特表 2023-540052 遺伝子構築物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-21

(54)【発明の名称】遺伝子構築物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20230913BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230913BHJP

   C07K 14/005 20060101ALI20230913BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20230913BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230913BHJP

   C12N 15/33 20060101ALI20230913BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20230913BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230913BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230913BHJP

   C12Q 1/6886 20180101ALI20230913BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20230913BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230913BHJP

   A61K 51/04 20060101ALI20230913BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230913BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230913BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/113 Z

C07K14/005

C07K14/435

C07K19/00

C12N15/33

C12N15/55

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12Q1/6886 Z

A61K31/7105

A61K48/00

A61K51/04 320

A61P35/00

A61P35/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023513671

(86)(22)【出願日】2021-08-25

(85)【翻訳文提出日】2023-04-21

(86)【国際出願番号】 PT2021050028

(87)【国際公開番号】W WO2022045912

(87)【国際公開日】2022-03-03

(31)【優先権主張番号】2013466.4

(32)【優先日】2020-08-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】511115734

【氏名又は名称】インスティテュート デ メディシナ モレキュラー ジョアオ ロボ アントゥネス

【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｊｏａｏ Ｌｏｂｏ Ａｎｔｕｎｅｓ

【住所又は居所原語表記】Ｆａｃｕｌｄａｄｅ ｄｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄｅ ｄｅ Ｌｉｓｂｏａ， Ａｖｅｎｉｄａ ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｅｇａｓ Ｍｏｎｉｚ，１６４９－０２８ Ｌｉｓｂｏｎ，Ｐｏｒｔｕｇｕｅｓｅ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100187540

【弁理士】

【氏名又は名称】國枝 由紀子

(72)【発明者】

【氏名】フラゴーソ，アナ・リタ・フレータス・マルチンス・デ・マトス

(72)【発明者】

【氏名】バラータ，ジョアン・ペドロ・タボルダ

【テーマコード（参考）】

4B063

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX02

4C084AA13

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB27

4C085HH03

4C085HH07

4C085HH11

4C085KB91

4C085LL18

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZB27

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA01

4H045CA40

4H045DA89

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ標的部位を含む遺伝子構築物、およびそのような構築物を含むベクターに関する。遺伝子構築物およびベクターは、がん、例えばＴ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）を含む、様々な障害の診断および治療に使用され得る。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）治療上活性な分子またはレポーター分子をコードする第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターであって、第１の核酸配列は少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的部位を含む、第１のプロモーター、ならびに
（ｉｉ）第１のプロモーターの阻害剤および／または治療上活性な分子もしくはレポーター分子をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結された第２のプロモーターであって、第２の核酸配列は少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位を含み、第１および第２の核酸配列の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は異なる、第２のプロモーター、
を含む遺伝子構築物。

【請求項2】

第２の核酸配列の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位が、第１の核酸配列の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位を標的とすることができるｍｉＲＮＡと異なるｍｉＲＮＡの標的部位である、請求項１に記載の遺伝子構築物。

【請求項3】

第１の核酸配列が、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位もしくはｍｉＲＮＡ標的部位の種、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的部位もしくはｍｉＲＮＡ標的部位の種、少なくとも３つのｍｉＲＮＡ標的部位もしくはｍｉＲＮＡ標的部位の種、少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的部位もしくはｍｉＲＮＡ標的部位の種、または少なくとも５つのｍｉＲＮＡ標的部位もしくはｍｉＲＮＡ標的部位の種を含み、
場合により、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも１つのコピー、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも２つのコピー、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも３つのコピー、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも４つのコピー、またはそれぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも５つのコピー、またはｍｉＲＮＡ標的部位の種が存在する、
請求項１または請求項２のいずれかに記載の遺伝子構築物。

【請求項4】

第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位が、疾患細胞で発現されないｍｉＲＮＡの標的部位である、請求項１から３のいずれかに記載の遺伝子構築物。

【請求項5】

疾患細胞ががん細胞であり、場合により疾患細胞がＴ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）細胞である、請求項４に記載の遺伝子構築物。

【請求項6】

第２の核酸配列が、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位もしくはｍｉＲＮＡ標的部位の種、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的部位もしくはｍｉＲＮＡ標的部位の種、少なくとも３つのｍｉＲＮＡ標的部位もしくはｍｉＲＮＡ標的部位の種、少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的部位もしくはｍｉＲＮＡ標的部位の種、または少なくとも５つのｍｉＲＮＡ標的部位もしくはｍｉＲＮＡ標的部位の種を含み、
場合により、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも１つのコピー、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも２つのコピー、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも３つのコピー、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも４つのコピー、またはそれぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも５つのコピー、またはｍｉＲＮＡ標的部位の種が存在する、
請求項１から５のいずれかに記載の遺伝子構築物。

【請求項7】

第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位が、疾患細胞で発現されるｍｉＲＮＡの標的部位である、請求項１から６のいずれかに記載の遺伝子構築物。

【請求項8】

レポーター分子が、光学レポーター、核医学レポーター、またはＭＲＩレポーターである、請求項１から７のいずれかに記載の遺伝子構築物。

【請求項9】

治療上活性な分子が治療用タンパク質および／または核酸である、請求項１から８のいずれかに記載の遺伝子構築物。

【請求項10】

核酸がＤＮＡ、ＲＮＡまたはキメラＤＮＡ／ＲＮＡ分子である、請求項９に記載の遺伝子構築物。

【請求項11】

治療用タンパク質が、エンドヌクレアーゼ、キメラ抗原受容体、ウイルスタンパク質およびアポトーシス駆動タンパク質からなる群から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。

【請求項12】

治療用タンパク質が、Ｂａｘ、Ａｐｏｐｔｉｎ、Ｅ４ｏｒｆ４およびＢｉｍからなる群から選択されるアポトーシス駆動タンパク質である、請求項１１に記載の遺伝子構築物。

【請求項13】

治療用タンパク質がＢａｘであり、配列番号１６に実質的に記載されているようなアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なバリアントもしくは断片、を含むまたはそれらからなる、請求項１２に記載の遺伝子構築物。

【請求項14】

治療用タンパク質がＡｐｏｐｔｉｎであり、配列番号１８に実質的に記載されているようなアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる、請求項１２に記載の遺伝子構築物。

【請求項15】

治療用タンパク質がＥ４ｏｒｆ４であり、配列番号２０に実質的に記載されているような配列、またはその生物学的に活性なバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる、請求項１２に記載の遺伝子構築物。

【請求項16】

治療用タンパク質がＢｉｍであり、配列番号２５に実質的に記載されているような配列、またはその生物学的に活性なバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる、請求項１２に記載の遺伝子構築物。

【請求項17】

第２のプロモーターが、第１のプロモーターに対して構築物中で反対方向に配置される、請求項１から１６のいずれかに記載の遺伝子構築物。

【請求項18】

第２の核酸配列によってコードされる阻害剤が第１のプロモーターの阻害剤であり、第１のプロモーターの阻害剤がＬａｃオペロンであり、第２の核酸配列がＬａｃリプレッサーを含み、および第１のプロモーターがＬａｃオペレーター制御因子部位を含む、請求項１から１７のいずれかに記載の遺伝子構築物。

【請求項19】

遺伝子構築物が、配列番号５、２２から２４、２７、もしくは７８から８２のいずれか１つに実質的に記載されているような核酸配列、またはその断片もしくはバリアントを含む、請求項１から１８のいずれかに記載の遺伝子構築物。

【請求項20】

請求項１から１９のいずれかに記載の遺伝子構築物を含む、組換えベクター。

【請求項21】

治療に使用するための、請求項１から１９のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、または請求項２０に記載のベクター。

【請求項22】

がんの処置、予防または改善に使用するための、請求項１から１９のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、または請求項２０に記載のベクター。

【請求項23】

請求項１から１９のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、または請求項２０に記載のベクター、および場合により薬学的に許容されるビヒクル、を含む医薬組成物。

【請求項24】

診断に使用するための、請求項１から１９のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、または請求項２０に記載のベクター。

【請求項25】

がんの診断に使用するための、請求項１から１９のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、または請求項２０に記載のベクター。

【請求項26】

診断または予知の方法であって、対象から得られた試料において、請求項１から１９のいずれか一項に記載の遺伝子構築物のレポーター分子、または請求項２０に記載のベクターを検出するステップを含む方法。

【請求項27】

対象のがんを診断または予知する方法であって、対象から得られた試料において、請求項１から１９のいずれか一項に記載の遺伝子構築物のレポーター分子、または請求項２０に記載のベクターを検出するステップを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子構築物およびベクターに関する。本発明は、遺伝子構築物およびベクターを含む医薬組成物、ならびに診断および治療において遺伝子構築物およびベクターを使用する方法にも及ぶ。本発明は、特に、排他的ではないが、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）の診断および治療に関する。

【背景技術】

【0002】

ここ数十年の間に、様々な障害の分子生物学的な知識と理解が著しく深まった。このため、がんなどの状態の治療や診断において、遺伝子に基づくアプローチの利用が増加し、より正確な状態の処置が可能になるとともに、診断の特異度が高まり、通常では発見されないような疾患のサブセットの同定が可能になった。

【0003】

がん研究の熱心な取り組みにより、がん発症のメカニズムがより深く理解されるようになった。その結果、がん治療に対する考え方が変わり、標的特異的な薬剤の探索と開発が行われるようになった（１）。しかしながら、このような変化にもかかわらず、がん患者は依然として非特異的な細胞傷害性薬剤によって処置されることが主流である。がんドライバーの多くが知られているにもかかわらず、これらの遺伝子を標的とすることは非常に困難であった。これらの遺伝子の多くが正常な組織において重要な機能を有していることを考えると、正常な細胞に大きな毒性を与えることなく、これらの遺伝子を標的とすることは困難である。そのため、代替治療法の開発が急務となっている。

【0004】

Ｔ－ＡＬＬは、中枢神経系への浸潤など予後不良因子を伴うことが多い攻撃的な血液系悪性腫瘍である。Ｔ－ＡＬＬは、小児および成人の急性リンパ性白血病のそれぞれ１５％および２５％を占め（２）、Ｔ－ＡＬＬ患者の転帰は近年改善されているものの、耐性または再発した疾患を有する患者の予後は依然として非常に不良である（３、４）。現在、既存の治療法では奏効率が低く、毒性も高いことから、より特異的で効果的な治療戦略を開発する必要性が強調されている（３）。

【0005】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、２２ヌクレオチド程度の小さな非コードＲＮＡであり、通常は標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにある相補的な配列に結合することにより（６）、遺伝子発現を転写後に調節する（５）（図１参照）。マイクロＲＮＡは、いくつかの生物学的プロセスだけでなく、がんを含むヒトの疾患も制御している（５）。さらに機能研究は、マイクロＲＮＡが腫瘍抑制因子またはがん遺伝子として作用し、腫瘍形成に関与することを示している（７）。

【0006】

重要なことに、プロファイリング研究は、いくつかのマイクロＲＮＡが組織／細胞特異的に発現されることを示している（８、９）。このような組織／細胞型に特異的なマイクロＲＮＡの発現を利用して、導入遺伝子発現をネガティブに制御することが行われている。特定のマイクロＲＮＡによって認識される人工的な配列を導入遺伝子に付加することで、その転写後サイレンシングを誘導する。この概念はＢｒｏｗｎらによって初めて開発された（１０）。造血細胞特異的なマイクロＲＮＡの標的配列を組み込んだ導入遺伝子発現レンチウイルスベクターを構築することで、非造血細胞での導入遺伝子の発現を可能にし、造血系での発現を抑制するシステムを構築した。最近、この戦略は、治療用遺伝子導入のためのさまざまな疾患状況で検討されている（１１～１３）。

【0007】

がんにおいても、マイクロＲＮＡの発現プロファイルは、腫瘍と正常細胞を区別し、異なる発生起源と分化状態を有する腫瘍を識別することが示されている（８、９、１４、１５）。そのため、本発明者らは、Ｔ－ＡＬＬ特異的マイクロＲＮＡ発現プロファイルを利用することに着手し、いわゆるマイクロＲＮＡ「検出器システム」として動作する組換え遺伝子構築物を開発した。この遺伝子構築物は、第一に、マイクロＲＮＡプロファイルを用いて、患者におけるがん性または腫瘍性のＴ－ＡＬＬ細胞を同定し、白血病細胞を患者の正常な健康細胞と区別することができ、第二に、健康細胞ではなくＴ－ＡＬＬ細胞のみにおける治療用遺伝子（例えば、腫瘍細胞死を引き起こすタンパク質をコードするアポトーシス誘導遺伝子）またはマーカー遺伝子（例えば、タンパク質マーカーをコードするレポーター遺伝子）の発現を調節することができる。

【発明の概要】

【0008】

したがって、本発明の第１の態様では、
（ｉ）治療上活性な分子またはレポーター分子をコードする第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターであって、第１の核酸配列は少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的部位を含む、第１のプロモーター、ならびに
（ｉｉ）第１のプロモーターの阻害剤および／または治療上活性な分子もしくはレポーター分子をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結された第２のプロモーターであって、第２の核酸配列は少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位を含み、第１および第２の核酸配列の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は異なる、第２のプロモーター、
を含む遺伝子構築物が提供される。

【0009】

有利なことに、本発明の構築物は、腫瘍の状況において、患者の不健康な細胞を標的として殺すために、特異的な所定のマイクロＲＮＡプロファイルを利用する。患者の細胞内で発現させた場合、構築物はその細胞が不健康な細胞であるかどうかを決定し、この場合細胞死を誘導する、またはその細胞が健康な細胞であるかどうかを決定し、この場合細胞死を誘導しない。したがって、不健康な細胞内での特定のマイクロＲＮＡの発現と構築物との間の正の一致は、治療用遺伝子を標的細胞に送達し、その死を誘導する結果となる（図２Ａに示す）。患者の体内で不健康な細胞と健康な細胞を区別する構築物の内因性の能力は、高精度腫瘍学の有用なツールである本技術の特徴であり、患者に最良の有効性と安全性の結果を提供するため、先行技術に対する大きな利点である。実際、本発明の構築物は、標準的な遺伝子治療技術に付随した特異性の欠如を効果的に回避する可能性を有する。

【0010】

さらに、本発明の構築物を用いれば、たった１つのベクターを用いて、治療上活性な分子を高い特異性と効率で送達することができる。加えて、１つの構築物（すなわち、本発明の構築物）のみが標的細胞に送達され、それにより、（ｉ）治療上活性な分子またはレポーター分子、および（ｉｉ）第１のプロモーターの阻害剤および／または治療上活性な分子またはレポーター分子、の共局在化が確実になる。これは、複数の構築物を使用し、同じ細胞への共送達を確実にする場合と比較して、著しく低い用量の構築物が投与に必要なことを意味する。加えて、この単一の構築物は、治療用分子の発現を駆動するための外部因子または合図による誘導を必要としない。このように、本発明の構築物は、より単純でより効果的なシステムとなるため、先行技術に対して著しく有利である。

【0011】

好ましくは、第２の核酸配列の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位が、第１の核酸配列の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位を標的とすることができるｍｉＲＮＡと異なるｍｉＲＮＡの標的部位である。

【0012】

したがって、本発明の構築物は、第１のプロモーターおよび第１の核酸配列を含む第１の発現カセット、ならびに第２のプロモーターおよび第２の核酸配列を含む第２の発現カセットを含むことが理解されるであろう。

【0013】

第１の核酸配列は、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の種またはタイプを含んでいてもよいことが理解されるであろう。
好ましくは、第１の核酸配列は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位（または少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位の種）を含む。好ましくは、第１の核酸配列は、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的部位（または少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的部位の種）を含む。好ましくは、第１の核酸配列は、少なくとも３つのｍｉＲＮＡ標的部位（または少なくとも３つのｍｉＲＮＡ標的部位の種）を含む。好ましくは、第１の核酸配列は、少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的部位（または少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的部位の種）を含む。好ましくは、第１の核酸配列は、少なくとも５つのｍｉＲＮＡ標的部位（または少なくとも５つのｍｉＲＮＡ標的部位の種）を含む。好ましくは、第１の核酸配列に存在するｍｉＲＮＡ標的部位は、異なるｍｉＲＮＡの種の標的部位である。第１の核酸配列に存在するｍｉＲＮＡ標的部位が多ければ多いほど、遺伝子発現はより堅固に制御されることになる。しかしながら、構築物が適切に機能するためには、第１および第２の核酸配列が異なるｍｉＲＮＡの標的部位であることを条件として、第１および第２の核酸配列のそれぞれに最低１つのみのｍｉＲＮＡ標的部位が必要であることが理解されるであろう。

【0014】

それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の２つ以上のコピーが存在してもよく、すなわちそれぞれのｍｉＲＮＡ標的部位種が標的部位の少なくとも１つの重複を含んでいてもよいことが理解されるであろう。したがって、好ましくは、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも１つのコピー、すなわちそれぞれの種が存在する。好ましくは、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも２つのコピー、すなわちそれぞれの種が存在する。好ましくは、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも３つのコピー、すなわちそれぞれの種が存在する。好ましくは、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも４つのコピー、すなわちそれぞれの種が存在する。好ましくは、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも５つのコピー、すなわちそれぞれの種が存在する。

【0015】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、健康な細胞と比較した場合、疾患細胞において発現が欠如または減少または下方調節されているｍｉＲＮＡの標的部位である。

【0016】

健康な細胞と比較した場合、がん細胞において特異的に欠如または減少するｍｉＲＮＡの同定は、以下の基準を前提として、がん細胞と健康な細胞との間の示差発現ｍｉＲＮＡを解析することにより得ることができる。

【0017】

１）高発現グループの５、１０、１５、２０、２５、３０または３５パーセンタイルが、低発現グループの６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５パーセンタイルより高く、好ましくは高発現グループの２５パーセンタイルが低発現グループの７５パーセンタイルより高く、および
２）ｍｉＲＮＡは、分析したすべての健康な試料の少なくとも６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％に対して発現値を有する。好ましくは、ｍｉＲＮＡは、分析したすべての健康な試料の少なくとも７５％について発現値を有する。

【0018】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、疾患細胞では発現しないか、または非常に低いかもしくは検出できないレベルのｍｉＲＮＡの標的部位である。好ましくは、第１の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、健康な細胞で特異的に発現されるｍｉＲＮＡの標的部位である。好ましくは、第１の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、健康な細胞でのみ実質的に発現されるｍｉＲＮＡの標的部位である。好ましくは、第１の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、健康な細胞で広範に発現されるｍｉＲＮＡの標的部位である。

【0019】

疾患細胞における下方調節されたまたは減少したｍｉＲＮＡ発現は、健康な細胞で生じるよりも少なくとも５％、１０％、１５％または２０％少ないと考えられる場合がある。好ましくは、疾患細胞における下方調節されたまたは減少したｍｉＲＮＡ発現は、健康な細胞で生じるよりも少なくとも２５％、３０％、３５％または４０％少ないと考えられる場合がある。好ましくは、疾患細胞における下方調節されたまたは減少したｍｉＲＮＡ発現は、健康な細胞で生じるよりも少なくとも５０％、５５％、６０％または６５％少ないと考えられる場合がある。好ましくは、疾患細胞における下方調節されたまたは減少したｍｉＲＮＡ発現は、健康な細胞で生じるよりも少なくとも７０％、７５％、８０％または８５％少ないと考えられる場合がある。好ましくは、疾患細胞における下方調節されたまたは減少したｍｉＲＮＡ発現は、健康な細胞で生じるよりも少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％少ないと考えられる場合がある。

【0020】

好ましくは、疾患細胞は、がん細胞である。より好ましくは、疾患細胞は、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）細胞である。例示にすぎないが、ｍｉＲＮＡ１５３、ｍｉＲＮＡ１２８ａ、ｍｉＲ－３６８７、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－６０８７、ｍｉＲ－１０６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－７７０４、ｍｉＲ－５７０１、ｍｉＲ－７６６－５ｐ、ｍｉＲ－３６０９、ｍｉＲ－３６１５、および／またはｍｉＲ－４７４６－５ｐはＴ－ＡＬＬ細胞において上方調節され（すなわち、健康な細胞よりも高い発現レベル）、一方、ｍｉＲＮＡ２９ａ、ｍｉＲＮＡ１４９、ｍｉＲ－５３９－５ｐ、ｍｉＲ－４８７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－６５５－３ｐ、ｍｉＲ－４１１－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－１１８５－５ｐ、ｍｉＲ－４８３－５ｐ、ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、および／またはｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐはＴ－ＡＬＬ細胞において下方調節されている（すなわち、健康な細胞よりも低い発現レベル）。

【0021】

好ましくは、したがって、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲＮＡ２９ａ、ｍｉＲＮＡ１４９、ｍｉＲ－５３９－５ｐ、ｍｉＲ－４８７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－６５５－３ｐ、ｍｉＲ－４１１－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－１１８５－５ｐ、ｍｉＲ－４８３－５ｐ、ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、および／またはｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ標的部位を含む。好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲＮＡ２９ａ、ｍｉＲＮＡ１４９、ｍｉＲ－５３９－５ｐ、ｍｉＲ－４８７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－６５５－３ｐ、ｍｉＲ－４１１－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－１１８５－５ｐ、ｍｉＲ－４８３－５ｐ、ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、およびｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ標的部位のそれぞれの少なくとも１、２、３、４または５コピーを含む。より好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲＮＡ２９ａ、ｍｉＲＮＡ１４９、ｍｉＲ－５３９－５ｐ、ｍｉＲ－４８７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－６５５－３ｐ、ｍｉＲ－４１１－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－１１８５－５ｐ、ｍｉＲ－４８３－５ｐ、ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、およびｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ標的部位のそれぞれの４コピーを含む。

【0022】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲＮＡ２９ａ標的部位を含み、以下のように、配列番号１として本明細書に提供される。
TAACCGATTTCAGATGGTGCTA
［配列番号１］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号１に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲＮＡ２９ａ標的部位を含む。

【0023】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ１４９標的部位を含み、以下のように、配列番号２として本明細書に提供される。
GGGAGTGAAGACACGGAGCCAGA
［配列番号２］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号２に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ１４９標的部位を含む。

【0024】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－５３９－５ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号２８として本明細書に提供される。
ACACACCAAGGATAATTTCTCC
［配列番号２８］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号２８に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－５３９－５ｐ標的部位を含む。

【0025】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－４８７ａ－３ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号２９として本明細書に提供される。
AACTGGATGTCCCTGTATGATT
［配列番号２９］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号２９に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－４８７ａ－３ｐ標的部位を含む。

【0026】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－６５５－３ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号３０として本明細書に提供される。
AAAGAGGTTAACCATGTATTAT
［配列番号３０］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号３０に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－６５５－３ｐ標的部位を含む。

【0027】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－４１１－３ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号３１として本明細書に提供される。
GGTTAGTGGACCGTGTTACATA
［配列番号３１］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号３１に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－４１１－３ｐ標的部位を含む。

【0028】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－３７７－５ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号３２として本明細書に提供される。
GAATTCACCAAGGGCAACCTCT
［配列番号３２］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号３２に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－３７７－５ｐ標的部位を含む。

【0029】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－３３７－５ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号３３として本明細書に提供される。
AACTCCTGTATGAAGCCGTTC
［配列番号３３］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号３３に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－３３７－５ｐ標的部位を含む。

【0030】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－３１－３ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号３４として本明細書に提供される。
ATGGCAATATGTTGGCATAGCA
［配列番号３４］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号３４に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－３１－３ｐ標的部位を含む。

【0031】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－２１４－５ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号３５として本明細書に提供される。
GCACAGCAAGTGTAGACAGGCA
［配列番号３５］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号３５に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－２１４－５ｐ標的部位を含む。

【0032】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－１１８５－５ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号３６として本明細書に提供される。
AACATACAAAGGGTATCCTCT
［配列番号３６］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号３６に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－１１８５－５ｐ標的部位を含む。

【0033】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－４８３－５ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号３７として本明細書に提供される。
CTCCCTTCTTTCCTCCCGTCTT
［配列番号３７］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号３７に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－４８３－５ｐ標的部位を含む。

【0034】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号３８として本明細書に提供される。
CACATCTGCCCCCAAAAGTCCCT
［配列番号３８］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号３８に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ標的部位を含む。

【0035】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－１２７－３ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号３９として本明細書に提供される。
AGCCAAGCTCAGACGGATCCGA
［配列番号３９］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号３９に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－１２７－３ｐ標的部位を含む。

【0036】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－５７４－３ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号４０として本明細書に提供される。
TGTGGGTGTGTGCATGAGCGTG
［配列番号４０］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号４０に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－５７４－３ｐ標的部位を含む。

【0037】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号４１として本明細書に提供される。
TCACAAGTTAGGGTCTCAGGGA
［配列番号４１］
したがって、好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号４１に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ標的部位を含む。

【0038】

好ましくは、第１の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号１、２、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、および／または４１、またはそのバリアントもしくは断片を含む。一部の実施形態では、第１の核酸配列は、追加のｍｉＲＮＡ標的部位および／またはそれぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の２つ以上のコピーを含んでいてもよい。

【0039】

一実施形態では、ｍｉＲＮＡ２９ａは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００００８６によって表される。ｍｉＲＮＡ２９ａの配列は、本明細書において、以下のように配列番号６として提供される場合がある。
UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA
［配列番号６］
したがって、好ましくは、ｍｉＲＮＡ２９ａは、配列番号６に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0040】

一実施形態では、ｍｉＲＮＡ１４９は、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ００００４５０によって表される。ｍｉＲＮＡ１４９の配列は、本明細書において、以下のように配列番号７として提供される場合がある。
UCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCC
［配列番号７］
したがって、好ましくは、ｍｉＲＮＡ１４９は、配列番号７に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0041】

一実施形態では、ｍｉＲ－５３９－５ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００３１６３によって表される。ｍｉＲ－５３９－５ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号４２として提供される場合がある。
GGAGAAAUUAUCCUUGGUGUGU
［配列番号４２］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－５３９－５ｐは、配列番号４２に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0042】

一実施形態では、ｍｉＲ－４８７ａ－３ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００２１７８によって表される。ｍｉＲ－４８７ａ－３ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号４３として提供される場合がある。
AAUCAUACAGGGACAUCCAGUU
［配列番号４３］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－４８７ａ－３ｐは、配列番号４３に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0043】

一実施形態では、ｍｉＲ－６５５－３ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００３３３１によって表される。ｍｉＲ－６５５－３ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号４４として提供される場合がある。
AUAAUACAUGGUUAACCUCUUU
［配列番号４４］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－６５５－３ｐは、配列番号４４に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0044】

一実施形態では、ｍｉＲ－４１１－３ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００４８１３によって表される。ｍｉＲ－４１１－３ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号４５として提供される場合がある。
UAUGUAACACGGUCCACUAACC
［配列番号４５］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－４１１－３ｐは、配列番号４５に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0045】

一実施形態では、ｍｉＲ－３７７－５ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００４６８９によって表される。ｍｉＲ－３７７－５ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号４６として提供される場合がある。
AGAGGUUGCCCUUGGUGAAUUC
［配列番号４６］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－３７７－５ｐは、配列番号４６に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0046】

一実施形態では、ｍｉＲ－３３７－５ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００４６９５によって表される。ｍｉＲ－３３７－５ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号４７として提供される場合がある。
GAACGGCUUCAUACAGGAGUU
［配列番号４７］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－３３７－５ｐは、配列番号４７に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0047】

一実施形態では、ｍｉＲ－３１－３ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００４５０４によって表される。ｍｉＲ－３１－３ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号４８として提供される場合がある。
UGCUAUGCCAACAUAUUGCCAU
［配列番号４８］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－３１－３ｐは、配列番号４８に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0048】

一実施形態では、ｍｉＲ－２１４－５ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００４５６４によって表される。ｍｉＲ－２１４－５ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号４９として提供される場合がある。
UGCCUGUCUACACUUGCUGUGC
［配列番号４９］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－２１４－５ｐは、配列番号４９に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0049】

一実施形態では、ｍｉＲ－１１８５－５ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００５７９８によって表される。ｍｉＲ－１１８５－５ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号５０として提供される場合がある。
AGAGGAUACCCUUUGUAUGUU
［配列番号５０］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－１１８５－５ｐは、配列番号５０に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0050】

一実施形態では、ｍｉＲ－４８３－５ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００４７６１によって表される。ｍｉＲ－４８３－５ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号５１として提供される場合がある。
AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG
［配列番号５１］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－４８３－５ｐは、配列番号５１に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0051】

一実施形態では、ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００９１９９によって表される。ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号５２として提供される場合がある。
AGGGACUUUUGGGGGCAGAUGUG
［配列番号５２］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐは、配列番号５２に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0052】

一実施形態では、ｍｉＲ－１２７－３ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ００００４４６によって表される。ｍｉＲ－１２７－３ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号５３として提供される場合がある。
UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU
［配列番号５３］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－１２７－３ｐは、配列番号５３に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0053】

一実施形態では、ｍｉＲ－５７４－３ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００３２３９によって表される。ｍｉＲ－５７４－３ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号５４として提供される場合がある。
CACGCUCAUGCACACACCCACA
［配列番号５４］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－５７４－３ｐは、配列番号５４に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0054】

一実施形態では、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ００００４２３によって表される。ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号５５として提供される場合がある。
UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA
［配列番号５５］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐは、配列番号５５に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0055】

好ましくは、配列番号６、７、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および／または５５、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲＮＡは、第１の核酸配列の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位、好ましくは第１の核酸配列の２種類のｍｉＲＮＡ標的部位を標的とする。

【0056】

第１の核酸配列は、２つ以上の種のｍｉＲＮＡ標的配列を含んでいてもよいことが理解されるであろう。
好ましくは、第２の核酸配列は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位（または少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位の種）を含む。好ましくは、第２の核酸配列は、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的部位（または少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的部位の種）を含む。好ましくは、第２の核酸配列は、少なくとも３つのｍｉＲＮＡ標的部位（または少なくとも３つのｍｉＲＮＡ標的部位の種）を含む。好ましくは、第２の核酸配列は、少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的部位（または少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的部位の種）を含む。好ましくは、第２の核酸配列は、少なくとも５つのｍｉＲＮＡ標的部位（または少なくとも５つのｍｉＲＮＡ標的部位の種）を含む。好ましくは、第２の核酸に存在するｍｉＲＮＡ標的部位は、異なるｍｉＲＮＡの標的部位である。第２の核酸配列に存在するｍｉＲＮＡ標的部位が多ければ多いほど、遺伝子発現はより堅固に制御されることになる。しかしながら、構築物が適切に機能するためには、第１および第２の核酸配列が異なるｍｉＲＮＡの標的部位であることを条件として、第１および第２の核酸配列のそれぞれに最低１つのみのｍｉＲＮＡ標的部位が必要であることが理解されよう。

【0057】

それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の２つ以上のコピーが存在してもよく、すなわちそれぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の種が標的部位の少なくとも１つの重複を含んでいてもよいことが理解されるであろう。したがって、好ましくは、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも１つのコピー、すなわちそれぞれの種が存在する。好ましくは、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも２つのコピー、すなわちそれぞれの種が存在する。好ましくは、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも３つのコピー、すなわちそれぞれの種が存在する。好ましくは、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも４つのコピー、すなわちそれぞれの種が存在する。好ましくは、それぞれのｍｉＲＮＡ標的部位の少なくとも５つのコピー、すなわちそれぞれの種が存在する。

【0058】

好ましくは、第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、疾患細胞で発現されるｍｉＲＮＡの標的部位である。好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、疾患細胞で特異的に発現されるｍｉＲＮＡの標的部位である。好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、健康な細胞では発現しないか、または非常に低いかもしくは検出できないレベルのｍｉＲＮＡの標的部位である。好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、疾患細胞で広範に発現されるｍｉＲＮＡの標的部位である。

【0059】

疾患細胞における上方調節されたまたは増加したｍｉＲＮＡ発現は、健康な細胞で生じるよりも少なくとも５％、１０％、１５％または２０％多いと考えられる場合がある。好ましくは、疾患細胞における上方調節されたまたは増加したｍｉＲＮＡ発現は、健康な細胞で生じるよりも少なくとも２５％、３０％、３５％または４０％多いと考えられる場合がある。好ましくは、疾患細胞における上方調節されたまたは増加したｍｉＲＮＡ発現は、健康な細胞で生じるよりも少なくとも５０％、５５％、６０％または６５％多いと考えられる場合がある。好ましくは、疾患細胞における上方調節されたまたは増加したｍｉＲＮＡ発現は、健康な細胞で生じるよりも少なくとも７０％、７５％、８０％または８５％多いと考えられる場合がある。好ましくは、疾患細胞における上方調節されたまたは増加したｍｉＲＮＡ発現は、健康な細胞で生じるよりも少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％多いと考えられる場合がある。

【0060】

好ましくは、疾患細胞は、がん細胞である。より好ましくは、疾患細胞は、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）細胞である。
好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲＮＡ１５３、ｍｉＲ１２８ａ、ｍｉＲ－３６８７、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－６０８７、ｍｉＲ－１０６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－７７０４、ｍｉＲ－５７０１、ｍｉＲ－７６６－５ｐ、ｍｉＲ－３６０９、ｍｉＲ－３６１５、および／またはｍｉＲ－４７４６－５ｐ標的部位を含む。

【0061】

好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲＮＡ１５３標的部位を含み、以下のように、配列番号３として本明細書に提供される。
AGCTGCAACATCACAAAATGA
［配列番号３］
したがって、好ましくは、第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号３に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲＮＡ１５３標的部位を含む。

【0062】

好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ１２８ａ標的部位を含み、以下のように、配列番号４として本明細書に提供される。
AAAGAGACCGGTTCACTGTGA
［配列番号４］
したがって、好ましくは、第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号４に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ１２８ａ標的部位を含む。

【0063】

好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－３６８７標的部位を含み、以下のように、配列番号５６として本明細書に提供される。
ACGTCGCACGAACGCCTGTCCGGG
［配列番号５６］
したがって、好ましくは、第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号５６に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－３６８７標的部位を含む。

【0064】

好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号５７として本明細書に提供される。
GTAATGCAACAAATCCCCACCC
［配列番号５７］
したがって、好ましくは、第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号５７に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ標的部位を含む。

【0065】

好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－２０ｂ－３ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号５８として本明細書に提供される。
CTGGAAGTGCCCATACTACAGT
［配列番号５８］
したがって、好ましくは、第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号５８に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－２０ｂ－３ｐ標的部位を含む。

【0066】

好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－６０８７標的部位を含み、以下のように、配列番号５９として本明細書に提供される。
GCTCGCCCCCCCGCCTCA
［配列番号５９］
したがって、好ましくは、第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号５９に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－６０８７標的部位を含む。

【0067】

好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－１０６ａ－３ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号６０として本明細書に提供される。
GTAAGAAGTGCTTACATTGCAG
［配列番号６０］
したがって、好ましくは、第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号６０に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－１０６ａ－３ｐ標的部位を含む。

【0068】

好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－７７０４標的部位を含み、以下のように、配列番号６１として本明細書に提供される。
CACGTCGCCGCCGACCCCG
［配列番号６１］
したがって、好ましくは、第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号６１に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－７７０４標的部位を含む。

【0069】

好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－５７０１標的部位を含み、以下のように、配列番号６２として本明細書に提供される。
AATCAGAACGTGACAATAA
［配列番号６２］
したがって、好ましくは、第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号６２に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－５７０１標的部位を含む。

【0070】

好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－７６６－５ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号６３として本明細書に提供される。
AAGACCAGCACCAATTCCTCCT
［配列番号６３］
したがって、好ましくは、第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号６３に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－７６６－５ｐ標的部位を含む。

【0071】

好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－３６０９標的部位を含み、以下のように、配列番号６４として本明細書に提供される。
CAGCCAGTATTACTCATCACTTTG
［配列番号６４］
したがって、好ましくは、第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号６４に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－３６０９標的部位を含む。

【0072】

好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－３６１５標的部位を含み、以下のように、配列番号６５として本明細書に提供される。
GAGCCGCGAGGAGCCGAGAGA
［配列番号６５］
したがって、好ましくは、第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号６５に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－３６１５標的部位を含む。

【0073】

好ましくは、第２の核酸に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲ－４７４６－５ｐ標的部位を含み、以下のように、配列番号６６として本明細書に提供される。
TCTGCAGGTTCTCCTGGGACCGG
［配列番号６６］
したがって、好ましくは、第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号６６に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなるｍｉＲ－４７４６－５ｐ標的部位を含む。

【0074】

好ましくは、第２の核酸配列に存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号３、４、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、および／または６６、またはそのバリアントもしくは断片を含む。一部の実施形態では、第２の核酸配列は、追加のｍｉＲＮＡ標的部位を含んでいてもよい。

【0075】

一実施形態では、ｍｉＲＮＡ１５３は、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ００２６４８０によって表される。ｍｉＲＮＡ１５３の配列は、本明細書において、以下のように配列番号８として提供される場合がある。
UCAUUUUUGUGAUGUUGCAGCU
［配列番号８］
したがって、好ましくは、ｍｉＲＮＡ１５３は、配列番号８に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0076】

一実施形態では、ｍｉＲＮＡ１２８ａは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ００００４２４によって表される。ｍｉＲＮＡ１２８ａの配列は、本明細書において、以下のように配列番号９として提供される場合がある。
UCACAGUGAACCGGUCUCUUU
［配列番号９］
したがって、好ましくは、ｍｉＲＮＡ１２８ａは、配列番号９に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0077】

一実施形態では、ｍｉＲ－３６８７は、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ００１８１１５によって表される。ｍｉＲ－３６８７の配列は、本明細書において、以下のように配列番号６７として提供される場合がある。
CCCGGACAGGCGUUCGUGCGACGU
［配列番号６７］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－３６８７は、配列番号６７に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0078】

一実施形態では、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００４５０８によって表される。ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号６８として提供される場合がある。
GGGUGGGGAUUUGUUGCAUUAC
［配列番号６８］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐは、配列番号６８に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0079】

一実施形態では、ｍｉＲ－２０ｂ－３ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００４７５２によって表される。ｍｉＲ－２０ｂ－３ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号６９として提供される場合がある。
ACUGUAGUAUGGGCACUUCCAG
［配列番号６９］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－２０ｂ－３ｐは、配列番号６９に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0080】

一実施形態では、ｍｉＲ－６０８７は、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ００２３７１２によって表される。ｍｉＲ－６０８７の配列は、本明細書において、以下のように配列番号７０として提供される場合がある。
UGAGGCGGGGGGGCGAGC
［配列番号７０］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－６０８７は、配列番号７０に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0081】

一実施形態では、ｍｉＲ－１０６ａ－３ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ０００４５１７によって表される。ｍｉＲ－１０６ａ－３ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号７１として提供される場合がある。
CUGCAAUGUAAGCACUUCUUAC
［配列番号７１］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－１０６ａ－３ｐは、配列番号７１に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0082】

一実施形態では、ｍｉＲ－７７０４は、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ００３００１９によって表される。ｍｉＲ－７７０４の配列は、本明細書において、以下のように配列番号７２として提供される場合がある。
CGGGGUCGGCGGCGACGUG
［配列番号７２］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－７７０４は、配列番号７２に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0083】

一実施形態では、ｍｉＲ－５７０１は、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ００２２４９４によって表される。ｍｉＲ－５７０１の配列は、本明細書において、以下のように配列番号７３として提供される場合がある。
UUAUUGUCACGUUCUGAUU
［配列番号７３］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－５７０１は、配列番号７３に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0084】

一実施形態では、ｍｉＲ－７６６－５ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ００２２７１４によって表される。ｍｉＲ－７６６－５ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号７４として提供される場合がある。
AGGAGGAAUUGGUGCUGGUCUU
［配列番号７４］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－７６６－５ｐは、配列番号７４に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0085】

一実施形態では、ｍｉＲ－３６０９は、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ００１７９８６によって表される。ｍｉＲ－３６０９の配列は、本明細書において、以下のように配列番号７５として提供される場合がある。
CAAAGUGAUGAGUAAUACUGGCUG
［配列番号７５］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－３６０９は、配列番号７５に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0086】

一実施形態では、ｍｉＲ－３６１５は、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ００１７９９４によって表される。ｍｉＲ－３６１５の配列は、本明細書において、以下のように配列番号７６として提供される場合がある。
UCUCUCGGCUCCUCGCGGCUC
［配列番号７６］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－３６１５は、配列番号７６に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0087】

一実施形態では、ｍｉＲ－４７４６－５ｐは、ｍｉＲ ＩＤ番号ＭＩＭＡＴ００１９８８０によって表される。ｍｉＲ－４７４６－５ｐの配列は、本明細書において、以下のように配列番号７７として提供される場合がある。
CCGGUCCCAGGAGAACCUGCAGA
［配列番号７７］
したがって、好ましくは、ｍｉＲ－４７４６－５ｐは、配列番号７７に実質的に記載されているような配列、またはそのバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0088】

好ましくは、配列番号８、９、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６および／または７７、またはそのバリアントもしくは断片を含む、もしくはそれらからなるｍｉＲＮＡは、第２の核酸配列の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位、および好ましくは第２の核酸配列の２種類のｍｉＲＮＡ標的部位を標的とする。

【0089】

したがって、有利なことに、治療用分子またはレポーター分子の送達は、患者のＴ－ＡＬＬ細胞においてのみ存在する（または高発現する）マイクロＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ１５３、ｍｉＲＮＡ１２８ａ、ｍｉＲ－３６８７、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－６０８７、ｍｉＲ－１０６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－７７０４、ｍｉＲ－５７０１、ｍｉＲ－７６６－５ｐ、ｍｉＲ－３６０９、ｍｉＲ－３６１５、および／またはｍｉＲ－４７４６－５ｐ）とこれらの細胞において特異的に欠如（または著しく低発現）するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ２９ａ、ｍｉＲＮＡ１４９、ｍｉＲ－５３９－５ｐ、ｍｉＲ－４８７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－６５５－３ｐ、ｍｉＲ－４１１－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－１１８５－５ｐ、ｍｉＲ－４８３－５ｐ、ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、および／またはｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ）の両者によって制御される。本発明の構築物は、治療用分子またはレポーター分子の発現を正に制御するために、特定のマイクロＲＮＡの同時存在および非存在を使用する。好ましくは、そして有利には、この二重の調節は、双方向性発現ベクターの使用によって達成される。遺伝子発現による負のフィードバックループは、さらなる制御を提供することが理解されるであろう。

【0090】

第１のプロモーターは、構成的プロモーター、活性化可能プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターを含む、任意の適切なプロモーターであり得る。第１のプロモーターは、広範に発現されるプロモーターであってもよいし、がん細胞特異的プロモーターであってもよい。好ましくは、第１のプロモーターは、広範に発現されるプロモーターである。

【0091】

第１のプロモーターは、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター、ＥＦ１αショート（ＥＦＳ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、脾限局巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）長い末端反復、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）、および複合性ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ最初期エンハンサーとニワトリβ－アクチンプロモーターからなる）、からなる群から選択されてもよい。

【0092】

好ましくは、第１のプロモーターは、５’から３’方向に伸長する。
第１の核酸コード配列は、レポーター分子または治療用分子をコードすることができる。

【0093】

レポーター分子は、光学レポーター、核医学レポーター、またはＭＲＩレポーターであってもよい。
光学レポーターは、蛍光タンパク質またはルシフェラーゼであってもよい。核医学レポーターは、単純ヘルペスウイルス１型［ＨＳＶ１］チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ヒトミトコンドリアＴＫ２型、ドーパミン作動性受容体、ドーパミン２受容体、ヨウ化ナトリウム共輸送体、ノルエピネフリントランスポーター、ソマトスタチン受容体またはエストロゲン受容体であってもよい。ＭＲＩレポーターは、トランスフェリン受容体、β－ガラクトシダーゼ、チロシナーゼ、フェリチンまたはリジンリッチプロテイン（ＬＲＰ）であってもよい。

【0094】

治療上活性な分子は、治療用タンパク質および／または核酸であってもよい。
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはキメラＤＮＡ／ＲＮＡ分子であってもよい。核酸は、遺伝子サイレンシング分子であってもよく、例としては、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス分子を含むＲＮＡｉ分子が挙げられる。核酸は、ガイドＲＮＡであってもよい。

【0095】

当業者であれば、ガイドＲＮＡという用語は、相補的な標的ＤＮＡ配列に結合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの非コードＲＮＡ構成要素を指すと理解するであろう。ガイドＲＮＡはまずＣａｓ酵素に結合し、ｇＲＮＡ配列はペアリングを介して複合体をＤＮＡ上の特定の場所に誘導し、そこでＣａｓは標的ＤＮＡ鎖を切断することによってエンドヌクレアーゼ活性を実行する。

【0096】

遺伝子サイレンシング分子は、アンチセンス分子（アンチセンスＤＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡ）またはリボザイム分子であってもよい。リボザイムおよびアンチセンス分子は、疾患細胞における必須遺伝子の転写を阻害するために使用され得る。アンチセンス分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に配列特異的な方法で結合するオリゴヌクレオチドである。アンチセンスＲＮＡは、相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合すると、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。三重鎖分子とは、アンチセンスＤＮＡの一本鎖が二重鎖ＤＮＡと結合し、共直線性三重鎖分子を形成することを指し、それによって転写を阻害する。

【0097】

治療上活性な分子は、治療用タンパク質であってもよく、第１の核酸は、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子をコードする。
治療用タンパク質は、治療用途を有する組換えタンパク質であってもよい。

【0098】

治療用タンパク質は、エンドヌクレアーゼであってもよい。例えば、治療用タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）のようなＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであってもよい。好ましくは、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９および／またはＣｐｆ１であってもよい。

【0099】

治療用分子は、Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡを含むＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓシステムの両方の構成要素を含んでいてもよい。この実施形態では、構築物は、Ｃａｓタンパク質の発現を駆動するための追加のプロモーターを含んでいてもよい。

【0100】

治療用タンパク質は、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）であってもよい。例えば、治療用タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏ Ｔ細胞免疫療法のためのＣＡＲ－Ｔ細胞の仕組みを可能にするＣＡＲタンパク質であってもよい。

【0101】

治療用タンパク質は、エフェクタータンパク質であってもよい。好ましくは、治療用タンパク質は、腫瘍細胞内のアポトーシスカスケードを誘発することが可能であってもよい。したがって、好ましくは、治療用タンパク質は、アポトーシス駆動タンパク質であってもよい。好ましくは、アポトーシス駆動タンパク質は、Ｂａｘ、Ａｐｏｐｔｉｎ、Ｅ４ｏｒｆ４および／またはＢｉｍであってもよい。

【0102】

好ましくは、アポトーシス駆動タンパク質はＢａｘであってもよく、以下のように配列番号１６として本明細書に提供される遺伝子番号５８１によって表され得る。
MDGSGEQPRGGGPTSSEQIMKTGALLLQGFIQDRAGRMGGEAPELALDPVPQDASTKKLSECLKRIGDELDSNMELQRMIAAVDTDSPREVFFRVAADMFSDGNFNWGRVVALFYFASKLVLKALCTKVPELIRTIMGWTLDFLRERLLGWIQDQGGWGLPLAESLKRLMSLSPGRPPLLLWDAHVADRDHLCGGSAHRLTHHLEEDGLRPPAALDCVFPP
［配列番号１６］
したがって、好ましくは、Ｂａｘは、配列番号１６に実質的に記載されているようなアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0103】

一実施形態では、Ｂａｘは、以下のように配列番号１７として本明細書に提供されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
gcgctgcggc cgcccgcgcg gacccggcga gaggcggcgg cgggagcggc ggtgatggacgggtccggggagcagcccag aggcgggggg cccaccagct ctgagcagat catgaagacatgcttcaggg tttcatccag gatcgagcag ggcgaatggg gggggaggcacccgagctgg ccctggaccc ggtgcctcag gatgcgtcca ccaagaagct gagcgagtgtctcaagcgca tcggggacga actggacagt aacatggagc tgcagaggat gattgccgccgtggacacag actccccccg agaggtcttt ttccgagtgg cagctgacat gttttctgacggcaacttca actggggccg ggttgtcgcc cttttctact ttgccagcaa actggtgctcaaggccctgt gcaccaaggt gccggaactg atcagaacca tcatgggctg gacattggacttcctccggg agcggctgtt gggctggatc caagaccagg gtggttgggg gctgcccctggccgagtcac tgaagcgact gatgtccctg tctccaggac ggcctcctct cctactttgggacgcccacg tggcagaccg tgaccatctt tgtggcggga gtgctcaccg cctcactcaccatctggaag aagatgggct gaggccccca gctgccttgg actgtgtttt tcctccataaattatggcat ttttctggga ggggtgggga ttgggggacg tgggcatttt tcttacttttgtaattattg gggggtgtgg ggaagagtgg tcttgagggg gtaataaacc tccttcgggacaca
［配列番号１７］
したがって、好ましくは、Ｂａｘポリペプチドまたはその生物学的に活性なバリアントもしくは断片は、配列番号１７に実質的に記載されているようなヌクレオチド配列、またはそのバリアントもしくは断片によってコードされ得る。

【0104】

好ましくは、アポトーシス駆動タンパク質はＡｐｏｐｔｉｎであってもよく、以下のように、配列番号１８として本明細書に提供される遺伝子番号１４９４４４６によって表され得る。
MNALQEDTPPGPSTVFRPPTSSRPLETPHCREIRIGIAGITITLSLCGCANARAPTLRSATADNSESTGFKNVPDLRTDQPKPPSKKRSCDPSEYRVSELKESLITTTPSRPRTARRRIRL
［配列番号１８］
したがって、好ましくは、Ａｐｏｐｔｉｎは配列番号１８に実質的に記載されているようなアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0105】

一実施形態では、Ａｐｏｐｔｉｎは、以下のように配列番号１９として本明細書に提供されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
atgaacgctc tccaagaaga tactccaccc ggaccatcaa cggtgttcag gccaccaacaagttcacggc cgttggaaac ccctcactgc agagagatcc ggattggtat cgctggaattacaatcactc tatcgctgtg tggctgcgcg aatgctcgcg ctcccacgct aagatctgcaactgcggaca attcagaaag cactggtttc aagaatgtgc cggacttgag gaccgatcaacccaagcctc cctcgaagaa gcgatcctgc gacccctccg agtacagggt aagcgagctaaaagaaagct tgattaccac tactcccagc cgaccccgaa ccgcaagaag gcgtataagactgtaa
［配列番号１９］
したがって、好ましくは、Ａｐｏｐｔｉｎポリペプチドまたはその生物学的に活性なバリアントもしくは断片は、配列番号１９に実質的に記載されているようなヌクレオチド配列、またはそのバリアントもしくは断片によってコードされ得る。

【0106】

好ましくは、アポトーシス駆動タンパク質は、以下のように、配列番号２０として本明細書に提供される遺伝子番号ＡＣ＿０００００７．１によって表され得る、Ｅ４ｏｒｆ４であってもよい。
MVLPALPAPPVCDSQNECVGWLGVAYSAVVDVIRAAAHEGVYIEPEARGRLDALREWIYYNYYTERAKRRDRRRRSVCHARTWFCFRKYDYVRRSIWHDTTTNTISVVSAHSVQ
［配列番号２０］
したがって、好ましくは、Ｅ４ｏｒｆ４は配列番号２０に実質的に記載されているようなアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0107】

一実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ４は、以下のように、配列番号２１として本明細書に提供されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
atggttcttccagctcttcccgctcctcccgtgtgtgactcgcagaacgaatgtgtaggttggctgggtgtggcttattctgcggtggtggatgttatcagggcagcggcgcatgaaggagtttacatagaacccgaagccagggggcgcctggatgctttgagagagtggatatactacaactactacacagagcgagctaagcgacgagaccggagacgcagatctgtttgtcacgcccgcacctggttttgcttcaggaaatatgactacgtccggcgttccatttggcatgacactacgaccaacacgatctcggttgtctcggcgcactccgtacagtag
［配列番号２１］
したがって、好ましくは、Ｅ４ｏｒｆ４ポリペプチドまたはその生物学的に活性なバリアントもしくは断片は、配列番号２１に実質的に記載されているようなヌクレオチド配列、またはそのバリアントもしくは断片によってコードされ得る。

【0108】

好ましくは、アポトーシス駆動タンパク質はＢｉｍ（ＢＣＬ２Ｌ１１）であってもよく、以下のように配列番号２５として本明細書に提供される遺伝子番号１００１８によって表され得る。
MAKQPSDVSSECDREGRQLQPAERPPQLRPGAPTSLQTEPQGNPEGNHGGEGDSCPHGSPQGPLAPPASPGPFATRSPLFIFMRRSSLLSRSSSGYFSFDTDRSPAPMSCDKSTQTPSPPCQAFNHYLSAMASMRQAEPADMRPEIWIAQELRRIGDEFNAYYARRVFLNNYQAAEDHPRMVILRLLRYIVRLVWRMH
［配列番号２５］
したがって、好ましくは、Ｂｉｍは配列番号２５に実質的に記載されているようなアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なバリアントもしくは断片を含む、またはそれらからなる。

【0109】

一実施形態では、Ｂｉｍは、以下のように配列番号２６として本明細書に提供されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
atggcaaagcaaccttctgatg taagttctga gtgtgaccga gaaggtagac aattgcagcc tgcggagaggcctccccagc tcagacctgg ggcccctacc tccctacaga cagagccaca aggtaatcctgaaggcaatc acggaggtga aggggacagc tgcccccacg gcagccctca gggcccgctggccccacctg ccagccctgg cccttttgct accagatccc cgcttttcat ctttatgagaagatcctccc tgctgtctcg atcctccagt gggtatttct cttttgacac agacaggagcccagcaccca tgagttgtga caaatcaaca caaaccccaa gtcctccttg ccaggccttcaaccactatc tcagtgcaat ggcttccatg aggcaggctg aacctgcaga tatgcgcccagagatatgga tcgcccaaga gttgcggcgt attggagacg agtttaacgc ttactatgcaaggagggtat ttttgaataa ttaccaagca gccgaagacc acccacgaat ggttatcttacgactgttac gttacattgt ccgcctggtg tggagaatgc attga
［配列番号２６］
したがって、好ましくは、Ｂｉｍポリペプチドまたはその生物学的に活性なバリアントもしくは断片は、配列番号２６に実質的に記載されているようなヌクレオチド配列、またはそのバリアントもしくは断片によってコードされ得る。

【0110】

第２のプロモーターは、構成的プロモーター、活性化可能プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターを含む、任意の適切なプロモーターであり得る。好ましくは、第１のプロモーターは、広範に発現されるプロモーターである。好ましくは、第２のプロモーターは、第１のプロモーターと異なるプロモーターである。

【0111】

第２のプロモーターは、構築物中で第１のプロモーターと同じ向きに配置されてもよい。第２のプロモーターは、３’から５’方向に伸長していてもよい。しかしながら、好ましくは、第２のプロモーターは、第１のプロモーターに対して構築物中で反対方向に配置される。好ましくは、第２のプロモーターは、３’から５’方向に伸長する。好ましくは、プロモーターは双方向性である。双方向性プロモーターの本発明者の使用は、ＩＲＥＳエレメント、融合タンパク質または自己切断２Ａペプチドのような追加の遺伝子エレメントのいずれかを必要とせず、２つの遺伝子の協調発現という追加の利点を提供し、これらは２つの遺伝子の弱い共発現をもたらし、タンパク質の安定性および／または生物学的機能に影響を与える可能性のある追加の導入遺伝子工学を必要とする。さらに、双方向性プロモーターの使用は、例えばレンチベクターを使用する場合に生じ得る一方向性プロモーター干渉の問題を回避する。

【0112】

したがって、一実施形態では、第１の発現カセットは、第２の発現カセットと同じ方向に配置される。しかしながら、好ましい実施形態では、第１の発現カセットは、第２の発現カセットと反対方向に配置される。

【0113】

第２のプロモーターは、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター、ＥＦ１αショート（ＥＦＳ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、脾限局巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）長い末端反復、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）、および複合性ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ最初期エンハンサーとニワトリβ－アクチンプロモーターからなる）、からなる群から選択されてもよい。

【0114】

一実施形態において、第２の核酸配列によってコードされる阻害剤は、治療上活性な分子またはレポーター分子の直接的な阻害剤である。
好ましくは、しかしながら、第２の核酸配列によってコードされる阻害剤は、第１のプロモーターの阻害剤である。第１のプロモーターの阻害剤は、テトラサイクリン制御オペレーターシステムまたはクメート（Ｃｕｍａｔｅ）制御オペレーターシステムの一部であってもよく、このようなシステムは当業者によく知られている。

【0115】

第１のプロモーターの阻害剤は、Ｌａｃオペロンであってもよく、第２の核酸配列はＬａｃリプレッサーを含み、第１のプロモーターはＬａｃオペレーター制御因子部位を含む。

【0116】

一実施形態では、第１のプロモーターおよび第１の核酸配列は、第２のプロモーター配列および第２の核酸配列に対して５’である。一実施形態では、第１のプロモーターおよび第１の核酸配列は、第２のプロモーター配列および第２の核酸配列に対して３’である。

【0117】

一実施形態では、遺伝子構築物は、この指定された順序で５’から３’方向に、第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーター配列、レポーター分子および／または治療用分子をコードする第１の核酸配列、第２の核酸配列に作動可能に連結された第２のプロモーター配列、第１のプロモーターの阻害剤をコードする第２の核酸配列を含んでいてもよい。

【0118】

好ましい実施形態では、しかしながら、遺伝子構築物は、この指定された順序で５’から３’方向に、第２の核酸に作動可能に連結された第２のプロモーター配列、第１のプロモーターの阻害剤をコードする第２の核酸配列、第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーター配列ならびにレポーター分子および／または治療用分子をコードする第１の核酸配列を含んでいてもよい。

【0119】

５’および３’の使用は、その特徴が上流または下流のいずれかであることを示し、その特徴が必ずしも末端の特徴であることを示すことを意図していない。
遺伝子構築物の一実施形態は図８ｃに示され、以下のように配列番号５として本明細書で言及される。
acgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagattTggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtATCGGTtaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatGTCGAGccatagagcccaccgcatccccagcatgcctgctattgtcttcccaatcctcccccttgctgtcctgccccaccccaccccccagaatagaatgacacctactcagacaatgcgatgcaatttcctcattttattaggaaaggacagtgggagtggcaccttccagggtcaaggaaggcacgggggaggggcaaacaacagatggctggcaactagaaggcacagtcgCtcgagAGTAAAACACTACAACGTCGATAGCAGTAAAACACTACAACGTCGACACTAGTAAAACACTACAACGTCGATAGCAGTAAAACACTACAACGTCGACACTAGTGTCACTTGGCCAGAGAAATAGCAGTGTCACTTGGCCAGAGAAACACTAGTGTCACTTGGCCAGAGAAATAGCAGTGTCACTTGGCCAGAGAAActcgagTCAAACCTTCCTCTTCTTCTTAGGAGGCCTCAGGCTGCTCTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCATGGTGGGAGGGTACcTAGGTAAGCTTGGGCTGCAGGTCGAAAGGCCCGGAGATGAGGAAGAGGAGAACAGCGCGGCAGACGTGCGCTTTTGAAGCGTGCAGAATGCCGGGCCTCCGGAGGACCTTCGGGCGCCCGCCCCGCCCCTGAGCCCGCCCCTGAGCCCGCCCCCGGACCCACCCCTTCCCAGCCTCTGAGCCCAGAAAGCGAAGGAGCAAAGCTGCTATTGGCCGCTGCCCCAAAGGCCTACCCGCTTCCATTGCTCAGCGGTGCTGTCCATCTGCACGAGACTAGTGAGACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCTGCACGACGCGAGCTGCGGGGCGGGGGGGAACTTCCTGACTAGGGGAGGAGTAGAAGGTGGCGCGAAGGGGCCACCAAAGAACGGAGCCGGTTGGCGCCTACCGGTGGATGTGGA
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［配列番号５］
好ましくは、遺伝子構築物は、配列番号５に実質的に記載されているような核酸配列、またはその断片もしくはバリアントを含む。

【0120】

遺伝子構築物の別の実施形態は図８Ｈに示され、以下のように配列番号７８として本明細書で言及される。
acgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagattTggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtATCGGTtaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatGTCGAGccatagagcccaccgcatccccagcatgcctgctattgtcttcccaatcctcccccttgctgtcctgccccaccccaccccccagaatagaatgacacctactcagacaatgcgatgcaatttcctcattttattaggaaaggacagtgggagtggcaccttccagggtcaaggaaggcacgggggaggggcaaacaacagatggctggcaactagaaggcacagtcgCtcgagGGGCCTGTCCGCAAGCACGCTGCATAGCGGGCCTGTCCGCAAGCACGCTGCACACTGGGCCTGTCCGCAAGCACGCTGCATAGCGGGCCTGTCCGCAAGCACGCTGCACACTCCCACCCCTAAACAACGTAATGTAGCCCCACCCCTAAACAACGTAATGCACTCCCACCCCTAAACAACGTAATGTAGCCCCACCCCTAAACAACGTAATGCACTTGACATCATACCCGTGAAGGTCTAGCTGACATCATACCCGTGAAGGTCCACTTGACATCATACCCGTGAAGGTCTAGCTGACATCATACCCGTGAAGGTCCACTACTCCGCCCCCCCGCTCGTAGCACTCCGCCCCCCCGCTCGCACTACTCCGCCCCCCCGCTCGTAGCACTCCGCCCCCCCGCTCGCACTGACGTTACATTCGTGAAGAATGTAGCGACGTTACATTCGTGAAGAATGCACTGACGTTACATTCGTGAAGAATGTAGCGACGTTACATTCGTGAAGAATGCACTGCCCCAGCCGCCGCTGCACTAGCGCCCCAGCCGCCGCTGCACCACTGCCCCAGCCGCCGCTGCACTAGCGCCCCAGCCGCCGCTGCACctcgagTCAAACCTTCCTCTTCTTCTTAGGAGGCCTCAGGCTGCTCTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAA
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［配列番号７８］
好ましくは、遺伝子構築物は、配列番号７８に実質的に記載されているような核酸配列、またはその断片もしくはバリアントを含む。

【0121】

遺伝子構築物の別の実施形態は図８Ｄに示され、Ｂａｘコード配列を含んでいてもよく、以下のように配列番号２２によって表されることができる。
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［配列番号２２］
好ましくは、遺伝子構築物は、配列番号２２に実質的に記載されているような核酸配列、またはその断片もしくはバリアントを含む。

【0122】

Ｂａｘコード配列を含む遺伝子構築物の別の実施形態は図８Ｉに示され、以下のように配列番号７９によって表される。
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［配列番号７９］
好ましくは、遺伝子構築物は、配列番号７９に実質的に記載されているような核酸配列、またはその断片もしくはバリアントを含む。

【0123】

遺伝子構築物の別の実施形態は図８Ｅに示され、Ａｐｏｐｔｉｎコード配列を含んでいてもよく、以下のように配列番号２３によって表されることができる。
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［配列番号２３］
好ましくは、遺伝子構築物は、配列番号２３に実質的に記載されているような核酸配列、またはその断片もしくはバリアントを含む。

【0124】

Ａｐｏｐｔｉｎコード配列を含む遺伝子構築物の別の実施形態は図８Ｊに示され、以下のように配列番号８０によって表される。
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［配列番号８０］
好ましくは、遺伝子構築物は、配列番号８０に実質的に記載されているような核酸配列、またはその断片もしくはバリアントを含む。

【0125】

遺伝子構築物の別の実施形態は図８Ｆに示され、Ｅ４ｏｒｆ４コード配列を含んでいてもよく、以下のように配列番号２４によって表されることができる。
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［配列番号２４］
好ましくは、遺伝子構築物は、配列番号２４に実質的に記載されているような核酸配列、またはその断片もしくはバリアントを含む。

【0126】

Ｅ４ｏｒｆ４コード配列を含む遺伝子構築物の別の実施形態は図８Ｋに示され、以下のように配列番号８１によって表される。
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［配列番号８１］
好ましくは、遺伝子構築物は、配列番号８１に実質的に記載されているような核酸配列、またはその断片もしくはバリアントを含む。

【0127】

遺伝子構築物の別の実施形態は図８Ｇに示され、Ｂｉｍコード配列を含んでいてもよく、以下のように配列番号２７によって表されることができる。
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［配列番号２７］
好ましくは、遺伝子構築物は、配列番号２７に実質的に記載されているような核酸配列、またはその断片もしくはバリアントを含む。

【0128】

Ｂｉｍコード配列を含む遺伝子構築物の別の実施形態は図８Ｌに示され、以下のように配列番号８２によって表される。
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［配列番号８２］
好ましくは、遺伝子構築物は、配列番号８２に実質的に記載されているような核酸配列、またはその断片もしくはバリアントを含む。

【0129】

また、本発明は、治療薬送達のためのビヒクルとして、遺伝子構築物を含む組換えベクターにも及ぶ。
したがって、第２の態様では、第１の態様に記載の遺伝子構築物を含む組換えベクターが提供される。

【0130】

第１の態様の遺伝子構築物を含むベクターは、例えば、プラスミド、コスミドまたはファージおよび／またはウイルスベクターであってもよい。このような組換えベクターは、ヌクレオチド配列で細胞を形質転換するための本発明の送達システムにおいて非常に有用である。好ましくは、ベクターは、ウイルスベクターである。

【0131】

ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択されてもよい。
ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであってもよい。ｒＡＡＶは、天然に存在するベクターまたはハイブリッドＡＡＶ血清型を有するベクターであってもよい。ｒＡＡＶは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３Ａ、ＡＡＶ－３Ｂ、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、およびＡＡＶ－１１であってもよい。ＡＡＶ－２が最も好ましい。

【0132】

用語「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの末端反復配列を含む組換えＡＡＶ由来核酸を意味し得る。
好ましくは、しかしながら、ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、組込み型であっても非組込み型であってもよい。好ましくは、レンチウイルスベクターは、非組込み型である。

【0133】

好ましくは、第２の態様のベクターは、エピソームベクターである。
好ましくは、第２の態様のベクターは、組換え型である。組換えベクターは、他の機能的エレメントを含んでいてもよい。例えば、それらはさらに、様々な他の機能的エレメントを含んでいてもよい。例えば、ベクターは、宿主細胞の核において自律的に複製することができるか、またはベクターは、好ましくは宿主細胞の核において自律的に複製することが不可能である。この場合、ＤＮＡ複製を誘導または調節するエレメントが組換えベクターに必要とされる場合がある。あるいは、組換えベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれるように設計される場合がある。この場合、（例えば、相同組換えによる）標的化された組込みを促進するＤＮＡ配列が想定される。好適なプロモーターとしては、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＰＧＫ、ウイルス性長い末端反復、および誘導性プロモーター、例えばテトラサイクリン誘導性システムなどが例示され得る。カセットまたはベクターはまた、βグロビン、ＳＶ４０ポリアデニル化配列または合成ポリアデニル化配列のようなターミネーターを含んでいてもよい。組換えベクターはまた、必要に応じて核酸の発現を制御するための制御因子またはエンハンサーを含んでいてもよい。

【0134】

ベクターは、クローニングプロセスにおいて選択可能なマーカーとして使用され得る、すなわち、トランスフェクションまたは形質転換された細胞の選択を可能にし、異種ＤＮＡを組み込んだベクターを保有する細胞の選択を可能にする遺伝子をコードするＤＮＡを含んでいてもよい。例えば、アンピシリン、ネオマイシン、ピューロマイシンまたはクロラムフェニコール耐性が想定される。あるいは、選択可能なマーカー遺伝子は、遺伝子構築物を含むベクターと同時に使用するために、異なるベクターに存在してもよい。ベクターは、ヌクレオチド配列の発現の制御に関与するＤＮＡ、または発現したポリペプチドを宿主細胞の特定の部分に標的化するためのＤＮＡを含んでいてもよい。

【0135】

第３の態様では、治療に使用するための、第１の態様に記載の遺伝子構築物、または第２の態様に記載のベクターが提供される。
第４の態様では、がんの処置、予防または改善に使用するための、第１の態様に記載の遺伝子構築物、または第２の態様に記載のベクターが提供される。

【0136】

第５の態様では、対象におけるがんを処置、予防または改善する方法が提供され、この方法は、そのような処置を必要とする患者に、第１の態様に記載の遺伝子構築物、または第２の態様に記載のベクターの治療上有効な量を投与すること、または投与したことを含む。

【0137】

好ましくは、がんはＴ－ＡＬＬである。
本発明に記載の遺伝子構築物またはベクター（本明細書では「薬剤」と総称する）は、治療、好ましくはがんの処置、改善または予防のために、単剤療法（例えば、遺伝子構築物またはベクターの単独使用）で使用されてもよいことが理解されるであろう。あるいは、本発明に記載の薬剤は、治療、好ましくはがんの処置、改善、または予防のために、既知の治療法の補助として、または既知の治療法と組み合わせて使用されてもよい。

【0138】

本発明に記載の薬剤は、特に、組成物が使用される方法に依存して、多数の異なる形態を有する組成物中に組み合わされされてもよい。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル剤、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液、または処置を必要とする人または動物に投与され得る任意の他の適切な形態の形態であってもよい。本発明に記載の医薬のビヒクルは、それが投与される対象によって十分に許容されるものであるべきであることが理解されるであろう。

【0139】

本発明の薬剤を含む医薬は、多くの方法で使用され得る。例えば、経口投与が必要な場合があり、その場合、薬剤は、例えば、錠剤、カプセル剤または液体の形態で経口摂取され得る組成物内に含まれ得る。本発明の薬剤および医薬品を含む組成物は、吸入（例えば、経鼻）により投与されてもよい。組成物はまた、局所的な使用のために処方され得る。例えば、クリームまたは軟膏は、皮膚に適用され得る。

【0140】

本発明に記載の薬剤および医薬はまた、徐放性または遅延放出性の装置内に組み込まれてもよい。このような装置は、例えば、皮膚上または皮膚下に挿入されてもよく、医薬は数週間または数カ月にわたって放出され得る。装置は、少なくとも処置部位に隣接して配置されてもよい。このような装置は、本発明に従って使用される薬剤による長期処置が必要であり、通常、頻繁な投与（例えば、少なくとも毎日の注射）を必要とする場合に、特に有利である場合がある。

【0141】

好ましい実施形態では、本発明に記載の薬剤および医薬は、血流中への注射または処置を必要とする部位への直接の注射によって対象に投与されてもよい。注射は、静脈内（ボーラスもしくは注入）または皮下（ボーラスもしくは注入）、または皮内（ボーラスもしくは注入）であってもよい。

【0142】

必要な遺伝子構築物またはベクター（すなわち薬剤）の量は、その生物学的活性およびバイオアベイラビリティによって決定され、その次に、投与様式、薬剤の物理化学的特性、および単剤療法または併用療法として使用されているかどうかに依存することが理解されるであろう。また、投与頻度は、処置対象内の薬剤の半減期にも影響されるであろう。投与すべき最適な用量は当業者によって決定され、使用する特定の薬剤、医薬組成物の強度、投与様式、および処置される疾患、例えばがんの進行度によって変化するであろう。処置される特定の対象に依存する追加の要因は、対象の年齢、体重、性別、食事、および投与時間を含む、投与量を調整する必要性をもたらすであろう。

【0143】

一般に、本発明に記載の薬剤は、０．００１μｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重の間の１日量で、どの薬剤であるかにもよるが、治療、特にがんの処置、改善、または予防に使用される場合がある。より好ましくは、薬剤の１日量は、０．０１μｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ／ｋｇ体重の間、より好ましくは０．１μｇ／ｋｇ体重から１００μｇ／ｋｇ体重の間、最も好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ体重から１０μｇ／ｋｇ体重の間である。

【0144】

あるいは、対象に投与される用量は、０．５×１０^７から５×１０^１２形質導入単位（ＴＵ）／Ｋｇ体重の間であってもよい。より好ましくは、対象に投与される用量は、０．５×１０^８から５×１０^１１ＴＵ／Ｋｇ体重の間であってもよい。最も好ましくは、対象に投与される用量は、０．５×１０^９から５×１０^１０ＴＵ／Ｋｇ体重の間であってもよい。

【0145】

本剤は、がんの発症前、発症中または発症後に投与される場合がある。１日の投与量は、単回投与（例えば、１日１回の注射）として行われる場合がある。あるいは、薬剤は、１日の間に２回またはそれ以上の投与を必要とする場合がある。一例として、薬剤は、０．０７μｇから７００ｍｇの間（すなわち、７０ｋｇの体重を想定）の１日の投与量を２回（または処置される疾患、例えばがんの重症度に応じてそれ以上）として投与される場合がある。処置を受ける患者は、起床時に１回目の投与を行い、夕方に２回目の投与を行うか（２回投与レジメンの場合）、その後３時間または４時間間隔で投与する場合がある。あるいは、薬剤は週に１回、月に１回でも投与が必要な場合がある。あるいは、徐放装置を使用して、繰り返し投与する必要なく、本発明に記載の薬剤の最適用量が患者に提供される場合がある。本発明に記載の薬剤の特定の製剤および正確な治療レジメン（薬剤の１日の投与量および投与頻度など）を形成するために、製薬業界で従来採用されているような既知の手順（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ実験、臨床試験など）が使用される場合がある。

【0146】

本発明の第６の態様では、第１の態様に記載の遺伝子構築物、または第２の態様に記載のベクター、および場合により薬学的に許容されるビヒクル、を含む医薬組成物が提供される。

【0147】

医薬組成物は、好ましくは抗がん組成物、すなわち対象におけるがんの治療的改善、予防または処置に使用される医薬製剤であり、好ましくは対象におけるＴ－ＡＬＬの治療的改善、予防または処置に使用される医薬製剤である。

【0148】

本発明はまた、第７の態様において、第６の態様に記載の医薬組成物を製造するためのプロセスを提供し、該プロセスは、治療上有効な量の第１の態様に記載の遺伝子構築物、または第２の態様に記載のベクターを、薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせることを含む。

【0149】

「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、または家畜家禽であってもよい。したがって、本発明に記載の医薬は、任意の哺乳動物、例えば家畜（例えばウマ）、ペットを処置するために使用されてもよく、または他の獣医学的用途に使用されてもよい。最も好ましくは、対象はヒトである。

【0150】

遺伝子構築物またはベクターの「治療上有効な量」とは、対象に投与された場合に、処置される疾患、例えばがんを処置するため、または所望の効果をもたらすために必要な薬剤の量である任意の量である。

【0151】

例えば、使用される遺伝子構築物またはベクターの治療上有効な量は、約０．００１ｎｇから約１ｍｇ、好ましくは約０．０１ｎｇから約１００ｎｇであってもよい。遺伝子構築物またはベクターの量は、約０．１ｎｇから約１０ｎｇ、最も好ましくは約０．５ｎｇから約５ｎｇの量であることが好ましい。

【0152】

本明細書で言及される「薬学的に許容されるビヒクル」とは、医薬組成物の製剤化に有用であることが当業者に知られている任意の公知化合物または公知化合物の組合せである。

【0153】

一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは固体であってもよく、組成物は粉末または錠剤の形態であってもよい。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、香味料、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮補助剤、不活性結合剤、甘味料、保存料、染料、被覆剤、または錠剤崩壊剤として働くこともある１つまたは複数の物質を含んでいてもよい。ビヒクルはまた、カプセル化材料であってもよい。粉末では、ビヒクルは、本発明に記載の微細に分割された活性剤と混和される微細に分割された固体である。錠剤では、活性剤は、必要な圧縮特性を有するビヒクルと適切な割合で混合され、所望の形状およびサイズに圧縮されていてもよい。粉末および錠剤は、好ましくは９９％までの活性剤を含む。好適な固体ビヒクルとしては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖類、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂が挙げられる。別の実施形態では、医薬ビヒクルはゲルであってもよく、組成物はクリームなどの形態であってもよい。

【0154】

しかしながら、医薬ビヒクルは液体であってもよく、医薬組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ剤、エリキシル剤および加圧組成物の調製に使用される。本発明に記載の活性剤は、水、有機溶媒、両者の混合物、または薬学的に許容される油または脂肪などの薬学的に許容される液体ビヒクル中に溶解または懸濁される場合がある。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存料、甘味料、香味料、懸濁化剤、増粘剤、着色料、粘度調節剤、安定剤または浸透圧調節剤などの他の適切な医薬添加物を含むことができる。経口および非経口投与のための液体ビヒクルの好適な例としては、水（部分的に上記のような添加物を含む、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコールを含む、例えばグリコール）およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば分画ヤシ油およびラッカセイ油）である。非経口投与の場合、ビヒクルはまた、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルのような油性エステルであり得る。非経口投与用の無菌液体形態組成物では、無菌液体ビヒクルが有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴霧剤であり得る。

【0155】

無菌の溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、特に皮下注射によって利用され得る。薬剤は、滅菌水、生理食塩水、または他の適切な滅菌注射用媒体を用いて、投与時に溶解または懸濁され得る滅菌固体組成物として調製される場合がある。

【0156】

本発明の薬剤および組成物は、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノオレート、ポリソルベート８０（ソルビトールとその無水物をエチレンオキシドで共重合したオレイン酸エステル）等を含む無菌溶液または懸濁液の形態で経口投与される場合がある。また、本発明に従って使用される薬剤は、液体または固体の組成物の形態で経口投与され得る。経口投与に適した組成物としては、丸剤、カプセル剤、顆粒、錠剤、粉末などの固体形態、溶液、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁液などの液体形態が挙げられる。非経口投与に有用な形態としては、滅菌溶液、エマルジョン、懸濁液などが挙げられる。

【0157】

本明細書で議論するように、本発明の遺伝子構築物は、レポーター遺伝子を含んでいてもよく、これは、疾患細胞において特異的に発現される場合がある。したがって、有利には、本発明の遺伝子構築物およびベクターは、頑健な診断ツールとしても使用される場合がある。本発明の構築物は、有利には、患者における腫瘍のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを検出し、腫瘍のサブタイプを特定するために使用することができ、これは、患者のための適切な処置を決定するために使用することができる。あるいは、本発明の構築物は、単にがんの存在を検出するために使用され得る。

【0158】

したがって、第８の態様では、診断に使用するための、第１の態様に記載の遺伝子構築物、または第２の態様に記載のベクターが提供される。
第９の態様では、がんの診断に使用するための、第１の態様に記載の遺伝子構築物、または第２の態様に記載のベクターが提供される。

【0159】

第１０の態様では、診断または予知の方法であって、対象から得られた試料において、第１の態様に記載の遺伝子構築物のレポーター分子、または第２の態様に記載のベクターを検出するステップを含む方法が提供される。

【0160】

第１１の態様では、対象のがんを診断または予知する方法であって、対象から得られた試料において、第１の態様に記載の遺伝子構築物のレポーター分子、または第２の態様に記載のベクターを検出するステップを含む方法が提供される。

【0161】

好ましくは、がんはＴ－ＡＬＬである。
予後は、疾患、好ましくはがんと診断された対象における治療結果を決定することに関連する場合がある。予後は、対象における疾患の進行または改善の割合および／または期間、生存の確率、および／または様々な処置レジメンの有効性を予測することに関連する場合がある。したがって、予後不良は、疾患進行、生存の確率の低さ、および処置レジメンの有効性の低下を示す場合がある。良好な予後は、疾患の消散、生存の確率の高さ、処置レジメンの有効性の高さを示す場合がある。

【0162】

診断方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで実施される場合がある。しかしながら、好ましくは、診断方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施される。好ましくは、診断方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。好ましくは、診断方法は、ｅｘ ｖｉｖｏで実施される。

【0163】

また、本発明は、がんに罹患している患者を診断するためのキットを提供する。
第１２の態様では、がんに罹患している対象、またはその素因を診断するためのキット、あるいは対象の状態の予後を提供するためのキットであって、第１の態様に記載の遺伝子構築物、または第２の態様に記載のベクターを含むキット、が提供される。

【0164】

試料は、生物学的試料または画像試料であってもよい。
画像試料は、ＰＥＴスキャン画像またはＭＲＩ画像であってもよい。
好ましくは、試料は、生物学的試料を含む。試料は、対象から取得可能な任意の材料であってもよい。

【0165】

生物学的試料は、組織または生物学的体液であってもよい。さらに、試料は、血液、血漿、血清、髄液、尿、汗、唾液、涙、乳房吸引液、母乳、前立腺液、精液、膣液、便、子宮頸部掻き取り物、サイト（ｃｙｔｅｓ）、羊水、眼内液、粘液、息中の水分、動物組織、細胞溶解物、腫瘍組織、毛髪、皮膚、頬掻き取り物、リンパ、間質液、爪、骨髄、軟骨、プリオン、骨粉、耳垢、リンパ、肉芽腫、脳脊髄液、がん生検またはそれらの組合せであってもよい。

【0166】

試料は、液体の吸引液であってもよい。例えば、試料は、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）、腹水、胸膜洗浄、または心膜洗浄であってもよい。
試料は、血液、尿、組織などを含んでいてもよい。好ましい一実施形態では、生物学的試料は、血液試料を含む。血液は、静脈血または動脈血であってもよい。血液試料は、直ちにアッセイされてもよい。あるいは、血液試料は、方法を実施する前に低温で、例えば冷蔵庫で、あるいは凍結して保存されてもよい。あるいは、血液試料は、方法が実施される前に、室温、例えば１８から２２℃の間で保存されてもよい。血液試料は、血清を含んでいてもよい。血液試料は、血漿を含んでいてもよい。好ましくは、しかしながら、検出は全血で行われ、最も好ましくは、血液試料は末梢血である。

【0167】

血液試料は、循環腫瘍細胞を含んでいてもよく、構築物を使用して循環腫瘍細胞のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを検出することができ、したがって、患者のための最良の処置オプションを特定することができるようにする。

【0168】

診断方法を実施する前に、血液はさらに処理されてもよい。例えば、クエン酸塩（クエン酸ナトリウムなど）、ヒルジン、ヘパリン、ＰＰＡＣＫ、またはフッ化ナトリウムなどの抗凝固剤が添加されてもよい。したがって、試料採取容器は、血液試料が凝固するのを防ぐために、抗凝固剤を含有してもよい。

【0169】

一実施形態では、本発明の構築物は、患者から得られた脳脊髄液において、がん細胞を検出するため、またはがんサブタイプを決定するために使用されてもよい。したがって、好ましくは、生物学的試料は、脳脊髄液を含んでいてもよい。

【0170】

本発明は、いずれかの核酸、ペプチド、またはそのバリアント、誘導体、もしくはアナログに及び、本明細書で言及されるいずれかの配列のアミノ酸配列または核酸配列、そのバリアントまたは断片、を実質的に含むことが理解されるであろう。用語「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「バリアント」および「断片」は、本明細書で言及されるいずれか１つの配列のアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する配列、例えば配列番号１から８２などとして同定される配列と４０％の同一性を有する配列であり得る。

【0171】

参照される配列のいずれかと６５％より大きい、より好ましくは７０％より大きい、さらに好ましくは７５％より大きい、なおより好ましくは８０％より大きい配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列もまた想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、本明細書で言及される配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９２％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９７％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９８％の同一性および、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。

【0172】

当業者は、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性パーセンテージを計算する方法を理解するであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性パーセンテージを計算するためには、まず２つの配列のアラインメントを作成し、次いで配列同一性値を計算する必要がある。２つの配列の同一性パーセントは、（ｉ）配列を整列するために使用される方法、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実装）、または３Ｄ比較からの構造アラインメント；および（ｉｉ）アラインメント方法によって用いられるパラメータ、例えば、ローカル対グローバルアラインメント、用いられるペアスコア行列（例えばＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）およびギャップ－ペナルティ、例えば関数形式および定数、に応じて異なる値になる場合がある。

【0173】

アラインメントを行った後、２つの配列間の同一性のパーセンテージを計算する多くの異なる方法がある。例えば、同一性の数を、（ｉ）最短配列の長さ、（ｉｉ）アラインメントの長さ、（ｉｉｉ）配列の平均の長さ、（ｉｖ）非ギャップ位置の数、または（ｖ）オーバーハングを除く等価な位置の数、によって割る場合がある。さらに、同一性のパーセンテージも長さに強く依存することが理解されよう。したがって、一対の配列が短ければ短いほど、偶然に発生すると予想される配列同一性が高くなる場合がある。

【0174】

したがって、タンパク質配列またはＤＮＡ配列の正確なアラインメントは複雑なプロセスであることが理解されるであろう。一般的なマルチプルアラインメントプログラムであるＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２、４６７３～４６８０頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４、４８７６～４８８２頁）は、本発明に従って、タンパク質またはＤＮＡのマルチプルアラインメントを生成するための好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの適切なパラメータは、以下の通りである。ＤＮＡアラインメントの場合：ギャップ開始ペナルティ＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティ＝６．６６、および行列＝同一性。タンパク質アラインメントの場合：ギャップ開始ペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、および行列＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡおよびタンパク質のアラインメントの場合：ＥＮＤＧＡＰ＝－１、およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者であれば、最適な配列アライメントを行うために、これらのパラメータおよび他のパラメータを変化させることが必要であることを認識するであろう。

【0175】

好ましくは、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性パーセンテージの計算は、次いで、このようなアラインメントから（Ｎ／Ｔ）^＊１００として計算される場合があり、ここでＮは配列が同一の残基を共有する位置の数、Ｔはギャップを含み、オーバーハングを含むか含まない比較された位置の総数である。好ましくは、オーバーハングが計算に含まれる。したがって、２つの配列間の同一性パーセンテージを計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて、例えば上記のような適切なパラメータセットを使用して、配列アラインメントを準備すること；および（ｉｉ）ＮおよびＴの値を以下の式：配列の同一性＝（Ｎ／Ｔ）^＊１００に挿入すること、を含む。

【0176】

類似の配列を同定するための代替方法は、当業者に公知であろう。例えば、実質的に類似したヌクレオチド配列は、厳密な条件下でＤＮＡ配列またはそれらの相補体にハイブリダイズする配列によってコードされるであろう。厳密な条件とは、本発明者らは、ヌクレオチドが、約４５℃の３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルター結合したＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズし、その後約２０から６５℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で少なくとも１回洗浄することを意味する。あるいは、実質的に類似したポリペプチドは、例えば、配列番号１から８２のアミノ酸配列に示される配列から、少なくとも１つ、しかし５、１０、２０、５０または１００アミノ酸未満だけ異なっていてもよい。

【0177】

遺伝暗号の縮重により、本明細書に記載される任意の核酸配列は、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を与えることなく変化または変更され、その機能的バリアントを提供し得ることは明白である。好適なヌクレオチドバリアントは、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化した配列を有するものであり、したがって、サイレント（同義）変化を生じさせる。他の適切なバリアントは、相同なヌクレオチド配列を有するが、配列のすべて、または一部を含み、それが置換するアミノ酸と同様の生物物理的特性を有する側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換により変化し、保存的変化をもたらす。例えば、小さな非極性疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、メチオニンが挙げられる。大きな非極性の疎水性アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンが挙げられる。極性の中性アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、リジン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。したがって、どのアミノ酸を同様の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置換してもよいかが理解され、当業者はこれらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列がわかるであろう。

【0178】

本明細書（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）に記載されたすべての特徴、および／または、このように開示された任意の方法またはプロセスのすべてのステップは、そのような特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互に排他的である組合せを除いて、任意の組合せで上記の態様のいずれかと組み合わせてもよい。

【0179】

本発明をより良く理解するために、また、本発明の実施形態がどのように実施され得るかを示すために、次に、例として、添付の図が参照される。

【図面の簡単な説明】

【0180】

【図1】標的ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡを介したサイレンシングの概略図である。ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、いずれも遺伝子前駆体から転写される。次いで、ｍｉＲＮＡはそれらの標的ｍＲＮＡの相補的領域に結合し分解に至る。

【図2】Ｔ－ＡＬＬ細胞における治療用遺伝子送達のための、本発明のマイクロＲＮＡ検出器システムおよび関連する遺伝子構築物の一実施形態の概略図である。

【図3】ＲＴ－ｑＰＣＲによって決定され、２^{－ΔΔＣｔ}法を使用して計算されたＴ－ＡＬＬ細胞と非Ｔ－ＡＬＬ細胞におけるマイクロＲＮＡ相対発現を示す図である。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図4】ＳＢＩのｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ（ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ）発現ベクターの一実施形態の概略図である。

【図5】Ｌａｃオペロンを発現させるために改変された双方向性レンチウイルス発現ベクター（「ｂｄＬＶ」）の概略図であり、２ステップのアプローチを示す図である。

【図6】ＥＦ１プロモーターの下流にＬａｃオペレーター配列（ＬａｃＯ）をクローニングした結果を示す図である。Ａ）は、ｂｄＬＶベクターまたはｂｄＬＶ＿ＬａｃＯベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のＧＦＰ発現を示す図である。Ｂ．ｉ）は、ｂｄＬＶ＿ＬａｃＯベクターまたはＢｄＬＶ＿ＬａｃＯベクターおよびＬａｃＩベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のＧＦＰ発現を示す図である。Ｂ．ｉｉ）は、ｂｄＬＶ＿ＬａｃＯベクターおよびＬａｃＩベクターで共トランスフェクトし、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）で２４時間および４８時間処理したか否かの２９３Ｔ細胞のＧＦＰ発現を示す図である。Ｕｎｔ．＝非トランスフェクト。

【図7】ＰＧＫプロモーターの下流にＬａｃリプレッサー（ＬａｃＩ）をクローニングした結果を示す図である。ｂｄＬＶ＿ＬａｃＯベクターまたはｂｄＬＶ＿ＬａｃＩ＿ＬａｃＯベクターでトランスフェクトし、ＩＰＴＧで処理した２９３Ｔ細胞のＧＦＰ発現（強度および幾何平均）を示す。Ｕｎｔ．＝非トランスフェクト。

【図8】マイクロＲＮＡ検出器システムの２つの実施形態（ＡおよびＢ）と、マイクロＲＮＡ標的部位の可能な組合せＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ）を有する関連遺伝子構築物の概略図である。

【図8C】マイクロＲＮＡ検出器システムの２つの実施形態（ＡおよびＢ）と、マイクロＲＮＡ標的部位の可能な組合せＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ）を有する関連遺伝子構築物の概略図である。

【図8D】マイクロＲＮＡ検出器システムの２つの実施形態（ＡおよびＢ）と、マイクロＲＮＡ標的部位の可能な組合せＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ）を有する関連遺伝子構築物の概略図である。

【図8E】マイクロＲＮＡ検出器システムの２つの実施形態（ＡおよびＢ）と、マイクロＲＮＡ標的部位の可能な組合せＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ）を有する関連遺伝子構築物の概略図である。

【図8F】マイクロＲＮＡ検出器システムの２つの実施形態（ＡおよびＢ）と、マイクロＲＮＡ標的部位の可能な組合せＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ）を有する関連遺伝子構築物の概略図である。

【図8G】マイクロＲＮＡ検出器システムの２つの実施形態（ＡおよびＢ）と、マイクロＲＮＡ標的部位の可能な組合せＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ）を有する関連遺伝子構築物の概略図である。

【図8H】マイクロＲＮＡ検出器システムの２つの実施形態（ＡおよびＢ）と、マイクロＲＮＡ標的部位の可能な組合せＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ）を有する関連遺伝子構築物の概略図である。

【図8I】マイクロＲＮＡ検出器システムの２つの実施形態（ＡおよびＢ）と、マイクロＲＮＡ標的部位の可能な組合せＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ）を有する関連遺伝子構築物の概略図である。

【図8J】マイクロＲＮＡ検出器システムの２つの実施形態（ＡおよびＢ）と、マイクロＲＮＡ標的部位の可能な組合せＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ）を有する関連遺伝子構築物の概略図である。

【図8K】マイクロＲＮＡ検出器システムの２つの実施形態（ＡおよびＢ）と、マイクロＲＮＡ標的部位の可能な組合せＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ）を有する関連遺伝子構築物の概略図である。

【図8L】マイクロＲＮＡ検出器システムの２つの実施形態（ＡおよびＢ）と、マイクロＲＮＡ標的部位の可能な組合せＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ）を有する関連遺伝子構築物の概略図である。

【図9A】ｍｉＲ－２９ａおよびｍｉＲ－１４９の標的配列を有するマイクロＲＮＡ検出器の効率および特異性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検証を示す図である。Ｔ－ＡＬＬ（Ａ）および非Ｔ－ＡＬＬ（Ｂ）細胞を、マイクロＲＮＡ検出器ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ２９ａ＿４×Ｔ、ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１４９＿４×Ｔ、およびＢｄＬＶ＿ｍｉＲ２９ａ＿４×Ｔ＿ｍｉＲ１４９＿４×Ｔで形質導入した。ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで分析し、レポーター遺伝子の発現を抑制する検出器の効率を決定するための読み取りとして使用した。

【図9B】ｍｉＲ－２９ａおよびｍｉＲ－１４９の標的配列を有するマイクロＲＮＡ検出器の効率および特異性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検証を示す図である。Ｔ－ＡＬＬ（Ａ）および非Ｔ－ＡＬＬ（Ｂ）細胞を、マイクロＲＮＡ検出器ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ２９ａ＿４×Ｔ、ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１４９＿４×Ｔ、およびＢｄＬＶ＿ｍｉＲ２９ａ＿４×Ｔ＿ｍｉＲ１４９＿４×Ｔで形質導入した。ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで分析し、レポーター遺伝子の発現を抑制する検出器の効率を決定するための読み取りとして使用した。

【図10A】ｍｉＲ－１２８ａおよびｍｉＲ－１５３の標的配列を有するマイクロＲＮＡ検出器の効率および特異性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検証を示す図である。Ｔ－ＡＬＬ細胞を、マイクロＲＮＡ検出器ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１２８ａ＿４×Ｔ、ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１５３＿４×Ｔ、およびＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１２８ａ＿４×Ｔ＿ｍｉＲ１５３＿４×Ｔで形質導入した。ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで分析し、マイクロＲＮＡ検出器がＬａｃＩを介してレポーター遺伝子プロモーターを抑制解除するマイクロＲＮＡ検出器の効率を決定するための読み取りとして使用した。

【図10B】ｍｉＲ－１２８ａおよびｍｉＲ－１５３の標的配列を有するマイクロＲＮＡ検出器の効率および特異性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検証を示す図である。Ｔ－ＡＬＬ細胞を、マイクロＲＮＡ検出器ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１２８ａ＿４×Ｔ、ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１５３＿４×Ｔ、およびＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１２８ａ＿４×Ｔ＿ｍｉＲ１５３＿４×Ｔで形質導入した。ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで分析し、マイクロＲＮＡ検出器がＬａｃＩを介してレポーター遺伝子プロモーターを抑制解除するマイクロＲＮＡ検出器の効率を決定するための読み取りとして使用した。

【図11】デュアルｍｉＲＮＡ標的部位を含む構築物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検証を示す図である。

【図12】２つ、３つ、または４つのｍｉＲＮＡ標的部位を含むマイクロＲＮＡ検出器の効率および特異性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検証を示す図である。

【図13】非組込み型レンチウイルスベクターで形質導入したＴ－ＡＬＬ細胞および非Ｔ－ＡＬＬ細胞の培養におけるマイクロＲＮＡ検出器の効率および特異性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検証を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0181】

【実施例】

【0182】

実施例１
Ｔ－ＡＬＬを同定し、選択的に阻害することが可能な新規マイクロＲＮＡ検出器の概要
がんにおいて、マイクロＲＮＡの発現プロファイルは、腫瘍細胞と正常細胞を区別し、異なる発生起源とそれらの分化状態を識別することが示されている（８、９、１４、１５）。したがって、本発明者らは、Ｔ－ＡＬＬ特異的なマイクロＲＮＡ発現プロファイルを利用して、マイクロＲＮＡを使用した（１）Ｔ－ＡＬＬ細胞を識別し、次いで（２）白血病細胞への治療用遺伝子（アポトーシス誘導遺伝子）の発現を制御する、マイクロＲＮＡ検出システム（すなわち、本発明の組換え遺伝子構築物）を開発した。宿主細胞内で発現させた場合、Ｔ－ＡＬＬ細胞のみに特異的な所定のマイクロＲＮＡプロファイルに基づき、まず宿主細胞が白血病細胞であるかどうかを構築物が判定し、白血病細胞であれば、構築物は細胞死を誘導する。したがって、Ｔ－ＡＬＬ細胞内の特定のマイクロＲＮＡの発現と構築物との間の正の一致は、治療用遺伝子をそのＴ－ＡＬＬ細胞に送達し、その死が誘導されるが正常な健康細胞は死なない結果となる（図２Ａ参照）。患者の体内でＴ－ＡＬＬ細胞と非Ｔ－ＡＬＬ細胞とを区別するこのシステムの本質的な能力は、それゆえ、本発明の固有の態様である。このため、高精度腫瘍学に適用される他の遺伝子治療技術と比較して大きな優位性があり、患者に最良の有効性と安全性の結果を提供するために意図的に設計されている。

【0183】

治療用遺伝子の送達は、Ｔ－ＡＬＬ細胞のみに存在する（または高発現する）マイクロＲＮＡと、その細胞に特異的に存在しない（または著しく発現量が少ない）マイクロＲＮＡの両方によって制御される。例えば、図２Ｂを参照すると、白血病細胞は、マイクロＲＮＡ ＡおよびＢの非存在、ならびにマイクロＲＮＡ ＣおよびＤの存在によって正常細胞から識別され得ると仮定すると、治療用遺伝子は、（１）マイクロＲＮＡ ＡとＢが存在しない、（２）マイクロＲＮＡ ＣとＤが同じ細胞内で発現している、の場合にのみ送達される（図２Ｂ参照）。

【0184】

マイクロＲＮＡは、従来、遺伝子発現を負に制御するために探索されてきた。しかしながら、本発明は、治療用遺伝子の発現を正に制御するために、特定のマイクロＲＮＡの同時存在および非存在を使用する。この二重の調節は、双方向性発現ベクターと負のフィードバックループの使用によって達成される。このようなシステムはこれまで適用されておらず、治療用遺伝子を標的細胞のみに送達する技術の特異性を高め、薬物の有効性と安全性、および患者の治療結果を最大化する（図２Ｃ参照）。

【0185】

この革新的な技術は、Ｔ－ＡＬＬ治療における特異性の欠如を効果的に回避する可能性を有する。重要なことは、この戦略が、マイクロＲＮＡの発現プロファイルにばらつきのある他のがん種における同様の個別化治療の開発に応用できることを示す概念実証となることである。
材料および方法
バイオインフォマティクス解析
Ｔ－ＡＬＬ細胞に特異的なマイクロＲＮＡ発現プロファイルを定義するために、本発明者らは、公開されているヒトデータセットからマイクロＲＮＡ発現データを収集した。本発明者らは、最初に、Ｔ－ＡＬＬ試料を含む１０のヒトデータセットを特定した（１～１０）。これらのうち、４つは非腫瘍試料を欠いているため除外され（１～４）、他の２つは生データにアクセスすることが不可能であったため除外された（５、６）。分析したデータセット（７～１０）のそれぞれについて、本発明者らは非Ｔ－ＡＬＬ試料（対照群）とＴ－ＡＬＬ試料（Ｔ－ＡＬＬ群）を比較した。対照群で分析された試料は研究によって異なり、肺、結腸、膀胱、脳、腎臓、乳房、全骨髄（ＢＭ）細胞、全胸腺細胞、造血ＣＤ３４＋ＢＭ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の健康組織を含む。Ｔ－ＡＬＬ群には、Ｔ－ＡＬＬ初代細胞および細胞株が含まれた。

【0186】

Ｔ－ＡＬＬ試料において上方調節とみなされるには、その群における特定のｍｉＲＮＡの最小発現値が、対照群におけるそのｍｉＲＮＡの最大発現値よりも高くなければならなかった。同様に、対照群におけるあるｍｉＲＮＡの最小発現値がＴ－ＡＬＬ群における最大発現値よりも高い場合、そのｍｉＲＮＡはＴ－ＡＬＬ試料において下方調節されているとみなされた。この分類システムを用いて、本発明者らは、異なるデータセットにおいて下方調節および上方調節された１２のｍｉＲＮＡを特定することができた。

【0187】

その後、本発明者らは、ヒトＴ－ＡＬＬ細胞および正常細胞および組織から得られた一般に入手可能なマイクロＲＮＡデータのバイオインフォマティクス解析により、さらなるＴ－ＡＬＬ特異的なマイクロＲＮＡ発現プロファイルを確立した。これらのデータセットは、約１４０種類のＴ－ＡＬＬ細胞株と患者細胞、ならびに脳、肝臓、腎臓、肺、心臓、乳房、膀胱、結腸、子宮、皮膚、卵巣、膵臓、前立腺、胃、精巣、髄膜、甲状腺、胸腺、骨髄、脾臓、リンパ節、末梢血などの約４８０種類の正常組織試料を包含する。造血器官およびリンパ系器官は、造血幹細胞や前駆細胞など、異なる系統と異なる分化段階をカバーした。

【0188】

この解析により、以下の表１に示すように、２５のマイクロＲＮＡが同定された。

【0189】

【表1-1】

【0190】

【表1-2】

【0191】

このリストに基づき、本発明者らは、以下の表２に示すように、マイクロＲＮＡ検出器の構築に使用される可能性が最も高い１６のマイクロＲＮＡを掲載した。

【0192】

【表2】

【0193】

マイクロＲＮＡ発現プロファイルの検証
Ｔ－ＡＬＬ特異的なマイクロＲＮＡ発現プロファイルの検証は、ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、それぞれのマイクロＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ定量化により実施した。異なる分化段階に対応するＴ－ＡＬＬ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ、ＤＮＤ４．１、ＭＯＬＴ４、ＣＥＭ、ＳＵＰ－Ｔ１、ＨＰＢ－ＡＬＬ、ＴＡＬＬ－１、Ｐ１２およびＬｏｕｃｙ）ならびに２９３Ｔ、Ａ５４９、ＭＤＡ２３１、ＣａＣＯ２、Ｕ２ＯＳ、ＨＣＴ－１１６、ＡＣＨＮ、Ａ４９８およびＤ４５８のようないくつかの非Ｔ－ＡＬＬ細胞株においてマイクロＲＮＡ発現を解析した。

【0194】

Ｔ－ＡＬＬ細胞株は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を補充したＬ－グルタミンを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。非Ｔ－ＡＬＬ細胞株は、以下のように、２９３Ｔ、Ａ５４９、ＭＤＡ２３１およびＣａＣＯ２は、１０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したダルベッコ改変イーグル培地で、Ｕ２ＯＳ、ＨＣＴ－１１６は１０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むマッコイ５Ａ培地で、ＡＣＨＮおよびＡ４９８は１０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むイーグル最小必須培地で、Ｄ４５８は１０％ＦＢＳと１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むイスコベ改変ダルベッコ培地、で培養した。すべての細胞株は、３７℃、５％ＣＯ_２環境で保存した。

【0195】

製造業者のプロトコールに従い、ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて、細胞から全ＲＮＡを抽出した。次に、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＫｉｔとＴａｑＭａｎ ｍｉＲＮＡ Ａｓｓａｙｓを併用して、マイクロＲＮＡ発現量の定量を行った。これは、マイクロＲＮＡ ＲＴ特異的プライマーを用いて、マイクロＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することから始まる２段階のプロセスである。この反応に続いて、ｍｉｃｒｏＲＮＡ特異的なＴａｑＭａｎプローブを用いて、マイクロＲＮＡをリアルタイムＰＣＲで増幅する。ＰＣＲ反応は、Ｖｉｉ７ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムを用いて実施した。マイクロＲＮＡの発現はＲＮＵ６ｂを用いて正規化し、マイクロＲＮＡの相対発現は２^{－ΔΔＣｔ}法で計算した。
マイクロＲＮＡ検出器の技術設計
図４に示すように、ｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ（ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ）発現ベクター（ＳＢＩ）を骨格として用いて、マイクロＲＮＡ検出器（すなわち本発明の構築物）を構築した。この双方向性プロモーター発現ベクターは、構成的ＥＦ１プロモーターでＧＦＰを発現させることができる。負の方向では、ＰＧＫプロモーターがピューロマイシンマーカーの発現を駆動する。概念実証の目的で、ＧＦＰを治療用遺伝子の代替として使用した。

【0196】

本発明者らは、まず、図４に示すベクター骨格である双方向性レンチウイルス発現ベクター（ｂｄＬＶ）にＬａｃオペロンシステムを導入することから始めた。このプロセスは以下を含む。
ステップ１。ＥＦ１プロモーターの下流にＬａｃオペレーター配列（ＬａｃＯ）をクローニングする
この目的のために、本発明者らは、ｐＯＰＩ３ＣＡＴ（ＡｇｉｌｅｎｔのＬａｃＳｗｉｔｃｈ ＩＩ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）からＬａｃ Ｏｐｅｒａｔｏｒ配列を３コピー含むＳＶ４０イントロン（ＳＶ４０ｉｎｔｒｏｎ／３ＬａｃＯ）を増幅してｂｄＬＶ（ｂｄＬＶ＿ＬａｃＯ）にクローニングした。ＳＶ４０ｉｎｔｒｏｎ／３ＬａｃＯは、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩの制限部位を持つプライマーを使用して増幅した（表３）。増幅後、ＰＣＲ産物とＢｄＬＶベクターの両方をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ制限酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で消化した。消化されたＳＶ４０ｉｎｔｒｏｎ／３ＬａｃＯ ＰＣＲ産物とＢｄＬＶベクターを、次いでＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用してライゲーションした。ＬａｃＯ配列の正しい挿入は、制限酵素診断消化とサンガー配列決定によって確認した。
ステップ２。ＰＧＫプロモーターの下流にＬａｃリプレッサー（ＬａｃＩ）をクローニングする。

【0197】

このステップは、ＬａｃＩによるピューロマイシンの置換を含む（逆方向）。ＬａｃＩを、ｐＣＭＶＬａｃＩベクター（ＡｇｉｌｅｎｔのＬａｃＳｗｉｔｃｈ ＩＩ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）からＰＣＲ増幅し、逆方向で得られるより小さなベクター（ｐｃＤＮＡ３．１＋）にサブクローニングした。そのために、ＬａｃＩ＿ＮＬＳを、平滑末端ＳｍａＩの制限部位を持つプライマーを使用して増幅した（表３）。精製後、ＬａｃＩ＿ＮＬＳ ＰＣＲ産物およびｐｃＤＮＡ３．１＋ベクターをＳｍａＩ（ＮＥＢ）で消化した。消化されたＬａｃＩ＿ＮＬＳ断片とｐｃＤＮＡ３．１＋ベクターを、次いでＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用してライゲーションした。ＬａｃＩが正しい向きで挿入されていることは、制限酵素消化とサンガー配列決定によって確認した。次に、定方向突然変異誘発（ＡｇｉｌｅｎｔのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット）を使用して、ｂｄＬＶ＿ＬａｃＯベクターからピューロマイシンｃＤＮＡを切り出し、それをＬａｃＩで置換するために必要な制限酵素部位を作成した。ｂｄＬＶ＿ＬａｃＯのサイズ（約１０Ｋｂ）のため、ｂｄＬＶ＿ＬａｃＯベクターの変異させる領域（ピューロマイシンおよび隣接する配列）を除去し、ｐｃＤＮＡ３．１＋ベクターにサブクローニングした。より具体的には、制限酵素ＮｏｔＩとＥｃｏＲＩを用いて、ｂｄＬＶ＿ＬａｃＯとｐｃＤＮＡ３．１＋の両ベクターを消化した。ピューロマイシン消化産物および消化されたｐｃＤＮＡ３．１＋を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用してライゲーションした。この中間的な小さいベクター（約６．７Ｋｂ）を使用して、１つのＸｈｏＩ制限部位を除去し、ＡｖｒＩＩ制限部位を生成した。一度突然変異させると、ピューロマイシンおよび隣接する領域は、ＨｐａＩおよびＳｐｅＩに対する制限酵素部位を有するプライマー（表３）を使用して増幅され、ＰＣＲ産物とこれらの酵素で消化したベクターとのライゲーションによりｂｄＬＶベクターに再びクローニングされた。次いで、ＸｈｏＩとＡｖｒＩＩ制限酵素を使用してｂｄＬＶ＿ＬａｃＯベクターからピューロマイシンを除去し、同じ酵素を使用してｐｃＤＮＡ３．１＋ベクター＿ＬａｃＩからＬａｃＩを切り出した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてｂｄＬＶ＿ＬａｃＯベクターとＬａｃＩをライゲーションし、ｂｄＬＶ＿ＬａｃＩ＿ＬａｃＯベクターを作成した。ｂｄＬＶ＿ＬａｃＯベクターにＬａｃＩが正しく挿入されていることは、制限酵素診断消化とサンガー配列決定によって確認した。

【0198】

次に、本発明者らは、ｂｄＬＶ＿ＬａｃＩ＿ＬａｃＯ構築物において、レポーター遺伝子プロモーターの下流にｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－１４９、またはｍｉＲ－２９ａおよびｍｉＲ－１４９（Ｔ－ＡＬＬ細胞で特異的に非存在または下方調節されるマイクロＲＮＡ）の４つの標的部位をクローニングした。そのために、ＧＦＰの下流にＸｍａＩの制限酵素部位を作成した。それぞれのマイクロＲＮＡ（または両方）の４つの標的部位をタンデムに合成し、ＸｍａＩで消化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションしてｂｄＬＶ－ＬａｃＩ＿ＬａｃＯベクターに導入した。

【0199】

第二段階として、本発明者らは、ｂｄＬＶ＿ＬａｃＩ＿ＬａｃＯ構築物において、レポーター遺伝子プロモーターのリプレッサーの下流にｍｉＲ－１２８ａまたはｍｉＲ－１５３（Ｔ－ＡＬＬ細胞で特異的に上方調節されるマイクロＲＮＡ）の４つの標的部位をクローニングした。このため、それぞれのマイクロＲＮＡの４つの標的部位をタンデムに合成し、制限酵素ＸｈｏＩで消化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションしてｂｄＬＶ－ＬａｃＩ＿ＬａｃＯベクターに導入した。
使用した方法の参考文献
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5) Schotte, D. et al (2009) Leukemia Feb;23(2):313-22.
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10) Sanghvi, V. R. eta al. (2014) Sci. Signal. Nov 18;7(352):ra111.

【0200】

【表3】

【0201】

実施例２
Ｔ－ＡＬＬ特異的なｍｉＲＮＡ発現プロファイルの定義および検証
本発明のマイクロＲＮＡ検出器構築物の構築を開始するために、本発明者らは、公開されているヒトデータセットを利用して、暫定的なＴ－ＡＬＬ特異的マイクロＲＮＡ発現プロファイルを確立した。このアプローチを用いて、本発明者らは、Ｔ－ＡＬＬ細胞において特異的に下方調節および上方調節される１２のｍｉＲＮＡを特定することができた。

【0202】

図３に示すように、これら１２のマイクロＲＮＡをリアルタイムＰＣＲで検証した結果、ｍｉＲ－１２８ａとｍｉＲ－１５３はＴ－ＡＬＬ細胞で特異的に上方調節され、ｍｉＲ－２９ａとｍｉＲ－１４９はＴ－ＡＬＬ細胞で特異的に下方調節されることが確認された。

【0203】

その後、ヒトＴ－ＡＬＬ細胞および正常細胞および組織から得られた、一般に入手可能なマイクロＲＮＡデータのより多くのコホートのバイオインフォマティクス解析により、２５のｍｉＲＮＡが特定され、健康な細胞と比較してＴ－ＡＬＬ細胞において、特異的に下方調節される（ｍｉＲ－５３９－５ｐ、ｍｉＲ－４８７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－６５５－３ｐ、ｍｉＲ－４１１－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－１１８５－５ｐ、ｍｉＲ－４８３－５ｐ、ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｍｉＲ－５７４－３ｐおよびｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ）ならびに上方調節される（ｍｉＲ－３６８７、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－６０８７、ｍｉＲ－１０６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－７７０４、ｍｉＲ－５７０１、ｍｉＲ－７６６－５ｐ、ｍｉＲ－３６０９、ｍｉＲ－３６１５およびｍｉＲ－４７４６－５ｐ）が特定された。これらは、マイクロＲＮＡ検出器の構築に使用される可能性が最も高い１６のマイクロＲＮＡに掲載され、Ｔ－ＡＬＬ細胞では、１０の（ｍｉＲ－５３９－５ｐ、ｍｉＲ－４８７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－６５５－３ｐ、ｍｉＲ－４１１－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－１１８５－５ｐおよびｍｉＲ－４８３－５ｐ）が特異的に下方調節され、６の（ｍｉＲ－３６８７、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－２０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－６０８７、ｍｉＲ－１０６ａ－３ｐおよびｍｉＲ－７７０４）が特異的に上方調節された。

【0204】

実施例３
マイクロＲＮＡ検出器／構築物の設計および構築
本発明者らが開発したマイクロＲＮＡ検出器構築物は、双方向性レンチウイルス発現ベクターからなり、治療用遺伝子を一方のプロモーターで発現させ、治療用遺伝子プロモーターのリプレッサーを第２プロモーターで発現させる。リプレッサーとしては、Ｌａｃオペロンシステムが使用される。両ｍＲＮＡの発現は、Ｔ－ＡＬＬ細胞特異的マイクロＲＮＡによって制御される。概念実証のため、アポトーシス誘導遺伝子の代わりにＧＦＰを使用した（すなわち、ＧＦＰ発現を治療用遺伝子の代替として使用した）。

【0205】

図４に示すように、検出器システムの骨格として、本発明者らは、ＳＢＩのｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ（ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ）発現ベクター（ＢｄＬＶと称する）を使用した。この双方向性プロモーター発現ベクターは、構成的ＥＦ１プロモーターでＧＦＰを発現させることができる。負の方向ではＰＧＫプロモーターがピューロマイシンマーカーの発現を駆動する。

【0206】

本発明者らは、図５に示すように、骨格ベクターにＬａｃオペロンシステムを導入し、これを抑制システムとして機能させた。そのプロセスは２つのステップに分割された。
ｉ）ＥＦ１プロモーターの下流にＬａｃオペレーター配列（ＬａｃＯ）をクローニングする
図６に示すように、Ｌａｃリプレッサー（ＬａｃＩ）はプロモーターのＬａｃオペレーター（ＬａｃＯ）調節部位に結合して転写を停止するため、ＬａｃＯ配列の挿入がＥＦ１プロモーターによるＧＦＰ発現に影響しないことが確認された（図６Ａ）。

【0207】

本発明者らは、ＬａｃＯが機能性であることをさらに確認した。本発明者らは、ＬａｃＩタンパク質がｂｄＬＶ＿ＬａｃＯのＬａｃオペレーター配列に結合し、ＥＦ１プロモーターによるＧＦＰ発現を抑制することが可能であることを確認した。図６Ｂｉに示すように、ｂｄＬＶ＿ＬａｃＯ発現細胞にＬａｃＩ発現ベクターをトランスフェクションすると、ＧＦＰの発現が低下した。本発明者らは、ＬａｃＩおよびｂｄＬＶ＿ＬａｃＯベクターを共トランスフェクトした細胞をイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で２４時間および４８時間処理することによって、ＥＦ１プロモーターを抑制するＬａｃＯの能力をさらに確認した。ＩＰＴＧはＬａｃＩに結合して抑制する。したがって、細胞をＩＰＴＧで処理した場合に観察されるＧＦＰ発現の増加は、ＩＰＴＧの非存在下で、ＬａｃＩがＬａｃオペレーター配列に結合して、ＥＦ１プロモーターによるＧＦＰ転写を抑制することを示す（図６Ｂｉｉ）。
ｉｉ）ＰＧＫプロモーターの下流にＬａｃリプレッサー（ＬａｃＩ）をクローニングする
このステップは、ＬａｃＩによるピューロマイシンの置換を含む（逆方向）。ＬａｃＩを、ｐＣＭＶＬａｃベクター（ＡｇｉｌｅｎｔのＬａｃＳｗｉｔｃｈ ＩＩ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）からＰＣＲ増幅し、逆方向で発現されるより小さなベクター（ｐＣＤＮ３．１＋）にサブクローニングした。次に、定方向突然変異誘発を使用して、ｂｄＬＶ＿ＬａｃＯベクターからピューロマイシンｃＤＮＡを切り出し、それをＬａｃＩで置換するために必要な制限酵素部位を作成した。

【0208】

図７に示すように、本発明者らは、ＰＧＫプロモーターによって発現されたＬａｃＩタンパク質が、ｂｄＬＶ＿ＬａｃＩ＿ＬａｃＯのＬａｃオペレーター配列に結合し、ＥＦ１プロモーターによるＧＦＰ発現を抑制する、機能性を有することを確認した。このため、ｂｄＬＶ＿ＬａｃＩ＿ＬａｃＯベクターをトランスフェクションした細胞をＩＰＴＧで処理した。ＰＧＫによって発現されるＬａｃＩタンパク質が機能性である場合、ＩＰＴＧによる処理はＧＦＰの発現を増加させるはずである。本発明者らは、ＩＰＴＧで処理することにより、約５０％のＧＦＰ発現が抑制解除されることを確認した。

【0209】

次いで、本発明者らは、図８Ａに示すように、ｂｄＬＶ＿ＬａｃＩ＿ＬａｃＯ構築物において、レポーター遺伝子プロモーターの下流にｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－１４９、またはｍｉＲ－２９ａおよびｍｉＲ－１４９（Ｔ－ＡＬＬ細胞で特異的に非存在または下方調節されるマイクロＲＮＡ）の４つの標的部位をクローニングした。第二段階として、本発明者らは、図８Ｂに示すように、ｂｄＬＶ＿ＬａｃＩ＿ＬａｃＯ構築物において、レポーター遺伝子プロモーターのリプレッサーの下流にｍｉＲ－１２８ａまたはｍｉＲ－１５３（Ｔ－ＡＬＬ細胞で特異的に上方調節されるマイクロＲＮＡ）の４つの標的部位をクローニングした。

【0210】

実施例４
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるマイクロＲＮＡ検出器の効率および特異性の試験
ｉｎ ｖｉｔｒｏで白血病細胞を選択的に標的とするための異なるマイクロＲＮＡ検出器の実際の効率と特異性を評価するために、本発明者らは、マイクロＲＮＡ検出器ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ２９ａ＿４×Ｔ、ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１４９＿４×Ｔ、およびＢｄＬＶ＿ｍｉＲ２９ａ＿４×Ｔ＿ｍｉＲ１４９＿４×Ｔを形質導入したＴ－ＡＬＬ（図９Ａおよび９Ｂの「Ａ」）または非Ｔ－ＡＬＬ（図９Ａおよび９Ｂの「Ｂ」）細胞の培養から始めた。

【0211】

ＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析により、本発明者らは、試験したそれぞれのマイクロＲＮＡ検出器の効率および特異性を決定することができた（図９Ａおよび９Ｂ参照）。その結果、ｍｉＲ２９ａまたはｍｉＲ１４９を発現する細胞において、マイクロＲＮＡ検出器ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ２９ａ＿４×ＴおよびＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１４９＿４×Ｔ（それぞれ）は、レポーター遺伝子の発現を効率的に抑制する（ＢｄＬＶ＿ＬａｃＩ＿ＬａｃＯ形質導入細胞と比較して最大９０％のＧＦＰ発現抑制）ことがわかった（図９ＡとＢを参照のこと）。これらのマイクロＲＮＡのいずれも発現していない細胞では、それぞれのマイクロＲＮＡ検出器を用いた形質導入はＧＦＰ発現に影響を与えなかった（図９Ａおよび９Ｂの「Ａ」）。重要なことは、ｍｉＲ２９ａとｍｉＲ１４９の両方を発現している細胞では、ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ２９ａ＿４×Ｔ＿ｍｉＲ１４９＿４×Ｔ検出器による形質導入は相加効果を持ち、ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ２９ａ＿４×ＴとＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１４９＿４×Ｔ検出器を超える、ＧＦＰ発現に対する抑制効果を誘導する（図９Ａおよび９Ｂの「Ｂ」）。

【0212】

ここで図１０Ａおよび図１０Ｂを参照すると、本発明者らは、次いで、マイクロＲＮＡ検出器ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１２８＿４×Ｔ、ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１５３＿４×ＴおよびＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１２８＿４×Ｔ＿ｍｉＲ１５３＿４×Ｔで形質導入したＴ－ＡＬＬ細胞の培養を行った。ＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析により、ｍｉＲ１２８およびｍｉＲ１５３を発現するＴ－ＡＬＬ細胞において、マイクロＲＮＡ検出器ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１２８＿４×Ｔ、ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１５３＿４×ＴおよびＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１２８＿４×Ｔ＿ｍｉＲ１５３＿４×Ｔは、効率的にレポーター遺伝子の発現を抑制解除した（ＢｄＬＶ＿ＬａｃＩ＿ＬａｃＯ形質導入細胞と比較してＧＦＰ発現が最大４０倍増加）（図１０Ａおよび１０Ｂ参照）。

【0213】

ここで図１１を参照すると、本発明者らは、存在するまたは上方調節されたマイクロＲＮＡおよび存在しないまたは下方調節されたマイクロＲＮＡによって調節されたマイクロＲＮＡ検出器を形質導入した細胞の培養を行った。マイクロＲＮＡ１２８および１５３を発現しない２９３－Ｔ非Ｔ－ＡＬＬ細胞において示されるように、マイクロＲＮＡ検出器ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１２８＿４×Ｔ＿ｍｉＲ２９ａ＿４×Ｔ、ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１２８＿４×Ｔ＿ｍｉＲ１４９＿４×Ｔ、ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１２８＿４×Ｔ＿ｍｉＲ２９ａ＿４×Ｔ＿ｍｉＲ１４９＿４×ＴおよびＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１５３＿４×Ｔ＿ｍｉＲ２９ａ＿４×Ｔ＿ｍｉＲ１４９＿４×Ｔによる形質導入は、レポーター遺伝子を効率よく抑制した（ｍｉＲ２９ａおよび１４９両方の標的部位を含むマイクロＲＮＡ検出器では、ＢｄＬＶ＿ＬａｃＩ＿ＬａｃＯ導入細胞と比較して最大９０％のＧＦＰ発現抑制）。

【0214】

ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－１５３、およびｍｉＲ－２９ａを発現するＣＥＭ Ｔ－ＡＬＬ細胞については、マイクロＲＮＡ検出器ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１２８＿４×Ｔ＿ｍｉＲ２９ａ＿４×Ｔ、ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１２８＿４×Ｔ＿ｍｉＲ２９ａ＿４×Ｔ＿ｍｉＲ１４９＿４×ＴおよびＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１５３＿４×Ｔ＿ｍｉＲ２９ａ＿４×Ｔ＿ｍｉＲ１４９＿４×Ｔによる形質導入は、レポーター遺伝子を効率よく抑制する結果となった。逆に、構築物ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ１２８＿４×Ｔ＿ｍｉＲ１４９＿４×Ｔを形質導入しても、レポーター遺伝子の発現に与える影響は小さかった。

【0215】

図１２を参照すると、マイクロＲＮＡ１２８および１５３を発現しない２９３－Ｔ非Ｔ－ＡＬＬ細胞において、マイクロＲＮＡ検出器ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ－１５３＿４×Ｔ－ｍｉＲ－２９ａ＿４×Ｔ＿ｍｉＲ－１４９＿４×Ｔ、ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ－１２８＿４×Ｔ－ｍｉＲ－２９ａ＿４×Ｔ＿ｍｉＲ－１４９＿４×ＴおよびＢｄＬＶｍｉＲ－１２８＿４×Ｔ＿ｍｉＲ－１５３＿４×Ｔ－ｍｉＲ－２９ａ＿４×Ｔ＿ｍｉＲ－１４９＿４×Ｔによる形質導入は、レポーター遺伝子を効率よく抑制する結果となった。

【0216】

マイクロＲＮＡ１２８および１５３を発現するＤＮＤ４．１ Ｔ－ＡＬＬ細胞において、マイクロＲＮＡ検出器ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ－１５３＿４×Ｔ－ｍｉＲ－２９ａ＿４×Ｔ、ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ－１５３＿４×Ｔ－ｍｉＲ－１４９＿４×Ｔ、およびＢｄＬＶ＿ｍｉＲ－１２８＿４×Ｔ＿ｍｉＲ－１５３＿４×Ｔ－ｍｉＲ－１４９＿４×Ｔによる形質導入は、レポーター遺伝子を効率よく抑制解除した。ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－１５３、およびｍｉＲ－２９ａを発現するＣＥＭ Ｔ－ＡＬＬ細胞については、マイクロＲＮＡ検出器ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ－１２８＿４×Ｔ－ｍｉＲ－１４９＿４×Ｔ、ＢｄＬＶ＿ｍｉＲ－１５３＿４×Ｔ－ｍｉＲ－１４９＿４×ＴおよびＢｄＬＶ＿ｍｉＲ－１２８＿４×Ｔ ｍｉＲ－１５３＿４×Ｔ－ｍｉＲ－１４９＿４×Ｔによる形質導入は、レポーター遺伝子を効率よく抑制解除する結果となった。

【0217】

ここで図１３を参照すると、本発明者らは次いで、非組込み型レンチウイルスベクターで形質導入したＴ－ＡＬＬ細胞および非－Ｔ－ＡＬＬ細胞の培養を行った。マイクロＲＮＡ１２８および１５３を発現しない２９３－Ｔ非Ｔ－ＡＬＬ細胞において図示されるように、すべてのマイクロＲＮＡ検出器による形質導入は、レポーター遺伝子を効率よく抑制する結果となった。一方、ＣＥＭ Ｔ－ＡＬＬ細胞では、マイクロＲＮＡ検出器ｍｉＲ－１５３＿４×Ｔ－ｍｉＲ－２９ａ＿４×ＴおよびｍｉＲ－１５３＿４×Ｔ－ｍｉＲ－１４９＿４×Ｔによる形質導入は、レポーター遺伝子を効率よく抑制解除する結果となった。
考察および結論
本発明者らは、本発明の第１の態様の治療上活性な分子またはレポーター分子をコードする第１の核酸配列におけるエフェクター遺伝子の活性の調節の実例として、Ｔ－ＡＬＬ細胞においてのみＧＦＰ発現を調節するマイクロＲＮＡ検出器の実現可能性および有効性について説得力のある概念実証データを作成した。本発明者らは、このようなシステムは、将来的に、目的のがんまたは疾患に、関連するマイクロＲＮＡ標的配列を導入することにより、他のがんタイプ、あるいは他の疾患タイプにも将来にわたって適応させることができ、それによって、細胞が多様なｍｉＲＮＡプロファイルを示すあらゆる疾患においてこの遺伝子治療技術の使用への道を開くことができると予想している。

【0218】

患者の体内でＴ－ＡＬＬ細胞と非Ｔ－ＡＬＬ細胞の同一性を区別するこのシステムの本質的な能力は、それゆえ、この技術の特徴であり、高精度腫瘍学において決定的に価値のあるツールである。これまで開発された高精度腫瘍学に適用される競合遺伝子治療技術と比較して大きな優位性があり、患者に最良の有効性と安全性の結果を提供するために意図的に設計されている。この革新的な技術は、Ｔ－ＡＬＬ治療における特異性の欠如を効果的に回避する可能性を有する。重要なことは、この戦略が、他の疾患やがん細胞タイプにおける同様の個別化治療の開発に応用できることを示す概念実証となることである。さらに、本技術は、健康な細胞／組織と比較して、疾患細胞や組織のｍｉＲＮＡプロファイルが異なることを特徴とする特定の状態の診断に効果的に使用され得る。

【0219】

最後に、本発明のシステムを用いれば、治療用分子はたった１つのベクターを用いて高い特異性と効率で送達されることが可能であり、外部要因や合図による誘導を必要としない。さらに、同じ細胞内でコードされた分子の共局在化が、複数の構築物アプローチを使用して可能な場合よりも低い投与量で達成される。このように、従来の技術に比べ、本結果は非常に簡単なシステムであるため、大きな利点がある。
参考文献
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図8I】

【図8J】

【図8K】

【図8L】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】