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特表2023-540426前立腺癌診断スコアを算出するための方法及びそれの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-25
(54)【発明の名称】前立腺癌診断スコアを算出するための方法及びそれの使用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6851 20180101AFI20230915BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230915BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230915BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20230915BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6851 ZNA
G01N33/50 P
C12Q1/686 Z
C12N15/113 110Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022581715
(86)(22)【出願日】2020-09-08
(85)【翻訳文提出日】2023-03-03
(86)【国際出願番号】 KR2020012128
(87)【国際公開番号】W WO2022054976
(87)【国際公開日】2022-03-17
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523002091
【氏名又は名称】ウロテック． カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム、ウン ジェ
(72)【発明者】
【氏名】ジェオン、ピル ドゥ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA26
2G045CB03
2G045DA14
2G045FB02
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR62
4B063QS25
4B063QX02
(57)【要約】
【要約】
本明細書は、少なくとも２つの値を組み合わせることによって前立腺癌のための診断スコアを算出する方法を提供する。方法は、サンプルを調製する段階、第１の値を取得する段階、第２の値を取得する段階、及び診断スコアを算出する段階を備える。サンプルは、被験体由来の尿サンプルであり、第１の値は、サンプル中の細胞外小胞に由来するｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐの量に対応し、第２の値は、サンプル中の細胞外小胞に由来するｍｉＲＮＡに対応する。第１の値及び第２の値の両方は、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての情報を含み、第２の値は、第１の値のために特殊化された正規化係数に対応する。方法に従って算出される前立腺癌のための診断スコアは、前立腺癌を診断することができることによって特徴付けられる。本明細書は、前立腺癌のための診断スコアの使用を提供する。
本明細書は、少なくとも２つの値を組み合わせることによって前立腺癌のための診断スコアを算出する方法を提供する。方法は、サンプルを調製する段階、第１の値を取得する段階、第２の値を取得する段階、及び診断スコアを算出する段階を備える。サンプルは、被験体由来の尿サンプルであり、第１の値は、サンプル中の細胞外小胞に由来するｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐの量に対応し、第２の値は、サンプル中の細胞外小胞に由来するｍｉＲＮＡに対応する。第１の値及び第２の値の両方は、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての情報を含み、第２の値は、第１の値のために特殊化された正規化係数に対応する。方法に従って算出される前立腺癌のための診断スコアは、前立腺癌を診断することができることによって特徴付けられる。本明細書は、前立腺癌のための診断スコアの使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも２つの値を組み合わせることによって前立腺癌のための診断スコアを算出する方法であって、被験体のサンプルを調製する段階であって、
前記サンプルは尿サンプルである、被験体のサンプルを調製する段階と；
前記サンプル中の第１の標的の量に関連する第１の値を取得する段階であって、
前記第１の標的は、前記サンプル中の細胞外小胞に由来するｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９であり、
前記第１の値は、前記被験体の前記前立腺癌を診断する能力を有する第１の情報を反映し、
前記第１の値は前記第１の情報と同時に第１のノイズも反映するため、前記第１の値それ自体を単独で使用して前記被験体の前記前立腺癌を診断することができず、
前記第１のノイズは、前記前立腺癌に関連する要因から独立した内生要因によって引き起こされる、前記サンプル中の第１の標的の量に関連する第１の値を取得する段階と；
前記サンプル中の第２の標的の量に関連する第２の値を取得する段階であって、
前記第２の標的は、前記サンプル中の細胞外小胞に由来するｍｉＲＮＡであり、
前記第２の値は、前記被験体が前記前立腺癌を有するかどうかに関連する第２の情報を反映し、
前記第２の値は、前記内生要因に関連する第３の情報を反映し、
前記第３の情報は、前記第１のノイズと強く相関しており、
それにより前記第１の値において反映される前記第１のノイズは、前記第２の値を使用することによって制御することができる、前記サンプル中の第２の標的の量に関連する第２の値を取得する段階と；
前記第１の値及び前記第２の値を使用することによって、前記前立腺癌のための前記診断スコアを算出する段階と、を備え、
それにより前記診断スコアを使用して前立腺癌を診断することができる、
方法。
【請求項2】
前記第２の標的はｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記診断スコアは、前記第１の値の前記第２の値に対する比である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記内生要因は、前記サンプルに関連する第１の状態；及び
前記被験体に関連する第２の状態
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記第１の状態は、前記サンプルの量、サンプル採取時間、前記サンプルを採取する方法、サンプル保管期間、サンプル保管温度、及び前記サンプルを分割する方法
からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記第２の状態は、前記被験体の性別、前記被験体の年齢、前記被験体の人種、前記被験体の体重、前記被験体の腎機能、前記被験体の水分補給状態
からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項7】
前記第１の値を前記取得する段階は、前記サンプル中の前記第１の標的の第１のｃＤＮＡを合成する段階；
第１のプライマを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、前記第１のｃＤＮＡを増幅する段階、
前記第１のプライマは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２からなる群から選択される配列を有する；及び
前記第１のｃＤＮＡを前記増幅する段階の結果から、前記第１の値を決定する段階
をさらに有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記第２の値を前記取得する段階は、前記サンプル中の前記第２の標的の第２のｃＤＮＡを合成する段階と；
第２のプライマを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、前記第２のｃＤＮＡを増幅する段階であって、
前記第２のプライマは、前記第２の標的に相同的である配列、又は前記第２の標的に相補的である配列を含む配列を有する、前記第２のｃＤＮＡを増幅する段階と；
前記第２のｃＤＮＡを前記増幅する段階の結果から、前記第２の値を決定する段階と、
をさらに有する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記第２の標的はｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３であり、前記第２のプライマは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５からなる群から選択される配列を有する、
請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前立腺癌を診断するための検査基準を決定する方法であって、第１のデータのセットを取得する段階であって、
前記第１のデータのセットは、
前記前立腺癌を有するかどうか、コホートの各被験体の状態のリスト、及び
請求項１に従って算出される、前記コホートの各被験体の診断スコアのリスト
を含み、
前記コホートは、正常な状態又はＢＰＨ状態を有する少なくとも１の被験体、及び前記前立腺癌を有する少なくとも１の被験体を含む、第１のデータのセットを取得する段階と、；
前記第１のデータのセットから、前記前立腺癌のための前記検査基準を決定する段階と、
を備える方法。
【請求項11】
前記検査基準は、前記診断スコアと同じ次元を有する単一の値である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記検査基準は、前記前立腺癌を有する確率を表す１又は複数の値を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
被験体の前立腺癌を診断するための方法であって、請求項１に記載の被験体の前記診断スコアを算出する段階；及び
少なくとも１つの所定値を参照することによって前記診断スコアからリスク要因を決定する段階
を備える方法。
【請求項14】
前記所定値は、請求項１０に記載の検査基準を含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、被験体の尿に含まれるバイオマーカの発現量を測定することによって前立腺癌の発病の診断についての情報を提供することができる診断スコアを算出するための方法に関する技術に関する。
【背景技術】
【0002】
原理的には、前立腺癌を診断する標準的な方法は、被験体から少量の前立腺組織が採取され、次いで癌細胞の発症が決定される生検である。しかしながら、生検は被験体にとって非常に苦痛の多いプロセスが伴う。したがって、被験体が前立腺癌の発病が疑われる症状（例えば、例えば多尿症及び排尿痛などの泌尿器症状）を示すという理由のみで生検を行うことは望ましくない。したがって、被験体が前立腺癌の発病が疑われる症状を示す場合、被験体から体液（例えば、血液又は尿）を採取し、前立腺癌の発病を調べる間接的な検査を行い、次いで、これらの結果に基づいて、生検が必要であるかどうかを決定することが一般的である。現在、臨床診療において、前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＳＡ）検査が一般に行われてきており、被験体から血液を採取して、血液サンプル中のＰＳＡの濃度が測定される。しかしながら、ＰＳＡ検査は、その精度及び診断能力に関して議論を引き起こしているため、非侵襲的に前立腺癌を診断する、信頼性のある方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明の１つの態様は、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての情報を提供することができる診断スコアを算出する方法を提供することである。
【0004】
本発明の別の態様は、診断スコアから前立腺癌の診断のための診断基準を決定する方法を提供することである。
【0005】
本発明のさらに別の態様は、診断スコアから前立腺癌の診断についての情報を提供する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本明細書によれば、少なくとも２つの値を組み合わせることによって前立腺癌のための診断スコアを算出する方法が提供される。方法は、被験体のサンプルを調製する段階、ここでサンプルは尿サンプルである；サンプル中の第１の標的の量に関連する第１の値を取得する段階、ここで第１の標的は、サンプル中の細胞外小胞に由来するｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９である、ここで第１の値は、被験体の前立腺癌を診断する能力を有する第１の情報を反映する、ただし、第１の値は第１の情報と同時に第１のノイズも反映するため、第１の値それ自体を単独で使用して被験体の前立腺癌を診断することができない、ここで第１のノイズは、前立腺癌に関連する要因からは独立した内生要因によって引き起こされる；サンプル中の第２の標的の量に関連する第２の値を取得する段階、ここで第２の標的はサンプル中の細胞外小胞に由来するｍｉＲＮＡである、ここで第２の値は、被験体が前立腺癌を有するかどうかに関連する第２の情報を反映する、ここで第２の値は、内生要因に関連する第３の情報を反映する、ここで第３の情報は第１のノイズと強く相関しており、それにより第１の値において反映される第１のノイズは、第２の値を使用することによって制御することができる；及び第１の値及び第２の値を使用することによって前立腺癌のための診断スコアを算出する段階、それにより診断スコアを使用して前立腺癌を診断することができる、を備える。
【0007】
１つの実施形態において、ここで第２の標的はｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３である。
【0008】
１つの実施形態において、ここで診断スコアは、第１の値と第２の値の比によって算出される。
【0009】
１つの実施形態において、ここで内生要因は、サンプルと関連付けられた第１の状態、及び被験体と関連付けられた第２の状態を含む。
【0010】
１つの実施形態において、ここで第１の状態は、サンプルの量、サンプル採取時間、サンプルを採取する方法、サンプル保管期間、サンプル保管温度、及びサンプルを細分化する方法からなる群から選択される１又は複数を含む。
【0011】
１つの実施形態において、ここで第２の状態は、被験体の性別、被験体の年齢、被験体の人種、被験体の体重、被験体の腎機能、被験体の水分補給状態からなる群から選択される１又は複数を含む。
【0012】
１つの実施形態において、ここで第１の値を取得する段階は、サンプル中の第１の標的の第１のｃＤＮＡを合成する段階；第１のプライマを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって第１のｃＤＮＡを増幅する段階、ここで第１のプライマは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２からなる群から選択される；及び第１のｃＤＮＡの増幅結果から第１の値を決定する段階をさらに含む。
【0013】
１つの実施形態において、ここで第２の値を取得する段階は、サンプル中の第２の標的の第２のｃＤＮＡを合成する段階；第２のプライマを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって第２のｃＤＮＡを増幅する段階、ここで第２のプライマは、第２の標的の配列に対し相同性を有する配列又は第２の標的の配列に相補的に結合可能な配列を有する；及び第２のｃＤＮＡの増幅結果から第２の値を決定する段階をさらに含んでもよい。
【0014】
１つの実施形態において、ここで第２の標的は、ｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３であってもよく、第２のプライマは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５からなる群から選択されてもよい。
【0015】
本明細書によれば、前立腺癌の診断のための診断基準を決定する方法が提供される。方法は、第１のデータセットを取得する段階、ここで第１のデータセットは、コホートの各被験体が前立腺癌を発症しているかどうかのリスト、及び前立腺癌のための診断スコアを算出する方法に従ってコホートの各被験体に関して算出された診断スコアのリストを含む、ここでコホートは、正常であるか、又は良性前立腺過形成を発症している少なくとも１の被験体、及び前立腺癌を発症している少なくとも１の被験体を含む、及び第１のデータセットから前立腺癌の診断のための診断基準を決定する段階を備える。
【0016】
１つの実施形態において、ここで診断基準は、診断スコアと同じ次元を有する単一の値を含む。
【0017】
１つの実施形態において、ここで診断基準は、１又は複数の、前立腺癌を発症する確率値を含む。
【0018】
本明細書によれば、被験体における前立腺癌の発病の診断についての情報を提供する方法が提供される。方法は、診断スコアを算出する方法に従って被験体における前立腺癌のための診断スコアを算出する段階、及び少なくとも１つの所定値を参照して前立腺癌のための診断スコアからリスク要因を決定する段階を備える。
【0019】
１つの実施形態において、ここで所定値は、診断基準を決定する方法に従って決定された診断基準である。
【発明の効果】
【0020】
被験体の尿サンプルから前立腺癌の非侵襲性診断をするための情報は、本明細書で提供される診断スコアを算出する方法を用いて提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】前立腺癌のための診断スコアを算出する方法のフローチャートを示す。 この場合、第１の値を取得する工程及び第２の値を取得する工程は、並行して独立して行われてもよい工程を表す。
【0022】
【図2】すべての被験体実験群に関する、実施例１及び実施例２において説明される良性前立腺過形成（ｂｅｎｉｇｎ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ：ＢＰＨ）被験体の群と前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ：ＰＣａ）被験体の群との診断スコアの差異の統計的有意性を示すグラフを示す。 （ａ）は、実施例１の結果（ｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９）を示し、（ｂ）は、実施例２の結果（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９）を示す。
【0023】
【図3】すべての被験体実験群に関する、実施例３及び実施例４において説明される良性前立腺過形成（ＢＰＨ）被験体の群と前立腺癌（ＰＣａ）被験体の群との診断スコアの差異の統計的有意性を示すグラフを示す。 （ａ）は、実施例３の結果（ｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐ）を示し、（ｂ）は、実施例４の結果（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐ）を示す。
【0024】
【図4】すべての被験体実験群に関する、実施例５及び実施例６において説明される良性前立腺過形成（ＢＰＨ）被験体の群と前立腺癌（ＰＣａ）被験体の群との診断スコアの差異の統計的有意性を示すグラフを示す。 （ａ）は、実施例５の結果（ｈｓｖ１－ｍｉＲ－Ｈ１８対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９）を示し、（ｂ）は、実施例６の結果（ｈｓｖ１－ｍｉＲ－Ｈ１８対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐ）を示す。
【0025】
【図5】すべての被験体実験群に関して比較例１及び比較例２において説明される良性前立腺過形成被験体（ＢＰＨ）の群と前立腺癌被験体（ＰＣａ）の群との診断スコアの差異の統計的有意性を示すグラフを示す。 （ａ）は、比較例１の結果（ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ対ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）を示し、（ｂ）は、比較例２の結果（ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ対ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）を示す。
【0026】
【図6】ＰＳＡグレイゾーン（３～１０ｎｇ／ｍＬ）にある被験体の群に関する、実施例１及び実施例２において説明される良性前立腺過形成（ＢＰＨ）被験体の群と前立腺癌（ＰＣａ）被験体の群との診断スコアの差異の統計的有意性を示すグラフを示す。 （ａ）は、実施例１の結果（ｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９）を示し、（ｂ）は、実施例２の結果（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９）を示す。
【0027】
【図7】ＰＳＡグレイゾーン（３～１０ｎｇ／ｍＬ）にある被験体の群に関する、実施例３及び実施例４において説明される良性前立腺過形成（ＢＰＨ）被験体の群と前立腺癌（ＰＣａ）被験体の群との診断スコアの差異の統計的有意性を示すグラフを示す。 （ａ）は、実施例３の結果（ｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐ）を示し、（ｂ）は、実施例４の結果（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐ）を示す。
【0028】
【図8】ＰＳＡグレイゾーン（３～１０ｎｇ／ｍＬ）にある被験体の群に関する、実施例５及び実施例６において説明される良性前立腺過形成（ＢＰＨ）被験体の群と前立腺癌（ＰＣａ）被験体の群との診断スコアの差異の統計的有意性を示すグラフを示す。 （ａ）は、実施例５の結果（ｈｓｖ１－ｍｉＲ－Ｈ１８対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９）を示し、（ｂ）は、実施例６の結果（ｈｓｖ１－ｍｉＲ－Ｈ１８対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐ）を示す。
【0029】
【図9】ＰＳＡグレイゾーン（３～１０ｎｇ／ｍＬ）にある被験体の群に関する、比較例１及び比較例２において説明される良性前立腺過形成（ＢＰＨ）被験体の群と前立腺癌（ＰＣａ）被験体の群との診断スコアの差異の統計的有意性を示すグラフを示す。 （ａ）は、比較例１の結果（ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ対ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）を示し、（ｂ）は、比較例２の結果（ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ対ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）を示す。
【0030】
【図10】ＰＳＡ検査における被験体の群すべてに関するＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ：ＲＯＣ）曲線を示すグラフである。
【0031】
【図11】実施例１及び実施例２において説明される被験体の群すべてに関するＲＯＣ曲線を示すグラフを示す。 （ａ）は、実施例１のＲＯＣ曲線（ｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９）を示し、（ｂ）は、実施例２のＲＯＣ曲線（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９）を示す。
【0032】
【図12】実施例３及び実施例４において説明される被験体の群すべてに関するＲＯＣ曲線を示すグラフを示す。 （ａ）は、実施例３のＲＯＣ曲線（ｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐ）を示し、（ｂ）は、実施例４のＲＯＣ曲線（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐ）を示す。
【0033】
【図13】実施例５及び実施例６において説明される被験体の群すべてに関するＲＯＣ曲線を示すグラフを示す。 （ａ）は、実施例５のＲＯＣ曲線（ｈｓｖ１－ｍｉＲ－Ｈ１８対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９）を示し、（ｂ）は、実施例６のＲＯＣ曲線（ｈｓｖ１－ｍｉＲ－Ｈ１８対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐ）を示す。この場合、診断能が基準に届かなかったため、感度及び特異度の値は別々に示されていない。
【0034】
【図14】比較例１及び比較例２において説明される被験体の群すべてに関するＲＯＣ曲線を示すグラフを示す。 （ａ）は、比較例１のＲＯＣ曲線（ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ対ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）を示し、（ｂ）は、比較例２のＲＯＣ曲線（ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ対ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）を示す。この場合、診断能が基準に届かなかったため、感度及び特異度の値は別々に示されていない。
【0035】
【図15】ＰＳＡ検査においてＰＳＡグレイゾーン（３～１０ｎｇ／ｍＬ）にある被験体の群に関するＲＯＣ曲線を示すグラフである。この場合、診断能が基準に届かなかったため、感度及び特異度の値は別々に示されていない。
【0036】
【図16】実施例１及び実施例２における、ＰＳＡグレイゾーン（３～１０ｎｇ／ｍＬ）にある被験体の群に関するＲＯＣ曲線を示すグラフを示す。 （ａ）は、実施例１のＲＯＣ曲線（ｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９）を示し、（ｂ）は、実施例２のＲＯＣ曲線（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９）を示す。
【0037】
【図17】実施例３及び実施例４における、ＰＳＡグレイゾーン（３～１０ｎｇ／ｍＬ）にある被験体の群に関するＲＯＣ曲線を示すグラフを示す。 （ａ）は、実施例３のＲＯＣ曲線（ｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐ）を示し、（ｂ）は、実施例４のＲＯＣ曲線（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐ）を示す。
【0038】
【図18】実施例５及び実施例６における、ＰＳＡグレイゾーン（３～１０ｎｇ／ｍＬ）にある被験体の群に関するＲＯＣ曲線を示すグラフを示す。 （ａ）は、実施例５のＲＯＣ曲線（ｈｓｖ１－ｍｉＲ－Ｈ１８対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９）を示し、（ｂ）は、実施例６のＲＯＣ曲線（ｈｓｖ１－ｍｉＲ－Ｈ１８対ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐ）を示す。この場合、診断能が基準に届かなかったため、感度及び特異度の値は別々に示されていない。
【0039】
【図19】比較例１及び比較例２における、ＰＳＡグレイゾーン（３～１０ｎｇ／ｍＬ）にある被験体の群に関するＲＯＣ曲線を示すグラフを示す。 （ａ）は、比較例１のＲＯＣ曲線（ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ対ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）を示し、（ｂ）は、比較例２のＲＯＣ曲線（ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ対ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ）を示す。この場合、診断能が基準に届かなかったため、感度及び特異度の値は別々に示されていない。
【発明を実施するための形態】
【0040】
［最良の形態］
以下に、いくつかの特定の実施形態及び例に関して添付図面を参照しながらさらに詳細に、ここで開示される主題を説明する。添付図面は、本発明のいくつかの、しかしすべてではない実施形態を包含することに留意されるべきである。ここで開示される主題は、多くの異なる形式において具現化されてもよく、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要件を満たすように提供されている。実際、本発明の多くの修正及び他の実施形態は、ここで開示される主題が関連する分野の当業者であれば思い付くであろう。したがって、ここで開示される主題が、開示される特定の実施形態に限定されるべきものではないこと、及び修正及び他の実施形態が添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されることは理解されるべきである。
以下に、いくつかの特定の実施形態及び例に関して添付図面を参照しながらさらに詳細に、ここで開示される主題を説明する。添付図面は、本発明のいくつかの、しかしすべてではない実施形態を包含することに留意されるべきである。ここで開示される主題は、多くの異なる形式において具現化されてもよく、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要件を満たすように提供されている。実際、本発明の多くの修正及び他の実施形態は、ここで開示される主題が関連する分野の当業者であれば思い付くであろう。したがって、ここで開示される主題が、開示される特定の実施形態に限定されるべきものではないこと、及び修正及び他の実施形態が添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されることは理解されるべきである。
【0041】
用語の定義
約
本明細書において使用される「約」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、重量、又は長さに対して、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１％の程度まで変更される、量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、数量、重量、又は長さを指す。
約
本明細書において使用される「約」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、重量、又は長さに対して、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１％の程度まで変更される、量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、数量、重量、又は長さを指す。
【0042】
被験体
本明細書において使用される「被験体」という用語は、ある特定の物質（例えば、ペプチドなど）に暴露される個別の生物を指す。被験体は、例えばヒト及び動物などの独立した生物を意味することがあり、例えば組織及び細胞の一部などの、独立した生物のいくつかの構成要素を意味することもある。この意味は、文脈において適宜解釈されてもよい。また、「被験体」という用語は、当業者によって認識される他の意味すべてを包含してもよい。
本明細書において使用される「被験体」という用語は、ある特定の物質（例えば、ペプチドなど）に暴露される個別の生物を指す。被験体は、例えばヒト及び動物などの独立した生物を意味することがあり、例えば組織及び細胞の一部などの、独立した生物のいくつかの構成要素を意味することもある。この意味は、文脈において適宜解釈されてもよい。また、「被験体」という用語は、当業者によって認識される他の意味すべてを包含してもよい。
【0043】
診断
本明細書において使用される「診断」という用語は、被験体がある特定の疾患と関連付けられるかどうかを決定する、すべてのタイプの直接及び間接の行為を集合的に指す。この場合、「ある特定の疾患と関連付けられる」という語句は、関連した障害の発病、及び関連した障害が発症した場合の障害の進行についての情報などを含んでもよい。本明細書において、「ある特定の疾患を診断する」という用語が本明細書に記載されている場合、この用語は、ある特定の疾患の発病の確認、並びにある特定の疾患の発症の確率、リスク、及び／又は尤度などを包含することが広く理解されるべきである。この意味は、文脈において適宜解釈されてもよい。また、「診断」という用語は、当業者によって認識される他の意味すべてを包含してもよい。
本明細書において使用される「診断」という用語は、被験体がある特定の疾患と関連付けられるかどうかを決定する、すべてのタイプの直接及び間接の行為を集合的に指す。この場合、「ある特定の疾患と関連付けられる」という語句は、関連した障害の発病、及び関連した障害が発症した場合の障害の進行についての情報などを含んでもよい。本明細書において、「ある特定の疾患を診断する」という用語が本明細書に記載されている場合、この用語は、ある特定の疾患の発病の確認、並びにある特定の疾患の発症の確率、リスク、及び／又は尤度などを包含することが広く理解されるべきである。この意味は、文脈において適宜解釈されてもよい。また、「診断」という用語は、当業者によって認識される他の意味すべてを包含してもよい。
【0044】
バイオマーカ
本明細書において使用される「バイオマーカ」という用語は一般に、被験体の身体における変化を感知し得、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又は他の代謝物質を含む指標を指す。より狭い意味において、「バイオマーカ」という用語は、被験体がある特定の疾患を有するかどうかについての情報を反映する標的物質（例えば、ある特定のタンパク質又はｍｉＲＮＡ）を指すことが多い。この意味は、文脈において適宜解釈されてもよく、「バイオマーカ」という用語は、当業者によって認識される他の意味すべてを包含してもよい。
本明細書において使用される「バイオマーカ」という用語は一般に、被験体の身体における変化を感知し得、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又は他の代謝物質を含む指標を指す。より狭い意味において、「バイオマーカ」という用語は、被験体がある特定の疾患を有するかどうかについての情報を反映する標的物質（例えば、ある特定のタンパク質又はｍｉＲＮＡ）を指すことが多い。この意味は、文脈において適宜解釈されてもよく、「バイオマーカ」という用語は、当業者によって認識される他の意味すべてを包含してもよい。
【0045】
ｍｉＲＮＡ
本明細書において使用される「ｍｉＲＮＡ」又は「マイクロＲＮＡ」という用語は、植物、動物、及びウイルスなどに見出されている、２０～２５のヌクレオチドからなる発現されていない小さなＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡは、例えば、遺伝子発現の制御などの機能を有することが公知である。ｍｉＲＮＡは、細胞中に見出され、細胞外液中にも見出される。ヒトの場合特に、ｍｉＲＮＡは、例えば、血清、血漿、尿、唾液、及び涙液など、体のほぼすべての体液中に特に見出される。したがって、細胞外液中に見出されるｍｉＲＮＡは、ある特定の疾患（例えば癌）のための診断バイオマーカとして使用するために積極的に研究されてきている。「ｍｉＲＮＡ」又は「マイクロＲＮＡ」という用語は、当業者によって認識される他の意味すべてを包含してもよい。
本明細書において使用される「ｍｉＲＮＡ」又は「マイクロＲＮＡ」という用語は、植物、動物、及びウイルスなどに見出されている、２０～２５のヌクレオチドからなる発現されていない小さなＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡは、例えば、遺伝子発現の制御などの機能を有することが公知である。ｍｉＲＮＡは、細胞中に見出され、細胞外液中にも見出される。ヒトの場合特に、ｍｉＲＮＡは、例えば、血清、血漿、尿、唾液、及び涙液など、体のほぼすべての体液中に特に見出される。したがって、細胞外液中に見出されるｍｉＲＮＡは、ある特定の疾患（例えば癌）のための診断バイオマーカとして使用するために積極的に研究されてきている。「ｍｉＲＮＡ」又は「マイクロＲＮＡ」という用語は、当業者によって認識される他の意味すべてを包含してもよい。
【0046】
細胞外小胞
本明細書において使用される「細胞外小胞」という用語は、細胞由来の脂質二重層によって取り囲まれ、自己複製機能を有しない微粒子形態の構造を指す。細胞外小胞の直径は、約２０～３０ナノメートルに、最大約１０ミクロンまで広く変動する。細胞外小胞は、被験体の体において様々な機能を有する。この場合、細胞外小胞は、細胞外小胞において様々な機能を有するタンパク質及び脂質などを包み込み、それらを細胞外へ送達するという代表的な機能を有する。細胞外小胞は、すべてのタイプのエクトソーム、微小胞、微粒子、エキソソーム、アポトーシス小体、ラージオンコソーム、及びエキソファを包含するように言及されるが、本発明はそれらに限定されない。「細胞外小胞」という用語は、当業者によって認識される他の意味すべてを包含してもよい。
本明細書において使用される「細胞外小胞」という用語は、細胞由来の脂質二重層によって取り囲まれ、自己複製機能を有しない微粒子形態の構造を指す。細胞外小胞の直径は、約２０～３０ナノメートルに、最大約１０ミクロンまで広く変動する。細胞外小胞は、被験体の体において様々な機能を有する。この場合、細胞外小胞は、細胞外小胞において様々な機能を有するタンパク質及び脂質などを包み込み、それらを細胞外へ送達するという代表的な機能を有する。細胞外小胞は、すべてのタイプのエクトソーム、微小胞、微粒子、エキソソーム、アポトーシス小体、ラージオンコソーム、及びエキソファを包含するように言及されるが、本発明はそれらに限定されない。「細胞外小胞」という用語は、当業者によって認識される他の意味すべてを包含してもよい。
【0047】
背景：前立腺癌の診断
前立腺癌の診断－概観
原理的には、前立腺癌を診断する標準的な方法は、被験体から少量の前立腺組織が採取され、次いで癌細胞の発達が決定される生検である。しかしながら、生検は被験体にとって非常に苦痛の多いプロセスが伴う。したがって、被験体が前立腺癌の発病が疑われる症状（例えば、例えば多尿症及び排尿痛などの泌尿器症状）を示すという理由のみで生検を行うことは望ましくない。したがって、被験体が前立腺癌の発病が疑われる症状を示す場合、ＰＳＡ検査によって、生検が必要であるかどうかを最初に決定することが一般的である。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）検査は、被験体から血液を採取して血液サンプル中のＰＳＡの濃度を測定し、被験体が前立腺癌を発症する確率を推定することを含む診断方法である。以下に、診断方法のそれぞれがさらに詳細に説明される。
前立腺癌の診断－概観
原理的には、前立腺癌を診断する標準的な方法は、被験体から少量の前立腺組織が採取され、次いで癌細胞の発達が決定される生検である。しかしながら、生検は被験体にとって非常に苦痛の多いプロセスが伴う。したがって、被験体が前立腺癌の発病が疑われる症状（例えば、例えば多尿症及び排尿痛などの泌尿器症状）を示すという理由のみで生検を行うことは望ましくない。したがって、被験体が前立腺癌の発病が疑われる症状を示す場合、ＰＳＡ検査によって、生検が必要であるかどうかを最初に決定することが一般的である。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）検査は、被験体から血液を採取して血液サンプル中のＰＳＡの濃度を測定し、被験体が前立腺癌を発症する確率を推定することを含む診断方法である。以下に、診断方法のそれぞれがさらに詳細に説明される。
【0048】
ＰＳＡ検査
ＰＳＡ検査は、前立腺癌の発病が疑われる被験体の静脈から血液を採取し、血中の前立腺特異抗原（以下、「ＰＳＡ」と呼ばれる）の濃度を測定し、ＰＳＡの濃度に基づいて前立腺癌を発症する確率を予測することを含む、一種の診断方法である。前立腺特異抗原は、主に前立腺の細胞によって産生されるタンパク質である。ＰＳＡは前立腺癌を有しない正常な被験体の血中に少量で含まれるが、ＰＳＡの濃度は一般に、前立腺癌患者の血中で増大する傾向がある。したがって、血中のＰＳＡ濃度は、前立腺癌の発病を決定するための指標として有用に使用されてもよいが、専門家らは、１）血中のＰＳＡ濃度は一般に年齢とともに増大する傾向がある、及び２）血中のＰＳＡ濃度は、被験体が癌を発症する場合でさえ前立腺癌のタイプによって増大しないなど、ＰＳＡ濃度の精度に関して様々な見解を有する。文献において開示される特定の数値には差異がある程度あるが、一般に、血中のＰＳＡ濃度が測定されて３ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬの範囲である場合、グレイゾーンにあると考えられ、グレイゾーンにおいては、ＰＳＡ検査のみを使用して、被験体が、被験体が前立腺癌を発症する高リスク群に入るかどうかを確認することが困難である。
ＰＳＡ検査は、前立腺癌の発病が疑われる被験体の静脈から血液を採取し、血中の前立腺特異抗原（以下、「ＰＳＡ」と呼ばれる）の濃度を測定し、ＰＳＡの濃度に基づいて前立腺癌を発症する確率を予測することを含む、一種の診断方法である。前立腺特異抗原は、主に前立腺の細胞によって産生されるタンパク質である。ＰＳＡは前立腺癌を有しない正常な被験体の血中に少量で含まれるが、ＰＳＡの濃度は一般に、前立腺癌患者の血中で増大する傾向がある。したがって、血中のＰＳＡ濃度は、前立腺癌の発病を決定するための指標として有用に使用されてもよいが、専門家らは、１）血中のＰＳＡ濃度は一般に年齢とともに増大する傾向がある、及び２）血中のＰＳＡ濃度は、被験体が癌を発症する場合でさえ前立腺癌のタイプによって増大しないなど、ＰＳＡ濃度の精度に関して様々な見解を有する。文献において開示される特定の数値には差異がある程度あるが、一般に、血中のＰＳＡ濃度が測定されて３ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬの範囲である場合、グレイゾーンにあると考えられ、グレイゾーンにおいては、ＰＳＡ検査のみを使用して、被験体が、被験体が前立腺癌を発症する高リスク群に入るかどうかを確認することが困難である。
【0049】
生検
実際には、被験体が前立腺癌を発症するかどうかを確認するためには、生検によって前立腺癌の発病を診断することが必要である。これは、被験体から微量の前立腺組織を採取して前立腺組織中に癌細胞が存在するかどうかを直接的に検査することを含む方法によって達成される。これには、１）目的の試料を採取するために生検針が被験体の肛門に通されるため、患者がかなりの痛みを感じる、２）癌細胞が存在する部位が正確に突き止められない場合、生検針が通る部位の周辺部の試料を採取してしまうため、誤診のリスクがある、及び３）検査工程中に被験体の直腸などに傷が生じ、感染などにいたることがある、という点で問題がある。したがって、生検の信頼性を向上させ、検査が実際に必要な患者に限定して生検を行うための補助的な診断方法が必要とされる。ＰＳＡ検査は、これらの補助的な診断方法の１つとして使用されてきたが、その信頼性が低下しており、検査結果がグレイゾーン内にある場合などに、前立腺癌が発症するかどうかを正確に決定することが不可能であるという点で、多くの制約を有する。
実際には、被験体が前立腺癌を発症するかどうかを確認するためには、生検によって前立腺癌の発病を診断することが必要である。これは、被験体から微量の前立腺組織を採取して前立腺組織中に癌細胞が存在するかどうかを直接的に検査することを含む方法によって達成される。これには、１）目的の試料を採取するために生検針が被験体の肛門に通されるため、患者がかなりの痛みを感じる、２）癌細胞が存在する部位が正確に突き止められない場合、生検針が通る部位の周辺部の試料を採取してしまうため、誤診のリスクがある、及び３）検査工程中に被験体の直腸などに傷が生じ、感染などにいたることがある、という点で問題がある。したがって、生検の信頼性を向上させ、検査が実際に必要な患者に限定して生検を行うための補助的な診断方法が必要とされる。ＰＳＡ検査は、これらの補助的な診断方法の１つとして使用されてきたが、その信頼性が低下しており、検査結果がグレイゾーン内にある場合などに、前立腺癌が発症するかどうかを正確に決定することが不可能であるという点で、多くの制約を有する。
【0050】
背景－ｍｉＲＮＡバイオマーカをスクリーニングすること
ある特定の疾患を被験体が有するかどうかを決定するためにバイオマーカとしてある特定のｍｉＲＮＡを使用するためには、何よりもまず、ある特定のｍｉＲＮＡが、ある特定の疾患を有する被験体において、正常な被験体と比較して異常に発現されているかどうかを決定する必要がある。ｍｉＲＮＡマイクロアレイは、ある特定のｍｉＲＮＡをスクリーニングする方法を代表する。ｍｉＲＮＡマイクロアレイは、被験体の体液サンプルから、ヒトにおいて発現されることが公知であるほとんどのｍｉＲＮＡの発現量をスクリーニングする方法である。この場合、被験体のサンプル中のｍｉＲＮＡの発現量は、主に、当技術分野において予め製造されたキット（例えば、ＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏ Ｃｈｉｐ Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国、カリフォルニア州、サンタクララ）を使用して測定される。ヒトにおいて発現されるタイプのｍｉＲＮＡは、約１，４００個のｍｉＲＮＡ（ヒト由来の約１，２００個のｍｉＲＮＡ及びウイルス由来の約１５０個のｍｉＲＮＡを含む）を含み、その数は公知のヒト遺伝子の数より比較的低い。また、ｍｉＲＮＡの配列は当技術分野において公知である。したがって、被験体のほぼすべてのｍｉＲＮＡをスクリーニングすることが可能である。市販されているキットを使用する場合、被験体のサンプル中のｍｉＲＮＡの発現量をおおよそで得ることが可能である。これらの結果に基づいて、前立腺癌を有する被験体及び正常な被験体からのサンプル中のｍｉＲＮＡの発現量が比較されると、前立腺癌を有する被験体において、どのｍｉＲＮＡが異常に発現されているのかを見出すことが可能である。しかしながら、キットは、スクリーニング目的でのみ、およその発現量を得るために使用され得、かつ正規化の問題も有するため、正確な分析能を有するバイオマーカを見出すための追加の分析がさらに必要とされる。ｍｉＲＮＡマイクロアレイは、前立腺癌の診断に使用され得るバイオマーカの候補群を迅速に見出すことが可能であるという点で利点を有し、したがって完全な分析作業に先立って、分析の被験体のためのスクリーニングをするために広く使用されてきた。
ある特定の疾患を被験体が有するかどうかを決定するためにバイオマーカとしてある特定のｍｉＲＮＡを使用するためには、何よりもまず、ある特定のｍｉＲＮＡが、ある特定の疾患を有する被験体において、正常な被験体と比較して異常に発現されているかどうかを決定する必要がある。ｍｉＲＮＡマイクロアレイは、ある特定のｍｉＲＮＡをスクリーニングする方法を代表する。ｍｉＲＮＡマイクロアレイは、被験体の体液サンプルから、ヒトにおいて発現されることが公知であるほとんどのｍｉＲＮＡの発現量をスクリーニングする方法である。この場合、被験体のサンプル中のｍｉＲＮＡの発現量は、主に、当技術分野において予め製造されたキット（例えば、ＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏ Ｃｈｉｐ Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国、カリフォルニア州、サンタクララ）を使用して測定される。ヒトにおいて発現されるタイプのｍｉＲＮＡは、約１，４００個のｍｉＲＮＡ（ヒト由来の約１，２００個のｍｉＲＮＡ及びウイルス由来の約１５０個のｍｉＲＮＡを含む）を含み、その数は公知のヒト遺伝子の数より比較的低い。また、ｍｉＲＮＡの配列は当技術分野において公知である。したがって、被験体のほぼすべてのｍｉＲＮＡをスクリーニングすることが可能である。市販されているキットを使用する場合、被験体のサンプル中のｍｉＲＮＡの発現量をおおよそで得ることが可能である。これらの結果に基づいて、前立腺癌を有する被験体及び正常な被験体からのサンプル中のｍｉＲＮＡの発現量が比較されると、前立腺癌を有する被験体において、どのｍｉＲＮＡが異常に発現されているのかを見出すことが可能である。しかしながら、キットは、スクリーニング目的でのみ、およその発現量を得るために使用され得、かつ正規化の問題も有するため、正確な分析能を有するバイオマーカを見出すための追加の分析がさらに必要とされる。ｍｉＲＮＡマイクロアレイは、前立腺癌の診断に使用され得るバイオマーカの候補群を迅速に見出すことが可能であるという点で利点を有し、したがって完全な分析作業に先立って、分析の被験体のためのスクリーニングをするために広く使用されてきた。
【0051】
先行技術の制約
尿サンプルの使用における利点
被験体の体液サンプルからある特定の疾患の感染、及び疾患の進行程度などを診断する必要がある場合、被験体の尿は、体液サンプルとして使用されるため、様々な利点を有する。最初に、血液又は組織がサンプルとして使用される場合とは異なり、注射針の使用を必要としないため、サンプルを採取することが容易であり、被験体に痛みを与えるおそれがない。さらに、ある特定の疾患が男性の泌尿器疾患である場合、泌尿器疾患は尿の流れによって尿路の比較的近い近傍で生じる。したがって、男性の泌尿器疾患についての直接的な情報は、血液サンプルと比較して、尿サンプル中に含まれていると思われる。したがって、多くの面で、男性の泌尿器疾患が診断される場合に尿サンプルを使用することは望ましい。
尿サンプルの使用における利点
被験体の体液サンプルからある特定の疾患の感染、及び疾患の進行程度などを診断する必要がある場合、被験体の尿は、体液サンプルとして使用されるため、様々な利点を有する。最初に、血液又は組織がサンプルとして使用される場合とは異なり、注射針の使用を必要としないため、サンプルを採取することが容易であり、被験体に痛みを与えるおそれがない。さらに、ある特定の疾患が男性の泌尿器疾患である場合、泌尿器疾患は尿の流れによって尿路の比較的近い近傍で生じる。したがって、男性の泌尿器疾患についての直接的な情報は、血液サンプルと比較して、尿サンプル中に含まれていると思われる。したがって、多くの面で、男性の泌尿器疾患が診断される場合に尿サンプルを使用することは望ましい。
【0052】
細胞外小胞由来のバイオマーカを標的とすることにおける利点
細胞外小胞は、脂質二重層からなり、したがって安定した構造を有するという特徴を有する。したがって、細胞外小胞に含まれる核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡなど）、又はタンパク質断片などは、細胞外小胞が意図的に破壊されない限り、時間がたっても安定状態に保たれ得る。これは、体液サンプル（血液及び尿など）中に直接的に含まれる核酸、又はタンパク質断片などが、外部要因によって経時的に容易に分解されるという事実とは反対である。したがって、細胞外小胞中に含まれる物質がバイオマーカ標的として使用される場合、サンプルを長期間保管し得るという利点がある。細胞外小胞は尿サンプル中にも含まれるため、細胞外小胞由来の物質が、適切な前処理工程に供された後、尿サンプルにおけるバイオマーカ標的として使用されてもよい。
細胞外小胞は、脂質二重層からなり、したがって安定した構造を有するという特徴を有する。したがって、細胞外小胞に含まれる核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡなど）、又はタンパク質断片などは、細胞外小胞が意図的に破壊されない限り、時間がたっても安定状態に保たれ得る。これは、体液サンプル（血液及び尿など）中に直接的に含まれる核酸、又はタンパク質断片などが、外部要因によって経時的に容易に分解されるという事実とは反対である。したがって、細胞外小胞中に含まれる物質がバイオマーカ標的として使用される場合、サンプルを長期間保管し得るという利点がある。細胞外小胞は尿サンプル中にも含まれるため、細胞外小胞由来の物質が、適切な前処理工程に供された後、尿サンプルにおけるバイオマーカ標的として使用されてもよい。
【0053】
尿中の細胞外小胞由来のバイオマーカを測定することにおける問題
尿中の細胞外小胞由来の物質をバイオマーカ標的として使用する場合、１）サンプルを確保することが容易である、２）男性の泌尿器疾患を診断することが有利である、及び３）前述の特徴に起因してサンプルを保管することが容易であるという点で利点を有する。しかしながら、細胞外小胞由来の物質は利点だけでなく明白な欠点も有する。すなわち、それは、１）尿中に含まれる細胞外小胞由来の物質（例えば、ｍｉＲＮＡなど）の絶対量が少ない、及び２）尿中に含まれるバイオマーカ標的の量はサンプル又は被験体の状態に依存して大きく変動するという点で欠点を有する。サンプル中に含まれるバイオマーカ標的の発現量に基づいてある特定の疾患を診断するためには、複数の被験体から複数のサンプルを採取してそれぞれのサンプル中のバイオマーカ標的の発現量を比較することが必要である。したがって、前述の欠点を克服して、バイオマーカ標的として尿中の細胞外小胞由来の物質を使用する診断方法を開発しなければならない。前述の欠点を克服するためには、サンプル中のバイオマーカ標的の発現量における、信頼性のある正規化処理が必要とされる。
尿中の細胞外小胞由来の物質をバイオマーカ標的として使用する場合、１）サンプルを確保することが容易である、２）男性の泌尿器疾患を診断することが有利である、及び３）前述の特徴に起因してサンプルを保管することが容易であるという点で利点を有する。しかしながら、細胞外小胞由来の物質は利点だけでなく明白な欠点も有する。すなわち、それは、１）尿中に含まれる細胞外小胞由来の物質（例えば、ｍｉＲＮＡなど）の絶対量が少ない、及び２）尿中に含まれるバイオマーカ標的の量はサンプル又は被験体の状態に依存して大きく変動するという点で欠点を有する。サンプル中に含まれるバイオマーカ標的の発現量に基づいてある特定の疾患を診断するためには、複数の被験体から複数のサンプルを採取してそれぞれのサンプル中のバイオマーカ標的の発現量を比較することが必要である。したがって、前述の欠点を克服して、バイオマーカ標的として尿中の細胞外小胞由来の物質を使用する診断方法を開発しなければならない。前述の欠点を克服するためには、サンプル中のバイオマーカ標的の発現量における、信頼性のある正規化処理が必要とされる。
【0054】
先行技術の技術的解決法及び制約
先行技術によれば、正規化処理の１つとして、尿中の細胞外小胞由来のバイオマーカ（例えば、ｍｉＲＮＡ）のためのハウスキーピング遺伝子の発見が試みられてきたが、試みは失敗した。また、サンプル中のｍｉＲＮＡの総量を使用して正規化すること（Ｙｕｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ Ｎｅｕｒｏｕｒｏｌ Ｊ ２０１５；１９：１７－８４）、及び上方発現されたバイオマーカと下方発現されたバイオマーカの比を算出することによって正規化の必要性を回避すること（ＵＳ１５／５５０４１６）が試みられてきたが、それは、効果が限定的であるという点で制約がある。
先行技術によれば、正規化処理の１つとして、尿中の細胞外小胞由来のバイオマーカ（例えば、ｍｉＲＮＡ）のためのハウスキーピング遺伝子の発見が試みられてきたが、試みは失敗した。また、サンプル中のｍｉＲＮＡの総量を使用して正規化すること（Ｙｕｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ Ｎｅｕｒｏｕｒｏｌ Ｊ ２０１５；１９：１７－８４）、及び上方発現されたバイオマーカと下方発現されたバイオマーカの比を算出することによって正規化の必要性を回避すること（ＵＳ１５／５５０４１６）が試みられてきたが、それは、効果が限定的であるという点で制約がある。
【0055】
前立腺癌のための診断スコアを算出する方法
診断スコアを算出する方法－概観
本明細書は、少なくとも２つの値を使用して前立腺癌のための診断スコアを算出する方法を提供する。診断スコアを算出する方法は、サンプルを調製する段階、第１の値を測定する段階、第２の値を測定する段階、及び診断スコアを算出する段階を備える。この場合、被験体の尿サンプルがサンプルとして使用される。第１の値は、第１の標的と関連付けられた値、すなわち、細胞外小胞に由来するｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９である。この場合、ｍｉＲＮＡは、前立腺癌の発病についての情報を含む。しかしながら、第１の値は、内生要因の作用を反映するため、前立腺癌の診断において使用するために第１の値を正規化することが必要である。第２の値は、第２の標的、すなわち、サンプル中の細胞外小胞に由来するｍｉＲＮＡと関連付けられた値である。例えば、第２の標的は、細胞外小胞に由来するｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。第２の値は、第１の値の正規化係数として使用されてもよく、第２の値は、前立腺癌の発病についての情報も含む。第１の値を測定する段階及び／又は第２の値を測定する段階は、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）によって第１の標的及び／又は第２の標的を増幅させる段階、及び結果を決定する段階を含んでもよい。診断スコアは、上述の工程において取得された第１の値及び第２の値に基づいて算出される。この場合、診断スコアは、被験体における前立腺癌の発病を診断することができる。
診断スコアを算出する方法－概観
本明細書は、少なくとも２つの値を使用して前立腺癌のための診断スコアを算出する方法を提供する。診断スコアを算出する方法は、サンプルを調製する段階、第１の値を測定する段階、第２の値を測定する段階、及び診断スコアを算出する段階を備える。この場合、被験体の尿サンプルがサンプルとして使用される。第１の値は、第１の標的と関連付けられた値、すなわち、細胞外小胞に由来するｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９である。この場合、ｍｉＲＮＡは、前立腺癌の発病についての情報を含む。しかしながら、第１の値は、内生要因の作用を反映するため、前立腺癌の診断において使用するために第１の値を正規化することが必要である。第２の値は、第２の標的、すなわち、サンプル中の細胞外小胞に由来するｍｉＲＮＡと関連付けられた値である。例えば、第２の標的は、細胞外小胞に由来するｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。第２の値は、第１の値の正規化係数として使用されてもよく、第２の値は、前立腺癌の発病についての情報も含む。第１の値を測定する段階及び／又は第２の値を測定する段階は、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）によって第１の標的及び／又は第２の標的を増幅させる段階、及び結果を決定する段階を含んでもよい。診断スコアは、上述の工程において取得された第１の値及び第２の値に基づいて算出される。この場合、診断スコアは、被験体における前立腺癌の発病を診断することができる。
【0056】
診断スコアを算出する方法の第１の特徴－尿サンプルを使用すること
本明細書において提供される診断スコアを算出する方法を使用して、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかを診断し得る。診断スコアを算出する方法は、尿サンプルを使用して、尿サンプル中に含まれるバイオマーカを測定することによって特徴付けられる。これは、サンプルを採取する方法は簡便かつ安価であり、被験体に痛みを与えるおそれがないという点で利点を有する。また、前立腺細胞から分泌される物質は尿中に直接的に含まれ得るため、診断スコアを算出する方法は、血液サンプルからの、前立腺癌と関連付けられたバイオマーカを測定する方法と比較して、より直接的な方法であり得るという点で利点を有する。
本明細書において提供される診断スコアを算出する方法を使用して、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかを診断し得る。診断スコアを算出する方法は、尿サンプルを使用して、尿サンプル中に含まれるバイオマーカを測定することによって特徴付けられる。これは、サンプルを採取する方法は簡便かつ安価であり、被験体に痛みを与えるおそれがないという点で利点を有する。また、前立腺細胞から分泌される物質は尿中に直接的に含まれ得るため、診断スコアを算出する方法は、血液サンプルからの、前立腺癌と関連付けられたバイオマーカを測定する方法と比較して、より直接的な方法であり得るという点で利点を有する。
【0057】
診断スコアを算出する方法の第２の特徴－細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡを測定すること
本明細書において提供される診断スコアを算出する方法は、サンプル中の少なくとも２つのバイオマーカの発現量を測定することによって、前立腺癌のための診断スコアを算出することである。この場合、バイオマーカは、それが、尿中の細胞外小胞に含まれるｍｉＲＮＡであることを特徴とする。細胞外小胞は、脂質二重層によって取り囲まれて安定した構造を有するため、細胞外小胞に含まれる物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、外部環境の作用から効果的に保護される。したがって、細胞外小胞は、細胞外小胞が破壊されない限り、その中の物質を保持するという特徴を有する。したがって、測定されることになる標的として、細胞外小胞に含まれるｍｉＲＮＡが使用される場合、サンプルが被験体から採取された後、サンプルは長期間保管され得るという点で利点を有する。また、サンプルの保管状態は、診断スコアの算出結果に大きい影響を有しないという点で利点を有する。
本明細書において提供される診断スコアを算出する方法は、サンプル中の少なくとも２つのバイオマーカの発現量を測定することによって、前立腺癌のための診断スコアを算出することである。この場合、バイオマーカは、それが、尿中の細胞外小胞に含まれるｍｉＲＮＡであることを特徴とする。細胞外小胞は、脂質二重層によって取り囲まれて安定した構造を有するため、細胞外小胞に含まれる物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、外部環境の作用から効果的に保護される。したがって、細胞外小胞は、細胞外小胞が破壊されない限り、その中の物質を保持するという特徴を有する。したがって、測定されることになる標的として、細胞外小胞に含まれるｍｉＲＮＡが使用される場合、サンプルが被験体から採取された後、サンプルは長期間保管され得るという点で利点を有する。また、サンプルの保管状態は、診断スコアの算出結果に大きい影響を有しないという点で利点を有する。
【0058】
診断スコアを算出する方法の第３の特徴－ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９の発現量を測定すること
大韓民国特許出願第１０－２０１８－００４５０６２号において開示されているように、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９は、前立腺癌のためのバイオマーカとして使用されてもよい。本明細書において提供される診断スコアを算出する方法は、被験体におけるｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９の発現量と関連付けられた値を基本的に使用するため、方法によって算出された診断スコアは、前立腺癌の発病を診断することができる。
大韓民国特許出願第１０－２０１８－００４５０６２号において開示されているように、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９は、前立腺癌のためのバイオマーカとして使用されてもよい。本明細書において提供される診断スコアを算出する方法は、被験体におけるｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９の発現量と関連付けられた値を基本的に使用するため、方法によって算出された診断スコアは、前立腺癌の発病を診断することができる。
【0059】
診断スコアを算出する方法の第４の特徴－ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９のために特殊化された正規化係数を使用すること本明細書において提供される診断スコアを算出する方法は、尿サンプル中に含まれるｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９の発現量のために特殊化された正規化係数を使用することによって特徴付けられる。一般に、ハウスキーピング遺伝子のためのバイオマーカが見出され、バイオマーカの発現量を正規化するために使用されるが、本明細書において提供される診断スコアを算出する方法では、標的であるｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９のために特殊化された正規化係数を使用する。ハウスキーピング遺伝子のためのバイオマーカが正規化係数として使用される場合、それは、１）一般にハウスキーピング遺伝子のためのバイオマーカを見出すことは非常に困難な作業である、２）尿中の細胞外小胞に由来するｍｉＲＮＡに関して、ハウスキーピング遺伝子と関連付けられたバイオマーカは明確に明らかにされていないという点で困難である。他方で、標的のために特殊化された正規化係数が使用される場合、１）ハウスキーピング遺伝子のためのバイオマーカを見出す困難を避けることが可能である、２）標的の発現量に関してより信頼性のある結果を得ることが可能であるという点で利点を有する。
【0060】
診断スコアを算出する方法の第５の特徴－前立腺癌に関連付けられた要因を正規化係数として使用すること
本明細書において提供される診断スコアを算出する方法において、正規化係数はまた、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての情報を含むことによって特徴付けられる。したがって、１又は複数のタイプの処理された情報は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９の発現量を含む前立腺癌についての情報と、正規化係数に含まれる前立腺癌についての情報とを組み合わせることによって演繹されてもよい。例えば、処理された情報は、前立腺癌の発病についての情報を増幅することによって得られてもよい。
本明細書において提供される診断スコアを算出する方法において、正規化係数はまた、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての情報を含むことによって特徴付けられる。したがって、１又は複数のタイプの処理された情報は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９の発現量を含む前立腺癌についての情報と、正規化係数に含まれる前立腺癌についての情報とを組み合わせることによって演繹されてもよい。例えば、処理された情報は、前立腺癌の発病についての情報を増幅することによって得られてもよい。
【0061】
診断スコアの使用
本明細書において提供される診断スコアを、１）使用して前立腺癌の発病のための診断基準を決定してもよい、及び２）診断基準を参照する、前立腺癌を診断する方法のために使用してもよい。
本明細書において提供される診断スコアを、１）使用して前立腺癌の発病のための診断基準を決定してもよい、及び２）診断基準を参照する、前立腺癌を診断する方法のために使用してもよい。
【0062】
サンプルの調製
サンプルの調製－概観
本明細書において提供される診断スコアを算出する方法に含まれる被験体のためのサンプルの調製は、被験体のための尿サンプルを調製することを含む。尿サンプルの調製は、適切な前処理を行って尿サンプル中に含まれる細胞外小胞に由来するｍｉＲＮＡの量を測定することをさらに含んでもよい。１つの実施形態によれば、サンプルの調製は、尿サンプル中に含まれる細胞外小胞を破壊することを含んでもよい。
サンプルの調製－概観
本明細書において提供される診断スコアを算出する方法に含まれる被験体のためのサンプルの調製は、被験体のための尿サンプルを調製することを含む。尿サンプルの調製は、適切な前処理を行って尿サンプル中に含まれる細胞外小胞に由来するｍｉＲＮＡの量を測定することをさらに含んでもよい。１つの実施形態によれば、サンプルの調製は、尿サンプル中に含まれる細胞外小胞を破壊することを含んでもよい。
【0063】
サンプルのタイプ
サンプルは被験体由来の尿サンプルである。１つの実施形態によれば、尿サンプルは、朝一番に被験体から採取された尿サンプルであってもよい。１つの実施形態によれば、尿サンプルは被験体から採取された尿の上清サンプルであってもよい。１つの実施形態によれば、尿サンプルは、被験体の尿が遠心分離された後得られる生成物の上清サンプルであってもよい。
サンプルは被験体由来の尿サンプルである。１つの実施形態によれば、尿サンプルは、朝一番に被験体から採取された尿サンプルであってもよい。１つの実施形態によれば、尿サンプルは被験体から採取された尿の上清サンプルであってもよい。１つの実施形態によれば、尿サンプルは、被験体の尿が遠心分離された後得られる生成物の上清サンプルであってもよい。
【0064】
サンプルの体積
尿サンプルの体積は特に限定されず、必要に応じて適切に選択されてもよい。
尿サンプルの体積は特に限定されず、必要に応じて適切に選択されてもよい。
【0065】
サンプル保管温度
尿サンプルの保管温度は、サンプル中に含まれる標的バイオマーカが安全に保管され得る温度である限り特に限定されない。
尿サンプルの保管温度は、サンプル中に含まれる標的バイオマーカが安全に保管され得る温度である限り特に限定されない。
【0066】
細胞外小胞を含むサンプル
尿サンプルは、被験体の細胞から分泌された細胞外小胞を含む。１つの実施形態によれば、細胞外小胞はエキソソームであってもよい。１つの実施形態によれば、細胞外小胞は、エキソソーム、微小胞、及びアポトーシス小体からなる群から選択される１又は複数を含んでもよい。
尿サンプルは、被験体の細胞から分泌された細胞外小胞を含む。１つの実施形態によれば、細胞外小胞はエキソソームであってもよい。１つの実施形態によれば、細胞外小胞は、エキソソーム、微小胞、及びアポトーシス小体からなる群から選択される１又は複数を含んでもよい。
【0067】
サンプルの細分化
尿サンプルは、必要である場合細分化した後使用されてもよい。１つの実施形態によれば、第１のサンプルは、第１のサブサンプル及び第２のサブサンプルに分割されてもよい。１つの実施形態によれば、第２のサンプルは、３つ又はそれより多くのサブサンプルに分割されてもよい。
尿サンプルは、必要である場合細分化した後使用されてもよい。１つの実施形態によれば、第１のサンプルは、第１のサブサンプル及び第２のサブサンプルに分割されてもよい。１つの実施形態によれば、第２のサンプルは、３つ又はそれより多くのサブサンプルに分割されてもよい。
【0068】
サンプルの調製－例
サンプルの調製において、尿サンプルの調製は、それが第１の値及び第２の値を得るために必要とされる工程である限り特に限定されない。１つの実施形態によれば、サンプルの調製は、被験体由来の尿上清サンプルを調製することを含んでもよい。サンプルの調製は、サンプルを前処理することをさらに含んでもよい。サンプルの前処理は、目的の細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡの発現量に対応する値を測定するために必要とされる工程である限り特に限定されない。１つの実施形態によれば、尿サンプルの調製は、被験体の尿サンプルに好適なキットを使用して尿中のｍｉＲＮＡを抽出することをさらに含んでもよい。この場合、公知のキットがキットとして使用されてもよく、例えば、Ｇｅｎｏｌｕｔｉｏｎ尿中ｍｉＲＮＡ精製キット（Ｇｅｎｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、韓国、ソウル）であってもよいが、本発明はそれに限定されない。
サンプルの調製において、尿サンプルの調製は、それが第１の値及び第２の値を得るために必要とされる工程である限り特に限定されない。１つの実施形態によれば、サンプルの調製は、被験体由来の尿上清サンプルを調製することを含んでもよい。サンプルの調製は、サンプルを前処理することをさらに含んでもよい。サンプルの前処理は、目的の細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡの発現量に対応する値を測定するために必要とされる工程である限り特に限定されない。１つの実施形態によれば、尿サンプルの調製は、被験体の尿サンプルに好適なキットを使用して尿中のｍｉＲＮＡを抽出することをさらに含んでもよい。この場合、公知のキットがキットとして使用されてもよく、例えば、Ｇｅｎｏｌｕｔｉｏｎ尿中ｍｉＲＮＡ精製キット（Ｇｅｎｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、韓国、ソウル）であってもよいが、本発明はそれに限定されない。
【0069】
第１の値を取得する段階
第１の値を取得する段階－概観
本明細書において提供される診断スコアを算出する方法において、第１の値は、前立腺癌を診断することができる、細胞外小胞由来のｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９と関連付けられた値である。１つの実施形態によれば、第１の値は、サンプル中に含まれる第１の標的の量に対応する値であってもよい。この場合、第１の標的は、細胞外小胞に由来するｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９及び／又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９である。第１の値は、被験体が前立腺癌を有するかどうかについての情報を反映する。しかしながら、第１の値においては、被験体が前立腺癌を有するかどうかについての情報とともに、様々な内生要因の作用が反映されるため、第１の値を単独で使用して、被験体が前立腺癌を有するかどうかを決定することは困難である。１つの実施形態によれば、第１の値は、前立腺癌を診断することができる第１の情報、及び第１の情報から独立した内生要因によって引き起こされる第１のノイズを同時に反映してもよい。第１の値を取得する方法は、細胞外小胞由来のｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９の量に対応する値を算出することができる方法である限り特に限定されない。１つの実施形態によれば、第１の値を取得する段階は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してサンプル中の１又は複数のｍｉＲＮＡを増幅する段階、及び増幅の結果からサンプル中の１又は複数のｍｉＲＮＡの量を算出する段階を含んでもよい。
第１の値を取得する段階－概観
本明細書において提供される診断スコアを算出する方法において、第１の値は、前立腺癌を診断することができる、細胞外小胞由来のｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９と関連付けられた値である。１つの実施形態によれば、第１の値は、サンプル中に含まれる第１の標的の量に対応する値であってもよい。この場合、第１の標的は、細胞外小胞に由来するｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９及び／又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９である。第１の値は、被験体が前立腺癌を有するかどうかについての情報を反映する。しかしながら、第１の値においては、被験体が前立腺癌を有するかどうかについての情報とともに、様々な内生要因の作用が反映されるため、第１の値を単独で使用して、被験体が前立腺癌を有するかどうかを決定することは困難である。１つの実施形態によれば、第１の値は、前立腺癌を診断することができる第１の情報、及び第１の情報から独立した内生要因によって引き起こされる第１のノイズを同時に反映してもよい。第１の値を取得する方法は、細胞外小胞由来のｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９の量に対応する値を算出することができる方法である限り特に限定されない。１つの実施形態によれば、第１の値を取得する段階は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してサンプル中の１又は複数のｍｉＲＮＡを増幅する段階、及び増幅の結果からサンプル中の１又は複数のｍｉＲＮＡの量を算出する段階を含んでもよい。
【0070】
尿中の細胞外小胞由来のｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９を標的とすること第１の値は、前立腺癌を診断することができる、細胞外小胞由来のｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９と関連付けられた値である。これは、ｍｉＲＮＡアッセイ法を使用して見出された、前立腺癌の発病についての情報を含むバイオマーカに対応する。本発明者は、研究を行い、被験体の尿中の細胞外小胞由来のｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９及びｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９は、前立腺癌を有する被験体において、正常な被験体と比較して下方発現されていることを見出した。したがって、本明細書において提供される診断スコアを算出する方法は、被験体の尿サンプル中に含まれる細胞外小胞由来のｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９及び／又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９を標的として使用して、サンプル中に含まれる標的の量を算出する段階を備える。
【0071】
第１の値を取得する方法の例－ＰＣＲ
１つの実施形態によれば、第１の値を取得する段階は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、尿サンプル中の細胞外小胞由来のｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９を増幅する段階、及び増幅の結果から第１の値を取得する段階を含んでもよい。この場合、ＰＣＲを使用して増幅する方法は、当業者に公知の方法から適切に選択されてもよい。１つの実施形態によれば、第１の値を取得する段階は、第１の標的としてサンプル中の細胞外小胞由来のｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９及び／又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９を使用して第１の標的のｃＤＮＡを合成する段階；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２からなる群から選択される１又は複数のプライマを含む反応試薬とｃＤＮＡを混合してＰＣＲ増幅のための混合物を調製する段階；ＲＴ－ＰＣＲによってＰＣＲ増幅のための混合物を増幅する段階；及びＲＴ－ＰＣＲの結果からサンプル中に含まれる第１の標的の量を算出する段階をさらに含んでもよい。１つの実施形態によれば、ＲＴ－ＰＣＲの結果は、反応サイクル数対蛍光シグナル強度のグラフ及び／又は融解曲線を含んでもよい。１つの実施形態によれば、第１の値を取得する段階は、公知のＰＣＲ装置を使用して行われてもよい。具体的には、ＰＣＲ装置は、Ｒｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ ６０００機器（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデン）であってもよいが、本発明はそれに限定されない。
１つの実施形態によれば、第１の値を取得する段階は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、尿サンプル中の細胞外小胞由来のｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９を増幅する段階、及び増幅の結果から第１の値を取得する段階を含んでもよい。この場合、ＰＣＲを使用して増幅する方法は、当業者に公知の方法から適切に選択されてもよい。１つの実施形態によれば、第１の値を取得する段階は、第１の標的としてサンプル中の細胞外小胞由来のｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９及び／又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９を使用して第１の標的のｃＤＮＡを合成する段階；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２からなる群から選択される１又は複数のプライマを含む反応試薬とｃＤＮＡを混合してＰＣＲ増幅のための混合物を調製する段階；ＲＴ－ＰＣＲによってＰＣＲ増幅のための混合物を増幅する段階；及びＲＴ－ＰＣＲの結果からサンプル中に含まれる第１の標的の量を算出する段階をさらに含んでもよい。１つの実施形態によれば、ＲＴ－ＰＣＲの結果は、反応サイクル数対蛍光シグナル強度のグラフ及び／又は融解曲線を含んでもよい。１つの実施形態によれば、第１の値を取得する段階は、公知のＰＣＲ装置を使用して行われてもよい。具体的には、ＰＣＲ装置は、Ｒｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ ６０００機器（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデン）であってもよいが、本発明はそれに限定されない。
【0072】
第１の値の単独使用の制約－内生要因の作用
被験体のサンプル中に含まれる細胞外小胞由来のｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９の量が、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての情報を反映する場合でさえ、第１の値を単独で使用して前立腺癌の発病及び／又は前立腺癌の進行の程度を診断することはできない。これは、前立腺癌の発病についての情報及び情報から独立した内生要因の作用が、第１の値において同時に反映されるためである。したがって、内生要因の作用が除去、低減、且つ／又は制御されない限り、第１の値を単独で使用して前立腺癌の発病及び／又は前立腺癌の進行の程度を診断することは困難である。内生要因は、前立腺癌から独立した様々な要因を指し、以下のとおりさらに詳細に説明される。
被験体のサンプル中に含まれる細胞外小胞由来のｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９の量が、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての情報を反映する場合でさえ、第１の値を単独で使用して前立腺癌の発病及び／又は前立腺癌の進行の程度を診断することはできない。これは、前立腺癌の発病についての情報及び情報から独立した内生要因の作用が、第１の値において同時に反映されるためである。したがって、内生要因の作用が除去、低減、且つ／又は制御されない限り、第１の値を単独で使用して前立腺癌の発病及び／又は前立腺癌の進行の程度を診断することは困難である。内生要因は、前立腺癌から独立した様々な要因を指し、以下のとおりさらに詳細に説明される。
【0073】
内生要因
内生要因－定義
ある特定の疾患に関するバイオマーカの発現量が測定される場合、バイオマーカの発現量に影響を有する様々な要因が存在する。本明細書において、「内生要因」という用語は、バイオマーカの発現量に影響を及ぼす要因の中でも、ある特定の疾患と関連付けられた要因（例えば、ある特定の疾患の発病及び進行）ではなく、サンプル又は被験体それ自体と関連付けられた要因を集合的に指す。サンプル中に含まれるバイオマーカの量は、ある特定の疾患の作用だけでなく内生要因の作用も反映するため、バイオマーカの発現量を使用してある特定の疾患を診断するためには、内生要因の作用を除去、低減、且つ／又は制御することは非常に重要である。
内生要因－定義
ある特定の疾患に関するバイオマーカの発現量が測定される場合、バイオマーカの発現量に影響を有する様々な要因が存在する。本明細書において、「内生要因」という用語は、バイオマーカの発現量に影響を及ぼす要因の中でも、ある特定の疾患と関連付けられた要因（例えば、ある特定の疾患の発病及び進行）ではなく、サンプル又は被験体それ自体と関連付けられた要因を集合的に指す。サンプル中に含まれるバイオマーカの量は、ある特定の疾患の作用だけでなく内生要因の作用も反映するため、バイオマーカの発現量を使用してある特定の疾患を診断するためには、内生要因の作用を除去、低減、且つ／又は制御することは非常に重要である。
【0074】
内生要因の第１の例－サンプル関連要因
内生要因はサンプル関連要因を含んでもよい。「サンプル関連要因」という語句は、サンプル中のバイオマーカの発現量に影響を及ぼし得る要因の中でも、サンプルそれ自体の属性と関連付けられた要因を集合的に指す。１つの実施形態によれば、内生要因は、１又は複数のサンプル関連要因を含んでもよい。具体的には、サンプル関連要因は、サンプルの体積、サンプル採取時間、サンプルを採取する方法、サンプル保管期間、サンプル保管温度、又はサンプルを細分化する方法を含んでもよいが、本発明はそれらに限定されない。
内生要因はサンプル関連要因を含んでもよい。「サンプル関連要因」という語句は、サンプル中のバイオマーカの発現量に影響を及ぼし得る要因の中でも、サンプルそれ自体の属性と関連付けられた要因を集合的に指す。１つの実施形態によれば、内生要因は、１又は複数のサンプル関連要因を含んでもよい。具体的には、サンプル関連要因は、サンプルの体積、サンプル採取時間、サンプルを採取する方法、サンプル保管期間、サンプル保管温度、又はサンプルを細分化する方法を含んでもよいが、本発明はそれらに限定されない。
【0075】
内生要因の第２の例－被験体関連要因
内生要因は、被験体関連要因を含んでもよい。「被験体関連要因」という語句は、サンプル中のバイオマーカの発現量に影響を及ぼし得る要因の中でも、被験体における、前立腺癌の発病から独立した生理活性及び状態などと関連付けられた要因を集合的に指す。１つの実施形態によれば、内生要因は、１又は複数の被験体関連要因を含んでもよい。具体的には、被験体関連要因は、サンプルの採取前に被験体の性別、被験体の年齢、被験体の人種、被験体の体重、被験体の腎機能、又は被験体の水分補給状態を含んでもよいが、本発明はそれらに限定されない。
内生要因は、被験体関連要因を含んでもよい。「被験体関連要因」という語句は、サンプル中のバイオマーカの発現量に影響を及ぼし得る要因の中でも、被験体における、前立腺癌の発病から独立した生理活性及び状態などと関連付けられた要因を集合的に指す。１つの実施形態によれば、内生要因は、１又は複数の被験体関連要因を含んでもよい。具体的には、被験体関連要因は、サンプルの採取前に被験体の性別、被験体の年齢、被験体の人種、被験体の体重、被験体の腎機能、又は被験体の水分補給状態を含んでもよいが、本発明はそれらに限定されない。
【0076】
第２の値を取得する段階
第２の値を取得する段階－概観
第２の値は、サンプル中の細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡと関連付けられた値である。１つの実施形態によれば、第２の値は、サンプル中に含まれる細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡの量に対応する値であってもよい。具体的には、細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡは、ｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。また、第２の値は、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての情報を含む。さらに、内生要因の作用が第２の値において反映される。この場合、第２の値において反映される内生要因の作用は、第１の値において反映される内生要因の作用の程度と緊密な相関関係を有する。したがって、第１の値は、第２の値を使用して正規化されてもよい。換言すると、第１の値において反映される内生要因の作用は、第２の値を使用して除去、低減、且つ／又は制御されてもよい。１つの実施形態によれば、第２の値は、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての第２の情報、及び内生要因と関連付けられた第３の情報を反映する値であってもよい。この場合、第３の情報は、第１のノイズと緊密な相関関係を有し、したがって、第１の値は、第２の値を使用して正規化され得る。
第２の値を取得する段階－概観
第２の値は、サンプル中の細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡと関連付けられた値である。１つの実施形態によれば、第２の値は、サンプル中に含まれる細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡの量に対応する値であってもよい。具体的には、細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡは、ｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３であってもよいが、本発明はそれらに限定されない。また、第２の値は、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての情報を含む。さらに、内生要因の作用が第２の値において反映される。この場合、第２の値において反映される内生要因の作用は、第１の値において反映される内生要因の作用の程度と緊密な相関関係を有する。したがって、第１の値は、第２の値を使用して正規化されてもよい。換言すると、第１の値において反映される内生要因の作用は、第２の値を使用して除去、低減、且つ／又は制御されてもよい。１つの実施形態によれば、第２の値は、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての第２の情報、及び内生要因と関連付けられた第３の情報を反映する値であってもよい。この場合、第３の情報は、第１のノイズと緊密な相関関係を有し、したがって、第１の値は、第２の値を使用して正規化され得る。
【0077】
細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡを標的とすること
第２の値は、サンプル中の細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡと関連付けられた値である。第１の値において反映される内生要因の作用を除去するためには、第１の値から独立しており、かつ同じ内生要因の作用を反映する値が必要とされる。細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡの発現量と関連付けられた値は、好ましくは第２の値として使用され、このことは、それが、第１の値も細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９）の発現量と関連付けられた値であるため、同じ又は類似の内生要因の作用を有すると考えられるためである。１つの実施形態によれば、第２の値は、サンプル中に含まれる細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡの量に対応する値であってもよい。
第２の値は、サンプル中の細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡと関連付けられた値である。第１の値において反映される内生要因の作用を除去するためには、第１の値から独立しており、かつ同じ内生要因の作用を反映する値が必要とされる。細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡの発現量と関連付けられた値は、好ましくは第２の値として使用され、このことは、それが、第１の値も細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９）の発現量と関連付けられた値であるため、同じ又は類似の内生要因の作用を有すると考えられるためである。１つの実施形態によれば、第２の値は、サンプル中に含まれる細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡの量に対応する値であってもよい。
【0078】
第２の値の第１の特徴－内生要因についての情報を含むこと
第１の値と同様に、第２の値は内生要因の作用を反映する。上述したように、内生要因は、１又は複数のサンプル関連要因、及び／又は１又は複数の被験体関連要因を含む。
第１の値と同様に、第２の値は内生要因の作用を反映する。上述したように、内生要因は、１又は複数のサンプル関連要因、及び／又は１又は複数の被験体関連要因を含む。
【0079】
第２の値の第２の特徴－前立腺癌と関連付けられた情報を含むこと
第１の値と同様に、第２の値も、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての情報を含む。ただし、第２の値に含まれる前立腺癌の発病についての情報は、第１の値に含まれる情報から独立している。１つの実施形態によれば、第２の値は、サンプル中に含まれる第２の標的の量に対応する値であってもよい。この場合、第２の値は、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての第２の情報を反映してもよい。１つの実施形態によれば、第２の標的は、正常な被験体又は良性前立腺過形成を有する被験体と比較して、前立腺癌を発症している被験体において上方制御されていてもよい。さらに別の実施形態によれば、第２の標的は、正常な被験体又は良性前立腺過形成を有する被験体と比較して、前立腺癌を発症している被験体において下方制御されていてもよい。１つの実施形態によれば、第２の標的は、細胞外小胞に由来するｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９－５ｐ、ｈｓｖ１－ｍｉＲ－Ｈ１８、又はｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３であってもよい。
第１の値と同様に、第２の値も、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての情報を含む。ただし、第２の値に含まれる前立腺癌の発病についての情報は、第１の値に含まれる情報から独立している。１つの実施形態によれば、第２の値は、サンプル中に含まれる第２の標的の量に対応する値であってもよい。この場合、第２の値は、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての第２の情報を反映してもよい。１つの実施形態によれば、第２の標的は、正常な被験体又は良性前立腺過形成を有する被験体と比較して、前立腺癌を発症している被験体において上方制御されていてもよい。さらに別の実施形態によれば、第２の標的は、正常な被験体又は良性前立腺過形成を有する被験体と比較して、前立腺癌を発症している被験体において下方制御されていてもよい。１つの実施形態によれば、第２の標的は、細胞外小胞に由来するｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９－５ｐ、ｈｓｖ１－ｍｉＲ－Ｈ１８、又はｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３であってもよい。
【0080】
第２の値の第３の特徴－第１の値において反映される内生要因の作用との緊密な相関関係そのため、第２の値は、１）細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡを標的とすること、２）前立腺癌と関連付けられる情報を含むこと、及び３）内生要因についての情報を含むことによって特徴付けられる。しかしながら、第２の値がこれら３つの状態を満たす場合でさえ、本明細書において提供される診断スコアを算出する方法において、第２の値として利用されないことがある。これは、第２の値を取得する目的が、第１の値において反映される内生要因の作用を除去、低減、且つ／又は制御することであるためである。したがって、第２の値において反映される内生要因の作用は、第１の値において反映される内生要因の作用と緊密な相関関係を有しなければならない。本明細書において提供される第２の値が使用される場合、第１の値において反映される内生要因の作用は、除去、低減、且つ／又は制御され得る。１つの実施形態によれば、第２の値は、第１の値において反映される内生要因の作用である第１のノイズと緊密な相関関係を有する第３の情報を含んでもよい。
【0081】
第２の値を取得する方法の例－ＰＣＲ
１つの実施形態によれば、第２の値を取得する段階は、ＰＣＲによって尿サンプル中の細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡを増幅する段階、及び増幅の結果から第２の値を取得する段階を含んでもよい。具体的なＰＣＲ法は、「第１の値を取得する方法の例－ＰＣＲ」のセクションにおいて説明されるとおりである。この場合、ｃＤＮＡと混合された反応試薬に含まれるプライマの特異的な配列は、第２の値を算出するための標的としての細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡの配列に依存して変動してもよい。１つの実施形態によれば、第２の標的として細胞外小胞由来のｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９－５ｐ及び／又はｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３を使用して第２の値を取得する段階を行う場合、反応試薬に含まれるプライマは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４からなる群から選択される１又は複数の配列を有してもよい。
１つの実施形態によれば、第２の値を取得する段階は、ＰＣＲによって尿サンプル中の細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡを増幅する段階、及び増幅の結果から第２の値を取得する段階を含んでもよい。具体的なＰＣＲ法は、「第１の値を取得する方法の例－ＰＣＲ」のセクションにおいて説明されるとおりである。この場合、ｃＤＮＡと混合された反応試薬に含まれるプライマの特異的な配列は、第２の値を算出するための標的としての細胞外小胞由来のｍｉＲＮＡの配列に依存して変動してもよい。１つの実施形態によれば、第２の標的として細胞外小胞由来のｈｓｖ２－ｍｉＲ－Ｈ９－５ｐ及び／又はｈｓａ－ｍｉＲ－１９１３を使用して第２の値を取得する段階を行う場合、反応試薬に含まれるプライマは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４からなる群から選択される１又は複数の配列を有してもよい。
【0082】
第１の値を取得する工程と第２の値を取得する工程との関係
本明細書において提供される前立腺癌のための診断スコアを算出する方法に含まれる、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階が、前述の状態及び特徴を満たす場合、各順序及び方法は特に限定されない。１つの実施形態によれば、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、同時に行われてもよい。別の実施形態によれば、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、順次的に行われてもよい。例えば、第１の値が取得された後、第２の値が取得されてもよい。別の例として、第２の値が取得された後、第１の値が取得されてもよい。１つの実施形態によれば、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、同じ方法によって行われてもよい。具体的には、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、同じＰＣＲ法によって行われてもよい。さらに、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、同じＰＣＲ装置を使用して行われてもよい。さらに別の実施形態によれば、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、異なる方法によって行われてもよい。１つの実施形態によれば、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、他の分離工程なしにサンプル中で行われてもよい。別の実施形態によれば、サンプルが２つ又はそれより多くのサブサンプルに細分化された後で、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、サブサンプルに対し別々に行われてもよい。具体的には、サンプルは、第１のサブサンプル及び第２のサブサンプルに細分化されてもよく、第１の値は第１のサブサンプルから取得されてもよく、次いで第２の値は第２のサブサンプルから取得されてもよい。
本明細書において提供される前立腺癌のための診断スコアを算出する方法に含まれる、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階が、前述の状態及び特徴を満たす場合、各順序及び方法は特に限定されない。１つの実施形態によれば、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、同時に行われてもよい。別の実施形態によれば、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、順次的に行われてもよい。例えば、第１の値が取得された後、第２の値が取得されてもよい。別の例として、第２の値が取得された後、第１の値が取得されてもよい。１つの実施形態によれば、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、同じ方法によって行われてもよい。具体的には、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、同じＰＣＲ法によって行われてもよい。さらに、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、同じＰＣＲ装置を使用して行われてもよい。さらに別の実施形態によれば、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、異なる方法によって行われてもよい。１つの実施形態によれば、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、他の分離工程なしにサンプル中で行われてもよい。別の実施形態によれば、サンプルが２つ又はそれより多くのサブサンプルに細分化された後で、第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階は、サブサンプルに対し別々に行われてもよい。具体的には、サンプルは、第１のサブサンプル及び第２のサブサンプルに細分化されてもよく、第１の値は第１のサブサンプルから取得されてもよく、次いで第２の値は第２のサブサンプルから取得されてもよい。
【0083】
診断スコアを算出する段階
診断スコアを算出する段階－概観
本明細書において提供される診断スコアを算出する方法は、上述したような第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階から取得された第１の値及び第２の値を使用して診断スコアを算出する段階を備えてもよい。１つの実施形態によれば、前立腺癌のための診断スコアを算出する段階は、第１の値及び第２の値を使用して行われる。結果として、診断スコアを使用して前立腺癌を診断してもよい。
診断スコアを算出する段階－概観
本明細書において提供される診断スコアを算出する方法は、上述したような第１の値を取得する段階及び第２の値を取得する段階から取得された第１の値及び第２の値を使用して診断スコアを算出する段階を備えてもよい。１つの実施形態によれば、前立腺癌のための診断スコアを算出する段階は、第１の値及び第２の値を使用して行われる。結果として、診断スコアを使用して前立腺癌を診断してもよい。
【0084】
診断スコアの特徴－前立腺癌関連バイオマーカについての情報を反映すること
診断スコアは、第２の値を使用して第１の値において反映される内生要因の作用を正規化することによって取得されるため、診断スコアは、第１の値において反映される前立腺癌の発病及び／又は前立腺癌の進行の程度と関連付けられた情報を含む。したがって、診断スコアは前立腺癌を診断することができる。
診断スコアは、第２の値を使用して第１の値において反映される内生要因の作用を正規化することによって取得されるため、診断スコアは、第１の値において反映される前立腺癌の発病及び／又は前立腺癌の進行の程度と関連付けられた情報を含む。したがって、診断スコアは前立腺癌を診断することができる。
【0085】
診断スコアを算出する方法の例
診断スコアの算出は、以下の２つの条件、１）第１の値及び第２の値の両方を使用すること、及び２）診断スコアにおける第１の値及び第２の値において反映される内生要因の作用を除去、低減、且つ／又は制御することを満たす限り特に限定されない。１つの実施形態によれば、診断スコアは第１の値と第２の値の比によって算出されてもよい。
診断スコアの算出は、以下の２つの条件、１）第１の値及び第２の値の両方を使用すること、及び２）診断スコアにおける第１の値及び第２の値において反映される内生要因の作用を除去、低減、且つ／又は制御することを満たす限り特に限定されない。１つの実施形態によれば、診断スコアは第１の値と第２の値の比によって算出されてもよい。
【0086】
前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法
前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法－概観
本明細書は、前立腺癌のための診断スコアを使用して前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法を提供する。前立腺癌のための診断スコアは、前立腺癌を発症している被験体の群及び前立腺癌を発症していない被験体の群に関して、異なるパターン（例えば、被験体の個別の群に関する診断スコアの異なる平均値）を有するため、個別の被験体における前立腺癌の発病が予めわかっているコホートに関して、個別の被験体に関する診断スコアの分布が分析される場合に、前立腺癌検査の診断基準は決定され得る。１つの実施形態によれば、前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法は、コホートに含まれる被験体から、前立腺癌の発病についての情報及び前立腺癌のための診断スコアを含むデータセットを取得する段階；及びデータセットから前立腺癌の診断のための検査基準を決定する段階を備える。この場合、コホートは、前立腺癌を発症している１又は複数の被験体、及び前立腺癌を発症していない１又は複数の被験体を含む。また、前立腺癌のための診断スコアは、本明細書において提供される前立腺癌のための診断スコアを算出する方法によって算出される。
前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法－概観
本明細書は、前立腺癌のための診断スコアを使用して前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法を提供する。前立腺癌のための診断スコアは、前立腺癌を発症している被験体の群及び前立腺癌を発症していない被験体の群に関して、異なるパターン（例えば、被験体の個別の群に関する診断スコアの異なる平均値）を有するため、個別の被験体における前立腺癌の発病が予めわかっているコホートに関して、個別の被験体に関する診断スコアの分布が分析される場合に、前立腺癌検査の診断基準は決定され得る。１つの実施形態によれば、前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法は、コホートに含まれる被験体から、前立腺癌の発病についての情報及び前立腺癌のための診断スコアを含むデータセットを取得する段階；及びデータセットから前立腺癌の診断のための検査基準を決定する段階を備える。この場合、コホートは、前立腺癌を発症している１又は複数の被験体、及び前立腺癌を発症していない１又は複数の被験体を含む。また、前立腺癌のための診断スコアは、本明細書において提供される前立腺癌のための診断スコアを算出する方法によって算出される。
【0087】
コホート
前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法は、１又は複数の被験体における前立腺癌の発病についての情報、及び前立腺癌のための診断スコアを必要とする。したがって、方法は、前立腺癌を発症していない１又は複数の被験体及び前立腺癌を発症している１又は複数の被験体を含むコホートを標的とする。１つの実施形態によれば、前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法は、正常であるか又は良性前立腺過形成を発症している１又は複数の被験体、及び前立腺癌を発症している被験体を含むコホートに対し行われてもよい。
前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法は、１又は複数の被験体における前立腺癌の発病についての情報、及び前立腺癌のための診断スコアを必要とする。したがって、方法は、前立腺癌を発症していない１又は複数の被験体及び前立腺癌を発症している１又は複数の被験体を含むコホートを標的とする。１つの実施形態によれば、前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法は、正常であるか又は良性前立腺過形成を発症している１又は複数の被験体、及び前立腺癌を発症している被験体を含むコホートに対し行われてもよい。
【0088】
データセットを取得する段階
前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法は、コホートに含まれる被験体のそれぞれからの前立腺癌の発病についての情報及び前立腺癌のための診断スコアを含むデータセットを取得する段階を備える。１つの実施形態によれば、前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法は、第１のデータセットを算出する段階、ここで第１のデータセットは、コホートの各被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての情報のリスト、及びコホートの個別の被験体のための診断スコアのリストを含む、を備える。この場合、診断スコアは、本明細書において提供される前立腺癌のための診断スコアを算出する方法によって算出される。
前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法は、コホートに含まれる被験体のそれぞれからの前立腺癌の発病についての情報及び前立腺癌のための診断スコアを含むデータセットを取得する段階を備える。１つの実施形態によれば、前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法は、第１のデータセットを算出する段階、ここで第１のデータセットは、コホートの各被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての情報のリスト、及びコホートの個別の被験体のための診断スコアのリストを含む、を備える。この場合、診断スコアは、本明細書において提供される前立腺癌のための診断スコアを算出する方法によって算出される。
【0089】
前立腺癌の診断のための検査基準を決定する段階
前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法は、データセットから前立腺癌の診断のための検査基準を決定する段階を備える。前立腺癌の診断のための検査基準は、前立腺癌の発症が不明である被験体から診断スコアが取得される場合に被験体が前立腺癌を発症しているかどうかを決定するための標準を提供する。１つの実施形態によれば、データセットから前立腺癌の診断のための検査基準を決定する段階は、検査基準の感度及び特異度を考慮して行われてもよい。例えば、検査基準は、感度及び特異度を最大化するための標準を提供してもよい。別の例として、検査基準は、ある特定の感度値より大きいか等しい値を表すための標準を提供してもよい。さらに別の例として、検査基準は、ある特定の特異度値より大きいか等しい値を表すための標準を提供してもよい。１つの実施形態によれば、前立腺癌の診断のための検査基準は、診断スコア値に応じて、前立腺癌を発症する確率を提供してもよい。
前立腺癌の診断のための検査基準を決定する方法は、データセットから前立腺癌の診断のための検査基準を決定する段階を備える。前立腺癌の診断のための検査基準は、前立腺癌の発症が不明である被験体から診断スコアが取得される場合に被験体が前立腺癌を発症しているかどうかを決定するための標準を提供する。１つの実施形態によれば、データセットから前立腺癌の診断のための検査基準を決定する段階は、検査基準の感度及び特異度を考慮して行われてもよい。例えば、検査基準は、感度及び特異度を最大化するための標準を提供してもよい。別の例として、検査基準は、ある特定の感度値より大きいか等しい値を表すための標準を提供してもよい。さらに別の例として、検査基準は、ある特定の特異度値より大きいか等しい値を表すための標準を提供してもよい。１つの実施形態によれば、前立腺癌の診断のための検査基準は、診断スコア値に応じて、前立腺癌を発症する確率を提供してもよい。
【0090】
前立腺癌の診断についての情報を提供する方法
本明細書は、診断スコアを使用して前立腺癌の診断についての情報を提供する方法を開示する。この場合、前立腺癌の診断のための検査基準が使用されてもよい。１つの実施形態によれば、前立腺癌の診断についての情報を提供する方法は、被験体における前立腺癌のための診断スコアを算出する段階；及び１又は複数の所定値を参照して、診断スコアから前立腺癌に関するリスク要因を決定する段階を備えてもよい。この場合、１又は複数の所定値は、前立腺癌の診断のための検査基準であってもよい。
本明細書は、診断スコアを使用して前立腺癌の診断についての情報を提供する方法を開示する。この場合、前立腺癌の診断のための検査基準が使用されてもよい。１つの実施形態によれば、前立腺癌の診断についての情報を提供する方法は、被験体における前立腺癌のための診断スコアを算出する段階；及び１又は複数の所定値を参照して、診断スコアから前立腺癌に関するリスク要因を決定する段階を備えてもよい。この場合、１又は複数の所定値は、前立腺癌の診断のための検査基準であってもよい。
【0091】
前立腺癌のための診断スコアを算出する方法－概要
本明細書は、少なくとも２つの値を組み合わせることによって前立腺癌のための診断スコアを算出する方法を提供する。前立腺癌のための診断スコアを算出する方法は、サンプルを調製する段階、第１の値を取得する段階、第２の値を取得する段階、及び診断スコアを算出する段階を備える。サンプルはそれが被験体の尿サンプルであることを特徴とし、第１の値は、サンプル中に含まれる第１の標的の量に対応する値であり、ここで、サンプル中に含まれる細胞外小胞に由来するｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐは第１の標的として使用される、且つ第２の値は、サンプル中に含まれる第２の標的の量に対応する値であり、ここで、サンプル中に含まれる細胞外小胞に由来するｍｉＲＮＡは第２の標的として使用される。第１の値及び第２の値の両方は、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての情報を含み、第２の値は、第１の値のために特殊化された正規化係数に対応する。したがって、方法に従って算出される前立腺癌のための診断スコアは、前立腺癌を診断することができることによって特徴付けられる。本明細書は、前立腺癌のための診断スコアの使用を提供する。１）前立腺癌のための診断基準は、前立腺癌のための診断スコアを使用して決定されてもよい、及び２）前立腺癌のための診断スコアを使用する前立腺癌の発病の診断についての情報及び前立腺癌のための診断基準が提供されてもよい。
本明細書は、少なくとも２つの値を組み合わせることによって前立腺癌のための診断スコアを算出する方法を提供する。前立腺癌のための診断スコアを算出する方法は、サンプルを調製する段階、第１の値を取得する段階、第２の値を取得する段階、及び診断スコアを算出する段階を備える。サンプルはそれが被験体の尿サンプルであることを特徴とし、第１の値は、サンプル中に含まれる第１の標的の量に対応する値であり、ここで、サンプル中に含まれる細胞外小胞に由来するｈｓａ－ｍｉＲ－３６５９又はｈｓａ－ｍｉＲ－３６７９－５ｐは第１の標的として使用される、且つ第２の値は、サンプル中に含まれる第２の標的の量に対応する値であり、ここで、サンプル中に含まれる細胞外小胞に由来するｍｉＲＮＡは第２の標的として使用される。第１の値及び第２の値の両方は、被験体が前立腺癌を発症しているかどうかについての情報を含み、第２の値は、第１の値のために特殊化された正規化係数に対応する。したがって、方法に従って算出される前立腺癌のための診断スコアは、前立腺癌を診断することができることによって特徴付けられる。本明細書は、前立腺癌のための診断スコアの使用を提供する。１）前立腺癌のための診断基準は、前立腺癌のための診断スコアを使用して決定されてもよい、及び２）前立腺癌のための診断スコアを使用する前立腺癌の発病の診断についての情報及び前立腺癌のための診断基準が提供されてもよい。
【実施例】
【0092】
［発明の形態］
以下に、本明細書において提供される本発明を、実験例及びそれらの実施例を参照しながらさらに詳細に本発明を説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を説明する目的のためだけに提供されるのであり、本明細書に記載される本開示の範囲を限定するものとして解釈されることを意図しないことは、当業者にとって明白となろう。
以下に、本明細書において提供される本発明を、実験例及びそれらの実施例を参照しながらさらに詳細に本発明を説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を説明する目的のためだけに提供されるのであり、本明細書に記載される本開示の範囲を限定するものとして解釈されることを意図しないことは、当業者にとって明白となろう。
【0093】
実験例１：検査被験体及びサンプルの調製
実験例１．１：検査被験体
前立腺癌のための診断スコアを算出するために、サンプルを採取されることになる被験体の実験群を調製した。被験体実験群は、前立腺癌を発症しない、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）を有する患者、及び前立腺癌を発症している患者の両方を含んだ。被験体の実験群の特徴は、下記の表１に列挙されるとおりである。
ＢＰＨ：良性前立腺過形成；ＰＣａ：前立腺癌；ＳＤ：標準偏差；ＰＳＡ：前立腺特異抗原；ＴＵＲＰ：経尿道的前立腺切除術。Ｐ値は、ＢＰＨ及びＰＣａを有する被験体由来の尿サンプルを使用することによって、マン・ホイットニーのＵ検定によって算出される値である。
実験例１．１：検査被験体
前立腺癌のための診断スコアを算出するために、サンプルを採取されることになる被験体の実験群を調製した。被験体実験群は、前立腺癌を発症しない、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）を有する患者、及び前立腺癌を発症している患者の両方を含んだ。被験体の実験群の特徴は、下記の表１に列挙されるとおりである。
【表1】
【0094】
実験例１．２：サンプルの調製
実験例１．１において調製された被験体の各群からサンプルを調製した。サンプルの調製は以下のとおりであった。
（１）朝に被験体の尿を採取した。
（２）遠心分離機を使用して２，５００ｒｐｍで１５分間、尿サンプルを遠心分離した。
（３）サンプルとして尿の上清を採取し、次の工程で使用するまで－２０℃で保管した。
実験例１．１において調製された被験体の各群からサンプルを調製した。サンプルの調製は以下のとおりであった。
（１）朝に被験体の尿を採取した。
（２）遠心分離機を使用して２，５００ｒｐｍで１５分間、尿サンプルを遠心分離した。
（３）サンプルとして尿の上清を採取し、次の工程で使用するまで－２０℃で保管した。
【0095】
実験例１．３：サンプルの前処理
実験例１．２において調製された尿サンプルを、第１の値及び第２の値を算出するための前処理工程に供した。この工程は以下のとおりである。
（１）Ｇｅｎｏｌｕｔｉｏｎ尿中ｍｉＲＮＡ精製キット（Ｇｅｎｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、韓国、ソウル）を使用して尿サンプルを精製した。
（２）Ｇｅｎｏｌｕｔｉｏｎが商標権を有するｍｉＲＮＡ分離溶液を含有するチューブに５００μＬの尿サンプル上清を加え、２０秒間ボルテックスした。
（３）チューブに２００μＬのクロロホルムを加え、１０秒間ボルテックスした。
（４）段階（３）の後、４℃、及び１３，０００ｒｐｍで１０分間、チューブを遠心分離機にかけた。
（５）段階（４）の後、チューブの上部から６５０μＬの液相を除去した。この場合では、チューブ中の白色沈殿物を除去しないように注意した。
（６）段階（５）の後、チューブ中に残るサンプルを新しい１．５ｍＬチューブに移し、これに０．８ｍＬのイソプロパノールを加えた。
（７）段階（６）の後、４℃、及び１５，０００ｒｐｍで２０分間、チューブを遠心分離機にかけた。
（８）段階（７）の後、ＲＮＡペレットの反対方向にチューブを傾けて液相を注ぎ出した。
（９）段階（８）の後、チューブに５００μＬの７０％ＥｔＯＨを加えた。
（１０）段階（９）の後、４℃、及び１５，０００ｒｐｍで２０分間、チューブを遠心分離機にかけた。
（１１）段階（１０）の後、残存するエタノールをチューブから除去し、次いで、残りのペレットを４０μＬのＲＮａｓｅフリー水に溶解させ、使用するまで－８０℃で保管した。
実験例１．２において調製された尿サンプルを、第１の値及び第２の値を算出するための前処理工程に供した。この工程は以下のとおりである。
（１）Ｇｅｎｏｌｕｔｉｏｎ尿中ｍｉＲＮＡ精製キット（Ｇｅｎｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、韓国、ソウル）を使用して尿サンプルを精製した。
（２）Ｇｅｎｏｌｕｔｉｏｎが商標権を有するｍｉＲＮＡ分離溶液を含有するチューブに５００μＬの尿サンプル上清を加え、２０秒間ボルテックスした。
（３）チューブに２００μＬのクロロホルムを加え、１０秒間ボルテックスした。
（４）段階（３）の後、４℃、及び１３，０００ｒｐｍで１０分間、チューブを遠心分離機にかけた。
（５）段階（４）の後、チューブの上部から６５０μＬの液相を除去した。この場合では、チューブ中の白色沈殿物を除去しないように注意した。
（６）段階（５）の後、チューブ中に残るサンプルを新しい１．５ｍＬチューブに移し、これに０．８ｍＬのイソプロパノールを加えた。
（７）段階（６）の後、４℃、及び１５，０００ｒｐｍで２０分間、チューブを遠心分離機にかけた。
（８）段階（７）の後、ＲＮＡペレットの反対方向にチューブを傾けて液相を注ぎ出した。
（９）段階（８）の後、チューブに５００μＬの７０％ＥｔＯＨを加えた。
（１０）段階（９）の後、４℃、及び１５，０００ｒｐｍで２０分間、チューブを遠心分離機にかけた。
（１１）段階（１０）の後、残存するエタノールをチューブから除去し、次いで、残りのペレットを４０μＬのＲＮａｓｅフリー水に溶解させ、使用するまで－８０℃で保管した。
【0096】
実験例２：サンプル中に含まれる標的ｍｉＲＮＡの量の測定
実験例１において調製されたサンプル中に含まれる標的ｍｉＲＮＡの量をＰＣＲ法によって算出した。具体的なＰＣＲ法は以下のとおりである。
（１）Ｍｉｒ－ＸＴＭ ｍｉＲＮＡ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ、日本、大津）を使用して、実験例１．３において調製されたサンプルからｃＤＮＡを合成した。この場合では、製造業者のプロトコルに従ってｃＤＮＡ合成法を行った。
（２）ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ）を含有する微量反応チューブ（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、オーストラリア、モートレイク）に、１０μＬの最終体積で段階（１）の生成物を加え、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ機器（Ｑｉａｇｅｎ、米国、カリフォルニア州、バレンシア）を使用するＲＴ－ＰＣＲ分析に供した。この場合では、標的ｍｉＲＮＡにそれぞれ対応するプライマ（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （ＩＤＴ）、韓国、ソウル）を使用して標的ｍｉＲＮＡの標準曲線をプロットした。使用した標的ｍｉＲＮＡ及びプライマの配列を下記の表２に列挙する。
（３）２．２５×１０５～２．２５×１０８の範囲で標準曲線をプロットし、すべてのサンプルを３連で測定した。この場合では、製造業者のプロトコルに従って、ＲＴ－ＰＣＲの条件を設定した。
（４）Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑソフトウェア２．３．１．４９を使用して出力としてのスペクトルデータを収集し分析した。
実験例１において調製されたサンプル中に含まれる標的ｍｉＲＮＡの量をＰＣＲ法によって算出した。具体的なＰＣＲ法は以下のとおりである。
（１）Ｍｉｒ－ＸＴＭ ｍｉＲＮＡ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ、日本、大津）を使用して、実験例１．３において調製されたサンプルからｃＤＮＡを合成した。この場合では、製造業者のプロトコルに従ってｃＤＮＡ合成法を行った。
（２）ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ）を含有する微量反応チューブ（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、オーストラリア、モートレイク）に、１０μＬの最終体積で段階（１）の生成物を加え、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ機器（Ｑｉａｇｅｎ、米国、カリフォルニア州、バレンシア）を使用するＲＴ－ＰＣＲ分析に供した。この場合では、標的ｍｉＲＮＡにそれぞれ対応するプライマ（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （ＩＤＴ）、韓国、ソウル）を使用して標的ｍｉＲＮＡの標準曲線をプロットした。使用した標的ｍｉＲＮＡ及びプライマの配列を下記の表２に列挙する。
【表2】
（４）Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑソフトウェア２．３．１．４９を使用して出力としてのスペクトルデータを収集し分析した。
【0097】
実験例３：統計解析
実験例３．１：診断スコアの算出
第１の値又は第２の値として実験例２において取得したサンプル中に含まれる標的ｍｉＲＮＡの量を使用して診断スコアを算出した。サンプル中に含まれる２つの標的ｍｉＲＮＡの量の比によって、診断スコアを算出した。下記の表３に実施例において使用した特定の標的を列挙する。
実験例３．１：診断スコアの算出
第１の値又は第２の値として実験例２において取得したサンプル中に含まれる標的ｍｉＲＮＡの量を使用して診断スコアを算出した。サンプル中に含まれる２つの標的ｍｉＲＮＡの量の比によって、診断スコアを算出した。下記の表３に実施例において使用した特定の標的を列挙する。
【表3】
【0098】
実験例３．２：各実施例における分析能の確認
実験例３．１において算出されたそれぞれの実施例の診断スコアを使用して前立腺癌を診断する能力を確認するために、以下のとおり統計解析を行った。
（１）マン・ホイットニーのＵ検定を使用して、それぞれの実施例の診断スコアを算出し、被験体の群間で診断スコアに統計的有意差があるかどうかを決定した。ｉ）すべてのＢＰＨ被験体に対して、前立腺癌を発症しているすべての被験体、及びｉｉ）ＰＳＡグレイゾーン（ＰＳＡ濃度：３ｎｇ／Ｌ～１０ｎｇ／Ｌ）にあるＢＰＨ被験体の群に対して、ＰＳＡグレイゾーンにある前立腺癌被験体の群に関して、統計的有意性を算出した。
（２）最も高い特異度及び感度を演繹することができる最適なカットオフ標準を設定するために、各実施例における被験体実験群に関して受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を導出した。また、ＲＯＣ曲線に関して、曲線下面積（ｔｈｅ ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ：ＡＵＣ）及び最適な感度及び特異度を導出した。ＲＯＣ曲線は、ｉ）被験体のすべての群、及びｉｉ）ＰＳＡグレイゾーンにある被験体の群それぞれに関して導出した。
実験例３．１において算出されたそれぞれの実施例の診断スコアを使用して前立腺癌を診断する能力を確認するために、以下のとおり統計解析を行った。
（１）マン・ホイットニーのＵ検定を使用して、それぞれの実施例の診断スコアを算出し、被験体の群間で診断スコアに統計的有意差があるかどうかを決定した。ｉ）すべてのＢＰＨ被験体に対して、前立腺癌を発症しているすべての被験体、及びｉｉ）ＰＳＡグレイゾーン（ＰＳＡ濃度：３ｎｇ／Ｌ～１０ｎｇ／Ｌ）にあるＢＰＨ被験体の群に対して、ＰＳＡグレイゾーンにある前立腺癌被験体の群に関して、統計的有意性を算出した。
（２）最も高い特異度及び感度を演繹することができる最適なカットオフ標準を設定するために、各実施例における被験体実験群に関して受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を導出した。また、ＲＯＣ曲線に関して、曲線下面積（ｔｈｅ ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ：ＡＵＣ）及び最適な感度及び特異度を導出した。ＲＯＣ曲線は、ｉ）被験体のすべての群、及びｉｉ）ＰＳＡグレイゾーンにある被験体の群それぞれに関して導出した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】
【国際調査報告】