2023-540393 カテプシンＣ阻害剤により転移を治療するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-22

(54)【発明の名称】カテプシンＣ阻害剤により転移を治療するための方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20230914BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230914BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20230914BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230914BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20230914BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230914BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20230914BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20230914BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230914BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20230914BHJP

   A61K 31/553 20060101ALI20230914BHJP

   A61K 31/454 20060101ALI20230914BHJP

   A61K 31/404 20060101ALI20230914BHJP

   A61K 31/655 20060101ALI20230914BHJP

   A61K 31/495 20060101ALI20230914BHJP

   A61K 31/277 20060101ALI20230914BHJP

   A61K 31/497 20060101ALI20230914BHJP

   A61K 31/4545 20060101ALI20230914BHJP

   A61K 31/496 20060101ALI20230914BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P35/00

A61P35/04

A61P43/00 111

A61P15/00

A61P11/00

A61P1/18

A61P1/00

A61P1/16

A61P19/08

A61K31/553

A61K31/454

A61K31/404

A61K31/655

A61K31/495

A61K31/277

A61K31/497

A61K31/4545

A61K31/496

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023516107

(86)(22)【出願日】2021-09-10

(85)【翻訳文提出日】2023-05-08

(86)【国際出願番号】 CN2021117698

(87)【国際公開番号】W WO2022053019

(87)【国際公開日】2022-03-17

(31)【優先権主張番号】202010955820.1

(32)【優先日】2020-09-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521438021

【氏名又は名称】シャンハイ インスティチュート オブ ニュートリション アンド ヘルス，チャイニーズ アカデミー オブ サイエンシーズ

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】フー，グオホン

(72)【発明者】

【氏名】シャオ，ヤンセン

(72)【発明者】

【氏名】ツオン，ミン

(72)【発明者】

【氏名】リャン，チェンシー

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C084AA17

4C084NA14

4C084ZA59

4C084ZA66

4C084ZA75

4C084ZA81

4C084ZA96

4C084ZB26

4C084ZC20

4C084ZC41

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC13

4C086BC50

4C086CB05

4C086CB09

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4C086GA02

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4C086MA01

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4C206AA02

4C206HA13

4C206NA14

4C206ZA59

4C206ZA66

4C206ZA75

4C206ZA81

4C206ZA96

4C206ZB26

4C206ZC20

4C206ZC41

(57)【要約】

有効量のカテプシンＣ（ＣＴＳＣ）阻害剤を含む医薬組成物によりがんの転移を治療するための方法が本明細書に提供される。ＣＴＳＣ阻害剤は、いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩、例えば、ブレンソカチブである。本治療方法により、転移の進行が阻害されるか、遅延するか、又は逆転する。いくつかの実施形態では、本方法は、好中球浸潤及び／又は好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を低減させることを更に含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

原発がんの治療又は阻害のための、カテプシンＣ阻害剤又はカテプシンＣ阻害剤を含む組成物の使用。

【請求項2】

がんの転移の治療又は阻害のための、カテプシンＣ阻害剤又はカテプシンＣ阻害剤を含む組成物の使用。

【請求項3】

前記カテプシンＣ阻害剤が、ブレンソカチブ:

【化1】

その薬学的に許容される塩、又はそのプロドラッグである、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項4】

前記カテプシンＣ阻害剤が、

【化2】

又はその薬学的に許容される塩である、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項5】

前記転移が、乳がんの肺転移、乳がんの肝転移、乳がんの骨転移、又は肺がんの骨転移である、請求項２～４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項6】

前記転移が、肺がんの転移である、請求項２～４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項7】

前記肺がんが、小細胞肺がんである、請求項６に記載の使用。

【請求項8】

前記肺がんが、非小細胞肺がんである、請求項６に記載の使用。

【請求項9】

前記転移が、乳がんの転移である、請求項２～４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項10】

前記乳がんが、ルミナール乳がん、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）陽性乳がん、又はトリプルネガティブ乳がんである、請求項９に記載の使用。

【請求項11】

前記転移が、膵がん又は胃がんの転移である、請求項２～４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項12】

前記転移が、骨がん、肝がん、胃がん、又は大腸がんの転移である、請求項２～４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項13】

前記原発がんが、肝がんである、請求項１及び３～４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項14】

前記原発がんが、乳がんである、請求項１及び３～４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項15】

前記原発がんが、肺がんである、請求項１及び３～４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項16】

がんの転移を治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療を必要とする前記患者に、治療期間にわたって、有効量のカテプシンＣ阻害剤を含む医薬組成物を投与することを含み、前記治療することにより、前記転移の進行が、阻害されるか、遅延するか、又は逆転する、方法。

【請求項17】

原発がんを治療することを、それを必要とする患者において行う方法であって、治療を必要とする前記患者に、治療期間にわたって、有効量のカテプシンＣ阻害剤を含む医薬組成物を投与することを含み、前記治療することにより、前記原発がんの進行が、阻害されるか、遅延するか、又は逆転する、方法。

【請求項18】

前記カテプシンＣ阻害剤が、

【化3】

から選択される、請求項１６又は１７に記載の方法。

【請求項19】

前記ＣＴＳＣ阻害剤が、式（Ｉ）の構造を有する化合物、又はその薬学的に許容される塩であり、

【化4】

式中、
Ｒ^１が、

【化5】

であり、
Ｒ^２が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ_２（Ｃ_１－３）アルキル、及び（Ｃ_１－３）アルキルからなる群から選択され、
Ｒ^３が、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＳＯ_２Ｃ_１－３アルキル、ＣＯＮＨ_２、又はＳＯ_２ＮＲ^４Ｒ^５であり、Ｒ^４及びＲ^５は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、又はピペリジン環を形成し、
Ｘが、Ｏ、Ｓ、又はＣＦ_２であり、
Ｙが、Ｏ又はＳであり、
Ｑが、ＣＨ又はＮであり、
Ｒ^６が、（Ｃ_１－３）アルキルであり、前記（Ｃ_１－３）アルキルが、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのフッ素原子で置換され、前記（Ｃ_１－３）アルキル基が、任意選択で、ＯＨ、Ｏ（Ｃ_１－３）アルキル、Ｎ［（Ｃ_１－３）アルキル］_２、シクロプロピル、又はテトラヒドロピラニルから選択される置換基で置換され、
Ｒ^７が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＨ_３である、請求項１６又は１７に記載の方法。

【請求項20】

Ｒ^１が、

【化6】

であり、Ｒ^２が、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ_２Ｃ_１－３アルキル、又はＣ_１－３アルキルであり、Ｒ^３が、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＳＯ_２Ｃ_１－３アルキル、ＣＯＮＨ_２、又はＳＯ_２ＮＲ^４Ｒ^５であり、Ｒ^４及びＲ^５は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、又はピペリジン環を形成する、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

Ｒ^２が、水素、Ｆ、Ｃｌ、又はＣ_１－３アルキルであり、Ｒ^３が、水素、Ｆ、Ｃｌ、ＣＮ、又はＳＯ_２Ｃ_１－３アルキルである、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

Ｒ^３が、水素、Ｆ、又はＣＮである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

Ｒ^１が、

【化7】

であり、
Ｘが、Ｏ、Ｓ、又はＣＦ_２であり、
Ｙが、Ｏ又はＳであり、
Ｑが、ＣＨ又はＮであり、
Ｒ^６が、Ｃ_１－３アルキルであり、前記Ｃ_１－３アルキルが、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦによって置換され、及び任意選択で、ＯＨ、ＯＣ_１－３アルキル、Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２、シクロプロピル、又はテトラヒドロピランによって置換され、
Ｒ^７が、水素、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＨ_３である、請求項１９に記載の方法。

【請求項24】

Ｒ^１が、

【化8】

である、請求項１９に記載の方法。

【請求項25】

Ｒ^１が、

【化9】

である、請求項１９又は２３に記載の方法。

【請求項26】

Ｒ^１が、

【化10】

である、請求項１９又は２３に記載の方法。

【請求項27】

Ｘが、Ｏ、Ｓ、又はＣＦ_２であり、Ｙが、Ｏ又はＳであり、Ｒ^６が、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦによって置換され、及び任意選択で、ＯＨ、ＯＣ_１－３アルキル、Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２、シクロプロピル、又はテトラヒドロピランによって置換された、Ｃ_１－３アルキルであり、Ｒ^７が、水素、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＨ_３である、請求項１９及び２４～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

Ｒ^１が、

【化11】

であり、Ｘが、Ｏ、Ｓ、又はＣＦ_２であり、Ｒ^６が、Ｃ_１－３アルキルであり、前記Ｃ_１－３アルキルが、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦによって置換され、Ｒ^７が、水素、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＨ_３である、請求項１９に記載の方法。

【請求項29】

Ｒ^１が、

【化12】

であり、Ｘが、Ｏであり、Ｒ^６が、Ｃ_１－３アルキルであり、前記Ｃ_１－３アルキルが、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦによって置換され、Ｒ^７が、水素である、請求項１９に記載の方法。

【請求項30】

Ｒ^６が、Ｃ_１－３アルキルである、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

Ｒ^６が、メチルである、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

Ｒ^６が、エチルである、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

Ｒ^６が、プロピルである、請求項３０に記載の方法。

【請求項34】

Ｒ^２が、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ_２Ｃ_１－３アルキル、又はＣ_１－３アルキルである、請求項１９及び２３～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

Ｒ^２が、水素、Ｆ、Ｃｌ、又はＣ_１－３アルキルである、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

Ｒ^２が、水素、Ｆ、又はＣ_１－３アルキルである、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

Ｒ^３が、水素、Ｆ、Ｃｌ、ＣＮ、又はＳＯ_２Ｃ_１－３アルキルである、請求項１９及び２４～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

Ｒ^３が、水素、Ｆ、又はＣＮである、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

Ｒ^６が、Ｃ_１－３アルキルであり、前記Ｃ_１－３アルキルが、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦによって置換され、及び任意選択で、ＯＨ、ＯＣ_１－３アルキル、Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２、シクロプロピル、又はテトラヒドロピランから選択される１つの置換基によって置換される、請求項１９及び２４～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

Ｒ^６が、Ｃ_１－３アルキルであり、前記Ｃ_１－３アルキルが、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦによって置換される、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

Ｒ^６が、メチル又はエチルである、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

Ｒ^６が、メチルである、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

Ｒ^７が、水素、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＨ_３である、請求項１９及び２４～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

Ｒ^７が、水素である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

Ｘが、Ｏであり、Ｒ^６が、Ｃ_１－３アルキルであり、前記Ｃ_１－３アルキルが、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦによって置換され、Ｒ^７が、水素である、請求項１９及び２４～２６に記載の方法。

【請求項46】

前記式（Ｉ）の化合物が、ブレンソカチブ：

【化13】

又はその薬学的に許容される塩である、請求項１９に記載の方法。

【請求項47】

前記式（Ｉ）の化合物が、ブレンソカチブ：

【化14】

である、請求項１９に記載の方法。

【請求項48】

前記転移が、乳がんの転移である、請求項１６及び１８～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記乳がんの転移が、乳がんの肺転移、乳がんの肝転移、乳がんの骨転移、又は乳がんの脳転移である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記乳がんの転移が、乳がんの肺転移である、請求項４８に記載の方法。

【請求項51】

前記乳がんが、ルミナール乳がん、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）陽性乳がん、又はトリプルネガティブ乳がんである、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記転移が、肺がんの骨転移、膵がんの肝転移、大腸がんの肝転移、又は胃がんの肝転移である、請求項１６及び１８～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記転移が、乳がんの肺転移、乳がんの肝転移、乳がんの骨転移、乳がんの脳転移、肺がんの骨転移、膵がんの肝転移、又は胃がんの肝転移である、請求項１６及び１８～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記転移が、肺がんの転移である、請求項１６及び１８～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記肺がんが、非小細胞肺がんである、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記肺がんが、小細胞肺がんである、請求項５４に記載の方法。

【請求項57】

前記転移が、膵がん又は胃がんの転移である、請求項１６及び１８～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記転移が、骨がん、肝がん、胃がん、又は大腸がんの転移である、請求項１６及び１８～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記原発がんが、肝がんである、請求項１７～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記原発がんが、乳がんである、請求項１７～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記乳がんが、ルミナール乳がん、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）陽性乳がん、又はトリプルネガティブ乳がんである、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記原発がんが、肺がんである、請求項１７～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記肺がんが、非小細胞肺がんである、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記肺がんが、小細胞肺がんである、請求項６２に記載の方法。

【請求項65】

投与が、経口投与を含む、請求項１６～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

投与が、非経口投与を含む、請求項１６～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

投与が、静脈内投与を含む、請求項１６～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

前記投与が、前記治療期間中、１日に１回、１日に２回、２日に１回、又は３日に１回行われる、請求項１６～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記投与が、前記治療期間中、１日に１回行われる、請求項１６～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記治療期間が、約６か月～約３６か月である、請求項１６～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記治療期間が、約６か月～約２４か月である、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記治療期間が、約６か月～約１８か月である、請求項７０に記載の方法。

【請求項73】

前記治療期間が、約６か月～約１２か月である、請求項７０に記載の方法。

【請求項74】

前記治療期間が、約１２か月～約３６か月である、請求項７０に記載の方法。

【請求項75】

前記治療期間が、約１８か月～約３６か月である、請求項７０に記載の方法。

【請求項76】

前記化合物が、前記医薬組成物中に約１０ミリグラム（ｍｇ）～約７０ｍｇで存在する、請求項１６～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記化合物が、前記医薬組成物中に約１０ｍｇ～約４０ｍｇで存在する、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記化合物が、前記医薬組成物中に約２５ｍｇで存在する、請求項７６に記載の方法。

【請求項79】

前記化合物が、前記医薬組成物中に約４０ｍｇで存在する、請求項７６に記載の方法。

【請求項80】

前記治療期間の前に、前記患者が、カテプシンＣ（ＣＴＳＣ）の上昇した血清レベルを有する、請求項１６～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記ＣＴＳＣの上昇した血清レベルが、がんを有しない対象と比較して上昇している、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記治療することが、前記ＣＴＳＣタンパク質の上昇した血清レベルを、前記治療期間中に又は前記治療期間の後に、前記治療期間前の前記ＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して約２５％～約７５％低減させることを更に含む、請求項８０又は８１に記載の方法。

【請求項83】

前記治療することが、前記患者におけるインターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）の循環レベルを、前記治療期間中に又は前記治療期間の後に、前記治療期間前の前記患者のＩＬ－１βの循環レベルと比較して低減させることを更に含む、請求項１６～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記転移の体積が、前記治療期間中に又は前記治療期間の後に、前記治療期間前の前記転移の体積と比較して約５％～約２５％低減する、請求項１６、１８～５８、及び６５～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記転移の体積が、前記治療期間中に又は前記治療期間の後に、前記治療期間前の前記転移の体積と比較して約２５％～約５０％低減する、請求項１６、１８～５８、及び６５～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記転移の体積が、前記治療期間中に又は前記治療期間の後に、前記治療期間前の前記転移の体積と比較して約５０％～約７５％低減する、請求項１６、１８～５８、及び６５～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記原発がんの体積が、前記治療期間中に又は前記治療期間の後に、前記治療期間前の前記原発がんの体積と比較して約５％～約２５％低減する、請求項１７～４７及び５９～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記原発がんの体積が、前記治療期間中に又は前記治療期間の後に、前記治療期間前の前記原発がんの体積と比較して約２５％～約５０％低減する、請求項１７～４７及び５９～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記原発がんの体積が、前記治療期間中に又は前記治療期間の後に、前記治療期間前の前記原発がんの体積と比較して約５０％～約７５％低減する、請求項１７～４７及び５９～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記患者の生存率が、前記医薬組成物を投与されていないがん患者の生存率と比べて増加する、請求項１６～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記治療することが、前記原発がんにおける前記患者の好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を、前記治療期間中に又は前記治療期間の後に、前記治療期間前の前記原発がんにおける前記患者のＮＥＴの数と比較して低減させることを更に含む、請求項１６～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記治療することが、前記転移における前記患者の好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を、前記治療期間中に又は前記治療期間の後に、前記治療期間前の前記転移における前記患者のＮＥＴの数と比較して低減させることを更に含む、請求項１６、１８～５８、６５～８６、及び９０～９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記治療することが、前記転移における好中球遊走を、前記治療期間中に又は前記治療期間の後に、前記治療期間前の前記転移における好中球遊走と比較して低減させることを更に含む、請求項１６、１８～５８、６５～８６、及び９０～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記転移における好中球遊走を低減させることが、前記転移における好中球遊走を、同じ転移を有するが前記医薬組成物を投与されていない第２の患者における好中球遊走と比較して、約２５％～約７５％低減させることを含む、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

前記転移における好中球遊走を低減させることが、前記転移における好中球遊走を、同じ転移を有するが前記医薬組成物を投与されていない第２の患者における好中球遊走と比較して、約２５％～約５０％低減させることを含む、請求項９３に記載の方法。

【請求項96】

前記転移における好中球遊走を低減させることが、前記転移における好中球遊走を、同じ転移を有するが前記医薬組成物を投与されていない第２の患者における好中球遊走と比較して、少なくとも約２５％低減させることを含む、請求項９３に記載の方法。

【請求項97】

前記転移における好中球遊走を低減させることが、前記転移における好中球遊走を、同じ転移を有するが前記医薬組成物を投与されていない患者における好中球遊走と比較して、少なくとも約５０％低減させることを含む、請求項９３に記載の方法。

【請求項98】

前記転移におけるＮＥＴの数が、前記治療期間前の前記転移におけるＮＥＴの数と比較して少なくとも５０％低減する、請求項９２に記載の方法。

【請求項99】

前記転移におけるＮＥＴの数が、前記治療期間前の前記転移におけるＮＥＴの数と比較して少なくとも約２５％～約７５％低減する、請求項９２に記載の方法。

【請求項100】

前記治療することが、前記患者における１つ以上のタンパク質の発現レベルを低減させることを更に含み、前記１つ以上のタンパク質が、カテプシンＣ（ＣＴＳＣ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＣＬ３）、又はＲＥＬＡ（ｐ６５）である、請求項１６～９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記治療することが、腫瘍様塊サイズを低減させることを更に含む、請求項１６～１００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項102】

前記治療することが、前記原発がんの腫瘍様塊サイズを低減させることを更に含む、請求項１０１に記載の方法。

【請求項103】

前記腫瘍様塊サイズが、画像化によって測定される、請求項１０１又は１０２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月１１日に出願された中国特許出願第ＣＮ２０２０１０９５５８２０．１号の利益を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、腫瘍学の分野に関し、より詳細には、原発腫瘍又は転移等の腫瘍の治療におけるカテプシンＣ阻害剤の使用に関する。

【背景技術】

【0003】

多くの腫瘍の中で、転移は患者の死亡を引き起こす主な要因であり、腫瘍患者の死亡の９０％は転移によって引き起こされる。肺は、乳がんの転移の最も一般的な標的器官であり、また人体における空気交換のための場所でもある。肺転移の発生は、腫瘍患者にとって致命的な脅威である。

【0004】

乳がんは、国内外で発生率及び死亡率が最も高い女性腫瘍である。現在、治療効果が最悪のトリプルネガティブ乳がんサブタイプでは、肺転移が治療の失敗及び患者の死亡の主な原因である。腫瘍細胞による微小環境制御は、腫瘍細胞の転移形成のあらゆる段階において重要な役割を果たす。多くの研究は、プロテアーゼ、サイトカイン、成長因子、細胞外マトリックスタンパク質などを含む腫瘍細胞によって分泌される細胞外タンパク質が、がん細胞による腫瘍微小環境の制御プロセスにおいて重要な役割を果たすことを示している。

【0005】

重要な腫瘍微小環境制御分子の一種として、プロテアーゼは、腫瘍細胞転移に密接に関連する一連のプロセスに関与する。したがって、腫瘍関連分泌タンパク質、特にプロテアーゼ活性を有する分泌因子が、転移をどのように制御するかに関する研究は、重要な生物学的意義及び臨床応用価値を有する。

【0006】

カテプシンＣ（ＣＴＳＣ）は、１９８４年にＧｕｔｍａｎ及びＦｒｕｔｏｎによって発見されたジペプチジルペプチダーゼ１（ＤＰＰ１）とも呼ばれる。染色体１１ｑ１４．１－ｑ１４．３に位置するＣＴＳＣは、重要な共通プロテアーゼである。しかしながら、ＣＴＳＣが腫瘍転移において果たした関連する役割についての報告はほとんどない。

【0007】

したがって、腫瘍転移に対するプロテアーゼの影響、特に腫瘍転移に対するＣＴＳＣの影響を研究し、これに基づいて、腫瘍転移を阻害するための新規の医薬製剤を開発し、それによって生存期間を延長し、腫瘍患者の生存の質を改善することが緊急に必要とされている。

【発明の概要】

【0008】

本開示の一態様は、がんの転移を治療若しくは阻害する、又は原発がんを治療するためのＣＴＳＣ阻害剤の使用に関する。一実施形態では、がんは、乳がんである。一実施形態における転移、乳がんの肺転移、乳がんの肝転移、乳がんの骨転移、又は肺がんの骨転移。更なる実施形態では、転移は、乳がんの肺転移である。別の実施形態では、転移は、肺がんである。

【0009】

別の態様では、治療を必要とする患者においてがんの転移を治療するための方法が提供される。この方法は、治療を必要とする患者に、治療期間にわたって、ＣＴＳＣ阻害剤を含む医薬組成物を投与することを含み、治療することにより、転移の進行が、阻害されるか、遅延するか、又は逆転する。

【0010】

別の態様では、治療を必要とする患者において原発がんを治療するための方法が提供される。この方法は、治療を必要とする患者に、治療期間にわたって、ＣＴＳＣ阻害剤を含む医薬組成物を投与することを含み、治療することにより、原発がんの進行が、阻害されるか、遅延するか、又は逆転する。

【0011】

一実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤は、ブレンソカチブ（以前はＡＺＤ７９８６として知られていた）、又はその薬学的に許容される塩である。

【化1】

更に別の実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤は、本明細書の表１に示される阻害剤の１つである。

【0012】

本明細書において提供される方法の一実施形態では、方法は、患者に、治療期間にわたって、有効量の式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を投与することを含み、

【化2】

式中、
Ｒ^１は、

【化3】

であり、
Ｒ^２は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ_２Ｃ_１－３アルキル、又はＣ_１－３アルキルであり、
Ｒ^３は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＳＯ_２Ｃ_１－_３アルキル、ＣＯＮＨ_２、又はＳＯ_２ＮＲ^４Ｒ^５であり、
Ｒ^４及びＲ^５は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、又はピペリジン環を形成し、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＣＦ_２であり、
Ｙは、Ｏ又はＳであり、
Ｑは、ＣＨ又はＮであり、
Ｒ^６は、Ｃ_１－３アルキルであり、Ｃ_１－３アルキルは、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦによって置換され、任意選択で、ＯＨ、ＯＣ_１－３アルキル、Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２、シクロプロピル、又はテトラヒドロピランから選択される１つの置換基によって置換され、
Ｒ^７は、水素、Ｆ、Ｃｌ又はＣＨ_３であり、治療することにより、原発がん又は転移の進行が、阻害されるか、遅延するか、又は逆転する。

【0013】

方法の一実施形態では、医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ｒ^１は、

【化4】

である。更なる実施形態では、Ｒ^１は、

【化5】

であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＣＦ_２であり、Ｒ^６は、Ｃ_１－３アルキルであり、Ｃ_１－３アルキルは、任意選択で、１つ、２つ又は３つのＦで置換され、Ｒ^７は、水素、Ｆ、Ｃｌ又はＣＨ_３である。更なる実施形態では、Ｒ^７は、水素である。

【0014】

一実施形態では、医薬組成物は、有効量のブレンソカチブを含む。

【0015】

本明細書に提供されるがんの転移を治療するための方法の一実施形態では、転移は、乳がんである。更なる実施形態では、乳がんの転移は、乳がんの肺転移、乳がんの肝転移、乳がんの骨転移、又は乳がんの脳転移である。更なる実施形態では、乳がんの転移は、乳がんの肺転移である。一実施形態では、乳がんは、管腔乳がん、ヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）陽性乳がん、又はトリプルネガティブ乳がんである。

【0016】

本明細書に提供される原発がんの治療の一実施形態では、原発がんは、肺がん、肝がん、又は乳がんである。更なる実施形態では、原発がんは、乳がんである。更なる実施形態では、乳がんは、管腔乳がん、ヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）陽性乳がん、又はトリプルネガティブ乳がんである。別の実施形態では、原発がんは、肝がんである。更に別の実施形態では、原発がんは、肺がんである。更なる実施形態において、肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。別の実施形態では、肺がんは、小細胞肺がんである。

【0017】

本明細書に提供されるがんの転移を治療するための方法の別の実施形態では、転移は、肺がんの骨転移、膵がんの肝転移、又は胃がんの肝転移である。本明細書に提供されるがんの転移を治療するための方法の更に別の実施形態では、転移は、乳がんの肺転移、乳がんの肝転移、乳がんの骨転移、乳がんの脳転移、肺がんの骨転移、膵がんの肝転移、結腸がんの肝転移、又は胃がんの肝転移である。更に別の実施形態では、転移は、肺がんの転移である。一実施形態では、転移は、膵がん又は胃がんの転移である。更に別の実施形態では、転移は、骨がん、肝がん、胃がん、又は大腸がんの転移である。

【0018】

本明細書に提供される方法の一実施形態では、医薬組成物は、経口投与される。更なる実施形態では、投与は、治療期間中、１日に１回である。

【0019】

本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態によれば、治療期間は、約６か月～約３６か月である。更なる実施形態では、治療期間は、約６か月～約２４か月である。更なる実施形態では、治療期間は、約６か月～約１８か月である。更なる実施形態では、治療期間は、約６か月～約１２か月である。別の実施形態では、治療期間は、約１２か月～約３６か月である。更に別の実施形態では、治療期間は、約１８か月～約３６か月である。

【0020】

本明細書に提供される原発がん又はがんの転移を治療するための方法の一実施形態では、原発がん（原発腫瘍）又は転移の体積は、治療期間中又は治療期間後に、治療期間前の原発がん（原発腫瘍）又は転移の体積と比較して低減する。更なる実施形態では、体積は、治療期間中又は治療期間後に、治療期間前の体積と比較して約５％～約２５％、又は約２５％～約５０％、又は約５０％～約７５％低減する。

【0021】

本明細書に提供される原発がん又はがんの転移を治療するための方法のいくつかの実施形態では、治療は、治療期間中又は治療期間後に、治療期間前の患者の循環ＮＥＴの数と比較して、又は同じ原発がん又は転移を有するが医薬組成物を投与されていない第２の患者の循環ＮＥＴの数と比較して、患者の循環好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を低減することを伴う。更なる実施形態では、循環ＮＥＴの数は、治療期間前の循環ＮＥＴの数と比較して少なくとも５０％低減する。

【0022】

本明細書に提供されるがんの転移を治療するための方法の更に別の実施形態では、本方法は、治療期間前の原発がん（原発腫瘍）又は転移におけるＮＥＴの数と比較して、治療期間中に又は治療期間の後の原発がん（原発腫瘍）転移におけるＮＥＴを低減することを含む。更なる実施形態では、原発がん（原発腫瘍）又は転移におけるＮＥＴの数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して少なくとも５０％低減する。

【0023】

本明細書に提供される原発がん又はがんの転移を治療するための方法のいくつかの実施形態では、治療は、治療期間中又は治療期間後に、治療期間前の好中球遊走と比較して、又は同じ原発がん又は転移を有するが医薬組成物を投与されていない第２の患者における好中球遊走と比較して、原発がん又は転移における好中球遊走を低減することを伴う。更なる実施形態では、好中球遊走は、約２５％～約７５％、約２５％～約５０％、又は少なくとも約２５％低減する。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1A】乳がんの臨床試料における肺転移にＣＴＳＣタンパク質発現を相関する。図１Ａは、対になった原発腫瘍及び肺転移における相対的なＣＴＳＣタンパク質レベルの免疫蛍光（ＩＦ）画像を示し、図１Ｂは、ＩＦによって決定される７人の乳がん患者の対での原発腫瘍及び肺転移病変の試料における相対的なＣＴＳＣタンパク質レベルをプロットしたものであり、ここでプロットのスケールは１００μｍである。図１Ｃは、乳がん患者の原発腫瘍（７４例）及び肺転移病変（２９例）からなる１０３個の腫瘍試料におけるＣＴＳＣタンパク質発現レベルを比較したものである。図１Ｄは、肺転移あり又はなしの乳がん患者の血清ＣＴＳＣレベルを比較したものである。図１Ｅは、低血清ＣＴＳＣレベル及び高血清ＣＴＳＣレベルのいずれかを有する肺転移のない乳がん患者の生存率を比較したものである。図１Ｆは、低及び高ＣＴＳＣ組織レベルで群分けした場合の乳がん患者の生存曲線分析を示す。

【図1B】乳がんの臨床試料における肺転移にＣＴＳＣタンパク質発現を相関する。図１Ａは、対になった原発腫瘍及び肺転移における相対的なＣＴＳＣタンパク質レベルの免疫蛍光（ＩＦ）画像を示し、図１Ｂは、ＩＦによって決定される７人の乳がん患者の対での原発腫瘍及び肺転移病変の試料における相対的なＣＴＳＣタンパク質レベルをプロットしたものであり、ここでプロットのスケールは１００μｍである。図１Ｃは、乳がん患者の原発腫瘍（７４例）及び肺転移病変（２９例）からなる１０３個の腫瘍試料におけるＣＴＳＣタンパク質発現レベルを比較したものである。図１Ｄは、肺転移あり又はなしの乳がん患者の血清ＣＴＳＣレベルを比較したものである。図１Ｅは、低血清ＣＴＳＣレベル及び高血清ＣＴＳＣレベルのいずれかを有する肺転移のない乳がん患者の生存率を比較したものである。図１Ｆは、低及び高ＣＴＳＣ組織レベルで群分けした場合の乳がん患者の生存曲線分析を示す。

【図1C】乳がんの臨床試料における肺転移にＣＴＳＣタンパク質発現を相関する。図１Ａは、対になった原発腫瘍及び肺転移における相対的なＣＴＳＣタンパク質レベルの免疫蛍光（ＩＦ）画像を示し、図１Ｂは、ＩＦによって決定される７人の乳がん患者の対での原発腫瘍及び肺転移病変の試料における相対的なＣＴＳＣタンパク質レベルをプロットしたものであり、ここでプロットのスケールは１００μｍである。図１Ｃは、乳がん患者の原発腫瘍（７４例）及び肺転移病変（２９例）からなる１０３個の腫瘍試料におけるＣＴＳＣタンパク質発現レベルを比較したものである。図１Ｄは、肺転移あり又はなしの乳がん患者の血清ＣＴＳＣレベルを比較したものである。図１Ｅは、低血清ＣＴＳＣレベル及び高血清ＣＴＳＣレベルのいずれかを有する肺転移のない乳がん患者の生存率を比較したものである。図１Ｆは、低及び高ＣＴＳＣ組織レベルで群分けした場合の乳がん患者の生存曲線分析を示す。

【図1D】乳がんの臨床試料における肺転移にＣＴＳＣタンパク質発現を相関する。図１Ａは、対になった原発腫瘍及び肺転移における相対的なＣＴＳＣタンパク質レベルの免疫蛍光（ＩＦ）画像を示し、図１Ｂは、ＩＦによって決定される７人の乳がん患者の対での原発腫瘍及び肺転移病変の試料における相対的なＣＴＳＣタンパク質レベルをプロットしたものであり、ここでプロットのスケールは１００μｍである。図１Ｃは、乳がん患者の原発腫瘍（７４例）及び肺転移病変（２９例）からなる１０３個の腫瘍試料におけるＣＴＳＣタンパク質発現レベルを比較したものである。図１Ｄは、肺転移あり又はなしの乳がん患者の血清ＣＴＳＣレベルを比較したものである。図１Ｅは、低血清ＣＴＳＣレベル及び高血清ＣＴＳＣレベルのいずれかを有する肺転移のない乳がん患者の生存率を比較したものである。図１Ｆは、低及び高ＣＴＳＣ組織レベルで群分けした場合の乳がん患者の生存曲線分析を示す。

【図1E】乳がんの臨床試料における肺転移にＣＴＳＣタンパク質発現を相関する。図１Ａは、対になった原発腫瘍及び肺転移における相対的なＣＴＳＣタンパク質レベルの免疫蛍光（ＩＦ）画像を示し、図１Ｂは、ＩＦによって決定される７人の乳がん患者の対での原発腫瘍及び肺転移病変の試料における相対的なＣＴＳＣタンパク質レベルをプロットしたものであり、ここでプロットのスケールは１００μｍである。図１Ｃは、乳がん患者の原発腫瘍（７４例）及び肺転移病変（２９例）からなる１０３個の腫瘍試料におけるＣＴＳＣタンパク質発現レベルを比較したものである。図１Ｄは、肺転移あり又はなしの乳がん患者の血清ＣＴＳＣレベルを比較したものである。図１Ｅは、低血清ＣＴＳＣレベル及び高血清ＣＴＳＣレベルのいずれかを有する肺転移のない乳がん患者の生存率を比較したものである。図１Ｆは、低及び高ＣＴＳＣ組織レベルで群分けした場合の乳がん患者の生存曲線分析を示す。

【図1F】乳がんの臨床試料における肺転移にＣＴＳＣタンパク質発現を相関する。図１Ａは、対になった原発腫瘍及び肺転移における相対的なＣＴＳＣタンパク質レベルの免疫蛍光（ＩＦ）画像を示し、図１Ｂは、ＩＦによって決定される７人の乳がん患者の対での原発腫瘍及び肺転移病変の試料における相対的なＣＴＳＣタンパク質レベルをプロットしたものであり、ここでプロットのスケールは１００μｍである。図１Ｃは、乳がん患者の原発腫瘍（７４例）及び肺転移病変（２９例）からなる１０３個の腫瘍試料におけるＣＴＳＣタンパク質発現レベルを比較したものである。図１Ｄは、肺転移あり又はなしの乳がん患者の血清ＣＴＳＣレベルを比較したものである。図１Ｅは、低血清ＣＴＳＣレベル及び高血清ＣＴＳＣレベルのいずれかを有する肺転移のない乳がん患者の生存率を比較したものである。図１Ｆは、低及び高ＣＴＳＣ組織レベルで群分けした場合の乳がん患者の生存曲線分析を示す。

【図2A】ＣＴＳＣの過剰発現が、乳がんの肺転移を促進することを実証する。図２Ａは、ウェスタンブロットによるＳＣＰ２８細胞におけるＣＴＳＣの過剰発現のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの検証を示す。図１Ｂ～Ｄは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞の尾静脈注射後の肺の蛍光シグナル（Ｂ）、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞の尾静脈注射後の肺表面転移性結節の数（Ｃ）、及びＳＣＰ２８細胞を注射したマウスの対照群と比較した、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスの生存分析（各群についてｎ＝１０）（Ｄ）を示す。

【図2B】ＣＴＳＣの過剰発現が、乳がんの肺転移を促進することを実証する。図２Ａは、ウェスタンブロットによるＳＣＰ２８細胞におけるＣＴＳＣの過剰発現のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの検証を示す。図１Ｂ～Ｄは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞の尾静脈注射後の肺の蛍光シグナル（Ｂ）、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞の尾静脈注射後の肺表面転移性結節の数（Ｃ）、及びＳＣＰ２８細胞を注射したマウスの対照群と比較した、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスの生存分析（各群についてｎ＝１０）（Ｄ）を示す。

【図2C】ＣＴＳＣの過剰発現が、乳がんの肺転移を促進することを実証する。図２Ａは、ウェスタンブロットによるＳＣＰ２８細胞におけるＣＴＳＣの過剰発現のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの検証を示す。図１Ｂ～Ｄは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞の尾静脈注射後の肺の蛍光シグナル（Ｂ）、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞の尾静脈注射後の肺表面転移性結節の数（Ｃ）、及びＳＣＰ２８細胞を注射したマウスの対照群と比較した、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスの生存分析（各群についてｎ＝１０）（Ｄ）を示す。

【図2D】ＣＴＳＣの過剰発現が、乳がんの肺転移を促進することを実証する。図２Ａは、ウェスタンブロットによるＳＣＰ２８細胞におけるＣＴＳＣの過剰発現のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの検証を示す。図１Ｂ～Ｄは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞の尾静脈注射後の肺の蛍光シグナル（Ｂ）、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞の尾静脈注射後の肺表面転移性結節の数（Ｃ）、及びＳＣＰ２８細胞を注射したマウスの対照群と比較した、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスの生存分析（各群についてｎ＝１０）（Ｄ）を示す。

【図3A】ＣＴＳＣノックダウンが乳がんの肺転移を阻害することを示す。図３Ａは、ウェスタンブロットによるＬＭ２－４１７５細胞におけるＣＴＳＣノックダウンのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの検証を示す。図３Ｂ～Ｄは、マウスにおけるＣＴＳＣ低減ＬＭ２－４１７５細胞の尾静脈注射後の肺の蛍光シグナル（Ｂ）、マウスにおけるＣＴＳＣ低減ＬＭ２－４１７５の尾静脈注射後の肺表面転移性結節の数（Ｃ）、及びＬＭ２－４１７５細胞を注射したマウスの対照群と比較した、ＣＴＳＣ低減ＬＭ２－４１７５を注射したマウスの生存分析（各群についてｎ＝１０）（Ｄ）を示す。

【図3B】ＣＴＳＣノックダウンが乳がんの肺転移を阻害することを示す。図３Ａは、ウェスタンブロットによるＬＭ２－４１７５細胞におけるＣＴＳＣノックダウンのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの検証を示す。図３Ｂ～Ｄは、マウスにおけるＣＴＳＣ低減ＬＭ２－４１７５細胞の尾静脈注射後の肺の蛍光シグナル（Ｂ）、マウスにおけるＣＴＳＣ低減ＬＭ２－４１７５の尾静脈注射後の肺表面転移性結節の数（Ｃ）、及びＬＭ２－４１７５細胞を注射したマウスの対照群と比較した、ＣＴＳＣ低減ＬＭ２－４１７５を注射したマウスの生存分析（各群についてｎ＝１０）（Ｄ）を示す。

【図3C】ＣＴＳＣノックダウンが乳がんの肺転移を阻害することを示す。図３Ａは、ウェスタンブロットによるＬＭ２－４１７５細胞におけるＣＴＳＣノックダウンのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの検証を示す。図３Ｂ～Ｄは、マウスにおけるＣＴＳＣ低減ＬＭ２－４１７５細胞の尾静脈注射後の肺の蛍光シグナル（Ｂ）、マウスにおけるＣＴＳＣ低減ＬＭ２－４１７５の尾静脈注射後の肺表面転移性結節の数（Ｃ）、及びＬＭ２－４１７５細胞を注射したマウスの対照群と比較した、ＣＴＳＣ低減ＬＭ２－４１７５を注射したマウスの生存分析（各群についてｎ＝１０）（Ｄ）を示す。

【図3D】ＣＴＳＣノックダウンが乳がんの肺転移を阻害することを示す。図３Ａは、ウェスタンブロットによるＬＭ２－４１７５細胞におけるＣＴＳＣノックダウンのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの検証を示す。図３Ｂ～Ｄは、マウスにおけるＣＴＳＣ低減ＬＭ２－４１７５細胞の尾静脈注射後の肺の蛍光シグナル（Ｂ）、マウスにおけるＣＴＳＣ低減ＬＭ２－４１７５の尾静脈注射後の肺表面転移性結節の数（Ｃ）、及びＬＭ２－４１７５細胞を注射したマウスの対照群と比較した、ＣＴＳＣ低減ＬＭ２－４１７５を注射したマウスの生存分析（各群についてｎ＝１０）（Ｄ）を示す。

【図4A】ＣＴＳＣ発現が、免疫完全マウスにおける乳がんの肺転移を促進することを示す。図４Ａは、４Ｔ０７細胞におけるＣＴＳＣの過剰発現及びウェスタンブロットによる４Ｔ１細胞におけるＣＴＳＣの低減のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの検証を示す。図４Ｂは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７細胞の尾静脈注射後、又はＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞の乳脂肪パッド注射後の肺の蛍光シグナルを示す。図４Ｃは、ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７細胞を注射したマウス対対照４Ｔ０７細胞の表面転移性結節の数を示す（各群についてｎ＝１０）。図４Ｄ～Ｅは、ＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射されたマウス対４Ｔ１対照細胞を注射されたマウスの腫瘍体積（Ｄ）及び肺転移性結節（Ｅ）の数の変化を示す（各群についてｎ＝１０）。

【図4B】ＣＴＳＣ発現が、免疫完全マウスにおける乳がんの肺転移を促進することを示す。図４Ａは、４Ｔ０７細胞におけるＣＴＳＣの過剰発現及びウェスタンブロットによる４Ｔ１細胞におけるＣＴＳＣの低減のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの検証を示す。図４Ｂは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７細胞の尾静脈注射後、又はＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞の乳脂肪パッド注射後の肺の蛍光シグナルを示す。図４Ｃは、ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７細胞を注射したマウス対対照４Ｔ０７細胞の表面転移性結節の数を示す（各群についてｎ＝１０）。図４Ｄ～Ｅは、ＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射されたマウス対４Ｔ１対照細胞を注射されたマウスの腫瘍体積（Ｄ）及び肺転移性結節（Ｅ）の数の変化を示す（各群についてｎ＝１０）。

【図4C】ＣＴＳＣ発現が、免疫完全マウスにおける乳がんの肺転移を促進することを示す。図４Ａは、４Ｔ０７細胞におけるＣＴＳＣの過剰発現及びウェスタンブロットによる４Ｔ１細胞におけるＣＴＳＣの低減のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの検証を示す。図４Ｂは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７細胞の尾静脈注射後、又はＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞の乳脂肪パッド注射後の肺の蛍光シグナルを示す。図４Ｃは、ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７細胞を注射したマウス対対照４Ｔ０７細胞の表面転移性結節の数を示す（各群についてｎ＝１０）。図４Ｄ～Ｅは、ＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射されたマウス対４Ｔ１対照細胞を注射されたマウスの腫瘍体積（Ｄ）及び肺転移性結節（Ｅ）の数の変化を示す（各群についてｎ＝１０）。

【図4D】ＣＴＳＣ発現が、免疫完全マウスにおける乳がんの肺転移を促進することを示す。図４Ａは、４Ｔ０７細胞におけるＣＴＳＣの過剰発現及びウェスタンブロットによる４Ｔ１細胞におけるＣＴＳＣの低減のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの検証を示す。図４Ｂは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７細胞の尾静脈注射後、又はＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞の乳脂肪パッド注射後の肺の蛍光シグナルを示す。図４Ｃは、ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７細胞を注射したマウス対対照４Ｔ０７細胞の表面転移性結節の数を示す（各群についてｎ＝１０）。図４Ｄ～Ｅは、ＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射されたマウス対４Ｔ１対照細胞を注射されたマウスの腫瘍体積（Ｄ）及び肺転移性結節（Ｅ）の数の変化を示す（各群についてｎ＝１０）。

【図4E】ＣＴＳＣ発現が、免疫完全マウスにおける乳がんの肺転移を促進することを示す。図４Ａは、４Ｔ０７細胞におけるＣＴＳＣの過剰発現及びウェスタンブロットによる４Ｔ１細胞におけるＣＴＳＣの低減のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの検証を示す。図４Ｂは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７細胞の尾静脈注射後、又はＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞の乳脂肪パッド注射後の肺の蛍光シグナルを示す。図４Ｃは、ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７細胞を注射したマウス対対照４Ｔ０７細胞の表面転移性結節の数を示す（各群についてｎ＝１０）。図４Ｄ～Ｅは、ＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射されたマウス対４Ｔ１対照細胞を注射されたマウスの腫瘍体積（Ｄ）及び肺転移性結節（Ｅ）の数の変化を示す（各群についてｎ＝１０）。

【図5A】ＣＴＳＣが、肺内の乳がん細胞の早期転移性コロニー形成に関与していることを実証する。図５Ａは、ＳＣＰ２８対照細胞と比較して、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおける肺転移の生物発光イメージング（ＢＬＩ）の結果を示し、ＣＴＳＣ過剰発現マウスにおける肺転移の増加を示している。図５Ｂは、肺切片の免疫蛍光染色によって検出されるように、経時的にＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスにおけるがん細胞の播種の増加を示す。図５Ｃは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現細胞が、マウスにおける対照細胞よりも増殖性であることを示す。一方、図５Ｄは、ＣＴＳＣをノックダウンしたＬＭ２細胞を注射したマウスの肺における転移形成の低減を示し、図５Ｅ～Ｆは、マウスにおけるＣＴＳＣ低減細胞のがん細胞播種（Ｅ）及び増殖（Ｆ）の低減を示す。図５Ｇは、ＣＴＳＣがノックダウンされたＬＭ２細胞を注射した６週間後にＫｉ６７染色することによって、マウスにおける肺転移を視覚的に比較したものである。

【図5B】ＣＴＳＣが、肺内の乳がん細胞の早期転移性コロニー形成に関与していることを実証する。図５Ａは、ＳＣＰ２８対照細胞と比較して、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおける肺転移の生物発光イメージング（ＢＬＩ）の結果を示し、ＣＴＳＣ過剰発現マウスにおける肺転移の増加を示している。図５Ｂは、肺切片の免疫蛍光染色によって検出されるように、経時的にＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスにおけるがん細胞の播種の増加を示す。図５Ｃは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現細胞が、マウスにおける対照細胞よりも増殖性であることを示す。一方、図５Ｄは、ＣＴＳＣをノックダウンしたＬＭ２細胞を注射したマウスの肺における転移形成の低減を示し、図５Ｅ～Ｆは、マウスにおけるＣＴＳＣ低減細胞のがん細胞播種（Ｅ）及び増殖（Ｆ）の低減を示す。図５Ｇは、ＣＴＳＣがノックダウンされたＬＭ２細胞を注射した６週間後にＫｉ６７染色することによって、マウスにおける肺転移を視覚的に比較したものである。

【図5C】ＣＴＳＣが、肺内の乳がん細胞の早期転移性コロニー形成に関与していることを実証する。図５Ａは、ＳＣＰ２８対照細胞と比較して、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおける肺転移の生物発光イメージング（ＢＬＩ）の結果を示し、ＣＴＳＣ過剰発現マウスにおける肺転移の増加を示している。図５Ｂは、肺切片の免疫蛍光染色によって検出されるように、経時的にＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスにおけるがん細胞の播種の増加を示す。図５Ｃは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現細胞が、マウスにおける対照細胞よりも増殖性であることを示す。一方、図５Ｄは、ＣＴＳＣをノックダウンしたＬＭ２細胞を注射したマウスの肺における転移形成の低減を示し、図５Ｅ～Ｆは、マウスにおけるＣＴＳＣ低減細胞のがん細胞播種（Ｅ）及び増殖（Ｆ）の低減を示す。図５Ｇは、ＣＴＳＣがノックダウンされたＬＭ２細胞を注射した６週間後にＫｉ６７染色することによって、マウスにおける肺転移を視覚的に比較したものである。

【図5D】ＣＴＳＣが、肺内の乳がん細胞の早期転移性コロニー形成に関与していることを実証する。図５Ａは、ＳＣＰ２８対照細胞と比較して、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおける肺転移の生物発光イメージング（ＢＬＩ）の結果を示し、ＣＴＳＣ過剰発現マウスにおける肺転移の増加を示している。図５Ｂは、肺切片の免疫蛍光染色によって検出されるように、経時的にＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスにおけるがん細胞の播種の増加を示す。図５Ｃは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現細胞が、マウスにおける対照細胞よりも増殖性であることを示す。一方、図５Ｄは、ＣＴＳＣをノックダウンしたＬＭ２細胞を注射したマウスの肺における転移形成の低減を示し、図５Ｅ～Ｆは、マウスにおけるＣＴＳＣ低減細胞のがん細胞播種（Ｅ）及び増殖（Ｆ）の低減を示す。図５Ｇは、ＣＴＳＣがノックダウンされたＬＭ２細胞を注射した６週間後にＫｉ６７染色することによって、マウスにおける肺転移を視覚的に比較したものである。

【図5E】ＣＴＳＣが、肺内の乳がん細胞の早期転移性コロニー形成に関与していることを実証する。図５Ａは、ＳＣＰ２８対照細胞と比較して、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおける肺転移の生物発光イメージング（ＢＬＩ）の結果を示し、ＣＴＳＣ過剰発現マウスにおける肺転移の増加を示している。図５Ｂは、肺切片の免疫蛍光染色によって検出されるように、経時的にＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスにおけるがん細胞の播種の増加を示す。図５Ｃは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現細胞が、マウスにおける対照細胞よりも増殖性であることを示す。一方、図５Ｄは、ＣＴＳＣをノックダウンしたＬＭ２細胞を注射したマウスの肺における転移形成の低減を示し、図５Ｅ～Ｆは、マウスにおけるＣＴＳＣ低減細胞のがん細胞播種（Ｅ）及び増殖（Ｆ）の低減を示す。図５Ｇは、ＣＴＳＣがノックダウンされたＬＭ２細胞を注射した６週間後にＫｉ６７染色することによって、マウスにおける肺転移を視覚的に比較したものである。

【図5F】ＣＴＳＣが、肺内の乳がん細胞の早期転移性コロニー形成に関与していることを実証する。図５Ａは、ＳＣＰ２８対照細胞と比較して、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおける肺転移の生物発光イメージング（ＢＬＩ）の結果を示し、ＣＴＳＣ過剰発現マウスにおける肺転移の増加を示している。図５Ｂは、肺切片の免疫蛍光染色によって検出されるように、経時的にＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスにおけるがん細胞の播種の増加を示す。図５Ｃは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現細胞が、マウスにおける対照細胞よりも増殖性であることを示す。一方、図５Ｄは、ＣＴＳＣをノックダウンしたＬＭ２細胞を注射したマウスの肺における転移形成の低減を示し、図５Ｅ～Ｆは、マウスにおけるＣＴＳＣ低減細胞のがん細胞播種（Ｅ）及び増殖（Ｆ）の低減を示す。図５Ｇは、ＣＴＳＣがノックダウンされたＬＭ２細胞を注射した６週間後にＫｉ６７染色することによって、マウスにおける肺転移を視覚的に比較したものである。

【図5G】ＣＴＳＣが、肺内の乳がん細胞の早期転移性コロニー形成に関与していることを実証する。図５Ａは、ＳＣＰ２８対照細胞と比較して、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおける肺転移の生物発光イメージング（ＢＬＩ）の結果を示し、ＣＴＳＣ過剰発現マウスにおける肺転移の増加を示している。図５Ｂは、肺切片の免疫蛍光染色によって検出されるように、経時的にＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスにおけるがん細胞の播種の増加を示す。図５Ｃは、マウスにおけるＣＴＳＣ過剰発現細胞が、マウスにおける対照細胞よりも増殖性であることを示す。一方、図５Ｄは、ＣＴＳＣをノックダウンしたＬＭ２細胞を注射したマウスの肺における転移形成の低減を示し、図５Ｅ～Ｆは、マウスにおけるＣＴＳＣ低減細胞のがん細胞播種（Ｅ）及び増殖（Ｆ）の低減を示す。図５Ｇは、ＣＴＳＣがノックダウンされたＬＭ２細胞を注射した６週間後にＫｉ６７染色することによって、マウスにおける肺転移を視覚的に比較したものである。

【図6A】肺転移における好中球動員がＣＴＳＣ発現レベルの影響を受けることを裏付ける。図６Ａは、過剰発現ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８細胞を注射したマウス、及び低減ＣＴＳＣを有するＬＭ２細胞を注射したマウスにおける、肺転移のＣＤ４５^＋免疫細胞におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球の量をパーセンテージで定量するフローサイトメトリー結果を示す。図６Ｂは、同様に処置されたマウス群の肺実質におけるＣＤ４５^＋免疫細胞におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球についての比較可能なフローサイトメトリー結果を示す。図６Ｃは、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスにおけるがん細胞に近接したＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球のクラスタリングの増加、及び低減ＣＴＳＣを有するＬＭ２細胞を注射したマウスにおけるクラスタリングの減少を示す。図６Ｄは、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球凝集をＥｄＵ^＋標識播種腫瘍細胞増殖と相関させたものであり、図６Ｅ～Ｇは、過剰発現ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８細胞を注射する前にＬｙ６Ｇクリアランス抗体でマウスを処置すると、好中球凝集（Ｅ）、増殖（Ｆ）、及び肺結節形成（Ｇ）が低減することを示す。

【図6B】肺転移における好中球動員がＣＴＳＣ発現レベルの影響を受けることを裏付ける。図６Ａは、過剰発現ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８細胞を注射したマウス、及び低減ＣＴＳＣを有するＬＭ２細胞を注射したマウスにおける、肺転移のＣＤ４５^＋免疫細胞におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球の量をパーセンテージで定量するフローサイトメトリー結果を示す。図６Ｂは、同様に処置されたマウス群の肺実質におけるＣＤ４５^＋免疫細胞におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球についての比較可能なフローサイトメトリー結果を示す。図６Ｃは、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスにおけるがん細胞に近接したＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球のクラスタリングの増加、及び低減ＣＴＳＣを有するＬＭ２細胞を注射したマウスにおけるクラスタリングの減少を示す。図６Ｄは、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球凝集をＥｄＵ^＋標識播種腫瘍細胞増殖と相関させたものであり、図６Ｅ～Ｇは、過剰発現ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８細胞を注射する前にＬｙ６Ｇクリアランス抗体でマウスを処置すると、好中球凝集（Ｅ）、増殖（Ｆ）、及び肺結節形成（Ｇ）が低減することを示す。

【図6C】肺転移における好中球動員がＣＴＳＣ発現レベルの影響を受けることを裏付ける。図６Ａは、過剰発現ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８細胞を注射したマウス、及び低減ＣＴＳＣを有するＬＭ２細胞を注射したマウスにおける、肺転移のＣＤ４５^＋免疫細胞におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球の量をパーセンテージで定量するフローサイトメトリー結果を示す。図６Ｂは、同様に処置されたマウス群の肺実質におけるＣＤ４５^＋免疫細胞におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球についての比較可能なフローサイトメトリー結果を示す。図６Ｃは、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスにおけるがん細胞に近接したＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球のクラスタリングの増加、及び低減ＣＴＳＣを有するＬＭ２細胞を注射したマウスにおけるクラスタリングの減少を示す。図６Ｄは、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球凝集をＥｄＵ^＋標識播種腫瘍細胞増殖と相関させたものであり、図６Ｅ～Ｇは、過剰発現ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８細胞を注射する前にＬｙ６Ｇクリアランス抗体でマウスを処置すると、好中球凝集（Ｅ）、増殖（Ｆ）、及び肺結節形成（Ｇ）が低減することを示す。

【図6D】肺転移における好中球動員がＣＴＳＣ発現レベルの影響を受けることを裏付ける。図６Ａは、過剰発現ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８細胞を注射したマウス、及び低減ＣＴＳＣを有するＬＭ２細胞を注射したマウスにおける、肺転移のＣＤ４５^＋免疫細胞におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球の量をパーセンテージで定量するフローサイトメトリー結果を示す。図６Ｂは、同様に処置されたマウス群の肺実質におけるＣＤ４５^＋免疫細胞におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球についての比較可能なフローサイトメトリー結果を示す。図６Ｃは、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスにおけるがん細胞に近接したＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球のクラスタリングの増加、及び低減ＣＴＳＣを有するＬＭ２細胞を注射したマウスにおけるクラスタリングの減少を示す。図６Ｄは、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球凝集をＥｄＵ^＋標識播種腫瘍細胞増殖と相関させたものであり、図６Ｅ～Ｇは、過剰発現ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８細胞を注射する前にＬｙ６Ｇクリアランス抗体でマウスを処置すると、好中球凝集（Ｅ）、増殖（Ｆ）、及び肺結節形成（Ｇ）が低減することを示す。

【図6E】肺転移における好中球動員がＣＴＳＣ発現レベルの影響を受けることを裏付ける。図６Ａは、過剰発現ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８細胞を注射したマウス、及び低減ＣＴＳＣを有するＬＭ２細胞を注射したマウスにおける、肺転移のＣＤ４５^＋免疫細胞におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球の量をパーセンテージで定量するフローサイトメトリー結果を示す。図６Ｂは、同様に処置されたマウス群の肺実質におけるＣＤ４５^＋免疫細胞におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球についての比較可能なフローサイトメトリー結果を示す。図６Ｃは、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスにおけるがん細胞に近接したＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球のクラスタリングの増加、及び低減ＣＴＳＣを有するＬＭ２細胞を注射したマウスにおけるクラスタリングの減少を示す。図６Ｄは、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球凝集をＥｄＵ^＋標識播種腫瘍細胞増殖と相関させたものであり、図６Ｅ～Ｇは、過剰発現ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８細胞を注射する前にＬｙ６Ｇクリアランス抗体でマウスを処置すると、好中球凝集（Ｅ）、増殖（Ｆ）、及び肺結節形成（Ｇ）が低減することを示す。

【図6F】肺転移における好中球動員がＣＴＳＣ発現レベルの影響を受けることを裏付ける。図６Ａは、過剰発現ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８細胞を注射したマウス、及び低減ＣＴＳＣを有するＬＭ２細胞を注射したマウスにおける、肺転移のＣＤ４５^＋免疫細胞におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球の量をパーセンテージで定量するフローサイトメトリー結果を示す。図６Ｂは、同様に処置されたマウス群の肺実質におけるＣＤ４５^＋免疫細胞におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球についての比較可能なフローサイトメトリー結果を示す。図６Ｃは、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスにおけるがん細胞に近接したＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球のクラスタリングの増加、及び低減ＣＴＳＣを有するＬＭ２細胞を注射したマウスにおけるクラスタリングの減少を示す。図６Ｄは、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球凝集をＥｄＵ^＋標識播種腫瘍細胞増殖と相関させたものであり、図６Ｅ～Ｇは、過剰発現ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８細胞を注射する前にＬｙ６Ｇクリアランス抗体でマウスを処置すると、好中球凝集（Ｅ）、増殖（Ｆ）、及び肺結節形成（Ｇ）が低減することを示す。

【図6G】肺転移における好中球動員がＣＴＳＣ発現レベルの影響を受けることを裏付ける。図６Ａは、過剰発現ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８細胞を注射したマウス、及び低減ＣＴＳＣを有するＬＭ２細胞を注射したマウスにおける、肺転移のＣＤ４５^＋免疫細胞におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球の量をパーセンテージで定量するフローサイトメトリー結果を示す。図６Ｂは、同様に処置されたマウス群の肺実質におけるＣＤ４５^＋免疫細胞におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球についての比較可能なフローサイトメトリー結果を示す。図６Ｃは、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を注射したマウスにおけるがん細胞に近接したＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球のクラスタリングの増加、及び低減ＣＴＳＣを有するＬＭ２細胞を注射したマウスにおけるクラスタリングの減少を示す。図６Ｄは、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球凝集をＥｄＵ^＋標識播種腫瘍細胞増殖と相関させたものであり、図６Ｅ～Ｇは、過剰発現ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８細胞を注射する前にＬｙ６Ｇクリアランス抗体でマウスを処置すると、好中球凝集（Ｅ）、増殖（Ｆ）、及び肺結節形成（Ｇ）が低減することを示す。

【図7A】ＣＴＳＣによる好中球動員が、ＰＲ３－ＩＬ－１ｂ－ＮＦ－ｋＢ経路調節によって増強されることを実証する。図７Ａ～Ｂは、制御培地における好中球動員に対するＣＴＳＣの過剰発現又は低減の効果を示す。図７Ｂの画像は、ＩＬ－６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、Ｇ－ＣＳＦ、及びＴＮＦＲ１の各々が、ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７がん細胞で前処理される好中球において上方制御されることを示す。図７Ｃのウェスタンブロット画像は、６つの好中球由来セリンプロテアーゼのセットのうち、ＰＲ３のみが好中球細胞質膜上に発現されることを示す。図７Ｄは、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞のＣＭで培養したヒト好中球のＰＲ３活性が、ＰＲ３の阻害剤（Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ）による処理時に低減することを示す。図７Ｅ～Ｇは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣ（Ｅ）を過剰発現する４Ｔ０７細胞の馴化培地で前処理されたマウス好中球の移行を低減し、ＣＴＳＣ（Ｆ－Ｇ）を過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の周りの好中球凝集を低下させることを示す。図７Ｈは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で前処理された好中球のＩＬ－１ｂレベルを低下させる一方で、ＮＦ－_ＫＢ阻害剤（ＢＡＹ１１－７０８２）は低下させないことを示す。図７Ｉ～Ｊに見られるように、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を移植されたマウスをＩＬ－１ｂブロッキング抗体で処置すると、ＩｇＧ処置と比較して、肺転移（Ｉ）及び肺表面結節形成（Ｊ）が低減する。

【図7B】ＣＴＳＣによる好中球動員が、ＰＲ３－ＩＬ－１ｂ－ＮＦ－ｋＢ経路調節によって増強されることを実証する。図７Ａ～Ｂは、制御培地における好中球動員に対するＣＴＳＣの過剰発現又は低減の効果を示す。図７Ｂの画像は、ＩＬ－６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、Ｇ－ＣＳＦ、及びＴＮＦＲ１の各々が、ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７がん細胞で前処理される好中球において上方制御されることを示す。図７Ｃのウェスタンブロット画像は、６つの好中球由来セリンプロテアーゼのセットのうち、ＰＲ３のみが好中球細胞質膜上に発現されることを示す。図７Ｄは、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞のＣＭで培養したヒト好中球のＰＲ３活性が、ＰＲ３の阻害剤（Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ）による処理時に低減することを示す。図７Ｅ～Ｇは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣ（Ｅ）を過剰発現する４Ｔ０７細胞の馴化培地で前処理されたマウス好中球の移行を低減し、ＣＴＳＣ（Ｆ－Ｇ）を過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の周りの好中球凝集を低下させることを示す。図７Ｈは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で前処理された好中球のＩＬ－１ｂレベルを低下させる一方で、ＮＦ－_ＫＢ阻害剤（ＢＡＹ１１－７０８２）は低下させないことを示す。図７Ｉ～Ｊに見られるように、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を移植されたマウスをＩＬ－１ｂブロッキング抗体で処置すると、ＩｇＧ処置と比較して、肺転移（Ｉ）及び肺表面結節形成（Ｊ）が低減する。

【図7C】ＣＴＳＣによる好中球動員が、ＰＲ３－ＩＬ－１ｂ－ＮＦ－ｋＢ経路調節によって増強されることを実証する。図７Ａ～Ｂは、制御培地における好中球動員に対するＣＴＳＣの過剰発現又は低減の効果を示す。図７Ｂの画像は、ＩＬ－６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、Ｇ－ＣＳＦ、及びＴＮＦＲ１の各々が、ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７がん細胞で前処理される好中球において上方制御されることを示す。図７Ｃのウェスタンブロット画像は、６つの好中球由来セリンプロテアーゼのセットのうち、ＰＲ３のみが好中球細胞質膜上に発現されることを示す。図７Ｄは、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞のＣＭで培養したヒト好中球のＰＲ３活性が、ＰＲ３の阻害剤（Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ）による処理時に低減することを示す。図７Ｅ～Ｇは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣ（Ｅ）を過剰発現する４Ｔ０７細胞の馴化培地で前処理されたマウス好中球の移行を低減し、ＣＴＳＣ（Ｆ－Ｇ）を過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の周りの好中球凝集を低下させることを示す。図７Ｈは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で前処理された好中球のＩＬ－１ｂレベルを低下させる一方で、ＮＦ－_ＫＢ阻害剤（ＢＡＹ１１－７０８２）は低下させないことを示す。図７Ｉ～Ｊに見られるように、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を移植されたマウスをＩＬ－１ｂブロッキング抗体で処置すると、ＩｇＧ処置と比較して、肺転移（Ｉ）及び肺表面結節形成（Ｊ）が低減する。

【図7D】ＣＴＳＣによる好中球動員が、ＰＲ３－ＩＬ－１ｂ－ＮＦ－ｋＢ経路調節によって増強されることを実証する。図７Ａ～Ｂは、制御培地における好中球動員に対するＣＴＳＣの過剰発現又は低減の効果を示す。図７Ｂの画像は、ＩＬ－６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、Ｇ－ＣＳＦ、及びＴＮＦＲ１の各々が、ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７がん細胞で前処理される好中球において上方制御されることを示す。図７Ｃのウェスタンブロット画像は、６つの好中球由来セリンプロテアーゼのセットのうち、ＰＲ３のみが好中球細胞質膜上に発現されることを示す。図７Ｄは、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞のＣＭで培養したヒト好中球のＰＲ３活性が、ＰＲ３の阻害剤（Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ）による処理時に低減することを示す。図７Ｅ～Ｇは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣ（Ｅ）を過剰発現する４Ｔ０７細胞の馴化培地で前処理されたマウス好中球の移行を低減し、ＣＴＳＣ（Ｆ－Ｇ）を過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の周りの好中球凝集を低下させることを示す。図７Ｈは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で前処理された好中球のＩＬ－１ｂレベルを低下させる一方で、ＮＦ－_ＫＢ阻害剤（ＢＡＹ１１－７０８２）は低下させないことを示す。図７Ｉ～Ｊに見られるように、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を移植されたマウスをＩＬ－１ｂブロッキング抗体で処置すると、ＩｇＧ処置と比較して、肺転移（Ｉ）及び肺表面結節形成（Ｊ）が低減する。

【図7E】ＣＴＳＣによる好中球動員が、ＰＲ３－ＩＬ－１ｂ－ＮＦ－ｋＢ経路調節によって増強されることを実証する。図７Ａ～Ｂは、制御培地における好中球動員に対するＣＴＳＣの過剰発現又は低減の効果を示す。図７Ｂの画像は、ＩＬ－６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、Ｇ－ＣＳＦ、及びＴＮＦＲ１の各々が、ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７がん細胞で前処理される好中球において上方制御されることを示す。図７Ｃのウェスタンブロット画像は、６つの好中球由来セリンプロテアーゼのセットのうち、ＰＲ３のみが好中球細胞質膜上に発現されることを示す。図７Ｄは、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞のＣＭで培養したヒト好中球のＰＲ３活性が、ＰＲ３の阻害剤（Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ）による処理時に低減することを示す。図７Ｅ～Ｇは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣ（Ｅ）を過剰発現する４Ｔ０７細胞の馴化培地で前処理されたマウス好中球の移行を低減し、ＣＴＳＣ（Ｆ－Ｇ）を過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の周りの好中球凝集を低下させることを示す。図７Ｈは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で前処理された好中球のＩＬ－１ｂレベルを低下させる一方で、ＮＦ－_ＫＢ阻害剤（ＢＡＹ１１－７０８２）は低下させないことを示す。図７Ｉ～Ｊに見られるように、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を移植されたマウスをＩＬ－１ｂブロッキング抗体で処置すると、ＩｇＧ処置と比較して、肺転移（Ｉ）及び肺表面結節形成（Ｊ）が低減する。

【図7F】ＣＴＳＣによる好中球動員が、ＰＲ３－ＩＬ－１ｂ－ＮＦ－ｋＢ経路調節によって増強されることを実証する。図７Ａ～Ｂは、制御培地における好中球動員に対するＣＴＳＣの過剰発現又は低減の効果を示す。図７Ｂの画像は、ＩＬ－６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、Ｇ－ＣＳＦ、及びＴＮＦＲ１の各々が、ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７がん細胞で前処理される好中球において上方制御されることを示す。図７Ｃのウェスタンブロット画像は、６つの好中球由来セリンプロテアーゼのセットのうち、ＰＲ３のみが好中球細胞質膜上に発現されることを示す。図７Ｄは、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞のＣＭで培養したヒト好中球のＰＲ３活性が、ＰＲ３の阻害剤（Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ）による処理時に低減することを示す。図７Ｅ～Ｇは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣ（Ｅ）を過剰発現する４Ｔ０７細胞の馴化培地で前処理されたマウス好中球の移行を低減し、ＣＴＳＣ（Ｆ－Ｇ）を過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の周りの好中球凝集を低下させることを示す。図７Ｈは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で前処理された好中球のＩＬ－１ｂレベルを低下させる一方で、ＮＦ－_ＫＢ阻害剤（ＢＡＹ１１－７０８２）は低下させないことを示す。図７Ｉ～Ｊに見られるように、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を移植されたマウスをＩＬ－１ｂブロッキング抗体で処置すると、ＩｇＧ処置と比較して、肺転移（Ｉ）及び肺表面結節形成（Ｊ）が低減する。

【図7G】ＣＴＳＣによる好中球動員が、ＰＲ３－ＩＬ－１ｂ－ＮＦ－ｋＢ経路調節によって増強されることを実証する。図７Ａ～Ｂは、制御培地における好中球動員に対するＣＴＳＣの過剰発現又は低減の効果を示す。図７Ｂの画像は、ＩＬ－６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、Ｇ－ＣＳＦ、及びＴＮＦＲ１の各々が、ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７がん細胞で前処理される好中球において上方制御されることを示す。図７Ｃのウェスタンブロット画像は、６つの好中球由来セリンプロテアーゼのセットのうち、ＰＲ３のみが好中球細胞質膜上に発現されることを示す。図７Ｄは、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞のＣＭで培養したヒト好中球のＰＲ３活性が、ＰＲ３の阻害剤（Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ）による処理時に低減することを示す。図７Ｅ～Ｇは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣ（Ｅ）を過剰発現する４Ｔ０７細胞の馴化培地で前処理されたマウス好中球の移行を低減し、ＣＴＳＣ（Ｆ－Ｇ）を過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の周りの好中球凝集を低下させることを示す。図７Ｈは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で前処理された好中球のＩＬ－１ｂレベルを低下させる一方で、ＮＦ－_ＫＢ阻害剤（ＢＡＹ１１－７０８２）は低下させないことを示す。図７Ｉ～Ｊに見られるように、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を移植されたマウスをＩＬ－１ｂブロッキング抗体で処置すると、ＩｇＧ処置と比較して、肺転移（Ｉ）及び肺表面結節形成（Ｊ）が低減する。

【図7H】ＣＴＳＣによる好中球動員が、ＰＲ３－ＩＬ－１ｂ－ＮＦ－ｋＢ経路調節によって増強されることを実証する。図７Ａ～Ｂは、制御培地における好中球動員に対するＣＴＳＣの過剰発現又は低減の効果を示す。図７Ｂの画像は、ＩＬ－６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、Ｇ－ＣＳＦ、及びＴＮＦＲ１の各々が、ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７がん細胞で前処理される好中球において上方制御されることを示す。図７Ｃのウェスタンブロット画像は、６つの好中球由来セリンプロテアーゼのセットのうち、ＰＲ３のみが好中球細胞質膜上に発現されることを示す。図７Ｄは、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞のＣＭで培養したヒト好中球のＰＲ３活性が、ＰＲ３の阻害剤（Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ）による処理時に低減することを示す。図７Ｅ～Ｇは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣ（Ｅ）を過剰発現する４Ｔ０７細胞の馴化培地で前処理されたマウス好中球の移行を低減し、ＣＴＳＣ（Ｆ－Ｇ）を過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の周りの好中球凝集を低下させることを示す。図７Ｈは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で前処理された好中球のＩＬ－１ｂレベルを低下させる一方で、ＮＦ－_ＫＢ阻害剤（ＢＡＹ１１－７０８２）は低下させないことを示す。図７Ｉ～Ｊに見られるように、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を移植されたマウスをＩＬ－１ｂブロッキング抗体で処置すると、ＩｇＧ処置と比較して、肺転移（Ｉ）及び肺表面結節形成（Ｊ）が低減する。

【図7I】ＣＴＳＣによる好中球動員が、ＰＲ３－ＩＬ－１ｂ－ＮＦ－ｋＢ経路調節によって増強されることを実証する。図７Ａ～Ｂは、制御培地における好中球動員に対するＣＴＳＣの過剰発現又は低減の効果を示す。図７Ｂの画像は、ＩＬ－６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、Ｇ－ＣＳＦ、及びＴＮＦＲ１の各々が、ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７がん細胞で前処理される好中球において上方制御されることを示す。図７Ｃのウェスタンブロット画像は、６つの好中球由来セリンプロテアーゼのセットのうち、ＰＲ３のみが好中球細胞質膜上に発現されることを示す。図７Ｄは、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞のＣＭで培養したヒト好中球のＰＲ３活性が、ＰＲ３の阻害剤（Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ）による処理時に低減することを示す。図７Ｅ～Ｇは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣ（Ｅ）を過剰発現する４Ｔ０７細胞の馴化培地で前処理されたマウス好中球の移行を低減し、ＣＴＳＣ（Ｆ－Ｇ）を過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の周りの好中球凝集を低下させることを示す。図７Ｈは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で前処理された好中球のＩＬ－１ｂレベルを低下させる一方で、ＮＦ－_ＫＢ阻害剤（ＢＡＹ１１－７０８２）は低下させないことを示す。図７Ｉ～Ｊに見られるように、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を移植されたマウスをＩＬ－１ｂブロッキング抗体で処置すると、ＩｇＧ処置と比較して、肺転移（Ｉ）及び肺表面結節形成（Ｊ）が低減する。

【図7J】ＣＴＳＣによる好中球動員が、ＰＲ３－ＩＬ－１ｂ－ＮＦ－ｋＢ経路調節によって増強されることを実証する。図７Ａ～Ｂは、制御培地における好中球動員に対するＣＴＳＣの過剰発現又は低減の効果を示す。図７Ｂの画像は、ＩＬ－６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、Ｇ－ＣＳＦ、及びＴＮＦＲ１の各々が、ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７がん細胞で前処理される好中球において上方制御されることを示す。図７Ｃのウェスタンブロット画像は、６つの好中球由来セリンプロテアーゼのセットのうち、ＰＲ３のみが好中球細胞質膜上に発現されることを示す。図７Ｄは、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞のＣＭで培養したヒト好中球のＰＲ３活性が、ＰＲ３の阻害剤（Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ）による処理時に低減することを示す。図７Ｅ～Ｇは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣ（Ｅ）を過剰発現する４Ｔ０７細胞の馴化培地で前処理されたマウス好中球の移行を低減し、ＣＴＳＣ（Ｆ－Ｇ）を過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の周りの好中球凝集を低下させることを示す。図７Ｈは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔが、ＣＴＳＣを有するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で前処理された好中球のＩＬ－１ｂレベルを低下させる一方で、ＮＦ－_ＫＢ阻害剤（ＢＡＹ１１－７０８２）は低下させないことを示す。図７Ｉ～Ｊに見られるように、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を移植されたマウスをＩＬ－１ｂブロッキング抗体で処置すると、ＩｇＧ処置と比較して、肺転移（Ｉ）及び肺表面結節形成（Ｊ）が低減する。

【図8A】腫瘍ＣＴＳＣが好中球を動員してＮＥＴｏｓｉｓを誘導することを示唆する。図８ＡのＩＦ結果は、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で培養された好中球が広範なＮＥＴを形成することを示す。マウスの採取された肺のＩＦ結果は、ＣＴＳＣ過剰発現がん細胞（ＳＣＰ２８）の近くで有意なＮＥＴ形成を示すが、低減ＣＴＳＣ発現を有するがん細胞（ＬＭ２）の近くではＮＥＴ形成はほとんどないことを示している（図８Ｂ）。図８Ｃは、４Ｔ０７がん細胞の馴化培地で前処理したマウス好中球におけるＲＯＳレベルを、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔを添加したものと添加しなかったものとで比較している。図８Ｄは、ＣＴＳＣ発現レベルにかかわらず、４Ｔ１馴化培地及び／又はｒｈＰＲ３を添加した組換えヒト活性ＰＲ３で前処理したマウス好中球におけるｐ３８リン酸化の増加を示す。ＣＴＳＣを過剰発現する４Ｔ０７細胞で前処理したマウス好中球では、ＲＯＳ産生が増加するが、ｐ３８阻害剤（ＳＢ２０３５８０）の添加は、この効果を逆転させる（図８Ｅ）。４Ｔ０７又は４Ｔ１馴化培地中で培養されたマウス好中球を、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ（ＰＲ３を阻害するため）又はＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＴを消化するため）のいずれかで処理することにより、ＣＴＳＣによって誘導されるＮＥＴ形成がブロックされ（図８Ｆ）、同じ効果が、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ又はＤＮａｓｅ Ｉで更に処理されるＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおいて見られる（図８Ｇ）。図８Ｈは、ｒｍＴＳＰ－１は好中球培地中で培養した４Ｔ０７がん細胞のスフェロイド増殖をブロックできないが、ａ－ＩＬ６及び／又はＤＮａｓｅ Ｉの更なる添加は、スフェロイド増殖を様々な程度まで抑制することを示す。

【図8B】腫瘍ＣＴＳＣが好中球を動員してＮＥＴｏｓｉｓを誘導することを示唆する。図８ＡのＩＦ結果は、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で培養された好中球が広範なＮＥＴを形成することを示す。マウスの採取された肺のＩＦ結果は、ＣＴＳＣ過剰発現がん細胞（ＳＣＰ２８）の近くで有意なＮＥＴ形成を示すが、低減ＣＴＳＣ発現を有するがん細胞（ＬＭ２）の近くではＮＥＴ形成はほとんどないことを示している（図８Ｂ）。図８Ｃは、４Ｔ０７がん細胞の馴化培地で前処理したマウス好中球におけるＲＯＳレベルを、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔを添加したものと添加しなかったものとで比較している。図８Ｄは、ＣＴＳＣ発現レベルにかかわらず、４Ｔ１馴化培地及び／又はｒｈＰＲ３を添加した組換えヒト活性ＰＲ３で前処理したマウス好中球におけるｐ３８リン酸化の増加を示す。ＣＴＳＣを過剰発現する４Ｔ０７細胞で前処理したマウス好中球では、ＲＯＳ産生が増加するが、ｐ３８阻害剤（ＳＢ２０３５８０）の添加は、この効果を逆転させる（図８Ｅ）。４Ｔ０７又は４Ｔ１馴化培地中で培養されたマウス好中球を、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ（ＰＲ３を阻害するため）又はＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＴを消化するため）のいずれかで処理することにより、ＣＴＳＣによって誘導されるＮＥＴ形成がブロックされ（図８Ｆ）、同じ効果が、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ又はＤＮａｓｅ Ｉで更に処理されるＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおいて見られる（図８Ｇ）。図８Ｈは、ｒｍＴＳＰ－１は好中球培地中で培養した４Ｔ０７がん細胞のスフェロイド増殖をブロックできないが、ａ－ＩＬ６及び／又はＤＮａｓｅ Ｉの更なる添加は、スフェロイド増殖を様々な程度まで抑制することを示す。

【図8C】腫瘍ＣＴＳＣが好中球を動員してＮＥＴｏｓｉｓを誘導することを示唆する。図８ＡのＩＦ結果は、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で培養された好中球が広範なＮＥＴを形成することを示す。マウスの採取された肺のＩＦ結果は、ＣＴＳＣ過剰発現がん細胞（ＳＣＰ２８）の近くで有意なＮＥＴ形成を示すが、低減ＣＴＳＣ発現を有するがん細胞（ＬＭ２）の近くではＮＥＴ形成はほとんどないことを示している（図８Ｂ）。図８Ｃは、４Ｔ０７がん細胞の馴化培地で前処理したマウス好中球におけるＲＯＳレベルを、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔを添加したものと添加しなかったものとで比較している。図８Ｄは、ＣＴＳＣ発現レベルにかかわらず、４Ｔ１馴化培地及び／又はｒｈＰＲ３を添加した組換えヒト活性ＰＲ３で前処理したマウス好中球におけるｐ３８リン酸化の増加を示す。ＣＴＳＣを過剰発現する４Ｔ０７細胞で前処理したマウス好中球では、ＲＯＳ産生が増加するが、ｐ３８阻害剤（ＳＢ２０３５８０）の添加は、この効果を逆転させる（図８Ｅ）。４Ｔ０７又は４Ｔ１馴化培地中で培養されたマウス好中球を、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ（ＰＲ３を阻害するため）又はＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＴを消化するため）のいずれかで処理することにより、ＣＴＳＣによって誘導されるＮＥＴ形成がブロックされ（図８Ｆ）、同じ効果が、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ又はＤＮａｓｅ Ｉで更に処理されるＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおいて見られる（図８Ｇ）。図８Ｈは、ｒｍＴＳＰ－１は好中球培地中で培養した４Ｔ０７がん細胞のスフェロイド増殖をブロックできないが、ａ－ＩＬ６及び／又はＤＮａｓｅ Ｉの更なる添加は、スフェロイド増殖を様々な程度まで抑制することを示す。

【図8D】腫瘍ＣＴＳＣが好中球を動員してＮＥＴｏｓｉｓを誘導することを示唆する。図８ＡのＩＦ結果は、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で培養された好中球が広範なＮＥＴを形成することを示す。マウスの採取された肺のＩＦ結果は、ＣＴＳＣ過剰発現がん細胞（ＳＣＰ２８）の近くで有意なＮＥＴ形成を示すが、低減ＣＴＳＣ発現を有するがん細胞（ＬＭ２）の近くではＮＥＴ形成はほとんどないことを示している（図８Ｂ）。図８Ｃは、４Ｔ０７がん細胞の馴化培地で前処理したマウス好中球におけるＲＯＳレベルを、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔを添加したものと添加しなかったものとで比較している。図８Ｄは、ＣＴＳＣ発現レベルにかかわらず、４Ｔ１馴化培地及び／又はｒｈＰＲ３を添加した組換えヒト活性ＰＲ３で前処理したマウス好中球におけるｐ３８リン酸化の増加を示す。ＣＴＳＣを過剰発現する４Ｔ０７細胞で前処理したマウス好中球では、ＲＯＳ産生が増加するが、ｐ３８阻害剤（ＳＢ２０３５８０）の添加は、この効果を逆転させる（図８Ｅ）。４Ｔ０７又は４Ｔ１馴化培地中で培養されたマウス好中球を、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ（ＰＲ３を阻害するため）又はＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＴを消化するため）のいずれかで処理することにより、ＣＴＳＣによって誘導されるＮＥＴ形成がブロックされ（図８Ｆ）、同じ効果が、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ又はＤＮａｓｅ Ｉで更に処理されるＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおいて見られる（図８Ｇ）。図８Ｈは、ｒｍＴＳＰ－１は好中球培地中で培養した４Ｔ０７がん細胞のスフェロイド増殖をブロックできないが、ａ－ＩＬ６及び／又はＤＮａｓｅ Ｉの更なる添加は、スフェロイド増殖を様々な程度まで抑制することを示す。

【図8E】腫瘍ＣＴＳＣが好中球を動員してＮＥＴｏｓｉｓを誘導することを示唆する。図８ＡのＩＦ結果は、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で培養された好中球が広範なＮＥＴを形成することを示す。マウスの採取された肺のＩＦ結果は、ＣＴＳＣ過剰発現がん細胞（ＳＣＰ２８）の近くで有意なＮＥＴ形成を示すが、低減ＣＴＳＣ発現を有するがん細胞（ＬＭ２）の近くではＮＥＴ形成はほとんどないことを示している（図８Ｂ）。図８Ｃは、４Ｔ０７がん細胞の馴化培地で前処理したマウス好中球におけるＲＯＳレベルを、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔを添加したものと添加しなかったものとで比較している。図８Ｄは、ＣＴＳＣ発現レベルにかかわらず、４Ｔ１馴化培地及び／又はｒｈＰＲ３を添加した組換えヒト活性ＰＲ３で前処理したマウス好中球におけるｐ３８リン酸化の増加を示す。ＣＴＳＣを過剰発現する４Ｔ０７細胞で前処理したマウス好中球では、ＲＯＳ産生が増加するが、ｐ３８阻害剤（ＳＢ２０３５８０）の添加は、この効果を逆転させる（図８Ｅ）。４Ｔ０７又は４Ｔ１馴化培地中で培養されたマウス好中球を、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ（ＰＲ３を阻害するため）又はＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＴを消化するため）のいずれかで処理することにより、ＣＴＳＣによって誘導されるＮＥＴ形成がブロックされ（図８Ｆ）、同じ効果が、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ又はＤＮａｓｅ Ｉで更に処理されるＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおいて見られる（図８Ｇ）。図８Ｈは、ｒｍＴＳＰ－１は好中球培地中で培養した４Ｔ０７がん細胞のスフェロイド増殖をブロックできないが、ａ－ＩＬ６及び／又はＤＮａｓｅ Ｉの更なる添加は、スフェロイド増殖を様々な程度まで抑制することを示す。

【図8F】腫瘍ＣＴＳＣが好中球を動員してＮＥＴｏｓｉｓを誘導することを示唆する。図８ＡのＩＦ結果は、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で培養された好中球が広範なＮＥＴを形成することを示す。マウスの採取された肺のＩＦ結果は、ＣＴＳＣ過剰発現がん細胞（ＳＣＰ２８）の近くで有意なＮＥＴ形成を示すが、低減ＣＴＳＣ発現を有するがん細胞（ＬＭ２）の近くではＮＥＴ形成はほとんどないことを示している（図８Ｂ）。図８Ｃは、４Ｔ０７がん細胞の馴化培地で前処理したマウス好中球におけるＲＯＳレベルを、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔを添加したものと添加しなかったものとで比較している。図８Ｄは、ＣＴＳＣ発現レベルにかかわらず、４Ｔ１馴化培地及び／又はｒｈＰＲ３を添加した組換えヒト活性ＰＲ３で前処理したマウス好中球におけるｐ３８リン酸化の増加を示す。ＣＴＳＣを過剰発現する４Ｔ０７細胞で前処理したマウス好中球では、ＲＯＳ産生が増加するが、ｐ３８阻害剤（ＳＢ２０３５８０）の添加は、この効果を逆転させる（図８Ｅ）。４Ｔ０７又は４Ｔ１馴化培地中で培養されたマウス好中球を、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ（ＰＲ３を阻害するため）又はＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＴを消化するため）のいずれかで処理することにより、ＣＴＳＣによって誘導されるＮＥＴ形成がブロックされ（図８Ｆ）、同じ効果が、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ又はＤＮａｓｅ Ｉで更に処理されるＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおいて見られる（図８Ｇ）。図８Ｈは、ｒｍＴＳＰ－１は好中球培地中で培養した４Ｔ０７がん細胞のスフェロイド増殖をブロックできないが、ａ－ＩＬ６及び／又はＤＮａｓｅ Ｉの更なる添加は、スフェロイド増殖を様々な程度まで抑制することを示す。

【図8G】腫瘍ＣＴＳＣが好中球を動員してＮＥＴｏｓｉｓを誘導することを示唆する。図８ＡのＩＦ結果は、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で培養された好中球が広範なＮＥＴを形成することを示す。マウスの採取された肺のＩＦ結果は、ＣＴＳＣ過剰発現がん細胞（ＳＣＰ２８）の近くで有意なＮＥＴ形成を示すが、低減ＣＴＳＣ発現を有するがん細胞（ＬＭ２）の近くではＮＥＴ形成はほとんどないことを示している（図８Ｂ）。図８Ｃは、４Ｔ０７がん細胞の馴化培地で前処理したマウス好中球におけるＲＯＳレベルを、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔを添加したものと添加しなかったものとで比較している。図８Ｄは、ＣＴＳＣ発現レベルにかかわらず、４Ｔ１馴化培地及び／又はｒｈＰＲ３を添加した組換えヒト活性ＰＲ３で前処理したマウス好中球におけるｐ３８リン酸化の増加を示す。ＣＴＳＣを過剰発現する４Ｔ０７細胞で前処理したマウス好中球では、ＲＯＳ産生が増加するが、ｐ３８阻害剤（ＳＢ２０３５８０）の添加は、この効果を逆転させる（図８Ｅ）。４Ｔ０７又は４Ｔ１馴化培地中で培養されたマウス好中球を、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ（ＰＲ３を阻害するため）又はＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＴを消化するため）のいずれかで処理することにより、ＣＴＳＣによって誘導されるＮＥＴ形成がブロックされ（図８Ｆ）、同じ効果が、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ又はＤＮａｓｅ Ｉで更に処理されるＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおいて見られる（図８Ｇ）。図８Ｈは、ｒｍＴＳＰ－１は好中球培地中で培養した４Ｔ０７がん細胞のスフェロイド増殖をブロックできないが、ａ－ＩＬ６及び／又はＤＮａｓｅ Ｉの更なる添加は、スフェロイド増殖を様々な程度まで抑制することを示す。

【図8H】腫瘍ＣＴＳＣが好中球を動員してＮＥＴｏｓｉｓを誘導することを示唆する。図８ＡのＩＦ結果は、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で培養された好中球が広範なＮＥＴを形成することを示す。マウスの採取された肺のＩＦ結果は、ＣＴＳＣ過剰発現がん細胞（ＳＣＰ２８）の近くで有意なＮＥＴ形成を示すが、低減ＣＴＳＣ発現を有するがん細胞（ＬＭ２）の近くではＮＥＴ形成はほとんどないことを示している（図８Ｂ）。図８Ｃは、４Ｔ０７がん細胞の馴化培地で前処理したマウス好中球におけるＲＯＳレベルを、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔを添加したものと添加しなかったものとで比較している。図８Ｄは、ＣＴＳＣ発現レベルにかかわらず、４Ｔ１馴化培地及び／又はｒｈＰＲ３を添加した組換えヒト活性ＰＲ３で前処理したマウス好中球におけるｐ３８リン酸化の増加を示す。ＣＴＳＣを過剰発現する４Ｔ０７細胞で前処理したマウス好中球では、ＲＯＳ産生が増加するが、ｐ３８阻害剤（ＳＢ２０３５８０）の添加は、この効果を逆転させる（図８Ｅ）。４Ｔ０７又は４Ｔ１馴化培地中で培養されたマウス好中球を、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ（ＰＲ３を阻害するため）又はＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＴを消化するため）のいずれかで処理することにより、ＣＴＳＣによって誘導されるＮＥＴ形成がブロックされ（図８Ｆ）、同じ効果が、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ又はＤＮａｓｅ Ｉで更に処理されるＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおいて見られる（図８Ｇ）。図８Ｈは、ｒｍＴＳＰ－１は好中球培地中で培養した４Ｔ０７がん細胞のスフェロイド増殖をブロックできないが、ａ－ＩＬ６及び／又はＤＮａｓｅ Ｉの更なる添加は、スフェロイド増殖を様々な程度まで抑制することを示す。

【図8I】腫瘍ＣＴＳＣが好中球を動員してＮＥＴｏｓｉｓを誘導することを示唆する。図８ＡのＩＦ結果は、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で培養された好中球が広範なＮＥＴを形成することを示す。マウスの採取された肺のＩＦ結果は、ＣＴＳＣ過剰発現がん細胞（ＳＣＰ２８）の近くで有意なＮＥＴ形成を示すが、低減ＣＴＳＣ発現を有するがん細胞（ＬＭ２）の近くではＮＥＴ形成はほとんどないことを示している（図８Ｂ）。図８Ｃは、４Ｔ０７がん細胞の馴化培地で前処理したマウス好中球におけるＲＯＳレベルを、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔを添加したものと添加しなかったものとで比較している。図８Ｄは、ＣＴＳＣ発現レベルにかかわらず、４Ｔ１馴化培地及び／又はｒｈＰＲ３を添加した組換えヒト活性ＰＲ３で前処理したマウス好中球におけるｐ３８リン酸化の増加を示す。ＣＴＳＣを過剰発現する４Ｔ０７細胞で前処理したマウス好中球では、ＲＯＳ産生が増加するが、ｐ３８阻害剤（ＳＢ２０３５８０）の添加は、この効果を逆転させる（図８Ｅ）。４Ｔ０７又は４Ｔ１馴化培地中で培養されたマウス好中球を、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ（ＰＲ３を阻害するため）又はＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＴを消化するため）のいずれかで処理することにより、ＣＴＳＣによって誘導されるＮＥＴ形成がブロックされ（図８Ｆ）、同じ効果が、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ又はＤＮａｓｅ Ｉで更に処理されるＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスにおいて見られる（図８Ｇ）。図８Ｈは、ｒｍＴＳＰ－１は好中球培地中で培養した４Ｔ０７がん細胞のスフェロイド増殖をブロックできないが、ａ－ＩＬ６及び／又はＤＮａｓｅ Ｉの更なる添加は、スフェロイド増殖を様々な程度まで抑制することを示す。

【図9A】ＣＴＳＣの発現を、乳がんの肺転移の臨床試料中の好中球浸潤及びＮＥＴ形成と相関する。図９Ａは、ＣＴＳＣ発現、ＮＥＴの数、及び好中球浸潤が、肺転移試料において、原発腫瘍試料と比較して高いことを実証する。図９Ｂは、ＣＴＳＣ発現レベルが、原発腫瘍及び肺転移の両方におけるＮＥＴ形成及び好中球浸潤と強く相関することを示す。図９Ｃは、循環ＮＥＴレベルが非転移性腫瘍よりも肺転移性腫瘍において高いことを示し、図９Ｄは、原発腫瘍及び肺転移を一緒に考慮した場合、血清ＣＴＳＣ発現レベルが血清中の循環ＮＥＴレベルと強く相関することを示す。図９Ｅは、３つの異なる臨床乳がんサブタイプにおいて、より高いレベルのＣＴＳＣ、ＮＥＴｏｓｉｓ、及び好中球遊走が観察されることを示す。

【図9B】ＣＴＳＣの発現を、乳がんの肺転移の臨床試料中の好中球浸潤及びＮＥＴ形成と相関する。図９Ａは、ＣＴＳＣ発現、ＮＥＴの数、及び好中球浸潤が、肺転移試料において、原発腫瘍試料と比較して高いことを実証する。図９Ｂは、ＣＴＳＣ発現レベルが、原発腫瘍及び肺転移の両方におけるＮＥＴ形成及び好中球浸潤と強く相関することを示す。図９Ｃは、循環ＮＥＴレベルが非転移性腫瘍よりも肺転移性腫瘍において高いことを示し、図９Ｄは、原発腫瘍及び肺転移を一緒に考慮した場合、血清ＣＴＳＣ発現レベルが血清中の循環ＮＥＴレベルと強く相関することを示す。図９Ｅは、３つの異なる臨床乳がんサブタイプにおいて、より高いレベルのＣＴＳＣ、ＮＥＴｏｓｉｓ、及び好中球遊走が観察されることを示す。

【図9C】ＣＴＳＣの発現を、乳がんの肺転移の臨床試料中の好中球浸潤及びＮＥＴ形成と相関する。図９Ａは、ＣＴＳＣ発現、ＮＥＴの数、及び好中球浸潤が、肺転移試料において、原発腫瘍試料と比較して高いことを実証する。図９Ｂは、ＣＴＳＣ発現レベルが、原発腫瘍及び肺転移の両方におけるＮＥＴ形成及び好中球浸潤と強く相関することを示す。図９Ｃは、循環ＮＥＴレベルが非転移性腫瘍よりも肺転移性腫瘍において高いことを示し、図９Ｄは、原発腫瘍及び肺転移を一緒に考慮した場合、血清ＣＴＳＣ発現レベルが血清中の循環ＮＥＴレベルと強く相関することを示す。図９Ｅは、３つの異なる臨床乳がんサブタイプにおいて、より高いレベルのＣＴＳＣ、ＮＥＴｏｓｉｓ、及び好中球遊走が観察されることを示す。

【図9D】ＣＴＳＣの発現を、乳がんの肺転移の臨床試料中の好中球浸潤及びＮＥＴ形成と相関する。図９Ａは、ＣＴＳＣ発現、ＮＥＴの数、及び好中球浸潤が、肺転移試料において、原発腫瘍試料と比較して高いことを実証する。図９Ｂは、ＣＴＳＣ発現レベルが、原発腫瘍及び肺転移の両方におけるＮＥＴ形成及び好中球浸潤と強く相関することを示す。図９Ｃは、循環ＮＥＴレベルが非転移性腫瘍よりも肺転移性腫瘍において高いことを示し、図９Ｄは、原発腫瘍及び肺転移を一緒に考慮した場合、血清ＣＴＳＣ発現レベルが血清中の循環ＮＥＴレベルと強く相関することを示す。図９Ｅは、３つの異なる臨床乳がんサブタイプにおいて、より高いレベルのＣＴＳＣ、ＮＥＴｏｓｉｓ、及び好中球遊走が観察されることを示す。

【図9E】ＣＴＳＣの発現を、乳がんの肺転移の臨床試料中の好中球浸潤及びＮＥＴ形成と相関する。図９Ａは、ＣＴＳＣ発現、ＮＥＴの数、及び好中球浸潤が、肺転移試料において、原発腫瘍試料と比較して高いことを実証する。図９Ｂは、ＣＴＳＣ発現レベルが、原発腫瘍及び肺転移の両方におけるＮＥＴ形成及び好中球浸潤と強く相関することを示す。図９Ｃは、循環ＮＥＴレベルが非転移性腫瘍よりも肺転移性腫瘍において高いことを示し、図９Ｄは、原発腫瘍及び肺転移を一緒に考慮した場合、血清ＣＴＳＣ発現レベルが血清中の循環ＮＥＴレベルと強く相関することを示す。図９Ｅは、３つの異なる臨床乳がんサブタイプにおいて、より高いレベルのＣＴＳＣ、ＮＥＴｏｓｉｓ、及び好中球遊走が観察されることを示す。

【図10A】ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、乳がんの肺転移を阻害することを示す。図１０Ａは、マウス中のＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射してから７日後のブレンソカチブ投与後の腫瘍細胞増殖を観察することによって得られた腫瘍体積対時間を示す。図１０Ｂ～Ｅは、ブレンソカチブ処置が、４Ｔ１細胞を注射したマウスへのブレンソカチブの投与後の肺転移性結節の形成を抑制し（Ｂ）、体重減少を低減し（Ｃ）、生存率を増加させ（Ｄ）、肺病変中の好中球浸潤を低減する（Ｅ）ことを示す。図１０Ｆは、４Ｔ１（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した４Ｔ１乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。同様の効果は、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を同所的に注射し、次いでブレンソカチブで処置したマウスで観察される（図１０Ｇ～Ｊ）。ブレンソカチブ処置はまた、ＩＬ－１ｂの循環レベルの低減をもたらす（図１０Ｋ）。

【図10B】ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、乳がんの肺転移を阻害することを示す。図１０Ａは、マウス中のＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射してから７日後のブレンソカチブ投与後の腫瘍細胞増殖を観察することによって得られた腫瘍体積対時間を示す。図１０Ｂ～Ｅは、ブレンソカチブ処置が、４Ｔ１細胞を注射したマウスへのブレンソカチブの投与後の肺転移性結節の形成を抑制し（Ｂ）、体重減少を低減し（Ｃ）、生存率を増加させ（Ｄ）、肺病変中の好中球浸潤を低減する（Ｅ）ことを示す。図１０Ｆは、４Ｔ１（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した４Ｔ１乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。同様の効果は、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を同所的に注射し、次いでブレンソカチブで処置したマウスで観察される（図１０Ｇ～Ｊ）。ブレンソカチブ処置はまた、ＩＬ－１ｂの循環レベルの低減をもたらす（図１０Ｋ）。

【図10C】ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、乳がんの肺転移を阻害することを示す。図１０Ａは、マウス中のＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射してから７日後のブレンソカチブ投与後の腫瘍細胞増殖を観察することによって得られた腫瘍体積対時間を示す。図１０Ｂ～Ｅは、ブレンソカチブ処置が、４Ｔ１細胞を注射したマウスへのブレンソカチブの投与後の肺転移性結節の形成を抑制し（Ｂ）、体重減少を低減し（Ｃ）、生存率を増加させ（Ｄ）、肺病変中の好中球浸潤を低減する（Ｅ）ことを示す。図１０Ｆは、４Ｔ１（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した４Ｔ１乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。同様の効果は、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を同所的に注射し、次いでブレンソカチブで処置したマウスで観察される（図１０Ｇ～Ｊ）。ブレンソカチブ処置はまた、ＩＬ－１ｂの循環レベルの低減をもたらす（図１０Ｋ）。

【図10D】ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、乳がんの肺転移を阻害することを示す。図１０Ａは、マウス中のＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射してから７日後のブレンソカチブ投与後の腫瘍細胞増殖を観察することによって得られた腫瘍体積対時間を示す。図１０Ｂ～Ｅは、ブレンソカチブ処置が、４Ｔ１細胞を注射したマウスへのブレンソカチブの投与後の肺転移性結節の形成を抑制し（Ｂ）、体重減少を低減し（Ｃ）、生存率を増加させ（Ｄ）、肺病変中の好中球浸潤を低減する（Ｅ）ことを示す。図１０Ｆは、４Ｔ１（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した４Ｔ１乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。同様の効果は、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を同所的に注射し、次いでブレンソカチブで処置したマウスで観察される（図１０Ｇ～Ｊ）。ブレンソカチブ処置はまた、ＩＬ－１ｂの循環レベルの低減をもたらす（図１０Ｋ）。

【図10E】ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、乳がんの肺転移を阻害することを示す。図１０Ａは、マウス中のＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射してから７日後のブレンソカチブ投与後の腫瘍細胞増殖を観察することによって得られた腫瘍体積対時間を示す。図１０Ｂ～Ｅは、ブレンソカチブ処置が、４Ｔ１細胞を注射したマウスへのブレンソカチブの投与後の肺転移性結節の形成を抑制し（Ｂ）、体重減少を低減し（Ｃ）、生存率を増加させ（Ｄ）、肺病変中の好中球浸潤を低減する（Ｅ）ことを示す。図１０Ｆは、４Ｔ１（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した４Ｔ１乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。同様の効果は、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を同所的に注射し、次いでブレンソカチブで処置したマウスで観察される（図１０Ｇ～Ｊ）。ブレンソカチブ処置はまた、ＩＬ－１ｂの循環レベルの低減をもたらす（図１０Ｋ）。

【図10F】ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、乳がんの肺転移を阻害することを示す。図１０Ａは、マウス中のＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射してから７日後のブレンソカチブ投与後の腫瘍細胞増殖を観察することによって得られた腫瘍体積対時間を示す。図１０Ｂ～Ｅは、ブレンソカチブ処置が、４Ｔ１細胞を注射したマウスへのブレンソカチブの投与後の肺転移性結節の形成を抑制し（Ｂ）、体重減少を低減し（Ｃ）、生存率を増加させ（Ｄ）、肺病変中の好中球浸潤を低減する（Ｅ）ことを示す。図１０Ｆは、４Ｔ１（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した４Ｔ１乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。同様の効果は、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を同所的に注射し、次いでブレンソカチブで処置したマウスで観察される（図１０Ｇ～Ｊ）。ブレンソカチブ処置はまた、ＩＬ－１ｂの循環レベルの低減をもたらす（図１０Ｋ）。

【図10G】ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、乳がんの肺転移を阻害することを示す。図１０Ａは、マウス中のＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射してから７日後のブレンソカチブ投与後の腫瘍細胞増殖を観察することによって得られた腫瘍体積対時間を示す。図１０Ｂ～Ｅは、ブレンソカチブ処置が、４Ｔ１細胞を注射したマウスへのブレンソカチブの投与後の肺転移性結節の形成を抑制し（Ｂ）、体重減少を低減し（Ｃ）、生存率を増加させ（Ｄ）、肺病変中の好中球浸潤を低減する（Ｅ）ことを示す。図１０Ｆは、４Ｔ１（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した４Ｔ１乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。同様の効果は、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を同所的に注射し、次いでブレンソカチブで処置したマウスで観察される（図１０Ｇ～Ｊ）。ブレンソカチブ処置はまた、ＩＬ－１ｂの循環レベルの低減をもたらす（図１０Ｋ）。

【図10H】ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、乳がんの肺転移を阻害することを示す。図１０Ａは、マウス中のＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射してから７日後のブレンソカチブ投与後の腫瘍細胞増殖を観察することによって得られた腫瘍体積対時間を示す。図１０Ｂ～Ｅは、ブレンソカチブ処置が、４Ｔ１細胞を注射したマウスへのブレンソカチブの投与後の肺転移性結節の形成を抑制し（Ｂ）、体重減少を低減し（Ｃ）、生存率を増加させ（Ｄ）、肺病変中の好中球浸潤を低減する（Ｅ）ことを示す。図１０Ｆは、４Ｔ１（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した４Ｔ１乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。同様の効果は、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を同所的に注射し、次いでブレンソカチブで処置したマウスで観察される（図１０Ｇ～Ｊ）。ブレンソカチブ処置はまた、ＩＬ－１ｂの循環レベルの低減をもたらす（図１０Ｋ）。

【図10I】ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、乳がんの肺転移を阻害することを示す。図１０Ａは、マウス中のＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射してから７日後のブレンソカチブ投与後の腫瘍細胞増殖を観察することによって得られた腫瘍体積対時間を示す。図１０Ｂ～Ｅは、ブレンソカチブ処置が、４Ｔ１細胞を注射したマウスへのブレンソカチブの投与後の肺転移性結節の形成を抑制し（Ｂ）、体重減少を低減し（Ｃ）、生存率を増加させ（Ｄ）、肺病変中の好中球浸潤を低減する（Ｅ）ことを示す。図１０Ｆは、４Ｔ１（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した４Ｔ１乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。同様の効果は、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を同所的に注射し、次いでブレンソカチブで処置したマウスで観察される（図１０Ｇ～Ｊ）。ブレンソカチブ処置はまた、ＩＬ－１ｂの循環レベルの低減をもたらす（図１０Ｋ）。

【図10J】ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、乳がんの肺転移を阻害することを示す。図１０Ａは、マウス中のＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射してから７日後のブレンソカチブ投与後の腫瘍細胞増殖を観察することによって得られた腫瘍体積対時間を示す。図１０Ｂ～Ｅは、ブレンソカチブ処置が、４Ｔ１細胞を注射したマウスへのブレンソカチブの投与後の肺転移性結節の形成を抑制し（Ｂ）、体重減少を低減し（Ｃ）、生存率を増加させ（Ｄ）、肺病変中の好中球浸潤を低減する（Ｅ）ことを示す。図１０Ｆは、４Ｔ１（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した４Ｔ１乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。同様の効果は、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を同所的に注射し、次いでブレンソカチブで処置したマウスで観察される（図１０Ｇ～Ｊ）。ブレンソカチブ処置はまた、ＩＬ－１ｂの循環レベルの低減をもたらす（図１０Ｋ）。

【図10K】ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、乳がんの肺転移を阻害することを示す。図１０Ａは、マウス中のＣＴＳＣ低減４Ｔ１細胞を注射してから７日後のブレンソカチブ投与後の腫瘍細胞増殖を観察することによって得られた腫瘍体積対時間を示す。図１０Ｂ～Ｅは、ブレンソカチブ処置が、４Ｔ１細胞を注射したマウスへのブレンソカチブの投与後の肺転移性結節の形成を抑制し（Ｂ）、体重減少を低減し（Ｃ）、生存率を増加させ（Ｄ）、肺病変中の好中球浸潤を低減する（Ｅ）ことを示す。図１０Ｆは、４Ｔ１（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した４Ｔ１乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。同様の効果は、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を同所的に注射し、次いでブレンソカチブで処置したマウスで観察される（図１０Ｇ～Ｊ）。ブレンソカチブ処置はまた、ＩＬ－１ｂの循環レベルの低減をもたらす（図１０Ｋ）。

【図11A】様々な転移性がん細胞による好中球動員、ＮＥＴｏｓｉｓ誘導、及び腫瘍様塊形成を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１１Ａは、弱い（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、略して２３１）、中程度（ＳＰ１６）、及び強い（ＳＰ１６Ｌ）肝転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｂは、弱い又は強い骨転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｃは、弱い又は強い骨転移性肺がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｄは、肺転移性乳がん細胞ＬＭ２－４１７５にブレンソカチブを投与した後のＮＥＴ分子マーカー（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯ）、（シトルリン化ヒストンＨ３（Ｃｉ－Ｈ３））での免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｅは、ＳＣＰ２馴化培地（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理された好中球培地中で培養された骨転移性ＳＣＰ２乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｆは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｇは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｈは、ＳＣＰ１６（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した肝転移性（ＳＣＰ１６）乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｉは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｊは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｋ～Ｐは、がん細胞のＣＭ（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理した好中球培地中で培養した、結腸がん細胞ＳＷ４８０（Ｋ）、肺がん細胞Ａ５４９（Ｌ）、胃がん細胞ＡＧＳ（Ｍ）、肝細胞がん細胞ＨＵＨ７（Ｎ）及び膵がん細胞ＫＰ４（Ｏ）の腫瘍様塊形成を示す。

【図11B】様々な転移性がん細胞による好中球動員、ＮＥＴｏｓｉｓ誘導、及び腫瘍様塊形成を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１１Ａは、弱い（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、略して２３１）、中程度（ＳＰ１６）、及び強い（ＳＰ１６Ｌ）肝転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｂは、弱い又は強い骨転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｃは、弱い又は強い骨転移性肺がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｄは、肺転移性乳がん細胞ＬＭ２－４１７５にブレンソカチブを投与した後のＮＥＴ分子マーカー（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯ）、（シトルリン化ヒストンＨ３（Ｃｉ－Ｈ３））での免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｅは、ＳＣＰ２馴化培地（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理された好中球培地中で培養された骨転移性ＳＣＰ２乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｆは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｇは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｈは、ＳＣＰ１６（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した肝転移性（ＳＣＰ１６）乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｉは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｊは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｋ～Ｐは、がん細胞のＣＭ（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理した好中球培地中で培養した、結腸がん細胞ＳＷ４８０（Ｋ）、肺がん細胞Ａ５４９（Ｌ）、胃がん細胞ＡＧＳ（Ｍ）、肝細胞がん細胞ＨＵＨ７（Ｎ）及び膵がん細胞ＫＰ４（Ｏ）の腫瘍様塊形成を示す。

【図11C】様々な転移性がん細胞による好中球動員、ＮＥＴｏｓｉｓ誘導、及び腫瘍様塊形成を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１１Ａは、弱い（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、略して２３１）、中程度（ＳＰ１６）、及び強い（ＳＰ１６Ｌ）肝転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｂは、弱い又は強い骨転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｃは、弱い又は強い骨転移性肺がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｄは、肺転移性乳がん細胞ＬＭ２－４１７５にブレンソカチブを投与した後のＮＥＴ分子マーカー（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯ）、（シトルリン化ヒストンＨ３（Ｃｉ－Ｈ３））での免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｅは、ＳＣＰ２馴化培地（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理された好中球培地中で培養された骨転移性ＳＣＰ２乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｆは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｇは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｈは、ＳＣＰ１６（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した肝転移性（ＳＣＰ１６）乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｉは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｊは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｋ～Ｐは、がん細胞のＣＭ（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理した好中球培地中で培養した、結腸がん細胞ＳＷ４８０（Ｋ）、肺がん細胞Ａ５４９（Ｌ）、胃がん細胞ＡＧＳ（Ｍ）、肝細胞がん細胞ＨＵＨ７（Ｎ）及び膵がん細胞ＫＰ４（Ｏ）の腫瘍様塊形成を示す。

【図11D】様々な転移性がん細胞による好中球動員、ＮＥＴｏｓｉｓ誘導、及び腫瘍様塊形成を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１１Ａは、弱い（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、略して２３１）、中程度（ＳＰ１６）、及び強い（ＳＰ１６Ｌ）肝転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｂは、弱い又は強い骨転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｃは、弱い又は強い骨転移性肺がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｄは、肺転移性乳がん細胞ＬＭ２－４１７５にブレンソカチブを投与した後のＮＥＴ分子マーカー（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯ）、（シトルリン化ヒストンＨ３（Ｃｉ－Ｈ３））での免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｅは、ＳＣＰ２馴化培地（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理された好中球培地中で培養された骨転移性ＳＣＰ２乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｆは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｇは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｈは、ＳＣＰ１６（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した肝転移性（ＳＣＰ１６）乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｉは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｊは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｋ～Ｐは、がん細胞のＣＭ（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理した好中球培地中で培養した、結腸がん細胞ＳＷ４８０（Ｋ）、肺がん細胞Ａ５４９（Ｌ）、胃がん細胞ＡＧＳ（Ｍ）、肝細胞がん細胞ＨＵＨ７（Ｎ）及び膵がん細胞ＫＰ４（Ｏ）の腫瘍様塊形成を示す。

【図11E】様々な転移性がん細胞による好中球動員、ＮＥＴｏｓｉｓ誘導、及び腫瘍様塊形成を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１１Ａは、弱い（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、略して２３１）、中程度（ＳＰ１６）、及び強い（ＳＰ１６Ｌ）肝転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｂは、弱い又は強い骨転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｃは、弱い又は強い骨転移性肺がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｄは、肺転移性乳がん細胞ＬＭ２－４１７５にブレンソカチブを投与した後のＮＥＴ分子マーカー（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯ）、（シトルリン化ヒストンＨ３（Ｃｉ－Ｈ３））での免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｅは、ＳＣＰ２馴化培地（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理された好中球培地中で培養された骨転移性ＳＣＰ２乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｆは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｇは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｈは、ＳＣＰ１６（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した肝転移性（ＳＣＰ１６）乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｉは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｊは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｋ～Ｐは、がん細胞のＣＭ（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理した好中球培地中で培養した、結腸がん細胞ＳＷ４８０（Ｋ）、肺がん細胞Ａ５４９（Ｌ）、胃がん細胞ＡＧＳ（Ｍ）、肝細胞がん細胞ＨＵＨ７（Ｎ）及び膵がん細胞ＫＰ４（Ｏ）の腫瘍様塊形成を示す。

【図11F】様々な転移性がん細胞による好中球動員、ＮＥＴｏｓｉｓ誘導、及び腫瘍様塊形成を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１１Ａは、弱い（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、略して２３１）、中程度（ＳＰ１６）、及び強い（ＳＰ１６Ｌ）肝転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｂは、弱い又は強い骨転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｃは、弱い又は強い骨転移性肺がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｄは、肺転移性乳がん細胞ＬＭ２－４１７５にブレンソカチブを投与した後のＮＥＴ分子マーカー（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯ）、（シトルリン化ヒストンＨ３（Ｃｉ－Ｈ３））での免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｅは、ＳＣＰ２馴化培地（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理された好中球培地中で培養された骨転移性ＳＣＰ２乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｆは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｇは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｈは、ＳＣＰ１６（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した肝転移性（ＳＣＰ１６）乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｉは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｊは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｋ～Ｐは、がん細胞のＣＭ（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理した好中球培地中で培養した、結腸がん細胞ＳＷ４８０（Ｋ）、肺がん細胞Ａ５４９（Ｌ）、胃がん細胞ＡＧＳ（Ｍ）、肝細胞がん細胞ＨＵＨ７（Ｎ）及び膵がん細胞ＫＰ４（Ｏ）の腫瘍様塊形成を示す。

【図11G】様々な転移性がん細胞による好中球動員、ＮＥＴｏｓｉｓ誘導、及び腫瘍様塊形成を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１１Ａは、弱い（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、略して２３１）、中程度（ＳＰ１６）、及び強い（ＳＰ１６Ｌ）肝転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｂは、弱い又は強い骨転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｃは、弱い又は強い骨転移性肺がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｄは、肺転移性乳がん細胞ＬＭ２－４１７５にブレンソカチブを投与した後のＮＥＴ分子マーカー（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯ）、（シトルリン化ヒストンＨ３（Ｃｉ－Ｈ３））での免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｅは、ＳＣＰ２馴化培地（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理された好中球培地中で培養された骨転移性ＳＣＰ２乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｆは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｇは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｈは、ＳＣＰ１６（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した肝転移性（ＳＣＰ１６）乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｉは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｊは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｋ～Ｐは、がん細胞のＣＭ（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理した好中球培地中で培養した、結腸がん細胞ＳＷ４８０（Ｋ）、肺がん細胞Ａ５４９（Ｌ）、胃がん細胞ＡＧＳ（Ｍ）、肝細胞がん細胞ＨＵＨ７（Ｎ）及び膵がん細胞ＫＰ４（Ｏ）の腫瘍様塊形成を示す。

【図11H】様々な転移性がん細胞による好中球動員、ＮＥＴｏｓｉｓ誘導、及び腫瘍様塊形成を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１１Ａは、弱い（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、略して２３１）、中程度（ＳＰ１６）、及び強い（ＳＰ１６Ｌ）肝転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｂは、弱い又は強い骨転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｃは、弱い又は強い骨転移性肺がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｄは、肺転移性乳がん細胞ＬＭ２－４１７５にブレンソカチブを投与した後のＮＥＴ分子マーカー（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯ）、（シトルリン化ヒストンＨ３（Ｃｉ－Ｈ３））での免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｅは、ＳＣＰ２馴化培地（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理された好中球培地中で培養された骨転移性ＳＣＰ２乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｆは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｇは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｈは、ＳＣＰ１６（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した肝転移性（ＳＣＰ１６）乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｉは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｊは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｋ～Ｐは、がん細胞のＣＭ（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理した好中球培地中で培養した、結腸がん細胞ＳＷ４８０（Ｋ）、肺がん細胞Ａ５４９（Ｌ）、胃がん細胞ＡＧＳ（Ｍ）、肝細胞がん細胞ＨＵＨ７（Ｎ）及び膵がん細胞ＫＰ４（Ｏ）の腫瘍様塊形成を示す。

【図11I】様々な転移性がん細胞による好中球動員、ＮＥＴｏｓｉｓ誘導、及び腫瘍様塊形成を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１１Ａは、弱い（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、略して２３１）、中程度（ＳＰ１６）、及び強い（ＳＰ１６Ｌ）肝転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｂは、弱い又は強い骨転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｃは、弱い又は強い骨転移性肺がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｄは、肺転移性乳がん細胞ＬＭ２－４１７５にブレンソカチブを投与した後のＮＥＴ分子マーカー（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯ）、（シトルリン化ヒストンＨ３（Ｃｉ－Ｈ３））での免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｅは、ＳＣＰ２馴化培地（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理された好中球培地中で培養された骨転移性ＳＣＰ２乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｆは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｇは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｈは、ＳＣＰ１６（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した肝転移性（ＳＣＰ１６）乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｉは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｊは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｋ～Ｐは、がん細胞のＣＭ（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理した好中球培地中で培養した、結腸がん細胞ＳＷ４８０（Ｋ）、肺がん細胞Ａ５４９（Ｌ）、胃がん細胞ＡＧＳ（Ｍ）、肝細胞がん細胞ＨＵＨ７（Ｎ）及び膵がん細胞ＫＰ４（Ｏ）の腫瘍様塊形成を示す。

【図11J】様々な転移性がん細胞による好中球動員、ＮＥＴｏｓｉｓ誘導、及び腫瘍様塊形成を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１１Ａは、弱い（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、略して２３１）、中程度（ＳＰ１６）、及び強い（ＳＰ１６Ｌ）肝転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｂは、弱い又は強い骨転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｃは、弱い又は強い骨転移性肺がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｄは、肺転移性乳がん細胞ＬＭ２－４１７５にブレンソカチブを投与した後のＮＥＴ分子マーカー（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯ）、（シトルリン化ヒストンＨ３（Ｃｉ－Ｈ３））での免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｅは、ＳＣＰ２馴化培地（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理された好中球培地中で培養された骨転移性ＳＣＰ２乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｆは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｇは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｈは、ＳＣＰ１６（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した肝転移性（ＳＣＰ１６）乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｉは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｊは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｋ～Ｐは、がん細胞のＣＭ（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理した好中球培地中で培養した、結腸がん細胞ＳＷ４８０（Ｋ）、肺がん細胞Ａ５４９（Ｌ）、胃がん細胞ＡＧＳ（Ｍ）、肝細胞がん細胞ＨＵＨ７（Ｎ）及び膵がん細胞ＫＰ４（Ｏ）の腫瘍様塊形成を示す。

【図11K】様々な転移性がん細胞による好中球動員、ＮＥＴｏｓｉｓ誘導、及び腫瘍様塊形成を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１１Ａは、弱い（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、略して２３１）、中程度（ＳＰ１６）、及び強い（ＳＰ１６Ｌ）肝転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｂは、弱い又は強い骨転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｃは、弱い又は強い骨転移性肺がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｄは、肺転移性乳がん細胞ＬＭ２－４１７５にブレンソカチブを投与した後のＮＥＴ分子マーカー（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯ）、（シトルリン化ヒストンＨ３（Ｃｉ－Ｈ３））での免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｅは、ＳＣＰ２馴化培地（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理された好中球培地中で培養された骨転移性ＳＣＰ２乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｆは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｇは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｈは、ＳＣＰ１６（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した肝転移性（ＳＣＰ１６）乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｉは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｊは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｋ～Ｐは、がん細胞のＣＭ（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理した好中球培地中で培養した、結腸がん細胞ＳＷ４８０（Ｋ）、肺がん細胞Ａ５４９（Ｌ）、胃がん細胞ＡＧＳ（Ｍ）、肝細胞がん細胞ＨＵＨ７（Ｎ）及び膵がん細胞ＫＰ４（Ｏ）の腫瘍様塊形成を示す。

【図11L】様々な転移性がん細胞による好中球動員、ＮＥＴｏｓｉｓ誘導、及び腫瘍様塊形成を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１１Ａは、弱い（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、略して２３１）、中程度（ＳＰ１６）、及び強い（ＳＰ１６Ｌ）肝転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｂは、弱い又は強い骨転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｃは、弱い又は強い骨転移性肺がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｄは、肺転移性乳がん細胞ＬＭ２－４１７５にブレンソカチブを投与した後のＮＥＴ分子マーカー（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯ）、（シトルリン化ヒストンＨ３（Ｃｉ－Ｈ３））での免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｅは、ＳＣＰ２馴化培地（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理された好中球培地中で培養された骨転移性ＳＣＰ２乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｆは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｇは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｈは、ＳＣＰ１６（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した肝転移性（ＳＣＰ１６）乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｉは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｊは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｋ～Ｐは、がん細胞のＣＭ（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理した好中球培地中で培養した、結腸がん細胞ＳＷ４８０（Ｋ）、肺がん細胞Ａ５４９（Ｌ）、胃がん細胞ＡＧＳ（Ｍ）、肝細胞がん細胞ＨＵＨ７（Ｎ）及び膵がん細胞ＫＰ４（Ｏ）の腫瘍様塊形成を示す。

【図11M】様々な転移性がん細胞による好中球動員、ＮＥＴｏｓｉｓ誘導、及び腫瘍様塊形成を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１１Ａは、弱い（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、略して２３１）、中程度（ＳＰ１６）、及び強い（ＳＰ１６Ｌ）肝転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｂは、弱い又は強い骨転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｃは、弱い又は強い骨転移性肺がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｄは、肺転移性乳がん細胞ＬＭ２－４１７５にブレンソカチブを投与した後のＮＥＴ分子マーカー（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯ）、（シトルリン化ヒストンＨ３（Ｃｉ－Ｈ３））での免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｅは、ＳＣＰ２馴化培地（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理された好中球培地中で培養された骨転移性ＳＣＰ２乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｆは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｇは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｈは、ＳＣＰ１６（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した肝転移性（ＳＣＰ１６）乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｉは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｊは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｋ～Ｐは、がん細胞のＣＭ（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理した好中球培地中で培養した、結腸がん細胞ＳＷ４８０（Ｋ）、肺がん細胞Ａ５４９（Ｌ）、胃がん細胞ＡＧＳ（Ｍ）、肝細胞がん細胞ＨＵＨ７（Ｎ）及び膵がん細胞ＫＰ４（Ｏ）の腫瘍様塊形成を示す。

【図11N】様々な転移性がん細胞による好中球動員、ＮＥＴｏｓｉｓ誘導、及び腫瘍様塊形成を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１１Ａは、弱い（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、略して２３１）、中程度（ＳＰ１６）、及び強い（ＳＰ１６Ｌ）肝転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｂは、弱い又は強い骨転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｃは、弱い又は強い骨転移性肺がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｄは、肺転移性乳がん細胞ＬＭ２－４１７５にブレンソカチブを投与した後のＮＥＴ分子マーカー（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯ）、（シトルリン化ヒストンＨ３（Ｃｉ－Ｈ３））での免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｅは、ＳＣＰ２馴化培地（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理された好中球培地中で培養された骨転移性ＳＣＰ２乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｆは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｇは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｈは、ＳＣＰ１６（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した肝転移性（ＳＣＰ１６）乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｉは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｊは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｋ～Ｐは、がん細胞のＣＭ（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理した好中球培地中で培養した、結腸がん細胞ＳＷ４８０（Ｋ）、肺がん細胞Ａ５４９（Ｌ）、胃がん細胞ＡＧＳ（Ｍ）、肝細胞がん細胞ＨＵＨ７（Ｎ）及び膵がん細胞ＫＰ４（Ｏ）の腫瘍様塊形成を示す。

【図11O】様々な転移性がん細胞による好中球動員、ＮＥＴｏｓｉｓ誘導、及び腫瘍様塊形成を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１１Ａは、弱い（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、略して２３１）、中程度（ＳＰ１６）、及び強い（ＳＰ１６Ｌ）肝転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｂは、弱い又は強い骨転移性乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｃは、弱い又は強い骨転移性肺がん細胞におけるＣＴＳＣ発現レベルを示す。図１１Ｄは、肺転移性乳がん細胞ＬＭ２－４１７５にブレンソカチブを投与した後のＮＥＴ分子マーカー（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯ）、（シトルリン化ヒストンＨ３（Ｃｉ－Ｈ３））での免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｅは、ＳＣＰ２馴化培地（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理された好中球培地中で培養された骨転移性ＳＣＰ２乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｆは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｇは、異なる肝転移性乳がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｈは、ＳＣＰ１６（ＣＭ）のＣＭ、又はブレンソカチブで前処理した好中球培地中で培養した肝転移性（ＳＣＰ１６）乳がん細胞の腫瘍様塊形成を示す。図１１Ｉは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後の免疫蛍光染色によって観察されるように、がん細胞馴化培地による刺激下での好中球におけるＮＥＴの形成を示す。図１１Ｊは、異なる骨転移性肺がん細胞にブレンソカチブを投与した後のがん細胞馴化培地における好中球動員を分析したものである。図１１Ｋ～Ｐは、がん細胞のＣＭ（ＣＭ）、又はブレンソカチブ（Ｂｒｅｎ）で前処理した好中球培地中で培養した、結腸がん細胞ＳＷ４８０（Ｋ）、肺がん細胞Ａ５４９（Ｌ）、胃がん細胞ＡＧＳ（Ｍ）、肝細胞がん細胞ＨＵＨ７（Ｎ）及び膵がん細胞ＫＰ４（Ｏ）の腫瘍様塊形成を示す。

【図12A】肝臓原発腫瘍及び転移を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１２Ａ～Ｂは、ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、肝臓がん細胞ＨＵＨ７の原発腫瘍増殖（Ａ）及び肝臓表面結節の形成（Ｂ）を抑制することを示す。図１２Ｃは、ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、膵がん細胞ＫＰ４の肝転移を抑制することを示す。

【図12B】肝臓原発腫瘍及び転移を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１２Ａ～Ｂは、ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、肝臓がん細胞ＨＵＨ７の原発腫瘍増殖（Ａ）及び肝臓表面結節の形成（Ｂ）を抑制することを示す。図１２Ｃは、ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、膵がん細胞ＫＰ４の肝転移を抑制することを示す。

【図12C】肝臓原発腫瘍及び転移を阻害するブレンソカチブの能力を示す。図１２Ａ～Ｂは、ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、肝臓がん細胞ＨＵＨ７の原発腫瘍増殖（Ａ）及び肝臓表面結節の形成（Ｂ）を抑制することを示す。図１２Ｃは、ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、膵がん細胞ＫＰ４の肝転移を抑制することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本開示は、ＣＴＳＣが乳がんの転移を促進するという所見に部分的に基づいている。追加的に、本開示は、転移性微小環境における好中球浸潤及び／又はＮＥＴの形成を制御することによって、ＣＴＳＣが、乳がん細胞上での肺転移及び肝転移の発生を促進し、腫瘍転移の治療のためのＣＴＳＣの薬学的阻害剤の同定を促すことを実証する。理論によって拘束されることを望むものではないが、ＣＴＳＣ、好中球浸潤、及びＮＥＴの形成を阻害することによって、ＣＴＳＣ阻害剤は、がんの腫瘍微小環境を制御して、他の器官における転移を遅らせるか、低減するか、又は阻害する。

【0026】

したがって、本発明の一態様では、治療を必要とする患者においてがんの転移を治療するための方法が提供される。方法は、有効量のＣＴＳＣ阻害剤を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。治療は、転移の進行を阻害、遅延、又は逆転させ、例えば、転移性増殖のサイズを減少させる。

【0027】

本発明の別の態様では、治療を必要とする患者において原発がんを治療するための方法が提供される。方法は、有効量のＣＴＳＣ阻害剤を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。治療は、原発がんの進行を阻害、遅延、又は逆転させ、例えば、原発腫瘍増殖のサイズを減少させる。

【0028】

本明細書で使用される場合、「がん」は、異常な細胞増殖によって引き起こされる任意の悪性及び／又は浸潤性増殖又は腫瘍を指す。がんには、それらを形成する細胞のタイプにちなんで名付けられた固形腫瘍、血液がん、骨髄がん、又はリンパ系が含まれる。固形腫瘍の例としては、肉腫及びがん腫が挙げられる。がんにはまた、体内の特定の部位に由来する原発がん、それが始まった場所から体の他の部分に広がった転移性がん、寛解後の元の原発がんからの再発、及び後者とは異なるタイプの以前のがんの病歴を有するヒトの新しい原発がんである二次原発がんも含まれる。「原発がん」又は「原発腫瘍」は、本明細書で使用される場合、対象又は患者における元の又は第１のがん又は腫瘍を指す。

【0029】

本明細書で使用される場合、「転移」という用語は、転移が一次増殖からのがん細胞を含む、がんの原発部位から離れて位置する異なる部位又は二次部位での悪性増殖を指す。例えば、「肺転移」は、他の場所、すなわち原発がんからの肺内の二次がん／腫瘍を指す。「がんの転移」及び「がん転移」は、本明細書では交換可能に使用され、原発がん部位から離れた二次がんの増殖を指す。

【0030】

本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、遺伝子又は遺伝子の一部からのｍＲＮＡの産生を含み、ＲＮＡ又は遺伝子又は遺伝子の一部によってコードされるタンパク質の産生を含み、発現に関連する検出物質の出現を含む。例えば、ｃＤＮＡ、遺伝子又は他のオリゴヌクレオチド、タンパク質又はタンパク質断片との結合リガンド（例えば抗体）の結合、及び結合リガンドの発色性部分は全て、「発現」という用語の範囲内である。したがって、免疫ブロット、例えば、ウェスタンブロットのブロット密度の増加もまた、生物学的分子に基づく用語「発現」の範囲内である。

【0031】

本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要又は十分な投薬量及び期間での有効な量を指す。

【0032】

本明細書で使用される場合、「治療すること」という用語は、患者が疾患の症状（例えば、腫瘍増殖及び／若しくは転移、又は免疫細胞の数及び／若しくは活性によって媒介される他の効果など）を経験する頻度を減少させることを意味する。この用語は、疾患の症状、合併症、若しくは生化学的指標の発症を予防若しくは遅延させる、症状を緩和する、又は疾患、状態、若しくは障害の更なる発達を停止若しくは阻害するために、本発明の化合物又は薬剤を投与することを含む。治療は、予防的（疾患の発症を予防若しくは遅延させるか、又はその臨床的若しくは亜臨床的症状の発現を予防する）、又は疾患の発現後の症状の治療的抑制若しくは緩和であってもよい。

【0033】

本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、ヒト又は動物の対象を示す。好ましい実施形態では、患者は、ヒトである。

【0034】

「薬学的に許容される」という用語は、別段の記載がない限り、部分（例えば、塩、剤形、又は賦形剤）を、健全な医学的判断に従って使用するのに適切であると特徴付けるために使用される。一般に、薬学的に許容される部分は、その部分が有し得る有害な効果を上回る１つ以上の利点を有する。有害な効果としては、例えば、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、並びに他の問題及び合併症が挙げられ得る。

【0035】

本明細書で使用される場合、「Ｃ_１～３」は、１、２、又は３個の炭素原子を有する炭素基を意味する。

【0036】

「アルキル」という用語は、別段の記載がない限り、直鎖及び分岐鎖の両方のアルキル基を含み、置換されていても非置換であってもよい。「アルキル」基としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ブチル、ペンチルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0037】

「及び／又は」という用語は、２つ以上の項目の列挙で使用される場合、列挙された項目のうちのいずれか１つが、それ自体で、又は列挙された項目のうちのいずれか１つ以上と組み合わせて使用され得ることを意味する。例えば、「Ａ及び／又はＢ」という表現は、Ａ及びＢのいずれか又は両方、すなわち、Ａ単独、Ｂ単独、又はＡ及びＢの組み合わせを意味することを意図している。「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」という表現は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢとの組み合わせ、ＡとＣとの組み合わせ、ＢとＣとの組み合わせ、又はＡと、Ｂと、Ｃとの組み合わせを意味することを意図している。

【0038】

本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数及び単数形の用語は、例えば、内容によって別段に明確に示されない限り、複数の指示物を含む。

【0039】

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値が、本開示に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲に独立して含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界に従って、これらも本開示に包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか両方を除外する範囲も本開示に含まれる。「含む」という語句が使用されるときはいつでも、「から本質的になる」及び「からなる」などの変形も企図される。

【0040】

原発がん又はがんの転移を治療するための方法であって、部分的に、有効量のＣＴＳＣ阻害剤を含む医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む方法が、本明細書に提供される。治療は、原発がん又は転移の進行を阻害、遅延、又は逆転させ、例えば、原発腫瘍又は転移性増殖のサイズを減少させる。ジペプチジルペプチダーゼ１（ＤＰＰ１）としても知られるＣＴＳＣは、プロテアーゼであり、その遺伝子配列は染色体１１ｑ１４．１～ｑ１４．３に位置する。

【0041】

ＣＴＳＣは、免疫細胞において発現されるセリン活性化に重要であることが報告されている。例えば、ＣＴＳＣは、肥満細胞中の好中球、キマーゼ及びトリプターゼαＩＩ／βＩＩ／γ、並びにリンパ球中のグランザイムＡ／Ｂにおいて、好中球エラスターゼ（ＮＥ）、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）、カテプシンＧ（ＣＴＳＧ）、及び好中球セリンプロテアーゼ４（ＮＳＰ４）を活性化することができる。

【0042】

ＣＴＳＣによる好中球のＮＥ、ＰＲ３、ＣＴＳＧ、及びＮＳＰ４の活性化を例にとると、リソソーム又はゴルジ装置によって位置付けられたＣＴＳＣは、Ｎ末端で２つのアミノ酸を除去することによって好中球のＮＥ、ＰＲ３、及びＣＴＳＧの３つのセリンプロテアーゼを活性化し、それにより炎症反応を制御する役割を果たす。好中球成熟プロセスの初期段階、すなわち、形態における骨髄芽細胞及びプロ骨髄球の段階では、ＮＳＰは、プロエンザイムの形態で瞬時に発現され、好中球セリンプロテアーゼ（ＮＥ、ＰＲ３、ＣＴＳＧ、及びＮＳＰ４）のプロエンザイムのＮ末端に含まれる独自の酵素活性をブロックするジペプチドは、ゴルジ装置輸送プロセス中、又は一次顆粒（アズロフィル顆粒）内で、ＣＴＳＣによって切断され、次いで、活性形態で一次顆粒に格納される。しかしながら、ＰＲ３が不活性状態で細胞膜上で構成的に発現されることを報告している文献もある。

【0043】

ＣＴＳＣは、好中球が正常な免疫機能を有するために重要な役割を果たすが、転移性がんにおけるＣＴＳＣの役割は完全には解明されていない。本開示では、病変部位における好中球浸潤を改善し、ＮＥＴの数を増加させることにより、ＣＴＳＣは、腫瘍微小環境を改善し、乳がんの肺転移を促進することが見出されている。したがって、本発明の一態様は、治療を必要とする患者のがんの転移を治療するための方法であって、有効量のＣＴＳＣ阻害剤を含む医薬組成物を患者に投与することを含む方法に関する。治療は、転移の進行を阻害するか、遅延させるか、又は逆転させる。

【0044】

一実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤は、以下の表１又は表２に示されるＣＴＳＣ阻害剤の１つである。

【表1】

【表2】

【0045】

本明細書に提供される方法で使用するための他のＣＴＳＣ阻害剤は、米国特許第８，８８９，７０８号、米国特許第８，９８７，２４９号、及び米国特許第９，０７３，８６９号、並びに国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／１１９９４１号、国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／０３２９４５号、国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／０３２９４３号、及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／０３２９４２号に開示されており、それぞれの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法における使用に適した他のＣＴＳＣ阻害剤は、米国特許第８，９９９，９７５号、米国特許第９，４４０，９６０号、米国特許第９，７１３，６０６号、米国特許第９，８５６，２２８号、米国特許第９，８７９，０２６号、ＲＥ４７，６３６Ｅ、米国特許第１０，２３８，６３３号、Ｂｏｎｄｅｂｊｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ ｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｉ （ｈＤＰＰＩ），”Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１３：４００８－４４２４（２００５）、及びＢｏｎｄｅｂｊｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｎｉｔｒｉｌｅｓ ａｓ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ １ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，”Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．１６：３６１４－３６１７（２００６）に開示されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0046】

本明細書に提供される原発がん又はがんの転移を治療するための方法のいくつかの実施形態では、方法は、治療を必要とする患者に、治療期間にわたって、有効量の式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を投与することを含む。

【化6】

式中、
Ｒ^１は、

【化7】

であり、
Ｒ^２は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ_２Ｃ_１－３アルキル、又はＣ_１－３アルキルであり、
Ｒ^３は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＳＯ_２Ｃ_１－_３アルキル、ＣＯＮＨ_２、又はＳＯ_２ＮＲ^４Ｒ^５であり、
Ｒ^４及びＲ^５は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、又はピペリジン環を形成し、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＣＦ_２であり、
Ｙは、Ｏ又はＳであり、
Ｑは、ＣＨ又はＮであり、
Ｒ^６は、Ｃ_１－３アルキルであり、Ｃ_１－３アルキルは、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦによって置換され、任意選択で、ＯＨ、ＯＣ_１－３アルキル、Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２、シクロプロピル、又はテトラヒドロピランから選択される１つの置換基によって置換され、
Ｒ^７は、水素、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＨ_３であり、
治療は、原発がんの進行を阻害するか、遅延させるか、若しくは逆転させるか、又は進行転移を阻害するか、遅延させるか、若しくは逆転させる。

【0047】

更なる実施形態では、方法は、がんの転移を治療する方法である。

【0048】

一実施形態では、有効量の式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物が患者に投与され、式中、Ｒ^１は、

【化8】

であり、Ｒ^２は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ_２Ｃ_１～３アルキル、又はＣ_１～３アルキルであり、Ｒ^３は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＳＯ_２Ｃ_１～３アルキル、ＣＯＮＨ_２又はＳＯ_２ＮＲ^４Ｒ^５であり、Ｒ^４及びＲ^５は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、又はピペリジン環を形成する。更なる実施形態では、Ｒ^２は、水素、Ｆ、Ｃｌ、又はＣ_１～３アルキルであり、Ｒ^３は、水素、Ｆ、Ｃｌ、ＣＮ、又はＳＯ_２Ｃ_１～３アルキルである。更なる実施形態では、Ｒ^３は、水素、Ｆ又はＣＮである。

【0049】

別の実施形態では、有効量の式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物が患者に投与され、式中、Ｒ^１は、

【化9】

であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＣＦ_２であり、Ｙは、Ｏ又はＳであり、Ｑは、ＣＨ又はＮであり、Ｒ^６は、Ｃ_１～３アルキルであり、Ｃ_１－３アルキルは、任意選択で、１つ、２つ又は３つのＦで置換され、任意選択で、ＯＨ、ＯＣ_１－３アルキル、Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２、シクロプロピル、又はテトラヒドロピランで置換され、Ｒ^７は、水素、Ｆ、Ｃｌ又はＣＨ_３である。更なる実施形態では、Ｒ^１は、

【化10】

である。

【0050】

別の実施形態では、有効量の式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物が患者に投与され、式中、Ｒ^１は、

【化11】

であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＣＦ_２であり、Ｙは、Ｏ又はＳであり、Ｒ^６は、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦによって置換され、任意選択で、ＯＨ、ＯＣ_１－３アルキル、Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２、シクロプロピル、又はテトラヒドロピランによって置換された、Ｃ_１－３アルキルであり、Ｒ^７は、水素、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＨ_３である。更なる実施形態では、
Ｒ^１は、

【化12】

である。

【0051】

いくつかの実施形態では、有効量の式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物が患者に投与され、式中、
Ｒ^１は、

【化13】

であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＣＦ_２であり、Ｒ^６は、Ｃ_１ー３アルキルであり、Ｃ_１ー３アルキルは、任意選択で、１つ、２つ又は３つのＦで置換され、Ｒ^７は、水素、Ｆ、Ｃｌ又はＣＨ_３である。

【0052】

更に別の実施形態では、有効量の式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物が患者に投与され、式中、
Ｒ^１は、

【化14】

であり、Ｘは、Ｏであり、Ｒ^６は、Ｃ_１－３アルキルであり、Ｃ_１－３アルキルは、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦによって置換され、Ｒ^７は、水素である。更なる実施形態では、Ｒ^６は、Ｃ_１－３アルキル、すなわち、メチル、エチル、又はプロピルである。更なる実施形態では、Ｒ^６は、メチルである。

【0053】

更に別の実施形態では、有効量の式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物が患者に投与され、式中、Ｒ^２は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ_２Ｃ_１－３アルキル又はＣ_１－３アルキルである。更なる実施形態では、Ｒ^２は、水素、Ｆ、Ｃｌ、又はＣ_１－３アルキルである。更なる実施形態では、Ｒ^２は、水素、Ｆ又はＣ_１－３アルキルである。

【0054】

本明細書に記載の方法の一実施形態では、有効量の式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物が患者に投与され、式中、Ｒ^３は、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＳＯ_２Ｃ_１～３アルキル、ＣＯＮＨ_２又はＳＯ_２ＮＲ^４Ｒ^５であり、Ｒ^４及びＲ^５は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、又はピペリジン環を形成する。更なる実施形態では、Ｒ^３は、水素、Ｆ、Ｃｌ、ＣＮ、又はＳＯ_２Ｃ_１－３アルキルである。更なる実施形態では、Ｒ^３は、水素、Ｆ又はＣＮである。

【0055】

原発がん又はがんの転移を治療するための本明細書に提供される方法の一実施形態では、有効量の式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物が患者に投与され、式中、Ｒ^６は、Ｃ_１－３アルキルであり、Ｃ_１－３アルキルは、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦによって、及び任意選択で、ＯＨ、ＯＣ_１－３アルキル、Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２、シクロプロピル、又はテトラヒドロピランから選択される１つの置換基によって置換される。更なる実施形態では、Ｒ^６は、Ｃ_１－３アルキルであり、Ｃ_１－３アルキルは、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦで置換され、更なる実施形態では、Ｒ^６は、メチル又はエチルである。更なる実施形態では、Ｒ^６は、メチルである。

【0056】

更に別の実施形態では、Ｒ^７は、水素、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＨ_３である。更なる実施形態では、Ｒ^７は、水素である。

【0057】

一実施形態では、患者に投与される医薬組成物は、有効量の（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド（ブレンソカチブ）：

【化15】

又はその薬学的に許容される塩を含む。更なる実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、ブレンソカチブである。更なる実施形態では、方法は、がんの転移を治療するための方法である。別の実施形態では、有効量のブレンソカチブを含む医薬組成物は、原発がんの治療を必要とする患者に投与される。

【0058】

いくつかの実施形態では、患者に投与される化合物は、以下の式（Ｉ）の化合物のうちの１つである：
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４’－シアノビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３，７－ジメチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
４’－［（２Ｓ）－２－シアノ－２－｛［（２Ｓ）－１，４－オキサゼパン－２－イルカルボニル］アミノ｝エチル］ビフェニル－３－イルメタンスルホネート、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－１，２－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４’－（トリフルオロメチル）ビフェニル－４－イル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（３’，４’－ジフルオロビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（６－シアノピリジン－３－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（４－メチル－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－１，４－ベンゾチアジン－６－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－エチル－７－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２，２－ジフルオロエチル）－７－フルオロ－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４－｛３－［２－（ジメチルアミノ）エチル］－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル｝フェニル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３，３－ジフルオロ－１－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インドール－６－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（７－フルオロ－３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－エチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（シクロプロピルメチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２－メトキシエチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾチアゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［２－オキソ－３－（プロパン－２－イル）－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（４－メチル－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－１，４－ベンゾオキサジン－６－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２－メトキシエチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（５－シアノチオフェン－２－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－２－（４’－カルバモイル－３’－フルオロビフェニル－４－イル）－１－シアノエチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（１－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－７－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［２－オキソ－３－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イルメチル）－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－２－［４－（７－クロロ－３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］－１－シアノエチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２，２－ジフルオロエチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［２－オキソ－３－（２，２，２－トリフルオロエチル）－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾチアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４’－（メチルスルホニル）ビフェニル－４－イル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－２－［４’－（アゼチジン－１－イルスルホニル）ビフェニル－４－イル］－１－シアノエチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４’－フルオロビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－２－［４－（１，３－ベンゾチアゾール－５－イル）フェニル］－１－シアノエチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、若しくは
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４’－シアノビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
又は上記化合物のうちの１つの薬学的に許容される塩。

【0059】

本明細書に提供される方法の一実施形態では、患者は、有効量のブレンソカチブ：

【化16】

を含む医薬組成物を投与される。いくつかの実施形態では、ブレンソカチブは、米国特許第９，５２２，８９４号に開示されている多型形態Ａであり、その開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ブレンソカチブは、ＣｕＫα放射線を使用して測定される、約１２．２±０．２（°２θ）にピークを有するＸ線粉末回折パターンを特徴とする。いくつかの実施形態では、ブレンソカチブは、ＣｕＫα放射線を使用して測定される、約２０．６±０．２（°２θ）にピークを有するＸ線粉末回折パターンを特徴とする。いくつかの実施形態では、ブレンソカチブは、ＣｕＫα放射線を使用して測定される、約１２．２±０．２及び約２０．６±０．２（°２θ）にピークを有するＸ線粉末回折パターンを特徴とする。いくつかの実施形態では、ブレンソカチブは、ＣｕＫα放射線を使用して測定される、約１２．２±０．２、約１４．３±０．２、約１６．２±０．２、約１９．１±０．２及び約２０．６±０．２（°２θ）にピークを有するＸ線粉末回折パターンを特徴とする。

【0060】

当業者は、本開示の化合物が、周知の様式で、様々な手法で調製され得ることを認識するであろう。例えば、一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，５２２，８９４号に記載の方法に従って調製される。

【0061】

本明細書に記載されるＣＴＳＣ阻害剤、例えば式（Ｉ）の化合物は、薬学的に許容される塩として医薬組成物中に存在し得る。

【0062】

理論によって拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載されるＣＴＳＣ阻害剤の薬学的に許容される塩、例えば、式（Ｉ）の化合物は、異なる温度及び湿度における安定性、又はＨ_２Ｏ、油、若しくは他の溶媒中の望ましい溶解性など、その化学的又は物理的特性のうちの１つ以上のために有利であり得る。いくつかの場合では、ＣＴＳＣ阻害剤の単離又は精製を補助するために、塩が使用され得る。

【0063】

ＣＴＳＣ阻害剤が十分に酸性である場合、薬学的に許容される塩としては、アルカリ金属塩、例えば、Ｎａ若しくはＫ、アルカリ土類金属塩、例えば、Ｃａ若しくはＭｇ、又は有機アミン塩が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＴＳＣ阻害剤が十分に塩基性である場合、薬学的に許容される塩としては、無機又は有機酸付加塩が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、薬学的に許容される塩は、塩化物塩、マレイン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、メシル酸塩、酒石酸塩、臭化物塩、硝酸塩、リン酸塩、酢酸塩、又はグルコン酸塩である。

【0064】

いくつかの実施形態では、荷電官能基の数及びカチオン又はアニオンの価数に応じて、２つ以上のカチオン又はアニオンが存在し得る。

【0065】

好適な塩、及び本明細書における使用に適した薬学的に許容される塩に関するレビューについては、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１－１９又は“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ”，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ，Ｐ．Ｇ．Ｖｅｒｍｕｔｈ，ＩＵＰＡＣ，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００２を参照されたい。

【0066】

本明細書に記載のＣＴＳＣ阻害剤は、その塩及び共結晶形態の混合物を形成してもよい。したがって、本明細書に提供される方法は、ＣＴＳＣ阻害剤、例えば、式（Ｉ）の化合物のそのような塩／共結晶混合物を使用することができることを理解されたい。

【0067】

塩及び共結晶は、周知の技術、例えば、粉末Ｘ線回折、単結晶Ｘ線回折（例えば、プロトン位置、結合長さ又は結合角度を評価するため）、固体ＮＭＲ（例えば、Ｃ、Ｎ又はＰ化学シフトを評価するため）又は分光技術（例えば、ＯＨ、ＮＨ又はＣＯＯＨシグナル及び水素結合から生じるＩＲピークシフトを測定するため）を使用して特徴付けられ得る。

【0068】

ＣＴＳＣ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩又は本明細書に記載の別のＣＴＳＣ阻害剤の溶媒和物を含む溶媒和形態、例えば水和物で存在し得ることも理解されたい。

【0069】

本明細書に記載のある特定のＣＴＳＣ阻害剤はまた、連結（例えば、炭素－炭素結合、アミド結合などの炭素－窒素結合）を含有してもよく、結合回転は、その特定の連結の周りで制限され、例えば、環結合又は二重結合の存在に起因して制限される。したがって、本開示が全てのそのような異性体を包含することを理解されたい。加えて、ＣＴＳＣ阻害剤は、複数の互変異性形態を含み得る。立体異性体は、従来の技術、例えば、クロマトグラフィー若しくは分別結晶を使用して分離することができ、又は立体異性体は、立体選択的合成によって作製することができる。

【0070】

一実施形態では、医薬組成物は、有効量の同位体標識された（又は「放射標識された」）ＣＴＳＣ阻害剤、例えば、式（Ｉ）の化合物を含む。そのような誘導体は、１つ以上の原子が自然界において典型的に見出される原子質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を有する原子によって置き換えられる、ＣＴＳＣ阻害剤の誘導体である。組み込まれ得る放射性核種の例としては、^２Ｈ（重水素については「Ｄ」とも記述される）が挙げられる。したがって、一実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤は、１つ以上の水素原子が１つ以上の重水素原子によって置き換えられる、本明細書に記載の阻害剤の１つであり、重水素化化合物は、本明細書に提供される方法の１つで使用される。

【0071】

別の実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤は、ヒト又は動物の体内で分解されて、本明細書に記載されるＣＴＳＣ阻害剤のうちの１つを与えるプロドラッグの形態で投与される。プロドラッグの例としては、式（Ｉ）の化合物のインビボ加水分解性エステルが挙げられる。

【0072】

カルボキシ又はヒドロキシ基を含有するＣＴＳＣ阻害剤化合物のインビボ加水分解性（又は切断可能な）エステルは、例えば、ヒト又は動物の体内で加水分解されて親酸又はアルコールを産生する薬学的に許容されるエステルである。エステルプロドラッグ誘導体の例については、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．２００３，４，４６１を参照されたい。様々な他の形態のプロドラッグが当該技術分野で既知であり、本明細書で提供される方法において使用され得る。プロドラッグの例については、あらゆる目的のために参照によりその開示全体が本明細書に組み込まれる、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２００８，７，２５５を参照されたい。

【0073】

投与される投薬量は、使用されるＣＴＳＣ阻害剤及び投与様式に応じて変動する。投与される投薬量は、使用されるＣＴＳＣ阻害剤及び投与様式とともに変動する。例えば、一実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤の１日投薬量は、体重１キログラム当たり０．０５マイクログラム（μｇ／ｋｇ）～体重１キログラム当たり１００マイクログラム（μｇ／ｋｇ）の範囲内であり得る。別の実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤が経口投与される場合、本発明の方法で使用される化合物の１日投薬量は、体重１キログラム当たり０．０１マイクログラム（μｇ／ｋｇ）～体重１キログラム当たり１００ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の範囲内であり得る。

【0074】

一実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤の１日投薬量は、約５ｍｇ～約７０ｍｇ、約１０ｍｇ～約６０ｍｇ、又は約１０ｍｇ～約４０ｍｇである。更なる実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩である。また更なる実施形態では、化合物は、ブレンソカチブである。別の実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤の１日投薬量は、約１０ｍｇ、約２５ｍｇ、約４０ｍｇ、又は約６５ｍｇである。更なる実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩である。また更なる実施形態では、化合物は、ブレンソカチブである。

【0075】

一実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤は、経口剤形で投与される。一実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤の経口投薬量は、約５ｍｇ～約７０ｍｇ、約１０ｍｇ～約６０ｍｇ、又は約１０ｍｇ～約４０ｍｇである。更なる実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩である。また更なる実施形態では、化合物は、ブレンソカチブである。別の実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤の経口投薬量は、約１０ｍｇ、約２５ｍｇ、約４０ｍｇ、又は約６５ｍｇである。更なる実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩である。また更なる実施形態では、化合物は、ブレンソカチブである。

【0076】

本明細書に提供される方法では、有効量のＣＴＳＣ阻害剤を含む医薬組成物は、原発がん又はがんの転移の治療を必要とする患者に投与される。

【0077】

医薬組成物は、一実施形態において、固体剤形である。経口投与に使用される固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末、及び顆粒が含まれる。これらの固体剤形の中で、活性化合物は、クエン酸ナトリウム若しくはリン酸二カルシウムなどの少なくとも１つの従来の不活性賦形剤（若しくはビヒクル）と混合されるか、又は以下の成分と混合される：（ａ）充填剤又は相溶化剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸、（ｂ）結合剤、例えばヒドロキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及びアラビアゴム、（ｃ）保湿剤、例えばグリセリン、（ｄ）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプン、又はタピオカデンプン、アルギン酸、いくつかの複合ケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム、（ｅ）弱溶媒、例えばパラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば四級アミン化合物、（ｇ）湿潤剤、例えばセチルアルコール及びグリセリルモノステアレート、（ｈ）吸着剤、例えばカオリン、並びに（ｉ）滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ドデシル硫酸ナトリウム、又はそれらの混合物。カプセル剤、錠剤、及び丸剤の剤形はまた、緩衝剤を含有し得る。

【0078】

一実施形態では、医薬組成物は、錠剤形態である。更なる実施形態では、錠剤形態の医薬組成物は、錠剤コーティングを更に含む。

【0079】

錠剤、糖化丸薬、カプセル、丸薬、及び顆粒などの固形剤形は、腸溶性コーティング及び当該技術分野で既知の他の材料などのコーティング及びシェルを使用して調製され得る。それらは、不透明化剤を含んでもよく、更に、そのような組成物中の活性化合物又は化合物は、遅延様式で消化管の一部に放出されてもよい。使用され得る包埋成分の例は、ポリマー材料及びワックス材料である。必要に応じて、活性化合物はまた、上記の賦形剤のうちの１つ以上を含むマイクロカプセルに形成され得る。

【0080】

経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤、又はチンキ剤が挙げられる。活性化合物に加えて、液体剤形は、水又は他の溶媒、可溶化剤、及び乳化剤、例えば、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、プロピレングリコール、１，３－ブタンジオール、ジメチルホルムアミド、及び油、特に綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、又はこれらの物質の混合物などの、当該技術分野において従来用いられる不活性希釈剤を含有し得る。

【0081】

経口適用のための液体調製物は、シロップ、溶液又は懸濁液の形態であり得る。溶液は、例えば、本発明の方法で使用される化合物を含有してもよく、残りは、糖、並びにエタノール、水、グリセロール及びプロピレングリコールの混合物である。任意選択で、そのような液体調製物は、増粘剤として着色剤、香味剤、サッカリン及び／又はカルボキシメチルセルロースを含有し得る。更に、経口使用のための製剤を作製する場合、当業者に既知の他の賦形剤が使用されてもよい。

【0082】

これらの不活性希釈剤に加えて、組成物は、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、及びスパイスなどのアジュバントを含有してもよい。

【0083】

活性化合物に加えて、懸濁液は、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメトキシド、寒天、又はこれらの物質の混合物などの懸濁化剤を含有してもよい。

【0084】

非経口注射のための組成物は、生理学的に許容される無菌水溶液又は非水溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョン、及び無菌注射可能溶液又は分散液への再溶解のための無菌粉末を含み得る。好適な水性及び非水性ビヒクル、希釈剤、溶媒、又は賦形剤としては、水、エタノール、ポリオール、及びそれらの好適な混合物が挙げられる。

【0085】

本明細書に提供される方法で使用される医薬組成物は、一実施形態では、有効量のＣＴＳＣ阻害剤及び薬学的に許容される担体、アジュバント又は希釈剤を含む。「薬学的に許容される担体、アジュバント又は希釈剤」は、人体での使用に好適であり、十分な純度及び十分に低い毒性を有する必要がある１つ以上の適合性のある固体又は液体の充填剤又はゲル物質を指す。本明細書における「適合性」とは、組成物中の全ての成分が互いに混合され得、本開示による化合物と混合され得るが、化合物の薬効は著しく低下しないことを指す。薬学的に許容される担体、アジュバント又は希釈剤のいくつかの例としては、セルロース及びその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースナトリウム、及び酢酸セルロース）、ゼラチン、タルク、固体滑剤（例えば、ステアリン酸及びステアリン酸マグネシウム）、硫酸カルシウム、植物油（例えば、大豆油、ゴマ油、ピーナッツ油、及びオリーブ油）、ポリオール（例えば、プロピレングリコール、グリセリン、マンニトール、及びソルビトール）、乳化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ）、湿潤剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、着色剤、香料、安定剤、酸化防止剤、保存剤、発熱物質を含まない水などが挙げられる。

【0086】

経口投与のために、ＣＴＳＣ阻害剤は、１つ以上の薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、又は担体、例えば、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、例えば、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、又はアミロペクチン、セルロース誘導体、結合剤、例えば、ゼラチン又はポリビニルピロリドン、崩壊剤、例えば、セルロース誘導体、及び／又は潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ポリエチレングリコール、ワックス、パラフィンなどと混合され、次いで錠剤に圧縮されてもよい。コーティングされた錠剤が必要な場合、上述のように調製されたコアは、水又は容易に揮発する有機溶媒（複数種可）に溶解又は分散された好適なポリマーでコーティングされ得る。代替的に、錠剤は、例えば、アラビアゴム、ゼラチン、タルカム、及び二酸化チタンを含有し得る濃縮糖溶液でコーティングされてもよい。

【0087】

１つの経口投与実施形態では、経口剤形は、フィルムコーティングされた経口錠剤である。更なる実施形態において、剤形は、インビトロ試験条件下での迅速溶解特性を有する即時放出剤形である。

【0088】

軟質ゼラチンカプセルの調製のために、発明の方法で使用される化合物は、例えば、植物油又はポリエチレングリコールと混合されてもよい。硬質ゼラチンカプセルは、錠剤のための上記賦形剤のような薬学的賦形剤を使用する化合物の顆粒を含有し得る。また、本発明の方法に使用される化合物の液体又は半固体製剤を、硬質ゼラチンカプセルに充填してもよい。

【0089】

一実施形態では、組成物は、経口崩壊性錠剤（ＯＤＴ）である。ＯＤＴは、従来の錠剤とは異なり、全体を飲み込むのではなく、舌の上で溶解するように設計されている。

【0090】

一実施形態では、組成物は、経口薄膜又は経口崩壊性フィルム（ＯＤＦ）である。そのような製剤は、舌の上に置かれた場合、唾液との相互作用を介して水和し、剤形から活性化合物を放出する。一実施形態では、ＯＤＦは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、プルラン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ペクチン、デンプン、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）又はアルギン酸ナトリウムなどのフィルム形成ポリマーを含有する。

【0091】

原発がん又はがんの転移を治療するための本明細書に提供される方法の一実施形態では、医薬組成物は、国際出願公開第ＷＯ２０１９／１６６６２６号に記載されている組成物のうちの１つであり、その開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0092】

一実施形態では、薬学的に許容される担体、アジュバント又は希釈剤は、滅菌生理食塩水である。本開示の他の態様では、薬学的に許容される担体、アジュバント又は希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。

【0093】

投与経路に応じた好適な医薬製剤の選択及び調製のための従来の手順は、例えば、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ－Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍ Ｄｅｓｉｇｎｓ”，Ｍ．Ｅ．Ａｕｌｔｏｎ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２^ｎｄ Ｅｄ．２００２に記載されている。

【0094】

本明細書に提供される方法では、医薬組成物は、治療期間投与される。一実施形態では、治療期間は、少なくとも１か月、少なくとも３か月、少なくとも６か月、少なくとも１２か月、少なくとも１８か月、少なくとも２４か月、少なくとも３０か月又は少なくとも３６か月である。

【0095】

一実施形態では、治療期間は、約６か月～約３６か月である。更なる実施形態では、治療期間は、約６か月～約３０か月である。更なる実施形態では、治療期間は、約６か月～約２４か月である。更なる実施形態では、治療期間は、約６か月～約１８か月である。更なる実施形態では、治療期間は、約６か月～約１２か月である。

【0096】

別の実施形態では、治療期間は、約１２か月～約３６か月である。更なる実施形態では、治療期間は、約１２か月～約３０か月である。更なる実施形態では、治療期間は、約１２か月～約２４か月である。更なる実施形態では、治療期間は、約１２か月～約１８か月である。

【0097】

一実施形態では、治療期間中、医薬組成物は、１日１回投与される。更なる実施形態では、医薬組成物は、経口組成物である。更なる実施形態では、医薬組成物は、ほぼ毎日同じ時間、例えば朝食前に投与される。

【0098】

別の実施形態では、治療期間中、医薬組成物は、１日２回投与される。更に別の実施形態では、治療期間中、医薬組成物は、週に１回、２日に１回、３日に１回、週に２回、週に３回、週に４回、又は週に５回投与される。

【0099】

本発明のいくつかの実施形態では、医薬組成物は、それを必要とする患者に、治療期間を通して１日１回投与される。別の実施形態では、医薬組成物は、それを必要とする患者に、治療期間を通して１日２回投与される。別の実施形態では、医薬組成物は、それを必要とする患者に、治療期間を通して１日に３回投与される。更に別の実施形態では、医薬組成物は、それを必要とする患者に、治療期間を通して２日に１回投与される。更に別の実施形態では、医薬組成物は、それを必要とする患者に、治療期間を通して３日に１回投与される。

【0100】

本発明の方法のいくつかの実施形態では、治療期間は、少なくとも１か月、少なくとも６週間、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも４か月、少なくとも５か月、少なくとも６か月、少なくとも７か月、少なくとも８か月、少なくとも９か月、少なくとも１０か月、少なくとも１１か月、少なくとも１年、少なくとも１３か月、少なくとも１４か月、少なくとも１５か月、少なくとも１６か月、少なくとも１７か月、少なくとも１８か月、少なくとも１９か月、少なくとも２０か月、少なくとも２１か月、少なくとも２２か月、少なくとも２３か月、又は少なくとも２年の期間である。

【0101】

本発明は、原発がん及び／又はがんの転移を治療するための方法であって、治療を必要とする患者に、治療期間にわたって、有効量のＣＴＳＣ阻害剤、例えば、式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。一実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤は、ブレンソカチブである。一実施形態では、ＣＴＳＣ阻害剤は、表１に示される化合物、又はその薬学的に許容される塩のうちの１つである。本発明の方法によれば、治療は、原発がん及び／又は転移の進行を阻害するか、遅延させるか、又は逆転させる。

【0102】

一実施形態では、本方法は、原発がんを治療するための方法である。更なる実施形態では、原発がんは、肝がんである。別の実施形態では、原発がんは、乳がんである。乳がんは、更なる実施形態では、管腔乳がん、ヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）陽性乳がん、又はトリプルネガティブ乳がんである。更に別の実施形態では、原発がんは、肺がんである。肺がんは、一実施形態では、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。別の実施形態では、肺がんは、小細胞肺がんである。

【0103】

一実施形態では、方法は、がんの転移を治療するための方法である。更なる実施形態では、転移は、乳がんの転移である。乳がんは、更なる実施形態では、管腔乳がん、ヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）陽性乳がん、又はトリプルネガティブ乳がんである。

【0104】

一実施形態では、上に示されるように、本明細書に提供される方法は、乳がんの転移を治療するための方法である。更なる実施形態では、乳がんの転移は、乳がんの肺転移、乳がんの肝転移、乳がんの骨転移、又は乳がんの脳転移である。更なる実施形態では、乳がんの転移は、乳がんの肺転移である。

【0105】

本明細書に提供されるがんの転移を治療する方法の別の実施形態では、転移は、肺がんの転移である。肺がんは、一実施形態では、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。別の実施形態では、肺がんは、小細胞肺がんである。

【0106】

本明細書に提供されるがんの転移を治療するための方法の更に別の実施形態では、転移は、肺がんの骨転移、膵がんの肝転移、又は胃がんの肝転移である。本明細書に提供されるがんの転移を治療するための方法の更に別の実施形態では、転移は、乳がんの肺転移、乳がんの肝転移、乳がんの骨転移、乳がんの脳転移、肺がんの骨転移、膵がんの肝転移、又は胃がんの肝転移である。

【0107】

本明細書に提供されるがんの転移を治療するための方法の一実施形態では、転移は、膵がん又は胃がんの転移である。更なる実施形態では、転移は、膵がんの転移である。別の実施形態では、転移は、胃がんの転移である。

【0108】

更に別の実施形態では、転移は、骨がん、肝がん、胃がん、又は大腸がんの転移である。

【0109】

本方法の一実施形態では、治療は、原発がんの結果として生じた患者の体重減少を緩和することを更に含む。別の実施形態では、治療は、腫瘍転移の結果として生じた患者の体重減少を緩和することを更に含む。

【0110】

原発がん又はがんの転移を治療するための方法の一実施形態では、治療は、患者におけるＣＴＳＣの血清学的レベルを低下させることを更に含む。一実施形態では、原発腫瘍又は転移は、治療期間前のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルの上昇を含む。一実施形態では、治療期間中又は治療期間後、治療は、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルを少なくとも約１０％低減することを含む。更なる実施形態では、治療は、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルを少なくとも約２０％低減することを含む。更なる実施形態では、治療は、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルを少なくとも約３０％低減することを含む。更なる実施形態では、治療は、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルを少なくとも約４０％低減することを含む。更なる実施形態では、治療は、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルを少なくとも約５０％低減することを含む。別の実施形態では、治療は、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルを少なくとも約６０％低減することを含む。更に別の実施形態では、治療は、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルを少なくとも約７０％低減することを含む。更に別の実施形態では、治療は、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルを少なくとも約８０％低減することを含む。

【0111】

原発がん又は転移を治療するための方法の一実施形態では、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルは、約１０％～約８０％低減される。更なる実施形態では、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルは、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、約１０％～約７０％低減される。更なる実施形態では、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルは、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、約１０％～約６０％低減される。更なる実施形態では、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルは、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、約１０％～約５０％低減される。更なる実施形態では、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルは、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、約１０％～約４０％低減される。

【0112】

別の実施形態では、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルは、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、約４０％～約８０％低減される。更なる実施形態では、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルは、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、約５０％～約８０％低減される。更なる実施形態では、患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルは、治療期間前の患者のＣＴＳＣタンパク質の血清レベルと比較して、約６０％～約８０％低減される。

【0113】

本明細書に提供される治療方法の一実施形態では、方法は、治療期間中又は治療期間後に、治療期間前の好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の数と比較して、患者のＮＥＴを低減することを更に含む。更なる実施形態では、方法は、治療期間前の転移におけるＮＥＴの数と比較して、治療期間中又は治療期間後の転移におけるＮＥＴを低減することを含む。別の実施形態では、方法は、治療期間前の原発がんにおけるＮＥＴの数と比較して、治療期間中又は治療期間後の原発がんにおけるＮＥＴを低減することを含む。一実施形態では、方法は、治療期間前の循環ＮＥＴの数と比較して、治療期間中又は治療期間後に患者における循環ＮＥＴを低減することを含む。

【0114】

本明細書に提供される方法の一実施形態では、治療期間中又は治療期間後のＮＥＴ（例えば、循環ＮＥＴ又は転移部位（複数可）におけるＮＥＴ）の数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、少なくとも約１０％低減される。更なる実施形態では、ＮＥＴの数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、少なくとも約２０％低減される。更なる実施形態では、ＮＥＴの数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、少なくとも約３０％低減される。更なる実施形態では、ＮＥＴの数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、少なくとも約４０％低減される。更なる実施形態では、ＮＥＴの数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、少なくとも約５０％低減される。別の実施形態では、ＮＥＴの数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、少なくとも約６０％低減される。更に別の実施形態では、ＮＥＴの数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、少なくとも約７０％低減される。更に別の実施形態では、ＮＥＴの数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、少なくとも約８０％低減される。

【0115】

本明細書に提供される方法の一実施形態では、治療期間中又は治療期間後のＮＥＴの数（例えば、循環ＮＥＴ又は原発腫瘍若しくは腫瘍転移に存在するＮＥＴ）は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、約１０％～約８０％低減される。更なる実施形態では、ＮＥＴの数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、約１０％～約７０％低減される。更なる実施形態では、ＮＥＴの数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、約１０％～約６０％低減される。更なる実施形態では、ＮＥＴの数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、約１０％～約５０％低減される。更なる実施形態では、ＮＥＴの数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、約１０％～約４０％低減される。

【0116】

本明細書に提供される治療方法の別の実施形態では、ＮＥＴの数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、約４０％～約８０％低減される。更なる実施形態では、ＮＥＴの数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、約５０％～約８０％低減される。更なる実施形態では、ＮＥＴの数は、治療期間前のＮＥＴの数と比較して、約６０％～約８０％低減される。

【0117】

一実施形態では、ＮＥＴは、免疫蛍光染色によって検出される。

【0118】

本明細書に提供される転移治療方法の別の実施形態では、方法は、治療期間中又は治療期間後に、治療期間前の好中球遊走と比較して、又は医薬組成物で治療されていない転移患者と比較して、転移における好中球遊走を低減することを更に含む。更なる実施形態では、好中球遊走は、治療期間中又は治療期間後に、治療期間前の転移における好中球遊走と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％低減される。一実施形態では、好中球遊走は、免疫蛍光染色によって測定される。

【0119】

本明細書に提供される原発がん治療方法の別の実施形態では、方法は、治療期間中又は治療期間後に、治療期間前の好中球遊走と比較して、又は医薬組成物で治療されていない原発がん患者と比較して、転移における好中球遊走を低減することを更に含む。更なる実施形態では、好中球遊走は、治療期間中又は治療期間後に、治療期間前の原発がんにおける好中球遊走と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％低減される。一実施形態では、好中球遊走は、免疫蛍光染色によって測定される。

【0120】

本明細書に提供される方法の一実施形態では、治療期間中又は治療期間後の好中球遊走は、治療期間前の好中球遊走と比較して、又は医薬組成物を投与されていない患者における好中球遊走と比較して、約１０％～約８０％低減される。更なる実施形態では、治療期間中又は治療期間後の好中球遊走は、治療期間前の好中球遊走と比較して、又は医薬組成物を投与されていない患者における好中球遊走と比較して、約１０％～約７０％低減される。更なる実施形態では、治療期間中又は治療期間後の好中球遊走は、治療期間前の好中球遊走と比較して、又は医薬組成物を投与されていない患者における好中球遊走と比較して、約１０％～約６０％低減される。更なる実施形態では、治療期間中又は治療期間後の好中球遊走は、治療期間前の好中球遊走と比較して、又は医薬組成物を投与されていない患者における好中球遊走と比較して、約１０％～約５０％低減される。更なる実施形態では、治療期間中又は治療期間後の好中球遊走は、治療期間前の好中球遊走と比較して、又は医薬組成物を投与されていない患者における好中球遊走と比較して、約１０％～約４０％低減される。

【0121】

本明細書で提供されるのは、原発がん又はがんの転移を治療するための方法であって、部分的に、ＣＴＳＣ阻害剤、例えば式（Ｉ）の化合物（例えばブレンソカチブ）を、治療を必要とする患者に投与することを含む方法である。治療は、原発がん又は転移の進行を阻害するか、遅延させるか、又は逆転させる。

【0122】

一実施形態では、方法は、治療期間前のインターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）レベルと比較して、又は医薬組成物を投与されていない患者と比較して、治療期間中又は治療期間後に患者におけるＩＬ－１βレベルを減少させることを更に含む。一実施形態では、患者におけるＩＬ－１βレベルは、治療期間前の患者におけるＩＬ－１βレベルと比較して、又は医薬組成物を投与されていない患者と比較して、治療期間中又は治療期間後に少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、低減される。別の実施形態では、方法は、治療期間前の患者のＩＬ－１βレベルと比較して、又は医薬組成物を投与されていない患者と比較して、治療期間中又は治療期間後に患者のＩＬ－１βレベルを約５％～約２５％、約２５％～約５０％、約５０％～約７５％、約２５％～約７５％、又は約５％～約７５％減少させることを含む。

【0123】

一実施形態では、ＩＬ－１βレベルを減少させることは、原発がんの部位又は転移の部位におけるＩＬ－１βレベルを減少させることを含む。一実施形態では、ＩＬ－１βレベルを減少させることは、循環ＩＬ－１βレベルを減少させることを含む。

【0124】

一実施形態では、本発明の方法は、走化性因子の循環レベルを減少させることを更に含む。更なる実施形態では、走化性因子は、インターロイキン６（ＩＬ－６）、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＣＬ３）、又はＲＥＬＡ（ｐ６５）である。本明細書に提供される転移治療方法の一実施形態では、方法は、治療期間中又は治療期間後に、治療期間前の走化性因子のレベルと比較して、走化性因子のレベルを減少させることを更に含む。一実施形態では、患者における走化性因子レベルは、治療期間前の患者における走化性因子レベルと比較して、又は医薬組成物を投与されていない患者と比較して、治療期間中又は治療期間後に少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、低減される。別の実施形態では、方法は、治療期間前の患者の走化性因子レベルと比較して、又は医薬組成物を投与されていない患者と比較して、治療期間中又は治療期間後に患者の走化性因子レベルを約５％～約２５％、約２５％～約５０％、約５０％～約７５％、約２５％～約７５％、又は約５％～約７５％減少させることを含む。

【0125】

本明細書に提供される転移治療方法の一実施形態では、患者の原発がん又は転移の体積は、治療期間中又は治療期間後に、治療期間前の原発がん又は転移の容積と比較して低減される。一実施形態では、体積の低減は、約５％～約７５％である。更なる実施形態では、腫瘍体積（原発腫瘍又は二次腫瘍）の低減は、治療期間中又は治療期間後に、治療期間前の腫瘍体積と比較して約２５％～約５０％、又は約５０％～約７５％である。別の実施形態では、腫瘍体積の低減は、治療期間中又は治療期間後に、治療期間前の腫瘍体積と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％である。

【0126】

本明細書に提供される原発がんのための方法の一実施形態では、原発がんの進行は退縮する。更なる実施形態では、治療期間中又は治療期間後に原発がんの退縮が生じる。例えば、一実施形態では、転移退縮は、治療期間の開始から約１か月後、約２か月後、約３か月後、約４か月後、約５か月後、約６か月後、約７か月後、約８か月後、約９か月後、約１０か月後、約１１か月後、又は約１年後に検出される。

【0127】

本明細書に提供される転移を治療する方法の一実施形態では、転移の進行は退縮する。更なる実施形態では、治療期間中又は治療期間後に転移の退縮が生じる。例えば、一実施形態では、転移退縮は、治療期間の開始から約１か月後、約２か月後、約３か月後、約４か月後、約５か月後、約６か月後、約７か月後、約８か月後、約９か月後、約１０か月後、約１１か月後、又は約１年後に検出される。

【0128】

本明細書に提供される方法は、一実施形態では、患者の生存率を改善することを更に含む。一実施形態では、生存率は、医薬組成物を投与されていない患者（すなわち、原発がん患者又は転移患者）の生存率と比較して増加する。一実施形態において、本明細書に提供される方法のうちの１つを受けた患者の生存率は、医薬組成物を投与されていない転移患者の生存率と比較して、平均１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４か月増加する。

【0129】

更に別の実施形態では、方法は、治療期間前の腫瘍様塊サイズと比較して、治療期間中又は治療期間後の原発がん又は転移における腫瘍様塊サイズを低減することを含む。更なる実施形態では、腫瘍様塊サイズは、治療期間中又は治療期後に、治療期間前の腫瘍様塊サイズと比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％低減される。いくつかの実施形態では、腫瘍様塊サイズは、画像化によって測定される。

【0130】

例示的な実施形態
実施形態１．原発腫瘍又は転移の治療又は阻害を必要とする患者において、それを治療又は阻害するための、カテプシンＣ阻害剤又はカテプシンＣ阻害剤を含む組成物の使用。
実施形態２．カテプシンＣ阻害剤が、式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩であり、

【化17】

式中、
Ｒ^１が、

【化18】

であり、
Ｒ^２が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ_２（Ｃ_１－３）アルキル、及び（Ｃ_１－３）アルキルからなる群から選択され、
Ｒ^３が、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＳＯ_２Ｃ_１－３アルキル、ＣＯＮＨ_２、又はＳＯ_２ＮＲ^４Ｒ^５であり、Ｒ^４及びＲ^５は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、又はピペリジン環を形成し、
Ｘが、Ｏ、Ｓ、又はＣＦ_２であり、
Ｙが、Ｏ又はＳであり、
Ｑが、ＣＨ又はＮであり、
Ｒ^６が、（Ｃ_１－３）アルキルであり、（Ｃ_１－３）アルキルが、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのフッ素原子で置換され、（Ｃ_１－３）アルキル基が、任意選択で、ＯＨ、Ｏ（Ｃ_１－３）アルキル、Ｎ［（Ｃ_１－３）アルキル］_２、シクロプロピル、又はテトラヒドロピラニルから選択される置換基で置換され、
Ｒ^７が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＨ_３である、実施形態１の使用。
実施形態３．カテプシンＣ阻害剤が、ブレンソカチブである、実施形態１の使用。
実施形態４．カテプシンＣ阻害剤が、表１に記載の阻害剤、又はその薬学的に許容される塩である、実施形態１の使用。
実施形態５．原発腫瘍を治療又は阻害するための、実施形態１～４のいずれか１つの使用。
実施形態６．転移を治療又は阻害するための、実施形態１～４のいずれか１つの使用。
実施形態７．転移が、乳がんの肺転移、乳がんの肝転移、乳がんの骨転移、乳がんの脳転移、肺がんの骨転移、膵がんの肝転移、及び胃がんの肝転移である、実施形態６の使用。
実施形態８．転移が、乳がんの肺転移、乳がんの肝転移、乳がんの骨転移、又は肺がんの骨転移である、実施形態６の使用。
実施形態９．腫瘍転移が、乳がんの転移である、実施形態６の使用。
実施形態１０．乳がんが、管腔乳がん、ヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）陽性乳がん、又はトリプルネガティブ乳がんである、実施形態９の使用。
実施形態１１．転移が、肺がんの転移である、実施形態６の使用。
実施形態１２．肺がんが、非小細胞肺がん又は小細胞肺がんである、実施形態１１の使用。
実施形態１３．原発がんが、肺がんである、実施形態５の使用。
実施形態１４．原発がんが、肝がんである、実施形態５の使用。
実施形態１５．原発がんが、乳がんである、実施形態５の使用。
実施形態１６．阻害剤又は組成物が、経口投与されることを特徴とする、実施形態１～１５のいずれか１つの使用。
実施形態１７．阻害剤又は組成物が、非経口投与されることを特徴とする、実施形態１～１５のいずれか１つの使用。
実施形態１８．患者が、カテプシンＣ（ＣＴＳＣ）タンパク質の上昇した血清レベルを有し、治療又は阻害が、ＣＴＳＣタンパク質の上昇した血清レベルを少なくとも約２５％低減することを含む、実施形態１～１７のいずれか１つの使用。
実施形態１９．患者が、カテプシンＣ（ＣＴＳＣ）タンパク質の上昇した血清レベルを有し、治療又は阻害が、ＣＴＳＣタンパク質の上昇した血清レベルを約２５％～約７５％低減することを含む、実施形態１～１７のいずれか１つの使用。
実施形態２０．治療を必要とする患者においてがんの転移を治療する方法であって、
治療を必要とする患者に、治療期間にわたって、有効量のＣＴＳＣ阻害剤を含む医薬組成物を投与することを含み、治療することにより、患者における腫瘍転移の進行が、阻害されるか、遅延するか、又は逆転する、方法。
実施形態２１．治療を必要とする患者において原発がんを治療する方法であって、治療を必要とする患者に、治療期間にわたって、有効量のＣＴＳＣ阻害剤を含む医薬組成物を投与することを含み、治療することにより、患者における原発がんの進行が、阻害されるか、遅延されるか、又は逆転する、方法。
実施形態２２．ＣＴＳＣ阻害剤が、以下の化合物のうちの１つである、実施形態２０又は２１に記載の方法。

【表3】

治療は、患者における原発がんの進行を阻害するか、遅延させるか、又は逆転させる。
実施形態２３．ＣＴＳＣ阻害剤が、式（Ｉ）の構造を有する化合物、又はその薬学的に許容される塩であり、

【化19】

式中、
Ｒ^１が、

【化20】

であり、
Ｒ^２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＳＯ_２（Ｃ_１－３）アルキル、又は（Ｃ_１－３）アルキルであり、
Ｒ^３が、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＳＯ_２Ｃ_１－３アルキル、ＣＯＮＨ_２、又はＳＯ_２ＮＲ^４Ｒ^５であり、Ｒ^４及びＲ^５は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、又はピペリジン環を形成し、
Ｘが、Ｏ、Ｓ、又はＣＦ_２であり、
Ｙが、Ｏ又はＳであり、
Ｑが、ＣＨ又はＮであり、
Ｒ^６が、（Ｃ_１－３）アルキルであり、（Ｃ_１－３）アルキルが、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのフッ素原子で置換され、（Ｃ_１－３）アルキル基が、任意選択で、ＯＨ、Ｏ（Ｃ_１－３）アルキル、Ｎ［（Ｃ_１－３）アルキル］_２、シクロプロピル、又はテトラヒドロピラニルから選択される置換基で置換され、
Ｒ^７が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＨ_３である。
Ｒ^７が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＨ_３である、実施形態２０又は２１の方法。
実施形態２４．Ｒ^１が、

【化21】

であり、
Ｘが、Ｏ、Ｓ、又はＣＦ_２であり、
Ｙが、Ｏ又はＳであり、
Ｑが、ＣＨ又はＮであり、
Ｒ^６が、Ｃ_１－３アルキルであり、Ｃ_１－３アルキルが、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦによって置換され、任意選択で、ＯＨ、ＯＣ_１－３アルキル、Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２、シクロプロピル、及びテトラヒドロピランからなる群から選択される１つの置換基によって置換され、
Ｒ^７が、水素、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＨ_３である、実施形態２３の方法。
実施形態２５．Ｒ^１が、

【化22】

であり、
Ｘが、Ｏ、Ｓ、又はＣＦ_２であり、
Ｙが、Ｏ又はＳであり、
Ｒ^６が、Ｃ_１－３アルキルであり、Ｃ_１－３アルキルが、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦによって置換され、任意選択で、ＯＨ、ＯＣ_１－３アルキル、Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２、シクロプロピル、及びテトラヒドロピランからなる群から選択される１つの置換基によって置換され、
Ｒ^７が、水素、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＨ_３である、実施形態２３又は２４の方法。
実施形態２６．Ｒ^１が、

【化23】

である、実施形態２３～２５のいずれか１つの方法。
実施形態２７．Ｘが、Ｏであり、Ｒ^６が、Ｃ_１－３アルキルであり、Ｒ^７が、水素である、実施形態２６の方法。
実施形態２８．Ｒ^１が、

【化24】

であり、
Ｘが、Ｏであり、
Ｒ^６が、Ｃ_１－３アルキルであり、Ｃ_１－３アルキルは、任意選択で、１つ、２つ、又は３つのＦによって置換され、
Ｒ^７が、水素である、実施形態２３の方法。
実施形態２９．Ｒ^１が、

【化25】

であり、
Ｘが、Ｏであり、
Ｒ^６が、Ｃ_１－３アルキルであり、
Ｒ^７が、水素である、実施形態２３の方法。
実施形態３０．Ｘが、Ｏ、Ｓ、及びＣＦ_２であり、Ｒ^６が、（Ｃ_１－_３）アルキルであり、（Ｃ_１－_３）アルキルは、任意選択で、１つ、２つ、若しくは３つのフッ素原子で置換され、Ｒ^７が、Ｈである、実施形態２６の方法。
実施形態３１．式（Ｉ）の化合物が、ブレンソカチブ、又はその薬学的に許容される塩である、実施形態２３の方法。
実施形態３２．式（Ｉ）の化合物が、ブレンソカチブである、実施形態２３の方法。
実施形態３３．式（Ｉ）の化合物が、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４’－シアノビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３，７－ジメチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
４’－［（２Ｓ）－２－シアノ－２－｛［（２Ｓ）－１，４－オキサゼパン－２－イルカルボニル］アミノ｝エチル］ビフェニル－３－イルメタンスルホネート、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－１，２－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４’－（トリフルオロメチル）ビフェニル－４－イル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（３’，４’－ジフルオロビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（６－シアノピリジン－３－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（４－メチル－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－１，４－ベンゾチアジン－６－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－エチル－７－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２，２－ジフルオロエチル）－７－フルオロ－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４－｛３－［２－（ジメチルアミノ）エチル］－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル｝フェニル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３，３－ジフルオロ－１－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インドール－６－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（７－フルオロ－３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－エチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（シクロプロピルメチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２－メトキシエチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾチアゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［２－オキソ－３－（プロパン－２－イル）－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（４－メチル－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－１，４－ベンゾオキサジン－６－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２－メトキシエチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（５－シアノチオフェン－２－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－２－（４’－カルバモイル－３’－フルオロビフェニル－４－イル）－１－シアノエチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（１－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロキノリン－７－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［２－オキソ－３－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イルメチル）－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－２－［４－（７－クロロ－３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル）フェニル］－１－シアノエチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［３－（２，２－ジフルオロエチル）－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－｛４－［２－オキソ－３－（２，２，２－トリフルオロエチル）－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾオキサゾール－５－イル］フェニル｝エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４－（３－メチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１，３－ベンゾチアゾール－５－イル）フェニル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－１－シアノ－２－［４’－（メチルスルホニル）ビフェニル－４－イル］エチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－２－［４’－（アゼチジン－１－イルスルホニル）ビフェニル－４－イル］－１－シアノエチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４’－フルオロビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－｛（１Ｓ）－２－［４－（１，３－ベンゾチアゾール－５－イル）フェニル］－１－シアノエチル｝－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、
（２Ｓ）－Ｎ－［（１Ｓ）－１－シアノ－２－（４’－シアノビフェニル－４－イル）エチル］－１，４－オキサゼパン－２－カルボキサミド、又は
その薬学的に許容される塩である、実施形態２３の方法。
実施形態３４．医薬組成物の投与が、経口投与によるものである、実施形態２０～３３のいずれか１つの方法。
実施形態３５．医薬組成物の投与が、非経口投与によるものである、実施形態２０～３３のいずれか１つの方法。
実施形態３６．医薬組成物の投与が、静脈内投与によるものである、実施形態２０～３３のいずれか１つの方法。
実施形態３７．医薬組成物の投与が、注入によるものである、実施形態２０～３３のいずれか１つの方法。
実施形態３８．医薬組成物が、錠剤形態である、実施形態２０～３３のいずれか１つの方法。
実施形態３９．医薬組成物が、錠剤コーティングを更に含む、実施形態２０～３４のいずれか１つの方法。
実施形態４０．式（Ｉ）の化合物が、医薬組成物中に約５ミリグラム（ｍｇ）～約７０ｍｇ存在する、実施形態２０～３９のいずれか１つの方法。
実施形態４１．式（Ｉ）の化合物が、医薬組成物中に約１０ミリグラム（ｍｇ）～約６０ｍｇ存在する、実施形態２０～３９のいずれか１つの方法。
実施形態４２．式（Ｉ）の化合物が、医薬組成物中に約１０ミリグラム（ｍｇ）～約４０ｍｇ存在する、実施形態２０～３９のいずれか１つの方法。
実施形態４３．式（Ｉ）の化合物が、医薬組成物中に約１０ミリグラム（ｍｇ）で存在する、実施形態２０～３９のいずれか１つの方法。
実施形態４４．式（Ｉ）の化合物が、医薬組成物中に約２５ミリグラム（ｍｇ）で存在する、実施形態２０～３９のいずれか１つの方法。
実施形態４５．式（Ｉ）の化合物が、医薬組成物中に約４０ミリグラム（ｍｇ）で存在する、実施形態２０～３９のいずれか１つの方法。
実施形態４６．式（Ｉ）の化合物が、医薬組成物中に約６０ミリグラム（ｍｇ）で存在する、実施形態２０～３９のいずれか１つの方法。
実施形態４７．投与が、治療期間を通して、１日に１回行われる、実施形態２０～４６のいずれか１つの方法。
実施形態４８．投与が、治療期間を通して、１日に２回行われる、実施形態２０～４６のいずれか１つの方法。
実施形態４９．投与が、治療期間を通して、２日に１回行われる、実施形態２０～４６のいずれか１つの方法。
実施形態５０．投与が、治療期間を通して、３日に１回行われる、実施形態２０～４６のいずれか１つの方法。
実施形態５１．治療期間が、少なくとも１か月である、実施形態２０～５０のいずれか１つの方法。
実施形態５２．治療期間が、少なくとも２か月である、実施形態２０～５０のいずれか１つの方法。
実施形態５３．治療期間が、少なくとも３か月である、実施形態２０～５０のいずれか１つの方法。
実施形態５４．治療期間が、少なくとも６か月である、実施形態２０～５０のいずれか１つの方法。
実施形態５５．治療期間が、約６か月～約２４か月である、実施形態２０～５０のいずれか１つの方法。
実施形態５６．治療期間が、約６か月～約１８か月である、実施形態５５の方法。
実施形態５７．治療期間が、約６か月～約１２か月である、実施形態５５の方法。
実施形態５８．治療期間が、約１２か月～約２４か月である、実施形態５５の方法。
実施形態５９．治療期間が、約１２か月～約１８か月である、実施形態５５の方法。
実施形態６０．患者が、治療期間前に、カテプシンＣ（ＣＴＳＣ）タンパク質の上昇した血清レベルを呈する、実施形態２０～５９のいずれか１つの方法。
実施形態６１．ＣＴＳＣタンパク質の上昇した血清レベルが、治療期間中又は治療期間後に少なくとも約２５％低減される、実施形態６０の方法。
実施形態６２．ＣＴＳＣタンパク質の上昇した血清レベルが、治療期間中又は治療期間後に少なくとも約５０％低減される、実施形態６０の方法。
実施形態６３．ＣＴＳＣタンパク質の上昇した血清レベルが、治療期間中又は治療期間後に少なくとも約７５％低減される、実施形態６０の方法。
実施形態６４．ＣＴＳＣタンパク質の上昇した血清レベルが、治療期間中又は治療期間後に約２５％～約７５％低減される、実施形態６０の方法。
実施形態６５．患者が、ヒトである、実施形態２０～６４のいずれか１つの方法。
実施形態６６．患者が、治療期間後又は治療期間中に転移の退縮を経験する、実施形態２０及び２２～６５のいずれか１つの方法。
実施形態６７．患者が、治療期間後又は治療期間中に原発がんの退縮を経験する、実施形態２１～６５のいずれか１つの方法。
実施形態６８．退縮が、治療期間に入って約２か月又は約３か月で生じる、実施形態６６又は６７の方法。
実施形態６９．退縮が、治療期間に入って約６か月で生じる、実施形態６６又は６７の方法。
実施形態６９．転移が、乳がんの転移である、実施形態２０、２２～６６及び６８～６９のいずれか１つの方法。
実施形態７０．乳がんの転移が、乳がんの肺転移、乳がんの肝転移、乳がんの骨転移、又は乳がんの脳転移である、実施形態６９の方法。
実施形態７１．乳がんの転移が、乳がんの肺転移である、実施形態７０の方法。
実施形態７２．乳がんが、ルミナール乳がん、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）陽性乳がん、又はトリプルネガティブ乳がんである、実施形態６９～７１のいずれか１つの方法。
実施形態７３．転移が、肺がんの骨転移、膵がんの肝転移、又は胃がんの肝転移である、実施形態２０、２２～６６及び６８～６９のいずれか１つの方法。
実施形態７４．転移が、乳がんの肺転移、乳がんの肝転移、乳がんの骨転移、乳がんの脳転移、肺がんの骨転移、直腸がんの肝転移、膵がんの肝転移、又は胃がんの肝転移である、実施形態２０、２２～６６及び６８～６９のいずれか１つの方法。
実施形態７５．転移が、肺がんの転移である、実施形態２０、２２～６６及び６８～６９のいずれか１つの方法。
実施形態７６．肺がんが、非小細胞肺がんである、実施形態７５の方法。
実施形態７７．肺がんが、小細胞肺がんである、実施形態７５の方法。
実施形態７８．転移が、膵がん又は胃がんの転移である、実施形態２０、２２～６６及び６８～６９のいずれか１つの使用。
実施形態７９．転移が、骨がん、肝がん、胃がん、結腸がん、直腸がん又は結腸直腸がんの転移である、実施形態２０、２２～６６及び６８～６９のいずれか１つの方法。
実施形態８０．原発がんが、肺がんである、実施形態２１～６５及び６７～６９のいずれか１つの方法。
実施形態８１．原発がんが、乳がんである、実施形態２１～６５及び６７～６９のいずれか１つの方法。
実施形態８２．原発がんが、肝がんである、実施形態２１～６５及び６７～６９のいずれか１つの方法。
実施形態８３．肺がんが、小細胞肺がんである、実施形態８０の方法。
実施形態８４．肺がんが、非小細胞肺がんである、実施形態８０の方法。
実施形態８５．乳がんが、ルミナール乳がん、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）陽性乳がん、又はトリプルネガティブ乳がんである、実施形態８１の方法。
実施形態８６．治療することが、患者におけるインターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）の循環レベルを、治療期間中に又は治療期間の後に、治療期間前の患者のＩＬ－１βの循環レベルと比較して低減させることを更に含む、実施形態２０～８５のいずれか１つの方法。
実施形態８８．転移の体積が、治療期間中に又は治療期間の後に、治療期間前の転移の体積と比較して約５％～約２５％低減する、実施形態２０、２２～６６、６８～７９及び８６のいずれか１つの方法。
実施形態８９．転移の体積が、治療期間中に又は治療期間の後に、治療期間前の転移の体積と比較して約２５％～約５０％低減する、実施形態２０、２２、２４～６６、６８～７９及び８６のいずれか１つの方法。
実施形態９０．転移の体積が、治療期間中に又は治療期間の後に、治療期間前の転移の体積と比較して約５０％～約７５％低減する、実施形態２０、２２、２４～６６、６８～７９及び８６のいずれか１つの方法。
実施形態９１．原発がんの体積が、治療期間中に又は治療期間の後に、治療期間前の原発がんの体積と比較して約５％～約２５％低減する、実施形態２１～６５、６７～６９及び８０～８６のいずれか１つの方法。
実施形態９２．原発がんの体積が、治療期間中に又は治療期間の後に、治療期間前の原発がんの体積と比較して約２５％～約５０％低減する、実施形態２１～６５、６７～６９及び８０～８６のいずれか１つの方法。
実施形態９３．原発がんの体積が、治療期間中に又は治療期間の後に、治療期間前の原発がんの体積と比較して約５０％～約７５％低減する、実施形態２１～６５、６７～６９及び８０～８６のいずれか１つの方法。
実施形態９４．患者の生存率が、医薬組成物を投与されていない患者の生存率と比べて増加する、実施形態２０～９３のいずれか１つの方法。
実施形態９５．治療することが、患者の循環好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を、治療期間中に又は治療期間の後に、治療期間前の患者の循環ＮＥＴの数と比較して低減させることを更に含む、実施形態２０～９４のいずれか１つの方法。
実施形態９６．治療することが、好中球遊走を、治療期間中に又は治療期間の後に、治療期間前の転移における好中球遊走と比較して低減させることを更に含む、実施形態２０～９５のいずれか１つの方法。
実施形態９７．好中球遊走を減少させることが、好中球遊走を、医薬組成物を投与されていない第２の患者における好中球遊走と比較して、約２５％～約７５％低減させることを含む、実施形態９６の方法。
実施形態９８．好中球遊走を減少させることが、好中球遊走を、医薬組成物を投与されていない第２の患者における好中球遊走と比較して、約２５％～約５０％低減させることを含む、実施形態９６の方法。
実施形態９９．好中球遊走を減少させることが、好中球遊走を、医薬組成物を投与されていない第２の患者における好中球遊走と比較して、少なくとも約２５％低減させることを含む、実施形態９６の方法。
実施形態１００．好中球遊走を減少させることが、好中球遊走を、医薬組成物を投与されていない第２の患者における好中球遊走と比較して、少なくとも約５０％低減させることを含む、実施形態９６の方法。
実施形態１０１．好中球遊走が、免疫蛍光染色によって測定される、実施形態９６～１００のいずれか１つの方法。
実施形態１０２．治療することが、患者の好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を、治療期間中に又は治療期間の後に、治療期間前の患者のＮＥＴの数と比較して低減させることを更に含む、実施形態２０～１０１のいずれか１つの方法。
実施形態１０３．転移におけるＮＥＴの数が、治療期間前の転移におけるＮＥＴの数と比較して少なくとも５０％低減する、実施形態１０２の方法。
実施形態１０４．ＮＥＴが、免疫蛍光染色によって検出される、実施形態１０２又は１０３の方法。
実施形態１０５．治療することが、患者における１つ以上のタンパク質の発現レベルを低減させることを更に含み、１つ以上のタンパク質が、カテプシンＣ（ＣＴＳＣ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＣＬ３）、又はＲＥＬＡ（ｐ６５）である、実施形態２０～１０４のいずれか１つの方法。
実施形態１０６．治療することが、原発がん又は転移における腫瘍様塊サイズを低減させることを更に含む、実施形態２０～１０５のいずれか１つの方法。
実施形態１０７. 腫瘍様塊サイズが、画像化によって測定される、実施形態１０６の方法。

【実施例】

【0131】

本発明は、以下の実施例を参照することによって更に例示される。しかしながら、実施例は、上述の実施形態と同様に、例示的なものであり、いかなる場合においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことに留意されたい。

【0132】

材料及び方法
別段の指示がない限り、以下の材料及び方法を使用して、以下の実施例を実施した。

【0133】

オリゴヌクレオチド配列及びデータ
この研究で使用されるオリゴヌクレオチド配列は、表Ｓ２に示されている。セクレトームプロファイリングデータの一部（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びそのサブライン）は、以前の研究で公表されている（Ｚｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｌｕｎｇ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＤＫＫ１，”Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９：１２７４－１２８５（２０１７））。残りのデータ（ＭＣＦ１０ＣＡ１ｈ対ＭＣＦ１０ＣＡ１ａ、４Ｔ１シリーズ）は、この研究において、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｌｕｎｇ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２９：１－１５（２０２１）の表Ｓ３及びＳ４として示されている。この研究のオリジナルデータは、Ｍｅｎｄｅｌｅｙ Ｄａｔａ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｄｏｉ（ｄｏｔ）ｏｒｇ／１０．１７６３２／ｓｂ８ｈ３ｈｗ８４ｋ．１）に保存されている。

【0134】

細胞株
この研究で生成された細胞株及びそれらの親細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びそのサブライン、４Ｔ１シリーズ、ＡＴ３）は、１０％ｖ／ｖのＦＢＳ及び１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで増殖させた。ＭＣＦ１０シリーズ細胞株は、１０μｇ／ｍｌのインスリン、２０ｎｇ／ｍｌのＥＦＧ、０．５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、及び２０％ｖ／ｖ馬血清を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で増殖させた。５～８継代の細胞培養物を使用し、毎週マイコプラズマ汚染について試験した。

【0135】

ヒト乳がん組織及び血液試料
転移状態のフォローアップ情報を有する凍結原発腫瘍標本（管腔、ＨＥＲ２^＋、トリプルネガティブ腫瘍に対してそれぞれｎ＝４８、３０、１０）及び患者血清（ｎ＝４６）は、患者のインフォームドコンセント及びＱｉｌｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄの承認を得て、Ｑｉｌｕ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手した。これらの８８の原発腫瘍検体のうち、５８はまた、全体的生存情報を有していた。パラフィン包埋原発腫瘍（管腔、ＨＥＲ２^＋、トリプルネガティブ腫瘍に対してそれぞれｎ＝４２、１２、２０）及び肺転移（ｎ＝２９）は、全ての対象からのインフォームドコンセント及び病院機関研究倫理委員会からの承認を得て、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌから入手した。上海コホートのこれら７４の原発腫瘍のうち、５８の試料（管腔、ＨＥＲ２^＋、トリプルネガティブ腫瘍に対してそれぞれ３０、９、１９）は、転移状態のフォローアップ情報を有していた。フォローアップ情報のある試料は、転移（ｎ＝１４６）及び全体的生存（ｎ＝５８）のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ分析に使用された。好中球単離のための全血試料を、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｓｉｘｔｈ Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ及びＺｈｏｎｇｓｈａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌから、センターの治験審査委員会の免除承認下で、収集した。

【0136】

マウス実験
６～１０週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ及び無胸腺マウスを全ての動物実験に使用した。直交及び静脈内注射を、以前に説明されたように行った（Ｚｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｌｕｎｇ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＤＫＫ１，”Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９：１２７４－１２８５（２０１７））。ＥｄＵ標識アッセイのために、ヌードマウスに２×１０^５個のがん細胞を静脈内注射し、続いて１００ｎｇ／マウスＥｄＵ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃ１０６４０）を肺採取の２４時間前に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。好中球枯渇アッセイについては、マウスに、がん細胞注射の３日前に１Ａ８ Ｌｙ６Ｇ抗体（ＢＥ００７５－１，ＢｉｏＸＣｅｌ）又はラットＩｇＧ対照（Ｉ４１３１、Ｓｉｇｍａ）の２回の初回ｉ．ｐ．注射（２００μｇ／マウス）を行い、次いでがん細胞注射の１週間後に２回、維持注射を行った。Ｓｉｖｅｌｅｓｔａｔ又はＤＮａｓｅ Ｉ処置については、マウスにＳｉｖｅｌｅｓｔａｔ（５０ｍｇ／ｋｇ）又はＤＮａｓｅ Ｉ（５ｍｇ／ｋｇ）をがん細胞注射の２時間前に注射し、続いて９日間試薬を毎日注射し、次いで週に２回維持注射した。ＧＳＫ４８４処置については、マウスを、ＡＴ３又は４Ｔ０７細胞の同所注射後、ＧＳＫ４８４（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．１日１回ショット、７日目から２０日間、次いで２日毎に維持ショット）で処置した。ＩＬ－１ｂブロッキング又はＩＬ６Ｒ／ＣＣＲ１阻害アッセイについては、マウスを５×１０^４ＡＴ３で同所接種し、マウスを屠殺するまで７日目から２日毎に、ＩｇＧ若しくはＩＬ－１βブロッキング抗体（マウス当たり１００μｇ）、又はＩＬ６Ｒブロッキング抗体（マウス当たり１００μｇ）及びＣＣＲ１阻害剤ＢＸ４７１（２０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．投与で処置した。ブレンソカチブ処置については、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１×１０^５個の４Ｔ１細胞を同所接種し、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに２×１０^５個のＡＴ３を同所接種した。ビヒクル対照（０．５％ＨＰＭＣ、０．１Ｍクエン酸緩衝液中の０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ３）及びブレンソカチブ（５ｍｇ／ｋｇ）を、マウスを屠殺するまで１日２回経口投与した。同所性腫瘍を、約１ｃｍ^３のサイズで外科的に除去した。１×１０^５個のＬＭ２細胞の静脈内接種後、組換えヒト活性ＰＲ３処理（１．５ｍｇ／ｋｇ）を毎日静脈内投与した。ＴＳＰ－１分解アッセイについては、マウスに、がん細胞注射の２時間前にＧＳＫ４８４（２０ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．注射し、続いて毎日処置を行った。次いで、３×１０^６個のＡＴ３又は４Ｔ０７細胞の注射の７２時間後に、血液が除去されるまで、肺に右室を通して５０ｍｌの事前冷却ＰＢＳを灌流した。ＢＬＩをＮｉｇｈｔＯＷＬ ＩＩ ＬＢ９８３ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ （ＢＥＲＴ－ｈｏｌｄ）及びＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で取得した。全ての動物試験は、実験動物のケア及び使用に関するガイドラインに従って実施され、 Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈの施設動物ケア及び使用委員会によって承認された。

【0137】

ウェスタンブロット
培養細胞をスクレーパーにより収集又はトリプシン処理し、次いで溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ－４０洗剤、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤を用いた０．１％のＳＤＳ）で溶解し、分散させた組織を氷上のＲＩＰＡ緩衝液中で１５分間均質化し、続いて１７，０００ｇで１５分間遠心分離した。タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキットで測定した。膜タンパク質、ＩＬ－１β処理、ｐ６５リン酸化及び他のアッセイについては、それぞれ１０μｇ、８０μｇ、３０μｇのタンパク質を投入し、８～１２％のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル上で分離した。がん細胞馴化培地（ＣＭ）収集については、細胞を１０ｃｍ培養皿内で約８０％コンフルエンスまで増殖させた。３７℃で無血清培地で３回洗浄した後、細胞を無血清培地中で３７℃で２４時間インキュベートした。ＣＭを収集し、２，０００ｇで１０分間遠心分離し、０．２２μｍフィルターによって濾過し、使用するまで－８０℃で保管した。ＣＭ中の分泌タンパク質を、ＴＣＡ沈殿によって収集した。簡潔に述べると、２５％ｖ／ｖのＴＣＡを、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤とともに１ｍｌのＣＭに添加し、４℃で一晩インキュベートし、次いで２０，０００ｇで６０分間遠心分離し、その後、上清を廃棄し、ペレットを１ｍｌの事前冷却アセトンで２回洗浄し、２０，０００ｇで４℃で５分間再度遠心分離した。乾燥タンパク質ペレットを溶解緩衝液で溶解し、１２％のＳＤＳ－ポリ－アクリルアミドゲル上で分離した。

【0138】

肺転移及び転移性ニッチにおける間質成分のＦＡＣＳ分析
間質含有量分析の手順は、以前にＺｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｌｕｎｇ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＤＫＫ１，”Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９：１２７４－１２８５（２０１７）で説明されている。簡潔に述べると、肺転移を採取し、粉砕し、５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＩＩ型（ＬＳ００４１８２、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、０．００１％（Ｗ／Ｖ）ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｄ－４５２７、Ｓｉｇｍａ）及び１％（ｗ／ｗ）Ｄｉｓｐａｓｅ（１７１０５－０４１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって３７℃で１時間更に消化させた。早期転移性ニッチにおける免疫細胞の分析については、血液が除去されるまで、肺に右室を通して５０ｍｌのＰＢＳを灌流した。肺組織の単細胞懸濁液を上記のように調製した。次いで、赤血球をＲＢＣ溶解試薬（５５５８９９、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で溶解した。細胞をＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（２．４Ｇ２、ＢＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに４℃で１０分間インキュベートして、抗体染色の前にＦｃＲをブロックした。フローサイトメトリーをＧａｌｌｉｏｕｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＦＡＣＳシステムによって実施し、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアによって定量化した。

【0139】

好中球単離
骨髄から好中球を単離するために、８～１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスからの骨髄細胞を、Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋（１４１８５０５２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）なしの滅菌ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）中で採取し、２層Ｐｅｒｃｏｌｌ（１７０８９１０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）勾配（ＨＢＳＳ中７２％及び６３．５％）の上に置き、続いて、１，２００ｇで、２５℃で３０分間遠心分離した。６３．５％～７２％の画分の界面で濃縮された好中球は、フローサイトメトリー分析によって＞９５％の純度のものであることが確認された。マウスの末梢血から好中球を単離するために、心穿刺（動物１匹当たり１ｍｌ）を介して全血を収集し、１５ｍＭのＥＤＴＡを含むＨＢＳＳ（動物１匹当たり２ｍｌ）中に懸濁した。遠心分離（４００ｇ、１０分、４℃）後、白血球を２ｍＭのＥＤＴＡを含む２ｍｌのＨＢＳＳ中に再懸濁した。次いで、細胞を、３層Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配（７８％、６９％、及び５２％）で中断なく遠心分離した（１５００ｇ、３０分、室温）。フローサイトメトリー分析により、６９％及び７８％の層の界面で濃縮された好中球の純度が９５％超であることが確認された。Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（１１１４６８３、Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）を使用して密度勾配分離し、室温で５００ｇで３０分間遠心分離することによって、健康な女性ボランティア及び乳がん患者の末梢血からヒト好中球を単離した。単離された好中球の純度を、Ｍａｙ－Ｇｒｕｎｗａｌｄ－Ｇｉｅｍｓａ染色（４０７５１ＥＳ０２、Ｙｅａ－ｓｅｎ）によって決定した。別段の記載がない限り、好中球を、０．２％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。

【0140】

インビトロＮＥＴ分析
ＮＥＴ形成を評価するために、好中球（２．５×１０^５個の細胞）を、２４ウェルプレート中のポリ－Ｌ－リジン（Ｐ４７０７、Ｓｉｇｍａ）でコーティングされたカバースリップに３０分間播種した後、１０％のがん細胞ＣＭ、Ｓｉｖｅｌｅｓｔａｔ（１０μＭ）、ＰＭＡ（２０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ）、Ｃｌ－アミジン（１００μＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋ）、及び／又はＤＮａｓｅ Ｉ（１μｇ／ｍｌ）を添加した。３７℃で１２～１６時間後、好中球を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で室温で１０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で５分間透過化した。細胞を、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で３０分間ブロックし、次いで、４℃で一晩ブロッキング緩衝液中で、抗ヒストンＨ３（１：５０、３６８０、ＣＳＴ）及び抗ＮＥ（１：１００、ａｂ６８６７２、ＡＢＣＡＭ）、又は抗ＭＰＯ（１：４００、ＡＦ３６６７、Ｒ＆Ｄ）及びＣｉ－Ｈ３（１：２００、ａｂ５１０３、ＡＢＣＡＭ）でインキュベートした。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、細胞を蛍光色素複合二次抗体（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１時間インキュベートし、次いでＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ、１０２３６２７６００１）で対比染色してからマウントした（Ｄａｋｏ、Ｓ３０２３）。共焦点顕微鏡Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ（ＺＥＩＳＳ、ドイツ）で観察及び撮影を行い、Ｚｅｎブルーエディションソフトウェア（ＺＥＩＳＳ、ドイツ）で画像処理及び分析を行った。ＮＥＴ面積定量は、ＤＡＮＡ法（Ｒｅｂｅｒｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ ａｒｅａ ａｎｄ ＮＥＴｏｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ （ＤＡＮＡ）：ａ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｑｕａｎｔｉｆｙ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ ｉｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｉｍａｇｅｓ，”Ｂｉｏｌ．Ｐｒｏｃｅｄ．Ｏｎｌｉｎｅ ２０：７（２０１８））を使用して行った。簡潔に述べると、ＮＥＴ形態を示す構造の面積と、Ｃｉ－Ｈ３又は全Ｈ３について陽性である面積をＮＥＴｏｔｉｃ細胞面積としてカウントし、ＮＥＴｏｔｉｃ細胞面積を全ＤＮＡ面積で除した面積としてＮＥＴ面積パーセンテージを分析した。ＮＥＴｏｔｉｃ細胞のパーセンテージを、前述のように分析した（Ｖａｌｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃａｌｌｙ ｕｓｅｆｕｌ ｇｅｎｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ，”Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１６１７－１６２８（２００４））。細胞をインキュベートし、細胞透過性ＳＹＴＯ赤色（１μＭ）及び細胞透過性ＳＹ－ＴＯＸ緑色（１μＭ）の両方で３時間同時に染色した。次いで、上清を廃棄し、細胞を４℃で、４％のＰＦＡによって固定した。共焦点顕微鏡Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ（ＺＥＩＳＳ、ドイツ）によって画像を撮影した。ＮＥＴｏｔｉｃ細胞の数を全細胞数で除したものとして、ＮＥＴｏｔｉｃ細胞のパーセンテージをカウントした。

【0141】

循環ＮＥＴの検出
循環ＮＥＴを分析するために、ヒト血清中のＭＰＯ－ＤＮＡ複合体又はマウス血清中の又はＮＥ－ＤＮＡ複合体を、前述の捕捉ＥＬＩＳＡ法（Ｋｅｓｓｅｎｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｅｔｔｉｎｇ ｎｅｕｔｒｏ－ｐｈｉｌｓ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｓｍａｌｌ－ｖｅｓｓｅｌ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ，”Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１５：６２３－６２５（２００９）、Ｔｅｉｊｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，“ＣＸＣＲ１ ａｎｄ ＣＸＣＲ２ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎｄｕｃｅ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，”Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５２：８５６－８７１ ｅ８５８（２０２０））をわずかな修飾とともに使用してアッセイした。ヒト血清ＭＰＯ－ＤＮＡを分析するために、９６ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（４４－２４０４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、４℃で一晩、５μｇ／ｍｌの抗ＭＰＯ（０４００－０００２、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）捕捉抗体でコーティングした。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、室温で４５分間、ＰＢＳ中５％のＢＳＡでウェルをブロックした。次いで、５０μｌの患者血清をペルオキシダーゼ標識抗ＤＮＡモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ、１１７７４４２５００１の成分２）とともに添加し、室温で２時間インキュベートし、プレートを洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄した。マウス血清ＮＥＴを分析するために、ＮＥ－ＤＮＡ複合体を、製造業者の指示に従って、上記のペルオキシダーゼ標識抗ＤＮＡモノクローナル抗体と組み合わせて、マウスＮＥ ＥＬＩＳＡキット（ａｂ２５２３５６、ＡＢＣＡＭ）を使用して捕捉した。ＰＢＳ洗浄を３回行った後、ペルオキシダーゼ基質（Ｒｏｃｈｅ、１１７７４４２５００１）を添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、シグナルを４０５ｎｍで測定した。

【0142】

２チャンバー好中球遊走アッセイ
２チャンバー遊走アッセイの手順は、以前に説明されている（Ｚｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｌｕｎｇ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＤＫＫ１，”Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９：１２７４－１２８５（２０１７））。簡潔に述べると、ＲＰＭＩ １６４０中の５×１０^５個の新たに単離された好中球を上部チャンバー（３６３０９６、ＢＤ）に添加し、ＲＰＭＩ １６４０とがん細胞ＣＭとの１：１混合物、又はがん細胞ＣＭ中で培養された好中球由来の培地を、化学誘引剤として下部チャンバーに添加した。下部チャンバー内の遊走した細胞を、３時間後に数えた。

【0143】

好中球原形質膜タンパク質の単離
ＨＬ－６０由来好中球の原形質膜タンパク質を、以前に報告されたプロトコル（Ｓｕｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ，”Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．９：３１２－３２２（２０１４）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｃｏａｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｌｌｅｖｉａｔｅ ｊｏｉｎｔ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，”Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ １３：１１８２－１１９０（２０１８））に従って精製した。ＨＬ－６０細胞から誘導された好中球を、分化培地（ＩＭＤＭ、１０％ ＦＢＳ、１．２５％ＤＭＳＯ）中で８日間培養した。膜タンパク質を採取するために、凍結細胞を解凍し、１×１０^８個の細胞胞／ｍｌの密度でプロテアーゼ阻害剤カクテル（５３９１３４、Ｍｅｒｃｋ）又はシステインプロテアーゼ阻害剤Ｅ６４ｄ（ＨＹ－１００２２９、ＭＣＥ）を含む低張性溶解緩衝液（２２５ｍＭのＤ－マンニトール、３０ｍＭ ｐＨ７．５のトリス－ＨＣｌ、０．２ｍＭのＥＧＴＡ、７５ｍＭのスクロース）中に懸濁した。細胞を氷冷Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザ（２０パス）内で均質化し、次いで２０，０００ｇで２０分間４℃で遠心分離し、その後ペレットを廃棄し、上清を１００，０００ｇで３０分間４℃で再度遠心分離した。上清は、細胞質ゾル分画であった。原形質膜タンパク質を含有するペレットを、低張性溶解緩衝液中で１回洗浄した。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８９８８１）を用いて、前述のように、ヒト末梢血由来好中球から原形質膜タンパク質を単離した（Ｔｅｉ－ｊｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．“ＣＸＣＲ１ ａｎｄ ＣＸＣＲ２ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎｄｕｃｅ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，”Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５２：８５６－８７１ ｅ８５８（２０２０））。簡潔に述べると、細胞を、非細胞透過性及びチオール切断可能なアミン反応性ビオチン化試薬であるＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＳＳ－Ｂｉｏｔｉｎで標識した。次いで、Ｐｉｅｒｃｅ ＩＰ溶解緩衝液（２５ｍＭのトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ－４０、及び５％のグリセロール）で溶解し、５回の１秒バーストを用いて氷上で超音波処理することによって、細胞溶解物全体を得た。ビオチン化細胞膜タンパク質をＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ－ａｇａｒｏｓｅ樹脂によって精製し、５ｍＭのジチオスレイトールを含有するＰｉｅｒｃｅ ＩＰ溶解緩衝液でインキュベートすることによって放出した。

【0144】

酵素活性アッセイ
酵素活性アッセイの手順を、以前に報告されたように実施した（Ｋｏｒｋｍａｚ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３ ａｎｄ ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｉ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｃ） ａｓ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙａｎｇｉｉｔｉｓ（Ｗｅｇｅｎｅｒ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ），”Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．３５：４１１－４２１（２００８））。細胞懸濁液又は遊離酵素によって、ＰＲ３特異的基質（Ａｂｚ）－ＶＡＤｎｏｒＶＡＤＲＱ－（ＥＤＤｎｐ）又はＮＥ特異的基質（Ａｂｚ）－ＡＰＥＥＩＭＲＲＱ－（ＥＤＤｎｐ）の加水分解速度を検出することによって、ＰＲ３又はＮＥ酵素活性を定量化した。膜結合ＰＲ３活性を分析するために、好中球を、がん細胞ＣＭ又は非馴化培地中で培養し、ＤＭＳＯ又はＳｉｖｅｌｅｓｔａｔ（１０μＭ）、Ａｌｖｅｌｅｓｔａｔ（１０μＭ）、及びＣＴＳＧｉ（２０μＭ）を含む様々な阻害剤で、３７℃で３０～４５分間処理した。次いで、細胞を、１５μＭのＰＲ３特異的基質とともに活性緩衝液（１ｍｌ当たり５×１０^６、ＰＢＳ、４ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ７．４）中に懸濁し、加水分解の動態に続いて、λ_ｅｘ＝３２０ｎｍ及びλ_ｅｍ＝４２０ｎｍでの蛍光を測定した。単離された形質膜画分におけるＰＲ３の活性化のために、組換えヒトＣＴＳＣ（１０７１－ＣＹ、Ｒ＆Ｄ）を製造業者の指示に従って活性化した。次いで、形質膜タンパク質を、１ｍｌ当たり２５０μｇに希釈し、活性化緩衝液（２５ｍＭのＭＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．０）中で１時間、活性ヒトＣＴＳＣとともにインキュベートした。遊離ＰＲ３及びＮＥの活性を、λ_ｅｘ＝３２０ｎｍ及びλ_ｅｍ＝４２０ｎｍでの蛍光を記録することによって、１５μＭの特異的基質を有するアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で測定した。

【0145】

サイトカイン抗体アレイ
製造業者の指示に従い、マウスサイトカイン抗体アレイ（ａｂ１３３９９４、ＡＢＣＡＭ）を使用して、４Ｔ０７細胞からＣＭで培養された好中球の培地中でサイトカインを検出した。簡潔に述べると、膜をブロッキング緩衝液で４５分間ブロックし、次いでプロテアーゼ阻害剤カクテル（５３９１３４、Ｍｅｒｃｋ）を含有する試料１ｍｌとともに４℃で一晩インキュベートした。ビオチン結合抗体及びＨＲＰ－ストレプトアビジンインキュベーション後、化学発光検出を行った。アレイに含まれるサイトカインは、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｌｕｎｇ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２９：１－１５（２０２１）の表Ｓ５に列挙されている。

【0146】

ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡキットを使用して、製造業者の指示に従い、細胞培養上清又は血清中のヒトＩＬ－１β（８８－７６２１－８８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、マウスＩＬ－１ β（４３２６０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、マウスＩＬ６（８８－７０６４－８８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、マウスＣＣＬ３（８８－５６０１３－８８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のレベルをアッセイした。簡潔に述べると、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）ＥＬＩＳＡプレート（４４－２４０４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、コーティング緩衝液（１５ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３、３５ｍＭのＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．６）中で４℃で一晩、捕捉抗体でコーティングした。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、室温で４５分間、ＰＢＳ中５％のＢＳＡでウェルをブロックした。次いで、１００μｌの細胞培養上清又は血清及び標準試料を、ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートし、プレートを、洗浄緩衝液（１％のＢＳＡ、ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄した。次に、２．５％ＢＳＡ中のビオチン結合検出抗体をウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ＨＲＰ－ストレプトアビジンを室温で４５分間インキュベートした。次いで、ＴＭＢ溶液を使用してシグナルを検出し、４５０ｎｍで読み取った。

【0147】

免疫蛍光（ＩＦ）染色
マウスの肺組織については、血液が除去されるまで、肺に右室を通して５０ｍｌのＰＢＳを灌流した。次いで、組織を事前冷却ＰＢＳですすぎ、振盪器上で、４℃で４％のＰＦＡ中で２時間固定し、ＰＢＳ中の３０％スクロースによって一晩脱水し、ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ、４５８３）中に４℃で１時間埋め込み、続いて、－８０℃で凍結した。組織を１０μｍの厚さに切片化し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で１５分間透過化し、５％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で４５分間ブロックした。ＥｄＵ染色には、ＣＬＩＣＫ ＰＬＵＳ ＥｄＵ ６４７ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃ１０６４０）を使用した。

【0148】

三次元スフェロイド培養
３Ｄスフェロイド培養アッセイの手順は、以前に報告されている（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｙｓｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｍｅｃｈａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ，”Ｎｅｏｐｌａｓｉａ １３：４０６－４１８（２０１１））。簡潔に述べると、４Ｔ０７細胞（ウェル当たり２００個）を、スフェロイド培地中の１００％増殖因子低減マトリゲル（３５６２３１、ＢＤ）クッション上の４８ウェルプレート（１％ＦＢＳ ＤＭＥＭと、がん細胞ＣＭ中で培養した好中球由来の培地との１：１混合物、５０μｇ／ｍｌのｍＴＳＰ－１（７８５９－ＴＨ－０５０）を補充した５０％マトリゲル）で培養した。ゲル化が完了すると、１０μｇ／ｍｌのｍＴＳＰ－１（７８５９－ＴＨ－０５０）を含む２５０μｌの培養培地（１％のＦＢＳ ＤＭＥＭと、がん細胞ＣＭ中で培養した好中球由来の培地との１：１混合物）を、各ウェルに添加し、培養培地を３日毎に交換した。７～１０日目に、スフェロイドの数を分析した。

【0149】

活性酸素種（ＲＯＳ）分析
ＲＯＳレベルを測定するために、好中球を、がん細胞ＣＭ又は非馴化培地中で培養し、ＤＭＳＯ又はＳｉｖｅｌｅｓｔａｔ（１０μＭ）、ＢＡＹ１１－７０８２（１０μＭ）、及びＳＢ２０３５８０（１０μＭ）を含む様々な阻害剤で、３７℃で１時間処理した。次いで、細胞を採取し、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、４ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ７．４、１０μＭのＣＭ－Ｈ２ＤＣＦＤＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎを含む）中で再懸濁し、３７℃で１５分間、暗闇中でインキュベートし、事前冷却ＰＢＳで洗浄し、続いて、３０分以内にＦＡＣＳ分析した。

【0150】

臨床的分析
全てのホルマリン固定ヒト乳がん組織をパラフィンに包埋し、試料を６μｍの厚さに切片化した。パラフィン包埋切片を脱パラフィン化し、再水和した。抗原回収を、クエン酸溶液（ｐＨ６．０）又はＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）によって９５℃で行った。次いで、切片をＰＢＳで２回洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で１５分間透過化し、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で４５分間ブロックした。次に、上述のようにＩＦ染色を行った。ＣＴＳＣ、Ｃｉ－Ｈ３及びＭＰＯの相対染色強度を、ＤＡＰＩ染色強度に対する正規化によって計算した。各試料について、陰性、低、中、又は高としてＩＦレベルをスコア化した。試料を、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存分析のカットオフとして、全ての染色原発腫瘍の中央値染色強度を有するＣＴＳＣ高発現又は低発現群に分類した。血清試料を、製造元の指示に従って血液前処理後にＣＴＳＣ ＥＬＩＳＡキット（ＥＬＨ－Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｃ、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）で分析した。

【0151】

統計分析
データ分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＵＳＡ）を使用して行った。データ提示及び統計解析は、図の凡例に説明されている。ｐ値＜０．０５が統計的に有意であると見なされた。図の凡例に示されるように、インビトロでの実験を独立して複数回繰り返し、同様の結果を得た。

【0152】

実施例１：肺転移の可能性が高い乳がん細胞におけるＣＴＳＣ発現
７４個の原発病変及び２９個の肺転移病変が、乳がん患者から得られた。これらには、７人の乳がん患者からの対形成された原発腫瘍及び肺転移が含まれる。図１Ａ～Ｃに示すように、試料のＣＴＳＣタンパク質発現レベルを、免疫蛍光染色によって分析する。

【0153】

ＣＴＳＣが乳がんの肺転移と臨床的に関係することを検証するために、乳がんを有する患者の血清中のＣＴＳＣのレベルを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定する。次いで、腫瘍試料中のＣＴＳＣタンパク質の発現レベルに従って患者を２つの群に分け、第１の群は、高いＣＴＳＣ発現に対応し、第２の群は、低いＣＴＳＣ発現に対応する。最後に、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存分析を用いて、２つの群の患者の予後（無転移生存及び全生存）を比較する。

【0154】

免疫蛍光（ＩＦ）染色によるＣＴＳＣタンパク質発現レベルの分析は、乳がん患者由来の原発腫瘍と比較して、肺転移におけるＣＴＳＣタンパク質レベルが有意に上方制御されることを示す（図１Ａ）。図１Ａの免疫蛍光画像から、対になった原発腫瘍及び肺転移における相対ＣＴＳＣタンパク質レベルを、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色（図１Ｂ）への正規化によって計算する。図１Ｂに示されるように、ＣＴＳＣ発現は、対になった原発腫瘍と比較して、肺転移において上昇する。更に、図１Ｃに示されるように、１０３個の腫瘍試料の全てを一緒に考察すると、一般に、ＣＴＳＣは肺転移において高度に発現されるが、原発腫瘍の過半数において、ＣＴＳＣ発現が低いか、又は全くない。

【0155】

より高い血清ＣＴＳＣ濃度は、乳がん患者における肺転移の再発と相関する（図１Ｄ）。図１Ｄに示されるように、肺転移の再発を経験する乳がん患者は、転移の再発を伴わない乳がん患者と比較して、血清中のＣＴＳＣレベルが有意に高い。そのような血清ＣＴＳＣレベルの上昇は、より短い無転移及び全患者生存時間に対応することが示されている（図１Ｅ～Ｆ）。図１Ｅに示されるように、血清中のＣＴＳＣ発現レベルが高い患者の肺転移のない生存期間は、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ分析によれば、低いＣＴＳＣ血清発現の患者よりも有意に短い。更に、図１Ｆに示されるように、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ分析によれば、高ＣＴＳＣ発現群の患者は、低ＣＴＳＣ発現群の患者よりも有意に短い全生存期間を有する。

【0156】

図１Ａ～Ｆに実証されるデータは、ＣＴＳＣ分泌レベルが、乳がん患者における肺転移の可能性と有意な正の相関を有し、ＣＴＳＣが、乳がん患者における肺転移のリスクを予測するためのマーカー遺伝子として使用され得ることを示す。

【0157】

実施例２：乳がんの肺転移に対するＣＴＳＣ過剰発現の影響
ＣＴＳＣが乳がんの肺転移を機能的に促進することを検証するため、ＣＴＳＣは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１のサブラインであるＳＣＰ２８で過剰発現され、内因性ＣＴＳＣレベルの中央値と肺転移の低い可能性を示す。肺転移に対するＣＴＳＣ過剰発現の結果をアッセイするために、尾静脈注射を介して、ルシフェラーゼでタグ付けされたＳＣＰ２８対照細胞又はＣＴＳＣ過剰発現ルシフェラーゼでタグ付けされたＳＣＰ２８細胞をマウスに導入する。ルシフェラーゼシグナルの定量を介して肺転移の程度を検出するために、インビボ画像化を行う。

【0158】

ルシフェラーゼでタグ付けされたＳＣＰ２８対照細胞（１）又はルシフェラーゼでタグ付けされたＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞（２）を、尾静脈注射を介してマウスに導入する。マウスの２つの群（すなわち、対照細胞を注射したマウス又はＣＴＳＣ過剰発現細胞を注射したマウス）の肺組織のルシフェラーゼシグナルを評価し、２つの群の肺表面転移性結節の数を決定し、２つの群の全生存率を計算して、肺転移に対するＣＴＳＣ過剰発現の結果を決定する。結果を図２Ａ～Ｄに示す。

【0159】

図２Ａの左パネルは、ＣＴＳＣ ｍＲＮＡレベルが、対照ＳＣＰ２８細胞（「ｐＭＳＣＶ群」）と比較して、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞においてより高いことを裏付けている。図２Ａの右パネルは、ＣＴＳＣタンパク質レベルが、対照群と比較して実際にＣＴＳＣ過剰発現群において上方制御されることを示すウェスタンブロット画像を示す。「ＣＭ」は、馴化培地である。

【0160】

図２Ｂの左パネルにグラフ表示されるように、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスは、５週間の期間を通して、ＣＴＳＣ過剰発現群における生物発光の全体的なレベルがより高いことによって示されるように、対照マウスと比較して有意に多くの肺転移を示す。図２Ｂの右パネルに示されるように、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を移植したマウスは、注射後３５日で対照ＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスよりも有意に多くの肺転移を示す。

【0161】

図２Ｃの左パネルにグラフ表示されるように、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を移植されたマウスの肺は、対照ＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスと比較して、肺表面転移性結節の平均数が多い。図２Ｃの中央パネルは、対照ＳＣＰ２８細胞を注射されたマウス及びＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスの全肺画像を示す。ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスの全肺には、より多くの可視肺表面転移性結節が含まれていることが観察される。図２Ｂの右パネルは、対照ＳＣＰ２８細胞を注射されたマウス、及びＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスからのＨＥ染色された肺組織を比較している。ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスの肺組織の結節密度は、ＳＣＰ２８対照細胞を注射されたマウスの結節密度よりも有意に高いことが観察される。

【0162】

生存率は、ＣＴＳＣの過剰発現の影響を受ける。対照ＳＣＰ２８細胞を注射された群と比較して、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射されたマウスの生存率は有意に低減する（図２Ｄ）。

【0163】

図２Ａ～Ｄに示されるデータは、ＣＴＳＣの過剰発現が、マウス尾静脈注射によってアッセイされるように、乳がん細胞の肺転移を機能的に促進し得ることを実証している。

【0164】

実施例３：乳がんの肺転移に対するＣＴＳＣノックダウンの影響
乳がん細胞の肺転移に対するＣＴＳＣ喪失の機能的影響を評価するために、肺転移の可能性が高いことが知られているＭＤＡ－ＭＢ－２３１のサブラインであるＬＭ２－４１７５を使用する。ＣＴＳＣ（ｓｈＣＴＳＣ＃１及びｓｈＣＴＳＣ＃２）のレベルが低減した対照ルシフェラーゼタグＬＭ２－４１７５又はルシフェラーゼタグＬＭ２－４１７５のマウス尾静脈注射後の肺転移を、実施例２のように評価する。対照ルシフェラーゼタグＬＭ２－４１７５及びルシフェラーゼタグＣＴＳＣ低減ＬＭ２－４１７５を注射されたマウスの肺組織の蛍光シグナル及び肺表面転移性結節の数、並びにそれぞれの生存率を計算する。結果を図３Ａ～Ｄに示す。

【0165】

図３Ａの左パネルは、ＣＴＳＣを標的とするｓｈＲＮＡを有するＬＭ２－４１７５細胞（「ｓｈＣＴＳＣ＃１」及び「ｓｈＣＴＳＣ＃２」）において、対照ＬＭ２－４１７５細胞（「ｐＳｕｐｅｒ」群）と比較してＣＴＳＣ ｍＲＮＡレベルが低いことを裏付けている。図３Ａの右パネルは、対照ＬＭ２－４１７５細胞（「ｐＳｕｐｅｒ」群）と比較して、ＬＭ２－４１７５細胞（「ｓｈＣＴＳＣ＃１」及び「ｓｈＣＴＳＣ＃２」）におけるＣＴＳＣのｓｈＲＮＡノックダウン後のＣＴＳＣタンパク質の低減を裏付けるウェスタンブロット画像を示す。「ＣＭ」は、馴化培地である。

【0166】

ＣＴＳＣ低減ＬＭ２－４１７５細胞を有するマウスの尾静脈注射後、肺転移及び肺表面転移性結節形成が低減し（それぞれ図３Ｂ及び３Ｃ）、無転移生存率が、ＬＭ２－４１７５対照細胞を注射されたマウスと比較して増加する（図３Ｄ）。

【0167】

図３Ａ～Ｄに実証されるデータは、ＣＴＳＣノックダウンが、マウス尾静脈注射によってアッセイされるように、生存期間を延長するように乳がん細胞の肺転移を減衰させることができることを示す。

【0168】

実施例４：免疫完全マウスにおける乳がんの肺転移に対するＣＴＳＣ発現の影響
乳がんの肺転移に対するＣＴＳＣ発現の効果を検証するために、マウスの免疫系が肺転移に及ぼす影響を検証する。無傷免疫系を有するＢＡＬＢ／ｃマウスモデルを用いて、２種類の実験を行う。

【0169】

第１の種類の実験では、ともにルシフェラーゼでタグ付けされた４Ｔ０７対照細胞株及び過剰発現ＣＴＳＣを有する４Ｔ０７マウス乳がん細胞株を、免疫能のあるＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に注射して、マウスの対照群及びＣＴＳＣ過剰発現群を生成する。次いで、２つの群のマウスの肺組織の蛍光シグナル及び肺表面転移性結節の数を取得する。結果を図４Ｂ～Ｃに示す。

【0170】

第２の種類の実験では、４Ｔ１対照細胞株及び低減したＣＴＳＣを有する４Ｔ１細胞株を、免疫能のあるＢＡＬＢ／ｃマウスの乳脂肪パッドに注射して、マウスの対照群及びＣＴＳＣノックダウン群を生成する。次いで、２つの群のマウスの腫瘍増殖体積及び肺結節の数を取得する。結果を図４Ｄ～Ｅに示す。

【0171】

図４Ａの左パネルは、ＣＴＳＣ ｍＲＮＡレベルが、対照細胞株と比較して、４Ｔ０７細胞においてより高いことを裏付けている。図４Ａの中央パネルは、ＣＴＳＣがノックダウンされた４Ｔ１細胞（「ｓｈＣＴＳＣ＃１」及び「ｓｈＣＴＳＣ＃２」）におけるＣＴＳＣ ｍＲＮＡレベルが、対照細胞（「ｐＶＬＸ」群）と比較して低いことを裏付けている。図４Ａの右パネルは、対応する対照群と比較して、ＣＴＳＣ過剰発現細胞においてＣＴＳＣタンパク質レベルが上方制御され、２つのＣＴＳＣノックダウン群において下方制御されることを示すウェスタンブロット画像を示す。「ＣＭ」は、馴化培地である。

【0172】

図４Ｂは、過剰発現ＣＴＳＣを有する４Ｔ０７細胞を用いて免疫完全マウスを静脈内注射した後、肺への腫瘍転移が上方制御され、それによって、ＣＴＳＣ過剰発現が肺における腫瘍細胞の成長を有意に促進し、この効果がＢＡＬＢ／ｃマウスの無傷の能力のある免疫系によって影響されないことを示す。

【0173】

図４Ｃは、過剰発現ＣＴＳＣを有する４Ｔ０７細胞を免疫能のあるマウスに静脈内注射した後、ＣＴＳＣ過剰発現群のマウスにおける肺結節の数が、ブランク対照群の肺結節の数よりも有意に多いことを示す。これは、ＣＴＳＣの過剰発現がマウスの肺表面転移性病変の数を有意に増加させ、この促進効果がＢＡＬＢ／ｃマウスの無傷の有能な免疫系によって影響されていないことを示している。

【0174】

一方、免疫能のあるマウスにおいて、ＣＴＳＣがノックダウンされた４Ｔ１細胞の同所性注射の後、ＣＴＳＣノックダウン群では、腫瘍体積及び腫瘍成長率の両方が、対照群と比較して低い（図４Ｄ）。更に、免疫能のあるマウスでは、ＣＴＳＣの低減は、移植部位における４Ｔ１細胞のｉｎ ｓｉｔｕ増殖に影響を及ぼさないが、対照群と比較して肺表面転移性結節の形成を有意に減少させる（図４Ｅ）。

【0175】

要約すると、図２Ａ～４Ｅに示されるデータは、ＣＴＳＣが、免疫不全及び免疫能のあるマウスにおける乳がん細胞の肺転移を促進することを立証している。

【0176】

実施例５：ＣＴＳＣは、肺転移中の乳がん細胞の早期播種及び持続的増殖を促進する。
ＣＴＳＣは、肺内の乳がん細胞の早期転移性コロニー形成において役割を果たす。ＣＴＳＣが過剰発現したＳＣＰ２８を注射されたマウスの生物発光画像化（ＢＬＩ）は、注射後の第１週中に有意な肺転移を示す（図５Ａ）。一方、ＢＬＩシグナルの減少によって明らかなように、注射後の第１週を通して、ＣＴＳＣ（ｐＭＳＣＶ）を過剰発現しない対照細胞を注射されたマウスでは、肺転移が減少するか、又は安定したままである。

【0177】

図５Ｂに示されるように、ＣＴＳＣが過剰発現したＳＣＰ２８細胞で処置したマウスの肺切片の免疫蛍光染色は、注射後２４時間、４８時間、及び７２時間で肺実質中でＣＴＳＣを過剰発現するがん細胞の播種の増加を明らかに示している。ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞を移植したマウスの肺に播種されたがん細胞の増殖を、肺採取の２４時間前に５－エチニル－２’－デオキシウリジン（ＥｄＵ）標識によって評価する。図５Ｃに示されるように、ＣＴＳＣ過剰発現細胞は、注射後２４時間、４８時間、及び７２時間の時点での肺播種後に、対照細胞よりも増殖性が高い。

【0178】

ＣＴＳＣの低減は、肺内の乳がん細胞の早期転移性コロニー形成に反対の効果を有することが示されている。ＣＴＳＣがノックダウンされたＬＭ２細胞を注射されたマウスのＢＬＩは、対照細胞を注射されたマウスと比較して、注射後第１週を通して有意に肺転移が減少したことを示す（図５Ｄ）。

【0179】

図５Ｅに示されるように、ＣＴＳＣがノックダウンされたＬＭ２で処置したマウスの肺切片の免疫蛍光染色は、注射後７２時間での肺実質中のＧＦＰ^＋がん細胞の播種の減少を明らかに示している。図５Ｆの右パネルに示されるように、Ｅｄｕ標識は、注射後７２時間での対照細胞と比較して、播種されたＣＴＳＣ過剰発現細胞の増殖が少ないことを示す。

【0180】

ＣＴＳＣ低減は、後期転移においてがん細胞の転移性増殖を阻害することも示されている。図５Ｇに示されるように、注射の６週間後にＣＴＳＣノックダウン細胞を注射されたマウスの肺のＫｉ６７染色は、対照細胞を注射されたマウスの肺と比較して、肺転移の減少を明らかに示している。

【0181】

図５Ａ～Ｇに実証されるデータは、ＣＴＳＣ発現レベルが、転移の播種段階中の腫瘍細胞の増殖に影響することを示している。

【0182】

実施例６：ＣＴＳＣは、肺転移における好中球の動員を促進する
ＣＴＳＣは、肺転移における好中球動員の調節において役割を果たす。処置マウスにおける肺転移のＣＤ４５^＋免疫細胞中のＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球のパーセンテージは、注射後７週目のフローサイトメトリーによって決定される。図６Ａの左パネルに示されるように、ＣＴＳＣが過剰発現したＳＣＰ２８細胞は、対照細胞と比較して、より高いパーセンテージのＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球を含有する。逆に、図６Ａの中央パネルに示されるように、ＣＴＳＣが低減したＬＭ２細胞は、対照細胞と比較して、より低いパーセンテージのＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球を含有する。図６Ａの最右パネルは、ＣＴＳＣ過剰発現細胞が、対照細胞（３．８％）と比較して、より高いパーセンテージの好中球（１１．７％）（両方のグラフで丸で囲まれている）を有することを示すフローサイトメトリー分析を提示している。

【0183】

処置マウスにおける肺実質中のＣＤ４５^＋免疫細胞中のＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球のパーセンテージはまた、注射後７２時間におけるフローサイトメトリーによって決定される。図６Ｂの左パネルに示されるように、ＣＴＳＣが過剰発現したＳＣＰ２８細胞は、対照細胞よりも高いパーセンテージのＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球を含有する。図６Ｂの右パネルに示されるように、ＣＴＳＣが低減したＬＭ２細胞は、対照細胞と比較して、より少ないパーセンテージのＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球を含有する。

【0184】

マウス肺組織の免疫染色は、対照ｐＭＳＣＶ細胞と比較して、ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８細胞（図６Ｃ、左パネル）を注射したマウスにおいて、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球ががん細胞に近接してクラスタ化することを示す。ＣＴＳＣが低減したＬＭ２細胞を注射したマウスにおいて、対照細胞と比較して、ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球のがん細胞との凝集が少ないことが観察される（図６Ｃ）。

【0185】

ＥｄＵ^＋標識された播種腫瘍細胞の増殖と、それらの周りのＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋好中球の凝集との間の相関を、図６Ｄに示す。

【0186】

がん細胞の初期段階の播種及び増殖は、対象マウスにおける好中球が、ＩｇＧによる前処理と比較して、ＳＣＰ２８がん細胞の注射前のＬｙ６Ｇクリアランス抗体による処理によって枯渇した場合に失われる（図６Ｅ）。同じことが、ＥｄＵ^＋標識腫瘍細胞（図６Ｆ）の初期段階の播種及び増殖にも当てはまる。加えて、ＩｇＧで前処置されたＳＣＰ２８マウスと比較して、注射後８週間での肺表面転移性結節の形成が、α－Ｌｙ６Ｇで前処置したＳＣＰ２８マウスで抑制される（図６Ｇ）。

【0187】

図６Ａ～Ｇに実証されるデータは、肺転移におけるＣＴＳＣの過剰発現が、好中球動員の増加を促進することを示している。

【0188】

実施例７：ＣＴＳＣは、ＰＲ３－ＩＬ－１β－ＮＦ－κＢ軸を制御することによって好中球の動員を増強する
ＣＴＳＣによる好中球動員の機序を調査する。ＣＴＳＣ過剰発現（４Ｔ０７細胞）及びＣＴＳＣ低減（４Ｔ１細胞）の両方は、馴化培地（ＣＭ）中のがん細胞による好中球の動員に影響を及ぼさない（図７Ａ）。しかしながら、好中球を４Ｔ０７ ＣＴＳＣ含有がん細胞馴化培地で前処理する場合、好中球培養培地は、ＣＴＳＣを過剰発現することなく、対照４Ｔ０７調節培地と比較して、より多くの好中球を引き付けることができる（図７Ａ、左パネル）。

【0189】

ＣＴＳＣ過剰発現４Ｔ０７で前処理された好中球培地のサイトカインアレイ分析は、１２時間のインキュベーション後、インタールキン－６（ＩＬ－６）、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド２及び３（ＣＣＬ２及びＣＣＬ３）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、及び可溶性腫瘍壊死因子受容体Ｉ（ＴＮＦＲＩ）が全て、対照４Ｔ０７での前処理と比較して上方制御されることを明らかに示す（図７Ｂ）。図７Ｂに示されるように、ＩＬ－６及びＣＣＬ３の上方制御が最も顕著である。

【0190】

図７Ｃは、好中球由来セリンプロテアーゼ、ＰＲ３、ＮＥ、及びＣＴＳＧの発現レベルを示すが、これらは全て、ＨＬ－６０由来好中球の様々な細胞画分におけるＣＴＳＣの既知の基質である。この実験で使用される画分マーカーは、Ｎａ／Ｋ ＡＴＰａｓｅ、ＧＲＰ７８、及びβアクチンである。図７Ｃに示されるように、ＨＬ－６０由来の好中球の細胞質膜上にはＰＲ３のみが発現され、ＣＴＳＣが好中球細胞表面上の膜結合ＰＲ３を直接制御し得ることを示す。

【0191】

次いで、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で培養したヒト好中球の膜結合ＰＲ３活性を調べる（図７Ｄ）。図７Ｄに示されるように、ＣＴＳＧ阻害剤であるＣＴＳＧｉ又はＮＥ阻害剤であるＡｌｖｅｌｅｓｔａｔのいずれかによる処置は、ＣＴＳＣ過剰発現に起因する上方制御されたＰＲ３活性に影響を及ぼさない。しかしながら、ＰＲ３阻害剤であるＳｉｌｖｅｌｅｓｔａｔによる処置は、上方制御されたＰＲ３活性を有意に減少させる。

【0192】

図７Ｅの左パネルに示されるように、４Ｔ０７（ＣＴＳＣ過剰発現を伴う）がん細胞の馴化培地で前処理された好中球の培地によって動員されたマウス好中球の遊走は、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔでの処置後に有意に減少する。

【0193】

ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８の注射から７２時間後のマウスの肺内のＧＦＰ^＋がん細胞の周りのミエロペルオキシダーゼ陽性好中球の数は、肺組織の免疫染色によって定量化される。がん細胞の周りの好中球凝集は、対照に対して増加するが、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔによる更なる処置は、好中球凝集の量を減少させる（図７Ｆ）。これらの効果は、注射後７週間にわたって持続することが示される（図７Ｇ）。図７Ｄ～Ｇに示されるデータは、ＣＴＳＣが、ＣＴＳＧ又はＮＥではなく、ＰＲ３を通して好中球を制御することを示唆している。

【0194】

図７Ｈは、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ、Ａｌｖｅｌｅｓｔａｔ、ＣＴＳＧｉ、又はＮＦ－_ＫＢ阻害剤であるＢＡＹ１１－７０８２と組み合わせて、ＣＴＳＣ過剰発現を有する、及び有さないＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で前処理されたヒト好中球のＩＬ－１β分泌を示す。４つの阻害剤のうち、ＰＲ３阻害剤Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔのみが、ＣＴＳＣが過剰発現した（ＣＴＳＣ＋、Ｓｉｌｖｅｓｔａｔ＋）ＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地で前処理された好中球のＩＬ－１βレベルを低減する。ＢＡＹ１１－７０８２によるそのような処理は、好中球におけるＣＴＳＣによるＩＬ－１βの制御がインフラマソーム経路から独立していることを示唆する。

【0195】

ＣＴＳＣ媒介性肺転移におけるＩＬ－１βの役割は、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞の同所移植を受けたマウスにおける実験によって更に検証される。ＩＬ－１βブロッキング抗体によるそのようなマウスの更なる処置は、肺ＢＬＩデータ（図７Ｉ）によって証明されるように、ＩｇＧで処置されたマウスと比較して、移植後３４日で肺転移を低減する。α－ＩＬ－１βでの更なる処置は、ＩｇＧで更に処置されたマウスと比較して、ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞を移植したマウスの肺における肺表面結節の数を低減する（図７Ｊ）。

【0196】

図７Ａ～Ｊに示されるデータは、ＣＴＳＣが、好中球ＰＲ３を活性化し、ＰＲ３－ＩＬ－１β－ＮＦ－κＢ経路によるシグナル伝達を促進することによって好中球動員を増強することを示している。

【0197】

実施例８：腫瘍におけるＣＴＳＣは、好中球を誘導して転移を支持するＮＥＴを形成する
転移性ニッチに動員された好中球による転移制御の機序を調査する。ＣＴＳＣ過剰発現ＳＣＰ２８がん細胞の馴化培地中で培養された好中球の免疫蛍光染色は、ホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテート（ＰＭＡ）で誘導されたものと同様の数で、肺内に広範な細胞外トラップ（ＮＥＴ）構造を形成する（図８Ａ）。逆に、ＣＴＳＣノックダウンＬＭ２がん細胞の馴化培地中で培養された好中球は、ＮＥＴ形成の低減を示す。

【0198】

採取した肺のＩＦ分析は、採取が注射後２４時間、４８時間、及び７２時間で行われた場合、対照と比較して、ＣＴＳＣを過剰発現する近接ＧＦＰ^＋ＳＣＰ２８がん細胞におけるＮＥＴの増加を示し、一方、反対の効果が、肺内のＣＴＳＣノックダウンＬＭ２がん細胞で観察される（図８Ｂ）。

【0199】

好中球による活性酸素種（ＲＯＳ）の放出は、ＮＥＴ形成を誘導することが知られている。Ｋｏｌａｃｋｚｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＮＥＴ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ，”Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｍ．６，６６７３（２０１５）を参照されたい。４Ｔ０７がん細胞の馴化培地で前処理されたマウス好中球のＲＯＳ分析は、ＣＴＳＣ過剰発現に起因するＲＯＳ産生の増加を示し、一方、ＣＴＳＣが過剰発現された場合、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔの添加は、ＲＯＳ産生をブロックする（図８Ｃ）。

【0200】

図８Ｄに示されるように、４Ｔ１馴化培地及び／又は組換えヒト活性ＰＲ３で前処理されたマウス好中球は、ＣＴＳＣが４Ｔ１細胞内でノックダウンされたかどうかにかかわらず、ｒｈＰＲ３の存在下でｐ３８リン酸化の増加を示す。しかし、この効果は、ＩＬ－１βブロッキング抗体を添加することによってブロックされる。

【0201】

４Ｔ０７馴化培地で前処理されたマウス好中球のＲＯＳ分析は、ＣＴＳＣ過剰発現によるＲＯＳ産生結果の増加を示す（図８Ｅ）。ＮＦ－_ＫＢ阻害剤ＢＡＹ１１－７０８２の添加は、ＲＯＳレベルに影響を及ぼさず、ＮＦ－_ＫＢシグナル伝達が好中球のＲＯＳ産生に関与していないことを示唆している。一方、ｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０の添加は、ＲＯＳレベルを有意に低減し、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路が好中球ＲＯＳ産生及びＮＥＴｏｓｉｓに関与することを示している。

【0202】

図８Ｆに示されるように、４Ｔ０７又は４Ｔ１馴化培地中で培養されたマウス好中球を、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ（ＰＲ３を阻害するため）又はＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＴを消化するため）のいずれかで処置することにより、ＮＥＴによってカバーされる低いパーセンテージの領域によって証明されるように、ＣＴＳＣがＮＥＴ形成を誘導する能力がブロックされる。更に、ＣＴＳＣを過剰発現するＳＣＰ２８細胞を注射したマウスにおける肺転移は、図８Ｇに示されるＢＬＩ結果によって明らかなように、注射後最大８週間の間、Ｓｉｌｖｅｌｅｓｔａｔ又はＤＮａｓｅ Ｉのいずれかの更なる処置によって抑制される。

【0203】

転移抑制性ＥＣＭタンパク質である組換えマウスＴＳＰ－１（ｒｍＴＳＰ－１）の添加は、ＰＭＡで前処理された好中球培地で培養した４Ｔ０７がん細胞のスフェロイド増殖をブロックすることができない（図８Ｈ）。同様に、ｒｍＴＳＰ－１の添加は、４Ｔ０７馴化培地を過剰発現するＣＴＳＣにおけるスフェロイド増殖をブロックしない。しかしながら、ＤＮａｓｅ Ｉによる更なる処置は、それぞれの場合においてスフェロイド増殖を縮小させるが、無効化するわけではない。

【0204】

ｒｍＴＳＰ－１及びＩＬ６ブロッキング抗体の両方を、４Ｔ０７馴化培地を過剰発現するＣＴＳＣに添加すると、スフェロイド増殖が阻害される（図８Ｉ、左パネル）。スフェロイド増殖は、ＤＮａｓｅ Ｉ（図８Ｉ、左パネル）の添加により更に阻害される。α－ＩＬ６、ＤＮａｓｅ Ｉ、及びそれらの組み合わせのスフェロイド形成に対する阻害効果は、図８Ｉに示される画像において観察され得る。

【0205】

全体として見ると、図８Ａ～Ｉに提供されるデータは、ＣＴＳＣが、好中球におけるｐ３８を活性化し、ＲＯＳを増加させることによって、腫瘍におけるＮＥＴｏｓｉｓを誘導し、結果として生じるＮＥＴが、腫瘍細胞における転移性増殖を支持することを実証する。

【0206】

実施例９：好中球浸潤及びＮＥＴに関するヒト乳房腫瘍試料の分析
ヒト乳がんの肺転移に対するＮＥＴ形成の臨床的関連性を調査する。

【0207】

７４のヒト原発性乳房腫瘍のセット及び２９の肺転移のセットのＩＦ分析は、ＣＴＳＣの発現、ＮＥＴの形成、及び好中球浸潤が、原発腫瘍試料と比較して肺転移試料において有意に高いことを示す（図９Ａ）。更に、ＣＴＳＣ発現レベルは、原発腫瘍及び肺転移の両方におけるＮＥＴ形成（図９Ｂ、左パネル）及び好中球浸潤（図９Ｂ、右パネル）と強く相関する。

【0208】

図９Ｃは、循環ＮＥＴレベルが非転移性腫瘍よりも肺転移性腫瘍において高いことを示し、図９Ｄは、原発腫瘍及び肺転移の両方を一緒に考慮した場合、血清ＣＴＳＣ発現レベルが血清中の循環ＮＥＴレベルと強く相関することを示す。

【0209】

３つの異なる乳がんサブタイプのＩＦ分析においても、より高いレベルのＣＴＳＣ発現、ＮＥＴ形成、及び好中球遊走が観察される（図９Ｅ）。

【0210】

図９Ａ～Ｅに示されるデータは、臨床試料において、ＣＴＳＣ発現が、乳がんの肺転移における好中球浸潤及びＮＥＴ形成に関連することを示している。

【0211】

実施例１０：ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブは、肺における乳がんの転移を阻害する
乳がんの肺転移を治療するためのＣＴＳＣ阻害剤の使用を調査する。ブレンソカチブ（ＡＺＤ７９８６又はＩＮＳ１００７としても知られる）は、非嚢胞性線維症気管支拡張症の治療に使用されるＣＴＳＣ特異的阻害剤であり、現在第ＩＩ相臨床試験に入っている。Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｃｏｖａｌｅｎｔ ＤＰＰ１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ａｎ ｏｘａｚｅｐａｎｅ ａｍｉｄｏａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ｂａｓｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｄｉｄａｔｅ （ＡＺＤ７９８６），”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５９：９４５７－９４７２（２０１６）を参照されたい。ブレンソカチブは、脂肪パッド注射による４Ｔ１細胞の導入の７日後にマウスに投与される。ビヒクル対照群も提供される。経時的な腫瘍体積の変化、形成される肺結節の数、経時的なマウス重量の変化、及びマウス生存率、並びに病変におけるＮＥＴの数の統計図を図１０Ａ～Ｅに示す。ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブはまた、４Ｔ１細胞のＮＥＴ促進腫瘍様塊形成を抑制する（図１０Ｆ）。

【0212】

４Ｔ１ ＣＴＳＣ低減表現型と一致して、ｉｎ ｓｉｔｕ腫瘍体積対時間の変化は、ブレンソカチブ投与群と未処置対照群との間で一貫しており、ブレンソカチブの投与が原発腫瘍増殖に影響を及ぼさないことを示す（図１０Ａ）。

【0213】

未処置マウスと比較して、ブレンソカチブで処置したマウスは、有意に低減された肺結節形成を呈し、ブレンソカチブ投与が肺表面上の腫瘍細胞による転移性病変の形成を阻害することができることを示す（図１０Ｂ）。

【0214】

ブレンソカチブで処置したマウスの体重減少は、未処置マウスよりも低く、ブレンソカチブ投与が肺転移に起因する体重減少を緩和することができることを示す（図１０Ｃ）。

【0215】

ブレンソカチブによる処置は、未処置マウスと比較してマウスの生存率を有意に改善し、ブレンソカチブ投与がマウスの生存期間を有意に延長することを示す（図１０Ｄ）。

【0216】

図１０Ｅは、ブレンソカチブで処置されたマウスの肺病変における好中球浸潤が、未処置マウスと比較して低減し、ブレンソカチブ投与が肺転移性病変における好中球浸潤及びＮＥＴの形成を有意に阻害することを示す。

【0217】

図１０Ｆは、４Ｔ１のＣＭで前処理された好中球の培地中で培養された４Ｔ１乳がん細胞の腫瘍様塊形成が、未処置の対照群と比較してブレンソカチブによって抑制され、ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが乳がん細胞のＮＥＴ促進腫瘍様塊形成を抑制することを示す。

【0218】

ＣＴＳＣ過剰発現ＡＴ３がん細胞の同所性注射後のブレンソカチブによるマウスの処置においても、同様の効果が見られる。ブレンソカチブ処置に起因する肺中葉、循環ＮＥＴ、好中球遊走、及び肺転移性結節形成の減少が、図１０Ｇ～Ｉに示されている。また、生存率の有意な増加及びＩＬ－１βの循環レベルの減少が、ブレンソカチブ処置マウスにおいて観察される（図１０Ｊ～Ｋ）。

【0219】

上記のデータは全て、乳がんの肺転移の臨床的治療のための潜在的な新しい標的としてのＣＴＳＣを支持している。機構的には、ＣＴＳＣは、好中球浸潤の増加及び病変部位におけるＮＥＴの数の増加によって乳がんの肺転移を促進し、それによって乳がんの肺転移を促進するための腫瘍微小環境をプライミングする。しかしながら、ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブは、好中球浸潤を効果的に阻害し、病変部位でのＮＥＴの形成を低減し、それによりマウスにおける乳がんの肺転移を阻害する。

【0220】

実施例１１：ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブは、様々な種類の転移性がん細胞による好中球の動員、ＮＥＴの形成及び腫瘍様塊形成を阻害する
腫瘍転移における好中球動員及びＮＥＴの形成に対するＣＴＳＣ上方制御の促進効果、並びに好中球機能に対するＣＴＳＣ阻害剤（ブレンソカチブ）の有益な効果を鑑みて、腫瘍転移の他の疾患（肝臓及び骨への乳がんの転移、並びに骨への肺がんの転移を含む）におけるＣＴＳＣ阻害剤の使用が考慮される。

【0221】

様々な標的器官への転移（肝臓、骨への乳がんの転移、及び骨への肺がんの転移を含む）の異なる能力を有する腫瘍細胞におけるＣＴＳＣタンパク質分泌レベルを調べる。一般に、ＣＴＳＣ発現レベルは、高転移性腫瘍細胞において増加する。骨髄由来の好中球は、ブレンソカチブあり又はなしでこれらの細胞の馴化培地（分泌物）で処理される。次いで、腫瘍分泌物が好中球を引き付ける能力を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ透過性細胞培養チャンバーで評価し、ＮＥＴの形成を、ＮＥＴ分子マーカー（ＭＰＯ及びシトルリン化ヒストンＨ３）の免疫蛍光染色によって分析する。本研究からのデータを図１１Ａ～Ｊに示す。

【0222】

好中球を引き付け（動員し）、ＮＥＴの形成を誘導する、薬物処置された腫瘍細胞の分泌物の能力は、ブレンソカチブ処置により有意に弱められる。実際に、ＣＴＳＣタンパク質発現（図１１Ａ～Ｃ）、ＮＥＴの形成（図１１Ｄ、Ｆ、Ｉ）、及び好中球動員（図１１Ｇ、Ｊ）は、ブレンソカチブで処置されたいくつかの転移性腫瘍細胞型において有意に低減される。

【0223】

インビトロでの骨及び肝転移性乳がん細胞の腫瘍細胞増殖を促進する、薬物処置された好中球の能力は、ブレンソカチブ処置により有意に弱められる。好中球を、ブレンソカチブ処置あり又はなしでがん細胞からの馴化培地で培養してＮＥＴｏｓｉｓを活性化し、次いで好中球培地を骨及び肝転移性乳がん細胞の腫瘍様塊形成に使用して、好中球培地の腫瘍細胞増殖を促進する効果を分析した。骨転移性乳がん細胞ＳＣＰ２についてのデータを図１１Ｅに、また肝転移性乳がん細胞ＳＣＰ１６についてのデータを図１１Ｈに示す。

【0224】

図１１Ａ～Ｊに示されるデータは、ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブが、乳がんの肝転移、乳がんの骨転移、及び肺がんの骨転移などの、乳がんの肺転移以外の疾患の早期転移性病変における好中球浸潤、ＮＥＴの形成及び腫瘍細胞増殖を低下させることができることを示唆している。

【0225】

実施例１２：ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブは、インビトロでの様々な種類のがんにおけるＮＥＴ促進腫瘍様塊の形成を低減する
インビトロで異なるがんの種類におけるブレンソカチブの治療効果を試験するために、ブレンソカチブがＮＥＴ促進腫瘍様塊の形成を阻害する能力を調査する。好中球を、ＮＥＴｏｓｉｓを活性化するためにブレンソカチブ処置あり又はなしで結腸がん、肝がん、肺がん、胃がん、及び膵がんの腫瘍細胞からの馴化培地で培養し、次いで、好中球培地をこれらのがん細胞の腫瘍様塊形成に使用して、好中球培地の腫瘍細胞増殖を促進する効果を分析した。次いで、各試料中の腫瘍様塊の量を、画像化により決定する。これらのがんの種類のインビトロ腫瘍増殖を阻害するブレンソカチブの効果は、図１１Ｋ～Ｏで観察される。

【0226】

実施例１３：ＣＴＳＣ阻害剤ブレンソカチブは、インビボでの肝臓における原発腫瘍増殖及び転移を低減する
一連のマウス異種移植片研究を、脾臓注射によってヌードマウスに肝臓及び膵臓腫瘍細胞を注射することによって行う。次いで、マウスをブレンソカチブによって処置し、肝臓における腫瘍の増殖を観察する。ブレンソカチブ処置は、肝臓における肝がん細胞ＨＵＨ７の腫瘍増殖（図１２Ａ、Ｂ）、及び肝臓における膵がん細胞ＫＰ４の転移性増殖（図１２Ｃ）を有意に阻害することが分かる。
＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊

【0227】

本開示は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本開示の範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われ得、等価物がその要素に置換され得ることが当業者によって理解されるであろう。加えて、記載された発明の客観的な趣旨及び範囲に対して、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスステップ又はステップ（複数）を採用するために多くの修正を行うことができる。全てのそのような修正は、本明細書に添付される特許請求の範囲内であることが意図される。

【0228】

したがって、本開示は、本開示を実施するために企図される最良の様式として開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、本開示は、添付の特許請求の範囲及び趣旨に該当する全ての実施形態を含むことが意図される。

【0229】

本明細書で参照される特許、特許出願、特許出願公開、雑誌記事、及びプロトコルは、あらゆる目的のために、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図7H】

【図7I】

【図7J】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図8I】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図10G】

【図10H】

【図10I】

【図10J】

【図10K】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図11G】

【図11H】

【図11I】

【図11J】

【図11K】

【図11L】

【図11M】

【図11N】

【図11O】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【国際調査報告】