾臓細胞を含むウェルプレートに加えた。対照群にそれぞれ１００μｌの培養液を加えた。
５）上記細胞を３７℃のインキュベーターで３日間培養した。
６）フローサイトメトリーによるＴ細胞増殖の検出：上記培養細胞をＵ底の９６ウェルプレートに移し、ＰＢＳで２回回洗浄し、５００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をＰＥ抗マウスＣＤ４（クローン：ＧＫ１．５，１：５００，ＢＤ）およびＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ（クローン：５３－６．７，１：５００，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ ＦＢＳ、２ ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に再懸濁し、氷上で暗所で１５分間インキュベートし、それからＰＢＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＤＡＰＩ（０．５μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標） Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２μｌ／サンプル）を含む２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図１１Ａ－Ｄに示すように、抗ヒトＯＸ４０抗体はインビトロ免疫活性化活性を持っている
実施例１６、抗ヒトＯＸ４０抗体のインビボ免疫活性化活性分析
ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖モデルを使用してで、抗ヒトＯＸ４０組換え抗体のインビボ免疫活性化活性を検出した。具体的な手順は、以下のとおりである。
１）ｄａｙ－１にｈＦＣＧＲＴｇｈＯＸ４０ＴｇマウスにＯＴ－ＩｈＯＸ４０Ｔｇマウス由来の脾臓細胞を尾静脈から注射した（いずれも１＊１０＾６／匹）。
２）ｄａｙ０に、５μｇ／匹のＤＥＣ－ＯＶＡタンパク質、一定用量の抗ヒトＯＸ４０抗体およびＣｔｒｌ ｈＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を腹腔内注射する方式により、ｈＦＣＧＲＴｇｈＯＸ４０Ｔｇマウスを免疫化した。各群の状況と抗体用量は以下の通りである：
群１：Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧ， ５０μｇ／匹 ｎ＝５
群２：ＰＮ１１６＊， ５０μｇ／匹 ｎ＝３
群３：ＰＮ１２１＊， ５０μｇ／匹 ｎ＝３
群４：ＰＮ１２５＊， ５０μｇ／匹 ｎ＝３
３）ｄａｙ６にマウスを犠牲にし、無菌条件下でマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で５ｍｌの赤血球溶解液ＡＣＫで５分間溶解し、９ｍｌのＰＢＳを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、４００ｇで５ｍｉｎ遠心し、脾臓細胞を２ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。
４）フローサイトメトリーによるＴ細胞増殖の検出：２００μｌの上記脾臓細胞をＵ底の９６ウェルプレートに移し、５００ｇでで５分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をＰＥ抗マウスＣＤ４（クローン：ＧＫ１．５，１：５００，ＢＤ）およびＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ（クローン：５３－６．７，１：５００，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ ＦＢＳ、２ ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に再懸濁し、氷上で暗所で１５分間インキュベートし、それからＰＢＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＤＡＰＩ（０．５μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標） Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２μｌ／サンプル）を含む２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図１２に示すように、抗ヒトＯＸ４０抗体はインビボ免疫活性化活性を持っている。
１）ｈＦＣＧＲＴｇｈＯＸ４０Ｔｇマウス脾臓白血球単細胞懸濁液の調製：無菌条件下でｈＦＣＧＲＴｇｈＯＸ４０Ｔｇマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で５ｍｌの赤血球溶解液ＡＣＫで５分間溶解し、９ｍｌのＰＢＳを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、４００ｇで５ｍｉｎ遠心し、脾臓細胞を２ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。少量の単細胞懸濁液を取り、１：１００に希釈し、改良ノイバウエル計算盤で細胞を計数した。
２）ＣＦＳＥ標識脾臓細胞：実験の必要に応じて、一部の細胞を取り出し、細胞密度が（２－４）＊１０＾７／ｍｌ、体積が５ｍｌ未満になるようにＰＢＳで希釈し、ＣＦＳＥを加え、最終濃度を５μＭにした。混合後、３７℃のインキュベーターに入れ、１５分間インキュベートした。次いで、細胞を９ｍｌの５％ＦＢＳを含有する洗浄液で２回洗浄し、４００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。２ｍｌの初代細胞培養培地（ＲＰＭＩ ＋ １０％ ＦＢＳ ＋ １％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ ＋ １％ ＨＥＰＥＳ ＋ １％ピルビン酸ナトリウム ＋ ０．１％ ２Ｍｅ（最終濃度５０ｕＭ）＋ １％ Ｌ－グルタミン＋ １％非必須アミノ酸））を加えて細胞を再懸濁し、計数した。
３）対照（未処理、ＣＦＳＥのみ、ＣＤ３のみ、ＣＤ３＋ＣＤ２８）を除き、０．２μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３ｅ（クローン：１４５－２Ｃ１１，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））を含む初代細胞培養培地を使用して、上記のＣＦＳＥ標識細胞を再懸濁し細胞密度を２＊１０＾６／ｍｌにした。実験計画に従って、各ウェルの細胞数が２＊１０＾５になるように、１００μｌの上記細胞を９６ウェル細胞培養フラットボトムプレートに加えた。無処理群にはＣＦＳＥで標識していない細胞を加え、抗マウスＣＤ３などの抗体を加えなかった。ＣＦＳＥのみ群にＣＦＳＥ標識細胞を加え、抗マウスＣＤ３などの抗体を加えなかった。ＣＤ３群のみにＣＦＳＥ標識細胞と抗マウスＣＤ３を加え、他の抗体は加えなかった。ＣＤ３＋ＣＤ２８群にＣＦＳＥ標識細胞と抗マウスＣＤ３を加え、２μｇ／ｍｌの濃度の抗マウスＣＤ２８抗体（クローン３７．５１（ＲＵＯ），ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））も加えた（ステップ４で等体積希釈した後、抗マウスＣＤ３およびＣＤ２８の最終濃度はそれぞれ０．１μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌであった）。
４）異なる濃度の抗体を調製：初代培養培地で抗ヒトＯＸ４０抗体およびＣｔｒｌ ｈＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を最終濃度の２倍に希釈し、それぞれ１００μｌ取り、上記抗マウスＣＤ３抗体とＣＦＳＥ標識脾臓細胞を含むウェルプレートに加えた。対照群にそれぞれ１００μｌの培養液を加えた。
５）上記細胞を３７℃のインキュベーターで３日間培養した。
６）フローサイトメトリーによるＴ細胞増殖の検出：上記培養細胞をＵ底の９６ウェルプレートに移し、ＰＢＳで２回回洗浄し、５００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をＰＥ抗マウスＣＤ４（クローン：ＧＫ１．５，１：５００，ＢＤ）およびＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ（クローン：５３－６．７，１：５００，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ ＦＢＳ、２ ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に再懸濁し、氷上で暗所で１５分間インキュベートし、それからＰＢＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＤＡＰＩ（０．５μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標） Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２μｌ／サンプル）を含む２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図１１Ａ－Ｄに示すように、抗ヒトＯＸ４０抗体はインビトロ免疫活性化活性を持っている
実施例１６、抗ヒトＯＸ４０抗体のインビボ免疫活性化活性分析
ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖モデルを使用してで、抗ヒトＯＸ４０組換え抗体のインビボ免疫活性化活性を検出した。具体的な手順は、以下のとおりである。
１）ｄａｙ－１にｈＦＣＧＲＴｇｈＯＸ４０ＴｇマウスにＯＴ－ＩｈＯＸ４０Ｔｇマウス由来の脾臓細胞を尾静脈から注射した（いずれも１＊１０＾６／匹）。
２）ｄａｙ０に、５μｇ／匹のＤＥＣ－ＯＶＡタンパク質、一定用量の抗ヒトＯＸ４０抗体およびＣｔｒｌ ｈＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を腹腔内注射する方式により、ｈＦＣＧＲＴｇｈＯＸ４０Ｔｇマウスを免疫化した。各群の状況と抗体用量は以下の通りである：
群１：Ｃｔｒｌ ｈＩｇＧ， ５０μｇ／匹 ｎ＝５
群２：ＰＮ１１６＊， ５０μｇ／匹 ｎ＝３
群３：ＰＮ１２１＊， ５０μｇ／匹 ｎ＝３
群４：ＰＮ１２５＊， ５０μｇ／匹 ｎ＝３
３）ｄａｙ６にマウスを犠牲にし、無菌条件下でマウスの脾臓を採取し、研磨してから氷上で５ｍｌの赤血球溶解液ＡＣＫで５分間溶解し、９ｍｌのＰＢＳを加え溶解を停止させ、脾臓細胞を洗浄し、４００ｇで５ｍｉｎ遠心し、脾臓細胞を２ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、脾臓単細胞懸濁液を得た。
４）フローサイトメトリーによるＴ細胞増殖の検出：２００μｌの上記脾臓細胞をＵ底の９６ウェルプレートに移し、５００ｇでで５分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をＰＥ抗マウスＣＤ４（クローン：ＧＫ１．５，１：５００，ＢＤ）およびＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ（クローン：５３－６．７，１：５００，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ ＦＢＳ、２ ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に再懸濁し、氷上で暗所で１５分間インキュベートし、それからＰＢＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、ＤＡＰＩ（０．５μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標） Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２μｌ／サンプル）を含む２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターによって分析した。
図１２に示すように、抗ヒトＯＸ４０抗体はインビボ免疫活性化活性を持っている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】