特表 2023-540054 ＧＲＮ関連成人発症性神経変性の治療のための組換えアデノ随伴ウイルス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-21

(54)【発明の名称】ＧＲＮ関連成人発症性神経変性の治療のための組換えアデノ随伴ウイルス

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20230913BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230913BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230913BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230913BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230913BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230913BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20230913BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20230913BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230913BHJP

【ＦＩ】

A61K35/76

C12N15/864 100Z

C12N7/01 ZNA

C12N15/113 Z

C12N15/12

A61P43/00 105

A61P25/28

G01N33/68

A61K48/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023513708

(86)(22)【出願日】2021-08-26

(85)【翻訳文提出日】2023-04-26

(86)【国際出願番号】 US2021047686

(87)【国際公開番号】W WO2022046988

(87)【国際公開日】2022-03-03

(31)【優先権主張番号】63/070,639

(32)【優先日】2020-08-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＬＡＢＲＡＳＯＬ

２．ＴＷＥＥＮ

３．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】502409813

【氏名又は名称】ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア

(74)【代理人】

【識別番号】110000741

【氏名又は名称】弁理士法人小田島特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ウイルソン，ジェームス・エム

(72)【発明者】

【氏名】ヒンデラー，クリスチャン

(72)【発明者】

【氏名】ミラー，ニムロッド

【テーマコード（参考）】

2G045

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045DA36

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA44

4C084AA17

4C084MA55

4C084NA14

4C084ZA151

4C084ZB211

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA55

4C087NA14

4C087ZA15

4C087ZB21

(57)【要約】

ヒト患者における成人発症性神経変性疾患の治療に有用な治療レジメンであって、ＡＡＶ１カプシド及びプログラニュリン（ＧＲＮ）のコード配列を含むベクターゲノムを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの投与を含む、治療レジメンが提供される。また、組換えＡＡＶベクターを含む組成物、及び組換えＡＡＶベクターの投与を含む、患者における成人発症性神経変性疾患を治療する方法も提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト患者における成人発症性神経変性疾患の治療に有用な治療レジメンであって、前記レジメンが、ＡＡＶ１カプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの投与を含み、前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プログラニュリン（ＧＲＮ）のコード配列、及び標的細胞における前記プログラニュリンの発現を指示する調節配列を含み、前記投与が、
（ｉ）約３．３×１０^１０ゲノムコピー（ＧＣ）／脳質量のグラム、
（ｉｉ）約１．１×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、
（ｉｉｉ）約２．２×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、又は
（ｉｖ）約３．３×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラムを含む、単回用量の大層内（ＩＣＭ）注入を含む、治療レジメン。

【請求項2】

前記プログラニュリンのコード配列が、配列番号３、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列である、請求項１に記載のレジメン。

【請求項3】

前記ベクターゲノムが、ＣＢ７プロモーター、キメライントロン、及びウサギベータグロビンポリＡを更に含む、請求項１又は２に記載のレジメン。

【請求項4】

前記ベクターゲノムが、配列番号２４を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のレジメン。

【請求項5】

前記患者が、ＧＲＮハプロ不全及び／又は前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を有すると特定されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のレジメン。

【請求項6】

前記患者が、少なくとも３５歳である、請求項１～５のいずれか一項に記載のレジメン。

【請求項7】

前記患者は、ＣＳＦ中のプログラニュリンの濃度が低い、請求項１～６のいずれか一項に記載のレジメン。

【請求項8】

前記患者は、ＣＳＦ中のプログラニュリンの濃度が正常レベルの５０％未満である、請求項７に記載のレジメン。

【請求項9】

前記患者は、ＣＳＦ中のプログラニュリン濃度が正常レベルの約３０％である、請求項７に記載のレジメン。

【請求項10】

ＣＳＦ、血清、及び／又は血漿中のプログラニュリンのレベルを検出することを更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のレジメン。

【請求項11】

ｉ）ニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）、総タウ（Ｔ－タウ）、及びリン酸化タウ（Ｐ－タウ）のうちの１つ以上のＣＳＦレベル、
ｉｉ）網膜リポフスチンを評価すること、
ｉｉｉ）脳体積、白質完全性、並びに中前頭皮質及び頭頂領域の厚さのうちの１つ以上の変化を追跡するためにＭＲＩを実施すること、
ｉｖ）前頭葉及び／若しくは側頭葉における代謝低下を評価するためにＦＤＧ ＰＥＴを実施すること、並びに／又は
ｖ）疾患に関連する変化の減速を評価するためにＥＥＧ／誘発応答電位を測定すること、を測定することを更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のレジメン。

【請求項12】

前記単回用量が、以下の組織型：前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質、後頭部皮質、髄質、小脳、頸部脊髄、胸部脊髄、腰椎脊髄、頸部後根神経節、胸部後根神経節、腰部後根神経節、及び三叉神経節のうちのいずれか１つ以上において、１０^３ＧＣ／μｇのＤＮＡを提供するのに十分である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のレジメン。

【請求項13】

前記単回用量が、以下の組織型：前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質、後頭部皮質、髄質、小脳、頸部脊髄、胸部脊髄、腰椎脊髄、頸部後根神経節、胸部後根神経節、腰部後根神経節、及び三叉神経節のうちのいずれか１つ以上において、１０^４ＧＣ／μｇのＤＮＡを提供するのに十分である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のレジメン。

【請求項14】

ＡＡＶ１カプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えＡＡＶベクターを含む、医薬組成物であって、前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プログラニュリンのコード配列、及び標的細胞における前記プログラニュリンの発現を指示する調節配列を含み、前記組成物が、
（ｉ）約３．３×１０^１０ゲノムコピー（ＧＣ）／脳質量のグラム、
（ｉｉ）約１．１×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、
（ｉｉｉ）約２．２×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、又は
（ｉｖ）約３．３×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラムの用量を投与するために、大槽内（ＩＣＭ）注入を必要とするヒト患者への大槽内（ＩＣＭ）注入用に製剤化されている、医薬組成物。

【請求項15】

前記プログラニュリンのコード配列が、配列番号３、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列である、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記ベクターゲノムが、ＣＢ７プロモーター、キメライントロン、及びウサギベータグロビンポリＡを更に含む、請求項１４又は１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記ベクターゲノムが、配列番号２４を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項18】

成人発症性神経変性疾患を有する患者を治療する方法であって、前記方法が、ＩＣＭ注入によって単回用量の組換えＡＡＶを前記患者に投与することを含み、前記組換えＡＡＶが、ＡＡＶ１カプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ ＩＴＲ、プログラニュリンのコード配列、及び標的細胞における前記プログラニュリンの発現を指示する調節配列を含み、
前記単回用量が、
（ｉ）約３．３×１０^１０ゲノムコピー（ＧＣ）／脳質量のグラム、
（ｉｉ）約１．１×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、
（ｉｉｉ）約２．２×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、又は
（ｉｖ）約３．３×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラムである、方法。

【請求項19】

前記プログラニュリンのコード配列が、配列番号３、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記ベクターゲノムが、ＣＢ７プロモーター、キメライントロン、及びウサギベータグロビンポリＡを更に含む、請求項１８又は１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ベクターゲノムが、配列番号２４を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記患者が、ＧＲＮハプロ不全及び／又は前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を有すると特定されている、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記患者が、少なくとも３５歳である、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記患者は、ＣＳＦ中のプログラニュリンの濃度が低い、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記患者は、ＣＳＦ中のプログラニュリンの濃度が正常レベルの５０％未満である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記患者は、ＣＳＦ中のプログラニュリン濃度が正常レベルの約３０％である、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

ＣＳＦ、血清、及び／又は血漿中のプログラニュリンの濃度を検出することを更に含む、請求項１８～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

ｉ）ニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）、総タウ（Ｔ－タウ）、及びリン酸化タウ（Ｐ－タウ）のうちの１つ以上のＣＳＦ濃度、
ｉｉ）網膜リポフスチンを評価すること、
ｉｉｉ）脳体積、白質完全性、並びに中前頭皮質及び頭頂領域の厚さのうちの１つ以上の変化を追跡するためにＭＲＩを実施すること、
ｉｖ）前頭葉及び／若しくは側頭葉における代謝低下を評価するためにＦＤＧ ＰＥＴを実施すること、並びに／又は
ｖ）疾患に関連する変化の減速を評価するためにＥＥＧ／誘発応答電位を測定すること、を測定することを更に含む、請求項１８～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

単位剤形の医薬組成物であって、
約１．４４×１０^１３～約４．３３×１０^１４ＧＣの緩衝液中の組換えＡＡＶベクターを含み、
前記組換えＡＡＶが、ＡＡＶ１カプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プログラニュリンのコード配列、及び標的細胞において前記プログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む、医薬組成物。

【請求項30】

前記プログラニュリンのコード配列が、配列番号３、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列である、請求項２９に記載の医薬組成物。

【請求項31】

前記ベクターゲノムが、ＣＢ７プロモーター、キメライントロン、及びウサギベータグロビンポリＡを更に含む、請求項２９又は３０に記載の医薬組成物。

【請求項32】

前記ベクターゲノムが、配列番号２４を含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項33】

前記組成物が、ＩＣＭ投与用に製剤化されている、請求項２９～３２のいずれか一項に
記載の医薬組成物。

【請求項34】

前記緩衝液が、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、及びポロキサマー１８８を含む、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項35】

前記緩衝液が、１ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭの塩化カリウム、１．４ｍＭの塩化カルシウム、０．８ｍＭの塩化マグネシウム、及び０．００１％のポロキサマー１８８を含む、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項36】

約３．０ｍＬ、約４．０ｍＬ、又は約５．０ｍＬの体積を有する、請求項２９～３５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項37】

成人発症性神経変性疾患を有するヒト患者の治療における使用のための、請求項２９～３６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項38】

前記患者が、ＧＲＮハプロ不全及び／又は前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を有すると特定されている、請求項３７に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項39】

前記組成物が、
（ｉ）約３．３×１０^１０ゲノムコピー（ＧＣ）／脳質量のグラム、
（ｉｉ）約１．１×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、
（ｉｉｉ）約２．２×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、又は
（ｉｖ）約３．３×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラムの用量を投与するために製剤化されている、請求項３７又は３８に記載の使用のための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、致命的な神経変性疾患であり、典型的には、人生の６０代又は７０代に現れ、実行機能、行動、発話、又は言語理解の障害を伴う。これらの症状は、前頭皮質及び側頭皮質に影響を及ぼす脳萎縮の特徴的なパターンに関連している。患者は、普遍的に進行性の経過を示し、症状の発症からの平均生存期間は８年である（Ｃｏｙｌｅ－Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ ＩＴ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０１６；８６（１８）：１７３６－４３）。

【0002】

ＦＴＤは、高度に遺伝性であり、患者の約４０％が陽性の家族歴を有する（Ｒｏｈｒｅｒ ＪＤ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００９；７３（１８）：１４５１－６．）。５～１０％のＦＴＤ患者では、遍在性のリソソームタンパク質であるプログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするグラニュリン（ＧＲＮ）遺伝子において、病原性の機能喪失変異が特定され得る（Ｒｏｈｒｅｒ ＪＤ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００９；７３（１８）：１４５１－６）。ＧＲＮ変異の保因者は、急速かつ広範囲の脳萎縮を示し、進行性核上性麻痺、基底核症候群、パーキンソン病、レビー小体を伴う認知症、又はアルツハイマー病などの他の神経変性疾患の臨床的特徴を呈し得る（Ｌｅ Ｂｅｒ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ：ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００８；１３１（３）：７３２－４６．）。ＧＲＮ変異は、常染色体優性形態で遺伝し、７０歳までに９０％を超える浸透率を有する（Ｇａｓｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００６；１５（２０）：２９８８－３００１）。単一のＧＲＮ変異の遺伝は、ＦＴＤ及び他の遅発性神経変性疾患を引き起こすが、ホモ接合性の機能喪失変異を有する患者は、人生のずっと早い時期に神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ、バッテン病）を呈し、ニューロンのリソソーム内の自己蛍光物質（リポフスチン）の蓄積、急速な認知低下及び網膜変性を特徴とする（Ｓｍｉｔｈ Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ
Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１２；９０（６）：１１０２－７）。ＧＲＮ変異に対してヘテロ接合の患者は、症状の発症がずっと遅延するが、最終的に、ＮＣＬ患者と同一の脳及び網膜におけるリソソーム蓄積病変を発症し、同様に、進行性神経変性を経験する（Ｗａｒｄ ＭＥ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１７；９（３８５）；Ｇｏｔｚｌ ＪＫ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ．２０１４；１２７（６）：８４５－６０）。プログラニュリンは、最近、リソソームの酸性化を促進し、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）を含むリソソームプロテアーゼのシャペロンとして機能することによって、リソソーム機能において重要な役割を果たすことが見出された（Ｂｅｅｌ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１７ Ａｕｇ １；２６（１５）：２８５０－２８６３；Ｔａｎａｋａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１７；２６（５）：９６９－８８）。ＣＴＳＤをコードする遺伝子の変異もまた、ＮＣＬ表現型をもたらし、欠損したリソソームプロテアーゼ活性に関連する一般的な病態生理を支持している（Ｓｉｉｎｔｏｌａ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ：ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００６；１２９（Ｐｔ ６）：１４３８－４５）。

【0003】

現在、ＧＲＮハプロ不全によって引き起こされる成人発症性神経変性の疾患を修飾する療法は存在しない。疾病管理は、疾患に関連する行動、認知、及び／又は運動の症状を低減することを目的とした支持ケア及び適応症外治療を含む（Ｔｓａｉ ａｎｄ Ｂｏｘｅｒ，２０１６，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１３８ Ｓｕｐｐｌ １：２１１－２１）。更に、認知症の家族歴のある個人をスクリーニングすることによって、より多くの患者がより早い段階で到達する可能性があるが、現在、治療の欠如を考慮して適応されていない。
したがって、この疾患スペクトルは、満たされていない医療ニーズの高い領域を表している。

【0004】

必要とされているものは、ＧＲＮハプロ不全に関連する成人発症性神経変性疾患及びそれに関連する症状のための治療である。

【発明の概要】

【0005】

一態様では、ヒト患者における成人発症性神経変性疾患の治療に有用な治療レジメンであって、レジメンが、ＡＡＶ１カプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの投与を含み、当該ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プログラニュリン（ＧＲＮ）のコード配列、及び標的細胞における前記プログラニュリンの発現を指示する調節配列を含み、投与が、（ｉ）約３．３×１０^１０ゲノムコピー（ＧＣ）／脳質量のグラム、（ｉｉ）約１．１×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、（ｉｉｉ）約２．２×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、又は（ｉｖ）約３．３×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラムを含む、単回用量の大層内（ＩＣＭ）注入を含む、治療レジメンが、本明細書で提供される。特定の実施形態では、プログラニュリンのコード配列は、配列番号３、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列である。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＣＢ７プロモーター、キメライントロン、及びウサギベータグロビンポリＡを更に含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号２４を含む。特定の実施形態では、患者は、ＧＲＮハプロ不全及び／又は前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を有すると特定されている。

【0006】

一態様では、ＡＡＶ１カプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えＡＡＶベクターを含む、医薬組成物であって、当該ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プログラニュリンのコード配列、及び標的細胞における前記プログラニュリンの発現を指示する調節配列を含み、組成物が、（ｉ）約３．３×１０^１０ゲノムコピー（ＧＣ）／脳質量のグラム、（ｉｉ）約１．１×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、（ｉｉｉ）約２．２×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、又は（ｉｖ）約３．３×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラムの用量を投与するために、大槽内（ＩＣＭ）注入を必要とするヒト患者への大槽内（ＩＣＭ）注入用に製剤化されている、医薬組成物が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、プログラニュリンのコード配列は、配列番号３、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列である。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＣＢ７プロモーター、キメライントロン、及びウサギベータグロビンポリＡを更に含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号２４を含む。

【0007】

一態様では、成人発症性神経変性疾患を有する患者を治療する方法であって、方法が、ＩＣＭ注入によって単回用量の組換えＡＡＶを患者に投与することを含み、組換えＡＡＶが、ＡＡＶ１カプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムが、ＡＡＶ ＩＴＲ、プログラニュリンのコード配列、及び標的細胞におけるプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含み、単回用量が、（ｉ）約３．３×１０^１０ゲノムコピー（ＧＣ）／脳質量のグラム、（ｉｉ）約１．１×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、（ｉｉｉ）約２．２×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、又は（ｉｖ）約３．３×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラムである、方法が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、プログラニュリンのコード配列は、配列番号３、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列である。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＣＢ７プロモーター、キメライントロン、及びウサギベータグロビンポリＡを更に含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号２４を含む。特定の実施形態では、患者は、ＧＲＮハプロ不全及び／又は前頭側頭型認
知症（ＦＴＤ）を有すると特定されている。

【0008】

一態様では、単位剤形の医薬組成物であって、約１．４４×１０^１３～約４．３３×１０^１４ＧＣの緩衝液中の組換えＡＡＶベクターを含み、組換えＡＡＶが、ＡＡＶ１カプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プログラニュリンのコード配列、及び標的細胞においてプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む、医薬組成物が、本明で提供される。

【0009】

特定の実施形態では、プログラニュリンのコード配列は、配列番号３、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列である。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＣＢ７プロモーター、キメライントロン、及びウサギベータグロビンポリＡを更に含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号２４を含む。特定の実施形態では、組成物は、ＩＣＭ注入用に製剤化されている。特定の実施形態では、医薬組成物は、成人発症性神経変性疾患を有するヒト患者の治療における使用のためのものである。

【0010】

本発明のこれらの及び他の態様は、以下の本発明の詳細な説明から明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮベクターゲノムの線形マップである。ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（以下、ＰＢＦＴ０２とも称される）ベクターゲノムは、遍在性ＣＢ７プロモーターの制御下でヒトＰＧＲＮのコード配列を含み、これは、ＣＭＶ ＩＥエンハンサーとニワトリβアクチンプロモーターとの間のハイブリッドで構成される。略語：ＢＡ：β－アクチン、ｂｐ：塩基対、ＣＭＶ ＩＥ：サイトメガロウイルス最初期、ＩＴＲ：逆位末端反復、ＰｏｌｙＡ：ポリアデニル化、ｒＢＧ：ウサギβ－グロビン。

【図2】ベクターゲノムを担持するシスプラスミドの線形ベクターマップである。

【図3A-3D】ＧＲＮ^－／－マウスの脳におけるリポフスチン蓄積及びヘキソサミニダーゼ活性の自然歴を提供する。ＧＲＮ^－／－マウス（ＫＯ）又はＧＲＮ^＋／＋（ＷＴ）対照は、示された齢で犠牲になった（ｎ＝１０^／時点）。未染色の脳切片を、海馬、視床、及び前頭皮質における自己蛍光物質（リポフスチン）について画像化し、リポフスチン沈着物を３人の盲検レビュアによって定量化及び平均化した（図３Ａ～図３Ｃ）。リポフスチンの数は、関心領域の総面積に対して表される。ヘキソサミニダーゼ活性は、脳試料において測定され、総タンパク質濃度に対して正規化された（図３Ｄ）。値は、野生型対照に対する比率で表される。

【図4】ヒトＰＧＲＮを発現するＡＡＶベクター又はビヒクルで処置されたＧｒｎ－／－マウスのＣＳＦ及び脳中のヒトＰＧＲＮ発現を示す。ビヒクル（ＰＢＳ）処置ＷＴマウス、ビヒクル処置Ｇｒｎ－／－マウス、及びＡＡＶｈｕ６８．ｈＰＧＲＮ（ＡＡＶ）処置Ｇｒｎ－／－マウス（ＩＣＶ用量：１．００×１０１１ＧＣ）を投薬の６５日後に剖検した（Ｎ＝１０／群）。ヒトＰＧＲＮタンパク質の濃度を、ＣＳＦ（ＷＴ＋ＰＢＳ：Ｎ＝５、Ｇｒｎ－／－＋ＰＢＳ：Ｎ＝６、Ｇｒｎ－／－＋ＡＡＶ：Ｎ＝９）及び前頭皮質からの脳組織（Ｎ＝１０／群）に対してＥＬＩＳＡによって測定した。脳ＰＧＲＮ濃度は、脳から単離された総タンパク質に対して正規化された。ＥＬＩＳＡのＬＯＤは、ＣＳＦについては１．２５ｎｇ／ｍＬ、脳については０．０８ｎｇ／ｍｇであった。

【図5】ヒトＰＧＲＮを発現するＡＡＶベクター又はビヒクルで処置されたＧｒｎ－／－マウスの脳及び血清におけるヘキソサミニダーゼ活性を示す。ビヒクル（ＰＢＳ）処置ＷＴマウス、ビヒクル処置Ｇｒｎ－／－マウス、及びＡＡＶｈｕ６８．ｈＰＧＲＮ（ＡＡＶ）処置Ｇｒｎ－／－マウス（ＩＣＶ用量：１．００×１０１１ＧＣ）を投薬の６５日後に剖検した（Ｎ＝１０／群）。ＨＥＸ活性は、前頭皮質由来の脳組織及び血清において測定された（Ｎ＝９である血清についてのＧｒｎ－／－＋ＡＡＶを除いてＮ＝１０／群）。脳ＨＥＸ活性は、脳から単離された総タンパク質に対して正規化された）。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの多重比較検定。

【図6】ヒトＰＧＲＮを発現するＡＡＶベクター又はビヒクルで処置されたＧｒｎ－／－マウスの脳におけるリポフスチン沈着物の定量化を示す。ビヒクル（ＰＢＳ）処置ＷＴマウス、ビヒクル処置Ｇｒｎ－／－マウス、及びＡＡＶｈｕ６８．ｈＰＧＲＮ（ＡＡＶ）処置Ｇｒｎ－／－マウス（ＩＣＶ用量：１．００×１０１１ＧＣ）を投薬の６５日後に剖検した（Ｎ＝１０／群）。海馬、視床、及び前頭皮質の未染色凍結切片における自己蛍光リポフスチン沈着物は、盲検レビュアにより定量化された（ＷＴ＋ＰＢＳ：Ｎ＝１０、Ｇｒｎ－／－＋ＰＢＳ：Ｎ＝８、Ｇｒｎ－／－＋ＡＡＶ：Ｎ＝１０）。リポフスチン数は、高倍率視野ごとに表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの多重比較検定。

【図7A-7C】ＡＡＶ媒介性ＰＧＲＮ発現による、加齢ＧＲＮ^－／－マウスにおける脳ミクログリオーシスの補正を示す。生後７ヶ月で、ＧＲＮ^－／－マウス（ＫＯ）又はＧＲＮ^＋／＋（ＷＴ）対照を、ビヒクル（ＰＢＳ）又はヒトＰＧＲＮ（１０^１１ＧＣ）を発現するＡＡＶｈｕ６８ベクターの単回ＩＣＶ注入で処置した。動物は、注入４ヶ月後に犠牲にされ、脳切片は、ＣＤ６８について染色された。海馬、視床、及び前頭皮質の画像におけるＣＤ６８陽性領域は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、盲検レビュアによって定量化された。領域は、高倍率視野ごとに表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの多重比較検定。

【図8】ＩＣＭ ＡＡＶ投与後のＮＨＰのＣＳＦ及び血漿中のヒトＰＧＲＮタンパク質の発現を示す。成人ＮＨＰ（Ｎ＝２／群）は、３．０×１０^１３ＧＣの用量で、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）、ＡＡＶ５．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ、又はＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＰＩ．ｈＰＧＲＮ２．ＳＶ４０の単回ＩＣＭ投与を受けた。示された試験日に、ＣＳＦ及び血漿中のヒトＰＧＲＮタンパク質を、ＥＬＩＳＡによって測定した。破線は、健常なヒト対照試料中の平均正常ＰＧＲＮ濃度を示す。正常なヒト対照ＣＳＦ試料は、ＮＨＰ試料と同時に評価され、一方、血漿の正常なヒトＰＧＲＮ濃度は、公表された文献に由来する。ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＰＩ．ｈＰＧＲＮ２．ＳＶ４０の血漿分析は、他の群と比較して、ＣＳＦ中のＰＧＲＮ発現レベルが低いことにより、２１日目及び２８日目には実施されなかった。

【図9】ＩＣＭ ＡＡＶ投与後のＮＨＰのＣＳＦ及び血清中の抗ヒトＰＧＲＮ抗体を示す。成人ＮＨＰ（Ｎ＝２／群）は、３．０×１０^１３ＧＣの用量で、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧのいずれかの単回ＩＣＭ投与を受けた。示された試験日に、ＣＳＦ及び血清中の抗ヒトＰＧＲＮ抗体を、ＥＬＩＳＡによって測定した。ＡＡＶ５．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ及びＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＰＩ．ｈＰＧＲＮ２．ＳＶ４０の場合の抗ヒトＰＧＲＮ抗体は、評価されなかった。

【図10】ＩＣＭのＡＡＶ投与後のＮＨＰの体重を示す。成人ＮＨＰ（Ｎ＝２／群）は、３．０×１０^１３ＧＣの用量で、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）、ＡＡＶ５．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ、又はＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＰＩ．ｈＰＧＲＮ２．ＳＶ４０の単回ＩＣＭ投与を受けた。体重を、示された時点で測定した。

【図11】ＩＣＭ ＡＡＶ送達後のＮＨＰにおけるＣＳＦ白血球数を示す。成人ＮＨＰ（Ｎ＝２／群）は、３．０×１０^１３ＧＣの用量で、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）、ＡＡＶ５．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ）、又はＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＰＩ．ｈＰＧＲＮ２．ＳＶ４０の単回ＩＣＭ投与を受けた。ＣＳＦ白血球数を、示された時点で評価した。特定された細胞は、分析された全ての試料において主に小リンパ球であった。

【図12】非ヒト霊長類へのＡＡＶ１及びＡＡＶｈｕ６８ベクターのＩＣＭ投与後の脳形質導入のレベルを示す。成体アカゲザルに、ニワトリβアクチンプロモーターからＧＦＰを発現する３ｘ１０^１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８（ｎ＝２）又はＡＡＶ１（ｎ＝２）ベクターを、ＩＣＭ注入によって投与した。ベクター投与の２８日後、動物を剖検し、脳の右半球の５つの領域の切片を、ＧＦＰ免疫組織化学又はＧＦＰ及びＤＡＰＩの染色による免疫蛍光によって分析した。特定の細胞型（ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰ、及びＯｌｉｇ２）のマーカーによる共染色で、形質導入された、アストロサイト、及びオリゴデンドロサイトの定量を可能にした。全てのサンプリングされた脳領域について、各細胞型の平均形質導入を計算した。エラーバー＝５つの切片のＳＥＭ。

【図13】非ヒト霊長類へのＡＡＶ１（動物ＩＤ１８２６及び２０６８）及びＡＡＶｈｕ６８（動物ＩＤ１５１８及び２０７６）ベクターのＩＣＭ投与後の、ニューロン、アストロサイト及びオリゴデンドロサイトの形質導入パーセントを示す表を提供する。試験０日目、成体アカゲザルに、ニワトリβアクチンプロモーターからＧＦＰを発現する３×１０^１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８（ｎ＝２）又はＡＡＶ１（ｎ＝２）ベクターを、ＩＣＭ注入によって投与した。ベクター投与の２８日後、動物を剖検し、脳の右半球の５つの領域の切片を、特定の細胞型（ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰ、及びＯｌｉｇ２）に対する共染色によるＧＦＰ免疫蛍光によって分析した。各細胞型の全細胞及び各型のＧＦＰ発現細胞の数を、ＨＡＬＯソフトウェアを使用して定量した。各領域について、形質導入された各細胞型の割合を示す。一部の動物については、領域５からの２つの切片を分析した。

【図14】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はビヒクルを投与されたＧｒｎ^－／－マウスの体重を示す。Ｇｒｎ^－／－マウスに、４．４×１０^９ＧＣ、１．３×１０^１０ＧＣ、４．４×１０^１０ＧＣ、又は１．３×１０^１１ＧＣの用量でＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）をＩＣＶ投与した（Ｎ＝１５／群）。Ｇｒｎ^－／－マウス及びＷＴマウス（Ｎ＝１５／群）に、対照としてビヒクル（ＩＴＦＦＢ）をＩＣＶ投与した。毎週、動物を体重測定した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。

【図15】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はビヒクルを投与されたＧｒｎ^－／－マウスの脳脊髄液中の導入遺伝子産物の発現を示す。Ｇｒｎ^－／－マウスに、４．４×１０^９ＧＣ（Ｎ＝１２）、１．３×１０^１０ＧＣ（Ｎ＝１２）、４．４×１０^１０ＧＣ（Ｎ＝１３）、又は１．３×１０^１１ＧＣ（Ｎ＝１１）の用量でＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）をＩＣＶ投与した。Ｇｒｎ^－／－（Ｎ＝７）及び正常ＷＴマウス（Ｎ＝１１）に、対照としてビヒクル（ＩＴＦＦＢ）をＩＣＶ投与した。９０日目に、ＣＳＦを採取し、ＰＧＲＮ発現をＥＬＩＳＡによって測定した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ＥＬＩＳＡアッセイのＬＯＤは、ＣＳＦの１：４０希釈については１．２５ｎｇ／ｍＬであった。

【図16A-16C】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はビヒクルを投与したＧｒｎ^－／－マウスの脳におけるリポフスチン沈着物の定量を示す。Ｇｒｎ^－／－マウスに、４．４×１０^９ＧＣ（Ｎ＝１５）、１．３×１０^１０ＧＣ（Ｎ＝１４）、４．４×１０^１０ＧＣ（Ｎ＝１５）、１．３×１０^１１ＧＣ（Ｎ＝１５）の用量でＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）をＩＣＶ投与した。Ｇｒｎ^－／－及び野生型マウスに、対照としてビヒクル（ＩＴＦＦＢ）をＩＣＶ投与した（Ｎ＝１５／群）。９０日目に、脳を採取し、凍結切片にした。視床（図１６Ａ）、皮質（図１６Ｂ）、及び海馬（図１６Ｃ）における自己蛍光リポフスチン沈着物を、自動化画像分析ソフトウェアを使用して定量化した。１日目に未処置Ｇｒｎ^－／－マウス及び野生型マウスから採取した脳は、ベースライン対照として含まれた。エラーバーは、ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１は、全９０日目群対ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－対照の一元配置ＡＮＯＶＡ、続くテューキーの多重比較検定に基づいている。

【図17A-17C】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はビヒクルを投与したＧｒｎ^－／－マウスの脳におけるＣＤ６８発現の定量を示す。Ｇｒｎ^－／－マウスに、４．４×１０^９ＧＣ（Ｎ＝１５）、１．３×１０^１０ＧＣ（Ｎ＝１４）、４．４×１０^１０ＧＣ（Ｎ＝１５）、１．３×１０^１１ＧＣ（Ｎ＝１５）の用量でＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）をＩＣＶ投与した。Ｇｒｎ^－／－及び野生型マウスに、対照としてビヒクル（ＩＴＦＦＢ）をＩＣＶ投与した（Ｎ＝１５／群）。９０日目に、ＣＤ６８ ＩＨＣのために脳を採取した。視床（図１７Ａ）、皮質（図１７Ｂ）、及び海馬（図１７Ｃ）におけるＣＤ６８染色を、自動化画像分析ソフトウェアを使用して、視野当たりの陽性面積として定量化した。１日目に未処置Ｇｒｎ^－／－マウス及び野生型マウスから採取した脳は、ベースライン対照として含まれた。エラーバーは、ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１は、全９０日目群対ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－対照についての一元配置ＡＮＯＶＡ、続くテューキーの多重比較検定に基づいている。

【図18】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はビヒクルを投与されたＧｒｎ^－／－マウスの脳におけるヘキソサミニダーゼ活性の定量化を示す。Ｇｒｎ^－／－マウスに、４．４×１０^９ＧＣ（Ｎ＝１５）、１．３×１０^１０ＧＣ（Ｎ＝１３）、４．４×１０^１０ＧＣ（Ｎ＝１５）、１．３×１０^１１ＧＣ（Ｎ＝１５）の用量でＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）をＩＣＶ投与した。Ｇｒｎ^－／－及び野生型マウスに、対照としてビヒクル（ＩＴＦＦＢ）をＩＣＶ投与した（Ｎ＝１５／群）。９０日目に、脳の第３の前頭部分（主に皮質組織）の脳試料を採取し、ＨＥＸ活性を、蛍光発生基質を使用して測定した。１日目に剖検した未処置Ｇｒｎ^－／－及び野生型マウス由来の脳組織溶解物をベースライン対照として含めた。エラーバーは、ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１は、全９０日目群対ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－対照についての一元配置ＡＮＯＶＡ、続くテューキーの多重比較検定に基づいている。

【図19】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はビヒクルを投与された野生型マウスの体重を示す。野生型マウスに、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（１．３×１０^１１ＧＣ［Ｎ＝８／群］）又はビヒクル（ＩＴＦＦＢ、［Ｎ＝４／群］）のいずれかをＩＣＶ投与した。ベースライン（－４日目）及び投薬後毎週、動物を体重測定した。ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）を投与された全てのマウス（群２、４、６、及び８）を分析のために組み合わせ、ビヒクルを投与された全ての群（群１、３、５、７）を分析のために組み合わせた。エラーバーは、ＳＥＭを表す。

【図20】野生型マウスへのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）の脳室内投与後のベクター生体内分布を示す。脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、及び骨格筋（大腿四頭筋）を、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（１．３×１０^１１ＧＣ［Ｎ＝８／群］）又はビヒクル（ＩＴＦＦＢ、［Ｎ＝４／群］）のいずれかの単一ＩＣＶ投与の１０、３０、６０、及び９０日後の野生型マウスからの剖検で採取した。各棒グラフは、ＤＮＡ１μｇ当たり検出された平均ベクターゲノムを表す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ＬＯＤは、５０ＧＣ／μｇＤＮＡであった。

【図21】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はビヒクルを投与された野生型マウスのＣＮＳ中の導入遺伝子産物の発現を示す。野生型マウスに、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（１．３×１０^１１ＧＣ［Ｎ＝８／群］）又はビヒクル（ＩＴＦＦＢ、［Ｎ＝４／群］）のいずれかをＩＣＶ投与した。１０、３０、６０、及び９０日目に、ＣＳＦ、脳、及び脊髄を採取し、ヒトＰＧＲＮ発現をＥＬＩＳＡによって測定した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１は、対応のないｔ検定に基づいている。

【図22】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はビヒクルを投与された野生型マウスの血清中の導入遺伝子産物の発現を示す。野生型マウスに、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（１．３×１０^１１ＧＣ［Ｎ＝８／群］）又はビヒクル（ＩＴＦＦＢ、［Ｎ＝４／群］）のいずれかをＩＣＶ投与した。１０、３０、６０、及び９０日目に、血清を採取し、ヒトＰＧＲＮの発現をＥＬＩＳＡによって測定した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。各時点について、対応のないｔ検定を実施した。

【図23A-23F】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はビヒクルを投与された野生型マウスの末梢臓器中の導入遺伝子産物の発現を示す。野生型マウスに、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（１．３×１０^１１ＧＣ［Ｎ＝８／群］）又はビヒクル（ＩＴＦＦＢ、［Ｎ＝４／群］）のいずれかをＩＣＶ投与した。１０、３０、６０、及び９０日目に、心臓（図２３Ａ）、肝臓（図２３Ｂ）、脾臓（図２３Ｃ）、腎臓（図２３Ｄ）、四頭筋（図２３Ｅ）、及び頸部リンパ節（図２３Ｆ）を採取した。ヒトＰＧＲＮ発現を、ＥＬＩＳＡによって測定した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１は、対応のないｔ検定に基づいている。

【図24】健常なＮＨＰの第ＩＩ指から記録された典型的な正中神経ＳＮＡＰからの典型的な感覚神経活動電位波を示す。感覚神経伝導速度は、刺激カソードと第ＩＩ指の記録部位との間の距離を、発症潜時（すなわち、刺激とＳＮＡＰの発症との間の時間）で割ることによって計算した。ＳＮＡＰ振幅は、ＳＮＡＰ開始時の電位とＳＮＡＰピークとの差として計算した。

【図25】ＮＨＰへのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のＩＣＭ投与後の感覚神経活動電位を示す。３．０×１０^１２ＧＣ（低用量）、１．０×１０^１３ＧＣ（中用量）、又は３．０×１０^１３ＧＣ（高用量）の用量で、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）の単回ＩＣＭ投与を受けた成人ＮＨＰからの、ＢＬ並びに２８±３及び９０±５日目の代表的なＳＮＡＰ波形（Ｎ＝３／群）。動物１８１３２３（群１）、１７１２２９（群２）、１７１３１１（群３）、及び１７１２４６（群４）は、９０±５日目までにＳＮＡＰ振幅の著しい片側の低減を示した動物１７１１２３（ビヒクル、群１）及び１８０６６８（低用量、群２）、並びに９０±５日目までにＳＮＡＰ振幅の著しい両側の低減を示した動物１７１２０９（高用量、群４）を除いて、それぞれ、ビヒクル、低用量、中用量、及び高用量の全ての動物について得られた神経伝導データの代表である。

【図26A-26B】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のＩＣＭ投与後のＮＨＰにおけるＳＮＡＰ振幅（図２６Ａ）及び神経伝導速度（図２６Ｂ）を示す。成人ＮＨＰは、ビヒクル（ＩＴＦＦＢ、Ｎ＝２／群）又は３．０×１０^１２ＧＣ（低用量）、１．０×１０^１３ＧＣ（中用量）、若しくは３．０×１０^１３ＧＣ（高用量）（Ｎ＝３／群）の用量でのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のいずれかの単回ＩＣＭ投与を受けた。感覚神経伝導試験を、ＢＬ並びに２８及び９０日目に実施した。左右の正中神経のＳＮＡＰ振幅及び伝導速度を提示する。

【図27】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のＩＣＭ投与後のＮＨＰの体重を示す。成人ＮＨＰは、ビヒクル（ＩＴＦＦＢ、Ｎ＝２／群）又は３．０×１０^１２ＧＣ（低用量）、１．０×１０^１３ＧＣ（中用量）、若しくは３．０×１０^１３ＧＣ（高用量）（Ｎ＝３／群）の用量でのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のいずれかの単回ＩＣＭ投与を受けた。体重は、０、７、１４、２８、６０、及び９０日目にモニタリングされた。

【図28】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はビヒクルのＩＣＭ投与後のＮＨＰの脳脊髄液中の白血球数を示す。成人ＮＨＰは、ビヒクル（ＩＴＦＦＢ、Ｎ＝２／群）又は３．０×１０^１２ＧＣ（低用量）、１．０×１０^１３ＧＣ（中用量）、若しくは３．０×１０^１３ＧＣ（高用量）（Ｎ＝３／群）の用量でのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のいずれかの単回ＩＣＭ投与を受けた。ＣＳＦを、０、７、１４、２８、６０、及び９０日目に採取した。白血球を、ＣＳＦの１μｌ当たりの白血球（ＷＢＣ）の数として定量化した。

【図29】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のＩＣＭ投与後のＮＨＰにおけるカプシド又は導入遺伝子に対するＩＦＮ－γＴ細胞応答の要約を示す。

【図30】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）をＮＨＰにＩＣＭ投与した後のＣＳＦ及び血清中のベクター薬物動態を示す。成人ＮＨＰは、ビヒクル（ＩＴＦＦＢ、Ｎ＝２／群）又は３．０×１０^１２ＧＣ（低用量）、１．０×１０^１３ＧＣ（中用量）、若しくは３．０×１０^１３ＧＣ（高用量）（Ｎ＝３／群）の用量でのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のいずれかの単回ＩＣＭ投与を受けた。ＣＳＦを、０、７、１４、及び６０日目に採取した。全血を、０、７、１４、２８、及び６０日目に採取した。ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲによって、ベクターゲノムを定量化した。

【図31】ＮＨＰへのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のＩＣＭ投与後の尿及び糞便中のベクター排泄を示す。成人ＮＨＰは、ビヒクル（ＩＴＦＦＢ、Ｎ＝２／群）又は３．０×１０^１２ＧＣ（低用量）、１．０×１０^１３ＧＣ（中用量）、若しくは３．０×１０^１３ＧＣ（高用量）（Ｎ＝３／群）の用量でのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のいずれかの単回ＩＣＭ投与を受けた。尿及び糞便を、ベースライン並びに５、２８、６０、及び９０日目に採取した。ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲによって、ベクターゲノムを定量化した。

【図32】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のＩＣＭ投与後のＮＨＰの脳脊髄液及び血清中のヒトＰＧＲＮ発現を示す。成人ＮＨＰは、ビヒクル（ＩＴＦＦＢ、Ｎ＝２／群）又は３．０×１０^１２ＧＣ（低用量）、１．０×１０^１３ＧＣ（中用量）、若しくは３．０×１０^１３ＧＣ（高用量）（Ｎ＝３／群）の用量でのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のいずれかの単回ＩＣＭ投与を受けた。ＣＳＦを、０、７、１４、２８、６０、及び９０日目に採取した。血清を、ＢＬ時並びに１４、２８、６０、及び９０日目に採取した。試料をＥＬＩＳＡによって分析して、ヒトＰＧＲＮ発現レベルを評価した。

【図33】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のＩＣＭ投与後のＮＨＰの脳脊髄液中のヒトＰＧＲＮタンパク質を示す。成人ＮＨＰは、ビヒクル（ＩＴＦＦＢ、Ｎ＝２／群）又は３．０×１０^１２ＧＣ（低用量）、１．０×１０^１３ＧＣ（中用量）、若しくは３．０×１０^１３ＧＣ（高用量）（Ｎ＝３／群）の用量でのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のいずれかの単回ＩＣＭ投与を受けた。１４日目に採取したＣＳＦをＥＬＩＳＡによって分析して、ヒトＰＧＲＮ発現レベルを評価した。

【図34】ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のＩＣＭ投与後のＮＨＰのＣＳＦ及び血清中の抗ヒトＰＧＲＮ抗体を示す。成人ＮＨＰは、ビヒクル（ＩＴＦＦＢ、Ｎ＝２／群）又は３．０×１０^１２ＧＣ（低用量）、１．０×１０^１３ＧＣ（中用量）、若しくは３．０×１０^１３ＧＣ（高用量）（Ｎ＝３／群）の用量でのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のいずれかの単回ＩＣＭ投与を受けた。ＣＳＦを、０、７、１４、２８、６０、及び９０日目に採取した。血清を、ＢＬ時並びに１４、２８、６０、及び９０日目に採取した。試料をＥＬＩＳＡによって分析して、抗ヒトＰＧＲＮ抗体レベルを評価した。

【図35】ＮＨＰへのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のＩＣＭ投与の９０日後のベクターの生体内分布を示す。示される組織を、３．０×１０^１２ＧＣ（低用量）、１．０×１０^１３ＧＣ（中用量）、又は３．０×１０^１３ＧＣ（高用量）（Ｎ＝３／群）の用量でのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）の単回ＩＣＭ投与の９０日後の成人ＮＨＰから剖検で採取した。また、ビヒクル（ＩＴＦＦＢ）治療ＮＨＰ（Ｎ＝２）から対照として組織を採取した。各棒グラフは、ＤＮＡ１μｇ当たり検出された平均ベクターゲノムを表す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ＬＯＤは、５０ＧＣ／μｇＤＮＡであった。

【発明を実施するための形態】

【0012】

ＡＡＶ１カプシド及びプログラニュリンのコード配列を有するベクターゲノムを含む組換えＡＡＶを含む、医薬組成物が提供される。医薬組成物は、プログラニュリン（ＧＲＮ）関連前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を含む、ヒト患者における成人発症性神経変性疾患の治療のための方法及びレジメンにおいて有用である。

【0013】

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ．ｈＰＧＲＮ」又は「ｒＡＡＶ．ｈＰＧＲＮ」という用語は、調節配列の制御下でヒトプログラニュリン（ＧＲＮ、またＰＧＲＮとも）のコード配列を含むベクターゲノムをその中に有するＡＡＶカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルスを指すために使用される。特定のカプシドの種類が特定されてもよく、例えば、ＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮは、ＡＡＶ１カプシドを有する組換えＡＡＶを指し、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＰＧＲＮは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する組換えＡＡＶを指し、ＡＡＶ５．ｈＰＧＲＮは、ＡＡＶ５カプシドを有する組換えＡＡＶを指す。

【0014】

「組換えＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ」は、２つのエレメント、ＡＡＶカプシド、及びＡＡＶカプシド内にパッケージングされた少なくとも非ＡＡＶコード配列を含むベクターゲノムを含むＤＮＡｓｅ耐性ウイルス粒子である。特に明記しない限り、この用語は「ｒＡＡＶベクター」という句と互換的に使用され得る。ｒＡＡＶは、任意の機能的ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子又は機能的ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を欠き、後代を生成することができないため、「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」である。特定の実施形態では、唯一のＡＡＶ配列は、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）であり、ＩＴＲ間に位置する遺伝子及び調節配列がＡＡＶカプシド内にパッケージングされることを可能にするために、典型的にはベクターゲノムの５’及び３’最末端に位置する。

【0015】

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するｒＡＡＶカプシドの内側にパッケージングされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含有する。本明細書の例では、ベクターゲノムは、少なくとも、５’から３’へ、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、コード配列、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含有する。ＡＡＶ２からのＩＴＲ、カプシドとは異なる供給源ＡＡＶ、又は全長ＩＴＲ以外が選択され得る。特定の実施形態では、ＩＴＲは、産生中のｒｅｐ機能又はトランス相補性ＡＡＶを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ供給源由来である。更に、他のＩＴＲが使用され得る。更に、ベクターゲノムは、遺伝子産物の発現を指示する制御配列を含む。ベクターゲノムの好適な成分が本明細書でより詳細に考察される。

【0016】

治療用タンパク質及びコード配列：
ｒＡＡＶは、ヒトプログラニュリン（ｈＰＧＲＮ）タンパク質又はそのバリアントのコード配列を含み、ｈＰＧＲＮの生物学的機能のうちの１つ以上を行う。このタンパク質のコード配列は、中枢神経系（ＣＮＳ）における発現のためにベクターゲノムへと操作される。

【0017】

ヒトＰＧＲＮ１（ｈＰＧＲＮ）は、最も一般的に、配列番号１に再現されるＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００２０７８の５９３アミノ酸の配列によって特徴付けられる。この配列は、分泌プログラニュリンタンパク質又はアミノ酸１８～約５９３を含む分泌グラニュリンとともに１～１７位にシグナルペプチドを有する。このタンパク質は、配列番号１の番号付けを参照して、グラニュリン１（別名グラニュリンＧ：約ａａ５８約アミノ酸１１３）、グラニュリン２（約アミノ酸１２３～約１７９）、グラニュリン３（約アミノ酸２０６～約アミノ酸２６１）、グラニュリン４（約アミノ酸２８１～約アミノ酸３３６）、グラニュリン５（約アミノ酸３６４～約アミノ酸４１７）、グラニュリン６（約アミノ酸４４２～約アミノ酸４９６）、及びグラニュリン７（約アミノ酸５１８～約アミノ酸５７３）の８つの鎖に切断され得る。特定の実施形態では、天然シグナルペプチドの代わりに、異種シグナルペプチドで置換され得る。しかしながら、他の実施形態は、外因性シグナルペ
プチド（例えば、ヒトＩＬ２リーダー）を有するプログラニュリンを包含し得る。また、例えば、ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｍ＝ｌｉｓｔｓｐｄｂ＿ｍａｍｍａｌｉａを参照されたい。したがって、プログラニュリン及び／又はその断片を含む融合タンパク質が企図される。かかる融合タンパク質は、互いと様々な組み合わせで活性ＧＲＮ（例えば、ＧＲＮ１、２、３、４、４、６、又は７）のうちの１つ以上を包含してもよく、あるいはこれらのペプチドのうちの１つ以上を、全長ＰＧＲＮ又は別のタンパク質若しくはペプチド（例えば、別の活性タンパク質若しくはペプチド、及び／又はヒトＰＧＲＮに対して外因性のシグナルペプチド）と組み合わせてもよい。

【0018】

ベクターゲノムは、このタンパク質のコード配列を担持し、ヒト細胞において（特に、中枢神経系において）タンパク質を発現するように操作される。特定の実施形態では、コード配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００２０８７．３に見出され、配列番号２に再現される。

【0019】

特定の実施形態では、コード配列は、配列番号３に提供される。特定の他の実施形態は、配列番号３と９５％～９９．９％又は１００％同一性のコード配列を包含し、それらの間の値を含む。一部の実施形態では、コード配列は、より良い治療転帰（例えば、哺乳動物細胞における発現増強）のためにコドン最適化される。同一性は、シグナル（リーダー）配列を有する全長プログラニュリンのコード配列にわたって、シグナル（リーダー）配列を有さないプログラニュリンにわたって、又は本明細書に定義される融合タンパク質のコード配列の長さにわたって評価され得る。特定の実施形態では、コード配列は、配列番号３に提供される。特定の他の実施形態は、配列番号４と９５％～１００％未満同一性のコード配列を包含する。同一性は、シグナル（リーダー）配列を有する全長プログラニュリンのコード配列にわたって、シグナル（リーダー）配列を有さないプログラニュリンにわたって、又は本明細書に定義される融合タンパク質のコード配列の長さにわたって評価され得る。

【0020】

好適には、これらのコード配列は、全長プログラニュリンをコードする。しかしながら、他の実施形態は、異種シグナルペプチド（例えば、ヒトＩＬ２リーダー）を有する活性グラニュリン鎖を包含し得る。また、例えば、ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｍ＝ｌｉｓｔｓｐｄｂ＿ｍａｍｍａｌｉａを参照されたい。

【0021】

特定の実施形態では、ヒトＰＧＲＮのコード配列（例えば、配列番号３若しくは配列番号４）の断片、又はそれと約９５％～９９．９％若しくは１００％同一の配列を利用してもよい。かかる断片は、活性ヒトＧＲＮ（ａａ１８～５９３）、又は活性ヒトＧＲＮとともに異種シグナルペプチドを含む融合ペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、活性ＧＲＮ（例えば、ＧＲＮ１、２、３、４、４、６、又は７）のうちの１つ以上のコード配列のうちの１つ以上は、互いに様々な組み合わせでベクターゲノムに含まれ得るか、又はこれらのペプチドのうちの１つ以上は、全長ＰＧＲＮ若しくは別のコード配列と組み合わせられ得る。

【0022】

理論に束縛されることを意図するものではないが、ＣＮＳの細胞のサブセット（例えば、上衣細胞）におけるＡＡＶ媒介性ＰＧＲＮ発現は、分泌されたタンパク質のデポ（ｄｅｐｏｔ）を提供すると考えられる。分泌ＰＧＲＮタンパク質（及び／又は１つ以上のＧＲＮ）は、ソーティリン又はマンノース－６－リン酸受容体を介して他の細胞に取り込まれ、その後、リソソームに輸送される。特定の実施形態では、分泌タンパク質は、プログラニュリンである。特定の実施形態では、分泌タンパク質は、グラニュリンである。特定の実施形態では、分泌タンパク質は、プログラニュリン及びグラニュリンの混合物を含む。

【0023】

特定の実施形態では、プログラニュリンのコード配列に加えて、別の非ＡＡＶコード配
列、例えば、目的のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、又は他の遺伝子産物を含んでもよい。有用な遺伝子産物としては、ｍｉＲＮＡが挙げられ得る。ｍｉＲＮＡ及び他の低分子干渉核酸は、標的ＲＮＡ転写産物の切断／分解又は標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制を介して遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、最終的な１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物として天然に発現される。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を介してそれらの活性を示す。これらの内因性の発現ｍｉＲＮＡは、ヘアピン前駆体を形成し、これがその後、ｍｉＲＮＡ二本鎖へと処理され、更に「成熟」一本鎖ｍｉＲＮＡ分子へと処理される。この成熟ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡとの相補性に基づいて、例えば、３′ＵＴＲ領域内の標的ｍＲＮＡの標的部位を特定する、多タンパク質複合体ｍｉＲＩＳＣを誘導する。

【0024】

特定の実施形態では、発現カセットは、後根神経節（ｄｒｇ）におけるｈＰＧＲＮの発現を抑制する１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を更に含む。特定の実施形態では、発現カセットは、ｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも２つのタンデム反復を含み、少なくとも２つのタンデム反復は、少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列と、同じ又は異なり得る少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列とを含む。特定の実施形態では、タンデムｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であるか、又は１～１０個の核酸のスペーサーによって分離されており、当該スペーサーは、ｍｉＲＮＡ標的配列ではない。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列があり、ｈＰＧＲＮコード配列の３’に位置する。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡタンデム反復の第１の開始は、ｈＰＧＲＮコード配列の３’末端から２０ヌクレオチド以内である。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡタンデム反復の第１の開始は、ｈＰＧＲＮコード配列の３’末端から少なくとも１００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡタンデム反復は、２００～１２００ヌクレオチド長を含む。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列があり、ｈＰＧＲＮコード配列の５’に位置する。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｈＰＧＲＮコード配列の５’及び３’の両方に位置する。特定の実施形態では、発現カセットｍＲＮＡ又はＤＮＡプラス鎖の少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列及び／又は少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列は、（ｉ）ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（ｍｉＲ１８３、配列番号：３２）、（ｉｉ）ＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号：３３）、（ｉｉｉ）ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号：３４）、及び（ｉｖ）ＡＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＣ（配列番号：３５）から選択される。特定の実施形態では、２つ以上の連続したｍｉＲＮＡ標的配列は、連続しており、スペーサーによって分離されていない。特定の実施形態では、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、スペーサーによって分離されており、各スペーサーは、独立して、（Ａ）ＧＧＡＴ、（Ｂ）ＣＡＣＧＴＧ、又は（Ｃ）ＧＣＡＴＧＣのうちの１つ以上から選択される。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置するスペーサーは、第１のｍｉＲＮＡ標的配列の３’及び／又は最後のｍｉＲＮＡ標的配列の５’に位置し得る。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列間のスペーサーは同じである。２０２０年２月１２に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２号を参照されたく、これは、参照により本明細書に援用される。

【0025】

ＡＡＶ１
クレードＦ由来のＡＡＶｈｕ６８は、ＣＮＳ内でｈＰＧＲＮを標的化及び発現するベクターを生成するために使用することができる。しかしながら、ＡＡＶ１媒介性ＰＧＲＮ送達は、同等の血漿中濃度が観察されたにもかかわらず、予想外に、ＡＡＶｈｕ６８よりもＣＮＳにおける優れたＰＧＲＮ発現を提供することが観察された。本発明者らは、ｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮの髄腔内送達が、本明細書に記載される療法のための魅力的な送達経路であることを発見した。したがって、特に望ましい実施形態では、ＡＡＶ１カプシドが選択
される。

【0026】

特定の実施形態では、組成物が提供され、髄腔内注入に好適な水性液体と、上衣細胞を優先的に標的とするＡＡＶカプシドを有するｒＡＡＶのストックとを含み、ｒＡＡＶは、中枢神経系（ＣＮＳ）への送達のためのＰＧＲＮコード配列を有するベクターゲノムを更に含む。特定の実施形態では、組成物は、大槽への（大槽内）後頭下注入用に製剤化される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによるｒＡＡＶ注入を介して投与される。特定の実施形態では、患者に、単回用量の組成物を投与する。

【0027】

ＡＡＶ１カプシドは、ＡＡＶ ｖｐ１タンパク質、ＡＡＶ ｖｐ２タンパク質、及びＡＡＶ ｖｐ３タンパク質を有するカプシドを指す。特定の実施形態では、ＡＡＶ１カプシドは、約１：１：１０の所定の比率のＡＡＶ ｖｐ１タンパク質、ＡＡＶ ｖｐ２タンパク質、及びＡＡＶ ｖｐ３タンパク質で構成され、６０個の総ｖｐタンパク質のＴ１正二十面体カプシドに組み立てられる。ＡＡＶ１カプシドは、ゲノム配列をパッケージングして、ＡＡＶ粒子（例えば、ゲノムがベクターゲノムである組換えＡＡＶ）を形成することができる。典型的には、最も長いｖｐタンパク質（すなわち、ＶＰ１）をコードするカプシド核酸配列は、ＡＡＶ１カプシドを有するｒＡＡＶの産生中にトランスで発現される。例えば、米国特許第６，７５９，２３７号、米国特許第７，１０５，３４５号、米国特許第７，１８６，５５２号、米国特許第８，６３７，２５５号、及び米国特許第９，５６７，６０７号に記載されている（これらは、参照により本明細書に援用される）。

【0028】

カプシドのコード配列は、最終的に組み立てられたｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮには存在しない。しかしながら、かかる配列は、組換えＡＡＶの産生に利用される。特定の実施形態では、ＡＡＶ１カプシドのコード配列は、配列番号２６の全長ＡＡＶ１ ＶＰ１タンパク質、又はそのＶＰ２領域若しくはＶＰ３領域をコードする任意の核酸配列である。例えば、米国特許第６，７５９，２３７号、米国特許第７，１０５，３４５号、米国特許第７，１８６，５５２号、米国特許第８，６３７，２５５号、及び米国特許第９，５６７，６０７号を参照されたい（これらは、参照により本明細書に援用される）。特定の実施形態では、ＡＡＶ１カプシドのコード配列は、配列番号２５である。一部の実施形態では、ＡＡＶ１カプシドは、翻訳後修飾を伴うか又は伴わない配列番号２５のコード配列から産生されるタンパク質である。しかしながら、このコード配列のバリアントは、操作され得、かつ／又は他のコード配列は、ＡＡＶ１ ＶＰ１、ＡＡＶ１ ＶＰ２、及び／又はＡＡＶ ＶＰ３のアミノ酸配列を使用して、所望の発現系のために逆翻訳され得る。

【0029】

特定の実施形態では、組換えＡＡＶ１を含む組成物は、配列番号２６に再現されたＡＡＶ１ ＶＰ１の一次配列の番号付けに基づいて、ＡＡＶ１が、高度に脱アミド化された５つのアミノ酸（Ｎ５７、Ｎ３８３、Ｎ５１２、及びＮ７１８）を含有するカプシドを有する。

【表1】

【0030】

特定の実施形態では、ＡＡＶ１は、質量分析を使用して決定されたカプシド中のＶＰタンパク質の総量に基づいて、以下の表で定義されるように脱アミド化されたＶＰアイソフォームの異種集団のカプシド組成によって特徴付けられる。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、質量分析を使用して決定される、以下に提供される範囲で、以下の位置のうちの１つ以上で修飾される。残基番号は、配列番号２６に再現される公開されたＡＡＶ１配列に基づく。

【表2】

【0031】

好適な修飾には、脱アミド化標識された上記段落に記載の修飾が含まれ、本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、以下の位置、又はＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。特定の実施形態では、５７位、３８３位、５１２位、及び／又は７１８位のＮに続くグリシンが保存されている（すなわち、未修飾のままである）ＡＡＶ１変異が構築される。特定の実施形態では、前文で示した４つの位置のＮＧは、天然配列で保存される。残基番号は、配列番号２６に再現される公開されたＡＡＶ１ ＶＰ１に基づく。特定の実施形態では、人工ＮＧは示される、上の表で特定される位置のうちの１つとは異なる位置に導入される。

【0032】

ｒＡＡＶベクター
上述のように、ＡＡＶ１カプシドを有する組換えＡＡＶは、ＦＴＤの治療のための本明
細書に記載される好ましいベクターである。特定の実施形態では、例えば、以下の実施例では（例えば、ＡＡＶｈｕ６８又はＡＡＶ５）、他のＡＡＶカプシドを使用して、ｒＡＡＶが生成され得る。特定の実施形態では、ＡＡＶ１カプシドが選択され得、プログラニュリン（ＧＲＮ）のコード配列を含むベクターゲノムのエレメントのうちの１つ以上が置換され得る。

【0033】

本明細書で使用される場合、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＷＯ２０１８／１６０５８２で定義されるカプシドを指す（参照により本明細書に援用される）。本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを有し、配列番号３１のｖｐ１アミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８核酸配列（配列番号３０）、及び任意選択的に、追加の核酸配列（例えば、ｖｐ１及び／又はｖｐ２の固有領域を含まないｖｐ３タンパク質をコードする配列）からのカプシドを発現する産生システムで産生される。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生から得られるｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、及びｖｐ３タンパク質の異種集団を産生する。より具体的には、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号３１の予測されたアミノ酸残基からの修飾を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有する。これらの亜集団は、最低限、脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、アスパラギン－グリシン対におけるアスパラギンは、高度に脱アミド化される。一実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１核酸配列は、配列番号３０の配列、又はそれに相補的な鎖、例えば、対応するｍＲＮＡ若しくはｔＲＮＡを有する。特定の実施形態では、ｖｐ２及び／又はｖｐ３タンパク質は、追加的又は代替的に、例えば、選択された発現系においてｖｐタンパク質の比率を変化させるために、ｖｐ１とは異なる核酸配列から発現され得る。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）及び／又はｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号３１のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）若しくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ若しくはｔＲＮＡ（配列番号３０の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）をコードする核酸配列も提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を含まない配列番号３１のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）又はそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ若しくはｔＲＮＡ（配列番号３０のｎｔ４１１～２２１１）をコードする核酸配列も提供される。

【0034】

本明細書で使用される場合、ＡＡＶ５カプシドは、配列番号２９の予測されたアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＡＡＶ５カプシドは、配列番号２８の核酸配列から発現される。

【0035】

ＡＡＶカプシド中にパッケージングされ宿主細胞に送達されるゲノム配列は、典型的には、最低でもトランス遺伝子、及びその制御性配列、及びＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）から構成される。一本鎖ＡＡＶ及び自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶの両方がｒＡＡＶに含まれる。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、又は他の遺伝子産物をコードするベクター配列とは異種の核酸コード配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で調節要素に作動可能に連結される。

【0036】

ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性５’及び３’逆位末端反復配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ “Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。好ましくは、ＩＴＲをコードする実質的に完全な配列が分子中で使用されるが、これらの配列のある程度の最小限の修飾は許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当業者の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照されたい）。本発明で使用されるこのような分子の一例は、導入遺伝子を含有する「シス作用性」プラスミドであり、選択された導入遺伝子配列及び関連する調節エレメントは、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するのとは異なるＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列である。Ｄ配列及び末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。しかしながら、他のＡＡＶ供給源に由来するＩＴＲが選択され得る。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。しかしながら、これらのエレメントの他の構成も好適であり得る。

【0037】

組換えＡＡＶベクターについて上述した主要エレメントに加えて、ベクターは、プラスミドベクターでトランスフェクトされた、又は本発明により産生されたウイルスに感染した細胞中でその転写、翻訳、及び／又は発現を可能にするような様式で導入遺伝子と作動可能に連結される必要な従来の制御エレメントも含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列には、目的の遺伝子と連続する発現制御配列、及び目的の遺伝子を制御するためにトランスで、又は離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。

【0038】

制御性調節要素は、典型的には、発現制御配列の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置するプロモーター配列を含む。構成的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば、ＷＯ ２０１１／１２６８０８及びＷＯ ２０１３／０４９４３を参照されたい］、組織特異的プロモーター、又は生理学的ヒントに応答するプロモーターが、本明細書に記載されるベクターに使用され得る。プロモーターは、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０最初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモマウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）又は神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス金属タンパク質プロモーター（ＭＰＰ）、及びニワトリβアクチンプロモーターから選択され得る。プロモーターに加えて、ベクターは、１つ以上の他の適切な転写開始、終結、エンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、例えばＷＰＲＥ、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強する配列、及び必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含み得る。好適なエンハンサーの一例は、ＣＭＶエンハンサーである。他の好適なエンハンサーには、所望の標的組織適応症に適切なものが含まれる。一実施形態では、発現カセットは、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは、２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは、同じであってもよく、又は互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、ＣＭＶ前初期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピー中に存在し得る。代替的に、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列によって分離される。更に別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリベータアクチンイントロンを更に含む。他の好適なイントロンとしては、当該技術分野で既知のものが含まれ、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８に記載されるものなどが含まれる。好適なポリＡ配列の例には、例えば、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、及び合成ポリＡが含まれる。任意選択
的に、１つ以上の配列を選択して、ｍＲＮＡを安定させてもよい。かかる配列の一例は、修飾ＷＰＲＥ配列であり、これは、ポリＡ配列の上流及びコード配列の下流で操作され得る（例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９．を参照されたい。

【0039】

一実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、プロモーター、任意選択的なエンハンサー、任意選択的なイントロン、ヒトＰＧＲＮ（複数可）のコード配列、又はそれらを含む融合タンパク質、ポリＡ、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、プロモーター、任意選択的なエンハンサー、任意選択的なイントロン、ヒトＰＧＲＮのコード配列、又はそれらを含む融合タンパク質、ポリＡ、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、プロモーター、任意選択的なエンハンサー、任意選択的なイントロン、ｈＰＧＲＮのコード配列、ポリＡ、及びＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、ＥＦ１ａプロモーター、任意選択的なエンハンサー、任意選択的なプロモーター、ｈＰＧＲＮ、ＳＶ４０ポリＡ、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、ＵｂＣプロモーター、任意選択的なエンハンサー、任意選択的なイントロン、ｈＰＧＲＮ、ＳＶ４０ポリＡ、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモーター、イントロン、ｈＰＧＲＮ、ＳＶ４０ポリＡ、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモーター、イントロン、ｈＰＧＲＮ、ウサギベータグロビンポリＡ、及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲである。例えば、配列番号２２（ＥＦ１ａ．ｈＰＧＲＮ．ＳＶ４０）、配列番号２３（ＵｂＣ．ＰＩ．ｈＰＧＲＮ．ＳＶ４０）、又は配列番号２４（ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ１．ｒＢＧ）を参照されたい。ｈＰＧＲＮのコード配列は、本明細書で定義される配列から選択される。例えば、配列番号３若しくはそれと９５％～９９．９％同一の配列、又は配列番号４若しくはそれと９５％～９９．９％同一の配列、又は本明細書に定義されるそれらの断片を参照されたい。以下の実施例で使用されるベクターエレメントの例示的な配列は、例えば、配列番号６（ウサギグロビンポリＡ）、ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号７及び８）、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター（配列番号９）、ＣＢプロモーター（配列番号１０）、キメライントロン（配列番号１１）、ＵｂＣプロモーター（配列番号１２）、ＥＦ－１ａプロモーター（配列番号１７）、イントロン（配列番号１３）、及びＳＶ４０後期ポリＡ（配列番号１４）で提供される。ベクターゲノムの他のエレメント又はこれらの配列上のバリエーションは、本発明の特定の実施形態について、ベクターゲノムに対して選択され得る。

【0040】

ベクター産生
ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の産生における使用のために、発現カセットは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミド上に担持され得る。本発明において有用なプラスミドは、とりわけ、原核細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞におけるインビトロでの複製及びパッケージングに適しているように操作され得る。好適なトランスフェクション技術及びパッケージング宿主細胞は、既知であり、かつ／又は当業者によって容易に設計することができる。

【0041】

ベクターとしての使用に好適なＡＡＶを生成及び単離するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃ
ｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、及び以下に引用される参考文献を参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される。導入遺伝子をビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、発現カセットを含む核酸分子と同じ構築物中でシスに必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。

【0042】

一実施形態では、本明細書に記載される発現カセットは、ウイルスベクターを産生するために、その上に運ばれる免疫グロブリン構築物配列をパッケージング宿主細胞に導入する遺伝子要素（例えば、シャトルプラスミド）に操作される。一実施形態では、選択される遺伝子エレメントは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によってＡＡＶパッケージ細胞に送達され得る。好適なＡＡＶパッケージング細胞も作製され得る。代替的には、発現カセットは、ＡＡＶ以外のウイルスベクターを生成するために、又はインビトロでの抗体の混合物の産生のために使用され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技法を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

【0043】

「ＡＡＶ中間体」又は「ＡＡＶベクター中間体」という用語は、それにパッケージングされた所望のゲノム配列を欠失している組み立てられたｒＡＡＶカプシドを指す。これらはまた、「空の」カプシドと称され得る。かかるカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列を含んでいなくてもよく、又は遺伝子産物の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージングされたゲノム配列のみを含んでいてもよい。これらの空のカプシドは、宿主細胞に目的の遺伝子を導入するために非機能的である。

【0044】

本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技法を使用して産生されてもよい。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、機能性ｒｅｐ遺伝子、最低限、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及び導入遺伝子で構成される発現カセット、並びに発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを可能にするのに十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含む。カプシドを生成する方法、そのためのコード配列、及びｒＡＡＶウイルスベクターの産生方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。

【0045】

一実施形態では、組換えＡＡＶを産生するために有用な産生細胞培養物が提供される。かかる細胞培養物は、宿主細胞中でＡＡＶカプシドタンパク質を発現する核酸、ＡＡＶカプシドへのパッケージングに好適な核酸分子、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ及び宿主細胞中の産物の発現を指示する配列と作動可能に連結される遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列を含有するベクターゲノム、並びに組換えＡＡＶカプシドへの核酸分子のパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能及びアデノウイルスヘルパー機能を含有する。一実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞（例えば、とりわけ、ヒト胎児腎臓２９３細胞）又は昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス）からなる。

【0046】

典型的には、ｒｅｐ機能は、ベクターゲノムに隣接するＩＴＲを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ源に由来する。本明細書の実施例では、ＡＡＶ２ ＩＴＲを選択し、ＡＡＶ２ ｒｅｐを使用する。コード配列は、配列番号２７に再現される。任意選択的に、他のＲＥＰ
配列又は別のＲＥＰソース（及び任意選択的に別のＩＴＲソース）が選択されてもよい。例えば、ｒｅｐは、これらに限定されないが、ＡＡＶ１ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、又はｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０、ｒｅｐ６８／７８、及びｒｅｐ４０／５２、若しくはそれらの断片であり得る。任意に、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、細胞培養物中の同じ遺伝子要素上にある。ｒｅｐ配列とｃａｐ遺伝子との間にスペーサーが存在し得る。これらのＡＡＶ又は変異体ＡＡＶカプシド配列のいずれかは、宿主細胞中でそれらの発現を指示する外因性調節制御配列の制御下にあり得る。

【0047】

一実施形態では、細胞は、好適な細胞培養（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞において製造される。本明細書に記載される遺伝子療法ベクターを製造するための方法には、遺伝子療法ベクターの産生に使用されるプラスミドＤＮＡの生成、ベクターの生成、及びベクターの精製などの、当該技術分野で周知の方法が含まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶベクターであり、生成されたプラスミドは、ＡＡＶゲノム及び目的の遺伝子をコードするＡＡＶシス－プラスミド、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶトランス－プラスミド、並びにアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、並びにベクター含有細胞及び培養培地の回収などの方法ステップを含み得る。

【0048】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＰＧＲＮの製造プロセスは、プラスミドＤＮＡによるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを伴う。単一バッチ又は複数バッチは、ＰＡＬＬ ｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクターで、ＨＥＫ２９３細胞のＰＥＩ媒介性三重トランスフェクションによって産生される。回収したＡＡＶ材料は、可能な場合、使い捨ての閉鎖型バイオプロセッシングシステムにおいて、清澄化、ＴＦＦ、アフィニティクロマトグラフィ、及びアニオン交換クロマトグラフィによって順次精製される。

【0049】

回収されたベクター含有細胞及び培養培地は、本明細書では粗細胞回収物と称される。更に別の系では、遺伝子療法ベクターは、バキュロウイルスベースのベクターによる感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生系に関するレビューについては、概して、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたく、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。これら及び他のＡＡＶ産生系を作製及び使用する方法はまた、以下の米国特許に記載されており、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、及び７，４３９，０６５（これらは、参照により本明細書に援用される）。

【0050】

粗細胞回収物は、その後、ベクター回収物の濃縮、ベクター回収物の透析濾過、ベクター回収物の顕微溶液化、ベクター回収物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化された中間体の濾過、クロマトグラフィによる粗精製、超遠心分離による粗精製、接線流濾過による緩衝液交換、及び／又はバルクベクターを調製するための製剤化及び濾過などの、追加の方法ステップに供される。

【0051】

２工程の高塩濃度でのアフィニティクロマトグラフィ精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィを用いて、ベクター薬物製品を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／
０６５９７０号に更に詳細に記載されている（これは、参照により本明細書に援用される）。ＡＡＶ８の精製方法：２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７６号、及びｒｈ１０の精製方法：２０１６年１２月９日に出願され、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶｒｈ１０」と題する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６６０１３号（２０１５年１２月１１日にも出願されている）、並びにＡＡＶ１の精製方法：２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７４号、２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ１」は、全て参照により本明細書に援用される。

【0052】

空及び充填粒子の含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配で精製された調製物、ここで、ＧＣの数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド体積が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物ピークのバンド体積中の粒子の数を算出する。次いで、ロードした２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割り算し、ゲノムコピーに対する粒子の比率（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ～ＧＣ／ｍＬは、空ｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割り、１００を掛け算することによって、空粒子のパーセンテージを得る。

【0053】

一般に、空のカプシド及びパッケージされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性カプシドについて試験するために、本方法は、処理されたＡＡＶストックを、３つのカプシドタンパク質を分離することが可能な任意のゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、緩衝液中に３～８％のトリス酢酸塩を含有する勾配ゲル）に供することと、次いで、試料材料が分離されるまでゲルを試行することと、ナイロン又はニトロセルロース膜、好ましくはナイロンの上でゲルをブロッティングすることと、を含む。抗－ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗－ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗－ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する主要な抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、又は比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラムフラクションからの試料を取って、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ充填緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）中で分解された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って、又は他の好適な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビー若しくはクマシー色素を用いて、銀染色を実施してもよい。一実施形態では、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（又は別の好適なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活性化後、試料は、更に希釈され、プライマー及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを用いて、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を生成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）の値を使用して、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することによって、ベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用されることができる。

【0054】

一態様では、広域スペクトルのセリンプロテアーゼ、例えば、プロテイナーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料をプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテイナーゼＫで処理し、続いて、熱失活させることを除き、標準的なアッセイと同様である。好適には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテアーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮され得る。典型的には、プロテイナーゼＫ処理は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。治療ステップは、一般に、約５５°Ｃで約１５分間、実施されるが、より低い温度（例えば、約３７°Ｃ～約５０°Ｃ）でより長時間（例えば、約２０分間～約３０分間）、又はより高い温度（例えば、最高約６０°Ｃ）でより短時間（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱失活は、一般に、約９５°Ｃで約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０°Ｃ）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準的なアッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。

【0055】

追加的に、又は代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されてもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖及び自己相補性ＡＡＶベクターゲノム力価を決定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

【0056】

簡潔に言うと、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ粒子をゲノム欠損ＡＡＶ中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶカプシド中間体を含む懸濁液を高性能液体クロマトグラフィに供することを含み、ＡＡＶウイルス粒子及びＡＡＶ中間体は、高ｐＨで平衡化された強力アニオン交換樹脂に結合され、約２６０及び約２８０で紫外吸光度のために溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供される。ｐＨは、選択されたＡＡＶに応じて調節され得る。例えば、ＷＯ２０１７／１６０３６０（ＡＡＶ９）、ＷＯ２０１７／１００７０４（ＡＡＶｒｈ１０）、ＷＯ２０１７／１００６７６（例えば、ＡＡＶ８）、及びＷＯ２０１７／１００６７４（ＡＡＶ１）を参照されたい（これらは、参照により本明細書に援用される）。この方法では、ＡＡＶ完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に到達すると溶出される画分から回収される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィステップのために、ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶ２血清型を効率的に捕らえるＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン性条件下、残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は、効率的に捕捉される。

【0057】

組成物
本明細書では、少なくとも１つのｒＡＡＶ．ｈＰＧＲＮストック（例えば、ｒＡＡＶストック）、及び任意選択的な担体、賦形剤及び／又は防腐剤を含む組成物が提供される。

【0058】

本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶの「ストック」は、ｒＡＡＶの集団を指す。脱アミド化に起因するカプシドタンパク質の不均一性にもかかわらず、ストック内のｒＡＡＶは、同一のベクターゲノムを共有することが予想される。ストックは、例えば、選択されたＡＡＶカプシドタンパク質及び選択された産生系に特徴的な不均一な脱アミド化パターンを有するカプシドを有するｒＡＡＶを含み得る。ストックは、単一の産生系から産生されてもよく、又は産生系の複数の実行からプールされてもよい。本明細書に記載されるものを含むが、これらに限定されない様々な産生系が選択され得る。

【0059】

特定の実施形態では、組成物は、プログラニュリン関連前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を治療する際の使用に好適な組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であるウイルスストックを含み、当該ｒＡＡＶは、（ａ）アデノ随伴ウイルス１カプシドと、（ｂ）ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムであって、当該ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトプログラニュリンのコード配列、及びプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む、ベクターゲノムと、を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ヒトＰＧＲＮのコード配列、及びポリアデニル化シグナルを含む。特定の実施形態では、イントロンは、ニワトリベータアクチンスプライスドナー及びウサギβスプライスアクセプターのエレメントからなる。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ及びＡＡＶ２ ３’ＩＴＲを更に含み、これらは、ベクターゲノムの全てのエレメントに隣接する。

【0060】

ｒＡＡＶ．ｈＰＧＲＮは、好ましくは生理学的に適合する担体に懸濁され、ヒト患者又は非ヒト哺乳動物患者に投与され得る。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、ｒＡＡＶは、好適には、生理食塩水、界面活性剤、及び生理学的に適合性の塩又は塩の混合物を含有する水溶液に懸濁される。好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～９、又はｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、又はｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは、約７．２８～約７．３２、又は髄腔内送達の場合、約７．２～約７．４であるので、この範囲内のｐＨが望ましいが、静脈内送達の場合、約６．８～約７．２のｐＨが望ましい場合がある。しかしながら、より広範囲にある他のｐＨ、及びこれらの下位範囲が、他の送達経路のために選択され得る。

【0061】

特定の実施形態では、製剤は、重炭酸ナトリウムを含まない緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。かかる製剤は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、及びこれらの組み合わせのうちの１つ以上を水中に含む緩衝生理食塩水溶液、例えば、Ｈａｒｖａｒｄ緩衝液を含有し得る。水溶液は、ポロキサマーであるＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８を更に含んでもよく、これは、ＢＡＳＦから市販され、以前、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８という商品名で販売されていた。水溶液は、７．２のｐＨ又は７．４のｐＨを有し得る。

【0062】

別の実施形態では、製剤は、１ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ_３ＰＯ_４）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、１．４ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、０．８ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、及び０．００１％のＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標））１８８を含む、緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。例えば、ｈａｒｖａｒｄａｐｐａｒａｔｕｓ．ｃｏｍ／ｈａｒｖａｒｄ－ａｐｐａｒａｔｕｓ－ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ－ｆｌｕｉｄ．ｈｔｍｌを参照されたい。特定の実施形態では、ハーバード緩衝液が好ましい。

【0063】

他の実施形態では、製剤は、１つ以上の浸透促進剤を含有し得る。適切な浸透促進剤の例は、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、
又はＥＤＴＡを含んでもよい。

【0064】

別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤及び／又はアジュバントを含む。好適な担体は、導入ウイルスが指向する適応症の観点で、当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、生理食塩水を含み、様々な緩衝化溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）を用いて製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、及び水が挙げられる。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブに粘着するのを防ぐが、インビボでのｒＡＡＶ結合活性を妨害しない構成要素を含むべきである。

【0065】

任意選択的に、組成物は、ｒＡＡＶ及び担体（複数可）に加えて、防腐剤又は化学安定剤などの他の従来の医薬成分を含み得る。好適な例示的な防腐剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学的安定剤には、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。

【0066】

本明細書で使用される場合、「担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足活性成分を組成物中に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギー又は類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。リポソーム、ナノカプセル、ミクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などのような送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。詳細には、ｒＡＡＶベクター送達導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、又はナノ粒子などに封入化された送達のいずれかのために製剤化され得る。

【0067】

一実施形態では、組成物は、対象への送達に適した最終製剤を含み、例えば、生理的に適合するｐＨ及び塩濃度に緩衝される水性液体懸濁液である。任意選択的に、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、凍結乾燥され、投与時に再構築されてもよい。

【0068】

好適な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、８４００の平均分子量を有する、ポロキサマー１８８としても知られている、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、第一級ヒドロキシル基末端の二機能的ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般的に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）の後に３桁の数字で命名され、最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与え、最後の１桁×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与える。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在してもよい。

【0069】

ベクターは、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺伝子導入及び発現を提供して、過度の悪影響なしに、又は医学的に許容される生理学的効果を伴う治療効果を提供し、これは当業者によって決定され得る。任意に、髄腔内投与以外の経路、例えば、所望の臓器（例えば、肝臓（任意に肝動脈を介して）、肺、心臓、眼、腎臓）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の親の投与経路などを使用することができる。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。

【0070】

ウイルスベクターの投薬量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、及び健康状態などの要因に依存し得、したがって、患者間で変化し得る。例えば、ウイルスベクターの治療上有効なヒト投薬量は、概して、約２５～約１０００マイクロリットル～約１００ｍＬの範囲の、（体重が７０ｋｇの平均的な対象を治療するために）約１×１０^９～１×１０^１６ゲノムウイルスベクターの濃度（その範囲内の全ての整数又は分数量を含み、好ましくは、ヒト患者に対して、１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣ）を含む溶液である。一実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量あたり少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、又は９×１０^９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、又は９×１０^１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、又は９×１０^１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、又は９×１０^１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、又は９×１０^１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、又は９×１０^１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、又は９×１０^１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は少数を含む、用量あたり１×１０^１０～約１×１０^１２ＧＣの範囲であり得る。

【0071】

特定の実施形態では、用量は、約１×１０^９ＧＣ／ｇ脳質量～約１×１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。特定の実施形態では、用量は、約１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．３３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。特定の実施形態では、用量は、約３．３３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量～約１．１×１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。特定の実施形態では、用量は、約１．１×１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量～約３．３３×１０^１３ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。特定の実施形態では、用量は、３．３３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量よりも低い。特定の実施形態では、用量は、１．１×１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量よりも低い。特定の実施形態では、用量は、３．３３×１０^１３ＧＣ／ｇ脳質量よりも低い。

【0072】

特定の実施形態では、用量は、約１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約２×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約
２×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約３×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約４×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約５×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約６×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約７×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約８×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約９×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約１×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約２×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約４×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約３．３×１０^１０ＧＣ／脳質量のｇである。特定の実施形態では、用量は、約１．１×１０^１１ＧＣ／脳質量のｇである。特定の実施形態では、用量は、約２．２×１０^１１ＧＣ／脳質量のｇである。特定の実施形態では、用量は、約３．３×１０^１１ＧＣ／脳質量のｇである。

【0073】

特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約１．４４×１０^１３～４．３３×１０^１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約１．４４×１０^１３～２×１０^１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約３×１０^１３～１×１０^１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約５×１０^１３～１×１０^１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。

【0074】

特定の実施形態では、組成物は、ｒＡＡＶの約１×１０^１３～８×１０^１４ＧＣの範囲にあるＡＡＶの量を含有するように投薬量単位で製剤化され得る。特定の実施形態では、組成物は、ｒＡＡＶの約１．４４×１０^１３～４．３３×１０^１４ＧＣの範囲にあるｒＡＡＶの量を含有するように投薬量単位で製剤化され得る。特定の実施形態では、組成物は、ｒＡＡＶの約３×１０^１３～１×１０^１４ＧＣの範囲にあるｒＡＡＶの量を含有するように投薬量単位で製剤化され得る。特定の実施形態では、組成物は、ｒＡＡＶの約５×１０^１３～１×１０^１４ＧＣの範囲にあるｒＡＡＶの量を含有するように投薬量単位で製剤化され得る。

【0075】

特定の実施形態では、以下の組織型：前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質、後頭部皮質、髄質、小脳、頸部脊髄、胸部脊髄、腰椎脊髄、頸部後根神経節、胸部後根神経節、腰部後根神経節、及び三叉神経節のうちのいずれか１つ以上において、１０^３ＧＣ／μｇのＤＮＡを提供するのに十分である単回用量が投与される。特定の実施形態では、以下の組織型：前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質、後頭部皮質、髄質、小脳、頸部脊髄、胸部脊髄、腰椎脊髄、頸部後根神経節、胸部後根神経節、腰部後根神経節、及び三叉神経節のうちのいずれか１つ以上において、１０^４ＧＣ／μｇのＤＮＡを提供するのに十分である単回用量が投与される。

【0076】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、単回用量で対象に投与される。特定の実施形態では、複数回の用量（例えば、２用量）が所望される。

【0077】

任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。導入遺伝子の発現レベルをモニタリングして、ウイルスベクター、好ましくはミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクターをもたらす投薬頻度を決定することができる。任意選択的に、治療目的で記載されているものと同様の投与レジメンは、本発明の組成物を使用した免疫化に利用され得る。

【0078】

本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」又は「髄腔内投与」という用語は、脳脊髄
液（ＣＳＦ）に到達するように、脊柱管内、より具体的には、クモ膜下腔内への注射を介した、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、及び／又はＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰椎穿刺の手段によって、クモ膜下腔全体に拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注入は、大槽内であってもよく、又は実質内送達を介してもよい。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる大槽への（大槽内）後頭下注入を介して投与される。特定の実施形態では、患者は、単回用量で投与される。

【0079】

本明細書で使用される場合、「大槽内送達」又は「大槽内投与」という用語は、小脳延髄大槽の脳脊髄液への直接的な薬物の投与経路、より具体的には、後頭下穿刺による、若しくは大槽内への直接注射による、又は永続的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。

【0080】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＰＧＲＮのストックは、髄腔内最終製剤緩衝液（ＩＴＦＦＢ；０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を含む人工ＣＳＦ）中に製剤化される。バッチ（複数可）を凍結し、その後解凍し、必要に応じてプールし、標的濃度に調整し、０．２２μｍフィルターを通して滅菌濾過し、バイアルを充填する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮの製剤緩衝液を含む懸濁液は、ｐＨ７．２～７．４に調整される。

【0081】

一実施形態では、本明細書で提供されるｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮの用量の送達のための容量は、当業者により決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量が選択されてもよいが、より高容量が、成人用に選択されてもよい。典型的には、新生児のために、好適な体積は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年長の乳児のために、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択され得る。幼児のために、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの体積が選択され得る。小児のために、最大約３０ｍＬの体積が選択され得る。１０代前半及び１０代のために、最大約５０ｍＬの体積が選択され得る。更に他の実施形態では、患者は、約５ｍＬ～約１５ｍＬの体積での髄腔内投与を受けてもよく、これが選択されるか、又は約７．５ｍＬ～約１０ｍＬを受けてもよい。他の適切な体積及び投薬量が決定され得る。任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。

【0082】

特定の実施形態では、組成物は、ｒＡＡＶ．ＥＦ１ａ．ｈＰＧＲＮ．ＳＶ４０、ｒＡＡＶ．ＵｂＣ．ＰＩ．ｈＰＧＲＮ．ＳＶ４０、又はｒＡＡＶＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ１．ｒＢＧを含む。ｒＡＡＶカプシドがＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ５、又はＡＡＶ１である組成物は、以下の実施例に例示される。特に好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１である。特定の実施形態では、ｈＰＧＲＮのコード配列は、本明細書で定義される配列から選択される。例えば、配列番号３若しくはそれと９５％～９９．９％同一の配列、又は配列番号４若しくはそれと９５％～９９．９％同一の配列、又は本明細書に定義されるそれらの断片を参照されたい。以下の実施例で使用されるベクターエレメントの例示的な配列は、例えば、配列番号６（ウサギグロビンポリＡ）、ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号７及び８）、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター（配列番号９）、ＣＢプロモーター（配列番号１０）、キメライントロン（配列番号１１）、ＵｂＣプロモーター（配列番号１２）、ＥＦ－１ａプロモーター（配列番号１７）、イントロン（配列番号１３）、及びＳＶ４０後期ポリＡ（配列番号１４）で提供される。

【0083】

使用
本明細書で使用される場合、ＰＧＲＮハプロ不全は、欠乏したＰＧＲＮ及び／又はＧＲＮ（複数可）のレベルをもたらす、ＰＧＲＮ遺伝子の変異を有する患者を指す。ｒＡＡＶ１－ＰＧＲＮ療法の標的集団には、ＰＧＲＮハプロ不全を有する患者、及び／又はその他
の欠乏したＰＧＲＮ又はＧＲＮのレベルを有する患者が含まれる。特定の実施形態では、患者は、ＰＧＲＮ変異についてヘテロ接合である。更に別の実施形態では、患者は、ＰＧＲＮ変異由来のホモ接合である。特定の実施形態では、患者は、本明細書で提供されるｒＡＡＶ１媒介性ｈＰＧＲＮ療法と組み合わせた免疫抑制レジメンが投与される。

【0084】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮは、ＧＲＮハプロ不全を有する患者の治療に有用である。かかる患者は、ＧＲＮハプロ不全によって引き起こされる成人発症性神経変性症と診断された可能性があるか、又は症状前である可能性がある。ｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮは、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる大槽への（大槽内［ＩＣＭ］）後頭下注入を介して、単回用量として投与することができる。単回用量は、所定の用量レベルで投与される。ＮＨＰにおける単回ＩＣＭ注入により達成された優れた脳形質導入により、この投与経路が選択された。特定の実施形態では、ベクターのＩＣＭへの投与はまた、別の投与経路（例えば、側脳室への注入）と比較して、抗ＰＧＲＮ Ｔ細胞応答の低下をもたらす。一般的な手順では、ＩＣＭ注入（後頭下穿刺としても知られている）は、以前は腰椎穿刺によって置き換えられていた。しかしながら、他の投薬レベル及び送達経路は、このｒＡＡＶ１媒介性ｈＰＧＲＮ療法と併せて選択及び／又は使用されてもよい。

【0085】

特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶ１媒介性療法は、ＧＲＮ変異を有しないヒト（ハプロ不全）に対して、およそ平均的で正常な生理学的レベルで、ＰＧＲＮ発現を提供し得る。しかしながら、治療は、ＰＧＲＮ発現の増加が正常レベルよりも低い場合であっても、治療効果を提供し得、正常な平均レベルの約４０％～９９％、例えば、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はこれらの間の他の値を提供する。特定の実施形態では、これは、治療前の患者の発現レベルを上回る、少なくとも５％～約７０％、又はそれ以上のＰＧＲＮレベルの増加から生じ得る。特定の実施形態では、治療は、ｒＡＡＶ１媒介性ｈＰＧＲＮの投与が、ＣＳＦ中のＰＧＲＮのレベルの上昇（例えば、正常レベルよりも１０倍～４０倍高い）をもたらす治療有効性を提供する。

【0086】

特定の実施形態では、有効性は、ＣＳＦにおけるＰＧＲＮタンパク質のレベルの増加、及び／又は脳皮質の厚さの変化のうちの１つ以上によって評価される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ１媒介療法の有効性は、単回ＩＣＭ用量の投与後に評価され、長期生存、並びにミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）、臨床全般印象変化（ＣＧＩ－Ｃ）、前頭葉機能検査（ＦＡＢ）、前頭側頭型認知症評価尺度（ＦＲＳ）、前頭葉性行動質問紙（ＦＢＩ）、統一パーキンソン病評価尺度（ＵＰＤＲＳ）、言語流暢性検査、前頭側頭葉変性症の臨床認知症尺度評価項目合計（ＣＤＲ－ＦＴＬＤ ｓｂ）、及び／又は神経精神症状質問紙（ＮＰＩ）によって評価される臨床症状及び日常機能の改善のうちの１つ以上によって測定される。特定の実施形態では、有効性は、ニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）、タウ、リン酸化タウ、及び炎症マーカーのＣＳＦレベルの改善、並びに／又はＰＧＲＮの血漿中レベルの増加によって実証される。特定の実施形態では、有効性は、ミクログリオーシスのレベルの減少又は逆転を測定することによって評価される。特定の実施形態では、有効性は、前頭葉及び／又は側頭葉における代謝低下を評価するためにＦＤＧ ＰＥＴを実施することによって実証される。

【0087】

特定の実施形態では、有効性は、ＧＲＮ患者に関連する臨床症状のうちの１つ以上の改善によって測定され、これには、例えば、行動上の欠陥（脱抑制、無気力、同情又は共感の喪失、強迫的又は常同的な行動、又は口唇傾向）及び認知上の欠陥（エピソード記憶又は視覚空間スキルに重大な影響を及ぼさない実行機能の低下）が含まれる。

【0088】

特定の実施形態では、改善は、いくつかの他のより非定型的な症状において観察され、精神医学的特徴（妄想、幻覚、及び強迫行動）及び／又は他の認知障害（エピソード記憶
障害、失行、及び視空間機能障害）を含む。評価は、ＦＴＤＣ基準を使用して行われてもよく、前頭葉変性及び／又は側頭葉変性の徴候についての脳イメージング、臨床評価尺度（前頭側頭葉変性症の臨床認知症尺度［ＣＤＲ－ＦＴＬＤ］、前頭葉性行動質問紙［ＦＢＩ］、神経精神症状質問紙［ＮＰＩ］、及び前頭側頭型認知症評価尺度［ＦＲＳ］など）での減少の評価、及び最終的には、病原性ＧＲＮ変異を確認するための遺伝子検査を含む。脳脊髄液（ＣＳＦ）のバイオマーカーを使用してもよく、タウ及びアミロイド－β、並びにアミロイドの陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングが含まれる。

【0089】

特定の実施形態では、改善は、原発性進行性失語（ＰＰＡ）を有するＧＲＮ変異保因者において観察され、これは、発話及び言語に関連する症状によって特徴付けられる。これらは、ＰＰＡの３つの臨床型である意味型ＰＰＡ（ｓｖＰＰＡ）、非流暢型ＰＰＡ（ｎｆｖＰＰＡ）、及びロゴペニック型ＰＰＡ（ｌｖＰＰＡ）を区別するメスラム基準に基づくガイドラインを使用して診断され得る（Ｇｏｒｎｏ－Ｔｅｍｐｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）“Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ａｐｈａｓｉａ ａｎｄ ｉｔｓ ｖａｒｉａｎｔｓ．”Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．７６（１１）：１００６－１４）。ｎｆｖＰＰＡは、発話を生成する能力の欠陥を呈し、基本的な特徴としては、言語生成における失文法、努力性発話、及び発話の失行が挙げられる。ｓｖＰＰＡは、単語の意味を理解する能力の欠陥を呈し、基本的な特徴としては、単語の呼称及び単語の理解の障害が挙げられる。ｌｖＰＰＡは、会話中に適切な単語を見つけることが困難であることを特徴とするが、単語の理解の低下を伴わない。ｌｖＰＰＡの基本的主な特徴は、単語の想起及び文の復唱の能力の欠陥である。ＧＲＮ変異保因者は、ｎｆｖＰＰＡで最も一般的であるが、ＰＰＡの臨床スペクトルにわたってより広範な症状を有する場合があり、「ＰＰＡ－特定不能（ｎｏｔ ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）」の診断をもたらす（Ｇｏｒｎｏ－Ｔｅｍｐｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｗｏｏｌｌａｃｏｔｔ ａｎｄ Ｒｏｈｒｅｒ，２０１６）。

【0090】

ＧＲＮハプロ不全に関連する神経変性状態を有するヒト患者を治療する方法が提供される。特定の実施形態では、この状態は、プログラニュリン関連前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）である。本方法は、アデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ１）カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を介して、プログラニュリンのコード配列を中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することを含み、当該ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド中にパッケージされるベクターゲノムを更に含み、当該ベクターゲノムは、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトプログラニュリンのコード配列、及びプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む。

【0091】

プログラニュリンに関連する前頭側頭型認知症又はＧＲＮハプロ不全に関連する別の神経変性状態、に関連する脳病変を有するヒト患者を治療するための方法が提供される。本方法は、アデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ１）カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を介して、プログラニュリンのコード配列を中枢神経系（ＣＮＳ）に投与することを含み、当該ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムを更に含み、当該ベクターゲノムは、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトプログラニュリンのコード配列、及びプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む。

【0092】

特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、（ａ）脳病変の減少の予測因子として網膜蓄積病変の減少について患者を非侵襲的に評価すること、（ｂ）磁気共鳴画像法を行って脳体積を評価すること、及び／又は（ｃ）ＣＳＦ中のプログラニュリンの濃度を測定することによって、治療をモニタリングすることを更に含み得る。任意選択的に、血漿中のプログラニュリン濃度を評価してもよい。

【0093】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＰＧＲＮ組成物の有効性は、主に認知的方法、主に行動的方法、又は認知／他の方法のうちの１つ以上によって評価される。以下に、好適な
評価について説明する。

【0094】

主な認知評価には、言語流暢性検査、ＦＴＬＤの臨床認知症比率、又はミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）がある。言語流暢性検査は、各対象に同じ絵／写真を提示し、口頭での説明を求めることによって実施される。説明中に、発話速度（単語／分）がカウントされ、記録され、最終的に定型発達の成人を反映する速度と比較される。ＣＤＲ－ＦＴＬＤは、古典的なＣＤＲの拡張版であり、歴史的に、アルツハイマー病のスペクトル障害の重症度を評価するために使用されている。この評価には、ＣＤＲの元の６つのドメイン（記憶、見当識、判断力と問題解決、社会適応、家庭状況と趣味、介護状況）、並びに言語及び行動という２つの追加のドメインが含まれ、ＦＴＬＤの低下を検出する際に、感度がより高くなる。「０」の評価は、正常な行動又は言語を示し、「１」、「２」、又は「３」のスコアは、軽度から重度の障害を示す。「評価項目合計（ｓｕｍ ｏｆ ｂｏｘｅｓ）」、又は個々のドメインスコアの合計は、全体的な認知症の重症度を決定するために使用される。ＭＭＳＥは、臨床及び研究の実践で広く使用されている１１問の全体的な認知評価である。質問としては、例えば、「今年は何年ですか？季節はいつですか？何日ですか？何曜日ですか？何月ですか？」と尋ねられ、正解ごとに１ポイントが与えられ、質問ごとに最高スコアが与えられる。最高総スコアは３０で、２４及び２７のスコアの２つのカットオフがある。これらのカットオフは、認知機能低下の指標である。

【0095】

主な運動評価には、例えば、統一パーキンソン病評価尺度（ＵＰＤＲＳ）が含まれる。ＵＰＤＲＳは、メンテーション、行動、日常生活の気分と活動など、パーキンソニズムに関連するいくつかのドメインの４２項目の４部構成の評価である。各項目は、典型的には、０（典型的には障害なしを示す）から４（典型的には最も重度の障害を示す）の範囲の評価尺度を含む。各部のスコアは、疾患の重症度を提供するために集計され、高スコアの１９９点は、最悪／最も完全な障害を示す。

【0096】

主な行動評価としては、例えば、神経精神症状質問紙（ＮＰＩ）又は前頭葉性行動質問紙（ＦＢＩ）が含まれる。ＮＰＩは、脳の障害を有する患者における精神病理の存在を解明するために使用される。当初、これはアルツハイマー病の集団で使用するために開発されたが、他の条件における行動の変化を評価するのに役立つ場合がある。この評価は、１０の行動ドメインと２つの自律神経領域で構成され、その中には、４つのスコア：頻度、重症度、総合的な負担、及び介護者の負担がある。ＮＰＩの総スコアは、行動ドメインのドメインスコアを加算し、介護者負担のスコアを減算することによって得られる。ＦＢＩは、ｂｖＦＴＤに特に関連する行動及び人格の変化を評価し、ＦＴＤと他の認知症間を区別することを目的とした２４項目の評価である。ｂｖＦＴＤと診断された患者は、一般に、これらのタイプの変化について十分な洞察を有していないため、これは、主介護者との対面面接として実施される。行動と人格に関連するいくつかの分野に焦点を当て、各質問を０（なし）から３（重度／ほとんどの場合）まで採点する。総スコアは、病気の重症度に関する洞察を提供し、経時的な変化を評価するために使用することができる。

【0097】

他の／認知及び運動評価の両方には、例えば、コロンビア自殺重症度評価尺度（Ｃ－ＳＳＲＳ）、臨床全般印象度変化（ＣＧＩ－Ｃ）、前頭葉機能検査（ＦＡＢ）、及び／又は前頭側頭型認知症評価尺度（ＦＤＲ）が含まれる。Ｃ－ＳＳＲＳは、自殺の念慮と行動を評価するための質問を通して、自殺念慮、念慮の強度、自殺行動を測定する３部構成の尺度である。この評価の結果は、尺度から直接取得される自殺行動致死率評価、自殺念慮スコア、及び自殺念慮強度評価で構成される。０を超える念慮スコアは、評価ガイドラインに基づいて、介入の必要性を示し得る。強度評価は、０～２５の範囲であり、０は、自殺念慮の支持なしを表す。ＣＧＩ－Ｃは、３部の簡潔で広く使用されている評価のうちの１つであり、３項目で構成され、臨床医と観察者によって評価される。ＣＧＩ－Ｃは、改善が完全に治療によるものであるかどうかにかかわらず、研究への登録から始まり、１（非
常に改善された）から７（非常に悪化した）の範囲の７段階で評価される。ＦＡＢは、前頭葉性遂行機能障害表現型認知症とアルツハイマー型認知症間の区別を補助するための簡易評価である。これは、軽度の痴呆患者（ＭＭＳＥ＞２４）において特に有用である。評価は、認知、運動、及び行動の領域に対処する６部で構成され、総スコアが１８で、より高いスコアは、より良好なパフォーマンスを示す。ＦＤＲは、前頭側頭型認知症の患者のための簡易病期分類評価であり、経時的なＦＴＤサブタイプの疾患進行の差異を検出する。この簡単な面接は、主介護者とともに実施され、３０項目からなり、「起こらない」、「時々起こる」、又は「常に起こる」に分類される。次いで、パーセンテージスコアが計算され、ロジットスコア（ｌｏｇｉｔ ｓｃｏｒｅ）、そして最終的には、重症度スコアに変換される。重症度スコアは、非常に軽度から最重度までの範囲である。

【0098】

有効性の他の尺度としては、症状の発症後、診断時点からの生存期間の増加が挙げられ、有効性の尺度である。現在、ＧＲＮ変異によって引き起こされる神経変性と診断された患者の平均寿命は、症状の発症から７～１１年である。有効性の別の尺度は、標的集団における全ての臨床症状にわたって最も一般的に影響を受ける脳領域である中前頭皮質及び頭頂領域の厚さにおける萎縮の安定化及び／又は増加である。これは、ＭＲＩ又は他の画像診断技術を使用して評価することができる。更に他の評価には、生化学的バイオマーカーが含まれる。ＣＳＦ中及び血漿中のＰＧＲＮタンパク質のレベルは、ＡＡＶ形質導入の読み出しとして測定され、ｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮの投与後、患者において増加することが予想される。他の実施形態では、神経フィラメント軽鎖（ＮＦＬ）、タウ、リン酸化タウ、及び他の炎症マーカーのＣＳＦレベルが評価される。特定の実施形態では、これらのバイオマーカーのレベルの調節及び／又は減少は、有効性と相関する。

【0099】

以下の実施例は、ヘテロ接合ＧＲＮハプロ不全に関連する特定の状態の治療に焦点を当てているが、特定の実施形態では、本明細書に記載のベクター及び組成物は、他の疾患、例えば、神経セロイドリポフスチン症、癌（例えば、卵巣癌、乳癌、副腎癌、及び／又は膵臓癌）、アテローム性動脈硬化症、２型糖尿病、及び代謝性疾患などのＧＲＮ遺伝子のホモ接合性変異に関連する疾患の治療に使用され得る。

【0100】

更なる実施形態は、以下、「Ａ１」～「Ｅ３」として続く。

【0101】

Ａ１．ヒト患者における成人発症性神経変性疾患の治療に有用な治療レジメンであって、レジメンが、ＡＡＶ１カプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの投与を含み、当該ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プログラニュリン（ＧＲＮ）のコード配列、及び標的細胞におけるプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含み、投与が、
（ｉ）約３．３×１０^１０ゲノムコピー（ＧＣ）／脳質量のグラム、
（ｉｉ）約１．１×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、
（ｉｉｉ）約２．２×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、又は
（ｉｖ）約３．３×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラムを含む、単回用量の大層内（ＩＣＭ）注入を含む、治療レジメン。

【0102】

Ａ２．プログラニュリンのコード配列が、配列番号３、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列である、実施形態Ａ１に記載のレジメン。

【0103】

Ａ３．ベクターゲノムが、ＣＢ７プロモーター、キメライントロン、及びウサギベータグロビンポリＡを更に含む、実施形態Ａ１又はＡ２に記載のレジメン。

【0104】

Ａ４．ベクターゲノムが、配列番号２４を含む、実施形態Ａ１～Ａ３のうちのいずれか
１つに記載のレジメン。

【0105】

Ａ５．患者が、ＧＲＮハプロ不全及び／又は前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を有すると特定されている、実施形態Ａ１～Ａ４のうちのいずれか１つに記載のレジメン。

【0106】

Ａ６．患者が、少なくとも３５歳である、実施形態Ａ１～Ａ５のうちのいずれか１つに記載のレジメン。

【0107】

Ａ７．患者は、ＣＳＦ中のプログラニュリンの濃度が低い、実施形態Ａ１～Ａ６のうちのいずれか１つに記載のレジメン。

【0108】

Ａ８．患者は、ＣＳＦ中のプログラニュリンの濃度が正常レベルの５０％未満である、実施形態Ａ７に記載のレジメン。

【0109】

Ａ９．患者は、ＣＳＦ中のプログラニュリン濃度が正常レベルの約３０％である、実施形態Ａ７に記載のレジメン。

【0110】

Ａ１０．ＣＳＦ、血清、及び／又は血漿中のプログラニュリンのレベルを検出することを更に含む、実施形態Ａ１～Ａ９のうちのいずれか１つに記載のレジメン。

【0111】

Ａ１１．
ｉ）ニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）、総タウ（Ｔ－タウ）、血漿グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、及びリン酸化タウ（Ｐ－タウ）のうちの１つ以上のＣＳＦレベル、
ｉｉ）網膜リポフスチンを評価すること、
ｉｉｉ）脳体積、白質完全性、並びに中前頭皮質及び頭頂領域の厚さのうちの１つ以上の変化を追跡するためにＭＲＩを実施すること、
ｉｖ）前頭葉及び／若しくは側頭葉における代謝低下を評価するためにＦＤＧ ＰＥＴを実施すること、並びに／又は
ｖ）疾患に関連する変化の減速を評価するためにＥＥＧ／誘発応答電位を測定すること、を測定することを更に含む、実施形態Ａ１～Ａ１０のうちのいずれか１つに記載のレジメン。

【0112】

Ａ１２．単回用量が、以下の組織型：前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質、後頭部皮質、髄質、小脳、頸部脊髄、胸部脊髄、腰椎脊髄、頸部後根神経節、胸部後根神経節、腰部後根神経節、及び三叉神経節のうちのいずれか１つ以上において、１０^３ＧＣ／μｇのＤＮＡを提供するのに十分である、実施形態Ａ１～Ａ１１のうちのいずれか１つに記載のレジメン。

【0113】

Ａ１３．単回用量が、以下の組織型：前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質、後頭部皮質、髄質、小脳、頸部脊髄、胸部脊髄、腰椎脊髄、頸部後根神経節、胸部後根神経節、腰部後根神経節、及び三叉神経節のうちのいずれか１つ以上において、１０^４ＧＣ／μｇのＤＮＡを提供するのに十分である、実施形態Ａ１～Ａ１２のうちのいずれか１つに記載のレジメン。

【0114】

Ｂ１．ＡＡＶ１カプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えＡＡＶベクターを含む、医薬組成物であって、当該ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プログラニュリンのコード配列、及び標的細胞におけるプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含み、組成物が、
（ｉ）約３．３×１０^１０ゲノムコピー（ＧＣ）／脳質量のグラム、
（ｉｉ）約１．１×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、
（ｉｉｉ）約２．２×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、又は
（ｉｖ）約３．３×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラムの用量を投与するために、大槽内（ＩＣＭ）注入を必要とするヒト患者への大槽内（ＩＣＭ）注入用に製剤化されている、医薬組成物。

【0115】

Ｂ２．プログラニュリンのコード配列が、配列番号３、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列である、実施形態Ｂ１に記載の医薬組成物。

【0116】

Ｂ３．ベクターゲノムが、ＣＢ７プロモーター、キメライントロン、及びウサギベータグロビンポリＡを更に含む、実施形態Ｂ１又はＢ２に記載の医薬組成物。

【0117】

Ｂ４．ベクターゲノムが、配列番号２４を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ３のうちのいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0118】

Ｃ１．成人発症性神経変性疾患を有する患者を治療する方法であって、方法が、ＩＣＭ注入によって単回用量の組換えＡＡＶを患者に投与することを含み、組換えＡＡＶが、ＡＡＶ１カプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムが、ＡＡＶ ＩＴＲ、プログラニュリンのコード配列、及び標的細胞におけるプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含み、
単回用量が、
（ｉ）約３．３×１０^１０ゲノムコピー（ＧＣ）／脳質量のグラム、
（ｉｉ）約１．１×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、
（ｉｉｉ）約２．２×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、又は
（ｉｖ）約３．３×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラムである、方法。

【0119】

Ｃ２．プログラニュリンのコード配列が、配列番号３、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列である、実施形態Ｃ１に記載の方法。

【0120】

Ｃ３．ベクターゲノムが、ＣＢ７プロモーター、キメライントロン、及びウサギベータグロビンポリＡを更に含む、実施形態Ｃ１又はＣ２に記載の方法。

【0121】

Ｃ４．ベクターゲノムが、配列番号２４を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ３のうちのいずれか１つに記載の方法。

【0122】

Ｃ５．患者が、ＧＲＮハプロ不全及び／又は前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を有すると特定されている、実施形態Ｃ１～Ｃ４のうちのいずれか１つに記載の方法。

【0123】

Ｃ６．患者が、少なくとも３５歳である、実施形態Ｃ１～Ｃ５のうちのいずれか１つに記載の方法。

【0124】

Ｃ７．患者は、ＣＳＦ中のプログラニュリンの濃度が低い、実施形態Ｃ１～Ｃ６のうちのいずれか１つに記載の方法。

【0125】

Ｃ８．患者は、ＣＳＦ中のプログラニュリンの濃度が正常レベルの５０％未満である、実施形態Ｃ７に記載の方法。

【0126】

Ｃ９．患者は、ＣＳＦ中のプログラニュリン濃度が正常レベルの約３０％である、実施
形態Ｃ７に記載の方法。

【0127】

Ｃ１０．ＣＳＦ、血清、及び／又は血漿中のプログラニュリンの濃度を検出することを更に含む、実施形態Ｃ１～Ｃ９のうちのいずれか１つに記載の方法。

【0128】

Ｃ１１．
ｉ）ニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）、総タウ（Ｔ－タウ）、血漿グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、及びリン酸化タウ（Ｐ－タウ）のうちの１つ以上のＣＳＦ濃度、
ｉｉ）網膜リポフスチンを評価すること、
ｉｉｉ）脳体積、白質完全性、並びに中前頭皮質及び頭頂領域の厚さのうちの１つ以上の変化を追跡するためにＭＲＩを実施すること、
ｉｖ）前頭葉及び／若しくは側頭葉における代謝低下を評価するためにＦＤＧ ＰＥＴを実施すること、並びに／又は
ｖ）疾患に関連する変化の減速を評価するためにＥＥＧ／誘発応答電位を測定すること、を測定することを更に含む、実施形態Ｃ１～Ｃ１０のうちのいずれか１つに記載の方法。

【0129】

Ｄ１．単位剤形の医薬組成物であって、
約１．４４×１０^１３～約４．３３×１０^１４ＧＣの緩衝液中の組換えＡＡＶベクターを含み、
組換えＡＡＶが、ＡＡＶ１カプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プログラニュリンのコード配列、及び標的細胞においてプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む、医薬組成物。

【0130】

Ｄ２．プログラニュリンのコード配列が、配列番号３、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する配列である、実施形態Ｄ２に記載の医薬組成物。

【0131】

Ｄ２．ベクターゲノムが、ＣＢ７プロモーター、キメライントロン、及びウサギベータグロビンポリＡを更に含む、実施形態Ｄ１又はＤ２に記載の医薬組成物。

【0132】

Ｄ４．ベクターゲノムが、配列番号２４を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ３のうちのいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0133】

Ｄ５．組成物が、ＩＣＭ投与用に製剤化されている、実施形態Ｄ１～Ｄ４のうちのいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0134】

Ｄ６．緩衝液が、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、及びポロキサマー１８８を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ５のうちのいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0135】

Ｄ７．緩衝液が、１ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭの塩化カリウム、１．４ｍＭの塩化カルシウム、０．８ｍＭの塩化マグネシウム、及び０．００１％のポロキサマー１８８を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ６のうちのいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0136】

Ｄ８．約３．０ｍＬ、約４．０ｍＬ、又は約５．０ｍＬの体積を有する、実施形態Ｄ１～Ｄ６のうちのいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0137】

Ｅ１．成人発症性神経変性疾患を有するヒト患者の治療における使用のための、実施形態Ｄ１～Ｄ８のうちのいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0138】

Ｅ２．患者が、ＧＲＮハプロ不全及び／又は前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を有すると特定されている、実施形態Ｅ１に記載の使用のための医薬組成物。

【0139】

Ｅ３．組成物が、
（ｉ）約３．３×１０^１０ゲノムコピー（ＧＣ）／脳質量のグラム、
（ｉｉ）約１．１×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、
（ｉｉｉ）約２．２×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラム、又は
（ｉｖ）約３．３×１０^１１ＧＣ／脳質量のグラムの用量を投与するために製剤化されている、実施形態Ｅ１又はＥ２に記載の使用のための医薬組成物。

【0140】

本明細書で使用される場合、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）という用語は、軸に沿って作成された一連の平面断面画像から、コンピュータによって身体構造の三次元画像が構築される放射線撮影を指す。

【0141】

「実質的相同性」又は「実質的類似性」という用語は、核酸、又はその断片を参照する場合、別の核酸（又はその相補的鎖）と適切なヌクレオチド挿入又は欠失によって最適にアラインメントされるとき、アラインメントされる配列の少なくとも約９５～９９％のヌクレオチド配列同一性を有することを示す。好ましくは、相同性は、全長配列、又はそのオープンリーディングフレーム、又は少なくとも１５ヌクレオチド長である別の適切な断片にわたる相同性である。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。

【0142】

核酸配列の文脈で「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、又は「同一パーセント」という用語は、最大限対応するようにアラインメントさせたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、又は、少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたってもよく、これが望ましい。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。同様に、「パーセント配列同一性」は、タンパク質の全長わたるアミノ酸配列又はその断片について容易に決定することができる。好適には、断片は、少なくとも約８アミノ酸長であり、最大で約７００アミノ酸長であり得る。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。

【0143】

「実質的相同性」又は「実質的類似性」という用語は、核酸、又はその断片を参照する場合、別の核酸（又はその相補的鎖）と適切なアミノ酸挿入又は欠失によって最適にアラインメントされるとき、アラインメントされる配列の少なくとも約９５～９９％のアミノ酸配列同一性を有することを示す。好ましくは、相同性は、全長配列、若しくはそのタンパク質、例えば、ｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質、又は少なくとも８アミノ酸長であるそれらの断片、若しくはより好ましくは、少なくとも１５アミノ酸長にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。

【0144】

「高度に保存された」という用語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９７％を超える同一性を意味する。同一性は、当業者によって知られているアルゴリズム及びコンピュータプログラムに頼ることによって、当業者によって容易に決定される。

【0145】

一般的に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」又は「類似性
」について言及する場合、「同一性」、「相同性」又は「類似性」は、「アラインメントされた」配列を参照して決定される。「アラインメントされた」配列又は「アラインメント」とは、複数の核酸配列又はタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損又は追加塩基又はアミノ酸についての補正を含む。例では、公開されたＡＡＶ９配列を参照点として使用してＡＡＶアラインメントを行う。アラインメントは、公的又は商業的に利用可能な様々な多重配列整列プログラムのいずれかを使用して行われる。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会及び検索配列の間の最良の重複領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、本明細書に参考として組み込まれる、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１で提供される、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）を用いるＦａｓｔａ（商標）を使用して決定することができる。「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムなどの多重配列整列プログラムもまた、アミノ酸配列に対して利用可能である。一般的に、これらのプログラムのいずれかをデフォルト設定で使用するが、当業者は、これらの設定を必要に応じて変更し得る。あるいは、当業者は、参照のアルゴリズム及びプログラムによって提供されるものと少なくとも同じレベルの同一性又はアラインメントを提供する、別のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

【0146】

「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を指すことに留意されたい。したがって、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0147】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「なっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語、及びその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。明細書中の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言語を使用して提示されるが、他の状況下では、関連する実施形態は、「～からなる」又は「～から本質的になる」という言語を使用して解釈され、記載されることも意図している。

【0148】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照から１０％（±１０％、例えば、±１、±２、±３、±４、±５、±６、±７、±８、±９、±１０、又はそれらの間の値）の可変性を意味する。

【0149】

本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、及び「状態」は、対象における異常な状態を示すために互換的に使用される。

【0150】

本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当
業者によって、及び本明細書で使用される多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する、公開された文献を参照することによって、一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0151】

「発現」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、ＲＮＡ又はＲＮＡ及びタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」又は「翻訳」という用語は、特に、ペプチド又はタンパク質の産生に関する。発現は、一過性又は安定であり得る。

【0152】

本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、コード配列、プロモーターを含む核酸分子を指し、それらのための他の調節配列を含み得、そのカセットは、遺伝子要素（例えば、プラスミド）によりパッケージング宿主細胞に送達され得、ウイルスベクターのカプシド（例えば、ウイルス粒子）へパッケージされる。典型的には、ウイルスベクターを生成するためのこのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載の遺伝子産物のためのコード配列と、本明細書に記載されるものなどの他の発現制御配列と、を含有する。

【0153】

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、目的の遺伝子に連続している発現制御配列、及びトランスで又は離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を指す。

【0154】

タンパク質又は核酸を参照して使用される場合、「異種性」という用語は、タンパク質又は核酸が、天然では互いに同じ関係で見出されない、２つ以上の配列又は部分配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、ある遺伝子由来のプロモーターを有し、異なる遺伝子由来のコード配列の発現を指令するように配置される。したがって、コード配列を参照すると、プロモーターは、異種性である。

【0155】

本発明の文脈における「翻訳」という用語は、リボソームでのプロセスに関し、ｍＲＮＡ鎖は、アミノ酸配列の集合を制御して、タンパク質又はペプチドを生成する。

【0156】

以下の実施例は、単なる例示であり、本発明を限定することを意図していない。

【実施例】

【0157】

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【表3-6】

【0158】

実施例１：材料及び方法
ベクター
操作されたヒトＰＧＲＮ ｃＤＮＡを、サイトメガロウイルス初期エンハンサーを有するニワトリβアクチンプロモーター、キメライントロン、及びウサギβグロビンポリアデニル化配列を含む発現構築物にクローニングした（図１）。第２の操作されたヒトＰＧＲＮ ｃＤＮＡを、ヒトユビキチンＣプロモーターを含む発現構築物にクローニングした。発現構築物は、ＡＡＶ２逆位末端配列に隣接した。アデノ随伴ウイルス血清型１、５及びヒト６８（ＡＡＶｈｕ６８）は、前述のようにＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクション及びイオジキサノール精製によって、この構築物から生成された（Ｌｏｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０；２１（１０）：１２５９－７１）。

【0159】

動物手順
全ての動物プロトコルは、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにより認可された。つがいのＧＲＮノックアウトマウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ストック番号０１３１７５）から購入し、コロニーをペンシルベニア大学で維持した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６（ストック番号０００６６４）は、対照として機能した。最初の研究では、２ヶ月齢のマウスをイソフルランで麻酔し、１×１０^１１ベクターゲノムコピー（ＧＣ）を５μＬの量で側脳室（ＩＣＶ）に注入した。注入６０日後、マウスを、ケタミン／キシラジン麻酔下、失血により安楽死させ、頚椎脱臼により、死亡を確認した。第２の研究では、マウスは、７ヶ月齢で処置され、１１ヶ月齢で犠牲にされた。剖検時に、血清を、心臓穿刺により採取し、ＣＳＦを、ポリエチレンチューブに連結された３２ゲージ針を用いて、後頭下穿刺により採取した。血清及びＣＳＦ試料を、ドライアイス上で即時凍結し、分析時まで－８０度で保存した。前頭皮質を、生化学用に回収し、ドライアイス上で即時凍結し、残りの脳は、組織学用に１０％のホルマリンで固定した。

【0160】

３～４歳齢のアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）を、Ｃｏｖａｎｃｅから購入した。大槽内への後頭下穿刺を介した指定された試験物の単回注入（ＩＣＭ注入）で動物に投与した。同じデバイス及び手順を使用して全ての動物に行った。
試験０日目に、動物を実施前に鎮静させた。試験物の投与前に、動物を体重測定し、バイタルサインを記録した。鎮痛剤が動物に提供された。

【0161】

次いで、麻酔されたアカゲザルを、動物保持スペースから移し、Ｘ線台上に側臥位で配置し、ＣＳＦ採取及び大槽への投薬のために頭を前方に曲げた。注入部位は無菌的に準備
した。無菌技術を使用して、ＣＳＦの流れが観察されるまで、２１～２７ゲージのＱｕｉｎｃｋｅ脊椎ニードル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を後頭下空間へと前進させた。次いで、１．０ｍＬのＣＳＦを、投与前に、ベースライン分析のために採取した。横切られる解剖学的構造は、皮膚、皮下脂肪、硬膜外腔、硬膜、及び環椎後頭筋膜を含む。ニードルは、血液の汚染及び潜在的な脳幹損傷を回避するために、より広範囲の大槽の上部空隙へ指向された。ニードル穿刺の正確な配置は、透視装置（ＯＥＣ９８００Ｃ－Ａｒｍ、ＧＥ）を使用する脊髄造影法を介して確認され得る。ＣＳＦ採取の後、レウルアクセス延長カテーテルを、脊椎ニードルに連結して、イオヘキサール（商標名：Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０ｍｇ／ｍＬ，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）造影剤及び試験物の投薬を容易にする。最大２ｍＬのイオヘキソールを、カテーテル及び脊椎ニードルを介して投与した。ニードル配置を確認した後、試験物を含有するシリンジ（１．０ｍＬに等価な容量並びにシリンジ及びリンカーのデッドスペース容量）を、可撓性リンカーに連結して、３０±５秒間にわたって注入した。投与後、ニードルを取り出し、直接的圧力が穿刺部位に適用された。

【0162】

組織学及び画像診断
マウスの脳を１０％ホルマリンで固定し、スクロース中で凍結保存し、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物中に包埋し、クリオスタットで切片化した。目的の領域の自己蛍光物質（リポフスチン）の低倍率画像を撮影した。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して、リポフスチン沈着物を盲検で定量した。非ヒト霊長類組織を１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。スライドは、委員会認定の獣医病理学者（ＥＬＢ）によって審査された。ＧＦＰベクターで処置された動物の場合、脳切片を、ｏｌｉｇ２、ＧＦＡＰ、又はＮｅｕＮに対する抗体で染色した。全ての切片を、ＤＡＰＩ及びＧＦＰに対する抗体、続いて蛍光二次抗体で共染色した。スライドをＬｅｉｃａ Ａｐｅｒｉｏ Ｖｅｒｓａ ２００スライドスキャナーでスキャンし、ｅＳｌｉｄｅ Ｍａｎａｇｅｒからダウンロードして、ＨＡＬＯイメージングソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）で分析した。各動物について右半球の５つの領域をサンプリングし、各細胞型マーカーを用いて細胞を定量した。細胞を、以下の設定を調整することによって検出した：核検出タブの下で「最小核強度」、「核サイズ」、「核セグメンテーションアグレッシブネス」、及び「最小核ラウンドネス」。次いで、個々の色素ごとに基準を定義して、細胞を更に同定し、各マーカーの定量的な総細胞数を生成した。設定は、所望の細胞型の検出の感度及び信頼性に基づいて経験的に決定された。一部の場合、細胞質におけるＮｅｕＮの検出などの設定は、マーカーの真の細胞内局在を反映しなかったが、より高い特異性及び感度の検出を提供した。自動化された手段によって検出された全ての細胞は、手動で検証された。ニューロンについては、「色素１」タブの下、「核陽性閾値」及び「細胞質陽性閾値」を調整して、核及び細胞質の両方に存在するＮｅｕＮを有する細胞のみを検出した。アストロサイトについては、ＤＡＰＩ及びＧＦＡＰマーカーを選択し、細胞の核及び細胞質の両方に存在する場合、カウントに含めた。オリゴデンドロサイトについては、ＤＡＰＩとｏｌｉｇ２の両方が核に存在するが、細胞の細胞質には存在しない場合、細胞をカウントした。共局在については、同じ設定が使用されたが、ニューロンでは核、並びにアストロサイトでは核及び細胞質の両方で、ＧＦＰが追加の色素として含まれた。全ての選択されたマーカーを発現しなかった細胞は、核又は細胞質の「マスク」機能を使用して「マスキング」することによって、生成される結果表から除外された。ｏｌｉｇ２と共局在するＧＦＰ陽性細胞が稀なため、形質導入されたオリゴデンドロサイトは手動でカウントした。場合によって、自己蛍光を示す血管又は脈絡叢の一部は、「はさみ」ツールを使用して手動で、輪郭を描き、除外した。得られた値を、各細胞型マーカーのＧＦＰ陽性細胞の割合として表した。

【0163】

神経炎症の評価（ＣＤ６８免疫組織化学）
ＣＤ６８の免疫組織化学染色を、各動物の脳の凍結切片で実施した。簡潔にいうと、抗
原賦活化は、ｄｉＨ_２Ｏ中に１：１００で希釈されたクエン酸塩ベースの抗原賦活緩衝液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｈ－３３００）中でスライドを１００℃で２０分間インキュベーションすることによって実施された。次いで、スライドを洗浄し、０．２％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘを含む１％のロバ血清中で、室温で１５分間ブロッキングした。スライドを、ウサギ抗マウスＣＤ６８一次抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号１２５２１２）とともに、４℃で一晩インキュベーションした。翌日、スライドを洗浄し、抗ウサギＩｇＧ ＴｒｉｔＣコンジュゲート二次抗体とともに室温で１時間インキュベーションした。スライドをＰＢＳ中で洗浄し、続いてｄｉＨ２０を１分間洗浄した。スライドを、核対比染色として、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ又はＤＡＰＩを含有する同様の培地でカバーガラスした。ＣＤ６８染色を、ＶＩＳ画像分析ソフトウェアを使用して、視野当たりの陽性面積として定量化した。ＣＤ６８面積は、平均視野サイズを視野サイズで割り、次いでＣＤ６８陽性面積で乗算することによって、全視野領域に正規化した（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ、Ｈｏｅｒｓｈｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ２０１９．０７．０．６３２８）。

【0164】

ヘキソサミニダーゼ（Ｈｅｘ）アッセイのための試料調製
ＨＥＸ活性は、９６ウェルの黒色プラスチックアッセイプレート中で、１０μｇの脳組織溶解物又は５μＬの血清を９５μＬの反応混合物（１ｍＭの４－メチルウンベリフェリルナセチルβＤ－グルコサミニド［Ｓｉｇｍａ Ｍ２１３３］、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び０．１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５８）と混合することによって測定した。プレートを密封し、３７℃で３０分間インキュベーションし、１５０μＬの停止溶液（２９０ｍＭのグリシン及び１８０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ１０．９）を添加することによって、反応を停止した。反応産物からの蛍光を、３６５ｎｍで励起したときの４５０ｎｍの発光波長で測定した。

【0165】

ＤＮＡ抽出及び生体内分布（ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ）
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）抽出及びゲノムコピーの定量化を、ＴａｑＭａｎ定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用してベクター生体内分布分析のために採取された組織に対して実施した。簡潔にいうと、組織を機械的に均質化し、プロテイナーゼＫで消化した。試料をＲＮＡｓｅ Ａで処理し、細胞をＢｕｆｆｅｒ ＡＬ（カタログ番号１９０７５、ＱＩＡＧＥＮ）中、７０℃で１時間インキュベーションすることによって溶解した。ＤＮＡを抽出し、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム上で精製した。９０ｎｇ／μｌ以上、１１０ｎｇ／μｌ以下の濃度まで希釈した後、ベクター特異的プライマー及び／又は導入遺伝子特異的プライマーを使用して、ｑＰＣＲ反応を二重に行った。シグナルを、同じ研究からのナイーブ又は陰性対照動物由来の既知の濃度のＤＮＡのバックグラウンドにおける線状化プラスミドＤＮＡの標準曲線と比較した。１マイクログラムのＤＮＡ当たりのゲノムコピーを計算した。ＰＣＲ反応における交差汚染及び試料干渉を除外するために、追加の対照を利用した。生データは、Ｃｔ値について事前に定義された合格基準に基づいて分析され、各実行について定量限界が決定された。全てのデータは、バッチレコードフォームに含まれ、及び／又はバッチレコードフォームに添付された。

【0166】

導入遺伝子の発現の評価（ＥＬＩＳＡ）
前頭皮質からの脳組織の凍結試料を、０．９％のＮａＣｌ（ｐＨ４．０）及び０．０５％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含む溶液中で、Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒを使用して、３０Ｈｚで２分間均質化した。試料を、ドライアイス上で凍結し、室温で解凍し、軽くボルテックスした。溶解物を、１０，０００ＲＰＭの卓上遠心分離機で１０分間遠心分離することによって清澄化した。

【0167】

サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、脳組織溶解物又はＣＳＦ中のヒトＰＧＲＮ発現を測定した。簡潔にいうと、ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で
一晩、抗ヒトＰＧＲＮ捕捉抗体でコーティングした。プレートを洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン中で、室温で２時間ブロッキングした。プレートをデカントし、１００μｌの脳組織溶解物又はＣＳＦを室温で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、ビオチンコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体とともに、室温で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジンコンジュゲートホースラディッシュペルオキシダーゼとともに、室温で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色基質及び０．００４％Ｈ_２Ｏ_２を含有する現像溶液中で、室温でインキュベーションした。反応は、任意のウェルの色が飽和に達するように見えるまで、最大３０分間、発色のために観察された。次いで、Ｈ_２Ｓ０_４を含有する停止緩衝液を添加することによって反応をクエンチし、吸光度を４５０ｎｍで測定した。

【0168】

抗導入遺伝子抗体の評価（ＥＬＩＳＡ）
血清及びＣＳＦ中の抗ヒトＰＧＲＮ抗体を、間接ＥＬＩＳＡによって測定した。簡潔にいうと、ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩、組換えヒトＰＧＲＮタンパク質（１μｇ／ｍＬ）でコーティングした。プレートを洗浄し、次いで、ＤＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン中で、室温で１時間ブロッキングした。血清試料を、ＤＰＢＳ中に１：２５０に希釈し、一方、ＣＳＦ試料を、１：５に希釈した。希釈した試料をＥＬＩＳＡプレートのウェルに二重で添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、ビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体とともに室温で１時間インキュベーションし、続いて、洗浄し、ストレプトアビジンコンジュゲートホースラディッシュペルオキシダーゼ二次抗体とともに１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色基質及び０．００４％Ｈ_２Ｏ_２を含有する現像溶液中で、室温でインキュベーションした。反応は、任意のウェルの色が飽和に達するように見えるまで、最大３０分間、発色のために観察された。Ｈ_２Ｓ０_４を含有する停止緩衝液を添加することによって反応をクエンチし、吸光度を４５０ｎｍで測定した。

【0169】

ＥＬＩＳｐｏｔアッセイのための末梢血単核球及びリンパ球単離
末梢血単核球分離
最大１０ｍＬの血液を、事前に標識された５０ｍＬの遠心分離機チューブ中で、滅菌されたＨａｎｋの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で希釈した。試料を十分に混合し、次いで、１００％Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ密度勾配で遠心分離した。上部血漿画分を除去した。下部のＰＢＭＣ含有層を新しいチューブ中に配置し、洗浄し、細胞を、ＡＣＫ溶解緩衝液を使用して溶解した。懸濁液をＤＮＡｓｅ Ｉで処理し、遠心分離し、溶解した赤血球からなる上清を除去した。白血球ペレットをほぐし、洗浄し、ＤＮＡｓｅ Ｉで処理し、遠心分離した。ペレットを完全なＲＰＭＩ培地（Ｌ－グルタミン、ウシ胎児血清［ＦＢＳ］、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、及びゲンタマイシン硫酸塩を補充したＲＰＭＩ１６５０培地を含有する）に再懸濁した。

【0170】

肝臓リンパ球単離
各動物の肝臓の切片を採取し、室温で滅菌ＲＰＭＩ１６４０培地中に配置した。肝臓を採取した直後に、ペトリ皿でさいの目に切断した。小片をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ハンドプロセッサを使用して１ｍｍサイズの断片に切り刻んだか、又は自動化組織解離器を使用して均質化した。組織をコラゲナーゼで消化し、１００μｍ及び４０μｍのフィルターを通して濾過した。試料を遠心分離し、ペレットを１％のＦＢＳを補充したＰＢＳで洗浄して、コラゲナーゼを除去した。ペレットを、５％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。次いで、肝臓リンパ球を、２０００ＲＰＭで、２０℃（±２℃）で２０分間のＰｅｒｃｏｌｌ勾配を通した遠心分離を介して単離した。肝臓リンパ球を、１％のＦＢＳを補充したＰＢＳ中で２回洗浄し、続いて１６００ＲＰＭで５
分間遠心分離し、各洗浄を２０℃（±２℃）で行った。肝臓リンパ球をＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。

【0171】

脾臓リンパ球単離
各動物の脾臓の切片を採取し、室温で滅菌Ｌ１５培地中に配置した。その後、それをさいの目に切断し、自動化組織解離器を使用して粉砕又は均質化した。スラリーを細胞ストレーナを通して５０ｍＬの円錐遠心チューブに濾過した。試料を１７００ＲＰＭで、２０℃（±２℃）で５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを、室温で３分間、ＡＣＫ溶解緩衝液中に再懸濁した。次いで、ＤＮＡｓｅ Ｉを含有するＲＰＭＩ１６４０培地を試料に添加し、続いて、直ちに、１７００ＲＰＭで、２０℃（±２℃）で５分間遠心分離した。細胞ペレットをＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄して、ＤＮａｓｅ Ｉ及び溶解緩衝液を除去し、遠心分離した。洗浄した脾細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁した。

【0172】

骨髄リンパ球単離
骨髄を、室温で、ヘパリン及びＰＢＳを含有するチューブに採取した。骨髄を、滅菌ＨＢＳＳ中で希釈し、７０μｍストレーナ、続く４０μｍストレーナを通して濾過するか、又は自動化組織解離器を使用して均質化するかのいずれかを行った。濾過した骨髄を新しいチューブ内のフィコールパーク層の上部に配置し、遠心分離器を止めて２５００ＲＰＭで２５分間遠心分離した。上部画分を除去し、骨髄リンパ球を含有する画分を新しいチューブにピペットした。細胞をＨＢＳＳで洗浄し、１７００ＲＰＭで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、完全なＲＰＭＩ培地（Ｌ－グルタミン、ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、及びゲンタマイシン硫酸塩を補充したＲＰＭＩ１６５０培地を含有する）で再度洗浄し、１７００ＲＰＭで５分間遠心分離した。ペレットをＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁した。

【0173】

中和抗体アッセイ
ＡＡＶｈｕ６８に対する中和抗体は、前述のように評価された（Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００９；１９９（３）：３８１－９０）。

【0174】

感覚神経伝導試験
動物を、ケタミン／デクスメデトミジンの組み合わせで鎮静させた。体温を維持するために、鎮静した動物を、ヒートパックを備えた処置台に対して横向き又は背殿位で配置した。電気信号取得に干渉する可能性があるため、電子加温デバイスは使用しなかった。

【0175】

感覚神経伝導試験（ＮＣＳ）は、感覚神経伝導速度（ＮＣＶ）試験とも称され、Ｎｉｃｏｌｅｔ ＥＤＸ（登録商標）システム（Ｎａｔｕｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）及びＶｉｋｉｎｇ（登録商標）分析ソフトウェアを使用して、感覚神経活動電位（ＳＮＡＰ）の振幅及び伝導速度を測定するために実施した。簡潔にいうと、刺激プローブは、記録部位に最も近いカソードで、正中神経の上に配置された。２つの針電極を、遠位指骨（参照電極）及び近位指骨（記録電極）のレベルで第２指の皮下に挿入し、一方、接地電極を刺激プローブ（陰極）の近位に配置した。ＷＲ５０ Ｃｏｍｆｏｒｔ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｂｅ小児刺激装置（Ｎａｔｕｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）を使用した。励起された応答を、差動増幅させ、モニターに表示させた。初期取得刺激強度を０．０ｍＡに設定して、バックグラウンド電気信号の欠如を確認した。最適刺激位置を見つけるために、刺激強度を１０．０ｍＡまで増加させ、連発刺激を生成しつつ、最大の明確な波形によって決定される最大位置が見つかるまで、正中神経に沿ってプローブを移動させた。プローブを最適位置に保ちつつ、ピーク振幅応答が増加しなくなるまで、刺激強度を段階的に１０．０ｍＡまで増加させた。最後の３０回の刺激応答を記録し、ソフトウェアに保存した。最大１０の最大刺激応答を平均し、正中神経について報告した。記録部位から刺激カソードまでの距離（ｃｍ）を測定し、ソフトウェアに入力した。伝導速度は、応答の開始潜時及び距離（ｃｍ）を
使用して計算した。伝導速度及びＳＮＡＰ振幅の平均の両方を報告した。正中神経を両側試験した。この装置によって生成した全ての生データを、試験ファイルの一部として保持した。

【0176】

実施例２：組換えＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮ
ｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮは、１）ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する導入遺伝子カセットをコードするＡＡＶシスプラスミド（ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ．ＫａｎＲと称される）、２）ＡＡＶ２ ｒｅｐ及びＡＡＶ１ ｃａｐの遺伝子をコードするＡＡＶトランスプラスミド（ｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲと称される）、及び３）ヘルパーアデノウイルスプラスミド（ｐＡｄΔＦ６．ＫａｎＲと称される）を用いたＨＥＫ２９３細胞の三重プラスミドトランスフェクションによって生成される。

【0177】

Ａ．ＡＡＶベクターゲノムプラスミドの配列エレメント
シスプラスミド（ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ．ＫａｎＲ（ｐ４８６２）と称される）由来のベクターゲノムの線形マップは、図２を参照されたい。

【0178】

シスプラスミドは、以下のベクターゲノム配列エレメントを含む：
１．逆位末端反復（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ、ＩＴＲ）：ＩＴＲは、同一の逆相補配列であり、ＡＡＶ２（１３０塩基対［ｂｐ］、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００１４０１）に由来し、ベクターゲノムの全ての構成要素に隣接する。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ及びアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供される場合、ベクターＤＮＡの複製起点及びベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。したがって、ＩＴＲ配列は、ベクターゲノムの複製及びパッケージングに必要とされるシス配列のみを表す。

【0179】

２．ヒトサイトメガロウイルス最初期エンハンサー（ＣＭＶ ＩＥ）：このエンハンサー配列は、ヒト由来のＣＭＶ（３８２ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｋ０３１０４．１）から得られ、下流導入遺伝子の発現を増加させる。

【0180】

３．ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＢＡ）この遍在性プロモーター（２８２ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ００１８２．１）を選択して、任意のＣＮＳ細胞型における導入遺伝子の発現を駆動させた。

【0181】

４．キメライントロン（ＣＩ）：ハイブリッドイントロンは、ニワトリβ－アクチンスプライスドナー（９７３ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ００１８２．１）及びウサギβ－グロビンスプライスアクセプターのエレメントを含む。イントロンは転写されるが、その両端のいずれかにある配列と合わせて、スプライシングによって成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から除去される。発現カセットにおけるイントロンの存在は、核から細胞質へのｍＲＮＡ輸送を促進し、それにより、翻訳のためのｍＲＮＡの一定レベルの蓄積を高めることが示されている。これは、遺伝子発現レベルの増加を意図した遺伝子ベクターにおいて共通の特徴である。

【0182】

５．コード配列：ヒトＧＲＮ遺伝子の操作されたｃＤＮＡ（２つの終止コドンを含む１７８５ｂｐ）は、ヒトＰＧＲＮ（ｈＰＧＲＮ）タンパク質（５９３アミノ酸［ａａ］、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００２０７８）をコードし、それは、リソソーム機能及び他の神経系の役割に関与する。

【0183】

６．ウサギβグロビンのポリアデニル化シグナル（ｒＢＧ ＰｏｌｙＡ）：ｒＢＧ ＰｏｌｙＡシグナル（１２７ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｖ００８８２．１）は、ｃｉｓで導入遺伝子のｍＲＮＡの効率的なポリアデニル化を促進する。このエレメントは、転写終結、
新生転写物の３’末端での特異的切断事象、及び長いポリアデニル鎖付加のためのシグナルとして機能する。

【0184】

Ｂ．ＡＡＶ１トランスプラスミド：ｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲ（ｐ００６９）
ＡＡＶ２／１トランスプラスミドは、ｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲ（ｐ００６９）である。ｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲプラスミドは、鎖長が８１１３ｂｐであり、ＡＡＶベクターゲノムの複製及びパッケージングに必要とされる４つの野生型ＡＡＶ２レプリカーゼ（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする。ｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲはまた、３つの野生型ＡＡＶ１ビリオンタンパク質カプシド（Ｃａｐ）タンパク質をコードし、ＡＡＶベクターゲノムを収容するためにＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）のビリオンシェルに組み立てられる。ｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲに含まれるＡＡＶ１ ｃａｐ遺伝子は、サル源から単離された。

【0185】

ｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲ構築物を作製するために、ｐ５Ｅ１８（２／２）からの３．０キロ塩基（ｋｂ）断片、ｐＡＶ１Ｈからの２．３ｋｂ断片、及びｐ５Ｅ１８（２／２）からの１．７ｋｂ断片を組み込んで、ｐＡＡＶ２／１（ｐ０００１）を形成し、これは、アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）カセット（文献ではｐ５Ｅ１８［２／１］と称される）中にＡＡＶ２ ｒｅｐ及びＡＡＶ１ ｃａｐを含む。このクローニング戦略では、ＡＡＶ ｐ５プロモーター（通常ｒｅｐ発現を駆動する）を、ｒｅｐの５’末端からｃａｐの３’末端へと移し、ｒｅｐの上流の切断型ｐ５プロモーターを残す。この切断型プロモーターは、ｒｅｐの発現を下方制御し、結果として、ベクター産生を最大化する役割を果たす（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７３（５）：３９９４－４００３）。

【0186】

臨床製品の製造のためのｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲを生成するために、ｐＡＡＶ２／１の骨格配列におけるアンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）遺伝子をカナマイシン耐性（ＫａｎＲ）遺伝子で置換した。トランスプラスミドの全ての構成部品は、直接配列決定によって検証された。

【0187】

Ｃ．アデノウイルスヘルパープラスミド：ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）
プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）は、ペンシルベニア大学のＪａｍｅ Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ博士及び同僚の研究室内で構築され、サイズは１５，７７４ｂｐである。このプラスミドには、ＡＡＶの複製に重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡが含まれている（アデノウイルスＥ１の機能は、ＨＥＫ２９３細胞によって提供される）。しかしながら、このプラスミドには、他のアデノウイルスの複製遺伝子又は構造遺伝子は含まれていない。プラスミドは、アデノウイルスＩＴＲなどの複製に重要なシスエレメントを含んでおらず、したがって、感染性のアデノウイルスが生成されることは予想されない。プラスミドは、Ａｄ５のＥ１、Ｅ３欠失分子クローン（ｐＢＨＧ１０、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド）に由来した。Ａｄ５に欠失を導入して、不要なアデノウイルス遺伝子の発現を除去し、かつアデノウイルスＤＮＡの量を削減した（３２ｋｂから１２ｋｂへ）。最後に、アンピシリン耐性遺伝子を、カナマイシン耐性遺伝子によって置き換え、ｐＡｄｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）を生成した。このプラスミドに残るＥ２、Ｅ４、及びＶＡＩのアデノウイルス遺伝子は、ＨＥＫ２９３細胞に存在するＥ１とともに、ＡＡＶベクターの産生に必要である。

【0188】

最終生成物は、ＵＳＰ＜７９１＞によって決定される６．２～７．７の範囲のｐＨ、ＵＳＰ＜７８５＞によって決定される２６０～３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧、及びｄｄＰＣＲによって決定される２．５×１０^１３ＧＣ／ｍＬ以上のＧＣ力価を有する必要がある（Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，（２０１４）．“Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ
ｔａｒｙ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｔｉｔｅｒｓ ｂｙ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ．”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５（２）：１１５－２５。

【0189】

実施例３：マウス疾患モデルにおけるヒトＰＧＲＮ導入遺伝子のＡＡＶ媒介性送達
ＣＢ７プロモーター及びキメライントロンの制御下でヒトＰＧＲＮ（配列番号３）を発現するＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する組換えＡＡＶベクター（ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ）を、例えば、ＷＯ２０１８／１６０５８２に記載されている公開された三重トランスフェクション技術を使用して産生した。

【0190】

本発明者らは、ＧｒｎノックアウトマウスモデルにおけるヒトＧｒｎ導入遺伝子のＡＡＶ媒介性送達を評価した。ヘテロ接合のＧｒｎ変異（Ｇｒｎ＋／－）のマウスは、Ｇｒｎ関連神経変性疾患の病理学的特徴を示さず、おそらく、マウスの寿命では、ヒトにおいて数十年後に初めて現れるＧＲＮハプロ不全の後遺症の発生が不可能であるためである。対照的に、（Ｇｒｎ－／－）マウスにおける完全なＰＧＲＮ欠損では、リソソーム機能の障害、自己蛍光リソソーム蓄積物質（リポフスチン）の蓄積、及びミクログリアの活性化などのヒトにおけるＧｒｎハプロ不全のいくつかの初期の特徴を再現するが、Ｇｒｎ－／－マウスは、最大２歳齢まででさえニューロン損失を示さない（Ｌｕｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６；１６５（４）：９２１－３５；Ｗａｒｄ ＭＥ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１７ Ａｐｒ １２；９（３８５）：ｐｉｉ：ｅａａｈ５６４２）。Ｇｒｎ＋／－マウス及びＧｒｎ－／－マウスの両方とも、行動異常を示すことが報告されているが、所見は群間で一致していない（Ａｈｍｅｄ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０１０；１７７（１）：３１１－２４；Ｗｉｌｓ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２０１２；２２８（１）：６７－７６、Ｇｈｏｓｈａｌ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ．２０１２；４５（１）：３９５－４０８、Ｆｉｌｉａｎｏ ＡＪ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３；３３（１２）：５３５２－６１、Ｙｉｎ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ．２０１０；２４（１２）：４６３９－４７）。同様に、一部の報告は、Ｇｒｎ－／－マウスにおける生存率の低減が示されたが、他では、Ｇｒｎ－／－マウスが、正常な寿命を有することが見出され、本発明者ら経験と一致した（Ａｈｍｅｄ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０１０；１７７（１）：３１１－２４；Ｗｉｌｓ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２０１２；２２８（１）：６７－７６）。Ｇｒｎ^－／－マウスは、明らかな神経変性又は神経学的徴候を示さないが、ヒトにおけるＧＲＮハプロ不全との顕著な生化学的及び組織学的類似性から、新規療法を評価するための潜在的に有益なモデルとなる。したがって、本発明者らは、Ｇｒｎ－／－マウスにおけるこれらの生化学的及び組織学的所見に分析の焦点を当てた。

【0191】

この研究の目的は、ヒトＧｒｎ遺伝子の脳への送達が、既存のリソソーム蓄積物質を排除し、Ｇｒｎ^－／－マウスにおけるリソソーム機能を正常化することができるかどうかを評価することである。リソソーム蓄積に応答して、細胞は、リソソーム酵素の発現を上方制御し、リソソーム蓄積症のバイオマーカーとして使用され得る（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１４；２２（１２）：２０１８－２７、Ｇｕｒｄａ ＢＬ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１６；２４（２）：２０６－１６、Ｋａｒａｇｅｏｒｇｏｓ ＬＥ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ．１９９７；２３４（１）：８５－９７）。本発明者ら、種々の年齢のＧｒｎ^－／－及びＧｒｎ^＋／＋マウス由来の脳組織におけるリソソーム酵素ヘキソサミニダーゼの活性、並びに皮質、海馬、及び視床におけるリポフスチン沈着物を評価した（図３Ａ～図３Ｄ）。ヘキソサミニダーゼ活性の上昇は、生涯を通して明らかであったが、リポフスチンは進行性の蓄積を示した。リポフスチンは、早くも２ヶ月齢で明らかであり、以前の所見と一致した（Ｋｌｅｉｎ ＺＡ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ２０１７；９５（２）：２８１－９６ ｅ６）。本発明者らの最初の研究は、天然分離株であるＡＡＶｈｕ６８に基づくＡＡＶベクターを用いて実施され、これは、クレードＦの分離株であるＡＡＶ９と密接に関連している。２～３ヶ月齢のＧｒｎ^－／－マウスを、ヒトＧｒｎを発現するＡＡＶｈｕ６８ベクター又はビヒクル（ＰＢＳ）のいずれかの脳室内（ＩＣＶ）注入で処置した（群当たりＮ＝１０）。更に、野生型マウスのコホートに、ビヒクル（Ｎ＝１０）を注入した。小規模の２ヶ月齢マウスでは、ＩＣＭ経路（ＮＨＰ研究及び提案されたＦＩＨ臨床試験に使用されるＲＯＡである）を介してベクターを確実に投与することが困難になるため、ＩＣＶ ＲＯＡ（脳室のＣＳＦにＡＡＶベクターを直接注入することを伴う）を使用した。以前の研究では、この研究に選択された用量（１０^１１ＧＣ）でのＡＡＶｈｕ６８のＩＣＶ投与では、形質導入が注入された脳室近くの脳領域に限定されることが示され、小さな細胞集団によるＰＧＲＮの分泌によって、脳病変の全体的な改善が達成され得るかどうかを評価するための有用なシステムとなる。

【0192】

ベクター投与の２ヶ月後、動物を安楽死させ、脳、ＣＳＦ、及び血清を回収した。脳におけるヒトＰＧＲＮタンパク質レベルの定量化により、ＡＡＶ処置群における形質導入を確認した（図４）。ＰＧＲＮは、ＣＳＦ中の測定可能な分泌タンパク質であり、ヒトＧＲＮ変異保因者のＣＳＦ中で減少している（Ｌｕｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６；１６５（４）：９２１－３５；Ｍｅｅｔｅｒ ＬＨ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｍｅｎｔ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｃｏｇｎ Ｄｉｓ Ｅｘｔｒａ．２０１６；６（２）：３３０－４０）。したがって、本発明者らは、ＡＡＶ処置Ｇｒｎ^／－マウスのＣＳＦ中のＰＧＲＮタンパク質レベルを評価し、平均ＣＳＦ濃度が１４ｎｇ／ｍＬであることを明らかにしたが、一方、ビヒクル処置群では、ヒトＰＧＲＮは検出レベル未満であった（図４）。ＰＧＲＮの発現は、リソソーム酵素の発現の正常化を伴い、ＡＡＶ処置ＧＲＮ^－／－マウスの脳におけるＨｅｘ活性レベルが、ほぼ正常レベルに戻った（図５）。血清において、ビヒクル処置Ｇｒｎ－／－マウスにおけるＨＥＸ活性は、ビヒクル処置ＷＴマウスよりも有意に高かった。対照的に、ＡＡＶ処置Ｇｒｎ－／－マウスにおけるＨＥＸ活性は、ビヒクル処置Ｇｒｎ－／－マウスよりも有意に低く、ビヒクル処置ＷＴマウスのものと同様であった。

【0193】

Ｇｒｎ^－／－マウスの脳におけるＰＧＲＮ発現を確認した後、ＰＧＲＮ発現が海馬、視床、及び皮質におけるリポフスチン沈着物の数を低減させたかどうかを評価した。その目的で、未染色の固定脳切片をカバーガラスに載せ、盲検で自己蛍光リポフスチンを撮像した。ビヒクル処置Ｇｒｎ－／－マウスの海馬、視床、及び前頭皮質には、ビヒクル処置ＷＴマウスのものと比較して有意に多くのリポフスチン沈着物が存在した。対照的に、ＡＡＶ投与は、Ｇｒｎ－／－マウスの３つの脳領域全てにおけるリポフスチン沈着物の数を、ビヒクル処置ＷＴマウスのものに匹敵するレベルにまで有意に低減させた（図６）。

【0194】

概念研究の最初の証明は、蓄積物質が脳に現れ始めたばかりの早い時期に、処置マウスにおいてＡＡＶ媒介性ＰＧＲＮ発現の治療活性を実証した。その後、より重篤な既存病態を有する高齢マウスにおける遺伝子導入の影響を評価した。この研究では、７ヶ月齢のＧｒｎ^－／－マウスは、ヒトＰＧＲＮを発現するＡＡＶｈｕ６８ベクター又はビヒクルの単回ＩＣＶ注入を受け、１１ヶ月齢で犠牲になった。広範囲の脳リポフスチン沈着物に加えて、１１ヶ月齢のＧｒｎ^－／－マウスは、Ｇｒｎ変異によって引き起こされるＦＴＤを有する患者と同様に、広範囲のミクログリオーシスを示した（図７Ａ～図７Ｃ）（Ａｈｍｅｄ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ
Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２００７ Ｆｅｂ １１；４：７）。ＧＲＮ遺伝子導入は、より若い動物における所見と同様に、老化マウスにおいて、脳Ｈｅｘ活性及びリポフスチン沈着物を減少させた（図５Ａ～図５Ｄ）。加えて、処置マウスの脳において、ミクログリアのサイズ及び数が正常化された。

【0195】

併せると、ヒトＰＧＲＮを発現するＡＡＶベクターをＧｒｎ^－／－マウスの脳にＩＣＶ送達することで、リポフスチン凝集物が除去され、リソソーム酵素の活性がほぼ完全に正常化され、ＰＧＲＮ遺伝子送達によって、Ｇｒｎ関連神経変性疾患の基礎となる病態生理の重要な側面が、効果的に修正され得ることを実証する。

【0196】

実施例４：非ヒト霊長類におけるＡＡＶ媒介性ＧＲＮ遺伝子送達
この研究は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするヒトグラニュリン前駆体（ＧＲＮ）遺伝子を発現する４つのベクター（ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ、ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＰＩ．ｈＰＧＲＮ２．ＳＶ４０、及びＡＡＶ５．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ）を評価した。しかしながら、各候補は、異なる血清型、プロモーター、操作された導入遺伝子（配列番号３又は４）、及び転写終結因子の組み合わせからなった。

【0197】

ベクターを、３．０×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／動物の単回大槽内（ＩＣＭ）用量として、成体非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に投与した。生存中評価には、毎日の観察、体重測定、血液及び脳脊髄液（ＣＳＦ）の臨床病理学パネル（細胞数、分化、臨床化学、及び／又は総タンパク質）、並びにＣＳＦ及び血清中の導入遺伝子発現の評価が含まれた。ＣＳＦ及び血清中の導入遺伝子に対する抗体も、導入遺伝子発現の最も高いレベルを示す群において測定された。全てのＮＨＰについて、３５日目又は６０日目に剖検を実施し、最も高いレベルの導入遺伝子発現を有する群からの脳及び脊髄を、組織病理について評価した。

【0198】

群の割り当ての後、各動物は、３．０×１０^１３ＧＣ（３．３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳）の用量で、以下の試験物のうちの１つの単回ＩＣＭ注入を受けた：
１．ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）
２．ＡＡＶ５．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ
３．ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ
４．ＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＰＩ．ｈＰＧＲＮ２．ＳＶ４０
以下の表に、研究事象を要約する。

【表4】

【0199】

ＣＳＦにおいて、ヒトＰＧＲＮの発現は、試験された全てのベクターについて、７日目までに検出された。１４日目までに、ＰＧＲＮの発現は、試験した全てのベクターについて、健常なヒト対照試料で見出される平均発現レベルを超えた。発現は、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）を投与したＮＨＰのＣＳＦにおいて一貫して最も高かった。７～３５日目から、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）を投与された動物の平均ＰＧＲＮ濃度は、正常なヒトＣＳＦのＰＧＲＮレベルよりも約４０倍高かった（図８）。ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）を投与した両方のＮＨＰについて、ＣＳＦのＰＧＲＮレベルは、およそ２１～２８日にピークに達したようであった。血漿中で、ヒトＰＧＲＮの発現は、試験された全てのベクターについて、７日目までに検出された。ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧのいずれかを投与されたＮＨＰにおけるＰＧＲＮ発現レベルは、７及び１４日目に健常なヒト対照試料について公表されたＰＧＲＮ濃度を超え、発現は両方のベクターについておよそ１４～２１日目にピークに達したようであった。対照的に、ＡＡＶ５．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧを投与されたＮＨＰは、血漿中のＰＧＲＮの低いレベルを示した（図８）。

【0200】

研究中、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧを投与されたＮＨＰは、他の群と比較して、ＣＳＦ及び血漿中のより高いレベルのＰＧＲＮを示したため、これらの群のみが、導入遺伝子に対する抗体応答について評価された。ＣＳＦでは、７～３５日以内にＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧのいずれかを投与されたＮＨＰにおいて、抗ＰＧＲＮ抗体の存在が検出された。ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）を投与されたＮＨＰは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧを投与したものと比較して、より早い抗体応答を示した（図９）。血清では、７～１４日以内にＰＢＦＴ０２又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧのいずれかを投与されたＮＨＰにおいて、抗ＰＧＲＮ抗体の存在が検出された。抗体応答の発症のタイミングは、２つの処置群間で同様であった（図９）。

【0201】

全てのＮＨＰは、予定された研究エンドポイント（群１～３では３５±２日目、群４で
は６０±４日目）まで生存した。全ての動物を剖検した。毎日の観察では、処置に関連する異常は特定されなかった。体重は、研究全体を通して、全ての動物で安定していた（図１０）。

【0202】

ＣＳＦ分析から、投与された全てのベクターについて、ＡＡＶ投与の７～２１日後に始まる無症候性リンパ球増加が明らかになった（図１１）。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧが投与された両方の動物（ＲＡ２９８１及びＲＡ２９８２）及びＡＡＶｈｕ６８．ＵｂＣ．ＰＩ．ｈＰＧＲＮ２．ＳＶ４０が投与された１匹の動物（ＲＡ３１５３）は、研究における他の動物のものと比較して、概して軽度のプレオサイトーシスを示した。ＣＳＦ白血球数は、ピークレベルから低下したが、研究中のほとんどの動物について、剖検時、上昇したままであった。

【0203】

研究中のいずれの動物においても処置関連の全体的な病理学的知見は存在しなかった。ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧを投与されたＮＨＰは、研究中にＣＳＦ及び血漿中でより高いレベルのＰＧＲＮを示したため、脳及び脊髄の組織病理学は、これらの群に対してのみ実施された。ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧを投与されたＮＨＰは、髄膜及び脈絡叢における時折の最小限のリンパ球浸潤を示した。いくつかのＤＲＧ及び脊髄切片では、感覚ニューロン及びそれらに関連する軸索の変性も観察された。感覚ニューロンの所見は、典型的には、重症度が最小限から軽度であり、臨床徴候とは関連していなかった。

【0204】

非ヒト霊長類へのＡＡＶ１及びＡＡＶｈｕ６８ベクターのＩＣＭ投与後のＣＮＳ形質導入の異なるパターン。
本研究者らは、ＡＡＶ１ベクターで処置されたＮＨＰのＣＳＦにおける著しく高いＰＧＲＮ発現から、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、及びＡＡＶｈｕ６８ベクターの形質導入パターンの差異を更に探求することにした。ＧＦＰレポーター遺伝子を発現するＡＡＶ１、ＡＡＶ５、又はＡＡＶｈｕ６８ベクター（３×１０^１３ＧＣ、ベクターあたりｎ＝２）の単回ＩＣＭ注入がＮＨＰに投与された。脳形質導入の組織学的分析のために、注入の２８日後に動物が犠牲になった。

【0205】

免疫組織化学により、ＡＡＶ１及びＡＡＶｈｕ６８ベクターで処置されＮＨＰの脳全体にわたって、散在的なパッチ状の形質導入が明らかになった。最小限の形質導入は、ＡＡＶ５ベクターを受けた動物の脳において顕著であった。ＡＡＶ１とＡＡＶｈｕ６８との間の形質導入における差異をより正確に特徴付けるために、複数の脳領域から回収された切片で形質導入細胞を定量化する半自動化方法を開発した。ＧＦＰ及び特定の細胞型のマーカーに対する蛍光標識抗体で染色された切片を使用して、ＮｅｕＮ、ｏｌｉｇ２、及びＧＦＡＰの染色、続いて各型のＧＦＰ発現細胞の定量によって、それぞれ、ニューロン、オリゴデンドロサイト、及びアストロサイトの総数を定量した（図１２、図１３）。ＡＡＶ１及びＡＡＶｈｕ６８は、それぞれ、調べた全ての領域で、各細胞型の１パーセント未満を形質導入した。ニューロンの形質導入は、２つのベクター間でほぼ同等であったが、ＡＡＶｈｕ６８は、わずかに多くのアストロサイト及びオリゴデンドロサイトを形質導入したように見えた。

【0206】

ＡＡＶ１で達成された劇的に高いＣＳＦのＰＧＲＮレベルを考慮すると、ＡＡＶ１及びＡＡＶｈｕ６８ベクターで観察されたほぼ同等の脳形質導入は、予想外であった。上衣細胞の形質導入は、ＡＡＶｈｕ６８で処置された動物及びＡＡＶ１で処置された動物ＲＡ１８２６の側脳室及び第４脳室の複数の領域において、免疫組織化学によって評価された。興味深いことに、ＡＡＶ１処置動物（ＲＡ１８２６）からの複数の脳切片は、脳室系の一部を含み、脳室に沿って並ぶ上衣細胞の広範な形質導入を示したが、これは、ＡＡＶｈｕ
６８処置動物のいずれにおいても観察されなかった（未掲載）。側脳室の前角、側角及び後角と第４の脳室とを含む、全てのサンプリングされた領域にわたって、平均４８％の上衣細胞が形質導入された。対照的に、ＡＡＶｈｕ６８ベクターを与えられた動物の同じ脳領域では、１～２％の上衣細胞のみが形質導入された。第２のＡＡＶ１処置動物において１つの側脳室の小さなセグメントのみが評価可能であり、約１％の上衣細胞の形質導入を示したものの、分析は、小さなサンプリング領域に限定された。これらの知見は、他の細胞型の形質導入が２つの血清型間で類似しているように見えることを考慮すると、ＡＡＶ１処置動物において高度に形質導入される上衣細胞が、ＣＳＦにおける高レベルのＰＧＲＮの供給源であり得ることを示唆する。分泌されたＰＧＲＮによって媒介される傍観者効果により、ＧＲＮ変異によって引き起こされるＦＴＤは、例外的に、ＡＡＶ遺伝子療法に適している。細胞外ＰＧＲＮはニューロンに取り込まれ得るため、ＡＡＶ１ベクターで達成される高いＣＳＦのＰＧＲＮレベル（明らかに、頑強な上衣細胞の形質導入によって媒介されている）により、ＡＡＶ１が、ＧＲＮ遺伝子療法のための理想的な選択肢となる。

【0207】

累積的に、これらの研究は、大型動物モデルのＣＳＦにおける治療的ＰＧＲＮ発現レベルを達成するための髄腔内ＡＡＶ送達の可能性を確立した。

【0208】

実施例５：最小有効用量（ＭＥＤ）を決定するためのＧｒｎ^－／－ マウスにおける脳室内投与後のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）の有効性
この薬理学的研究の目的は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするヒトグラニュリン前駆体（ＧＲＮ）遺伝子を発現する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型１ベクターであるＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）の脳室内（ＩＣＶ）投与後のＧｒｎ^－／－マウスにおける最小有効用量（ＭＥＤ）及び導入遺伝子発現レベルを評価することであった。

【0209】

成体Ｇｒｎ^－／－マウス（６．５～８．５ヶ月齢）は、４つの用量レベル、４．４×１０^９ゲノムコピー［ＧＣ］／動物、１．３×１０^１０ＧＣ／動物、４．４×１０^１０ＧＣ／動物、又は１．３×１０^１１ＧＣ／動物（それぞれ、１．１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳、３．３×１０^１０ＧＣ／ｇ脳、１．１×１０^１１ＧＣ／ｇ脳、３．３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳）のうちの１つで、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）の単回のＩＣＶ投与を受けた。追加のＧｒｎ^－／－マウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに、対照としてビヒクル（髄腔内最終製剤緩衝液［ＩＴＦＦＢ］）を投与した。

【0210】

以下の表に、群の指定、用量レベル、及び投与経路（ＲＯＡ）を示す。

【表5】

【0211】

ベースライン（－７～０日目）に、投薬前に動物から血液を採取し、将来の分析のために保存した。投薬日（１日目）に、成体Ｇｒｎ^－／－マウス（６．５～８．５ヶ月齢）は、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（４．４×１０^９ＧＣ／動物、１．３×１０^１０ＧＣ／動物、４．４×１０^１０ＧＣ／動物、又は１．３×１０^１１ＧＣ／動物）又はビヒクル（ＩＴＦＦＢ）のいずれかの単回ＩＣＶ投与を受けた。年齢適合野生型マウスにも、ビヒクルを対照として投与した。投薬日（１日目）に、未処置Ｇｒｎ１^－／－マウス及び野生型マウスも、疾患関連脳異常の進行又は解消に対するＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）の効果とともに、臨床病理学及び組織病理学におけるベースライン異常を評価するための対照として機能するように剖検した。

【0212】

ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はビヒクルのいずれかを投与されたマウスを、生存率について毎日モニタリングし、毎週体重測定をした。９０日目に、全ての生存マウスを剖検した。剖検では、それぞれ臨床病理学（ＣＢＣ及び血
清化学）及び組織病理学のために血液及び組織を採取した。ＣＳＦを採取して、導入遺伝子産物の発現（ヒトＰＧＲＮタンパク質）を測定した。脳組織を採取して、Ｇｒｎ^－／－マウスモデルに特徴的な疾患関連バイオマーカーを評価した。これらのバイオマーカーには、視床、皮質、及び海馬において定量化された脳蓄積物質の蓄積（リポフスチン沈着物）及び神経炎症（ミクログリアに標識するためのＣＤ６８免疫組織化学）が含まれた。前頭皮質を含む脳の第３の前頭部分の溶解物を使用して、リソソーム酵素ＨＥＸの活性を評価した。

【0213】

全ての群は、研究期間中、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はビヒクル投与後も体重を維持した（図１４）。

【0214】

導入遺伝子産物の発現（ヒトＰＧＲＮタンパク質）は、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与の９０日後に、剖検されたマウスのＣＳＦにおいて測定された。ＣＳＦ中のヒトＰＧＲＮ発現は、ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－対照のものと比較して、２つの最も高い用量のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（４．４×１０^１０ＧＣ及び１．３×１０^１１ＧＣ）で増加した（図１５）。２つの最も低い用量のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（４．４×１０^９ＧＣ又は１．３×１０^１０ＧＣ）を投与されたＧｒｎ^－／－マウスにおけるヒトＰＧＲＮ発現は、ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－マウス及び野生型対照のものと同様のようであった。しかしながら、ＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡアッセイのＬＯＤは１．２５ｎｇ／ｍＬであり、したがって、２つの最も低い用量並びにビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－及び野生型対照におけるＰＧＲＮ発現の変化を検出する能力を制限した。

【0215】

ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－対照と比較した場合、９０日目のＣＢＣ又は血清化学パネルでは、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与に関連する異常は観察されなかった。盲検化された肉眼的及び顕微鏡的評価において、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）の投与に関連する組織病理学的所見はなかった。

【0216】

リポフスチン沈着物を、ベースライン及びＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与の９０日後に剖検されたマウスの３つの脳領域（視床、皮質、及び海馬）において定量化した。ベースライン及び９０日目の両方で、リポフスチン沈着物は、皮質及び海馬と比較して、視床においてより豊富であり、視床が、他の脳領域よりも、リポフスチン凝集体を評価するためのより高い感度を提供し得ることを示唆した。視床では、未処置野生型対照よりも、未処置Ｇｒｎ^－／－マウスにおいて、より高いベースラインのリポフスチン数が観察された。９０日目で、ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－マウスにおける平均リポフスチン数は、未処置Ｇｒｎ^－／－ベースライン対照のものよりも高く、リポフスチン沈着物の進行性の増加を示した。対照的に、全てのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置群（４．４×１０^９ＧＣ／動物、１．３×１０^１０ＧＣ／動物、４．４×１０^１０ＧＣ／動物、及び１．３×１０^１１ＧＣ／動物）は、ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－マウスのものよりも有意に低いリポフスチン数を示した。リポフスチン数は、全てのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）用量群間で同様であったため、用量依存性応答は観察されなかった。全てのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置群における平均リポフスチン数は、未処置Ｇｒｎ^－／－ベースライン対照群の平均数と同様であったため、全ての用量レベルでのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与は、９０日の研究中のリポフスチンの漸進的な蓄積を防止するようであった（図１６Ａ～図１６Ｃ）。皮質及び海馬において、未処置のＧｒｎ^－／－マウスでは、ベースラインの未処置の野生型対照よりも高い平均リポフスチン数が観察された。同様に、９０日目に、ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－マウスでは、ビヒクル処置野生型マウスよりも、より高い平均リポフスチン数
も観察された。全てのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置群（４．４×１０^９ＧＣ／動物、１．３×１０^１０ＧＣ／動物、４．４×１０^１０ＧＣ／動物、及び１．３×１０^１１ＧＣ／動物）は、ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－マウスよりも９０日目に平均リポフスチン数が少なかったが、低減は、１．３×１０^１０ＧＣ／動物の用量での皮質において統計的に有意であっただけであった。リポフスチン数は、４つのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）用量群全てで同様であったため、用量依存性応答は観察されなかった。

【0217】

神経炎症マーカーＣＤ６８を、ベースライン及びＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与の９０日後に剖検されたマウスの３つの脳領域（視床、皮質、及び海馬）において、定量化した。ＣＤ６８発現は、ＣＤ６８染色が陽性の組織の領域を定量化することにより評価された。ベースラインでは、未処置Ｇｒｎ^－／－マウスの視床、皮質、及び海馬において、未処置野生型対照と比較して、より高い平均ＣＤ６８発現が観察された。同様に、９０日目に、ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－マウスの視床、皮質、及び海馬において、ビヒクル処置野生型対照と比較して、より高い平均ＣＤ６８発現が観察された。９０日目の視床では、３つの最も高いＰＢＦＴ０２用量群（１．３×１０^１０ＧＣ／動物、４．４×１０^１０ＧＣ／動物、及び１．３×１０^１１ＧＣ／動物）で概して用量依存的な応答が観察され、ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－マウスの発現と比較して有意に低減したＣＤ６８発現を示した（図１７Ａ）。注目すべきことに、最も高い用量のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（１．３×１０^１１ＧＣ／動物）を投与されたマウスは、ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－マウスのものと比較して、約４倍のＣＤ６８発現の低減を示した。９０日目の皮質において、全てのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置群において平均ＣＤ６８発現が低減したが、低減は、ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－マウスにおけるＣＤ６８発現との有意差ではなかった。用量依存性応答は観察されなかった（図１７Ｂ）。９０日目の海馬では、全てのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置群（４．４×１０^９ＧＣ／動物、１．３×１０^１０ＧＣ／動物、４．４×１０^１０ＧＣ／動物、及び１．３×１０^１１ＧＣ／動物）は、ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－マウスのものと比較して有意に低いＣＤ６８発現を示した。更に、ＣＤ６８の発現は、全ての用量のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）について、ビヒクル処置野生型対照のものと同様であった。ＣＤ６８の発現は、全ての用量のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）において同様であったため、この応答は用量依存的ではなかった（図１７Ｃ）。

【0218】

主に皮質組織からなる脳の第３の前頭葉部分の溶解物に対して、ベースライン及びＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与の９０日後に、ＨＥＸ活性アッセイを実施した。ベースラインでは、未処置野生型対照よりも、未処置Ｇｒｎ^－／－マウスにおいて、脳ＨＥＸ活性が高かった。９０日目に、最も高いＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）用量（１．３×１０^１１ＧＣ／動物）を投与されたＧｒｎ^－／－マウスは、ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－マウスのものと比較して、有意に低減した脳ＨＥＸ活性を示した。更に、最も高い用量群（１．３×１０^１１ＧＣ／動物）におけるＨＥＸ活性は、ビヒクル処置野生型対照のものと同様であり、この用量での脳ＨＥＸレベルの正常化を示す（図１８）。

【0219】

累積的に、Ｇｒｎ^－／－マウスのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置は、最も高い用量（１．３ｘ１０^１１ＧＣ［３．３ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ脳］）で観察されたリポフスチン、神経炎症、及びリソソーム酵素活性に対する最も広範な処置に関連する効果を有する組織病理学の用量関連補正をもたらした。最も低い用量のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（４．４×１０^９ＧＣ［１．１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳］）は、視床におけるリポフスチンの蓄積の予防及び海馬にお
けるミクログリア浸潤（すなわち、ＣＤ６８発現によって定義される神経炎症）の低減を含む、ＧＲＮ関連神経変性を有する患者に見出される主要な神経病理学的特徴を有意に改善した。この用量では、組織学的補正は、調べた脳領域のサブセットに限定され（おそらく、Ｇｒｎ^－／－マウスの皮質及び海馬と比較して、視床におけるリポフスチン沈着物及びＣＤ６８発現細胞の全体的な大きな濃縮によるものである）、リソソーム酵素活性（ＨＥＸ活性によって測定された）は正規化されなかったが、ＭＥＤは、４．４×１０^９ＧＣ（１．１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳）であると決定された。

【0220】

実施例６：野生型マウスにおける脳室内投与後のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）の生体内分布及び導入遺伝子の発現
この薬理学的研究の目的は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするヒトグラニュリン前駆体（ＧＲＮ）遺伝子を発現する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型１ベクターであるＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）の脳室内（ＩＣＶ）投与後の野生型マウスにおけるベクター生体内分布及び導入遺伝子発現レベルを評価することであった。

【0221】

投与日（１日目）に、成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス（３．５～５．５ヶ月齢）は、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（１．３×１０^１１ゲノムコピー［ＧＣ］／動物［３．３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳］）又はビヒクル（髄腔内最終製剤緩衝［ＩＴＦＦＢ］）のいずれかの単回ＩＣＶ投与を受けた。

【0222】

以下の表に、群の指定、用量レベル、及び投与経路（ＲＯＡ）を示す。

【表6】

【0223】

最小有効用量（実施例５）を同定した用量範囲の研究で評価された最も高い用量であり、体積制約及び予想されるベクター力価によって制限されるマウスにおける最大実行可能用量に近いため、１．３×１０^１１ＧＣ／動物のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）用量を選択した。この用量は、標的系（ＣＮＳ）並びに血液及び末梢組織の両方におけるマウスにおけるベクター分布及び導入遺伝子産物の発現の包括的な評価を可能にすることが期待された。

【0224】

投与日（１日目）に、成体野生型マウス（３．５～５．５ヶ月齢）は、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（１．３×１０^１１ＧＣ／動物）又はビヒクル（ＩＴＦＦＢ）のいずれかの単回ＩＣＶ投与を受けた。全てのマウスを、生存率について毎日モニタリングし、週に１回、体重測定をした。ＣＳＦ、血清、及び組織の包括的リストを、１０、３０、６０、及び９０日目の剖検で採取して、ベクターの生体内分布及び導入遺伝子産物の発現（ヒトＰＧＲＮタンパク質）を評価した。

【0225】

研究全体を通して、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与に関連する臨床的異常は認められなかった。全ての群は、研究期間中、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はビヒクル投与後も体重を維持した（
図９）。

【0226】

ベクター投与後１０日目までに、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）ベクターゲノムは、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置マウスの標的組織（脳）及び全ての末梢組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、及び骨格筋）において検出可能であった。組織内ベクターゲノムレベルは、一部の臓器で３０、６０、及び９０日目に変動したが、ｖベクターゲノムレベルの減少傾向は、概して、１０日目後に観察され、全ての組織は、最終的に、１０日目よりも９０日目に低いベクターゲノムレベルを示した。１つの注目すべき例外は、腎臓であり、これは、９０日目に１０日目と同様のレベルのベクターゲノムを示した。この研究全体を通して、脳は他の全ての組織と比較して最も高い濃度のベクターゲノムを示した。肝臓、脾臓、腎臓、及び心臓においては、低いレベルのベクターゲノムが観察された。研究全体を通して、肺及び骨格筋は、最も低いレベルのベクターゲノムを示した（図２０）。

【0227】

ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）ベクターゲノムは、６０日目の脳及び肺（それぞれ、動物８及び７［群５］）並びに３０日目の心臓（動物１８［群３］）を除いて、研究全体を通してビヒクル処置マウスの組織において検出できなかった。これらの組織において低レベルのベクターゲノムが観察されたため、ビヒクル処置マウスにおけるそれらの存在は、試料処理中の汚染に起因する可能性が高い。

【0228】

ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）又はビヒクル投与後１０、３０、６０、及び９０日目に、導入遺伝子産物の発現（ヒトＰＧＲＮタンパク質）を、標的臓器系（ＣＮＳ）並びに血清及び末梢臓器において測定した。ＣＳＦでは、ヒトＰＧＲＮ発現レベルは、研究全体を通して評価された全てのビヒクル処置マウス（１４／１４の動物）において検出できなかった。対照的に、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与は、１０日目及び３０日目のＣＳＦ中のヒトＰＧＲＮ発現レベルを、ビヒクル処置対照のものと比較して有意に上昇させた。６０日目及び９０日目の発現レベルは、ビヒクル処置対照のものと比較して有意に上昇しなかったが、評価されたＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ＨＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置マウスの大部分（６０日目の２／５の動物及び９０日目の７／８の動物）において、ヒトＰＧＲＮ発現は依然としてＣＳＦにおいて検出可能であった。

【0229】

ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置マウスは、１０日目、３０日目、及び９０日目に、それぞれ４９．９３ｎｇ／ｍＬ、３４．９７ｎｇ／ｍＬ、及び３１．４１ｎｇ／ｍＬの平均ヒトＰＧＲＮ ＣＳＦ濃度を示した。６０日目は、１．４６ｎｇ／ｍＬの低い平均ヒトＰＧＲＮ濃度で、唯一の外れ値であった。６０日目のヒトＰＧＲＮ発現レベルが、他の時点でのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ＨＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置群の発現レベルよりも低かった理由は不明である。ヒト導入遺伝子産物に対する抗体は、この研究では分析されなかったが、６０日目のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置群の動物は、ヒト導入遺伝子産物に対する抗体応答を有した可能性がある（図２１）。

【0230】

脳では、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置マウスは、１０日目、３０日目、及び９０日目に、同じ時点でのビヒクル処置対照のレベルと比較して、有意にヒトＰＧＲＮレベルの上昇を示した。ＣＳＦで観察されたものと同様に、６０日目の脳中のヒトＰＧＲＮ発現レベルは、ビヒクル処置対照のものと比較して有意に上昇しなかったが、これは、おそらく、６０日目群におけるヒト導入遺伝子産物に対する抗体応答によるものであった（図２１）。

【0231】

脊髄では、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与は、１
０、３０、６０、又は９０日目に、ビヒクル処置対照レベルを上回るヒトＰＧＲＮ発現を有意に増加させなかった（図２１）。

【0232】

血清では、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与は、１０、３０、６０、又は９０日目に、ビヒクル処置対照レベルを上回るヒトＰＧＲＮ発現を有意に増加させなかった（図２２）。

【0233】

研究中、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置マウスの腎臓、骨格筋、又は頸部リンパ節において、ヒトＰＧＲＮ発現の有意な上昇は観察されなかった。しかしながら、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置マウスは、心臓、肝臓、及び脾臓において、ヒトＰＧＲＮ発現の一過性の上昇を示した。心臓及び肝臓では、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置マウスは、ビヒクル処置対照のものと比較して、６０日目に有意に上昇したヒトＰＧＲＮ発現レベルを示したが、１０日目、３０日目、又は９０日目では示さなかった。脾臓では、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置マウスは、ビヒクル処置対照のものと比較して、１０日目に有意に上昇したヒトＰＧＲＮレベルを示したが、３０日目、６０日目、又は９０日目では示さなかった（図２３Ａ～図２３Ｆ）。

【0234】

ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）ベクターゲノムは、髄腔内投与後に組織中に広く分布していたが、ＧＲＮ関連神経変性を治療するための標的臓器系（すなわち、ＣＮＳ）は、研究全体を通して、ベクター形質導入の全体的な最も高いレベルを示し、形質導入遺伝子産物の発現が持続していた。

【0235】

実施例７：成体アカゲザルに槽内投与したＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）の毒性及び生体内分布
この毒性学研究の目的は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における大槽内（ＩＣＭ）投与後にヒトプログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質を発現する組換えアデノ随伴ウイルス血清型１（ＡＡＶ１）ベクターであるＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）の安全性、耐容性、生体内分布、及び排泄（排出）プロファイルを評価することであった。

【0236】

成体の雄及び雌アカゲザルは、ビヒクル（髄腔内最終製剤緩衝液［ＩＴＦＦＢ］）又は３．０×１０^１２ゲノムコピー（ＧＣ）（低用量、３．３×１０^１０ＧＣ／ｇ脳）、１．０×１０^１３ＧＣ（中用量、１．１×１０^１１ＧＣ／ｇ脳）、若しくは３．０×１０^１３ＧＣ（高用量、３．３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳）の用量でのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）の単回ＩＣＭ投与を受けた。

【0237】

用量の投与日（０日目）を、投与日にわたって可能な限り多くの研究群を表す動物と交錯させた。以下の表に、研究事象を要約する。

【表7】

【0238】

評価される最も高い用量（３．０×１０^１３ＧＣ）は、予想されるベクター力価及び最大投与体積に基づいた最大実行可能用量である。中用量（１．０×１０^１３ＧＣ）及び低用量（３．０×１０^１２ＧＣ）は、それぞれ、最大実行可能用量より３倍及び１０倍低い。用量が区別され、マウス薬理学研究で評価された用量範囲を包含することを確実にするために、この範囲を選択した。

【0239】

この研究は、９０日目の剖検時点を含んだ。先のＩＣＭプログラムでは、ＤＲＧ及びＴＲＧニューロンの毒性が再現可能な動態で観察されている。ＤＲＧ及びＴＲＧニューロンは、ベクター投与の１４～２１日以内に一貫して変性する。細胞体の変性後、ベクター投与のおよそ３０日後に、末梢神経及び脊髄の後側柱におけるこれらの細胞の軸索のその後の変性（軸索障害）が現れる。軸索の変化は、ベクター投与の９０日後に犠牲になった動物において引き続き見ることができる。ベクター投与後１８０日で、組織学的病変の重症度は、多くの場合、３０日目又は９０日目と同様であったが、変性ニューロン及びそれらの関連する軸索が、先の犠牲時点で存在するマクロファージによって除去されたためであると推定されるため、通常、多少改善される。これらの動態に基づいて、本研究者らは、９０日目の剖検時点が、ＤＲＧ及びＴＲＧの組織学的所見及び関連する任意の臨床徴候を評価するのに十分であると予想した。

【0240】

標準化された神経学的検査を、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦ
Ｔ０２）投与前のベースライン、並びに投与後１４、２８、及び９０日目に実施した。動物は、時折、試験に非協力的であり、いくつかの評価を不可能にした。しかしながら、試験に必要な全ての構成要素は、各動物について、最大時点で評価された。ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（１．０×１０^１３ＧＣ、動物１７１３１１、群３、Ｎ＝１／３）の中用量を投与された１匹の動物は、９０日目に離脱反射を有しなかった。しかし、動物はケージバー及びグリッドを手及び足の両方でつかみ、正常に歩行することが示された。無反応は、不安に起因し、深い痛みの感覚の喪失に起因しなかった。研究全体を通して、他の異常な神経学的徴候は認められなかった。

【0241】

感覚神経伝導試験は、両側正中神経活動電位振幅及び伝導速度を測定するために、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与前のベースラインで並びに２８及び９０日目に、全ての動物に対して実施された（図２５）。

【0242】

ＳＮＡＰ振幅の場合、動物間及び動物内の変動が明らかであったが、値は、典型的には、ベースライン測定の範囲内にとどまった（図２６Ａ）。１匹のビヒクル処置動物（ＩＴＦＦＢ、動物１７１１２３、群１、１／２の動物）及び低用量のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）を投与された１匹の動物（３．０×１０^１２ＧＣ、動物１８０６６８、群２、１／３の動物）は、９０日目に、片側正中神経ＳＮＡＰ振幅の著しい低減を示した。高用量のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（３．０×１０^１３ＧＣ、動物１７１２０９、群４、１／３の動物）を投与された１匹の動物は、左右の正中神経の両方について、９０日目までに両側正中神経ＳＮＡＰ振幅の著しい低減を示した。これら３匹の動物に異常な臨床所見はなかったが、高用量のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（３．０ｘ１０^１３ＧＣ）の投与後の動物１７１２０９におけるＮＣＳ所見は、正中神経における組織病理学的所見と相関していた。正中神経伝導速度については、研究全体を通して、いずれの動物においても、有意な変化は観察されなかった（図２６Ｂ）。

【0243】

全ての動物は、研究全体を通して正常な体重を維持した（図２７）。

【0244】

血液ＣＢＣ、凝固研究、又は血清化学パネルでは、顕著な試験物に関連する異常は観察されなかった。全ての群（５／１１）にわたるいくつかの動物は、ベースライン及び／又は０日目に一過性クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）の上昇（＞１０００Ｕ／Ｌ）を示した。全ての上昇はＣＰＫの骨格筋アイソフォームを伴っていたため、ＣＰＫの上昇は鎮静作用又は静脈穿刺中の筋肉外傷に続発したものである可能性が高く、したがって試験物とは無関係とみなされた。いくつかのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置動物（２／９、動物１８０６６８、３．０×１０^１２ＧＣ、群２、動物１７１２０９、３．０×１０^１３ＧＣ、群４）は、血清アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ、＞６００Ｕ／Ｌ）の軽度の増加を示し、これは当初、ベースライン又は６０日目のいずれかで示された。ＡＬＰ上昇は、両方の動物において９０日目の剖検まで持続した。ＡＬＰには、肝臓、腎臓、及び骨に見られるものを含む複数のアイソフォームがあり、これらの変化は、動物の年齢に起因する本質的に生理学的である可能性が最も高いと見なされた。９０日目に、低用量のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）（３．０×１０^１２ＧＣ、動物１７２２９、群２）を投与した単一の動物において、軽度の血小板減少が観察されたが、関連する臨床徴候の欠如及び低い発生率は、この減少がアーチファクトである可能性が高いことを示唆した。

【0245】

いくつかのＣＳＦ試料には、ＣＳＦ採取中の血液汚染に起因する赤血球が含まれていた。５／９（５６％）のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置動物及び０／２（０％）のビヒクル処置対照において、軽度の髄液細胞増加（＞６個の白血球［ＷＢＣ］／μＬとして定義される）が生じた。髄液細胞増加は、リンパ球性（主
にリンパ球又はリンパ球及びマクロファージの混合物からなる）であり、試験物に関連するとみなされた（図２８）。１匹の高用量動物（３．０×１０^１３ＧＣ、動物１７１２０９、群４）の７日目、１匹の高用量動物（３．０×１０^１３ＧＣ、動物１８１３３０、群４）の１４日目、１匹の中用量動物（１．０×１０^１３ＧＣ、動物１７１３０６、群３）の２８日目、及び１匹の低用量動物（３．０×１０^１２ＧＣ、動物１７１２２９、群２）の６０日目に、８～１８ＷＢＣ／μＬのピークＣＳＦ ＷＢＣ数が生じた。中用量群の１匹の動物（１．０×１０^１３ＧＣ、動物１７１１１８、群３）は、２８日目及び９０日目に１８ＷＢＣ／μＬの２つのピークＣＳＦ ＷＢＣ数を示したが、２８日目の結果は、試料中の血液汚染によるアーチファクトであった可能性が高い。全ての動物において、髄液細胞増加は自己限定的であり、臨床的続発症とは関連していなかった。

【0246】

ＡＡＶ１カプシドに対する既存のＮＡｂは、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与前に、３／１１の動物（２７％）の血清において検出可能であった。ビヒクル処置された動物は、９０日目までに血清ＮＡｂ力価の変化を示さず、一方、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）を投与された全ての動物は、９０日目までに血清ＮＡｂ力価の増加を示した。低用量（３．０×１０^１２ＧＣ）、中用量（１．０×１０^１３ＧＣ）、及び高用量（３．０×１０^１３ＧＣ）群のＮＡｂ力価は、９０日目に同等であり、用量依存性応答の欠如を示した。加えて、ＡＡＶ１ ＮＡｂ応答の大きさは、評価したいずれの用量でも、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与前の既存のＡＡＶ１ ＮＡｂの存在に影響されないようであった。以下の表に、血清中のＡＡＶ１に対するＮＡｂ応答を要約する。

【表8】

【0247】

図２９に要約されるように、ビヒクル処置対照動物（ＩＴＦＦＢ、２／２の動物）は両方とも、研究期間を通して、カプシド（ＡＡＶ１）及び導入遺伝子産物（ヒトＰＧＲＮ）に対するＩＦＮ－γＴ細胞応答について陰性のままであった。対照的に、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与は、８／９（８９％）のＮＨＰにおいて、ＡＡＶ１カプシド及び／又はヒトＰＧＲＮに対するＩＦＮ－γＴ細胞応答を誘発した。単一の非応答者は、中用量を投与した動物（３．０×１０^１２ＧＣ、動物１７１３１１、群３）であった。

【0248】

ＩＦＮ－γＴ細胞応答を示す動物のうち、６／８（７５％）は、ＡＡＶ１カプシドに対して陽性応答を示し、６／８（７５％）は、ヒトＰＧＲＮに向けられた応答を有した。これらの動物のうち、２／８（２５％）のＮＨＰは、ＡＡＶ１カプシドに対してのみＴ細胞応答を示し、２／８（２５％）のＮＨＰは、ヒトＰＧＲＮに対してのみＴ細胞応答を示した。ＡＡＶ１カプシドに対するＩＦＮ－γ応答は低く、１００万細胞当たり５８～１８８
スポット形成ユニット（ＳＦＵ）の範囲であった。ＡＡＶ１カプシドに応答を示す６匹の動物のうち、３／６匹（５０％）は、低用量群の１匹の動物（３．０×１０^１２ＧＣ、動物１７１２５０、群２）、中用量群の１匹の動物（１．０×１０^１３ＧＣ、動物１７１１１８、群３）、及び高用量群の１匹の動物（３．０×１０^１３ＧＣ、動物１７１２０９、群４）を含み、研究中の単一の時点で低い一過性ＩＦＮ－γ応答を示した。残りの３／６匹（５０％）は、ＰＢＭＣで開始し、９０日目の剖検で少なくとも１つの組織リンパ球集団を介して運ばれた、より持続的な応答を示した。２／６（３３％）のＮＨＰのみが、肝臓におけるＡＡＶ１カプシドに対する検出可能なＩＦＮ－γ応答を有した。

【0249】

ヒトＰＧＲＮに対するＩＦＮ－γ応答を示す６／８の動物については、中等度から高い陽性応答（１００万個の細胞当たり２８０～５２０ＳＦＵ）が９０日目に観察された高用量群（３．０×１０^１３ＧＣ、動物１７１２０９、群４）の単一の動物の肝臓における応答を除いて、全ての観察された応答は低かった（１００万個の細胞当たり６０～２００ＳＦＵの範囲である）。ヒトＰＧＲＮに対するＩＦＮ－γ応答は、剖検で単離された肝臓リンパ球（６／６の動物［１００％］）において、ＰＢＭＣ（４／６の動物［６７％］）又は脾細胞（２／６の動物［３３％］）よりも優勢であった。

【0250】

カプシド及び導入遺伝子産物に対するＴ細胞応答は、異常な臨床観察又は血液学、凝固、及び血清化学のパラメータの変化とは関連していなかった。

【0251】

試験物関連の肉眼的所見は観察されなかった。全ての肉眼的所見は、偶発的なものとみなされた。試験物に関連する所見は、主に、ＤＲＧ、三叉神経節ＴＲＧ、脊髄の後側白質路、及び末梢神経内で観察された。これらの所見は、後根神経節（ＤＲＧ）及び三叉神経節（ＴＲＧ）内の単核細胞浸潤を伴うニューロン変性からなり、線維症の有無にかかわらず、脊髄及び末梢神経の後側白質路内の軸索変性（すなわち、軸索障害）を伴った。全体的に、これらの所見は、全てのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置群にわたって観察された。これらの所見の重症度は、中用量群（１．０×１０^１３ＧＣ）及び高用量群（３．０×１０^１３ＧＣ）由来の動物においてより高くなる傾向があった。脊髄及び末梢神経におけるＤＲＧ／ＴＲＧ変性及び軸索障害の発生率は、用量にかかわらず同様であったが、中用量（１．０×１０^１３ＧＣ）及び高用量（３．０×１０^１３ＧＣ）では、より高い線維症の発生率が観察された。他の試験物に関連する所見には、注入部位での骨格筋及び脂肪組織における慢性炎症が含まれた。

【0252】

ＤＲＧ／ＴＲＧ神経変性
軸索を脊髄の後側白質路に中枢的に、末梢神経に末梢的に投射するＤＲＧにおける単核細胞の浸潤を伴う神経細胞体の変性は、全てのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置群で観察され、試験物に関連するとみなされた。同様の所見がＴＲＧで観察された。ＤＲＧ／ＴＲＧ神経変性の重症度は、低用量（最小、［３．０×１０^１２ＧＣ、群２、２／３の動物、６／１２の神経節］）で最も低く、続いて高用量群（最小～軽度、［３．０×１０^１３ＧＣ、群４、３／３の動物、６／１２の神経節］）が密接に続いた。重症度は、全体として、中用量群で最も高かったが（最小～軽度、［１．０×１０^１３ＧＣ、群３、３／３の動物、７／１２の神経節］）、中用量群と高用量群との間では、明確な用量応答は観察されなかった。発生率は、全てのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置群（群２～４）にわたって同様であった。最小限の神経細胞体変性は、１匹のビヒクル処置対照（動物１７１１２３［ＩＴＦＦＢ、群１、１／２の動物］）において生じたが、処置対バックグラウンドに対するこの所見の関係を確立することができなかった。加えて、中用量群の１匹の動物（動物１７１３０６［１．０×１０^１３ＧＣ、群３、１／３の動物］）及び高用量群の１匹の動物（動物１７１２０９［３．０×１０^１３ＧＣ、群４、１／３の動物］）の脳神経ＩＸ、Ｘ、及び／又はＸＩにおいて観察される最小の軸索障害。

【0253】

脊髄における軸索障害
ＤＲＧ変性は、脊髄の後側白質路の軸索障害をもたらした。軸索障害の発生率は、全てのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置群で同様であったが、重症度の用量依存的増加が観察された。重症度は、低用量群（３．０×１０^１２ＧＣ、群２、３／３の動物）の最小から、中用量群（１．０×１０^１３ＧＣ［群３、３／３の動物］）及び高用量群（３．０×１０^１３ＧＣ［群４、３／３匹の動物］）の両方で最小から著しいまで増加した。注目すべきことに、中用量群の１匹の動物（動物１７１３０６［１．０×１０^１３ＧＣ、群３、１／３の動物］）及び高用量群の１匹の動物（動物１７１２０９［３．０×１０^１３ＧＣ；群４、１／３の動物］）は、同じ用量を投与された他の動物よりも、全体的により高い重症度を示した。

【0254】

末梢神経における軸索障害
ＤＲＧ変性は、末梢神経の軸索障害をもたらした。末梢神経の軸索障害は、用量依存的応答を示した。重症度は、低用量群（最小～軽度、［３．０×１０^１２ＧＣ、群２、２３／３０の神経］）において最も低く、中用量群（最小～中等度、［１．０×１０^１３ＧＣ、群３、２６／３０の神経］）から高用量群（最小～中等度、［３．０×１０^１３ＧＣ、群４、２３／３０の神経］）に増加した。しかしながら、この発生率は、全てのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置群にわたって比較的同様であった。対照動物（動物１７１１２３［ＩＴＦＦＢ、群１、１／３０の神経］）において最小限の軸索障害はめったに観察されず、偶発的であるとみなされた。

【0255】

神経内膜線維症
用量依存性神経内線維症（軸索周囲線維症又は神経周囲線維症とも称される）は、末梢神経において観察され、軸索損傷に続発するとみなされた。低用量群（３．０×１０^１２ＧＣ、群２）の末梢神経では線維症は観察されなかったが、中用量群（１．０×１０^１３ＧＣ、群３、２／３の動物、４／３０の神経）から高用量群（３．０×１０^１３ＧＣ、群４、２／３の動物、６／３０の神経）まで、発生率及び重症度の両方が増加した最小～中等度の線維症が観察された。末梢神経における線維症の最も高い発生率及び重症度は、中用量群の１匹の動物（動物１７１３０６［１．０×１０^１３ＧＣ、群３、１／３の動物］）及び高用量群の１匹の動物（動物１７１２０９［３．０×１０^１３ＧＣ、群４、１／３の動物］）で観察され、これらは、脊髄における軸索障害所見の重症度と相関した。軽度の神経内膜線維症は、中用量群の１匹の動物（動物１７１３０６［１．０×１０^１３ＧＣ、群３、１／３の動物、１／１２の神経節）の腰部セグメントのＤＲＧ神経根内でも観察され、軸索損傷に続発するとみなされた。

【0256】

注入部位の所見
局所注入部位の所見は、対照動物を含む全ての群にわたって観察された。ＩＣＭ注入／ＣＳＦ採取部位及び周辺領域において、ビヒクル処置対照動物は、骨格筋筋膜内に最小限の局所急性炎症又は骨格筋内の単核細胞浸潤を示した（ＩＴＦＦＢ、群１、２／２の動物）。ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置動物は、関連する筋線維の変化（８／９の動物）を伴う骨格筋及び脂肪組織内の最小～中等度の慢性炎症（９／９の動物）からなるこれらの所見の重症度の増加を示した。ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置動物における注入部位の所見の重症度は、用量依存性ではなかった。これらの注入部位所見は、部分的に、ＩＣＭ注入及び／又は反復ＣＳＦ採取に手順的に関連しているとみなされた。しかしながら、試験物に対する局所的応答に由来する増悪があった可能性が高い。

【0257】

ＩＣＭ投与後、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）ベクターＤＮＡは、ＣＳＦ及び末梢血の両方で検出可能であった。ＣＳＦ中のＡＡＶ１．ＣＢ７
．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）の濃度は、評価された最初の時点（７日目）後、急速に低下し、低用量群の１匹の動物（３．０×１０^１２ＧＣ、動物１７１２２９、群２）及び高用量群の１匹の動物（３．０×１０^１３ＧＣ、動物１８１３３０、群４）を除いて、ほとんどの動物において６０日目までに検出できなかった。動物１７１２２９及び動物１８１３３０の両方について、ＣＳＦにおけるＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）ベクターＤＮＡ濃度は、６０日目の最後の試料採取時点で減少傾向にあった。血液中のＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）ベクターＤＮＡ濃度は、よりゆっくりと低下し、末梢血細胞の形質導入に起因する可能性がある。ＣＳＦ又は末梢血のいずれにおいても、ピークベクター濃度は、用量依存的にではないようであった（図３０）。

【0258】

０日目に、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）ベクターＤＮＡはＣＳＦで検出されたが、中用量群の２匹の動物（動物１７１３０６及び１７１３１１［１．０×１０^１３ＧＣ、群３］）の血液では検出されなかった。０日目にＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）が陽性であったＣＳＦ試料を再試験して、結果を確認した。０日目のＣＳＦ中の低レベルのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）ベクターＤＮＡの検出は、ＩＣＭ投与手順中のＣＳＦ試料汚染に起因する可能性が高い。

【0259】

ベクター投与後５日目に、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）ベクターＤＮＡは、分析することができた８／９匹の動物の尿中及び全ての動物の糞便中（５／５の動物）で検出可能であった。ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）ベクターＤＮＡは、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与後２８日目までに、全ての動物（９／９の動物）の尿中で検出できなかった。ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）ベクターＤＮＡは、２８日目に分析することができた全ての動物の糞便中で検出することができず（３／３匹）、６０日目（９／９匹）に全ての糞便試料中で検出できないことが確認された。ピーク尿及び糞便のベクター濃度は、用量依存的ではないようであった。

【0260】

導入遺伝子産物の発現（ヒトＰＧＲＮタンパク質）は、ビヒクル処置対照動物のＣＳＦにおいて検出できなかった。ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）のＩＣＭ投与後、ヒトＰＧＲＮは、１４日目までにＣＳＦにおいて検出可能なヒトＰＧＲＮを発現しなかった１匹の低用量動物（３．０×１０^１２ＧＣ、動物１７１２５０、群２）及び１匹の高用量動物（３．０×１０^１３ＧＣ、動物１７１２４６、群４）を除いて、７日目までに全ての動物のＣＳＦ及び血清中で検出可能であった。これらの動物の両方が、ＡＡＶ１カプシドに対してベースラインＮＡｂを有していた。発現は、ＣＳＦ及び血清の両方について用量依存的であった（図３２）。

【0261】

ＣＳＦにおいて、最大のヒトＰＧＲＮ発現は、１／３の中用量動物（１．０×１０^１３ＧＣ、群３）及び２／３高用量動物（３．０×１０^１３ＧＣ、群４）において、１４日目に観察された。低用量群の全ての動物（３．０×１０^１２ＧＣ、群２、Ｎ＝３／３）は、２８日目に最大発現に達し、中用量群の２／３の動物（１．０×１０^１３ＧＣ、群３）、及び高用量群１／３の動物（３．０×１０^１３ＧＣ、群４）も同様に達した。最大発現では、低用量群（５．２７ｎｇ／ｍＬ）と比較して、中用量群（１１．５８ｎｇ／ｍＬ）及び高用量群（１１．７７ｎｇ／ｍＬ）で、約２倍高いヒトＰＧＲＮの平均濃度が観察された（図３２）。

【0262】

血清では、両方とも２８日目に最大の発現を示した低用量群の１匹の動物（３．０×１０^１２ＧＣ、動物１７１２２９、群２）及び中用量群の１匹の動物（１．０×１０^１３ＧＣ、動物１７１１１８、群３）を除いて、ほとんどの動物で１４日目に最大のヒトＰＧＲ
Ｎ発現が観察された。低用量（３．０×１０^１２ＧＣ、群２）、中用量（１．０×１０^１３ＧＣ、群３）、及び高用量（３．０×１０^１３ＧＣ、群４）群において、それぞれ１０９．０３ｎｇ／ｍＬ、２４０．１２ｎｇ／ｍＬ、及び４３０．５２ｎｇ／ｍＬの平均最大発現レベルが観察された（図３３）。

【0263】

６０日目までに、ＣＳＦ及び血清中のヒトＰＧＲＮ発現は、全てのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置動物において最大レベルから低下した（図３４）。この低下は９０日目を通して続き、全てのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置動物のＣＳＦ及び血清の両方での抗ヒトＰＧＲＮ抗体の出現と相関した（図３４）。

【0264】

ベクターゲノムは、９０日目に、脳、脊髄、ＤＲＧ、肝臓、及び脾臓において高レベルで検出された（図３５）。ＣＮＳ組織において検出されたベクターゲノムの量は、概して、用量依存性であることが観察された。１匹の低用量動物（３．０×１０^１２ＧＣ、動物１７１２５０、群２）及び１匹の高用量動物（３．０×１０^１３ＧＣ、動物１７１２４６、群４）におけるＡＡＶ１カプシドに対するベースラインＮＡｂの存在は、他の全てのＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）処置ＮＨＰと比較して、肝臓へのベクター分布の実質的な低減と相関した。

【0265】

ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）投与は、関連する中枢及び末梢軸索（９／９の動物）と一緒にＤＲＧ及びＴＲＧ感覚ニューロン（８／９の動物）無症候性変性をもたらした。これらの病変の重症度は、最小～軽度であった。これらの所見は、中用量群及び高用量群においてより重度の病変の傾向を示した。脊髄及び末梢神経の線維症において最も重度の軸索損失を示した２匹の動物のうち、高用量群の１匹の動物（動物１７１２０９、３．０×１０^１３ＧＣ［３．３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳］）は、９０日目に、両側の正中神経の感覚活動電位振幅の著しい低減を示した。全ての用量群における無症候性感覚ニューロン病変の存在に起因して、無観察有害作用レベル（ＮＯＡＥＬ）は定義されなかった。評価された最も高い用量（３．０×１０^１３ＧＣ）は、最大耐容用量（ＭＴＤ）とみなされた。

【0266】

実施例８：ヒト試験
ＧＲＮ遺伝子の変異によって引き起こされる成人発症性神経変性疾患（前頭側頭ジメンチア（ｄｉｍｅｎｔｉａ）を含む）を有する患者におけるＰＢＦＴ０２）の単回投与の第１のヒト（ＦＩＨ）第１ｂ相用量漸増研究を実施する（以下の表にサマライズした）。ＰＢＦＴ０２は、ＧＲＮ遺伝子を置き換えるように設計されている。現在、ＧＲＮハプロ不全によって引き起こされる成人発症性神経変性の疾患を修飾する療法は存在しない。疾病管理は、疾患に関連する行動、認知、及び／又は運動の症状を低減することを目的とした支持ケア及び認可外治療を含む。したがって、この疾患スペクトルは、満たされていない医療ニーズの高い領域を表している。このＦＩＨ試験は、安全性及び耐容性を評価し、有効性に関する予備データを収集する。

【表9-1】

【表9-2】

【表9-3】

【表9-4】

【表9-5】

【表9-6】

【0267】

標的集団：ＦＴＤ及びＧＲＮハプロ不全を有する軽度の症候性対象
ホモ接合性ＧＲＮ変異を有する対象は、１０代及び若年成人に影響を与えるリソソーム蓄積症であるバッテン病のより重症で早期発症表現型を有することが記載されており、したがって、本研究から除外される。ＧＲＮハプロ不全は、成人発症性神経変性をもたらす。これらの患者の間では、疾患の期間は、典型的には、４．９～１０．０年の範囲である。ＦＴＤにおける症状発症の平均年齢範囲は、５４．８～６９．５歳であり、７０歳までに疾患の浸透率は９０％を超える。患者は、普遍的に進行性の経過を示す。発症からの生存期間は平均８年であり、６８±８年の平均寿命をもたらす。

【0268】

７５歳の最大年齢は、生存の合理的な可能性を有する患者を含めることを確実にし、これにより、提案されたエンドポイントの分析が可能になり、認知障害に寄与する併存疾患が検出されない可能性のある高齢の患者を含める可能性を低減する。

【0269】

現在の臨床試験研究集団は、３５以上７５歳以下の年齢の病原性ヘテロ接合型ＧＲＮ変異を有する早期ＦＴＤ（ＣＤＲプラスＮＡＣＣ ＦＴＬＤの全体的スコア＝０．５～１．０）を有する対象からなる。

【0270】

この集団は、治療を受けるときにすでに疾患の初期臨床症状を有しており、試験の経過中に最初の臨床症候群の進行及び他のＦＴＤ症状の発症を経験することが予想されるという点で、良好なリスク／利益プロファイルを提供すると考えられる。しかし、彼らはまだ進行及び広範囲の神経変性を有していないため、ＦＴＬＤ病態生理学の進行を著しく遅らせるか、又は停止させる介入から利益を得る。

【0271】

ＦＴＬＤにおける神経変性を遅らせるためのＣＮＳプログラニュリンレベルを増加させるための疾患メカニズム及び根拠
ＧＲＮは、分泌糖タンパク質であるＰＧＲＮタンパク質産物（以下、ＰＧＲＮと称する）をコードする。ＧＲＮは、神経系を含む全身の広範囲の組織で発現される。ＰＧＲＮの正確な分子機能は不明であるが、新たな証拠は、成人発症性神経変性に対するその病原性の寄与がリソソームにおける重要な役割に関連することを示唆している。

【0272】

ＰＧＲＮは最近、リソソームの酸性化を促進し、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）を含むリソソームプロテアーゼのシャペロンとして機能することが見出された。これらの活動に沿って、ＧＲＮハプロ不全を有する患者は、リポフスチンと呼ばれる自己蛍光材料のリソソーム蓄積を示す。同様に、少なくとも１２個の異なる遺伝性障害が、ニューロンのリソソーム中のリポフスチンの異常な蓄積を引き起こす。これら全ての疾患は、必須リソソームタンパク質の欠乏によって引き起こされ、全てが神経変性をもたらす。組織学的に同一のリソソーム蓄積病変は、進行性神経変性疾患である神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）（バッテン病としても知られる）を伴う人生のずっと早い時期に存在するホモ接合性機能喪失ＧＲＮ変異を有する患者においても同様に観察される。累積的に、これらの観察結果は、中央ＰＧＲＮを増加させることが、リソソーム病理を修正し、ＦＴＬＤにおける神経変性を遅らせる可能性があることを示唆している。

【0273】

●ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）での遺伝子療法についての根拠
ＧＲＮハプロ不全によって引き起こされる成人発症性神経変性は、分泌タンパク質の欠乏に起因する単一遺伝性疾患であるため、遺伝子療法の魅力的な候補である。新しく合成されたＰＧＲＮは、トランスゴルジネットワークからリソソームに直接輸送され得るが、ソーティリン又はマンノース－６－リン酸受容体を介して他の細胞に分泌及び取り込まれ得、その後、リソソームに輸送される。ＰＧＲＮの分泌の重要な結果は、ニューロンにおけるＧｒｎの選択的欠失後のトランスジェニックマウスにおいて実証されている。全ての細胞型においてＰＧＲＮタンパク質を完全に欠くＧｒｎ－／－動物とは対照的に、単独のニューロンにおけるＰＧＲＮ発現の切除は、ニューロンリポフスチン蓄積をもたらさず、他の中枢神経系（ＣＮＳ）細胞が、ＰＧＲＮ欠損ニューロンにＰＧＲＮタンパク質を供給することを示す。したがって、ＣＮＳの細胞のサブセットでＰＧＲＮを過剰発現させることは、周囲の細胞によって取り込まれ得る分泌されたタンパク質のデポを提供し、交差補正の可能性をもたらし得る。研究動物におけるＡＡＶベクターの髄腔内（ＩＴ）送達は、ＣＮＳ全体で細胞を形質導入することが示されており、この経路は、ＧＲＮハプロ不全によって引き起こされるＦＴＬＤの治療に魅力的なアプローチとなっている。更に、Ｇｒｎ－／－ノックアウトマウス及びＮＨＰの両方における本発明者らの非臨床研究は、ＩＴ ＡＡＶ送達が、Ｇｒｎ－／－ノックアウトマウスにおけるＰＧＲＮ欠乏に関連するリソソーム蓄積病変の分解に加えて、ＣＳＦ及びＣＮＳにおける堅牢なＰＧＲＮ発現をもたらすことを実証する。

【0274】

研究の根拠
ＦＴＬＤは、プログラニュリン（ＧＲＮ）遺伝子を含む５つの既知の疾患遺伝子のうちの１つの変異によって引き起こされる。ＧＲＮにおける全ての病理学的変異は、機能の損失を引き起こし、プログラニュリン（ＰＧＮ）ｍＲＮＡレベル（約５０％）及びタンパク質レベル（約３３％）の低減をもたらすことが確認されるか、又は予測される。ＧＲＮハプロ不全によって引き起こされるＦＴＬＤは、分泌タンパク質の欠乏に起因する単一遺伝性疾患であるため、遺伝子療法の魅力的な候補である。新しく合成されたＰＧＲＮは、トランスゴルジネットワークからリソソームに直接輸送され得るが、ソーティリン又はマンノース－６－リン酸受容体を介して他の細胞に分泌及び取り込まれ得、その後、リソソームに輸送される。研究動物におけるＡＡＶベクターのＩＴ送達は、ＣＮＳ全体で細胞を形質導入することが示されており、この経路は、ＦＴＬＤ－ＧＲＮハプロ不全の治療に魅力的なアプローチとなっている。更に、Ｇｒｎ－／－ノックアウトマウス及びＮＨＰの両方における本発明者らの非臨床研究は、ＩＴ ＡＡＶ送達が、Ｇｒｎ－／－ノックアウトマウスにおけるＣＳＦ及びＣＮＳにおける堅牢なＰＧＲＮ発現及びＰＧＲＮ欠乏に関連するリソソーム蓄積病変の分解をもたらすことを実証する。

【0275】

研究の目的
一次目的
単回ＩＣＭ用量の投与後のＰＢＦＴ０２の全体的な安全性及び耐容性を評価すること。二次目的
●単回ＩＣＭ投与後の、ＣＳＦ及び血漿プログラニュリンレベル並びに他の疾患バイオマーカーに対するＰＢＦＴ０２の薬物動態効果の耐久性を評価すること。
●神経変性の神経画像化、流体及び眼のバイオマーカーで評価されたＦＴＬＤの進行に対するＰＢＦＴ０２での処置の効果を評価すること。
●ＦＴＤの臨床進行（認知機能、行動、言語及び運動の徴候及び症状）に対するＰＢＦＴ０２での処置の効果を評価すること。
●生存に対するＰＢＦＴ０２の影響を評価すること。

【0276】

研究設計及び根拠
研究設計の概要
これは、早期ＦＴＤ及びＧＲＮハプロ不全を有する３５歳以上７５歳以下の対象において、５年間にわたって単回ＩＣＭ注入として投与されたＰＢＦＴ０２の安全性、耐容性、及び薬力学を評価する、第１ｂ、ＦＩＨ、非盲検、単群、多施設用量漸増研究である。安全性、耐容性、薬力学及び臨床有効性を２年間にわたって評価し、全ての対象をＰＢＦＴ０２の投与後５年間にわたって、安全性及び耐容性、薬物動態、並びに臨床転帰の長期評価について追跡する。

【0277】

本試験は、約－３５日目から－７日目までの各潜在的な対象の適格性を決定するためのスクリーニング段階からなる。適格性の確認後、対象は、脳及び脊髄磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ＣＳＦ採取のための腰部穿刺、採血、採尿、バイタルサイン、ＥＣＧ、身体検査、神経学的検査、Ｔｏｔａｌ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ Ｓｃｏｒｅ－Ｎｕｒｓｅ（ＴＮＳｎ）、神経伝導試験、及び臨床評価を含み得るベースライン評価を受ける。ベースライン評価は、ＰＢＦＴ０２の投与前の、－１４日目～０日目（含む）に行われる。治療段階では、対象は１日目の朝に入院する。対象は、１日目に単回ＩＣＭ用量のＰＢＦＴ０２を受け、観察のために投薬後、所定の時間病院に留まる。その後の試験来院は、投薬後の最初の２年間は６ヶ月ごとを含む、投薬後の所定の時間（３０、６０、９０日）に行われる。長期フォローアップ来院は、更に３年間、１２ヶ月ごとの頻度で、用量後５年間にわたって行われる。

【0278】

本研究は、各々、単回用量のＰＢＦＴ０２を単回ＩＣＭ注入として投与された最大５人の対象の最大３つのコホートからなる。第１のコホートでは、各対象は、順次登録され、各対象間の６０日間の安全性観察期間を伴って、最も低い計画用量を投与される。事前に定義された安全審査トリガーが観察されない場合、第１のコホートの全ての対象がＰＢＦＴ０２を投与されてから９０日後に、第１のコホートの全ての利用可能なデータはＩｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄａｔａ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＤＭＣ）によって審査される。

【0279】

より高い用量に進むことが決定された場合、最大５人の対象が順次登録される場合があり、各対象間に６０日間の安全性観察期間があるより高い用量を受ける場合がある。第２のコホートの利用可能な全てのデータは、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄａｔａ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＤＭＣ）によって審査される。

【0280】

最大実行可能な用量に達していない場合、任意選択の第３のコホートが順次登録される場合があり、各対象間に６０日間の安全性観察期間がある第２のコホートよりも高い用量で投薬される場合がある。

【0281】

情報提供者（例えば、親類、パートナー、又は友人）はまた、この研究の不可欠な参加者でもある（組み入れ基準を参照）。情報提供者は、臨床スケールに対する対象情報を提供し、ＡＥの報告に役立つ場合がある。この研究において情報提供者が果たす重要な役割のために、第２のバックアップ情報提供者も、好ましくは０日目の前に特定される必要がある。

【0282】

安全審査トリガー
治験薬の投与後、各対象は、有害事象について所定の時間観察される。有害事象の有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）は、独立した審査及び倫理委員会によって要求される有害事象（ＡＥ）の重症度の等級付けに使用される。これらは、治験責任医師がグレード４又はグレード５とみなす任意の有害事象及び重篤な有害事象、又は治験薬関連とみなされるグレード３の事象である。投与後いつでも、これらの事象が発生した場合、ＩＤＭＣは事象を審査し、研究を継続するべきか又は停止するべきかを決定する必要がある。

【0283】

治験薬関連とは見なされないグレード４以上の事象が生じる場合、又は技術的な問題がある場合、その事象は臨床研究医療チームによって審査され、ＩＤＭＣは審査のために招集される。

【0284】

このサイクルは、コホートの最後の対象が登録され、審査されるまで続く。

【0285】

コホートの最後の対象からの９０日間のデータが利用可能な場合、コホートからの全ての利用可能なデータが要約され、用量漸増を進めるべきか、研究を中止すべきかを決定するためにＩＤＭＣに提示される。

【0286】

用量を漸増させる決定がなされた場合、対象は、より高い用量のＰＢＦＴ０２を受けるためにコホート２に登録される。登録は、低用量について上述したのと同じ手順に従う。以前のように、最後の対象からのデータが利用可能な場合、コホートからの全ての利用可能なデータが要約され、研究を進めるべきか、研究を中止すべきかを決定するためにＩＤＭＣに提示される。

【0287】

ＰＢＦＴ０２が第２のコホートにおいて良好に耐容され、より高い用量が実行可能である場合、安全性及び耐容性を評価するために、連続した対象の間に少なくとも６０日間、第３のコホートを登録され得る場合がある。

【0288】

ＳＲＴを引き起こす事象に加えて、以下の基準のうちのいずれかが満たされている場合、研究は中止され、新しい対象は登録されない。
●治験責任医師によって評価された治験薬又はＩＣＭ注入手順に関連すると見なされる任意の死亡
●治験責任医師によって評価された治験薬又はＩＣＭ注入手順に関連すると考えられるＣＮＳ出血、脳卒中、又は急性麻痺
Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄａｔａ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅは、これらの有害事象を審査し、研究の継続的な実施及び対象の登録に関する決定を下す。

【0289】

用量漸増基準
用量漸増は、安全性（臨床及び実験室評価を含む）、耐容性、及びＣＳＦ ＰＧＲＮレベルへの影響の評価に基づいている。評価は、各対象が各コホートに登録された後に実施される。各コホートの後に要約評価も実施される。安全審査トリガー基準が確立され、正式なＩｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄａｔａ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの会合が臨時に開催される時期が決定される。そうでなければ、急性の安全性の問題が見られない場合、各コホートの要約データが利用可能であるときに定期的に予定されているＩｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄａｔａ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの会合が開催され、より高い用量に進むかどうかのガイダンスを提供することができる。安全性の考慮に加えて、ＣＳＦプログラニュリンレベルの評価を実施して、ＰＢＦＴ０２が所望の薬力学的効果を有する程度を決定する。

【0290】

研究設計の根拠
盲検、対照、研究相、治療群
これは非盲検用量漸増研究設計である。各コホートは、積極的な治療を受けている最大５人の対象からなる。研究の最初の２年間の部分は、一次エンドポイント及び臨床及びバイオマーカー疾患進行の潜在的ないくつかの二次エンドポイントに対する効果を評価するのに十分である。追加の３年間の延長相は、長期的な安全性の評価に適している。当初、２つのコホート、低用量コホート及び高用量コホートが計画されている。ＰＢＦＴ０２が第２の用量コホートにおいて良好に忍容され、用量を増加させることが可能である場合、第３のコホートは、第２のコホートよりも高い用量で登録される場合がある。これは、バイオマーカー（ＣＳＦ ＰＧＲＮレベル、及び神経変性の他の流体及び神経画像化バイオマーカーを含む）に対する安全性、耐容性、及び治療効果に基づいて、最適な用量を特定することを可能にする。

【0291】

研究集団
この研究の標的集団は、３５歳以上７５歳以下の、ＦＴＤの軽度の徴候及び症状（ＣＤＲプラスＮＡＣＣ ＦＴＬＤの全体的スコア０．５～１．０によって定義される）、並びに低いＣＳＦ ＰＧＲＮレベル及びヘテロ接合病原性ＧＲＮ変異の遺伝子バイオマーカー証拠（ＡＤ＆ＦＤＭＤＢによって分類される）によって確認されるＧＲＮハプロ不全を有する対象からなるＦＴＬＤの治療の評価を混乱させる可能性のあるアルツハイマー病又は他のＣＮＳ障害と一致する臨床病歴又はバイオマーカープロファイルを有する対象は除外される。

【0292】

遺伝子療法として、ＰＢＦＴ０２は、ＧＲＮの１つ又は両方のコピーにおける病原性変異によって引き起こされる神経変性疾患に罹患する患者に利益をもたらす可能性を有する。既知のＧＲＮ変異は、ヒトゲノム変異協会によって確立されたガイドラインに従って、ＡＤ及びＦＴＬＤ患者両方の全ての既知の変異及び非病原性コード変異をカタログ化するＡＤ＆ＦＴＤＭＤＢによって病原性として定義される。この突然変異解釈へのアプローチは、概して、これらの患者を評価する臨床医によって受け入れられており、ＦＴＬＤ疾患
の専門家との議論の中で本研究に採用された。

【0293】

ＧＲＮハプロ不全によって引き起こされる成人発症性神経変性の初期臨床症状は、不均一である。この不均一性は、疾患の進行にともなって現れる追加の症状とともに様々な初期臨床症状をもたらす。ＦＴＤの患者は、典型的には、最初の症状の発症後に急速に低下するため、本研究は、行動変化及び実行機能障害が顕著な初期症状である行動バリアント（ｂｖＦＴＤ）、及び言語の理解及び／又は産生が損なわれる原発性進行性失語（ｐｐａＦＴＤ）を含む、主要な臨床ＦＴＤ表現型のいずれかを呈する対象を登録する。ＰＰＡは、特定の言語欠陥に従って、非流暢型ＰＰＡ（ｎｆｖＰＰＡ）及び意味型ＰＰＡ（ｓｖＰＰＡ）に更に分割され、いずれも登録の対象となる。ＰＰＡの第３のサブタイプであるロゴペニック型ｌＰＰＡは、アルツハイマー病のバイオマーカーが同時ＡＤと一致しない場合にも登録の対象となる。

【0294】

ＦＴＤスペクトルには、進行性核上性麻痺症候群、皮質基底症候群（ＣＢＳ）、及びＡＬＳを含む運動障害表現型も含まれる。この比較的小規模な第１相研究における疾患の臨床経過の均質性を確保するために、運動症状のみを有する対象は、登録に適格ではない。しかしながら、これらの運動障害の併発症状を有するｂｖＦＴＤ又はｐｐａＦＴＤのいずれかを有する対象はこの研究に含まれる。

【0295】

適格な対象は、ＣＤＲプラスＮＡＣＣ ＦＴＬＤ尺度でスクリーニングされ、それは、記憶、見当識、判断力及び問題解決、社会的状況、家庭状況及び趣味、個人医療、行動、及び言語を含む、全てのＦＴＤ臨床症状にわたる症状の重症度を評価するように設計されている。０．５～１．０のＣＤＲプラスＮＡＣＣ ＦＴＬＤの全体的スコア（軽度の症状のある患者を含む）は、遺伝子療法の利益が最大化される可能性が高い神経変性の初期段階で、症状のある患者の選択が可能になる。この初期段階で患者を登録することもまた、その後の疾患進行の変化又は安定化、及び追加の症状の発症の遅延の検出が可能にする。

【0296】

対象へのリスクを最小限に抑えるため、本研究では、臨床手順に禁忌がある、病原性が予測されるＧＲＮ変異がない、又は神経系若しくは免疫系に関連する疾患を有する、患者を除外する。

【0297】

更に、本研究には、がんに関連するリスクを最小限に抑える除外基準が含まれている。ＰＧＲＮの過剰発現が様々な腫瘍で観察されているため、がん関連の除外基準が提案されている。ＰＧＲＮの過剰発現は、がんの進行を促進すると仮定されている。したがって、悪性腫瘍（限局性皮膚がんを除く）、又は遺伝性がん症候群の既往歴を有する患者は除外する。しかし、以前に悪性腫瘍を成功裏に治療し、再発を除外するための十分なフォローアップを有する対象は、治験責任医師の裁量で含まれる場合がある。加えて、この遺伝子療法は、生理学的レベルを上回るＰＧＲＮの発現をもたらさないことが予想される。ＦＩＨ試験で使用される用量よりも高い非ヒト霊長類研究におけるＰＢＦＴ０２の用量を使用すると、ＰＢＦＴ０２のＩＣＭ投与後、ＰＧＲＮが正常に近いレベルで血清中に発現することが見出された。ＦＩＨ試験に登録された対象は、典型的には、ベースライン循環ＰＧＲＮレベルが正常値の約３０％であったため、循環血清ＰＧＲＮレベルは、せいぜい正常値に回復するであろうと予想される。したがって、ＰＧＲＮへの異常に高い全身曝露は予想されない。

【0298】

ＣＮＳのＰＧＲＮレベルは、いくつかの脳領域では正常より高い可能性があるため、患者は、潜在的なＣＮＳ腫瘍の兆候について厳密にモニタリングされている。対象の血液検査は、ＣＢＣパネルを介してモニタリングされ、対象は、以下の表に指定されるフォローアップの時点で、毎年５年間、脳及び脊髄のガドリニウム造影剤を用いたＭＲＩを介してモニタリングされる。ガドリニウム保持に関連する潜在的なリスクは認識されているが、
ＧＲＮ媒介性腫瘍の潜在的なリスクとバランスが取れていると考えられる。

【0299】

用量選択（ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２））
ＰＢＦＴ０２は、ＧＲＮ遺伝子を置き換え、中央ＰＧＲＮレベルを上昇させるように設計される。ＧＲＮハプロ不全によって引き起こされるＦＴＬＤは、分泌タンパク質の欠乏に起因する単一遺伝性疾患であるため、遺伝子療法の魅力的な候補である。新しく合成されたＰＧＲＮは、トランスゴルジネットワークからリソソームに直接輸送され得るが、ソーティリン又はマンノース－６－リン酸受容体を介して他の細胞に分泌及び取り込まれ得、その後、リソソームに輸送される。ＰＧＲＮの分泌の重要な結果は、ニューロンにおけるＧｒｎの選択的欠失後のトランスジェニックマウスにおいて実証されている。全ての細胞型においてＰＧＲＮタンパク質を完全に欠くＧｒｎ－／－動物とは対照的に、単独のニューロンにおけるＰＧＲＮ発現の切除は、ニューロンリポフスチン蓄積をもたらさず、他の中枢神経系（ＣＮＳ）細胞が、ＰＧＲＮ欠損ニューロンにタンパク質を供給することを示す。したがって、ＣＮＳの細胞のサブセットでＰＧＲＮを過剰発現させることは、周囲の細胞によって取り込まれ得る分泌されたタンパク質のデポを提供し、交差補正の可能性をもたらし得る。

【0300】

開始ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）用量レベルは、ＧＬＰ ＮＨＰ毒性研究及びマウス疾患モデル研究から決定される（実施例３に記載）。このＦＩＨ用量漸増研究は、最大３つの用量コホートからなる。試験される全ての用量は、治療的利益を付与する可能性を有する。容量は、バイオマーカー（ＣＳＦ ＰＧＲＮレベル、及び神経変性の他の流体及び神経画像化バイオマーカーを含む）に対する安全性、耐容性、及び治療効果に基づいて、最適な用量を特定することを可能にするために、順次投与されるであろう（低用量、続いて高用量）。

【0301】

エンドポイント
安全性及び耐容性を主要エンドポイントとして測定することに加えて、二次的有効性のエンドポイントを、最近の文献に基づき、前頭側頭型認知症の研究を専門とする一流の臨床医と協議して、この研究のために選択した。これらのエンドポイントは、その後の登録用試験のための適切なエンドポイントを特定することを目的として、臨床転帰及び疾患バイオマーカーを追跡する。以下の表に示される時点と同様に、所定の時点を測定する。これらの時点を選択して、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ＲＢＧ（ＰＢＦＴ０２）の安全性及び耐容性の完全な評価を容易にした。臨床有効性測定値の評価を可能にするために、ＧＲＮ患者における疾患進行の速度を考慮して、それらも選択された。対象は、ＰＢＦＴ０２投与後合計５年間、安全性及び有効性について引き続きモニタリングされ、それは草案“ＦＤＡ Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍ
Ｆｏｌｌｏｗ－Ｕｐ ａｆｔｅｒ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”（Ｊｕｌｙ ２０１８）に準拠している。

【0302】

バイオマーカー
以下の表は、この研究で評価されるバイオマーカーの概要及びその全体的な目的を示している。このリストは網羅的なものではなく、科学分野が進歩するにつれて進化するであろう。これらのバイオマーカーは、本プロトコルの後続のセクションに詳細に記載されている。プロトコルで事前に指定されたものに加えて、追加のバイオマーカー分析のためのインフォームドコンセントが得られる。

【表10】

【0303】

ＧＲＮハプロ不全の決定
対象は、医療記録の一部である検証されたアッセイの結果に基づいて、又は本研究のスクリーニング手順の一部として臨床現場によって実施される遺伝子型決定に基づいて、ＧＲＮ変異保持者であることを文書化される必要がある。

【0304】

アルツハイマー病の病理学を有する対象を除外するバイオマーカー
アルツハイマー病は、ＦＴＤと誤解される場合があるか、又は－ＦＴＤを有する患者の併存疾患として存在する場合がある。したがって、本研究の結果の解釈に対するＡＤの混同効果を避けるために、アルツハイマー病のバイオマーカー証拠を有する対象を除外する。対象は、除外基準に概説されるように、検証されたアッセイを使用して、アルツハイマー病の存在について評価される。

【0305】

ベースライン及び治療後のＣＳＦ及び血漿ＰＧＲＮレベルの決定
ＣＳＦ中及び血漿中のＰＧＲＮタンパク質のレベルは、ＡＡＶ形質導入の指標として、ベースライン（選択のため）及びその後の治療後に測定される。ＰＧＲＮレベルは、ＰＢＦＴ０２の投与後、患者において増加することが予想される。中でも、他の尺度、ＣＳＦ及び血漿ＰＧＲＮレベルの治療関連の増加は、この試験における用量漸増及びその後の試験の用量選択に通知することができる。

【0306】

神経変性の流体バイオマーカーの評価
流体バイオマーカーは、神経変性、及び関連する神経炎症及びミクログリア活性に対する潜在的な治療効果を評価するために採取される。ニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）、総タウ（Ｔ－タウ）、リン酸化タウ（Ｐ－タウ）のＣＳＦレベルの治療関連変化も、研究の経過中に追跡されるが、これらのエンドポイントに対する疾患安定化の予測される影
響は不明である。

【0307】

ＮｆＬ
ニューロフィラメントは、軸索細胞骨格の構造タンパク質である。ＦＴＤでは、ＮｆＬサブユニットのＣＳＦ濃度は、アルツハイマー病（ＡＤ）と比較して高いことが示されている。高濃度のＣＳＦ ＮｆＬは、ＦＴＤにおける生存期間の短縮と関連しており、これは、疾患の強度／重症度のマーカーであることを示唆している。ＮｆＬの血漿中濃度はＣＳＦと強く相関しており、最近のデータは、ＮｆＬの血清又は血漿レベルがＦＴＤで増加し、疾患強度を反映し、磁気共鳴画像法での将来の臨床的悪化及び脳容積損失を予測することを示している。ＮｆＬは、神経細胞の損失又は損傷の一般的な指標と考えられる。

【0308】

ＧＦＡＰ
ＧＦＡＰの血漿レベルにおけるグリア線維性酸性タンパク質処置関連の変化は、研究の経過を通じて追跡されるであろう。ＧＦＡＰは、ＦＴＤの既知の病理学的過程であるアストログリオーシスの尺度である。ＧＦＡＰ濃度の上昇は、ＦＴＤ－ＧＲＮに固有のものであり、症状発症直前にレベルが上昇する可能性があることから、ＧＦＡＰが発症に近い重要なマーカーである可能性が示唆される（Ｈｅｌｌｅｒら、２０２０）。

【0309】

タウ
タウ及びリン酸化タウは、ＡＤ、ＰＤ、及びいくつかの形態のＦＴＤサブタイプで見られる病理に関連し、概して、サブグループに関係なく、神経損傷又は変性に関連する（基礎となるＡＤ病理に関連するロゴペニック型原発性進行性失語［ｌｖＰＰＡ］を除く）。ＦＴＤ患者は、ＣＳＦにおいて、Ｔ－タウに対するＰ－タウの比率が低いようであった。

【0310】

網膜リポフスチン
網膜変性は、ヘテロ接合ＧＲＮ変異保持者において生じ、表現型はまた、Ｇｒｎノックアウトマウスにおいても観察される。Ｇｒｎノックアウトマウスはまた、中枢神経系全体にリポフスチンとして知られる自家蛍光凝集体の顕著な沈着物を発達させる。非侵襲的網膜画像化は、ヘテロ接合ＧＲＮ変異保持者における網膜リポフスチン症を検出することができる。眼コヒーレンス断層撮影（ＯＣＴ）を本研究で使用して、スクリーニング及び以下の表に概説されるものと同様の時点で、網膜リポフスチンを評価する。

【0311】

神経変性の神経画像化バイオマーカーの評価
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
ＧＲＮハプロ不全の患者は、主に前頭葉及び側頭葉皮質に神経細胞の損失を示し、全脳容積は典型的には、症状発現後に年に３．４％の割合で減少する。したがって、この研究は、Ｔ１加重ＭＲＩを利用して、標的集団における全ての臨床症状にわたって最も一般的に影響を受ける脳領域である脳体積、白質の完全性、及び中前頭皮質及び頭頂領域の厚さの変化を追跡する。ＰＢＦＴ０２の投与は、経時的にこれらの領域の萎縮の低下を安定させることが期待される。萎縮罹患脳領域は様々な臨床症状の間で異なることがあり、これらのデータは、ＧＲＮ関連の神経変性の自然史の理解を助けることができるため、他の皮質又は皮質下脳領域からの追加の探索的データが収集される。ＭＲＩは、スクリーニング中及び以下の表に概説されるものと同様の時点で実施される。

【0312】

フルオロデオキシグルコース陽電子放出断層撮影（ＦＤＧ ＰＥＴ）
ＦＴＤでは、代謝低下は、典型的には、前側頭葉及び前頭葉、より具体的には、両側の内側皮質、下側皮質及び上側皮質、前帯状皮質、左側の側頭皮質、及び右側の頭頂皮質及び尾状核に見られる。通常、代謝低下はＭＲＩの萎縮と相関するが、多くの場合、先行する。ＦＴＤについては、ＦＤＧ ＰＥＴスキャンの感度は４７％～９０％の範囲であり、特異度は６８％～９８％の範囲である。経時的に異常の増加が見られ得、疾患進行のバイ
オマーカーとしてのＦＤＧ ＰＥＴの潜在的有用性を示す。ＰＢＦＴ０２の投与は、経時的にこれらの領域で観察される代謝低下を安定させることが期待される。ＦＤＧ ＰＥＴ画像化は、スクリーニング中、及び以下の表に概説されるものと同様の時点で実施される。

【0313】

ＥＥＧ／誘発応答電位
事象関連ＥＥＧ活性の振幅又は供給源活性は、感覚及び認知運動情報プロセス中の視床皮質及び上昇活動システムの同期／非同期及び結合／分離のメカニズムを調べ、軽度の認知障害及びアルツハイマー病及び介入の進行性効果を、特に早期の疾患段階で明らかにし、他の形態の認知症に有用であり得る。

【0314】

臨床転帰尺度
臨床進行、生活の質、及び機能に対するＰＢＦＴ０２の効果を評価する。標的患者集団によって示される表現型が不均一であるために、臨床症状の範囲にわたって発現される症状の進行を捕捉する尺度が用いられる。これらの有効性評価は、経時的な症状の低下少を安定させるＰＢＦＴ０２の能力を捉えることを意図している。様々な臨床症状を有する患者の様々な臨床パラメータにわたる更なる低下の速度に関するデータは、適切なエンドポイントの選択に更に情報を提供し、登録用試験の臨床的に有意義な変化を定義するために使用される。

【0315】

行動、言語、及び認知の評価
ＣＤＲプラスＮＡＣＣ ＦＴＬＤ ＳＢ
ＣＤＲプラスＮＡＣＣ ＦＴＬＤは、ＡＤスペクトラム障害の重症度を評価するために歴史的に使用される古典的な臨床認知症評価（ＣＤＲ）尺度の拡張版である。この評価には、ＣＤＲのオリジナルな６つのドメイン（記憶、見当識、判断力と問題解決、社会適応、家庭状況と趣味、介護状況）が含まれる。それはまた、より高い感度でＦＴＬＤスペクトル患者の減少の検出を可能にする、言語及び行動の２つの追加のドメインを含む。０の全体的な評価スコアは、正常な行動又は言語を示し０．５、１、２、又は３のスコアは、軽度から重度の障害を示す。ＣＤＲプラスＮＡＣＣ ＦＴＬＤ評価項目合計（ＣＤＲプラスＮＡＣＣ ＦＴＬＤ ｓｂ）スコアは、個々のドメインの合計を表し、個々のドメイン及び複数のドメインにわたる疾患の重症度の進行を決定するために使用される。

【0316】

前頭葉機能検査（ＦＡＢ）
ＦＡＢは、実行機能を評価するための簡易評価である。これは、軽度の痴呆患者（ＭＭＳＥ＞２４）において特に有用である。この評価は、６部で構成され、認知、運動、及び行動の領域に対処する。総スコアは１８、又はより高いスコアは、より良好なパフォーマンスを示す。

【0317】

前頭側頭型認知症評価尺度（ＦＲＳ）
ＦＲＳは、疾患の進行を測定する。これは、認知症関連の行動及び障害を測定するために設計された２つの古い機器から選ばれた３０個のプローブの質問の項目分析によって構築された。統計的に定義された閾値を計算して、重症度のレベルを定義した。ＦＲＳは、経時的なＦＴＤの疾患進行の差異を検出する。この簡単な面接は、主介護者とともに実施され、３０項目からなり、「起こらない」、「時々起こる」、又は「常に起こる」に分類される。次いで、パーセンテージスコアが計算され、ロジットスコア（ｌｏｇｉｔ ｓｃｏｒｅ）、そして最終的には、重症度スコアに変換される。重症度スコアは、「非常に軽度」から「最重度」までの範囲である。

【0318】

ボストン命名試験（ＢＮＴ）
ＢＮＴは、対立命名能力を評価するために幅広く使用されるツールである。ＢＮＴは、
ベッドからそろばんまでの語彙頻度に応じて順序付けられたオブジェクトの６０個の白黒線画からなる。描かれた刺激の順序は、ノミネート障害のある個人が低周波オブジェクトの命名に大きな困難を抱えることが多いという発見を考慮に入れている。

【0319】

多言語命名試験（ＭＩＮＴ）
３２個の項目のＭＩＮＴは、もともと４つの言語（英語、スペイン語、ヘブライ語、中国語）で命名をテストするために開発されたＢＮＴの代替品であり、言語間のアイテムの難易度を同等にするように注意してある。ＭＩＮＴは、アルツハイマー病における障害の命名に感度が高い。

【0320】

数字スパン試験
番号スパン試験は、個人のワーキングメモリ数記憶容量を測定するために使用され、実行機能の尺度である。参加者には一連の数字（例えば、「８、３、４」）が提示され、すぐにそれらを繰り返さなければならない。これを成功させると、より長いリストが与えられる（例えば、「９、２、４、０」）。人が覚えていることができる最長のリストの長さは、その人の数字スパンである。参加者は、前方の数スパンのタスクで与えられた順序で数値を入力するように求められるが、後方も数スパンタスクでは、参加者は数値の順序を逆にする必要がある。

【0321】

意味流暢性
意味流暢性は、実行機能及び意味記憶へのアクセスの広く受け入れられた尺度である。タスクのスコアリングは、単一のカテゴリから可能な限り多くの単語を６０秒で口頭で命名することで構成される。意味流暢性のパフォーマンスは、ＡＤを有するヒトと健常な高齢者とを区別するために成功裏に使用されている。

【0322】

発話流暢性（音素テスト）
単語の流暢性は、意味及び文字単語リスト生成テスト並びに２つの文字生成タスクで測定される。各タスクには６０秒かかり、正しい項目が合計さる。エラー及びルール違反に注意されたい。

【0323】

追跡作製試験（口頭適応）
追跡作製試験の口頭版は、書かれた追跡作製試験の動作及び視覚的要求なしに連続的なセットシフトの評価を提供する神経心理学的尺度である。もともとは、書かれた追跡作製試験の口頭アナログとして機能することを目的としていたが、口頭版は身体的制限のある患者を評価する手段を提供する。これは、実行機能の臨床的尺度である。

【0324】

ベンソンコンプレックスフィギュアコピー（１０分間リコール）
ベンソンコンプレックスフィギュアは、建設能力のテストである。図のエレメントは、存在及び配置についてスコア化される。再現は、保持記憶を測定するために遅延後に試験される。

【0325】

カリフォルニア州言語学習テスト（ＣＶＬＴ）、第２版
エピソードの言語学習及び記憶の尺度としてのＣＶＬＴの構築妥当性は、神経心理学の文献でかなりの支持を得ている。この尺度は、４つの学習試験にわたって提示された９単語のリストを使用して、最近のエピソード記憶を評価する。３０秒間の気を散らすタスクの後に、即座に自由なリコールが行われる。自由リコール及び意味論的手がかりのリコール試験は、１０分間の遅延後に実施される。

【0326】

モントリオール認知評価（ＭｏＣＡ）
ＭｏＣＡは、軽度の認知機能障害のための迅速なスクリーニング機器として設計された
１ページ３０点の試験である。それは異なる認知領域：注意及び集中、実行機能、記憶、言語、視覚構造スキル、概念的思考、計算、並びに見当識を評価する。

【0327】

生活の質及び機能的活動の評価
機能活動質問票（ＦＡＱ）
ＦＡＱは、バランスの取れた食事の準備及び個人の財政管理など、日常生活の道具的な活動を測定する。日常生活の基本的な活動と比較してより高い認知能力を必要とする日常生活の器用な活動で、機能的な変化が認知症プロセスの初期に注目されるので、このツールは、経時的なこれらの機能的な変化をモニタリングするのに有用である。

【0328】

日常生活のシュワブ及びイングランド活動（ＳＥＡＤＬ）
シュワブ及びイングランド尺度は、日常生活能力の活動を０～１００％の尺度で評価し、１００％が完全に独立しており、障害はない。この尺度は、日常生活の活動における独立性及びパフォーマンスの有用な世界的な尺度である。

【0329】

重症度の臨床全体的印象
ＣＧＩ－Ｓは、同じ診断を受けた患者に対する臨床医の過去の経験と比較して、評価時の患者の疾患の重症度に対する臨床医の印象を評価するために広く使用される簡潔な器具である。ＣＧＩ－Ｓは研究者に１つの質問をする：「この特定の集団でのあなたの総臨床経験を考慮して、患者は現時点でどの程度病気か？」これは以下の７点スケールで評価される：１＝正常、まったく病気ではない；２＝境界病気；３＝軽度の病気；４＝中等度の病気；５＝著しい病気；６＝重度の病気；７＝最も重度の病気の患者の間。

【0330】

臨床全般印象度変化
ＣＧＩ－Ｃは、３部の簡潔で広く使用されている評価のうちの１つである。これは、３つの項目で構成され、臨床医によって評価される。ＣＧＩ－Ｃは、改善が完全に治療によるものであるかどうかにかかわらず、研究への登録から始まり、１（非常に改善された）から７（非常に悪化した）の範囲の７段階で評価される。

【0331】

ケンブリッジ行動目録－改訂版（ＣＢＩ－Ｒ）
ＣＢＩ－Ｒは、複数の行動領域（すなわち、記憶及び見当識、日常的なスキル、自己治療、異常な行動、気分、信念、食習慣、睡眠、ステレオタイプ及び運動行動、及び動機付け）を評価する４５項目で構成された代理アンケートであり、各項目は５段階で評価される（０＝なし、１＝月に数回、２＝週に数回、３＝毎日、４＝常に）。このアンケートは、ｂｖＦＴＤ及びＡＤをパーキンソン病及びハンチントン病から区別するために使用されている。

【0332】

その他の評価
Ｃ－ＳＳＲＳ
コロンビア自殺重症度評価尺度（Ｃ－ＳＳＲＳ）を使用して自殺リスクを評価する。Ｃ－ＳＳＲＳは、自殺念慮、念慮の強度、及び自殺行動を測定する３部構成の尺度である。この評価の結果は、尺度から直接取得される自殺行動致死率評価、自殺念慮スコア、及び自殺念慮強度評価で構成される。０を超える念慮スコアは、評価ガイドラインに基づいて、介入の必要性を示し得る。強度評価は、０～２５の範囲であり、０は、自殺念慮の支持なしを表す。

【0333】

安全性評価
処置段階では、以下の表に列挙されるものと同様の時点で、定期的な安全性評価が実施される。これらの安全性評価には、ＡＥ及び併用薬のモニタリング、臨床検査の決定（血液学、臨床化学、尿検査）のための血液試料の採取、バイタルサインの測定、身体検査及
び神経学的検査、神経伝導試験、並びにＴＮＳｎが含まれるが、これらに限定されない。

【0334】

対象へのリスクを最小限に抑えるため、本研究では、臨床手順に禁忌がある、病原性が予測されるＧＲＮ変異がない、又は神経系若しくは免疫系に関連する疾患を有する、患者を除外する。

【0335】

ＣＮＳのＰＧＲＮレベルは、いくつかの脳領域では正常より高い可能性があるため、患者は、潜在的なＣＮＳ腫瘍の兆候について厳密にモニタリングされている。対象の血液検査は、ＣＢＣパネルを介してモニタリングされ、対象は、以下の表に指定されるフォローアップの時点で、毎年５年間、脳及び脊髄のガドリニウム造影剤を用いたＭＲＩを介してモニタリングされる。ガドリニウム保持に関連する潜在的なリスクは認識されているが、ＧＲＮ媒介性腫瘍の潜在的なリスクとバランスが取れていると考えられる。

【0336】

研究集団及び参加の期間
研究参加の期間
各対象の研究期間は６０ヶ月である（安全性及び有効性のための中間解析：２４ヶ月）。

【0337】

標的集団
標的集団は、ＧＲＮハプロ不全によって引き起こされる成人発症性神経変性と診断された、３５歳以上７５歳以下の患者である。

【0338】

対象及び現地の数
米国以外のグローバル現地では、最大１５人の成人対象が登録される。対象は、施設への提示中、又は病院／医師の紹介を通じて特定される。地方、地域、及び国家の対象擁護群のパートナーシップも、研究の意識を高めるために利用されている。

【0339】

選択基準
１．登録時に３５歳以上、７５歳以下
２．以下の基準の１つによる原因としてのＧＲＮ変異の確認（スクリーニング中又は検証されたアッセイを用いた文書化された既往歴に基づく）：
●Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＡＣＭＧ）が発行したガイドラインに従って、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ ＆ Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＡＤ＆ＦＴＤＭＤＢ）によって病原性に分類された突然変異
●ＧＲＮ以外の変異が疾患の存在を説明することができるという証拠はないはずである。
３．可能性のあるｂｖＦＴＤ又はＰＰＡ（非流動型［ｎｆｖＰＰＡ］、意味型［ｓｖＰＰＡ］、又はロゴペニック型［ｌＰＰＡ］）の現在の国際的なコンセンサス診断基準に従った臨床及び画像診断：
●Ｒａｓｃｏｖｓｋｙ（２０１１）基準によるｂｖＦＴＤの可能性
Ａ．以下の行動／認知症状（Ａ～Ｆ）のうち３つが存在する必要がある。確認には、症状が単一又はまれな事象ではなく、持続的又は再発することが必要である。
Ａ．早期＊行動的脱阻害［以下の症状（Ａ．１～Ａ．３）のうちの１つが存在しなければならない］：Ａ．１．社会的に不適切な行動
Ａ．２．マナー又は礼儀の喪失
Ａ．３．衝動的、発疹、又は不注意な行動
Ｂ．早期無関心又は慣性［以下の症状（Ｂ．１～Ｂ．２）のうちの１つが存在する必要がある］：Ｂ．１．無関心
Ｂ．２．慣性
Ｃ．同情又は共感の早期喪失［以下の症状のうち１つ（Ｃ．１～Ｃ．２）が存在する必要がある］：Ｃ．１．他人のニーズ及び感情に対する応答の低下
Ｃ．２．社会的関心、相互関係、又は個人的な暖かさの低下
Ｄ．早期の忍耐的、ステレオタイプ的又は強迫的／儀式的行動［以下の症状（Ｄ．１～Ｄ．３）のうちの１つが存在する必要がある］：Ｄ．１．単純な反復動作
Ｄ．２．複雑な、強迫的な、又は儀式的な行動
Ｄ．３．スピーチのステレオタイプ
Ｅ．口唇傾向及び食事の変化［以下の症状（Ｅ．１～Ｅ．３）のうちの１つが存在する必要がある］：
Ｅ．１．食事の好みの変化
Ｅ．２．過食、アルコール又はタバコの消費の増加
Ｅ．３．口腔探索又は食べられないものの消費
Ｆ．神経心理学的プロファイル：記憶及び視覚空間機能の相対的な節約を伴う実行／世代欠陥［以下の症状（Ｆ．１～Ｆ．３）の全てが存在する必要がある］：Ｆ．１．実行タスクの欠陥
Ｆ．２．エピソード記憶の相対的な保存
Ｆ．３．視覚空間スキルの相対的な節約
Ｂ．著しい機能低下を示す（医療専門家の報告による、又は臨床認知症評価尺度又は機能活動アンケートスコアによって証明される）
Ｃ．ｂｖＦＴＤと一致する画像化結果［以下のうちの１つ（Ｃ．１～Ｃ．２）が存在する必要がある］：
Ｃ．１．ＭＲＩにおける前頭及び／又は前側頭の萎縮
Ｃ．２．ＰＥＴの前頭及び／又は前側頭の代謝低下
●Ｇｏｒｎｏ－Ｔｅｍｐｉｎｉ（２０１１）基準による原発性進行性失語症のバリアントＭｅｓｕｌａｍ（２００１）による基準に基づくＰＰＡの診断
１．最も顕著な臨床的特徴は、言語の困難である
２．これらの欠陥は、日常生活活動の障害の主な原因である。
３．失語症は、症状の発症時及び疾患の初期段階で最も顕著な欠陥であるべきである
ＰＰＡ診断が確立されたら、ＰＰＡバリアントを分類するために以下を使用すべきである：
Ａ．非流動性型ＰＰＡ［ｎｆｖＰＰＡ］
－次の２つのコア機能のうち、少なくとも１つが存在する必要がある：
１．言語産生におけるアグラマティズム
２．一貫性のないスピーチエラー及び歪みを伴う努力的で停止するスピーチ（スピーチのアプラクシア）
－以下の３つの他の機能のうち少なくとも２つが存在する必要がある：
１．構文的に複雑な文章の理解の障害
２．割愛単一語の理解
３．割愛物体の知識
－画像化では、以下の結果の１つ以上を表示する必要がある。
ａ．ＭＲＩ上の優勢な左後部前頭島萎縮又は
ｂ．ＰＥＴ上の優勢な左後部前頭島代謝低下
Ｂ．意味型ＰＰＡ［ｓｖＰＰＡ］
－以下のコア機能の両方が存在する必要がある：
１．対立の命名の障害
２．単語理解の障害
－以下の他の診断機能のうち少なくとも３つが存在する必要がある：
１．障害のある物体の知識、特に低頻度又は低慣れ度の項目
２．表面失読症又は書字障害
３．割愛された繰り返し
４．スピーチ制作（文法及び運動スピーチ）
－画像化では、以下の結果の１つ以上を表示する必要がある。
ａ．ＭＲＩ上の優勢な前側頭葉萎縮
ｂ．ＰＥＴにおける優勢な前側頭代謝低下
Ｃ．意味型［ｌＰＰＡ］）
－以下のコア機能の両方が存在する必要がある：
１．自発的な発話と命名における単語検索の障害
２．文章やフレーズの繰り返しが損なわれている
－以下の他の機能のうち少なくとも３つが存在する必要がある：
１．自発的なスピーチ及び命名におけるスピーチ（音声学的）エラー
２．単語の理解及びオブジェクトの知識を割愛
３．割愛された運動スピーチ
４．率直な非文法主義の欠如
画像には、以下の結果のうちの少なくとも１つが表示されている必要がある：
ａ．ＭＲＩでの優勢な左後周囲萎縮又は頭頂萎縮
ｂ．ＰＥＴ上の優勢な左後周囲又は頭頂部の代謝低下
４．ｂｖＦＴＤ又はｐｐａＦＴＤ（基準＃２に定義）のいずれかを有する対象で、進行性核上性麻痺症候群（ＰＳＰ）、皮質基底症候群（ＣＢＳ）、又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の併発症状を有する対象が含まれる（運動症状のみの対象は登録資格がない）。
５．少なくとも毎週、個人的に話をしたり、対象を見たりする信頼できる情報提供者を雇う
６．ＣＤＲプラスＮＡＣＣ ＦＴＬＤの全体的スコア０．５又は１．０
７．低プログラニュリンレベル：歴史的に低いＣＳＦプログラニュリンレベルが確認されていない対象を、血漿プログラニュリンレベルについてスクリーニングする。血漿プログラニュリンレベルが低い場合、対象を登録してもよい。
８．ＮｆＬの上昇：歴史的に高いＮｆＬ ＣＳＦレベルが確認されていない対象を、血漿ＮｆＬレベルについてスクリーニングする。血漿中ＮｆＬレベルが上昇している場合、対象を登録してもよい。

【0340】

除外基準
１．アルツハイマー病のバイオマーカー証拠。アルツハイマー病のバイオマーカーの証拠を有することが以前に同定されていない、又は過去１２ヶ月以内にアルツハイマー病のバイオマーカーについて試験されていない対象を、血漿ｐタウ１８１のレベルについてスクリーニングする。血漿ｐタウ１８１がＡＤ病理と一致する場合、対象は除外される。
２．ローゼン修飾ハチンスキー虚血スケールスコア＞７
３．ＭＲＩのＦａｚｅｋａｓスコア＞１
４．症候性参加者の症状を合理的に説明できる構造的脳病変（例えば、腫瘍、皮質梗塞）の既知の存在
５．ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２又はＡＰＰにおけるアルツハイマー病を引き起こす変異の既知の存在。
６．コルサコフ脳症の既往歴、重度のアルコール依存症（認知症の発症から５年以内）、頻繁なアルコール又は他の物質中毒。
７．Ｂ１２欠乏症の既往歴又は検査室での検査を通じた証拠は、フォローアップ検査（ホモシステイン及びメチルマロン酸）がその値が生理学的に有意でないことを示す場合を除き、除外される。Ｂ１２補充で治療された対象は、疾患／治療の安定性及びコンプライアンスを確保するために、治験責任医師による診断及び治療歴記録の審査後、治験依頼者の医療モニターによる書面による同意とともに登録され得る。
８．甲状腺機能低下症（ＴＳＨ＞正常の１５０％）の既往歴又は検査による証拠
９．腎不全（クレアチニン＞２）
１０．肝不全（ＡＬＴ又はＡＳＴ＞正常の２倍）
１１．酸素補給を必要とする呼吸不全、
１２．大きな合流性白質病変
１３．心血管疾患の悪化などの重大な全身性医学的疾患
１４．完全な同意が提供できない、又は同意を提供できる適切な連絡先を有する法的権限のある介護者がいない。
１５．ＭＲＩ、ＩＣＭ宗達、又はＬＰへの禁忌（例えば、局所感染、血小板減少症、凝固障害、頭蓋内圧の上昇（占拠性病変による［ＩＣＰ］）。
１６．ＡＤ＆ＦＤＭＤＢにおける「病原性ではない」、「良性バリアントである可能性が高い」、又は「良性バリアント」としてのＧＲＮ変異の分類。
１７．免疫不全患者。
１８．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はＣ型肝炎の試験結果が陽性の患者であること。
１９．ＧＲＮ変異に起因しない他の悪性腫瘍又は慢性ＣＮＳ障害。
２０．治験責任医師の意見では、免疫抑制薬又は全身性コルチコステロイドなど、患者にリスクをもたらす可能性のある薬物。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、スクリーニング前の３０日間安定した用量で使用され、試験期間中同じ用量で維持されることに同意がある場合、使用が許容される。
２１．悪性腫瘍（限局性皮膚癌を除く）、又は遺伝性癌症候群の既往歴。以前に悪性腫瘍を成功裏に治療し、再発を除外するための十分なフォローアップ（腫瘍学者の意見に基づく）を有する対象は、治験委託者又は被指名人による議論及び承認の後に含めることができる。
２２．治験責任医師の見解では、認知症の他の原因、神経梅毒、水頭症、脳卒中、小血管虚血性疾患、制御されていない甲状腺機能不全、又はビタミン欠乏症を含む、ＧＲＮ変異とは無関係の認知障害を引き起こす可能性のある任意の併発症
２３．妊娠可能な女性の場合、スクリーニング来院時の血清妊娠検査で陽性尿が確認された場合、治験薬投与前の１日目の血清の結果で陽性尿が確認された場合、又は治験中に追加の妊娠検査を行う意思がない場合。
２４．男性及び妊娠可能な女性の場合、医学的に許容される二重バリア避妊法（殺精子剤とともにコンドーム／ダイアフラムの使用など）を使用する意思がない、又はスクリーニング日からベクター投与後５２週間まで禁欲に従事する意思がない。
２５．治験責任医師の見解では、対象を過度のリスクにさらす可能性があるか、治験薬の評価を妨害し得るか、又は対象の安全性若しくは研究結果の解釈を妨害し得る、任意の状態（例えば、任意の病歴、任意の現在の疾患の証拠、身体検査における任意の所見、又は任意の検査異常）を有する。
２６．登録の３０日以内に入院が必要な任意の急性の病気

【0341】

禁止事項及び制限事項
潜在的な対象は、参加資格を得るために、研究の進行中に以下の禁止事項及び制限事項を順守する意思があり、順守することができなければならない：
●研究の完了（すなわち、最終フォローアップ来院）後、少なくとも９０日間は献血を避ける。
●併用薬に関連する禁止又は制限について。
●アルコール含有製品は、治験参加施設への来院予定時刻の２４時間前からは使用できない。

【0342】

投約量及び投与
投薬量
大槽内注入
ＣＮＳを治療するための静脈内（ＩＶ）全身ＡＡＶ投与の限界を回避するために、本研究では、大槽への髄腔内（ＩＴ）ベクター送達を使用する。ベクター分散のためのビヒク
ルとしてのＣＳＦを使用して、ＩＴ投与は、単一の低侵襲手順でＣＮＳ全体にわたって導入遺伝子送達を達成する可能性を有する。動物研究は、血液脳関門を通過する必要性を排除することによって、ＩＴ送達は、ＩＶアプローチのものよりもはるかに低いベクター用量で、実質的により効率的なＣＮＳ遺伝子導入をもたらすことを実証している。腰部穿刺（ＬＰ）及び大槽内（ＩＣＭ）を含む、ＣＳＦアクセスのための様々な経路が存在する。研究は、ＬＰを介したＣＳＦへのＡＡＶベクターの送達は、大槽のレベルでのベクターの注入と比較して、脳及び脊髄の細胞を形質導入する際の効率が少なくとも１０倍低いことが見出されたことを示している。

【0343】

研究前及び併用薬
スクリーニング開始の３０日前までに投与された全ての研究前療法は、スクリーニング時に記録する必要がある。

【0344】

全ての併用療法は、最初のＩＣＦへの署名から開始して、研究終了来院（フォローアップ来院）まで、研究全体を通して記録される必要がある。具体的には、治験薬とは異なる治療（ワクチン、ビタミン、ハーブサプリメントを含む処方薬又は市販薬、電気神経刺激、鍼治療、特別な食事、運動療法などの非薬理療法）は、対象のソースレコードに記録し、ｅＣＲＦに入力する必要がある。

【0345】

併用療法は、新規又は悪化する有害事象と併せて、事象が解消するまで、この時間を超えて記録する必要がある。対象は、新しい薬剤又はサプリメントを開始する前、及び現在の併用薬剤又はサプリメントの投与量を変更する前に、治験責任医師又は現場の適切な治験担当者に相談するよう指示されている。

【0346】

ＡＣｈＥ阻害剤、メマンチン、ベンゾジアゼピン、及び抗うつ薬などの特別な関心のある特定の併用薬物の使用に関する情報は、用量及び投与経路、投与日、及び使用適応症を含む、ｅＣＲＦに別々に採取される。

【0347】

治験依頼者は、禁止された治療法が投与された場合には、事前に（又はその後できるだけ早く）通知されなければならない。

【0348】

ＡＤに関連する症状の進行は、治験責任医師の意見では加速すると考えられる場合を除き、ＡＥとして記録されるべきではない。しかしながら、いずれの対症療法も、研究終了時の来院（フォローアップ来院）までは文書化される。

【0349】

有効な既存の療法の修正は、対象を研究に登録するという明示的な目的のために行われるべきではない。

【0350】

高齢者集団で頻繁に発生する可能性のある安定した医学的状態の治療は、対象が試験薬の投与開始前に少なくとも６週間安定した薬剤を服用している場合に許可される。対象は、可能であれば、研究期間中、安定した薬物療法を継続すべきである。医薬品の変更又は追加は、臨床的に適応がある場合にのみ許可され、ｅＣＲＦの併用医薬品セクションに文書化する必要がある。

【0351】

認知障害の治療を目的とした認知エンハンサー（例えば、ＡＣｈＥ阻害剤）又は薬物による治療は、研究への登録時に除外される。研究中に認知機能低下を経験した対象は、承認されたＡＤ療法を受けることが許可されているが、認知能力に影響を与えると予想されるこれらの新しい療法又は治療適応（例えば、ＡＣｈＥ阻害剤又はメマンチン）は、医学的必要性に基づく治験依頼者の明示的な許可なしに許可されていない。認知に影響を与えると予想される治療の用量を開始、停止、又は変更する前に、治験依頼者の医療モニター
に連絡して、対象が研究を継続すべきかどうか、及び臨床的アウトカム測定を実施すべきかどうかを判断する必要がある。

【0352】

研究中、ベンゾジアゼピンの継続的（毎日）使用は許可されていないが、短時間作用型ベンゾジアゼピンの時折の摂取は許可されている。対象がベンゾジアゼピンによる断続的な治療を必要とする場合、ベンゾジアゼピンの最後の用量からの間隔及びその後の認知評価は、その化合物の少なくとも４半減期又は２４時間のいずれか長い方でなければならない。任意の来院時に、又は任意の短期使用のために、研究処置（例えば、ＭＲＩ、ＰＥＴスキャン、腰部穿刺）のために鎮静剤が投与される場合、全ての認知評価は、鎮静剤の投与後、少なくとも２４時間、又は４半減期のいずれか長い方の前に投与され、完了されなければならない。

【0353】

中枢神経系（ＣＮＳ）の機能に影響を及ぼす他の併用薬は、投与量が研究全体を通して変わらず維持することを意図している場合に投与され得る。これらの化合物の用量は、無作為化の６週間前から一定のままであるべきである。認知評価への影響を避けるために、以下の事項が適用される。ただし、医療上の必要性が文書化されている場合を除き、治験依頼者の医療モニターと議論されている。
●無作為化の前に少なくとも６週間、ＣＮＳ機能に影響を及ぼす薬物の安定用量を受けた対象は、研究中にこの薬物の投与を停止すべきではなく、この薬物の用量を変更すべきではない。
●対象は、研究期間中にＣＮＳ機能に影響を与える薬物を追加してはならない。

【0354】

治験中にＣＮＳ機能に影響を及ぼす治療の予期せぬ開始、停止、又は安定用量への変更があった場合、治験依頼者の医療モニターに連絡して、対象が治験を継続すべきかどうか、及び臨床転帰測定を実施すべきかどうかを判断する必要がある。

【0355】

ＣＳＦ試料採取に関しては、本節で別途指定されていない限り、併用療法に関連する局所部位の指示に従う。患者に処方される可能性のある精神作用薬の併用について話し合う。

【0356】

研究手順
実施された評価
以下のセクションで特定された研究手順は、以下の表に記載されているものと同様に、指示された試験来院時の全ての対象に必要である。

【0357】

書面によるインフォームドコンセント
患者／介護者は、スクリーニング評価を含む任意の研究関連手順の前に、ＩＲＢ／ＩＥＣ承認のインフォームド・コンセント・フォーム（ＩＣＦ）に署名する必要がある。

【0358】

既往歴及び身体検査
対象の人口統計学的データ、過去の既往歴、過去及び併用薬、身長及び体重は、治験責任医師によって採取及び記録される。完全な身体検査及び完全な神経学的検査（強度、感覚、調整、及び反射試験を含む）は、ベースライン来院時に医師によって実施される。有害事象、又は薬物療法を含む既往歴の変更について議論される。

【0359】

血漿及び血清バイオマーカー
同意後、血漿、血清、ＤＮＡ、及びＲＮＡのために血液を採取する。標準安全性ラボは、現場研究所で、又は現場と契約した地方研究所で実施され、現場スタッフが研究所の値をｅＣＲＦに入力する。中央研究所で処理するための試料は、現地で保管され、研究運用マニュアルに記載されているように、現場によってドライアイスでバッチ出荷される。採
血は、各臨床試験来院時に経験豊富な研究スタッフによって標準的な手順を使用して実施される。採血には断食は必要ない。対象が全身麻酔を受けている場合、痛み及び不快感を軽減するために、その間に採血を行ってもよい。

【0360】

神経伝導試験（ＮＣＳ）
神経伝導試験（ＮＣＳ）には、研究マニュアルで指定された標準的な表面記録技術を使用した、２つの感覚神経（腕の１つ及び脚の１つ）の遠位セグメントにおける神経伝導速度及び振幅の測定が含まれる。ＮＣＳは、ベースライン及び事前に指定された時点で評価される。各時点で、変動を最小限に抑えるために、繰り返しの尺度が用いられる。感覚神経伝導速度は、毎秒メートルで測定され、応答の開始時に記録される。感覚神経振幅は、ベースラインからピークまでのマイクロボルトで測定される。全てのＮＣＳは、研究全体を通して、個々の対象について、体の同じ側で実施され、皮膚の温度は慎重に記録され、維持される。臨床現場は、集中型中核研究所の専門家によってＮＣＳで訓練され、認定されており、中核研究所及び治験依頼者による継続的な審査を介してＮＣＳデータの品質管理が保証される。

【0361】

心電図（ＥＣＧ）
ＥＣＧは、心臓の電気的活動を記録し、異常を検出するために、対象の胸、腕、及び脚に取り付けられた電極を使用した試験である。バイタルサインが測定される来院時では、まず、ＥＣＧを実施する必要がある。

【0362】

脳の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
ＭＲＩは、以下の表に列挙されているものと同様に、対象の同意を得て、指示された試験来院時に対象に対して実施される。

【0363】

Ｔ１加重ＭＲＩ画像は、疾患進行及び安全性モニタリングのためのガドリニウム対照の両方を評価するために得られる。

【0364】

腰部穿刺及びＣＳＦバイオマーカー
ＣＳＦは、以下の表に列挙されているものと同様に、対象の同意後に、指示された試験来院時に、全ての対象について採取される。この処置は、腰椎穿刺を伴う。既往歴の最初の議論中に、対象が現在抗血小板薬を服用しているかどうかが決定される。対象が抗血小板薬を服用している場合、その来院のために腰椎穿刺は実施されない。

【0365】

腰部穿刺は、現場スタッフの資格のあるメンバーによって、標準的な病院の手順に従って実施される。腰部穿刺の前に、全ての適切な検査前処置を実施する。腰椎穿刺及びＣＳＦ採取は、全身麻酔下で行われ得る。

【0366】

標準的なＣＳＦ化学検査及び細胞診検査は、現場研究所で、又は現場と契約した地方研究所で実施され、現場スタッフが研究所の値をｅＣＲＦに入力する。中央研究所で処理するための試料は、現地で保管され、ＦＴＤ特異的バイオマーカー試験（ＰＧＲＮタンパク質、ベクターＤＮＡ、ベクター中和抗体）及び将来の研究（同意が得られた場合）のために、現場スタッフによってドライアイス上でバッチ出荷される。

【0367】

全ての治験固有の検体採取、処理、及び保管手順は、治験運営マニュアルで治験実施施設に提供されている。ＣＳＦは、示された試験来院時に対象について採取される。これらの来院の各々で、対象が現在血液シンナーを服用しているかどうかが判定される。対象が抗血小板薬を服用している場合、その来院の場合の腰部穿刺は実施されない。

【0368】

Ｔｏｔａｌ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ Ｓｃｏｒｅ－Ｎｕｒｓｅ
Ｔｏｔａｌ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ Ｓｃｏｒｅ－Ｎｕｒｓｅには、治療が発生した感覚、運動、及び自律神経の症状について対象者に標的を絞った質問、並びに定量的感覚検査（振動及びピン）が含まれる。振動試験はＲｙｄｅｌ－Ｓｅｉｆｆｅｒ Ｃ６４ Ｇｒａｄｕａｔｅｄ Ｔｕｎｉｎｇ Ｆｏｒｋを使用して実施し、ピン試験はＮｅｕｒｏＰｅｎを使用して実施する。臨床現場でＴＮＳｎを実行する個人は、医学の背景及び患者ケアの経験を持っている必要がある（例えば、看護師、医師のアシスタント、医師－非神経科医、経験豊富な臨床技術者）。彼らは、患者に対処し、臨床データを採取することに快適でなければならない。ＴＮＳｎを実行する全てのサイト担当者は、ＮｅｕｒｏＰｅｎ及びＲｙｄｅｌ－Ｓｅｉｆｆｅｒ Ｃ６４ Ｇｒａｄｕａｔｅｄ Ｔｕｎｉｎｇ Ｆｏｒｋの両方を使用して、治験依頼者が開発したトレーニングモジュール及びトレーニングの文書化を完了する必要がある。

【0369】

対象の離脱及び早期終了
対象は、治療に影響を及ぼすことなく、いつでも研究を中止することができる。彼らはまた、遵守研究手順又は来院スケジュールの欠如のために、治験責任医師の裁量で試験を中止される場合がある。治験責任医師はまた、治験計画に違反した対象を、安全性に関連する理由、又は管理上の理由で対象を保護するために取り下げることができる。該当する場合、各対象が研究を完了したかどうか、及び早期中止／終了の理由がｅＣＲＦに文書化されている。継続的な参加を妨げる任意の治験薬による治療を開始したために早期に終了した対象を含め、早期に中止した対象は、全ての研究終了手順が実施される最終的な研究終了臨床来院（来院７２０日目）に出席するためにあらゆる努力を払う必要がある。早期終了の理由が死亡である場合、これはｅＣＲＦに記録され、採取され、対象の情報源に保管される必要がある。

【0370】

研究を中止した、又は早期に終了した対象から採取されたデータは、中止又は終了の時点まで、分析に使用され続ける。介護者は、早期終了後に中央ラボ又はバイオバンクに出荷されたラボ試料の更なるテストの同意を撤回することができる。ただし、既に識別されていない試料／試料データは、データセットから除外することはできない。

【表11】

【表12】

【表13】

【0371】

（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、
数値識別子＜２２３＞の下のフリーテキストを含む配列に関して提供される。

【表14-1】

【表14-2】

【表14-3】

【0372】

本明細書に引用される全ての文書は、参照により本明細書に援用される。「２１－９６５８ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名づけられた本明細書とともに提出された配列表、並びにその中の配列及びテキストは、参照により援用される。２０１９年２月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８０９，３２９号、２０１９年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／９２３，８１２号、２０２０年２月２日に出願された米国仮特許出願第６２／９６９，１０８号、２０２０年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／０７０，６３９号、及び２０２０年２月２１日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０／１９１４９号が参照により本明細書に援用される。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図23E】

【図23F】

【図24】

【図25-1】

【図25-2】

【図25-3】

【図26A】

【図26B】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【配列表】

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【国際調査報告】