特表2023-540292Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質およびこれを利用したＬ－ヒスチジン生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-22
(54)【発明の名称】Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質およびこれを利用したＬ－ヒスチジン生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20230914BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230914BHJP
C12P 13/24 20060101ALI20230914BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20230914BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31
C12N1/21 ZNA
C12P13/24 C
C12N1/20 A
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023514404
(86)(22)【出願日】2021-12-23
(85)【翻訳文提出日】2023-03-01
(86)【国際出願番号】 KR2021019769
(87)【国際公開番号】W WO2022139523
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】10-2020-0183702
(32)【優先日】2020-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507406611
【氏名又は名称】シージェイ チェルジェダン コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】ホ，ラン
(72)【発明者】
【氏名】ソ，チャン・イル
(72)【発明者】
【氏名】チョン，ギ・ヨン
(72)【発明者】
【氏名】イム，ス‐ビン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AE26
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC22
4B064CC24
4B064DA10
4B065AA01Y
4B065AA24X
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC15
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA41
(57)【要約】
ヒスチジン排出活性を有する新規蛋白質、前記蛋白質が発現するように改変されたＬ－ヒスチジン生産微生物、および前記微生物を利用してＬ－ヒスチジンを生産する方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１２、配列番号１３、またはその組み合わせと６０％以上の配列相同性を有する蛋白質を発現するように改変された、Ｌ－ヒスチジン生産微生物。
【請求項2】
前記蛋白質は、外来の蛋白質である、請求項１に記載のＬ－ヒスチジン生産微生物。
【請求項3】
前記改変は、配列番号１２、配列番号１３、またはその組み合わせと６０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子の導入によるものである、請求項１に記載のＬ－ヒスチジン生産微生物。
【請求項4】
前記蛋白質は、配列番号１２および１３、配列番号４１および４２、または配列番号４４および４５のアミノ酸配列で表わされるものである、請求項１に記載のＬ－ヒスチジンを生産する微生物。
【請求項5】
前記改変は、配列番号１２および１３、配列番号４１および４２、または配列番号４４および４５のアミノ酸配列をコードする遺伝子の導入によるものである、請求項４に記載のＬ－ヒスチジン生産微生物。
【請求項6】
前記微生物は、コリネバクテリウム属またはエスケリキア属である、請求項１～５のいずれか一項に記載のＬ－ヒスチジン生産微生物。
【請求項7】
前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムまたはエスケリキアコリである、請求項６に記載のＬ－ヒスチジン生産微生物。
【請求項8】
配列番号１２、配列番号１３、またはその組み合わせと６０％以上の配列相同性を有する蛋白質、前記蛋白質をコードする遺伝子、
前記遺伝子を含む組換えベクター、または、
前記遺伝子または前記組換えベクターを含む組換え微生物、
を含む、Ｌ－ヒスチジン生産用組成物。
【請求項9】
前記蛋白質は、配列番号１２および１３、配列番号４１および４２、または配列番号４４および４５のアミノ酸配列で表わされるものである、請求項８に記載のＬ－ヒスチジン生産用組成物。
【請求項10】
前記微生物は、コリネバクテリウム属またはエスケリキア属である、請求項８または９に記載のＬ－ヒスチジン生産用組成物。
【請求項11】
前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムまたはエスケリキアコリである、請求項１０に記載のＬ－ヒスチジン生産用組成物。
【請求項12】
請求項１～５のいずれか一項に記載のＬ－ヒスチジン生産微生物を培地で培養する工程を含む、Ｌ－ヒスチジン生産方法。
【請求項13】
前記培養する工程の後、培養した微生物または培地からＬ－ヒスチジンを回収する工程を追加的に含む、請求項１２に記載のＬ－ヒスチジン生産方法。
【請求項14】
前記微生物は、コリネバクテリウム属またはエスケリキア属である、請求項１２に記載のＬ－ヒスチジン生産方法。
【請求項15】
前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムまたはエスケリキアコリである、請求項１４に記載のＬ－ヒスチジン生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
ヒスチジン排出活性を有する新規蛋白質、前記蛋白質が発現するように改変されたＬ－ヒスチジン生産微生物、および前記微生物を利用してＬ－ヒスチジンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－ヒスチジンは、２０個の標準アミノ酸の中の一つのアミノ酸であり、栄養学的な観点からみると、成人には多量が要求されないが、成長期の子供には必須アミノ酸として分類される。また、Ｌ－ヒスチジンは、抗酸化と免疫調節など重要な生理的過程に関与して胃腸潰瘍治療剤、循環器系治療剤の原料およびアミノ酸輸液製剤など医学産業に使用される。
【0003】
Ｌ－ヒスチジンは、特にヘモグロビンに多く含まれており、主に血粉を原料とする蛋白質加水分解抽出法を通じて主に生産される。しかし、このような方法は、低い効率と環境汚染などの短所を有している。反面、微生物発酵法を通じてＬ－ヒスチジンを生産することは可能であるが、大規模工業化はまだなされていない。これはＬ－ヒスチジンの生合成がヌクレオチド合成前駆体であるホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）と競争関係を有し、高エネルギーを要求する複雑な生合成過程および調節メカニズムを有しているためである。
【0004】
他の種類のアミノ酸の排出能を有する蛋白質の発現および／または機能が強化されると当該アミノ酸の生産が増加する例は知られているが、Ｌ－ヒスチジン特異的排出能を有する蛋白質に対する先行研究はほとんど行われていない。
【0005】
このような背景下で、ヒスチジン特異的排出能を有する蛋白質の発掘およびこれを利用したヒスチジン生産技術の開発が要求される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本明細書では、Ｌ－ヒスチジン排出能を有するヒスチジン排出蛋白質を発掘し、これをＬ－ヒスチジンの生産能を有する微生物で発現させた結果、Ｌ－ヒスチジン生産量を画期的に向上させることができることを提案する。
【0007】
一例は、Ｌ－ヒスチジン排出活性を有する蛋白質を提供する。前記蛋白質は、Ｌ－ヒスチジン特異的排出能を有する蛋白質であり得る。
【0008】
他の例は、前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を発現する、Ｌ－ヒスチジン生産微生物を提供する。
【0009】
他の例は、前記微生物を培地で培養する工程を含む、Ｌ－ヒスチジン生産方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本明細書では、Ｌ－ヒスチジン排出能を有するヒスチジン排出蛋白質を発掘し、これをＬ－ヒスチジンの生産能を有する微生物で導入させてＬ－ヒスチジン生産量が画期的に向上した組換え微生物およびこれを利用したＬ－ヒスチジン生産技術を提供する。
【0011】
以下、より詳しく説明する。
【0012】
一例は、Ｌ－ヒスチジン排出活性を有する蛋白質を提供する。前記蛋白質は、Ｌ－ヒスチジン特異的排出能を有する蛋白質であり得る。本明細書において、前記蛋白質は、Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質で表現され得る。一例において、前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質は、コリネバクテリウム属および／またはエスケリキア属微生物でＬ－ヒスチジン排出能を有するものであり得、この時、前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質は、コリネバクテリウム属および／またはエスケリキア属に属しない微生物、例えば、デルマバクタ属（例、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓなど）、ヘルコバチルス属（例、Ｈｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓなど）、マイコバクテリウム属（例、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓなど）などからなる群より選択された１種以上の微生物由来の蛋白質であり得る。
【0013】
一例において、前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質は、配列番号１２、配列番号１３またはこれらの組み合わせと６０％以上の配列相同性を有する蛋白質であり得る。例えば、一具体例において、前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質は、配列番号１２、１３、またはその組み合わせと６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上の相同性を有するものであり得る。
【0014】
一具体例において、前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質は、下記の中から選択されたアミノ酸配列を含むか、または前記配列からなる蛋白質からなる群より選択された１種以上、例えば、１種、２種または３種であり得る。
【0015】
配列番号１２、配列番号１３、またはその組み合わせ、
配列番号４１、配列番号４２、またはその組み合わせ、および、
配列番号４４、配列番号４５、またはその組み合わせ。
配列番号４１、配列番号４２、またはその組み合わせ、および、
配列番号４４、配列番号４５、またはその組み合わせ。
【0016】
前記配列番号１２で表わされる蛋白質は配列番号６４の核酸配列によりコードされ、配列番号１３で表わされる蛋白質は配列番号６５の核酸配列によりコードされたり、配列番号１２および／または配列番号１３で表わされる蛋白質は配列番号１４の核酸配列（配列番号６４の３’末端と配列番号６５の５’末端の重複部位で融合されたオペロン配列である）によりコードされるものであり得る。
【0017】
前記配列番号４１で表わされる蛋白質は配列番号６６の核酸配列によりコードされ、配列番号４２で表わされる蛋白質は配列番号６７の核酸配列によりコードされたり、配列番号４１および／または配列番号４２で表わされる蛋白質は配列番号４３の核酸配列（配列番号６６の３’末端と配列番号６７の５’末端の重複部位で融合されたオペロン配列である）によりコードされるものであり得る。
【0018】
前記配列番号４４で表わされる蛋白質は配列番号６８の核酸配列によりコードされ、配列番号４５で表わされる蛋白質は配列番号６９の核酸配列によりコードされたり、配列番号４４および／または配列番号４５で表わされる蛋白質は配列番号４６の核酸配列（配列番号６８の３’末端と配列番号６９の５’末端の重複部位で融合されたオペロン配列である）によりコードされるものであり得る。
【0019】
他の例は、Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を発現するように改変された、Ｌ－ヒスチジン生産微生物を提供する。前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質は前述したとおりである。前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質は、前記Ｌ－ヒスチジン生産微生物に対して外来の蛋白質、例えば、前記微生物と異種の微生物由来の蛋白質であり得る。
【0020】
本明細書において、用語「Ｌ－ヒスチジン生産微生物」は、
Ｌ－ヒスチジン生産能を有する微生物が前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を発現するように改変、例えば、１）前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を追加的に発現したり、２）内在的Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を代替して発現するように改変されることによって、非改変微生物に比べて増加されたＬ－ヒスチジン生産能を有する場合、および／または
Ｌ－ヒスチジン生産能を有さない微生物が前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を発現するように改変されることによってＬ－アミノ酸生産能を有するようになる場合、を意味するために使用され得る。
Ｌ－ヒスチジン生産能を有する微生物が前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を発現するように改変、例えば、１）前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を追加的に発現したり、２）内在的Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を代替して発現するように改変されることによって、非改変微生物に比べて増加されたＬ－ヒスチジン生産能を有する場合、および／または
Ｌ－ヒスチジン生産能を有さない微生物が前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を発現するように改変されることによってＬ－アミノ酸生産能を有するようになる場合、を意味するために使用され得る。
【0021】
本明細書で「微生物」は、単細胞バクテリアを包括するもので、「細胞」と互換可能に使用され得る。
【0022】
本明細書において、前記非改変微生物は、Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を発現するように改変されてＬ－ヒスチジン生産能が増加したりＬ－ヒスチジン生産能が付与された「Ｌ－ヒスチジン生産微生物」と区別するために使用されるもので、前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を発現するように改変される前の微生物または前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を発現するように改変されていない微生物を意味するものであり得、宿主微生物とも表現され得る。
【0023】
前記微生物は、自然にＬ－ヒスチジン生産能を有する微生物またはＬ－ヒスチジン生産能がないか顕著に少ない菌株に変異が導入されてＬ－ヒスチジン生産能を有することができる全てのグラム陽性細菌、例えばコリネバクテリウム属（ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）微生物およびエスケリキア属（ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）微生物からなる群より選択された１種以上であり得る。前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アムモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウムフラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）などを含むことができるが、これに限定されるのではない。例えば、前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であり得る。
【0024】
一例において、前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を発現するように改変されたＬ－ヒスチジン生産微生物は、前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質、例えば外来のＬ－ヒスチジン排出蛋白質を発現するように改変されていない同種の非改変微生物と比較して、Ｌ－ヒスチジン生産能が増加されたものであり得る。一具体例において、前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を発現するように改変されたＬ－ヒスチジン生産微生物は、非改変微生物と比較して、Ｌ－ヒスチジン生産量（例えば、培地内含有量）が５％（ｗ／ｖ）以上、１０％（ｗ／ｖ）以上、１２．５％（ｗ／ｖ）以上、１５％（ｗ／ｖ）以上、１７．５％（ｗ／ｖ）以上、または２０％（ｗ／ｖ）以上増加したものであり得る（前記Ｌ－ヒスチジン生産増加率の上限値は、これに制限されないが、１００％（ｗ／ｖ）、９０％（ｗ／ｖ）、８０％（ｗ／ｖ）、７５％（ｗ／ｖ）、７０％（ｗ／ｖ）、６５％（ｗ／ｖ）、６０％（ｗ／ｖ）、５５％（ｗ／ｖ）、または５０％（ｗ／ｖ）であり得る）。前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を発現するように改変されたＬ－ヒスチジン生産微生物と非改変微生物とのＬ－ヒスチジン生産量の比較は、基質（例えば、ブドウ糖などの糖）が互いに同量で使用された場合を基準に行われるものであり得、例えば、基質（例えば、ブドウ糖などの糖）単位量（１ｇ、１０ｇ、または１００ｇなど）を基準に培地内Ｌ－ヒスチジン含有量を比較したものであり得る。
【0025】
本明細書において、用語「Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質を発現するように改変」とは、微生物で外来のＬ－ヒスチジン排出蛋白質が発現するようにする全ての操作を意味し得、例えば、微生物に外来のＬ－ヒスチジン排出蛋白質をコードする遺伝子を導入または前記微生物を外来のＬ－ヒスチジン排出蛋白質をコードする遺伝子で形質転換させることを意味し得る。
【0026】
本明細書において、ポリヌクレオチド（「遺伝子」と互換可能に使用され得る）またはポリペプチド（「蛋白質」と互換可能に使用され得る）が「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む、特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなる、または特定の核酸配列またはアミノ酸配列で表わされる」とは、等価的意味で互換使用可能な表現であり、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須で含んでなることを意味し得、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能および／または目的とする機能を維持する範囲で前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、改変、および／または付加）が加えられた「実質的に同等な配列」を含むもの（または前記変異が導入されたことを排除しないもの）と解釈され得る。
【0027】
一例において、本明細書で提供される核酸配列またはアミノ酸配列は、これらの本来の機能または目的とする機能を維持する範囲で通常の突然変異誘発法、例えば指向性進化法（ｄｉｒｅｃｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）および／または部位特異的突然変異法（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などにより改変されたものを含むことができる。一例において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが（ｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなるかまたはこれを必須で含むか、または（ｉｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列と６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上（例えば、６０％～９９．５％、７０％～９９．５％、８０％～９９．５％、８５％～９９．５％、９０％～９９．５％、９１％～９９．５％、９２％～９９．５％、９３％～９９．５％、９４％～９９．５％、９５％～９９．５％、９６％～９９．５％、９７％～９９．５％、９８％～９９．５％、または９９％～９９．５％）の相同性を有する核酸配列またはアミノ酸配列からなるかまたはこれを必須で含み、本来の機能および／または目的とする機能を維持することを意味し得る。本明細書において、前記本来の機能は、Ｌ－ヒスチジン排出機能（アミノ酸配列の場合）、またはＬ－ヒスチジン排出機能を有する蛋白質をコードする機能（核酸配列の場合）であり得、前記目的とする機能は、微生物のＬ－ヒスチジン生産能を増加させたり付与する機能を意味し得る。
【0028】
本明細書に記載された核酸配列は、コドンの縮重性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により前記蛋白質（Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質）を発現させようとする微生物で好まれるコドンを考慮して、コーディング領域から発現する蛋白質のアミノ酸配列および／または機能を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な改変が行われ得る。
【0029】
本出願で用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、二つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と関連した程度を意味し、百分率で表示され得る。相同性および同一性の用語は、時々相互交換的に利用され得る。
【0030】
保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムにより決定され、使用されるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に利用され得る。実質的に、相同性を有するか（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または同一な（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般的に配列全体または全体長さの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％により中間または高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドで一般コドンまたはコドン縮重性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドも含まれることが自明である。
【0031】
任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するか否かは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８５］： ２４４４でのようなデフォルトパラメータを利用して「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定され得る。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ： Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６－２７７）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３）が使用されて決定され得る（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７ （１９８４））， ＢＬＡＳＴＰ， ＢＬＡＳＴＮ， ＦＡＳＴＡ （Ａｔｓｃｈｕｌ， ［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ， Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］： ４０３ （１９９０）； Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ， ［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４、および［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８： １０７３を含む）。 例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを利用して相同性、類似性または同一性を決定することができる。
【0032】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ（１９８１）２：４８２に公知されたとおり、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７０）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを利用して配列情報を比較することによって決定され得る。要約すれば、ＧＡＰプログラムは、二つの配列のうち、より短いものにおける記号の全体数で、類似の配列された記号（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値で定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）２進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非同一性のために０の値を含有する）およびＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３５３－３５８（１９７９）により開示されたとおり、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティおよび各ギャップで各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；および（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。
【0033】
また、任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するか否かは、定義されたストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験により配列を比較することによって確認することができ、定義される適切なハイブリダイゼーション条件は当該技術範囲内であり、当業者によく知られた方法（例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９； Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で決定され得る。
【0034】
前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質をコードする遺伝子を導入または形質転換は、通常の発現ベクターを使用した公知の形質転換方法を当業者が適切に選択して行われ得る。本明細書において、用語「形質転換」は、標的蛋白質（Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主微生物内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードする蛋白質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主微生物内で発現さえできれば、宿主微生物の染色体内に挿入されて位置するかおよび／または染色体外に位置することができる。前記ポリヌクレオチドは、宿主微生物内に導入されて発現できるものであれば、その導入される形態は制限がない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、独自的に発現するのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主微生物に導入され得る。前記発現カセットは、通常前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位および／または翻訳終結信号などの発現調節要素を含むことができる。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクターの形態であり得る。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。前記で用語「作動可能に連結」されたものとは、発現調節要素が目的蛋白質（Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質）をコードするポリヌクレオチドの転写調節（例、転写開始）を行うことができるように発現調節要素（例、プロモーター）とポリヌクレオチドが機能的に連結されていることを意味し得る。作動可能な連結は、当業界における公知の遺伝子組換え技術を利用して行うことができ、例えば、通常の部位特異的ＤＮＡ切断および連結により行われ得るが、これに制限されない。
【0035】
前記ポリヌクレオチドを宿主微生物に形質転換する方法は、核酸を細胞（微生物）内に導入する如何なる方法でも遂行可能であり、宿主微生物により当該分野における公知の形質転換技術を適切に選択して行うことができる。前記公知の形質転換方法として電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱法、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱法、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｐｔａｋｅ）、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポゾーム法、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが例示され得るが、これに制限されるのではない。
【0036】
前記遺伝子の宿主細胞ゲノム（染色体）内挿入は、公知の方法を当業者が適切に選択して行うことができ、例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼシステム（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ；例えば、（ａ）ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９蛋白質など）、そのコード遺伝子、または前記遺伝子を含むベクター；および（ｂ）ガイドＲＮＡ（例、ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）など）、そのコードＤＮＡ、または前記ＤＮＡを含むベクターを含む混合物（例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼ蛋白質とガイドＲＮＡの混合物など）、複合体（例えば、リボ核酸融合蛋白質（ＲＮＰ）、組換えベクター（例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼコード遺伝子およびガイドＲＮＡコードＤＮＡを共に含むベクターなど）などからなる群より選択された一つ以上）を使用して行うことができるが、これに制限されるのではない。
【0037】
他の例は、前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質をコードする核酸分子を提供する。一例において、前記核酸分子は、配列番号６４および／または配列番号６５、または配列番号１４；配列番号６６および／または配列番号６７、または配列番号４３；または配列番号６８および／または配列番号６９、または配列番号４６の核酸配列を含むか、または前記配列からなる核酸分子であり得る。
【0038】
他の例は、前記核酸分子を含む組換えベクター（発現ベクター）を提供する。
【0039】
他の例は、前記核酸分子または組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【0040】
一例は、Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質をコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、または前記核酸分子または前記組換えベクターを含む細胞を含む、Ｌ－ヒスチジン生産用組成物、Ｌ－ヒスチジン生産増加用組成物、またはＬ－ヒスチジン生産微生物製造用組成物を提供する。
【0041】
他の例は、微生物をＬ－ヒスチジン排出蛋白質を発現するように改変させる工程を含む、Ｌ－ヒスチジン生産微生物製造方法、または前記微生物のＬ－ヒスチジン生産能増進および／または付与方法を提供する。前記微生物をＬ－ヒスチジン排出蛋白質を発現するように改変させる工程は、前記微生物にＬ－ヒスチジン排出蛋白質をコードする遺伝子を導入したり、前記微生物をＬ－ヒスチジン排出蛋白質をコードする遺伝子で形質転換させることによって行われ得る。
【0042】
前記Ｌ－ヒスチジン排出蛋白質、これをコードする遺伝子、および微生物は前述したとおりである。
【0043】
本明細書において、用語「ベクター」は、適した宿主内で目的蛋白質を発現させることができるように適した調節配列に作動可能に連結された前記目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および／または転写および／または翻訳の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適当な宿主微生物内に形質転換された後、宿主微生物のゲノム（遺伝体）と関係なく発現したり、宿主微生物のゲノム内に統合されたりし得る。
【0044】
本明細書で使用可能なベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、通常使用される全てのベクターの中で選択され得る。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージなどが挙げられる。例えば、前記ベクターとして、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系およびｐＥＴ系などを使用することができる。具体的にはｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを例示することができるが、これに制限されない。
【0045】
本明細書で使用可能なベクターは、公知の発現ベクターおよび／またはポリヌクレオチドの宿主細胞染色体内挿入用ベクターであり得る。前記ポリヌクレオチドの宿主細胞染色体内挿入は、当業界に知られた任意の方法、例えば、相同組換えにより行われ得るが、これに限定されない。前記ベクターは、前記染色体内挿入有無を確認するための選別マーカ（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を追加的に含むことができる。前記選別マーカは、ベクターで形質転換された細胞を選別、つまり、前記ポリヌクレオチドの挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面蛋白質の発現のような選択可能表現型を付与する遺伝子の中で選択して使用することができる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では選別マーカを発現する細胞だけが生存したり他の表現形質を示したりするため、形質転換された細胞を選別することができる。
【0046】
他の例は、前記Ｌ－ヒスチジン生産微生物を培地で培養する工程を含む、Ｌ－ヒスチジンの生産方法を提供する。前記方法は、前記培養する工程以降に、前記培養した微生物、培地、またはこれらの全てからＬ－ヒスチジンを回収する工程を追加的に含むことができる。
【0047】
前記方法において、前記微生物を培養する工程は、特にこれに制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行うことができる。この時、培養条件は、特にこれに制限されないが、塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を使用して適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、具体的にはｐＨ６～８、最も具体的にはｐＨ６．８）を調節することができ、酸素または酸素－含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができる。培養温度は、２０～４５℃、または２５～４０℃を維持することができ、約１０～１６０時間、約１０時間～９６時間、約１０時間～４８時間、または約１０時間～３６時間培養することができるが、これに制限されるのではない。前記培養により生産されたＬ－ヒスチジンは培地中に分泌されたり細胞内に残留したりすることができる。
【0048】
前記培養に使用可能な培地は、炭素供給源として糖および炭水化物（例：グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプンおよびセルロース）、油脂および脂肪（例：大豆油、ヒマワリ種子油、ピーナッツ油およびココナッツ油）、脂肪酸（例：パルミチン酸、ステアリン酸およびリノレン酸）、アルコール（例：グリセロールおよびエタノール）、有機酸（例：酢酸）などからなる群より選択された１種以上を個別的に使用したりまたは２種以上を混合して使用したりすることができるが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素－含有有機化合物（例：ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、とうもろこし浸漬液、大豆粕粉およびウレア）、無機化合物（例：硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム）などからなる群より選択された１種以上を個別的に使用したりまたは２種以上を混合して使用することができるが、これに制限されない。リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などからなる群より選択された１種以上を個別的に使用したりまたは２種以上を混合して使用することができるが、これに制限されない。また、前記培地は、その他金属塩（例：硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸、および／またはビタミンなどのような必須成長促進物質を含むことができる。
【0049】
前記Ｌ－ヒスチジンを回収する工程は、培養方法により当該分野に公知の適した方法を利用して培地、培養液、または微生物から目的とするアミノ酸を収集するものであり得る。例えば、前記回収する工程は、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどから選択された一つ以上の方法で行うことができる。前記Ｌ－ヒスチジンを回収する方法は、前記回収する工程の前、同時、または後に、精製工程を追加的に含むことができる。
【発明の効果】
【0050】
本明細書で提供されるＬ－ヒスチジン排出遺伝子をＬ－ヒスチジン生産能を有する微生物に発現させることによって、前記遺伝子が発現しない母菌株に比べて、Ｌ－ヒスチジン生産量を画期的に向上させることができるため、Ｌ－ヒスチジンをより効果的に生産することができるだけでなく、Ｌ－ヒスチジンの産業的規模の大規模生産に寄与することができる。
【発明を実施するための形態】
【0051】
以下、本出願を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これら実施例は本出願を例として説明するためのものであり、本出願の範囲がこれら実施例に限定されるのではない。
【0052】
実施例１．外来ヒスチジン排出遺伝子の探索および候補の選別
Ｌ－ヒスチジンは、アミノ酸分類の中で主に塩基性（Ｂａｓｉｃ）アミノ酸に分類されるが、芳香族（Ａｒｏｍａｔｉｃ）アミノ酸または分枝鎖（Ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ）アミノ酸に分類されたりもする。Ｌ－ヒスチジン特異排出能を有する蛋白質候補を選別するために各分類別アミノ酸（塩基性アミノ酸：Ｌ－リジン、芳香族アミノ酸：Ｔｒｐ、分枝鎖アミノ酸：イソロイシン）に対する排出蛋白質（ＬｙｓＥ（Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １８０：１５５－１６０）、Ｗｅｘ（大韓民国登録特許第１０－１９６８３１７号）、ＢｒｎＦＥ（Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １８０：１５５－１６０））のアミノ酸配列をｑｕｅｒｙ配列とし、ＮＣＢＩとＫｅｇｇ ｄａｔａｂａｓｅを基盤としてＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ探索結果、Ｌ－ヒスチジンを排出する可能性のある膜蛋白質として予測される候補遺伝子とこれを保有する微生物を選定した。
Ｌ－ヒスチジンは、アミノ酸分類の中で主に塩基性（Ｂａｓｉｃ）アミノ酸に分類されるが、芳香族（Ａｒｏｍａｔｉｃ）アミノ酸または分枝鎖（Ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ）アミノ酸に分類されたりもする。Ｌ－ヒスチジン特異排出能を有する蛋白質候補を選別するために各分類別アミノ酸（塩基性アミノ酸：Ｌ－リジン、芳香族アミノ酸：Ｔｒｐ、分枝鎖アミノ酸：イソロイシン）に対する排出蛋白質（ＬｙｓＥ（Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １８０：１５５－１６０）、Ｗｅｘ（大韓民国登録特許第１０－１９６８３１７号）、ＢｒｎＦＥ（Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １８０：１５５－１６０））のアミノ酸配列をｑｕｅｒｙ配列とし、ＮＣＢＩとＫｅｇｇ ｄａｔａｂａｓｅを基盤としてＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ探索結果、Ｌ－ヒスチジンを排出する可能性のある膜蛋白質として予測される候補遺伝子とこれを保有する微生物を選定した。
【0053】
このうち、生産菌株に適用可能な程度の生物安全度（Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ）と確保の可能性を考慮して、下記表１のようにＬｙｓＥ基盤１種、Ｗｅｘ基盤３種、ＢｒｎＦＥ基盤２種の蛋白質、これをコードする遺伝子、およびこれを含む微生物を選定した。
【0054】
【表1】
【0055】
（前記表１で、生物安全度は、米国のＣｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎで定義した微生物病原性指標（ｌｅｖｅｌ１～４）によるものである（ｌｅｖｅｌが低いほど安全である）
【0056】
実施例２．外来Ｌ－ヒスチジン排出遺伝子候補導入ベクターおよびこれを導入した組換えコリネバクテリウム属菌株の作製
前記実施例１で選定した外来Ｌ－ヒスチジン排出遺伝子候補６種をコリネバクテリウム属菌株に導入するためのベクター６種を作製した。
前記実施例１で選定した外来Ｌ－ヒスチジン排出遺伝子候補６種をコリネバクテリウム属菌株に導入するためのベクター６種を作製した。
【0057】
外来Ｌ－ヒスチジン排出遺伝子候補を導入するために、コリネバクテリウム・グルタミカムのトランスポゾンをコーディングする遺伝子のうち、ＮＣｇｌ２１３１遺伝子を挿入ｓｉｔｅとして使用した（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０４、５－２５ Ｊｏｒｎ Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ２００３）。また外来Ｌ－ヒスチジン排出遺伝子候補がコリネバクテリウム由来ｇａｐＡ遺伝子のプロモーター（以下、ＰｇａｐＡ、配列番号１５）下で発現するように設計した。
【0058】
ＮＣｇｌ２１３１遺伝子を排出体遺伝子に置換するためにＮＣｇｌ２１３１欠損およびターゲット遺伝子挿入ベクターを作製した。ベクターを作製するために、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型として配列番号１６と配列番号１７、配列番号１８と配列番号１９のプライマー対をそれぞれ利用してＰＣＲをそれぞれ行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、それぞれ５３１ｂｐのｄｅｌ－Ｎ２１３１Ｌ（配列番号２０）と５５５ｂｐのｄｅｌ－Ｎ２１３１Ｒ（配列番号２１）のＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して精製した後、ｐＤＺベクター（大韓民国登録特許第１０－０９２４０６５号）とＴａＫａＲａ社のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用してクローニングし、ＮＣｇｌ２１３１遺伝子欠損およびターゲット遺伝子挿入用ベクターｐＤＺΔＮ２１３１を作製した。
【0059】
Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ由来蛋白質（以下、Ｈａｑ、配列番号１）をコーディングする遺伝子（以下、ｈａｑ、配列番号２）の塩基配列情報を米国国立衛生研究所のジェンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から獲得した。ｈａｑを増幅させるためにＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ菌株（ＫＣＴＣ４２００１）の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号２２と配列番号２３のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、９４５ｂｐのｈａｑ（配列番号２）を含む９７７ｂｐのｈａｑ断片を得た。ｈａｑと連結可能なＰｇａｐＡ断片を得るために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型として配列番号２４と配列番号２５のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、１分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、４０９ｂｐのＰｇａｐＡ（配列番号１５）を含む４４１ｂｐのＰｇａｐＡ断片を得た。前記得られたｈａｑ断片とＰｇａｐＡ断片、そしてＳｃａＩ制限酵素で切断されたｐＤＺΔＮ２１３１ベクターをギブソンアセンブリー（ＤＧ Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ， ＶＯＬ．６ ＮＯ．５， ＭＡＹ ２００９， ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）方法を利用してクローニングして、組換えプラスミドを獲得し、これをｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｈａｑと命名した。
【0060】
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｐｉｎａｔｕｂｏｎｅｎｓｉｓ由来蛋白質（以下、Ｃｐｉ、配列番号３）をコーディングする遺伝子（以下、ｃｐｉ、配列番号４）の塩基配列情報を米国国立衛生研究所のジェンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から獲得した。Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｐｉｎａｔｕｂｏｎｅｎｓｉｓ由来ｃｐｉを増幅させるために、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｐｉｎａｔｕｂｏｎｅｎｓｉｓ菌株（ＫＣＴＣ２２１２５）の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号２４と配列番号２５のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、９４５ｂｐのｃｐｉ（配列番号４）を含む９７７ｂｐのｃｐｉ断片を得た。ｃｐｉと連結可能なＰｇａｐＡ断片を得るために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型として配列番号２２と配列番号２６のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、１分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、４０９ｂｐのＰｇａｐＡ（配列番号１５）を含む４４１ｂｐのＰｇａｐＡ断片を得た。前記得られたｃｐｉ断片とＰｇａｐＡ断片、そしてＳｃａＩ制限酵素で切断されたｐＤＺΔＮ２１３１ベクターをギブソンアセンブリを利用してクローニングして、組換えプラスミドを獲得し、これをｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｃｐｉと命名した。
【0061】
Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｃｒｙｏｃｒｅｓｃｅｎｓ由来蛋白質（以下、Ｋｃｒ、配列番号５）をコーディングする遺伝子（以下、ｋｃｒ、配列番号６）の塩基配列情報を米国国立衛生研究所のジェンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から獲得した。Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｃｒｙｏｃｒｅｓｃｅｎｓ由来ｋｃｒを増幅させるために、Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｃｒｙｏｃｒｅｓｃｅｎｓ菌株（ＫＣＴＣ２５８０）の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号２９と配列番号３０のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、８８２ｂｐのｋｃｒ（配列番号６）を含む９１４ｂｐのｋｃｒ断片を得た。ｋｃｒと連結可能なＰｇａｐＡ断片を得るために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型として配列番号２４と配列番号３１のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、１分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、４０９ｂｐのＰｇａｐＡ（配列番号１５）を含む４４１ｂｐのＰｇａｐＡ断片を得た。前記得られたｋｃｒ断片とＰｇａｐＡ断片、そしてＳｃａＩ制限酵素で切断されたｐＤＺΔＮ２１３１ベクターをギブソンアセンブリを利用してクローニングして、組換えプラスミドを獲得し、これをｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｋｃｒと命名した。
【0062】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ由来蛋白質（以下、Ｃｓｔ、配列番号７）をコーディングする遺伝子（以下、ｃｓｔ、配列番号８）の塩基配列情報を米国国立衛生研究所のジェンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から獲得した。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ由来ｃｓｔを増幅させるために、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ菌株（ＡＴＣＣ６８７２）の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号３２と配列番号３３のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、７１７ｂｐのｃｓｔ（配列番号８）を含む７４９ｂｐのｃｓｔ断片を得た。ｃｓｔと連結可能なＰｇａｐＡ断片を得るために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型として配列番号２４と配列番号３４のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、１分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果、４０９ｂｐのＰｇａｐＡ（配列番号１５）を含む４４１ｂｐのＰｇａｐＡ断片を得た。得られたｃｓｔ断片とＰｇａｐＡ断片、そしてＳｃａＩ制限酵素で切断されたｐＤＺΔＮ２１３１ベクターをギブソンアセンブリを利用してクローニングして、組換えプラスミドを獲得し、これをｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｃｓｔと命名した。
【0063】
Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｓｉｃｉｕｓ由来蛋白質（以下、ＬｓａＦＥ、配列番号９、１０）をコーディングするオペロン（以下、ｌｓａ、配列番号１１）の塩基配列情報を米国国立衛生研究所のジェンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から獲得した。Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｓｉｃｉｕｓ由来ｌｓａを増幅させるためにＬｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｓｉｃｉｕｓ菌株（ＫＣＴＣ１９９０４）の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号３５と配列番号３６のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、１０４８ｂｐのｌｓａ（配列番号１１）を含む１０８０ｂｐのｌｓａ断片を得た。ｌｓａと連結可能なＰｇａｐＡ断片を得るために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型として配列番号２４と配列番号３７のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、１分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、４０９ｂｐのＰｇａｐＡ（配列番号１５）を含む４４１ｂｐのＰｇａｐＡ断片を得た。得られたｌｓａ断片とＰｇａｐＡ断片、そしてＳｃａＩ制限酵素で切断されたｐＤＺΔＮ２１３１ベクターをギブソンアセンブリを利用してクローニングして、組換えプラスミドを獲得し、これをｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｌｓａと命名した。
【0064】
Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来蛋白質（以下、ＤｖａＦＥ、配列番号１２、１３）をコーディングするオペロン（以下、ｄｖａ、配列番号１４）の塩基配列情報を米国国立衛生研究所のジェンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から獲得した。Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来ｄｖａを増幅させるために、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ菌株（ＫＣＴＣ３９５８５）の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号３８と配列番号３９のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、１０８１ｂｐのｄｖａ（配列番号１４）を含む１１１３ｂｐのｄｖａ断片を得た。ｄｖａと連結可能なＰｇａｐＡ断片を得るために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型として配列番号２４と配列番号４０のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、１分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、４０９ｂｐのＰｇａｐＡ（配列番号１５）を含む４４１ｂｐのＰｇａｐＡ断片を得た。得られたｄｖａ断片とＰｇａｐＡ断片、そしてＳｃａＩ制限酵素で切断されたｐＤＺΔＮ２１３１ベクターをギブソンアセンブリを利用してクローニングして、組換えプラスミドを獲得し、これをｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｄｖａと命名した。
【0065】
前記外来Ｌ－ヒスチジン排出遺伝子候補のＬ－ヒスチジン排出能を確認するために、前記作製されたＮＣｇｌ２１３１欠損ベクター（ｐＤＺΔＮ２１３１）、外来Ｌ－ヒスチジン排出遺伝子候補導入ベクター６種（ｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｈａｑ、ｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｃｐｉ、ｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｋｃｒ、ｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｃｓｔ、ｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｌｓａ、ｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｄｖａ）をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株に導入した。より具体的に、前記ベクターをそれぞれＡＴＣＣ１３０３２菌株に電気穿孔法で形質転換し、２次交差過程を経て染色体上のＮＣｇｌ２１３１遺伝子が欠損されたりＬ－ヒスチジン排出遺伝子候補に置換されている７種の組換え菌株を作製し、これらをそれぞれＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１（Ｎ２１３１遺伝子欠損）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｈａｑ（Ｎ２１３１遺伝子がｈａｑに置換）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｃｐｉ（Ｎ２１３１遺伝子がｃｐｉに置換）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｋｃｒ（Ｎ２１３１遺伝子がｋｃｒに置換）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｃｓｔ（Ｎ２１３１遺伝子がｃｓｔに置換）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｌｓａ（Ｎ２１３１遺伝子がｌｓａに置換）、およびＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｄｖａ（Ｎ２１３１遺伝子がｄｖａに置換）と命名した。
【0066】
実施例３．外来Ｌ－ヒスチジン排出遺伝子候補導入コリネバクテリウム属菌株のＭＩＣ測定
前記実施例２で作製された７種の組換えコリネバクテリウム・グルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｈａｑ、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｃｐｉ、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｋｃｒ、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｃｓｔ、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｌｓａ、およびＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｄｖａ）のＬ－ヒスチジン排出能活性の保有有無の確認のために、Ｌ－ヒスチジンを利用した最小阻止濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＭＩＣ）実験を行った。７種の菌株を最小液体培地に３０℃で２４時間培養した後、１×１０３と１×１０４個の細胞で希釈してＬ－ヒスチジンが添加された最小固体培地でスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）培養した。前記使用された最小固体培地の組成は次のとおりである。
前記実施例２で作製された７種の組換えコリネバクテリウム・グルタミカム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｈａｑ、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｃｐｉ、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｋｃｒ、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｃｓｔ、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｌｓａ、およびＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｄｖａ）のＬ－ヒスチジン排出能活性の保有有無の確認のために、Ｌ－ヒスチジンを利用した最小阻止濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＭＩＣ）実験を行った。７種の菌株を最小液体培地に３０℃で２４時間培養した後、１×１０３と１×１０４個の細胞で希釈してＬ－ヒスチジンが添加された最小固体培地でスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）培養した。前記使用された最小固体培地の組成は次のとおりである。
【0067】
最小培地（ｐＨ７．２）
ブドウ糖１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ２ｇ、ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ、尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、ニコチンアミド５μｇ、カルシウム－パントテン酸０．１μｇ、ビオチン０．２μｇ、チアミンＨＣｌ ３μｇ、Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ＊ １ｍｌ（蒸溜水１リットル基準）、２０ｇ Ａｇａｒ
ブドウ糖１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ２ｇ、ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ、尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、ニコチンアミド５μｇ、カルシウム－パントテン酸０．１μｇ、ビオチン０．２μｇ、チアミンＨＣｌ ３μｇ、Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ＊ １ｍｌ（蒸溜水１リットル基準）、２０ｇ Ａｇａｒ
【0068】
＊Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｎａ２Ｂ４Ｏ７ １０Ｈ２Ｏ ０．０９ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２７ ４Ｈ２Ｏ ０．０４ ｇ、ＺｎＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ、ＣｕＳＯ４ ５Ｈ２Ｏ ０．２７ｇ、ＭｎＣｌ２ ４Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ、ＦｅＣｌ３ ６Ｈ２Ｏ １ｇ、ＣａＣｌ２ ０．０１ｇ（蒸溜水１リットル基準）
Ｎａ２Ｂ４Ｏ７ １０Ｈ２Ｏ ０．０９ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２７ ４Ｈ２Ｏ ０．０４ ｇ、ＺｎＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ、ＣｕＳＯ４ ５Ｈ２Ｏ ０．２７ｇ、ＭｎＣｌ２ ４Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ、ＦｅＣｌ３ ６Ｈ２Ｏ １ｇ、ＣａＣｌ２ ０．０１ｇ（蒸溜水１リットル基準）
【0069】
最小阻止濃度の実験のために、１ｇ／ＬのＬ－ヒスチジンを最小固体培地に添加し、４８時間後の細胞の成長を観察して、その結果を下記の表２に示した。
【0070】
【表2】
【0071】
（表２で、＋個数は菌株の相対的な成長程度を示すもので、それぞれ次を示す。
＋：ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙは形成されないが、ｈｅａｖｙ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙとして成長されずにかたまって成長する形態）は形成される
＋＋：ｈｅａｖｙが形成され、ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙが５個未満形成される
＋＋＋：ｈｅａｖｙが形成され、ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙが５０個未満形成される
＋＋＋＋：ｈｅａｖｙがｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙと区分されないように形成される）
＋：ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙは形成されないが、ｈｅａｖｙ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙとして成長されずにかたまって成長する形態）は形成される
＋＋：ｈｅａｖｙが形成され、ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙが５個未満形成される
＋＋＋：ｈｅａｖｙが形成され、ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙが５０個未満形成される
＋＋＋＋：ｈｅａｖｙがｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙと区分されないように形成される）
【0072】
表２に示されているように、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｄｖａ菌株を除いた全ての菌株がＬ－ヒスチジンを含まない最小培地で円滑に成長した。しかし、Ｌ－ヒスチジンが１ｇ／Ｌが含まれている最小培地では大部分のＬ－ヒスチジン排出候補遺伝子が導入された菌株の成長が微々であり、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来遺伝子が導入されたＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１：：Ｄｖａ菌株だけがＡＴＣＣ１３０３２ΔＮ２１３１に比べて顕著な成長を示した。これは、導入されたＤｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来蛋白質が最小阻止濃度以上のＬ－ヒスチジンを含む培地でもＬ－ヒスチジン排出能を有することができることを示す。
【0073】
これにより、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来蛋白質Ｄｖａをコリネバクテリウム菌株に最小阻止濃度以上のＬ－ヒスチジンに対する耐性を付与し、Ｌ－ヒスチジン特異排出能を有する蛋白質として選択した。
【0074】
実施例４．コリネバクテリウム由来Ｌ－ヒスチジン生産菌株ＫＣＣＭ ８０１７９を基盤としてＤｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来遺伝子導入菌株の作製およびＬ－ヒスチジン生産能の評価
Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来蛋白質ＤｖａのＬ－ヒスチジン排出能を確認するために、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来遺伝子ｄｖａをＬ－ヒスチジン生産菌株ＫＣＣＭ ８０１７９（大韓民国出願特許第１０－２０１９－００４６９３４１４－６８２号）菌株に導入した。
Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来蛋白質ＤｖａのＬ－ヒスチジン排出能を確認するために、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来遺伝子ｄｖａをＬ－ヒスチジン生産菌株ＫＣＣＭ ８０１７９（大韓民国出願特許第１０－２０１９－００４６９３４１４－６８２号）菌株に導入した。
【0075】
このために、実施例２で作製されたベクターｐＤＺΔＮ２１３１、およびｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－ＤｖａをそれぞれＫＣＣＭ８０１７９菌株に電気穿孔法で形質転換し、２次交差過程を経て染色体上のＮＣｇｌ２１３１遺伝子が欠損されたりＬ－ヒスチジン排出遺伝子候補（ｄｖａ）に置換されている菌株２種を作製し、これをそれぞれＫＣＣＭ ８０１７９ΔＮ２１３１（ＮＣｇｌ２１３１遺伝子が欠損）およびＫＣＣＭ ８０１７９ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｄｖａ（ＮＣｇｌ２１３１遺伝子がｄｖａに置換）と命名した。
【0076】
前記作製されたＫＣＣＭ ８０１７９ΔＮ２１３１およびＫＣＣＭ ８０１７９ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｄｖａ菌株のＬ－ヒスチジン生産能を確認するために、次のような方法で培養した：ＫＣＣＭ ８０１７９ΔＮ２１３１およびＫＣＣＭ ８０１７９ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｄｖａ菌株を活性化培地で１６時間培養した後、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌバッフル付三角フラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌバッフル付三角フラスコに１ｍｌの種培養液を接種して３０℃で４８時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。前記培養に使用された培地の組成は次のとおりである。
【0077】
＜活性化培地＞
肉汁１％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、寒天２％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．２
肉汁１％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、寒天２％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．２
【0078】
＜種培地＞
ブドウ糖５％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．２５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、尿素０．４％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．２
ブドウ糖５％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．２５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、尿素０．４％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．２
【0079】
＜生産培地＞
ブドウ糖１０％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム２％（ｗ／ｖ）、第１リン酸カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）、ＣＳＬ（とうもろこし浸漬液）２．０％（ｗ／ｖ）、ビオチン２００μｇ／Ｌ、炭酸カルシウム、ｐＨ７．２
ブドウ糖１０％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム２％（ｗ／ｖ）、第１リン酸カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）、ＣＳＬ（とうもろこし浸漬液）２．０％（ｗ／ｖ）、ビオチン２００μｇ／Ｌ、炭酸カルシウム、ｐＨ７．２
【0080】
培養終了後、ＨＰＬＣによりＬ－ヒスチジン生産量（培地内ヒスチジン含有量）を測定して、その結果を次の表３に示した。
【0081】
【表3】
【0082】
表３に示されているように、ＮＣｇｌ２１３１欠損菌株は、母菌株であるＫＣＣＭ ８０１７９菌株と同等程度のＬ－ヒスチジン生産能を有する反面、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来遺伝子が導入されたＫＣＣＭ ８０１７９ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｄｖａ菌株はＮＣｇｌ２１３１欠損菌株および母菌株であるＫＣＣＭ ８０１７９菌株に比べてＬ－ヒスチジン生産能がそれぞれ２３％および２１％以上増加することを確認した。前記実施例３および４の結果から、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来遺伝子の導入を通じて最小阻害濃度以上のＬ－ヒスチジン濃度に対する耐性が増加するだけでなく、Ｌ－ヒスチジン生産能も大きく増加することを確認した。このような結果はＤｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来蛋白質がＬ－ヒスチジンを特異的に排出できるＬ－ヒスチジン排出蛋白質であることを立証する。
【0083】
実施例５．Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来Ｌ－ヒスチジン排出者類似蛋白質の追加確保
前記実施例３と４でＤｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来蛋白質のＬ－ヒスチジン排出能を確認したため、前記蛋白質とアミノ酸の配列相同性が高い類似蛋白質を追加的に確保するために、ＤｖａＦＥ中のＤｖａＦの配列（配列番号１２）をｑｕｅｒｙで利用してＢＬＡＳＴ探索を行った（表４参照）。
前記実施例３と４でＤｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来蛋白質のＬ－ヒスチジン排出能を確認したため、前記蛋白質とアミノ酸の配列相同性が高い類似蛋白質を追加的に確保するために、ＤｖａＦＥ中のＤｖａＦの配列（配列番号１２）をｑｕｅｒｙで利用してＢＬＡＳＴ探索を行った（表４参照）。
【0084】
【表4】
【0085】
前記ＢＬＡＳＴ探索結果、６０％以上の配列相同性を示し、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ属に属しないＬ－ヒスチジン排出体候補２種を追加的に選定して、次の表５に示した。
【0086】
【表5】
【0087】
実施例６．追加の外来Ｌ－ヒスチジン排出遺伝子候補導入ベクターの作製
前記実施例５で追加選定されたＬ－ヒスチジン排出遺伝子候補２種をコリネバクテリウム属菌株に導入するためのベクター２種を作製した。実施例２と同一にＮＣｇｌ２１３１遺伝子を欠損ｓｉｔｅとして、ＰｇａｐＡをプロモーターとして使用した。
前記実施例５で追加選定されたＬ－ヒスチジン排出遺伝子候補２種をコリネバクテリウム属菌株に導入するためのベクター２種を作製した。実施例２と同一にＮＣｇｌ２１３１遺伝子を欠損ｓｉｔｅとして、ＰｇａｐＡをプロモーターとして使用した。
【0088】
Ｈｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来蛋白質（以下、ＨｍａＦＥ、配列番号４１、４２）をコーディングするオペロン（以下、ｈｍａ、配列番号４３）の塩基配列情報を米国国立衛生研究所のジェンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から獲得した。ｈａｑ ＤＮＡを得るためにＢｉｏｎｉｃｓ社のジェン合成サービスを利用してＤＮＡを合成した。合成されたＤＮＡを増幅するために配列番号４７と配列番号４８のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、１０８１ｂｐのｈｍａ（配列番号４３）を含む１１１３ｂｐのｈｍａ断片を得た。ｈｍａと連結可能なＰｇａｐＡ断片を得るために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型として配列番号２４と配列番号４９のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、１分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、４０９ｂｐのＰｇａｐＡ（配列番号１５）を含む４４１ｂｐのＰｇａｐＡ断片を得た。得られたｈｍａ断片とＰｇａｐＡ断片、そしてＳｃａＩ制限酵素で切断されたｐＤＺΔＮ２１３１ベクターをギブソンアセンブリを利用してクローニングして、組換えプラスミドを獲得し、これをｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｈｍａと命名した。
【0089】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来蛋白質（以下、ＭａｂＦＥ、配列番号４４、４５）をコーディングするオペロン（以下、ｍａｂ、配列番号４６）の塩基配列情報を米国国立衛生研究所のジェンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から獲得した。ｍａｂ ＤＮＡを得るためにＢｉｏｎｉｃｓ社のジェン合成サービスを利用してＤＮＡを合成した。合成されたＤＮＡを増幅するために配列番号５０と配列番号５１のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、１０８１ｂｐのｍａｂ（配列番号４６）を含む１１１３ｂｐのｍａｂ断片を得た。ｍａｂと連結可能なＰｇａｐＡ断片を得るために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型として配列番号２４と配列番号５２のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、１分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、４０９ｂｐのＰｇａｐＡ（配列番号１５）を含む４４１ｂｐのＰｇａｐＡ断片を得た。得られたｍａｂ断片とＰｇａｐＡ断片、そしてＳｃａＩ制限酵素で切断されたｐＤＺΔＮ２１３１ベクターをギブソンアセンブリを利用してクローニングして、組換えプラスミドを獲得し、これをｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｍａｂと命名した。
【0090】
実施例７．Ｌ－ヒスチジン生産菌株ＫＣＣＭ ８０１７９を基盤としてＨｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来遺伝子導入菌株の作製およびＬ－ヒスチジン生産能の評価
Ｈｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来蛋白質ＨｍａおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来蛋白質ＭａｂがＬ－ヒスチジン排出能を有するか否かを確認するために、ｈｍａとｍａｂをそれぞれＬ－ヒスチジン生産菌株ＫＣＣＭ ８０１７９菌株に導入した。
Ｈｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来蛋白質ＨｍａおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来蛋白質ＭａｂがＬ－ヒスチジン排出能を有するか否かを確認するために、ｈｍａとｍａｂをそれぞれＬ－ヒスチジン生産菌株ＫＣＣＭ ８０１７９菌株に導入した。
【0091】
このために実施例６で作製されたベクターｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－ＨｍａおよびｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－ＭａｂをそれぞれＫＣＣＭ８０１７９菌株に電気穿孔法で形質転換し、２次交差過程を経て染色体上のＮＣｇｌ２１３１遺伝子がＬ－ヒスチジン排出遺伝子候補に置換されている菌株２種を作製し、これをそれぞれＫＣＣＭ ８０１７９ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｈｍａ（ＮＣｇｌ２１３１遺伝子がｈｍａに置換）およびＫＣＣＭ ８０１７９ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｍａｂ（ＮＣｇｌ２１３１遺伝子がｍａｂに置換）と命名した。
【0092】
前記作製されたＫＣＣＭ ８０１７９ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－ＨｍａおよびＫＣＣＭ ８０１７９ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｍａｂ菌株のＬ－ヒスチジン生産能を確認するために、前記菌株を実施例４で行った方法で培養してＬ－ヒスチジン生産量を測定した。対照群として実施例４で作製されたＫＣＣＭ ８０１７９ΔＮ２１３１菌株とＫＣＣＭ ８０１７９ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｄｖａ菌株に対して同様な方法で培養およびＬ－ヒスチジン生産量（培地内ヒスチジン含有量）測定を行った。前記得られた結果を表６に示した。
【0093】
【表6】
【0094】
表６に示されているように、ＫＣＣＭ ８０１７９ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｈｍａ菌株およびＫＣＣＭ ８０１７９ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｍａｂ菌株は、母菌株であるＫＣＣＭ ８０１７９菌株に比べてＬ－ヒスチジン生産量がそれぞれ１８％および１５．８％増加した。このような結果はＨｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来蛋白質とＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来蛋白質もＬ－ヒスチジンを特異的に排出できるＬ－ヒスチジン排出体として選別され得ることを示す。
【0095】
実施例８．Ｌ－ヒスチジン生産菌株ＣＡ１４－７３７を基盤としてＤｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来、Ｈｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来遺伝子導入菌株の作製およびＬ－ヒスチジン生産能の評価
前記Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来蛋白質Ｄｖａ、Ｈｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来蛋白質Ｈｍａ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来蛋白質ＭａｂのＬ－ヒスチジン排出能を再度確認するために、野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来でＬ－ヒスチジンによるフィードバック制限解消ＨｉｓＧポリペプチド変異導入、Ｌ－ヒスチジン生合成遺伝子が強化されたＬ－ヒスチジン生産菌株ＣＡ１４－７３７（大韓民国出願特許第１０－２０１９－００４６９３４１４－６８２号）菌株に導入した。
前記Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来蛋白質Ｄｖａ、Ｈｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来蛋白質Ｈｍａ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来蛋白質ＭａｂのＬ－ヒスチジン排出能を再度確認するために、野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来でＬ－ヒスチジンによるフィードバック制限解消ＨｉｓＧポリペプチド変異導入、Ｌ－ヒスチジン生合成遺伝子が強化されたＬ－ヒスチジン生産菌株ＣＡ１４－７３７（大韓民国出願特許第１０－２０１９－００４６９３４１４－６８２号）菌株に導入した。
【0096】
このために実施例２と６で作製されたベクター４種（ｐＤＺΔＮ２１３１、ｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｄｖａ、ｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｈｍａ、ｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｍａｂ）をそれぞれＣＡ１４－７３７菌株に電気穿孔法で形質転換し、２次交差過程を経て染色体上のＮＣｇｌ２１３１遺伝子が欠損されたりＬ－ヒスチジン排出遺伝子候補に置換されたりしている菌株４種を作製し、これをそれぞれＣＡ１４－７３７ΔＮ２１３１、ＣＡ１４－７３７ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｄｖａ、ＣＡ１４－７３７ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｈｍａ、およびＣＡ１４－７３７ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｍａｂと命名した。
【0097】
前記作製されたＣＡ１４－７３７ΔＮ２１３１、ＣＡ１４－７３７ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｄｖａ、ＣＡ１４－７３７ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｈｍａ、ＣＡ１４－７３７ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｍａｂ菌株のＬ－ヒスチジン生産能を確認するために、実施例４で行った方法で培養してＬ－ヒスチジン生産量（培地内ヒスチジン含有量）を測定して、その結果を次の表７に示した。
【0098】
【表7】
【0099】
表７に示されているように、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来遺伝子が導入されたＣＡ１４－７３７ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｄｖａ菌株は、母菌株であるＣＡ１４－７３７菌株に比べてＬ－ヒスチジン生産量が６２．５％増加し、Ｈｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来遺伝子が導入されたＣＡ１４－７３７ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｈｍａ菌株は４７．５％増加し、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来遺伝子が導入されたＣＡ１４－７３７ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｍａｂ菌株は５２．５％増加した。これによりＤｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来蛋白質、Ｈｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来蛋白質、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来蛋白質の全てがＬ－ヒスチジンを特異的に排出できるＬ－ヒスチジン排出体であることを再度確認した。前記作製された組換え菌株の中で、ＣＡ１４－７３７ΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－Ｄｖａ菌株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＡ１４－０８７５）を２０２０年０９月２１日付で大韓民国ソウル市西大門区に所在するブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に国際寄託してＫＣＣＭ１２７９３Ｐで寄託番号が付与された。
【0100】
実施例９．Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来、Ｈｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来蛋白質の大腸菌発現用ベクターの作製
前記選別されたＬ－ヒスチジン排出体が多様な菌株でＬ－ヒスチジン生産能を示すか否かを確認した。このために、大腸菌でＤｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来、Ｈｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来蛋白質をそれぞれ発現させることができるベクターを作製した。それぞれの遺伝子は大腸菌発現ベクターであるｐＣＣ１ＢＡＣ（以下、ｐＢＡＣ、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ ｃｏｒｐ．）にクローニングされ、大腸菌菌株ＭＧ１６５５のｙｃｃＡプロモーター（以下、ＰｙｃｃＡ、配列番号５３）下で発現させた。
前記選別されたＬ－ヒスチジン排出体が多様な菌株でＬ－ヒスチジン生産能を示すか否かを確認した。このために、大腸菌でＤｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来、Ｈｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来蛋白質をそれぞれ発現させることができるベクターを作製した。それぞれの遺伝子は大腸菌発現ベクターであるｐＣＣ１ＢＡＣ（以下、ｐＢＡＣ、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ ｃｏｒｐ．）にクローニングされ、大腸菌菌株ＭＧ１６５５のｙｃｃＡプロモーター（以下、ＰｙｃｃＡ、配列番号５３）下で発現させた。
【0101】
Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来ｄｖａを増幅するためにＤｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ菌株の染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号５４と配列番号５５のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、１０８１ｂｐのｄｖａ（配列番号１０）を含む１１１３ｂｐのｄｖａ断片を得た。ｄｖａと連結可能なＰｙｃｃＡ断片を得るためにＭＧ１６５５の染色体を鋳型として配列番号５６と配列番号５７のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、１分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、１００ｂｐのＰｙｃｃＡ（配列番号５３）を含む１３２ｂｐのＰｙｃｃＡ断片を得た。得られたｄｖａ断片とＰｙｃｃＡ断片、そしてＥｃｏＲＩ制限酵素で切断されたｐＢＡＣベクターをギブソンアセンブリを利用してクローニングして、組換えプラスミドを獲得し、これをｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｄｖａと命名した。
【0102】
Ｈｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来ｈｍａを増幅するために、実施例６で作製したｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－ＨｍａベクターＤＮＡを鋳型として配列番号５８と配列番号５９のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、１０８１ｂｐのｈｍａ（配列番号４３）を含む１１１３ｂｐのｈｍａ断片を得た。ｈｍａと連結可能なＰｙｃｃＡ断片を得るためにＭＧ１６５５の染色体を鋳型として配列番号５６と配列番号６０のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、１分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、１００ｂｐのＰｙｃｃＡ（配列番号５３）を含む１３２ｂｐのＰｙｃｃＡ断片を得た。得られたｈｍａ断片とＰｙｃｃＡ断片、そしてＥｃｏＲＩ制限酵素で切断されたｐＢＡＣベクターをギブソンアセンブリを利用してクローニングして、組換えプラスミドを獲得し、これをｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｈｍａと命名した。
【0103】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来ｍａｂを増幅するために、実施例６で作製したｐＤＺΔＮ２１３１－ＰｇａｐＡ－ＭａｂベクターＤＮＡを鋳型として配列番号６１と配列番号６２のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行したその結果、１０８１ｂｐのｍａｂ（配列番号４６）を含む１１１３ｂｐのｍａｂ断片を得た。ｍａｂと連結可能なＰｙｃｃＡ断片を得るために、ＭＧ１６５５の染色体を鋳型として配列番号５６と配列番号６３のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は次のとおりにした：変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、１分を２８回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を遂行した。その結果、１００ｂｐのＰｙｃｃＡ（配列番号５３）を含む１３２ｂｐのＰｙｃｃＡ断片を得た。得られたｍａｂ断片とＰｙｃｃＡ断片、そしてＥｃｏＲＩ制限酵素で切断されたｐＢＡＣベクターをギブソンアセンブリを利用してクローニングして、組換えプラスミドを獲得し、これをｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｍａｂと命名した。
【0104】
実施例１０．大腸菌由来Ｌ－ヒスチジン生産菌株を基盤としてＤｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来遺伝子導入菌株の作製およびＬ－ヒスチジン生産能の評価
大腸菌由来Ｌ－ヒスチジン生産菌株を基盤として新たなヒスチジン排出体３種（Ｄｖａ、Ｈｍａ、Ｍａｂ）のＬ－ヒスチジン排出能を確認するために、前記作製されたベクター３種を既報告された遺伝子型（ｐｕｒＲ欠損、ｈｉｓＬ欠損、ｈｉｓＧｒ； Ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｕｔａｎｔｓ； Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１３， Ｖｏｌ． ４９， Ｎｏ． ２， ｐｐ． １３０－１３５）を有するＣＡ１４－９００３ｅ菌株（ＭＧ１６５５＋ ｈｉｓＧｒ ｈｉｓＬ’＿Δ ΔｐｕｒＲ）に導入した。このために前記実施例９で作製されたベクター３種（ｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｄｖａ、ｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｈｍａ、ｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｍａｂ）とｐＢＡＣベクターをそれぞれ導入して、ＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ、ＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｄｖａ、ＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｈｍａ、およびＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｍａｂ菌株を作製した。
大腸菌由来Ｌ－ヒスチジン生産菌株を基盤として新たなヒスチジン排出体３種（Ｄｖａ、Ｈｍａ、Ｍａｂ）のＬ－ヒスチジン排出能を確認するために、前記作製されたベクター３種を既報告された遺伝子型（ｐｕｒＲ欠損、ｈｉｓＬ欠損、ｈｉｓＧｒ； Ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｕｔａｎｔｓ； Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１３， Ｖｏｌ． ４９， Ｎｏ． ２， ｐｐ． １３０－１３５）を有するＣＡ１４－９００３ｅ菌株（ＭＧ１６５５＋ ｈｉｓＧｒ ｈｉｓＬ’＿Δ ΔｐｕｒＲ）に導入した。このために前記実施例９で作製されたベクター３種（ｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｄｖａ、ｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｈｍａ、ｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｍａｂ）とｐＢＡＣベクターをそれぞれ導入して、ＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ、ＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｄｖａ、ＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｈｍａ、およびＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｍａｂ菌株を作製した。
【0105】
作製されたＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ、ＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｄｖａ、ＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｈｍａ、ＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ－ＰｙｃｃＡ－Ｍａｂ菌株のＬ－ヒスチジン生産能を確認するために、次のような方法で培養した。菌株をＬＢ固体培地（クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含む）で１６時間培養した後、ＬＢ液体培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌバッフル付三角フラスコに各菌株を接種し、３７℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、大腸菌生産培地（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１３， Ｖｏｌ． ４９， Ｎｏ． ２， ｐｐ． １３０－１３５）２５ｍｌを含有する２５０ｍｌバッフル付三角フラスコに１ｍｌの種培養液を接種して３７℃で４８時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。前記培養に使用された培地は次のとおりである。
【0106】
＜大腸菌生産培地＞
ブドウ糖４％（ｗ／ｖ）、酵母抽出液０．２％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム１．６％（ｗ／ｖ）、第２リン酸カリウム３水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸鉄７水塩０．０００５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム５水塩０．０００５％（ｗ／ｖ）、炭酸カルシウム、ｐＨ７．２
ブドウ糖４％（ｗ／ｖ）、酵母抽出液０．２％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム１．６％（ｗ／ｖ）、第２リン酸カリウム３水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸鉄７水塩０．０００５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム５水塩０．０００５％（ｗ／ｖ）、炭酸カルシウム、ｐＨ７．２
【0107】
培養終了後、ＨＰＬＣによりＬ－ヒスチジン生産量（培地内ヒスチジン含有量）を測定してその結果を次の表８に示した。
【0108】
【表8】
【0109】
表８に示されているように、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来遺伝子が導入されたＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ－ＰｇａｐＡ－Ｄｖａ菌株は、母菌株であるＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ菌株に比べてＬ－ヒスチジン生産量が６２．５％増加し、Ｈｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来遺伝子が導入されたＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ－ＰｇａｐＡ－Ｈｍａ菌株は２１．９％増加し、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来遺伝子が導入されたＣＡ１４－９００３ｅ／ｐＢＡＣ－ＰｇａｐＡ－Ｍａｂ菌株は１８．８％増加した。これによりＤｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来蛋白質、Ｈｅｌｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来蛋白質、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ ｓｕｂｓｐ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来蛋白質の全てが大腸菌Ｌ－ヒスチジン生産菌株でもＬ－ヒスチジンを特異的排出体として作動することを確認した。
【0110】
前記結果を通じて、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ ｖａｇｉｎａｌｉｓ由来蛋白質との相同性が６０％以上である蛋白質を微生物に導入時、Ｌ－ヒスチジンを特異的に細胞外に排出する排出体として作動することを確認した。
【0111】
以上、本明細書で開示されるそれぞれの説明および実施形態は、それぞれの他の説明および実施形態にも適用され得る。本明細書で開示された多様な要素の可能な全ての組み合わせが本明細書で提案される発明の範疇に属する。また、下記で記述する具体的な叙述により本明細書の発明の範疇が制限されるといえず、当該技術分野の通常の知識を有する者が本明細書に記載された特定様態に対する多数の等価物を認知したり確認できたりする限り、このような等価物は本明細書で提案される発明に含まれると意図される。
【0112】
［受託番号］
寄託機関名：韓国微生物保存センター
受託番号：ＫＣＣＭ１２７９３Ｐ
受託日付：２０２００９２１
寄託機関名：韓国微生物保存センター
受託番号：ＫＣＣＭ１２７９３Ｐ
受託日付：２０２００９２１
【0113】
【配列表】
【国際調査報告】