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特表2023-539910免疫チェックポイント阻害剤の増強剤の調製における細菌の使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-20

(54)【発明の名称】免疫チェックポイント阻害剤の増強剤の調製における細菌の使用

(51)【国際特許分類】

A61K 35/741 20150101AFI20230912BHJP

A61K 45/00 20060101ALI20230912BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20230912BHJP

A61P 37/04 20060101ALI20230912BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20230912BHJP

A61P 13/02 20060101ALI20230912BHJP

A61P 13/10 20060101ALI20230912BHJP

A61P 15/00 20060101ALI20230912BHJP

A61P 1/18 20060101ALI20230912BHJP

A61P 1/16 20060101ALI20230912BHJP

A61P 1/04 20060101ALI20230912BHJP

A61P 35/02 20060101ALI20230912BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20230912BHJP

A61P 1/02 20060101ALI20230912BHJP

A61P 11/02 20060101ALI20230912BHJP

A61P 11/04 20060101ALI20230912BHJP

A61P 13/12 20060101ALI20230912BHJP

A61P 11/00 20060101ALI20230912BHJP

A61P 13/08 20060101ALI20230912BHJP

A61P 21/00 20060101ALI20230912BHJP

A61P 17/00 20060101ALI20230912BHJP

A61P 35/04 20060101ALI20230912BHJP

A61P 27/02 20060101ALI20230912BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20230912BHJP

C12N 1/20 20060101ALI20230912BHJP

C07K 16/28 20060101ALI20230912BHJP

【ＦＩ】

A61K35/741

A61K45/00

A61P35/00

A61P37/04

A61P43/00 121

A61P43/00 105

A61P13/02

A61P13/10

A61P15/00

A61P1/18

A61P1/16

A61P1/04

A61P35/02

A61P25/00

A61P1/02

A61P11/02

A61P11/04

A61P13/12

A61P11/00

A61P13/08

A61P21/00

A61P17/00

A61P35/04

A61P27/02

A61K39/395 U

C12N1/20 E ZNA

C07K16/28

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023514909

(86)(22)【出願日】2022-07-12

(85)【翻訳文提出日】2023-03-03

(86)【国際出願番号】 CN2022105302

(87)【国際公開番号】W WO2023284758

(87)【国際公開日】2023-01-19

(31)【優先権主張番号】202110808366.1

(32)【優先日】2021-07-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202110939699.8

(32)【優先日】2021-08-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202210143529.3

(32)【優先日】2022-02-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522160686

【氏名又は名称】中山大学腫瘤防治中心（中山大学附属腫瘤医院、中山大学腫瘤研究所）

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子修平

(72)【発明者】

【氏名】徐瑞華

(72)【発明者】

【氏名】趙霞

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065CA44

4C084AA19

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZA021

4C084ZA331

4C084ZA341

4C084ZA591

4C084ZA661

4C084ZA671

4C084ZA751

4C084ZA811

4C084ZA891

4C084ZA941

4C084ZB091

4C084ZB211

4C084ZB261

4C084ZB271

4C084ZC751

4C085AA14

4C085CC23

4C085EE03

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC31

4C087CA08

4C087CA09

4C087CA10

4C087MA02

4C087MA52

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZA02

4C087ZA33

4C087ZA34

4C087ZA59

4C087ZA66

4C087ZA67

4C087ZA75

4C087ZA81

4C087ZA89

4C087ZA94

4C087ZB21

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC75

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は免疫チェックポイント阻害剤の増強剤の調製における細菌の使用を開示する。前記細菌は、細菌生菌又は不活性全細胞腸内細菌であり、本発明は、ヒト内因性腸内細菌であるアリスティペス菌を用いた単菌経口製剤を免疫チェックポイント阻害剤と併用することで、活性ヒト共生腸内細菌又は不活性全細胞ヒト共生腸内細菌の経口投与刺激による抗腫瘍免疫保護反応及び腸内細菌叢の再構築作用を利用して、免疫チェックポイント阻害剤の複数の腫瘍に対する薬効を著しく増強させ、抗腫瘍免疫機能を増強させ、癌免疫療法を受けている人の応答率を向上させるのに役立ち、また、安全性がより優れ、癌患者の総生存期間を延長し、癌免疫治療（免疫治療用チェックポイント阻害剤）が適用できる腫瘍患者の範囲を広げ、免疫チェックポイント阻害剤の難治性腫瘍患者の治療に新たな併用療法プラン及び治療薬を提供し、癌免疫治療が適用できる腫瘍患者の範囲を広げる。
【選択図】図１３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１種又は２種以上の免疫チェックポイント阻害剤と細菌とを含む腫瘍治療用製品であって、
前記免疫チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞抑制性共刺激（共阻害）分子及び／又はそれぞれのリガンドに作用するブロッカーの１種又は２種以上の組み合わせであり、
前記細菌は、アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）であり、
前記細菌は、細菌生菌、不活性全細胞細菌、細菌誘導体又は細菌代謝物の１種又は２種以上である、ことを特徴とする腫瘍治療用製品。

【請求項2】

前記アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）の１６ＳｒＤＮＡ配列が、アリスティペス・ファインゴールディイ菌株ＤＳＭ１７２４２（ＡｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉＤＳＭ１７２４２）の１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも９９．５％の相同性を有する、ことを特徴とする請求項１に記載の製品。

【請求項3】

前記アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）は、１種又は２種以上のアリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）菌株の組み合わせである、ことを特徴とする請求項１に記載の製品。

【請求項4】

前記アリスティペス・ファインゴールディイ菌株は、以下の菌株の１種又は２種以上の組み合わせである、ことを特徴とする請求項３に記載の製品。
ドイツ微生物菌種寄託センターＤＳＭＺに寄託されている、寄託番号ＤＳＭ１７２４２のアリスティペス・ファインゴールディイ、
日本ＪＣＭ種菌寄託センターに寄託されている、寄託番号ＪＣＭ１６７７０のアリスティペス・ファインゴールディイ、
韓国ＫＣＴＣ種菌寄託センターに寄託されている、寄託番号ＫＣＴＣ１５２３６のアリスティペス・ファインゴールディイ、
フィンランドヘルシンキ嫌気性菌参考実験室に寄託されている、寄託番号ＡＨＮ２４３７のアリスティペス・ファインゴールディイ、
スウェーデンＣＣＵＧ菌種寄託センターに寄託されている、寄託番号ＣＣＵＧ４６０２０のアリスティペス・ファインゴールディイ、
フランスＣＩＰ種菌寄託センターに寄託されている、寄託番号ＣＩＰ１０７９９９のアリスティペス・ファインゴールディイ、
中国広東省微生物菌種寄託センターに寄託されている、寄託番号ＧＤＭＣＣ１．２３２４のアリスティペス・ファインゴールディイ

【請求項5】

前記細菌生菌は完全細菌及び／又は完全活性菌であり、前記不活性細菌は、不活性全細胞細菌である、ことを特徴とする請求項１に記載の製品。

【請求項6】

前記不活性全細胞細菌は、細菌を培養して増幅した後、種々の方法で不活性化することにより得られる、ことを特徴とする請求項１に記載の製品。

【請求項7】

前記細菌の不活化手段は、高温及び／又は高圧不活化、紫外線不活化、放射線不活化、及び化学剤不活化から選ばれるいずれか１種又は２種以上であり、前記化学剤は、ホルムアルデヒド、アセトン、及びフェノール類のいずれか１種又は２種以上である、ことを特徴とする請求項６に記載の製品。

【請求項8】

前記細菌誘導体は、細菌構成成分と遺伝物質及び関連成分とを含み、細菌細胞膜、菌毛、鞭毛、ＬＰＳ、核酸物質などの細菌由来成分の１種又は２種以上を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の製品。

【請求項9】

前記細菌代謝物は、前記細菌の調製及び貯蔵の間、ならびに哺乳動物の消化管輸送の間に、細菌の成長、生存、滞留、輸送又は存在の結果として、前記細菌によって生産又は修飾された全ての分子を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の製品。

【請求項10】

前記Ｔ細胞抑制性共刺激（共阻害）分子及び／又はそれぞれのリガンドは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ａ２ＡＲ、ＩＤＯ、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＤ４０、ＫＩＲ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＧＡＲＰ、ＰＳ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＴＤＯ、ＴＮＦＲ、ＤｃＲ３から選ばれる１種又は２種以上の組み合わせである、ことを特徴とする請求項１に記載の製品。

【請求項11】

前記Ｔ細胞抑制性共刺激（共阻害）分子のリガンドに作用するブロッカーは、ニボルマブ、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、アゼトリズマブ、アテゾリズマブ、カムレリズマブ、チスレリズマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、スパルタリズマブ、アベルマブ、シンチリマブ、トリパリマブ、セミプリマブ、ＭＧＡ０１２、ＭＧＤ０１３、ＭＧＤ０１９、エノブリツズマブ、ＭＧＤ００９、ＭＧＣ０１８、ＭＥＤＩ０６８０、ＰＤＲ００１、ＦＡＺ０５３、ＰＤＲ００１ＦＡＺ０５３、ＴＳＲ０２２、ＭＢＧ４５３、レラトリマブ（ｒｅｌａｔｌｉｍａｂ）、ＬＡＧ５２５、ＩＭＰ３２１、ＲＥＧＮ３７６７、ペキシダルチニブ、ＬＹ３０２２８５５、ＦＰＡ００８、ＢＬＺ９４５、ＧＤＣ０９１９、エパカドスタット、ｉｎｄｏｘｉｍｉｄ、ＢＭＳ９８６２０５、ＣＰＩ－４４４、ＭＥＤＩ９４４７、ＰＢＦ５０９、リリルマブから選ばれる１種又はこれらの任意の２種以上の組み合わせである、ことを特徴とする請求項１０に記載の製品。

【請求項12】

前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル経路及び／又はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２シグナル経路に作用する阻害剤であり、前記ＰＤ－１は、プログラムされた細胞死タンパク質１を意味し、前記ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１又はＣＤ２７４）及び前記ＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ又はＣＤ２７３）は、前記ＰＤ－１のリガンドである、ことを特徴とする請求項１に記載の製品。

【請求項13】

前記ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル経路及び／又はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２シグナル経路の阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アゼトリズマブ、アテゾリズマブ、カムレリズマブ、チスレリズマブ、デュルバルマブ、スパルタリズマブ、アベルマブ、シンチリマブ、トリパリマブ、セミプリマブ、ＭＧＡ０１２、ＭＧＤ０１３、ＭＧＤ０１９（ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重抗体）、ＭＥＤＩ０６８０、ＰＤＲ００１、ＦＡＺ０５３から選ばれる１種又はこれらの任意の２種以上の組み合わせである、ことを特徴とする請求項１２に記載の製品。

【請求項14】

前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４／Ｂ７－１シグナル経路及び／又はＣＴＬＡ－４／Ｂ７－２シグナル経路に作用する阻害剤であり、前記ＣＴＬＡ－４は細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４を意味し、Ｂ７－１（ＣＤ８０）及びＢ７－２（ＣＤ８６）は前記ＣＴＬＡ－４のリガンドである、ことを特徴とする請求項１に記載の製品。

【請求項15】

前記免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びＭＧＤ０１９から選ばれる１種又はこれらの任意の２種以上の組み合わせである、ことを特徴とする請求項１３に記載の製品。

【請求項16】

請求項１に記載の製品中の免疫チェックポイント阻害剤と細菌とを同時に、別個に、又は順次投与し、
前記免疫チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞抑制性共刺激（共阻害）分子及び／又はそれぞれのリガンドに作用するブロッカーの１種又は２種以上の組み合わせであり、
前記細菌は、アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）である、ことを特徴とする細菌を用いた腫瘍治療方法。

【請求項17】

前記腫瘍治療は、腫瘍の縮小又は安定化、総生存期間の延長、無増悪生存期間の延長、又は生活の質の改善から選ばれる１種又は２種以上の組み合わせとして示される、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記腫瘍は、腺腫、悪性腫瘍及び腺癌であり、腫瘍は、組織由来や細胞名によって分類されると、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、乳癌、膵臓癌、子宮頸癌、胆管癌、結腸癌、結腸直腸癌、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、多形性膠芽腫、神経膠腫、頭頸部癌、腎嫌色細胞癌、混合腎癌、腎臓癌、白血病、リンパ腫、脳癌、肝臓癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、中皮癌、卵巣癌、膵臓癌、クロム親和性細胞腫、副神経節癌、前立腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃癌、食道癌、精巣癌、甲状腺癌、胸腺癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、ぶどう膜黒色腫、及び軟部肉腫の１種又は２種以上である、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記腫瘍は悪性腫瘍、転移性腫瘍又は非転移性腫瘍である、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。

【請求項20】

前記細菌の投与方法は経口投与である、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腫瘍治療の技術分野に関し、具体的には、腫瘍治療における細菌の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

悪性腫瘍は、現在世界が直面する最大の問題の１つであり、毎年死亡を引き起こす各種致死要素の中で、悪性腫瘍は首位を占めている。手術治療、放射線治療及び化学治療などの通常の治療法は腫瘍細胞を完全に除去することが難しく、再発率が高く、しかも放射線治療や化学治療などの治療手段は、標的性が低いため、腫瘍細胞を殺すと同時に正常な細胞に対しても殺傷作用があり、患者に大きな傷害をもたらし、患者の生活の質に深刻な影響を与える。

【0003】

通常の治療法に比べて、腫瘍免疫療法の標的は腫瘍細胞や組織ではなく、人体自身の免疫系であり、人体免疫系の調節と活性化を通じて、自己免疫機能により、遠隔部位に転移している腫瘍細胞を含め腫瘍細胞を除去し、正常細胞に対する毒性や副作用が小さく、末期悪性腫瘍患者の予後と生活の質を大幅に改善する。免疫増強剤は新しい薬物分類であり、免疫調節剤とも呼ばれ、かつて免疫促進剤や免疫刺激剤と呼ばれていた。免疫増強剤の多くは腫瘍の非特異的免疫療法を目的として開発されており、生体の免疫機能を向上させ、免疫応答反応を促進誘導することで治療効果を発揮する。臨床では主に免疫不全疾患、悪性腫瘍の補助治療、及び難治性細菌やウイルスの感染に使用されている。臨床でよく使われる免疫増強剤薬物はその由来によって５つの種類に分けられる。
１、ＢＣＧワクチンのような細菌由来の免疫増強剤薬物
２、ヒト又は動物の免疫系の産物、例えば、サイモシン、転移因子、インターフェロン、インターロイキンなど
３、化学合成免疫増強剤薬物、例えばレバミゾール、ポリイノシン－シチジンなど
４、真菌多糖類、例えばシイタケ多糖類など
５、漢方薬及びその他、例えばニンジン、オウギなどの漢方薬の有効成分；植物ヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ及び胎盤多糖など。

【0004】

細菌由来の免疫増強剤の癌治療における使用の歴史は古く、早く１８９３年に、癌免疫治療分野の先駆者ＷｉｌｌｉａｍＣｏｌｅｙは化膿性レンサ球菌から調製した「Ｃｏｌｅｙの毒素」を末期癌患者に繰り返して接種し、発熱や生体の免疫反応を刺激することで、一部の患者の腫瘍を退縮させた。「Ｃｏｌｅｙの毒素」は癌免疫治療の投石となり、現代の癌免疫療法の勃興を促進した。過去１０年間に、癌免疫療法は今までない発展及び成功を遂げて多種の悪性腫瘍の臨床管理を徹底的に変えた。中でも、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ：Ｉｍｍｕｎｅ－ＣｈｅｃｋｐｏｉｎｔＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）は免疫療法の最先端技術の１つである。

【0005】

現在、腫瘍免疫療法は多種多様であり、その中でも、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ：ｉｍｍｕｎｅｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）療法は腫瘍細胞にハイジャックされた免疫抑制経路（例えばＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１とＣＴＬＡ－４／Ｂ７－１）を遮断することによって、Ｔ細胞を再活性化し、生体の免疫系の腫瘍細胞に対する識別と除去能力を再活性化するものであり、治療効果が良く、反応の持続時間が長いような優位性を持ち、腫瘍治療の新時代を切り開いた。ＩＣＩ療法は治療の選択が不足している多種のタイプの腫瘍への適用において癌治療の変革を引き起こし、癌治療の新しいマイルストーンとなっている。

【0006】

現在、ＩＣＩ治療を受けた患者は治療中断後にも長期的に寛解することができ、ある患者にとっては治癒の希望を増加した。特にメラノーマ患者では、完全寛解、すなわち全ての可視腫瘍転移巣が完全に消失することが可能である。しかし、ＩＣＩ単剤では患者の応答率が低いという問題はその発展や使用の最大のボトルネックになり、単剤ＩＣＩ治療でも完全寛解を実現する患者は１５％～４０％しか占めておらず、免疫チェックポイント阻害剤の効能を向上させる併用策略を早急に開発する必要がある。

【0007】

現在主流の併用策略は手術、化学療法、放射線治療、標的治療などの治療手段とＩＣＩとの併用療法を含み、相乗作用を発揮させ、ＩＣＩの持続性及び治療効果を増強させ、ＩＣＩの応答率が低いという問題を解決することができる。これらの併用療法はある程度でＩＣＩの治療効果及び応答率を高めることができるが、通常毒性もそれに伴って増加する。

【0008】

研究により、患者のＩＣＩ治療に対する応答率の特異性や薬剤耐性の関連要素は腫瘍の内部要素、例えば腫瘍の微小環境に加えて、宿主の関連要素、例えば年齢、遺伝の多様性、飲食及び腸内細菌叢などの要素を含むことを発見した。ある特定の腸内細菌が、定植や、自身の全細胞構成成分と腸粘膜免疫系の直接作用、若しくはその代謝機能を通じて小分子代謝物を産生する間接作用を介してＩＣＩの治療効果に与える影響が最も注目されている。そのため、多くの併用療法の中で、内因性腸内微生物を操作することでＩＣＩ治療を補助する多くの研究は腫瘍治療分野におけるマイルストーンイベントとなった。腸は体内最大のリンパ器官で、７０％以上のＴ細胞が存在し、ほとんどのメモリーＴ細胞の居住地となっている。腸内に宿る腸内細菌叢は、腸内免疫器官との相互作用により人体の免疫系の発達を促進し、人体の免疫力の基礎を築いてそのバランスを確立する。人体の防御系及び免疫系にとって、細菌と腫瘍のいずれも「異種」であるため、人体は細菌と腫瘍に対する免疫反応に同じ防御メカニズムを使用しており、腸内因性細菌で刺激される免疫反応は抗腫瘍の潜在能力も持っている。このような腸内細菌叢の抗腫瘍免疫交差理論及びある腸内細菌自身が分泌した腫瘍溶解酵素に基づいて、細菌による腫瘍治療はすでに数百年の歴史がある。なお、腸管内因性細菌により誘導される抗腫瘍効果は、生体自己の免疫反応に由来し、放射線療法と化学療法との併用療法に比較して、安全性が高く、毒性や副作用が少ない。

【0009】

２０２１年８月にＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖｅｒｙ雑誌に掲載された概要は、２０１７年から２０２０年までに発表された３８件の研究をまとめたもので、ＩＣＩ治療を受けた１１,９５９人の腫瘍患者を分析したところ、免疫療法を受ける前又は治療中に抗生物質を使用することで、患者の生存率が著しく低下し（死亡リスク比率値ＨＲ＝１．８１、ｐ＝０．０３）、腸内細菌が生体から誘導する免疫応答はＩＣＩ療法の治療効果に対して重要な効果があることが示された(Derosa, Routy et al. 2021)。中国の国内外の複数の臨床研究では、糞便菌移植、純粋菌株やプレバイオティクスの経口投与など、腸内細菌叢を操作する手段とＩＣＩ療法とを併用することにより、腫瘍患者のＩＣＩに対する薬剤耐性を逆転できることが示されており、これは、腸内細菌叢介入に基づく局所治療が腸内免疫力をサポートし、有効な抗腫瘍免疫監視を刺激し、永続的な遠位抗腫瘍免疫をトリガーすることを示している。最近の２つの臨床研究の報告によると、ＩＣＩ治療を受けて応答した（一部寛解又は完全寛解）患者への糞便菌移植はＩＣＩに対して応答のない難治性転移性黒色腫患者を一部寛解又は完全寛解させることができ、しかも毒性や副作用がなく、内因性腸内微生物のＩＣＩ療法に対する効果増強作用を証明した(Baruch EN 2020, Zipkin 2021)。しかし、糞便菌移植は、成分が複雑であり、糞便菌移植で効果を発揮するのは腸内微生物全体であり、しかも、腸内細菌叢は環境、食事、生活様式などの影響を大きく受け、持続的で安定したドナー糞便菌が得られないことによって、糞便菌移植・ＩＣＩ併用免疫療法の臨床応用が制限されている。そのため、標準化定量生産が可能な単一成分の抗腫瘍腸内細菌を同定して調製することはこの問題を解決する鍵となる。最新の研究では、研究者はＩＣＩ治療を受けた腸癌マウスモデルから、ビフィドバクテリウム・シュードロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ユーラシア・スペシーズ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａｓｐｅｃｉｅｓ）の３種類の細菌を分離した。この３種類の特殊な細菌はそれぞれ免疫チェックポイント阻害剤を併用することで、４種類のマウス癌モデルにおいてＩＣＩの治療効果を増強させることができる。さらに研究を進めると、ビフィドバクテリウム・シュードロングムがその代謝産物であるイノシンを介してＩＣＩ増強効果を発揮することがわかった(Mager LF 2020)。

【0010】

生物と化学から材料科学、工学、コンピュータ科学などの分野への融合に伴い、新しい腸内細菌叢由来の免疫増強剤の研究開発に新たな手段を提供する。腸内細菌由来の免疫増強剤と免疫チェックポイント阻害剤との強力な組み合わせは、次世代腫瘍免疫治療の突破口として期待することができ、難治性腫瘍患者の免疫治療のための代替治療法を提供する。

【0011】

アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）はバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の１つの属であり、グラム陰性、偏性嫌気性であって、腸内共生細菌である。既存の研究によれば、アリスティペスは臨床サンプルから分離された新しい細菌属であり、アリスティペスの種組成は多様かつ複雑であり、異なるアリスティペス種は独自の機能特性を持ち、人体に対して健康促進や病原性を発揮する(Parker, Wearsch et al. 2020)。ＮＣＢＩ分類データベース(The NCBI taxonomy database)によると、これまでに同定・命名されたアリスティペスは、アリスティペス・コミュニス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｃｏｍｍｕｎｉｓ）、アリスティペス・ディスパー（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｄｉｓｐａｒ）、アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）、アリスティペス・イヒュミー（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｉｈｕｍｉｉ）、アリスティペス・インディスティンクタス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｉｎｄｉｓｔｉｎｃｔｕｓ）、アリスティペス・イノプス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｉｎｏｐｓ）、アリスティペス・マシリエンシス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、アリスティペス・メガグティ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｍｅｇａｇｕｔｉ）、アリスティペス・オカヤスエンシス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｏｋａｙａｓｕｅｎｓｉｓ）、アリスティペス・オンダードンキ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ）、アリスティペス・プロヴァンセンシス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｐｒｏｖｅｎｃｅｎｓｉｓ）、アリスティペス・ピュトレディニス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ）、アリスティペス・プトレディーニ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ）、アリスティペス・シャヒイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｓｈａｈｉｉ）、アリスティペス・ティモネンシス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ）の１５個の種からなる。このほか、マクロゲノムシーケンシングデータによって命名されていないか予測されている約９０種のアリスティペス種も含まれている。典型菌株データベース（ＴｙｐｅＳｔｒａｉｎＧｅｎｏｍｅ）によると、寄託番号を持つ培養可能なアリスティペス種の典型菌株は１４株である。現在、動物実験で免疫治療増強機能を持つ可能性が示唆されているアリスティペス種は、アリスティペス・シャヒイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｓｈａｈｉｉ）とアリスティペス・インディスティンクタス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｉｎｄｉｓｔｉｎｃｔｕｓ）の２種のみである(Iida N 2013, Routy B 2018)。他のアリスティペス種、又はアリスティペス種の組み合わせが腸内細菌由来の免疫チェックポイント阻害剤の増強剤として利用可能であるか否かを検討する必要がある。

【0012】

生態学的観点から、アリスティペスの各種は主に健常者の腸に存在し、人体の腸内免疫状態の健康維持に重要な役割を果たしている。例えば、アリスティペスの減少は短鎖脂肪酸の減少を促進し、非アルコール性脂肪肝症患者の末期線維化を増悪する恐れがある。しかし、アリスティペスの各種は、人体の他の液体からも分離され、例えば、アリスティペス・オンダードンキ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ）とアリスティペス・シャヒイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｓｈａｈｉｉ）はそれぞれ人体の腹部膿瘍、虫垂組織や尿から分離され、これは、アリスティペスの個々の種の潜在的な日和見病原性を示している。

【0013】

先行特許出願ＣＮ１１０５８２２９１Ａに基づく実施例では、補償性抗癌プロバイオティクスとして、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｍｕｎｉｃｉｐｈｉｌａ）、エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｈｉｒａｅ）１３１４４、アリスティペス・インディスティンクタス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｉｎｄｉｓｔｉｎｃｔｕｓ）及びアッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｍｕｎｉｃｉｐｈｉｌａ）＋エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｈｉｒａｅ）１３１４４の組み合わせなど、様々な単菌及び菌種の組み合わせを用いて、マウスＭＣＡ２０５マウス線維肉腫モデルにおける免疫チェックポイント阻害剤耐性を逆転させる腫瘍応答の効果を比較した。その結果、選択された単菌又は菌種の組み合わせはいずれも、ＦＭＴを行わず、又はＦＭＴ（免疫チェックポイント阻害剤治療で応答しない患者の糞便に由来）による自発的腸内細菌叢再構築を行った抗生物質処理後のマウスの最終的な腫瘍サイズを著しく低下させることができ、そのうち、最適応答群はアッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｍｕｎｉｃｉｐｈｉｌａ）＋エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｈｉｒａｅ）１３１４４強制経口投与であった。効果的な抗癌プロバイオティクスの組み合わせの活性の最適な代替マーカーの１つは循環血液（又は脾臓）ＣＤ４⁺又はＣＤ８⁺Ｔ細胞上でのＰＤ－Ｌ１発現のアップレギュレーション、又は循環Ｔ細胞上でのＣＣＲ９のアップレギュレーションである。単剤ＰＤ１群と比較すると、ＰＤ１とアッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｍｕｎｉｃｉｐｈｉｌａ）＋エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｈｉｒａｅ）１３１４４との併用では、脾臓組織ＣＤ８⁺ＰＤＬ１⁺及びＣＤ４⁺ＰＤＬ１⁺免疫細胞が有意に増加し、一方、ＰＤ１とアリスティペス・インディスティンクタス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｉｎｄｉｓｔｉｎｃｔｕｓ）を併用した群では、脾臓組織ＣＤ８⁺ＰＤＬ１⁺及びＣＤ４⁺ＰＤＬ１⁺免疫細胞の有意な増加は認められなかった。ＣＮ１１０５８２２９１Ａでは、異なる補償性抗癌プロバイオティクスの組み合わせをさらに比較し、各組み合わせがマウスＭＣＡ２０５マウス線維肉腫モデルにおける免疫チェックポイント阻害剤耐性を逆転させる腫瘍応答に対する効果を比較し、これらは、２種類のアリスティペス種（アリスティペス・オンダードンキ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ）＋アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ））の組み合わせを含む。その結果、組み合わせが多ければ多いほど治療効果が高いわけではなく、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｍｕｎｉｃｉｐｈｉｌａ）＋エンテロコッカス・リモサム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｌｉｍｏｓｕｍ）の組み合わせが最適応答であったが、アリスティペス・オンダードンキ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ）＋アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）の組み合わせは単剤ＰＤ１抗体の治療効果を向上させる作用を示さなかった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明に係るアリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）は、優先権に基づく先行出願ＣＮ２０２１１０８０８３６６１及びＣＮ２０２１１０９３９６９９８ではＡｆと略され、優先権に基づく先行出願ＣＮ２０２２１０１４３５２９３ではＲＸ－ａｆ０１と略され、本出願では、Ａｆと略されている。

【0015】

本発明の目的は、免疫チェックポイント阻害剤の増強剤の調製における細菌の使用を提供することである。

【0016】

本発明は、１種又は２種以上の腫瘍に適用できる免疫チェックポイント阻害剤の治療効果を増強させる併用療法を提供する。

【0017】

本発明の前記免疫チェックポイント阻害剤の治療効果を増強させる増強剤は、細菌、好ましくは、アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｆ：Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）であり、前記Ａｆは、アリスティペス・ファインゴールディイの細菌生菌、不活性全細胞細菌、細菌誘導体又は細菌代謝物から選ばれる１種又は２種以上である。

【0018】

本発明の前記癌免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤療法から選ばれ、前記免疫療法の増強は、癌患者の総生存期間の延長、癌免疫療患者の応答率の向上、又は癌免疫療法が適用できる腫瘍患者の範囲拡大を示す。

【0019】

本発明で開示された実験データでは、免疫チェックポイント阻害抗ＰＤ１抗体（αＰＤ－１）と化学療法を併用した療法で応答した癌患者及び応答しない癌患者の治療後の腸内細菌叢を比較すると、応答性患者では、アリスティペス属は非応答性患者よりも有意に高く、このような差は化学療法単独群では存在しないことが示されている。αＰＤ－１併用化学療法を受けた結腸直腸癌患者（ＣＲＣ）の腸管では、アリスティペス属陽性患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）はアリスティペス陰性患者より有意に長い。αＰＤ－１併用化学療法を受けた食道癌（ＥＳＣＣ）患者の腸管では、アリスティペス属の相対存在量が高い患者の総生存期間（ＯＳ）はアリスティペス属の相対存在量の低い患者より有意に長い。検出された５種類のアリスティペス菌種のうち、ＰＦＳが６ケ月より大きいＥＳＣＣ患者及びＣＲＣ患者では、αＰＤ－１併用化学療法を受けた後、腸内アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）の相対存在量はＰＦＳが６ケ月より小さい患者より明らかに高い。

【0020】

本発明者らは、複数の腫瘍モデルにおいて、アリスティペス・シャヒイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｓｈａｈｉｉ）単独又はアリスティペス・シャヒイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｓｈａｈｉｉ）＋アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）の組み合わせを投与することで、免疫チェックポイント阻害剤を増強させる効果が得られないことを見出した。一方、活性アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）単独又は不活化全細胞アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）と免疫チェックポイント阻害剤を併用したものを投与したところ、アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）又はその不活性細菌体成分が、癌治療における免疫チェックポイント阻害剤の増強剤として作用し、生体の腫瘍殺傷免疫機能を増強させることが示された。

【0021】

本発明は、毒性や副作用が大きく、転移・再発しやすく、持続時間が短く、生存期間が短く、生活の質が悪いという従来の治療法の欠点に対して、明らかな改善があり、作用する腫瘍の範囲が限られ、薬物に応答する患者が少ないという免疫チェックポイント抑制剤単剤による治療法の欠点に対して、明らかな改善があり、毒性や副作用が大きく、薬物に応答する患者が少ないという免疫チェックポイント抑制剤と放射線化学療法を併用した治療法の欠点に対して、明らかな改善があった治療法を提供する。

【0022】

本発明で提供される治療法は、手術不能であり、使用可能な標的薬剤がなく、放射線療法、化学療法などが無効である患者；免疫チェックポイント阻害剤単剤が無効であるか、薬剤耐性（原発性、適応性及び獲得性薬剤耐性）を有する患者；免疫チェックポイント阻害剤と放射線療法、化学療法、標的療法との併用では、効果がないか、又は薬剤耐性（原発性、適応性及び獲得性薬剤耐性）を有する患者に対して、優れた治療効果を有する。

【課題を解決するための手段】

【0023】

本発明は、以下の態様によって上記の目的を達成する。
腫瘍の治療における細菌の使用。

【0024】

好ましくは、前記細菌は、細菌生菌、不活性細菌、細菌誘導体及び細菌代謝産物の１種又は２種以上である。

【0025】

好ましくは、前記不活性細菌は、不活性全細胞細菌である。

【0026】

好ましくは、前記細菌生菌は、完全細菌及び／又は完全活性菌である。

【0027】

好ましくは、前記使用は、免疫チェックポイント阻害剤の増強剤の調製における有効成分としての細菌の使用である。

【0028】

好ましくは、前記使用は、免疫チェックポイント阻害剤の増加剤としての使用であり、腫瘍の治療における免疫チェックポイント阻害剤の効果を向上させる。

【0029】

好ましくは、前記細菌は、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）に属し、すなわち、前記細菌菌株の１６ＳｒＤＮＡ配列は、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）の１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の相同性を有する。

【0030】

好ましくは、前記アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）に属する細菌は、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）に属する１種又は２種以上の細菌の菌種又は菌株の組み合わせである。

【0031】

より好ましくは、前記アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）に属する細菌はアリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）である。

【0032】

さらに好ましくは、前記アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）に含まれる１６ＳｒＤＮＡ配列は、アリスティペス・ファインゴールディイ菌種（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）の１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも９９％の相同性を有する。

【0033】

さらに好ましくは、前記アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）に含まれる１６ＳｒＤＮＡ配列は、アリスティペス・ファインゴールディイ菌株ＤＳＭ１７２４２（ＡｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉＤＳＭ１７２４２）の１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも９９．５％又は１００％の相同性を有する。

【0034】

よりさらに好ましくは、前記アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）の１種又は２種以上のアリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）菌株の組み合わせである。

【0035】

よりさらに好ましくは、前記アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）の菌株は、米国国立バイオテクノロジーセンター（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、略語ＮＣＢＩ）ゲノムデータベース(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/#!/prokaryotes/11196/)における亜種分類の菌株名(Strain name of sub species classification)は、ＡｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉＤＳＭ１７２４２、ＡｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉＤ５３ｔ１＿１８０９２８＿Ｄ３、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ２７８９ＳＴＤＹ５８３４９４７、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ１００１７１３Ｂ１７０２０７＿１７０３０６＿Ｈ２、ＡｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉＤＦＩ．２．３１、ＡｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉＢＩＯＭＬ－Ａ１、ＡｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉＤＦＩ．２．１６、ＡｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉＤＦＩ．２．１０、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉａａ＿０１４３、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ２７８９ＳＴＤＹ５６０８８９０、ＡｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉＭＧＢＣ１１６４５３、ＡｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉＣＯＰＤ０７６、又はＡｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉＵＢＧ１９５の１種又は２種以上の組み合わせである。
よりさらに好ましくは、前記アリスティペス・ファインゴールディイ菌株は、以下の菌株の１種又は２種以上の組み合わせである。

【0036】

ドイツ微生物菌種寄託センターＤＳＭＺに寄託されている、寄託番号ＤＳＭ１７２４２のアリスティペス・ファインゴールディイ(ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ＝Ｇｅｒｍａｎｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓａｎｄｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｓ)(NCBI:txid679935 ,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=679935)、
日本ＪＣＭ種菌寄託センター（ＪａｐａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託されている、寄託番号ＪＣＭ１６７７０のアリスティペス・ファインゴールディイ、
韓国ＫＣＴＣ種菌寄託センター（ＫｏｒｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託されている、寄託番号ＫＣＴＣ１５２３６のアリスティペス・ファインゴールディイ、
フィンランドヘルシンキ嫌気性菌参考実験室（ＡｎａｅｒｏｂｅＲｅｆｅｒｅｎｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＨｅｌｓｉｎｋｉＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＮａｔｉｏｎａｌＰｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）に寄託されている、寄託番号ＡＨＮ２４３７のアリスティペス・ファインゴールディイ、
スウェーデンＣＣＵＧ菌種寄託センター（ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｏｔｈｅｎｂｕｒｇ）に寄託されている、寄託番号ＣＣＵＧ４６０２０のアリスティペス・ファインゴールディイ、
フランスＣＩＰ種菌寄託センター（ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｄｅＬ'ＩｎｓｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒｏｆＩｎｓｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ）に寄託されている、寄託番号ＣＩＰ１０７９９９のアリスティペス・ファインゴールディイ、
中国広東省微生物菌種寄託センターに寄託されている、寄託番号ＧＤＭＣＣ１．２３２４のアリスティペス・ファインゴールディイ
好ましくは、前記アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）に含まれる１６ＳｒＤＮＡ配列は、配列番号１に示されるアリスティペス・ファインゴールディイ菌種（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）の１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも９９％の相同性を有する。

【0037】

より好ましくは、前記アリスティペス・ファインゴールディイ細菌は、ＤＳＭに寄託されている寄託番号１７２４２のアリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）菌株である。

【0038】

より好ましくは、アロステリス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）に属する細菌と免疫チェックポイント阻害剤とを同時に又は別個に投与する。

【0039】

好ましくは、前記細菌代謝物は、細菌の調製及び貯蔵の間、ならびに哺乳動物の消化管輸送の間に、細菌の成長、生存、滞留、輸送又は存在の結果として、前記細菌によって生産又は修飾された全ての分子を含む。

【0040】

より好ましくは、前記細菌代謝物は、全ての有機酸、無機酸、塩基、タンパク質及びペプチド、酵素及び補酵素、アミノ酸及び核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、ビタミン、全ての生物学的に活性な化合物、無機成分を含有する代謝物、例えば窒素含有分子又は亜硫酸含有分子などの小分子を含む。

【0041】

好ましくは、前記細菌誘導体は、細菌構成成分と遺伝物質及び関連成分とを含み、具体例としては、細菌細胞膜、菌毛、鞭毛、ＬＰＳ、核酸物質などの細菌由来成分を含む。

【0042】

好ましくは、前記不活性全細胞細菌は、細菌を培養して増幅した後、種々の方法で不活性化することにより得られる。

【0043】

より好ましくは、前記細菌の不活化手段は、高温及び／又は高圧不活化、紫外線不活化、放射線不活化、ホルムアルデヒド、アセトン、フェノール類などの化学剤不活化から選ばれるいずれか１種又は２種以上である。

【0044】

さらに好ましくは、前記化学剤はホルムアルデヒド、アセトン、フェノール類のいずれか１種又は２種以上である。

【0045】

より好ましくは、前記不活性全細胞細菌は、細菌全細胞成分、細菌全細胞誘導体、又は細菌全細胞代謝産物の１種又は２種以上を含む。

【0046】

より好ましくは、前記細菌全細胞成分は、細菌構成成分と遺伝物質及び関連成分とを含み、具体的には、細菌細胞壁、細胞膜、菌毛、鞭毛、ＬＰＳ、核酸物質などの細菌由来成分の１種又は２種以上を含む。

【0047】

より好ましくは、前記細菌全細胞誘導体は、細菌細胞外小胞、細菌関連エクソソーム、プロファージの１種又は２種以上を含む。

【0048】

より好ましくは、前記細菌全細胞代謝産物は、細菌全細胞成分が産生に関与する代謝産物を意味し、全ての有機酸、無機酸、塩基、タンパク質及びペプチド、酵素及び補酵素、アミノ酸及び核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、ビタミン類、全ての生物学的に活性な化合物、無機成分を含有する代謝物、例えば窒素含有分子又は亜硫酸含有分子などの小分子の１種又は２種以上を含む。

【0049】

好ましくは、前記腫瘍の治療は、腫瘍の縮小又は安定化、総生存期間の延長、無増悪生存期間の延長、及び生活の質の改善として示される。

【0050】

好ましくは、前記腫瘍は、腺腫、悪性腫瘍、及び腺癌であり、腫瘍は、組織由来や細胞名によって分類されると、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、乳癌、膵臓癌、子宮頸癌、胆管癌、結腸癌、結腸直腸癌、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、多形性膠芽腫、神経膠腫、頭頸部癌、腎嫌色細胞癌、混合腎癌、腎臓癌、白血病、リンパ腫、脳癌、肝臓癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、中皮癌、卵巣癌、膵臓癌、クロム親和性細胞腫、副神経節癌、前立腺癌、直腸腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、胃癌、食道癌、精巣癌、甲状腺癌、胸腺癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、ぶどう膜黒色腫、及び軟部肉腫の１種又は２種以上である。

【0051】

本発明の一特定実施例において、前記細菌（Ａｆ）は、ＤＳＭに寄託されている寄託番号１７２４２のアリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）菌株の細菌生菌であり、前記腫瘍は結腸癌又は黒色腫であり、前記免疫チェックポイント阻害剤は、クローン番号Ｇ４Ｃ２のＰＤ－１モノクローナル抗体（αＰＤ－１）、又はクローン番号９Ｄ９のＣＴＬＡ４モノクローナル抗体（αＣＴＬＡ４）である。

【0052】

本発明の一特定実施例において、前記細菌（Ａｆ）は、ＤＳＭに寄託されている寄託番号１７２４２のアリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）菌株の不活性細菌であり、前記腫瘍は結腸癌又は肺癌であり、前記免疫チェックポイント阻害剤（αＰＤ－１）は、クローン番号Ｇ４Ｃ２である。

【0053】

好ましくは、前記腫瘍は、悪性腫瘍、転移性腫瘍又は非転移性腫瘍である。

【0054】

好ましくは、ここでは、前記腫瘍は悪性、転移性及び非転移性のタイプを含み、癌のあらゆる段階（臨床ステージ：Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ；悪性腫瘍ＴＮＭ分類：Ｔ１－４、Ｎ０－４、又はＭ０－１；組織ステージ：Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、又はＧ４など）を含む。

【0055】

より好ましくは、前記免疫チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞抑制性共刺激（共阻害）分子及び／又はそれぞれのリガンドに作用するブロッカーの１種又は２種以上の組み合わせである。

【0056】

さらに好ましくは、Ｔ細胞抑制性共刺激（共阻害）分子及び／又はそれぞれのリガンドは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ａ２ＡＲ、ＩＤＯ、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＤ４０、ＫＩＲ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＧＡＲＰ、ＰＳ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＴＤＯ、ＴＮＦＲ、及びＤｃＲ３から選ばれる１種又はこれらの任意の２種以上の組み合わせである。

【0057】

よりさらに好ましくは、前記Ｔ細胞抑制性共刺激（共阻害）分子のリガンドのブロッカーは、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ＰＤ－１モノクローナル抗体）、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、ＰＤ－１モノクローナル抗体）、アゼトリズマブ（ａｚｅｔｏｌｉｚｕｍａｂ、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）、カムレリズマブ（ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）、チスレリズマブ（ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ、ＢＧＢ－Ａ３１７）、デュバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）、トラメムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ、ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体）、スパルタリズマブ（ｓｐａｒｔａｌｉｚｕｍａｂ、ＰＤ－１モノクローナル抗体）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）、シンチリマブ（ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ、ＰＤ－１モノクローナル抗体）、トリパリマブ（ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ、ＰＤ－１モノクローナル抗体）、セミプリマブ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ、ＰＤ－１モノクローナル抗体）、ＭＧＡ０１２（ｒｅｔｉｆａｎｌｉｍａｂ、ＰＤ－１モノクローナル抗体）、ＭＧＤ０１３（ｔｅｂｏｔｅｌｉｍａｂ、ＰＤ－１／ＬＡＧ－３二重モノクローナル抗体）、ＭＧＤ０１９（ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重モノクローナル抗体）、エノブリツズマブ（ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ、Ｂ７－Ｈ３モノクローナル抗体）、ＭＧＤ００９（Ｂ７－Ｈ３モノクローナル抗体）、ＭＧＣ０１８（Ｂ７－Ｈ３モノクローナル抗体）、ＭＥＤＩ０６８０（ＰＤ－１モノクローナル抗体）、ＰＤＲ００１（ＰＤ－１モノクローナル抗体）、ＦＡＺ０５３（ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）、ＰＤＲ００１ＦＡＺ０５３、ＴＳＲ０２２（ＴＩＭ－３モノクローナル抗体）、ＭＢＧ４５３（ＴＩＭ－３モノクローナル抗体）、ｒｅｌａｔｌｉｍａｂ（ＢＭＳ９８６０１６、ＬＡＧ－３モノクローナル抗体）、ＬＡＧ５２５（ＬＡＧ－３モノクローナル抗体）、ＩＭＰ３２１（ＬＡＧ－３モノクローナル抗体）、ＲＥＧＮ３７６７（ＬＡＧ－３モノクローナル抗体）、ペキシダルチニブ（ｐｅｘｉｄａｒｔｉｎｉｂ、ＣＳＦ－１Ｒモノクローナル抗体）、ＬＹ３０２２８５５（ＣＳＦ－１Ｒモノクローナル抗体）、ＦＰＡ００８（ＣＳＦ－１Ｒモノクローナル抗体）、ＢＬＺ９４５（ＣＳＦ－１Ｒモノクローナル抗体）、ＧＤＣ０９１９（ｎａｖｏｘｉｍｏｄ, ＩＤＯモノクローナル抗体）、エパカドスタット（ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ,ＩＤＯモノクローナル抗体）、ｉｎｄｏｘｉｍｉｄ（ＩＤＯモノクローナル抗体）、ＢＭＳ９８６２０５（ＩＤＯモノクローナル抗体）、ＣＰＩ－４４４（Ａ２ＡＲモノクローナル抗体）、ＭＥＤＩ９４４７（ｏｌｅｃｌｕｍａｂ、ＣＤ７３モノクローナル抗体）、ＰＢＦ５０９（Ａ２ＡＲモノクローナル抗体）、及びリリルマブ（ｌｉｒｉｌｕｍａｂ、ＫＩＲモノクローナル抗体）から選ばれる１種又はこれらの任意の２種以上の組み合わせであり、好ましくは、前記ブロッカーは、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、トリパリマブ、シンディリルマブ、セミプリマブから選ばれる１種又はこれらの任意の２種以上の組み合わせである。

【0058】

よりさらに好ましくは、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル経路及び／又はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２シグナル経路に作用する阻害剤であり、ＰＤ－１はプログラムされた細胞死タンパク質１を意味し、ＣＤ２７９とも呼ばれ、ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１又はＣＤ２７４）及びＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ又はＣＤ２７３）はＰＤ－１のリガンドである。

【0059】

よりさらに好ましくは、前記ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル経路及び／又はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２シグナル経路の阻害剤は、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ＰＤ－１モノクローナル抗体）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、ＰＤ－１モノクローナル抗体）、アセトリスマフ（ａｚｅｔｏｌｉｚｕｍａｂ、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）、アテソリスマフ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）、カムレリスマフ（ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）、チスレリズマブ（ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ、ＢＧＢ－Ａ３１７）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）、スパルタリズマブ（ｓｐａｒｔａｌｉｚｕｍａｂ、ＰＤ－１モノクローナル抗体）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）、シンチリマブ（ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ、ＰＤ－１モノクローナル抗体）、トリパリマブ（ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ、ＰＤ－１モノクローナル抗体）、セミプリマブ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ、ＰＤ－１モノクローナル抗体）、ＭＧＡ０１２（ｒｅｔｉｆａｎｌｉｍａｂ、ＰＤ－１モノクローナル抗体）、ＭＧＤ０１３（ｔｅｂｏｔｅｌｉｍａｂ、ＰＤ－１／ＬＡＧ－３二重モノクローナル抗体）、ＭＧＤ０１９（ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重モノクローナル抗体）、ＭＥＤＩ０６８０（ＰＤ－１モノクローナル抗体）、ＰＤＲ００１（ＰＤ－１モノクローナル抗体）、及びＦＡＺ０５３（ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）の１種又はこれらの任意の２種以上の組み合わせである。

【0060】

よりさらに好ましくは、前記ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル経路又はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２シグナル経路の阻害剤は、イピリムマブ、トレメリムマブ、又はＭＧＤ０１９から選ばれる１種又はこれらの任意の２種以上の組み合わせである。

【0061】

よりさらに好ましくは、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４／Ｂ７－１シグナル経路及び／又はＣＴＬＡ－４／Ｂ７－２シグナル経路に作用する阻害剤であり、ＣＴＬＡ－４は細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４を意味し、ＣＤ１５２とも呼ばれ、Ｂ７－１（ＣＤ８０）及びＢ７－２（ＣＤ８６）はＣＴＬＡ－４のリガンドである。

【0062】

よりさらに好ましくは、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体）、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ、ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体）、ＭＧＤ０１９（ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４二重モノクローナル抗体）、又はこれらの任意の２種以上の組み合わせであってもよい。

【0063】

本発明の一特定実施例として、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル経路及び／又はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２シグナル経路に作用する阻害剤、及び／又はＣＴＬＡ－４／Ｂ７－１シグナル経路及び／又はＣＴＬＡ－４／Ｂ７－２シグナル経路に作用する阻害剤である。
具体的には、前記免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－１モノクローナル抗体又はＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体である。

【0064】

好ましくは、化学療法、免疫療法、放射線療法は、Ａｆの投与と同時に、別個に、又は順次行われる。

【0065】

好ましくは、前記投与対象はヒトであり、前記ヒトは、乳幼児、小児、青少年、成人又は老人である。

【0066】

好ましくは、前記投与対象は非ヒト霊長類であり、前記非ヒト霊長類は、哺乳類（例えば、イヌ、ネコ、フェレット、ウマ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、キタリス、ラット、マウス）の非ヒト霊長類；鳥類；爬虫類；魚；両生類；節足動物又は家畜動物（例えば、牛、豚、羊、ヤギ、アルパカ、ロバ、ラクダ、バッファロー又はミンク）である。

【0067】

好ましくは、前記細菌ＣＦＵ（コロニー形成単位）を１０⁵～１０¹²個、又は１０⁷～１０¹¹、又は１０⁸～１０¹¹、又は１０⁹～１０¹¹、又は１０¹⁰～１０¹¹、より好ましくは、１０⁹～１０¹¹個を含む用量で前記細菌（Ａｆ）を投与する。

【0068】

本発明は、以下のものをさらに含む。

【0069】

前記免疫チェックポイント阻害剤の１種又は２種以上と、前記細菌とを含むか、又は、前記免疫チェックポイント阻害剤の１種又は２種以上と、前記細菌とからなる腫瘍治療用キット。

【0070】

好ましくは、前記キットは、容器を含む。

【0071】

アリスティペス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）の１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％の相同性を有する１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌であって、細菌生菌、不活性細菌、細菌誘導体、又は細菌代謝産物の１種又は２種以上である。

【0072】

アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）の１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも９９％の相同性を有する１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌であって、細菌生菌、非活性細菌、細菌誘導体及び細菌代謝産物の１種又は２種以上である。

【0073】

以下の菌株のいずれか１種の１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも９９％又は１００％の相同性を有する１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌であって、細菌生菌、非活性細菌、細菌誘導体及び細菌代謝産物の１種又は２種以上である。

【0074】

ドイツ微生物菌種寄託センターＤＳＭＺに寄託されている、寄託番号ＤＳＭ１７２４２のアリスティペス・ファインゴールディイ（ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ＝Ｇｅｒｍａｎｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓａｎｄｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）(NCBI:txid679935 ,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=679935)、
日本ＪＣＭ種菌寄託センター（ＪａｐａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託されている、寄託番号ＪＣＭ１６７７０のアリスティペス・ファインゴールディイ、
韓国ＫＣＴＣ種菌寄託センター（ＫｏｒｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託されている、寄託番号ＫＣＴＣ１５２３６のアリスティペス・ファインゴールディイ、
フィンランドヘルシンキ嫌気性菌参考実験室（ＡｎａｅｒｏｂｅＲｅｆｅｒｅｎｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＨｅｌｓｉｎｋｉＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＮａｔｉｏｎａｌＰｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）に寄託されている、寄託番号ＡＨＮ２４３７のアリスティペス・ファインゴールディイ、
スウェーデンＣＣＵＧ菌種寄託センター（ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｏｔｈｅｎｂｕｒｇ）に寄託されている、寄託番号ＣＣＵＧ４６０２０のアリスティペス・ファインゴールディイ、
フランスＣＩＰ種菌寄託センター（ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｄｅＬ'ＩｎｓｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒｏｆＩｎｓｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ）に寄託されている、寄託番号ＣＩＰ１０７９９９のアリスティペス・ファインゴールディイ、
中国広東省微生物菌種寄託センターに寄託されている、寄託番号ＧＤＭＣＣ１．２３２４のアリスティペス・ファインゴールディイ。

【0075】

好ましくは、前記不活性細菌は、不活性全細胞細菌である。

【0076】

好ましくは、前記細菌は、生菌完全細菌及び／又は完全活性菌である。

【0077】

その中でも、寄託番号ＤＳＭ１７２４２のアリスティペス・ファインゴールディイ（ＡｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉＤＳＭ１７２４２）の１６ＳｒＤＮＡ配列は配列番号１に示される。

【0078】

配列番号１:
agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcggcaggc ttaacacatg caagtcgagg
ggcagcgggg agtagcaata ctccgccggc gaccggcgca cgggtgcgta acgcgtatgc
aacctacctt taacaggggc ataacactga gaaattggta ctaattcccc ataacattcg
agaaggcatc ttcttgggtt aaaaactccg gtggttaaag atgggcatgc gttgtattag
ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc aacgatacat agggggactg agaggttaac
cccccacatt ggtactgaga cacggaccaa actcctacgg gaggcagcag tgaggaatat
tggtcaatgg acgcaagtct gaaccagcca tgccgcgtgc aggaagacgg ctctatgagt
tgtaaactgc ttttgtacta gggtaaacgc ttttacgtgt aggagcctga aagtatagta
cgaataagga tcggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggagga tccaagcgtt
atccggattt attgggttta aagggtgcgt aggcggtttg ataagttaga ggtgaaatac
cggggctcaa ctccggaact gcctctaata ctgttgaact agagagtagt tgcggtaggc
ggaatgtatg gtgtagcggt gaaatgctta gagatcatac agaacaccga ttgcgaaggc
agcttaccaa actatatctg acgttgaggc acgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga
taccctggta gtccacgcag taaacgatga taactcgttg tcggcgatac acagtcggtg
actaagcgaa agcgataagt tatccacctg gggagtacgt tcgcaagaat gaaactcaaa
ggaattgacg ggggcccgca caagcggagg aacatgtggt ttaattcgat gatacgcgag
gaaccttacc cgggcttgaa agttagtgac gattctggaa acaggatttc ccttcggggc
acgaaactag gtgctgcatg gttgtcgtca gctcgtgccg tgaggtgtcg ggttaagtcc
cataacgagc gcaaccccta ccgttagttg ccatcaggtc aagctgggca ctctggcggg
actgccggtg taagccgaga ggaaggtggg gatgacgtca aatcagcacg gcccttacgt
ccggggctac acacgtgtta caatggtagg tacagagggc cgctaccccg cgaggggatg
ccaatctcga aagcctatct cagttcggat cggaggctga aacccgcctc cgtgaagttg
gattcgctag taatcgcgca tcagccatgg cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca
caccgcccgt caagccatgg aagctggggg tgcctgaagt tcgtgaccgc aaggagcgac
ctagggcaaa accggtgact ggggctaagt cgtaacaagg taaccaa

【0079】

腫瘍治療用の前記細菌の１種又は２種以上の組成物を有効量で薬学的に許容される担体及び補助材料に加えて、凍結乾燥粉末、錠剤、カプセル剤、顆粒剤又は注射剤として調製する製剤。

【0080】

ここで、「薬学的に許容される担体」とは、生体に対して明らかな刺激性を引き起こさず、かつ、与えられた化合物の生物活性及び性質を妨げない担体をいう。ここで、「補助材料」とは、溶剤、希釈剤又はその他の賦形剤、分散剤、界面活性剤をいう。

【0081】

前記細菌及び薬学的に許容される担体を含む組成物。

【0082】

医薬品として使用するために調製された上記のいずれかに記載の細菌を含む組成物。

【0083】

医療用食品として使用するために調製された上記のいずれかに記載の細菌を含む組成物。

【0084】

上記のいずれかに記載された細菌菌株の２種以上の混合物を含む組成物であって、必要に応じて薬学的に許容される担体をさらに含む組成物。

【0085】

腫瘍治療用の上記のいずれかに記載の細菌の２種以上を有効量で含む組成物であって、必要に応じて薬学的に許容される担体をさらに含む組成物。

【0086】

腫瘍治療用の上記のいずれかに記載の細菌の細菌生菌、不活性細菌、細菌誘導体、又は細菌代謝産物の１種又は２種以上を有効量で組成物であって、必要に応じて薬学的に許容される担体をさらに含む組成物。

【0087】

上記のいずれかに記載の細菌を含み、経腸栄養用として製剤化される飲食品、サプリメント、プロバイオティクス又は健康食品。

【0088】

上記のいずれかに記載の２種以上の細菌の混合物を含み、経腸栄養用として製剤化する飲食品、サプリメント、プロバイオティクス又は健康食品。

【0089】

凍結乾燥粉末、錠剤、カプセル剤、顆粒剤又は注射剤として調製された上記のいずれかに記載の細菌又は組成物。

【0090】

投与対象がヒトであることを特徴とする、上記のいずれかに記載の細菌、製剤、組成物、飲食品、サプリメント、プロバイオティクス又は健康食品。

【0091】

好ましくは、前記ヒトは、乳幼児、小児、青少年、成人又は老人である。

【0092】

非ヒト霊長類に投与され、前記非ヒト霊長類は哺乳類（例えば、イヌ、ネコ、フェレット、ウマ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、キタリス、ラット、マウス）の非ヒト霊長類；鳥類；爬虫類；魚；両生類；節足動物又は家畜動物（例えば、牛、豚、羊、ヤギ、アルパカ、ロバ、ラクダ、バッファロー又はミンク）である上記のいずれかに記載の細菌、製剤、組成物、飲食品、サプリメント、プロバイオティクス又は健康食品。

【0093】

上記のいずれかに記載の細菌、製剤、組成物、飲食品、サプリメント、プロバイオティクス又は健康食品の腫瘍治療における使用。

【0094】

上記のいずれかに記載の細菌、前記細菌の有効量を含む、製剤、組成物、飲食品、サプリメント、プロバイオティクス又は健康食品の腫瘍治療における使用。

【0095】

上記のいずれかに記載の細菌、前記細菌の有効量を含む、製剤、組成物、飲食品、サプリメント、プロバイオティクス又は健康食品の腫瘍治療における使用であって、前記腫瘍治療では、上記のいずれかに記載の細菌、製剤、組成物、飲食品、サプリメント、プロバイオティクス又は健康食品を投与する、ことを特徴とする使用。

【0096】

癌治療用の上記のいずれかに記載の細菌又は組成物を有効量で含む組成物であって、必要に応じて薬学的に許容される担体をさらに含む組成物。

【0097】

癌治療用の上記のいずれかに記載の細菌又は組成物の２種以上を有効量で含む組成物であって、必要に応じて薬学的に許容される担体をさらに含む組成物。

【0098】

アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）生菌と、免疫チェックポイント阻害剤とを含む組成物。

【0099】

好ましくは、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１モノクローナル抗体（αＰＤ－１）及び／又はＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体（αＣＴＬＡ４）である。

【0100】

本発明はまた、腫瘍治療薬の調製における前記組成物の使用を含む。

【0101】

本発明はまた、前記組成物を含む医薬品、具体的には、アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）と免疫チェックポイント阻害剤とを有効成分とする腫瘍治療用の医薬組成物を含む。

【0102】

腫瘍治療用の免疫チェックポイント阻害剤の増強剤の調製における、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）に属する細菌の細菌生菌、不活性細菌、細菌誘導体、又は細菌代謝産物の１種又は２種以上の使用。

【0103】

好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤の増強剤の調製における有効成分としてのアリスティペス・ファインゴールディイの使用であって、前記増強剤は免疫チェックポイント阻害剤の腫瘍治療効果を向上させることができる使用。

【0104】

より好ましくは、アリスティペス・ファインゴールディイ菌株は、以下の菌株の１種又は２種以上の組み合わせである。

【0105】

【0106】

本発明は、免疫チェックポイント阻害剤の治療効果を増強させる腫瘍患者の治療に有用なアリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｆ：Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）を提供する。具体的には、本発明は、免疫チェックポイント阻害治療を、活性又は不活性全細胞Ａｆ投与と同時に、別個に又は順次行うことにより、免疫チェックポイント阻害の治療効果を増強させる併用療法を提案する。

【0107】

アリスティペス・ファインゴールディイを投与することで腸内固有細菌叢を除去する。

【0108】

抗生物質の組み合わせを使用して腸内細菌叢を除去する。

【0109】

抗生物質の組み合わせを使用して腸内固有菌叢を除去し、７日間処理する。

【0110】

抗生物質の組み合わせ：メトロニダゾール１００ｍｇ／ｋｇ、バンコマイシン５０ｍｇ／ｋｇ、ペニシリンナトリウム１００ｍｇ／ｋｇ、硫酸ネオマイシン１００ｍｇ／ｋｇ。

【0111】

Ａｆの投与は経口投与とする。

【0112】

併用療法の投与順序は、免疫チェックポイント阻害剤治療と同時に、前及び／又は後に前記Ａｆを投与する。

【0113】

前記併用療法では、個々の患者の治療に対する耐性に応じて、必要に応じて、投与遅延及び／又は投与量減少及び時間調整が実施される。

【0114】

本発明の前記Ａｆは、一般に薬学的又は薬理学的に許容される担体に分散された有効量のアリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）を含んでもよい。

【0115】

「薬学的に又は薬理学的に許容される」という用語は、動物（例えば、適切であれば、ヒト）に投与されたときに、副作用、アレルギー反応又は他の不利な反応を生じない分子実体及び組成物を意味する。本明細書に記載の薬理学的に許容される担体の具体例は、ホウ酸塩緩衝液又は無菌塩水溶液である。

【0116】

本発明の前記免疫チェックポイント阻害剤の増強は、免疫チェックポイント阻害剤による治療に対する先天性（原発性）耐性を示し、第１剤から少なくとも約８週間又は１２週間に亘って前記チェックポイント阻害剤の治療に対する応答欠如又は応答不足として示される免疫チェックポイント阻害剤の難治性患者に有用である。

【0117】

本発明の前記免疫チェックポイント阻害剤の増強は、前記チェックポイント阻害剤による治療に対する後天性（二次性）耐性を示し、前記チェックポイント阻害剤に対して初期応答を示すが、１種又は２種以上の腫瘍がその後再発し、進行する免疫チェックポイント阻害剤の難治性患者に有用である。

【0118】

本発明の前記併用療法の治療効果の評価は、増加した総総生存期間によって増強された治療効果を測定する。

【0119】

本発明の前記併用療法の治療効果の評価は、増加した無進展生存期間によって増強された治療効果を測定する。

【0120】

本発明の前記併用療法の治療効果の評価は、ＲＥＣＩＳＴ１．１に定義されるように、標的腫瘍の疾患安定化（ＳＤ）、完全寛解（ＣＲ）、又は部分寛解（ＰＲ）、及び／又は１種又は２種以上の非標的腫瘍の疾患安定化（ＳＤ）又は完全寛解（ＣＲ）を含む、１種又は２種以上の腫瘍の腫瘍サイズを減少又は安定化させることによって、前記増強された治療効果を測定する。

【0121】

本発明の前記併用療法の治療効果の評価は、改善された全寛解率及び／又は向上した生活の質によって、増強された治療効果を測定する。

【0122】

本発明の前記併用療法の安全性評価は、下痢又は腸炎を発症しているか否かにより、その安全性を測定する。

【発明の効果】

【0123】

従来技術と比較して、本発明は以下の有益な効果を有する。

【0124】

本発明は、ヒト共生細菌である単菌経口製剤と免疫チェックポイント阻害剤とを併用することで、細菌刺激による抗腫瘍免疫保護反応により、免疫チェックポイント阻害剤の多種類の腫瘍に対する薬効を著しく増強させ、また安全性がより優れ、癌患者の総生存期間を延長し、癌免疫療法を受けている人の応答率を向上させ、癌免疫療法（免疫治療用チェックポイント阻害剤）が適用できる腫瘍患者の範囲を広げる。

【図面の簡単な説明】

【0125】

【図1】実施例１の臨床コホートを用いた、免疫チェックポイント阻害剤の効果を増強できる腸内細菌のスクリーニングである。

【図2】実施例１の各アリスティペス菌種と免疫チェックポイント阻害剤の治療効果との関係についての臨床コホート分析である。

【図3】実施例２における結腸癌及びメラノーマのモデルマウスへの各活性アリスティペス菌種の投与のフローチャートである。

【図4】実施例２の腫瘍写真（２１日目）である。

【図5】実施例２の腫瘍体積の変化曲線である。

【図6】実施例２の腫瘍重量の統計図である。

【図7】実施例２のマウス肛門の写真（２１日目）である。

【図8】実施例２のマウス腸管組織のＨＥ染色図（２１日目）である。

【図9】実施例２の腫瘍組織免疫細胞の免疫組織化学図（２１日目）である。

【図10】実施例２のフローサイトメトリーによる、アリスティペス・ファインゴールディイ投与後の腫瘍殺傷関連免疫保護反応の検出である。

【図11】実施例３において結腸癌及びメラノーマのモデルマウスに各用量の活性アリスティペス・ファインゴールディイを投与したときの生存曲線図である。

【図12】実施例４における結腸癌モデルマウスへの活性アリスティペス・ファインゴールディイ及び不活性全細胞アリスティペス・ファインゴールディイの投与のフローチャートである。

【図13】実施例４の活性アリスティペス・ファインゴールディイ及び不活性全細胞アリスティペス・ファインゴールディイの電子顕微鏡写真の比較図である。

【図14】実施例４において結腸癌モデルマウスに活性アリスティペス・ファインゴールディイ及び不活性全細胞アリスティペス・ファインゴールディイを投与した場合の腫瘍体積の変化曲線である。

【図15】実施例４において結腸癌モデルマウスに活性アリスティペス・ファインゴールディイ及び不活性全細胞アリスティペス・ファインゴールディイを投与した場合の腸内細菌叢のβ－多様性ＰＣｏＡ解析である。

【図16】実施例４において結腸癌モデルマウスに活性アリスティペス・ファインゴールディイ及び不活性全細胞アリスティペス・ファインゴールディイを投与した場合の腸内細菌叢の再構築作用の比較である。

【図17】実施例４において結腸癌モデルマウスに活性アリスティペス・ファインゴールディイ及び不活性全細胞アリスティペス・ファインゴールディイを投与したマウスの腸内細菌叢の相対存在量上位２０細菌属の統計学的差の解析である。

【図18】実施例５における肺癌モデルマウスへの活性アリスティペス・ファインゴールディイ及び不活性全細胞アリスティペス・ファインゴールディイの投与のフローチャートである。

【図19】実施例５において肺癌モデルマウスに活性アリスティペス・ファインゴールディイ及び不活性全細胞アリスティペス・ファインゴールディイを投与した場合の腫瘍体積の変化曲線である。

【図20】実施例５において肺癌モデルマウスに活性アリスティペス・ファインゴールディイ及び不活性全細胞アリスティペス・ファインゴールディイを投与した場合の実験エンドポイントでの腫瘍重量である。

【図21】実施例５において肺癌モデルマウスに活性アリスティペス・ファインゴールディイ及び不活性全細胞アリスティペス・ファインゴールディイを投与した場合の実験エンドポイントでの腫瘍写真である。

【図22】実施例６の健常人の腸内及び他の身体部位におけるアリスティペス・ファインゴールディイの相対存在量の分析である。

【図23】実施例７の健常人及び他の人の腸内における分布及び相対存在量である。

【発明を実施するための形態】

【0126】

以下、明細書の図面及び特定実施例を参照しながら、本発明をさらに詳細に説明するが、前記実施例は本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではない。下記実施例に使用される試験方法は、特に断らない限り、いずれも通常の方法であり、使用される材料、試薬などは、特に断らない限り、商業的に入手可能なものである。

【0127】

実施例１臨床コホートを用いた、免疫チェックポイント阻害剤を増強させることができる腸内細菌のスクリーニング
一、実験方法
１、データセット
（１）腸内細菌叢は１０８名の結腸直腸癌（ＣＲＣ）又は食道癌（ＥＳＣＣ）患者の治療後の異なる時点での２３０個の糞便サンプルから得られた。その中でも、１１５個のサンプルは免疫チェックポイント阻害剤群（ＩＣＩ）の患者から得られたものであり、治療方式は、抗ＰＤ１抗体治療と化学療法又は標的薬とを併用することであり、１１５個のサンプルは化学療法群（Ｃｈｅｍｏ）の患者（表１）から得られたものである。治療効果に関する評価は、主に、無進展生存期間（ＰＦＳ）、生存期間（ＯＳ）及び最適治療効果を含む。最適治療効果が完全寛解（ＣＲ）と部分寛解（ＰＲ）の患者を治療応答性患者（Ｒ）と定義し、最適治療効果が疾患安定（ＳＤ）と疾患進展（ＰＤ）の患者を治療非応答性患者（ＮＲ）と定義した。

（２）１１５個の糞便サンプルからＤＮＡを抽出した後、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＶ３－Ｖ４領域増幅とシーケンシングを行った（ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑプラットフォーム）。１６ＳｒＲＮＡシーケンシングデータ解析は、品質管理、フィルタリング、種同定のためにＵＳＥＡＲＣＨソフトウェア（バージョン番号１１．０．６６７）を使用した。１人の患者について複数の治療後の時点での糞便サンプルがある場合、腸内細菌叢の種の存在量は、その後の分析を考慮して、異なる時点の平均値をとる。後の菌株レベルの純粋培養実験で分析結果を検証できるように、ＬＴＰ（ＬｉｖｉｎｇＴｒｅｅＰｒｏｊｅｃｔ）データベースを用いて種の同定を行った。ＬＴＰデータベースは、観察された形質に基づいて分類された典型的な菌株と分離株の配列を主に収集する。可１６ＳｒＲＮＡシーケンシングによる種レベルの細菌鑑定の正確性を能な限り高めるために、同定対象の種に対して信頼性を採点することのできるＳＩＮＴＡＸアルゴリズムを用いて種の注釈を行い、種の信頼性が７５％を超えると注釈された腸内細菌をスクリーニングして次の分析を行った。
２、統計学的分析
（１）ＰＦＳとＯＳの単因子ｃｏｘ回帰分析：Ｒ言語パックｓｕｒｖｉｖａｌ（バージョン番号：３．３－１）を用いて、全ての腸内細菌叢の属レベルの細菌を単因子ｃｏｘ回帰分析にかけた。
（２）群間差の分析：群間差の統計はＷｉｌｃｏｘｏｎｒａｎｋ－ｓｕｍｔｅｓｔ（ウィルコクソンの順位和検定）統計学的差分析を用いた。
二、実験結果
図１ＡはＣｈｅｍｏ群とＩＣＩ群の治療応答性患者（Ｒ）と非応答性患者（ＮＲ）の治療後の異なる時点での腸内アリスティペスの平均相対存在量である。ＩＣＩ群では、Ｒ群患者の治療後の腸内アリスティペスの平均相対存在量はＮＲ群患者より有意に高かった（ｐ＜０．００１）が、Ｃｈｅｍｏ群では、Ｒ群患者の治療後の腸内アリスティペスの平均相対存在量はＮＲ群患者との間に有意差がなかった（ｐ＝０．９９）。治療後に高い存在量のアリスティペスは免疫チェックポイント阻害剤の良い治療効果と相関することを示した。図１Ｂは、免疫チェックポイント阻害剤を受けた後のＣＲＣとＥＳＣＣ患者の異なる時点での腸内アリスティペスの平均相対存在量である。
その結果、免疫チェックポイント阻害剤を受けた後、アリスティペスはＣＲＣ患者の５０％でゼロ値を示したが、ＥＳＣＣ患者の全てでアリスティペスは検出された。そのため、免疫チェックポイント阻害剤の治療を受けた後のアリスティペスの相対存在量の平均値がゼロであるか否かによって、ＣＲＣ患者を陰性（アリスティペスの相対存在量はゼロ）と陽性（アリスティペスの相対存在量がゼロより大きい）の２群に分けた。免疫チェックポイント阻害剤を受けた後のアリスティペスの相対存在量の平均値により、ＥＳＣＣ患者を高（平均値以上）と低（平均値未満）の２群に分けた。
図１Ｃは陰性群と陽性群のＣＲＣ患者の無進展生存期間（ＰＦＳ）のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ（ＫＭ）曲線の比較である。図１Ｄは高群と低群のＥＳＣＣ患者の総生存期間（ＯＳ）のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ（ＫＭ）曲線の比較である。その結果、陽性群のＣＲＣ患者のＰＦＳ時間は陰性群の患者より有意に長かった（ｌｏｇ－ｒａｎｋｐ＝０．０２）。アリスティペスの相対存在量の平均値が高いＥＳＣＣ患者の総総生存期間は、アリスティペスの相対存在量の平均値が低い患者（ｌｏｇ－ｒａｎｋｐ＝０．００７１）より有意に長かった。
これらのデータは免疫チェックポイント阻害剤を受けた後、腸内の高い存在量のアリスティペスが免疫チェックポイント阻害剤の治療効果発揮に有利であることを示している。
図２は各アリスティペス菌種と免疫チェックポイント阻害剤の治療効果時間との関係の分析である。本データセットでは、信頼度が０．７５より大きい１１個のアリスティペスに属する操作分類系単位（ＯＴＵ：ＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌＴａｘｏｎｏｍｉｃＵｎｉｔｓ）を比較し、ここでは、１個のアリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）、４個のアリスティペス・インディスティンクタス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｉｎｄｉｓｔｉｎｃｔｕｓ）、３個のアリスティペス・オンダードンキ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｏｎｄｅｒｄｏｎｋｉｉ）、２個のアリスティペス・シャヒイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｓｈａｈｉｉ）及び１個のアリスティペス・ティモネンシス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ）を含む５つのアリスティペス種に関し、その中でも、Ｏｔｕ１５５７はアリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）と同定され、信頼度は９８％であった（表２）。
検出された５種類のアリスティペス菌種のうち、ＰＦＳが６ケ月より大きいＣＲＣ患者は、αＰＤ－１併用化学療法を受けた後、腸内のアリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）、アリスティペス・ティモネンシス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ）及びアリスティペス・シャヒイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｓｈａｈｉｉ）の相対存在量が、ＰＦＳが６ケ月より小さい患者より明らかに高かった。一方、ＰＦＳが６ケ月より大きいＥＳＣＣ患者及びＣＲＣ患者は、αＰＤ－１併用化学療法を受けた後、腸内のアリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）の相対存在量が、ＰＦＳが６ケ月より小さい患者より明らかに高かった。その結果、アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）は免疫チェックポイント阻害剤に対する増強作用が他のアリスティペス菌種よりも広いスペクトルである可能性が示された。

【0128】

実施例２各活性アリスティペス菌種単独又は活性アリスティペス菌種の組み合わせによる免疫チェックポイント阻害剤に対する増強効果の比較
一、実験方法
１、実験材料
（１）マウス系統：６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス
（２）腫瘍細胞株：ラット黒色腫細胞系（Ｂ１６－ＯＶＡ、ＡＴＣＣ）、ラット結腸癌細胞系（ＭＣ３８、ＡＴＣＣ）
（３）アリスティペス菌種（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ．ｓｐ）は以下から選ばれる。
アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、ＤＳＭＮｏ．：１７２４２、Ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎ、その１６ＳｒＤＮＡ配列は配列番号１に示す）であって、略称はＡｆであり、ドイツ微生物菌種寄託センターＤＳＭＺ（ＤＳＭＺの公式サイト：http://www.dsmz.de）から購入した。
アリスティペス・シャヒイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｓｈａｈｉｉ、ＤＳＭＮｏ．：１９１２１、Ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎ）であって、略称はＡｓであり、ドイツ微生物菌種保存センターＤＳＭＺから購入した。
（４）細菌培地：処方には主にペプトン、酵母抽出物、牛肉抽出物、及びブドウ糖などが含まれ、ドイツ微生物菌種保存センターＤＳＭＺから購入した液体ＤＳＭＺ１０４培地。
（５）免疫チェックポイント阻害剤：ＰＤ－１モノクローナル抗体（αＰＤ－１）、クローン番号Ｇ４Ｃ２、試薬は上海君実生物医薬科技股フェン有限公司から贈呈。
（６）抗生物質の組み合わせ：メトロニダゾール１００ｍｇ／ｋｇ、バンコマイシン５０ｍｇ／ｋｇ、ペニシリンナトリウム１００ｍｇ／ｋｇ、ネオマイシン硫酸１００ｍｇ／ｋｇ。
２、実験群分け
実験群を表３に示す。

Ａｉｓｔｉｐｅｓ．ｓｐ＝１）Ａｆ：アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）、２）Ａｓ：アリスティペス・シャヒイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｓｈａｈｉｉ）、３）Ａｆ＋Ａｓ：アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）＋アリスティペス・シャヒイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｓｈａｈｉｉ）
３、実験のステップ（流れは図３参照）
（１）活性アリスティペス菌種の培養：アリスティペス菌種（Ａｆ、Ａｓ又はＡｆ＋Ａｓ）をＤＳＭＺ１０４液体培地に接種し、３７℃の嫌気槽で１８時間培養した後、濃度が１×１０¹⁰ＣＦＵ／ｍｌとなるまで遠心分離した。
（２）腫瘍細胞を、ＭＣ３８細胞系１×１０⁶／匹、Ｂ１６－ＯＶＡ細胞系５×１０⁵／匹で皮下に接種した。
（３）１～３日目：各群のマウスに抗生物質を胃内投与して腸内固有菌叢を除去した。
（４）それぞれ５、８、１１日目にＩｇＧ又はαＰＤ－１を２００μｇ／匹で腹腔内投与した。
（５）それぞれ５、７、９、１１、１３、１５日目に、１００μｌ／匹で胃内投与することによって活性アリスティペス菌種治療を行った。単菌Ａｆ又はＡｓ用量：１×１０⁹ＣＦＵ／匹。Ａｆ＋Ａｓ併用用量：Ａｆ：０．５×１０⁹ＣＦＵ＋Ａｓ：０．５×１０⁹ＣＦＵ／匹。
（６）それぞれ５、８、１１、１４、１７、２１日目に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積＝腫瘍幅²×腫瘍長さ／２
（７）２１日目にマウスを安楽死させ、腫瘍組織を取り出して写真を撮り、重さを量り、腸管組織についてＨＥ染色を行って、腸炎の状況を明らかにした。
マウス腫瘍体積の測定、エンドポイントでの腫瘍重量の測定、免疫組織化学評価による腫瘍組織の免疫細胞浸潤の効果評価を行った。
マウス肛門と腸管組織の切片のＨＥ染色を用いて、アリスティペス・ファインゴールディイが腸炎を引き起こすか否かを評価し、安全性の評価を行った。
フローサイトメトリーを用いて、マウスの血液中の腫瘍殺傷関連免疫細胞を検出し、系の抗腫瘍免疫反応を評価した。
二、実験結果
図４は２１日目の腫瘍である。図５は腫瘍体積の変化曲線であり、図６は腫瘍重量の統計図であり、ＭＣ３８結腸癌及びＢ１６－ＯＶＡメラノーマのマウスモデルでは、未治療群（ＩｇＧ）に対して、単剤療法群（αＰＤ－１）は明らかかつ有意（ｐ＜０．０１）な腫瘍縮小を示し、一方、単剤療法群（αＰＤ－１）に対して、活性Ａｆ併用療法群（αＰＤ－１＋Ａｆ）のみは明らかかつ有意（ｐ＜０．０１）な腫瘍縮小を示したが、活性Ａｓ併用療法群（αＰＤ－１＋Ａｓ）及び活性Ａｆ＋Ａｓ併用療法群（αＰＤ－１＋Ａｆ＋Ａｓ）は、単剤療法群（αＰＤ－１）との間には、統計学的差はなかった。
アリスティペス・ファインゴールディイがαＰＤ－１の抗腫瘍効果を増強させることが確認された。一方、アリスティペス・シャヒイ（Ａｓ）及びアリスティペス・シャヒイとアリスティペス・ファインゴールディイの組み合わせ（Ａｆ＋Ａｓ）はαＰＤ－１の抗腫瘍を増強させる効果がなかった。
これに加えて、アリスティペス・ファインゴールディイ活性菌単独治療群のマウス（ＩｇＧ＋Ａｆ）と未治療群（ＩｇＧ）では、腫瘍には差がなく、アリスティペス・ファインゴールディイの抗腫瘍作用はαＰＤ－１に依存することを示した。
図７のマウスの肛門写真及び図８の腸管組織切片のＨＥ染色から明らかなように、活性Ａｆ単独治療群（ＩｇＧ＋Ａｆ）とＡｆ併用療法群（αＰＤ－１＋Ａｆ）のいずれのマウスでも、腸炎が認められず、アリスティペス・ファインゴールディイの経腸胃投与の安全性が証明された。
図９の実験エンドポイントでのＭＣ３８マウスモデルの腫瘍組織免疫組織化学から明らかなように、活性Ａｆ併用療法群（ＩｇＧ＋Ａｆ）は、腫瘍間質領域ＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞浸潤を有意に増加できることが示され、単剤療法群（αＰＤ－１）に比べて、活性Ａｆ併用療法群（αＰＤ－１＋Ａｆ）は腫瘍間質領域ＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞浸潤を増加させる傾向を示したが、統計学的差はなかった。未治療群（ＩｇＧ）に比べて、単剤療法群（αＰＤ－１）のマウスでは、実験エンドポイントでのＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞浸潤も増加する傾向にあったが、統計学的差はなかった。この結果は、単剤療法（αＰＤ－１）と活性Ａｆ併用療法（αＰＤ－１＋Ａｆ）のマウスの腫瘍組織への免疫細胞浸潤への影響が短時間である可能性を示唆しており、実験エンドポイントの腫瘍サンプルでは有意差は検出できなかった。Ａｆ併用療法（ＩｇＧ＋Ａｆ）はマウス腫瘍組織への免疫細胞浸潤に対する影響の持続時間が長く、治療中止１週間後にもＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞浸潤が有意に上昇し、このことからも、活性アリスティペス・ファインゴールディイ単菌の経口投与による腫瘍免疫微環境の調節作用が証明された。
図１０はフローサイトメトリーによる、ＭＣ３８マウスモデルの腫瘍殺傷関連免疫細胞、すなわちグラニュラーゼ陽性ＣＤ８⁺Ｔ細胞、グラニュラーゼ陽性ＮＫ細胞及びＩＬ－６⁺好中球の存在量の検出である。その結果、活性Ａｆ併用療法群（αＰＤ－１＋Ａｆ）は、単剤療法群（αＰＤ－１）に比べて、グラニュラーゼ陽性ＣＤ８⁺Ｔ細胞、グラニュラーゼ陽性ＮＫ細胞及びＩＬ－６⁺好中球の相対存在量を有意に増加させることが示された。活性アリスティペス・ファインゴールディイとαＰＤ－１の併用は免疫系の腫瘍殺傷作用を増強させることを証明した。

【0129】

実施例３活性アリスティペス・ファインゴールディイと各免疫チェックポイント阻害剤との併用による総生存期間の延長作用
一、実験方法
１、実験材料
（１）マウス系統：６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス
（２）腫瘍細胞株：ラット黒色腫細胞系（Ｂ１６－ＯＶＡ、ＡＴＣＣ）、ラット結腸癌細胞系（ＭＣ３８、ＡＴＣＣ）
（３）アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、ＤＳＭＮｏ：１７２４２、Ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎ、その１６ＳｒＤＮＡ配列は配列番号１に示す）であって、略称はＡｆであり、ＤＳＭＺドイツ国家培養物寄託センターから購入した。
（４）細菌培地：処方には主にペプトン、酵母抽出物、牛肉抽出物及びブドウ糖などが含まれ、ＤＳＭＺドイツ国家培養物保存センターから購入した液体ＤＳＭＺ１０４培地。
（５）免疫チェックポイント阻害剤：ＰＤ－１モノクローナル抗体（αＰＤ－１）、クローン番号Ｇ４Ｃ２、試薬は上海君実生物医薬科技股フェン有限公司から贈呈。ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体（αＣＴＬＡ４）、クローン番号９Ｄ９、米国ＢｉｏＸｃｅｌｌから購入した。
（６）抗生物質の組み合わせ：メトロニダゾール１００ｍｇ／ｋｇ、バンコマイシン５０ｍｇ／ｋｇ、ペニシリンナトリウム１００ｍｇ／ｋｇ、ネオマイシン硫酸１００ｍｇ／ｋｇ。
２、実験群分け
実験群を表４に示す。

３、実験のステップ
（１）活性アリスティペス・ファインゴールディイの培養：アリスティペス・ファインゴールディイをＤＳＭＺ１０４液体培地に接種し、３７℃の嫌気槽で１８時間培養した後、濃度が１×１０¹⁰ＣＦＵ／ｍｌとなるまで遠心分離した。
（２）腫瘍細胞を、ＭＣ３８細胞系１×１０⁶／匹、Ｂ１６－ＯＶＡ細胞系５×１０⁵／匹で皮下に接種した。
（３）１～３日目：各群のマウスに抗生物質を胃内投与して腸内固有菌叢を除去した。
（４）５日目から３日ごとにＩｇＧ又はαＰＤ－１又はαＣＴＬＡ４を２００μｇ／匹で腹腔内投与した。
（５）５日目から２日ごとに、低用量群（ｌｏｗ）は１００μｌ／匹、１×１０⁹ＣＦＵ／匹、中用量群（ｍｅｄｉｕｍ）は２００μｌ／匹、２×１０⁹ＣＦＵ／匹、高用量群（ｈｉｇｈ）は４００μｌ／匹、４×１０⁹ＣＦＵ／匹のように、各用量のアリスティペス・ファインゴールディイ治療を胃内投与により行った。
（６）５日目から３日ごとに腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積＝腫瘍幅²×腫瘍長さ／２
（７）治療周期としてマウスの腫瘍が体積（２０００ｍｍ³）に成長すると、マウスを安楽死させるか、マウスが腫瘍の理倫体積に達しないで自然死した。
（８）各マウスの死亡状態と時間を記録し、生存曲線図を作成した。
二、実験結果
図１１はマウスの生存曲線であり、ＭＣ３８結腸癌及びＢ１６－ＯＶＡメラノーマのマウスモデルでは、免疫チェックポイント阻害剤単剤群（αＰＤ－１）に対して、アリスティペス・ファインゴールディイ高用量（ｈｉｇｈ）、中用量（ｍｅｄｉｕｍ）及び低用量（ｌｏｗ）併用療法群（αＰＤ－１＋Ａｆ）はいずれも担癌マウスの総生存期間を有意に増加させることができた。Ｂ１６－ＯＶＡメラノーママウスモデルでは、アリスティペス・ファインゴールディイはαＣＴＬＡ４免疫チェックポイント阻害剤に対する治療効果促進作用を示し、αＣＴＬＡ４と高用量（ｈｉｇｈ）、中用量（ｍｅｄｉｕｍ）及び低用量（ｌｏｗ）のアリスティペス・ファインゴールディイとの併用は、いずれも担癌マウスの総生存期間を有意に増加させた。一方、ＭＣ３８結腸癌マウスモデルでは、αＣＴＬＡ４免疫チェックポイント阻害剤の薬効作用が強すぎるため、アリスティペス・ファインゴールディイのαＣＴＬＡ４に対する効果増強作用は観察されなかった。

【0130】

実施例４活性及び不活性全細胞アリスティペス・ファインゴールディイと免疫チェックポイント阻害剤との併用による腸癌の治療
一、実験方法
１、実験材料
（１）マウス系統：６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス
（２）腫瘍細胞株：マウス結腸癌細胞系（ＭＣ３８、ＡＴＣＣ）
（３）菌株情報：アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、ＤＳＭＮｏ．：１７２４２、Ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎ、その１６ＳｒＤＮＡ配列は配列番号１に示す）であって、略称はＡｆであり、ドイツ微生物菌種保存センターＤＳＭＺから購入した（ＤＳＭＺの公式サイト：http://www.dsmz.de）。
（４）培地成分：処方には主にペプトン、酵母抽出物、牛肉抽出物及びブドウ糖などが含まれ、ＤＳＭＺドイツ国家培養物保存センターから購入した液体ＤＳＭＺ１０４培地。
（５）免疫チェックポイント阻害剤：ＰＤ－１モノクローナル抗体（αＰＤ－１）、クローン番号Ｇ４Ｃ２、試薬は上海君実生物医薬科技股フェン有限公司から贈呈。
（６）抗生物質の組み合わせ：メトロニダゾール１００ｍｇ／ｋｇ、バンコマイシン５０ｍｇ／ｋｇ、ペニシリンナトリウム１００ｍｇ／ｋｇ、硫酸ネオマイシン１００ｍｇ／ｋｇ。
２、実験群分け
実験群を表５に示す。

注：Ａｆはアリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）
３、実験のステップ（流れは図１２参照）
（１）活性Ａｆ（Ａｆ）の調製：アリスティペス・ファインゴールディイをＤＳＭＺ１０４液体培地に接種し、３７℃の嫌気槽で１８時間培養した後、濃度が１×１０¹⁰ＣＦＵ／ｍｌとなるまで遠心分離した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で菌体を３回洗浄して濃縮し、培地の残留物を洗浄した。
（２）不活性全細胞Ａｆ（熱不活化、Ａｆ＿ｈｅａｔｋｉｌｌｅｄ）の調製：リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて、（１）で調製した菌体を洗浄して濃縮し、９５℃の高温で菌体を５分間加熱した。
（３）腫瘍細胞の皮下接種：ＭＣ３８細胞系１×１０⁶／匹。
（４）抗生物質処理：各群のマウスに抗生物質を胃内投与して腸内固有菌群を除去し、７日間処理した。
（５）群別の治療：それぞれ６、９、１２日目にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）又はαＰＤ－１を２００μｇ／匹で腹腔内注射した。５、７、９、１１、１３日目に、１００μｌ／匹、１×１０⁹ＣＦＵ／匹で胃内投与することにより活性Ａｆ治療を行うか、又は経口投与により不活性全細胞Ａｆ治療を行った。それぞれ０日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１３日目、１６日目、１９日目、２２日目、２５日目に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を算出した。
（６）腫瘍体積を測定する計算式
腫瘍体積＝腫瘍幅²×腫瘍長さ／２
（７）エンドポイント（２５日目）でマウスの腸内容物を採取し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングを用いてマウスの腸内細菌叢の組成を解析し、活性Ａｆと不活性全細胞Ａｆを用いた腸癌治療がマウスの腸内細菌叢に与える影響を比較した。
二、実験結果
図１３は活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆの電子顕微鏡写真の比較図であり、不活性全細胞処理では、Ａｆ細胞の全細胞完全性が保持され、不活性全細胞Ａｆが抗腫瘍効果を発揮する成分は全細胞成分から由来することがわかった。
図１４は活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆを用いた結腸癌治療における腫瘍体積の変化曲線であり、腫瘍体積変化の比較から見ると、ＭＣ３８結腸癌では、未治療群（ＰＢＳ）に対して、単剤免疫チェックポイント阻害剤群（αＰＤ－１）は有意（ｐ＝０．０５５）な腫瘍縮小を示さなかったことから、本実施例では、結腸癌は単剤αＰＤ－１治療に耐性であり、一方、αＰＤ－１と活性Ａｆ又は不活性全細胞Ａｆとを併用して治療すると、いずれも有意（＊＊＊：ｐ＜０．００１）に単剤αＰＤ－１群よりも優れた腫瘍縮小を示した。活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆと免疫チェックポイント阻害剤とを併用した２群の治療効果を比較すると、不活性全細胞Ａｆ併用αＰＤ－１は有意（＊：ｐ＜０．０５）に活性Ａｆ併用αＰＤ－１よりも腫瘍縮小が優れていた。
以上の結果により、活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆはいずれも免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果を増強できることが証明された。単剤αＰＤ－１の治療効果が悪いか薬剤耐性がある場合、αＰＤ－１を活性Ａｆ又は不活性全細胞Ａｆのいずれと併用しても、結腸癌の単剤αＰＤ－１治療に対する薬剤耐性を逆転することができ、そのため、活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆはいずれも免疫チェックポイント阻害剤の難治性腫瘍を治療、減少、抑制又は制御する効力があり、しかも、不活性全細胞Ａｆの抗腫瘍効果は活性Ａｆの抗腫瘍効果より優れていた。
図１５に活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆを用いた結腸癌治療における腸内細菌叢のβ－多様性ＰＣｏＡ（ｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏ－ｏｒｄｉｎａｔｅｓａｎａｌｙｓｉｓ）の主座標解析である。ここで、腸内細菌叢のβ多様性は異なる腸内環境間の腸内環境全体の細菌の組成の差を指し、２群間の統計学的差の測定には、置換検定とランク和検定に基づく非パラメトリック検定法であるＡｎｏｓｉｍ分析法（Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ）を用い、群間の差が群内の差よりも有意に大きいか否かを検証し、群分けが有意であるか否かを判断した。このＡｎｏｓｉｍ方法は主に２つの数値結果がある。１つはＲであり、その範囲は（－１,１）であり、異なる群間に差があるか否かを判断するために用いられ、Ｒ＞０は群間の差が群内の差より大きいことを示し、Ｒ＜０は群間の差が群内の差より小さいことを示し、Ｒの値が１に近いほど群間の差が大きいことを示し、もう１つは、群間に有意差があるか否かを示すｐである。
その結果、活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆを用いた結腸癌治療における腸内細菌叢のβ多様性には有意に大きな差（Ｒ＝０．６９５０、ｐ＝０．００１）が認められた。活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆを用いて結腸癌を治療することにより、腸内細菌叢全体の組成には明らかで大きな差が存在し、さらに腸粘膜免疫状態の大きな差が生じることが証明された。したがって、実施例５では、不活性全細胞Ａｆ及び活性Ａｆの抗腫瘍効果の差は、腸内細菌叢構造への再構築作用の差につながる可能性があり、すなわち、不活性全細胞ＡｆとαＰＤ－１を併用して結腸癌を治療した場合、再構築された腸内細菌叢構造は、増強された抗腫瘍免疫機能と関連している。
図１６は、活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆを用いた結腸癌治療における腸内細菌叢の属レベルの組成の違いを比較したものである。図１７は、活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆを用いた結腸癌治療における腸内細菌叢の相対存在量上位２０細菌属を比較したＷｉｌｃｏｘｏｎｒａｎｋ－ｓｕｍｔｅｓｔ（ウィルコクソンの順位和検定）の統計学的差分析である。
その結果、活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆを用いた結腸癌治療の間で腸内細菌叢の相対存在量上位２０細菌属のうち、８個の菌属に有意な統計学的差が認められた。それらのうち、差が最も大きいのはバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）であり、活性Ａｆを用いた治療群では、バクテロイデス属の相対存在量は不活性Ａｆ治療群より明らかに高く、もう１つの際立った違いはデスルフィ・ビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）であり、この菌属は不活性全細胞併用療法群（αＰＤ－１＋Ａｆ＿ｈｅａｔｋｉｌｌｅｄ）にのみ存在する。一方、Ａｆに属するアリスティペス属（Ａｉｓｔｉｐｅｓ）は活性併用療法群では相対存在量が不活性全細胞併用療法群より有意に（ｐ＝０．０１５６）高かった。活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆを用いて結腸癌を治療することにより、腸内細菌叢の属レベルの組成に顕著な差が存在し、さらに差のある腸粘膜免疫状態が生じることが証明された。したがって、実施例４では、活性全細胞Ａｆと不活性全細胞Ａｆとの抗腫瘍効果の差は、腸内の特定の細菌属に対する特異的な富化又は成長の弱化と関連しており、さらに、差のある腸粘膜免疫状態を形成し、差のある抗腫瘍免疫監視を刺激した。

【0131】

実施例５活性及び不活性全細胞アリスティペス・ファインゴールディイと免疫チェックポイント阻害剤との併用投与による肺癌の治療
一、実験方法
１、実験材料
（１）マウス系統：６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス
（２）腫瘍細胞株：マウス肺癌細胞系（ＬＬＣ、ＡＴＣＣ）
（３）Ａｆ菌株情報：アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ、ＤＳＭＮｏ．：１７２４２、Ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎ、その１６ＳｒＤＮＡ配列は配列番号１に示す）、ドイツ微生物菌株寄託センターＤＳＭＺ（ＤＳＭＺの公式サイト：http://www.dsmz.de）から購入した。
（４）培地成分：処方には主にペプトン、酵母抽出物、牛肉抽出物及びブドウ糖などが含まれ、ＤＳＭＺドイツ国家培養物保存センターから購入した液体ＤＳＭＺ１０４培地。
（５）免疫チェックポイント阻害剤：ＰＤ－１モノクローナル抗体（αＰＤ－１）、クローン番号Ｇ４Ｃ２、試薬は上海君実生物医薬科技股フェン有限公司から贈呈。
（６）抗生物質の組み合わせ：メトロニダゾール１００ｍｇ／ｋｇ、バンコマイシン５０ｍｇ／ｋｇ、ペニシリンナトリウム１００ｍｇ／ｋｇ、硫酸ネオマイシン１００ｍｇ／ｋｇ。
２、実験群分け
実験群を表６に示す。

３、実験のステップ（流れは図１８参照）
（１）活性Ａｆ（Ａｆ）の調製：アリスティペス・ファインゴールディイをＤＳＭＺ１０４液体培地に接種し、３７℃の嫌気槽で１８時間培養した後、濃度が１×１０¹⁰ＣＦＵ／ｍｌとなるまで遠心分離した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で菌体を３回洗浄して濃縮し、培地の残留物を洗浄した。
（２）不活性全細胞Ａｆ（熱不活化、Ａｆ＿ｈｅａｔｋｉｌｌｅｄ）の調製：リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて、（１）で調製した菌体を洗浄して濃縮し、９５℃の高温で菌体を５分間加熱した。
（３）腫瘍細胞の皮下接種：ＬＬＣ細胞系１×１０⁶／匹。
（４）抗生物質処理：各群のマウスに抗生物質を胃内投与して腸内固有菌群を除去し、７日間処理した。
（５）群別の治療：それぞれ６、９、１２、１５日目にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）又はαＰＤ－１を１５０μｇ／匹で腹腔内注射した。それぞれ５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９日目に活性Ａｆ又は不活性全細胞Ａｆを、１００μｌ／匹、１×１０⁹ＣＦＵ／匹で胃内投与した。それぞれ０日目、５日目、７日目、１０日目、１３日目、１６日目、１９日目、２２日目、２５日目、２８日目に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を算出した。
（６）腫瘍体積を測定する計算式
腫瘍体積＝腫瘍幅²×腫瘍長さ／２
（７）エンドポイント（２８日目）で腫瘍重量を測定し、群別に統計を行った。
二、実験結果
図１９は、活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆを用いたＬＬＣマウス肺癌モデルの治療における腫瘍体積変化である。未治療群（ＰＢＳ）に対して、単剤免疫チェックポイント阻害剤群（αＰＤ－１）は有意（ｎｓ：ｐ＞０．０５）な腫瘍縮小を示さず、本実施例では、単剤免疫チェックポイント阻害剤群（αＰＤ－１）はＬＬＣマウス肺癌モデルでは治療効果が悪く、単剤αＰＤ－１治療に耐性があることを示しており、αＰＤ－１と活性Ａｆ（αＰＤ－１＋Ａｆ）又はαＰＤ－１と不活性全細胞Ａｆ（αＰＤ－１＋Ａｆ＿ｈｅａｔｋｉｌｌｅｄ）を併用して治療を行うと、いずれも有意（αＰＤ－１＋Ａｆ：＊＊ｐ＜０．０１；αＰＤ－１＋Ａｆ＿ｈｅａｔｋｉｌｌｅｄ：＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）に未治療群（ＰＢＳ）より優れた腫瘍縮小を示しており、単剤免疫チェックポイント阻害剤群（αＰＤ－１）を比較して、αＰＤ－１と活性Ａｆ（αＰＤ－１＋Ａｆ）又はαＰＤ－１と不活性全細胞Ａｆ（αＰＤ－１＋Ａｆ＿ｈｅａｔｋｉｌｌｅｄ）を併用した群は、いずれも有意（αＰＤ－１＋Ａｆ：＊ｐ＜０．０５；αＰＤ－１＋Ａｆ＿ｈｅａｔｋｉｌｌｅｄ：＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）に単剤αＰＤ－１より優れた腫瘍治療効果を示しており、活性Ａｆ併用αＰＤ－１（αＰＤ－１＋Ａｆ）と不活性全細胞Ａｆ併用αＰＤ－１（αＰＤ－１＋Ａｆ＿ｈｅａｔｋｉｌｌｅｄ）の治療効果を比較すると、不活性全細胞Ａｆは活性Ａｆよりも治療効果が優れる傾向があったが、統計学的差はなかった（ｎｓ：ｐ＞０．０５）。
図２０は、活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆを用いたＬＬＣマウスの肺癌の治療における、エンドポイント時点（２８日目）での肺癌腫瘍重量の統計図である。実験のエンドポイントでの腫瘍重量から分かるように、未治療群（ＰＢＳ）に対して、単剤免疫チェックポイント阻害剤群（αＰＤ－１）は有意な（ｎｓ：ｐ＞０．０５）腫瘍縮小を示さなかった。αＰＤ－１薬剤併用活性Ａｆは単剤αＰＤ－１より有意（ｎｓ：ｐ＞０．０５）に優れた治療効果を示さなかったが、不活性全細胞Ａｆ併用αＰＤ－１薬剤による治療は有意（＊＊ｐ＜０．０１）に単剤αＰＤ－１より優れた治療治療効果を示した。活性Ａｆ併用αＰＤ－１と不活性全細胞Ａｆ併用αＰＤ－１の治療効果を比較すると、不活性全細胞Ａｆ群では、平均重量は活性Ａｆ群の平均重量より低かった。その結果、活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆは免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果を増強できることを証明した。単剤αＰＤ－１の治療効果が悪い又は薬剤耐性がある場合、αＰＤ－１を活性Ａｆ又は不活性全細胞Ａｆと併用すると、肺癌の単剤αＰＤ－１治療に対する薬剤耐性を逆転できるため、活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆは、いずれも、免疫チェックポイント阻害剤の難治性腫瘍を治療、減少、抑制又は制御する効力があり、しかも、不活性全細胞Ａｆの抗腫瘍効果は活性Ａｆの抗腫瘍効果より優れていた。
図２１は活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆを用いた肺癌治療の実験エンドポイントでの腫瘍写真であるが、ＬＬＣマウス肺癌モデルにおいて、活性併用療法群（αＰＤ－１＋Ａｆ）及び不活性全細胞併用療法群（αＰＤ－１＋Ａｆ＿ｈｅａｔｋｉｌｌｅｄ）の２群では、それぞれ腫瘍が完全に消失したマウスが１例出現した。活性Ａｆ及び不活性全細胞Ａｆはいずれも免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果を増強させることが証明された。

【0132】

実施例６健常人の腸内及び他の身体部位におけるアリスティペス・ファインゴールディイの相対存在量の分析
１．実施方法及びステップ
（１）オリジナルなマクロゲノムデータ由来：米国立衛生研究所（ＮＩＨ：ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）のヒト細菌叢計画プロジェクトのパブリックデータリソースを用いたマクロゲノム解析データ（ＨｕｍａｎＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔ，ＨＭＰ，https://www.hmpdacc.org/)。
（２）細菌の分類及び菌株レベルの同定分析ソフト：ＭｅｔａＰｈｌＡｎ２及びＳｔｒａｉｎＰｈｌＡｎ (https://github.com/biobakery/metaphlan2,https://github.com/biobakery/metaphlan)。ＭｅｔａＭｅｔａＰｈｌＡｎ２とＳｔｒａｉｎＰｈｌＡｎを併用することにより、マクロゲノムデータを菌株レベルで同定・分析することができる。両方のソフトウェアを使用する場合は、デフォルト設定を使用する。
（３）（２）から菌株の相対存在量（全微生物集団に対するある菌株の割合）を得た後、身体の異なる部位におけるＡｆの存在量を可視化して分析する。
二、実施結果
図２２は健常人の腸管及び他の身体部位におけるＡｆの相対存在量である。健常人の４つの身体部位（そのうち、５５３個の腸サンプル、１２５９個の口腔サンプル、３０９個の皮膚サンプル、２３４個の膣サンプル）に由来する２３３５個のサンプルに対して分析を行った結果、Ａｆは主に腸サンプルに存在し、腸では陽性検出率は７３．６％（４０７／５５３）であった。一方、Ａｆの検出率は、口腔、皮膚、膣の各サンプルでは、それぞれ１．４％（１８／１２５９）、１．９％（６／３０９）、１．７％（４／２３４）であった。Ａｆ陽性の腸内サンプル４０７例では、Ａｆの相対存在量の範囲は０．００００６％～９．０％であった。最新の腸内細菌数推定データによれば、体重７０ｋｇの健常な成人男性の腸内に含まれる全細菌数は約３．８＊１０¹³個であり、ＨＭＰデータベースによれば、健常者の腸内のＡｆ数は約１０⁶～１０¹³(Sender, Fuchs et al. 2016)であった。従って、Ａｆは人体に固有の共生腸内細菌であり、主に腸内に定植し、人体との相互作用があり、かつ、Ａｆの相対存在量は一部の人群において優勢な菌種（総腸内細菌叢数に占める割合が１％より大きい菌種と定義される）の地位にあり、本発明のＡｆ及び投与量が１０⁵～１０¹²である場合は、安全性が確保されることを証明した。

【0133】

実施例７健常者及び他の疾患罹患者の腸内におけるアリスティペス・ファインゴールディイの相対存在量の分析
一、実験方法
４つのヒト腸マクロゲノムデータセットを分析し、ここでは、計１３９６個のヒト糞便サンプルが含まれ、９種類の異なるタイプの人々に及んだ。マクロゲノムシーケンシング技術は、ヒトの腸内細菌種レベルの同定の精度に達することができる。
９種類の異なるタイプの集団は、１）健常な成人、２）結腸直腸腺腫患者、３）大腸癌患者、４）大腸癌術後患者、５）アテローム性動脈硬化性疾患患者、６）免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を受ける前の非小細胞肺癌患者、７）免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を受けた後の非小細胞肺癌患者、８）免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を受ける前の腎臓癌患者、９）免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）を受けた後の腎臓癌患者を含む。
データセットの詳細を表７に示す。

二、実験結果
図２３及び表８の結果によると、アリスティペス・ファインゴールディイ（Ａｆ）はそれぞれの集団に存在し、その相対存在量は０．００１～０．０７％であり、Ａｆの相対存在量は集団によって差があり、ここでは、相対存在量とは、腸内細菌の全菌種に占める特定の菌種の割合である。ヒト腸に含まれている全細菌種の数が約１０¹⁴ＣＦＵ／ｍｌであるとすれば、これらの群のヒトの腸内では、Ａｆは約１０⁹ＣＦＵ／ｍｌ～１０¹⁰ＣＦＵ／ｍｌであった。

【0134】

なお、以上の実施例は、本発明の技術的解決手段を説明するためにのみ使用され、本発明の特許範囲を限定するものではなく、当業者にとっては、上記の説明及び考え方に基づいて、他のさまざまな形態の変化又は変更を行うことも可能であり、本明細書では、全ての実施形態を網羅する必要はなく、また、これらの実施形態を網羅することもできない。本発明の精神及び原則の範囲内で行われた修正、均等置換や改良などは、全て本発明のクレームの特許範囲に含まれるものとする。

【0135】

（参考文献）
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6. Routy B, L. C. E., Derosa L, Duong CPM, Alou MT, Daillere R, Fluckiger A, Messaoudene M, Rauber C, Roberti MP, Fidelle M, Flament C, Poirier-Colame V, Opolon P, Klein C, Iribarren K, Mondragon L, Jacquelot N, Qu B, Ferrere G, Clemenson C, Mezquita L, Masip JR, Naltet C, Brosseau S, Kaderbhai C, Richard C, Rizvi H, Levenez F, Galleron N, Quinquis B, Pons N, Ryffel B, Minard-Colin V, Gonin P, Soria JC, Deutsch E, Loriot Y, Ghiringhelli F, Zalcman G, Goldwasser F, Escudier B, Hellmann MD, Eggermont A, Raoult D, Albiges L, Kroemer G, Zitvogel L (2018). "Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors." Sciense 5(359(6371)): 7.
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【図1】