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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-22
(54)【発明の名称】インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20230914BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20230914BHJP
A23L 33/18 20160101ALI20230914BHJP
C07K 16/10 20060101ALN20230914BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230914BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 S
A61P31/16
A23L33/18
C07K16/10 ZNA
C12N15/13
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023515629
(86)(22)【出願日】2021-09-08
(85)【翻訳文提出日】2023-03-08
(86)【国際出願番号】 KR2021012191
(87)【国際公開番号】W WO2022055243
(87)【国際公開日】2022-03-17
(31)【優先権主張番号】63/075,456
(32)【優先日】2020-09-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】10-2021-0119473
(32)【優先日】2021-09-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ
２．ＴＷＥＥＮ
３．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523037495
【氏名又は名称】ノヴェルジェン カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＶＥＬＧＥＮ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】（Ｓｕｗｏｎ Ｗｏｒｌｄ Ｃｕｐ Ｓｔａｄｉｕｍ， Ｕｍａｎ－ｄｏｎｇ） ４Ｆ， ３１０， Ｗｏｒｌｄ ｃｕｐ－ｒｏ， Ｐａｌｄａｌ－ｇｕ， Ｓｕｗｏｎ－ｓｉ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ １６２３０ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100137095
【弁理士】
【氏名又は名称】江部 武史
(74)【代理人】
【識別番号】100091627
【弁理士】
【氏名又は名称】朝比 一夫
(72)【発明者】
【氏名】キム， タイ ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】キム， ヨン ジュン
(72)【発明者】
【氏名】オ， クァン ジ
(72)【発明者】
【氏名】リ， グン ソプ
(72)【発明者】
【氏名】リ， ヨン ジュン
【テーマコード（参考）】
4B018
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B018LB01
4B018LB02
4B018LB06
4B018LB07
4B018LB08
4B018MD20
4B018ME14
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB31
4C085CC21
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG08
4H045AA11
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA29
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明はインフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス用組成物に関し、より詳細には、配列番号１で表される重鎖ＣＤＲ１（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号２で表されるＶＨ ＣＤＲ２および配列番号３で表されるＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４で表される軽鎖ＣＤＲ１（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号５で表されるＶＬ ＣＤＲ２および配列番号６で表されるＶＬ ＣＤＲ３を含む抗体またはその断片を含むことにより、インフルエンザＡウイルスに対して優れた抗ウイルス効果を示し、インフルエンザＡウイルスによって引き起こされる疾患の予防、治療または改善効果を示す。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１で表される重鎖ＣＤＲ１（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号２で表されるＶＨ ＣＤＲ２および配列番号３で表されるＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４で表される軽鎖ＣＤＲ１（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号５で表されるＶＬ ＣＤＲ２および配列番号６で表されるＶＬ ＣＤＲ３を含む抗体またはその断片を含む、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス用組成物。
【請求項2】
前記抗体またはその断片は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ウイルス用組成物。
【請求項3】
前記抗体またはその断片は、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ウイルス用組成物。
【請求項4】
前記断片は、配列番号９のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、請求項１に記載の抗ウイルス用組成物。
【請求項5】
前記インフルエンザＡウイルスは、インフルエンザＡウイルスＨ１サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ２サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ５サブタイプおよびインフルエンザＡウイルスＨ６サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ３サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ４サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ１４サブタイプ、およびこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の抗ウイルス用組成物。
【請求項6】
前記インフルエンザＡウイルスは、インフルエンザＡウイルスＮ１サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＮ２サブタイプ、およびこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の抗ウイルス用組成物。
【請求項7】
前記インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ３Ｎ２サブタイプ、およびこれらの変異体の少なくとも１つである、請求項１に記載の抗ウイルス用組成物。
【請求項8】
前記インフルエンザＡウイルスは、オセルタミビル耐性インフルエンザＡウイルスである、請求項１に記載の抗ウイルス用組成物。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物を含むインフルエンザＡウイルス感染症の予防または治療用薬学組成物。
【請求項10】
前記インフルエンザＡウイルス感染症の治療用である、請求項９に記載の薬学組成物。
【請求項11】
請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物を含むインフルエンザＡウイルス感染症の予防または改善用食品組成物。
【請求項12】
前記インフルエンザＡウイルス感染症の改善用である、請求項１１に記載の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
一般に「フルー（the flu）」として知られているインフルエンザは、インフルエンザウイルスにより引き起こされる伝染性発熱性呼吸器疾患である。Ａ型及びＢ型のインフルエンザウイルスは人々に広がり、毎年季節性インフルエンザの流行を引き起こす。世界保健機構（ＷＨＯ）によると、インフルエンザウイルスの伝染により約３００万～５００万の重症患者が発生し、約２９０，０００～６５０，０００人が死亡する。ＷＨＯは高リスク群に対して毎年インフルエンザに対する予防接種を勧めており、ワクチンは一般的に３～４種類のインフルエンザに有効である。しかし、ウイルスの急速な進化により、１年間にわたって作られたワクチンは翌年には有効でない可能性がある。インフルエンザＡ及びＢウイルスのゲノムは、抗原連続変異（antigenic drift）と抗原不連続変異（antigenic shift）の２通りに突然変異が起こり得る。そのため、従来のワクチンや抗ウイルス剤はウイルスに対して低い抗ウイルス効果を示す。したがって、インフルエンザウイルスのゲノムに突然変異が起こった場合でも優れた抗ウイルス効果を示す物質の開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明は、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス用組成物を提供することを目的とする。
【0004】
本発明は、インフルエンザＡウイルス感染症の予防または治療用薬学組成物を提供することを目的とする。
【0005】
本発明は、インフルエンザＡウイルス感染症の予防または改善用食品組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
１．配列番号１で表される重鎖ＣＤＲ１（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号２で表されるＶＨ ＣＤＲ２および配列番号３で表されるＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４で表される軽鎖ＣＤＲ１（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号５で表されるＶＬ ＣＤＲ２および配列番号６で表されるＶＬ ＣＤＲ３を含む抗体またはその断片を含む、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス用組成物。
【0007】
２．前記項目１において、前記抗体またはその断片は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗ウイルス用組成物。
【0008】
３．前記項目１において、前記抗体またはその断片は、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗ウイルス用組成物。
【0009】
４．前記項目１において、前記断片は、配列番号９のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、抗ウイルス用組成物。
【0010】
５．前記項目１において、前記インフルエンザＡウイルスは、インフルエンザＡウイルスＨ１サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ２サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ５サブタイプおよびインフルエンザＡウイルスＨ６サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ３サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ４サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ１４サブタイプ、およびこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１つである、抗ウイルス用組成物。
【0011】
６．前記項目１において、前記インフルエンザＡウイルスは、インフルエンザＡウイルスＮ１サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＮ２サブタイプ、およびこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１つである、抗ウイルス用組成物。
【0012】
７．前記項目１において、前記インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ３Ｎ２サブタイプ、およびこれらの変異体の少なくとも１つである、抗ウイルス用組成物。
【0013】
８．前記項目１において、前記インフルエンザＡウイルスは、オセルタミビル耐性インフルエンザＡウイルスである、抗ウイルス用組成物。
【0014】
９．前記項目１～８のいずれかに記載の組成物を含むインフルエンザＡウイルス感染症の予防または治療用薬学組成物。
【0015】
１０．前記項目９において、インフルエンザＡウイルス感染症の治療用薬学組成物。
【0016】
１１．前記項目１～８のいずれかに記載の組成物を含むインフルエンザＡウイルス感染症の予防または改善用食品組成物。
【0017】
１２．前記項目１１において、インフルエンザＡウイルス感染症の改善用食品組成物。
【発明の効果】
【0018】
本発明の抗ウイルス用組成物に含まれる抗体またはその断片は、ウイルスに感染した細胞内に浸透することができ、インフルエンザＡウイルスＲＮＡに結合してそれを分解することができる。
【0019】
本発明の抗ウイルス用組成物は、インフルエンザＡウイルスに特異的に結合し、それを加水分解することによってインフルエンザＡウイルスに対して優れた抗ウイルス効果を示し、インフルエンザＡウイルス感染症の予防、治療または改善効果を示すことができる。
【0020】
本発明の抗ウイルス用組成物は、様々なサブタイプのインフルエンザＡウイルスまたはその変異体に対して優れた抗ウイルス効果を示すことができる。
【0021】
本発明の抗ウイルス用組成物は、オセルタミビル耐性インフルエンザＡウイルスに対して優れた抗ウイルス効果を示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図6】図６は、インフルエンザＡウイルス菌株（Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８、Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１およびＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ）に対する３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理の抗ウイルス効果（細胞生存率）を試験するための概略図および試験結果を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図7】図７は、インフルエンザＡウイルス菌株（Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８、Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１およびＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ）に対する３Ｄ８ ｓｃＦｖ後処理の抗ウイルス効果（細胞生存率）を試験するための概略図および試験結果を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図11】図１１は、３Ｄ８ ｓｃＦｖが前処理された後、インフルエンザウイルスに感染した細胞からウイルスタンパク質ＨＡを検出した結果を示す（核：ＤＡＰＩ（青）、３Ｄ８ ｓｃＦｖ：Ａｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ４８８（緑）、ウイルスＨＡ：ＴＲＩＴＣ（赤））。
【図12】図１２は、インフルエンザウイルスに感染した細胞に３Ｄ８ ｓｃＦｖが後処理された後、ウイルスタンパク質ＨＡを検出した結果を示す（核：ＤＡＰＩ（青）、３Ｄ８ ｓｃＦｖ：Ａｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ４８８（緑）、ウイルスＨＡ：ＴＲＩＴＣ（赤））。
【発明を実施するための形態】
【0023】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0024】
本発明は、配列番号１で表される重鎖ＣＤＲ１（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号２で表されるＶＨ ＣＤＲ２および配列番号３で表されるＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４で表される軽鎖ＣＤＲ１（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号５で表されるＶＬ ＣＤＲ２および配列番号６で表されるＶＬ ＣＤＲ３を含む抗体またはその断片を含む、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス用組成物を提供する。
【0025】
用語「相補性決定領域（complementarity determining region, CDR）」とは、抗原の認識に関与する領域であり、この領域の配列の変化によって抗体の抗原に対する特異性が決定される。本明細書において、「ＶＨ ＣＤＲ」とは重鎖可変領域に存在する重鎖相補性決定領域を意味し、「ＶＬ ＣＤＲ」とは軽鎖可変領域に存在する軽鎖相補性決定領域を意味する。
【0026】
用語「可変領域」とは、抗原に特異的に結合する機能を果たしながら配列の変異を示す領域を意味する。可変領域にはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が存在する。前記ＣＤＲの間にはフレームワーク領域（framework region, FR）部分が存在し、これはＣＤＲを支持する役割を果たすことができる。フレームワーク領域とは無関係に、ＣＤＲは抗体またはその断片が特定の機能を発揮できるようにする重要な領域であり得る。
【0027】
抗体またはその断片は、配列番号１で表される重鎖ＣＤＲ１（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号２で表されるＶＨ ＣＤＲ２および配列番号３で表されるＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに、配列番号４で表される軽鎖ＣＤＲ１（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号５で表されるＶＬ ＣＤＲ２および配列番号６で表されるＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【0028】
抗体またはその断片は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むことができる。一実施形態によると、抗体またはその断片は、配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含むことができる。
【0029】
抗体またはその断片は、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことができる。一実施形態によると、抗体またはその断片は、配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことができる。
【0030】
抗体の断片は、一本鎖抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ＬＣ、ｄＡｂ、ＣＤＲ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、およびダイアボディ（diabody）からなる群より選択される少なくとも１つであってもよい。
【0031】
抗体の断片は、配列番号９のアミノ酸配列を含むことができる。一実施形態によると、抗体の断片は、配列番号９のアミノ酸配列からなるものであってもよい。一実施形態によると、抗体の断片は、配列番号９のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖであってもよい。
【0032】
抗体またはその断片は、ヒト化抗体またはその断片；若しくは、キメラ抗体またはその断片であってもよい。ヒト化抗体は、当業界で公知の方法で製造することができる。
【0033】
実施形態によると、抗体の断片は、配列番号９のｓｃＦｖのＣＤＲ配列を含むヒト化ｓｃＦｖであってもよい。
【0034】
本発明の抗体またはその断片は、ウイルスが感染した宿主細胞の細胞質に浸透することができる。抗体またはその断片の細胞質への浸透効果は、カベオラ依存的エンドサイトーシス（Caveolae mediated endocytosis）によるものとみることができる。
【0035】
本発明の抗体またはその断片は、インフルエンザＡウイルスの核酸に特異的に結合することができる。具体的には、本発明の抗体またはその断片は、インフルエンザＡウイルスのＲＮＡに特異的に結合することができる。本発明の抗体またはその断片は、ヌクレアーゼ活性を有し、ウイルスのＲＮＡおよびＤＮＡを分解することができる。
【0036】
本発明の抗体またはその断片は、インフルエンザＡウイルスに感染した宿主の細胞質へ浸透することができ、感染した細胞からネイキッドウイルスＲＮＡ（naked viral RNA）を除去することにより、ウイルスの遺伝子の複製量の低下およびウイルスタンパク質の低下を誘導し、ウイルス治療の効果を持つことができる。
【0037】
インフルエンザＡウイルスは、表面抗原で、ヘマグルチニン（hemagglutinin、HA）サブタイプとノイラミニダーゼ（neuraminidase, NA）サブタイプ、またはこれらの変異体に分けることができる。
【0038】
前記変異体は、インフルエンザＡウイルスサブタイプの突然変異体であってもよく、例えば、インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニン及び／又はノイラミニダーゼに突然変異が生じたものであってもよい。
【0039】
具体的には、前記変異体はインフルエンザＡウイルスサブタイプの突然変異体であり、インフルエンザＡウイルスのノイラミニダーゼに突然変異が発生して、オセルタミビル（oseltamivir、タミフル）耐性が示されたものであってもよい。例えば、前記変異体はＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙであってもよい。Ｈ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙは、Ｈ１Ｎ１／ｐｄｍ０９から生じたタンパク質変異である。
【0040】
タミフルの作用機序は、Ｈ１Ｎ１のノイラミニダーゼのスパイクタンパク質を抑制して拡散を防止することであるが、Ｈ１Ｎ１のノイラミニダーゼのＨ２７５Ｙアミノ酸変異が発生したＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙは、ノイラミニダーゼとタミフルとの結合力が非常に弱く、タミフルの抵抗性が示される。ヘマグルチニンは宿主細胞の表面を認識し、細胞内に浸透する役割を果たすことができる。また、細胞内で様々な炎症反応を引き起こし、自身を複製する役割を果たすことができる。
【0041】
インフルエンザＡウイルスは、ヘマグルチニンによって定義された様々な種類のサブタイプまたはこれらの変異体であってもよい。
【0042】
ヘマグルチニンによって定義されたサブタイプは、Ｈ１サブタイプ、Ｈ２サブタイプ、Ｈ３サブタイプ、Ｈ４サブタイプ、Ｈ５サブタイプ、Ｈ６サブタイプ、Ｈ７サブタイプ、Ｈ８サブタイプ、Ｈ９サブタイプ、Ｈ１０サブタイプ、Ｈ１１サブタイプ、Ｈ１２サブタイプ、Ｈ１３サブタイプ、Ｈ１４サブタイプ、Ｈ１５サブタイプ、およびＨ１６サブタイプであってもよい（図２４）。インフルエンザＡウイルスＨ１、Ｈ２およびＨ３サブタイプが、主にヒトに病気を引き起こす。
【0043】
インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ２ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ３ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ４ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ５ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ６ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ６ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ７ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ８ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ９ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ１０ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ１１ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ１２ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ１３ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ１４ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ１５ヘマグルチニンを含むサブタイプ、Ｈ１６ヘマグルチニンを含むサブタイプ、及び／又はこれらの変異体であってもよい。
【0044】
インフルエンザＡウイルスは、ヘマグルチニン（hemagglutinin、HA）によって定義された１６種のサブタイプの中でＨ１サブタイプを除く残りの１５種のサブタイプの少なくとも１つであってもよい。
【0045】
例えば、本発明の抗体またはその断片は、インフルエンザＡウイルスＨ１サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ２サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ５サブタイプおよびインフルエンザＡウイルスＨ６サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ３サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ４サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ１４サブタイプ、およびこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１つに対する抗ウイルス効果を示すことができる。一実施形態によると、本発明の抗体またはその断片は、インフルエンザＡウイルスＨ１サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＨ３サブタイプ、およびこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１つに対する抗ウイルス効果を示すことができる。
【0046】
また、インフルエンザＡウイルスは、ノイラミニダーゼ（Neuraminidase、NA）によって定義された様々な種類のサブタイプおよびこれらの変異体であってもよい。
【0047】
ノイラミニダーゼは、宿主細胞内で増殖したウイルスが細胞膜を突き抜けるように「ハサミ」の働きをする酵素であり、ウイルス拡散の重要な役割を果たすことができる。
【0048】
例えば、インフルエンザＡウイルスは、インフルエンザＡウイルスＮ１サブタイプ、Ｎ２サブタイプ、Ｎ３サブタイプ、Ｎ４サブタイプ、Ｎ５サブタイプ、Ｎ６サブタイプ、Ｎ７サブタイプ、Ｎ８サブタイプ、Ｎ９サブタイプ、およびこれらの変異体であってもよい。
【0049】
インフルエンザＡウイルスは、Ｎ１ノイラミニダーゼを含むサブタイプ、Ｎ２ノイラミニダーゼを含むサブタイプ、およびこれらの変異体であってもよい。
【0050】
一実施形態によると、本発明の抗体またはその断片は、インフルエンザＡウイルスＮ１サブタイプ、インフルエンザＡウイルスＮ２サブタイプ、およびこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１つに対して抗ウイルス効果を示すことができる。
【0051】
一実施形態によると、本発明の抗体またはその断片は、Ｈ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ３Ｎ２サブタイプ、およびこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１つに対して抗ウイルス効果を示す。例えば、本発明の抗体またはその断片は、Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８、Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１、Ｈ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙウイルス菌株に対して抗ウイルス効果を示すことができる。
【0052】
また、本発明は前述の抗ウイルス用組成物を含むインフルエンザＡウイルス感染症の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0053】
抗ウイルス用組成物、抗体またはその断片、インフルエンザＡウイルスについては、前述の通りであるので具体的な説明を省略する。
【0054】
特に、本発明は前述の抗ウイルス用組成物を含むインフルエンザＡウイルス感染症を治療できる薬学組成物を提供する。
【0055】
用語「予防」とは、ウイルスによって引き起こされる疾患を抑制するか、または疾患の発症を遅らせるすべての行為を意味する。
【0056】
用語「治療」とは、ウイルスによって引き起こされる疾患の症状を改善または有益に変化させるすべての行為を意味する。
【0057】
インフルエンザＡウイルスは、ヘマグルチニン（hemagglutinin、HA）によって定義されたサブタイプまたはこれらの変異体であってもよい。ヘマグルチニン（hemagglutinin、HA）によって定義されたサブタイプは、Ｈ１サブタイプ、Ｈ２サブタイプ、Ｈ３サブタイプ、Ｈ４サブタイプ、Ｈ５サブタイプ、Ｈ６サブタイプ、Ｈ７サブタイプ、Ｈ８サブタイプ、Ｈ９サブタイプ、Ｈ１０サブタイプ、Ｈ１１サブタイプ、Ｈ１２サブタイプ、Ｈ１３サブタイプ、Ｈ１４サブタイプ、Ｈ１５サブタイプ、およびＨ１６サブタイプであってもよい（図２４）。また、インフルエンザＡウイルスは、ノイラミニダーゼ（Neuraminidase、NA）によって定義された様々な種類のサブタイプおよびこれらの変異体であってもよい。例えば、インフルエンザＡウイルスは、インフルエンザＡウイルスＮ１サブタイプ、Ｎ２サブタイプ、Ｎ３サブタイプ、Ｎ４サブタイプ、Ｎ５サブタイプ、Ｎ６サブタイプ、Ｎ７サブタイプ、Ｎ８サブタイプ、Ｎ９サブタイプ、およびこれらの変異体であってもよい。
【0058】
一実施形態によると、インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１Ｎ１サブタイプ、Ｈ３Ｎ２サブタイプ、およびこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１つであってもよい。
【0059】
インフルエンザＡウイルスの感染症は、発熱、嘔吐、下痢、倦怠感、咳、呼吸困難、肺炎、頭痛、筋肉痛、痰、咽頭炎、インフルエンザ、風邪、胸痛（pain／pressure in the chest）、めまい症（sudden dizziness）を含むものであってもよいが、ウイルス感染によって引き起こされる疾患であれば、これらに限定されない。
【0060】
インフルエンザＡウイルスの感染症は、インフルエンザＡ臨床症状を示す疾患であれば制限されない。
【0061】
本発明の薬学組成物は、疾患の予防および治療のために、単独でまたは手術、薬物治療および生物学的応答調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【0062】
薬学組成物は、インフルエンザＡウイルス感染に効果のある追加成分を含むことができ、追加成分は、化合物、天然物、タンパク質、ペプチド、核酸などを含むウイルス感染への効果が知られているあらゆる成分であってもよい。
【0063】
薬学組成物は、さらに組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤および希釈剤を含むことができる。担体、賦形剤および希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、でん粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などであってもよい。
【0064】
本発明の薬学組成物は、通常の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型製剤、外用剤、坐剤および滅菌注射溶液の形態で製剤化することができ、この製剤化は、薬剤学の分野で通常使用される方法によって行うことができる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤をさらに使用して調製することができる。
【0065】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、この固形製剤は少なくとも１つ以上の賦形剤、例えばでん粉、炭酸カルシウム（Calcium carbonate）、スクロース（sucrose）またはラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混ぜて調製する。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁液、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられるが、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油、エチルオレートなどの注射可能なエステルなどを用いることができる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイーン（tween）、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを用いることができる。
【0066】
また、本発明は前述の抗ウイルス用組成物を含むインフルエンザＡウイルス感染症の予防または改善用食品組成物を提供する。
【0067】
抗ウイルス用組成物、抗体またはその断片、インフルエンザＡウイルスおよび疾患については前述の通りであるので、具体的な説明を省略する。
【0068】
特に、本発明は前述の抗ウイルス用組成物を含むインフルエンザＡウイルス感染症を改善できる食品組成物を提供する。
【0069】
用語「改善」とは、ウイルスによって引き起こされる疾患の症状を軽減するすべての行為を意味する。
【0070】
食品組成物は他の食品または食品成分と共に使用することができ、通常の方法に従って適切に使用することができる。
【0071】
食品組成物に含まれる有効成分の混合量は、その使用目的（予防または改善用）によって適宜決定することができる。
【0072】
食品組成物の種類は特に制限されず、例えば肉、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤などであってもよい。
【0073】
食品組成物は通常の食品のように、有効成分の他に、香味剤または天然炭水化物などの追加の成分をさらに含むことができる。天然炭水化物はブドウ糖、果糖などのモノサッカライド；マルトース、スクロースなどのジサッカライド；およびデキストリン、シクロデキストリンなどのポリサッカライド；キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールであってもよい。甘味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物などの天然甘味剤；およびサッカリン、アスパルテームなどの合成甘味剤などを使用することができる。
【0074】
前記の他に、本発明の健康食品は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。その他に、天然のフルーツジュース、フルーツジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。
【0075】
また、本発明は前述の抗ウイルス用組成物を対象体に投与するステップを含むインフルエンザＡウイルス感染症の予防または治療方法を提供する。特に、本発明は前述の抗ウイルス用組成物を対象体に投与するステップを含むインフルエンザＡウイルス感染症の治療方法を提供する。
【0076】
対象体は、ヒト及び／又はヒトを除いた動物であってもよく、具体的には発明の薬物等を用いた治療によって有益な効果を示すことができる哺乳動物である。
【0077】
対象体には、インフルエンザＡウイルス感染症の症状（例えば、発熱、倦怠感、咳、呼吸困難、肺炎、痰、咽頭炎、インフルエンザ、風邪など）を有するか、またはそのような症状を有する危険性がある対象体がすべて含まれ得る。インフルエンザＡウイルスについては前述の通りであるので、具体的な説明を省略する。
【0078】
インフルエンザＡウイルス感染症を予防または治療するのに有効な量とは、治療を必要とする対象体において所望の効果を達成できる量、または治療を必要とする対象体に客観的または主観的な利点を提供できる量を意味する。
【0079】
インフルエンザＡウイルス感染症を予防または治療するのに有効な量は、単一または多重用量であってもよい。インフルエンザＡウイルス感染症を予防または治療するのに有効な量は、本発明の薬物を単独で提供する場合の量であってもよいが、１以上の他の組成物（例えば、他の呼吸器疾患治療剤など）と組み合わせて提供される場合の量であってもよい。
【0080】
本明細書に記載の数値は、特に断りのない限り、均等範囲まで含むものと解釈されるべきである。
【0081】
また、本発明はインフルエンザＡウイルス感染症の予防または治療のための前述の抗ウイルス用組成物を含む薬学組成物の使用を提供する。
【0082】
特に、本発明は、インフルエンザＡウイルス感染症の治療のための前述の抗ウイルス用組成物を含む薬学組成物の使用を提供する。
【0083】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明することとする。
【0084】
１．実験材料：細胞株およびウイルス
ＭＤＣＫ細胞は、５％ウシ胎児血清（Gibco、Cergy Pontois、France）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Hyclone、Logan、UT、USA）を含むイーグル最小必須培地（Eagle's minimal essential medium、EMEM）で保存した。ＨｅＬａとＶｅｒｏ細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's medium、DMEM）で培養し、Ａ５４９細胞は、ＭＤＣＫ培養培地と同じ血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Roswell park Memorial Institute 1640 培地；Hyclone）で培養した。細胞株は、韓国細胞株銀行から購入し、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。インフルエンザ菌株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８）およびＡ／Ｘ－３１（Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１）は、Ｋｗｅｏｎ教授（成均館大学、韓国）により提供された。また、パンデミック（Pandemic）Ｈ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ ＮＡ突然変異ウイルス（A／Korea／2785／2009pdm：NCCP 42017；オセルタミビル耐性（Oseltamivir－resistant））を国家病原体資源バンクから入手した。Ｈ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙは、Ｈ１Ｎ１／ｐｄｍ０９から発生した変異体である。３７℃で３日間、９日目になった孵化卵の尿膜嚢でウイルスを増殖させた。尿膜液を回収し、密度勾配遠心分離を用いて除去した。ウイルス力価は、プラークアッセイを用いて決定した。
ＭＤＣＫ細胞は、５％ウシ胎児血清（Gibco、Cergy Pontois、France）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Hyclone、Logan、UT、USA）を含むイーグル最小必須培地（Eagle's minimal essential medium、EMEM）で保存した。ＨｅＬａとＶｅｒｏ細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's medium、DMEM）で培養し、Ａ５４９細胞は、ＭＤＣＫ培養培地と同じ血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Roswell park Memorial Institute 1640 培地；Hyclone）で培養した。細胞株は、韓国細胞株銀行から購入し、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。インフルエンザ菌株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８）およびＡ／Ｘ－３１（Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１）は、Ｋｗｅｏｎ教授（成均館大学、韓国）により提供された。また、パンデミック（Pandemic）Ｈ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ ＮＡ突然変異ウイルス（A／Korea／2785／2009pdm：NCCP 42017；オセルタミビル耐性（Oseltamivir－resistant））を国家病原体資源バンクから入手した。Ｈ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙは、Ｈ１Ｎ１／ｐｄｍ０９から発生した変異体である。３７℃で３日間、９日目になった孵化卵の尿膜嚢でウイルスを増殖させた。尿膜液を回収し、密度勾配遠心分離を用いて除去した。ウイルス力価は、プラークアッセイを用いて決定した。
【0085】
２．抗体の断片の発現および精製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細胞をホスト（host）として用いて、下記表１の配列番号９のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを産生した（図１参照）。下記表１に、ｓｃＦｖ関連の配列（ｓｃＦｖ配列；そのＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ配列；及びその遺伝子配列）を示す。具体的には、３７℃の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ（Luria－Bertani）培地でｐＩｇ２０－３Ｄ８プラスミド形質転換した大腸菌（ＢＬ２１［ＤＥ３］ｐＬｙｓＥ）菌株を用いて抗体断片（３Ｄ８ ｓｃＦｖ）を発現させ（図２参照）、１ｍＭのイソプロピル１－チオール－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して２６℃で１８時間誘導した。細胞培養上層液を４℃で５，２００ｘｇで２０分間遠心分離して得た後、０．２２μｍフィルターを通過させた。ＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（GE Healthcare、Malborough、MA、USA）アフィニティーカラムを用いて上清液から３Ｄ８ ｓｃＦｖを精製した。カラムを１０ｂｅｄ体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで１０ｂｅｄ体積の５ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）で洗浄した。次に、０．１Ｍの酢酸（ｐＨ３．４）で３Ｄ８ ｓｃＦｖを溶出した。溶出した画分を０．１体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和した。精製された３Ｄ８ ｓｃＦｖの濃度は、２８０ｎｍにおける吸光係数に基づいて決定した。タンパク質を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、クーマシーブルー染色で検出した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細胞をホスト（host）として用いて、下記表１の配列番号９のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを産生した（図１参照）。下記表１に、ｓｃＦｖ関連の配列（ｓｃＦｖ配列；そのＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ配列；及びその遺伝子配列）を示す。具体的には、３７℃の１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ（Luria－Bertani）培地でｐＩｇ２０－３Ｄ８プラスミド形質転換した大腸菌（ＢＬ２１［ＤＥ３］ｐＬｙｓＥ）菌株を用いて抗体断片（３Ｄ８ ｓｃＦｖ）を発現させ（図２参照）、１ｍＭのイソプロピル１－チオール－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して２６℃で１８時間誘導した。細胞培養上層液を４℃で５，２００ｘｇで２０分間遠心分離して得た後、０．２２μｍフィルターを通過させた。ＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（GE Healthcare、Malborough、MA、USA）アフィニティーカラムを用いて上清液から３Ｄ８ ｓｃＦｖを精製した。カラムを１０ｂｅｄ体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで１０ｂｅｄ体積の５ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）で洗浄した。次に、０．１Ｍの酢酸（ｐＨ３．４）で３Ｄ８ ｓｃＦｖを溶出した。溶出した画分を０．１体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和した。精製された３Ｄ８ ｓｃＦｖの濃度は、２８０ｎｍにおける吸光係数に基づいて決定した。タンパク質を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、クーマシーブルー染色で検出した。
【0086】
【表1】
【0087】
３．抗体断片の細胞浸透活性の分析
まず、３Ｄ８ ｓｃＦｖの抗ウイルス効果の重要な前提条件となる細胞浸透活性を確認した。Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＶｅｒｏおよびＭＤＣＫ細胞（２×１０４）を８ウェルチャンバースライド（Nunc Lab－Tek）で培養した。細胞に３μＭの３Ｄ８ ｓｃＦｖを処理し、３７℃で５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次に、スライドをＰＢＳで２回洗浄し、２５℃の冷却メタノールに１５分間固定した。細胞内染色パーマ洗浄バッファー（Intracellular Staining Perm wash buffer（BioLegend、San Diego、CA、USA））を用いてサンプルを５分間透過化した。１％ＢＳＡ（in PBST）で１時間ブロックした後、サンプルをモノクローナルマウス抗３Ｄ８ ｓｃＦｖ抗体（１：１０００希釈；AbClon、Seoul、Korea）と共に４℃で２４時間インキュベートした。次いで、サンプルをヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８二次抗体（１：１０００希釈；Abcam、Cambridge、MA、USA）と共に２５℃で１時間インキュベートし、スライドをＤＡＰＩ（Vectashield、Burlingame、CA、USA）を含む退色防止封入剤（Antifade Mounting Medium）に取り付けた。その後、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００共焦点顕微鏡を用いてサンプルを可視化した。核はＤＡＰＩ染色（青）で検出し、３Ｄ８ ｓｃＦｖはＡｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ４８８ 蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）染料（緑）でコンジュゲートされた抗体で可視化された。３Ｄ８ ｓｃＦｖは、処理後２４時間以内にすべての細胞株の細胞質から検出された（図３）。
まず、３Ｄ８ ｓｃＦｖの抗ウイルス効果の重要な前提条件となる細胞浸透活性を確認した。Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＶｅｒｏおよびＭＤＣＫ細胞（２×１０４）を８ウェルチャンバースライド（Nunc Lab－Tek）で培養した。細胞に３μＭの３Ｄ８ ｓｃＦｖを処理し、３７℃で５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次に、スライドをＰＢＳで２回洗浄し、２５℃の冷却メタノールに１５分間固定した。細胞内染色パーマ洗浄バッファー（Intracellular Staining Perm wash buffer（BioLegend、San Diego、CA、USA））を用いてサンプルを５分間透過化した。１％ＢＳＡ（in PBST）で１時間ブロックした後、サンプルをモノクローナルマウス抗３Ｄ８ ｓｃＦｖ抗体（１：１０００希釈；AbClon、Seoul、Korea）と共に４℃で２４時間インキュベートした。次いで、サンプルをヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８二次抗体（１：１０００希釈；Abcam、Cambridge、MA、USA）と共に２５℃で１時間インキュベートし、スライドをＤＡＰＩ（Vectashield、Burlingame、CA、USA）を含む退色防止封入剤（Antifade Mounting Medium）に取り付けた。その後、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００共焦点顕微鏡を用いてサンプルを可視化した。核はＤＡＰＩ染色（青）で検出し、３Ｄ８ ｓｃＦｖはＡｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ４８８ 蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）染料（緑）でコンジュゲートされた抗体で可視化された。３Ｄ８ ｓｃＦｖは、処理後２４時間以内にすべての細胞株の細胞質から検出された（図３）。
【0088】
４．抗体断片のウイルスＲＮＡの分解活性
Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８で全ＲＮＡを分離し、ウイルスｃＤＮＡを合成した。ＮＡおよびＮＰに相当する配列をＰＣＲを用いて増幅し（表２）、Ｔ７およびＳＰ６プロモーターを保持するベクターであるｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ（Promega、Madison、WI、USA）にクローニングした。ＮＡ（Neuraminidase）およびＮＰ（核タンパク質（Nucleoprotein））ＲＮＡは、ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７試験管内転写キット（New England BioLabs、Ipswich、MA、USA）を用いて合成し、３７℃で０．１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＴＢＳで３Ｄ８ ｓｃＦｖ精製タンパク質（０．５μｇ）と共に１時間インキュベートした。１０Ｘローディングバッファー（Takara、Otsu、Shinga、Japan）を添加して反応を終了し、１％アガロースゲル電気泳動で分析し、エチジウムブロミド（ethidium bromide）で染色した。分析の結果、３Ｄ８ ｓｃＦｖ処理によってウイルスＲＮＡが分解されたことを確認した（図４）。
Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８で全ＲＮＡを分離し、ウイルスｃＤＮＡを合成した。ＮＡおよびＮＰに相当する配列をＰＣＲを用いて増幅し（表２）、Ｔ７およびＳＰ６プロモーターを保持するベクターであるｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ（Promega、Madison、WI、USA）にクローニングした。ＮＡ（Neuraminidase）およびＮＰ（核タンパク質（Nucleoprotein））ＲＮＡは、ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７試験管内転写キット（New England BioLabs、Ipswich、MA、USA）を用いて合成し、３７℃で０．１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＴＢＳで３Ｄ８ ｓｃＦｖ精製タンパク質（０．５μｇ）と共に１時間インキュベートした。１０Ｘローディングバッファー（Takara、Otsu、Shinga、Japan）を添加して反応を終了し、１％アガロースゲル電気泳動で分析し、エチジウムブロミド（ethidium bromide）で染色した。分析の結果、３Ｄ８ ｓｃＦｖ処理によってウイルスＲＮＡが分解されたことを確認した（図４）。
【0089】
【表2】
【0090】
５．抗体断片の細胞毒性の分析
ＭＤＣＫ細胞（２×１０４）を９６ウェルプレートで培養した。細胞を３Ｄ８ ｓｃＦｖ（１～１０μＭ）で処理し、４８時間の間、５％ＣＯ２と共に３７℃で培養した。その後、１０μｌのＭＴＴ溶液を添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。形成されたホルマザン結晶をＤＭＳＯで溶解し、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（TECAN、Mannedorf、Switzerland）を用いて５９５ｎｍにおける各ウェルの吸光度を読み取った。
ＭＤＣＫ細胞（２×１０４）を９６ウェルプレートで培養した。細胞を３Ｄ８ ｓｃＦｖ（１～１０μＭ）で処理し、４８時間の間、５％ＣＯ２と共に３７℃で培養した。その後、１０μｌのＭＴＴ溶液を添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。形成されたホルマザン結晶をＤＭＳＯで溶解し、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（TECAN、Mannedorf、Switzerland）を用いて５９５ｎｍにおける各ウェルの吸光度を読み取った。
【0091】
ＭＤＣＫ細胞に異なる濃度の３Ｄ８ ｓｃＦｖ（０～１０μＭ）を処理して細胞毒性を確認した。すべての濃度で５％未満の最小細胞毒性が観察された。これは実験が行われた濃度で３Ｄ８ ｓｃＦｖの毒性が最小に維持されたことを示す（図５）。
【0092】
６．抗体断片のインフルエンザＡウイルス感染細胞の生存率増加効果
ＭＤＣＫ細胞（２×１０４）を９６ウェルプレートで培養し、以下のように処理した。（ｉ）３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理：３７℃、５％ＣＯ２でＭＤＣＫ細胞に３Ｄ８ ｓｃＦｖ（３、５、７μＭ）を２４時間処理した後、３Ｄ８ ｓｃＦｖで処理した細胞を３７℃で１時間、ＭＥＭフリー培地で独立して３つのインフルエンザウイルス菌株（Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８、Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１およびＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ）（ＭＯＩ＝０．１）で感染させた。その後、感染培地を除去し、細胞をトシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）処理したトリプシン（１μｇ／ｍｌ）を含有する血清非添加ＭＥＭフリー培地（１％ＢＳＡ）中で３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した（図６の上側）。（ｉｉ）３Ｄ８ ｓｃＦｖ後処理：ＭＤＣＫ細胞を３７℃で１時間、ＭＥＭフリー培地で独立して３つのインフルエンザウイルス菌株（Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８、Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１およびＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ）（ＭＯＩ＝０．１）で感染させた後、感染培地を除去した。培地を３Ｄ８ ｓｃＦｖ（３、５、７μＭ）およびＴＰＣＫ処理したトリプシン（１μg／ｍｌ）を含むＭＥＭフリー培地（１％ＢＳＡ）で交換した後、３７℃、５％ＣＯ２で４７時間培養した（図７の上側）。その後、１０μｌのＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。形成されたホルマザン結晶をＤＭＳＯで溶解し、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーを用いて５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。ちなみに、３種類のウイルス（ＭＯＩ＝０．１）のそれぞれに感染した細胞に異なる濃度のオセルタミビル（oseltamivir）を処理した場合、Ｈ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ感染細胞は薬物耐性表現型を示したが、Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８およびＨ３Ｎ２／Ｘ－３１感染細胞はそうではなかった。
ＭＤＣＫ細胞（２×１０４）を９６ウェルプレートで培養し、以下のように処理した。（ｉ）３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理：３７℃、５％ＣＯ２でＭＤＣＫ細胞に３Ｄ８ ｓｃＦｖ（３、５、７μＭ）を２４時間処理した後、３Ｄ８ ｓｃＦｖで処理した細胞を３７℃で１時間、ＭＥＭフリー培地で独立して３つのインフルエンザウイルス菌株（Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８、Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１およびＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ）（ＭＯＩ＝０．１）で感染させた。その後、感染培地を除去し、細胞をトシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）処理したトリプシン（１μｇ／ｍｌ）を含有する血清非添加ＭＥＭフリー培地（１％ＢＳＡ）中で３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した（図６の上側）。（ｉｉ）３Ｄ８ ｓｃＦｖ後処理：ＭＤＣＫ細胞を３７℃で１時間、ＭＥＭフリー培地で独立して３つのインフルエンザウイルス菌株（Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８、Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１およびＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ）（ＭＯＩ＝０．１）で感染させた後、感染培地を除去した。培地を３Ｄ８ ｓｃＦｖ（３、５、７μＭ）およびＴＰＣＫ処理したトリプシン（１μg／ｍｌ）を含むＭＥＭフリー培地（１％ＢＳＡ）で交換した後、３７℃、５％ＣＯ２で４７時間培養した（図７の上側）。その後、１０μｌのＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。形成されたホルマザン結晶をＤＭＳＯで溶解し、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーを用いて５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。ちなみに、３種類のウイルス（ＭＯＩ＝０．１）のそれぞれに感染した細胞に異なる濃度のオセルタミビル（oseltamivir）を処理した場合、Ｈ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ感染細胞は薬物耐性表現型を示したが、Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８およびＨ３Ｎ２／Ｘ－３１感染細胞はそうではなかった。
【0093】
（ｉ）３Ｄ８ ｓｃＦｖが前処理された場合、Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８感染細胞における３Ｄ８ ｓｃＦｖ非処理群（０μＭ）の生存率は６６．８％であるのに対し、５μＭの３Ｄ８ ｓｃＦｖで前処理した群の生存率は約８８．３％であった（図６のＨ１Ｎ１／ＰＲ８（Ｐｒｅ））。また、Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１感染細胞における３Ｄ８ ｓｃＦｖ非処理群（０μＭ）の生存率は約５４．５％であるのに対し、３μＭの３Ｄ８ ｓｃＦｖで前処理した群の生存率は約７４．４％であった（図６のＨ３Ｎ２／Ｘ－３１（Ｐｒｅ））。Ｈ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ感染細胞における３Ｄ８ ｓｃＦｖ非処理群（０μＭ）の生存率は約５５．６％であるのに対し、全ての３Ｄ８ ｓｃＦｖ処理群の生存率は約８５％であった（図６のＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ（Ｐｒｅ））。（ｉｉ）３Ｄ８ ｓｃＦｖが後処理された場合、Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８感染細胞における３Ｄ８ ｓｃＦｖ非処理群（０μＭ）の生存率は６３．２％であるのに対し、５μＭの３Ｄ８ ｓｃＦｖで後処理した群の生存率は８６．９％であった（図７のＨ１Ｎ１／ＰＲ８（Ｐｏｓｔ））。また、Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１感染細胞における３Ｄ８ ｓｃＦｖ非処理群（０μＭ）の生存率は約６２．７％であるのに対し、５μＭの３Ｄ８ ｓｃＦｖで後処理した群の生存率は８４．４％であった（図７のＨ３Ｎ２／Ｘ－３１（Ｐｏｓｔ））。Ｈ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ感染細胞における３Ｄ８ ｓｃＦｖ非処理群（０μＭ）の生存率は約５８．４％であるのに対し、全ての３Ｄ８ ｓｃＦｖ処理群の生存率は約７７．４％であった（図７のＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ（Ｐｏｓｔ））。
【0094】
試験管内ウイルス感染の前または後における３Ｄ８ ｓｃＦｖの処理は、ウイルス感染細胞の生存力を２０％まで増加させた。
【0095】
７．抗体断片のウイルスＲＮＡ／タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）発現減少効果
（１）ｑＲＴ－ＰＣＲを用いたウイルスＲＮＡの発現の測定
ＭＤＣＫ細胞（４×１０５）を６ウェルプレートで培養し、以下のように処理した：（ｉ）３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理：３７℃、５％ＣＯ２でＭＤＣＫ細胞に３Ｄ８ ｓｃＦｖ（３μＭ）を２４時間処理した後、３Ｄ８ ｓｃＦｖを処理した細胞を３７℃で１時間、ＭＥＭフリー培地で独立して３つのインフルエンザウイルス菌株（Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８、Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１およびＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ）（ＭＯＩ＝０．１）で感染させた。その後、感染培地を除去し、細胞をトシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）処理したトリプシン（１μｇ／ｍｌ）を含有するＭＥＭフリー培地（１％ＢＳＡ）中で３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。（ｉｉ）３Ｄ８ ｓｃＦｖ後処理：ＭＤＣＫ細胞を３７℃で１時間、ＭＥＭフリー培地で独立して３つのインフルエンザウイルス菌株（Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８、Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１およびＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ）（ＭＯＩ＝０．１）で感染させた後、感染培地を除去した。培地を３Ｄ８ ｓｃＦｖ（３、５、７μＭ）およびＴＰＣＫ処理したトリプシン（１μｇ／ｍｌ）を含むＭＥＭフリー培地（１％ＢＳＡ）で交換した後、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した（図８の上側）。全ＲＮＡは、製造メーカーの指針に従ってＴＲＩ試薬（MRC、Montgomery、OH、USA）を用いて分離した。ＲＮＡ濃度は、分光光度計を用いて決定した。ｃＤＮＡは、製造メーカーのプロトコルに従ってCellScript All－in－One 5X First Strand cDNA Synthesis Master Mix（Cell safe、Yongin、Korea）を用いて合成した。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑおよびＲｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑシステムを用いて行った。データは、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑシリーズ・ソフトウェア・バージョン２．３．１（Qiagen、Chadstone、Victoria、Australia）を用いて分析した。遺伝子（ＨＡ及びＮＰ）は、下記表３に示すプライマーを用いて増幅した。ＧＡＰＤＨは内部対照群として増幅した。
（１）ｑＲＴ－ＰＣＲを用いたウイルスＲＮＡの発現の測定
ＭＤＣＫ細胞（４×１０５）を６ウェルプレートで培養し、以下のように処理した：（ｉ）３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理：３７℃、５％ＣＯ２でＭＤＣＫ細胞に３Ｄ８ ｓｃＦｖ（３μＭ）を２４時間処理した後、３Ｄ８ ｓｃＦｖを処理した細胞を３７℃で１時間、ＭＥＭフリー培地で独立して３つのインフルエンザウイルス菌株（Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８、Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１およびＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ）（ＭＯＩ＝０．１）で感染させた。その後、感染培地を除去し、細胞をトシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）処理したトリプシン（１μｇ／ｍｌ）を含有するＭＥＭフリー培地（１％ＢＳＡ）中で３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。（ｉｉ）３Ｄ８ ｓｃＦｖ後処理：ＭＤＣＫ細胞を３７℃で１時間、ＭＥＭフリー培地で独立して３つのインフルエンザウイルス菌株（Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８、Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１およびＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ）（ＭＯＩ＝０．１）で感染させた後、感染培地を除去した。培地を３Ｄ８ ｓｃＦｖ（３、５、７μＭ）およびＴＰＣＫ処理したトリプシン（１μｇ／ｍｌ）を含むＭＥＭフリー培地（１％ＢＳＡ）で交換した後、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した（図８の上側）。全ＲＮＡは、製造メーカーの指針に従ってＴＲＩ試薬（MRC、Montgomery、OH、USA）を用いて分離した。ＲＮＡ濃度は、分光光度計を用いて決定した。ｃＤＮＡは、製造メーカーのプロトコルに従ってCellScript All－in－One 5X First Strand cDNA Synthesis Master Mix（Cell safe、Yongin、Korea）を用いて合成した。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑおよびＲｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑシステムを用いて行った。データは、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑシリーズ・ソフトウェア・バージョン２．３．１（Qiagen、Chadstone、Victoria、Australia）を用いて分析した。遺伝子（ＨＡ及びＮＰ）は、下記表３に示すプライマーを用いて増幅した。ＧＡＰＤＨは内部対照群として増幅した。
【0096】
【表3】
【0097】
３種類のインフルエンザウイルスで感染してから２４時間目にウイルスＲＮＡ（ＨＡ及びＮＰ）の発現を測定したところ、Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８に感染した細胞において、３Ｄ８ ｓｃＦｖを前処理した群は、３Ｄ８ ｓｃＦｖ非処理群と比較してウイルスのＨＡ及びＮＰ ＲＮＡの発現が５０％以上減少し（図８のＨ１Ｎ１／ＰＲ８（Ｐｒｅ））、３Ｄ８ ｓｃＦｖを後処理した群は、３Ｄ８ ｓｃＦｖ非処理群と比較してウイルスのＨＡ及びＮＰ ＲＮＡの発現が４０％以上減少した（図８のＨ１Ｎ１／ＰＲ８（Ｐｏｓｔ））。Ｈ３Ｎ２／Ｘ－３１に感染した細胞において、３Ｄ８ ｓｃＦｖを前処理した群は、３Ｄ８ ｓｃＦｖ非処理群と比較してウイルスのＨＡ及びＮＰ ＲＮＡの発現が４０％以上減少し（図９のＨ３Ｎ２／Ｘ－３１（Ｐｒｅ））、３Ｄ８ ｓｃＦｖを後処理した群も図３Ｄ８ ｓｃＦｖ非処理群と比較してウイルスのＨＡ及びＮＰ ＲＮＡの発現が４０％以上減少した（図９のＨ３Ｎ２／Ｘ－３１（Ｐｏｓｔ））。また、Ｈ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙに感染した細胞において、３Ｄ８ ｓｃＦｖを前処理した群は、３Ｄ８ ｓｃＦｖ非処理群と比較してウイルスのＨＡ及びＮＰ ＲＮＡの発現が３５％以上減少し（図１０のＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ（Ｐｒｅ））、３Ｄ８ ｓｃＦｖを後処理した群も３Ｄ８ ｓｃＦｖ非処理群と比較してウイルスのＨＡ及びＮＰ ＲＮＡの発現が４０％以上減少した（図１０のＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ（Ｐｏｓｔ））。
【0098】
（２）免疫細胞化学（immunocytochemistry、ICC）を用いたウイルスタンパク質（ｐｒｏｅｔｉｎ）の発現の測定
ＭＤＣＫ細胞（２×１０４）を８ウェルチャンバースライドで培養した。前記（１）で作成した内容と同様に、３Ｄ８ ｓｃＦｖ処理およびウイルス感染（Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８およびＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ）を行った（図８の上側）。スライドをＰＢＳで２回洗浄し、２５℃で冷却したメタノールを用いて１５分間固定した。サンプルをIntracellular Staining Perm wash bufferで５分間透過化した。１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴで１時間ブロックした後、細胞をモノクローナルマウス抗３Ｄ８ ｓｃＦｖ抗体またはポリクローナルウサギ抗ＨＡ抗体（１：１０００希釈、Invitrogen）と共に４℃で２４時間インキュベートした。その後、細胞をヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８二次抗体またはヤギ抗ウサギＩｇＧ ＴＲＩＴＣ二次抗体（１：１０００希釈、Abcam）とそれぞれ２５℃で１時間培養した。ＤＡＰＩを含むanti-fade Mounting Mediumを用いてスライドを取り付け、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００共焦点顕微鏡を用いて細胞を可視化した。
ＭＤＣＫ細胞（２×１０４）を８ウェルチャンバースライドで培養した。前記（１）で作成した内容と同様に、３Ｄ８ ｓｃＦｖ処理およびウイルス感染（Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８およびＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ）を行った（図８の上側）。スライドをＰＢＳで２回洗浄し、２５℃で冷却したメタノールを用いて１５分間固定した。サンプルをIntracellular Staining Perm wash bufferで５分間透過化した。１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴで１時間ブロックした後、細胞をモノクローナルマウス抗３Ｄ８ ｓｃＦｖ抗体またはポリクローナルウサギ抗ＨＡ抗体（１：１０００希釈、Invitrogen）と共に４℃で２４時間インキュベートした。その後、細胞をヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８二次抗体またはヤギ抗ウサギＩｇＧ ＴＲＩＴＣ二次抗体（１：１０００希釈、Abcam）とそれぞれ２５℃で１時間培養した。ＤＡＰＩを含むanti-fade Mounting Mediumを用いてスライドを取り付け、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００共焦点顕微鏡を用いて細胞を可視化した。
【0099】
免疫蛍光分析により、ウイルスＨＡタンパク質および３Ｄ８ ｓｃＦｖの存在を確認した。Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８感染細胞の３Ｄ８ ｓｃＦｖ非処理群の場合は、細胞質でウイルスＨＡタンパク質が検出されたのに対して（赤色シグナル）、３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理群の場合は、ウイルスＨＡタンパク質が検出されなかった（図１１のＨ１Ｎ１／ＰＲ８）。３Ｄ８ ｓｃＦｖ処理群の細胞質において３Ｄ８ ｓｃＦｖ（緑色シグナル）が見出された。Ｈ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ感染細胞の３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理群は、３Ｄ８ ｓｃＦｖ非処理群と比較してウイルスＨＡタンパク質の検出シグナルが低かった（図１１のＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ）。また、Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８およびＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ感染細胞における３Ｄ８ ｓｃＦｖ後処理群は、３Ｄ８ ｓｃＦｖ非処理群と比較してウイルスＨＡタンパク質シグナルが低かった（図１２）。
【0100】
８．抗体断片の生体内（in－vivo）抗ウイルス活性試験
（１）Ｈ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ感染マウスにおける臨床的抗ウイルスの効果
３Ｄ８ ｓｃＦｖの臨床的抗ウイルスの効果を評価するために、実験用生体内（in vivo）モデルでマウスに対して実験を行った。６週齢の雄性ＳＰＦ（specific pathogen-free）ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＤＢＬ；体重１８～２０ｇ）を標準実験室の条件で受容した。これらのマウスを８～１０匹ずつ５つの群に分けた。
（１）Ｈ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙ感染マウスにおける臨床的抗ウイルスの効果
３Ｄ８ ｓｃＦｖの臨床的抗ウイルスの効果を評価するために、実験用生体内（in vivo）モデルでマウスに対して実験を行った。６週齢の雄性ＳＰＦ（specific pathogen-free）ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＤＢＬ；体重１８～２０ｇ）を標準実験室の条件で受容した。これらのマウスを８～１０匹ずつ５つの群に分けた。
【0101】
各群のマウスに対して、ウイルス感染前のＰＢＳ処理；ウイルス感染後のＰＢＳ処理；ウイルス感染前の３Ｄ８ ｓｃＦｖ処理；ウイルス感染後の３Ｄ８ ｓｃＦｖ処理；ウイルス感染後５日間、オセルタミビルリン酸塩（Oseltamivir Phosphate）（Sigma－Aldrich、ST．Louis、MO、USA）を経口投与した。各群のマウスを、５０μｌ致死量５０％のＨ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙウイルス（５×１０４ＰＦＵ）で鼻腔内感染させた。Ｈ１Ｎ１／Ｈ２７５Ｙでマウスを感染させた後、１１日目までに臨床徴候（体重変化、咳、曲がった背中、荒い毛、群れをなして集まること（発熱）、異常な分泌物、生存など）について毎日モニターした（図１３）。ちなみに、３Ｄ８ ｓｃＦｖを投与した後、マウスは異常な臨床徴候を示さず、組織病理学的に肺実質およびその間質には異常な変化が示されなかった（図１４）。また、３Ｄ８ ｓｃＦｖは、投与後４８時間の間、細気管支および肺胞の上皮内壁に局在することが見出された（図１５）。
【0102】
ＰＢＳ前処理群は２５％しか生存しなかったのに対して、３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理群は９０％が生存した。３Ｄ８ ｓｃＦｖ後処理群は４０％が生存し、ＰＢＳ後処理群はいずれも生存しなかった。オセルタミビル処理群は３０％が生存した（図１６）。
【0103】
体重変化の場合、ＰＢＳ前処理群は、平均体重が感染０日後（０ｄｐｉ）に２１．１ｇであり、感染１１日後（１１ｄｐｉ）に１５．５ｇに２７％減少した。３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理群は、平均体重が０ｄｐｉで２２．２ｇであり、７ｄｐｉで１８．２ｇに約１８％減少した。しかし、１１ｄｐｉで平均体重が２０．６ｇに反騰した。オセルタミビル処理群は、平均体重が０ｄｐｉで２１．８ｇ、７ｄｐｉで３０％減少し、１１ｄｐｉで反騰した。ＰＢＳ後処理群は、平均体重が０ｄｐｉで２０．８ｇであったが、８ｄｐｉで生存したマウスはなかった。３Ｄ８ ｓｃＦｖ後処理群は、平均体重が０ｄｐｉで２３ｇであり、１０ｄｐｉで１６ｇに約３０％減少したが、その後、平均体重が回復した（図１７）。
【0104】
これにより、３Ｄ８ ｓｃＦｖの処理がウイルスに感染した細胞の生存率を高め、ウイルス攻撃による初期の体重減少を迅速に回復させることを確認することができる。
【0105】
（２）インフルエンザＡウイルス感染マウスの肺の形態学的分析
前記（１）の各群のマウス（５ｄｐｉ）の肺組織を集めて、肉眼的な肺病変スコアの形態学的分析を行った。
前記（１）の各群のマウス（５ｄｐｉ）の肺組織を集めて、肉眼的な肺病変スコアの形態学的分析を行った。
【0106】
各肺の葉に、全肺体積のおおよその百分率を反映する数字を割り当てた。すべての葉の総点は、目に見える肺炎がある全肺の百分率推定値を形成した。顕微鏡的肺病変スコアの形態学的分析のために、肺組織を１０％中性緩衝ホルマリンに固定した。固定後、組織を一連のアルコール溶液とキシレンを用いて脱水し、パラフィンワックスに包埋した。各組織でセクション（５μｍ）を準備し、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色を行った。準備された組織スライドを盲検方式（blinded fashion）で検査し、間質性肺炎の推定重症度に対して以下のようにスコアを与えた：０、病変なし；１、軽い間質性肺炎；２、中程度の多焦点間質性肺炎；３、中程度のびまん性間質性肺炎；４、重篤な間質性肺炎。ＩＨＣ（免疫組織化学（Immunohistochemistry））の形態学的分析のために、断面をＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊ １．４３ｍ Ｐｒｏｇｒａｍ（https://imagej.nih.gov/ij）で分析して定量的データを得た。１０個のフィールドをランダムに選択し、単位面積（０．２５ｍｍ２）当たりの陽性細胞の数を決定した。その後、平均値を計算した。
【0107】
肉眼的病変は、主に間葉、尾状葉および副葉に存在していた。病理学的には、３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理群の肺は、ウイルス感染していないＷＴ群の肺と大きくは異ならなかった。一方、ＰＢＳ前処理群およびオセルタミビル（oseltamivir）処理群では、顕著な肺鬱血および黄褐色強化が観察された（図１８の上側）。３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理および後処理群は、ＰＢＳおよびオセルタミビル処理群と比較して肺病変の重症度スコアが有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。３Ｄ８ ｓｃＦｖ治療群の合計肺病変スコアは、３Ｄ８ ｓｃＦｖ後処理群よりも３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理群において有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。オセルタミビル処理群は、ＰＢＳ処理群よりも合計肺病変スコアが有意に低かった（Ｐ＜０．０５）（図１８の下側）。
【0108】
顕微鏡的病変は、ＰＢＳおよびオセルタミビル処理群において増加した数の間質マクロファージおよびリンパ球と共に厚くなった肺胞中隔を特徴とした。３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理およびＷＴ群の肺は正常であった（図１９の上側）。３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理群は、他の群と比較して顕微鏡病変スコアが有意に低く（Ｐ＜０．０１）、３Ｄ８ ｓｃＦｖ後処理群は、ＰＢＳおよびオセルタミビル処理群よりも顕微鏡病変スコアが有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。顕微鏡的肺病変スコアは、ＰＢＳ処理群とオセルタミビル処理群との間で有意な差がなかった（図１９の下側）。
【0109】
（３）インフルエンザＡウイルス感染マウスの肺におけるウイルスＲＮＡおよびインターフェロンレベルの測定
マウスの肺におけるウイルスＲＮＡおよびインターフェロンのレベルを測定した。製造メーカーの指針に従ってＴＲＩ試薬を用いて溶解したマウス肺組織（５ｄｐｉ）のサンプルから全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度は分光光度計を用いて決定した。ｃＤＮＡは、製造メーカーのプロトコルに従ってCellScript All－in－One 5x First Strand cDNA Synthesis Master Mixを用いて合成した。遺伝子（ＨＡ、ＮＰおよびＩＦＮ－β）は、前述のようにｑＲＴ－ＰＣＲを用いて表３のプライマーで増幅した。ＧＡＰＤＨは、内部対照群として増幅した。ＰＢＳ前処理群と比較して３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理群の肺におけるＨＡ（６８％）、ＮＰ（７１％）およびＩＦＮ－β（５１％）の減少した発現によって証明されたように、３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理群の肺におけるウイルスＲＮＡおよびＩＦＮ－βの発現が他の群と比較して減少した。３Ｄ８ ｓｃＦｖ後処理群の肺におけるウイルスＲＮＡの発現は３５％（ＨＡ）および１８％（ＮＰ）と低かった（図２０）。
マウスの肺におけるウイルスＲＮＡおよびインターフェロンのレベルを測定した。製造メーカーの指針に従ってＴＲＩ試薬を用いて溶解したマウス肺組織（５ｄｐｉ）のサンプルから全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度は分光光度計を用いて決定した。ｃＤＮＡは、製造メーカーのプロトコルに従ってCellScript All－in－One 5x First Strand cDNA Synthesis Master Mixを用いて合成した。遺伝子（ＨＡ、ＮＰおよびＩＦＮ－β）は、前述のようにｑＲＴ－ＰＣＲを用いて表３のプライマーで増幅した。ＧＡＰＤＨは、内部対照群として増幅した。ＰＢＳ前処理群と比較して３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理群の肺におけるＨＡ（６８％）、ＮＰ（７１％）およびＩＦＮ－β（５１％）の減少した発現によって証明されたように、３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理群の肺におけるウイルスＲＮＡおよびＩＦＮ－βの発現が他の群と比較して減少した。３Ｄ８ ｓｃＦｖ後処理群の肺におけるウイルスＲＮＡの発現は３５％（ＨＡ）および１８％（ＮＰ）と低かった（図２０）。
【0110】
（４）インフルエンザＡウイルス感染マウスの肺におけるウイルス力価の確認
また、インフルエンザＡウイルス感染マウスの肺におけるウイルス力価を確認した。マウスの肺組織を、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒ（Qiagen、Chadstone、Victoria、Australia）を用いて１ｍｌのＭＥＭフリー培地で均質化した。４℃で５分間６，０００ｘｇで遠心分離して均質液を得た。コンフルエント（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ） ＭＤＣＫ細胞を１２ウェルプレートで培養した。ＭＥＭフリー培地中で組織上層液（１：１０００希釈液）を３７℃で１時間感染させた後、感染培地を除去した。培地をＴＰＣＫ処理したトリプシン（１μｇ／ｍｌ）および１％アガロースを含有する１×ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's medium、DMEM）で交換した。細胞を３日間５％ＣＯ２、３７℃でさらにインキュベートした。細胞単層を４％ホルムアルデヒドで固定し、可視化のために０．５％クリスタルバイオレットで染色した。肺のウイルス力価は、ＰＢＳ前処理群と比較して３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理群において約７０％減少した（図２１）。肺のウイルス力価は、ＰＢＳ後処理群と比較して３Ｄ８ ｓｃＦｖ後処理群において約６０％減少した（図２１）。
また、インフルエンザＡウイルス感染マウスの肺におけるウイルス力価を確認した。マウスの肺組織を、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒ（Qiagen、Chadstone、Victoria、Australia）を用いて１ｍｌのＭＥＭフリー培地で均質化した。４℃で５分間６，０００ｘｇで遠心分離して均質液を得た。コンフルエント（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ） ＭＤＣＫ細胞を１２ウェルプレートで培養した。ＭＥＭフリー培地中で組織上層液（１：１０００希釈液）を３７℃で１時間感染させた後、感染培地を除去した。培地をＴＰＣＫ処理したトリプシン（１μｇ／ｍｌ）および１％アガロースを含有する１×ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's medium、DMEM）で交換した。細胞を３日間５％ＣＯ２、３７℃でさらにインキュベートした。細胞単層を４％ホルムアルデヒドで固定し、可視化のために０．５％クリスタルバイオレットで染色した。肺のウイルス力価は、ＰＢＳ前処理群と比較して３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理群において約７０％減少した（図２１）。肺のウイルス力価は、ＰＢＳ後処理群と比較して３Ｄ８ ｓｃＦｖ後処理群において約６０％減少した（図２１）。
【0111】
（５）免疫組織化学（Immunohistochemistry、IHC）を用いたウイルスタンパク質（ｐｒｏｅｔｉｎ）の発現の測定
組織切片を脱パラフィン化し、再水和した後、クエン酸緩衝液（citrate buffer）を用いて９５℃で２０分間抗原修復を行った。スライドをＴＢＳＴ（TBS、0.025％ Triton X－100）で洗浄し、１０％ウシ胎児血清＋１％ＢＳＡ溶液（in TBST）を用いて２時間ブロックした。組織切片を４℃で一晩ポリクローナルウサギ抗ＨＡ抗体（１：７５０希釈）と共にインキュベートした。その後、組織スライドをそれぞれヤギ抗ウサギＩｇＧ ＴＲＩＴＣ二次抗体（１：１０００希釈）と共に２５℃で１時間インキュベートした。組織切片スライドにＤＡＰＩを含むanti-fade Mounting Mediumを入れ、カバーガラスをかぶせ、ＬＳＭ ７００ Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡を用いて細胞を可視化した。ウイルスＨＡのシグナルは、肺胞上皮細胞内層で減少し（図２２の左側）、明確な陽性シグナルの数はオセルタミビル処理群と比較して３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理群において有意に低かった（Ｐ＜０．０５）（図２２の右側）。
組織切片を脱パラフィン化し、再水和した後、クエン酸緩衝液（citrate buffer）を用いて９５℃で２０分間抗原修復を行った。スライドをＴＢＳＴ（TBS、0.025％ Triton X－100）で洗浄し、１０％ウシ胎児血清＋１％ＢＳＡ溶液（in TBST）を用いて２時間ブロックした。組織切片を４℃で一晩ポリクローナルウサギ抗ＨＡ抗体（１：７５０希釈）と共にインキュベートした。その後、組織スライドをそれぞれヤギ抗ウサギＩｇＧ ＴＲＩＴＣ二次抗体（１：１０００希釈）と共に２５℃で１時間インキュベートした。組織切片スライドにＤＡＰＩを含むanti-fade Mounting Mediumを入れ、カバーガラスをかぶせ、ＬＳＭ ７００ Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡を用いて細胞を可視化した。ウイルスＨＡのシグナルは、肺胞上皮細胞内層で減少し（図２２の左側）、明確な陽性シグナルの数はオセルタミビル処理群と比較して３Ｄ８ ｓｃＦｖ前処理群において有意に低かった（Ｐ＜０．０５）（図２２の右側）。
【0112】
９．統計分析
連続データは、一元配置分散分析（a one-way analysis of variance、ANOVA）によって分析した。ＡＮＯＶＡ分析が有意な場合（Ｐ＜０．０５）、ペアワイズ・テューキー（pairwise Tukey）の調整を事後的に行った。離散データは、カイ二乗検定（Chi－square）およびフィッシャーの正確確率検定（Fisher's exact test）で分析した。必要に応じて、ピアソンの相関係数（Pearson's correlation coefficient）及び／又はスピアマン順位相関係数（Spearman's rank correlation coefficient）を用いてデータ間の関係を評価した。Ｐ＜０．０５の値は有意なものとみなした。全ての統計分析は、生物統計解析ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ（GraphPad Software、San Diego、CA、USA））を用いて行った。
連続データは、一元配置分散分析（a one-way analysis of variance、ANOVA）によって分析した。ＡＮＯＶＡ分析が有意な場合（Ｐ＜０．０５）、ペアワイズ・テューキー（pairwise Tukey）の調整を事後的に行った。離散データは、カイ二乗検定（Chi－square）およびフィッシャーの正確確率検定（Fisher's exact test）で分析した。必要に応じて、ピアソンの相関係数（Pearson's correlation coefficient）及び／又はスピアマン順位相関係数（Spearman's rank correlation coefficient）を用いてデータ間の関係を評価した。Ｐ＜０．０５の値は有意なものとみなした。全ての統計分析は、生物統計解析ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ（GraphPad Software、San Diego、CA、USA））を用いて行った。
【0113】
前述の結果から、３Ｄ８ ｓｃＦｖはウイルス感染から宿主を保護する予防的な効果も示すだけでなく、ウイルス感染後の過度の炎症および潜在的な追加の病因を軽減することによって治療的な効果も示すことができることを確認した。
【0114】
本発明の説明は例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明がその技術的思想や必須的特徴を変更せずに他の具体的な形態に容易に変形可能なことを理解できるはずである。よって、前述の実施形態は全ての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解すべきである。
【0115】
本発明の範囲は後述する特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】
【国際調査報告】