特表 2023-540161 メチル化状態の検出

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-22

(54)【発明の名称】メチル化状態の検出

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20230914BHJP

   C12Q 1/6816 20180101ALI20230914BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20230914BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12Q1/6816 Z ZNA

C12Q1/686 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2022580318

(86)(22)【出願日】2021-06-29

(85)【翻訳文提出日】2023-02-09

(86)【国際出願番号】 EP2021067880

(87)【国際公開番号】W WO2022002958

(87)【国際公開日】2022-01-06

(31)【優先権主張番号】20182947.0

(32)【優先日】2020-06-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521493329

【氏名又は名称】ペンタベース エーピーエス

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ベンディクセン，カミラ コールディング

(72)【発明者】

【氏名】ピーターセン，ラスムス コーフォード

(72)【発明者】

【氏名】クリステンセン，ウルフ ベック

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS36

(57)【要約】

本発明は、目的の標的核酸配列における少なくとも１つの目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）のエピジェネティック修飾状態を決定するための方法に関する。本発明は、疎水性ヌクレオチドを含む特定のオリゴヌクレオチドが、修飾されていない標的核酸と比較して、エピジェネティック修飾された標的核酸に対する融解温度に有意差を有するという発見に基づく。方法は、例えば、診断において複数の用途を有する。本発明は、そのような方法で使用するためのオリゴヌクレオチド、特にベースプライマーも提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

エピジェネティック修飾状態、例えば、目的の非修飾標的核酸配列中の少なくとも１つの目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）のメチル化状態を決定する方法であって、前記標的核酸配列は、前記ＮＯＩを含む標的アンカー配列を含み、前記方法が、
ａ．アンカー配列（Ａｎ）を含むオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、前記アンカー配列は、前記標的アンカー配列に対して少なくとも５０％相補的な配列であり、前記アンカー配列は、前記ＮＯＩに対して相補的な前記ヌクレオチドとそのすぐ５’側にあるヌクレオチドとの間に位置する少なくとも１つの疎水性ヌクレオチド（Ｈ）を含む、ステップと、
ｂ．前記ＮＯＩがメチル化などの修飾をされていない場合、前記オリゴヌクレオチドと前記目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも高い温度で、前記オリゴヌクレオチドを前記目的の標的核酸とインキュベートするステップと、
ｃ．前記オリゴヌクレオチドが前記目的の標的核酸にアニールするか否かを検出するステップと、
それにより、前記エピジェネティック修飾状態、例えば前記メチル化状態を決定するステップと、を含み、
ｉ．ここで、前記疎水性ヌクレオチド（Ｈ）は、以下の構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
を有し、式中、
Ｘは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体、または核酸もしくは核酸類似体の骨格に組み込むことができる骨格モノマー単位であり、
Ｑは、ワトソン・クリック水素結合に参加していないインターカレーターであり；
Ｙは、前記ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体または骨格モノマー単位と前記インターカレーターとを連結するリンカー部分であり、
ｉｉ．前記オリゴヌクレオチドは、構造５’－Ａｎ－Ｌｐ－Ｓｔ－３’を有し、式中、
Ａｎは、アンカー配列であり；
Ｌｐは、前記目的の標的核酸配列に対して相補的でないループ配列であり、前記ループ配列は、ループ構造もしくはステム構造などの突出構造を形成することができる単一の核酸配列からなるか、またはループ構造もしくはステム構造などの突出構造を形成することができる複合体を形成するために、少なくとも部分的に互いにハイブリダイズすることができる２つ以上の核酸配列からなり；
Ｓｔは、標的スターター配列にハイブリダイズすることができるスターター配列であり、ここで、前記標的スターター配列は、前記標的アンカー配列に対して５’に位置する前記標的核酸配列の配列である、
方法。

【請求項2】

前記目的の標的核酸が、ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記目的の標的核酸が、ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記方法を実施する前に、前記目的の非修飾核酸配列が、バイサルファイト変換、制限酵素消化、またはＴＥＴ酵素変換を含む処理に供されていない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＮＯＩが、シトシンである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

Ａ．
ｉ．前記目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合に、前記疎水性ヌクレオチド（複数可）を含む前記オリゴヌクレオチドであって、前記目的の核酸配列が、少なくとも１つのメチル化シトシンなどの少なくとも１つのメチル化ＮＯＩを含む、オリゴヌクレオチドと；
ｉｉ．前記目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合に、前記疎水性ヌクレオチド（複数可）を含む前記オリゴヌクレオチドであって、前記目的の核酸配列が、メチル化シトシンなどのメチル化ＮＯＩを含まない、オリゴヌクレオチドと；
の融解温度の絶対差、および
Ｂ．
ｉ．Ａ．の前記オリゴヌクレオチドと同一であるが、前記目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合、前記疎水性ヌクレオチド（複数可）を含まないオリゴヌクレオチドであって、前記目的の核酸配列が、Ａ．ｉ．と同数のメチル化ＮＯＩ、例えばＡ．ｉ．と同数のメチル化シトシンを含む、オリゴヌクレオチドと；
ｉｉ．Ａ．の前記オリゴヌクレオチドと同一であるが、前記目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合、前記疎水性ヌクレオチド（複数可）を含まないオリゴヌクレオチドであって、前記目的の核酸配列が、メチル化シトシンなどのメチル化ＮＯＩを含まない、オリゴヌクレオチドと；
の融解温度の絶対差が、
前記目的の標的核酸配列においてメチル化されていない代わりに、メチル化されているシトシンなどのＮＯＩあたり、少なくとも０．５０℃、例えば少なくとも０．７５℃、好ましくは少なくとも１．０℃の差であり、ここで前記差は、Ａ－Ｂであり、前記差は、正の差であり、ここで、前記融解温度は、０．０２Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．０２Ｍ ＮａＣｌ、および２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＭ緩衝液中で測定される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

ｉ．前記目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合に、前記疎水性ヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチドであって、前記目的の核酸配列が、少なくとも１つのメチル化シトシンなどの少なくとも１つのメチル化ＮＯＩを含む、オリゴヌクレオチドと；
ｉｉ．前記目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合に、前記疎水性ヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチドであって、前記目的の核酸配列が、メチル化シトシンなどのメチル化ＮＯＩを含まない、オリゴヌクレオチドと；
の融解温度間の絶対差が、
前記目的の標的核酸配列においてメチル化されていない代わりに、メチル化されているシトシンなどのＮＯＩあたり、少なくとも１．６℃、例えば少なくとも１．８℃、例えば少なくとも２．０℃、例えば少なくとも２．２℃、好ましくは少なくとも２．４℃であり、前記融解温度は、０．０２Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．０２Ｍ ＮａＣｌ、および２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＭ緩衝液中で測定される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記アンカー配列が、配列－Ｎ－Ｈ－Ｇ－を含み、式中、－Ｇ－が、前記目的のシトシンに対して相補的であり、－Ｎ－が、Ｃ、Ｇ、ＡおよびＴからなる群から選択され、前記目的のシトシンの隣接ヌクレオチドに対して相補的である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記シトシンが、ＣｐＧ部位にあり、前記アンカー配列が、配列－Ｃ－Ｈ－Ｇ－を含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記アンカー配列が、少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも４つ、例えば１～１０の範囲、例えば２～１０の範囲、例えば３～１０の範囲、例えば４～１０の範囲の疎水性ヌクレオチド（Ｈ）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記アンカー配列が、少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも４つ、例えば２～１０の範囲、例えば２～５の範囲、例えば３～５の範囲、例えば４～５の範囲の－Ｎ－Ｈ－Ｇ－配列を含み、ここで、各Ｎは、個別に、Ｃ、Ｇ、ＡおよびＴからなる群から選択され、各配列－Ｎ－Ｇ－は、目的のシトシンとその隣接ヌクレオチドに相補的である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

２つ以上のＮＯＩがＣｐＧ部位に位置し、前記アンカー配列が、少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも４つ、例えば２～５の範囲、例えば３～５の範囲、例えば４～５の範囲の－Ｃ－Ｈ－Ｇ－配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

ステップｂ）およびｃ）が共に、ＰＣＲを実施することを含み、前記温度が、前記ＰＣＲの１つ以上のサイクルにおける前記アニーリング温度として使用される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記オリゴヌクレオチドが、２つ、３つ、またはそれ以上の別個のオリゴヌクレオチドなどの、２つ以上の別個のオリゴヌクレオチドとしてコードされる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記オリゴヌクレオチドが単一のオリゴヌクレオチドとしてコードされる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記オリゴヌクレオチドが、第１および第２の核酸配列からなり、前記第１の核酸配列は、前記標的ＤＮＡに対して相補的な前記アンカー配列（Ａｎ）と、前記目的の標的核酸配列に対して相補的でないループ配列の第１の部分とを含み、前記第２の核酸配列は、前記ループ配列の前記第１の部分に少なくとも部分的にハイブリダイズすることができる前記ループ配列の第２の部分を含み、前記第２の核酸配列は、前記スターター配列（Ｓｔ）をさらに含み、前記第１および第２の核酸は、ハイブリダイズすると、突出構造を形成することができる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記アンカー配列（Ａｎ）が、８～３０の範囲、例えば８～２０の範囲、例えば１０～２０の範囲、例えば１５～２０の範囲のヌクレオチドからなり、前記ヌクレオチドの１つ以上は、疎水性ヌクレオチド（複数可）である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記アンカー配列（Ａｎ）が、前記標的アンカー配列に対して少なくとも８５％相補的である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記スターター配列（Ｓｔ）が、標的スターター配列に対して１００％相補的である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記標的アンカー配列および前記標的スターター配列が、互いから１０ヌクレオチド以内、例えば８ヌクレオチド以内、例えば５ヌクレオチド以内に位置する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

ＬｐおよびＳｔが、Ｌｐ－Ｓｔからなるオリゴヌクレオチドが、その相補的配列と共に少なくとも５０℃、例えば少なくとも５５℃、例えば少なくとも６５°Ｃの融解温度を有するように選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

ＬｐおよびＳｔが一緒になって、少なくとも１５ヌクレオチド、例えば少なくとも１７ヌクレオチド、例えば１５～４５ヌクレオチドの範囲、例えば１７～３５ヌクレオチドの範囲、例えば１７～２５ヌクレオチドの範囲からなる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

Ｌｐが疎水性ヌクレオチドを含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

Ｌｐが、２つ以上の核酸配列からなり、Ｓｔ配列に共有結合により連結していない前記核酸配列（複数可）が、１つ以上の疎水性ヌクレオチドを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

Ｓｔが疎水性ヌクレオチドを含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記オリゴヌクレオチドと前記目的のメチル化標的核酸配列との間の前記融解温度が、前記オリゴヌクレオチドと前記目的の非メチル化標的核酸配列との間の前記融解温度よりも、少なくとも５℃高い、例えば少なくとも６℃高い、例えば６～１５℃高い範囲、例えば６～１２℃高い範囲である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

目的の非メチル化標的核酸配列と比較した、前記オリゴヌクレオチドと前記メチル化標的核酸配列との間の融解温度の前記差は、非メチル化標的核酸配列と比較して、前記疎水性ヌクレオチドを欠いていることを除いて同一配列のオリゴヌクレオチドと前記メチル化標的核酸配列との間の融解温度の差より少なくとも１℃高い、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

ステップｂ）およびｃ）が共に、リアルタイムＰＣＲを実施することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記Ｃｔが、非メチル化標的核酸配列を鋳型として使用して行った対照ＰＣＲのＣｔよりも低い場合に、前記目的の核酸がメチル化されているとみなされる、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

ステップｂ）およびステップｃ）が共に、ＰＣＲを実施することを含み、前記ＰＣＲの少なくとも最初のサイクルが、前記ＮＯＩがメチル化されていない場合、前記オリゴヌクレオチドと前記目的の標的核酸配列との間の前記融解温度よりも高いアニーリング温度を使用する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

ステップｂ）の前記温度が、前記ＮＯＩがメチル化されていない場合の前記オリゴヌクレオチドと前記目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも少なくとも２℃高い、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

ステップｂ）およびステップｃ）が共に、ＰＣＲを実施することを含み、前記ＰＣＲの少なくとも最初のサイクルが、前記ＮＯＩがメチル化されていない場合、前記オリゴヌクレオチドと前記目的の標的核酸配列との間の前記融解温度よりも高く、前記ＮＯＩがメチル化されている場合、前記オリゴヌクレオチドと前記目的の標的核酸配列との間の前記融解温度より最大で４℃高い、例えば最大で２℃高い、同じかまたは低い、アニーリング温度を使用する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

ステップｂ）およびステップｃ）が共に、ＰＣＲを実施することを含み、前記ＰＣＲの少なくとも前記最初のサイクルが、前記ＮＯＩがメチル化されていない場合、前記オリゴヌクレオチドと前記目的の標的核酸配列との間の前記融解温度よりも高く、前記ＮＯＩがメチル化されている場合、前記オリゴヌクレオチドと前記目的の標的核酸配列との間の前記融解温度より最大で４℃高い～最大で４℃低い、アニーリング温度を使用する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

ステップｂ）およびｃ）が共に、ＰＣＲを実施することを含み、前記ＰＣＲの少なくとも前記最初のサイクルが５５～８０℃の範囲のアニーリング温度を使用する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記ＰＣＲの少なくとも前記最初のサイクルが、３０～１２０秒の範囲の間、前記アニーリング温度でインキュベーションすることを含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

ステップｂ）中の前記オリゴヌクレオチドの濃度が、３００～７００ｎＭの範囲である、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項37】

前記ＰＣＲが、１つ以上のメチル特異的増幅サイクルおよび１つ以上の一般的増幅サイクルを含み、前記メチル特異的増幅サイクル（複数可）が、
ａ．核酸を融解するステップと、
ｂ．メチル特異的条件下でのアニーリングおよび伸長ステップと、を含み、
前記一般的増幅サイクルが、
ａ．核酸を融解するステップと、
ｂ．一般的な条件下でのアニーリングおよび伸長ステップと、を含み、
ここで、前記融解することは、少なくとも９０℃の温度でインキュベーションすることを含み、メチル特異的条件下での前記アニーリングおよび前記伸長は、一般的条件下でのアニーリングおよび伸長よりも高い温度で実施される、請求項１３～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記アニーリングが、４５～９０秒の範囲で、例えば４５～７５秒の範囲で、例えば約６０秒間行われる、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

１～１００の範囲のメチル特異的増幅サイクルを含む、請求項３７～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記ＰＣＲが、前記オリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして使用して実施され、前記ＰＣＲが、前記目的の標的核酸配列の下流にある配列と少なくとも９０％同一、例えば１００％同一であるリバースプライマーの使用をさらに含む、請求項１３～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記ＰＣＲが、ＰＣＲ産物の検出のための検出可能なプローブの使用を含み、前記プローブが、前記ＰＣＲ反応の産物に少なくとも９０％相補的なオリゴヌクレオチドおよび検出可能な標識を含む、請求項１３～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記プローブが１つ以上の疎水性ヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

目的の標的核酸配列が、サンプルから精製されたＤＮＡに含まれる、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項44】

前記サンプルが、前記目的の核酸のメチル化に関連する臨床状態を患っているか、またはその臨床状態を有するリスクがある個体から得られたサンプルである、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

目的の核酸を前処理して、メチル化ヌクレオチドを検出可能な部分に変換するステップを含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

バイサルファイト変換ステップを含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

個体が臨床状態に罹患しているか否かのリスク、または個体が臨床状態になるリスクを決定するための方法であって、ここで、前記臨床状態は、目的の核酸中におけるＮＯＩのメチル化状態に関連し、
ａ．前記個体から得られたサンプルを提供することと；
ｂ．先行請求項のいずれか一項に記載の方法を実施することによって、前記サンプル中の前記ＮＯＩの前記メチル化状態を決定することであって、前記メチル化状態は、前記臨床状態の存在または前記臨床状態になるリスクを示す、決定することと、を含む、方法。

【請求項48】

それを必要とする個体における臨床状態の治療の効果の可能性を決定するための方法であって、ここで、前記臨床状態の前記治療の前記効果は、目的の核酸中におけるＮＯＩの前記メチル化状態に関連し、
ａ．前記個体から得られたサンプルを提供することと；
ｂ．請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法を実施することによって、前記サンプル中の前記ＮＯＩの前記メチル化状態を決定することであって、前記メチル化状態は、前記臨床状態に対する異なる治療レジメンの効果を示す、決定することと、を含む、方法。

【請求項49】

前期臨床状態ががんである、請求項４７～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記がんが、神経膠芽腫である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

以下の一般構造を含むか、またはこの構造からなるオリゴヌクレオチド：
５’（Ｎ）_ｎ－ＨＧ－（Ｎ）_ｍ－ＨＧ－（Ｎ）_ｐ－３’
（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；
Ｇは、ヌクレオチドグアニンであり；
ｎは、０以上の整数であり；
ｍは、１以上の整数であり；
ｐは、０以上の整数であり；
Ｈは、疎水性ヌクレオチドであり、
ここで、前記疎水性ヌクレオチドは、以下の構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
を有し、式中、
Ｘは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体、または核酸もしくは核酸類似体の骨格に組み込むことができる骨格モノマー単位であり、
Ｑは、ワトソン・クリック水素結合に参加していないインターカレーターであり；
Ｙは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体または骨格モノマー単位と前記インターカレーターとを連結するリンカー部分である）。

【請求項52】

前記オリゴヌクレオチドが、以下の一般構造を含むか、またはこの構造からなる、請求項５１に記載のオリゴヌクレオチド：
５’（Ｎ）_ｎ－ＨＧ－（Ｎ）_ｍ－ＨＧ－（Ｎ）_ｐ－ＨＧ－（Ｎ）_ｑ－３’
（式中、
ｐは、１以上であり；
ｑは、０以上の整数である）。

【請求項53】

前記オリゴヌクレオチドが、以下の一般構造を含むか、またはこの構造からなる、請求項５１～５２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド：
５’（Ｎ）_ｎ－ＨＧ－（Ｎ）_ｍ－ＨＧ－（Ｎ）_ｐ－ＨＧ－（Ｎ）_ｑ－ＨＧ－（Ｎ）_ｕ－３’
（式中、
ｑは、１以上の整数であり；
ｕは、０以上の整数である）。

【請求項54】

ｎが、０～４の範囲の整数であり、例えばｎが１である、請求項５１～５３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項55】

ｍが、１～８の範囲、例えば１～６の範囲の整数である、請求項５１～５４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項56】

ｐが、１～５０の範囲、例えば１～３０の範囲、例えば１～１０の範囲、例えば１～６の範囲の整数である、請求項５１～５５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項57】

ｑが、１～５０の範囲、例えば１～３０の範囲、例えば１～１０の範囲、例えば１～６の範囲の整数である、請求項５１～５６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項58】

ｕが、１～５０の範囲、例えば１～３０の範囲、例えば１～１０の範囲、例えば１～６の範囲の整数である、請求項５１～５７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項59】

少なくとも１つのＨのすぐ５’側にある前記ヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）である、請求項５１～５８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項60】

Ｈのすぐ５’側にあるすべてのヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）である、請求項５１～５９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項61】

すべてのインターカレーターなどの少なくとも１つのＱが、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシルおよびアミドからなる群から選択される１つ以上と任意により置換されたポリアロマート（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｅ）およびヘテロポリアロマート（ｈｅｔｅｒｏｐｏｌｙａｒｏｍａｔｅ）からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法またはオリゴヌクレオチド。

【請求項62】

前記ポリアロマートまたはヘテロポリアロマートが、少なくとも３つの環、例えば４つの環からなる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法またはオリゴヌクレオチド。

【請求項63】

前記インターカレーターが、ベンゼン、ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ａｓ－インダセン、ｓ－インダセン、ビフェニレン、アセナフチレン、フェナレン、ヘプタレン、フェナントラン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒａｎｅ）、フルオランテン、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、ピレン、アントラセン、ナフテン（ｎａｐｔｈｅｎｅ）、フェナントレン、フルレン（ｆｌｕｒｅｎｅ）、ピセン、クリセン、ナフタセン（ｎａｐｈｔａｃｅｎｅ）、アクリドン、ベンゾアントラセン、スチルベン、オキサロピリドカルバゾール、アジドベンゼン、ポルフィリンおよびソラレン、ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法またはオリゴヌクレオチド。

【請求項64】

すべてのインターカレーターなどの少なくとも１つのＱが、ピレンまたはピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－４（１Ｈ）－オンまたは７，９－ジメチル－ピリド［３’，２’，４，５］チエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－４（３Ｈ）－オンを含むか、またはこれらからなる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法またはオリゴヌクレオチド。

【請求項65】

少なくとも１つ、例えばすべての骨格モノマー単位が、ホスホロアミダイトからなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法またはオリゴヌクレオチド。

【請求項66】

前記オリゴヌクレオチドが、請求項４３～５７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドである、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

以下の一般構造を含むか、またはこの構造からなるオリゴヌクレオチド：
５’（Ｎ）_ｎ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｍ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｐ－３’
（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；
Ｃは、ヌクレオチドシトシンであり；
Ｇは、ヌクレオチドグアニンであり；
ｎは、０以上の整数であり；
ｍは、１以上の整数であり；
ｐは、０以上の整数であり；
Ｈは、疎水性ヌクレオチドであり、
ここで、前記疎水性ヌクレオチドは、以下の構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
を有し、式中、
Ｘは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体、または核酸もしくは核酸類似の骨格に組み込むことができる骨格モノマー単位であり、
Ｑは、ワトソン・クリック水素結合に参加していないインターカレーターであり；
Ｙは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体または骨格モノマー単位と前記インターカレーターとを連結するリンカー部分である）。

【請求項68】

前記オリゴヌクレオチドが、以下の一般構造を含むか、またはこの構造からなる、請求項６７に記載のオリゴヌクレオチド：
５’（Ｎ）_ｎ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｍ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｐ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｑ－３’
（式中、
ｐは、１以上であり；
ｑは、０以上の整数である）。

【請求項69】

前記オリゴヌクレオチドが、以下の一般構造を含むか、またはこの構造からなる、請求項６７～６８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド：
５’（Ｎ）_ｎ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｍ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｐ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｑ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｕ－３’
（式中、
ｑは、１以上の整数であり；
ｕは、０以上の整数である）。

【請求項70】

ｎ、ｍ、ｐ、ｑおよびｕが、請求項５４～５８のいずれか一項で定義されたとおりである、請求項６７～６９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項71】

ＱおよびＸが請求項６１～６５のいずれか一項で定義されたとおりである、請求項６７～７０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

背景技術
メチル化は、４つのＤＮＡ塩基のうちの１つにメチル基が付加されるＤＮＡのエピジェネティック修飾の一例である。最も一般的には、メチル基は、核酸塩基の５位でシトシンに付加される。プロモーター領域のＤＮＡメチル化は、遺伝子発現の調節に関与している。

【0002】

がんが進行すると、いくつかの遺伝子がプロモーターの過剰メチル化によりサイレンシングされ、これにより、遺伝子転写が抑制される。特定の遺伝子のメチル化は、がんの予後因子として使用され得るが、患者にとって最適な治療の選択にも使用できる。脳腫瘍である神経膠芽腫中では、ＭＧＭＴ（Ｏ６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）プロモーターのメチル化は、テモゾロミド（ＴＭＺ）などのアルキル化化学療法に対するより良好な予後およびより効率的な応答と相関している。したがって、神経膠芽腫の患者は、多くの場合、ＭＧＭＴのメチル化について検査される。

【0003】

メチル化の検出にはいくつかの方法が利用可能であり、ゴールドスタンダード法ではＤＮＡのバイサルファイト前処理を必要とする。この前処理により、非メチル化シトシンがウラシルに変換されるが、メチル化シトシンは変化しない。バイサルファイト処理は、時間を要し、大量のＤＮＡを投入する必要があり、反応時間が短すぎる場合には、不完全な非メチル化シトシンの変換となり、反応時間が長すぎる場合には、メチル化シトシンの変換となる可能性があるため、偽の結果となる傾向がある。これは、偽陽性および偽陰性の両方の結果のリスクにつながる。バイサルファイトを使用しない方法も開発されているが、それらはすべて別の変換を必要とするか、またはＰＣＲベースではない。バイサルファイト変換用のキットは市販されているが、典型的には、少なくとも１５の操作ステップを必要とする。

【0004】

疎水性ヌクレオチド、例えばインターカレート核酸（ＩＮＡ（商標））は、インターカレーターなどの疎水性部分を含む。インターカレーターは、ＤＮＡまたはＲＮＡ二重鎖のスタッキングに関与できる平坦な共役芳香環またはヘテロ芳香環系である。疎水性ヌクレオチドは、ワトソン・クリック型塩基対合には参加しない。疎水性ヌクレオチドが組み込まれているオリゴヌクレオチドが非修飾ＤＮＡ配列に結合した場合、疎水性部分自体が、ＤＮＡヘリックスの中心に置かれる。疎水性ヌクレオチドとＤＮＡ塩基との間の相互作用により、二本鎖ＤＮＡの安定性が上昇する。

【発明の概要】

【0005】

核酸を変換することなく、核酸塩基のメチル化を分析するなど、核酸の核酸塩基のエピジェネティック修飾を検出するための簡素な方法は、メチル化された核酸がより迅速に検出されること、変換ステップ中のサンプルの損失がないこと、および不完全または非特異的である変換に基づく不確実性がないことにより有益である。臨床現場では、メチル化状態などのエピジェネティック修飾を早期に検出することにより、患者の診断がより迅速になり、これにより治療を早期に開始できる可能性がある。より良い方法では、例えば、がんの治療および監視または診断などにおいて、メチル化のレベルをより適切に定量化し、メチル化状態の使用を拡大することができる可能性がある。

【0006】

本発明は、核酸におけるエピジェネティック修飾の検出、例えばメチル化ＤＮＡの検出のための非常に迅速な方法を提供する。これらの方法は、少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドを含む合成オリゴヌクレオチドが、核酸塩基にエピジェネティック修飾を含むＤＮＡおよびエピジェネティック修飾を含まないＤＮＡに対して（設計に合わせて）、それぞれ驚くほど高い親和性（融解温度）の差を有することができるという発見に基づく。これは特に、疎水性ヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチド内に配置され、潜在的にエピジェネティック修飾されたヌクレオチド（メチル化など）と標的核酸上のそのすぐ３’側のヌクレオチドとの間にインターカレートするようになる場合である。

【0007】

本発明の方法は、あらゆる種類の核酸におけるあらゆるヌクレオチドのエピジェネティック修飾を検出するために使用できるが、この方法は、ＤＮＡにおけるシトシンメチル化の検出に特に有用である。そのような場合、合成オリゴヌクレオチドは、疎水性ヌクレオチドが、潜在的にメチル化されたシトシンとそのすぐ３’側のヌクレオチド（ほとんどの場合グアニン）との間にインターカレートするように配置されるように設計されることが好ましい。

【0008】

この驚くほど高い融解温度の差は、様々な方法を使用して、核酸のメチル化状態を容易に検出するために活用され得る。例えば、核酸のメチル化状態は、簡素なＰＣＲ法によって検出することができる。重要なことは、本発明の方法では、核酸の前処理が必要ないことである。したがって、核酸のメチル化は、疎水性ヌクレオチド（複数可）を含む適切なプライマーを設計することにより、ワンステップＰＣＲで検出できる。

【0009】

本発明の好ましい実施形態では、方法は、以下により詳細に記載される、ベースプライマーと呼ばれる種類のプライマーを使用して実施される。

【0010】

これは、目的の標的核酸配列中の少なくとも１つの目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）のメチル化状態を決定する方法を提供する本発明の一態様であり、標的核酸配列は、ＮＯＩを含む標的アンカー配列を含み、本方法が、
ａ．アンカー配列（Ａｎ）を含むオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、アンカー配列は、標的アンカー配列に対して少なくとも５０％相補的な配列であり、アンカー配列は、ＮＯＩに対して相補的なヌクレオチドとそのすぐ５’側のオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドとの間に位置する少なくとも１つの疎水性ヌクレオチド（Ｈ）を含む、ステップと；
ｂ．ＮＯＩがメチル化されていない場合、オリゴヌクレオチドと目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも高い温度で、オリゴヌクレオチドを目的の標的核酸とインキュベートするステップと、
ｃ．オリゴヌクレオチドが目的の標的核酸にアニールするか否かを検出するステップと、
それによってメチル化状態を決定するステップと、を含み、
式中
ｉ．疎水性ヌクレオチド（Ｈ）は、構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
を有し、式中、
Ｘは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体、または核酸もしくは核酸類似体の骨格に組み込まれ得る骨格モノマー単位であり、
Ｑは、ワトソン・クリック水素結合に参加していないインターカレーターであり、
Ｙは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体または骨格モノマー単位とインターカレーターとを連結するリンカー部分である。

【0011】

また、これは、目的の非修飾標的核酸配列中の少なくとも１つの目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）のメチル化状態を決定する方法を提供する本発明の一態様であり、標的核酸配列は、ＮＯＩを含む標的アンカー配列を含み、本方法が、
ａ．アンカー配列（Ａｎ）を含むオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、アンカー配列は、標的アンカー配列に対して少なくとも５０％相補的な配列であり、アンカー配列は、ＮＯＩに対して相補的なヌクレオチドとそのすぐ５’側にあるヌクレオチドとの間に位置する少なくとも１つの疎水性ヌクレオチド（Ｈ）を含む、ステップと；
ｂ．ＮＯＩがメチル化されていない場合、オリゴヌクレオチドと目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも高い温度で、オリゴヌクレオチドを目的の標的核酸とインキュベートするステップと、
ｃ．オリゴヌクレオチドが目的の標的核酸にアニールするか否かを検出するステップと、
それによってメチル化状態を決定するステップと、を含み、
式中、
ｉ．疎水性ヌクレオチド（Ｈ）は、構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
を有し、式中、
Ｘは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体、または核酸もしくは核酸類似体の骨格に組み込まれ得る骨格モノマー単位であり、
Ｑは、ワトソン・クリック水素結合に参加していないインターカレーターであり、
Ｙは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体または骨格モノマー単位とインターカレーターとを連結するリンカー部分であり、
ｉｉ．オリゴヌクレオチドは、構造５’－Ａｎ－Ｌｐ－Ｓｔ－３’を有し、式中、
Ａｎは、アンカー配列であり；
Ｌｐは、目的の標的核酸配列に対して相補的でないループ配列であり、ループ配列は、ループ構造もしくはステム構造などの突出構造を形成することができる単一の核酸配列からなるか、またはループ構造もしくはステム構造などの突出構造を形成することができる複合体を形成するために、少なくとも部分的に互いにハイブリダイズすることができる２つ以上の核酸配列からなり；
Ｓｔは、標的スターター配列にハイブリダイズすることができるスターター配列であり、ここで、標的スターター配列は、標的アンカー配列に対して５’に位置する標的核酸配列の配列である。

【0012】

別の態様では、本発明は、個体が臨床状態に罹患しているか否かのリスク、または個体が臨床状態になるリスクを決定するための方法を提供し、ここで、臨床状態は、目的の核酸中におけるＮＯＩのメチル化状態に関連し、本方法は、
ａ．個体から得られたサンプルを提供することと；
ｂ．本明細書に開示される方法を実施することによって、サンプル中のＮＯＩのメチル化状態を決定することであって、メチル化状態は、臨床状態の存在または臨床状態になるリスクを示す、決定することと、を含む。

【0013】

いくつかの態様では、本発明は、それを必要とする個体における臨床状態の治療の効果の可能性を決定するための方法を提供し、ここで、臨床状態の治療の効果は、目的の核酸中におけるＮＯＩのメチル化状態に関連し、本方法は、
ａ．個体から得られたサンプルを提供することと；
ｂ．本明細書に開示される方法を実施することによって、サンプル中のＮＯＩのメチル化状態を決定することであって、メチル化状態は、臨床状態に対する異なる治療レジメンの効果を示す、決定することと、を含む。

【0014】

いくつかの態様では、以下の一般構造を含むまたはこの構造からなるオリゴヌクレオチドが提供される：
５’（Ｎ）_ｎ－ＨＧ－（Ｎ）_ｍ－ＨＧ－（Ｎ）_ｐ－３’
（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；
Ｇは、ヌクレオチドグアニンであり；
ｎは、０以上の整数であり；
ｍは、１以上の整数であり；
ｐは、０以上の整数であり；
Ｈは、疎水性ヌクレオチドであり、
ここで、疎水性ヌクレオチドは、以下の構造を有し；
Ｘ－Ｙ－Ｑ
式中、
Ｘは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体、または核酸もしくは核酸類似体の骨格に組み込むことができる骨格モノマー単位であり、
Ｑは、ワトソン・クリック水素結合に参加していないインターカレーターであり；
Ｙは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体または骨格モノマー単位とインターカレーターとを連結するリンカー部分である）。

【0015】

さらに別の態様では、以下の一般構造を含むまたはこの構造からなるオリゴヌクレオチドが提供される：
５’（Ｎ）_ｎ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｍ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｐ－３’
（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；
Ｃは、ヌクレオチドシトシンであり；
Ｇは、ヌクレオチドグアニンであり；
ｎは、０以上の整数であり；
ｍは、１以上の整数であり；
ｐは、０以上の整数であり；
Ｈは、疎水性ヌクレオチドであり、
ここで、疎水性ヌクレオチドは、以下の構造を有し；
Ｘ－Ｙ－Ｑ
式中、
Ｘは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体、または核酸もしくは核酸類似体の骨格に組み込むことができる骨格モノマー単位であり、
Ｑは、ワトソン・クリック水素結合に参加していないインターカレーターであり；
Ｙは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体または骨格モノマー単位とインターカレーターとを連結するリンカー部分である）。

【0016】

本発明は、添付の特許請求の範囲によってさらに定義される。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】融解温度（Ｔ_ｍ）の決定を示す図である。標識させたオリゴヌクレオチドとその相補的標的の二本鎖を加熱することにより、鎖が互いから解離するときに、ＲＦＵが減少する（実施例１を参照）。黒い点は、融解温度を示す。Ａ）プローブ／標的二本鎖の融解曲線。融解温度は、傾きが最も急になる点である。Ｂ）Ａの融解曲線の１次の負の導関数（－ｄＦ／ｄＴ）である。曲線の最大値は、融解温度である。

【図2】メチル化ＤＮＡ（ｍＣ）および非メチル化ＤＮＡ（ｎｏｎ．ｍＣ）のそれぞれのΔＣｔを示す図である。ΔＣｔは、参照アッセイのＣｔ値とｍＣまたは非ｍＣ ＤＮＡのメチル特異的アッセイのＣｔ値との差としてそれぞれ計算される。黒い線は計算の説明であり、正確なＣｔ値のマークではないことに留意されたい。

【図3】ベースプライマーアプローチを示す図である。ベースプライマーは、エピジェネティック修飾の可能性がある領域を標的とする疎水性ヌクレオチド（複数可）を含むアンカー（黒）、ループ（濃灰色）、およびスターター配列（薄灰色）からなる。Ａ）鋳型ＤＮＡがメチル化されている場合、アンカー配列は、鋳型に対して高い親和性を有し、ベースプライマーのアンカー配列およびスターター配列は、鋳型ＤＮＡにアニールし、伸長が生じ得る。Ｂ）ベースプライマーは、非メチル化鋳型に対して高い親和性を有しないため、選択した条件で非メチル化鋳型ＤＮＡに結合するものでない。これにより、非メチル化鋳型は、確実に増幅されない。濃灰色の線は、鋳型鎖、薄灰色は、アンプリコン、黒い円は、メチル化部位を表すことに留意されたい。ベースプライマーがプライマーとして作用する場合、ループ配列およびアンカー配列は、リバースプライマーのために働く可能性のある鋳型に組み込まれる。ベースプライマーを含む鋳型を使用したリバースプライマーからの伸長は、通常、ほとんどのＤＮＡポリメラーゼが、疎水性ヌクレオチドを読み取ることができないため、アンカー配列において停止する。ループ配列およびスターター配列は、メチル特異的増幅が発生後、通常のプライマーとして機能する（ＢｉｏＲｅｎｄｅｒ．ｃｏｍで作成）。

【図4】それぞれ、相補的なメチル化配列または非メチル化配列にハイブリダイズする場合の、異なる設計および疎水性ヌクレオチドを含む異なる種類のプローブの融解温度（ΔＴ_ｍ）の差の棒グラフを示す図である。プローブＭＧＭＴ＿Ｚ、ＭＧＭＴ＿Ｅ，ＭＧＭＴ＿Ｅ２、ＭＧＭＴ＿Ｅ３およびＭＧＭＴ＿Ｒｅｆ（表１の配列を参照）は、それぞれ、非メチル化（ＭＧＭＴ＿０ｍＣ）標的または完全メチル化（ＭＧＭＴ＿１，２，３，４ｍＣ）標的のいずれか（表１の配列を参照）と個別に混合した。完全メチル化標的と非メチル化標的との間の融解温度の差が示されている。各溶融実験で３回の複製を作製した。平均値は、バーの上に表示する。

【図5】標的ＭＧＭＴ＿１，２，３，４ｍＣおよびＭＧＭＴ＿０ｍＣにそれぞれハイブリダイズしたプローブＭＧＭＴ＿Ｅおよび参照プローブＭＧＭＴ＿Ｒｅｆ（表１の配列を参照）の融解ピーク（融解曲線の１次の負の導関数）を示す図である。ＭＧＭＴ＿Ｅは、メチル化標的および非メチル化標的の両方にハイブリダイズしたときに、高い融解温度を有するが、同時に、参照プローブと比較して、これらの間の識別が向上する（ΔＴ_ｍが大きくなる）ことが確認される。

【図6】プローブ下のメチル化部位の数とプローブの親和性との間に相関関係があることを示すグラフである。メチル化部位の数とプローブＭＧＭＴ＿Ｅの融解温度との線形フィットが示されている。線形フィットは、それぞれ１つのメチル化シトシンを有する、標的ＭＧＭＴ＿１ｍＣ、ＭＧＭＴ＿２ｍＣ、ＭＧＭＴ＿３ｍＣ、ＭＧＭＴ＿４ｍＣ、ならびにそれぞれ２つおよび４つのメチル化シトシンを有するＭＧＭＴ＿２，３ｍＣ、およびＭＧＭＴ＿１，２，３，４ｍＣ（表３の配列を参照）にハイブリダイズされたプローブＭＧＭＴ＿Ｅの融解温度に適用した。各溶融実験で３回の複製を作製した。

【図7】ＡｍｐｌｉＱｕｅｅｎマスターミックス（ＰｅｎｔａＢａｓｅから入手可能）中でのプローブＭＧＭＴ＿Ｅの融解ピークを示す図である。標的ＭＧＭＴ＿１，２，３，４ｍＣおよびＭＧＭＴ＿０ｍＣの各々にハイブリダイズさせたプローブＭＧＭＴ＿Ｅの融解曲線の１次の負の導関数。ＭＧＭＴ＿Ｅ／ＭＧＭＴ＿０ｍＣ二本鎖は、８０℃で最初に完全に解離することが確認される。これにより、約８０℃で、プローブＭＧＭＴ＿Ｅがマスターミックス中のメチル化相補配列に選択的に結合することが可能であることが示唆される。

【図8】異なるアニーリング時間と温度下でのベースプライマーと参照プライマーと間のシグナル（ΔＣｔ）に対するＰＣＲサイクルの差の棒グラフを示す図である。メチル特異的アッセイと参照アッセイと間のΔＣｔ、およびメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡと間のΔΔＣｔの差を使用して、最適なアニーリング条件を示す。アニーリング温度および時間は図に示す。参照アッセイでは、以下の実施例のセクション「ベースプライマーの設計」に記載のとおり７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２ＣおよびＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｃならびに５００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ２Ｅを使用した。メチル特異的アッセイでは、ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃの代わりに、ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ４Ｃプライマーを使用した。７９℃での実験のために、ＭＧＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ２Ｅの代わりに、１％ＺＵＢＲ Ｇｒｅｅｎを使用した。

【図9】メチル化および非メチル化ＤＮＡに対する参照およびメチル特異的アッセイのＰＣＲ曲線を示す図である。プローブの相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、サイクルに対応させてプロットしている。ＰＣＲプログラムＥ（表１０を参照）を使用した。テストしたサンプルは、ＩＤＨ Ｕ８７ ＷＴ（ｍＣ）から単離したメチル化ＤＮＡ、および対照として健康なドナーから得たＤＮＡ（非ｍＣ）であった。７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｃおよび１％ＺＵＢＲ Ｇｒｅｅｎは、参照アッセイ（Ｒｅｆ）で使用し、メチル特異的アッセイは、ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃの代わりに、７００ ｎＭ ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ４Ｃを有していた。

【図10】異なるアニール時間および温度でのＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｃ（配列については表１２を参照）のドットプロットを示す図である。メチル特異的アッセイと参照アッセイと間のΔＣｔと、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡと間のΔΔＣｔの差を使用して、アニーリング時間および温度の変化の効果を示す。Ａ）アニーリング時間を３０秒に固定し、温度を変化させた。Ｂ）アニーリング温度を８１℃に固定し、アニーリング時間を変化させた。参照アッセイは、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ＿ｓｕＥおよびＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｃ＿ｓｕＥおよび１％ＺＵＢＲ Ｇｒｅｅｎを有していた。メチル特異的アッセイは、ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ＿ｓｕＥの代わりに、ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｃを含む。

【図11】メチル化および非メチル化ＤＮＡに対する参照アッセイおよびメチル特異的アッセイのＰＣＲ曲線を示す図である。ＲＦＵは、サイクルに対応させてプロットしている。ＰＣＲプログラムＦ（表１５を参照）を使用した。参照アッセイでは、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ＿ｓｕＥ、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｃ＿ｓｕＥおよび１％ ＺＵＢＲ Ｇｒｅｅｎを使用し、メチル特異的アッセイでは、ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ＿ｓｕＥの代わりに、５００ｎＭ ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｃを有した。

【図12】参照アッセイおよびメチル特異的アッセイの線形結果を示す図である。Ｃｔは、鋳型の入力量の対数と対応させてプロットされている［ｌｏｇ（ｑ）］。Ａ）参照アッセイの結果。Ｂ）ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｃを用いたメチル特異的アッセイの結果。ＰＣＲプログラムＦを使用した。参照アッセイでは、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ＿ｓｕＥ、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｃ＿ｓｕＥおよび１％ ＺＵＢＲ Ｇｒｅｅｎを使用し、メチル特異的アッセイでは、ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ＿ｓｕＥの代わりに、５００ｎＭ ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｃを有した。

【図13】ＭｙＧｏ ＰｒｏリアルタイムＰＣＲ機器（Ｉｔ－Ｉｓｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）での感度試験結果を示す図である。ΔＣｔは、メチル化率％に対応させて、プロットしている。ＰＣＲプログラムＦ（表１５を参照）を使用した。参照アッセイでは、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ＿ｓｕＥ、７００ｎＭ Ｒｅｖ２Ｃおよび１％ ＺＵＢＲ Ｇｒｅｅｎを使用し、メチル特異的アッセイでは、ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ＿ｓｕＥの代わりに、５００ｎＭ ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｃを有した。

【図14】異なる種類の変異プローブ（ミスマッチを有するプローブ）のＴ_ｍおよびΔＴ_ｍの棒グラフを示す図である。Ｅ型（Ｅ＿Ｍ１、Ｅ＿Ｍ２、Ｅ＿Ｍ３、Ｅ＿Ｍ４、Ｅ＿Ｍ５）の疎水性ヌクレオチドを含むＭＧＭＴプローブおよび（Ｅ）変異（ミスマッチ）を含まないＭＧＭＴプローブは、それぞれ非メチル化（０ｍＣ）または完全メチル化（１，２，３，４ｍＣ）標的と個別に混合した。テストしたＭＧＭＴプローブおよびＭＧＭＴ標的配列を表２０に示す。メチル化標的と非メチル化標的との間の融解温度の差が示されている。平均値は、バーの上に示す。

【図15】アンカー配列中にミスマッチを有するベースプライマーを使用して、ＢａｓｅＴｙｐｅｒ（商標）リアルタイムＰＣＲ機器で実施された感度試験を示す図である。Ａ）ΔＣｔは、メチル化率％に対応させて、プロットしている。Ｂ）ΔＣｔは、ｌｏｇ（メチル化率％）に対応させて、プロットしている。ＰＣＲプログラムＧ（表２３を参照）を使用した。７００ｎＭＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ、７００ｎＭＲｅｖ２Ｅ、および５００ｎＭＭＧＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ２Ｅを参照アッセイで使用し、メチル特異的アッセイでは、ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃの代わりに、７００ｎＭＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｄ＿Ｍ５を有した。鋳型は、ＣｐＧメチルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してメチル化させたＭＧＭＴプロモーター領域からの人工ＤＮＡであった。Ｂ）で直線性が観察され、これは、アッセイが定量的であることを示す。

【図16】相補的標的配列上のアンカー配列（Ａｎ）の３’末端とスターター配列（Ｓｔ）の５’末端との間にヌクレオチドのギャップを有するベースプライマーを示す図である。０、２、および４ヌクレオチドのギャップを有するベースプライマーを示す（ＢｉｏＲｅｎｄｅｒ．ｃｏｍで作成）。

【図17】アンカー配列中にミスマッチを有するベースプライマーのΔＣｔの棒グラフを示す図である。ベースプライマーは、相補的標的配列上のアンカー配列の３’末端とスターター配列の５’末端との間にヌクレオチドのギャップを有するように設計した。ＰＣＲプログラムＨ（表２５を参照）を使用した。参照アッセイには、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｅ、および５００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ２Ｅを使用し、メチル特異的アッセイには、ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃの代わりに、表２４に記載されている７００ｎＭのベースプライマーを使用した。ΔＣｔは、１００％メチル化（１００％ｍＣ）、１０％メチル化（１０％ｍＣ）、および非メチル化ＤＮＡ（ｎｏｎ．ｍＣ）についてプロットしている。鋳型は、ＣｐＧメチルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してメチル化させたＭＧＭＴプロモーター領域からの人工ＤＮＡであった。

【図18】補助プライマー複合体の設計アプローチを示す図である。補助プライマー複合体は、２つのプライマーからなる。補助プライマーと呼ばれる１つのプライマー（濃灰色）は、標的ＤＮＡに相補的なアンカー配列と、標的配列に相補的でないステム配列と、を含む。ステム配列は、第２のプライマーの配列に相補的である。第２のプライマーは、プライマーの３’末端において、標的ＤＮＡに相補的な配列を有する。それにより、２つのプライマーは、三次複合体を作る。Ａ）選択された条件では、複合体は、鋳型ＤＮＡがメチル化されている場合にのみ安定する。補助プライマー複合体の第２のプライマーは、残りのＰＣＲサイクルに使用される。Ｂ）鋳型ＤＮＡがメチル化されていない場合、補助プライマー複合体は、選択条件では安定せず、増幅は生じない（ＢｉｏＲｅｎｄｅｒ．ｃｏｍで作成）。

【図19】補助プライマー複合体のＰＣＲ曲線を示す図である。相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、サイクルに対応させてプロットしている。ＰＣＲプログラムＨ（表２５を参照）を使用した。参照アッセイには、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｅ、および５００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ２Ｅを使用し、メチル特異的アッセイには、ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃの代わりに、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｐｒｉｍｅｒ＿１Ｄおよび５０ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ａｓｓｉｓｔ＿１Ａ＿Ｅを使用した。鋳型は、ＭＧＭＴプロモーター領域（ｎｏｎ．ｍＣ）およびＣｐＧメチルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してメチル化させた同じ鋳型（ｍＣ）からの人工ＤＮＡであった。

【発明を実施するための形態】

【0018】

定義
「アンカー配列」という用語は、オリゴヌクレオチド内、好ましくはベースプライマー内に含まれる配列を指す。アンカー配列は、目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）に対して相補的なヌクレオチドに隣接して位置する１つ以上の疎水性ヌクレオチドを含む。さらに、アンカー配列は、「標的アンカー配列」と呼ばれる目的の標的核酸配列の一部にハイブリダイズすることができる。「アンカー配列」は、本明細書において「Ａｎ」と略される。

【0019】

本明細書で使用される「ベースプライマー」という用語は、アンカー配列（Ａｎ）、ループ配列（Ｌｐ）、およびスターター配列（Ｓｔ）を含む、またはそれらからなるオリゴヌクレオチドを指す。ベースプライマーは、本明細書中以下により詳細に記載される。アンカー配列およびスターター配列は、標的核酸配列に対して少なくとも部分的に相補的であり、したがってそれにハイブリダイズすることができるが、ループ配列は、標的核酸配列に対して相補的ではない。典型的には、ループ配列およびスターター配列はいずれも、疎水性ヌクレオチドを含まない。ベースプライマーが、アンカー配列とループ配列との間に疎水性ヌクレオチドを含む場合、そのような疎水性ヌクレオチドは、アンカー配列の一部であると考えられる。「ループ配列」および「突出配列」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。

【0020】

本明細書で使用される「相補的」という用語は、ワトソン・クリック塩基対によってヌクレオチドの別の連続配列と塩基対合できるヌクレオチドの連続配列を指す。

【0021】

本明細書で使用される「疎水性ヌクレオチド」という用語は、本明細書の以下のセクション「疎水性ヌクレオチド」で詳細に説明される疎水性ヌクレオチドを指す。特に、本発明による疎水性ヌクレオチドは、リンカーを介してヌクレオチド／ヌクレオチド類似体／骨格モノマー単位に接続されたインターカレーターを含有する。

【0022】

本明細書で使用される「融解温度」という用語は、二本鎖を形成することができる核酸配列のハイブリダイズされていない形態に対して、５０％のハイブリダイズされた形態が存在する程度の温度を摂氏で表す。融解温度は、（Ｔ_ｍ）とも称され得る。核酸の融解は、二本鎖核酸分子の２つの鎖の熱分離を指す。融解温度は、好ましくは、以下の実施例１に記載のとおり決定される。融解温度は、本発明の方法を実施するために使用される同じ溶液（例えば、緩衝液）中で決定されることが好ましい。

【0023】

「ヌクレオチドのメチル化」または「メチル化ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの核酸塩基が、核酸塩基中に通常存在するもの（エピジェネティック修飾のない核酸中）と比較して、追加のメチル基で共有結合により修飾されていることを指す。異なるメチル化が本発明に関連するが、好ましいメチル化は、シトシンのメチル化である。多くの場合、メチル基は、ピリミジン環の５番目の原子に付加され、５－メチルシトシン（５－ｍＣ）を作出する。

【0024】

【化1】

【0025】

シトシンのメチル化は、「ＣｐＧ部位」とも呼ばれ得るＣｐＧジヌクレオチド中において、シトシンがグアニンの直前に置かれる場合に特に一般的である。ゲノムの特定の領域には、多数のＣｐＧ部位が含有されている。そのような領域は、「ＣｐＧアイランド」と呼ばれることがある。

【0026】

本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド、例えば、天然に存在するリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドの天然に存在する誘導体を指す。ヌクレオチドとしては、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）の４つの核酸塩基の１つを含むデオキシリボヌクレオチド、およびアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）の４つの核酸塩基の１つを含むリボヌクレオチドが挙げられる。簡潔にするために、特定の核酸塩基を含むヌクレオチドは、本明細書では単に核酸塩基の名前で呼ばれることがある。例として、シトシン（Ｃ）を含むヌクレオチドは、「シトシン」または「Ｃ」と呼ばれることもある。

【0027】

本明細書で使用される「目的のヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのメチル化状態を調査することが望ましいヌクレオチドを指す。目的のヌクレオチドは、任意のヌクレオチドであり得るが、好ましくは、目的のヌクレオチドは、シトシン（Ｃ）である。「目的のヌクレオチド」は、本明細書では「ＮＯＩ」と略される。

【0028】

本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体および／または疎水性ヌクレオチドのオリゴマーを指す。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、任意により１つ以上の疎水性ヌクレオチドを含むヌクレオチドのオリゴマーである。

【0029】

「目的の標的核酸配列」という用語は、「標的アンカー配列」を含む核酸配列を指し、「標的アンカー配列」は、少なくとも１つのＮＯＩを含む。

【0030】

「標的アンカー配列」という用語は、ＮＯＩを含む目的の標的核酸配列の部分を指す。「アンカー配列」は、標的アンカー配列にハイブリダイズすることができる。

【0031】

「エピジェネティック変化」という用語は、そのような修飾が核酸塩基のスタッキング効率を変化させることを考慮して、核酸の核酸塩基に自然に起こり得る修飾を指す。

【0032】

本明細書で使用される「エピジェネティック修飾」という用語は、典型的には娘細胞に遺伝する核酸塩基の共有結合修飾を指す。エピジェネティック修飾は、好ましくはメチル化であるが、アルキル化、アセチル化、ヒドロキシル化、メトキシ化、または核酸塩基の他の修飾であってもよい。

【0033】

本明細書で使用される「非修飾」という用語は、目的の核酸が、非メチル化ヌクレオチドを検出可能な部分に変換するためかつ／またはメチル化ヌクレオチドを検出可能な部分に変換するための修飾または前処理のステップを受けていないことを指す。そのような修飾または前処理の例としては、バイサルファイト変換、制限酵素消化またはＴＥＴ酵素変換が挙げられる。したがって、本明細書で定義される非修飾は、メチル化核酸または非メチル化核酸のいずれかに選択的に作用する核酸処理または修飾がないことのみを指す。メチル化核酸と非メチル化核酸を識別しない希釈、ＤＮＡ精製、または酵素処理などの、メチル化核酸または非メチル化核酸のいずれかに選択的に作用または識別することができない前処理ステップまたは修飾は、本明細書で使用されるこの用語には含まれない。

【0034】

標的核酸配列中での目的のヌクレオチドのメチル化状態
本発明は、標的核酸配列中の少なくとも１つのＮＯＩのエピジェネティック（メチル化など）状態を決定する方法に関する。

【0035】

この方法は、アンカー配列を含むオリゴヌクレオチドの使用に基づいており、アンカー配列は、１つ以上の疎水性ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、本明細書の以下のセクション「アンカー配列を含むオリゴヌクレオチド」に記載されるオリゴヌクレオチドのいずれかであり得る。アンカー配列を含むオリゴヌクレオチドは、エピジェネティック修飾（例えば、メチル化）を伴う核酸配列に対して、エピジェネティック修飾のない核酸配列に対する親和性とは著しく異なる親和性を有する。例えば、アンカー配列を含むオリゴヌクレオチドは、非メチル化核酸と比較して、メチル化核酸に対して著しく高い親和性を有する。この親和性の差は、以下に説明するように、様々な方法でメチル化などのエピジェネティック修飾を検出するために使用できる。

【0036】

したがって、本発明の方法は、一般に、ＮＯＩが、調査されるパターンとは異なるエピジェネティック修飾パターンを有する場合、オリゴヌクレオチドと目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも高い温度で、オリゴヌクレオチドを目的の標的核酸とインキュベートするステップｂ）を含む。

【0037】

好ましくは、温度は、ＮＯＩがメチル化されていないときのオリゴヌクレオチドと目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも高くなるように選択され、温度は、ＮＯＩがメチル化されているときのオリゴヌクレオチドと目的の標的核酸配列との間の融解温度より最大で２℃高いか、それに等しいか、またはそれより低い。

【0038】

いくつかの実施形態では、温度は、ＮＯＩがメチル化されていないときのオリゴヌクレオチドと目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも少なくとも２℃高くなるように選択され、温度は、ＮＯＩがメチル化されているときのオリゴヌクレオチドと目的の標的核酸配列との間の融解温度より最大で２℃高いか、それに等しいか、またはそれより低い。

【0039】

本明細書の別の場所に記載したとおり、融解温度で、約５０％のハイブリダイズ形態および非ハイブリダイズ形態が存在する。したがって、融解温度よりも高い温度では、典型的には、一部のハイブリダイゼーションが依然として生じる。したがって、融解温度よりわずかに高い温度、例えば２℃まで高い温度を使用することができる。

【0040】

親和性の差、したがってメチル化などのエピジェネティック状態は、様々な異なる方法を使用して検出できる。非常に簡潔に言えば、アンカー配列を含むオリゴヌクレオチドと標的核酸配列との間の融解温度を決定することができ、これに基づいてエピジェネティック状態を決定することができる。

【0041】

好ましくは、方法は、増幅ステップを含み、増幅は、ＮＯＩがメチル化されている場合にのみ増幅が起こるように、またはＮＯＩがメチル化されていない場合にのみ増幅が起こるように設計される。これは、メチル化標的核酸へのアンカー配列を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングを可能にするが、非メチル化標的配列へのオリゴヌクレオチドのアニーリングを可能にしない温度を使用する、１つ以上のステップを含むアッセイを設計することによって達成することができる。

【0042】

好ましい方法は、ＰＣＲに基づく方法であり、特に、本明細書の以下のセクション「ＰＣＲ」に記載されるＰＣＲに基づく方法のいずれかである。

【0043】

上記で説明したとおり、本発明の方法の１つの利点は、本方法が、バイサルファイト変換、制限酵素消化またはＴＥＴ酵素変換など、非メチル化またはメチル化ヌクレオチドを検出可能な部分に変換するための標的核酸の前処理を必要としないことである。

【0044】

バイサルファイトは、非メチル化シトシンをウラシルに変換する。５－メチルシトシンは、変化しないままである。これにより、メチル化状態に応じて塩基対配列に差が生じ、ＰＣＲなどによってメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの差を検出できる。

【0045】

メチル化感受性制限酵素を使用して、サンプルのメチル化状態を決定することもできる。通常、メチル化感受性制限酵素は、メチル化非感受性アイソシゾマーと共に存在する。このような酵素セットの例は、ＨｐａＩＩおよびＭｓｐＩであり、両方とも配列ＣＣＧＧを認識し、ＣＧジヌクレオチドの前を切断する酵素である。ＨｐａＩＩは、非メチル化ＣＣＧＧのみを切断し、ＭｓｐＩは、メチル化および非メチル化ＣＣＧＧ部位を両方とも切断する。これにより、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの消化の差を検出することができ、ＰＣＲによって分析できる。

【0046】

ＴＥＴ酵素変換は、２種類の酵素ＡＰＯＢＥＣおよびＴＥＴ２に依存する。ＴＥＴ２は、５－メチルシトシンを５－カルボキシシトシンに変換する。この変換により、５－メチルシトシンがＡＰＯＢＥＣによって変換されるのを防ぎ、これにより、非メチル化シトシンのみを脱アミノ化してウラシルとし、これにより、ＰＣＲなどによる、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの差の検出が可能になる。

【0047】

いくつかの実施形態では、目的の標的核酸配列は、修飾されていない。したがって、方法が、目的の核酸を前処理して、非メチル化ヌクレオチドを検出可能な部分に変換するおよび／またはメチル化ヌクレオチドを検出可能な部分に変換するステップを含まないことは、本発明に含まれる。いくつかの実施形態では、目的の標的核酸配列は、本明細書に開示される方法を実施する前に、バイサルファイト変換、制限酵素消化、またはＴＥＴ酵素変換を含む処理を受けていない。特に、方法が、バイサルファイト変換のステップを含まないことが好ましい。

【0048】

標的核酸配列
標的核酸配列は、メチル化状態などのエピジェネティクスを決定することが望ましい、少なくとも１つのヌクレオチド（ＮＯＩ）を含む任意の核酸配列であり得る。標的核酸配列は、典型的には、目的の短い配列を含む長い核酸配列であり、本明細書では「標的アンカー配列」と呼ばれる。標的アンカー配列は、少なくとも１つのＮＯＩを含む。

【0049】

好ましくは、核酸は、ＤＮＡであるが、核酸は、ＲＮＡなどの他の種類の核酸であってもよい。好ましい実施形態では、核酸は、ゲノムＤＮＡである。本方法は、天然に存在する配列のエピジェネティック修飾、特にシトシンのメチル化を決定するために有利に使用することができる。

【0050】

好ましくは、エピジェネティック修飾は、メチル化であるが、アルキル化、アセチル化、ヒドロキシル化、メトキシ化、または核酸塩基の他の修飾であってもよい。

【0051】

標的アンカー配列は、１つ以上のＮＯＩを含む。本発明のオリゴヌクレオチドのアンカー配列は、アンカー配列が標的アンカー配列とハイブリダイズできるような方法で選択される。典型的には、アンカー配列は、標的アンカー配列に対して少なくとも５０％相補的である。

【0052】

多くの場合、メチル化など、修飾されていてもいなくてもよいいくつかのＮＯＩが、標的核酸配列内に近接して置かれている。そのような場合、ヌクレオチドのすべての全体的な修飾（メチル化）状態を決定することが望ましい場合がある。これは、ＮＯＩあたり１つの疎水性ヌクレオチドを含むアンカー配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することにより、以下に記載する本発明の方法によって行うことができる。１つまたはいくつかのＮＯＩの修飾（メチル化）状態のみが決定されることも本発明に含まれる。ここでも、これは、調査するＮＯＩごとに１つの疎水性ヌクレオチドを含むアンカー配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することによって行うことができる。

【0053】

いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、エピジェネティック修飾状態が臨床状態に関連する１つ以上のＮＯＩを含む核酸配列であり得る。例えば、ＮＯＩのメチル化状態は、以下の「臨床状態」のセクションでより詳細に説明するように、臨床状態の存在、臨床状態の進行、臨床状態を獲得するリスク、または特定の治療方法に対する感受性と関連付けることができる。ＮＯＩのメチル化状態が臨床状態に「関連」しているということは、それがその臨床状態の原因であることを意味するのではなく、所定のメチル化状態がその臨床状態に関してより一般的であることを意味する。

【0054】

ＮＯＩは、エピジェネティック修飾状態を検出することが望ましい任意のヌクレオチドであり得る。好ましい実施形態では、ＮＯＩは、シトシン（Ｃ）であり、さらにより好ましくは、ＮＯＩは、ＣｐＧ部位に位置するシトシンである。最も好ましい実施形態では、ＮＯＩのエピジェネティック修飾は、ＣｐＧ部位のメチル化である。

【0055】

標的核酸は、標的核酸配列を含む任意の組成物中に含まれ得る。多くの場合、標的核酸は、核酸サンプル中に含まれる。サンプルは、エピジェネティック状態（例えば、メチル化状態）を決定することが望ましい任意の供給源から得られたものであり得る。例えば、サンプルは、ヒトなどの哺乳動物から得ることができる。サンプルは、少なくとも部分的に精製されてもよい、すなわち、サンプルは、少なくとも部分的に精製された核酸を含んでもよい。したがって、目的の標的核酸配列は、サンプルから精製されたＤＮＡ中に含まれ得る。

【0056】

本明細書の他の箇所に記載されているように、標的アンカー配列は、アンカー配列に少なくとも部分的に相補的である。したがって、標的核酸がＤＮＡなどの二本鎖核酸である場合、アンカー配列は通常、ＤＮＡの一方の鎖と少なくとも部分的に同一であり、標的アンカー配列はＤＮＡの他方の鎖に位置する。

【0057】

アンカー配列を含むオリゴヌクレオチド
本発明は、少なくとも１つのＮＯＩのメチル化状態などのエピジェネティックを決定するための方法に関し、方法は、アンカー配列（Ａｎ）を含むオリゴヌクレオチドの使用を採用し、ここで、アンカー配列は、本明細書では「標的アンカー配列」と示されるＮＯＩを含む標的核酸配列内のある部位に対して少なくとも５０％相補的な配列である。アンカー配列は、好ましくは、ＮＯＩに対して相補的なヌクレオチドとそのすぐ５’側のオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドとの間に位置する少なくとも１つの疎水性ヌクレオチド（Ｈ）を含む。

【0058】

ＮＯＩがＣである本発明の実施形態では、アンカー配列は、したがって好ましくは配列－Ｈ－Ｇ－を含み、ここで、Ｇは、目的のＣに相補的である。

【0059】

アンカー配列は、隣接する２つの疎水性ヌクレオチドを含まないことが好ましい。したがって、アンカー配列は、特に、配列－Ｎ－Ｈ－Ｇ－を含み、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、配列－Ｎ－Ｇ－は、目的のシトシンおよびその隣接ヌクレオチドに対して相補的である。特に、Ｎは、Ｃ、Ｇ、ＡおよびＴからなる群から選択され得る。

【0060】

ＮＯＩが、ＣｐＧ部位にあるＣである実施形態では、アンカー配列が、配列－Ｃ－Ｈ－Ｇ－を含むことが好ましい。

【0061】

アンカー配列は、２つ以上の疎水性ヌクレオチドを含み得る。したがって、アンカー配列は、少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも４つ、例えば１～１０の範囲、例えば２～１０の範囲、例えば３～１０の範囲、例えば４～１０の範囲の疎水性ヌクレオチド（Ｈ）を含み得る。

【0062】

アンカー配列は、特に、ＮＯＩあたり１つの疎水性ヌクレオチドを含み得る。疎水性ヌクレオチドは、好ましくはすべて、ＮＯＩに対して相補的なヌクレオチドとそのすぐ５’側のオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドとの間に位置する。さらに、アンカー配列は、追加の疎水性ヌクレオチドも含み得る。

【0063】

本発明の実施形態では、標的核酸配列がＣである２つ以上のＮＯＩを含む場合、アンカー配列は、２つ以上の－Ｎ－Ｈ－Ｇ－配列を含み得、ここで各Ｎは、個別に任意のヌクレオチドであり得る。好ましくは、アンカー配列は、ＣであるＮＯＩあたり１つの－Ｎ－Ｈ－Ｇ－配列を含み、各－Ｎ－Ｇ－配列は、目的のシトシンおよびその隣接ヌクレオチドに対して相補的である。したがって、アンカー配列は、少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも４つ、例えば２～５の範囲、例えば３～５の範囲、例えば４～５の範囲の－Ｎ－Ｈ－Ｇ－配列を含むことができ、ここで、各Ｎは、個別に任意のヌクレオチドであり、各配列－Ｎ－Ｇ－は、目的のシトシンおよびその隣接ヌクレオチドに対して相補的である。特に、Ｎは、Ｃ、Ｇ、ＡおよびＴからなる群から選択され得る。

【0064】

本発明の実施形態では、標的核酸配列がＣｐＧ部位に位置するＣである２つ以上のＮＯＩを含む場合、アンカー配列は、ＣｐＧ部位に位置するＣであるＮＯＩあたり１つの－Ｃ－Ｈ－Ｇ－配列を含むことができる。したがって、アンカー配列は、少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも４つ、例えば２～５の範囲、例えば３～５の範囲、例えば４～５の範囲の－Ｃ－Ｈ－Ｇ－配列を含むことができる。

【0065】

一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下の一般構造からなるアンカー配列を含む：
５’（Ｎ）_ｎ－ＨＧ－（Ｎ）_ｍ－ＨＧ－（Ｎ）_ｐ－３’
（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；
Ｇは、ヌクレオチドグアニンであり；
ｎは、０以上の整数であり；
ｍは、１以上の整数であり；
ｐは、０以上の整数であり；
Ｈは、疎水性ヌクレオチド、例えば以下に記載する疎水性ヌクレオチドのいずれかである）。

【0066】

一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下の一般構造からなるアンカー配列を含む：
５’（Ｎ）_ｎ－ＨＧ－（Ｎ）_ｍ－ＨＧ－（Ｎ）_ｐ－ＨＧ－（Ｎ）_ｑ－３’
（式中、
ｐは、１以上であり；
ｑは、０以上の整数である）。

【0067】

一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下の一般構造からなるアンカー配列を含む：
５’（Ｎ）_ｎ－ＹＧ－（Ｎ）_ｍ－ＹＧ－（Ｎ）_ｐ－ＹＧ－（Ｎ）_ｑ－ＹＧ－（Ｎ）_ｕ－３’
（式中、
ｑは、１以上の整数であり；
ｕは、０以上の整数である）。

【0068】

Ｙは、拡張ＩＵＰＡＣコードによるＣまたはＴを表す。

【0069】

上述のオリゴヌクレオチドに関して、ｎは、例えば、０～４の範囲の整数であってもよく、例えば、ｎは、１であってもよく、ｍは、例えば１～８の範囲、例えば１～６の範囲の整数であってもよく、ｐは、例えば１～５０の範囲、例えば１～３０の範囲、例えば１～１０の範囲、例えば１～６の範囲の整数であってもよく、ｑは、例えば１～５０の範囲、例えば１～３０の範囲、例えば１～１０の範囲、例えば１～６の範囲の整数であってもよく、ｕは、例えば１～５０の範囲、例えば１～３０の範囲、例えば１～１０の範囲、例えば１～６の範囲の整数であってもよい。

【0070】

本発明の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下に記載するベースプライマーである。そのような実施形態では、アンカー配列は、ループ配列およびスターター配列に連結され、そのような実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’部分は、ループ配列およびスターター配列の両方を含有するのに十分な長さである。

【0071】

上で説明したとおり、ＮＯＩは、ＣｐＧ部位に位置するシトシンであり得る。そのような場合、少なくとも１つのＨのすぐ５’側にあるヌクレオチドは、シトシン（Ｃ）であることが好ましい。すべてのＮＯＩがＣｐＧ部位に位置するシトシンである場合、ＨがＮＯＩに対して相補的なＧに隣接している場合、Ｈのすぐ５’側にあるすべてのヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であることが好ましい。

【0072】

アンカー配列を含むオリゴヌクレオチドは、非メチル化標的核酸配列よりも高い親和性でメチル化標的核酸配列にアニールする。したがって、オリゴヌクレオチドと目的のメチル化標的核酸配列との間の融解温度は、多くの場合、オリゴヌクレオチドと目的の非メチル化標的核酸配列との間の融解温度よりも、少なくとも５℃高い、例えば少なくとも６℃高い、例えば６～１５℃高い範囲、例えば６～１２℃高い範囲である。

【0073】

特に、本発明は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドが、疎水性ヌクレオチドを含まない同様のオリゴヌクレオチドと比較して、メチル化対非メチル化標的核酸に対する親和性においてより大きな差を有するという発見に基づく。この親和性の差が大きいことにより、ＰＣＲなどの簡素な方法でメチル化をうまく検出することができる。目的の非メチル化標的核酸配列と比較した、本発明のオリゴヌクレオチドとメチル化標的核酸配列との間の融解温度の差は、好ましくは、非メチル化標的核酸配列と比較して、疎水性ヌクレオチドを欠いていることを除いて同一配列のオリゴヌクレオチドとメチル化標的核酸配列との間の融解温度の差より少なくとも１℃高い。

【0074】

シトシンメチル化などのＮＯＩメチル化、すなわち、目的の標的核酸などの核酸中にメチル化シトシン（複数可）が存在することにより、核酸がオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするときの融解温度に差が生じる。この差は、メチル化ＮＯＩの数に依存し、検出が困難な場合がある。本発明のオリゴヌクレオチドの疎水性ヌクレオチドは、それ以外は同一であるが疎水性ヌクレオチドを含まないオリゴヌクレオチドと比較して、非メチル化対メチル化ＮＯＩに対する親和性の差を増幅する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、メチル化シトシンなどのメチル化ＮＯＩの数に応じて、目的の標的配列にハイブリダイズした場合に、疎水性ヌクレオチドを含まない同一のオリゴヌクレオチドと比較して、融解温度の大きい差をもたらし、したがって、メチル化ＮＯＩの存在の検出が容易になる。

【0075】

いくつかの実施形態では、
Ａ．
ｉ．目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合に、疎水性ヌクレオチド（複数可）を含む本発明のオリゴヌクレオチドであって、目的の核酸配列が、少なくとも１つのメチル化シトシンなどの少なくとも１つのメチル化ＮＯＩを含む、オリゴヌクレオチドと；
ｉｉ．目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合に、疎水性ヌクレオチド（複数可）を含む本発明のオリゴヌクレオチドであって、目的の核酸配列が、メチル化シトシンなどのメチル化ＮＯＩを含まない、オリゴヌクレオチドと；
の融解温度の絶対差、および
Ｂ．
ｉ．Ａ．のオリゴヌクレオチドと同一であるが、目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合、疎水性ヌクレオチド（複数可）を含まないオリゴヌクレオチドであって、目的の核酸配列が、Ａ．ｉ．と同数のメチル化ＮＯＩ、例えばＡ．ｉ．と同数のメチル化シトシンなどを含む、オリゴヌクレオチドと；
ｉｉ．Ａ．のオリゴヌクレオチドと同一のオリゴヌクレオチドであるが、目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合、疎水性ヌクレオチド（複数可）を含まないオリゴヌクレオチドであって、目的の核酸配列は、メチル化シトシンなどのメチル化ＮＯＩを含まない、オリゴヌクレオチドと；
の融解温度の絶対差が、
目的の標的核酸配列においてメチル化されていない代わりに、メチル化されているシトシンなどのＮＯＩあたり、少なくとも０．５０℃、例えば少なくとも０．７５℃、好ましくは少なくとも１．０℃の差であり、ここで差は、Ａ－Ｂであり、差は、正の差である。好ましい実施形態では、融解温度は、０．０２Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．０２Ｍ ＮａＣｌ、および２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＭ緩衝液中で測定される。

【0076】

いくつかの実施形態では、
ｉ．目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合に、疎水性ヌクレオチドを含む本発明のオリゴヌクレオチドであって、目的の核酸配列が、少なくとも１つのメチル化シトシンなどの少なくとも１つのメチル化ＮＯＩを含む、オリゴヌクレオチドと；
ｉｉ．目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合に、疎水性ヌクレオチドを含む本発明のオリゴヌクレオチドであって、目的の核酸配列が、メチル化シトシンなどのメチル化ＮＯＩを含まない、オリゴヌクレオチドと；
の融解温度間の絶対差は、
シトシンなどのＮＯＩあたり、少なくとも１．６℃、例えば少なくとも１．８℃、例えば少なくとも２．０℃、例えば少なくとも２．２℃、好ましくは少なくとも２．４℃であり、これは、目的の標的核酸配列においてメチル化されていない代わりにメチル化されている。好ましい実施形態では、融解温度は、０．０２Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．０２Ｍ ＮａＣｌ、および２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＭ緩衝液中で測定される。

【0077】

比較のために、いくつかの実施形態では、
ｉ．上記段落に記載のオリゴヌクレオチドと同一のオリゴヌクレオチドであるが、目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合、疎水性ヌクレオチドを含まないオリゴヌクレオチドであって、目的の核酸配列は、少なくとも１つのメチル化シトシンなどの少なくとも１つのメチル化ＮＯＩを含む、オリゴヌクレオチドと；
ｉｉ．上記段落に記載のオリゴヌクレオチドと同一のオリゴヌクレオチドであるが、目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合、疎水性ヌクレオチドを含まないオリゴヌクレオチドであって、目的の核酸配列は、メチル化シトシンなどのメチル化ＮＯＩを含まない、オリゴヌクレオチドと；
の融解温度の絶対差が、
目的の標的核酸配列中でメチル化されていない代わりにメチル化されているシトシンなどのＮＯＩあたり、最大で１．０℃、例えば、最大で０．９℃、例えば、最大で０．８℃である。好ましい実施形態では、融解温度は、０．０２Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．０２Ｍ ＮａＣｌ、および２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＭ緩衝液中で測定される。

【0078】

好ましくは、アンカー配列（Ａｎ）は、８～３０の範囲、例えば８～２０の範囲、例えば１０～２０の範囲、例えば１５～２０の範囲のヌクレオチドからなり、ヌクレオチドの１つ以上は、疎水性ヌクレオチド（複数可）である。

【0079】

言及したように、アンカー配列（Ａｎ）は、標的アンカー配列に対して少なくとも５０％相補的であり、好ましくは、アンカー配列（Ａｎ）は、標的アンカー配列に対して少なくとも８５％相補的である。いくつかの実施形態では、アンカー配列は、標的アンカー配列に対して１００％相補的であり得る。しかしながら、好ましい実施形態では、アンカー配列は、標的アンカー配列に対して１００％相補的ではない。

【0080】

ベースプライマー
本発明は、少なくとも１つのＮＯＩのメチル化状態などのエピジェネティック状態を決定するための方法に関し、本方法は、アンカー配列（Ａｎ）を含むオリゴヌクレオチドの使用を利用する。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、このセクションに記載のベースプライマーである。

【0081】

本発明によるベースプライマーは、以下の構造を有するオリゴヌクレオチドである；
５’－Ａｎ－Ｌｐ－Ｓｔ－３’
式中、Ａｎは、アンカー配列であり；
Ｌｐは、ループ配列であり；
Ｓｔは、スターター配列である。

【0082】

アンカー配列（Ａｎ）は、好ましくは、本明細書で「標的アンカー配列」と示されるＮＯＩを含む標的核酸配列内のある部位に対して少なくとも５０％相補的な配列である。アンカー配列は、好ましくは、ＮＯＩに対して相補的なヌクレオチドとそのすぐ５’側のオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドとの間に位置する少なくとも１つの疎水性ヌクレオチド（Ｈ）を含む。アンカー配列は、特に、本明細書の上記のセクション「アンカー配列を含むオリゴヌクレオチド」で説明したアンカー配列のいずれかであり得る。

【0083】

ループ配列（Ｌｐ）は、標的核酸配列に任意の有意な程度にはハイブリダイズしない配列である。したがって、好ましくは、Ｌｐは、目的の核酸配列に相補的ではない。ループ配列は、突出構造を形成することができる単一の核酸配列からなり得るか、または少なくとも部分的に互いにハイブリダイズして、突出構造を形成することができる複合体を形成することができる２つ以上の核酸配列からなり得る。いくつかの実施形態では、突出構造は、ループ構造である。いくつかの実施形態では、突出構造は、ステム構造である。

【0084】

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、第１および第２の核酸配列からなることができ、第１の核酸配列は、標的ＤＮＡに対して相補的なアンカー配列（Ａｎ）と、目的の標的核酸配列に対して相補的でないループ配列の第１の部分とを含み、第２の核酸配列は、ループ配列の第１の部分に少なくとも部分的にハイブリダイズすることができるループ配列の第２の部分を含み、第２の核酸配列は、スターター配列（Ｓｔ）をさらに含む。ハイブリダイズすると、第１および第２の核酸は、ステム構造などの突出構造を形成することができる。

【0085】

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、第１、第２および第３の核酸配列からなり得、第１の核酸配列は、標的ＤＮＡに対して相補的なアンカー配列（Ａｎ）と、目的の標的核酸配列に対して相補的でないループ配列の第１の部分とを含み、第２の核酸配列は、ループ配列の第１の部分に少なくとも部分的にハイブリダイズすることができるループ配列の第２の部分を含み、第２の核酸配列は、スターター配列（Ｓｔ）をさらに含み、第３の核酸配列は、第１の領域で第１のオリゴヌクレオチドの３’末端の一部にハイブリダイズし、第２の領域で第２のオリゴヌクレオチドの５’末端の一部にハイブリダイズすることができる。ハイブリダイズすると、第１、第２、および第３の核酸は、ループ構造などの突出構造を形成することができる。

【0086】

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、単一のオリゴヌクレオチドとしてコードされる。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、２つ以上の別個のオリゴヌクレオチドとしてコードされる。

【0087】

スターター配列（Ｓｔ）は、標的核酸配列にハイブリダイズできるが、低親和性でハイブリダイズする配列である。したがって、本発明の方法に使用される条件下では、スターター配列は、アンカー配列もアニールしない限り、標的核酸配列にアニールしないことが好ましい。スターター配列（Ｓｔ）は、好ましくは、伸長可能であり、したがってスターター配列は、プライマーとして働くことができるものである。したがって、スターター配列は、好ましくは、本明細書では「標的スターター配列」と呼ばれる標的核酸配列のある部位に対して少なくとも９０％相補的である。

【0088】

標的スターター配列は、標的アンカー配列の５’側に位置する標的核酸配列の配列である。標的スターター配列は、標的アンカー配列のすぐ５’側に位置し得るが、配列間にスペースがあってもよい。したがって、標的スターター配列は、１～２０ヌクレオチドの範囲、例えば２～１０ヌクレオチドの範囲、例えば２～５ヌクレオチドの範囲で、標的アンカー配列から分離され得る。

【0089】

上記のように、スターター配列は、標的スターター配列に対して少なくとも９０％相補的であるが、標的スターター配列に対して１００％相補的であってもよい。

【0090】

ベースプライマーは、ＰＣＲに基づく方法に特に有用であり、ベースプライマーは、標的核酸配列の増幅に使用できるプライマー対の１つのプライマーである。アンカー配列の設計に基づいて、アンカー配列は、メチル化された標的核酸配列に高親和性でアニールし、これにより、スターター配列のアニールも可能になる。アニーリング後、ＰＣＲに従来から使用されている任意のＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼを使用して、ベースプライマーを伸長することができる。ポリメラーゼが産物で最初の疎水性ヌクレオチドに遭遇したときに、最初の逆転写が典型的に終了し、したがってアンカー配列の少なくとも一部が欠失する。しかし、次のＰＣＲラウンドでもベースプライマーをプライマーとして使用できるが、これは、ループ配列およびスターター配列が、最初の増幅ラウンドの産物にアニーリングできるためである。

【0091】

ポリメラーゼは通常、鋳型が疎水性ヌクレオチドを含む位置で伸長を停止するので、ベースプライマーがアンカー配列とループ配列との間に疎水性ヌクレオチドを含むことが好ましい場合がある。疎水性ヌクレオチドなどは、アンカー配列の一部と見なされる。

【0092】

したがって、スターター配列およびループ配列は両方とも、疎水性ヌクレオチドを含まないことも好ましい。しかし、ループ配列が２つ以上の核酸配列からなる場合、スターター配列に共有結合により連結していない核酸配列（複数可）は、１つ以上の疎水性ヌクレオチドを含んでもよい。

【0093】

ループ配列およびスターター配列は、標的からの最初の増幅後のラウンドのプライマーとして機能する。したがって、ループ配列およびスターター配列（－Ｌｐ－Ｓｔ－）は、それらがプライマーとして機能できるような方法で設計するべきである。したがって、Ｌｐ－Ｓｔからなるオリゴヌクレオチドは、その相補配列に対して少なくとも５０℃、例えば少なくとも５５℃、例えば少なくとも６５℃の融解温度を有することが好ましい。一般に、ループ配列およびスターター配列が一緒になって、少なくとも１５ヌクレオチド、例えば少なくとも１７ヌクレオチド、例えば１５～４５ヌクレオチドの範囲、例えば１７～３５ヌクレオチドの範囲、例えば１７～２５ヌクレオチドの範囲からなることが好ましい。

【0094】

上記のように、スターター配列は、標的核酸配列に低親和性でアニーリングするものである。したがって、スターター配列は長すぎないことが好ましい。好ましくは、スターター配列は、５～１５の範囲、例えば８～１４の範囲、例えば１０～１２の範囲のヌクレオチドからなる。

【0095】

ベースプライマーは、アンカー、ループおよびスターター配列に加えて追加の部分を含んでもよい。例えば、ベースプライマーは、検出可能な標識に連結され得る。しかし、好ましい実施形態では、ベースプライマーは、アンカー、ループおよびスターター配列からなる。

【0096】

他のオリゴヌクレオチド
本発明による好ましいオリゴヌクレオチドが上記に記載されているが、本発明は、一実施形態では、例えば、最大３℃、例えば、最大２°ＣのＴ_ｍの差などの、メチル化および非メチル化標的核酸配列に対して同様の親和性を有するオリゴヌクレオチドも提供する。ＮＯＩがＣｐＧ部位に位置するシトシンである場合、そのようなオリゴヌクレオチドは、以下の一般構造を含み得るか、またはそれからなり得る：
５’（Ｎ）_ｎ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｍ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｐ－３’
（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；
Ｃは、ヌクレオチドシトシンであり；
Ｇは、ヌクレオチドグアニンであり；
ｎは、０以上の整数であり；
ｍは、１以上の整数であり；
ｐは、０以上の整数であり；
Ｈは、疎水性ヌクレオチドであり、
ここで、疎水性ヌクレオチドは、以下の構造を有し；
Ｘ－Ｙ－Ｑ
式中、
Ｘ、ＱおよびＹは、本明細書の「疎水性ヌクレオチド」のセクションに記載のとおりであり得る）。

【0097】

オリゴヌクレオチドは、特に、以下の一般構造を有し得る：
５’（Ｎ）_ｎ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｍ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｐ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｑ－３’
（式中、
ｐは、１以上であり；
ｑは、０以上の整数である）。

【0098】

一実施形態では、そのようなオリゴヌクレオチドは、以下の一般構造を含むか、またはその一般構造からなる：
５’（Ｎ）_ｎ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｍ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｐ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｑ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｕ－３’
（式中、
ｑは、１以上の整数であり；
ｕは、０以上の整数である）。

【0099】

ｎ、ｍ、ｐ、ｑおよびｕは、例えば、本明細書の上記セクション「アンカー配列を含むオリゴヌクレオチド」に記載されているとおりであり得る。

【0100】

疎水性ヌクレオチド
本発明で使用されるオリゴヌクレオチドは、１つ以上の疎水性ヌクレオチドを含む。本発明による疎水性ヌクレオチドは、以下の構造を有する：
Ｘ－Ｙ－Ｑ
（式中、
Ｘは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体、または核酸の骨格に組み込むことができる骨格モノマー単位であり、
Ｑは、ワトソン・クリック水素結合に参加していないインターカレーターであり；
Ｙは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体または骨格モノマー単位とインターカレーターとを連結するリンカー部分である）。

【0101】

インターカレーターＱは、任意のインターカレーターであり得る。本発明によるインターカレーターという用語は、核酸の核酸塩基と共スタッキングすることができる、少なくとも１つの本質的に平坦な共役系を含む任意の分子部分を包含する。好ましくは、本発明によるインターカレーターは、核酸の核酸塩基と共スタッキングすることができる、少なくとも１つの本質的に平坦な共役系から本質的になる。

【0102】

インターカレーターは、少なくとも１つのπ（ファイ）電子系を含み、本発明によれば、π電子系を含む他の分子と相互作用することができる。これらの相互作用は、インターカレーターの疎水性相互作用に正または負の様式で寄与することができる。Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒｓ（１９９０）Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：５５２５－５５３４は、２つのπ電子系が互いに積極的に相互作用できる様々な方向および条件を提唱した。

【0103】

インターカレーターは、国際特許出願ＷＯ２０１７／０４５６８９、ｐ．３０，ｌ．２６～ｐ．４０，ｌ．３のセクション「インターカレーター」に記載されているインターカレーターのいずれかであり得る。例えば、インターカレーターは、同国際特許出願ＷＯ２０１７／０４５６８９のｐ．３２－３９に記載の構造のいずれかを有し得、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0104】

一実施形態では、すべてのインターカレーターなどの少なくとも１つのＱは、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシルおよびアミドからなる群から選択される１つ以上と任意により置換されたポリアロマート（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｅ）およびヘテロポリアロマート（ｈｅｔｅｒｏｐｏｌｙａｒｏｍａｔｅ）からなる群から選択される。上記ポリアロマートまたはヘテロポリアロマートは、少なくとも３つの環、例えば４つの環からなり得る。

【0105】

インターカレーターは、例えば、ベンゼン、ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ａｓ－インダセン、ｓ－インダセン、ビフェニレン、アセナフチレン、フェナレン、ヘプタレン、フェナントラン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒａｎｅ）、フルオランテン、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、ピレン、アントラセン、ナフテン（ｎａｐｔｈｅｎｅ）、フェナントレン、フルレン（ｆｌｕｒｅｎｅ）、ピセン、クリセン、ナフタセン（ｎａｐｈｔａｃｅｎｅ）、アクリドン、ベンゾアントラセン、スチルベン、オキサロピリドカルバゾール、アジドベンゼン、ポルフィリンおよびソラレン、ならびにそれらの誘導体からなる群から選択され得る。

【0106】

一実施形態では、すべてのインターカレーターなどの少なくとも１つのＱは、ピレンまたはピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－４（１Ｈ）－オンまたは７，９－ジメチル－ピリド［３’，２’，４，５］チエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－４（３Ｈ）－オンを含むか、またはこれらからなる。特に、すべてのインターカレーターなどの少なくとも１つはピレンであってもよい。

【0107】

本発明によるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の骨格モノマー単位は、核酸または核酸類似体の骨格への組み込みに関与するヌクレオチドの一部である。骨格モノマー単位（Ｘ）は、インターカレーターに共有結合により連結しているリンカー（Ｙ）に共有結合により連結していることが好ましい。本発明によるオリゴヌクレオチド類似体にインターカレーターを組み込むために、任意の好適な骨格モノマー単位を使用することができる。

【0108】

骨格モノマー単位は、国際特許出願ＷＯ２０１７／０４５６８９、セクション「Ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｎｏｍｅｒ ｕｎｉｔ」、ｐ．４０，ｌ．５～ｐ．５６，ｌ．３に記載の骨格モノマー単位のいずれであってもよい。骨格モノマー単位は、国際特許出願ＷＯ０３／０５２１３２、セクション「Ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｎｏｍｅｒ ｕｎｉｔ」、ｐ．２４，ｌ．２７～ｐ．４３，ｌ．１４に記載の骨格モノマー単位のいずれであってもよい。

【0109】

本発明の特に好ましい実施形態では、疎水性ヌクレオチドは、ホスホロアミダイトを含む骨格モノマー単位を含み、より好ましくは、骨格モノマー単位は、三価ホスホロアミダイトまたは五価を含む。

【0110】

好適な三価ホスホロアミダイトは、核酸および／または核酸類似体の骨格に組み込むことができる三価または五価ホスホロアミダイトである。通常、アミダイト基自体は、核酸の骨格に組み込まれ得ず、むしろアミダイト基またはアミダイト基の一部が、脱離基および／または保護基として機能し得る。しかし、骨格モノマー単位がホスホロアミダイト基を含むことが好ましく、これは、そのような基が、核酸骨格への骨格モノマー単位の組み込みを容易にし得るためである。

【0111】

本発明によるインターカレーターヌクレオチドのリンカーは、インターカレーターと疎水性ヌクレオチドの骨格モノマーとを接続する部分であり、好ましくはインターカレーターと骨格モノマー単位とを共有結合により連結する。リンカーは、１つ以上の原子（複数可）または原子間の結合（複数可）を含み得る。

【0112】

本明細書の上記で定義された骨格およびインターカレーターの定義により、リンカーは、骨格とインターカレーターとを連結する最短経路である。インターカレーターが、骨格に直接連結している場合、リンカーは、結合である。

【0113】

リンカーは、通常、原子の鎖または原子の分枝鎖からなる。鎖は、飽和ならびに不飽和であり得る。リンカーはまた、共役結合を伴うまたは伴わない環構造であってもよい。

【0114】

例えば、リンカーは、Ｃ、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｇｅ、ＳｎおよびＰｂからなる群から、好ましくはＣ、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＰからなる群から選択される、さらにより好ましくはＣである原子の鎖を含み得、鎖の一端は、インターカレーターに接続され、鎖の他端は、骨格モノマー単位に接続される。

【0115】

リンカーは、例えば、国際特許出願ＷＯ２０１７／０４５６８９、セクション「Ｌｉｎｋｅｒ」、ｐ．５６，ｌ．５～ｐ．５９，ｌ．１０に記載のリンカーのいずれかであり得る。リンカーはまた、ＷＯ０３／０５２１３２、セクション「Ｌｉｎｋｅｒ」、ｐ．５４，ｌ．１５～ｐ．５８，ｌ．７に記載のリンカーのいずれかであり得る。

【0116】

ＰＣＲ
本発明の方法は、好ましくは、（ｂ）ＮＯＩが、調査するエピジェネティック修飾状態を含まない場合、例えばＮＯＩが、メチル化されていない場合、本発明のオリゴヌクレオチドを目的の標的核酸と共に、オリゴヌクレオチドと目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも高い温度でインキュベートするステップと、（ｃ）オリゴヌクレオチドが目的の標的核酸にアニールするか否かを検出するステップと、を含む。

【0117】

これらのステップは、好ましい実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の一部として実施され得る。ＰＣＲは、好ましくは、オリゴヌクレオチドが目的のエピジェネティック修飾状態を含まない場合に、オリゴヌクレオチドと目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも高い温度で、ＰＣＲのほとんどのステップ、またはすべてのステップが行われるような方法で実施される。ＰＣＲのほとんどのステップ、またはすべてのステップさえもが、ＮＯＩがメチル化されていない場合には、オリゴヌクレオチドと目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも高い温度であるが、ＮＯＩがメチル化されている場合には、オリゴヌクレオチドと目的の標的核酸配列との間の増幅を可能にするのに十分低い温度で実施されるような方法で、ＰＣＲが実施される場合、さらにより好ましい。

【0118】

ＰＣＲは、典型的には、
ｉ．融解温度、
ｉｉ．アニーリングおよび伸長温度
において、複数サイクルのインキュベーションを含む。

【0119】

アニーリングおよび伸長温度は、同じまたは異なる温度であり得る。

【0120】

好ましくは、ＮＯＩがメチル化されていない場合、少なくとも最初のサイクル、好ましくはＰＣＲの１つ以上のサイクル、例えばＰＣＲのほとんどのサイクル、例えばＰＣＲのすべてのサイクルで、アニーリングおよび伸長温度が、オリゴヌクレオチドと目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも高いような方法でＰＣＲが実施される。さらに、温度は、ＮＯＩがメチル化された場合に、オリゴヌクレオチドと目的の標的核酸配列との間の融解温度より最大で２℃高くまたは低くなるように選択され得る。

【0121】

アニーリング温度は、特定のオリゴヌクレオチドに依存するが、例えば、５５～８０℃の範囲であり得る。

【0122】

本発明のいくつかの実施形態では、ＰＣＲのステップの長さおよび／または温度は、ＰＣＲ中に変更される。特に、最初のサイクル、例えば最初の１～５サイクルは、メチル化ＤＮＡがより特異な方法で増幅されるような方法で実施され得る。したがって、ＰＣＲは、１つ以上のエピジェネティック修飾特異的増幅サイクルおよび１つ以上の一般的増幅サイクルを含むことができ、エピジェネティック修飾特異的増幅サイクル（複数可）は、
ａ．核酸を融解するステップと、
ｂ．エピジェネティック修飾特異的条件下でアニーリングする（および伸長させる）ステップと、を含み、
一般的な増幅サイクルは、
ａ．核酸を融解するステップと、
ｂ．一般的な条件下でアニーリングする（および伸長させる）ステップと、を含む。

【0123】

融解は、典型的には少なくとも９０℃である融解温度でのインキュベーションを含む。エピジェネティック修飾特異的条件下でのアニーリングおよび伸長は、通常、一般的条件下でのアニーリングおよび伸長よりも高い温度で、例えば、一般的条件下でのアニーリングおよび伸長に使用される温度より少なくとも１℃高い、例えば少なくとも２℃高い温度で行われる。この方法は、任意の好適な数のエピジェネティック修飾特異的増幅サイクル、例えば、１～１００の範囲のエピジェネティック修飾特異的増幅サイクルを含み得る。

【0124】

アニーリング（および伸長）温度でインキュベートするステップは、任意の好適な時間にわたって実施され得る。例えば、ＰＣＲの少なくとも最初のサイクルは、５～１２０秒の範囲、例えば１０～９０秒の範囲のアニーリング温度でのインキュベーションを含んでもよい。アニーリングはまた、例えば３０～９０秒の範囲で、例えば４５～７５秒の範囲で、例えば約６０秒で実施されてもよい。

【0125】

ＰＣＲは、一般に、目的の標的核酸配列を増幅することができる一組のプライマーの使用を伴う。好ましくは、プライマーのうちの１つは、本発明によるオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは、ベースプライマーである。フォワードプライマーが本発明によるオリゴヌクレオチド、例えばベースプライマーである場合、リバースプライマーは、典型的には従来のプライマーであり、逆もまた同様である。

【0126】

当業者は、ＰＣＲで使用される本発明のオリゴヌクレオチドの有用な濃度を決定することができる。例えば、濃度は、３００～７００ｎＭの範囲内、例えば、約５００ｎＭであってもよい。

【0127】

ＰＣＲは、当業者に知られている任意の好適な方法で実施され得る。一実施形態では、ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲである。リアルタイムＰＣＲは、典型的には、色素などの検出可能な標識の使用を伴う。一実施形態では、ＰＣＲ、例えばリアルタイムＰＣＲは、産物の検出のために検出可能な標識を含むプローブを使用する。プローブは、ＰＣＲ産物を結合できる任意のオリゴヌクレオチドであり得るが、好ましくは、プローブは、少なくとも同じ親和性で、好ましくはプライマーの各々よりも高い親和性でＰＣＲ産物を結合できるオリゴヌクレオチドである。したがって、プローブは、ＰＣＲ反応の産物に対して少なくとも９０％相補的なオリゴヌクレオチドおよび検出可能な標識を含み得る。好ましい実施形態では、疎水性ヌクレオチドは、プローブの親和性を高めるので、プローブは、１つ以上の疎水性ヌクレオチドを含む。

【0128】

ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲである場合、ＰＣＲの結果は、Ｃｔとして決定され得る。したがって、Ｃｔが所与の閾値未満である場合、目的の標的核酸は、メチル化されているとみなされ得る。閾値は、事前に決定するか、または関連対照を使用して決定することができる。

【0129】

プライマーおよびプローブに加えて、ＰＣＲにはＰＣＲ試薬が含有される。当業者は、好適なＰＣＲ試薬を選択することをよく知っている。一般に、ＰＣＲ試薬は、少なくともヌクレオチドおよびポリメラーゼを含む。典型的には、ＰＣＲ試薬は、好適な塩および緩衝液も含む。

【0130】

ポリメラーゼは、ＰＣＲに有用な任意のポリメラーゼ、例えばＰＣＲに有用な任意のＤＮＡポリメラーゼであり得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、鋳型中の任意の疎水性ヌクレオチドで伸長を停止させるポリメラーゼである。これは、日常的にＰＣＲを使用するほとんどの従来のＤＮＡポリメラーゼの場合である。

【0131】

臨床状態
本発明の方法は、ＮＯＩのメチル化を検出するために使用することができ、そのメチル化状態は、臨床状態に関連している。

【0132】

したがって、本発明の方法は、個体が臨床状態に罹患しているか否かのリスク、または個体が臨床状態になるリスクを決定するために使用され得、ここで、臨床状態は、目的の核酸中におけるシトシンなどのＮＯＩのメチル化状態に関連する。このような方法は、通常、
ａ．個体からサンプルを提供するステップと、
ｂ．本発明の方法を実施することにより、上記サンプル中のＮＯＩのメチル化状態を決定するステップと、を含む。

【0133】

いくつかの態様では、個体が臨床状態に罹患しているか否かのリスク、または個体が臨床状態になるリスクを決定するための方法を提供し、ここで、臨床状態は、目的の核酸中におけるＮＯＩのメチル化状態に関連し、本方法は、
ａ．個体から得られたサンプルを提供することと；
ｂ．先行請求項のいずれか一項に記載の方法を実施することによって、サンプル中のＮＯＩのメチル化状態を決定することであって、メチル化状態は、臨床状態の存在または臨床状態になるリスクを示す、決定することと、を含む。

【0134】

本発明の方法はまた、それを必要とする個体における臨床状態の治療の効果の可能性を決定するために使用され得、ここで、臨床状態の治療の効果は、目的の核酸中におけるシトシンのメチル化状態に関連する。このような方法は、通常、
ｉ．個体からサンプルを提供するステップと、
ｉｉ．本発明の方法を実施することにより、上記サンプル中のＮＯＩのメチル化状態を決定するステップと、を含む。

【0135】

本発明のいくつかの態様では、それを必要とする個体における臨床状態の治療の効果の可能性を決定するための方法を提供し、ここで、臨床状態の治療の効果は、目的の核酸中におけるＮＯＩのメチル化状態に関連し、本方法は、
ａ．個体から得られたサンプルを提供することと；
ｂ．本明細書に開示される方法を実施することによって、サンプル中のＮＯＩのメチル化状態を決定することであって、メチル化状態は、臨床状態に対する異なる治療レジメンの効果を示す、決定することと、を含む。

【0136】

いくつかの実施形態では、ＮＯＩは、シトシンである。

【0137】

数種類のがん、例えば、乳がん、結腸がん、および肝がんなど、ならびに疾患、例えば、関節リウマチおよび多発性硬化症など、多くの臨床状態が、１つ以上のＮＯＩのメチル化に関連していることが示されている。したがって、１つ以上のＮＯＩのメチル化状態は、臨床状態の存在、臨床状態の進行、臨床状態の深刻さ、臨床状態の予後、臨床状態を獲得するリスクなどを示し得る。また、異なる治療レジメンの効果は、１つ以上のＮＯＩのメチル化状態と関連していることが示されている。したがって、本発明の方法は、前述のすべての検出に使用することができる。臨床状態は、例えば、がん、例えば神経膠芽腫であり得る。

【0138】

好ましい実施形態では、本明細書で上記に開示された方法は、外科的ステップを伴わない。

【0139】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、患者から単離されたサンプルに対して実施される。いくつかの実施形態では、サンプルは、体液サンプルである。体液サンプルは、血液、尿、痰、母乳、脳脊髄液、耳垢（耳あか）、内リンパ、外リンパ、胃液、粘液、腹水、胸水、唾液、皮脂（ｓｅｂｕｍ）（皮脂（ｓｋｉｎ ｏｉｌ））、精液、汗、涙、膣分泌物、またはそれらの成分もしくは画分を含む嘔吐物サンプルであってもよい。体液サンプルは、混合またはプールされ得る。したがって、体液サンプルは、血液サンプルと尿サンプルとの混合物、または血液サンプルと脳脊髄液サンプルとの混合物であり得る。サンプルはまた、濾過、希釈および／または遠心分離などによって均質化され得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、皮膚、髪、細胞、または組織である。

【0140】

項目
本発明は、以下の項目によってさらに定義され得る：
１．目的の標的核酸配列中の少なくとも１つの目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）のメチル化状態を決定する方法であって、標的核酸配列は、ＮＯＩを含む標的アンカー配列を含み、本方法は、
ａ．アンカー配列（Ａｎ）を含むオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、アンカー配列は、標的アンカー配列に対して少なくとも５０％相補的な配列であり、アンカー配列は、ＮＯＩに対して相補的なヌクレオチドとそのすぐ５’側のオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドとの間に位置する少なくとも１つの疎水性ヌクレオチド（Ｈ）を含む、ステップと；
ｂ．ＮＯＩがメチル化されていない場合、オリゴヌクレオチドと目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも高い温度で、オリゴヌクレオチドを目的の標的核酸とインキュベートするステップと、
ｃ．オリゴヌクレオチドが目的の標的核酸にアニールするか否かを検出するステップと、
それによってメチル化状態を決定するステップと、を含み、
ここで、疎水性ヌクレオチド（Ｈ）は、以下の構造を有する；
Ｘ－Ｙ－Ｑ
（式中、
Ｘは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体、または核酸もしくは核酸類似体の骨格に組み込むことができる骨格モノマー単位であり、
Ｑは、ワトソン・クリック水素結合に参加していないインターカレーターであり；
Ｙは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体または骨格モノマー単位とインターカレーターとを連結するリンカー部分である）、
方法。

【0141】

２．目的の標的核酸が、ＤＮＡである、項目１に記載の方法。

【0142】

３．ＮＯＩがシトシンである、先行項目のいずれか１つに記載の方法。

【0143】

４．シトシンが、ＣｐＧ部位にあり、アンカー配列が、配列－Ｃ－Ｈ－Ｇ－を含む、項目３～４のいずれか１つに記載の方法。

【0144】

５．アンカー配列が、少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも４つ、例えば２～１０の範囲、例えば２～５の範囲、例えば３～５の範囲、例えば４～５の範囲の－Ｎ－Ｈ－Ｇ－配列を含み、ここで、各Ｎは、個別に、Ｃ、Ｇ、ＡおよびＴからなる群から選択され、各配列－Ｎ－Ｇ－は、目的のシトシンとその隣接ヌクレオチドに相補的である、先行項目のいずれか１つに記載の方法。

【0145】

６．ステップｂ）およびｃ）が共に、ＰＣＲを実施することを含み、温度が、ＰＣＲの１つ以上のサイクルにおけるアニーリング温度として使用される、先行項目のいずれか１つに記載の方法。

【0146】

７．オリゴヌクレオチドが、構造５’－Ａｎ－Ｌｐ－Ｓｔ－３’を有し、式中、
Ａｎは、アンカー配列であり；
Ｌｐは、ループ配列であり、目的の核酸配列に相補的でなく、
Ｓｔは、スターター配列であり、配列は、標的スターター配列に対して少なくとも９０％相補的であり、標的スターター配列は、標的アンカー配列の５’に位置する標的核酸配列の配列である、
先行項目のいずれか１つに記載の方法。

【0147】

８．アンカー配列（Ａｎ）は、８～３０の範囲、例えば８～２０の範囲、例えば１０～２０の範囲、例えば１５～２０の範囲のヌクレオチドからなり、ヌクレオチドの１つ以上は、疎水性ヌクレオチド（複数可）である、先行項目のいずれか１つに記載の方法。

【0148】

９．アンカー配列が、配列－Ｎ－Ｈ－Ｇ－を含み、Ｎが、Ｃ、Ｇ、Ａ、およびＴからなる群から選択され、配列－Ｎ－Ｇ－が、目的のシトシンおよびその隣接するヌクレオチドに対して相補的である、先行項目のいずれか１つに記載の方法。

【0149】

１０．ＬｐおよびＳｔが一緒になって、少なくとも１５ヌクレオチド、例えば少なくとも１７ヌクレオチド、例えば１５～４５ヌクレオチドの範囲、例えば１７～３５ヌクレオチドの範囲、例えば１７～２５ヌクレオチドの範囲からなる、項目８～９のいずれか１つに記載の方法。

【0150】

１１．目的の標的核酸配列が、サンプルから精製されたＤＮＡに含まれる、先行項目のいずれかに記載の方法。

【0151】

１２．個体が臨床状態に罹患しているか否かのリスク、または個体が臨床状態になるリスクを決定するための方法であって、ここで、臨床状態は、目的の核酸中におけるＮＯＩのメチル化状態に関連し、本方法は、
ａ．個体からサンプルを提供することと、
ｂ．先行項目のいずれか１つによる方法を実施することによって、サンプル中のＮＯＩのメチル化状態を決定することと、
を含む、方法。

【0152】

１３．それを必要とする個体における臨床状態の治療の効果の可能性を決定するための方法であって、ここで、臨床状態の治療の効果は、目的の核酸中におけるＮＯＩのメチル化状態に関連し、本方法は、
ａ．個体からサンプルを提供することと、
ｂ．項目１～１０のいずれか１つによる方法を実施することによって、サンプル中のＮＯＩのメチル化状態を決定することと、
を含む、方法。

【0153】

１４．臨床状態ががんである、項目１２～１３のいずれか１つに記載の方法。

【0154】

１５．以下の一般構造を含むまたはこの構造からなるオリゴヌクレオチド：
５’（Ｎ）_ｎ－ＨＧ－（Ｎ）_ｍ－ＨＧ－（Ｎ）_ｐ－３’
（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；
Ｇは、ヌクレオチドグアニンであり；
ｎは、０以上の整数であり；
ｍは、１以上の整数であり；
ｐは、０以上の整数であり；
Ｈは、疎水性ヌクレオチドであり、
ここで、疎水性ヌクレオチドは、以下の構造を有し；
Ｘ－Ｙ－Ｑ
式中、
Ｘは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体、または核酸もしくは核酸類似体の骨格に組み込むことができる骨格モノマー単位であり、
Ｑは、ワトソン・クリック水素結合に参加していないインターカレーターであり；
Ｙは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体または骨格モノマー単位とインターカレーターとを連結するリンカー部分である）。

【0155】

１６．すべてのインターカレーターなどの少なくとも１つのＱは、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシルおよびアミドからなる群から選択される１つ以上と任意により置換されたポリアロマート（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｅ）およびヘテロポリアロマート（ｈｅｔｅｒｏｐｏｌｙａｒｏｍａｔｅ）からなる群から選択される、先行請求項のいずれか１つに記載の方法またはオリゴヌクレオチド。

【0156】

実施例
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。

【0157】

実施例１
ＭＧＭＴプロモーター領域
ＭＧＭＴプロモーター領域の目的の配列は、配列番号１として本明細書に含まれる：

【化2】

【0158】

配列は、１２９４６７１２０－１２９４６７３８５ヒト染色体１０、ＧＲＣｈ３８．ｐ１２である。配列番号１の下線を引いた４つのＣＧは、このアッセイがそのメチル化状態を分析するように設計されているＣｐＧ部位である。選択された４つのＣｐＧ部位のうち３つが、市販キット、例えば、Ｑｉａｇｅｎのパイロシーケンシングキットなどでのメチル化検出に一般的に使用されている（Ｑｉａｇｅｎ．（２０１４）ＥｐｉＴｅｃｔ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｆｏｒ ｓａｍｐｌｅ ｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓａｍｐｌｅ＆Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＱＩＡＧＥＮ Ｓａｍｐｌｅ ａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｓａｍｐｌｅ＆Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。

【0159】

ＰＣＲアッセイの一般的な設定
以下の設計は、実施例１２および１３を除いて、すべてのＰＣＲアッセイの設定に使用した。容量は、２５μＬの総反応量を含有する１つのＰＣＲチューブ用である。
１）ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ_２および緩衝液を含有する２ｘマスターミックス＊（ＭＭ）１２．５μＬ
２）プライマー／プローブ（ＰＰ）混合物７．５μＬ
３）精製されたゲノムＤＮＡ ５μＬ

【0160】

実施例１２および１３では、ＰＣＲアッセイの設定のために以下の設計を使用した。容量は、１２μＬの総反応量を含有する１つのＰＣＲチューブ用である。
１）ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ_２および緩衝液を含有する２ｘマスターミックス＊（ＭＭ）６μＬ
２）プライマー／プローブ（ＰＰ）混合物１μＬ
３）精製されたゲノムＤＮＡ ５μＬ
＊特に明記されていない場合、マスターミックス（ＭＭ）は、２ｘＡｍｐｌｉｑｕｅｅｎ（ＰｅｎｔａＢａｓｅ ＡｐＳから入手可能）からなる。ＭｇＣｌ_２の濃度は、Ａｍｐｌｉｑｕｅｅｎの作業溶液で２．２５ｍＭである。

【0161】

すべてのＰＣＲは、ＭｙＧｏＰｒｏ（Ｉｔ－ＩｓＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｌｔｄ）、ＢａｓｅＣｙｃｌｅｒ、またはＢａｓｅＴｙｐｅｒ（ＰｅｎｔａＢａｓｅ ＡｐＳ）リアルタイムＰＣＲ機器のいずれかで実施される。ＲＦＵは、ＰＣＲ機器の標準設定を使用して決定する。

【0162】

Ｔ_ｍおよびΔＴ_ｍ
オリゴヌクレオチドの融解温度は、温度を上げながらオリゴヌクレオチドをその相補的標的と共にインキュベートすることによって実験的に見出される。一般に、オリゴヌクレオチドは、蛍光シグナルが結合に依存するように、蛍光標識で標識される。例えば、オリゴヌクレオチドは、一端で蛍光部分に連結され、他端でクエンチャーに連結され得る。温度が低い場合、プローブは、標的に結合して二本鎖を形成し、それによって蛍光シグナルが発生し、これは、ＲＦＵとして測定される。温度が上昇するにつれて、ＲＦＵは減少し、二本鎖のＴ_ｍに達すると、ＲＦＵの急激な低下が検出され得る。これを図１Ａに示す。Ｔ_ｍでは、融解プロセスの開始時に結合したヌクレオチドの半分が標的から解離する。融解曲線の１次の負の導関数をプロットすることができ、この曲線のピーク（最大）が、プローブの融解温度である（図１Ｂ）。

【0163】

Ｔ_ｍの差は、ある標的に結合したプローブを別の標的に結合した同じプローブから差し引いた差として計算される。

【数1】

【0164】

ΔＣｔおよびΔΔＣｔの計算
Ｃｔは、閾値サイクル、すなわち所定の基準に基づいて産物が検出されるＰＣＲサイクルを指す。一般に、Ｃｔは、蛍光閾値に基づいて決定される。特に明記しない限り、ＰＣＲマシンＭｙＧｏＰｒｏ、ＢａｓｅＣｙｃｌｅｒまたはＢａｓｅＴｙｐｅｒおよびそれらの関連ソフトウェアのデフォルト設定を使用する。閾値の設定は、ソフトウェアによって自動的に行われる。

【0165】

ΔＣｔは、参照アッセイ（すなわち、参照プライマーを使用するアッセイ）とメチル化感受性アッセイ（すなわち、疎水性ヌクレオチドを含むメチル化特異的ベースプライマーを使用するアッセイ）との間で計算される。

【数2】

【0166】

ΔΔＣｔは、非メチル化ＤＮＡを添加した場合のアッセイのΔＣｔと、鋳型としてメチル化ＤＮＡを添加した場合のアッセイのΔＣｔとの差として計算される。

【数3】

【0167】

したがって、ΔＣｔ_{ｎｏｎ．ｍＣ}は、非メチル化ＤＮＡ鋳型を使用した場合の参照アッセイとテストアッセイとのＣｔの差を示す。ΔＣｔ_{ｎｏｎ．ｍＣ}は、本明細書ではΔｎｏｎ．ｍＣとも称する。ΔＣｔ_{ｎｏｎ．ｍＣ}は、アッセイの特異性を示し、可能な限り高いことが好ましい。

【0168】

ΔＣｔ_ｍＣは、参照アッセイとメチル化ＤＮＡ鋳型を使用したメチル化特異的アッセイとの間のＣｔの差を示す。本明細書では、ΔＣｔ_ｍＣは、ΔｍＣとも称される。ΔＣｔ_ｍＣは、可能な限り低いことが好ましいアッセイの感度を示す。

【0169】

ΔΔＣｔは、ΔＣｔ_{ｎｏｎ．ｍＣ}とΔＣｔ_ｍＣとの差であり、これは、好ましくは可能な限り高いべきである。

【0170】

ベースプライマーの説明
ベースプライマーアプローチは、疎水性ヌクレオチドを使用したメチル化ＤＮＡの選択的増幅に基づく。この識別は、本明細書でベースプライマーと名付けられた単一のプライマーによって実現することができる。ベースプライマーは、３つの部分：アンカー配列、ループ配列、およびスターター配列からなる。アンカー配列は、疎水性ヌクレオチドを含有する。アンカー配列は、非メチル化ＤＮＡと比較して、メチル化ＤＮＡに結合したときに、高い熱安定性を有する。したがって、アンカー配列は、プライマーの３’末端に配置されるスターター配列の安定性をもたらすために使用される。スターター配列は、低い熱安定性を有するべきであり、したがって、アンカー配列からのサポートが得られない場合には、ＤＮＡ鋳型に結合しない（図４Ｂ）。ＰＣＲは、アンカー配列が高い熱安定性で結合する場合にのみ開始され、これにより、スターター配列が結合できるようになる（図３Ａ、「サイクル１」）。一般にポリメラーゼは、ＰＣＲ反応で非メチル化ヌクレオチドを含むｄＮＴＰを追加するため、ＰＣＲ中に作成されたアンプリコンには、いかなるメチル化ヌクレオチドも含有されないことに留意されたい。

【0171】

アンカー配列とスターター配列とは、ループ配列で接続されている。ほとんどのポリメラーゼは、疎水性ヌクレオチドを読み取ることができないため、この配列は有益であり、したがって、リバースプライマーが結合して相補鎖が作成されたときに、アンカー配列が切断される。スターター配列は、熱安定性が低く設計されているため、追加配列がなくては、アンプリコンに結合できない。したがって、ループ配列は、プライマーに組み込まれ、それによって、メチル特異的増幅の２サイクル後にループ配列およびスターター配列が、通常のプライマーとして機能できるようになる（図３Ａ、「残りのサイクル」）。

【0172】

実施例２
５－メチルシトシンに対する親和性
上記の配列番号１でマークされた４つのＣｐＧを包含する領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドを合成した。プローブは、５’末端にＦＡＭフルオロフォア、３’末端にブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ）で二重標識した。プローブでは、Ｚ型またはＥ型のいずれか２つの異なる疎水性ヌクレオチドを使用した。

【0173】

Ｚ型の疎水性ヌクレオチドは、化学名３－（１－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル）－２－Ｏ－（２－シアノエチルジイソプロピルアミドホスファイト）－１，２－ブタンジオール）－４－Ｎ－（７，９－ジメチル－３Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－４－オンのホスホロアミダイトを有する。Ｚ型の疎水性ヌクレオチドでは、インターカレーターＱは、以下の構造を有する：

【0174】

【化3】

【0175】

本明細書において、Ｚ型の疎水性ヌクレオチドは、単に「Ｚ」と称され得る。

【0176】

Ｅ型の疎水性ヌクレオチドは、化学名（Ｓ）－１－（４，４’－ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）－３－ピレンメチルオキシ－２－プロパノールのホスホロアミダイトを有する。Ｅ型のこの疎水性ヌクレオチドでは、インターカレーターＱは、以下の構造を有する：

【0177】

【化4】

【0178】

本明細書において、Ｅ型の疎水性ヌクレオチドは、単に「Ｅ」と称され得る。

【0179】

ＺまたはＥのいずれかが、配列番号１の４つのＣｐＧ中のＣとＧとの間に位置するような方法でプローブに組み込まれた。これは、ＥとＺのいずれが、メチル化ＤＮＡ（「５－ｍＣ」と称する）と非メチル化ＤＮＡ（「ｎｏｎ．ｍＣ」と称する）とを最もうまく識別するかをテストするために行われた。

【0180】

さらに、Ｅは、様々な位置でテストした。ＣｐＧのＣとＧとの間に位置するＥを含むプローブは、本明細書ではＥ型のプローブと称する。アニーリング時にＥがＣｐＧの直前に位置するプローブは、Ｅ２型のプローブと称され、アニーリング時にＥがＣｐＧの直後に位置するプローブは、Ｅ３型のプローブと称される。参照として、プローブを、ＥおよびＺを含まずに作製した。異なるプローブの配列を表１に示す。

【0181】

２つの人工標的を設計し、合成した。１つは、いかなるメチル化シトシン（ｍＣ）も含まず、もう１つは、４つのＣｐＧ部位にｍＣを含む。配列を、表１に示す。

【表1】

【0182】

融解温度は、実施例１に記載のとおり決定した。

【0183】

疎水性ヌクレオチドＥ型およびＺ型を含有するプローブは、非メチル化標的（ＭＧＭＴ＿０ｍＣ）と比較した場合、完全にメチル化された標的（ＭＧＭＴ＿１，２，３，４ｍＣ）に結合したときに、高いＴ_ｍを有することが観察された。１，２，３，４ｍＣと０ｍＣとの融解温度の差は、プローブＭＧＭＴ＿Ｚでは、約６．６℃、プローブ用ＭＧＭＴ＿Ｅでは、約９．６℃であった。さらに、参照プローブ（ＭＧＭＴ＿Ｒｅｆ）も、メチル化標的にハイブリダイズしたときに、ｍＣ標的とｎｏｎ．ｍＣ標的との差が３．４℃であり、高いＴ_ｍを有したことが観察された。図４および表２を参照されたい。

【0184】

疎水性ヌクレオチドＥ型の位置を調べた。ＥがＣｐＧのＣとＧとの間に配置された場合（プローブＭＧＭＴ＿Ｅ）に、最良の識別が行われた。疎水性ヌクレオチドをＣｐＧの後に配置した場合（プローブＭＧＭＴ＿Ｅ３）、参照プローブの場合よりも少ない識別が観察された。

【0185】

ＭＧＭＴ＿ＥおよびＭＧＭＴ＿Ｒｅｆとメチル化標的（ＭＧＭＴ＿１，２，３，４ｍＣ）および非メチル化標的（ＭＧＭＴ＿０ｍＣ）の融解の１次の負の導関数の差を、図５に示す。

【表2】

【0186】

実施例３
５－ｍＣの位置および数に関連するＺおよびＥ修飾プローブの親和性
相補的標的を有するＺおよびＥ修飾プローブの融解温度と、標的オリゴ中での５－ｍＣの位置および数との間の相関関係を調査した。それぞれが１つのメチル化ＣｐＧ部位を含む４つの異なる標的を設計した。

【0187】

さらに、２つのメチル化ＣｐＧ部位を有する１つの標的を設計し、４つのメチル化ＣｐＧ部位を有する別の標的を設計した。これは、５ｍＣの数とプローブの融解温度との相関関係を調査するために行った。配列を、表３に示す。

【表3】

【0188】

融解温度における標的中のメチル化部位の位置間に有意差は観察されなかった。

【0189】

プローブのメチル化部位の数と融解温度との相関関係を調査した。非メチル化標的を除外した場合の線形フィットのＲ^２は、０．９９７のＲ^２が得られた。これは、標的がメチル化されている場合に線形相関があることを示している。非メチル化標的は、線形モデルにフィッティングするには、融解温度が低かった。プロットを図６に、生データを表４に示す。

【表4】

【0190】

実施例４
Ａｍｐｌｉｑｕｅｅｎマスターミックスでの融解試験
二本鎖を１ＸＡｍｐｌｉｑｕｅｅｎ（ＰｅｎｔａＢａｓｅ ＡｐＳ）で融解することにより、ＴＭ緩衝液と比較して、融解温度が約５℃低下することが示された（表５を参照）。ＴＭ緩衝液は、０．０２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０２Ｍ ＮａＣｌ、および２ｍＭ ＥＤＴＡを含む。ＭＧＭＴ＿Ｅ／１，２，３，４ｍＣ二本鎖の融解温度は、約７８．５℃であり、ＭＧＭＴ＿Ｅ／０ｍＣ二本鎖の融解温度は、約６９．７℃であった。ＭＧＭＴ／０ｍＣ二本鎖が２本の一本鎖に完全に解離するのは、８０℃で初めてである。これは、融解ピーク後の温度によって見られ、－ｄＦ／ｄＴは、０である。図７を参照されたい。

【表5】

【0191】

実施例５
ベースプライマーの設計
４つの異なる設計のベースプライマーを作製した（表６）。プライマーは、２つの異なるループ配列および２つの異なる長さの３’末端スターター配列を有するように設計した。融解温度は、ループ配列および３’末端スターター配列のＴ_ｍに基づいて計算され、これは、ループ配列がアンプリコンに組み込まれた後、これらの配列が１つのプライマーとして機能するためである。

【表6】

【表7】

【0192】

ベースプライマーのテスト
フォワードプライマーとして表６のベースプライマーおよびリバースプライマーＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｃ使用して、ＰＣＲを設定した（表４）。参照アッセイでは、フォワードプライマーとしてプライマーＭＧＭＴ＿Ｆｗ２ＣおよびリバースプライマーとしてＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｃを使用した（表７）。

【0193】

メチル特異的アッセイは、表７の各ベースプライマー７００ｎＭを７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｃおよび５００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ２Ｅと混合することによって実施した（表７）。参照アッセイは、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃを７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｃおよび５００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ２Ｅと混合することによって行った。ＰＣＲプログラムを表８に示し、ＰＣＲプログラムを最適化するための最適化プロトコールを表９に示す。

【0194】

ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ３ＣおよびＦｗＬｏｏｐ４Ｃのみをプログラムの最適化に使用し、ＦｗＬｏｏｐ４Ｃのみを７９℃でテストした。この実験では、シグナル生成に、１％ ＺＵＢＲ Ｇｒｅｅｎを含有するマスターミックスを使用した。健康なドナーからの１ｎｇ／μＬ非メチル化ＤＮＡおよび１ｎｇ／μＬメチル化ＤＮＡ（細胞株ＩＤＨ Ｕ８７ ＷＴから精製）を実験に使用した。

【表8】

【表9】

【0195】

すべてのベースプライマーがＤＮＡの増幅に有用であることが判明した。ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ３ＢおよびＦｗＬｏｏｐ４Ｂは、参照アッセイと比較してメチル特異的アッセイにおいて高いＣｔ値を有することが判明し、これは、ベースプライマーがメチル化ＤＮＡを低い効率で増幅したことを意味する。ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ３ＣおよびＦｗＬｏｏｐ４Ｃは、メチル化ＤＮＡにおいて低いΔＣｔを有し、これはベースプライマーが参照アッセイとほぼ同じ効率で、メチル化ＤＮＡを増幅したことを意味する。しかし、ＦｗＬｏｏｐ３ＣおよびＦｗＬｏｏｐ４Ｃは、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとをうまく識別できなかった（ΔΔＣｔ＜０．５）。２つのベースプライマーを、より短いアニーリング時間およびより高い温度でテストし、識別が改善された（図８を参照）。

【0196】

７７℃および７９℃の両方のアニーリング温度で、アニール時間が２０秒から３０秒に延長したときに、メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡの両方のΔＣｔが低下することが観察された（図８）。これは、ベースプライマーがメチル化された鋳型に高効率でアニーリングするのに、より多くの時間を必要とすることを示している。最高のΔΔＣｔは、７９℃、３０秒間であり、４．４６±０．８６であった。

【0197】

実施例６
メチル特異的前増幅
ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ４Ｃを、メチル特異的前増幅を用いたＰＣＲプログラムでテストした（表１０）。メチル特異的アッセイは、７００ｎＭのＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ４Ｃを７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｃと混合することによって行った。参照アッセイは、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃを７００ｎＭ Ｒｅｖ２Ｃと混合することによって行った。１％ ＺＵＢＲ Ｇｒｅｅｎを含有するマスターミックスを、参照アッセイおよびメチル特異的アッセイの両方で使用した。結果を、アニーリング設定として７９℃で２０秒間の通常の２段階増幅と比較した。上記の実施例と同じ実験設定を使用した。

【表10】

【0198】

ΔＣｔおよびΔΔＣｔは、上記の実施例１に記載のとおり決定した。

【0199】

メチル特異的前増幅サイクリングは、メチル特異的アッセイにおいて、メチル化ＤＮＡのＣｔ値を低くし、非メチル化ＤＮＡのＣｔ値を高くし、これにより、メチル化の識別がΔΔＣｔ値９．９３に改善された。表１１を参照されたい。メチル特異的前増幅ＰＣＲのＰＣＲ曲線を図９に示す。しかし、メチル特異的アッセイでのメチル化ＤＮＡのＣｔ値は、前増幅では依然として高く、ループ配列およびスターター配列は、２段階の非メチル特異的増幅において十分に増幅されなかったと考えられた。

【表11】

【0200】

実施例７
より高いＴ_ｍでのベースプライマーの設計
ベースプライマーは、２段階増幅で高温で働くように、相補配列と３’末端スターター配列に対してより高い親和性を有するループ配列で設計された。設計を、表１２に示す。通常のプライマーを使用する代わりに、これらのプライマーの５’末端に疎水性ヌクレオチドを追加することによって、ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２ＣおよびＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｃの親和性が上昇した。

【表12】

【0201】

新しいベースプライマーは、２段階増幅における最適なアニーリング時間および温度を見出すために、前増幅を行わずに最初に分析した。代わりに、フォワードプライマーとしてＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｃを使用して、「メチル特異的前増幅」で説明したとおりにアッセイを混合した。ＰＣＲプログラムＤは、表１３に従って変更した。ＳＷ１０８８細胞株は、本実験および次の実験にも使用した。

【表13】

【0202】

ΔＣｔおよびΔΔＣｔは、上記の実施例１に記載のとおり決定した。

【0203】

ベースプライマーＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｃの異なるアニーリング時間および温度でのΔＣｔおよびΔΔＣｔについて得られた結果を図１０に示す。アニーリング温度を高くすることにより（時間は３０秒に固定）、メチル化ＤＮＡＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡの両方のメチル特異的増幅が悪化することが判明した。メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの最良の識別は、８０℃で観察された。

【0204】

実施例８
ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｃの滴定
ベースプライマーは、ＰＣＲプログラムＥを使用したメチル特異的前増幅でテストしたが、前増幅の第２の段階では８１℃を使用し、２段階増幅の第２の段階では、７９℃および８０℃の両方でテストした。

【表14】

【0205】

ＰＣＲプログラムＥを使用するが、前増幅の第２の段階で８１℃、および２段階増幅の第２の段階で８０℃を使用し、ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｃを、濃度５００ｎＭ、７００ｎＭ、および９００ｎＭで滴定した。濃度の変動を除いて、アッセイは、セクション「より高いＴ_ｍでのベースプライマーの設計」に記載のとおり行った。

【0206】

ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｃは、メチル特異的前増幅を使用して分析した。５００ｎＭのＦｗＬｏｏｐ５Ｃが、ベースプライマーの最適濃度であった。ここで、ΔΔＣｔは１２．６であり、メチル化ＤＮＡのΔＣｔは９．８であった。濃度が高いほど、メチル特異的増幅の悪化となる。表１４の結果を参照されたい。

【表15】

【0207】

実施例９
１－保持メチル特異的増幅のテスト
メチル特異的前増幅の代わりに、１段階メチル特異的保持を調査するために、ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｃを使用した。アッセイは、７００ｎＭの代わりに５００ｎＭのＦｗＬｏｏｐ５Ｃを使用して、セクション「より高いＴ_ｍでのベースプライマーの設計」に記載のとおり行った。ＰＣＲプログラムＦを使用した（表１５）。メチル保持時間は、６０秒間および１２０秒間、８０℃でテストした。

【表16】

【0208】

ベースプライマーの特異性を高めるために、５サイクルのメチル特異的増幅をメチル保持に変更した。８０℃で６０秒間（図１１を参照）は、表１４に示す５サイクルのメチル特異的増幅よりも優れていることが判明した。ΔΔＣｔは、１２．６から１４．８に増加した。生データを表１６に示す。

【表17】

【0209】

実施例１０
方法の検証
方法は、直線性および感度の試験を使用して、患者サンプルの評価によってさらに検証した。すべての検証サンプルは、ＰＣＲプログラムＦで二重にテストした。メチル特異的アッセイは、５００ｎＭ ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｃを７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｃ＿ｓｕＥと混合することによって行った。参照アッセイは、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ＿ｓｕＥを７００ｎＭ Ｒｅｖ２Ｃ＿ｓｕＥと混合することによって行った。１％ ＺＵＢＲ Ｇｒｅｅｎを含有するマスターミックスを、参照アッセイおよびメチル特異的アッセイの両方で使用した。

【0210】

参照およびメチル特異的アッセイの直線性
メチル化鋳型（ＳＷ１０８８細胞から精製したＤＮＡ）および非メチル化鋳型（健康な患者の血液から精製したＤＮＡ）について直線性試験を実施した。鋳型は、濃度５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６、０．７８ｎｇ／μＬに希釈し、参照およびメチル特異的アッセイの両方に追加した。標準曲線は、次式にフィットさせた（Ｋｕｂｉｓｔａら、２００６）：

【数4】

式中、ｋは傾きであり、ｑは、サンプル中のＤＮＡ分子の初期数である。
ＰＣＲ効率は、次式で計算した（Ｋｕｂｉｓｔａら、２００６）：

【数5】

【0211】

直線性は、メチル特異的アッセイと比較して、参照アッセイの方が優れていた。直線性は、参照アッセイ上のメチル化鋳型（Ｒ^２＝０．９８）と比較して、非メチル化鋳型（Ｒ^２＝０．９９８）の方が優れていた。メチル特異的アッセイでは逆の結果が見られ、直線性は、非メチル化鋳型（Ｒ^２＝０．８１１）と比較して、メチル化鋳型（Ｒ^２＝０．８７３）が最も優れていた。図１２を参照されたい。

【0212】

ＰＣＲ効率は、非メチル化鋳型では１００％を超え、メチル化鋳型では１００％未満であった。これにより、参照アッセイおよびメチル特異的アッセイ（ＦｗＬｏｏｐ５Ｃ）の両方が説明される。結果を表１７に示す。

【表18】

【0213】

メチル特異的アッセイの感度
メチル特異的アッセイの感度は、ＳＷ１０８８からの精製ＤＮＡ ２ｎｇ／μＬと健康な患者の血液からの精製ＤＮＡ ２ｎｇ／μＬを混合することによって分析した。次の濃度を作製した：１００％、５０％、２５％、１０％、５％、１％および０％メチル化。感度は、ＭｙＧｏ Ｐｒｏ機器で実施した。

【0214】

感度は５％であり、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの明確な識別は、ΔＣｔ＝１８で設定できた。メチル化率％とΔＣｔとの間に直線性は観察されなかった（図１３を参照）。

【0215】

結果から、ΔＣｔに基づいて患者を高メチル化、低メチル化、および非メチル化に大まかに分類するための提案を行うことができる。表１８を参照されたい。

【表19】

【0216】

実施例１１
変異（ミスマッチ）プローブの融解試験
溶融拡張試験は、ＭＧＭＴ＿Ｅプローブを使用して、配列中にいくつかのミスマッチヌクレオチドを意図的に追加することによって行った。２つのプローブは、２つの変異（２つのミスマッチにつながる）で作製し、３つのプローブは、１つの変異（１つのミスマッチにつながる）で作製した。配列を、表２０に示す。実験の設定は、セクション「５－メチルシトシンに対する親和性」と同じであった。

【表20】

【0217】

標的配列とのミスマッチを有するプローブは、ＭＧＭＴ＿Ｅ＿Ｍ２を除いて、非メチル化ＤＮＡよりも、メチル化ＤＮＡに対する特異性（ΔＴ_ｍ）に影響を与えることなく、二本鎖の融解温度を低下させることが判明し、ここでは、ΔＴ_ｍのわずかな低下が観察された。結果を図１４に示し、生データを表２１に示す。この実験は、特異性を低下させることなく、例えばいくつかの高親和性ＣｐＧ部位にまたがるメチル化特異的プライマーの親和性を低下させることが可能であることを示している。

【表21】

【0218】

実施例１２
アンカー配列中に単一のミスマッチを有するベースプライマーの感度
アンカー配列中に単一のミスマッチを有するベースプライマーは、ＭＧＭＴプロモーター領域からの合成ＤＮＡで行われた感度試験を使用して評価した。合成ＤＮＡは、製造業者のプロトコールに従って、ＣｐＧメチルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してメチル化した。希釈濃度５００コピー／μＬの完全にメチル化されたＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを混合して、１００％、５０％、２５％、１２．５％、６．３％、３．１％、および０％のメチル化鋳型を得た。７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｅ、および５００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ２Ｅは、参照アッセイに使用し、メチル特異的アッセイには、ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃの代わりに７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｄ＿Ｍ５を使用した（配列については、表２２を参照されたい）。この試験は、ＰＣＲプログラムＧ（表２３を参照）を使用して、ＢａｓｅＴｙｐｅｒ（商標）リアルタイムＰＣＲ機器（ＰｅｎｔａＢａｓｅ、Ｏｄｅｎｓｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で実施した。

【表22】

【表23】

【0219】

最低検出サンプルには６．３％のメチル化ＤＮＡが含有されており、ΔＣｔとｌｏｇ（メチル化率％）との間に線形相関が観察された（図１５を参照）。線形相関に基づいて、ΔＣｔ値に基づいてメチル化の程度を定量化することが可能である。

【0220】

アンカー配列とスターター配列との塩基対数の調査
前述のベースプライマーでは、スターター配列は、アンカー配列のすぐ３’末端で標的配列に相補的であった。アンカー配列中に単一のミスマッチを有する新しいベースプライマーは、相補的な標的配列上のアンカー配列の３’末端とスターター配列の５’末端との間にヌクレオチドのギャップを有するように設計した（図１６を参照）。ベースプライマーは、２つの長さのスターター配列（ＡおよびＢ）を使用して、０、２、４、６、および８ヌクレオチドのギャップを有するように設計した。表２４を参照されたい。

【表24】

【0221】

７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ、７００ｎ ＭＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｅ、および５００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ２Ｅを参照アッセイに使用し、メチル特異的アッセイには、ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃの代わりに、表２４に列挙されている７００ｎＭのベースプライマーを使用した。５００コピー／μＬの非メチル化、１００％メチル化、および１０％メチル化合成ＤＮＡを鋳型として使用した。ＰＣＲは、ＢａｓｅＴｙｐｅｒ上でＰＣＲプログラムＨ（表２５を参照）を使用して実施した。

【表25】

【0222】

ＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｂ＿Ｍ５＿８ＡおよびＭＧＭＴ＿ＦｗＬｏｏｐ５Ｂ＿Ｍ５＿８Ｂを除いて、すべての設計が１００％ｍＣ、１０％ｍＣ、およびｎｏｎ．ｍＣ ＤＮＡを識別できることがわかった（図１７を参照）。

【0223】

実施例１３
補助プライマー複合体

【0224】

別のメチル識別プライマー設計をテストした。メチル識別プライマー複合体は、アンカー配列およびステム配列を含む補助プライマーからなる。複合体の他の部分は通常のプライマーであり、補助プライマーのステム配列に部分的に相補的であり、標的配列に部分的に相補的である。非メチル化ＤＮＡに対するメチル化ＤＮＡの識別は、ベースプライマーと同じ原理によって行われる。しかし、メチル化ＤＮＡでＰＣＲが開始された後は、通常のプライマーが残りのサイクルに使用される。この原理を図１８に示す。

【0225】

補助プライマー複合体は、表２６に示す配列でテストした。参照アッセイには、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃ、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｒｅｖ２Ｅ、および５００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｐｒｏｂｅ２Ｅを使用し、メチル特異的アッセイには、ＭＧＭＴ＿Ｆｗ２Ｃの代わりに、７００ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ｐｒｉｍｅｒ＿１Ｄおよび５０ｎＭ ＭＧＭＴ＿Ａｓｓｉｓｔ＿１Ａ＿Ｅを使用した。５００コピー／μＬ非メチル化および１００％メチル化合成ＤＮＡを鋳型として使用した。ＰＣＲは、ＢａｓｅＴｙｐｅｒ上でＰＣＲプログラムＨ（表２５を参照）を使用して実施した。

【表26】

【0226】

ＰＣＲ曲線を図１９に示す。ΔＣｔは、１００％メチル化ＤＮＡで５．６、非メチル化ＤＮＡで９．５であり、ΔΔＣｔは、３．９であった。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【配列表】

2023540161000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-03-13

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

エピジェネティック修飾状態、例えば、目的の非修飾標的核酸配列中の少なくとも１つの目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）のメチル化状態を決定する方法であって、前記標的核酸配列は、前記ＮＯＩを含む標的アンカー配列を含み、前記方法が、
ａ．アンカー配列（Ａｎ）を含むオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、前記アンカー配列は、前記標的アンカー配列に対して少なくとも５０％相補的な配列であり、前記アンカー配列は、前記ＮＯＩに対して相補的な前記ヌクレオチドとそのすぐ５’側にあるヌクレオチドとの間に位置する少なくとも１つの疎水性ヌクレオチド（Ｈ）を含む、ステップと；
ｂ．前記ＮＯＩがメチル化などの修飾をされていない場合、前記オリゴヌクレオチドと前記目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも高い温度で、前記オリゴヌクレオチドを前記目的の標的核酸とインキュベートするステップと、
ｃ．前記オリゴヌクレオチドが前記目的の標的核酸にアニールするか否かを検出するステップと、
それにより、前記エピジェネティック修飾状態、例えば前記メチル化状態を決定するステップと、を含み、
ｉ．ここで、前記疎水性ヌクレオチド（Ｈ）は、以下の構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
を有し、式中、
Ｘは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体、または核酸もしくは核酸類似体の骨格に組み込むことができる骨格モノマー単位であり、
Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に参加していないインターカレーターであり；
Ｙは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体または骨格モノマー単位と前記インターカレーターとを連結するリンカー部分であり、
ｉｉ．前記オリゴヌクレオチドは、構造５’－Ａｎ－Ｌｐ－Ｓｔ－３’を有し、
式中、Ａｎは、アンカー配列であり；
Ｌｐは、前記目的の標的核酸配列に対して相補的でないループ配列であり、前記ループ配列は、ループ構造もしくはステム構造などの突出構造を形成することができる単一の核酸配列からなるか、またはループ構造もしくはステム構造などの突出構造を形成することができる複合体を形成するために、少なくとも部分的に互いにハイブリダイズすることができる２つ以上の核酸配列からなり；
Ｓｔは、スターター配列であり、標的スターター配列にハイブリタイズすることができ、前記標的スターター配列が、前記標的アンカー配列の５’に位置する前記標的核酸配列の配列である、方法。

【請求項2】

前記目的の標的核酸が、ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記目的の標的核酸が、ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記方法を実施する前に、前記目的の非修飾核酸配列が、バイサルファイト変換、制限酵素消化、またはＴＥＴ酵素変換を含む処理に供されていない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＮＯＩが、シトシンである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

Ａ．
ｉ．前記目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合に、前記疎水性ヌクレオチド（複数可）を含む前記オリゴヌクレオチドであって、前記目的の核酸配列が、少なくとも１つのメチル化シトシンなどの少なくとも１つのメチル化ＮＯＩを含む、オリゴヌクレオチドと；
ｉｉ．前記目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合に、前記疎水性ヌクレオチド（複数可）を含む前記オリゴヌクレオチドであって、前記目的の核酸配列が、メチル化シトシンなどのメチル化ＮＯＩを含まない、オリゴヌクレオチドと；の融解温度の絶対差、および
Ｂ．
ｉ．Ａ．の前記オリゴヌクレオチドと同一であるが、前記目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合、前記疎水性ヌクレオチド（複数可）を含まないオリゴヌクレオチドであって、前記目的の核酸配列が、Ａ．ｉ．と同数のメチル化ＮＯＩ、例えばＡ．ｉ．と同数のメチル化シトシンなどを含む、オリゴヌクレオチド；と
ｉｉ．Ａ．の前記オリゴヌクレオチドと同一であるが、前記目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合、前記疎水性ヌクレオチド（複数可）を含まないオリゴヌクレオチドであって、前記目的の核酸配列が、メチル化シトシンなどのメチル化ＮＯＩを含まない、オリゴヌクレオチド；との融解温度の絶対差が、
前記目的の標的核酸配列においてメチル化されていない代わりに、メチル化されているシトシンなどのＮＯＩあたり、少なくとも０．５０℃、例えば少なくとも０．７５℃、好ましくは少なくとも１．０℃の差であり、ここで前記差は、Ａ－Ｂであり、前記差は、正の差であり、ここで、前記融解温度は、０．０２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０２Ｍ ＮａＣｌ、および２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＭ緩衝液中で測定される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

ｉ．前記目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合に、前記疎水性ヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチドであって、前記目的の核酸配列が、少なくとも１つのメチル化シトシンなどの少なくとも１つのメチル化ＮＯＩを含む、オリゴヌクレオチドと；
ｉｉ．前記目的の標的核酸配列にハイブリダイズした場合に、前記疎水性ヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチドであって、前記目的の核酸配列が、メチル化シトシンなどのメチル化ＮＯＩを含まない、オリゴヌクレオチドと；の融解温度間の絶対差が、
前記目的の標的核酸配列においてメチル化されていない代わりに、メチル化されているシトシンなどのＮＯＩあたり、少なくとも１．６℃、例えば少なくとも１．８℃、例えば少なくとも２．０℃、例えば少なくとも２．２℃、好ましくは少なくとも２．４℃であり、前記融解温度は、０．０２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０２Ｍ ＮａＣｌ、および２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＭ緩衝液中で測定される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記アンカー配列が、配列－Ｎ－Ｈ－Ｇ－を含み、式中、－Ｇ－が、前記目的のシトシンに対して相補的であり、－Ｎ－が、Ｃ、Ｇ、ＡおよびＴからなる群から選択され、前記目的のシトシンの隣接ヌクレオチドに対して相補的である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記シトシンが、ＣｐＧ部位にあり、前記アンカー配列が、配列－Ｃ－Ｈ－Ｇ－を含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記アンカー配列が、少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも４つ、例えば１～１０の範囲、例えば２～１０の範囲、例えば３～１０の範囲、例えば４～１０の範囲の疎水性ヌクレオチド（Ｈ）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記アンカー配列が、少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも４つ、例えば２～１０の範囲、例えば２～５の範囲、例えば３～５の範囲、例えば４～５の範囲の－Ｎ－Ｈ－Ｇ－配列を含み、ここで、各Ｎは、個別に、Ｃ、Ｇ、ＡおよびＴからなる群から選択され、各配列－Ｎ－Ｇ－は、目的のシトシンとその隣接ヌクレオチドに相補的である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

２つ以上のＮＯＩがＣｐＧ部位に位置し、前記アンカー配列が、少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも４つ、例えば２～５の範囲、例えば３～５の範囲、例えば４～５の範囲の－Ｃ－Ｈ－Ｇ－配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

ステップｂ）およびｃ）が共に、ＰＣＲを実施することを含み、前記温度が、前記ＰＣＲの１つ以上のサイクルにおける前記アニーリング温度として使用される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記オリゴヌクレオチドが、２つ、３つ、またはそれ以上の別個のオリゴヌクレオチドなどの、２つ以上の別個のオリゴヌクレオチドとしてコードされる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記オリゴヌクレオチドが単一のオリゴヌクレオチドとしてコードされる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記オリゴヌクレオチドが、第１および第２の核酸配列からなり、前記第１の核酸配列は、前記標的ＤＮＡに対して相補的な前記アンカー配列（Ａｎ）と、前記目的の標的核酸配列に対して相補的でないループ配列の第１の部分とを含み、前記第２の核酸配列は、前記ループ配列の前記第１の部分に少なくとも部分的にハイブリダイズすることができる前記ループ配列の第２の部分を含み、前記第２の核酸配列は、前記スターター配列（Ｓｔ）をさらに含み、前記第１および第２の核酸は、ハイブリダイズすると、突出構造を形成することができる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記アンカー配列（Ａｎ）が、８～３０の範囲、例えば８～２０の範囲、例えば１０～２０の範囲、例えば１５～２０の範囲のヌクレオチドからなり、前記ヌクレオチドの１つ以上は、疎水性ヌクレオチド（複数可）である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記アンカー配列（Ａｎ）が、前記標的アンカー配列に対して少なくとも８５％相補的である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記スターター配列（Ｓｔ）が、標的スターター配列に対して１００％相補的である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記標的アンカー配列および前記標的スターター配列が、互いから１０ヌクレオチド以内、例えば８ヌクレオチド以内、例えば５ヌクレオチド以内に位置する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

ＬｐおよびＳｔが、Ｌｐ－Ｓｔからなるオリゴヌクレオチドが、その相補的配列と共に少なくとも５０℃、例えば少なくとも５５℃、例えば少なくとも６５°Ｃの融解温度を有するように選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

ＬｐおよびＳｔが一緒になって、少なくとも１５ヌクレオチド、例えば少なくとも１７ヌクレオチド、例えば１５～４５ヌクレオチドの範囲、例えば１７～３５ヌクレオチドの範囲、例えば１７～２５ヌクレオチドの範囲からなる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

Ｌｐが疎水性ヌクレオチドを含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

Ｌｐが、２つ以上の核酸配列からなり、Ｓｔ配列に共有結合により連結していない前記核酸配列（複数可）が、１つ以上の疎水性ヌクレオチドを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

Ｓｔが疎水性ヌクレオチドを含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記オリゴヌクレオチドと前記目的のメチル化標的核酸配列との間の前記融解温度が、前記オリゴヌクレオチドと前記目的の非メチル化標的核酸配列との間の前記融解温度よりも、少なくとも５℃高い、例えば少なくとも６℃高い、例えば６～１５℃高い範囲、例えば６～１２℃高い範囲である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

目的の非メチル化標的核酸配列と比較した、前記オリゴヌクレオチドと前記メチル化標的核酸配列との間の融解温度の前記差は、非メチル化標的核酸配列と比較して、前記疎水性ヌクレオチドを欠いていることを除いて同一配列のオリゴヌクレオチドと前記メチル化標的核酸配列との間の融解温度の差より少なくとも１℃高い、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

ステップｂ）およびｃ）が共に、リアルタイムＰＣＲを実施することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記Ｃｔが、非メチル化標的核酸配列を鋳型として使用して行った対照ＰＣＲのＣｔよりも低い場合に、前記目的の核酸がメチル化されているとみなされる、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

ステップｂ）およびステップｃ）が共に、ＰＣＲを実施することを含み、前記ＰＣＲの少なくとも最初のサイクルが、前記ＮＯＩがメチル化されていない場合、前記オリゴヌクレオチドと前記目的の標的核酸配列との間の前記融解温度よりも高いアニーリング温度を使用する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

ステップｂ）の前記温度が、前記ＮＯＩがメチル化されていない場合の前記オリゴヌクレオチドと前記目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも少なくとも２℃高い、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

ステップｂ）およびステップｃ）が共に、ＰＣＲを実施することを含み、前記ＰＣＲの少なくとも最初のサイクルが、前記ＮＯＩがメチル化されていない場合、前記オリゴヌクレオチドと前記目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも高く、前記ＮＯＩがメチル化されている場合、前記オリゴヌクレオチドと前記目的の標的核酸配列との間の前記融解温度より最大で４℃高い、例えば最大で２℃高い、同じかまたは低い、アニーリング温度を使用する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

ステップｂ）およびステップｃ）が共に、ＰＣＲを実施することを含み、前記ＰＣＲの少なくとも最初のサイクルが、前記ＮＯＩがメチル化されていない場合、前記オリゴヌクレオチドと前記目的の標的核酸配列との間の融解温度よりも高く、前記ＮＯＩがメチル化されている場合、前記オリゴヌクレオチドと前記目的の標的核酸配列との間の前記融解温度より最大で４℃高い～最大で４℃低い、アニーリング温度を使用する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

ステップｂ）およびｃ）が共に、ＰＣＲを実施することを含み、前記ＰＣＲの少なくとも最初のサイクルが５５℃～８０℃の範囲のアニーリング温度を使用する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記ＰＣＲの少なくとも最初のサイクルが、３０～１２０秒の範囲の間、前記アニーリング温度でインキュベーションすることを含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

ステップｂ）中の前記オリゴヌクレオチドの濃度が、３００～７００ｎＭの範囲である、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項37】

前記ＰＣＲが、１つ以上のメチル特異的増幅サイクルおよび１つ以上の一般的増幅サイクルを含み、前記メチル特異的増幅サイクル（複数可）が、
ａ．核酸を融解するステップと、
ｂ．メチル特異的条件下でのアニーリングおよび伸長ステップと、を含み、
前記一般的増幅サイクルが、
ａ．核酸を融解するステップと、
ｂ．一般的な条件下でのアニーリングおよび伸長ステップと、を含み、
ここで、前記融解することは、少なくとも９０℃の温度でインキュベーションすることを含み、メチル特異的条件下での前記アニーリングおよび前記伸長は、一般的条件下でのアニーリングおよび伸長よりも高い温度で実施される、請求項１３～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記アニーリングが、４５～９０秒の範囲で、例えば４５～７５秒の範囲で、例えば約６０秒間行われる、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

１～１００の範囲のメチル特異的増幅サイクルを含む、請求項３７～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記ＰＣＲが、前記オリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして使用して実施され、前記ＰＣＲが、前記目的の標的核酸配列の下流にある配列と少なくとも９０％同一、例えば１００％同一であるリバースプライマーの使用をさらに含む、請求項１３～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記ＰＣＲが、ＰＣＲ産物の検出のための検出可能なプローブの使用を含み、前記プローブが、前記ＰＣＲ反応の産物に少なくとも９０％相補的なオリゴヌクレオチドおよび検出可能な標識を含む、請求項１３～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記プローブが１つ以上の疎水性ヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

目的の標的核酸配列が、サンプルから精製されたＤＮＡに含まれる、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項44】

前記サンプルが、前記目的の核酸のメチル化に関連する臨床状態を患っているか、またはその臨床状態を有するリスクがある個体から得られたサンプルである、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

目的の核酸を前処理して、メチル化ヌクレオチドを検出可能な部分に変換するステップを含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

バイサルファイト変換ステップを含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

個体が臨床状態に罹患しているか否かのリスク、または個体が臨床状態になるリスクを決定するための方法であって、ここで、前記臨床状態は、目的の核酸中におけるＮＯＩのメチル化状態に関連し、
ａ．前記個体から得られたサンプルを提供することと；
ｂ．先行請求項のいずれか一項に記載の方法を実施することによって、前記サンプル中の前記ＮＯＩの前記メチル化状態を決定することであって、前記メチル化状態は、前記臨床状態の存在または前記臨床状態になるリスクを示す、決定することと、を含む、方法。

【請求項48】

それを必要とする個体における臨床状態の治療の効果の可能性を決定するための方法であって、ここで、前記臨床状態の前記治療の前記効果は、目的の核酸中におけるＮＯＩの前記メチル化状態に関連し、
ａ．前記個体から得られたサンプルを提供することと；
ｂ．請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法を実施することによって、前記サンプル中の前記ＮＯＩの前記メチル化状態を決定することであって、前記メチル化状態は、前記臨床状態に対する異なる治療レジメンの効果を示す、決定することと、を含む、方法。

【請求項49】

前記臨床状態ががんである、請求項４７～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記がんが、神経膠芽腫である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

以下の一般構造を含むか、またはこの構造からなるオリゴヌクレオチド：
５’（Ｎ） _ｎ －ＨＧ－（Ｎ） _ｍ －ＨＧ－（Ｎ） _ｐ －ＨＧ－（Ｎ） _ｑ －３’
（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；
Ｇは、ヌクレオチドグアニンであり；
ｎは、０以上の整数であり；
ｍは、１以上の整数であり；
ｐは、１以上の整数であり；
ｑは、０以上の整数であり；
Ｈは、疎水性ヌクレオチドであり、
ここで、前記疎水性ヌクレオチドは、以下の構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
を有し、式中、
Ｘは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体、または核酸もしくは核酸類似体の骨格に組み込むことができる骨格モノマー単位であり、
Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に参加していないインターカレーターであり；
Ｙは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体または骨格モノマー単位と前記インターカレーターとを連結するリンカー部分である）。

【請求項52】

前記オリゴヌクレオチドが、以下の一般構造を含むか、またはこの構造からなる、請求項５１に記載のオリゴヌクレオチド：
５’（Ｎ）_ｎ－ＨＧ－（Ｎ）_ｍ－ＨＧ－（Ｎ）_ｐ－ＨＧ－（Ｎ）_ｑ－ＨＧ－（Ｎ）_ｕ－３’
（式中、
ｑは、１以上の整数であり；
ｕは、０以上の整数である）。

【請求項53】

ｎが、０～４の範囲の整数であり、例えばｎが１である、請求項５１～５２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項54】

ｍが、１～８の範囲、例えば１～６の範囲の整数である、請求項５１～５３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項55】

ｐが、１～５０の範囲、例えば１～３０の範囲、例えば１～１０の範囲、例えば１～６の範囲の整数である、請求項５１～５４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項56】

ｑが、１～５０の範囲、例えば１～３０の範囲、例えば１～１０の範囲、例えば１～６の範囲の整数である、請求項５１～５５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項57】

ｕが、１～５０の範囲、例えば１～３０の範囲、例えば１～１０の範囲、例えば１～６の範囲の整数である、請求項５１～５６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項58】

少なくとも１つのＨのすぐ５’側にある前記ヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）である、請求項５１～５７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項59】

Ｈのすぐ５’側にあるすべてのヌクレオチドが、シトシン（Ｃ）である、請求項５１～５８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項60】

すべてのインターカレーターなどの少なくとも１つのＱが、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシルおよびアミドからなる群から選択される１つ以上と任意により置換されたポリアロマート（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｅ）およびヘテロポリアロマート（ｈｅｔｅｒｏｐｏｌｙａｒｏｍａｔｅ）からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法またはオリゴヌクレオチド。

【請求項61】

前記ポリアロメートまたはヘテロポリアロメートが、少なくとも３つの環、例えば４つの環からなる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法またはオリゴヌクレオチド。

【請求項62】

前記インターカレーターが、ベンゼン、ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ａｓ－インダセン、ｓ－インダセン、ビフェニレン、アセナフチレン、フェナレン、ヘプタレン、フェナントラン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒａｎｅ）、フルオランテン、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、ピレン、アントラセン、ナフテン（ｎａｐｔｈｅｎｅ）、フェナントレン、フルレン（ｆｌｕｒｅｎｅ）、ピセン、クリセン、ナフタセン（ｎａｐｈｔａｃｅｎｅ）、アクリドン、ベンゾアントラセン、スチルベン、オキサロピリドカルバゾール、アジドベンゼン、ポルフィリンおよびソラレン、ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法またはオリゴヌクレオチド。

【請求項63】

すべてのインターカレーターなどの少なくとも１つのＱが、ピレンまたはピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－４（１Ｈ）－オンまたは７，９－ジメチル－ピリド［３’，２’，４，５］チエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－４（３Ｈ）－オンを含むか、またはこれらからなる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法またはオリゴヌクレオチド。

【請求項64】

少なくとも１つ、例えばすべての骨格モノマー単位が、ホスホロアミダイトからなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法またはオリゴヌクレオチド。

【請求項65】

前記オリゴヌクレオチドが、請求項４３～５９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドである、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

以下の一般構造を含むか、またはこの構造からなるオリゴヌクレオチド：
５’（Ｎ）_ｎ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｍ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｐ－３’
（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；
Ｃは、ヌクレオチドシトシンであり；
Ｇは、ヌクレオチドグアニンであり；
ｎは、０以上の整数であり；
ｍは、１以上の整数であり；
ｐは、０以上の整数であり；
Ｈは、疎水性ヌクレオチドであり、
ここで、疎水性ヌクレオチドは、以下の構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
を有し、式中、
Ｘは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体、または核酸もしくは核酸類似体の骨格に組み込むことができる骨格モノマー単位であり、
Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に参加していないインターカレーターであり；
Ｙは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体または骨格モノマー単位と前記インターカレーターとを連結するリンカー部分である）。

【請求項67】

前記オリゴヌクレオチドが、以下の一般構造を含むか、またはこの構造からなる、請求項６６に記載のオリゴヌクレオチド：
５’（Ｎ）_ｎ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｍ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｐ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｑ－３’
（式中、
ｐは、１以上であり；
ｑは、０以上の整数である）。

【請求項68】

前記オリゴヌクレオチドが、以下の一般構造を含むか、またはこの構造からなる、請求項６６～６７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド：
５’（Ｎ）_ｎ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｍ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｐ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｑ－ＣＧＨ－（Ｎ）_ｕ－３’
（式中、
ｑは、１以上の整数であり；
ｕは、０以上の整数である）。

【請求項69】

ｎ、ｍ、ｐ、ｑおよびｕが、請求項５３～５７のいずれか一項で定義されたとおりである、請求項６６～６８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項70】

ＱおよびＸが請求項６０～６４のいずれか一項で定義されたとおりである、請求項６６～６９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2023540161000001.app

【国際調査報告】