特表 2023-540551 免疫療法組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-25

(54)【発明の名称】免疫療法組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20230915BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230915BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20230915BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230915BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230915BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20230915BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783 ZNA

A61P35/00

A61P31/00

A61P29/00

A61K35/17

C07K16/28

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023515068

(86)(22)【出願日】2021-09-04

(85)【翻訳文提出日】2023-03-03

(86)【国際出願番号】 IB2021058083

(87)【国際公開番号】W WO2022049550

(87)【国際公開日】2022-03-10

(31)【優先権主張番号】2013962.2

(32)【優先日】2020-09-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519391608

【氏名又は名称】ガンマデルタ セラピューティクス リミティッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＡＭＭＡＤＥＬＴＡ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＴＤ

【住所又は居所原語表記】１ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｗ２ ６ＢＤ Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】リカルディン、ティモシー

(72)【発明者】

【氏名】シモエス、アンドレ

(72)【発明者】

【氏名】ヌスバウマー、オリヴァー

(72)【発明者】

【氏名】コヴァックス、イストヴァン

(72)【発明者】

【氏名】パテル、ミヒル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065BB19

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB64

4C087MA66

4C087NA05

4C087ZB11

4C087ZB26

4C087ZB32

4H045AA11

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA60

(57)【要約】

本発明は、特に養子免疫療法で使用するための、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びγδＴ細胞を含む組成物に関する。本発明はまた、試料を抗ＴＣＲデルタ可変１（抗Ｖδ１）抗体と接触させることを含む、そのような組成物を調製するための方法を提供する。
【選択図】図１６Ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びγδＴ細胞を含む単離された組成物であって、前記組成物中に存在する前記γδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である、前記単離された組成物。

【請求項2】

ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む単離された組成物であって、前記組成物中に存在する前記γδＴ細胞の少なくとも５０％がＣＤ５６を発現する、前記単離された組成物。

【請求項3】

前記組成物中に存在する前記細胞の少なくとも９０％がＮＫ細胞及びγδＴ細胞からなる、請求項１または請求項２に記載の単離された組成物。

【請求項4】

前記組成物中に存在する前記細胞の少なくとも３０％がγδＴ細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【請求項5】

前記γδＴ細胞が、Ｖδ１Ｔ細胞及びＶδ２Ｔ細胞を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【請求項6】

前記組成物中に存在する前記細胞の少なくとも３０％がＮＫ細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【請求項7】

細胞を含む単離された組成物であって、前記細胞の少なくとも９０％がＮＫ細胞及びγδＴ細胞からなり、前記細胞の少なくとも１０％がＶδ１Ｔ細胞であり、前記細胞の少なくとも５％がＶδ２Ｔ細胞であり、前記細胞の少なくとも３０％がＮＫ細胞である、前記単離された組成物。

【請求項8】

前記組成物中に存在する前記γδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ５６を発現する、請求項７に記載の単離された組成物。

【請求項9】

前記γδＴ細胞が、Ｖδ１Ｔ細胞を含み、前記Ｖδ１Ｔ細胞の少なくとも１５％がＮＫｐ３０を発現する、請求項１～８のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【請求項10】

前記γδＴ細胞が、Ｖδ１Ｔ細胞を含み、前記Ｖδ１Ｔ細胞の５０％未満がＣＤ２７を発現する、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【請求項11】

前記単離された組成物が、改変されたＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【請求項12】

治療法で使用するための、請求項１～１１のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【請求項13】

がん、感染症または炎症性疾患の治療方法で使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【請求項14】

インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下及びインターロイキン－４（ＩＬ－４）の非存在下で抗ＴＣＲデルタ可変１（抗Ｖδ１）抗体またはその断片を使用してγδＴ細胞及びＮＫ細胞を含む混合細胞集団を刺激すること、ならびに前記混合細胞集団を培養することを含む、非γδ＋ＭＨＣ非拘束性リンパ球の増殖方法。

【請求項15】

ＭＨＣ非拘束性リンパ球が濃縮された細胞集団を含む組成物の調製方法であって、前記方法が、
（１）対象から取得した試料を、
（ｉ）抗Ｖδ１抗体またはその断片、及び
（ｉｉ）ＩＬ－１５の存在下、ＩＬ－４の非存在下で培養すること（前記培養の初日から）、及び
（２）前記試料から培養した前記細胞集団を単離することを含む、前記調製方法。

【請求項16】

前記方法のステップ（１）が、前記試料を少なくとも７日間、例えば少なくとも１４日間培養することを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

ステップ（２）で単離した前記細胞集団中に存在する前記ＭＨＣ非拘束性リンパ球の少なくとも７０％がＣＤ５６を発現する、請求項１５または請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

ステップ（２）で単離した前記細胞集団がγδＴ細胞を含み、前記γδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ５６を発現する、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

ステップ（２）で単離した前記細胞集団の少なくとも９０％がＮＫ細胞及びγδＴ細胞からなり、前記細胞の少なくとも１０％がＶδ１Ｔ細胞であり、前記細胞の少なくとも５％がＶδ２Ｔ細胞であり、前記細胞の少なくとも３０％がＮＫ細胞である、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記活性化抗Ｖδ１抗体またはその断片が、アミノ酸領域：
（ｉ）配列番号１の３～２０；及び／または
（ｉｉ）配列番号１の３７～７７内に１つ以上のアミノ酸残基を含むγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖のエピトープに結合する、請求項１４～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記エピトープが、配列番号１のアミノ酸領域５～２０及び６２～７７、５０～６４、３７～５３及び５９～７２、５９～７７、または３～１７及び６２～６９内の１つ以上のアミノ酸残基を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記抗Ｖδ１抗体またはその断片が、
配列番号２～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３、
配列番号２６～３７及び配列Ａ１～Ａ１２（表２の）のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２、及び／または
配列番号３８～６１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１のうちの１つ以上を含む、請求項１４～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記試料が、造血試料またはその画分である、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記試料から、前記培養の前にαβＴ細胞を枯渇させる、請求項１５～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記培養を、２．５％の血漿を含む培地中で実施する、請求項１５～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記方法のステップ（１）が、前記試料を約１２日間、例えば１２日間培養することを含む、請求項１５～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

請求項１４～２６のいずれか１項に記載の方法によって取得可能な、例えば取得される、ＭＨＣ非拘束性リンパ球が濃縮された細胞集団。

【請求項28】

請求項１４～２６のいずれか１項に記載の方法によって取得可能な、例えば取得される、細胞集団を含む組成物。

【請求項29】

治療法に使用するための、請求項２７に記載の細胞集団または請求項２８に記載の組成物。

【請求項30】

がん、感染症または炎症性疾患の治療方法で使用するための、請求項２７に記載の細胞集団または請求項２８に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、特に養子免疫療法で使用するための、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びγδＴ細胞を含む組成物に関する。本発明はまた、試料を抗ＴＣＲデルタ可変１（抗Ｖδ１）抗体と接触させることを含む、そのような組成物を調製するための方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

最近の非細胞免疫療法（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）及び細胞免疫療法（例えば、αβＣＡＲ－Ｔ細胞を標的とするＣＤ１９療法）の成功により、未改変及び遺伝子改変されたＴｒｅｇ、ｉＮＫ－Ｔ、γδＴ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージを利用した新規免疫療法アプローチの開発が促進されている。そのような高度な治療薬（ＡＴＭＰ）の製造には、様々なサイトカイン、培地、刺激ビーズ、フィーダー細胞の組み合わせを利用した複雑なプロセスが必要である。現在、これらの治療法の広範な応用は、複雑な製造プロセスと根底にある物流上の課題により、扱いにくく費用がかかる。

【0003】

例えば、ＣＡＲ修飾αβＴ細胞療法の大部分は自家移植に限定されており、製造実行の成功はドナー材料の品質によって大きく左右される。これらの治療法にはいくつかの欠点がある。第１に、αβＴ細胞はＭＨＣ拘束性であるため、同種異系環境で致死的な移植片対宿主病を生じさせる。第２に、ＣＡＲ－Ｔ療法の大部分は、サイトカイン放出症候群、神経毒性、オンターゲットのオフ腫瘍毒性（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｕｒ ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ）などの望ましくない副作用と関連している。第３に、αβＴ細胞の固形腫瘍部位への移動が不十分であるため、固形腫瘍を標的とするアプローチの治療効果が妨げられる。

【0004】

同種異系環境でのこの画期的な技術の使用を支援するために、本科学分野では２つの主な戦略が追求される：（１）洗練された遺伝子編集法を使用して（例えば、天然のαβＴＣＲをノックアウトすることにより）Ｔ細胞ＭＨＣを非拘束性にするか、または（２）本質的にＭＨＣ非拘束性の細胞型（すなわち、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞）を送達ビヒクルとして利用して、真の同種細胞産物を生成する。どちらのアプローチにもそれぞれ課題があり、遺伝子編集では製造プロセスと品質管理のステップが困難になり、一方、非拘束性細胞型の培養には明確なサイトカイン環境及び／またはフィーダー細胞系が必要である。血液源または細胞株のいずれかからＮＫ細胞を増殖させる確立された方法があるが、これらの方法のほとんどは、放射線を照射して後で除去する必要がある同種フィーダー細胞の使用を含む。ほとんどの方法は、製造中にフィーダー層として遺伝的に導入された膜結合サイトカインと共刺激分子を使用する照射腫瘍細胞株（Ｋ５６２）を使用するところまで行く。いくつかの場合（すなわち、ＮＫ細胞療法）では、細胞産物の凍結保存が不十分であり、その後の細胞傷害性の可能性が低下するため、この療法の広範な既製の適用が妨げられている。

【0005】

外来性サイトカインの添加を使用するγδＴ細胞の増殖方法は、以前に記載されており、ＷＯ２０１７／０７２３６７及びＷＯ２０１８／２１２８０８を参照されたい。薬理学的に改変された形態のヒドロキシ－メチルブタ－２－エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）または臨床的に承認されたアミノビスホスホネートを使用する患者自身のγδＴ細胞の増殖方法もまた、記載されている。これらのアプローチにより、２５０人を上回るがん患者が治療を受けており、一見安全に見えるが、完全な寛解はごくまれである。多数のγδＴ細胞を増殖させることができる方法が依然として必要である。

【0006】

ＮＫ細胞とγδＴ細胞は、ＭＨＣの拘束を受けず、その活性化がＭＨＣ結合抗原の認識に依存しないため、特に魅力的な免疫療法剤である。それらはいくつかの特定の機能を共有しているが（例えば、健康な細胞と悪性の細胞を識別する能力、天然の細胞傷害性受容体の存在など）、それらは進化的に保存されており、各細胞型は独自の免疫学的特性を備えている。これには、ＮＫ細胞を介した自己及びＮＣＲリガンド認識の欠落の概念、ならびに抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を実行するために抗体と協働する可能性など、各細胞型のユニークな作用機序が含まれるが、これらに限定されない。ＮＣＲに加えて、Ｖδ１細胞はＭＨＣ非拘束性ＴＣＲも使用して、腫瘍関連抗原を認識し、特定の組織部位に移動する。Ｖδ２Ｔ細胞は、変異したｐ５３がん遺伝子を有する悪性細胞に関連する特徴であるメバロン酸経路の代謝活性の増加を感知することにより、悪性細胞を認識することができるユニークな不変型ＴＣＲを有する。広範囲の標的認識と細胞傷害性様式に加えて、先天性リンパ球は、炎症を持続的な適応反応に橋渡しする。例えば、γδＴ細胞はＢ細胞と相互作用し、免疫グロブリン（ＩＧ）クラスの切り替えを促進して、腫瘍抗原に対する抗体応答を向上させることができる。ＮＫ細胞とγδＴ細胞の両方が抗原提示細胞を引き付けて成熟させ、長期にわたる免疫応答を開始させる可能性を有する患者自身の免疫系にドナー細胞を正式に橋渡しする。ＮＫ細胞とγδＴ細胞によって作成された炎症環境は、従来のαβＴ細胞をさらに引き付けて活性化する。

【0007】

ＮＫ細胞は、感染症（例えば、ウイルス、細菌、または真菌によって引き起こされる）と戦うのに非常に強力であり、一方、Ｖδ１γδＴ細胞は、ＣＭＶの再活性化（免疫不全患者、例えば、移植レシピエント及び重度の治療を受けたがん患者における重大な問題）に対する認識と保護の基本となる。さらに、ＣＭＶ活性化Ｖδ１γδＴ細胞は、移植後の免疫抑制剤治療患者における二次性悪性腫瘍のリスクを有意に低減する。

【0008】

Ｖδ２γδＴ細胞は、ＨＭＢＰＰ（主に原核生物及び一部の真核細胞型によって主に使用される非メバロン酸経路の非常に高親和性の中間体）の認識を通じてマイコバクテリア感染症を認識し、排除する上で基本的に重要である。Ｖδ２細胞は、原生動物も認識し、マラリア感染症に対する免疫応答に大きく貢献する。

【0009】

理想的には、同種異系の市販の細胞療法製品は、上記の細胞型のそれぞれが独自に所有するすべての利点、すなわち、悪性細胞に対する細胞傷害性の強化、ウイルス及び細菌感染症に対する広範な保護などを組み合わせ、同時に、各特異な細胞産物の制限を緩和し、抗原ドリフト、腫瘍逃避または免疫抑制のリスクを軽減する。現在、そのような併用療法は利用できず、細胞の種類ごとに個別の製造を行った後、事前に定義された比率で細胞を混合する必要がある。本発明は、この主要な製造上の課題を克服することを目的としている。

【発明の概要】

【0010】

本発明の第１の態様により、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びγδＴ細胞を含む単離された組成物を提供する。

【0011】

本発明のさらなる態様により、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも５０％がＣＤ５６を発現する、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む単離された組成物を提供する。

【0012】

本発明のさらなる態様により、細胞を含む単離された組成物を提供し、その場合、少なくとも９０％の細胞がＮＫ細胞及びγδＴ細胞からなり、少なくとも１０％の細胞がＶδ１Ｔ細胞であり、少なくとも５％の細胞がＶδ２Ｔ細胞であり、少なくとも３０％の細胞がＮＫ細胞である。

【0013】

本発明のさらなる態様により、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下及びインターロイキン－４（ＩＬ－４）の非存在下で抗ＴＣＲデルタ可変１（抗Ｖδ１）抗体またはその断片を使用してγδＴ細胞及びＮＫ細胞を含む混合細胞集団を刺激し、この混合細胞集団を培養することを含む、非γδ＋ＭＨＣ非拘束性リンパ球の増殖方法を提供する。

【0014】

本発明のさらなる態様により、ＭＨＣ非拘束性リンパ球を濃縮させた細胞集団を含む組成物の調製方法を提供し、この方法は、
（１）対象から取得した試料を、
（ｉ）抗Ｖδ１抗体またはその断片、及び
（ｉｉ）ＩＬ－１５の存在下、ＩＬ－４の非存在下で培養すること（前記培養の初日から）、及び
（２）試料から培養した細胞集団を単離することを含む。

【0015】

本発明のさらなる態様により、本明細書で定義される方法によって得られる組成物を提供する。

【0016】

本発明のさらなる態様により、本明細書で定義される方法によって得た組成物を提供する。

【0017】

本発明のさらなる態様により、治療薬に使用するための本明細書で定義される組成物を提供する。

【0018】

本発明のさらなる態様により、がん、感染症または炎症性疾患を治療する方法で使用するための、本明細書で定義される組成物を提供する。

【0019】

本発明のさらなる態様により、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む治療有効量の組成物を投与することを含む、がん、感染症または炎症性疾患の治療をそれが必要な対象で行う方法を提供し、その場合、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ５６を発現する。

【0020】

本発明のさらなる態様により、細胞を含む治療有効量の組成物を投与することを含む、がん、感染症または炎症性疾患の治療をそれが必要な対象で行う方法を提供し、その場合、少なくとも９０％の細胞がＮＫ細胞とγδＴ細胞からなり、少なくとも１０％の細胞がＶδ１Ｔ細胞であり、少なくとも５％の細胞がＶδ２Ｔ細胞であり、少なくとも３０％の細胞がＮＫ細胞である。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】条件１、２、及び３の細胞培養レジームの概略図。条件１では、細胞を播種し、抗Ｖδ１抗体、ＩＬ－４、ＩＬ－１β、ＩＬ－２１及びＩＦＮγと共に培養する。条件１の培養物にはさらに、回収するまで定期的に抗Ｖδ１抗体、ＩＬ－２１及びＩＬ－１５を供給する。条件２では、細胞を播種し、抗Ｖδ１抗体及びＩＬ－１５と共に培養する。条件２の培養物にはさらに、回収するまで定期的に抗Ｖδ１抗体及びＩＬ－１５を供給する。条件３では、細胞を播種し、抗Ｖδ１抗体、ＩＬ－１５、ＩＬ－４、ＩＬ－１β、ＩＬ－２１及びＩＦＮγと共に培養する。条件３の培養物にはさらに、回収するまで定期的にα－Ｖδ１抗体、ＩＬ－２１及びＩＬ－１５を供給する。条件１、２、及び３の培養を終了し、１１～１４日目の間に細胞を回収する。

【図2】条件１、２または３で培養した場合の、回収した細胞の総収量を示すグラフ。細胞を播種し、２４ウェルＧＲＥＸプレートで培養する。回収後、細胞を濃縮し、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ２５０を使用して計数した。条件１と２は、同等の細胞収量を生成するが、条件３は、条件１に比べて細胞収量を増加させる。

【図3】異なる培養レジーム（条件１、２または３）で培養した場合の、回収した細胞の免疫細胞組成を示すグラフ。具体的には、この図は、Ｖδ１＋γδＴ細胞、Ｖδ２＋γδＴ細胞、及びＮＫ（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）細胞の全ＣＤ４５＋リンパ球に対する割合を示す。異なる細胞集団の割合を、フローサイトメトリーによって評価した。条件１及び３では、Ｖδ１＋Ｔ細胞が高度に濃縮された細胞産物が生成され、一方、条件２では、Ｖδ１＋Ｔ細胞、Ｖδ２＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の混合集団を含む細胞産物が生成される。

【図4】異なる培養レジーム（条件１、２または３）で培養したＶδ１＋γδＴ細胞における主要な表現型マーカーの細胞表面マーカーの発現を示すグラフ。より具体的には、ＮＫｐ３０、ＣＤ２７及びＮＫＧ２Ｄ細胞表面発現をＶδ１＋γδＴ細胞内で試験した。表現型の表面特徴決定を、フローサイトメトリーによって評価した。条件１及び３から生成されたＶδ１＋Ｔ細胞は、ＣＤ２７及びＮＫＧ２Ｄについて高度に陽性であり、ＮＫｐ３０については低い。条件２から生成されたＶδ１＋Ｔ細胞は、ＣＤ２７の発現が低いが、ＮＫｐ３０及びＮＫＧ２Ｄの発現が増強される。

【図5】様々な抗Ｖδ１抗体または抗ＣＤ３抗体及びＩＬ－１５を用いて播種し、培養した場合の、回収した細胞の免疫細胞組成。具体的には、この図は、Ｖδ１＋γδＴ細胞、Ｖδ２＋γδＴ細胞、及びＮＫ（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）細胞の全ＣＤ４５＋リンパ球に対する割合を示す。異なる細胞集団の割合を、フローサイトメトリーによって評価した。２つの別々の抗Ｖδ１抗体クローンを使用すると、ＮＫ細胞とγδＴ細胞が濃縮される。抗ＣＤ３抗体を使用すると、γδＴ細胞のみが濃縮される。

【図6】細胞傷害性。（Ａ）は、異なる培養レジーム（条件１、２または３）で培養し、回収した細胞との共培養によるＮＡＬＭ－６ ＡＬＬ腫瘍細胞株の殺傷の割合を示す。２０～２２時間の共培養後、フローサイトメトリーによって殺傷率を評価した。（Ｂ）は、ＣＤ５６陽性リンパ球及びＣＤ５６陽性γδＴ細胞の全ＣＤ４５＋リンパ球に対する割合を示す。異なる細胞集団の割合を、フローサイトメトリーによって評価した。条件２と３はいずれも、ＮＡＬＭ－６腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を著しく増強する。殺傷の増強は、条件間のＣＤ５６発現と相関している。

【図7】培養前、及び条件１及び２からの回収後のＰＢＭＣにおけるＶδ１細胞及びＶδ２細胞のＣＤ５６発現プロファイル。ＣＤ５６表面発現を、フローサイトメトリーによる染色強度の分析により測定した。条件２は、固有のＰＢＭＣレベルと比較して、Ｖδ１細胞及びＶδ２細胞でのＣＤ５６発現強度を大幅に高める。

【図8】培養前、及び条件２からの回収後のＰＢＭＣにおけるγδＴ細胞及びＮＫ細胞でのＣＤ５６発現。ＣＤ５６表面発現を、フローサイトメトリーによって測定した。条件２は、γδＴ細胞とＮＫ細胞の両方でＣＤ５６－ｂｒｉｇｈｔ細胞の割合を大幅に高める。

【図9】異なる培養レジーム（条件１または２）で生成された細胞の凍結保存後の生存率及び全細胞回収率。ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ２５０とフローサイトメトリーの両方を使用して、全細胞生存率を評価した。全細胞回収率は、培養終了及び回収後に凍結させた細胞の量に対する、凍結保存細胞の解凍及び洗浄後に計数した全細胞から外挿する。凍結保存後の条件１と２の間で、同等の生存率と細胞回収率が観察される。

【図10】凍結保存後の細胞表現型。（Ａ）は、凍結保存前及び凍結保存後の条件２の培養レジームに従って生成された細胞産物の免疫細胞組成の代表的なフロープロットを示す。（Ｂ）は、凍結保存前及び凍結保存後に条件２の培養レジームに従って生成された細胞産物に存在する３つの主要な集団（Ｖδ１＋γδＴ細胞、Ｖδ２＋γδＴ細胞及びＮＫ（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）細胞）の表現型細胞表面マーカーの特徴決定を示す。より具体的には、ＮＫｐ３０、ＣＤ２７、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ５６の細胞表面発現を、存在するすべての免疫細胞集団で分析し、凍結保存前及び凍結保存後のその発現と比較した。条件２は、凍結保存前後で同等の免疫細胞組成と細胞表面マーカーの表現型を示す。

【図11】凍結保存後の細胞傷害性。グラフは、広範囲のエフェクター対標的比で、凍結保存後の条件１及び２の培養レジームから生成された細胞産物と共培養した場合のＮＡＬＭ－６ ＡＬＬ腫瘍細胞株の溶解率を示す。２０～２２時間の共培養後、フローサイトメトリーによって殺傷率を評価した。条件２は、条件１と比較して、エフェクター対標的比の範囲にわたって、凍結保存後のＮＡＬＭ－６細胞に対する細胞傷害性の増強を示す。

【図12】形質導入の許容度の増加。条件１及び２から生成された産物を構成するすべての免疫細胞のレンチウイルスベクターによる形質導入の（Ａ）グラフ及び（Ｂ）代表的なフロープロットを示す。形質導入は、レトロネクチンの存在下で実施した。形質導入された細胞産物は、未精製の凍結保存材料を使用して生成した。ＣＡＲ１９陽性細胞の割合は、形質導入の９６時間後にフローサイトメトリーによって測定する。フロープロットは、ＣＡＲ発現Ｖδ１＋γδＴ細胞の代表的なプロットを示す。条件２は、条件１に比べて形質導入に対する許容度が高いことを示している。

【図13A】条件２の培養レジームから生成された細胞の増強されたＣＡＲ媒介性細胞傷害性のグラフ及び代表的なフロープロット。より具体的には、広範囲のエフェクター対標的比での条件２培養レジームから生成されたＣＡＲ１９形質導入及び非形質導入細胞との共培養時にＮＡＬＭ－６死細胞（Ｓｙｔｏｘ＋ｖｅのＣＴＶ＋ｖｅ）の割合を示す。条件２から生成されたＣＡＲ１９形質導入細胞は、ＮＡＬＭ－６細胞に対する細胞傷害性の増強を示す。エフェクター対標的比が１：１００程度に低い場合に、細胞傷害性ターゲティングが観察される。

【図13B】条件２の培養レジームから生成された細胞の増強されたＣＡＲ媒介性細胞傷害性のグラフ及び代表的なフロープロット。より具体的には、ＮＡＬＭ－６との共培養時に条件２から生成された形質導入細胞のエフェクター対標的比１：５０（上部右側）及びアポトーシス標的細胞識別（下部右側）の代表的なフロープロットを示す。条件２から生成されたＣＡＲ１９形質導入細胞は、ＮＡＬＭ－６細胞に対する細胞傷害性の増強を示す。エフェクター対標的比が１：１００程度に低い場合に、細胞傷害性ターゲティングが観察される。

【図14】細胞の割合及び収量。（Ａ）培養レジメンの概略図。細胞を播種し、抗Ｖδ１抗体（クローンＣ０８）及びＩＬ－１５と共に培養する。この実験設定では、１２日目に回収するまで、６日目と９日目に細胞にＩＬ－１５を補充した。（Ｂ）（Ａ）に記載したプロセスを使用して培養した場合の回収された細胞の免疫細胞組成（上）、ならびに５人のドナーから採取した細胞の総収量及び生存率（下）を示すグラフ。

【図15】複数のドナー由来の細胞比率。（Ａ）無作為に選択された１５人の健康なドナーを使用して、図１４Ａに記載のように増殖させた場合の、回収した細胞の免疫細胞組成を示すグラフ。具体的には、この図は、Ｖδ１＋γδＴ細胞、Ｖδ２＋γδＴ細胞、及びＮＫ（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）細胞の全ＣＤ４５＋リンパ球に対する割合を示す。（Ｂ）生の値を示す表。

【図16A】ＣＤ５６発現と細胞傷害性との関連性。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）として表される、γδＴ細胞とＮＫ細胞からなる自然免疫細胞の組み合わせ（コンボ）でのＣＤ５６発現の誘導。

【図16B】ＣＤ５６発現と細胞傷害性との関連性。図１４Ａに示すように細胞を培養した場合の０～１２日目のコンボ内の異なる免疫細胞サブセットに対するＣＤ５６＋の割合として表される、γδＴ細胞とＮＫ細胞からなる自然免疫細胞の組み合わせ（コンボ）でのＣＤ５６発現の誘導。

【図16C】ＣＤ５６発現と細胞傷害性との関連性。８人のドナー由来のＣＤ３＋細胞（γδＴ細胞）でのＣＤ５６発現と細胞傷害性との相関。グラフは、ｓｙｔｏｘ＋標的細胞の割合とＣＤ５６＋Ｔ細胞の割合の間の線形回帰を示す（Ｒ^２＝０．９３，ｐ＝０．０００１）。

【図17】ホーミング／ケモカイン免疫細胞コンボの受容体プロファイル。図１４Ａに記載のように細胞を培養し、次いで凍結保存した。解凍後、示したマーカーに対する抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーで取得した。グラフは、３人のドナー由来の目的のマーカーを発現する各免疫サブセットの割合を示す。

【図18A】免疫細胞コンボにおけるＣＤ５６発現と形質導入能との相関。図１４Ａに示すように細胞を培養し、実施例８に記載のように形質導入した。回収時の形質導入効率を示す。グラフは、免疫細胞コンボの全形質導入効率及び各表示メンバーの形質導入効率を示す。

【図18B】免疫細胞コンボにおけるＣＤ５６発現と形質導入能との相関。ＣＤ５６発現によって階層化されたＶδ１＋サブセット内の形質導入効率。

【図18C】免疫細胞コンボにおけるＣＤ５６発現と形質導入能との相関。図１４Ａに示すようにＣ０８及びＩＬ－１５を使用して、またはＯＫＴ３＋ＩＬ－４＋ＩＬ－２１＋ＩＦＮγ＋ＩＬ－１β（実施例１の修正条件１）を使用して培養したＶδ１＋細胞でのＣＤ５６発現を示すフローサイトメトリーデータ（上部パネル）。グラフ（下部パネル）は、ＣＤ５６発現によって階層化された、ＯＫＴ３＋ＩＬ－４＋ＩＬ－２１＋ＩＦＮγ＋ＩＬ－１βを使用して培養した細胞由来のＶδ１＋サブセット内の形質導入効率を示す。より低いＣＤ５６発現が観察され、この条件での形質導入効率に対するＣＤ５６発現の影響は、図１４Ａに記載のプロセスを使用して培養した細胞と比較してはるかに低い。

【図19】免疫細胞の組み合わせ（「コンボ」）による固形腫瘍標的の細胞傷害性ターゲティング。図１４Ａに記載されているように生成されたエフェクター細胞を使用した、示されるエフェクター：標的比での（Ａ）ＯＶＣＡＲ細胞（卵巣癌起源）及び（Ｂ）ＨｅＬａ（子宮頸癌起源）の標的細胞溶解率。形質導入されていない免疫細胞コンボと、４－１ＢＢ及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を標的とするメソセリンで形質導入された遺伝子改変コンボ細胞の比較。対照として、同じ結合剤及びシグナル伝達ドメインを使用する最先端のαβＣＡＲ－Ｔ細胞を使用した。

【発明を実施するための形態】

【0022】

定義
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用する場合、以下の用語は、下記のそれぞれ与えられる意味を有する。

【0023】

ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞は、表面に別個の定義されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞の小さいサブセットを表す。このＴＣＲは、１つのガンマ（γ）鎖及び１つのデルタ（δ）鎖から構成されている。各鎖には、可変（Ｖ）領域、定常（Ｃ）領域、膜貫通領域、及び細胞質尾部が含まれている。Ｖ領域には、抗原結合部位が含まれている。ヒトγδＴ細胞には２つの主要なサブタイプがあり、１つは末梢血で優勢であり、もう１つは非造血組織で優勢である。２つのサブタイプは、細胞に存在するδ及び／またはγの種類によって定義され得る。例えば、末梢血で優勢なγδＴ細胞は、主にデルタ可変２鎖（Ｖδ２）を発現する。非造血組織において優性である（すなわち、組織常在性である）γδＴ細胞は、主にデルタ可変１（Ｖδ１）鎖を発現する。Ｖγをコードする主なＴＧＲＶ遺伝子セグメントは、ＴＲＧＶ２、ＴＲＧＶ３、ＴＲＧＶ４、ＴＲＧＶ５、ＴＲＧＶ８、ＴＲＧＶ９及びＴＲＧＶ１１、ならびに非機能遺伝子ＴＲＧＶ１０、ＴＲＧＶ１１、ＴＲＧＶＡ及びＴＲＧＶＢである。最も頻度の高いＴＲＤＶ遺伝子セグメントは、Ｖδ１、Ｖδ２、及びＶδ３をコードし、さらにＶδ及びＶαの両方の名称を有するいくつかのＶセグメントをコードする（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２９６：３０－４０（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）。

【0024】

「Ｖδ１Ｔ細胞」への言及は、Ｖδ１鎖を有するγδＴ細胞、すなわち、Ｖδ１^＋Ｔ細胞を指す。

【0025】

「デルタ可変１」への言及は、Ｖδ１またはＶｄ１とも称され得るが、一方、この領域を含むＴＣＲ鎖をコードするヌクレオチドは、「ＴＲＤＶ１」と称され得る。γδＴＣＲのＶδ１鎖と相互作用する抗体またはその断片はすべて、事実上、Ｖδ１に結合する抗体またはその断片であり、「抗ＴＣＲデルタ可変１抗体またはその断片」あるいは「抗Ｖδ１抗体またはその断片」と称され得る。

【0026】

本明細書では、「デルタ可変２」鎖などの他のデルタ鎖をさらに参照する。これらも同様に参照することができる。例えば、デルタ可変２鎖はＶδ２と称され得るが、この領域を含むＴＣＲ鎖をコードするヌクレオチドは「ＴＲＤＶ２」と称され得る。好ましい実施形態では、γδＴＣＲのＶδ１鎖と相互作用する抗体またはその断片は、Ｖδ２などの他のデルタ鎖とは相互作用しない。

【0027】

本明細書では、「ガンマ可変鎖」への言及も行う。これらはγ鎖またはＶγとも称され得るが、この領域を含むＴＣＲ鎖をコードするヌクレオチドはＴＲＧＶと称され得る。例えば、ＴＲＧＶ４は、Ｖγ４鎖を指す。好ましい実施形態では、γδＴＣＲのＶδ１鎖と相互作用する抗体またはその断片は、Ｖγ４などのガンマ鎖とは相互作用しない。

【0028】

「ナチュラルキラー細胞」すなわち「ＮＫ細胞」への言及は、ＴＣＲまたはＣＤ３を発現せず、大部分がＣＤ５６の発現に対して陽性である自然様リンパ球であるナチュラルキラー細胞を指す。ＮＫ細胞は、ＦＣ受容体ＣＤ１６、ならびにＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６及びＮＫＧ２Ｄなどの天然の細胞傷害性受容体も発現することができる。ヒトＮＫ細胞は、ＣＤ５６の細胞表面密度に基づいて２つのサブセット（ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}とＣＤ５６^ｄｉｍ）に分けることができ、それぞれ異なる表現型特性を有する。末梢血中のほとんどのＮＫ細胞はＣＤ５６^ｄｉｍであるが、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ} ＮＫ細胞は組織内により豊富に存在している。ＣＤ５６発現は活性化のマーカーであると考えられており、ＣＤ５６^ｄｉｍ ＮＫ細胞は、そのＣＤ５６発現を上方制御してＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}免疫表現型を採用している（Ｖａｎ Ａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：８９２）。

【0029】

「ＭＨＣ非拘束性リンパ球」または「非ＭＨＣ拘束性リンパ球」への言及は、認識または免疫応答の開始のために、エフェクターと標的細胞との間の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）適合性を必要としないリンパ球を指す。したがって、これらのリンパ球がＭＨＣ認識を必要としないため、この用語はＮＫ細胞とγδＴ細胞を指す。

【0030】

「非γδ＋ＭＨＣ非拘束性リンパ球」への言及は、γδＴＣＲを発現しない（すなわち、γδ－）ＭＨＣ非拘束性リンパ球を指す。したがって、この用語はＮＫ細胞を指す。

【0031】

用語「抗体」には、少なくとも１つの抗原結合部位（ＡＢＳ）を含む少なくとも１つの抗体可変ドメインを含む、任意の抗体タンパク質構築物が含まれる。抗体には、ＩｇＡ型、ＩｇＧ型、ＩｇＥ型、ＩｇＤ型、ＩｇＭ型（及びそのサブタイプ）の免疫グロブリンが含まれるが、これらに限定されない。２つの同一の重（Ｈ）鎖ポリペプチド及び２つの同一の軽（Ｌ）鎖ポリペプチドから組み立てられた免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の全体的な構造は十分に確立されており、哺乳動物で高度に保存されている（Ｐａｄｌａｎ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９－２１７）。

【0032】

従来の抗体または免疫グロブリン（Ｉｇ）は、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質である。各鎖は、定常領域と可変ドメインに分割される。重（Ｈ）鎖可変ドメインは本明細書ではＶＨと略され、軽（Ｌ）鎖可変ドメインは本明細書ではＶＬと略される。これらのドメイン、それに関連するドメイン及びそれに由来するドメインは、本明細書では免疫グロブリン鎖可変ドメインと称され得る。ＶＨドメイン及びＶＬドメイン（ＶＨ領域及びＶＬ領域とも称される）は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存されている領域と共に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される領域にさらに細分され得る。フレームワーク領域及び相補性決定領域は、明確に定義されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９９１）ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ９１－３２４２）。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３に記載されているような、ＣＤＲ配列についての別の番号付け規則もある。従来の抗体において、各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列される、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。２つの免疫グロブリン重鎖及び２つの免疫グロブリン軽鎖の従来の抗体四量体は、例えばジスルフィド結合によって相互接続された免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖、ならびに同様に接続された重鎖で形成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。重鎖の可変ドメイン及び軽鎖の可変ドメインは、抗原と相互作用する結合ドメインである。抗体の定常領域は、通常、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の構成要素（Ｃ１ｑ）を含めた、宿主組織または因子への抗体の結合を媒介する。

【0033】

本明細書で使用する場合、抗体の断片（「抗体断片」、「免疫グロブリン断片」、「抗原結合断片」または「抗原結合ポリペプチド」とも称され得る）は、標的に特異的に結合する抗体の一部（または前記一部を含有する構築物）、γδＴ細胞受容体のデルタ可変１（Ｖδ１）鎖（例えば、１つ以上の免疫グロブリン鎖が完全長ではないが標的に特異的に結合する分子）を指す。抗体断片という用語に含まれる結合断片の例には、以下が含まれる。
（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片）、
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により結合される２つのＦａｂ断片からなる二価の断片）、
（ｉｉｉ）Ｆｄ断片（ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなる）、
（ｉｖ）Ｆｖ断片（抗体の単一群のＶＬドメイン及びＶＨドメインからなる）、
（ｖ）一本鎖可変断片ｓｃＦｖ（組換え法を使用して、ＶＬ領域とＶＨ領域が対になって１価の分子を形成する１本のタンパク質鎖として作製されるのを可能にする合成リンカーによって結合したＶＬドメイン及びＶＨドメインからなる）、
（ｖｉ）ＶＨ（ＶＨドメインからなる免疫グロブリン鎖可変ドメイン）、
（ｖｉｉ）ＶＬ（ＶＬドメインからなる免疫グロブリン鎖可変ドメイン）、
（ｖｉｉｉ）ドメイン抗体（ｄＡｂ、ＶＨドメインまたはＶＬドメインのいずれかからなる）、
（ｉｘ）ミニボディ（ＣＨ３ドメインを介して結合するｓｃＦｖ断片の対からなる）、及び
（ｘ）ダイアボディ（小さなペプチドリンカーによって接続された１つの抗体由来のＶＨドメインと、別の抗体由来のＶＬドメインからなる、ｓｃＦｖ断片の非共有結合二量体からなる）。

【0034】

「ヒト抗体」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を指す。前記ヒト抗体を投与されたヒト対象は、前記抗体内に含有される一次アミノ酸に対する種間抗体応答（例えば、ＨＡＭＡ－ヒト抗マウス抗体－応答と称される）を生成しない。前記ヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ランダムまたは部位特異的突然変異誘発または体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含み得る。しかしながら、前記用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図していない。宿主細胞内に形質転換された組換え発現ベクターを使用して発現した抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子について遺伝子導入した動物（例えば、マウス）から単離された抗体などの組換え手段により調製、発現、作成もしくは単離されたヒト抗体、または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含有する任意の他の手段により調製、発現、作成もしくは単離された抗体は、「組換えヒト抗体」とも称され得る。

【0035】

非ヒト免疫グロブリン可変ドメインのフレームワーク領域の少なくとも１つのアミノ酸残基をヒト可変ドメイン由来の対応する残基で置換することは、「ヒト化」と称される。可変ドメインのヒト化は、ヒトの免疫原性を低下させ得る。

【0036】

「特異性」とは、特定の抗体またはその断片が結合できる異なる種類の抗原または抗原決定基の数を指す。抗体の特異性は、特定の抗原を固有の分子実体として認識し、それを別の抗原と区別する抗体の能力である。抗原またはエピトープに「特異的に結合する」抗体は、当技術分野でよく理解されている用語である。分子が、他の標的と反応する場合よりも特定の標的抗原またはエピトープとより頻繁に、より迅速に、より持続的に及び／またはより高い親和性で反応する場合、前記分子は「特異的結合」を示すと言われる。抗体が、他の物質と結合する場合よりも高い親和性、結合活性で、より容易に及び／または高い持続性で結合する場合、前記抗体は、標的抗原またはエピトープに「特異的に結合する」。

【0037】

抗原と抗原結合ポリペプチドとの解離に関する平衡定数（ＫＤ）によって表される「親和性」とは、抗原決定基と抗体（またはその断片）上の抗原結合部位との間の結合強度の尺度である。ＫＤの値が小さいほど、抗原決定基と抗原結合ポリペプチドとの間の結合強度は強くなる。あるいは、親和性は、親和定数（ＫＡ）、１／ＫＤとして表すこともできる。親和性は、目的の特定の抗原に応じて、既知の方法で決定することができる。

【0038】

１０^－６未満の任意のＫＤ値は、結合を示しているとみなされる。抗体またはその断片の抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えば、スキャッチャード分析及び／またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイなどの競合結合アッセイ、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法（例えば蛍光アッセイを使用する）、ならびに当技術分野で公知のこれらの様々な変形を含む、任意の好適な既知の方法で決定することができる。

【0039】

「結合活性」は、抗体またはその断片と関連する抗原との間の結合の強さの尺度である。結合活性は、抗原決定基と抗体上のその抗原結合部位との間の親和性、及び抗体上に存在する適切な結合部位の数の両方に関連している。

【0040】

「ヒト組織Ｖδ１＋細胞」ならびに「造血及び血液Ｖδ１＋細胞」ならびに「腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）Ｖδ１＋細胞」は、それぞれヒト組織もしくは造血血液系もしくはヒト腫瘍に含まれるか、またはそれらに由来する、Ｖδ１＋を発現する（Ｖδ１＋）細胞として定義される。すべての前記細胞型は、それらの（ｉ）位置またはそれらが由来する場所、及び（ｉｉ）Ｖδ１＋ＴＣＲのそれらの発現によって同定することができる。

【0041】

「調節抗体」は、細胞周期、及び／または細胞数、及び／または細胞生存率、及び／または１つ以上の細胞表面マーカー、及び／または１つ以上の分泌分子（例えば、サイトカイン、ケモカイン、ロイコトリエンなど）の分泌、及び／または抗体が結合する標的を発現する細胞に接触または結合する際の機能（標的細胞または疾患細胞に対する細胞傷害性など）における測定可能な変化を含むがこれらに限定されない、測定可能な変化を与える抗体である。

【0042】

細胞またはその集団を「調節する」方法は、前記細胞（複数可）または細胞からの分泌物における少なくとも１つの測定可能な変化において、１つ以上の「調節された細胞」を生成するように誘発される方法を指す。

【0043】

「免疫応答」は、例えば、調節抗体の添加などの際の、免疫系の少なくとも１つの細胞、または１つの細胞型、または１つの内分泌経路、または１つの外分泌経路における測定可能な変化である（細胞媒介性応答、体液性応答、サイトカイン応答、ケモカイン応答を含むが、限定されない）。

【0044】

「免疫細胞」は、ＣＤ３４＋細胞、Ｂ細胞、ＣＤ４５＋（リンパ球共通抗原）細胞、アルファ－ベータＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、形質細胞、好中球、単球、マクロファージ、赤血球、血小板、樹状細胞、食細胞、顆粒球、自然リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びガンマデルタＴ細胞を含むがこれらに限定されない免疫系の細胞として定義される。一般的には、コンビナトリアル細胞表面分子分析（例えば、フローサイトメトリーによる）を用いて免疫細胞を分類して、同定またはグループ化またはクラスター化して、免疫細胞を部分集団に区分する。次いでこれらを、追加の分析でさらに細分化することができる。例えば、ＣＤ４５＋リンパ球を、さらにｖδ陽性集団とｖδ陰性集団に細分化することができる。

【0045】

「疾患細胞」は、がんなどの疾患、ウイルス感染症などの感染症、または炎症状態もしくは炎症性疾患の進行に関連する表現型を示す。例えば、疾患細胞は、腫瘍細胞、自己免疫組織細胞またはウイルス感染細胞であり得る。したがって、前記疾患細胞は、腫瘍性、またはウイルス感染性、または炎症性と定義され得る。

【0046】

「健康な細胞」とは、疾患にかかっていない正常な細胞を指す。それらは、「正常」または「非疾患」細胞とも称され得る。非疾患細胞には、非がん細胞、または非感染細胞、または非炎症細胞が含まれる。前記細胞は、医薬品によって付与される疾患細胞特異性を判定し、及び／または医薬品の治療指数をよりよく理解するために、多くの場合、関連する疾患細胞と一緒に使用される。

【0047】

「疾患細胞特異性」は、エフェクター細胞またはその集団（例えば、Ｖδ１＋細胞の集団など）が、非疾患細胞すなわち健康な細胞に危害を加えない一方で、がん細胞などの疾患細胞を区別して殺傷するのにどれだけ効果的であるかの尺度である。この可能性は、モデル系で測定することができ、エフェクター細胞、またはエフェクター細胞の集団が、疾患細胞を選択的に殺傷または溶解する傾向と、前記エフェクター細胞（複数可）が非疾患細胞すなわち健康な細胞を殺傷または溶解する可能性とを比較することを含み得る。前記疾患細胞特異性から、医薬品の潜在的な治療指数を知ることができる。

【0048】

「増強された疾患細胞特異性」は、例えばＶδ１＋細胞またはその集団などのエフェクター細胞の表現型を表し、疾患細胞を特異的に殺傷するその能力をさらに高めるように調節されている。この増強は、疾患細胞殺傷特異性または選択性の倍数変化または割合の増加を含む、様々な方法で測定することができる。

【0049】

好適には、本発明の抗体またはその断片（すなわち、ポリペプチド）は、単離されている。「単離された」ポリペプチドまたは組成物は、元の環境から除去されたポリペプチドまたは組成物である。用語「単離された」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すために用いられ得る（例えば、Ｖδ１に特異的に結合する単離された抗体またはその断片は、Ｖδ１以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。

【0050】

好適には、本発明で使用される組成物は、単離されている。「単離された」組成物は、元の環境から除去された組成物である。例えば、天然の組成物は、それが天然の系で共存する材料のいくつかまたはすべてから分離されている場合に、単離されている。組成物は、例えば、それがｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで調製される場合、単離されているとみなされる。

【0051】

抗体またはその断片は、天然の対立遺伝子バリアント及び突然変異体または任意の他の非天然バリアントも含む「機能的に活性なバリアント」であってもよい。当技術分野で公知のように、対立遺伝子バリアントは、ポリペプチドの生物学的機能を本質的に変化させない１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有することを特徴とする（ポリ）ペプチドの代替形態である。非限定的な例として、ＣＤＲを含有するフレームワークを改変する場合、ＣＤＲ自体を改変する場合、前記ＣＤＲを代替のフレームワークにグラフトする場合、またはＮ末端もしくはＣ末端の伸長を組み込む場合、前記機能的に活性なバリアントは依然として機能し得る。さらに、ＣＤＲ含有結合ドメインを、異なるパートナー鎖、例えば、別の抗体と共有される鎖と対合させてもよい。いわゆる「共通の」軽鎖または「共通の」重鎖と共有される場合、前記結合ドメインは依然として機能し得る。さらに、前記結合ドメインは、多量体化された場合に機能し得る。さらに、「抗体またはその断片」はまた、ＶＨもしくはＶＬもしくは定常ドメインが異なるカノニカル配列（例えば、ＩＭＧＴ．ｏｒｇに記載されているような）から離れてまたはそれに向かって改変され、かつ依然として機能する機能性バリアントを含み得る。

【0052】

２つの密接に関連するポリペプチド配列を比較する目的で、第１のポリペプチド配列と第２のポリペプチド配列との間の「％の配列同一性」を、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｖ２．０を使用し、ポリペプチド配列の標準設定（ＢＬＡＳＴＰ）を使用して計算してもよい。２つの密接に関連するポリヌクレオチド配列を比較する目的で、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「％の配列同一性」を、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｖ２．０を使用し、ヌクレオチド配列の標準設定（ＢＬＡＳＴＮ）を使用して計算してもよい。

【0053】

ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、それらがその全長にわたって１００％の配列同一性を共有する場合、他のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列と同じまたは「同一」であると言及される。配列内の残基は、左から右へ、すなわちポリペプチドのＮ末端からＣ末端へ、ポリヌクレオチドの５’末端から３’末端へと番号付けされる。

【0054】

配列間の「差異」とは、第１の配列と比較して、第２の配列の位置における単一のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を指す。２つのポリペプチド配列は、１つ、２つまたはそれ以上のそのようなアミノ酸の差異を含むことができる。第１の配列と他の点では同一である（１００％の配列同一性）第２の配列の挿入、欠失または置換により、％配列同一性が減少する。例えば、同一の配列が９アミノ酸残基長である場合、第２の配列の１つの置換により、８８．９％の配列同一性になる。第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列が９のアミノ酸残基長であり、６の同一の残基を共有する場合、第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列は、６６％を超える同一性を共有する（第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列は、６６．７％の同一性を共有する）。

【0055】

あるいは、第１の参照ポリペプチド配列を第２の比較ポリペプチド配列と比較する目的で、第２の配列を生成するために第１の配列に対して行われた付加、置換及び／または欠失の数を確認してもよい。「付加」とは、第１のポリペプチドの配列への１つのアミノ酸残基の付加である（第１のポリペプチドのいずれかの末端での付加を含む）。「置換」とは、第１のポリペプチドの配列における１つのアミノ酸残基を１つの異なるアミノ酸残基で置換することである。前記置換は、保存的でも非保存的でもよい。「欠失」とは、第１のポリペプチドの配列からの１つのアミノ酸残基の欠失である（第１のポリペプチドのいずれかの末端での欠失を含む）。

【0056】

「保存的」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置き換えられ、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性にほとんど影響を及ぼさないと予想されるアミノ酸置換である。そのような保存的置換は、好適には、以下の群内の１つのアミノ酸が同じ群内からの別のアミノ酸残基によって置換される置換である。

【0057】

【表1】

【0058】

好適には、疎水性アミノ酸残基は非極性アミノ酸である。より好適には、疎水性アミノ酸残基は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、ＷまたはＣから選択される。

【0059】

本明細書で使用する場合、ポリペプチド配列の番号付けならびにＣＤＲ及びＦＲの定義は、Ｋａｂａｔシステムに従って定義されるとおりである（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１、その全体が参照により本明細書に援用される）。第１のポリペプチド配列と第２のポリペプチド配列との間の「対応する」アミノ酸残基は、第２の配列のアミノ酸残基とＫａｂａｔシステムに従って同じ位置を共有する第１の配列のアミノ酸残基であり、一方で第２の配列のアミノ酸残基は、第１の配列とは同一性が異なる場合がある。フレームワーク及びＣＤＲがＫａｂａｔの定義に従って同じ長さである場合、好適に対応する残基は同じ番号（及び文字）を共有する。アラインメントは、手動で、または例えば、標準設定を使用するＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｖ２．０（ＢＬＡＳＴＰまたはＢＬＡＳＴＮ）などの配列アラインメントのための既知のコンピューターアルゴリズムを使用することによって達成することができる。

【0060】

本明細書での「エピトープ」への言及は、抗体またはその断片によって特異的に結合される標的の一部を指す。エピトープは「抗原決定基」とも称され得る。抗体は、両方が同一または立体的に重複するエピトープを認識する場合、別の抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つの抗体が同一または重複するエピトープに結合するかどうかを判断するために一般的に使用される方法は、競合アッセイであり、これは、標識抗原または標識抗体のいずれかを使用して複数の様々な形式で構成され得る（例えば、放射性標識もしくは酵素標識を使用したウェルプレート、または抗原発現細胞でのフローサイトメトリー）。

【0061】

タンパク質標的に認められるエピトープは、「線状エピトープ」または「配座エピトープ」として定義され得る。線状エピトープは、タンパク質抗原のアミノ酸の連続配列によって形成される。配座エピトープは、タンパク質配列が不連続であるが、タンパク質がその三次元構造に折りたたまれると一緒になるアミノ酸で形成されている。

【0062】

本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、それと連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図されている。ベクターの一種には「プラスミド」があり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自己複製が可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクターならびにエピソーム哺乳動物及び酵母ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらと作動可能に連結した遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法で利用される発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書において「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、同じ意味で使用され得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）、ならびにバクテリオファージ及びファージミド系などの他の形態の発現ベクターを含むことが意図されている。本明細書で使用する場合、用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指すことが意図されている。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫を指すことが意図されている（例えば、前記子孫が、その後任意に保存、提供、販売、譲渡、または本明細書に記載の抗体もしくはその断片を製造するために利用される細胞株または細胞バンクを作製するために利用される場合）。

【0063】

「対象」、「患者」または「個体」への言及は、治療される対象、特に哺乳動物対象を指す。哺乳動物対象には、ヒト、非ヒト霊長類、家畜（ウシなど）、スポーツ動物、またはイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラットもしくはマウスなどのペット動物が含まれる。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象は、マウスなどの非ヒト哺乳動物である。

【0064】

用語「十分な量」とは、所望の効果を生成するのに十分な量を意味する。用語「治療有効量」とは、疾患または障害の症状を改善するのに有効な量である。予防は治療とみなすことができるため、治療有効量は「予防有効量」であり得る。

【0065】

本明細書で使用する場合、本明細書で使用する場合の用語「約」は、指定された値より最大で１０％（１０％を含む）高い値及び最大で１０％（１０％を含む）低い値を含み、好適には指定された値より最大で５％（５％を含む）高い値及び最大で５％（５％を含む）低い値を含み、特に指定された値を含む。用語「間」には、指定された境界値が含まれる。

【0066】

疾患もしくは障害の徴候もしくは症状の重症度、そのような徴候もしくは症状が対象によって経験される頻度、またはその両方が減少する場合、その疾患または障害は「改善」する。

【0067】

本明細書で使用する場合、「疾患または障害を治療すること」とは、対象が経験した疾患もしくは障害の少なくとも１つの徴候もしくは症状の頻度及び／または重症度を低減することを意味する。

【0068】

本明細書で使用する場合、「がん」とは、細胞の異常な増殖または分裂を指す。一般的に、がん細胞の増殖及び／または寿命は、その周囲の正常な細胞及び組織の増殖及び／または寿命を超えており、協調していない。がんは、良性、前悪性または悪性であり得る。がんは、口腔（例えば、口、舌、咽頭など）、消化器系（例えば、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肝臓、胆管、胆嚢、膵臓など）、呼吸器系（例えば、喉頭、肺、気管支など）、骨、関節、皮膚（例えば、基底細胞、扁平上皮細胞、髄膜腫など）、乳房、生殖器系（例えば、子宮、卵巣、前立腺、精巣など）、泌尿器系（例えば、膀胱、腎臓、尿管など）、眼、神経系（例えば、脳など）、内分泌系（例えば、甲状腺など）、及び造血系（例えば、リンパ腫、骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病など）を含む様々な細胞及び組織で発生する。

【0069】

組成物
本明細書において、特に有利な「三つ組」の細胞型：ＮＫ細胞、Ｖδ１細胞及びＶδ２細胞を含む組成物を提供する。ＮＫ細胞とγδＴ細胞はどちらもＭＨＣ拘束性を欠いており、活性化にＭＨＣを必要としない。これらの細胞はいくつかの生物学を共有しており、健康な細胞に危害を加えない一方で腫瘍細胞を認識することができるが、サブセットを含むＮＫ細胞とγδＴ細胞は、特定の１つの細胞型にのみ存在し、すべての自然リンパ球には認められない進化的に保存されたユニークな特性を特徴とする。したがって、望ましい細胞アプローチは、各細胞型の利点を組み合わせて、患者自身の適応免疫系と相互作用し、より大きく持続的な免疫応答を調整することができる、ほぼ完全で高度にプライミングされた自然免疫系を患者に補うことである。

【0070】

本発明の一態様により、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む組成物を提供する。

【0071】

本発明の別の態様により、組成物中に存在するＮＫ細胞の少なくとも５０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む組成物を提供する。

【0072】

本発明の一態様により、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも５０％がＣＤ５６を発現する、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む組成物を提供する。

【0073】

神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）としても知られるＣＤ５６は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの接着分子であり、ＮＫ細胞、αβＴ細胞、及びγδＴ細胞における高い細胞傷害性と相関している。ＣＤ５６は、リンパ球の活性化に寄与する、それ自体へのシス及びトランス結合に関与することが示されている。ＣＤ５６はまた、リンパ球、リンパ球と抗原提示細胞（ＡＰＣ）、及びリンパ球と標的細胞の間の免疫学的シナプス形成に必要であることも示されている（Ｎｕｓｓｂａｕｍｅｒ ａｎｄ Ｔｈｕｒｎｈｅｒ（２０２０）Ｃｅｌｌｓ ９（３）：７７２）。

【0074】

細胞の表現型は、ＣＤ５６の細胞表面密度によって定義することもできる。したがって、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}及びＣＤ５６^ｄｉｍ細胞の当技術分野で公知のサブタイプが認識されている。本発明の組成物中に存在するγδＴ細胞上のＣＤ５６の発現及び／または強度の増加は、殺傷の増強と相関関係を有することが本明細書で示され、これは本明細書に記載の組成物の治療可能性を示している。

【0075】

いくつかの実施形態では、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも約４０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも４５％、例えば少なくとも４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも約５０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも約５５％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも約６０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。

【0076】

いくつかの実施形態では、組成物中に存在するＮＫ細胞の少なくとも約５０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、組成物中に存在するＮＫ細胞の少なくとも６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、組成物中に存在するＮＫ細胞の少なくとも約７０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、組成物中に存在するＮＫ細胞の少なくとも約７５％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、組成物中に存在するＮＫ細胞の少なくとも約８０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。

【0077】

ＣＤ５６の表面発現は、フローサイトメトリーによる染色強度分析など、当技術分野で公知の方法を使用して測定することができる。細胞をＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}及びＣＤ５６^ｄｉｍに分けることは、例えば、Ｖａｎ Ａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：８９２に記載されているように、当技術分野で理解されている。そのような方法は、試料集団を、ＮＫ細胞を含む細胞集団など、既知のＣＤ５６発現レベルの参照集団と比較する。ＮＫ細胞は、ｂｒｉｇｈｔ及びｄｉｍとして識別できる明確なＣＤ５６発現レベルを有しているため、この参照集団を使用してゲーティング戦略を確立することにより、本発明の目的のために、試料集団をＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}画分とＣＤ５６^ｄｉｍ画分にソーティングすることもできる。

【0078】

いくつかの実施形態では、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも約４０％がＣＤ５６を発現する。いくつかの実施形態では、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも４５％、例えば少なくとも４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％がＣＤ５６を発現する。いくつかの実施形態では、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも約５０％がＣＤ５６を発現する。いくつかの実施形態では、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも約５５％がＣＤ５６を発現する。いくつかの実施形態では、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも約６０％がＣＤ５６を発現する。他の実施形態では、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％がＣＤ５６を発現する。一実施形態では、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％がＣＤ５６を発現する。さらなる実施形態では、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも８０％が、本明細書に記載の培養の約１２日後（１２日など）にＣＤ５６を発現する。

【0079】

いくつかの実施形態では、組成物中に存在する細胞の少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％が、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む。一実施形態では、組成物中に存在する細胞の少なくとも８５％が、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む。さらなる実施形態では、組成物中に存在する細胞の少なくとも９０％が、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む。さらに別の実施形態では、組成物中に存在する細胞の少なくとも９５％が、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む。

【0080】

いくつかの実施形態では、組成物中に存在する細胞の少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％が、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞からなる。一実施形態では、組成物中に存在する細胞の少なくとも８５％が、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞からなる。さらなる実施形態では、組成物中に存在する細胞の少なくとも９０％が、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞からなる。さらに別の実施形態では、組成物中に存在する細胞の少なくとも９５％が、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞からなる。

【0081】

いくつかの実施形態では、組成物中に存在する細胞の少なくとも３０％がγδＴ細胞である。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約３０％のγδＴ細胞、例えば、少なくとも約３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％または５０％のγδＴ細胞を含む。さらなる実施形態では、組成物は、少なくとも約４０％のγδＴ細胞、例えば約４５％超のγδＴ細胞を含む。他の実施形態では、組成物中に存在する細胞の少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％がγδＴ細胞である。一実施形態では、組成物は、少なくとも約２０％のγδＴ細胞を含む。

【0082】

いくつかの実施形態では、組成物中に存在する細胞の８０％未満がγδＴ細胞である。いくつかの実施形態では、組成物は、約８０％未満のγδＴ細胞、例えば、約７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６０％、６８％、５７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％または５０％未満のγδＴ細胞を含む。さらなる実施形態では、組成物は、約６０％未満のγδＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約３０％～８０％のγδＴ細胞、例えば、約３０％～６０％のγδＴ細胞を含む。さらなる実施形態では、組成物は、約５０％のγδＴ細胞を含む。

【0083】

いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１０％のＶδ１Ｔ細胞、例えば、少なくとも約１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％のＶδ１Ｔ細胞を含む。さらなる実施形態では、組成物は、少なくとも約２０％のＶδ１Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約１０％～５５％のＶδ１Ｔ細胞、例えば、約１０％～３０％のＶδ１Ｔ細胞を含む。一実施形態では、組成物は、約３０％のＶδ１Ｔ細胞を含む。

【0084】

いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約５％のＶδ２Ｔ細胞、例えば、少なくとも約６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％のＶδ２Ｔ細胞を含む。さらなる実施形態では、組成物は、少なくとも約７％のＶδ２Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約７％～３０％のＶδ２Ｔ細胞を含む。一実施形態では、組成物は、約１５％～２０％のＶδ２Ｔ細胞を含む。

【0085】

いくつかの実施形態では、γδＴ細胞は、Ｖδ１細胞、Ｖδ２細胞、Ｖδ３細胞、Ｖδ５細胞、及びＶδ８細胞を含む。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞は、Ｖδ１Ｔ細胞及びＶδ２Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞の少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％、特に、少なくとも９０％が、Ｖδ１Ｔ細胞及びＶδ２Ｔ細胞からなる。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞は、Ｖδ１Ｔ細胞及びＶδ２Ｔ細胞からなる。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞は、非Ｖδ１／Ｖδ２Ｔ細胞を含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、組成物中に存在する細胞の少なくとも３０％がＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約３０％のＮＫ細胞、例えば、少なくとも約３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％または５０％のＮＫ細胞を含む。さらなる実施形態では、組成物は、少なくとも約４０％のＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約８０％未満のＮＫ細胞、例えば、約７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６０％、６８％、５７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％または５０％未満のＮＫ細胞を含む。さらなる実施形態では、組成物は、約６０％未満のＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約２０％～７０％のＮＫ細胞、例えば、約３０％～６０％のＮＫ細胞を含む。他の実施形態では、組成物は、約４０％～５０％のＮＫ細胞を含む。さらなる実施形態では、組成物は、約５０％のＮＫ細胞を含む。他の実施形態では、組成物中に存在する細胞の少なくとも約１０％がＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１０％のＮＫ細胞、例えば、少なくとも１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％のＮＫ細胞を含む。一実施形態では、組成物は、約１０％～７５％のＮＫ細胞を含む。さらなる実施形態では、組成物は、少なくとも約２０％のＮＫ細胞を含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、組成物は、約１０％未満のαβＴ細胞、例えば、約５％、４％、３％、２％、１．５％、１％、０．５％、０．２％、０．１％または０．０５％未満のαβＴ細胞を含む。さらなる実施形態では、組成物は、約１％未満のαβＴ細胞を含む。αβ受容体を有するＴ細胞は非常に反応性が高く、したがって、本発明に関して患者への投与に好適な細胞集団は、低レベルのαβＴ細胞のみを含み得る。

【0088】

本発明の組成物はまた、組成物中に存在するＭＨＣ非拘束性リンパ球の割合によって定義され得る。したがって、本発明のさらなる態様により、細胞を含む組成物を提供し、その場合、少なくとも９０％の細胞がＮＫ細胞及びγδＴ細胞からなり、少なくとも１０％の細胞がＶδ１Ｔ細胞であり、少なくとも５％の細胞がＶδ２Ｔ細胞であり、少なくとも３０％の細胞がＮＫ細胞である。Ｖδ１、Ｖδ２及びＮＫ細胞の割合は、本明細書で前述したとおりであってもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１３％の細胞がＶδ１Ｔ細胞であり、少なくとも７％の細胞がＶδ２Ｔ細胞であり、少なくとも３５％の細胞がＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、少なくとも２０％の細胞がＶδ１Ｔ細胞であり、少なくとも１０％の細胞がＶδ２Ｔ細胞であり、少なくとも４０％の細胞がＮＫ細胞である。他の実施形態では、少なくとも３０％の細胞がＶδ１Ｔ細胞であり、少なくとも２０％の細胞がＶδ２Ｔ細胞であり、少なくとも３５％の細胞がＮＫ細胞である。

【0089】

本明細書に記載されるように、γδＴ細胞は、Ｖδ１Ｔ細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物中に存在するＶδ１Ｔ細胞は、高レベルのＮＫｐ３０を発現する。例えば、Ｖδ１Ｔ細胞の約１０％超、例えば、約１５％、２０％または２５％超がＮＫｐ３０を発現する（すなわち、ＮＫｐ３０＋）。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞はＶδ１Ｔ細胞を含み、前記Ｖδ１Ｔ細胞の少なくとも１５％がＮＫｐ３０を発現する。

【0090】

いくつかの実施形態では、組成物中に存在するＶδ１Ｔ細胞は、低レベルのＣＤ２７を発現する（ＣＤ２７^ｌｏｗ）。例えば、Ｖδ１Ｔ細胞の約７０％未満、例えば、約５０％、４０％または３０％未満がＣＤ２７を発現する（すなわち、ＣＤ２７＋）。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞はＶδ１Ｔ細胞を含み、前記Ｖδ１Ｔ細胞の５０％未満がＣＤ２７を発現する。

【0091】

改変細胞を含む組成物
自然リンパ球は、１つの受容体を介して増殖、活性化、サイトカイン産生、及び殺傷を制御しない。したがって、本明細書に記載の組成物により、αβＴ細胞において、または特に１つの先天性細胞型内においてさえ、不可能またはあまり有利ではない遺伝子改変戦略が可能になるであろう。例えば、非シグナル伝達ＣＡＲ、例えば、ＷＯ２０１９１８０２７９に記載されている非シグナル伝達ＣＡＲを使用することができる。特定のドメインを使用すると、バランスの取れた応答が開始され、例えば、ＤＡＰ１０は、ＮＫ細胞の活性化と殺傷、Ｖδ１Ｔ細胞のＴｈ１サイトカイン産生などの応答を引き起こし得る。

【0092】

いくつかの実施形態では、単離された組成物は、改変ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む。本明細書に提供する実施例に示されるように、特許請求する組成の細胞は、形質導入に対する寛容性が向上しており、それにより、この細胞は遺伝子改変方法に適したものとなっていることが示されている。

【0093】

当該組成の細胞を、例えば、膜結合タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの細胞表面受容体、αβＴＣＲ、天然の細胞傷害性受容体（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６）、サイトカイン、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ－１２受容体）、ケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ２受容体））、選択マーカー（例えば、レポーター遺伝子）、または自殺遺伝子をコードし得る１つ以上の導入遺伝子を発現するように改変してもよい。いくつかの場合では、本発明は、ＣＡＲ及び任意選択で１つ以上の追加の導入遺伝子コードタンパク質（例えば、アーマータンパク質）を発現するように改変されたＭＨＣ非拘束性リンパ球の集団を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の導入遺伝子は、コドン最適化されている。

【0094】

いくつかの実施形態では、改変ＮＫ細胞及びγδＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」とは、細胞を活性化する活性化シグナルを伝播する細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む組換えポリペプチド構築物を指す。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のＮ末端に任意選択のリーダー配列を含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、改変された細胞の少なくとも２０％（例えば、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的にすべて）が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変された細胞の少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的にすべて）が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変された細胞の２０％～８０％が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。他の実施形態では、改変された細胞の約２０％～６０％が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変された細胞の４０％～７０％が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。

【0096】

いくつかの実施形態では、改変されたＮＫ細胞の少なくとも約２０％（例えば、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％または４０％）が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変されたＮＫ細胞の少なくとも４０％（例えば、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的にすべて）が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変されたＮＫ細胞の少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的にすべて）が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。他の実施形態では、改変されたＮＫ細胞の少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または実質的にすべて）が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変されたＮＫ細胞の４０％～９５％が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変されたＮＫ細胞の５０％～８０％が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。他の実施形態では、改変されたＮＫ細胞の約２０％～７０％が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。

【0097】

いくつかの実施形態では、改変されたγδＴ細胞の少なくとも２０％（例えば、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的にすべて）が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変されたγδＴ細胞の少なくとも３０％（例えば、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または実質的にすべて）が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変されたγδＴ細胞の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または実質的にすべて）が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変されたγδＴ細胞の２０％～６０％が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変されたγδＴ細胞の３０％～５５％が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。他の実施形態では、改変されたγδＴ細胞の約３５％～６０％が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。

【0098】

本明細書に提供する実施例にも示されるように、特許請求する組成のＣＤ５６＋細胞は、形質導入に対する寛容性がなお向上しており、それにより、この細胞は遺伝子改変方法に特に適したものとなっていることが示されている。

【0099】

いくつかの実施形態では、改変されたＣＤ５６＋細胞の少なくとも２０％（例えば、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％）が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。他の実施形態では、改変されたＣＤ５６＋細胞の少なくとも約４０％（例えば、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％）が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変されたＣＤ５６＋細胞の約２０％～８０％が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。他の実施形態では、改変されたＣＤ５６＋細胞の約４５％～７５％が導入遺伝子、例えば、ＣＡＲまたは他の膜結合タンパク質もしくは可溶性タンパク質を発現する。

【0100】

医薬組成物
本発明のさらなる態様により、本明細書で定義される方法によって得た組成物を提供する。本発明のさらなる態様により、本明細書で定義される方法によって得た細胞集団を含む医薬組成物を提供する。そのような実施形態において、組成物は、任意選択で他の賦形剤と組み合わせて、細胞を含み得る。１つ以上の追加の活性薬剤（例えば、本明細書に記載の疾患を治療するのに適した活性薬剤）を含む組成物も含まれる。

【0101】

医薬組成物は、ＭＨＣ非拘束性リンパ球、特に本明細書に記載の増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球を、１つ以上の薬学的もしくは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化物質、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤を含み得る。本発明の医薬組成物に使用し得る凍結保存溶液は、例えばＤＭＳＯを含む。組成物は、例えば静脈内投与のために製剤化することができる。

【0102】

一実施形態では、医薬組成物は、汚染物質、例えば、エンドトキシンまたはマイコプラズマを実質的に含まない（例えば、検出可能なレベルで存在しない）。

【0103】

好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、髄腔内）である。好ましい実施形態では、組成物を静脈内注入または注射によって投与する。別の好ましい実施形態では、組成物を筋肉内注射または皮下注射によって投与する。

【0104】

そのような疾患の治療に通常使用される他の確立された治療の補助として、またはそれと組み合わせて、本明細書に記載の疾患の治療のための治療方法において本発明の医薬組成物を使用することは、本発明の範囲内である。

【0105】

本発明のさらなる態様では、細胞集団、組成物または医薬組成物を、少なくとも１つの活性薬剤と共に、連続的に、同時にまたは別々に投与する。

【0106】

ＭＨＣ非拘束性リンパ球が濃縮された組成物の調製方法
本発明は、ＭＨＣ非拘束性リンパ球が濃縮された組成物の調製方法を提供する。そのような方法は、治療効果がＭＨＣ適合性によって拘束されないため、同種異系使用に適した組成物を調製するのに特に有利である。

【0107】

本発明の態様により、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下及びインターロイキン－４（ＩＬ－４）の非存在下で抗ＴＣＲデルタ可変１（抗Ｖδ１）抗体またはその断片を使用してγδＴ細胞及びＮＫ細胞を含む混合細胞集団を刺激し、この混合細胞集団を培養することを含む、非γδ＋ＭＨＣ非拘束性リンパ球の増殖方法を提供する。前記混合細胞集団は、本明細書でより詳細に記載されるように、試料から取得し得ることが理解されるであろう。

【0108】

本発明者らは、驚くべきことに、抗Ｖδ１抗体及びＩＬ－１５が存在することにより、完全ＭＨＣ非拘束性ＣＤ５６＋免疫療法である組成物の産生が刺激されることを見出した。理論に拘泥するものではないが、Ｖδ１Ｔ細胞は、Ｖδ１ＴＣＲに特異的に結合し、予想外に非Ｖδ１細胞の増殖、例えばＮＫ細胞の増殖をサポートする抗体の存在によって刺激されるようである。理論に拘泥するものではないが、ＮＫ細胞増殖などのこの非Ｖδ１細胞増殖は、ＮＫ細胞表面に発現する抗Ｖδ１抗体及びＣＤ１６を介して媒介され得る。本発明の方法によって生成されるユニークな細胞組成物は、非常に有望な治療用途を有する細胞の混合物を提供する。

【0109】

本発明の態様により、ＭＨＣ非拘束性リンパ球を濃縮させた細胞集団を含む組成物の調製方法を提供し、この方法は、
（１）対象から取得した試料を、
（ｉ）抗ＴＣＲデルタ可変１（抗Ｖδ１）抗体またはその断片、及び
（ｉｉ）インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下、インターロイキン－４（ＩＬ－４）の非存在下で、培養すること（前記培養の初日から）、及び
（２）試料から培養した細胞集団を単離することを含む。

【0110】

培養ステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施し得ることが理解されるであろう。最初の試料は、混合細胞集団、例えば、γδＴ細胞、ＮＫ細胞及び任意選択でαβＴ細胞、好ましくはγδＴ細胞及びＮＫ細胞のみなどの複数の免疫細胞型を含む細胞集団を含み得る。したがって、一実施形態では、試料は、γδＴ細胞及びＮＫ細胞を含む混合細胞集団を含む。

【0111】

さらなる実施形態では、培養前、例えば、抗Ｖδ１抗体またはその断片の投与前に、試料をＴ細胞について濃縮する。

【0112】

いくつかの実施形態では、抗Ｖδ１抗体またはその断片の投与前に、試料から、試料中に存在するＭＨＣ非拘束性リンパ球以外の細胞型を枯渇させ、例えば、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞以外の細胞型を枯渇させる。例えば、試料を培養する前に、試料をＴ細胞について濃縮し、及び／またはαβＴ細胞を枯渇させてもよい。一実施形態では、最初に試料からαβＴ細胞を枯渇させる。濃縮または枯渇を、当技術分野で公知の技術を使用して、例えば、濃縮／枯渇させようとする表現型に関連する細胞表面上の分子に結合する抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用して達成してもよい。

【0113】

細胞培養物中にリンパ球以外の細胞型が存在することにより、ＭＨＣ非拘束性リンパ球増殖が阻害され得る。そのような細胞、例えば、間質、上皮、腫瘍及び／またはフィーダー細胞を、培養前に除去してもよい。したがって、一実施形態では、細胞集団は、培養中に間質細胞と直接接触しない。間質細胞の例として、線維芽細胞、周皮細胞、間葉細胞、ケラチノサイト、内皮細胞及び非血液腫瘍細胞が挙げられる。好ましくは、培養中、リンパ球は線維芽細胞と直接接触しない。一実施形態では、細胞集団は、培養中に上皮細胞と直接接触しない。一実施形態では、細胞集団は、培養中の腫瘍細胞及び／またはフィーダー細胞と直接接触しない。

【0114】

一実施形態では、この方法は、実質的な間質細胞接触の非存在下でＭＨＣ非拘束性リンパ球を培養することを含む。さらなる実施形態では、この方法は、実質的な線維芽細胞接触の非存在下でＭＨＣ非拘束性リンパ球を培養することを含む。

【0115】

一実施形態では、この方法は、血漿（例えば、ヒト血漿）を含む培地中で試料を培養することを含む。さらなる実施形態では、試料を、２．５％血漿、例えば２．５％ヒト血漿を含む培地中で培養する。

【0116】

一実施形態では、この方法は、血清を実質的に含まない培地（例えば、無血清培地または血清代替物（ＳＲ）を含有する培地）中で試料を培養することを含む。したがって、一実施形態では、この方法は、無血清培地中で培養することを含む。そのような無血清培地はまた、血清代替培地を含み得、この血清代替物は、ヒトまたは動物由来の血清の使用を避けるために、化学的に定義された成分に基づく。別の実施形態では、この方法は、血清（例えば、ヒトＡＢ血清またはウシ胎仔血清（ＦＢＳ））を含有する培地中で培養することを含む。一実施形態では、培地は、血清代替物を含有する。一実施形態では、培地は、動物由来製品を含有しない。

【0117】

無血清培地中で培養した試料は、濾過、沈殿、汚染、及び血清の供給に関する問題を回避するという利点を有することが理解されるであろう。さらに、動物由来製品は、臨床グレードのヒト治療薬の製造に使用するのに適していない。細胞、特にＶδ１Ｔ細胞に無血清培地を使用すると、ＡＢ血清を含有する培地を使用した場合と比較して、試料から得られる細胞の数が実質的に増加する。

【0118】

一実施形態では、抗Ｖδ１抗体またはその断片は、可溶性または固定化形態である。例えば、抗体またはその断片を、可溶性形態で試料に投与してもよい。あるいは、抗体またはその断片がビーズまたはプレートなどの表面に結合または共有結合している場合（すなわち、固定化形態である場合）、抗体またはその断片を試料に投与してもよい。一実施形態では、抗体を、Ｆｃコーティングされたウェルなどの表面に固定化する。あるいは、抗体またはその断片を、細胞の表面に結合させる（例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に固定化する）。別の実施形態では、細胞集団を抗体と接触させる場合、抗体を表面に固定化しない。

【0119】

抗Ｖδ１抗体またはその断片を接触させた細胞集団を、様々な種類の試料から取得してもよい。一実施形態では、試料は造血試料またはその画分である（すなわち、細胞集団を造血試料またはその画分から取得する）。本明細書における「造血試料」または「造血組織試料」への言及には、血液（末梢血または臍帯血など）、骨髄、リンパ組織、リンパ節組織、胸腺組織、及びそれらの画分または濃縮部分が含まれる。試料は、好ましくは、末梢血もしくは臍帯血を含む血液、またはバフィーコート細胞、白血球除去産物、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及び低密度単核球（ＬＤＭＣ）を含むそれらの画分である。いくつかの実施形態では、造血試料は、低密度単核球（ＬＤＭＣ）または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からなる。いくつかの実施形態では、試料は、ヒト血液またはその画分である。密度勾配遠心分離などの当技術分野で公知の技術を使用して、血液試料から細胞を取得してもよい。例えば、全血を等量のＦＩＣＯＬＬ－ＨＹＰＡＱＵＥに重層し、続いて室温で４００ｘｇで１５～３０分間遠心分離する。界面物質は低密度の単核球を含有し、これを培地中で回収し、洗浄し、室温にて２００ｘｇで１０分間遠心分離することができる。いくつかの実施形態では、細胞集団を、特定のタイプの試料、例えば、皮膚などの非造血組織試料から取得しない。

【0120】

別の実施形態では、試料は非造血組織試料である。本明細書における「非造血組織」または「非造血組織試料」への言及には、皮膚（例えば、ヒトの皮膚）及び腸（例えば、ヒトの腸）が含まれる。非造血組織とは、血液、骨髄、リンパ組織、リンパ節組織、または胸腺組織以外の組織である。一実施形態では、非造血組織試料は皮膚（例えば、ヒトの皮膚）である。いくつかの実施形態では、細胞集団を、皮膚（例えば、ヒトの皮膚）から取得し、これは当技術分野で公知の方法によって取得することができる。例えば、非造血組織試料からの細胞の流出を促進するように構成された合成足場上で非造血組織試料を培養することによって、非造血組織試料から細胞集団を取得してもよい。あるいは、胃腸管（例えば、結腸または腸）、乳腺、肺、前立腺、肝臓、脾臓、膵臓、子宮、膣及び他の皮膚、粘膜または漿膜から得られる細胞集団（例えば、γδＴ細胞）に、本方法を適用することができる。

【0121】

がん組織試料（すなわち、γδＴ細胞及びＮＫ細胞もがん組織試料に存在し得る）、例えば、乳房または前立腺の腫瘍から試料を取得してもよい。いくつかの実施形態では、試料は、ヒトがん組織試料（例えば、固形腫瘍組織）由来であってもよい。他の実施形態では、試料は、ヒトがん組織以外の供給源（例えば、実質的な数の腫瘍細胞を含まない組織）に由来し得る。例えば、試料は、近位のまたは隣接するがん組織から離れた皮膚の領域（例えば、健康な皮膚）由来の試料であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、試料をがん組織（例えば、ヒトがん組織）から取得しない。

【0122】

試料を、ヒトまたは非ヒト動物の組織から取得してもよい。したがって、この方法は、ヒトまたは非ヒト動物の組織から試料を取得するステップをさらに含んでもよい。一実施形態では、試料は、ヒトから取得されている。別の実施形態では、試料は、非ヒト動物対象から取得されている。

【0123】

いくつかの実施形態では、抗Ｖδ１抗体またはその断片を接触させる細胞集団を、少なくとも約１０ｍＬ、例えば、約１５ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７０ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬ、１００ｍＬまたはそれ以上の容量で培養する。一実施形態では、細胞集団を、約３０ｍＬ中で培養する。別の実施形態では、細胞集団を、約１００ｍＬ中で培養する。

【0124】

いくつかの実施形態では、抗Ｖδ１抗体またはその断片を接触させる細胞集団を、少なくとも約０．５×１０^６細胞／ｃｍ^２、例えば、約１×１０^６細胞／ｃｍ^２、１．５×１０^６細胞／ｃｍ^２、２×１０^６細胞／ｃｍ^２、２．５×１０^６細胞／ｃｍ^２または３×１０^６細胞／ｃｍ^２の細胞密度で培養する。一実施形態では、細胞集団を、約１×１０^６細胞／ｃｍ^２の細胞密度で培養する。別の実施形態では、細胞集団を、約２×１０^６細胞／ｃｍ^２の細胞密度で培養する。

【0125】

したがって、本発明は、濃縮されたＭＨＣ非拘束性リンパ球集団を産生するためのｅｘ ｖｉｖｏでの方法を提供する。濃縮された集団は、単離された混合細胞集団（例えば、患者／ドナーから採取した試料から取得した）から、混合細胞集団またはその精製画分を抗体またはその断片と接触させることを含む方法により、生成することができる。

【0126】

したがって、本明細書において、取得可能な、例えば、本明細書で定義される方法に従って取得される、ＭＨＣ非拘束性リンパ球が濃縮された細胞集団を提供する。本発明のこの態様により、そのような増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで取得し、及び／または増殖させ得ることが理解されるであろう。一態様では、取得可能な、例えば、本明細書で定義される方法に従って取得される増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団を提供し、その場合、集団を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで単離し、増殖させる。

【0127】

また、本明細書で定義される方法に従って取得される増殖したＮＫ細胞集団も提供する。本発明のこの態様により、そのような増殖したＮＫ細胞集団を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで取得し、及び／または増殖させ得ることが理解されるであろう。一態様では、本明細書で定義される方法に従って取得される増殖したＮＫ細胞集団を提供し、その場合、ＮＫ細胞集団を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで単離し、増殖させる。

【0128】

また、本明細書で定義される方法に従って取得される増殖したγδＴ細胞集団も提供する。本発明のこの態様により、そのような増殖したγδＴ細胞集団を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで取得し、及び／または増殖させ得ることが理解されるであろう。一態様では、本明細書で定義される方法に従って取得される増殖したγδＴ細胞集団を提供し、その場合、γδＴ細胞集団を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで単離し、増殖させる。

【0129】

本明細書に記載の抗体またはその断片は、ＭＨＣ非拘束性リンパ球を増殖する方法で使用してもよい。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施してもよい。この増殖方法をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する場合、抗体（またはその断片）を、上記のように取得した単離細胞集団に適用してもよい。いくつかの実施形態では、造血組織試料、例えば、血液試料から単離した細胞集団から、細胞を増殖させる。

【0130】

ＭＨＣ非拘束性リンパ球の増殖は、本明細書に記載の抗体またはその断片、及びインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下で試料を培養することを含む。そのような培養を、他のサイトカインの存在下または非存在下で行ってもよい。サイトカインには、インターロイキン、リンホカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子、及びケモカインが含まれ得る。本明細書に提示するデータは、培養開始時からＩＬ－１５の存在下及びインターロイキン－４（ＩＬ－４）の非存在下で試料を培養すると、ＭＨＣ非拘束性リンパ球が優先的に増殖することを示している。したがって、本明細書に記載の方法は、培養の開始時（すなわち、初日）から、抗Ｖδ１抗体（またはその断片）及びＩＬ－１５の存在下、ＩＬ－４の非存在下で試料を培養することを含む。本明細書に記載のサイトカインへの言及には、培養物中のＭＨＣ非拘束性リンパ球に対する同様の生理学的効果を促進する能力に関して前記サイトカインと同じ活性を有する任意の化合物が含まれ得ると共に、模倣物、またはその任意の機能的同等物が含まれるが、これらに限定されないことが理解されるであろう。

【0131】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、培養の開始時（すなわち、初日）に抗Ｖδ１抗体（またはその断片）を添加することを含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載の方法は、培養の開始時のみ（すなわち、初日のみ）に抗Ｖδ１抗体（またはその断片）を添加することを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、培養期間中の１つ以上の追加の時点（例えば、１つまたは２つの追加の時点）で抗Ｖδ１抗体を添加することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、培養の開始時（すなわち、初日）にＩＬ－１５を添加することを含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載の方法は、培養の開始時のみ（すなわち、初日のみ）にＩＬ－１５を添加することを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、培養期間中の１つ以上の追加の時点（例えば、１つまたは２つの追加の時点）でＩＬ－１５を添加することを含む。容易に理解されるように、抗Ｖδ１抗体及び／またはＩＬ－１５の添加頻度を低下させると、培養操作の低減、例えば取り扱いの低減という利点がもたらされる。そのような操作／取り扱いの低減は、製造性の向上につながり得る。

【0132】

培養ステップは、他のサイトカインの存在下または非存在下で実施してもよい。サイトカインの例として、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－３３（ＩＬ－３３）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、及び間質細胞由来因子１（ＳＤＦ－１）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0133】

使用するサイトカイン（例えば、インターロイキン）は、ヒトまたは動物起源であってよく、好ましくはヒト起源である。それは、野生型タンパク質または任意の生物学的に活性な断片もしくはバリアント（すなわち、その受容体に結合することができる）であってよい。そのような結合は、本発明による方法の条件下でγδＴ細胞の活性化を誘導し得る。より好ましくは、サイトカインは、別の分子、例えば、ペプチド、ポリペプチドまたは生物学的に活性なタンパク質と融合または複合体化した可溶型であり得る。好ましくは、ヒト組換えサイトカインを使用する。より好ましくは、インターロイキン濃度の範囲は、１～１００００ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは１～１０００ｎｇ／ｍｌで様々に異なり得、例えば約１００ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５の濃度は１００ｎｇ／ｍｌである。したがって、一実施形態では、培養ステップを、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５の存在下で実施する。

【0134】

一実施形態では、サイトカインは、インターロイキン－１５様活性を有する成長因子、すなわち、培養物中のＭＨＣ非拘束性リンパ球に対する同様の生理学的効果を促進する能力に関してＩＬ－１５と同じ活性を有する任意の化合物であり、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５模倣物、またはＩＬ－２及びＩＬ－７を含むＩＬ－１５の任意の機能的等価物が含まれるが、これらに限定されない。

【0135】

一実施形態では、培地は、ＩＬ－１５の存在下にある。一実施形態では、培地は、ＩＬ－４の非存在下にある。

【0136】

本明細書で使用される場合、「増殖した」または「増殖した集団」への言及には、増殖していない集団に比べて、より大きい、またはより多くの細胞を含む細胞集団が含まれる。そのような集団は、多数、少数、または集団内の割合または特定の細胞型の増殖を伴う混合集団であってもよい。用語「増殖方法」とは、増殖または増殖した集団をもたらすプロセスを指すことを理解されたい。したがって、増殖または増殖した集団は、増殖ステップを行っていない集団または増殖ステップの前の集団と比較して、より多数であるか、またはより多くの細胞を含み得る。増殖を示すために本明細書に示される任意の数字（例えば、倍数増加または倍数増殖）は、細胞集団の数もしくはサイズまたは細胞数の増加を示すものであり、増殖量の指標であることがさらに理解されるであろう。

【0137】

一実施形態では、この方法は、試料を少なくとも５日間（例えば、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１８日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、またはそれ以上、例えば、５日間～４０日間、７日間～３５日間、１４日間～２８日間、または約２１日間）培養することを含む。さらなる実施形態では、この方法は、試料を少なくとも７日間、例えば、少なくとも１１日間または少なくとも１４日間培養することを含む。

【0138】

さらなる実施形態では、方法は、試料を、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団を生成するのに有効な量で、ある期間（例えば、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１８日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、またはそれ以上、例えば、５日間～４０日間、７日間～３５日間、１４日間～２８日間、または約２１日間）培養することを含む。

【0139】

一実施形態では、試料を、５～６０日間、例えば、少なくとも７～４５日間、７～２１日間、または７～１８日間培養する。一実施形態では、試料を、１１～１４日間培養する。さらなる実施形態では、試料を１２日間培養して、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団を生成する。別の実施形態では、試料を、１４日間培養する。さらに別の実施形態では、Ｋｉ－６７などの活発な増殖のマーカーの発現が下方制御されるまでの期間、すなわち、そのような下方制御を検出し得る前の期間に、試料を培養する。したがって、一実施形態では、Ｋｉ－６７などの活発な増殖のマーカーの発現が下方制御される前の期間に、試料を培養する。特定の実施形態では、活発な増殖のマーカーの発現が下方制御されるまでの／前の培養期間は１２日間である。一実施形態では、Ｋｉ－６７の発現が下方制御されるまでの／前の培養期間は１２日間である。

【0140】

この方法は、培養中の抗Ｖδ１抗体もしくはその断片及び／または成長因子の定期的な添加を含み得る。例えば、抗Ｖδ１抗体もしくはその断片及び／または成長因子を、２～７日ごと、より好ましくは３～４日ごとに添加することができる。一実施形態では、（初回投与後）抗Ｖδ１抗体もしくはその断片及び／または成長因子を、培養の７日後に添加し、その後３～４日ごとに添加する。

【0141】

本発明の方法は、参照集団よりも数が多い、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団を提供する。いくつかの実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、増殖ステップ前の単離されたＭＨＣ非拘束性リンパ球集団よりも数が多い（例えば、増殖ステップ前の単離されたＭＨＣ非拘束性リンパ球集団に比べて、少なくとも２倍の数、少なくとも５倍の数、少なくとも１０倍の数、少なくとも２５倍の数、少なくとも５０倍の数、少なくとも６０倍の数、少なくとも７０倍の数、少なくとも８０倍の数、少なくとも９０倍の数、少なくとも１００倍の数、少なくとも２００倍の数、少なくとも３００倍の数、少なくとも４００倍の数、少なくとも５００倍の数、６００倍の数、少なくとも１，０００倍の数、またはそれ以上）。一実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、増殖ステップ前の単離されたＭＨＣ非拘束性リンパ球集団と比較して、数が５倍～１０倍多い。さらなる実施形態では、増殖した集団は、本明細書で定義される培養期間の後、増殖前の単離された集団と比較して、数が５倍～１０倍多い。さらに別の実施形態では、増殖した集団は、１２日間の培養期間の後、増殖前の単離された集団よりも、数が５倍～１０倍多い。別の実施形態では、増殖した集団は、１４日間の培養期間の後、増殖前の単離された集団と比較して、数が５倍～１０倍多い。一実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、抗体またはその断片の非存在下で同じ長さの時間培養した集団よりも数が多い。一実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球、特にＮＫ細胞の集団は、ＩＬ－４の存在下で同じ長さの時間培養した集団よりも数が多い。

【0142】

本発明の方法は、本明細書に記載のように特徴付けられ得る、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本方法を使用して単離された細胞集団に存在するＭＨＣ非拘束性リンパ球の少なくとも７０％がＣＤ５６を発現する。

【0143】

いくつかの実施形態では、本方法を使用して単離された細胞集団は、γδＴ細胞を含み、γδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ５６を発現する。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞の少なくとも約４５％がＣＤ５６を発現する。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞の少なくとも４５％、例えば少なくとも４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％がＣＤ５６を発現する。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞の少なくとも約５０％がＣＤ５６を発現する。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞の少なくとも約５５％がＣＤ５６を発現する。いくつかの実施形態では、γδＴ細胞の少なくとも約６０％がＣＤ５６を発現する。

【0144】

本発明の方法は、参照集団（例えば、出発物質／試料）と比較してより高い割合のＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞を有するＭＨＣ非拘束性リンパ球の集団を提供し得る。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}γδＴ細胞の数は、少なくとも４０％増加している。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}γδＴ細胞の数は、少なくとも４５％、例えば少なくとも４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％増加している。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}γδＴ細胞は、数が少なくとも約５０％増加している。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}γδＴ細胞は、数が少なくとも約５５％増加している。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}γδＴ細胞は、数が少なくとも約６０％増加している。

【0145】

いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも約４０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも４５％、例えば少なくとも４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも約５０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも約５５％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも約６０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。

【0146】

いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞は、数が少なくとも５０％増加している。いくつかの実施形態では、増殖した組成物中に存在するＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞は、数が少なくとも６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％増加している。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞は、数が少なくとも約７０％増加している。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞は、数が少なくとも約７５％増加している。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞は、数が少なくとも約８０％増加している。

【0147】

いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するＮＫ細胞の少なくとも約５０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するＮＫ細胞の少なくとも６０％、例えば少なくとも６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するＮＫ細胞の少なくとも約７０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するＮＫ細胞の少なくとも約７５％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。いくつかの実施形態では、増殖させた組成物中に存在するＮＫ細胞の少なくとも約８０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である。

【0148】

増殖方法は、参照集団よりも高い割合のＮＫ細胞を有する増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団を提供し得る。いくつかの実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、少なくとも約３０％のＮＫ細胞、例えば、少なくとも約３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％または５０％のＮＫ細胞を含む。さらなる実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、少なくとも約４０％のＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、約８０％未満のＮＫ細胞、例えば、約７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６０％、６８％、５７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％または５０％未満のＮＫ細胞を含む。さらなる実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、約６０％未満のＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、約２０％～７０％のＮＫ細胞、例えば、約３０％～６０％のＮＫ細胞を含む。さらなる実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、約５０％のＮＫ細胞を含む。

【0149】

増殖方法は、参照集団よりも高い割合のγδＴ細胞を有する増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団を提供し得る。いくつかの実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、少なくとも約３０％のγδＴ細胞、例えば、少なくとも約３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％または５０％のγδＴ細胞を含む。さらなる実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、少なくとも約４０％のγδＴ細胞、例えば約４５％超のγδＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、約８０％未満のγδＴ細胞、例えば、約７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６０％、６８％、５７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％または５０％未満のγδＴ細胞を含む。さらなる実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、約６０％未満のγδＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、約３０％～６０％のγδＴ細胞を含む。さらなる実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、約５０％のγδＴ細胞を含む。

【0150】

いくつかの実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、少なくとも約１０％のＶδ１Ｔ細胞、例えば、少なくとも約１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％のＶδ１Ｔ細胞を含む。さらなる実施形態では、増殖したＶδ１Ｔ細胞集団は、少なくとも約２０％のＶδ１Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、約１０％～５５％のＶδ１Ｔ細胞、例えば、約１０％～３０％のＶδ１Ｔ細胞を含む。

【0151】

いくつかの実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、少なくとも約５％のＶδ２Ｔ細胞、例えば、少なくとも約６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％のＶδ２Ｔ細胞を含む。さらなる実施形態では、増殖したＶδ１Ｔ細胞集団は、少なくとも約７％のＶδ２Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、約７％～３０％のＶδ２Ｔ細胞を含む。

【0152】

いくつかの実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、約１０％未満のαβＴ細胞、例えば、約５％、４％、３％、２％、１．５％、１％、０．５％、０．２％、０．１％または０．０５％未満のαβＴ細胞を含む。さらなる実施形態では、増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団は、約１％未満のαβＴ細胞を含む。αβ受容体を有するＴ細胞は非常に反応性が高く、したがって、本発明に関して患者への投与に好適な細胞集団は、低レベルのαβＴ細胞のみを含み得る。本明細書に記載の抗体を使用して、ＭＨＣ非拘束性リンパ球を選択的に増殖させてもよく、これにより、増殖後のαβＴ細胞除去のための大規模な精製方法の必要性が低減される。

【0153】

いくつかの実施形態では、この方法を使用して単離された細胞集団の少なくとも９０％がＮＫ細胞及びγδＴ細胞からなり、その場合、少なくとも１０％の細胞がＶδ１Ｔ細胞であり、少なくとも５％の細胞がＶδ２Ｔ細胞であり、少なくとも３０％の細胞がＮＫ細胞である。

【0154】

細胞表面マーカーの発現の増加または減少は、追加的または代替的に使用して、ＣＤ２７及び／またはＮＫｐ３０を含む、１つ以上の増殖したＭＨＣ非拘束性リンパ球集団を特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ非拘束性リンパ球集団に存在する増殖したＶδ１Ｔ細胞集団は、参照集団（本発明の方法を使用して増殖させていない集団など）と比較して、より低いレベルのＣＤ２７を発現する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ非拘束性リンパ球集団に存在する増殖したＶδ１Ｔ細胞集団は、低レベルのＣＤ２７を発現する（ＣＤ２７^ｌｏｗ）。例えば、増殖したＶδ１Ｔ細胞集団の約７０％未満、例えば、約５０％、４０％または３０％未満がＣＤ２７を発現する（すなわち、ＣＤ２７＋）。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ非拘束性リンパ球集団に存在する増殖したＶδ１Ｔ細胞集団は、参照集団（本発明の方法を使用して増殖させていない集団など）と比較して、より高いレベルのＮＫｐ３０を発現する。例えば、増殖したＶδ１Ｔ細胞集団の約１０％超、例えば、約１５％、２０％または２５％超がＮＫｐ３０を発現する（すなわち、ＮＫｐ３０＋）。

【0155】

いくつかの実施形態では、ＭＨＣ非拘束性リンパ球集団に存在する増殖したＶδ１Ｔ細胞集団は、高レベルのＮＫＧ２Ｄを発現する（ＮＫＧ２Ｄ^ｈｉｇｈ）。例えば、増殖したＶδ１Ｔ細胞集団の約８０％超、例えば、約８５％、９０％または９５％超がＮＫＧ２Ｄを発現する（すなわち、ＮＫＧ２Ｄ＋）。

【0156】

γδＴ細胞の増殖に使用するのに適した多数の基礎培地、特にＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）ＡＩＭ－Ｖ、Ｉｓｃｏｖｅｓ培地及びＲＰＭＩ－１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＸＶＩＶＯ－１０、ＥＸＶＩＶＯ－１５またはＥＸＶＩＶＯ－２０（Ｌｏｎｚａ）などの培地が、任意選択で血清または血漿の存在下で、利用可能である。本明細書で定義される他の培地因子、例えば、血清、血清タンパク質及び選択用薬剤、例えば抗生物質を培地に補充してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ＲＰＭＩ－１６４０培地は、２ｍＭグルタミン、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、非必須アミノ酸（例えば、１００μＭ Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ及びＳｅｒ；１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、ならびに１０μｌ／Ｌ β－メルカプトエタノールを含有する。別の実施形態では、ＡＩＭ－Ｖ培地にＣＴＳ免疫血清代替物及びアムホテリシンＢを補充してもよい。好都合には、培養中、好適な培地中で、５％ＣＯ_２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で細胞を培養する。ＮＫ細胞及び／またはＶδ２Ｔ細胞などの特定の細胞の増殖を特異的にサポートする因子を、培地にさらに補充してもよい。したがって、一実施形態では、培地は、ＮＫ細胞及び／またはＶδ２Ｔ細胞サプリメントを含む。培地サプリメントの例として、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ製のＮＫサプリメントが挙げられる。そのようなサプリメント（複数可）の存在により、標的細胞の増殖能力が増強し、したがって、増殖した集団におけるそのような細胞の割合が増加し得る。

【0157】

本明細書に記載されるように、抗体（またはその断片）を、試料から得られた細胞集団に適用してもよい。一実施形態では、抗Ｖδ１抗体またはその断片を投与する前に、試料から細胞集団を単離する。

【0158】

本明細書における細胞、特にγδＴ細胞の「単離」または「単離すること」への言及は、組織または細胞のプールから細胞を、除去、分離、精製、濃縮、または別の方法で取り出す方法またはプロセスを指す。そのような言及には、「分離された」、「除去された」、「精製された」、「濃縮された」などの用語が含まれることを理解されたい。γδＴ細胞の単離には、インタクトな非造血組織試料からの、または非造血組織の間質細胞（例えば、線維芽細胞または上皮細胞）からの細胞の単離または分離が含まれる。そのような単離は、代替的にまたは追加的に、他の造血細胞（例えば、αβＴ細胞または他のリンパ球）からのγδＴ細胞の単離または分離を含み得る。単離は、例えば、組織外植片もしくは生検を単離培養物に入れた時点から開始し、遠心分離もしくは単離した細胞集団を増殖培養物に移すための他の手段などによって培養物から細胞を回収するか、または他の目的に使用するか、あるいは培養物から元の組織外植片もしくは生検を除去する時点で終了する、定義された期間のものであり得る。単離ステップは、少なくとも約３日間～約４５日間のものであり得る。一実施形態では、単離ステップは、少なくとも約１０日間～少なくとも２８日間のものである。さらなる実施形態では、単離ステップは、少なくとも１４日間～少なくとも２１日間のものである。したがって、単離ステップは、少なくとも３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、約３５日間、約４０日間、または約４５日間のものであり得る。細胞増殖は、この単離ステップ中に実質的ではない場合があるが、必ずしも存在しないというわけではないことを理解することができる。実際、当業者には、単離された細胞が分裂を開始して、試料を含有する単離容器内で複数のそのような細胞が生成される場合もあることが認識される。

【0159】

非造血組織試料などのヒトまたは非ヒト動物試料由来のリンパ球、特にＶδ１Ｔ細胞の単離を可能にする任意の好適な方法によって細胞集団を取得してもよい。そのような方法の１つが、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２６（５）：１０５９－７０に記載されており、この文献には、ヒトの皮膚からリンパ球を単離するための三次元皮膚外植片プロトコルが記載されている。外植片を合成足場に接着させて、外植片から足場へのリンパ球の放出を促進してもよい。合成足場とは、細胞増殖をサポートするのに好適な非天然の三次元構造を指す。合成足場は、ポリマー（例えば、天然または合成ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、ポリメチルメタクリレート、メチルセルロース、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン）、セラミック（例えば、リン酸三カルシウム、アルミン酸カルシウム、カルシウムヒドロキシアパタイト）、または金属（タンタル、チタン、プラチナ、ならびにプラチナ、ニオブ、ハフニウム、タングステン、及びそれらの合金の組み合わせと同じ元素グループの金属）などの材料から構築され得る。生物学的因子（例えば、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩまたはコラーゲンＩＩ）、フィブロネクチン、ラミニン、インテグリン、血管新生因子、抗炎症因子、グリコサミノグリカン、ビトロゲン、抗体及びその断片、サイトカインを、足場表面にコーティングするか、または足場材料内にカプセル化して、当技術分野で公知の方法に従って、細胞の接着、遊走、生存、または増殖を増強してもよい。この方法及び他の方法を使用して、多くの他の非造血組織型、例えば、腸、前立腺及び乳房から細胞集団を単離することができる。好適な単離方法の他の例は、免疫細胞、特にＭＨＣ非拘束性リンパ球の単離または分離を誘導するのに十分なサイトカイン及び／またはケモカイン存在下で細胞集団及び／または試料を培養することを含み得る「クロールアウト」法を利用する。

【0160】

間質細胞、例えば、真皮線維芽細胞から非造血組織常駐リンパ球を採取し、例えば、しっかりとピペッティングすることによって分離することができる。処理中に緩んだ可能性のある線維芽細胞凝集体を保持するために、採取したリンパ球を４０μｍのナイロンメッシュに通してさらに洗浄してもよい。リンパ球はまた、例えばＣＤ４５抗体を使用する蛍光または磁気関連細胞分離法を使用して単離してもよい。

【0161】

本明細書における「培養」への言及は、試料から単離、分離、除去、精製、または濃縮した細胞を含む試料を、細胞及び／または試料に必要な及び／または好ましい成長因子及び／または必須栄養素を含む培地に添加することを含む。そのような培養条件は、試料から単離する細胞もしくは細胞集団に従って適合させてもよく、または試料から単離し、増殖させる細胞もしくは細胞集団に従って適合させてもよいことが理解される。

【0162】

培地には、γδＴ細胞の成長及び増殖を支援することができる他の成分をさらに含めてもよい。添加してもよい他の成分の例として、血漿または血清、アルブミンなどの精製タンパク質、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）などの脂質源、ビタミン、アミノ酸、ステロイド、ならびに細胞増殖及び／または生存をサポートするかまたは促進する任意の他のサプリメントが挙げられるが、これらに限定されない。

【0163】

抗体またはその断片
本明細書で提供される方法で使用される抗体は、γδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のデルタ可変１鎖（Ｖδ１）に特異的に結合することができる抗体またはその断片である。一実施形態では、抗Ｖδ１抗体またはその断片は、活性化抗Ｖδ１抗体またはその断片である。驚くべきことに、特定の培養条件下で抗Ｖδ１抗体の存在下で細胞集団を培養すると、予想どおりＶδ１Ｔ細胞だけでなく、すべてのＭＨＣ非拘束性リンパ球を同時に濃縮することができることが判明している。いくつかの実施形態では、抗Ｖδ１抗体を、４２ｎｇ／ｍｌの濃度で使用する。したがって、一実施形態では、本明細書に記載の方法の培養ステップを、４２ｎｇ／ｍｌの抗Ｖδ１抗体の存在下で実施する。

【0164】

一実施形態では、抗体またはその断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、可変ドメイン（例えば、ＶＨもしくはＶＬ）、ダイアボディ、ミニボディまたはモノクローナル抗体である。さらなる実施形態では、抗体またはその断片はｓｃＦｖである。

【0165】

本明細書に記載の抗体は、任意のクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはこれらのアイソタイプであり得、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖を含み得る。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体、例えば、アイソタイプ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のうちの少なくとも１つである。さらなる実施形態では、抗体は、エフェクター機能を低下させ、半減期を延長し、ＡＤＣＣを変更し、またはヒンジ安定性を向上させるように変異させたＦｃを有するなど所望の特性を与えるように改変されているＩｇＧ型などの形式であってもよい。そのような改変は、当技術分野で周知である。

【0166】

一実施形態では、抗体またはその断片はヒトである。したがって、抗体またはその断片は、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）配列に由来し得る。抗体（またはその断片）のＣＤＲ、フレームワーク及び／または定常領域は、ヒトＩｇ配列、特にヒトＩｇＧ配列に由来し得る。ＣＤＲ、フレームワーク及び／または定常領域は、ヒトＩｇ配列、特にヒトＩｇＧ配列について実質的に同一であり得る。ヒト抗体を使用する利点は、ヒトでの免疫原性が低いか、まったくないことである。

【0167】

抗体またはその断片はまた、キメラ、例えばマウス－ヒト抗体キメラであり得る。

【0168】

あるいは、抗体またはその断片は、マウスなどの非ヒト種に由来する。そのような非ヒト抗体は、ヒトにおいて自然に生成される抗体バリアントとの類似性を高めるように改変することができ、したがって、抗体またはその断片は、部分的または完全にヒト化され得る。したがって、一実施形態では、抗体またはその断片はヒト化されている。

【0169】

エピトープを標的とする抗体
本明細書において、γδＴＣＲのＶδ１鎖のエピトープに結合する抗体（またはその断片）を提供する。そのような結合は、任意選択で、活性化または阻害などのγδＴＣＲ活性に影響を及ぼし得る。

【0170】

一実施形態では、エピトープは、γδＴ細胞の活性化エピトープであり得る。「活性化」エピトープは、例えば、ＴＣＲ機能を刺激すること、例えば、脱顆粒、ＴＣＲ下方制御、細胞傷害性、増殖、動員、生存の延長もしくは消耗に対する耐性、細胞内シグナル伝達、サイトカインもしくは成長因子分泌、表現型の変化、または遺伝子発現の変化を含み得る。例えば、活性化エピトープの結合は、γδＴ細胞集団、好ましくはＶδ１Ｔ細胞集団の増大（すなわち、増殖）を刺激し得る。したがって、これらの抗体を使用して、γδＴ細胞の活性化を調節し、それによって免疫応答を調節することができる。したがって、一実施形態では、活性化エピトープの結合は、γδＴＣＲを下方制御する。追加のまたは別の実施形態では、活性化エピトープの結合は、γδＴ細胞の脱顆粒を活性化する。さらなる追加のまたは別の実施形態では、活性化エピトープの結合は、γδＴ細胞の殺傷を活性化する。

【0171】

あるいは、抗体（またはその断片）は、別の抗体または分子の結合または相互作用を阻止することによって遮断効果を有し得る。一実施形態では、本発明は、Ｖδ１を遮断し、ＴＣＲ結合を阻止する（例えば、立体障害を介して）単離された抗体またはその断片を提供する。Ｖδ１を遮断することにより、抗体は、ＴＣＲの活性化及び／またはシグナル伝達を阻止し得る。エピトープは、γδＴ細胞の抑制性エピトープであり得る。「抑制性」エピトープは、例えば、ＴＣＲ機能を遮断し、それによってＴＣＲ活性化を阻害することを含み得る。

【0172】

エピトープは、好ましくは、γδＴＣＲのＶδ１鎖の少なくとも１つの細胞外、可溶性、親水性、外部または細胞質部分で構成される。

【0173】

特に、エピトープは、γδＴＣＲのＶδ１鎖の超可変領域、特にＶδ１鎖のＣＤＲ３に認められるエピトープを含まない。好ましい実施形態では、エピトープは、γδＴＣＲのＶδ１鎖の非可変領域内にある。そのような結合は、非常に可変性のあるＴＣＲの配列（特にＣＤＲ３）に制限されることなく、Ｖδ１鎖のユニークな認識を可能にすることが理解されよう。ＭＨＣ様ペプチドまたは抗原を認識する様々なγδＴＣＲ複合体は、Ｖδ１鎖の存在のみによって、このように認識され得る。したがって、任意のＶδ１鎖を含むγδＴＣＲは、γδＴＣＲの特異性に関係なく、本明細書で定義される抗体またはその断片を用いて認識され得ることが理解されよう。一実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域１～２４及び／または３５～９０内の１つ以上のアミノ酸残基、例えば、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ３配列の一部ではないＶδ１鎖の一部を含む。一実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域９１～１０５（ＣＤＲ３）内のアミノ酸残基を含まない。

【0174】

良好に特性評価されたαβＴ細胞と同様に、γδＴ細胞は、体細胞性に再構成された可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、結合（Ｊ）及び定常（Ｃ）遺伝子の異なるセットを利用するが、γδＴ細胞には、αβＴ細胞よりも少ないＶ、Ｄ及びＪセグメントが含まれている。一実施形態では、抗体（またはその断片）が結合するエピトープは、Ｖδ１鎖のＪ領域（例えば、ヒトデルタ１鎖生殖系列にコードされる４つのＪ領域：配列番号１３１（Ｊ１＊０）または１３２（Ｊ２＊０）または１３３（Ｊ３＊０）または１３４（Ｊ４＊０）のうちの１つ）に認められるエピトープを含まない。一実施形態では、抗体（またはその断片）が結合するエピトープは、Ｖδ１鎖のＣ領域（例えば、Ｃ末端の膜近傍／膜貫通領域を含む配列番号１３５（Ｃ１＊０））に認められるエピトープを含まない。一実施形態では、抗体（またはその断片）が結合するエピトープは、Ｖδ１鎖のＮ末端リーダー配列（例えば、配列番号１２９）に認められるエピトープを含まない。したがって、抗体または断片は、Ｖδ１鎖のＶ領域（例えば、配列番号１３０）にのみ結合し得る。したがって、一実施形態では、エピトープは、γδＴＣＲのＶ領域のエピトープ（例えば、配列番号１のアミノ酸残基１～９０）からなる。

【0175】

エピトープへの言及は、Ｌｕｏｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３９：１０３２－１０４２、及び配列番号１：
ＡＱＫＶＴＱＡＱＳＳＶＳＭＰＶＲＫＡＶＴＬＮＣＬＹＥＴＳＷＷＳＹＹＩＦＷＹＫＱＬＰＳＫＥＭＩＦＬＩＲＱＧＳＤＥＱＮＡＫＳＧＲＹＳＶＮＦＫＫＡＡＫＳＶＡＬＴＩＳＡＬＱＬＥＤＳＡＫＹＦＣＡＬＧＥＳＬＴＲＡＤＫＬＩＦＧＫＧＴＲＶＴＶＥＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳ（配列番号１）
として示されるＲＣＳＢタンパク質データバンクエントリ：４ＭＮＨ及び３ＯＭＺに記載されている配列に由来するＶδ１配列に関連して行われる。

【0176】

配列番号１は、Ｖ領域（可変ドメインとも称される）、Ｄ領域、Ｊ領域及びＴＣＲ定常領域を含む可溶性ＴＣＲを表す。Ｖ領域はアミノ酸残基１～９０を含み、Ｄ領域はアミノ酸残基９１～１０４を含み、Ｊ領域はアミノ酸残基１０５～１１５を含み、定常領域はアミノ酸残基１１６～２０９を含む。Ｖ領域内で、ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸残基２５～３４として定義され、ＣＤＲ２は、配列番号１のアミノ酸残基５０～５４として定義され、ＣＤＲ３は、配列番号１のアミノ酸残基９３～１０４として定義される（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０８（６）：２４１４－２４１９（２０１１））。

【0177】

したがって、一実施形態では、単離された抗体またはその断片は、アミノ酸領域：
（ｉ）配列番号１の３～２０；及び／または
（ｉｉ）配列番号１の３７～７７内に１つ以上のアミノ酸残基を含むγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖のエピトープに結合する。

【0178】

本明細書に記載の抗体のエピトープマッピングを、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５１９５６号（これらは参照により本明細書に援用される）の実施例１及び９に記載されているように実施した。

【0179】

さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１２８のアミノ酸残基１～９０のエピトープを含む多型Ｖ領域をさらに認識する。したがって、配列番号１のアミノ酸１～９０と多型生殖系列バリアント配列（アミノ酸１～９０ 配列番号１２８）は、本明細書に記載のエピトープを定義する場合、互換性があるとみなされ得る。本発明の抗体は、この生殖系列配列の両方のバリアントを認識することができる。例として、本明細書で定義される抗体またはその断片が、配列番号１のアミノ酸領域１～２４及び／または３５～９０内の１つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープを認識すると記載されている場合、これはまた、配列番号１２８の同じ領域、具体的には、配列番号１２８のアミノ酸領域１～２４及び／または３５～９０を指す。

【0180】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸領域１～９０内の１つ以上のアミノ酸残基、及び配列番号１２８の領域１～９０の同等位置のアミノ酸を認識する。より具体的には、一実施形態では、本明細書で定義される抗体またはその断片は、ヒト生殖系列エピトープを認識し、前記生殖系列は、配列番号１の７１位でアラニン（Ａ）またはバリン（Ｖ）のいずれかをコードする。

【0181】

一実施形態では、エピトープは、記載された領域内に１つ以上、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０以上のアミノ酸残基を含む。

【0182】

さらなる実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域３～２０内の１つ以上（例えば５つ以上、例えば１０以上）のアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域３７～７７内（例えばアミノ酸領域５０～５４）に１つ以上（例えば５つ以上、例えば１０以上）のアミノ酸残基を含む。さらに別の実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域３～２０内（例えば５～２０または３～１７）の１つ以上（例えば５つ以上、例えば１０以上）のアミノ酸残基、及びアミノ酸領域３７～７７内（例えば６２～７７または６２～６９）に１つ以上（例えば５つ以上、例えば１０以上）のアミノ酸残基を含む。

【0183】

前記抗体（またはその断片）は、定義された範囲内のすべてのアミノ酸に結合する必要はないことがさらに理解されよう。そのようなエピトープは、線状エピトープと称され得る。例えば、配列番号１のアミノ酸領域５～２０内のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する抗体は、前記範囲のアミノ酸残基、例えば、任意選択で範囲内のアミノ酸（すなわち、アミノ酸５、９、１６及び２０）を含む、範囲の両端のアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸５及び２０）の１つ以上とのみ結合し得る。

【0184】

一実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基３、５、９、１０、１２、１６、１７、２０、３７、４２、５０、５３、５９、６２、６４、６８、６９、７２または７７のうちの少なくとも１つを含む。さらなる実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基３、５、９、１０、１２、１６、１７、２０、３７、４２、５０、５３、５９、６２、６４、６８、６９、７２または７７から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２アミノ酸を含む。

【0185】

一実施形態では、エピトープは、配列番号１（または配列番号１２８，上記のとおり）の以下のアミノ酸領域内の１つ以上のアミノ酸残基を含む：
（ｉ）３～１７、
（ｉｉ）５～２０、
（ｉｉｉ）３７～５３、
（ｉｖ）５０～６４、
（ｖ）５９～７２、
（ｖｉ）５９～７７、
（ｖｉｉ）６２～６９、及び／または
（ｖｉｉｉ）６２～７７。

【0186】

さらなる実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域：５～２０及び６２～７７、５０～６４、３７～５３及び５９～７２、５９～７７、または３～１７及び６２～６９内の１つ以上のアミノ酸残基を含む。さらなる実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域：５～２０及び６２～７７、５０～６４、３７～５３及び５９～７２、５９～７７、または３～１７及び６２～６９内の１つ以上のアミノ酸残基からなる。

【0187】

さらなる実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基：３、５、９、１０、１２、１６、１７、６２、６４、６８及び６９を含むか、または好適には、配列番号１のアミノ酸残基：３、５、９、１０、１２、１６、１７、６２、６４、６８及び６９からなる。さらなる実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基：５、９、１６、２０、６２、６４、７２及び７７を含むか、または好適には、配列番号１のアミノ酸残基：５、９、１６、２０、６２、６４、７２及び７７からなる。さらに別の実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基：３７、４２、５０、５３、５９、６４、６８、６９、７２、７３及び７７を含むか、または好適には、配列番号１のアミノ酸残基：３７、４２、５０、５３、５９、６４、６８、６９、７２、７３及び７７からなる。さらなる実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基：５０、５３、５９、６２及び６４を含むか、または好適には配列番号１のアミノ酸残基：５０、５３、５９、６２及び６４からなる。さらなる実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基：５９、６０、６８及び７２を含むか、または好適には、配列番号１のアミノ酸残基：５９、６０、６８及び７２からなる。

【0188】

一実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５～２０及び／または６２～７７内に１つ以上のアミノ酸残基を含む。さらなる実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５～２０及び６２～７７内の１つ以上のアミノ酸残基からなる。別のさらなる実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５～２０または６２～７７内の１つ以上のアミノ酸残基を含む。そのようなエピトープを有する抗体またはその断片は、１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７の配列の一部またはすべてを有し得るか、またはそのような抗体またはその断片は、１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７由来であり得る。例えば、１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７の１つ以上のＣＤＲ配列を有する抗体もしくはその断片、または１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７のＶＨ及びＶＬ配列の一方もしくは両方が、そのようなエピトープに結合し得る。

【0189】

一実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５０～６４内の１つ以上のアミノ酸残基を含む。さらなる実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５０～６４内の１つ以上のアミノ酸残基からなる。そのようなエピトープを有する抗体またはその断片は、１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８の配列の一部もしくはすべてを有し得るか、またはそのような抗体もしくはその断片は、１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８由来であり得る。例えば、１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８の１つ以上のＣＤＲ配列を有する抗体もしくはその断片、または１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８のＶＨ及びＶＬ配列の一方もしくは両方が、そのようなエピトープに結合し得る。

【0190】

一実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域３７～５３及び／または５９～７７内に１つ以上のアミノ酸残基を含む。さらなる実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域３７～５３及び５９～７７内の１つ以上のアミノ酸残基からなる。別のさらなる実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域３７～５３または５９～７７内の１つ以上のアミノ酸残基を含む。そのようなエピトープを有する抗体またはその断片は、１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４の配列の一部またはすべてを有し得るか、またはそのような抗体またはその断片は、１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４由来であり得る。例えば、１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４の１つ以上のＣＤＲ配列を有する抗体もしくはその断片、または１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４のＶＨ及びＶＬ配列の一方もしくは両方が、そのようなエピトープに結合し得る。

【0191】

一実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５９～７２内に１つ以上のアミノ酸残基を含む。さらなる実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５９～７２内の１つ以上のアミノ酸残基からなる。そのようなエピトープを有する抗体またはその断片は、１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５の配列の一部またはすべてを有し得るか、またはそのような抗体またはその断片は、１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５由来であり得る。例えば、１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５の１つ以上のＣＤＲ配列を有する抗体もしくはその断片、または１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５のＶＨ及びＶＬ配列の一方もしくは両方が、そのようなエピトープに結合し得る。

【0192】

一実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域１１～２１内のアミノ酸残基を含まない。一実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域２１～２８内のアミノ酸残基を含まない。一実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域５９及び６０内のアミノ酸残基を含まない。一実施形態では、エピトープは、配列番号１のアミノ酸領域６７～８２内のアミノ酸残基を含まない。

【0193】

一実施形態では、エピトープは、ＴＳ－１またはＴＳ８．２などの市販の抗Ｖδ１抗体が結合するエピトープと同じではない。ＷＯ２０１７１９７３４７に記載されているように、δ１鎖がＶδ１ Ｊ１及びＶδ１ Ｊ２配列を含むが、Ｖδ１ Ｊ３鎖を含んでいなかった場合、ＴＳ－１及びＴＳ８．２の可溶性ＴＣＲへの結合が検出され、ＴＳ－１及びＴＳ８．２の結合に重要な残基が、デルタＪ１及びデルタＪ２領域に含まれていたことが示された。

【0194】

本明細書における「～内」への言及は、定義された範囲の端を含む。例えば、「アミノ酸領域５～２０内」は、残基５（残基５を含む）～残基２０（残基２０を含む）のアミノ酸残基のすべてを指す。

【0195】

どのエピトープが抗体によって結合されるかを確定するための様々な技術が、当技術分野で公知である。例示的な技術には、例えば、日常的なクロスブロッキングアッセイ、アラニン走査変異分析、ペプチドブロット分析、ペプチド切断分析、結晶学的実験、及びＮＭＲ分析が含まれる。さらに、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出及び化学修飾などの方法を使用することができる。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、質量分析によって検出された水素／重水素交換である（実施例９に記載されているように）。一般的な用語において、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質を重水素で標識し、その後、抗体を重水素で標識したタンパク質に結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移動させ、抗体複合体によって保護されているアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素から水素への逆交換を受ける。その結果、タンパク質／抗体の界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持し得、そのため、界面に含まれていないアミノ酸と比較して比較的高い質量を示す。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及び質量分析に供し、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。

【0196】

抗体配列
単離された抗Ｖδ１抗体またはその断片を、それらのＣＤＲ配列を参照して記載してもよい。

【0197】

一実施形態では、抗Ｖδ１抗体またはその断片は、
配列番号２～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３、
配列番号２６～３７及び配列Ａ１～Ａ１２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２、及び／または
配列番号３８～６１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１のうちの１つ以上を含む。

【0198】

一実施形態では、単離された抗Ｖδ１抗体またはその断片は、配列番号２～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２６～３７及び配列Ａ１～Ａ１２（表２の）のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３８～６１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含む。

【0199】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～２５のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２６～３７及び配列Ａ１～Ａ１２（表２の）のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３８～６１のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含む。

【0200】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～２５のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２６～３７及び配列Ａ１～Ａ１２（表２の）のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ２を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３８～６１のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ１を含む。

【0201】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を共有するＣＤＲ３配列を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。

【0202】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。

【0203】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。

【0204】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。

【0205】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～７、特に２～６、例えば、２、３または４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び配列番号１４～１９、特に１４～１８、例えば、１４、１５または１６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～７、特に２～６、例えば、２、３または４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び配列番号１４～１９、特に１４～１８、例えば、１４、１５または１６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。

【0206】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～７、特に２～６、例えば、２、３または４のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～１９、特に１４～１８、例えば、１４、１５または１６のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～７、特に２～６、例えば、２、３または４のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～１９、特に１４～１８、例えば、１４、１５または１６のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。

【0207】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～７、特に２～６、例えば、２、３または４のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～１９、特に１４～１８、例えば、１４、１５または１６のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２～７、特に２～６、例えば、２、３または４のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号１４～１９、特に１４～１８、例えば、１４、１５または１６のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。

【0208】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８～１３、特に８、９、１０または１１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２０～２５、特に２０、２１、２２または２３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８～１３、特に８、９、１０または１１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２０～２５、特に２０、２１、２２または２３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。

【0209】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８～１３、特に８、９、１０または１１のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２０～２５、特に２０、２１、２２または２３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８～１３、特に８、９、１０または１１のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２０～２５、特に２０、２１、２２または２３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。

【0210】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８～１３、特に８、９、１０または１１のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２０～２５、特に２０、２１、２２または２３のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８～１３、特に８、９、１０または１１のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ領域、及び／または配列番号２０～２５、特に２０、２１、２２または２３のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。

【0211】

本明細書で「少なくとも８０％」または「８０％以上」に言及している実施形態は、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％など８０％以上のすべての値の配列同一性を含むと理解されるであろう。一実施形態では、抗体またはその断片は、指定された配列に対して少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含む。

【0212】

配列同一性の割合の代わりに、実施形態はまた、１つ以上のアミノ酸変化、例えば、１つ以上の付加、置換及び／または欠失で定義され得る。一実施形態では、配列は、最大５つのアミノ酸変化、例えば最大３つのアミノ酸変化、特に最大２つのアミノ酸変化を含み得る。さらなる実施形態では、配列は、最大５つのアミノ酸置換、例えば最大３つのアミノ酸置換、特に最大１つまたは２つのアミノ酸置換を含み得る。例えば、抗体またはその断片のＣＤＲ３は、配列番号２～２５のいずれか１つと比較して、２つ以下、より好適には１つ以下の置換（複数可）を有する配列を含むか、またはより好適にはそれからなる。

【0213】

好適には、配列番号２～６１及び配列Ａ１～Ａ１２におけるそれらの対応する残基とは異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３の任意の残基は、それらの対応する残基に関して保存的置換である。例えば、配列番号２～２５におけるそれらの対応する残基とは異なるＣＤＲ３の任意の残基は、それらの対応する残基に関して保存的置換である。

【0214】

一実施形態では、抗体またはその断片は、
（ｉ）配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、
（ｉｉ）配列番号２６～３７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ領域、
（ｉｉｉ）配列番号３８～４９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域、
（ｉｖ）配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域、
（ｖ）配列Ａ１～Ａ１２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＬ領域、及び／または、
（ｖｉ）配列番号５０～６１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を含む。

【0215】

一実施形態では、抗体またはその断片は、
（ｉ）配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域、
（ｉｉ）配列番号２６～３７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ領域、及び
（ｉｉｉ）配列番号３８～４９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を備えた重鎖を含む。

【0216】

一実施形態では、抗体またはその断片は、
（ｉ）配列番号１４～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域、
（ｉｉ）配列Ａ１～Ａ１２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＬ領域、及び
（ｉｉｉ）配列番号５０～６１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を備えた軽鎖を含む。

【0217】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２、３、４、５または６、例えば、２、３、４または５、特に２、３または４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域を含む（またはからなる）。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２６、２７、２８、２９または３０、例えば、２６、２７、２８または２９、特に２６、２７または２８のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ領域を含む（またはからなる）。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３８、３９、４０、４１または４２、例えば、３８、３９、４０または４１、特に３８、３９または４０のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を含む（または、それからなる）。

【0218】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８、９、１０または１１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ領域を含む（または、それからなる）。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３２、３３、３４または３５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ領域を含む（または、それからなる）。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４４、４５、４６または４７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ領域を含む（または、それからなる）。

【0219】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号２の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２６の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３８の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号２の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号２６の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号３８の配列からなる。

【0220】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号３の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２７の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３９の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号３の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号２７の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号３９の配列からなる。

【0221】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号４の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２８の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４０の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号４の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号２８の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号４０の配列からなる。

【0222】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号５の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２９の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４１の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号５の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号２９の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号４１の配列からなる。

【0223】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号６の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３０の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４２の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号６の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号３０の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号４２の配列からなる。

【0224】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号８の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３２の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４４の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号８の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号３２の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号４４の配列からなる。

【0225】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号９の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３３の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４５の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号９の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号３３の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号４５の配列からなる。

【0226】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１０の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３４のＣＤＲ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲ１配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号１０の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号３４の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号４６の配列からなる。

【0227】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１１の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３５のＣＤＲ２配列、及び配列番号４７のＣＤＲ１配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号１１の配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号３５の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号４７の配列からなる。

【0228】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１４～２５、例えば、配列番号１４、１５、１６、１７または１８、例えば、１４、１５、１６または１７、特に、１４、１５または１６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む（または、それからなる）。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列Ａ１～Ａ１２（表２の）、例えば、配列Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４またはＡ５、例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３またはＡ４、特にＡ１、Ａ２またはＡ３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２を含むＶＬ領域を含む（または、それからなる）。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号５０～６１、例えば、配列番号５０、５１、５２、５３または５４、例えば、５０、５１、５２または５３、特に、５０、５１または５２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１を含むＶＬ領域を含む（または、それからなる）。

【0229】

一実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号１４の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ１の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５０の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号１４の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ１の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号５０の配列からなる。

【0230】

一実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号１５の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ２の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５１の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号１５の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ２の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号５１の配列からなる。

【0231】

一実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号１６の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ３の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５２の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号１６の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ３の配列からなり、ＣＤＲ１は配列番号５２の配列からなる。

【0232】

一実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号１７の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ４の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５３の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号１７の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ４の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号５３の配列からなる。

【0233】

一実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号１８の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ５の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５４の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号１８の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ５の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号５４の配列からなる。

【0234】

一実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号２０の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ７の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５６の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号２０の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ７の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号５６の配列からなる。

【0235】

一実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号２１の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ８の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５７の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号２１の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ８の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号５７の配列からなる。

【0236】

一実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号２２の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ９の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５８の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号２２の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ９の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号５８の配列からなる。

【0237】

一実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号２３の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ１０の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５９の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＣＤＲ３は配列番号２３の配列からなり、ＣＤＲ２は配列Ａ１０の配列からなり、及びＣＤＲ１は配列番号５９の配列からなる。

【0238】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号２の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２６の配列を含むＣＤＲ２、配列番号３８の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号１４の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ１の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５０の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ３は配列番号２の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号２６の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号３８の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号１４の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列Ａ１の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５０の配列からなる。

【0239】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号３の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２７の配列を含むＣＤＲ２、配列番号３９の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号１５の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ２の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５１の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ３は配列番号３の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号２７の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号３９の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号１５の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列Ａ２の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５１の配列からなる。

【0240】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号４の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２８の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４０の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号１６の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ３の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５２の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ３は配列番号４の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号２８の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４０の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号１６の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列Ａ３の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５２の配列からなる。

【0241】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号５の配列を含むＣＤＲ３、配列番号２９の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４１の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号１７の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ４の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５３の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ３は配列番号５の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号２９の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４１の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号１７の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列Ａ４の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５３の配列からなる。

【0242】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号６の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３０の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４２の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号１８の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ５の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５４の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ３は配列番号６の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３０の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４２の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号１８の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列Ａ５の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５４の配列からなる。

【0243】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号７の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３１の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４３の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号１９の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ６の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５５の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ３は配列番号７の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３１の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４３の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号１９の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列Ａ６の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５５の配列からなる。

【0244】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号８の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３２の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４４の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号２０の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ７の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５６の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ３は配列番号８の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３２の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４４の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号２０の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列Ａ７の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５６の配列からなる。

【0245】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号９の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３３の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４５の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号２１の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ８の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５７の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ３は配列番号９の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３３の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４５の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号２１の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列Ａ８の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５７の配列からなる。

【0246】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１０の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３４の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４６の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号２２の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ９の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５８の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ３は配列番号１０の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３４の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４６の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号２２の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列Ａ９の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５８の配列からなる。

【0247】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１１の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３５の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４７の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号２３の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ１０の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５９の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ３は配列番号１１の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３５の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４７の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号２３の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列Ａ１０の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号５９の配列からなる。

【0248】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１２の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３６の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４８の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号２４の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ１１の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号６０の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ３は配列番号１２の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３６の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４８の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号２４の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列Ａ１１の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号６０の配列からなる。

【0249】

一実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１３の配列を含むＣＤＲ３、配列番号３７の配列を含むＣＤＲ２、配列番号４９の配列を含むＣＤＲ１を含み、ＶＬ領域は、配列番号２５の配列を含むＣＤＲ３、配列Ａ１２の配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号６１の配列を含むＣＤＲ１を含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ３は配列番号１３の配列からなり、ＨＣＤＲ２は配列番号３７の配列からなり、ＨＣＤＲ１は配列番号４９の配列からなり、ＬＣＤＲ３は配列番号２５の配列からなり、ＬＣＤＲ２は配列Ａ１２の配列からなり、ＬＣＤＲ１は配列番号６１の配列からなる。

【0250】

一実施形態では、抗体またはその断片は、表２に記載されるように１つ以上のＣＤＲ配列を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、表２に記載されるクローン１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８の１つ以上（例えばすべて）のＣＤＲ配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、表２に記載されるクローン１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７の１つ以上（例えばすべて）のＣＤＲ配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、表２に記載されるクローン１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４の１つ以上（例えばすべて）のＣＤＲ配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、表２に記載されるクローン１２４５＿Ｐ０２＿Ｂ０７の１つ以上（例えばすべて）のＣＤＲ配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、表２に記載されるクローン１２５１＿Ｐ０２＿Ｃ０５の１つ以上（例えばすべて）のＣＤＲ配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、表２に記載されるクローン１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４の１つ以上（例えばすべて）のＣＤＲ配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、表２に記載されるクローン１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７の１つ以上（例えばすべて）のＣＤＲ配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、表２に記載されるクローン１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６の１つ以上（例えばすべて）のＣＤＲ配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、表２に記載されるクローン１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９の１つ以上（例えばすべて）のＣＤＲ配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、表２に記載されるクローン１１３８＿Ｐ０１＿Ｂ０９の１つ以上（例えばすべて）のＣＤＲ配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、表２に記載されるクローン１２５１＿Ｐ０２＿Ｇ１０の１つ以上（例えばすべて）のＣＤＲ配列を含む。

【0251】

【表2】

【0252】

好適には、上記のＶＨ領域及びＶＬ領域はそれぞれ、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６２～８５のいずれか１つのフレームワーク領域と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４）を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６２～８５のいずれか１つのフレームワーク領域と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、９７％または９９％の配列同一性を有する配列を含むフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４）を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６２～８５のいずれか１つの配列を含むフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４）を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６２～８５のいずれか１つの配列からなるフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４）を含む。

【0253】

本明細書に記載の抗体は、それらの完全な軽鎖可変配列及び／または重鎖可変配列によって定義され得る。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６２～８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６２～８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。

【0254】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。さらなる実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号６２、６３、６４、６５または６６、例えば６２、６３、６４または６５、特に６２、６３または６４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号６２、６３、６４、６５または６６、例えば６２、６３、６４または６５、特に６２、６３または６４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。さらなる実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号６８、６９、７０、７１、７２または７３、例えば６８、６９、７０または７１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号６８、６９、７０、７１、７２または７３、例えば６８、６９、７０または７１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。

【0255】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。さらなる実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号７４、７５、７６、７７または７８、例えば、７４、７５、７６または７７、特に７４、７５、または７６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号７４、７５、７６、７７または７８、例えば、７４、７５、７６または７７、特に７４、７５、または７６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。さらなる実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号８０、８１、８２、８３、８４または８５、例えば８０、８１、８２または８３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号８０、８１、８２、８３、８４または８５、例えば８０、８１、８２または８３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。

【0256】

さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。

【0257】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６３（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６２（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６４（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６８（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６９（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７０（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７１（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。

【0258】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６３（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）のアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６２（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）のアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６４（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）のアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６８（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）のアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６９（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）のアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７０（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）のアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７１（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）のアミノ酸配列からなるＶＨ領域を含む。

【0259】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７５（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７４（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７６（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８０（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８１（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８２（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８３（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。

【0260】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７５（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７４（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７６（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８０（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８１（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８２（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８３（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。

【0261】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６３（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号７５（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６２（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号７４（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６４（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号７６（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６８（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号８０（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６９（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号８１（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７０（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号８２（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７１（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び配列番号８３（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。

【0262】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６３（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）のアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号７５（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６２（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）のアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号７４（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６４（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）のアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号７６（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６８（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）のアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号８０（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６９（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）のアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号８１（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７０（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）のアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号８２（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７１（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）のアミノ酸配列からなるＶＨ領域、及び配列番号８３（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）のアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む。

【0263】

ＶＨ領域及びＶＬ領域の両方を含む断片の場合、これらは、共有結合（例えば、ジスルフィド結合またはリンカーを介して）または非共有結合のいずれかで結合し得る。本明細書に記載の抗体断片は、ｓｃＦｖ、すなわち、リンカーによって結合されたＶＨ領域及びＶＬ領域を含む断片を含み得る。一実施形態では、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、（例えば、合成）ポリペプチドリンカーによって結合されている。ポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎリンカーを含み得、ｎ＝１～８、例えば、２、３、４、５または７である。ポリペプチドリンカーは、［（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎ（Ｇｌｙ_３ＡｌａＳｅｒ）_ｍ］_ｐリンカーを含み得、ｎ＝１～８、例えば、２、３、４、５または７であり、ｍ＝１～８、例えば、０、１、２または３であり、及びｐ＝１～８、例えば、１、２または３である。さらなる実施形態では、リンカーは、配列番号９８を含む。さらなる実施形態では、リンカーは、配列番号９８からなる。

【0264】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８６～９７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８６～９７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８７（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８６（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８８（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号９２（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号９３（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号９４（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号９５（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）のアミノ酸配列を含む。

【0265】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８６～９７のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８６～９７のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。さらに別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８７（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８）のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８６（１２４５＿Ｐ０１＿Ｅ０７）のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号８８（１２４５＿Ｐ０２＿Ｇ０４）のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号９２（１１３９＿Ｐ０１＿Ｅ０４）のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号９３（１２４５＿Ｐ０２＿Ｆ０７）のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号９４（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０６）のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号９５（１２４５＿Ｐ０１＿Ｇ０９）のアミノ酸配列からなる。

【0266】

当業者であれば、ｓｃＦｖ構築物を設計し、翻訳、精製及び検出を支援するためのＮ末端及びＣ末端修飾を含めて作成し得ることを理解されよう。例えば、ｓｃＦｖ配列のＮ末端に、追加のメチオニン及び／またはアラニンアミノ酸残基を、カノニカルＶＨ配列の前に含めてもよい（例えば、開始ＱＶＱまたはＥＶＱ）。Ｃ末端（すなわち、ＩＭＧＴの定義に従って終了するカノニカルＶＬドメイン配列のＣ末端）には、追加の配列、例えば、（ｉ）定常ドメインの部分配列及び／または（ｉｉ）精製及び検出を支援するためのＨｉｓタグ及びＦｌａｇタグなどのタグを含む追加の合成配列を含めてもよい。一実施形態では、配列番号１２４を、配列番号８６、８８～９０、９２～９７のいずれか１つのＣ末端に付加する。一実施形態では、配列番号１２５を、配列番号８６、８８～９０、９２～９７のいずれか１つのＣ末端に付加する。一実施形態では、配列番号１２６を、配列番号８７または９１のいずれか１つのＣ末端に付加する。一実施形態では、配列番号１２７を、配列番号８７または９１のいずれか１つのＣ末端に付加する。前記ｓｃＦｖ ＮまたはＣ末端配列は任意選択であり、別のｓｃＦｖ設計、翻訳、精製または検出戦略を採用する場合、除去、改変または置換され得ることがよく理解される。

【0267】

本明細書に記載されるように、抗体は任意の形式であり得る。好ましい実施形態では、抗体はＩｇＧ１型である。したがって、一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１１１～１２２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１１１～１２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１１１～１１６、例えば、配列番号１１１～１１３及び１１６のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１１７～１２２、例えば、配列番号１１７～１２０のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１１１、１１２、１１６～１２０、例えば、配列番号１１１、１１２もしくは１１６、または配列番号１１７～１２０のアミノ酸配列を含む。

【0268】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１１１～１２２のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１１１～１２２のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。さらに別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１１１～１１６、例えば、配列番号１１１～１１３及び１１６のアミノ酸配列からなる。さらに別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１１７～１２２、例えば、配列番号１１７～１２０のアミノ酸配列からなる。さらに別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１１１、１１２、１１６～１２０、例えば、配列番号１１１、１１２もしくは１１６、または配列番号１１７～１２０のアミノ酸配列からなる。

【0269】

一実施形態では、抗体は、本明細書で定義される抗体もしくはその断片と同じもしくは本質的に同じエピトープに結合するか、またはそれと競合する。当技術分野で公知の日常的な方法を使用することにより、抗体が参照抗Ｖδ１抗体と同じエピトープに結合するか、または結合についてそれと競合するかどうかを容易に判定することができる。例えば、被験抗体が参照抗Ｖδ１抗体と同じエピトープに結合するかどうかを判定するために、参照抗体を、飽和条件下でＶδ１タンパク質またはペプチドに結合させることができる。次に、Ｖδ１鎖に結合する被験抗体の能力を評価する。被験抗体が参照抗Ｖδ１抗体との飽和結合に続いてＶδ１に結合することができる場合、被験抗体は、参照抗Ｖδ１抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方、参照抗Ｖδ１抗体との飽和結合後に被験抗体がＶδ１鎖に結合することができない場合、被験抗体は、参照抗Ｖδ１抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合し得る。

【0270】

本発明はまた、本明細書で定義される抗体もしくはその断片、または本明細書に記載の例示的な抗体のいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体とＶδ１への結合について競合する、抗Ｖδ１抗体を含む。例えば、どのタンパク質、抗体及び他のアンタゴニストがＶδ１鎖への結合について抗体と競合するか及び／またはエピトープを共有するかを判定するために、抗体を用いて競合アッセイを実施することができる。これらのアッセイは、当業者には容易に知られ、タンパク質、例えばＶδ１上の限られた数の結合部位についてのアンタゴニストまたはリガンド間の競合を評価する。抗体（またはその断片）を競合の前後に固定化または不溶化し、Ｖδ１鎖に結合した試料を、例えば、デカント（抗体を事前に不溶化した場合）または遠心分離（抗体が競合反応後に沈殿した場合）によって非結合試料から分離する。また、競合結合は、タンパク質への抗体の結合または結合の欠如によって機能が変化するかどうか、例えば抗体分子が、例えば標識の酵素活性を阻害するかまたは増強するかどうかによって判定され得る。当技術分野で公知でありかつ本明細書に記載されているように、ＥＬＩＳＡ及び他の機能アッセイを使用してもよい。

【0271】

２つの抗体は、それぞれが他方の標的抗原への結合を競合的に阻害（遮断）する場合、同じまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍過剰な１つの抗体は、競合結合アッセイで測定した場合、他方の結合を少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％または９９％までも阻害する。あるいは、一方の抗体の結合を低下または排除する標的抗原の本質的にすべてのアミノ酸変異が、他方の結合を低下または排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。

【0272】

次いで、追加の日常的な実験（例えば、ペプチド変異及び結合分析）を実行して、観察された被験抗体の結合の欠如が、実際に参照抗体と同じエピトープへの結合によるものかどうか、または立体遮断（または、別の現象）が観察された結合の欠如の原因であるかどうかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当技術分野で利用可能な他の任意の定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを使用して実施することができる。

【0273】

いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、Ａｓｎ２９７（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）に連結された糖への改変によって修飾されたエフェクター機能を含む。さらなる前記修飾において、Ａｓｎ２９７は、フコシル化されていないか、または減少したフコシル化を示す（すなわち、脱フコシル化抗体または非フコシル化抗体）。フコシル化には、分子への糖フコースの付加、例えば、Ｎ－グリカン、Ｏ－グリカン及び糖脂質へのフコースの結合が含まれる。したがって、脱フコシル化抗体では、フコースは定常領域の糖鎖に結合していない。抗体を修飾して、抗体のフコシル化を防止または阻害してもよい。一般的には、グリコシル化修飾は、標的改変によるか、または標的もしくは偶然の宿主もしくはクローン選択による、代替グリコシル化プロセシング能力を含む宿主細胞における前記抗体またはその断片の発現を伴う。これら及び他のエフェクターの修飾は、Ｘｉｎｈｕａ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｐｒｏｔｅｉｎ ＆ Ｃｅｌｌ ９：６３－７３及びＰｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ｍＡｂｓ １０（５）：６９３－７１１（本明細書に援用される）による最近の概説でさらに考察されている。

【0274】

抗体配列の改変
既知の方法を使用して、抗体及びその断片を改変してもよい。本明細書に記載の抗体分子への配列改変は、当業者であれば容易に取り入れることができる。以下の例は非限定的である。

【0275】

ファージライブラリ由来の抗体の探索及び配列回収の間に、所望の抗体可変ドメインは、サブクローン化によって完全長ＩｇＧに再編成され得る。プロセスを加速するために、多くの場合、制限酵素を使用して可変ドメインを移す。これらのユニークな制限酵素部位は、付加的／代替的なアミノ酸を導入し、カノニカル配列から離れ得る（そのようなカノニカル配列は、例えば、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ［ＩＭＧＴ］情報システムで見いだされ得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇを参照のこと）。これらは、カッパまたはラムダ軽鎖配列改変として導入され得る。

【0276】

カッパ軽鎖の改変
可変カッパ軽鎖の可変配列は、完全長ＩｇＧに再編成する際に制限酵素部位（例えばＮｈｅ１－Ｎｏｔ１）を使用することによりクローニングされ得る。より具体的には、カッパ軽鎖のＮ末端に、クローニングをサポートするために追加のＡｌａ－Ｓｅｒ配列を導入した。好ましくは、この追加のＡＳ配列を、その後、カノニカルＮ末端配列を作製するようなさらなる開発の間に除去する。したがって、一実施形態では、本明細書に記載の抗体を含有するカッパ軽鎖は、それらのＮ末端にＡＳ配列を含まず、すなわち、配列番号７４、７６～７８及び８０～８５は、最初のＡＳ配列を含まない。さらなる実施形態では、配列番号７４及び７６～７８は、最初のＡＳ配列を含まない。この実施形態は、この配列を含有する本明細書に含まれる他の配列にも適用されることが理解されよう（例えば、配列番号８６、８８～９０及び９２～９７）。

【0277】

クローニングをサポートするために、追加のアミノ酸変更を行ってもよい。例えば、本明細書に記載の抗体の場合、カッパ軽鎖可変ドメイン／定常ドメイン境界で、バリンからアラニンへの変更を導入して、クローニングをサポートした。これにより、カッパ定常ドメインが改変された。具体的には、これにより、定常ドメインは

【0278】

【化1】

【0279】

（ＮｏｔＩ制限酵素部位から）で開始することになる。好ましくは、この配列をさらなる開発中に改変して、

【0280】

【化2】

【0281】

で開始するカノニカルカッパ軽鎖定常領域を作製することができる。したがって、一実施形態では、本明細書に記載の抗体を含有するカッパ軽鎖は、配列ＲＴＶで開始する定常ドメインを含有する。したがって、一実施形態では、配列番号１１１～１１４及び１１７～１２２の配列

【0282】

【化3】

【0283】

を、配列

【0284】

【化4】

【0285】

で置き換える。

【0286】

ラムダ軽鎖の改変
上記のカッパの例と同様に、ラムダ軽鎖可変ドメインも、完全長ＩｇＧに再編成する際に制限酵素部位（例えばＮｈｅ１－Ｎｏｔ１）を導入することによりクローニングされ得る。より具体的には、ラムダ軽鎖のＮ末端に、クローニングをサポートするために追加のＡｌａ－Ｓｅｒ配列を導入してもよい。好ましくは、この追加のＡＳ配列を、その後、カノニカルＮ末端配列を作製するようなさらなる開発の間に除去する。したがって、一実施形態では、本明細書に記載の抗体を含有するラムダ軽鎖は、それらのＮ末端にＡＳ配列を含まず、すなわち、配列番号７５及び７９は、最初のＡＳ配列を含まない。この実施形態は、この配列を含有する本明細書に含まれる他の配列にも適用されることが理解されよう（例えば、配列番号８７、９１、１１５及び１１６）。一実施形態では、配列番号７５は最初の６残基を含まず、すなわち、ＡＳＳＹＥＬ配列が除去されている。

【0287】

別の例として、本明細書に記載の抗体の場合、ラムダ軽鎖可変ドメイン／定常ドメイン境界で、リジンからアラニンへの配列変更を導入して、クローニングをサポートした。これにより、ラムダ定常ドメインが改変された。具体的には、これにより、定常ドメインは

【0288】

【化5】

【0289】

（ＮｏｔＩ制限酵素部位から）で開始することになる。好ましくは、この配列を、さらなる開発中に改変して、

【0290】

【化6】

【0291】

で開始するカノニカルラムダ軽鎖定常領域を作製することができる。したがって、一実施形態では、本明細書に記載の抗体を含有するラムダ軽鎖は、配列ＧＱＰＫで開始する定常ドメインを含有する。したがって、一実施形態では、配列番号１１５または１１６の配列

【0292】

【化7】

【0293】

を、配列

【0294】

【化8】

【0295】

で置き換える。

【0296】

重鎖の改変
通常、ヒト可変重鎖配列は、塩基性グルタミン（Ｑ）または酸性グルタミン酸（Ｅ）のいずれかで開始する。しかしながら、そのような配列は両方とも、その後、酸性アミノ酸残基であるピログルタミン酸（ｐＥ）に変換されることが知られている。ＱからｐＥへの変換により抗体の電荷が変化するが、ＥからｐＥへの変換は抗体の電荷を変化させない。したがって、経時的な電荷変化の変動を回避するための１つの選択肢は、最初に開始重鎖配列をＱからＥに改変することである。したがって、一実施形態では、本明細書に記載の抗体の重鎖は、Ｎ末端にＱからＥへの改変を含有する。特に、配列番号６２、６４及び／または６７～７１の最初の残基を、ＱからＥに改変してもよい。この実施形態は、この配列を含有する本明細書に含まれる他の配列にも適用されることが理解されよう（例えば、配列番号８６、８８、９１～９７及び１１１、１１２、１１５、１１７～１２０）。

【0297】

さらに、ＩｇＧ１定常ドメインのＣ末端はＰＧＫで終結する。しかしながら、末端の塩基性リジン（Ｋ）は、その後多くの場合、発現中に切断される（例えば、ＣＨＯ細胞中で）。これにより、Ｃ末端のリジン残基が様々に失われることにより、抗体の電荷が変化する。したがって、１つの選択肢は、最初にリジンを除去して、ＰＧで終結する均一で一貫した重鎖Ｃ末端配列を生じさせることである。したがって、一実施形態では、本明細書に記載の抗体の重鎖は、そのＣ末端から除去された末端Ｋを有する。特に、本発明の抗体は、末端リジン残基が除去されている配列番号１１１～１２２のいずれか１つを含み得る。

【0298】

任意選択のアロタイプの改変
抗体の探索中に、特定のヒトアロタイプを使用してもよい。任意選択で、抗体を、開発中に異なるヒトアロタイプに切り替えることができる。非限定的な例として、カッパ鎖には、３つのＫｍ対立遺伝子を定義するＫｍ１、Ｋｍ１，２及びＫｍ３と称される３つのヒトアロタイプがある（アロタイプ番号付けを使用）。Ｋｍ１はバリン１５３（ＩＭＧＴ Ｖ４５．１）及びロイシン１９１（ＩＭＧＴ Ｌ１０１）と相関し、Ｋｍ１，２はアラニン１５３（ＩＭＧＴ Ａ４５．１）及びロイシン１９１（ＩＭＧＴ Ｌ１０１）と相関し、Ｋｍ３はアラニン１５３（ＩＭＧＴ Ａ４５．１）及びバリン１９１（ＩＭＧＴ Ｖ１０１）と相関する。したがって、任意選択で、標準的なクローニングアプローチによって、１つのアロタイプから別のアロタイプに配列を改変することができる。例えば、Ｌ１９１Ｖ（ＩＭＧＴ Ｌ１０１Ｖ）の変更により、Ｋｍ１，２アロタイプがＫｍ３アロタイプに変換される。そのようなアロタイプのさらなる詳細については、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９）ＭＡｂｓ１（４）：３３２－８を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。

【0299】

したがって、一実施形態では、本明細書に記載の抗体は、同じ遺伝子の別のヒトアロタイプに由来するアミノ酸置換を含有する。さらなる実施形態では、抗体は、ｃドメインをｋｍ１，２からｋｍ３アロタイプに変換するためのカッパ鎖へのＬ１９１Ｖ（ＩＭＧＴ Ｌ１０１Ｖ）置換を含有する。

【0300】

抗体結合
抗体またはその断片は、表面プラズモン共鳴によって測定される１．５×１０^－７Ｍ（すなわち、１５０ｎＭ）未満の結合親和性（ＫＤ）でγδＴＣＲのＶδ１鎖に結合し得る。好ましい実施形態では、ＫＤは１．５×１０^－７Ｍ（すなわち１５０ｎＭ）未満である。さらなる実施形態では、ＫＤは、１．３×１０^－７Ｍ（すなわち、１３０ｎＭ）以下、例えば１．０×１０^－７Ｍ（すなわち、１００ｎＭ）以下である。さらに別の実施形態では、ＫＤは、５．０×１０^－８Ｍ（すなわち、５０ｎＭ）未満、例えば４．０×１０^－８Ｍ（すなわち、４０ｎＭ）未満、３．０×１０^－８Ｍ（すなわち、３０ｎＭ）未満または２．０×１０^－８Ｍ（すなわち、２０ｎＭ）未満である。例えば、一態様により、表面プラズモン共鳴によって測定される１．５×１０^－７Ｍ（すなわち、１５０ｎＭ）未満の結合親和性（ＫＤ）でγδＴＣＲのＶδ１鎖に結合するヒト抗Ｖδ１抗体を提供する。

【0301】

一実施形態では、抗体またはその断片は、表面プラズモン共鳴によって測定される４．０×１０^－８Ｍ（すなわち、４０ｎＭ）未満、３．０×１０^－８Ｍ（すなわち、３０ｎＭ）未満または２．０×１０^－８Ｍ（すなわち、２０ｎＭ）未満の結合親和性（ＫＤ）でγδＴＣＲのＶδ１鎖に結合する。

【0302】

本明細書に記載の抗体の結合親和性分析を、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５１９５６号（これらは参照により本明細書に援用される）の実施例１及び５に記載されているように実施した。

【0303】

一実施形態では、抗体またはその断片の結合親和性は、抗体またはその断片を直接または間接的に（例えば、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃによる捕捉によって）センサーの表面上（例えば、アミン高容量チップまたは同等物）にコーティングすることによって確立され、その場合、抗体またはその断片と結合した標的（すなわち、γδＴＣＲのＶδ１鎖）をチップ上で流して、結合を検出する。好適には、ＰＢＳ＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０ランニングバッファー中、２５℃、３０μｌ／分でＭＡＳＳ－２機器（Ｓｉｅｒｒａ ＳＰＲ－３２とも称される）を使用する。

【0304】

抗体機能を定義するために使用し得る他のアッセイを、本明細書に記載する。例えば、本明細書に記載の抗体またはその断片を、γδＴＣＲの関与、例えば、抗体結合時のγδＴＣＲの下方制御を測定することによって評価してもよい。抗体またはその断片の適用（任意選択で細胞の表面に提示させる）後に、γδＴＣＲの表面発現を、例えばフローサイトメトリーによって測定することができる。本明細書に記載の抗体またはその断片はまた、γδＴ細胞の脱顆粒を測定することによって評価してもよい。例えば、γδＴ細胞への抗体またはその断片の適用（任意選択で細胞の表面に提示させる）後に、細胞脱顆粒のマーカーであるＣＤ１０７ａの発現を、例えばフローサイトメトリーによって測定することができる。本明細書に記載の抗体またはその断片はまた、γδＴ細胞の殺傷活性を測定することによって評価してもよい（抗体がγδＴ細胞の殺傷活性に影響を与えるかどうかを試験するために）。例えば、標的細胞を、抗体またはその断片の存在下（任意選択で細胞の表面に提示させる）でγδＴ細胞と共にインキュベートしてもよい。インキュベーション後、培養物を細胞生死判別色素で染色して、生きている標的細胞と死んでいる標的細胞を区別してもよい。次いで、死細胞の割合を、例えばフローサイトメトリーによって測定することができる。

【0305】

本明細書に記載されるように、アッセイで使用する抗体またはその断片を、表面、例えば、Ｆｃ受容体を含む細胞などの細胞の表面に提示させてもよい。例えば、抗体またはその断片を、ＴＩＢ－２０２（商標）細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能）などのＴＨＰ－１細胞の表面に提示させてもよい。あるいは、抗体またはその断片を、アッセイで直接使用してもよい。

【0306】

そのような機能アッセイにおいて、「ＥＣ５０」または「５０％有効濃度」とも称される最大濃度の半分を計算することによって、出力を測定してもよい。用語「ＩＣ５０」とは、阻害濃度を指す。ＥＣ５０及びＩＣ５０の両方は、フローサイトメトリー法などの当技術分野で公知の方法を使用して測定してもよい。誤解を避けるために、本出願におけるＥＣ５０の値は、ＩｇＧ１型抗体を使用して提供されている。そのような値は、抗体形式の分子量に基づいて、以下のように同等の値に簡単に変換することができる。
（μｇ／ｍｌ）／（ｋＤａ中のＭＷ）＝μＭ
抗体（または断片）結合時のγδＴＣＲの下方制御のＥＣ５０は、０．５０μｇ／ｍｌ未満、例えば０．４０μｇ／ｍｌ、０．３０μｇ／ｍｌ、０．２０μｇ／ｍｌ、０．１５μｇ／ｍｌ、０．１０μｇ／ｍｌまたは０．０５μｇ／ｍｌ未満であり得る。好ましい実施形態では、抗体（または断片）結合時のγδＴＣＲの下方制御のＥＣ５０は０．１０μｇ／ｍｌ未満である。特に、抗体（または断片）結合時のγδＴＣＲの下方制御のＥＣ５０は、０．０６μｇ／ｍｌ未満、例えば０．０５μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌまたは０．０３μｇ／ｍｌ未満であり得る。特に、前記ＥＣ５０値は、抗体がＩｇＧ１型で測定された場合の値である。例えば、ＥＣ５０ γδＴＣＲ下方制御値は、フローサイトメトリーを使用して測定することができる（例えば、実施例６のアッセイに記載されるように）。

【0307】

抗体（または断片）結合時のγδＴ細胞脱顆粒のＥＣ５０は、０．０５０μｇ／ｍｌ未満、例えば０．０４０μｇ／ｍｌ、０．０３０μｇ／ｍｌ、０．０２０μｇ／ｍｌ、０．０１５μｇ／ｍｌ、０．０１０μｇ／ｍｌまたは０．００８μｇ／ｍｌ未満であり得る。特に、抗体（または断片）結合時のγδＴ細胞脱顆粒のＥＣ５０は、０．００５μｇ／ｍｌ未満、例えば０．００２μｇ／ｍｌ未満であり得る。好ましい実施形態では、抗体（または断片）結合時のγδＴ細胞脱顆粒のＥＣ５０は０．００７μｇ／ｍｌ未満である。特に、前記ＥＣ５０値は、抗体がＩｇＧ１型で測定された場合の値である。例えば、γδＴ細胞脱顆粒のＥＣ５０値は、フローサイトメトリーを使用してＣＤ１０７ａ発現（すなわち、細胞脱顆粒のマーカー）を検出することによって測定することができる（例えば、実施例７のアッセイに記載されるように）。一実施形態では、ＣＤ１０７ａ発現を、抗ヒトＣＤ１０７ａ ＢＶ４２１（クローンＨ４Ａ３）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの抗ＣＤ１０７ａ抗体を使用して測定する。

【0308】

抗体（または断片）結合時のγδＴ細胞殺傷のＥＣ５０は、０．５０μｇ／ｍｌ未満、例えば０．４０μｇ／ｍｌ、０．３０μｇ／ｍｌ、０．２０μｇ／ｍｌ、０．１５μｇ／ｍｌ、０．１０μｇ／ｍｌまたは０．０７μｇ／ｍｌ未満であり得る。好ましい実施形態では、抗体（または断片）結合によるγδＴ細胞殺傷のＥＣ５０は０．１０μｇ／ｍｌ未満である。特に、抗体（または断片）結合によるγδＴ細胞殺傷のＥＣ５０は、０．０６０μｇ／ｍｌ未満、例えば、０．０５５μｇ／ｍｌ未満、特に０．０２０μｇ／ｍｌまたは０．０１０μｇ／ｍｌ未満であり得る。特に、前記ＥＣ５０値は、抗体がＩｇＧ１型で測定された場合の値である。例えば、ＥＣ５０ γδＴ細胞殺傷値は、抗体、γδＴ細胞及び標的細胞のインキュベーション後にフローサイトメトリーを使用して死細胞の割合を検出することによって（すなわち、細胞生死判別色素を使用して）測定することができる（例えば、実施例８のアッセイに記載されるように）。一実施形態では、標的細胞の死を、細胞生死判別色素であるＶｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）５２０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して測定する。

【0309】

これらの態様で説明されるアッセイにおいて、抗体またはその断片を、ＴＨＰ－１細胞、例えばＴＩＢ－２０２（商標）（ＡＴＣＣ）などの細胞の表面に提示させてもよい。ＴＨＰ－１細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）などの色素で任意選択で標識されている。

【0310】

本明細書に記載の抗体の機能分析を、ＷＯ２０２１０３２９６１（ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５１９５６号）の実施例１、６、７及び８に記載されているように実施した（これらは参照により本明細書に援用される）。本明細書に記載の抗体の結合特性及び機能特性の概要を、表３に示す。

【0311】

【表3】

【0312】

抗体（または断片）は、例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２０１２）４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに開示されている技術を使用して取得及び操作することができる。

【0313】

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して、特定の抗体産生Ｂ細胞を、組織培養で増殖する能力及び抗体鎖合成の欠如のために選択される骨髄腫（Ｂ細胞癌）細胞と融合させることによって産生することができる。

【0314】

決定された抗原に対するモノクローナル抗体は、例えば、
ａ）ハイブリドーマを形成するために、決定された抗原で、不死細胞で及び好ましくは骨髄腫細胞で以前に免疫化された動物の末梢血から得られたリンパ球を不死化させ、
ｂ）形成された不死化細胞（ハイブリドーマ）を培養し、所望の特異性を有する抗体を産生する細胞を回収することによって得ることができる。

【0315】

あるいは、ハイブリドーマ細胞を使用する必要はない。本明細書に記載の標的抗原に結合することができる抗体は、例えば、当技術分野で公知のファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、または哺乳動物ディスプレイ技術を使用して、通常の慣例を介して好適な抗体ライブラリから単離され得る。したがって、モノクローナル抗体は、例えば、
ａ）ベクターに、特にファージ及びより具体的には糸状バクテリオファージ、リンパ球、特に動物の末梢血リンパ球から得られたＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列（好適には決定された抗原で以前に免疫されている）にクローニングするステップ、
ｂ）抗体の産生を可能にする条件で、上記のベクターで原核細胞を形質転換するステップ、
ｃ）抗体を抗原親和性選択に供することにより、抗体を選択するステップ、
ｄ）所望の特異性を有する抗体を回収するステップを含むプロセスによって得ることができる。

【0316】

ポリヌクレオチド及び発現ベクター
本発明の方法で使用するための抗Ｖδ１抗体または断片をコードするポリヌクレオチドもまた、提供する。一実施形態では、抗Ｖδ１抗体または断片は、配列番号９９～１１０と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれらからなるポリヌクレオチドによってコードされる。一実施形態では、抗Ｖδ１抗体または断片は、配列番号９９～１１０のＶＨ領域を含む発現ベクターによってコードされる。別の実施形態では、抗Ｖδ１抗体または断片は、配列番号９９～１１０のＶＬ領域を含む発現ベクターによってコードされる。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９９～１１０を含むか、またはそれらからなる。さらなる実施形態では、前記ポリヌクレオチドを含むｃＤＮＡを提供する。

【0317】

一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９９～１１０と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、発現ベクターは、配列番号９９～１１０のＶＨ領域を含む。別の実施形態では、発現ベクターは、配列番号９９～１１０のＶＬ領域を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９９～１１０を含むか、またはそれらからなる。さらなる態様では、前記ポリヌクレオチドを含むｃＤＮＡを提供する。

【0318】

一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９９～１０１または１０５～１０８と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、発現ベクターは、配列番号９９～１０１または１０５～１０８のＶＨ領域を含む。別の実施形態では、発現ベクターは、配列番号９９～１０１または１０５～１０８のＶＬ領域を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９９～１０１または１０５～１０８を含むか、またはそれらからなる。さらなる態様では、前記ポリヌクレオチドを含むｃＤＮＡを提供する。

【0319】

一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９９～１０１と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、発現ベクターは、配列番号９９～１０１のＶＨ領域を含む。別の実施形態では、発現ベクターは、配列番号９９～１０１のＶＬ領域を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９９～１０１を含むか、またはそれらからなる。さらなる態様では、前記ポリヌクレオチドを含むｃＤＮＡを提供する。

【0320】

一実施形態では、ポリヌクレオチドは、コードされた免疫グロブリン鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３をコードする配列番号９９～１１０の一部のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、コードされた免疫グロブリン鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３をコードする配列番号９９～１０１または１０５～１０８の一部のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、コードされた免疫グロブリン鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３をコードする配列番号９９～１０１の一部のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれらからなる。

【0321】

一実施形態では、ポリヌクレオチドは、コードされた免疫グロブリン鎖可変ドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４をコードする配列番号９９～１１０の一部のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、コードされた免疫グロブリン鎖可変ドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４をコードする配列番号９９～１０１または１０５～１０８の一部のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、コードされた免疫グロブリン鎖可変ドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／またはＦＲ４をコードする配列番号９９～１０１の一部のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれらからなる。

【0322】

本発明のポリヌクレオチド及び発現ベクターはまた、コードされたアミノ酸配列を参照して記載され得る。したがって、一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６２～８５のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする配列を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、発現ベクターは、配列番号６２～７３のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。別の実施形態では、発現ベクターは、配列番号７４～８５のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。

【0323】

抗体またはその断片を発現させるために、本明細書に記載の部分長または完全長の軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチドを、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、発現ベクター内に挿入する。したがって、一実施形態では、発現ベクターは、配列番号９９～１１０、例えば、配列番号９９、１００、１０１、１０５、１０６、１０７または１０８のＶＨ領域を含む。別の実施形態では、発現ベクターは、配列番号９９～１１０、例えば、配列番号９９、１００、１０１、１０５、１０６、１０７または１０８のＶＬ領域を含む。

【0324】

本明細書に記載のヌクレオチド配列は、翻訳、精製及び検出を支援するアミノ酸残基をコードする追加の配列を含むが、使用する発現系に応じて別の配列を使用し得ることが理解されるであろう。例えば、配列番号９９～１１０の最初（５’末端）の９ヌクレオチド及び配列番号９９～１００、１０２～１０３、１０５～１１０の最後（３’末端）の３６ヌクレオチド、または配列番号１０１及び１０４の最後（３’末端）の３９ヌクレオチドは、任意選択の配列である。別の設計、翻訳、精製、または検出戦略を採用する場合、これらの任意選択の配列を除去、修飾、または置換することができる。

【0325】

ポリペプチドのアミノ酸配列に関してサイレントであるが特定の宿主における翻訳のための好ましいコドンを提供するポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡに、突然変異を起こすことができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ならびに哺乳動物、特にヒトにおける核酸の翻訳のための好ましいコドンが知られている。

【0326】

ポリペプチドの突然変異は、例えば、ポリペプチドをコードする核酸への置換、付加または欠失によって達成することができる。ポリペプチドをコードする核酸への置換、付加または欠失は、例えば、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、オリゴヌクレオチド指定突然変異、アセンブリＰＣＲ、ＰＣＲ突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、再帰アンサンブル突然変異誘発、指数アンサンブル突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、遺伝子再構築、人工遺伝子合成、遺伝子部位飽和突然変異誘発（ＧＳＳＭ）、合成ライゲーション再構築（ＳＬＲ）、またはこれらの方法の組み合わせを含む多くの方法によって導入され得る。核酸への修飾、付加または欠失はまた、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ウラシル含有テンプレート突然変異誘発、ギャップ二重鎖突然変異誘発、ポイントミスマッチ修復突然変異誘発、修復欠損宿主株突然変異誘発、化学的突然変異誘発、放射性突然変異誘発、欠失突然変異誘発、制限選択突然変異誘発、制限精製突然変異誘発、アンサンブル突然変異誘発、キメラ核酸多量体作製、またはこれらの組み合わせを含む方法によって導入され得る。

【0327】

特に、人工遺伝子合成を使用してもよい。本明細書に記載のポリペプチドをコードする遺伝子は、例えば、固相ＤＮＡ合成によって合成的に生成することができる。前駆体テンプレートＤＮＡを必要とせずに、遺伝子全体をｄｅ ｎｏｖｏ合成してもよい。所望のオリゴヌクレオチドを得るために、ビルディングブロックを、生成物の配列によって必要とされる順序で、成長するオリゴヌクレオチド鎖に連続的に結合させる。鎖構築が完了すると、生成物は固相から溶液に放出され、脱保護され、回収される。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により生成物を単離し、所望のオリゴヌクレオチドを高純度で得ることができる。

【0328】

発現ベクターとして、例えば、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来エピソームが挙げられる。ベクター内の転写及び翻訳制御配列がポリヌクレオチドの転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように、ポリヌクレオチドをベクターにライゲーションする。発現及び／または制御配列は、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、コード配列の５’側の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル及び終止コドンを含み得る。発現ベクター及び発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合するように選択される。配列番号９９～１１０は、合成リンカー（例えば、配列番号９８をコードする）によって連結されたＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、本発明の一本鎖可変断片をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、ＶＨ領域、ＶＬ領域、またはその両方（任意選択でリンカーを含む）を含み得ることが理解されよう。したがって、ＶＨ領域及びＶＬ領域をコードするポリヌクレオチドを別々のベクターに挿入することができ、あるいは両方の領域をコードする配列を同じ発現ベクターに挿入する。ポリヌクレオチド（複数可）を、標準的な方法（例えば、ポリヌクレオチド及びベクターの相補的制限酵素部位のライゲーション、または制限酵素部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入する。

【0329】

便利なベクターは、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードするベクターであり、本明細書に記載されるように、任意のＶＨ配列またはＶＬ配列を容易に挿入及び発現できるように改変された適切な制限酵素部位を有している。発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体（またはその断片）の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが抗体のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ポリヌクレオチドをベクターにクローニングしてもよい。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。

【0330】

宿主細胞は、抗体またはその断片の軽鎖をコードする第１のベクター、及び抗体またはその断片の重鎖をコードする第２のベクターを含み得る。あるいは、重鎖及び軽鎖の両方が、宿主細胞に導入された同じ発現ベクター上にコードされる。一実施形態では、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、抗体またはその断片と融合した膜アンカーまたは膜貫通ドメインをコードし、抗体またはその断片を宿主細胞の細胞外表面に提示させる。

【0331】

形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の既知の方法によるものであり得る。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入する方法は当技術分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチド（複数可）の封入、遺伝子銃注射、ＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションが含まれる。さらに、ウイルスベクターによって核酸分子を哺乳動物細胞に導入してもよい。

【0332】

発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、及び他の多くの細胞株が含まれる。哺乳動物宿主細胞には、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ及びハムスター細胞が含まれる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有するかを判定することによって選択される。使用し得る他の細胞株は、昆虫細胞株、例えばＳｆ９細胞、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞及び真菌細胞である。ｓｃＦｖ断片及びＦｖ断片などの抗体の抗原結合断片は、当技術分野で公知の方法を使用して単離し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させることができる。

【0333】

抗体は、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは宿主細胞が増殖する培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して培地から回収され得る。

【0334】

本発明の抗体（または断片）は、例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２０１２）４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに開示されている技術を使用して取得し、操作することができる。

【0335】

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して、特定の抗体産生Ｂ細胞を、組織培養で増殖する能力及び抗体鎖合成の欠如のために選択される骨髄腫（Ｂ細胞癌）細胞と融合させることによって産生することができる。

【0336】

決定された抗原に対するモノクローナル抗体は、例えば、
ａ）ハイブリドーマを形成するために、決定された抗原で、不死細胞で及び好ましくは骨髄腫細胞で以前に免疫化された動物の末梢血から得られたリンパ球を不死化させ、
ｂ）形成された不死化細胞（ハイブリドーマ）を培養し、所望の特異性を有する抗体を産生する細胞を回収することによって得ることができる。

【0337】

あるいは、ハイブリドーマ細胞を使用する必要はない。本明細書に記載の標的抗原に結合することができる抗体は、例えば、当技術分野で公知のファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、または哺乳動物ディスプレイ技術を使用して、通常の慣例を介して好適な抗体ライブラリから単離され得る。したがって、モノクローナル抗体は、例えば、
ａ）ベクターに、特にファージ及びより具体的には糸状バクテリオファージ、リンパ球、特に動物の末梢血リンパ球から得られたＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列（好適には決定された抗原で以前に免疫されている）にクローニングするステップ、
ｂ）抗体の産生を可能にする条件で、上記のベクターで原核細胞を形質転換するステップ、
ｃ）抗体を抗原親和性選択に供することにより、抗体を選択するステップ、
ｄ）所望の特異性を有する抗体を回収するステップを含むプロセスによって得ることができる。

【0338】

治療方法
本発明の組成物は、臨床応用において特定の用途に用いられる。組成物に存在する三つ組の免疫細胞型の抗がん及び健康な細胞保護活性に加えて、ＮＫ細胞はまた、ウイルス、細菌、または真菌によって引き起こされる感染症と戦う上でも非常に強力である。Ｖδ１Ｔ細胞は、移植患者や治療前のがん患者の場合のように免疫不全患者における重大な問題であるＣＭＶの再活性化に対する認識及び保護の基本であるという確立された実績を有する。ＣＭＶ活性化Ｖδ１は、移植後の広範な免疫抑制剤を使用している患者の二次性悪性腫瘍のリスクを実際に有意に低減する。

【0339】

Ｖδ２Ｔ細胞は、非メバロン酸経路の中間体、すなわち、原核生物と一部の真核生物のみが使用するＨＭＢＰＰを非常に高い親和性で認識するという点でユニークである。これらの細胞は、マイコバクテリア感染を認識して戦う上で基本的に重要であり、活動性感染症の患者の血液中の全Ｔ細胞の５０％超を占め得る。Ｖδ２はまた、原生動物も認識し、マラリアに対する免疫応答に大きく貢献する。

【0340】

したがって、本明細書に記載の組成物は、免疫療法における死亡率に寄与し得るウイルス再活性化及び細菌感染などのがん療法または移植誘発性合併症に対する広範な保護を提供する。一度に１つの細胞型の保護ではカバーすることができないであろう。

【0341】

同じ理由で、この組成物は感染症の治療にも魅力的である。実際、ＮＫ細胞が、コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療のために試験されている。したがって、この組成物を、ＣＯＶＩＤ、ＣＭＶ、ＨＩＶ、マラリア、及び任意のマイコバクテリア感染症の治療に使用してもよい。

【0342】

本発明のさらなる態様により、治療薬に使用するための本明細書で定義される組成物を提供する。

【0343】

本発明のさらなる態様により、がん、感染症または炎症性疾患を治療する方法で使用するための、本明細書で定義される組成物を提供する。

【0344】

本発明の方法によって得られる細胞集団及び組成物はまた、治療に使用してもよい。したがって、本発明のさらなる態様により、医薬品として使用するための、本明細書で定義される方法によって得られる細胞集団を提供する。本明細書における、医薬品としてまたは治療における「使用のための」細胞集団への言及は、対象への細胞集団の投与に限定される。

【0345】

一実施形態では、細胞集団は、がん、感染症または炎症性疾患の治療に使用するためのものである。さらなる実施形態では、細胞集団は、がんの治療に使用するためのものである。

【0346】

本発明のさらなる態様により、医薬品として使用するための、本明細書で定義される細胞集団を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、細胞集団を含む医薬組成物は、がん、感染症または炎症性疾患の治療に使用するためのものである。さらなる実施形態では、細胞集団を含む医薬組成物は、がんの治療に使用するためのものである。

【0347】

本発明のさらなる態様により、本明細書で定義される治療有効量の組成物を投与することを含む、免疫応答の調節を、それを必要とする対象において行う方法を提供する。

【0348】

本発明のさらなる態様により、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む治療有効量の組成物を投与することを含む、がん、感染症または炎症性疾患の治療を、それを必要とする対象において行う方法を提供し、その場合、組成物中に存在するγδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ５６を発現する。前述の組成物について記載された実施形態は、本発明のこの態様に等しく適用され得ることが理解されよう。

【0349】

本発明のさらなる態様により、細胞を含む治療有効量の組成物を投与することを含む、がん、感染症または炎症性疾患の治療を、それを必要とする対象において行う方法を提供し、その場合、少なくとも９０％の細胞がＮＫ細胞とγδＴ細胞からなり、少なくとも１０％の細胞がＶδ１Ｔ細胞であり、少なくとも５％の細胞がＶδ２Ｔ細胞であり、少なくとも３０％の細胞がＮＫ細胞である。

【0350】

本発明のさらなる態様により、例えばがん、感染症または炎症性疾患の治療における、医薬品の製造のための本明細書で定義される細胞集団の使用を提供する。

【0351】

養子Ｔ細胞療法
本発明の方法によって得られる組成物は、例えば養子Ｔ細胞療法のための医薬品として使用してもよい。これには、患者への免疫細胞の移植が含まれる。治療は自家性であってもよく、すなわち、免疫細胞を得た同じ患者に戻してもよく、または治療は同種異系であってもよく、すなわち、ある人の免疫細胞を異なる患者に移してもよい。同種移植を伴う場合、組成物は、αβＴ細胞を実質的に含まない場合がある。例えば、αβＴ細胞を、例えば増殖後に、当技術分野で公知の任意の好適な手段を使用して（例えば、磁気ビーズを使用する陰性選択によって）、組成物から枯渇させてもよい。治療方法は、ドナー個体から得られた試料を提供すること、本明細書に記載のように試料から得られた免疫細胞を培養して、例えば、増殖集団を生成すること、及び培養した免疫細胞をレシピエント個体に投与することを含む。

【0352】

治療しようとする患者または対象は、好ましくは、ヒトがん患者（例えば、固形腫瘍の治療を受けているヒト癌患者）またはウイルス感染患者（例えば、ＣＭＶ感染患者またはＨＩＶ感染患者）である。いくつかの場合では、患者は固形腫瘍を有する及び／または治療中である。それらは通常、非造血組織に常駐しているため、組織常駐のＶδ１Ｔ細胞はまた、全身の血液常駐の対応物よりも腫瘍塊にホーミングして保持される可能性が高く、これらの細胞の養子移入は、固形腫瘍及び潜在的に他の非造血組織関連免疫病理を標的とする際に、より効果的である可能性が高い。

【0353】

γδＴ細胞とＮＫ細胞は非ＭＨＣ拘束性であるため、これらが移植された宿主を異物として認識せず、これは、移植片対宿主病を引き起こす可能性が低いことを意味する。これは、例えば、同種異系養子Ｔ細胞療法のために、それらを「既製品」で使用し、任意のレシピエントに移すことができることを意味する。

【0354】

本明細書に記載の方法によって得られたＭＨＣ非拘束性リンパ球は、ＮＫＧ２Ｄを発現し、ＮＫＧ２Ｄリガンド（例えば、ＭＩＣＡ）に応答する場合があり、これは悪性腫瘍と強く関連している。それらはまた、活性化がなくても細胞傷害プロファイルを発現する可能性があり、したがって、腫瘍細胞を殺傷するのに効果的である可能性が高い。

【0355】

いくつかの実施形態では、腫瘍を有する個体の治療方法は、ドナー個体から得られた前記腫瘍の試料を提供すること、上記のように、試料から得られたＭＨＣ非拘束性リンパ球を培養すること、及びＭＨＣ非拘束性リンパ球の集団を、腫瘍を有する個体に投与することを含み得る。

【0356】

いくつかの場合では、上記の方法のいずれかによって得られた治療有効量のＭＨＣ非拘束性リンパ球を、治療有効量で対象に投与することができる（例えば、がんの治療のために、例えば、固形腫瘍の治療のために）。いくつかの場合では、ＭＨＣ非拘束性リンパ球の治療有効量は、１用量あたり１０×１０^１２細胞未満（例えば、１用量あたり９×１０^１２細胞未満、１用量あたり８×１０^１２細胞未満、１用量あたり７×１０^１２細胞未満、１用量あたり６×１０^１２細胞未満、１用量あたり５×１０^１２細胞未満、１用量あたり４×１０^１２細胞未満、１用量あたり３×１０^１２細胞未満、１用量あたり２×１０^１２細胞未満、１用量あたり１×１０^１２細胞未満、１用量あたり９×１０^１１細胞未満、１用量あたり８×１０^１１細胞未満、１用量あたり７×１０^１１細胞未満、１用量あたり６×１０^１１細胞未満、１用量あたり５×１０^１１細胞未満、１用量あたり４×１０^１１細胞未満、１用量あたり３×１０^１１細胞未満、１用量あたり２×１０^１１細胞未満、１用量あたり１×１０^１１細胞未満、１用量あたり９×１０^１０細胞未満、１用量あたり７．５×１０^１０細胞未満、１用量あたり５×１０^１０細胞未満、１用量あたり２．５×１０^１０細胞未満、１用量あたり１×１０^１０細胞未満、１用量あたり７．５×１０^９細胞未満、１用量あたり５×１０^９細胞未満、１用量あたり２．５×１０^９細胞未満、１用量あたり１×１０^９細胞未満、１用量あたり７．５×１０^８細胞未満、１用量あたり５×１０^８細胞未満、１用量あたり２．５×１０^８細胞未満、１用量あたり１×１０^８細胞未満、１用量あたり７．５×１０^７細胞未満、１用量あたり５×１０^７細胞未満、１用量あたり２．５×１０^７細胞未満、１用量あたり１×１０^７細胞未満、１用量あたり７．５×１０^６細胞未満、１用量あたり５×１０^６細胞未満、１用量あたり２．５×１０^６細胞未満、１用量あたり１×１０^６細胞未満、１用量あたり７．５×１０^５細胞未満、１用量あたり５×１０^５細胞未満、１用量あたり２．５×１０^５細胞未満、または１用量あたり１×１０^５細胞未満）である。

【0357】

いくつかの実施形態では、ＭＨＣ非拘束性リンパ球の治療有効量は、治療過程にわたって、１０×１０^１２細胞未満（例えば、治療過程にわたって、９×１０^１２細胞未満、８×１０^１２細胞未満、７×１０^１２細胞未満、６×１０^１２細胞未満、５×１０^１２細胞未満、４×１０^１２細胞未満、３×１０^１２細胞未満、２×１０^１２細胞未満、１×１０^１２細胞未満、９×１０^１１細胞未満、８×１０^１１細胞未満、７×１０^１１細胞未満、６×１０^１１細胞未満、５×１０^１１細胞未満、４×１０^１１細胞未満、３×１０^１１細胞未満、２×１０^１１細胞未満、１×１０^１１細胞未満、９×１０^１０細胞未満、７．５×１０^１０細胞未満、５×１０^１０細胞未満、２．５未満×１０^１０細胞未満、１×１０^１０細胞未満、７．５×１０^９細胞未満、５×１０^９細胞未満、２．５×１０^９細胞未満、１×１０^９細胞未満、７．５×１０^８細胞未満、５×１０^８細胞未満、２．５×１０^８細胞未満、１×１０^８細胞未満、７．５×１０^７細胞未満、５×１０^７細胞未満、２．５×１０^７細胞未満、１×１０^７細胞未満、７．５×１０^６細胞未満、５×１０^６細胞未満、２．５×１０^６細胞未満、１×１０^６細胞未満、７．５×１０^５細胞未満、５×１０^５細胞未満、２．５×１０^５細胞未満、または１×１０^５細胞未満）である。

【0358】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＭＨＣ非拘束性リンパ球の用量は、約１×１０^６、１．１×１０^６、２×１０^６、３．６×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、１．８×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、または５×１０^８細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ非拘束性リンパ球の用量は、最大約１×１０^６、１．１×１０^６、２×１０^６、３．６×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、１．８×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、または５×１０^８細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ非拘束性リンパ球の用量は、約１．１×１０^６～１．８×１０^７細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ非拘束性リンパ球の用量は、約１×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、または５×１０^９細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ非拘束性リンパ球の用量は、少なくとも約１×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、または５×１０^９細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ非拘束性リンパ球の用量は、最大約１×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、または５×１０^９細胞を含む。

【0359】

一実施形態では、対象の体重１ｋｇあたり１０^４～１０^６のＭＨＣ非拘束性リンパ球を対象に投与する。一実施形態では、対象に、ＭＨＣ非拘束性リンパ球の集団の初期投与（例えば、対象の体重１ｋｇあたり１０^４～１０^６のＭＨＣ非拘束性リンパ球、例えば、対象の体重１ｋｇあたり１０^４～１０^５のＭＨＣ非拘束性リンパ球の初期投与）、及びＭＨＣ非拘束性リンパ球の１回以上（例えば、２、３、４、または５回）のその後の投与（例えば、対象の体重１ｋｇあたり１０^４～１０^６のＭＨＣ非拘束性リンパ球、例えば、対象の体重１ｋｇあたり１０^４～１０^５のＭＨＣ非拘束性リンパ球の１回以上のその後の投与）を与える。一実施形態では、１回以上のその後の投与は、前回の投与から１５日未満、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日後、例えば、前回の投与から４、３、または２日未満で行う。一実施形態では、対象に、ＭＨＣ非拘束性リンパ球集団の少なくとも３回の投与の過程にわたって、対象の体重１ｋｇあたり合計約１０^６のＭＨＣ非拘束性リンパ球を与え、例えば、対象に、１×１０^５のＭＨＣ非拘束性リンパ球の回の初回投与、３×１０^５のＭＨＣ非拘束性リンパ球の２回目の投与、及び６×１０^５のＭＨＣ非拘束性リンパ球の３回目の投与を与え、例えば、各投与を、前回の投与から４、３、または２日未満で行う。

【0360】

いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療薬を対象に投与することができる。追加の治療薬は、免疫療法剤、細胞傷害剤、増殖阻害剤、放射線療法剤、抗血管新生剤、または２つ以上のそれらの薬剤の組み合わせからなる群から選択してもよい。追加の治療薬は、ＭＨＣ非拘束性リンパ球の投与と同時に、投与前、または投与後に投与してもよい。追加の治療薬は免疫療法剤であってもよく、対象の体内の標的（例えば、対象自身の免疫系）及び／または移行させたＭＨＣ非拘束性リンパ球に作用する可能性がある。

【0361】

組成物の投与は、任意の簡便な方法で実施してもよい。本明細書に記載の組成物は、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内注射により、または例えば皮内もしくは皮下注射により腹腔内で、患者に投与してもよい。ＭＨＣ非拘束性リンパ球の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射してもよい。

【0362】

遺伝子改変
本発明の方法によって得られるＭＨＣ非拘束性リンパ球細胞はまた、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法などの治療特性を増強するために遺伝子改変してもよい。これには、新規特異性、例えば、モノクローナル抗体の特異性でＴ細胞を再プログラムするための改変された受容体（例えば、ＣＡＲ）の生成が含まれる。改変された受容体は、リンパ球を悪性細胞に対して特異的にする可能性があり、したがってがん免疫療法に有用である。例えば、リンパ球は、対象組織由来の正常な体細胞によって発現されない腫瘍関連抗原などの腫瘍抗原を発現するがん細胞を認識し得る。したがって、ＣＡＲ改変リンパ球を、例えばがん患者の養子Ｔ細胞療法に使用してもよい。

【0363】

本明細書に記載のすべての実施形態は、本発明のすべての態様に適用され得ることが理解されよう。

【0364】

条項
本発明及びその好ましい態様を定義する条項のセットは以下のとおりである。

【0365】

１．ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びγδＴ細胞を含む単離された組成物であって、前記組成物中に存在する前記γδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である、前記単離された組成物。

【0366】

２．ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む単離された組成物であって、前記組成物中に存在する前記ＮＫ細胞の少なくとも５０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である、前記単離された組成物。

【0367】

３．ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む単離された組成物であって、前記組成物中に存在する前記γδＴ細胞の少なくとも５０％がＣＤ５６を発現する、前記単離された組成物。

【0368】

４．前記組成物中に存在する前記細胞の少なくとも８０％が、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む、条項１～３のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【0369】

５．前記組成物中に存在する前記細胞の少なくとも９０％が、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞からなる、条項１～４のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【0370】

６．前記組成物中に存在する前記細胞の少なくとも２０％がγδＴ細胞である、条項１～５のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【0371】

７．前記組成物中に存在する前記細胞の少なくとも３０％がγδＴ細胞である、条項１～６のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【0372】

８．前記組成物中に存在する前記細胞の８０％未満がγδＴ細胞である、条項１～７のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【0373】

９．前記γδＴ細胞が、Ｖδ１Ｔ細胞及びＶδ２Ｔ細胞を含む、条項１～８のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【0374】

１０．前記組成物中に存在する前記細胞の少なくとも２０％がＮＫ細胞である、条項１～９のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【0375】

１１．前記組成物中に存在する前記細胞の少なくとも３０％がＮＫ細胞である、条項１～１０のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【0376】

１２．細胞を含む単離された組成物であって、前記細胞の少なくとも９０％がＮＫ細胞及びγδＴ細胞からなり、前記細胞の少なくとも１０％がＶδ１Ｔ細胞であり、前記細胞の少なくとも５％がＶδ２Ｔ細胞であり、前記細胞の少なくとも３０％がＮＫ細胞である、前記単離された組成物。

【0377】

１３．前記組成物中に存在する前記γδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ５６を発現する、条項１２に記載の単離された組成物。

【0378】

１４．前記組成物中に存在する前記細胞の８０％未満がγδＴ細胞である、条項１２または条項１３に記載の単離された組成物。

【0379】

１５．前記γδＴ細胞が、Ｖδ１Ｔ細胞を含み、前記Ｖδ１Ｔ細胞の少なくとも１５％がＮＫｐ３０を発現する、条項１～１４のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【0380】

１６．前記γδＴ細胞が、Ｖδ１Ｔ細胞を含み、前記Ｖδ１Ｔ細胞の５０％未満がＣＤ２７を発現する、条項１～１５のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【0381】

１７．前記単離された組成物が、改変されたＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む、条項１～１６のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【0382】

１８．前記改変されたＮＫ細胞及びγδＴ細胞が、キメラ抗原受容体を発現する、条項１７に記載の単離された組成物。

【0383】

１９．治療法で使用するための、条項１～１８のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【0384】

２０．がん、感染症または炎症性疾患の治療方法で使用するための、条項１～１８のいずれか１項に記載の単離された組成物。

【0385】

２１．インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下及びインターロイキン－４（ＩＬ－４）の非存在下で抗ＴＣＲデルタ可変１（抗Ｖδ１）抗体またはその断片を使用してγδＴ細胞及びＮＫ細胞を含む混合細胞集団を刺激すること、ならびに前記混合細胞集団を培養することを含む、非γδ＋ＭＨＣ非拘束性リンパ球の増殖方法。

【0386】

２２．前記混合細胞集団を少なくとも７日間、例えば少なくとも１４日間培養することを含む、条項２１に記載の方法。

【0387】

２３．前記増殖させた非γδ＋ＭＨＣ非拘束性リンパ球の少なくとも５０％がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}である、条項２１または２２のいずれか１項に記載の方法。

【0388】

２４．ＭＨＣ非拘束性リンパ球が濃縮された細胞集団を含む組成物の調製方法であって、前記方法が、
（１）対象から取得した試料を、
（ｉ）抗Ｖδ１抗体またはその断片、及び
（ｉｉ）ＩＬ－１５の存在下、ＩＬ－４の非存在下で培養すること（前記培養の初日から）、及び
（２）前記試料から培養した前記細胞集団を単離することを含む、前記調製方法。

【0389】

２５．前記方法のステップ（１）が、前記試料を少なくとも７日間、例えば少なくとも１４日間培養することを含む、条項２４に記載の方法。

【0390】

２６．前記ＭＨＣ非拘束性リンパ球が、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む、条項２４または条項２５に記載の方法。

【0391】

２７．ステップ（２）で単離した前記細胞集団中に存在する前記ＭＨＣ非拘束性リンパ球の少なくとも７０％がＣＤ５６を発現する、条項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。

【0392】

２８．ステップ（２）で単離した前記細胞集団がγδＴ細胞を含み、前記γδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ５６を発現する、条項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。

【0393】

２９．ステップ（２）で単離した前記細胞集団の８０％未満がγδＴ細胞である、条項２４～２８のいずれか１項に記載の方法。

【0394】

３０．ステップ（２）で単離した前記細胞集団の少なくとも９０％がＮＫ細胞及びγδＴ細胞からなり、前記細胞の少なくとも１０％がＶδ１Ｔ細胞であり、前記細胞の少なくとも５％がＶδ２Ｔ細胞であり、前記細胞の少なくとも３０％がＮＫ細胞である、条項２４～２９のいずれか１項に記載の方法。

【0395】

３１．前記活性化抗Ｖδ１抗体またはその断片が、アミノ酸領域：
（ｉ）配列番号１の３～２０；及び／または
（ｉｉ）配列番号１の３７～７７内に１つ以上のアミノ酸残基を含むγδＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変デルタ１（Ｖδ１）鎖のエピトープに結合する、条項２１～３０のいずれか１項に記載の方法。

【0396】

３２．前記エピトープが、配列番号１のアミノ酸領域５～２０及び６２～７７、５０～６４、３７～５３及び５９～７２、５９～７７、または３～１７及び６２～６９内の１つ以上のアミノ酸残基を含む、条項３１に記載の方法。

【0397】

３３．前記抗Ｖδ１抗体またはその断片が、
配列番号２～２５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ３、
配列番号２６～３７及び配列Ａ１～Ａ１２（表２の）のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ２、及び／または
配列番号３８～６１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＲ１のうちの１つ以上を含む、条項２１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【0398】

３４．前記抗Ｖδ１抗体またはその断片が、配列番号６２～７３のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む、条項２１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【0399】

３５．前記抗Ｖδ１抗体またはその断片が、配列番号７４～８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、条項２１～３４のいずれか１項に記載の方法。

【0400】

３６．前記抗Ｖδ１抗体またはその断片が、配列番号８６～９７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、条項２１～３５のいずれか１項に記載の方法。

【0401】

３７．前記試料が、造血試料またはその画分である、条項２４～３６のいずれか１項に記載の方法。

【0402】

３８．前記造血試料が、末梢血、臍帯血、リンパ組織、胸腺、骨髄、リンパ節組織またはその画分から選択される、条項３７に記載の方法。

【0403】

３９．前記造血試料が、低密度単核球（ＬＤＭＣ）または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からなる、条項３７または条項３８に記載の方法。

【0404】

４０．前記試料を、ヒトまたは非ヒト動物の組織から取得する、条項２４～３９のいずれか１項に記載の方法。

【0405】

４１．前記試料を、前記培養の前にＴ細胞について濃縮する、条項２４～４０のいずれか１項に記載の方法。

【0406】

４２．前記試料から、前記培養の前にαβＴ細胞を枯渇させる、条項２４～４１のいずれか１項に記載の方法。

【0407】

４３．前記培養を、２．５％の血漿を含む培地中で実施する、条項２４～４２のいずれか１項に記載の方法。

【0408】

４４．条項２１～４３のいずれか１項に記載の方法によって得られる組成物。

【0409】

４５．治療法で使用するための、条項４４に記載の組成物。

【0410】

４６．がん、感染症または炎症性疾患の治療方法で使用するための、条項４４に記載の組成物。

【0411】

４７．ＮＫ細胞及びγδＴ細胞を含む治療有効量の組成物を投与することを含む、がん、感染症または炎症性疾患の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記組成物中に存在する前記γδＴ細胞の少なくとも４０％がＣＤ５６を発現する、前記方法。

【0412】

４８．細胞を含む治療有効量の組成物を投与することを含む、がん、感染症または炎症性疾患の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記細胞の少なくとも９０％がＮＫ細胞とγδＴ細胞からなり、前記細胞の少なくとも１０％がＶδ１Ｔ細胞であり、前記細胞の少なくとも５％がＶδ２Ｔ細胞であり、前記細胞の少なくとも３０％がＮＫ細胞である、前記方法。

【0413】

４９．前記方法のステップ（１）が、前記試料を少なくとも１２日間、例えば約１２日間培養することを含む、条項２４～４３のいずれか１項に記載の方法。

【0414】

５０．条項２１～４３または条項４９のいずれか１項に記載の方法によって取得される、ＭＨＣ非拘束性リンパ球が濃縮された細胞集団。

【0415】

５１．治療法に使用するための条項５０に記載の細胞集団。

【0416】

５２．がん、感染症または炎症性疾患の治療方法で使用するための、条項５０に記載の細胞集団。

【0417】

５３．条項２１～４３のいずれか１項に記載の方法によって得られる細胞集団を含む組成物。

【0418】

本発明の他の特徴及び利点は、本明細書に提供される詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、この説明及び特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、当業者には様々な変更及び修正が明らかになるので、例示のためにのみ与えられていることが理解されよう。次に、本発明を、以下の非限定的な実施例を用いて説明する。

【実施例】

【0419】

実施例１．材料及び方法
細胞増殖
下記及び図１に要約される条件下で細胞を増殖させた。

【0420】

条件１：２．５％の同種異系プール血漿（Ｏｃｔａｐｌａｓ、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）及びＧｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補充した無血清培地（ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、αβ－ＴＣＲ＋枯渇末梢血単核球からＶδ１＋γδＴ細胞を生成した。単離した細胞を、組換えＩＬ－４、ＩＬ－１β、ＩＬ－２１、ＩＦＮγ及び可溶性抗Ｖδ１モノクローナル抗体の存在下で播種した（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８－社内抗体クローン）。設定後、加湿インキュベーター内で培養物を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。増殖中の細胞に、新鮮なＩＬ－１５、ＩＬ－２１及び抗Ｖδ１抗体を再補充した。１１～１４日間の培養後に細胞を回収し、混合集団としてＣｒｙｏｓｔｏｒ５（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で凍結保存した。

【0421】

条件２：２．５％の同種異系プール血漿（Ｏｃｔａｐｌａｓ、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）及びＧｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補充した無血清培地（ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、αβ－ＴＣＲ＋枯渇末梢血単核球からＣＤ５６＋リンパ球を生成した。単離した細胞を、組換えＩＬ－１５及び可溶性抗Ｖδ１モノクローナル抗体（社内抗体クローン）の存在下で増殖させた。設定後、加湿インキュベーター内で培養物を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。増殖中の細胞に、新鮮なＩＬ－１５及び抗Ｖδ１抗体を定期的に再補充した。１１～１４日間の培養後に細胞を回収し、混合集団としてＣｒｙｏｓｔｏｒ５（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で凍結保存した。

【0422】

条件３：条件１で記載したように、αβ－ＴＣＲ＋枯渇末梢血単核球からＶδ１＋γδＴ細胞を生成した。しかしながら、組換えＩＬ－４、ＩＬ－１β、ＩＬ－２１及びＩＦＮγならびに可溶性抗Ｖδ１モノクローナル抗体（社内抗体クローン）に加えて、組換えＩＬ－１５の存在下で細胞を播種した。設定後、加湿インキュベーター内で培養物を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。増殖中の細胞に、新鮮なＩＬ－１５、ＩＬ－２１及び抗Ｖδ１抗体を再補充した。１１～１４日間の培養後に細胞を回収し、混合集団としてＣｒｙｏｓｔｏｒ５（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で凍結保存した。

【0423】

細胞純度及び表面表現型のフローサイトメトリー評価
ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１６フローサイトメーターを使用して、免疫表現型検査を実施した。ｅＦｌｕｏｒ ７８０ ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅを使用して死細胞を除外した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ及びＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能な、ＦＩＴＣ抗ＣＤ４５、ＰＥ抗ＴＣＲ α／β、ＡＰＣ抗ＴＣＲγ／δ、ＶｉｏＢｌｕｅ抗ＴＣＲ Ｖδ１、ＦＩＴＣ抗ＣＤ２７、ＰＥ抗ＮＫｐ３０、ＰＥ－Ｖｉｏ７７０抗ＮＫＧ２Ｄ、ＰＥ抗ＣＤ１９、ＰｅｒＣＰ－Ｖｉｏ７７０抗ＣＤ１４、ＰＥ－Ｖｉｏ７７０抗ＣＤ５６、ＡＰＣ抗ＣＤ３、ＰＥ抗ＴＣＲ Ｖδ３及びＰＥ－Ｖｉｏ７７０抗ＴＣＲ Ｖδ２抗体を使用して、表面マーカーの発現について細胞を分析した。

【0424】

ＣＤ１９キメラ抗原受容体をコードするレンチウイルスによる形質導入
ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコーティング（２０μｇ／ｍＬ）し、非組織培養処理した２４ウェルプレート中で、ＣＤ１９標的化キメラ抗原受容体をコードするレンチウイルスベクターを、条件１及び２由来の増殖細胞に形質導入した。ウイルスベクターを、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（ＩＬ－１５及び抗Ｖδ１抗体を補充した）で希釈した免疫細胞と混合し、３２℃、８００×ｇで４５分間遠心接種した。形質導入の４日後にフローサイトメトリーによって形質導入効率を決定した。

【0425】

凍結保存培養物の解凍
凍結したクライオバイアルを３７℃のウォーターバスで解凍し、事前に加温したＯｐＴｍｉｚｅｒ＋２．５％同種異系血漿に加えた。細胞を３００ｇで７分間遠沈し、計数して生存率を評価し、次いで表現型解析及び下流のアッセイのために１ｍＬあたり２×１０^６細胞で再懸濁した。

【0426】

細胞傷害性アッセイ
条件１～３で増殖させた細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ標識ＮＡＬＭ－６腫瘍標的細胞と共に、９６ウェル丸底プレート中で様々なエフェクター対標的比で共培養した。対照（Ｃｔｒｌ）は、エフェクター細胞の非存在下で標的細胞のみを試験した。２０時間後、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１０フローサイトメーターでの取得前にＳＹＴＯＸ ＡＡＤＶＡＮＣＥＤ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎを培養液に加えた。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）染色により、ＮＡＬＭ－６腫瘍細胞が同定され、ＳＹＴＯＸに対して陽性であることにより、死細胞と生細胞を区別した。

【0427】

実施例２．細胞培養条件の比較
実施例１に記載し、図１に要約されている条件１～３のうちの１つを使用して、細胞集団を増殖させた。次いで、増殖した細胞集団を分析し、比較した。

【0428】

回収時の細胞収量を図２に示す。条件２では、条件１と同等の細胞収量が得られる。条件３では、条件１に比べて細胞収量が増加する。

【0429】

免疫細胞組成を分析した。条件１及び３では、Ｖδ１Ｔ細胞が高度に濃縮された集団が生成されるが、条件２では、Ｖδ１＋、Ｖδ２＋及びＮＫ細胞を含む混合集団が生成された。したがって、条件２は予想外に、すべてのＭＨＣ非拘束性リンパ球の同時濃縮を示した。結果を図３に示す。条件２を使用して培養した３人のドナー由来の個々の細胞組成を表４にまとめる。

【0430】

【表4】

【0431】

Ｖδ１Ｔ細胞の表面表現型を分析した。条件１及び３に由来するＶδ１Ｔ細胞は、ＣＤ２７及びＮＫＧ２Ｄに対して陽性である。条件２に由来するＶδ１Ｔ細胞では、条件１及び３に比べてＣＤ２７の発現が少ないが、ＮＫｐ３０の発現が多く、これはエフェクター表現型と一致する。結果を図４に示す。

【0432】

実施例３．抗Ｖδ１抗体の比較
条件２を使用して、ただし異なる抗体の存在下で細胞集団を増殖させた。結果を図５に示す。条件２における２つの個別の社内抗Ｖδ１抗体クローン（１２５２＿Ｐ０１＿Ｃ０８及び１２４５＿Ｐ０１＿Ｂ０７）を使用することにより、ＮＫ細胞とγδ細胞が濃縮される。これを、γδＴ細胞のみを効果的に濃縮する抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ－３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と比較する。

【0433】

実施例４．細胞組成物の細胞傷害性
条件１～３によって生成された細胞組成物を、実施例１に記載の細胞傷害性アッセイにおいて、１：１の低いエフェクター：標的比を用いて試験した。条件２は最大の細胞傷害活性を示したが、条件１と３の両方がＮＡＬＭ－６腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を著しく増強した（図６Ａ）。殺傷の増強は、条件間のＣＤ５６発現と相関している（図６Ｂ）。

【0434】

ＣＤ５６表面発現を、フローサイトメトリーによる染色強度の分析によっても測定した。条件２は、固有のＰＢＭＣレベルと比較して、Ｖδ１細胞及びＶδ２細胞でのＣＤ５６発現強度を大幅に高める（図７）。さらに、最初のＰＭＢＣ出発物質と比較して、条件２の回収から得られたγδ細胞集団とＮＫ細胞集団の両方でＣＤ５６－ｂｒｉｇｈｔ細胞の存在量の増加が示されている（図８）。

【0435】

実施例５．保存後の細胞の機能性
凍結とその後の解凍の保存ステップ後の細胞の機能性も調査した。条件１及び２を使用して培養した細胞の一部を１１～１４日目に取り出し、凍結した。次いで、細胞を実施例１に記載のように解凍した。凍結保存後の条件１と２との間で細胞の生存率及び回収率は同等である（図９）。

【0436】

条件２を使用した増殖後に凍結保存した細胞の表現型も分析した。条件２は、凍結保存前後で同等の免疫細胞組成と細胞表面表現型を示す（図１０）。

【0437】

最後に、凍結保存後の細胞の細胞傷害性を調べた。条件２は、条件１と比較して、エフェクター対標的比の範囲にわたって、凍結保存後のＮＡＬＭ－６腫瘍細胞に対する細胞傷害性の増強を示す（図１１）。

【0438】

実施例６．細胞組成物の形質導入
条件２を用いて得られた細胞組成物を、実施例１に記載されるようにレンチウイルスベクターで形質導入した。条件２で産生された細胞は、条件１と比べて形質導入に対する許容性の向上を示す（図１２）。さらに、ＣＡＲを形質導入する条件２は、ＮＡＬＭ－６細胞に対する細胞傷害性をさらに高め、１：１００の低いエフェクター対標的比で殺傷が観察される（図１３）。

【0439】

実施例７．最適化された方法の条件
方法をさらに最適化した。以下の変更を加えて、実施例１の条件２に記載のように、αβ－ＴＣＲ＋枯渇末梢血単核球からＣＤ５６＋リンパ球を生成した。培地には、１×ＮＫサプリメント（ＮＫ ＭＡＣＳ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）が含まれていた。特に明記しない限り、可溶性抗Ｖδ１モノクローナル抗体は培養の開始時にのみ提供し、それ以上添加しなかった。社内可溶性抗Ｖδ１モノクローナル抗体（ＷＯ２０２１０３２９６１に記載される）のＣ０８及びＧ０４の両方を試験し、同様の結果を得たが、特定されない限り、Ｃ０８を使用した。増殖状態を示すＫｉ－６７発現が低下するという観察に基づいて特に明記しない限り、細胞を１１日目（１２日間の増殖）に回収した。

【0440】

この方法はロバストであり、より短いＤ１１の回収及び０日目での可溶性抗Ｖδ１モノクローナル抗体の単回供給により、適切な細胞型で良好な細胞増殖が得られることが判明した（図１４）。追加のドナーを使用して実験を繰り返すと、このプロセスのロバスト性がさらに示される（図１５）。培養容量、開始時の細胞密度、容器の種類、ＮＫサプリメントの添加などの他のパラメーターは、悪影響を及ぼさないか、または多少のプラス効果をもたらした（データは示さず）。

【0441】

さらに、各細胞型由来の細胞で、ＣＤ５６の発現レベルが増加し（ＭＦＩの増加によって示されるように、図１６Ａ）、通常はＣＤ５６の高発現細胞ではないγδ細胞画分のＣＤ５６陽性率も増加した（図１６Ｂ）。ＣＤ５６発現の増加は、細胞傷害性の増加と相関する（図１６Ｃ）。

【0442】

最後に、細胞表面のケモカイン受容体の発現レベルを図１７に示す。これは、これらの細胞が広範囲の細胞型を標的にする可能性があることを示している。

【0443】

実施例８．γレトロウイルスベクターによる形質導入
図１４Ａに記載するように細胞を培養した。比較として、以下の例外を除いて実施例１の条件２に記載のように細胞を播種し、培養した：可溶性抗Ｖδ１モノクローナル抗体の代わりに可溶性抗ＣＤ３モノクローナル抗体（クローンＯＫＴ３）を使用した。次いで、細胞を、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体をコードするＧＡＬＶまたはＲＤ１１４偽型γ－レトロウイルスベクターで形質導入した。ウイルスベクターをＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒで希釈し、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコーティング（２０μｇ／ｍＬ）され、非組織培養物でコーティングされた６ウェルプレートに、遠心分離（２０００×ｇ、３２℃で２時間）により接着させた。培養した細胞を、ウイルスをプレロードしたプレートに移した。細胞を３２℃で４５分間、８００×ｇで遠心分離するか（「スピン」）、または静置した（「スピンなし」）。形質導入の６日後にフローサイトメトリーによって形質導入効率を決定した（図１８Ａ）。

【0444】

本方法のＣＤ５６＋細胞は、ＣＤ５６－細胞よりもはるかに形質導入能が高いことも示された（図１８Ｂ）。これは、ＣＤ５６の状態による影響が少なかったＷＯ２０２１０３２９６１の方法によって生成された細胞とは異なる（図１８Ｃ）。

【0445】

ヘムを標的としたＣＡＲ（ＣＤ１９）で形質導入された場合、細胞組成物は血液系の標的を殺傷することができることが以前に示されている。図１９は、メソテリンを標的とするＣＡＲで形質導入された場合、細胞組成物が、固形腫瘍標的を効率的に殺傷することができることを示している。実際、本発明の形質導入されていない組み合わせの細胞集団は、従来のＣＡＲ発現αβＴ細胞と同等またはそれ以上の性能を発揮するが（最も下側の線）、ＣＡＲを発現する組み合わせの細胞集団は、両方を実質的に上回る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図19】

【配列表】

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【国際調査報告】