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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-25
(54)【発明の名称】真核生物ＤＮＡ複製起点、及びそれを含むベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/85 20060101AFI20230915BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20230915BHJP
A01K 67/027 20060101ALI20230915BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230915BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20230915BHJP
C12P 21/00 20060101ALN20230915BHJP
【ＦＩ】
C12N15/85 Z
C12N15/10 Z ZNA
A01K67/027
C12N5/10
C12Q1/6806 Z
C12P21/00 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023515074
(86)(22)【出願日】2021-09-06
(85)【翻訳文提出日】2023-03-03
(86)【国際出願番号】 EP2021074523
(87)【国際公開番号】W WO2022049295
(87)【国際公開日】2022-03-10
(31)【優先権主張番号】20305987.8
(32)【優先日】2020-09-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】594016872
【氏名又は名称】サントル、ナショナール、ド、ラ、ルシェルシュ、シアンティフィク、（セーエヌエルエス）
(71)【出願人】
【識別番号】515011944
【氏名又は名称】ウニヴェルシテ・ドゥ・モンペリエ
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】マルセル、メシャリ
(72)【発明者】
【氏名】イルデム、アケルマン
(72)【発明者】
【氏名】ナデージュ、ガボリ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA05
4B063QA13
4B063QQ02
4B063QQ42
4B063QR48
4B063QR73
4B063QR77
4B063QR80
4B063QS14
4B063QS38
4B064AG01
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA46
(57)【要約】
本発明は、哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点を単離する方法に関し、方法は、
－ゲノムＤＮＡ分子を分離する工程と、
－ＤＮＡ分子内の５００ｂｐウインドウを同定する工程と、
－ゲノムＤＮＡ分子から５００ｐｂ～６０００ｐｂのサイズのフラグメントを単離する工程と、
－真核生物細胞のＤＮＡに含まれる場合、新生ＤＮＡを生成し、ＤＮＡ複製を開始できるＤＮＡ複製起点を選択する工程と、
－当該起点を単離する工程と、を含む。
－ゲノムＤＮＡ分子を分離する工程と、
－ＤＮＡ分子内の５００ｂｐウインドウを同定する工程と、
－ゲノムＤＮＡ分子から５００ｐｂ～６０００ｐｂのサイズのフラグメントを単離する工程と、
－真核生物細胞のＤＮＡに含まれる場合、新生ＤＮＡを生成し、ＤＮＡ複製を開始できるＤＮＡ複製起点を選択する工程と、
－当該起点を単離する工程と、を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点を単離する方法であって、ａ－哺乳動物の体細胞からゲノムＤＮＡ分子を単離する工程と、
ｂ－前記ゲノムＤＮＡ分子を、該ゲノムＤＮＡ分子に沿って１００ｐｂごとに５００ｂｐウインドウに分割する工程と、
ｃ－－前記第１の５００ｂｐウインドウが少なくとも１７２のＧヌクレオチドを有し、
－－前記第１の５００ｂｐウインドウが少なくとも１０５のＡ又はＴヌクレオチドを有し、
－－前記ウインドウの３’端で前記第１の５００ｂｐウインドウに直接隣接する第２の５００ｂｐウインドウが、１７２より低く、１２５より高いＧ含有量を有し、
前記第１の５００ｂｐウインドウと前記第２の５００ｂｐウインドウとの間のＧ含有量の変動が、８％～４０％の範囲であり、
－－第３の５００ｂｐウインドウが隣接する第４の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第５の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する前記第１の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する前記第２の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第６の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第７の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第８の５００ｂｐウインドウによって構成される８つの連続した５００ｂｐウインドウからなる大きなウインドウ内のＧ含有量が、９６０より高い
ように、第１の５００ｂｐウインドウを特定する工程と、
－－前記ゲノムＤＮＡ分子から、推定哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点に対応する５００ｂｐ～６０００ｂｐのサイズを有するフラグメントを単離する工程であって、前記推定哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点は、前記第１の５００ｂｐウインドウのその５’末端にある、工程と、
－真核生物細胞のＤＮＡに含まれる場合、新生ＤＮＡを生成し、ＤＮＡ複製を開始することができるフラグメントを、前記推定哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点から選択する工程と、
－前記フラグメントを単離する工程あって、前記フラグメントは、哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点である、工程と、
を含む、哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点を単離する方法。
【請求項2】
前記推定哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点が、５００ｂｐ～４０００ｂｐの変化するサイズを有する、請求項１に記載の哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点を単離する方法。
【請求項3】
フラグメントの前記第１の５００ｂｐウインドウがＯＲＣ１又はＯＲＣ２複製開始因子と相互作用する、請求項１又は２に記載の哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点を単離する方法。
【請求項4】
前記第１の５００ｐｂウインドウに直接隣接する配列が、－最大１２回存在する複数のタンデムＧ４構造、又は
－Ｇ－ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｅｄ Ｅｌｅｍｅｎｔ、若しくはＯＧＲＥ、あるいは
－両方である、請求項１～３のいずれか一項に記載の哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点を単離する方法。
【請求項5】
前記フラグメントが７１６ｐｂのコア開始起点配列を含み、前記コア開始起点配列が新生ＤＮＡフラグメント配列に相補的である、請求項１～４のいずれか一項に記載の哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点を単離する方法。
【請求項6】
前記フラグメントが、ポリコームタンパク質結合部位又はヒストンアセチル化マーク、あるいはその両方を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点を単離する方法。
【請求項7】
配列番号１及び配列番号３～配列番号４３，１７７、及び配列番号４３，２２０～４３，２８８に記載の配列のうちの１つを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法により得られやすい、単離及び精製された、哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点。
【請求項8】
配列番号１～配列番号４３，１７７、及び配列番号４３，２２０～４３，２８８に記載の配列のうちの１つからなる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法により得られやすい、単離及び精製された、哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点。
【請求項9】
－請求項７～８のいずれか一項に記載の哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点と、－少なくとも、真核生物細胞を殺す化合物に対する耐性を可能にするタンパク質をコードする配列と、
－前記哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点とは独立した、目的の遺伝子の挿入及びその発現を可能とする領域と、
を含む、ベクター。
【請求項10】
－原核生物複製起点と、－抗生物質に対する耐性を可能にするタンパク質をコードする配列と、
を更に含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項11】
配列番号４３，２９０～４３，３５８に記載の配列酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項９又は１０に記載のベクター。
【請求項12】
請求項９～１１のいずれか一項に記載のベクターを含む、哺乳動物細胞。
【請求項13】
請求項１２に記載の細胞を含む、非ヒト哺乳動物。
【請求項14】
目的の遺伝子を哺乳動物細胞においてインビトロ又はエクスビボで発現させるための、請求項９～１１のいずれか一項に記載のベクターの使用であって、その配列が前記哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点とは独立した領域において前記ベクターに挿入されている、請求項９～１１のいずれか一項に記載のベクターの使用。
【請求項15】
請求項１に記載の方法の工程ｂ～ｃを実行するための命令を含む適切なサポート上に実装された、コンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、真核生物ＤＮＡ複製起点及びそれを含むベクターに関する。
【背景技術】
【0002】
各細胞分裂中に、ヒト細胞はＳ期の時間制約内で約２メートルのＤＮＡを複製する。これを達成するために、ＤＮＡ複製は、ＤＮＡ複製起点と呼ばれ、ゲノム全体に広がっている何千もの領域から開始される。ゲノム内のＤＮＡ複製開始部位（ＩＳ）の位置（起点の仕様）は、後生動物ではよくわかっていない。原核生物及びウイルスでは、通常、単一の配列特異的な起点が存在するが、真核生物のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、ＤＮＡ複製は、酵母複製起点認識複合体（ｏｒｉｇｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＯＲＣ）によって結合されたＡＴ－ｒｉｃｈなコンセンサス配列から開始される。対照的に、ショウジョウバエ及びマウス細胞では、ＩＳの約３００ｂｐ上流にＧ－ｒｉｃｈ ＤＮＡ配列要素（Ｏｒｉｇｉｎ Ｇ－ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｅｄ Ｅｌｅｍｅｎｔ、ＯＧＲＥ）が存在することが、６０％を超える起点で報告されている。ＣＡ／ＧＴ－ｒｉｃｈモチーフ及びｐｏｌｙ－Ａ／Ｔトラックも、マウス細胞のＩＳで検出されている。ＯＧＲＥ要素には、ヌクレオソームのない領域に、ＣｐＧアイランド（ＣｐＧｉ）及び潜在的なＧ－四重鎖（Ｇ４）要素が含まれ得る。しかし、ゲノム内の全ての推定Ｇ４要素の一部のみが近くの起点をホストし、ＣｐＧｉは起点の一部にのみ存在する。これは、他の特性が複製起点の選択又は活性化に寄与していることを示している。
【0003】
そのため、複製起点がどのように機能するか、及びそれらを同定する方法をよりよく理解する必要がある。
【0004】
マウスでは、哺乳動物の複製起点に関するいくつかの情報が知られている。
【0005】
例えば、国際出願の国際公開第２０１１０２３８２７号は、複製起点コアの配列、特にＯＧＲＥ配列を開示している。しかし、この文書は、完全に機能する複製起点又はヒトゲノムの起点の配列を開示していない。
【発明の概要】
【0006】
したがって、本発明の１つの目的は、この欠点を取り除くことである。
【0007】
本発明の別の目的は、適切な状況で、自己複製できる機能的ＤＮＡ配列を同定及び単離する方法を提供することである。
【0008】
本発明の更なる目的は、宿主哺乳動物細胞において染色体と同様に複製できるＤＮＡベクターを提供することであり、これらのベクターは機能的な哺乳動物複製起点を含むためである。
【0009】
したがって、本発明は、哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点を単離するための方法に関し、方法は、
ａ－哺乳動物の体細胞からゲノムＤＮＡ分子を単離する工程と、
ｂ－ゲノムＤＮＡ分子を、当該ゲノムＤＮＡ分子に沿って１００ｐｂごとに５００ｂｐウインドウに分割する工程と、
ｃ－
Ｏ第１の５００ｂｐウインドウが少なくとも１７２のＧヌクレオチドを有し、
Ｏ第１の５００ｂｐウインドウが１０５以下のＡ又はＴヌクレオチドを有し、
Ｏウインドウの３’末端で第１の５００ｂｐウインドウに直接隣接する第２の５００ｂｐウインドウが、１７２より低く、１２５より高いＧ含有量を有し、
第１の５００ｂｐウインドウと第２の５００ｂｐウインドウとの間のＧ含有量の変動が、８％～４０％の範囲であり、
Ｏ第３の５００ｂｐウインドウが隣接する第４の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第５の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第１の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第２の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第６の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第７の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第８の５００ｂｐウインドウによって構成される８つの連続した５００ｂｐウインドウからなる大きなウインドウ内のＧ含有量が、９６０より高いように、第１の５００ｂｐウインドウを特定する工程と、
ｄ－ゲノムＤＮＡ分子から、推定哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点に対応する５００ｂｐ～６０００ｂｐまでのサイズを有するフラグメントを単離する工程であって、推定哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点が、第１の５００ｂｐウインドウのその５’末端にある、工程と、
ｅ－真核生物細胞のＤＮＡに含まれる場合、新生ＤＮＡを生成し、ＤＮＡ複製を開始することができるフラグメントを、当該推定哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点から選択する工程と、
ｆ－哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点である当該フラグメントを単離する工程と、を含む。
ａ－哺乳動物の体細胞からゲノムＤＮＡ分子を単離する工程と、
ｂ－ゲノムＤＮＡ分子を、当該ゲノムＤＮＡ分子に沿って１００ｐｂごとに５００ｂｐウインドウに分割する工程と、
ｃ－
Ｏ第１の５００ｂｐウインドウが少なくとも１７２のＧヌクレオチドを有し、
Ｏ第１の５００ｂｐウインドウが１０５以下のＡ又はＴヌクレオチドを有し、
Ｏウインドウの３’末端で第１の５００ｂｐウインドウに直接隣接する第２の５００ｂｐウインドウが、１７２より低く、１２５より高いＧ含有量を有し、
第１の５００ｂｐウインドウと第２の５００ｂｐウインドウとの間のＧ含有量の変動が、８％～４０％の範囲であり、
Ｏ第３の５００ｂｐウインドウが隣接する第４の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第５の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第１の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第２の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第６の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第７の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第８の５００ｂｐウインドウによって構成される８つの連続した５００ｂｐウインドウからなる大きなウインドウ内のＧ含有量が、９６０より高いように、第１の５００ｂｐウインドウを特定する工程と、
ｄ－ゲノムＤＮＡ分子から、推定哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点に対応する５００ｂｐ～６０００ｂｐまでのサイズを有するフラグメントを単離する工程であって、推定哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点が、第１の５００ｂｐウインドウのその５’末端にある、工程と、
ｅ－真核生物細胞のＤＮＡに含まれる場合、新生ＤＮＡを生成し、ＤＮＡ複製を開始することができるフラグメントを、当該推定哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点から選択する工程と、
ｆ－哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点である当該フラグメントを単離する工程と、を含む。
【0010】
本発明は、上述の方法を実施することによってコアＤＮＡ複製起点を同定及び単離することができるという本発明者等による観察に基づいている。
【0011】
この方法は、完全に活性であり、全ての哺乳動物のゲノムに存在する哺乳動物の複製起点を同定することができる。
【0012】
本発明による方法は、コア起点配列を同定する工程と、実験データと一致する配列を選択する工程と、の２つの工程で実行される。
【0013】
工程ａ）。
工程Ａでは、哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡを、フェノール／クロロホルム法等の当技術分野で周知の１つの方法に従って抽出し、配列決定し、生物情報学的に組み立てる。
工程Ａでは、哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡを、フェノール／クロロホルム法等の当技術分野で周知の１つの方法に従って抽出し、配列決定し、生物情報学的に組み立てる。
【0014】
それ以外の場合、工程ａを実行するために、データベースで公開されているゲノムの配列を使用できる。例えば、マウス及びヒトのゲノム等について、ゲノムの完全な配列は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（ＵＣＳＣ）のゲノムブラウザ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕで入手可能）で入手できる。
【0015】
当業者は、その目的のためにＤＮＡの抽出を適合させることができる。
【0016】
工程ｂ）及びｃ）
これらの２つの工程は、識別工程に対応する。
これらの２つの工程は、識別工程に対応する。
【0017】
工程ｂ）は、哺乳動物細胞に含まれるＤＮＡ分子の配列を得た後に実施される。その目的のために、ＤＮＡ分子の完全な配列、すなわち哺乳動物細胞に含まれる各染色体のＤＮＡの完全な配列を得るために、任意の配列決定技術を使用することができる。これに、ゲノムの完全な配列を取得するためのＤＮＡ配列のアセンブリが続く。
【0018】
配列を取得した後、配列は分子に沿って１００ｂｐごとに５００ｂｐウインドウに分割される（スライディングウインドウ法とも呼ばれる）。これは、Ｗａｔｓｏｎ鎖及びＣｒｉｃｋ鎖の両方で行われる。
【0019】
例えば、１０００ｂｐ分子では、６つの５００ｐｂウインドウ、位置１～位置５００、位置１００～位置６００、位置２００～位置７００、位置３００～位置８００、位置４００～位置９００及び位置５００～位置１０００が取得され得る。したがって、完全なヒトゲノムでは、多くの５００ｂｐが生成され得る。
【0020】
この工程は、例えばｂｅｄｔｏｏｌｓスイート等のコンピュータプログラムによって簡単に実行できる。
【0021】
工程ｃは、形式的には目的の配列の選択工程である。本発明者等は、哺乳動物における複製起点が、以下の基準を満たす５００ｂｐ領域を含むことを同定する。
【0022】
－目的の５００ｂｐウインドウは、少なくとも１７２のＧヌクレオチド、及び１０５以下のＡ又はＴヌクレオチドを有する。
【0023】
－決定された５００ｂｐウインドウを考慮する場合、５００ｐｂの３’末端で開始する直接隣接する５００ｂｐウインドウは、ウインドウが、１７２より低く、１２５より高いＧ含有量を有することを決定し、決定された５００ｂｐウインドウとそれに隣接するウインドウとの間のＧ含有量の変動は、８％～４０％の範囲である。ここでこれは、５００ｂｐウインドウが１７２ｂｐを含む場合、隣接領域のＧ含有量が１２５～１５８まで変化することを意味し（実際には１０５～１５８であるが、Ｇ含有量は１２５よりも高いため、範囲は１２５～１５８である）、
－第３の５００ｂｐウインドウが隣接する第４の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第５の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第１の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第２の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第６の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第７の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第８の５００ｂｐウインドウによって構成される８つの連続した５００ｂｐウインドウからなる大きなウインドウでは、８つの連続したウインドウに沿った平均Ｇ含有量は、９６０より高い。
－第３の５００ｂｐウインドウが隣接する第４の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第５の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第１の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第２の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第６の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第７の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第８の５００ｂｐウインドウによって構成される８つの連続した５００ｂｐウインドウからなる大きなウインドウでは、８つの連続したウインドウに沿った平均Ｇ含有量は、９６０より高い。
【0024】
実施例で述べたように、本発明者等は、哺乳動物の複製起点は、厳密な意味でコンセンサス配列を共有していないにもかかわらず、転写開始部位の５’に５００ｐｂのＧ－ｒｉｃｈ領域が存在し、開始部位の３’では、この領域はＧ－ｒｉｃｈ領域ではないことを特徴とする。これは、図７２の左パネルに明確に示されている。
【0025】
ここでも、この工程はコンピュータプログラムによって実行することができる。
【0026】
哺乳動物細胞のゲノムに沿って、上記の基準を満たす全ての５００ｂｐウインドウを特定した後、工程ｄ）が実行される。
工程ｄ）
工程ｄ）
【0027】
工程ｄ）において、目的の５００ｂｐウインドウが特定された場合、５００ｐｂ～６０００ｂｐのサイズを有するゲノムのフラグメントが選択される。これらのフラグメントは、複製起点を含み得るＤＮＡの分子に対応する。それらは「推定複製起点」と呼ばれる。
【0028】
「５００ｂｐ～６０００ｂｐ」とは、本発明において、５００ｂｐ、５１０ｂｐ、５２０ｂｐ、５３０ｂｐ、５４０ｂｐ、５５０ｂｐ、５６０ｂｐ、５７０ｂｐ、５８０ｂｐ、５９０ｂｐ、６００ｂｐ、６１０ｂｐ、６２０ｂｐ、６３０ｂｐ、６４０ｂｐ、６５０ｂｐ、６６０ｂｐ、６７０ｂｐ、６８０ｂｐ、６９０ｂｐ、７００ｂｐ、７１０ｂｐ、７２０ｂｐ、７３０ｂｐ、７４０ｂｐ、７５０ｂｐ、７６０ｂｐ、７７０ｂｐ、７８０ｂｐ、７９０ｂｐ、８００ｂｐ、８１０ｂｐ、８２０ｂｐ、８３０ｂｐ、８４０ｂｐ、８５０ｂｐ、８６０ｂｐ、８７０ｂｐ、８８０ｂｐ、８９０ｂｐ、９００ｂｐ、９１０ｂｐ、９２０ｂｐ、９３０ｂｐ、９４０ｂｐ、９５０ｂｐ、９６０ｂｐ、９７０ｂｐ、９８０ｂｐ、９９０ｂｐ、１０００ｂｐ、１０１０ｂｐ、１０２０ｂｐ、１０３０ｂｐ、１０４０ｂｐ、１０５０ｂｐ、１０６０ｂｐ、１０７０ｂｐ、１０８０ｂｐ、１０９０ｂｐ、１１００ｂｐ、１１１０ｂｐ、１１２０ｂｐ、１１３０ｂｐ、１１４０ｂｐ、１１５０ｂｐ、１１６０ｂｐ、１１７０ｂｐ、１１８０ｂｐ、１１９０ｂｐ、１２００ｂｐ、１２１０ｂｐ、１２２０ｂｐ、１２３０ｂｐ、１２４０ｂｐ、１２５０ｂｐ、１２６０ｂｐ、１２７０ｂｐ、１２８０ｂｐ、１２９０ｂｐ、１３００ｂｐ、１３１０ｂｐ、１３２０ｂｐ、１３３０ｂｐ、１３４０ｂｐ、１３５０ｂｐ、１３６０ｂｐ、１３７０ｂｐ、１３８０ｂｐ、１３９０ｂｐ、１４００ｂｐ、１４１０ｂｐ、１４２０ｂｐ、１４３０ｂｐ、１４４０ｂｐ、１４５０ｂｐ、１４６０ｂｐ、１４７０ｂｐ、１４８０ｂｐ、１４９０ｂｐ、１５００ｂｐ、１５１０ｂｐ、１５２０ｂｐ、１５３０ｂｐ、１５４０ｂｐ、１５５０ｂｐ、１５６０ｂｐ、１５７０ｂｐ、１５８０ｂｐ、１５９０ｂｐ、１６００ｂｐ、１６１０ｂｐ、１６２０ｂｐ、１６３０ｂｐ、１６４０ｂｐ、１６５０ｂｐ、１６６０ｂｐ、１６７０ｂｐ、１６８０ｂｐ、１６９０ｂｐ、１７００ｂｐ、１７１０ｂｐ、１７２０ｂｐ、１７３０ｂｐ、１７４０ｂｐ、１７５０ｂｐ、１７６０ｂｐ、１７７０ｂｐ、１７８０ｂｐ、１７９０ｂｐ、１８００ｂｐ、１８１０ｂｐ、１８２０ｂｐ、１８３０ｂｐ、１８４０ｂｐ、１８５０ｂｐ、１８６０ｂｐ、１８７０ｂｐ、１８８０ｂｐ、１８９０ｂｐ、１９００ｂｐ、１９１０ｂｐ、１９２０ｂｐ、１９３０ｂｐ、１９４０ｂｐ、１９５０ｂｐ、１９６０ｂｐ、１９７０ｂｐ、１９８０ｂｐ、１９９０ｂｐ、２０００ｂｐ、２０１０ｂｐ、２０２０ｂｐ、２０３０ｂｐ、２０４０ｂｐ、２０５０ｂｐ、２０６０ｂｐ、２０７０ｂｐ、２０８０ｂｐ、２０９０ｂｐ、２１００ｂｐ、２１１０ｂｐ、２１２０ｂｐ、２１３０ｂｐ、２１４０ｂｐ、２１５０ｂｐ、２１６０ｂｐ、２１７０ｂｐ、２１８０ｂｐ、２１９０ｂｐ、２２００ｂｐ、２２１０ｂｐ、２２２０ｂｐ、２２３０ｂｐ、２２４０ｂｐ、２２５０ｂｐ、２２６０ｂｐ、２２７０ｂｐ、２２８０ｂｐ、２２９０ｂｐ、２３００ｂｐ、２３１０ｂｐ、２３２０ｂｐ、２３３０ｂｐ、２３４０ｂｐ、２３５０ｂｐ、２３６０ｂｐ、２３７０ｂｐ、２３８０ｂｐ、２３９０ｂｐ、２４００ｂｐ、２４１０ｂｐ、２４２０ｂｐ、２４３０ｂｐ、２４４０ｂｐ、２４５０ｂｐ、２４６０ｂｐ、２４７０ｂｐ、２４８０ｂｐ、２４９０ｂｐ、２５００ｂｐ、２５１０ｂｐ、２５２０ｂｐ、２５３０ｂｐ、２５４０ｂｐ、２５５０ｂｐ、２５６０ｂｐ、２５７０ｂｐ、２５８０ｂｐ、２５９０ｂｐ、２６００ｂｐ、２６１０ｂｐ、２６２０ｂｐ、２６３０ｂｐ、２６４０ｂｐ、２６５０ｂｐ、２６６０ｂｐ、２６７０ｂｐ、２６８０ｂｐ、２６９０ｂｐ、２７００ｂｐ、２７１０ｂｐ、２７２０ｂｐ、２７３０ｂｐ、２７４０ｂｐ、２７５０ｂｐ、２７６０ｂｐ、２７７０ｂｐ、２７８０ｂｐ、２７９０ｂｐ、２８００ｂｐ、２８１０ｂｐ、２８２０ｂｐ、２８３０ｂｐ、２８４０ｂｐ、２８５０ｂｐ、２８６０ｂｐ、２８７０ｂｐ、２８８０ｂｐ、２８９０ｂｐ、２９００ｂｐ、２９１０ｂｐ、２９２０ｂｐ、２９３０ｂｐ、２９４０ｂｐ、２９５０ｂｐ、２９６０ｂｐ、２９７０ｂｐ、２９８０ｂｐ、２９９０ｂｐ、３０００ｂｐ、３０１０ｂｐ、３０２０ｂｐ、３０３０ｂｐ、３０４０ｂｐ、３０５０ｂｐ、３０６０ｂｐ、３０７０ｂｐ、３０８０ｂｐ、３０９０ｂｐ、３１００ｂｐ、３１１０ｂｐ、３１２０ｂｐ、３１３０ｂｐ、３１４０ｂｐ、３１５０ｂｐ、３１６０ｂｐ、３１７０ｂｐ、３１８０ｂｐ、３１９０ｂｐ、３２００ｂｐ、３２１０ｂｐ、３２２０ｂｐ、３２３０ｂｐ、３２４０ｂｐ、３２５０ｂｐ、３２６０ｂｐ、３２７０ｂｐ、３２８０ｂｐ、３２９０ｂｐ、３３００ｂｐ、３３１０ｂｐ、３３２０ｂｐ、３３３０ｂｐ、３３４０ｂｐ、３３５０ｂｐ、３３６０ｂｐ、３３７０ｂｐ、３３８０ｂｐ、３３９０ｂｐ、３４００ｂｐ、３４１０ｂｐ、３４２０ｂｐ、３４３０ｂｐ、３４４０ｂｐ、３４５０ｂｐ、３４６０ｂｐ、３４７０ｂｐ、３４８０ｂｐ、３４９０ｂｐ、３５００ｂｐ、３５１０ｂｐ、３５２０ｂｐ、３５３０ｂｐ、３５４０ｂｐ、３５５０ｂｐ、３５６０ｂｐ、３５７０ｂｐ、３５８０ｂｐ、３５９０ｂｐ、３６００ｂｐ、３６１０ｂｐ、３６２０ｂｐ、３６３０ｂｐ、３６４０ｂｐ、３６５０ｂｐ、３６６０ｂｐ、３６７０ｂｐ、３６８０ｂｐ、３６９０ｂｐ、３７００ｂｐ、３７１０ｂｐ、３７２０ｂｐ、３７３０ｂｐ、３７４０ｂｐ、３７５０ｂｐ、３７６０ｂｐ、３７７０ｂｐ、３７８０ｂｐ、３７９０ｂｐ、３８００ｂｐ、３８１０ｂｐ、３８２０ｂｐ、３８３０ｂｐ、３８４０ｂｐ、３８５０ｂｐ、３８６０ｂｐ、３８７０ｂｐ、３８８０ｂｐ、３８９０ｂｐ、３９００ｂｐ、３９１０ｂｐ、３９２０ｂｐ、３９３０ｂｐ、３９４０ｂｐ、３９５０ｂｐ、３９６０ｂｐ、３９７０ｂｐ、３９８０ｂｐ、３９９０ｂｐ、４０００ｂｐ、４０１０ｂｐ、４０２０ｂｐ、４０３０ｂｐ、４０４０ｂｐ、４０５０ｂｐ、４０６０ｂｐ、４０７０ｂｐ、４０８０ｂｐ、４０９０ｂｐ、４１００ｂｐ、４１１０ｂｐ、４１２０ｂｐ、４１３０ｂｐ、４１４０ｂｐ、４１５０ｂｐ、４１６０ｂｐ、４１７０ｂｐ、４１８０ｂｐ、４１９０ｂｐ、４２００ｂｐ、４２１０ｂｐ、４２２０ｂｐ、４２３０ｂｐ、４２４０ｂｐ、４２５０ｂｐ、４２６０ｂｐ、４２７０ｂｐ、４２８０ｂｐ、４２９０ｂｐ、４３００ｂｐ、４３１０ｂｐ、４３２０ｂｐ、４３３０ｂｐ、４３４０ｂｐ、４３５０ｂｐ、４３６０ｂｐ、４３７０ｂｐ、４３８０ｂｐ、４３９０ｂｐ、４４００ｂｐ、４４１０ｂｐ、４４２０ｂｐ、４４３０ｂｐ、４４４０ｂｐ、４４５０ｂｐ、４４６０ｂｐ、４４７０ｂｐ、４４８０ｂｐ、４４９０ｂｐ、４５００ｂｐ、４５１０ｂｐ、４５２０ｂｐ、４５３０ｂｐ、４５４０ｂｐ、４５５０ｂｐ、４５６０ｂｐ、４５７０ｂｐ、４５８０ｂｐ、４５９０ｂｐ、４６００ｂｐ、４６１０ｂｐ、４６２０ｂｐ、４６３０ｂｐ、４６４０ｂｐ、４６５０ｂｐ、４６６０ｂｐ、４６７０ｂｐ、４６８０ｂｐ、４６９０ｂｐ、４７００ｂｐ、４７１０ｂｐ、４７２０ｂｐ、４７３０ｂｐ、４７４０ｂｐ、４７５０ｂｐ、４７６０ｂｐ、４７７０ｂｐ、４７８０ｂｐ、４７９０ｂｐ、４８００ｂｐ、４８１０ｂｐ、４８２０ｂｐ、４８３０ｂｐ、４８４０ｂｐ、４８５０ｂｐ、４８６０ｂｐ、４８７０ｂｐ、４８８０ｂｐ、４８９０ｂｐ、４９００ｂｐ、４９１０ｂｐ、４９２０ｂｐ、４９３０ｂｐ、４９４０ｂｐ、４９５０ｂｐ、４９６０ｂｐ、４９７０ｂｐ、４９８０ｂｐ、４９９０ｂｐ、５０００ｂｐ、５０１０ｂｐ、５０２０ｂｐ、５０３０ｂｐ、５０４０ｂｐ、５０５０ｂｐ、５０６０ｂｐ、５０７０ｂｐ、５０８０ｂｐ、５０９０ｂｐ、５１００ｂｐ、５１１０ｂｐ、５１２０ｂｐ、５１３０ｂｐ、５１４０ｂｐ、５１５０ｂｐ、５１６０ｂｐ、５１７０ｂｐ、５１８０ｂｐ、５１９０ｂｐ、５２００ｂｐ、５２１０ｂｐ、５２２０ｂｐ、５２３０ｂｐ、５２４０ｂｐ、５２５０ｂｐ、５２６０ｂｐ、５２７０ｂｐ、５２８０ｂｐ、５２９０ｂｐ、５３００ｂｐ、５３１０ｂｐ、５３２０ｂｐ、５３３０ｂｐ、５３４０ｂｐ、５３５０ｂｐ、５３６０ｂｐ、５３７０ｂｐ、５３８０ｂｐ、５３９０ｂｐ、５４００ｂｐ、５４１０ｂｐ、５４２０ｂｐ、５４３０ｂｐ、５４４０ｂｐ、５４５０ｂｐ、５４６０ｂｐ、５４７０ｂｐ、５４８０ｂｐ、５４９０ｂｐ、５５００ｂｐ、５５１０ｂｐ、５５２０ｂｐ、５５３０ｂｐ、５５４０ｂｐ、５５５０ｂｐ、５５６０ｂｐ、５５７０ｂｐ、５５８０ｂｐ、５５９０ｂｐ、５６００ｂｐ、５６１０ｂｐ、５６２０ｂｐ、５６３０ｂｐ、５６４０ｂｐ、５６５０ｂｐ、５６６０ｂｐ、５６７０ｂｐ、５６８０ｂｐ、５６９０ｂｐ、５７００ｂｐ、５７１０ｂｐ、５７２０ｂｐ、５７３０ｂｐ、５７４０ｂｐ、５７５０ｂｐ、５７６０ｂｐ、５７７０ｂｐ、５７８０ｂｐ、５７９０ｂｐ、５８００ｂｐ、５８１０ｂｐ、５８２０ｂｐ、５８３０ｂｐ、５８４０ｂｐ、５８５０ｂｐ、５８６０ｂｐ、５８７０ｂｐ、５８８０ｂｐ、５８９０ｂｐ、５９００ｂｐ、５９１０ｂｐ、５９２０ｂｐ、５９３０ｂｐ、５９４０ｂｐ、５９５０ｂｐ、５９６０ｂｐ、５９７０ｂｐ、５９８０ｂｐ、５９９０ｂｐ又は６０００ｂｐのサイズを有する分子を意味する。
【0029】
工程ｅ）
工程ｄ）で選択された分子から、新生ＤＮＡを生成し、ＤＮＡ複製を開始する分子のみが保持される。この目的のために、新生ＤＮＡを生成するゲノムの領域（すなわち、起点ループが開いた時に合成される小分子）は、以下に詳述する実験手順によって特定される。
工程ｄ）で選択された分子から、新生ＤＮＡを生成し、ＤＮＡ複製を開始する分子のみが保持される。この目的のために、新生ＤＮＡを生成するゲノムの領域（すなわち、起点ループが開いた時に合成される小分子）は、以下に詳述する実験手順によって特定される。
【0030】
新生ＤＮＡの特定は、当技術分野で周知であり、以下の実施例に記載のＳＮＳ－ｓｅｑプロトコルを使用することによって実施することができる（新生鎖単離（ＳＮＳ－ｓｅｑ）を参照）。
【0031】
工程ｄで単離されたフラグメントが、実験的に同定された新生ＤＮＡと重複している（少なくとも１ｂｐ）場合、フラグメントは、本発明による複製起点を含むか、又はそれに対応する。
【0032】
したがって、上記の全ての基準を共有するフラグメントは、哺乳動物細胞の真の正確な複製起点であり、これらのフラグメントが哺乳動物細胞のゲノムに挿入されているか、又はＤＮＡ複製の開始に必要な全てのタンパク質の存在下に配置されている場合、これらのフラグメントから複製が起こる。
【0033】
工程ｆ）
この工程は、例えばクローニング目的又は更なる研究のために、目的のフラグメントを単離する工程である。
この工程は、例えばクローニング目的又は更なる研究のために、目的のフラグメントを単離する工程である。
【0034】
本発明において、哺乳動物とは、特にげっ歯類及びヒトを指し、より好ましくはマウス及びヒトを指す。
【0035】
本発明によれば、工程ｄ）及び工程ｅ）は逆にすることができる。したがって、方法は以下の工程、
ａ－哺乳動物の体細胞からゲノムＤＮＡ分子を単離する工程と、
ｂ－ゲノムＤＮＡ分子を、当該ゲノムＤＮＡ分子に沿って１００ｐｂごとに５００ｂｐウインドウに分割する工程と、
ｃ－
Ｏ第１の５００ｂｐウインドウが少なくとも１７２のＧヌクレオチドを有し、
Ｏ第１の５００ｂｐウインドウが１０５以下のＡ又はＴヌクレオチドを有し、
Ｏウインドウの３’末端で第１の５００ｂｐウインドウに直接隣接する第２の５００ｂｐウインドウが、１７２より低く、１２５より高いＧ含有量を有し、
第１の５００ｂｐウインドウと第２の５００ｂｐウインドウとの間のＧ含有量の変動が、８％～４０％の範囲であり、
Ｏ第３の５００ｂｐウインドウが隣接する第４の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第５の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第１の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第２の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第６の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第７の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第８の５００ｂｐウインドウによって構成される８つの連続した５００ｂｐウインドウからなる大きなウインドウ内のＧ含有量が、９６０より高いように、第１の５００ｂｐウインドウを特定する工程と、
ｄ－哺乳動物の体細胞の全ゲノムにおいて、新生ＤＮＡを生成し、ＤＮＡ複製を開始することができるＤＮＡ分子を同定する工程であって、当該分子は、５００ｂｐ～６０００ｂｐの範囲のサイズを有し、推定哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点である、工程と、
ｅ－当該推定哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点から、第１の５００ｂｐウインドウの５’末端からなり、哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点であるＤＮＡ分子を選択する工程と、
ｆ－哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点を分離する工程と、を含む。
ａ－哺乳動物の体細胞からゲノムＤＮＡ分子を単離する工程と、
ｂ－ゲノムＤＮＡ分子を、当該ゲノムＤＮＡ分子に沿って１００ｐｂごとに５００ｂｐウインドウに分割する工程と、
ｃ－
Ｏ第１の５００ｂｐウインドウが少なくとも１７２のＧヌクレオチドを有し、
Ｏ第１の５００ｂｐウインドウが１０５以下のＡ又はＴヌクレオチドを有し、
Ｏウインドウの３’末端で第１の５００ｂｐウインドウに直接隣接する第２の５００ｂｐウインドウが、１７２より低く、１２５より高いＧ含有量を有し、
第１の５００ｂｐウインドウと第２の５００ｂｐウインドウとの間のＧ含有量の変動が、８％～４０％の範囲であり、
Ｏ第３の５００ｂｐウインドウが隣接する第４の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第５の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第１の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第２の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第６の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第７の５００ｂｐウインドウ、それ自体が隣接する第８の５００ｂｐウインドウによって構成される８つの連続した５００ｂｐウインドウからなる大きなウインドウ内のＧ含有量が、９６０より高いように、第１の５００ｂｐウインドウを特定する工程と、
ｄ－哺乳動物の体細胞の全ゲノムにおいて、新生ＤＮＡを生成し、ＤＮＡ複製を開始することができるＤＮＡ分子を同定する工程であって、当該分子は、５００ｂｐ～６０００ｂｐの範囲のサイズを有し、推定哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点である、工程と、
ｅ－当該推定哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点から、第１の５００ｂｐウインドウの５’末端からなり、哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点であるＤＮＡ分子を選択する工程と、
ｆ－哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点を分離する工程と、を含む。
【0036】
有利には、本発明は、当該推定哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点が５００ｂｐ～４０００ｂｐの変化するサイズを有する、上述の方法に関する。
【0037】
「５００ｂｐ～４０００ｂｐ」とは、本発明において、５５０ｂｐ、５６０ｂｐ、５７０ｂｐ、５８０ｂｐ、５９０ｂｐ、６００ｂｐ、６１０ｂｐ、６２０ｂｐ、６３０ｂｐ、６４０ｂｐ、６５０ｂｐ、６６０ｂｐ、６７０ｂｐ、６８０ｂｐ、６９０ｂｐ、７００ｂｐ、７１０ｂｐ、７２０ｂｐ、７３０ｂｐ、７４０ｂｐ、７５０ｂｐ、７６０ｂｐ、７７０ｂｐ、７８０ｂｐ、７９０ｂｐ、８００ｂｐ、８１０ｂｐ、８２０ｂｐ、８３０ｂｐ、８４０ｂｐ、８５０ｂｐ、８６０ｂｐ、８７０ｂｐ、８８０ｂｐ、８９０ｂｐ、９００ｂｐ、９１０ｂｐ、９２０ｂｐ、９３０ｂｐ、９４０ｂｐ、９５０ｂｐ、９６０ｂｐ、９７０ｂｐ、９８０ｂｐ、９９０ｂｐ、１０００ｂｐ、１０１０ｂｐ、１０２０ｂｐ、１０３０ｂｐ、１０４０ｂｐ、１０５０ｂｐ、１０６０ｂｐ、１０７０ｂｐ、１０８０ｂｐ、１０９０ｂｐ、１１００ｂｐ、１１１０ｂｐ、１１２０ｂｐ、１１３０ｂｐ、１１４０ｂｐ、１１５０ｂｐ、１１６０ｂｐ、１１７０ｂｐ、１１８０ｂｐ、１１９０ｂｐ、１２００ｂｐ、１２１０ｂｐ、１２２０ｂｐ、１２３０ｂｐ、１２４０ｂｐ、１２５０ｂｐ、１２６０ｂｐ、１２７０ｂｐ、１２８０ｂｐ、１２９０ｂｐ、１３００ｂｐ、１３１０ｂｐ、１３２０ｂｐ、１３３０ｂｐ、１３４０ｂｐ、１３５０ｂｐ、１３６０ｂｐ、１３７０ｂｐ、１３８０ｂｐ、１３９０ｂｐ、１４００ｂｐ、１４１０ｂｐ、１４２０ｂｐ、１４３０ｂｐ、１４４０ｂｐ、１４５０ｂｐ、１４６０ｂｐ、１４７０ｂｐ、１４８０ｂｐ、１４９０ｂｐ、１５００ｂｐ、１５１０ｂｐ、１５２０ｂｐ、１５３０ｂｐ、１５４０ｂｐ、１５５０ｂｐ、１５６０ｂｐ、１５７０ｂｐ、１５８０ｂｐ、１５９０ｂｐ、１６００ｂｐ、１６１０ｂｐ、１６２０ｂｐ、１６３０ｂｐ、１６４０ｂｐ、１６５０ｂｐ、１６６０ｂｐ、１６７０ｂｐ、１６８０ｂｐ、１６９０ｂｐ、１７００ｂｐ、１７１０ｂｐ、１７２０ｂｐ、１７３０ｂｐ、１７４０ｂｐ、１７５０ｂｐ、１７６０ｂｐ、１７７０ｂｐ、１７８０ｂｐ、１７９０ｂｐ、１８００ｂｐ、１８１０ｂｐ、１８２０ｂｐ、１８３０ｂｐ、１８４０ｂｐ、１８５０ｂｐ、１８６０ｂｐ、１８７０ｂｐ、１８８０ｂｐ、１８９０ｂｐ、１９００ｂｐ、１９１０ｂｐ、１９２０ｂｐ、１９３０ｂｐ、１９４０ｂｐ、１９５０ｂｐ、１９６０ｂｐ、１９７０ｂｐ、１９８０ｂｐ、１９９０ｂｐ、２０００ｂｐ、２０１０ｂｐ、２０２０ｂｐ、２０３０ｂｐ、２０４０ｂｐ、２０５０ｂｐ、２０６０ｂｐ、２０７０ｂｐ、２０８０ｂｐ、２０９０ｂｐ、２１００ｂｐ、２１１０ｂｐ、２１２０ｂｐ、２１３０ｂｐ、２１４０ｂｐ、２１５０ｂｐ、２１６０ｂｐ、２１７０ｂｐ、２１８０ｂｐ、２１９０ｂｐ、２２００ｂｐ、２２１０ｂｐ、２２２０ｂｐ、２２３０ｂｐ、２２４０ｂｐ、２２５０ｂｐ、２２６０ｂｐ、２２７０ｂｐ、２２８０ｂｐ、２２９０ｂｐ、２３００ｂｐ、２３１０ｂｐ、２３２０ｂｐ、２３３０ｂｐ、２３４０ｂｐ、２３５０ｂｐ、２３６０ｂｐ、２３７０ｂｐ、２３８０ｂｐ、２３９０ｂｐ、２４００ｂｐ、２４１０ｂｐ、２４２０ｂｐ、２４３０ｂｐ、２４４０ｂｐ、２４５０ｂｐ、２４６０ｂｐ、２４７０ｂｐ、２４８０ｂｐ、２４９０ｂｐ、２５００ｂｐ、２５１０ｂｐ、２５２０ｂｐ、２５３０ｂｐ、２５４０ｂｐ、２５５０ｂｐ、２５６０ｂｐ、２５７０ｂｐ、２５８０ｂｐ、２５９０ｂｐ、２６００ｂｐ、２６１０ｂｐ、２６２０ｂｐ、２６３０ｂｐ、２６４０ｂｐ、２６５０ｂｐ、２６６０ｂｐ、２６７０ｂｐ、２６８０ｂｐ、２６９０ｂｐ、２７００ｂｐ、２７１０ｂｐ、２７２０ｂｐ、２７３０ｂｐ、２７４０ｂｐ、２７５０ｂｐ、２７６０ｂｐ、２７７０ｂｐ、２７８０ｂｐ、２７９０ｂｐ、２８００ｂｐ、２８１０ｂｐ、２８２０ｂｐ、２８３０ｂｐ、２８４０ｂｐ、２８５０ｂｐ、２８６０ｂｐ、２８７０ｂｐ、２８８０ｂｐ、２８９０ｂｐ、２９００ｂｐ、２９１０ｂｐ、２９２０ｂｐ、２９３０ｂｐ、２９４０ｂｐ、２９５０ｂｐ、２９６０ｂｐ、２９７０ｂｐ、２９８０ｂｐ、２９９０ｂｐ、３０００ｂｐ、３０１０ｂｐ、３０２０ｂｐ、３０３０ｂｐ、３０４０ｂｐ、３０５０ｂｐ、３０６０ｂｐ、３０７０ｂｐ、３０８０ｂｐ、３０９０ｂｐ、３１００ｂｐ、３１１０ｂｐ、３１２０ｂｐ、３１３０ｂｐ、３１４０ｂｐ、３１５０ｂｐ、３１６０ｂｐ、３１７０ｂｐ、３１８０ｂｐ、３１９０ｂｐ、３２００ｂｐ、３２１０ｂｐ、３２２０ｂｐ、３２３０ｂｐ、３２４０ｂｐ、３２５０ｂｐ、３２６０ｂｐ、３２７０ｂｐ、３２８０ｂｐ、３２９０ｂｐ、３３００ｂｐ、３３１０ｂｐ、３３２０ｂｐ、３３３０ｂｐ、３３４０ｂｐ、３３５０ｂｐ、３３６０ｂｐ、３３７０ｂｐ、３３８０ｂｐ、３３９０ｂｐ、３４００ｂｐ、３４１０ｂｐ、３４２０ｂｐ、３４３０ｂｐ、３４４０ｂｐ、３４５０ｂｐ、３４６０ｂｐ、３４７０ｂｐ、３４８０ｂｐ、３４９０ｂｐ、３５００ｂｐ、３５１０ｂｐ、３５２０ｂｐ、３５３０ｂｐ、３５４０ｂｐ、３５５０ｂｐ、３５６０ｂｐ、３５７０ｂｐ、３５８０ｂｐ、３５９０ｂｐ、３６００ｂｐ、３６１０ｂｐ、３６２０ｂｐ、３６３０ｂｐ、３６４０ｂｐ、３６５０ｂｐ、３６６０ｂｐ、３６７０ｂｐ、３６８０ｂｐ、３６９０ｂｐ、３７００ｂｐ、３７１０ｂｐ、３７２０ｂｐ、３７３０ｂｐ、３７４０ｂｐ、３７５０ｂｐ、３７６０ｂｐ、３７７０ｂｐ、３７８０ｂｐ、３７９０ｂｐ、３８００ｂｐ、３８１０ｂｐ、３８２０ｂｐ、３８３０ｂｐ、３８４０ｂｐ、３８５０ｂｐ、３８６０ｂｐ、３８７０ｂｐ、３８８０ｂｐ、３８９０ｂｐ、３９００ｂｐ、３９１０ｂｐ、３９２０ｂｐ、３９３０ｂｐ、３９４０ｂｐ、３９５０ｂｐ、３９６０ｂｐ、３９７０ｂｐ、３９８０ｂｐ、３９９０ｂｐ、４０００ｂｐのサイズを有する分子を意味する。
【0038】
有利には、本発明は、フラグメントの５００ｂｐウインドウがＯＲＣ１又はＯＲＣ２複製開始因子と相互作用する、上述の方法に関する。
【0039】
真核生物のＤＮＡ複製の開始における第１の工程は、複製起点のゲノム全体に分布する特定の部位での６サブユニット複製起点認識複合体（ＯＲＣ）の組立てである。
【0040】
ＯＲＣタンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列は知られていないが、ＤＮＡ分子がＯＲＣタンパク質、特にＯＲＣ１又はＯＲＣ２、あるいはその両方と相互作用するかどうかは、クロマチンＩＰ（ＣｈＩＰ実験又はＣｈＩＰ－ｓｅｑ）又はＤＮＡフットプリント、電気泳動移動度シフトアッセイ等の当技術分野で周知の多くの技術によって決定することが可能である。
【0041】
より有利には、本発明は、５００ｐｂウインドウに直接隣接する配列が以下を含む、上記の方法に関する。
－最大１２回存在する複数のタンデムＧ４構造、又は
－Ｇ－ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｅｄ Ｅｌｅｍｅｎｔ、若しくはＯＧＲＥ、あるいは
－両方。
－最大１２回存在する複数のタンデムＧ４構造、又は
－Ｇ－ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔｅｄ Ｅｌｅｍｅｎｔ、若しくはＯＧＲＥ、あるいは
－両方。
【0042】
有利なことに、本発明による複製起点は、最大１２回タンデムに繰り返されるＧ４構造を含み得る。
【0043】
Ｇ－四重鎖二次構造（Ｇ４）は、グアニンが豊富な配列によって核酸内に形成される。これらの構造はらせん状で、１本、２本、又は４本の鎖から形成できるグアニン四分子を含んでいる。単分子型は、多くの場合、テロメア領域としてよく知られている染色体の末端近く、及び複数の遺伝子の転写調節領域で自然に発生する。４つのグアニン塩基がＨｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合を介して会合して、グアニン四分子（Ｇ－四分子又はＧカルテット）と呼ばれる正方形の平面構造を形成することができ、２つ以上のグアニン四分子（Ｇ－トラクトから、グアニンの連続ラン）が互いの上部に積み重なって、Ｇ四重鎖を形成することができる。
【0044】
Ｇ四重鎖を形成する位置及び結合は無作為ではなく、非常に珍しい機能的目的を果たし、複製起点の近くに位置している。
【0045】
本発明による複製起点は、国際出願の国際公開第２０１１０２３８２７号に定義されているように、Ｇ－ｒｉｃｈ反復要素、又はＯＧＲＥを代替的又は追加的に含んでもよい。
【0046】
より有利には、本発明は、フラグメントが７１６ｐｂ（平均サイズ）のコア開始起点配列を含み、コア開始起点配列が新生ＤＮＡフラグメント配列に相補的である、上述の方法に関する。
【0047】
約７１６ｐｂ（平均サイズに相当）のコア開始起点配列のこの配列は、ＤＮＡポリメラーゼが二本鎖らせんを開いた後に第１のＲＮＡプライミング新生鎖を合成する領域である。
【0048】
より有利には、本発明は、フラグメントが、ヒストンアセチル化マークによって駆動されるようなポリコームタンパク質又はオープンクロマチン、あるいはその両方に対する結合部位も含む、上記の方法に関する。
【0049】
ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、及びクロマチン構成は、遺伝子発現の調節において非常に重要である。ヒストンアセチル化マークは、Ｈ３及びＨ４のアセチル化を含み得る。これらのエピジェネティックなメカニズムの中で、ポリコーム（Ｐｃ）タンパク質は、様々なメカニズムを介して遺伝子サイレンシングにおいて役割を果たす。これらのタンパク質は複合体で作用し、様々な細胞経路を調節する多数の遺伝子のヒストンメチル化プロファイルを制御する。これらは、複製起点部位にも関連付けられている。
【0050】
例えば、ヒストン３ Ｋ２７アセチル化は、一般的にエンハンサ機能に関連付けられ、活性なエンハンサをマークするヒストンマークである。
【0051】
本発明はまた、上で定義した方法によって得られやすいか、又は直接的に得られる哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点に関する。
【0052】
有利には、本発明は、配列番号１及び配列番号３～配列番号４３，１７７及び配列番号４３，２２０～４３，２８８に記載の配列のうちの１つを含む、上に規定されるような、哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点に関する。
【0053】
これらの配列は全て、哺乳動物のＤＮＡコア起点に対応している。これらの配列は新規である。上述の配列に示されるＤＮＡ分子は、それらの天然の状況から単離され、精製される。
【0054】
本発明において、「配列番号１～配列番号４３，１７７及び配列番号４３，２２０～４３，２８８」とは、特に添付の配列表において、４３２４６の配列全てが開示されていることを意味することが明白に理解される。
【0055】
有利には、本発明は、配列番号１～配列番号４３，１７７及び配列番号４３，２２０～４３，２８８に記載の配列のうちの１つからなる、上に規定されるような、哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点に関する。
【0056】
「配列番号１～配列番号４３１７７及び配列番号４３，２２０～４３，２８８」により、本発明では、配列番号１～配列番号４３１７７、及び配列番号４３，２２０～４３，２８８までの全ての配列が、本明細書に添付の配列表に開示されていることを意味する。
【0057】
これらの配列は、哺乳動物ＤＮＡ分子のコア起点、すなわちＤＮＡ複製の開始が可能な配列に対応する。複製起点を欠く［仮説上の］哺乳動物細胞のゲノムに挿入すると、これらの配列は新しいゲノム複製起点、すなわち二本鎖の開裂、相補的ＤＮＡの新合成を促進することができる。それらはまた、プラスミドに挿入された際に、自発的ＤＮＡ複製を促進することができる。
【0058】
本発明は、以下を含むベクターにも関する。
－上で定義した哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点、
－少なくとも、真核生物細胞に特異的な化合物に対する耐性又は感受性を可能にするタンパク質をコードする配列、及び
－哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点とは独立し、目的の遺伝子の挿入及びその発現を可能とする領域。
－上で定義した哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点、
－少なくとも、真核生物細胞に特異的な化合物に対する耐性又は感受性を可能にするタンパク質をコードする配列、及び
－哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点とは独立し、目的の遺伝子の挿入及びその発現を可能とする領域。
【0059】
本発明によるベクターは、少なくとも、種々の宿主哺乳動物細胞において複製することができる哺乳動物複製起点を含む。この複製は、上で定義されたコア起点の存在によるものである。
【0060】
このベクターはまた、遺伝子、特に例えば治療目的のための目的の遺伝子を挿入することができる、複製起点とは独立した領域を含む。哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点とは独立した領域は、特に、目的の遺伝子又はエピジェネティックな修飾を可能にする配列等の目的の核酸配列の挿入を可能にするクローニング部位である。有利には、クローニング部位（複数可）は、少なくとも１つの制限部位、すなわち、ベクターが特定の酵素によって選択的に切断され得る部位を含む。そのような部位は当業者に知られている。制限部位は、固有の制限部位、すなわち、目的のベクター又は核酸配列のどこにも見出されない制限部位であり得る。ベクターのクローニング部位は、多種多様な核酸配列の挿入を可能にする複数の固有の制限部位を含み得る。制限部位の具体例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。Ｈｉｎｄｌｌｌ部位、ＢａｍＨＩ部位、Ａｓｐ７１８ｌ部位、Ｋｐｎ Ｉ部位、Ｂｓｔ Ｉ部位、ＥｃｏＲＩ部位、ＥｃｏＲＶ部位、Ｐｓｔｌ部位、Ｅｃｏ３２ｌ部位、Ｘｈｏｌ部位、Ｓｆｒ２７４ｌ部位、Ｘｂａｌ部位、ＦａｕＮＤＩ部位、Ｎｄｅｌ部位、及びＰｍｅｌ部位。
【0061】
換言すれば、本発明は、哺乳動物複製起点を含むゲノムＤＮＡフラグメントが、クローニング部位でベクターにクローニングされたベクターを包含しない。
【0062】
ベクターはまた、その転写及び対応するタンパク質の発現を可能にする適切な手段の制御下に置かれた遺伝子を含み、この遺伝子は、真核生物細胞を特異的に標的とする薬物に対する耐性又は感受性のいずれかを付与するタンパク質をコードする。これはマーカ遺伝子に相当する。
【0063】
ベクターはまた、複製起点の近く又はそれを介して転写を促進することができる誘導性転写プロモータを含み得る。
【0064】
薬剤に対する耐性を付与するマーカ遺伝子はよく知られており、例えば、ゼオマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等がある。感受性を付与する遺伝子は、伝統的に、ＨＰＲＴ、チミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、及びＡＰＲＴ等のレシピエント細胞において不足している酵素をコードする遺伝子である。より最近では、レシピエントに新しい特性を付与するため、ＸＧＰＴ、メタロチオネイン及びメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ等の他の遺伝子が採用されている。このリストは限定的なものではなく、当業者は、実施する実験に従って、適切な選択マーカ遺伝子を容易に使用するであろう（特定のクローンを単離するための耐性遺伝子、トランスフェクト／形質転換細胞を殺すための感受性遺伝子）。
【0065】
有利には、上記のベクターは、配列番号４３，３８９に記載されており、配列番号１～配列番号４３，１７７及び配列番号４３，２２０～配列番号４３，２８８に記載の配列の１つが挿入されている。
【0066】
有利には、本発明は、上で定義したベクターに関し、ベクターは、
－原核生物複製起点、又は
－抗生物質に対する耐性を可能にするタンパク質をコードする配列、
あるいは両方を更に含む。
－原核生物複製起点、又は
－抗生物質に対する耐性を可能にするタンパク質をコードする配列、
あるいは両方を更に含む。
【0067】
好都合なことに、上で定義したベクターは、細菌細胞内でのＤＮＡ複製を可能にするために、原核生物複製起点も含み得る。アンピシリン、カナマイシン等の抗生物質に対する耐性を可能にするタンパク質をコードする遺伝子を使用することにより、細菌の形質転換細胞を選択するための遺伝子を有することも重要である。
【0068】
有利な一実施形態では、上記のベクターは、以下を含むようなものである。
－配列番号１～配列番号４３１７７及び配列番号４３，２２０～４３，２８８に示される配列の１つを含むか、又はそれからなる哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点の１つ、
－少なくとも、真核生物細胞に特異的な化合物に対する耐性又は感受性を可能にするタンパク質をコードする配列、
－おそらく、複製起点の近く又はそれを介して転写を促進できる誘導性転写プロモータ、及び
－哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点とは独立し、目的の遺伝子の挿入及びその発現を可能とする領域。
－配列番号１～配列番号４３１７７及び配列番号４３，２２０～４３，２８８に示される配列の１つを含むか、又はそれからなる哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点の１つ、
－少なくとも、真核生物細胞に特異的な化合物に対する耐性又は感受性を可能にするタンパク質をコードする配列、
－おそらく、複製起点の近く又はそれを介して転写を促進できる誘導性転写プロモータ、及び
－哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点とは独立し、目的の遺伝子の挿入及びその発現を可能とする領域。
【0069】
本発明はまた、配列番号４３，２９０～４３，３５８に示される配列酸配列を含むか又はそれからなるベクターに関する。
【0070】
本発明は、上で定義したベクターを含む哺乳動物細胞にも関する。
【0071】
本発明による哺乳動物細胞は、上で定義したベクター、すなわち哺乳動物複製起点を含むベクターを含む。このベクターは、自発的に複製するゲノムＤＮＡ複製起点と同様の複製起点を含むため、このベクターを哺乳動物宿主細胞のゲノムに挿入する必要はない。
【0072】
したがって、このベクターはゲノムＤＮＡと同様に複製される。
【0073】
本発明は、上で定義した細胞を含む哺乳動物、特に非ヒト哺乳動物にも関する。
【0074】
上記の動物、好ましくはマウス、ラット、サル、イヌ、ネコ等の非ヒト動物は、上で定義した少なくとも１つの哺乳動物細胞を含む。
【0075】
有利には、当該動物の１つ又は複数の器官が、上記の細胞によってコロニー形成され得、すなわち、器官の細胞の一部又は全てが、上で定義されたベクターを含む。
【0076】
本発明はまた、哺乳動物細胞において、好ましくはインビトロ又はエクスビボで、目的の遺伝子を発現させるための、上記で定義したベクターの使用に関し、その配列は、哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点とは独立した領域でベクターに挿入される。
【0077】
この特定の使用において、目的の遺伝子は、その発現及び対応するタンパク質の発現を可能にするプロモータの制御下に置かれる。
【0078】
「哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点とは独立した領域」とは、本発明において、目的の遺伝子が起点の配列内又は同じマルチクローニング部位内にクローニングされないことを意味する。したがって、目的の遺伝子をクローニングする目的で、追加のマルチクローニング部位をベクターに挿入することは、上記のベクターにおいて有利であり得る。
【0079】
上記のベクターは、同一又は異なる２つ以上の哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点を含むことができる。実施例に示すように、哺乳動物ゲノムＤＮＡ複製起点のコピー数を増加させると、哺乳動物細胞におけるベクターの複製特性が増加する。
【0080】
本発明はまた、上で定義した方法の工程ｂ～ｃを実行するための命令を含む、適切な支援上で実施されるコンピュータプログラム製品に関する。
【0081】
本発明は、上述の方法を実施するように設計された、及び／又は当該プログラムがコンピュータ上で実行される時に当該方法を実行するためのプログラムコードの部分／手段／命令を含む、ソフトウェア又はコンピュータプログラム製品に関する。有利には、当該プログラムは、コンピュータによって読み取ることができるデータ記録サポート上で提供される。このようなサポートは、ＣＤ－ＲＯＭ等のポータブル記録サポートに限定されず、コンピュータの内部メモリ（例えば、ＲＡＭ及び／又はＲＯＭ）を含むデバイス、あるいはハードディスク若しくはＵＳＢスティック、又は近接サーバー若しくはリモートサーバー等の外部メモリを備えたデバイスの一部を形成することもできる。
【0082】
コンピュータプログラムは、上述の方法の工程ｂ及びｃを実行するように適合されている。
【0083】
本発明は、以下の図、及び以下の実施例に照らして、より良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0084】
【図1】実験ワークフローを示す図である。ＳＮＳ－ｓｅｑは、３つの非形質転換（ｈＥＳＣ Ｈ９、患者由来の造血細胞（ＨＣ）、及び患者由来のヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ））、及び３つの不死化細胞型（合計ｎ＝１９）で実行された。不死化細胞は、ＨＭＥＣ細胞における、ＴＰ５３ ｍＲＮＡレベル（ＩｍＭ－１、ｐ５３ＫＤ）の低下、あるいは癌遺伝子ＲＡＳ（ＩｍＭ－２、＋ＲＡＳ）又はＷＮＴ（ＩｍＭ－３、＋ＷＮＴ）の更なる発現によって得られた。
【図2】ＳＮＳ－ｓｅｑによって捕捉されたヒト複製起点（ＭＹＣ起点）のＵＣＳＣゲノムブラウザスナップショットを示す図である。代表的なＳＮＳ－ｓｅｑ読取りプロファイル、ＯＲＣ２（赤）及びＭＣＭ７結合（青）領域の公開された位置、並びにＧＥＮＣＯＤＥ遺伝子（ｖ２５）が示されている。この研究で定義された起点の位置が上部に示されている。赤：高活性起点（コア起点）、淡ピンク：低活性起点（確率論的起点）。
【図3】各分位数（ｘ軸はＱ１～Ｑ１０の起点を表す）ごとの平均起点活性（全てのサンプルにわたる正規化されたＳＮＳ－ｓｅｑカウント、Ｌｏｇ２）を示す箱ひげ図を表す図である。箱ひげ図内の線は中央値を表し、箱の境界は第１四分位数及び第３四分位数を定義する。ひげの下部及び上部は、各箱ひげ図の最小数及び最大数をそれぞれ表す。
【図4】Ｑ１及びＱ２起点は、非形質転換細胞型の圧倒的多数の開始事象をホストすることを示す図である。示された非形質転換細胞型のＱ１、Ｑ２、又はＱ３－１０起点に由来するＤＮＡ複製開始事象（正規化されたＳＮＳ－ｓｅｑカウント）の百分率を表す円グラフである。
【図5】コア起点（左パネル）及び確率論的起点（右パネル）について、最も近い起点（ｘ軸、Ｋｂ）までの距離の分布を示す密度プロットである。灰色は、コア／確率論的起点から、起点と同じサイズ及び数の最も近い無作為化されたゲノム領域までの距離の分布を示す対照密度プロットである。両方の頻度プロットは、無作為化された分布とは有意に異なっていた（ｐ≦２．２Ｅ－１６、頻度の観測値及び期待値を使用したＲのカイ二乗適合度検定）。
【図6】細胞型間の起点活性のピアソンの相関係数（ｒ）を表す図である。
【図7】非形質転換細胞型によって共有されるコア及び確率論的起点の割合を示すオイラー図を表す図である。
【図8】別のＳＮＳ－ｓｅｑ試験（黒）によって起点領域として識別されたコア起点の百分率、及び対照領域との予想される重複量（白、点線）を示す棒グラフである。この図の対照領域は、ヒトゲノムの無作為化された座標に位置するコア起点と同じサイズの領域である。Ｐ値は、カイ二乗適合度検定によって得た。
【図9】この試験で特定された起点と重複するＩＮＩ－ｓｅｑ（黒）によって特定された領域の百分率を表す棒グラフである。点線のバーは、対照領域との重複の予想量を表す。Ｐ値は、カイ二乗適合度検定によって得た。
【図11】ｐｒｅ－ＲＣ構成要素ＯＲＣ２（±２Ｋｂ以内；赤）及びＭＣＭ７（直接重複、青）と重複するコア起点の百分率を表す図である。点線のバーは、対照領域との重複の予想量を表す。Ｐ値は、カイ二乗適合度検定によって得た。
【図13】２Ｋｂ以内のＤＮＡ複製開始をホストするＯＲＣ１結合部位（約１３，０００）及びＯＲＣ２結合部位（約５５，０００）の百分率を示す棒グラフを表す図である。点線のバーは、対照領域との重複を表す。Ｐ値は、カイ二乗適合度検定によって得た。
【図14】単一細胞型における起点活性の模式的要約である。
【図15】異なる細胞型における起点活性の模式的要約である。
【図16】マウス（薄緑色）との相同性を有する、全て、ｈＥＳＣ、ｈＥＳＣ特異的、及びＱ１ヒト起点の百分率を示す棒グラフである。また、マウスの相同領域を持つヒトゲノムの領域も示されている（薄緑色）。マウスの起点でもある領域は濃い緑色である。右側は、対応するシャッフルされたゲノム領域の百分率を示す棒グラフである。
【図17】ヒトＤＮＡ複製開始部位、類似サイズの制御領域（点線）、Ｒｅｆｓｅｑエキソン、プロモータ（ＴＳＳ領域の５００ｂｐ上流として定義される）及びイントロンについてプロットされた累積Ｐｈａｓｔｃｏｎ２０ｗａｙスコアを表す図である。
【図18】Ｇ４Ｈｕｎｔｅｒによって定義されたＧ４（インシリコ）又はミスマッチ（インビトロＧ４）と重複する各分位数における起点の百分率を示すグラフである。点線（ＣＴＬ）は、対照領域との重複を表す。
【図19】ヒトＤＮＡ複製起点及び対照ゲノム領域に隣接する領域の塩基含有量を表す図である。頻度プロットは起点の頂点を中心にしている。塩基頻度は、各塩基の割合を表す（０～１）。ヒトゲノムは、ゲノム平均で示されるように、３０％のＡ、Ｔ及び２０％のＧ、Ｃで構成されている。起点は、Ｇ含有量が最も高い上流に向けられている。
【図20】開始部位の頂点（点線）と、最も近いＯＲＣ１（赤）、ＯＲＣ２（濃赤）、及びＭＣＭ７（青）結合領域の、開始部位頂点（点線）と中心／頂点との間で測定された距離の頻度を表す密度プロットである。起点は、Ｇ含有量が最も高い上流に向けられている。
【図22】コア起点の模式図である。縦線はＩＳ頂点を表す。最も近いＯＲＣ１、ＯＲＣ２、及びＭＣＭ７のピーク中心、並びにコアＩＳ頂点からの平均距離が表示される。ＯＲＣ１、ＯＲＣ２、及びＭＣＭ７結合部位の平均サイズは左側に示されている。
【図23】ゲノムスキャニング（ＧＳ）アルゴリズムに基づいて予測できる起点の百分率を示す棒グラフである。点線のバーは、対照領域との重複の予想量を表す。円グラフは、偽陽性の結果（灰色）の百分率を示す。Ｐ値は、重複の観測値及び期待値を使用したカイ二乗適合度検定によって得た。
【図26】ＧＳアルゴリズムと２つの異なる機械学習アルゴリズム（単一ベクターマシン（ＳＶＭ）及び貪欲な特徴選択によるロジスティック回帰（ＬＲ））との組合わせを使用して予測できるコア起点の百分率を表す棒グラフである。Ｐ値は、重複の観測値及び期待値を使用したカイ二乗適合度検定によって得た。
【図27】起点であると予測される領域の特性を示すスキーマである。開始部位の直近（０．５Ｋｂ）及び遠位（２Ｋｂ）上流領域におけるＧ－ｒｉｃｈ度は、予測パラメータである。
【図28】ＧＥＮＣＯＤＥ遺伝子（赤色）のプロモータ領域（ＴＳＳの±２Ｋｂ）と重複する各分位数におけるＤＮＡ複製起点の百分率を表すプロットである。起点と同じサイズ及び数の無作為にシャッフルされたゲノム領域である対照領域（薄い色）との重複も示されている。Ｐ値は、重複の観測値及び期待値を使用したカイ二乗適合度検定によって得た。
【図31】ＴＳＳの＋／－２Ｋｂ内にＤＮＡ複製起点をホストするＣｐＧ含有遺伝子プロモータの百分率を表す棒グラフである。造血細胞の異なる転写活性レベルを有するプロモータが示される（サイレント＝０、低＝０～１５、中＝１５～６０、高＝＞６０ＲＰＫＭ）。この図では、ＣｐＧアイランドがＴＳＳの＋／－２Ｋｂ内に存在する場合（Ｇｅｎｃｏｄｅ ｖ２５）、プロモータはＣｐＧ含有（ＣｐＧ（＋））と見なされる。
【図32】造血細胞において、異なる転写出力レベル（サイレント＝０、低＝０～１５、中＝１５～６０、高＝＞６０ＲＰＫＭ）を有する遺伝子のＴＳＳの２Ｋｂ内に局在する起点の平均数を示す棒グラフを表す図である。
【図33】造血細胞における（ｄ）のように、異なる転写出力レベルを有する遺伝子のＴＳＳの２Ｋｂ内に局在する起点の平均活性を示す箱ひげ図である。ｐ値は、ＲのＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して取得された。
【図34】造血前駆細胞におけるＣｐＧｉ（＋）プロモータの転写出力（ｙ軸；ＲＰＫＭ、Ｌｏｇ２）と、造血前駆細胞におけるこれらの遺伝子のＴＳＳの±２Ｋｂ内に位置するコア起点の活性（ｘ軸；正規化されたＳＮＳ－ｓｅｑカウント、Ｌｏｇ２）との相関関係を示すドットプロットである。上位及び下位５％の外れ値は除去された。ピアソンの相関係数（ｒ）及び相関のｐ値が上部に表示され、傾向線が示される。
【図39】所見の模式的要約を表す図である。ＣｐＧｉ（＋）プロモータ（黒）は、転写状態に関係なく、ＤＮＡ複製起点をホストする傾向があるが、ＣｐＧｉ（－）プロモータ（灰色）は、転写活性がある場合に起点をホストする傾向がある。
【図40】非形質転換細胞株（白）及び不死化細胞株（灰色）において同定された共有コア及び確率論的起点の百分率を示すオイラー図である。
【図41】不死化細胞では、確率論的起点が著しく増加していることを示す図である。各細胞型で識別されたコア及び確率論的起点の百分率を示す棒グラフである。
【図42】不死化細胞及び非形質転換細胞において同定された起点（Ｑ１からＱ１０）の百分率を示す折れ線グラフである。
【図43】プロモータ領域と重複する（ＴＳＳの＋／－２ｋｂ内の）各分位数（青色の非形質転換Ｑ１－１０、ピンク色の不死化Ｑ１－Ｑ１０）における起点の百分率を表す図である。予想される重複可能性は、点線（淡い色）で示される。Ｐ値は、カイ二乗適合度検定によって得た。青で示されるＰ値は、非形質転換細胞の重複の統計分析を表し、ピンクは不死化細胞を示す。
【図45】ヘテロクロマチン関連Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヒストンマークが濃縮された領域との重複（ｈＥＳＣ中、左パネル）、及びｈＥＳＣ及びＫ２６５細胞中のＨＭＭによってヘテロクロマチンとして定義された領域との重複（右パネル）については、図４３と同様である。
【図46】トポロジー関連ドメイン（ＴＡＤ）にわたるコア起点（赤）密度を示すプロットである。全てのＴＡＤにわたるビン当たり（１００ビン）の平均起点密度がプロットされた（ｙ軸、起点／Ｍｂ）。コア起点密度はＴＡＤ境界でより高く、「スマイリー（ｓｍｉｌｅｙ）」傾向線を作成する。ｐ値は、Ｒの非パラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して取得された。
【図48】ＴＡＤ境界及びＴＡＤ中心におけるコア起点及び確率論的起点の両方に由来する１９のサンプルにわたる正規化された平均ＳＮＳ－ｓｅｑシグナル（ｙ軸、総開始）の合計を示す棒グラフである。ＳＮＳ－ｓｅｑシグナルの総量は、ＴＡＤ境界で１．５３倍高くなる。
【図52】適切な対照を用いた実験ＳＮＳ－ｓｅｑ手順の要約を表す図である。
【図53】６つの異なる細胞株において同定された全てのヒト起点の起点活性ヒートマップを表す図である。起点は、正規化されたＳＮＳ－ｓｅｑ読取りの数に基づく平均活性に従って識別された。次に、ヒトの起点は、それぞれ３２，０７４の起点を含む１０の等サイズの分位数（Ｑ１～Ｑ１０）に分割された。
【図54】マッピング可能性は、様々な分位数にわたる起点で同様であることを示す図である。起点の少なくとも５０％が完全にマッピング可能な領域と重複している各分位数の起点の百分率（ＵＣＳＣ－Ｕｍａｐ、マッピング可能性スコア１）。
【図55】マッピングされた起点領域の外側の広範で拡散した開始は実質的ではない。ヒトゲノムの初期及び後期の複製ドメインにおける総拡散開始の分析により、２つの細胞型のみが起点領域外に何らかの開始シグナルを有することが明らかになった。ｈＥＳＣ細胞。全てのＤＮＡ複製開始の９．６％は、識別された起点領域の外側の初期の（ただし後期ではない）複製ドメインから発生する。ＩｍＭ－１細胞型では、全ての開始の１４．７％が、起点領域外の後期複製（初期複製ではない）ドメインに由来する。
【図56】ほとんどのコア起点はゲノム内でクラスター化されていることを示す図である。コア起点の百分率を示す円グラフは、（ｉ）クラスター化された（すなわち、互いに７ｋｂ未満）、（ｉｉ）緩やかにクラスター化された（７ｋｂを超えるが、互いに１５ｋｂ未満）、及び（ｉｉｉ）分離されている（最も近いコア起点まで１５ｋｂ超）を見出した。右側のパネルは、定義された様々なクラスターの概略図を示している。
【図57】マウスゲノムの同様の数の領域も、ＤＮＡ複製開始事象の大部分をホストすることを示す図である。最も活性な６４，１４８の起点（ヒト細胞と同じ数）及び残りのより低い活性の起点を含む、正規化されたＳＮＳ－ｓｅｑタグの百分率を示す円グラフである。
【図58】３つの不死化細胞株が共有する起点の割合を示すオイラー図である。
【図59】以前のＳＮＳ－ｓｅｑ研究で検出された起点と重複する各分位数における起点の百分率を示す黒い点を表す図である。灰色の点は、無作為にシャッフルされた、我々の起点と同じサイズ及び数の対照ゲノム領域の予想される重複の可能性を表している。Ｐ値は、重複の観測値及び期待値を使用したカイ二乗適合度検定によって得た。
【図60】ＩＮＩ－ｓｅｑにより同定された領域については図５９と同様である。赤い点は、ＩＮＩ－ｓｅｑによって識別された初期発火起点の百分率を示しており、これは、最も初期の発火起点を特定するインビトロ法である。
【図62】緊密にクラスター化されたコア起点は、代替起点マッピング法ＯＫ－ｓｅｑによって識別される可能性が高くなることを示す図である。ＯＫ－ｓｅｑによって識別されたＤＮＡ複製開始ゾーンと重複する緊密にクラスター化されたコア起点（黒）の百分率を示す棒グラフである。点線のバーは、無作為にシャッフルされ、ＯＫ－ｓｅｑ領域と同じサイズ及び数の対照ゲノム領域の予想される重複可能性を表す。Ｐ値は、重複の観測値及び期待値を使用したカイ二乗適合度検定によって得た。
【図63】コア起点はｐｒｅ－ＲＣ構成要素ＯＲＣ１及びＯＲＣ２結合部位と重複することを示す図である。グラフは、±２ｋｂ以内のＯＲＣ１又はＯＲＣ２（赤）又はＯＲＣ２（青）によって結合された領域と重複する各分位数の起点の百分率を示している。淡い色のドットは、無作為にシャッフルされた、我々の起点と同じサイズ及び数の対照ゲノム領域の予想される重複の可能性を表している。
【図64】より大きなゲノム領域を占めるＯＲＣ２結合部位は、ＤＮＡ複製起点と関連している可能性がより高いことを示す図である。円グラフは、コア又は確率論的起点と交差するゲノム内のＯＲＣ２結合部位の百分率を表す（±２Ｋｂ以内）。左のパネルは１Ｋｂを超えるＯＲＣ２結合領域を表し、右のパネルは２Ｋｂを超えるＯＲＣ２結合領域を表す。ｐ値は、Ｒのカイ２乗適合度検定を使用して、観測値及び期待値の重複値により得た。
【図66】コア起点（Ｑ１及びＱ２）は、開始部位の上流に保存された配列を有することを示す図である。グラフは、ヒトの起点（Ｑ１～Ｑ１０）のＰｈａｓｔｃｏｎ２０スコアの平均を表しており、起点の頂点を中心とし、両側に領域が隣接している。起点は、上流にＧが豊富な領域を有するように方向付けられている。
【図68】Ｇ４構造を定義するために使用される２つの方法（ミスマッチスコアリング又はＧ４Ｈｕｎｔｅｒ）の任意の１つによって定義される、推定Ｇ４構造（黒色）と重複するコア及び確率論的起点の百分率を表す棒グラフである。点線は、我々の起点領域と同じサイズ及び数のゲノムの無作為化された領域である対照領域との予想される重複を表す。Ｐ値は、重複の観測値及び期待値を使用したカイ二乗適合度検定を表す。（＊）確率論的起点Ｑ３－７はＧ４領域（最大ｐ＝０．０００２）と大幅に重複しているが、Ｑ８－１０は重複していないことに注意されたい。
【図69】配向されたコア起点頂点の４００ｂｐ上流をカバーする領域についてのモチーフ濃縮分析（ＨＯＭＥＲを使用）の図である。この図の分析は、無作為化されたゲノム領域の濃縮を表している。
【図70】左のパネルは、コア起点と同じＣ及びＧ頻度を含む無作為化されたゲノム領域でのモチーフの濃縮を表す図である。右のパネルは、同じ頻度のジヌクレオチド「ＣＧ」を含む無作為化されたゲノム領域に対するモチーフの濃縮を表す図である。
【図71】ＤＮＡハイパーモチーフに基づいて起点を予測するために使用されるアルゴリズムの概略図である。
【図72】マウスＤＮＡ複製（コア及び確率論的）起点及び対照ゲノム領域に隣接する領域の塩基含有量の図である。頻度プロットは、起点の頂点（読取りパイルアップのピークの最高点）を中心にしている。塩基頻度は、１００ｂｐのスライディングウインドウ内の各塩基の割合を０～１のスケールで表す。起点は、上流のＧ含有量が最も高い側を有するように配向されている（詳細については、方法を参照されたい）。
【図73】３つの異なる機械学習アルゴリズム法の偽陽性率（灰色）の図である。ＬＲは貪欲な特徴選択によるロジスティック回帰を表し、ＳＶＭは単変量特徴選択及び単一ベクターマシンを表し、ｕＬＲは単変量特徴選択によるロジスティック回帰を表す。
【図74】様々な機械学習方法が、事実上同じコアの起点を予測することを示す図である。各機械学習方法によって予測されたコアの起点の重複を示すオイラー図である（実寸で描画）。
【図75】各機械学習アルゴリズムに使用される２２の特徴のそれぞれの重要性を示す図である。上部のパネルは、ＬＲアルゴリズムによって各機能に割り当てられた重みを表す。下部のパネルは、ＳＶＭアルゴリズムによって各機能に割り当てられた重みを表す。各機能（ｘ軸）の詳細な説明は、表２に見出すことができる。Ｙ軸は、各アルゴリズムによって各変数に割り当てられた重要度を表す任意の単位である。
【図76】ＴＳＳの＋／－２Ｋｂ内にＤＮＡ複製起点をホストする全てのＧｅｎｃｏｄｅ（ｖ２５）遺伝子プロモータの百分率を表す棒グラフである。造血細胞の異なる転写活性レベルを有するプロモータが示される（サイレント＝０、低＝０～１５、中＝１５～６０、高＝＞６０ＲＰＫＭ）。
【図77】造血細胞において、異なる転写出力レベル（サイレント＝０、低＝０～１５、中＝１５～６０、高＝＞６０ＲＰＫＭ）を有する遺伝子のプロモータ領域（ＴＳＳの＋／－２Ｋｂ）内に局在する起点の平均数を示す棒グラフである。
【図78】造血細胞における（ｄ）のような異なる転写出力レベルを有する遺伝子のプロモータ領域（ＴＳＳの＋／－２Ｋｂ）に局在する起点の平均活性を示す箱ひげ図である。ｐ値は、ＲのＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して取得された。箱ひげ図内の線は中央値を表し、箱の境界は、第１四分位数及び第３四分位数を定義する。ひげの下部及び上部は、各箱ひげ図の最小数及び最大数をそれぞれ表す。
【図79】造血細胞（ＨＣ）分化プロトコルの模式的要約である。ＨＣ（ＣＤ３４＋）は、３人の独立したヒト臍帯血ドナーから単離され、６～７日間、３つの独立した培養で増殖された。次に、エリスロポエチン（＋ＥＰＯ）を培養培地（０日目）に６日間添加し、０日目、３日目、及び６日目に細胞を採取してＳＮＳ－ｓｅｑ及びＲＮＡ－ｓｅｑ分析を行った。
【図80】赤血球分化後（６日目）に活性が増加した起点は、赤血球分化に関連する遺伝子をホストするゲノム領域にあることを示す図である。ＥＰＯの添加（０日目及び６日目）で有意に上方制御された起点のゲノム座標をＧＲＥＡＴで分析した。ＥＰＯ処理（０日目及び６日目）で有意に上方制御された起点のゲノム座標でＧＲＥＡＴ分析を実施した。起点領域は、ＧＲＥＡＴの単一遺伝子（ＳＧ）規則を使用して遺伝子に関連付けられた。ここにプロットされた二項ｐ値ｐ＜０．０５で統計的に有意なカテゴリは１つだけであった。
【図81】サイレント遺伝子は、そのプロモータ領域の近くにＣｐＧアイランド（ＣｐＧｉ）を含む可能性が低いことを示す図である。棒グラフは、ＴＳＳ領域内（±２Ｋｂ）で、ＣｐＧｉを含む（ＣｐＧ（＋）、黒）又は含まない（ＣｐＧ（－）、白）造血細胞（図７６のように定義）で異なる転写活性レベルを有するＧＥＮＣＯＤＥ（ｖ２５）遺伝子の割合を表す。
【図82】異なる転写出力レベル（サイレント＝０、低＝０～１５、中＝１５～６０、高＝＞６０ＲＰＫＭ）を有する遺伝子のプロモータ領域（ＴＳＳの＋／－２Ｋｂ）内に局在する起点の平均活性を示す箱ひげ図である。Ｇ－ｒｉｃｈ ＴＳＳは、±２Ｋｂ以内のＧ－ｒｉｃｈ（５００ｂｐ当たり＞３７％）のＤＮＡストレッチを含むＴＳＳとして定義された。この図の有意性のｐ値は、ＲのＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して取得される。箱ひげ図内の線は中央値を表し、箱の境界は第１四分位数及び第３四分位数を定義する。ひげの下部及び上部は、各箱ひげ図の最小数及び最大数をそれぞれ表す。
【図83】本発明で使用される全ての細胞型における、Ｑ１、Ｑ２（コア起点）又はＱ３－１０（確率論的起点）に由来する既知の起点におけるＤＮＡ複製開始事象（正規化されたＳＮＳ－ｓｅｑカウントによって評価される）の百分率を表す円グラフである。
【図84】起点Ｇ－ｒｉｃｈ配列特異性は不死化により失われることを示す図である。不死化細胞では、親細胞株（ＨＭＥＣ）と比較して下方制御された起点（黒いバー）は、ＣｐＧｉ（左パネル）又はＧ４（右パネル）要素と重複する傾向がある。対照的に、不死化時に上方制御された起点（白いバー）は、ＣｐＧｉ又はＧ４要素との重複が予想よりも少なくなっている。参考までに、点線は、ＣｐＧｉ（左パネル）又はＧ４（右パネル）と重複する全ての起点の百分率を示している。
【図85】不死化の際に上方制御又は下方制御されるコア起点についてであることを除いて、図８４と同じである。参考までに、点線は、ＣｐＧｉ（左パネル）又はＧ４（右パネル）と重複するコア起点の百分率を示している。
【図86】マウス胚性幹細胞６のトポロジー関連ドメイン（ＴＡＤ）にわたるマウスコア起点（左パネル）及び確率論的起点（右パネル）密度を示す図である。ＴＡＤドメイン（青）又は等サイズの対照領域（灰色）に沿った起点密度は、次のように計算された。ＴＡＤは１００の等しいビン（スライス）に分割され、各ビンの起点密度はＭｂ当たりの起点数として計算された。ｐ値は、Ｒの非パラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して計算された。
【図87】ｈＥＳＣ Ｈ９（左パネル）、ＨＣ（中央パネル）又はＨＭＥＣ（右パネル）で活性なＴＡＤ（ｈＥＳＣ Ｈ１で測定）にわたるコア起点密度の図である。ＴＡＤに沿った起点密度は、図８６のように計算された。
【図88】コア起点は、推定規制要素と一致することを示す図である。プロットは、起点（Ｑ１－Ｑ１０）と、推定調節機能を有するヒトゲノム領域との重複を示している（ＲｅＭａｐで定義されているように、＞１０ピーク）。
【図89】ＤｐｎＩ試験の原理の図である。
【図90】複製起点の受容体ベクターとしてのｐＥＰｉ－Ｄｅｌベクターの図である。元のベクターはｐＥＰｉベクターである。ｐＥＰｉ－Ｄｅｌレシピエントベクターは、ＳＶ４０複製起点を削除することにより、ｐＥＰｉからサブクローニングされた。
【図91】ｐＥＰｉ－Ｄｅｌ受容体ベクターは、ＳＶ４０複製起点を削除することによってｐＥＰｉからサブクローニングされたことを示す図である。２９３Ｔ（Ｔ抗原を発現）及び２９３（Ｔ抗原を含まない）細胞にｐＥＰｉ（ＳＶ４０起点）又はｐＥＰｉ－Ｄｅｌ（起点欠失）をトランスフェクトした。ＤｐｎＩアッセイの最後に（図８９）、カナマイシンを補充した寒天上で増殖できるコロニーの数を推定する。部分的な写真が示される。
【図92】２９３Ｔ（左）又は２９３（右）で実施された実験におけるコロニー数を示すヒストグラムである。
【図93】ＤｐｎＩ消化の特異性を検査するための対照の図である。Ｄａｍ（－）又はＤａｍ（＋）細菌のいずれかで準備されたＤｐｎＩ消化プラスミドで形質転換された細菌の結果の提示。
【図94】ＤｐｎＩ消化特異性対照と比較した、各条件について複製されたプラスミドの百分率を示すヒストグラムである。
【図95】目的の起点のクローニング戦略の進化の図である。
【図96】Ｓ／ＭＡＲ配列の減少、及びトランスフェクト細胞の抗生物質選択を可能にする遺伝子によるｅＧＦＰレポータ遺伝子の置換の図である。
【図97】ＭＡＲ５によるＳ／ＭＡＲ配列の減少により、２日後（左）及び５日後（右）に良好なトランスフェクション効率を維持することを可能にすることを示す図である。
【図98】ＭＡＲ５によるＳ／ＭＡＲ配列の減少は、ベクターの複製能を保存することを示す図である。
【図99】ピューロマイシン耐性遺伝子によるｅＧＦＰレポータ遺伝子の置換の図である。
【図100】ｅＧＦＰレポータ遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子で置換すると、少なくとも１３日間までの複製の評価が可能になることを示す図である。
【図101】ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５－ＭＣＳ受容体ベクターに挿入される複製起点を含む配列の特性の図である。
【図102】ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５－ＭＣＳ及びｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５－λＯＲＩ－ＭＣＳの図である。
【図103】ｖｅｃｔＯＲＩライブラリに含まれるプラスミドの複製能力を評価するための非複製プラスミドのＤｐｎＩ消化に基づく迅速複製アッセイの適用（５つのプラスミドのプール当たり）の図である。
【図104】プールＡ～Ｆについてのプラスミドの複製能力の結果を示すグラフ（トランスフェクションの６日後）の図である。
【図105】未消化、ＮｏｔＩ／ＳａｃＩ又はＢａｍＨＩ／ＳａｃＩで消化された、単離されたクローンのアガロースゲルでの移動プロファイルの図である。
【図106】未消化又は２つの酵素で消化されたクローン１５＿２のアガロースゲルでの移動プロファイルの図である。
【図107】二重（ＤＢＬ）プラスミド又は単一プラスミドのアガロースゲルでの移動プロファイルの図である。
【図108】単一及び二重プラスミドの模式図である。
【図109】二重プラスミドと単一プラスミドとの間の複製の比率を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【0085】
実施例
実施例１－ヒト起点の特性決定
ＤＮＡ複製は、複製起点と呼ばれる複数のゲノム位置から開始される。後生動物では、起点の特定に関与するＤＮＡ配列要素は理解しづらいままである。本発明者等は、多能性、一次、分化、及び不死化されたヒト細胞を調べ、コア起点と呼ばれる起点のクラスが異なる細胞型によって共有され、任意の細胞集団の全てのＤＮＡ複製開始事象の約８０％をホストすることを実証する。本発明者等は、ヒトゲノム及びマウスゲノムの両方におけるほとんどのコア起点と一致する共有Ｇ－ｒｉｃｈＤＮＡ配列シグネチャを検出する。転写要素及びＧ－ｒｉｃｈ要素は、複製起点の活性と独立して関連付けることができる。計算アルゴリズムは、コンセンサスモチーフではなくＤＮＡ配列パターンのみに基づいて、コア起点を予測できることを示している。本発明者等の結果は、確率論に起因するにもかかわらず、コア起点がゲノム領域の限られたプールから選択されることを示している。発癌性遺伝子発現による不死化ではなく、通常の細胞分化により、ヘテロクロマチンからの確率的発火が増加し、ＴＡＤ境界での起点密度が減少する。
実施例１－ヒト起点の特性決定
ＤＮＡ複製は、複製起点と呼ばれる複数のゲノム位置から開始される。後生動物では、起点の特定に関与するＤＮＡ配列要素は理解しづらいままである。本発明者等は、多能性、一次、分化、及び不死化されたヒト細胞を調べ、コア起点と呼ばれる起点のクラスが異なる細胞型によって共有され、任意の細胞集団の全てのＤＮＡ複製開始事象の約８０％をホストすることを実証する。本発明者等は、ヒトゲノム及びマウスゲノムの両方におけるほとんどのコア起点と一致する共有Ｇ－ｒｉｃｈＤＮＡ配列シグネチャを検出する。転写要素及びＧ－ｒｉｃｈ要素は、複製起点の活性と独立して関連付けることができる。計算アルゴリズムは、コンセンサスモチーフではなくＤＮＡ配列パターンのみに基づいて、コア起点を予測できることを示している。本発明者等の結果は、確率論に起因するにもかかわらず、コア起点がゲノム領域の限られたプールから選択されることを示している。発癌性遺伝子発現による不死化ではなく、通常の細胞分化により、ヘテロクロマチンからの確率的発火が増加し、ＴＡＤ境界での起点密度が減少する。
【0086】
方法
細胞及び組織培養
Ｈ９ ｈＥＳＣ細胞（ＷＡ－０９；Ｗｉｃｅｌｌ）はＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＥＳＩ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）から入手し、記載されているように供給者の指示に従って維持した６０。簡単に説明すると、マイトマイシンＣ処理（１０ｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）マウス胚性線維芽細胞（４～６ｘ１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度で使用）及び８０％ノックアウトＤＭＥＭ、２０％ノックアウト血清代替品、１％非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノールで構成された培地で未分化ｈＥＳＣを増殖させた。継代時に、８ｎｇ／ｍｌのヒトｂＦＧＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ又はＥｕｒｏｂｉｏ）を培地に添加した。末梢血単核細胞（造血細胞、ＨＣと呼ばれる）は、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配法を使用して、モンペリエのＣｌｉｎｉｑｕｅ Ｓａｉｎｔ Ｒｏｃｈからの３人の独立したヒトドナーの臍帯血から単離された。次に、抗ＣＤ３４抗体と結合した磁気ビーズによってＨＣを精製し、０．５～１ｘ１０６のＣＤ３４＋細胞を得、培地に播種し、補充したＳｔｅｍ Ｓｐａｎ培地（ＩＭＤＭ＋インスリン、トランスフェリン、ＢＳＡ、５％ＦＣＳ＋ＩＬ－３＋ＩＬ６＋ＳＣＦ）でエクスビボで６－７日間増殖させた。赤血球形成系統への細胞分化は、エリスロポエチン（ＥＰＯ、３単位／ｍＬ）の添加によって誘導された。ＥＰＯ添加後の異なる時点（０、３、及び６日目）で、５０ｘ１０６の細胞の一定分量が回収され、分子生物学実験（検証のためのＳＮＳ－Ｓｅｑ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＲＴ－ｑＰＣＲ）のためにペレット化され、残りの細胞は培養中に残された。赤血球生成分化を検証するために、造血／赤血球マーカＣＤ３６、ＣＤ１１ｂ、ＧｌｙＡ、ＣＤ７１、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ３４、ＣＤ９８、ＩＬ３Ｒ、ＣＤ１３（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に対する抗体を使用して、フローサイトメトリ分析によって細胞の表現型を決定した。ＥＰＯインキュベーション時の赤血球系統への分化は、系統マーカに特異的なプライマーを使用して、０、３、及び６日目の細胞からのＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ分析によっても確認された。
細胞及び組織培養
Ｈ９ ｈＥＳＣ細胞（ＷＡ－０９；Ｗｉｃｅｌｌ）はＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＥＳＩ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）から入手し、記載されているように供給者の指示に従って維持した６０。簡単に説明すると、マイトマイシンＣ処理（１０ｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）マウス胚性線維芽細胞（４～６ｘ１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度で使用）及び８０％ノックアウトＤＭＥＭ、２０％ノックアウト血清代替品、１％非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノールで構成された培地で未分化ｈＥＳＣを増殖させた。継代時に、８ｎｇ／ｍｌのヒトｂＦＧＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ又はＥｕｒｏｂｉｏ）を培地に添加した。末梢血単核細胞（造血細胞、ＨＣと呼ばれる）は、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配法を使用して、モンペリエのＣｌｉｎｉｑｕｅ Ｓａｉｎｔ Ｒｏｃｈからの３人の独立したヒトドナーの臍帯血から単離された。次に、抗ＣＤ３４抗体と結合した磁気ビーズによってＨＣを精製し、０．５～１ｘ１０６のＣＤ３４＋細胞を得、培地に播種し、補充したＳｔｅｍ Ｓｐａｎ培地（ＩＭＤＭ＋インスリン、トランスフェリン、ＢＳＡ、５％ＦＣＳ＋ＩＬ－３＋ＩＬ６＋ＳＣＦ）でエクスビボで６－７日間増殖させた。赤血球形成系統への細胞分化は、エリスロポエチン（ＥＰＯ、３単位／ｍＬ）の添加によって誘導された。ＥＰＯ添加後の異なる時点（０、３、及び６日目）で、５０ｘ１０６の細胞の一定分量が回収され、分子生物学実験（検証のためのＳＮＳ－Ｓｅｑ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＲＴ－ｑＰＣＲ）のためにペレット化され、残りの細胞は培養中に残された。赤血球生成分化を検証するために、造血／赤血球マーカＣＤ３６、ＣＤ１１ｂ、ＧｌｙＡ、ＣＤ７１、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ３４、ＣＤ９８、ＩＬ３Ｒ、ＣＤ１３（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に対する抗体を使用して、フローサイトメトリ分析によって細胞の表現型を決定した。ＥＰＯインキュベーション時の赤血球系統への分化は、系統マーカに特異的なプライマーを使用して、０、３、及び６日目の細胞からのＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ分析によっても確認された。
【0087】
ＨＭＥＣ細胞を単離し、ＩｍＭ１－３細胞を前述のように生成した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｅａｒｌｙ／２０１８／０６／１１／３４４４６５で入手可能）。簡単に言えば、ＨＭＥＣ細胞は、最初に、ＴＰ５３に対して安定にトランスフェクトされたｓｈＲＮＡ（ＩｍＭ－１）を使用して不死化された。次いで、ヒトＲＡＳ（ＩｍＭ－２）又はＷＮＴ（ＩｍＭ－３）を過剰発現させるためのプラスミドの安定トランスフェクションによって、ＩｍＭ－１サブクローンを生成した。
【0088】
マウスＥＳＣを前述のように培養し、ＳＮＳ－ｓｅｑをｍＥＳＣ（ｎ＝４）及び神経前駆細胞（ｎ＝４）で２回実施した。合計２４８，６８２の起点が特定され、ヒトと同様に１０の等しいサイズの分位数に分割された。
【0089】
倫理的許可
ｈＥＳＣ及び造血細胞を含む全ての実験は、フランスの生命倫理法及び「Ａｇｅｎｃｅ Ｆｒａｎｃａｉｓｅ ｄｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ」によって確立されたガイドラインに準拠している。ＣＤ３４＋細胞は、母親からの書面によるインフォームドコンセントの後、匿名化された満期産児の出産後に得られた臍帯血から単離した。これらの匿名化されたサンプルの使用は、Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｓによって発行されたガイドラインに従って、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによる倫理審査から免除されると判断された。
ｈＥＳＣ及び造血細胞を含む全ての実験は、フランスの生命倫理法及び「Ａｇｅｎｃｅ Ｆｒａｎｃａｉｓｅ ｄｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ」によって確立されたガイドラインに準拠している。ＣＤ３４＋細胞は、母親からの書面によるインフォームドコンセントの後、匿名化された満期産児の出産後に得られた臍帯血から単離した。これらの匿名化されたサンプルの使用は、Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｓによって発行されたガイドラインに従って、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによる倫理審査から免除されると判断された。
【0090】
新生鎖単離（ＳＮＳ－ｓｅｑ）及び分析
この方法は複製起点をマッピングするための最も正確な手順であるが、ＳＮＳ－ｓｅｑ及びバイオインフォマティクス分析方法論の違いは、多くの場合対照を使用しないか不適切な対照を使用するため、起点の識別における偽陽性率（ＦＰＲ）に影響を与え、結果として後生動物の起点に属する様々な特性が生じる。ここで、本発明者等は、本発明者等のＳＮＳ－ｓｅｑプロトコル及び分析パイプラインを提供している。簡単に言えば、細胞をＤＮＡｚｏｌで溶解し、その後、スクロース勾配サイズ分画に基づいて、新生鎖をゲノムＤＮＡから分離した。０．５～２ｋｂに対応する画分をプールし、５’末端リン酸化のためにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）と共にインキュベートし、１４０単位のλ－エキソヌクレアーゼ（λｅｘｎ）と共に一晩インキュベートすることにより消化した。１００単位のλｅｘｎによる一晩の消化の第２ラウンドを実施した。λｅｘｎは壊れたゲノムＤＮＡの混入を消化するが、ＲＮＡでプライミングされた新生鎖２２は消化しない。実験的バックグラウンド対照として、各細胞型の高分子量ゲノムＤＮＡを新生鎖と同じサイズに熱フラグメント化し、ＲＮａｓｅＡ／ＸＲＮ－１と共にインキュベートして、混入している新生鎖のＲＮＡプライマーを除去した後、サンプルと同じ量のλｅｘｎで処理した。
この方法は複製起点をマッピングするための最も正確な手順であるが、ＳＮＳ－ｓｅｑ及びバイオインフォマティクス分析方法論の違いは、多くの場合対照を使用しないか不適切な対照を使用するため、起点の識別における偽陽性率（ＦＰＲ）に影響を与え、結果として後生動物の起点に属する様々な特性が生じる。ここで、本発明者等は、本発明者等のＳＮＳ－ｓｅｑプロトコル及び分析パイプラインを提供している。簡単に言えば、細胞をＤＮＡｚｏｌで溶解し、その後、スクロース勾配サイズ分画に基づいて、新生鎖をゲノムＤＮＡから分離した。０．５～２ｋｂに対応する画分をプールし、５’末端リン酸化のためにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）と共にインキュベートし、１４０単位のλ－エキソヌクレアーゼ（λｅｘｎ）と共に一晩インキュベートすることにより消化した。１００単位のλｅｘｎによる一晩の消化の第２ラウンドを実施した。λｅｘｎは壊れたゲノムＤＮＡの混入を消化するが、ＲＮＡでプライミングされた新生鎖２２は消化しない。実験的バックグラウンド対照として、各細胞型の高分子量ゲノムＤＮＡを新生鎖と同じサイズに熱フラグメント化し、ＲＮａｓｅＡ／ＸＲＮ－１と共にインキュベートして、混入している新生鎖のＲＮＡプライマーを除去した後、サンプルと同じ量のλｅｘｎで処理した。
【0091】
本発明者等は、我々及びほとんどの研究所がＳＮＳ－Ｓｅｑに使用する条件は、ラムダエキソヌクレアーゼ消化のバイアスの可能性を主張する報告とは厳密に異なることを強調する必要がある。まず、古典的なＳＮＳ－Ｓｅｑプロトコルでは、複製起点でプライミングされた新生ＲＮＡは、ＤＮＡを融解し、続いてスクロース勾配遠心分離によってバルク親ＤＮＡから新生鎖を分離することによって精製される。その後、精製された新生鎖は徹底的なラムダエキソヌクレアーゼ消化（２，０００ｕ／μｇ超のＤＮＡ）で消化される。これは、部分的に一本鎖である全ＤＮＡを分画するＢＮＤセルロースを使用してバルクＤＮＡを複製中間体で単純に濃縮するＦｏｕｌｋ ｅｔ ａｌ．６２の場合とは異なる。次いでラムダエキソヌクレアーゼを使用すると、本発明者等の研究室が採用する比率よりも１０００倍～３０００倍少ない酵素のＤＮＡに対する比率が得られる。本発明者等はまた、本発明者等の全ての対照サンプルを繰り返し報告した（有糸分裂ＤＮＡ、又はＧ０ ＤＮＡ、又は高分子量ＤＮＡからの新生鎖は非常に低い濃縮値を与える）。
【0092】
各サンプルの起点濃縮の品質は、最初に、既知のヒト複製起点に対するプライマーを使用してｑＰＣＲによって試験した。様々な起点の起点活性を検出するために使用されるプライマーを表４に示す。ＣｙＳｃｒｉｂ ＧＦＸ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｓｔｒａ，２７９６０６－０２）を使用して一本鎖新生鎖を最初に精製し、次にＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）及びＡｒｒａｙＣＧＨ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｐｒｉｍｅ、４５－００４８）を使用した無作為プライミングにより二本鎖ＤＮＡに変換した。ＴｒｕｅＳｅｑ Ｃｈｉｐ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、ｃＤＮＡライブラリを調製した。並行して、熱変性ゲノムＤＮＡ入力対照も精製し、無作為プライミングし、同じ方法でライブラリを調製した。全てのサンプルは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００装置を使用してＭｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ ＧｅｎｏｍｉＸ（ＭＧＸ）施設で配列決定された。ｆａｓｔｑファイルの作成には、Ｉｌｌｕｍｉｎａのｂｃｌ２ｆａｓｔｑ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１７が使用された。Ｂｏｗｔｉｅ２（ｖ２．２．６）を使用して、各ＳＮＳ－ｓｅｑ複製物からのイルミナリード（５０ｂｐ、シングルエンド）をトリミングし、ｈｇ３８に合わせた。ＭＡＣＳ２６４（ｖ２．２．１）及びＳＩＣＥＲ６５（ｈｇ３８及びｍｍ１０を含むように変更されたｖ１．１）の２つのピーク呼出プログラムを使用して、ピークを呼び出した。ピークは最初にＭＡＣＳ２（デフォルトパラメータ＋－－ｂｗ５００－ｐ １ｅ－５－ｓ ６０－ｍ １０ ３０－－ｇｓｉｚｅ２．７ｅ９）を使用して呼び出され、ＳＩＣＥＲによるピーク呼出が続いた［パラメータ：冗長しきい値＝１、ウインドウサイズ（ｂｐ）＝２００、フラグメントサイズ＝１５０ 有効ゲノム画分＝０．８５、ギャップサイズ（ｂｐ）＝６００、ＦＤＲ＝１ｅ－３］。各サンプルのＳＩＣＥＲピークと交差するＭＡＣＳ２ピークは、ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｉｎｔｅｒｓｅｃｔを使用してマージされて、全てのヒトＤＮＡ開始部位（ＩＳ）の包括的なリストが作成された（表１）。ＥＮＣＯＤＥプロジェクト（ｈｇ３８、ＥＮＣＳＲ６３６ＨＦＦ）によって定義されたブラックリストに登録された領域は、最終的なヒトＤＮＡ複製起点リストから差し引かれた。マウスＳＮＳ－ｓｅｑサンプルは、ヒトＳＮＳ－ｓｅｑとして処理され、２５，１６８領域を含む各分位数を有する分位数（ｍＱ１－ｍＱ１０）にも分割された。主成分及び分析及びサンプル距離は、単一のドナーから得られた細胞型（すなわちＨＭＥＣ）の場合、他の細胞型よりも、複製の間で起点の重複が強いことを示唆している。ドナー由来の細胞型（造血細胞）について、本発明者等は、ＳＮＳ－ｓｅｑサンプルが、治療状態（すなわち、ＥＰＯによる治療）よりも同じドナー内でより類似していることを観察した。これは、サンプルが起点（ドナー）ではなく処理（ＥＰＯ）に従ってクラスター化されるＲＮＡ－ｓｅｑデータとは対照的である。
【0093】
ＳＮＳ－ｓｅｑの最適化及び品質制御
ＳＮＳ－ｓｅｑデータを取得し、分析するために、様々な実験及びバイオインフォマティクスの方法論が使用されてきた。ＳＮＳ－ｓｅｑは、ゲノムＤＮＡを特異的に消化するλｅｘｎの能力に依存しているが、新しく合成され、ＲＮＡでプライミングされた新生ＤＮＡはそのまま残る。本発明者等の分析は、バックグラウンド又は実験的ゲノムＤＮＡバックグラウンドの非存在下で１９のヒトＳＮＳ－ｓｅｑサンプルを使用して起点位置を定義するためのピーク呼出が、サンプル当たりそれぞれ約２００，０００及び１５０，０００のピークを識別したことを示唆している（ピークの平均数）。適切な実験的バックグラウンド（ＲＮＡｓｅ及びλｅｘｎで処理された熱フラグメント化ゲノムＤＮＡ）を使用すると、この数は約半分に減少し、これは、適切なバックグラウンドの使用がピーク呼出での偽陽性を減らすために重要であることを示唆している。本発明者等がバックグラウンドシグナル（ＲＮＡｓｅ＋λｅｘｎ）の性質を調べた時、無作為化されたゲノム領域と比較した（２５０ｂｐ当たり約５リードは、２５０ｂｐ当たり約２リードと比較した）Ｇ－ｒｉｃｈ領域（Ｇ４、Ｇ－ｒｉｃｈ、ＣＧ－ｒｉｃｈ）についての最小のバイアスのみを観察し、ピーク呼出又は下流分析をゆがめるには不十分な値である。これは、本発明者等の実験条件下（特に本発明者等のλｅｘｎ消化条件下）で、推定Ｇ４、Ｇ及びＧＣ－ｒｉｃｈ配列が、無作為化されたＤＮＡ配列とほぼ同じ効率で消化されることを確認し、消化に耐性のある領域によって生成されるバックグラウンドが、適切な実験的バックグラウンドサンプルを使用することで説明できる。
ＳＮＳ－ｓｅｑデータを取得し、分析するために、様々な実験及びバイオインフォマティクスの方法論が使用されてきた。ＳＮＳ－ｓｅｑは、ゲノムＤＮＡを特異的に消化するλｅｘｎの能力に依存しているが、新しく合成され、ＲＮＡでプライミングされた新生ＤＮＡはそのまま残る。本発明者等の分析は、バックグラウンド又は実験的ゲノムＤＮＡバックグラウンドの非存在下で１９のヒトＳＮＳ－ｓｅｑサンプルを使用して起点位置を定義するためのピーク呼出が、サンプル当たりそれぞれ約２００，０００及び１５０，０００のピークを識別したことを示唆している（ピークの平均数）。適切な実験的バックグラウンド（ＲＮＡｓｅ及びλｅｘｎで処理された熱フラグメント化ゲノムＤＮＡ）を使用すると、この数は約半分に減少し、これは、適切なバックグラウンドの使用がピーク呼出での偽陽性を減らすために重要であることを示唆している。本発明者等がバックグラウンドシグナル（ＲＮＡｓｅ＋λｅｘｎ）の性質を調べた時、無作為化されたゲノム領域と比較した（２５０ｂｐ当たり約５リードは、２５０ｂｐ当たり約２リードと比較した）Ｇ－ｒｉｃｈ領域（Ｇ４、Ｇ－ｒｉｃｈ、ＣＧ－ｒｉｃｈ）についての最小のバイアスのみを観察し、ピーク呼出又は下流分析をゆがめるには不十分な値である。これは、本発明者等の実験条件下（特に本発明者等のλｅｘｎ消化条件下）で、推定Ｇ４、Ｇ及びＧＣ－ｒｉｃｈ配列が、無作為化されたＤＮＡ配列とほぼ同じ効率で消化されることを確認し、消化に耐性のある領域によって生成されるバックグラウンドが、適切な実験的バックグラウンドサンプルを使用することで説明できる。
【0094】
起点の頂点及び配向
起点の頂点は、カスタムメイドのスクリプトを使用して全てのサンプルからのｂａｍファイルを使用して、２５ｂｐのスライディングウインドウから５０ｂｐのビンで最大数のＳＮＳ－ｓｅｑリードを計算することによって定義された（コードの可用性を参照）。リード数が最も多いビンの中間点は、ＩＳの頂上と見なされた。
起点の頂点は、カスタムメイドのスクリプトを使用して全てのサンプルからのｂａｍファイルを使用して、２５ｂｐのスライディングウインドウから５０ｂｐのビンで最大数のＳＮＳ－ｓｅｑリードを計算することによって定義された（コードの可用性を参照）。リード数が最も多いビンの中間点は、ＩＳの頂上と見なされた。
【0095】
起点には、ＩＳ頂点に隣接する領域のＧ含有量に基づいてプラス又はマイナスの鎖が割り当てられて、Ｇ－ｒｉｃｈ隣接領域がＩＳ頂点の上流（左）に向けられた。これを行うために、本発明者等は、各ＩＳの５００ｂｐ内のＧ塩基の数を計算し、（＋）又は（－）鎖を各起点に割り当てて、Ｇ塩基の数が最も多い５００ｂｐがＩＳの上流に向けられることを確認した。
【0096】
ＤＮＡ複製起点の定量化、分類、及び相違活性
このプロジェクトのバイオインフォマティクスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ（ＣａｓｔＬｅｓ及びＢｌｕｅＢｅａｒ）のハイパワーコンピューティングクラスターによってサポートされた。ＤＮＡ複製起点でのＳＮＳ－ｓｅｑシグナルの定量化は、全てのヒト／マウス起点座標を使用して、ＲパッケージＤｉｆｆＢｉｎｄ（ｖ３．９、ｄｂａ．ｓＣｏｒｅ：ＴＭＭ＿ｍｉｎｕｓ＿ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）を使用して行われた。ＴＭＭ＿ｍｉｎｕｓコマンドは、ＴＭＭベースのアルゴリズムを使用して１９サンプル全てを正規化する前に、シグナルからバックグラウンドシグナルを差し引いた。原稿の「正規化されたＳＮＳ－ｓｅｑシグナル」は、バックグラウンドの差引き及びＴＭＭの正規化後に得られたこれらの値を指す。ＴＭＭの正規化の後、正規化された平均ＳＮＳ－ｓｅｑカウントが各起点について１９サンプルにわたって計算され、この値に基づいて起点がランク付けされた。次に、各起点は、平均活性に基づいてランク付けされたリスト内の起点の位置を表す分位数（Ｑ１～Ｑ１０）に割り当てられた。例えば、活性の上位１０パーセンタイルの全ての起点はＱ１に割り当てられ、１０パーセンタイルと２０パーセンタイルとの間にランク付けされた全ての起点はＱ２に割り当てられ、他も同様である。コア起点は全てＱ１及びＱ２起点であったが、確率論的起点は他の全ての分位数（Ｑ３～Ｑ１０）にあった。スーパー起点は、正規化されたＳＮＳ－ｓｅｑカウントが５０を超えると定義された。スーパー起点は現在の分析には含まれていないが、ＭＹＣ及びＬａｍｉｎＢ２起点等、ゲノムに非常に遍在する起点に関心のある読者のために、表１に列挙されている。
このプロジェクトのバイオインフォマティクスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ（ＣａｓｔＬｅｓ及びＢｌｕｅＢｅａｒ）のハイパワーコンピューティングクラスターによってサポートされた。ＤＮＡ複製起点でのＳＮＳ－ｓｅｑシグナルの定量化は、全てのヒト／マウス起点座標を使用して、ＲパッケージＤｉｆｆＢｉｎｄ（ｖ３．９、ｄｂａ．ｓＣｏｒｅ：ＴＭＭ＿ｍｉｎｕｓ＿ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）を使用して行われた。ＴＭＭ＿ｍｉｎｕｓコマンドは、ＴＭＭベースのアルゴリズムを使用して１９サンプル全てを正規化する前に、シグナルからバックグラウンドシグナルを差し引いた。原稿の「正規化されたＳＮＳ－ｓｅｑシグナル」は、バックグラウンドの差引き及びＴＭＭの正規化後に得られたこれらの値を指す。ＴＭＭの正規化の後、正規化された平均ＳＮＳ－ｓｅｑカウントが各起点について１９サンプルにわたって計算され、この値に基づいて起点がランク付けされた。次に、各起点は、平均活性に基づいてランク付けされたリスト内の起点の位置を表す分位数（Ｑ１～Ｑ１０）に割り当てられた。例えば、活性の上位１０パーセンタイルの全ての起点はＱ１に割り当てられ、１０パーセンタイルと２０パーセンタイルとの間にランク付けされた全ての起点はＱ２に割り当てられ、他も同様である。コア起点は全てＱ１及びＱ２起点であったが、確率論的起点は他の全ての分位数（Ｑ３～Ｑ１０）にあった。スーパー起点は、正規化されたＳＮＳ－ｓｅｑカウントが５０を超えると定義された。スーパー起点は現在の分析には含まれていないが、ＭＹＣ及びＬａｍｉｎＢ２起点等、ゲノムに非常に遍在する起点に関心のある読者のために、表１に列挙されている。
【0097】
各細胞型のコア起点に該当するＳＮＳ－ｓｅｑシグナルの百分率を決定するために、正規化された（バックグラウンド減算及び正規化された）ＳＮＳ－ｓｅｑシグナルの合計、並びにＱ１、Ｑ２、及び確率論的起点（Ｑ３－Ｑ１０）に属する百分率を計算した。
【0098】
ＲライブラリＤｉｆｆｂｉｎｄ（ｖ３．９、ＴＭＭ＿ｍｉｎｕｓ）とＤｅＳｅｑ２を連続して使用して、起点の活性差を計算した（コードについては、コードの可用性を参照されたい）。
【0099】
初期及び後期の複製ドメインからの総開始
初期及び後期複製ドメインは、Ｈ９及びＣＤ３４＋造血前駆細胞に共通する初期及び後期複製ドメインに基づいて定義された（表３）。起点座標（＋／－２ｋｂ）はドメインから削除（マスク）された。次に、ＳＮＳ－ｓｅｑシグナルをサンプル及びバックグラウンドサンプルの両方でこれらのドメインで定量化し、ＲＰＫＭによって正規化した。次に、シグナルは次のように計算した。初期複製ドメイン上のサンプルの総ＳＮＳ－ｓｅｑシグナルから初期複製ドメイン上のバックグラウンドの総ＳＮＳ－ｓｅｑシグナルを差し引く。後期複製ドメインについても同じことを実行した。各細胞型について、３連の平均を計算した。ほとんどの細胞型では、非起点複製ドメインからのシグナルはバックグラウンドを超えなかった（つまり、負であった）。
初期及び後期複製ドメインは、Ｈ９及びＣＤ３４＋造血前駆細胞に共通する初期及び後期複製ドメインに基づいて定義された（表３）。起点座標（＋／－２ｋｂ）はドメインから削除（マスク）された。次に、ＳＮＳ－ｓｅｑシグナルをサンプル及びバックグラウンドサンプルの両方でこれらのドメインで定量化し、ＲＰＫＭによって正規化した。次に、シグナルは次のように計算した。初期複製ドメイン上のサンプルの総ＳＮＳ－ｓｅｑシグナルから初期複製ドメイン上のバックグラウンドの総ＳＮＳ－ｓｅｑシグナルを差し引く。後期複製ドメインについても同じことを実行した。各細胞型について、３連の平均を計算した。ほとんどの細胞型では、非起点複製ドメインからのシグナルはバックグラウンドを超えなかった（つまり、負であった）。
【0100】
初期又は後期（それぞれ）の複製ドメインからの開始シグナルがバックグラウンドを超えることを本発明者等が見出したｈＥＳＣ及びＩＭＭ－１について、本発明者等は、非起点領域及び起点領域からの開始の百分率を計算し、それを図５５に提示した。
【0101】
コア起点のクラスタリング
コア起点のクラスタリングは、ｂｅｄｔｏｏｌｓスイート（ｖ．２．２５、コマンド：ｂｅｄｔｏｏｌｓクラスター）を使用して、最も近いコア起点までの最大距離７ｋｂで行った。ｂｅｄｔｏｏｌｓはカテゴリカルクラスタリングを実行しないことに留意されたい。図６２は、クラスタリングの図を示している。これは、コア起点の７０％が、別のコア起点から７ｋｂの最大距離にある少なくとも２つ以上のコア起点を有するクラスターで見出されたことを意味する。コア起点の１５％を構成する単離したコア起点は、別のコア起点から１５ｋｂ超離れていることが見出される。本発明者等はまた、最も近いコア起点まで１５ｋｂ未満であるが７ｋｂ超である「緩クラスター化」コア起点を定義した。
コア起点のクラスタリングは、ｂｅｄｔｏｏｌｓスイート（ｖ．２．２５、コマンド：ｂｅｄｔｏｏｌｓクラスター）を使用して、最も近いコア起点までの最大距離７ｋｂで行った。ｂｅｄｔｏｏｌｓはカテゴリカルクラスタリングを実行しないことに留意されたい。図６２は、クラスタリングの図を示している。これは、コア起点の７０％が、別のコア起点から７ｋｂの最大距離にある少なくとも２つ以上のコア起点を有するクラスターで見出されたことを意味する。コア起点の１５％を構成する単離したコア起点は、別のコア起点から１５ｋｂ超離れていることが見出される。本発明者等はまた、最も近いコア起点まで１５ｋｂ未満であるが７ｋｂ超である「緩クラスター化」コア起点を定義した。
【0102】
ＯＫ－ｓｅｑデータとの比較：緊密にクラスター化されたコア起点を定義するために、本発明者等は、６つ以上のコア起点を含むコア起点クラスターをスクリーニングした。これにより、平均サイズが２７，２８７ｂｐで、１３，５１９のコア起点を含む１０３９のクラスターが生成された。ＯＫ－ｓｅｑはＸ染色体及びＹ染色体をマッピングしなかったので、本発明者等は、この比較のためにこれらの染色体にマッピングされたクラスターも除去した。緊密なコア起点クラスターのサイズは、ＯＫ－ｓｅｑによって定義された平均開始ゾーンに匹敵し、サイズは約３４ｋｂである。
【0103】
ＩＳとＰｒｅ－ＲＣ構成要素間の距離
ピーク座標は、関連するソース（ＯＲＣ１２４、ＯＲＣ２２５、及びＭＣＭ７２６）からダウンロードされ、ヒトゲノムのｈｇ３８バージョンにマッピングされた。ＯＲＣ２ピークについては、本発明者等はピークの頂点を提供されたが、ＯＲＣ１及びＭＣＭ７のピークについては、ピークの中心がピークの頂点として計算された。ＯＲＣ１及びＯＲＣ２との重複の場合、ピークは＋／－２ｋｂ拡張された。Ｐｒｅ－ＲＣ構成要素とＩＳ頂点との間の距離の密度をマッピングするために、本発明者等は、ＩＳの１０ｋｂの距離内にある全てのＰｒｅ－ＲＣ構成要素について、ＩＳ頂点及びＯＲＣ２頂点又はＯＲＣ１／ＭＣＭ７ピーク中心間の距離を計算した。次いで、本発明者等は、これらの距離の密度をＲにプロットした。対照として、ＩＳの上流又は下流でいずれの濃縮も示さなかったｐｒｅ－ＲＣ成分の無作為化されたゲノム座標を用いて、この手順を繰り返した。
ピーク座標は、関連するソース（ＯＲＣ１２４、ＯＲＣ２２５、及びＭＣＭ７２６）からダウンロードされ、ヒトゲノムのｈｇ３８バージョンにマッピングされた。ＯＲＣ２ピークについては、本発明者等はピークの頂点を提供されたが、ＯＲＣ１及びＭＣＭ７のピークについては、ピークの中心がピークの頂点として計算された。ＯＲＣ１及びＯＲＣ２との重複の場合、ピークは＋／－２ｋｂ拡張された。Ｐｒｅ－ＲＣ構成要素とＩＳ頂点との間の距離の密度をマッピングするために、本発明者等は、ＩＳの１０ｋｂの距離内にある全てのＰｒｅ－ＲＣ構成要素について、ＩＳ頂点及びＯＲＣ２頂点又はＯＲＣ１／ＭＣＭ７ピーク中心間の距離を計算した。次いで、本発明者等は、これらの距離の密度をＲにプロットした。対照として、ＩＳの上流又は下流でいずれの濃縮も示さなかったｐｒｅ－ＲＣ成分の無作為化されたゲノム座標を用いて、この手順を繰り返した。
【0104】
データ分析及びプロット
Ｒのｇｇｐｌｏｔ２（ｖ３．１．０）及びｐｈｅａｔｍａｐ（ｖ１．０．１２）を使用して、ヒートマップ、箱ひげ図、及びその他のプロットを生成した。円グラフは、Ｒで取得したデータを使用してＥｘｃｅｌ（ｖ１６．１６．２３）で生成した。ピアソン及びスピアマンの相関マトリックスの両方が（コマンドｃｏｒ（））を使用してＲで計算される。主成分分析（ＰＣＡ）及びオイラー図はＲで生成された（コマンドｐｃａ、ライブラリｅｕｌｅｒｒ）。ゲノム座標（分位数、代替起点マッピング法、ヒストン／Ｐｒｅ－ＲＣ結合部位）の比較（最小重複１ｂｐのｉｎｔｅｒｓｅｃｔＢｅｄ）、及び無作為化されたゲノム座標の生成は、ｂｅｄｔｏｏｌｓスイート（ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｓｈｕｆｆｌｅ－ｃｈｒｏｍ，－ｎｏＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ、可能な場合）を使用して計算された。ＯＲＣ１及びＯＲＣ２結合部位と起点との間の重複の計算では、２ｋｂの最大距離が正の重複として採用された。ＳＮＳ－ｓｅｑリード密度プロット及びヒートマップは、ｄｅｅｐｔｏｏｌｓ（ｐｌｏｔＰｒｏｆｉｌｅ、ｐｌｏｔＨｅａｔｍａｐ）を使用して生成された。必要に応じて、異なるゲノムアセンブリのゲノム座標をＵＣＳＣ ＬｉｆｔＯｖｅｒ（ＵＣＳＣ Ｔｏｏｌｋｉｔ）を使用して変換した。外部ソースからダウンロードしたゲノム領域の完全なリストは、表３に見出すことができる。
Ｒのｇｇｐｌｏｔ２（ｖ３．１．０）及びｐｈｅａｔｍａｐ（ｖ１．０．１２）を使用して、ヒートマップ、箱ひげ図、及びその他のプロットを生成した。円グラフは、Ｒで取得したデータを使用してＥｘｃｅｌ（ｖ１６．１６．２３）で生成した。ピアソン及びスピアマンの相関マトリックスの両方が（コマンドｃｏｒ（））を使用してＲで計算される。主成分分析（ＰＣＡ）及びオイラー図はＲで生成された（コマンドｐｃａ、ライブラリｅｕｌｅｒｒ）。ゲノム座標（分位数、代替起点マッピング法、ヒストン／Ｐｒｅ－ＲＣ結合部位）の比較（最小重複１ｂｐのｉｎｔｅｒｓｅｃｔＢｅｄ）、及び無作為化されたゲノム座標の生成は、ｂｅｄｔｏｏｌｓスイート（ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｓｈｕｆｆｌｅ－ｃｈｒｏｍ，－ｎｏＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ、可能な場合）を使用して計算された。ＯＲＣ１及びＯＲＣ２結合部位と起点との間の重複の計算では、２ｋｂの最大距離が正の重複として採用された。ＳＮＳ－ｓｅｑリード密度プロット及びヒートマップは、ｄｅｅｐｔｏｏｌｓ（ｐｌｏｔＰｒｏｆｉｌｅ、ｐｌｏｔＨｅａｔｍａｐ）を使用して生成された。必要に応じて、異なるゲノムアセンブリのゲノム座標をＵＣＳＣ ＬｉｆｔＯｖｅｒ（ＵＣＳＣ Ｔｏｏｌｋｉｔ）を使用して変換した。外部ソースからダウンロードしたゲノム領域の完全なリストは、表３に見出すことができる。
【0105】
ＲｅＭａｐ及び推定エンハンサ
起点はＲｅＭａｐ ａｔｌａｓ５５（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｍａｐ．ｃｉｓｒｅｇ．ｅｕ）にマッピングされた。ＲｅＭａｐは、パブリックデータセットとエンコードデータセットの両方からの転写調節因子ＣｈＩＰ－ｓｅｑ実験の統合分析の結果である。ＲｅＭａｐカタログは、４８５の転写因子、転写共活性因子、及びクロマチンリモデリング因子からの８０００万のピークを含む。重複はｂｅｄｔｏｏｌｓ（ｖ．２．２５）で評価し、最小１０のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク重複を有する領域のみをカウントした。
起点はＲｅＭａｐ ａｔｌａｓ５５（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｍａｐ．ｃｉｓｒｅｇ．ｅｕ）にマッピングされた。ＲｅＭａｐは、パブリックデータセットとエンコードデータセットの両方からの転写調節因子ＣｈＩＰ－ｓｅｑ実験の統合分析の結果である。ＲｅＭａｐカタログは、４８５の転写因子、転写共活性因子、及びクロマチンリモデリング因子からの８０００万のピークを含む。重複はｂｅｄｔｏｏｌｓ（ｖ．２．２５）で評価し、最小１０のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク重複を有する領域のみをカウントした。
【0106】
ＲＮＡ－Ｓｅｑ及び分析
起点位置（ＳＮＳ－Ｓｅｑ）が転写プログラム（ＲＮＡ－ｓｅｑ）に適合しているかどうかを判断するために、全てのＨＣサンプルでＲＮＡ－ｓｅｑプロファイリングを実行した。そのために、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して２００，０００の細胞の一定分量から≧２μｇのＲＮＡを抽出及び精製し、続いてＲＮＥａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ７４１０４）を使用してＲＮＡ精製を行った。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して、ＲＮＡの質及び量を分析した。ｃＤＮＡライブラリは、ＴｒｕｅＳｅｑ Ｃｈｉｐ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ ＧｅｎｏｍｉＸ施設によって調製された。品質制御（ＦａｓｔＱＣ ｖ０．１１．５を使用）の後、ＴｏｐＨａｔソフトウェア（バージョン２．１．１）を使用して、マッピングリードのためのＢｏｗｔｉｅ２（バージョン２．２．８）を介してスプライスジャンクションマッピングを使用した。遺伝子のリードカウントは、ＨＴＳｅｑ－ｃｏｕｎｔ（バージョン０．６．１ｐ１）を使用して実行した。遺伝子アノテーションは、ＧＥＮＣＯＤＥ、リリース２５（ＧＲＣｈ３８．ｐ７、２０１６年９月２３日）からダウンロードした。データは、ｅｄｇｅＲ（バージョン３．８．６）で実装された相対対数式によって正規化され、一般化された線形モデルを用いて、ＤｅＳｅｑ２（Ｒ３．２のバージョン１．１８．０）を使用して、差分遺伝子を同定するためのペアワイズ比較統計分析が実行された（結果はｅｄｇｅＲバージョン３．８．６で確認された）。
起点位置（ＳＮＳ－Ｓｅｑ）が転写プログラム（ＲＮＡ－ｓｅｑ）に適合しているかどうかを判断するために、全てのＨＣサンプルでＲＮＡ－ｓｅｑプロファイリングを実行した。そのために、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して２００，０００の細胞の一定分量から≧２μｇのＲＮＡを抽出及び精製し、続いてＲＮＥａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ７４１０４）を使用してＲＮＡ精製を行った。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して、ＲＮＡの質及び量を分析した。ｃＤＮＡライブラリは、ＴｒｕｅＳｅｑ Ｃｈｉｐ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ ＧｅｎｏｍｉＸ施設によって調製された。品質制御（ＦａｓｔＱＣ ｖ０．１１．５を使用）の後、ＴｏｐＨａｔソフトウェア（バージョン２．１．１）を使用して、マッピングリードのためのＢｏｗｔｉｅ２（バージョン２．２．８）を介してスプライスジャンクションマッピングを使用した。遺伝子のリードカウントは、ＨＴＳｅｑ－ｃｏｕｎｔ（バージョン０．６．１ｐ１）を使用して実行した。遺伝子アノテーションは、ＧＥＮＣＯＤＥ、リリース２５（ＧＲＣｈ３８．ｐ７、２０１６年９月２３日）からダウンロードした。データは、ｅｄｇｅＲ（バージョン３．８．６）で実装された相対対数式によって正規化され、一般化された線形モデルを用いて、ＤｅＳｅｑ２（Ｒ３．２のバージョン１．１８．０）を使用して、差分遺伝子を同定するためのペアワイズ比較統計分析が実行された（結果はｅｄｇｅＲバージョン３．８．６で確認された）。
【0107】
Ｇ－ｒｉｃｈ領域の定義（Ｇ４、ＣｐＧｉ、Ｇ－ｒｉｃｈ）
（ｉ）Ｋ＋及びピリドスタチン（ＰＤＳ）処理２８によって誘発されるミスマッチの同定（インビトロ Ｇ４）（ｉｉ）Ｇ４Ｈｕｎｔｅｒ２９による予測（インシリコＧ４）に基づいて、２つの方法を使用してヒトゲノムのＧ４要素を定義した。両方のデータセットはｈｇ１９で生成されたため、本発明者等は、重複を調べるために、本発明者等の起点座標をｈｇ１９に変換した。
（ｉ）Ｋ＋及びピリドスタチン（ＰＤＳ）処理２８によって誘発されるミスマッチの同定（インビトロ Ｇ４）（ｉｉ）Ｇ４Ｈｕｎｔｅｒ２９による予測（インシリコＧ４）に基づいて、２つの方法を使用してヒトゲノムのＧ４要素を定義した。両方のデータセットはｈｇ１９で生成されたため、本発明者等は、重複を調べるために、本発明者等の起点座標をｈｇ１９に変換した。
【0108】
サイズが３００ｂｐを超えるＣｐＧアイランドは、ＵＣＳＣ（ｈｇ３８）からダウンロードした。Ｇ－ｒｉｃｈ領域は、ｂｅｄｔｏｏｌｓコマンドｂｅｄｔｏｏｌｓ ｍａｋｅｗｉｎｄｏｗｓ、ｎｕｃ、及びカウントを使用して、１００ｂｐのスライディングウインドウ（ｈｇ３８）で５００ｂｐウインドウ内のＧ密度が３７％を超えると定義された。図７９の分析にはＧ－ｒｉｃｈ領域リストが使用された。
【0109】
ゲノム領域における塩基組成の解析及びモチーフ発見
塩基組成は、ＨＯＭＥＲ６６を使用して、ウインドウサイズは１００ｂｐで、ＩＳ頂点をピークの中心として分析した。密度データは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで視覚化した。
ＨＯＭＥＲ（ｖ４．１１．１）を使用して、コア起点頂点と４００ｂｐ上流領域との間のモチーフ濃縮を検索した（配向された起点では、これはＧ－ｒｉｃｈ領域に対応する）。発明者等は以下のパラメータを使用した。ｐｅｒｌ ｆｉｎｄＭｏｔｉｆｓＧｅｎｏｍｅ．ｐｌ ｈｇ３８－ｓｉｚｅ ｇｉｖｅｎ－ｌｅｎ ４，６，８，１０，１２－ｍａｓｋ－ｎｏｒｅｖｏｐｐ［ｎｏｎｅ，－ｎｏｗｅｉｇｈｔ又は－ＣｐＧ］
塩基組成は、ＨＯＭＥＲ６６を使用して、ウインドウサイズは１００ｂｐで、ＩＳ頂点をピークの中心として分析した。密度データは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで視覚化した。
ＨＯＭＥＲ（ｖ４．１１．１）を使用して、コア起点頂点と４００ｂｐ上流領域との間のモチーフ濃縮を検索した（配向された起点では、これはＧ－ｒｉｃｈ領域に対応する）。発明者等は以下のパラメータを使用した。ｐｅｒｌ ｆｉｎｄＭｏｔｉｆｓＧｅｎｏｍｅ．ｐｌ ｈｇ３８－ｓｉｚｅ ｇｉｖｅｎ－ｌｅｎ ４，６，８，１０，１２－ｍａｓｋ－ｎｏｒｅｖｏｐｐ［ｎｏｎｅ，－ｎｏｗｅｉｇｈｔ又は－ＣｐＧ］
【0110】
進化保存分析
Ｒｅｆｓｅｑエクソン、イントロン、及びプロモータ領域（転写開始部位の上流－５００～０ｂｐとして定義）及びＰｈａｓｔｃｏｎスコア（Ｐｈａｓｔｃｏｎ２０ｗａｙ）は、ＵＣＳＣテーブルブラウザ（最終更新１２／２０１７）からダウンロードした。領域の各セットの平均累積ｐｈａｓｔｃｏｎスコアは、Ｒ及びｂｅｄｔｏｏｌｓスイート（ｂｅｄｔｏｏｌｓカバレッジ）を使用して計算した。ヒトの起点座標は、ＬｉｆｔＯｖｅｒ（ＵＣＳＣツールキット）又はＢＬＡＳＴのいずれかを使用してマウス座標に変換された。非常に類似した結果がＢＬＡＳＴ及びＬｉｆｔＯｖｅｒで得られ、本発明者等はＬｉｆｔＯｖｅｒからの結果を提示した。
Ｒｅｆｓｅｑエクソン、イントロン、及びプロモータ領域（転写開始部位の上流－５００～０ｂｐとして定義）及びＰｈａｓｔｃｏｎスコア（Ｐｈａｓｔｃｏｎ２０ｗａｙ）は、ＵＣＳＣテーブルブラウザ（最終更新１２／２０１７）からダウンロードした。領域の各セットの平均累積ｐｈａｓｔｃｏｎスコアは、Ｒ及びｂｅｄｔｏｏｌｓスイート（ｂｅｄｔｏｏｌｓカバレッジ）を使用して計算した。ヒトの起点座標は、ＬｉｆｔＯｖｅｒ（ＵＣＳＣツールキット）又はＢＬＡＳＴのいずれかを使用してマウス座標に変換された。非常に類似した結果がＢＬＡＳＴ及びＬｉｆｔＯｖｅｒで得られ、本発明者等はＬｉｆｔＯｖｅｒからの結果を提示した。
【0111】
ヒト及びマウスゲノムにおけるＤＮＡ複製起点の予測
ヒト及びマウスのゲノムは、ｂｅｄｔｏｏｌｓ（ｍａｋｅｗｉｎｄｏｗｓ）スイート（ヒトゲノムで約３０００万のウインドウ）を使用して、１００ｂｐのスライディングウインドウサイズで対の５００ｂｐウインドウに（ワトソン及びクリック鎖を個別に）分割された。次に、各対のウインドウ内の各ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の数を計算した（ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｎｕｃ）。対になった（連続した）５００ｂｐウインドウは、第１のウインドウで最小２８％のＧ、連続する第２のウインドウで最小２５％のＧを有するＤＮＡ配列パターン（ハイパーモチーフ）に適合するように評価され、最初及び第２のウインドウ間の最大Ａ／Ｔ含有量０．２１で、８～４０％のＧ含有量低下を要した。これにより、１，０４１，５９４のウインドウ対を同定した。次に、保持されたウインドウ対をｂｅｄｔｏｏｌｓ ｍｅｒｇｅを使用してマージし、重複していない推定起点領域（平均サイズ１．７Ｋｂの２２８，４４２領域）を同定した。
ヒト及びマウスのゲノムは、ｂｅｄｔｏｏｌｓ（ｍａｋｅｗｉｎｄｏｗｓ）スイート（ヒトゲノムで約３０００万のウインドウ）を使用して、１００ｂｐのスライディングウインドウサイズで対の５００ｂｐウインドウに（ワトソン及びクリック鎖を個別に）分割された。次に、各対のウインドウ内の各ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の数を計算した（ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｎｕｃ）。対になった（連続した）５００ｂｐウインドウは、第１のウインドウで最小２８％のＧ、連続する第２のウインドウで最小２５％のＧを有するＤＮＡ配列パターン（ハイパーモチーフ）に適合するように評価され、最初及び第２のウインドウ間の最大Ａ／Ｔ含有量０．２１で、８～４０％のＧ含有量低下を要した。これにより、１，０４１，５９４のウインドウ対を同定した。次に、保持されたウインドウ対をｂｅｄｔｏｏｌｓ ｍｅｒｇｅを使用してマージし、重複していない推定起点領域（平均サイズ１．７Ｋｂの２２８，４４２領域）を同定した。
【0112】
ヒト及びマウスゲノムにおけるＤＮＡ複製起点の予測
ゲノムスキャンアルゴリズム
ヒト及びマウスのゲノムは、ｂｅｄｔｏｏｌｓ（ｍａｋｅｗｉｎｄｏｗｓ）スイート（ヒトゲノム、ｈｇ３８で約３，０００万のウインドウ）を使用して、１００ｂｐのスライディングウインドウサイズで対の５００ｂｐウインドウに（ワトソン及びクリック鎖を個別に）分割された。次に、各対のウインドウ内の各ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の数を計算した（ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｎｕｃ）。対になった（連続した）５００ｂｐウインドウは、第１のウインドウで最小２８％のＧ、連続する第２のウインドウで最小２５％のＧを有するＤＮＡ配列パターン（ハイパーモチーフ）に適合するように評価され、最初及び第２のウインドウ間の最大Ａ／Ｔ含有量０．２１で、８～４０％のＧ含有量低下を要した。同じアルゴリズムが、同じ３０Ｍウインドウ対で逆相補鎖（つまり、クリック鎖、第２のウインドウで２８％Ｃ、第２のウインドウで最小２５％Ｃ）に対して実行され、検査されたウインドウ対の数は６０００万になった。
ゲノムスキャンアルゴリズム
ヒト及びマウスのゲノムは、ｂｅｄｔｏｏｌｓ（ｍａｋｅｗｉｎｄｏｗｓ）スイート（ヒトゲノム、ｈｇ３８で約３，０００万のウインドウ）を使用して、１００ｂｐのスライディングウインドウサイズで対の５００ｂｐウインドウに（ワトソン及びクリック鎖を個別に）分割された。次に、各対のウインドウ内の各ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の数を計算した（ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｎｕｃ）。対になった（連続した）５００ｂｐウインドウは、第１のウインドウで最小２８％のＧ、連続する第２のウインドウで最小２５％のＧを有するＤＮＡ配列パターン（ハイパーモチーフ）に適合するように評価され、最初及び第２のウインドウ間の最大Ａ／Ｔ含有量０．２１で、８～４０％のＧ含有量低下を要した。同じアルゴリズムが、同じ３０Ｍウインドウ対で逆相補鎖（つまり、クリック鎖、第２のウインドウで２８％Ｃ、第２のウインドウで最小２５％Ｃ）に対して実行され、検査されたウインドウ対の数は６０００万になった。
【0113】
これにより、１，０４１，５９４のウインドウ対を同定した。次に、保持されたウインドウ対を「ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｍｅｒｇｅ」を使用してマージし、重複していない推定起点領域（平均サイズ１．７Ｋｂの２２８，４４２領域）を同定した。この一連の領域は、図２３及び２４で起点の予測可能性を定義するために使用した。マウスゲノムの場合、まったく同じパラメータを使用して同じアルゴリズムが実行され、（ｍｍ１０からの２７ｘ２００万の可能な対）のうち６８９，２８５ウインドウ対が保持される。同様に、これらの領域をマージして（ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｍｅｒｇｅ）、２３０，０５２の重複しない領域を生成し、ｂｅｄｔｏｏｌｓを使用してマウス起点と交差させ（ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ－ｗａ－ｕ）、図２５を生成した。
【0114】
機械学習及びハイパーモチーフ分析
本発明者等のアルゴリズムの予測変数は、重複しない座標と起点の交差によって定義される「起点」クラスへのメンバーシップである（特にコア起点の予測力を最大化する）。
本発明者等のアルゴリズムの予測変数は、重複しない座標と起点の交差によって定義される「起点」クラスへのメンバーシップである（特にコア起点の予測力を最大化する）。
【0115】
５００ｂｐウインドウの３０００万対が無作為に２つの同じサイズのデータセットに分割された。データセットの１つは、モデル開発（試験セット）の最後の最終検証用に予約された。もう１つのセットは、予測モデルのトレーニング及び内部検証に使用した。次に、トレーニングセットを１０の交差しないサブセットに無作為に分割し、１０倍の内部交差検証を実行した（つまり、これらのサブセットの９つを内部トレーニングに使用し、残りの１つをモデルの内部検証に使用し、これを１０回繰り返し、毎回異なる検証サブセットを使用）。最初に、これら１０の内部トレーニングデータセットのそれぞれに対してゲノムスキャンアルゴリズムを実行した。ＧＳアルゴリズムによって生成された１，０４１，５９４の領域のセット（ウインドウ対、上記を参照）について、本発明者等はドメイン知識を使用して２２のパラメータ／予測因子のセット（表２を参照）を構築した。次に、機械学習手順がゲノムスキャンの出力に適用され、それによって階層的な分類子が構築された。この手順は、２つの異なる機械学習アルゴリズム（ｉ）貪欲な増分特徴を使用したロジスティック回帰、及び（ｉｉ）ｌａｓｓｏ正則化を使用したサポートベクターマシンに対して１００回繰り返された。貪欲な特徴選択は、統計ＲパッケージＣＡＲＲｏＴの修正版（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｏｎｅ ｉｎ Ｔｅｎ Ｒｕｌｅ，Ｒ ＣＲＡＮ ｐａｃｋａｇｅ，２０１８，Ａｌｉｎａ Ｂａｚａｒｏｖａ ａｎｄ Ｍａｒｋｏ Ｒａｓｅｔａ，ｖ１．０）を使用して実行された。ソフトウェアは、ｂｅｄｔｏｏｌｓを使用して出力を交差しないゲノム領域にマージし、次いでこれらの領域が与えられたモデルの予測力を評価できるように変更された。サポートベクターマシンの予測は、ＲパッケージｓｐａｒｓｅＳＶＭ６７及び上記の追加のスクリプトを使用して実行された。
【0116】
本発明者等は、０．５＊［ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）＋ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）］として定義されるバランスの取れた（平均的なクラスごとの）精度を最大化することを目的としてモデルを選択し、ここで、ＴＰ、ＴＮ、ＦＰ、ＦＮは、真陽性（Ｔｒｕｅ Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）、真陰性（Ｔｒｕｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅｓ）、偽陽性（Ｆａｌｓｅ Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）、偽陰性（Ｆａｌｓｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅｓ）を意味する。起点の合成的に構築された負のインスタンスがないため、これらの量は、５００ｂｐウインドウ対の真陽性、真陰性、偽陽性、及び偽陰性ヒットに対応する領域の全長に関して計算された。本発明者等は、予測力の改善が１０＾－３を下回るまで、貪欲な特徴選択に特徴を追加し続けた。ＳＶＭを使用する場合、本発明者等は、上で定義したように、相互検証された予測力が最も高くなるペナルティパラメータを選択した。手順の最後に、本発明者等は、所与の１０倍交差検証区分に対して最高の予測力を示した各方法について１００の予測モデルを得た。ロジスティック回帰の場合、ＵＰ＿Ｃ＿ｆｒａｃｔｉｏｎ、ＵＰ＿Ｇ＿ｆｒａｃｔｉｏｎ、Ｄｏｗｎ＿Ｔ＿ｆｒａｃｔｉｏｎ、Ｇ＿ｃｏｎｔｅｎｔ＿２ｋｂ、ｒａｍｐＧ、ＡＡＡ、ＧＧ、ＴＴＴの特徴で構成される予測因子の頻度が最も高い最良のモデルが明らかになった（表２）。トレーニングが完了すると、１０倍の交差検証に基づいて選択されたモデルが、５００ｂｐウインドウの１５００万対の元のトレーニングセット全体に適合した。得られたトレーニング済みモデルは、最終的なホールドアウト試験セットで試験された（非常に最初の段階でトレーニング用のモデルから分離され、モデル構築フェーズ全体で触れられることはなかった）。各アルゴリズムが重複しないウインドウ対を報告したことに留意されたい（つまり、ウインドウ対がゲノムスキャンアルゴリズムによる順方向及び逆方向スキャン手順の両方で保持されている場合、このウインドウ対はいずれかの機械学習アルゴリズムによって一度陽性として報告される）。
【0117】
ゲノム全体の予測を生成するために、トレーニングされたモデルがＧＳの領域セット全体で実行され、その結果、ＬＲでは３３３，９８６のウインドウ対、ＳＶＭでは２７９，１９５のウインドウ対が各アルゴリズムによって陽性と呼ばれた。これらのウインドウ対は、ｂｅｄｔｏｏｌｓ（ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｍｅｒｇｅ）を使用してマージされ、６７，２９７（ＬＲ）及び５７，３３９（ＳＶＭ）領域の重複しないウインドウが生成された。本発明者等がゲノムをスキャンするために使用したスライディングウインドウパターンにより、各ウインドウは９つの他のウインドウをオーバーレイし、したがって同じゲノム領域が何度も報告されることに留意されたい。本発明者等は、ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｍｅｒｇｅを使用してそれらをマージすることによって反復領域を除去し、こうしてゲノムの重複しない領域を得る。これらの重複しない領域を使用して、最終的な予測領域（すなわち、コア起点の図２６）又は総偽陽性率（起点と交差しない領域、図７３、平均フラグメント長に正規化）を生成した。
【0118】
ＴＡＤドメイン全体の起点密度及び総開始シグナルの計算
ＴＡＤドメイン全体の起点密度を計算するために、各ＴＡＤを１００のビンに分割した（ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｍａｋｅｗｉｎｄｏｗｓ－ｎ１００）。各ＴＡＤのビンサイズはＴＡＤサイズの一部であるため、ＴＡＤの各ビンの起点の数はビンサイズに正規化された。ＴＡＤ全体の起点密度が異なる細胞型で有意に異なるかどうかを判断するために、各ビンのＴＡＤ全体の起点密度は、各ＴＡＤの中央にある２０のビンに正規化された（ビン数４０～６０）。これらの値は、ＴＡＤ全体の起点密度ではなく、ＴＡＤの中央と境界との間の起点密度の差を表す。
ＴＡＤドメイン全体の起点密度を計算するために、各ＴＡＤを１００のビンに分割した（ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｍａｋｅｗｉｎｄｏｗｓ－ｎ１００）。各ＴＡＤのビンサイズはＴＡＤサイズの一部であるため、ＴＡＤの各ビンの起点の数はビンサイズに正規化された。ＴＡＤ全体の起点密度が異なる細胞型で有意に異なるかどうかを判断するために、各ビンのＴＡＤ全体の起点密度は、各ＴＡＤの中央にある２０のビンに正規化された（ビン数４０～６０）。これらの値は、ＴＡＤ全体の起点密度ではなく、ＴＡＤの中央と境界との間の起点密度の差を表す。
【0119】
本発明者等は、ＴＡＤ境界又はＴＡＤ中心に位置する起点領域からの正規化された（バックグラウンドを差し引いた）シグナルの合計を計算した（表３、図４８及び５１のデータセット）。以前と同様に、ＴＡＤドメインは１００のビンに分割され、２０のビン（１～１０、９１～１００）が境界として定義され、２０のビン（４１～６０）が中心と見なされた。
【0120】
統計的有意性
図の凡例に示されているように、データの性質に応じて異なる統計検定が使用された。具体的には、Ｒコマンド「ｗｉｌｃｏｘｏｎ．ｔｅｓｔ」、「ｔ．ｔｅｓｔ」、及び「ｃｈｉｓｑ．ｔｅｓｔ」を使用して、統計的有意性を測定した。ｐ＝１Ｅ－３０７及びｐ＝２Ｅ－１６は、Ｒのメモリに格納されている最小値を表す（バージョンによって異なる）。カイ２乗検定は基本的に片側検定であるが、Ｗｉｌｃｏｘｏｎはノンパラメトリック分布を想定している。
図の凡例に示されているように、データの性質に応じて異なる統計検定が使用された。具体的には、Ｒコマンド「ｗｉｌｃｏｘｏｎ．ｔｅｓｔ」、「ｔ．ｔｅｓｔ」、及び「ｃｈｉｓｑ．ｔｅｓｔ」を使用して、統計的有意性を測定した。ｐ＝１Ｅ－３０７及びｐ＝２Ｅ－１６は、Ｒのメモリに格納されている最小値を表す（バージョンによって異なる）。カイ２乗検定は基本的に片側検定であるが、Ｗｉｌｃｏｘｏｎはノンパラメトリック分布を想定している。
【0121】
データの可用性
外部ソースからダウンロードしたデータを表３に示す。ＳＮＳ－ｓｅｑ／ＲＮＡ－ｓｅｑ及び処理済みファイルの生のリードファイルは、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）のアクセッションコードＧＳＥ１２８４７７で見つけることができる。
外部ソースからダウンロードしたデータを表３に示す。ＳＮＳ－ｓｅｑ／ＲＮＡ－ｓｅｑ及び処理済みファイルの生のリードファイルは、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）のアクセッションコードＧＳＥ１２８４７７で見つけることができる。
【0122】
コードの可用性
ＳＮＳ－ｓｅｑデータの分析に使用されるスクリプト及びその他のバイオインフォマティクスパイプラインは、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｉａｋｅｒｍａｎ／ＳＮＳ－ｓｅｑに見出される。
ＳＮＳ－ｓｅｑデータの分析に使用されるスクリプト及びその他のバイオインフォマティクスパイプラインは、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｉａｋｅｒｍａｎ／ＳＮＳ－ｓｅｑに見出される。
【0123】
結果
ヒトゲノムにおけるＤＮＡ複製起点のランドスケープ
最適化されたＳＮＳ－ｓｅｑプロトコルを使用して（方法及び図５２を参照）、本発明者等は、３つの非形質転換（ヒト胚性幹細胞、ｈＥＳＣ；臍帯血ＣＤ３４（＋）造血細胞、ＨＣ；一次ヒト乳腺上皮細胞、ＨＭＥＣ）及びＨＭＥＣ系統に由来する３つの不死化細胞型（ＩｍＭ－１、ＩｍＭ－２、ＩｍＭ－３）（図１）を提示する、１９のヒト細胞サンプルからＤＮＡ複製ＩＳを同定した。調査した多数の細胞サンプルにより、合計３２０，７４８のＩＳが特定され、その圧倒的多数は、不死化細胞型に属する低活性ＩＳであった（表１ａ、次のセクションを参照）。ＩＳレパートリには、以前に同定されたヒトＬａｍｉｎＢ２、ＭＹＣ、ＭＣＭ４、及びＨＳＰ７０起点が含まれていた（図２及び表１ｂ）。
ヒトゲノムにおけるＤＮＡ複製起点のランドスケープ
最適化されたＳＮＳ－ｓｅｑプロトコルを使用して（方法及び図５２を参照）、本発明者等は、３つの非形質転換（ヒト胚性幹細胞、ｈＥＳＣ；臍帯血ＣＤ３４（＋）造血細胞、ＨＣ；一次ヒト乳腺上皮細胞、ＨＭＥＣ）及びＨＭＥＣ系統に由来する３つの不死化細胞型（ＩｍＭ－１、ＩｍＭ－２、ＩｍＭ－３）（図１）を提示する、１９のヒト細胞サンプルからＤＮＡ複製ＩＳを同定した。調査した多数の細胞サンプルにより、合計３２０，７４８のＩＳが特定され、その圧倒的多数は、不死化細胞型に属する低活性ＩＳであった（表１ａ、次のセクションを参照）。ＩＳレパートリには、以前に同定されたヒトＬａｍｉｎＢ２、ＭＹＣ、ＭＣＭ４、及びＨＳＰ７０起点が含まれていた（図２及び表１ｂ）。
【0124】
生データが複製起点活性の変動を明らかに示したので、本発明者等は、それらの平均活性（すなわち、正規化されたＳＮＳ－ｓｅｑシグナルの平均）に基づいて、起点を第１０の分位数に分類し、起点の上位１０％（最高平均活性）を含んでいた分位数１（Ｑ１）から起点の下位１０％（最低平均活性）を含んでいた分位数１０（Ｑ１０）までであった（図３、図５３）。各分位数の起点は同様のマッピング可能性を示し、これは、ＳＮＳ－ｓｅｑリードがヒトゲノムに一致する能力の尺度である。したがって、異なる分位数に属する起点でのＳＮＳ－ｓｅｑシグナルの変動は、それらをマッピングする本発明者等の能力の技術的な違いによるものではなかった（図５４）。
【0125】
驚くべきことに、本発明者等の分類は、解析した全ての細胞型において、起点ＳＮＳ－ｓｅｑシグナルの７０～８５％がＱ１及びＱ２起点に由来することを明らかにした（図４、表１ａ）。更に、本発明者等は、ゲノム全体にわたるＳＮＳ－ｓｅｑシグナルの濃縮のほとんど全てが、本発明者等の研究で起点として定義された領域に由来することを観察し、起点領域外の広範で拡散した開始は実質的ではないことを示唆している（図５５、方法を参照されたい）。ＳＮＳ－ｓｅｑシグナルは細胞集団で起こるＤＮＡ複製開始事象の量を表すので、本発明者等は、Ｑ１及びＱ２起点が開始事象の大部分をホストし、細胞の種類に関係なく、複製開始のホットスポットとして「コア起点」と呼ばれるこれらの６４，１４８領域を強調していると結論付けた。
【0126】
ＩＳの残りの８０％（Ｑ３－Ｑ１０、２５６，６００領域）は、ここでは「確率論的起点」と呼ばれ、１９のサンプル全体で平均活性が低く、各細胞型で合計ＳＮＳ－ｓｅｑシグナルの約１５～３０％しかホストしていない（図４、表１ａ）。
【0127】
最も近い起点への距離は、確率論的起点又は無作為分布と比較してコア起点の方が短かったため、ほとんどのコア起点がクラスター化された（図５、図５３及び５６）。これは、クラスター化された起点が孤立した起点４，１０，２２よりも高い活性を示す、以前に観察されたコミュニティ効果と一致している（図５６）。注目すべきことに、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）宿主における同様の数のコア起点が、ＳＮＳ－ｓｅｑによって検出可能な全ての開始事象の６９％を占めており、コア起点がヒトゲノムに固有ではない特徴であることを示唆している（図５７）。
【0128】
コア起点の位置は一貫している
起点活性は、異なる細胞型で高度に相関しており（図６、ピアソンの平均ｒ＝０．６９、全ての比較でｐ値＜２Ｅ－１６）、所与の起点が異なる細胞型で同様の開始レベルを有することを示唆している。異なる細胞型が共有する起点の約７７％がコア起点であった（表１ａ）。逆に、確率論的起点はあまり共有されていなかった（図７、図５８）。コア起点が異なる細胞型でより偏在的に活性であるという本発明者等の発見を支持して、コア起点の７２％が、異なる細胞型を使用した独立したＳＮＳ－ｓｅｑ研究によって同定された（図８、図５９）。更に、異なる細胞株において異なる起点マッピング法（ＩＮＩ－ｓｅｑ）によって同定された領域の４９％が本発明者等の起点と重複し、その大部分はコア起点であった（図９）。早期発火コア起点は、早期発火起点をマッピングするＩＮＩ－ｓｅｑによって特定される可能性が高くなった（図６０）。更に、ＯＫ－ｓｅｑによって特定されたほぼ全て（８７％）の領域は、この研究で特定された重複した起点である（図１０）。ただし、この方法では５０００～１０，０００の領域しかマッピングされず、平均サイズは３４ｋｂであり、この重複は統計的に有意ではなかった。それにもかかわらず、コア起点及びＯＫ－ｓｅｑによって識別されたものと同様のサイズの開始ゾーンに似ている、緊密なクラスターに見られるコア起点（方法を参照）は、ＯＫ－ｓｅｑによって識別された領域と重複した（４９．７％、図６１及び６２）。
起点活性は、異なる細胞型で高度に相関しており（図６、ピアソンの平均ｒ＝０．６９、全ての比較でｐ値＜２Ｅ－１６）、所与の起点が異なる細胞型で同様の開始レベルを有することを示唆している。異なる細胞型が共有する起点の約７７％がコア起点であった（表１ａ）。逆に、確率論的起点はあまり共有されていなかった（図７、図５８）。コア起点が異なる細胞型でより偏在的に活性であるという本発明者等の発見を支持して、コア起点の７２％が、異なる細胞型を使用した独立したＳＮＳ－ｓｅｑ研究によって同定された（図８、図５９）。更に、異なる細胞株において異なる起点マッピング法（ＩＮＩ－ｓｅｑ）によって同定された領域の４９％が本発明者等の起点と重複し、その大部分はコア起点であった（図９）。早期発火コア起点は、早期発火起点をマッピングするＩＮＩ－ｓｅｑによって特定される可能性が高くなった（図６０）。更に、ＯＫ－ｓｅｑによって特定されたほぼ全て（８７％）の領域は、この研究で特定された重複した起点である（図１０）。ただし、この方法では５０００～１０，０００の領域しかマッピングされず、平均サイズは３４ｋｂであり、この重複は統計的に有意ではなかった。それにもかかわらず、コア起点及びＯＫ－ｓｅｑによって識別されたものと同様のサイズの開始ゾーンに似ている、緊密なクラスターに見られるコア起点（方法を参照）は、ＯＫ－ｓｅｑによって識別された領域と重複した（４９．７％、図６１及び６２）。
【0129】
コアの起点は、複製前の複合体（ｐｒｅ－ＲＣ）構成要素ＯＲＣ１、ＯＲＣ２、及びＭＣＭ７によって結合されることが以前に示された領域とも一致した。具体的には、コア起点の２８％及び３９％がＯＲＣ２又はＭＣＭ７結合領域と重複していた（図１１、図６３）。クラスター化されたコア起点（開始ゾーン）は、より頻繁に、ｐｒｅ－ＲＣ構成要素結合領域と重複した（ＯＲＣ２で４０％、ＭＣＭ７で６０％、図１２）。全てのコア起点の約半分のみが任意の１つの細胞型で活性であることを考えると、重複の量は、ほとんどの活性なコア起点がｐｒｅ－ＲＣ構成要素ＯＲＣ２及びＭＣＭ７に関連付けられていることを示唆している。相互に、ＯＲＣ１結合領域の５７％及びＯＲＣ２結合領域の５５％が、ＳＮＳ－ｓｅｑによって特定された少なくとも１つの起点と重複していた（図１３）。Ｓ．ｐｏｍｂｅで示唆されているように、複数のＯＲＣ１／２結合事象を有する領域を表している可能性がある、より広いＯＲＣ１又はＯＲＣ２結合領域は、起点をホストする可能性が高く、ほとんどがコア起点であった（図６４及び６５）。
【0130】
要約すると、本発明者等の分析は、別の起点マッピング法によっても同定される、異なる細胞型における真正のＩＳを表すコア起点を同定した。コア起点は平均して、単一の細胞型で特定された全ての起点の約４０％を表し、平均で約３０，０００の領域を表す（図１４及び１５）。コア起点は、以前にＳＮＳ－ｓｅｑデータで観察された「構成的／共通の起点」とは異なることに留意されたい。本発明者等の分析は、これらの研究の中で最大数のサンプルを有し、本発明者等のデータに基づいて、本発明者等は、全てのサンプルで活性な起点をめったに観察しない。
【0131】
ヒト及びマウスのゲノムは、Ｇ－ｒｉｃｈ配列シグネチャを共有している
本発明者等は次に、ＤＮＡ複製開始部位がマウス及びヒトゲノム全体の相同領域に配置されているかどうかを調査した。本発明者等は、ヒト起点のごく一部（８％）のみがマウスゲノムに相同領域を有し、２％のみがマウス細胞の起点としても同定されることを発見した（図１６、左パネル）。本発明者等は、無作為化されたゲノム領域について同程度のレベルの相同性を発見し（７％保存、０．８％重複マウス起点、図１６、右パネル）、ＤＮＡ複製開始部位の大部分がマウス及びヒトゲノムの相同領域に位置していないことを示唆している。したがって、本発明者等は、２０種の哺乳動物種にわたるプロモータ及びエキソン領域と比較して、元のＤＮＡ配列の配列保存レベルが低いことを観察し、これらの配列が進化中に異なる系統に独立して出現したという考えを補強した（図１７）。興味深いことに、起点に隣接する領域のＰｈａｓｃｏｎ２０ｗａｙスコア（起点頂点の＋／－５Ｋｂ）は、コア起点のＩＳ領域の０．５～３Ｋｂ上流の中程度に保存された領域を示し、これは主に調節要素／エキソン配列に起因する（図６６及び６７）。
本発明者等は次に、ＤＮＡ複製開始部位がマウス及びヒトゲノム全体の相同領域に配置されているかどうかを調査した。本発明者等は、ヒト起点のごく一部（８％）のみがマウスゲノムに相同領域を有し、２％のみがマウス細胞の起点としても同定されることを発見した（図１６、左パネル）。本発明者等は、無作為化されたゲノム領域について同程度のレベルの相同性を発見し（７％保存、０．８％重複マウス起点、図１６、右パネル）、ＤＮＡ複製開始部位の大部分がマウス及びヒトゲノムの相同領域に位置していないことを示唆している。したがって、本発明者等は、２０種の哺乳動物種にわたるプロモータ及びエキソン領域と比較して、元のＤＮＡ配列の配列保存レベルが低いことを観察し、これらの配列が進化中に異なる系統に独立して出現したという考えを補強した（図１７）。興味深いことに、起点に隣接する領域のＰｈａｓｃｏｎ２０ｗａｙスコア（起点頂点の＋／－５Ｋｂ）は、コア起点のＩＳ領域の０．５～３Ｋｂ上流の中程度に保存された領域を示し、これは主に調節要素／エキソン配列に起因する（図６６及び６７）。
【0132】
配列の相同性が欠けているにもかかわらず、ゲノムの機能領域には、種間で共有される配列要素が含まれている可能性がある。したがって、本発明者等は次に、異なる種の複製起点にわたって共有される可能性のある配列要素を調べた。起点と一致するＤＮＡ配列要素を同定するために、本発明者等は、１つ又は複数のグアニン四分子を含むらせんＤＮＡ構成である、ＩＳ及びＧ－ｒｉｃｈの推定Ｇ４構造間の関係を調べた。コアの８３％及び確率論的起点の３４％に、２つの異なる方法で定義された少なくとも１つの推定Ｇ４要素が含まれていた（図１８、図６８）。ヒト及びマウスのゲノムでは多数の推定Ｇ４要素が予測されているが、前述のように、それらの一部のみが起点をホストしている。したがって、推定上のＧ４要素の存在は、それ自体では起点配置の強力な予測因子ではないが、ほとんどのコア起点には実際にＧ４要素が含まれている。
【0133】
マウスにおける以前の発見と同様に、ＩＳの上流にある多数のＧ－ｒｉｃｈモチーフが明らかであり（図６９）、対照領域のＣ／Ｇ及びＣｐＧ含有量の正規化後でも起点配列が濃縮されていた（図７０）。指向性ＩＳ頂点の±１．５Ｋｂ以内のヒト起点の塩基組成の分析により、コア起点が、ＩＳ中心の上流最大１．５Ｋｂの非対称濃縮を伴うＧ－ｒｉｃｈ配列に濃縮されていることが確認された（図１９）。
【0134】
本発明者等は更に、ゲノム上のｐｒｅ－ＲＣ因子の配置と比較して、この研究の位置で複製起点がどのように決定されるかを求めた。本発明者等は、ｐｒｅ－ＲＣ成分ＯＲＣ１、ＯＲＣ２、及びＭＣＭ７の位置をＩＳに対して整列させた時、それらがＩＳの上流、コア及び確率論的起点の両方のＧ－ｒｉｃｈ領域の近くに優先的に配置されることを発見した（図２０及び２１）。更に、ＩＳとこれらのｐｒｅ－ＲＣ因子との間の距離は、コアＩＳ（ピーク頂点）とＯＲＣ１、ＯＲＣ２、及びＭＣＭ７結合部位（ピーク中心）との間の距離中央値が、それぞれ５１２、４４６、３０２ｂｐであるように、ｐｒｅ－ＲＣ因子結合部位の位置を測定する独立した生化学的方法を総括した。これにより、ＭＣＭ複合体のピークがＯＲＣサブユニットの下流、ＩＳから３００ｂｐに位置付けられた（図２２）。実際、ＭＣＭ複合体は少なくとも６８ｂｐに位置し、隣接するヌクレオソームに結合して、保護されたＤＮＡのサイズを２１０ｂｐまで増加させる。更に、ＭＣＭヘリカーゼは、ＤＮＡポリメラーゼが巻き戻されたＤＮＡに結合できるようにするために、最小限の長さでＤＮＡを巻き戻さなければならない。本発明者等は、ＳＮＳ－ｓｅｑによって決定されたＩＳとＣｈＩＰ－ｓｅｑによって決定されたｐｒｅ－ＲＣ結合部位とを関連付けるこの結果は、ＳＮＳ－ｓｅｑ法がＤＮＡ複製の開始部位を正確にマッピングするという明確な独立した実証であると考えている。更に、本発明者等の結果は、Ｐｒｅ－ＲＣ成分及びＩＳの相対的なインビボ位置が、生化学的方法によって決定されたものと類似していることを示している。
【0135】
起点の位置はＤＮＡ配列に基づいて予測できる
強力な起点はＧ－ｒｉｃｈプロファイル（推定上の配列シグネチャ）を示すため、本発明者等は、ＤＮＡ複製起点がＤＮＡ配列単独から予測できるかどうかを求めた。古典的なモチーフ検索アルゴリズムは、短いが非常に類似したＤＮＡストレッチの濃縮を検出するように設計されており、通常は転写因子によって結合されている。コア起点のサイズ（平均７１６ｂｐ）が与えられると、本発明者等は、典型的には古典的な転写因子結合部位よりも長い識別的なＤＮＡ配列パターンであるハイパーモチーフによって特定される可能性があるという仮説を立てた。これを行うために、本発明者等は、コア起点及びそのフランキング配列の非対称塩基組成をモデル化し、類似のＤＮＡ配列パターンについてヒトゲノムをスキャンした（図７１、方法を参照）。ゲノムスキャニング（ＧＳ）アルゴリズムは、２２８，４４２の非重複領域を特定し、コア起点の８３％及び確率論的起点の３３％に位置し、ＦＰＲは６６％であった（図２３）。ＧＳアルゴリズムの予測能力は平均起点活性と並行して減少し、より高い活性（コア）を持つ起点は、識別可能なＧ－ｒｉｃｈ配列要素を含む可能性が高いことを示唆している（図２４）。本発明者等のＧＳアルゴリズムはまた、マウスゲノムのコアの７６％及び全起点の５４％を予測し（図２５）、コア起点で同様のＧ－ｒｉｃｈ配列シグネチャを示す（図７２）。元の配列での非対称の塩基組成は、以前に観察されている。ただし、興味深いことに、コア起点のモデル化のみが、確率論的又は以前に公開された起点のモデル化ではなく、ＧＳアルゴリズムで高い予測力をもたらした（方法を参照）。結論として、これら２つの哺乳動物種におけるＤＮＡ複製起点の進化的配列保存の欠如にもかかわらず（図１６及び１７）、本発明者等のデータは、ほとんどのヒト及びマウスコアＤＮＡ複製起点の位置が、同じＧ－ｒｉｃｈＤＮＡハイパーモチーフに基づいて、ＤＮＡ配列のみを使用して予測できることを示唆し、これは、保存されたメカニズム（複数可）がこれらの脊椎動物種の起点選択を支配していることを示唆している。
強力な起点はＧ－ｒｉｃｈプロファイル（推定上の配列シグネチャ）を示すため、本発明者等は、ＤＮＡ複製起点がＤＮＡ配列単独から予測できるかどうかを求めた。古典的なモチーフ検索アルゴリズムは、短いが非常に類似したＤＮＡストレッチの濃縮を検出するように設計されており、通常は転写因子によって結合されている。コア起点のサイズ（平均７１６ｂｐ）が与えられると、本発明者等は、典型的には古典的な転写因子結合部位よりも長い識別的なＤＮＡ配列パターンであるハイパーモチーフによって特定される可能性があるという仮説を立てた。これを行うために、本発明者等は、コア起点及びそのフランキング配列の非対称塩基組成をモデル化し、類似のＤＮＡ配列パターンについてヒトゲノムをスキャンした（図７１、方法を参照）。ゲノムスキャニング（ＧＳ）アルゴリズムは、２２８，４４２の非重複領域を特定し、コア起点の８３％及び確率論的起点の３３％に位置し、ＦＰＲは６６％であった（図２３）。ＧＳアルゴリズムの予測能力は平均起点活性と並行して減少し、より高い活性（コア）を持つ起点は、識別可能なＧ－ｒｉｃｈ配列要素を含む可能性が高いことを示唆している（図２４）。本発明者等のＧＳアルゴリズムはまた、マウスゲノムのコアの７６％及び全起点の５４％を予測し（図２５）、コア起点で同様のＧ－ｒｉｃｈ配列シグネチャを示す（図７２）。元の配列での非対称の塩基組成は、以前に観察されている。ただし、興味深いことに、コア起点のモデル化のみが、確率論的又は以前に公開された起点のモデル化ではなく、ＧＳアルゴリズムで高い予測力をもたらした（方法を参照）。結論として、これら２つの哺乳動物種におけるＤＮＡ複製起点の進化的配列保存の欠如にもかかわらず（図１６及び１７）、本発明者等のデータは、ほとんどのヒト及びマウスコアＤＮＡ複製起点の位置が、同じＧ－ｒｉｃｈＤＮＡハイパーモチーフに基づいて、ＤＮＡ配列のみを使用して予測できることを示唆し、これは、保存されたメカニズム（複数可）がこれらの脊椎動物種の起点選択を支配していることを示唆している。
【0136】
予測力を向上させ、ＦＰＲを削減するために、本発明者等は予測領域周辺のＤＮＡ配列をモデル化し、２つの異なる機械学習（ＭＬ）アルゴリズム（「方法」を参照）を使用して、本発明者等の予測における真の起点をより良好に区別した。ＤＮＡ配列のモデリングは、ジ、トリ、及びマルチヌクレオチド（ＣＣ、ＣＧ、ＧＧ、ＣＧＣＧ等）の密度、相互予測距離、並びに４ｋｂ領域にわたるＤＮＡの塩基組成のバリエーション（Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣ）等の情報を使用することを含む（方法を参照）。注目すべきことに、ＧＳアルゴリズムとＭＬアルゴリズム（貪欲な特徴選択によるロジスティック回帰、ＬＲ）を組み合わせることで、６７，２９７の重複しない領域が特定され、合計ＦＰＲ２７．８％でコア起点の６７％が予測された（図２６、図７３）。言い換えると、コア起点の大部分（６７％）には識別可能なＤＮＡ配列パターンが含まれており、これらのパターンがゲノムに存在する場合、少なくとも１つの細胞型で７２．２％の確率で起点と関連付けられる。重要なことに、本発明者等が完全に独立したＭＬアプローチ（ＳＶＭ）を採用した場合、これは２３．４％のＦＰＲ（図７３）で非常に重複する予測（図２６、図７４）をもたらした。このように、ＧＳ及びＭＬアルゴリズムの結合により、ヒトゲノムと同じ大きさのゲノムの起点位置の予測が可能になった。
【0137】
ＳＶＭアプローチ及びＬＲアプローチの両方で、上流のＧ密度が予測の重要なパラメータとして特定された（図２７、図７５）。これは、起点のＧ－ｒｉｃｈ反復要素（ＯＧＲＥ）の存在、又はタンデムに配置された複数（最大６～１２）のＧ４構造、並びにヒト、マウス及びニワトリで見られる超短Ｃ／Ｇ－ｒｉｃｈヌクレオチドモチーフに従う。
【0138】
細胞分化は起点の位置及び活性を変える
本発明者等は、ヒトゲノムにおいて、コア起点が優先的にプロモータ領域の近くに配置され、遺伝子間領域から枯渇していることを観察した（図２８、２９及び３０）。これは、転写が様々な程度の相関関係を持つＤＮＡ複製起点仕様の特定の予測因子であることを示唆する多くの研究と一致している。本発明者等のデータはまた、造血細胞において、より高い転写活性を有する遺伝子が、それらのプロモータ領域に起点をホストする可能性が高いことを示唆している（図７６）。プロモータ領域内の起点の数及び活性の両方が、プロモータの転写出力と共に増加した（図７７及び７８）。ＲＮＡ合成活性自体、又は転写複合体アセンブリによって誘導されるオープンクロマチンのいずれかが、ｐｒｅ－ＲＣ形成を支持する可能性がある。しかしながら、遺伝子本体については、プロモータ及び遺伝子間領域におけるコア起点の位置の間の相関関係（図２８及び２９）は観察されない（図３０）。この発見は、プロモータ領域での起点の優先的な局在化において、ＲＮＡ合成自体ではなく、プロモータのクロマチン環境の影響を示唆している。
本発明者等は、ヒトゲノムにおいて、コア起点が優先的にプロモータ領域の近くに配置され、遺伝子間領域から枯渇していることを観察した（図２８、２９及び３０）。これは、転写が様々な程度の相関関係を持つＤＮＡ複製起点仕様の特定の予測因子であることを示唆する多くの研究と一致している。本発明者等のデータはまた、造血細胞において、より高い転写活性を有する遺伝子が、それらのプロモータ領域に起点をホストする可能性が高いことを示唆している（図７６）。プロモータ領域内の起点の数及び活性の両方が、プロモータの転写出力と共に増加した（図７７及び７８）。ＲＮＡ合成活性自体、又は転写複合体アセンブリによって誘導されるオープンクロマチンのいずれかが、ｐｒｅ－ＲＣ形成を支持する可能性がある。しかしながら、遺伝子本体については、プロモータ及び遺伝子間領域におけるコア起点の位置の間の相関関係（図２８及び２９）は観察されない（図３０）。この発見は、プロモータ領域での起点の優先的な局在化において、ＲＮＡ合成自体ではなく、プロモータのクロマチン環境の影響を示唆している。
【0139】
次に、本発明者等は、赤血球生成を受けている造血細胞を使用して、起点の特定に対する転写ランドスケープの変化の影響を調べた。ＣＤ３４（＋）造血細胞をヒト臍帯血から単離し、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を用いて赤血球造血系統に分化させた（図７９）。遺伝子オントロジー分析（ＧＲＥＡＴ）は、赤血球分化時に起点活性が増加した単一の濃縮された遺伝子セットを明らかにし（図８０）、ＤＮＡ複製起点が転写及びエピジェネティックな変化を受けている遺伝子ドメインに動員されることを示唆している。
【0140】
Ｇ－ｒｉｃｈ及び転写が起点活性に影響を与える
ＨＣでは、高発現遺伝子の８９％がそのプロモータにＣｐＧｉ（Ｇ－ｒｉｃｈ領域）をホストしたが、サイレント遺伝子プロモータの４８％のみがＣｐＧｉをホストした（図８１）。したがって、本発明者等は、ＣｐＧｉ（又はＧ－ｒｉｃｈストレッチ）の同時存在及び高い転写活性が、造血細胞における高い起点活性に必要であるかどうかを求めた。本発明者等は、起点番号、クラスタリング、又はＣｐＧｉ（＋）プロモータ付近の活性に対する転写の重大な影響を観察しなかった（図３１、３２及び３３）。更に、ＣｐＧｉ（＋）ＴＳＳからのＤＮＡ複製開始活性は、転写活性と相関しなかった（ピアソンのｒ＜０．０１、図３４）。
ＨＣでは、高発現遺伝子の８９％がそのプロモータにＣｐＧｉ（Ｇ－ｒｉｃｈ領域）をホストしたが、サイレント遺伝子プロモータの４８％のみがＣｐＧｉをホストした（図８１）。したがって、本発明者等は、ＣｐＧｉ（又はＧ－ｒｉｃｈストレッチ）の同時存在及び高い転写活性が、造血細胞における高い起点活性に必要であるかどうかを求めた。本発明者等は、起点番号、クラスタリング、又はＣｐＧｉ（＋）プロモータ付近の活性に対する転写の重大な影響を観察しなかった（図３１、３２及び３３）。更に、ＣｐＧｉ（＋）ＴＳＳからのＤＮＡ複製開始活性は、転写活性と相関しなかった（ピアソンのｒ＜０．０１、図３４）。
【0141】
対照的に、転写のレベルが増加すると、ＣｐＧｉ（－）プロモータでの起点位置が明らかに増加する（図３５）。更に、クラスター化された起点の数は転写活性に比例して増加し、総起点活性は転写活性の増加と共に高くなった（ピアソンの相関ｒ＝０．２５－図３６、３７、３８）。本発明者等は、ＣｐＧｉの代わりにＧ－ｒｉｃｈＤＮＡストレッチを含む遺伝子プロモータについて同様の傾向を観察した（図８２）。
【0142】
不死化により、起点位置の偶然性が増加する
異常なＤＮＡ複製は多くの癌細胞の特徴であるため、本発明者等らは次に、制御不能な細胞増殖につながる癌発生の重要な工程である細胞の不死化後に、元のレパートリが乱されているかどうかを求めた。この目的のために、本発明者等は、親のヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）細胞株の癌遺伝子の誤発現によって得られた３つの以前に記載された不死化細胞株を使用した：（ｉ）ｐ５３レベルが少なくとも５０％低下したＩｍＭ－１（ΔＴＰ５３）、（ｉｉ）癌遺伝子ＲＡＳが過剰発現されるＩｍＭ－２、及び（ｉｉｉ）ＷＮＴが過剰発現されるＩｍＭ－３。本発明者等は、非形質転換細胞型（ｈＥＳＣ、ＨＣ及びＨＭＥＣ）よりも不死化細胞型においてより多くの起点を同定した（平均して１００，０００対７０，０００起点）。これは、ｈＥＳＣ及びＨＣが同じかそれを超えるレベルで増殖したため、これらの細胞の増殖率がより高いためではない（方法を参照）。それにもかかわらず、非形質転換及び不死化細胞型は、共通のコア起点レパートリを共有し（図４０）、開始事象の大部分（約８０％）はコア起点に由来した（図８３）。不死化細胞における起点の数の増加は、明らかに確率論的起点の増加によって引き起こされた（図４１）。コア（Ｑ１及びＱ２）起点は非形質転換細胞型と不死化細胞型の間で共有されていたが、活性が最も低い分位数（Ｑ８－１０）は主に不死化細胞型に寄与していた（図４２）。非形質転換及び不死化細胞型からの起点をバラバラに試験するために、本発明者等は、前述のように、各分類の起点を個別に分位数に再分類した。遺伝子に関するコア起点のゲノム局在化は、非形質転換及び不死化細胞株で同等であった（図４３及び４４）。しかし、不死化細胞からの確率論的起点は、プロモータ領域の近くではあまり濃縮されていなかったが（図４４）、ヘテロクロマチン領域では濃縮されていた（Ｋ９ｍｅ３でマーク）（図４５）。したがって、不死化は、非形質転換細胞のヘテロクロマチンに関連する低活性起点を誘導する。
異常なＤＮＡ複製は多くの癌細胞の特徴であるため、本発明者等らは次に、制御不能な細胞増殖につながる癌発生の重要な工程である細胞の不死化後に、元のレパートリが乱されているかどうかを求めた。この目的のために、本発明者等は、親のヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）細胞株の癌遺伝子の誤発現によって得られた３つの以前に記載された不死化細胞株を使用した：（ｉ）ｐ５３レベルが少なくとも５０％低下したＩｍＭ－１（ΔＴＰ５３）、（ｉｉ）癌遺伝子ＲＡＳが過剰発現されるＩｍＭ－２、及び（ｉｉｉ）ＷＮＴが過剰発現されるＩｍＭ－３。本発明者等は、非形質転換細胞型（ｈＥＳＣ、ＨＣ及びＨＭＥＣ）よりも不死化細胞型においてより多くの起点を同定した（平均して１００，０００対７０，０００起点）。これは、ｈＥＳＣ及びＨＣが同じかそれを超えるレベルで増殖したため、これらの細胞の増殖率がより高いためではない（方法を参照）。それにもかかわらず、非形質転換及び不死化細胞型は、共通のコア起点レパートリを共有し（図４０）、開始事象の大部分（約８０％）はコア起点に由来した（図８３）。不死化細胞における起点の数の増加は、明らかに確率論的起点の増加によって引き起こされた（図４１）。コア（Ｑ１及びＱ２）起点は非形質転換細胞型と不死化細胞型の間で共有されていたが、活性が最も低い分位数（Ｑ８－１０）は主に不死化細胞型に寄与していた（図４２）。非形質転換及び不死化細胞型からの起点をバラバラに試験するために、本発明者等は、前述のように、各分類の起点を個別に分位数に再分類した。遺伝子に関するコア起点のゲノム局在化は、非形質転換及び不死化細胞株で同等であった（図４３及び４４）。しかし、不死化細胞からの確率論的起点は、プロモータ領域の近くではあまり濃縮されていなかったが（図４４）、ヘテロクロマチン領域では濃縮されていた（Ｋ９ｍｅ３でマーク）（図４５）。したがって、不死化は、非形質転換細胞のヘテロクロマチンに関連する低活性起点を誘導する。
【0143】
不死化はまた、特異的に上方制御又は下方制御された起点をもたらす。驚くべきことに、下方制御された起点のほとんどはＣｐＧｉ／Ｇ４等のＧ－ｒｉｃｈ要素を含むのに対し、上方制御された起点はＧ－ｐｏｏｒである傾向がある（図８４及び８５）。したがって、起点の仕様に変化が生じ、コア起点と確率論的起点の両方で、Ｇ－ｒｉｃｈＤＮＡからＧ－ｐｏｏｒ ＤＮＡに優先順位がシフトする。
【0144】
本発明者等は次に、自己相互作用して三次元（３Ｄ）構造を形成するゲノムの大きな領域であるトポロジー関連ドメイン（ＴＡＤ）全体に、コア及び確率論的起点の特定の分布があるかどうかを求めた。ＴＡＤ境界は、対応するクロマチンドメインの絶縁に関与しており、クロマチンループをＴＡＤ内に閉じ込めており、ＴＳＳ及び絶縁体因子ＣＴＣＦが豊富である。ヒトのコア起点（図４６）及び確率論的起点（図４７）の両方が、ＴＡＤ境界（すなわち、「スマイリー」傾向線）で有意に濃縮された。ＳＮＳ－ｓｅｑによって測定されたＤＮＡ複製開始の総量も、ＴＡＤ中心よりもＴＡＤ境界で１．５倍高かった（図４８）。本発明者等は、マウスコア及び確率論的起点について同様の結果を得た（図８６）。本発明者等は、複製起点密度パターンが、個々のクロマチンドメインにおけるゲノムの構造編成を模倣していると結論付けている。この分布は、親ＨＭＥＣ細胞系と比較して、不死化ＩｍＭ－１（ＴＰ５３ＫＤ）細胞において明らかに乱され、ＴＡＤ境界上の起点密度におけるこの変動は統計的に有意であった（図４９及び５０）。ＴＡＤ境界及びＴＡＤ中心における複製開始の総量もまた、親ＨＭＥＣと比較してＩｍＭ－１細胞において著しく異なっていた（図５１）。ｈＥＳ細胞、又はその他の非形質転換細胞型は、ＴＡＤ境界で変化したコア起点密度を示さず、この特性が不死化に特異的であり、高い増殖率を反映していないことを示唆している（図８７）。
【0145】
まとめると、これらのデータは、ＣｐＧｉ／Ｇ－ｒｉｃｈストレッチ又は転写のいずれかの存在が起点活性を動員するのに十分であることを示唆している。非常に活性なプロモータでは、ＣｐＧｉ又はＧ－ｒｉｃｈ要素は複製起点の活性と相関していない。逆に、不活性なプロモータでは、ＣｐＧｉ／Ｇ－ｒｉｃｈモチーフが複製起点活性と明らかに関連している（図３９に要約）。この結果は、ほとんどの複製起点にＧ－ｒｉｃｈ要素が存在することとも一致している。
【0146】
考察
ゲノム全体のＩＳマッピングを可能にする次世代シーケンシング技術の進歩にもかかわらず、ＤＮＡ複製起点の仕様はまだよくわかっていない。この研究では、本発明者等は、複製起点をマッピングするために最高の解像度を持つＳＮＳ－Ｓｅｑ法を使用し、この方法では、並行して生成された適切な実験対照でシグナルが補正された（方法を参照）。本発明者等は、不死化後も維持される複数の細胞型において、コア起点と呼ばれるＩＳのサブセットの仕様に顕著な一貫性があることを発見した。任意の細胞型で約３０，０００の領域を表すコア起点は、研究された全ての細胞型でＤＮＡ複製開始事象の大部分（７０－８５％）をホストした。本発明者等は、配列認識のみに基づく計算アルゴリズムによってほとんどのコア起点を予測できることを明らかにし、したがって複製起点が、異なる細胞型の哺乳動物ゲノムの正確な一連の領域で優先的に活性化されることを明確に結論付けた。
ゲノム全体のＩＳマッピングを可能にする次世代シーケンシング技術の進歩にもかかわらず、ＤＮＡ複製起点の仕様はまだよくわかっていない。この研究では、本発明者等は、複製起点をマッピングするために最高の解像度を持つＳＮＳ－Ｓｅｑ法を使用し、この方法では、並行して生成された適切な実験対照でシグナルが補正された（方法を参照）。本発明者等は、不死化後も維持される複数の細胞型において、コア起点と呼ばれるＩＳのサブセットの仕様に顕著な一貫性があることを発見した。任意の細胞型で約３０，０００の領域を表すコア起点は、研究された全ての細胞型でＤＮＡ複製開始事象の大部分（７０－８５％）をホストした。本発明者等は、配列認識のみに基づく計算アルゴリズムによってほとんどのコア起点を予測できることを明らかにし、したがって複製起点が、異なる細胞型の哺乳動物ゲノムの正確な一連の領域で優先的に活性化されることを明確に結論付けた。
【0147】
本発明者等の研究はまた、根底にあるＤＮＡ配列が、ヒト及びマウスのゲノムにおける起点位置の顕著な予測因子であることを明らかにしている。コア起点で一般的に見られるＧ－ｒｉｃｈ配列パターンは、ゲノム全体の起点配置を予測するものであった。ヒトゲノムに存在する場合、これらのパターンの７２％は、少なくとも１種類の細胞におけるＤＮＡ複製の開始に関連していた。ＩＳの上流のＧ－ｒｉｃｈ反復ＤＮＡ配列（ＯＧＲＥ）のストレッチは、ＯＲＣ１、ＯＲＣ２、及びＭＣＭ２－７結合領域に対応し、Ｇ及びＣ含有量が低い領域に結合している（図１９、２０、２１及び２２）。コアの起点もしばしばクラスター化されており、それらがいくつかの潜在的なｐｒｅ－ＲＣ結合部位を持つゲノムの領域を表していることを示唆している。この組織は、複数のｐｒｅ－ＲＣをホストし、ＭＣＭのローディング及び起点活性化の効率を高める、より広範なｐｒｅ－ＲＣ結合プラットフォームを構成する可能性がある。逆に、ほとんどの確率論的起点は、おそらく単一の推定ｐｒｅ－ＲＣ結合部位を表す、より短いストレッチのＧ－ｒｉｃｈ領域を含む（図１９）。ＳＮＳ－ｓｅｑによって明らかにされた開始部位の位置は、独立して決定されたｐｒｅ－ＲＣ因子の位置と完全に一致しており、開始部位の上流に見られ、予想通りＧ－ｒｉｃｈ領域と一致している（図２２）。重要なことに、この発見は、Ｇ－ｒｉｃｈ領域と後生動物の複製起点との関連の独立した確認である。
【0148】
Ｇ－ｒｉｃｈ領域はＤＮＡ複製の開始にどのように関与することができるであろうか。Ｇ－ｒｉｃｈＳＮＳ－ｓｅｑピークの正式な可能性の１つは、ラムダエキソヌクレアーゼの使用を含む実験プロトコルであり、Ｇ－ｒｉｃｈ配列は消化に耐性がある可能性がある（ＰＭＩＤ：２５６９５９５２）。ただし、本発明者等の研究を含むが前述の研究を除くほとんどの研究で使用されるＳＮＳ－ｓｅｑの実験条件は厳しい（方法を参照）。更に、並行して処理された対照ＳＮＳ－ｓｅｑサンプル（＋ＲＮａｓｅ）は、Ｇ－ｒｉｃｈＤＮＡがわずかに濃縮されている。更に、ラムダエキソヌクレアーゼを使用しない新生鎖精製法を使用して、複製起点のＧ－ｒｉｃｈ性質も確認されている。最後に、ＤＮＡ複製の開始に関与するいくつかの因子は、ＤＮＡ複製起点と共局在し（この研究）、Ｇ４に結合することができる（以下を参照）。
【0149】
２つ目の可能性は、ＤＮＡ複製起点のオン／オフ段階に関連している可能性がある。複製開始部位でのＤＮＡの開口部には、時間的に連続した２つの工程が必要である。まず、ＭＣＭヘリカーゼの動員を可能にするＯＲＣ、Ｃｄｃ６、Ｃｄｔ１の結合を介して、Ｇ１でＰｒｅ－ＲＣが形成される。全ての潜在的な起点がこの段階で事前に設定されていることは認められているが、後生動物の起点がＯＲＣによってどのように認識されるかはまだわかっていない。ＭＣＭヘリカーゼの活性化はＧ１からＳへの移行時に発生するが、ｐｒｅ－ＲＣの２０～３０％のみがＳ期で活性化される。Ｇ４の基本的な特徴は、折り畳まれた形態及び広げられた形態を含むいくつかの構造を形成する能力である。これらの２つの形態は、複製起点のＯＦＦ段階（ｐｒｅ－ＲＣ）又はＯＮ段階（開始）を調節する可能性がある。Ｇ４構造を形成できる外因性Ｇ４配列は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵抽出物中のｐｒｅ－ＲＣの形成を阻害しないが、複製起点の発火と競合する。この結果は、折り畳まれた形態のＧ４がＤＮＡ合成の開始に関与しているが、ｐｒｅ－ＲＣタンパク質による起点認識には必要ないことを示唆している可能性がある。一致して、ＭＴＢＰ、ＲｅｃｑＬ、及びＲｉｆ１である、起点発火に関与する３つの要因は全てＧ４に結合する。
【0150】
３番目の可能性は、複製起点でのＮＳプロファイルによって導かれ、これは、Ｇ４が複製起点で開始する複製フォークの一時的な一時停止として機能することを示唆している可能性がある。いくつかの以前の研究では、開始部位の５’側にあるＧ－ｒｉｃｈ領域の濃縮が報告されており、Ｇ４での複製フォークの一時的な停止が示唆されている。この仮説は、起点が活性化されるとＧ－ｒｉｃｈ／Ｇ４構造が折り畳まれ、その後、進行中の複製フォークの一時的な一時停止、つまり転写の一時停止に似た現象を課すメカニズムを通じて展開されることを示唆している。
【0151】
根底にあるＤＮＡ配列が所与の種の起点の配置を予測するという発見は、当然、クロマチン及び転写環境がまた、ＤＮＡ複製の開始にどの程度関与しているかという疑問につながる。起点の位置は、オープンクロマチン及び活性クロマチンに関連する様々なヒストンマークと以前に相関していた。コア起点は、ヒストンマークの活性化及びクロマチン開放に関連するゲノムの転写及び調節要素（例えば、プロモータ及びエンハンサ）（図２８、図８８）と一致することが多い。本発明者等が同定したＤＮＡ配列パターンは、通常、オープンクロマチン又は許容クロマチンの一部であると考えられる。ただし、コアの起点は、非遺伝子領域（１９．４％）又はサイレント遺伝子にも存在する。更に、転写の影響及びＧ－ｒｉｃｈ要素の存在を切り離すことができる。サイレント遺伝子のプロモータ領域又は非コード領域にＧ－ｒｉｃｈ要素／ＣｐＧｉが存在すると、複製起点の活性をホストするのに十分である。注目すべきは、ポリコームグループタンパク質はＣｐＧｉ（＋）プロモータと関連付けられ、Ｇ４ ＤＮＡに結合できる。本発明者等は、これらのタンパク質の存在が起点位置の強力な指標であることを以前に示し、サイレントＣｐＧｉ（＋）遺伝子プロモータ又は抑制されたクロマチンが起点をホストするメカニズムを支持している。興味深いことに、最近の報告は、ポリコームを介した遺伝子抑制の調節におけるＧ４要素の役割も支持している。
【0152】
結論として、ＤＮＡ配列情報はＳ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に存在するコンセンサスＡＲＳ要素配列ほど厳密には定義されていないが、その予測値は、配列特異性が後生動物細胞の複製起点の保存された特徴であることを示している。本発明者等は、選択されたエピジェネティックマークと配列情報との組合わせが、後生動物の複製起点の予測を改善する可能性があることも認めている。
【0153】
ＳＮＳ信号の大部分を表すコア起点に加えて、本発明者等の分析は、Ｇ－ｒｉｃｈ要素とほとんど一致しない数千の確率論的起点も特定した。興味深いことに、不死化により、特にヘテロクロマチン領域内で、これらの低活性起点の数が大幅に増加した。これは、ＴＡＤの境界及び中心におけるＤＮＡ複製開始事象の均等化を伴った（図５１）。
【0154】
複製起点がＴＡＤ境界で濃縮されているという発見は、クロマチンループの形成又はそれらの結果におけるＤＮＡ複製起点の役割を反映している可能性がある。そのため、起点の密度は、複製ドメインの隔離に役割を果たす可能性がある。これはまた、起点密度／起点活性が複製タイミングと高度に相関しているという以前の発見を彷彿とさせる。更に、複製のタイミング境界は、ＴＡＤ境界と相関している。したがって、変化したＤＮＡ開始密度、異常な複製タイミング、及び変化した染色体構造編成は、不死化を受けている細胞型に関連している可能性がある。以前の研究では、癌遺伝子ＭＹＣ及びＣＣＮＥ１の誤発現が、腫瘍由来細胞株における早期のＳ期侵入時の遺伝子内起点の形成に関連付けられていた。ここで、本発明者等は、複製起点の数及び分布の両方が、細胞形質転換の重要な工程である不死化中に摂動されることを示している。したがって、起点配置の確率の増加、及びＴＡＤでのＤＮＡ複製開始密度プロファイルの摂動の両方が、癌細胞に関連する新しいランドマークになる可能性がある。
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【0155】
実施例２－自発的複製を伴う非ウイルス性真核生物ベクター
Ｉ．主な目的
本発明者等の目標は、高い複製能力を有するヒト複製起点を含む配列を定義されたプラスミドに導入することにより、非ウイルス性の自己複製真核生物治療用ベクターを開発することであった。目的の複製起点を含む配列は、実験室で確立されたヒトゲノムの複製起点のレパートリを徹底的に分析することによって事前に決定される。
Ｉ．主な目的
本発明者等の目標は、高い複製能力を有するヒト複製起点を含む配列を定義されたプラスミドに導入することにより、非ウイルス性の自己複製真核生物治療用ベクターを開発することであった。目的の複製起点を含む配列は、実験室で確立されたヒトゲノムの複製起点のレパートリを徹底的に分析することによって事前に決定される。
【0156】
ＩＩ．結果
目的１：ベクターの最小サイズ及び特性を定義する。
このプロジェクトの最初の目的は、我々の複製起点を挿入するための基本的な受容体ベクターを定義すること、並びに迅速なベクター複製検出試験を定義することであった。
目的１：ベクターの最小サイズ及び特性を定義する。
このプロジェクトの最初の目的は、我々の複製起点を挿入するための基本的な受容体ベクターを定義すること、並びに迅速なベクター複製検出試験を定義することであった。
【0157】
１．ＤｐｎＩ複製試験
このアッセイは、メチル化ＤＮＡ消化酵素であるＤｐｎＩによる消化に対するプラスミドの耐性に基づいている。（図８９）。プラスミドは、大腸菌Ｄａｍ＋バクテリアで調製される。したがって、使用される元のプラスミドはメチル化されており、制限酵素ＤｐｎＩによる消化に感受性である。対照的に、ＤＮＡはヒト細胞での複製時にメチル化を失うため、ＤｐｎＩに対する感受性を失う。トランスフェクトされたプラスミドの複製状態は、ＤｐｎＩ消化に対する感受性を試験することで確認できる。細菌へのトランスフェクション後、コロニーの形成は、複製されたプラスミドの存在を示す（図８９）。
このアッセイは、メチル化ＤＮＡ消化酵素であるＤｐｎＩによる消化に対するプラスミドの耐性に基づいている。（図８９）。プラスミドは、大腸菌Ｄａｍ＋バクテリアで調製される。したがって、使用される元のプラスミドはメチル化されており、制限酵素ＤｐｎＩによる消化に感受性である。対照的に、ＤＮＡはヒト細胞での複製時にメチル化を失うため、ＤｐｎＩに対する感受性を失う。トランスフェクトされたプラスミドの複製状態は、ＤｐｎＩ消化に対する感受性を試験することで確認できる。細菌へのトランスフェクション後、コロニーの形成は、複製されたプラスミドの存在を示す（図８９）。
【0158】
２．基本ベクター：ｐＥＰｉ－Ｄｅｌ（ｐｅＧＦＰ－Ｓ／ＭＡＲ）
最初の工程として、本発明者等は、蛍光によって発現をモニタリングすることができ、核マトリックス上に結合部位を有し、細胞核においてより良好に保持され得るという利点を有する非組込みベクターであるｐＥＰｉベクターを試験した。本発明者等は、これに含まれるＳＶ４０ウイルスの複製起点（Ｏｒｉ ＳＶ４０）：ｐＥＰＩ－Ｄｅｌを除去することにより、以前にそれを適合させた（図９０）。これらの２つのベクターにより、本発明者等は、ラージＴ抗原を発現し、ＳＶ４０起点（対照として）の複製を可能にするＨＥＫ２９３Ｔ細胞と、この抗原を発現せず、ＳＶ４０ウイルス起点の複製を可能にしないＨＥＫ２９３細胞と、の二重細胞系におけるエピソーム複製の迅速な試験のための方法を開発することができた。（図９０～９４）。
最初の工程として、本発明者等は、蛍光によって発現をモニタリングすることができ、核マトリックス上に結合部位を有し、細胞核においてより良好に保持され得るという利点を有する非組込みベクターであるｐＥＰｉベクターを試験した。本発明者等は、これに含まれるＳＶ４０ウイルスの複製起点（Ｏｒｉ ＳＶ４０）：ｐＥＰＩ－Ｄｅｌを除去することにより、以前にそれを適合させた（図９０）。これらの２つのベクターにより、本発明者等は、ラージＴ抗原を発現し、ＳＶ４０起点（対照として）の複製を可能にするＨＥＫ２９３Ｔ細胞と、この抗原を発現せず、ＳＶ４０ウイルス起点の複製を可能にしないＨＥＫ２９３細胞と、の二重細胞系におけるエピソーム複製の迅速な試験のための方法を開発することができた。（図９０～９４）。
【0159】
発明者の予備的な結果に続いて、彼らは戦略を再適用した（図９５）。最初に、本発明者等は、レポータ遺伝子（ｅＧＦＰ）を、陽性にトランスフェクトされたヒト細胞の抗生物質選択（ピューロマイシン）を可能にする遺伝子で改変した。また、Ｓ／ＭＡＲ部位のサイズも縮小した。一方、本発明者等は、多数の配列を迅速にスクリーニングできることを選択した。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社の支援により、挿入される元の配列が合成され、新しい受容体ベクターにクローン化された。
【0160】
３．ベースベクター：ｐＰｕｒｏ－Ｄｅｌ－ＭＡＲ５
本発明者等の新しいベクター設計の関連性を検証するために、彼らは最初に、Ｓ／ＭＡＲ配列を短いＭＡＲ５配列で置き換えることの影響（図９６）、並びにｅＧＦＰ発現を可能にする遺伝子の代わりにピューロマイシン耐性遺伝子を使用することの影響を確認した。（図９９）。ｅＧＦＰの発現をフローサイトメトリでモニタリングした（図９７）。ＭＡＲ５配列を持つベクター（ｐＭＡＲ５）は、完全なＳ／ＭＡＲ配列を持つベクター、及び核マトリックス結合配列を持たないベクター（ｐｅＧＦＰ－Ｃ１）よりも５～６倍良好にトランスフェクトされることが示されている。複製アッセイ（図９８）は、ｐＭＡＲ５プラスミドの複製速度が、Ｓ／ＭＡＲを有するベクター（ｐＥＰｉ）よりも高く、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１ベクターよりも高いことを示している。これらの結果は、減少したＳ／ＭＡＲ配列サイズの値を実証する。更に、ｅＧＦＰ配列をピューロマイシン耐性を付与する遺伝子で置換することにより、以前の構築物による５日と比較して、細胞トランスフェクション後少なくとも１３日までＤｐｎ１複製アッセイを使用することができる（図１００）。受容体ベクターは最終的に保持され、クローニングされた。ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳを図１０２に示す。
本発明者等の新しいベクター設計の関連性を検証するために、彼らは最初に、Ｓ／ＭＡＲ配列を短いＭＡＲ５配列で置き換えることの影響（図９６）、並びにｅＧＦＰ発現を可能にする遺伝子の代わりにピューロマイシン耐性遺伝子を使用することの影響を確認した。（図９９）。ｅＧＦＰの発現をフローサイトメトリでモニタリングした（図９７）。ＭＡＲ５配列を持つベクター（ｐＭＡＲ５）は、完全なＳ／ＭＡＲ配列を持つベクター、及び核マトリックス結合配列を持たないベクター（ｐｅＧＦＰ－Ｃ１）よりも５～６倍良好にトランスフェクトされることが示されている。複製アッセイ（図９８）は、ｐＭＡＲ５プラスミドの複製速度が、Ｓ／ＭＡＲを有するベクター（ｐＥＰｉ）よりも高く、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１ベクターよりも高いことを示している。これらの結果は、減少したＳ／ＭＡＲ配列サイズの値を実証する。更に、ｅＧＦＰ配列をピューロマイシン耐性を付与する遺伝子で置換することにより、以前の構築物による５日と比較して、細胞トランスフェクション後少なくとも１３日までＤｐｎ１複製アッセイを使用することができる（図１００）。受容体ベクターは最終的に保持され、クローニングされた。ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳを図１０２に示す。
【0161】
目的２：自発的複製能力（ＷＰ２．１）の定性的及び定量的分析。
１．試験対象の起点バンクの選択及び合成
本発明者等は、ヒト複製起点及び２つの制御配列を含む６７の配列を選択した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社によって合成された）。これらの配列は、本発明による方法、すなわち本発明者等によって同定された複製起点の完全なレパートリを考慮して選択された。多能性胚性幹細胞、初代ＣＤ３４細胞、造血分化ＣＤ３４細胞、上皮細胞、及び癌遺伝子不死化上皮細胞等、様々なヒト細胞型から得られた２４の３連のサンプルを分析することにより、ヒトゲノム複製起点のゲノムワイドで高解像度のレパートリが特定された。この分析により、複製開始シグナルの８０％を担っており、分析したほとんどの細胞型に共通する「コア起点」（コアオリス）と名付けた特定のクラスの起点が明らかになった。本発明者等は、コア起点を代表する異なる特徴を示す一連の起点を選択した。これらの基準は、例えば、起点の認識に関与するＯＲＣ複合タンパク質の結合部位の存在、Ｇ四重鎖（Ｇ４）を形成できる部位の頻度、転写開始部位（ＴＳＳ）の存在、ヒストン３の翻訳後修飾（例えば、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３）の存在、Ｒｌｏｏｐの存在、他の技術（ＩｎｉＳｅｑ、ＥｄＵｓｅｑ）によるこれらの起点の位置の共同検証、起点プロファイルの４つの例の開始を担うヘリカーゼの活性化に関与するＴｒｅｓｌｉｎ－ＭＴＢＰ複合体の結合部位の存在が示されている（図１０１）。
１．試験対象の起点バンクの選択及び合成
本発明者等は、ヒト複製起点及び２つの制御配列を含む６７の配列を選択した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社によって合成された）。これらの配列は、本発明による方法、すなわち本発明者等によって同定された複製起点の完全なレパートリを考慮して選択された。多能性胚性幹細胞、初代ＣＤ３４細胞、造血分化ＣＤ３４細胞、上皮細胞、及び癌遺伝子不死化上皮細胞等、様々なヒト細胞型から得られた２４の３連のサンプルを分析することにより、ヒトゲノム複製起点のゲノムワイドで高解像度のレパートリが特定された。この分析により、複製開始シグナルの８０％を担っており、分析したほとんどの細胞型に共通する「コア起点」（コアオリス）と名付けた特定のクラスの起点が明らかになった。本発明者等は、コア起点を代表する異なる特徴を示す一連の起点を選択した。これらの基準は、例えば、起点の認識に関与するＯＲＣ複合タンパク質の結合部位の存在、Ｇ四重鎖（Ｇ４）を形成できる部位の頻度、転写開始部位（ＴＳＳ）の存在、ヒストン３の翻訳後修飾（例えば、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３）の存在、Ｒｌｏｏｐの存在、他の技術（ＩｎｉＳｅｑ、ＥｄＵｓｅｑ）によるこれらの起点の位置の共同検証、起点プロファイルの４つの例の開始を担うヘリカーゼの活性化に関与するＴｒｅｓｌｉｎ－ＭＴＢＰ複合体の結合部位の存在が示されている（図１０１）。
【0162】
配列は、多重クローニング部位（ＭＣＳ）に含まれるＥｃｏｒＶ部位でｐＰｕｒｏ－Ｄｅｌ－ＭＡＲ５－ＭＣＳにクローン化された（図１０２）。ライブラリ（すなわち起点を含む）を受け取ると、ベクターをコンピテント細菌に形質転換し、サブクローニングし、次いで調製した。それらの全体的なサイズ及び構造は、制限酵素消化とそれに続くアガロースゲル移動によって検証された。「単純な」ベクターの予想されるプロファイルに加えて、研究を続けるために単純化しなければならない二量体プラスミド（又は単純な二量体プラスミドの混合物）を特定した（ライブラリの約４分の１）。
【0163】
２．ベクターライブラリへのＤｐｎ１アッセイの適用
ライブラリからのベクターの自発的複製能力を評価するために、５つのプラスミドベクターのプールでトランスフェクトされた２９３Ｔ又は２９３細胞にＤｐｎＩ消化に基づく高速複製アッセイを適用した（図１０３及び表６）。アッセイの最後に、コロニーを計数し、プラスミドの複製能力の結果（トランスフェクションの６日後）を提示した（図１０４）。ＤｐｎＩ消化によるカナマイシン耐性コロニーに含まれるプラスミドを調製し、配列決定した。識別されると、自発的に複製できるベクターは個別に迅速複製アッセイに再提出された。トランスフェクションの６日後、複製が明確に検出される。ただし、ウイルス複製タンパク質（Ｔ抗原）をコードする２９３Ｔ細胞では、ＳＶ４０複製起点を含むベクターと比較してその速度は低くなる。しかし、ＳＶ４０には細胞周期を調節解除する能力があり、同じ細胞周期内でウイルスＤＮＡを再複製することができる。これは、細胞複製起点ではまったく不可能であり、その主要な規則は、各起点が同じ細胞周期中に一度だけしか使用できないことである。実際、再複製は遺伝子増幅現象を引き起こし、ゲノムの不安定性をもたらす。本発明者等は、連続する細胞分裂中に複製されるベクターの数をより正確に推定するために、ｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲによる定量化並びにその後の評価（トランスフェクションの１２～１３日後）を行った。これらのデータは、複製起点が真核生物細胞内でそれらを含むベクターの自己複製を可能にすることを示している。
ライブラリからのベクターの自発的複製能力を評価するために、５つのプラスミドベクターのプールでトランスフェクトされた２９３Ｔ又は２９３細胞にＤｐｎＩ消化に基づく高速複製アッセイを適用した（図１０３及び表６）。アッセイの最後に、コロニーを計数し、プラスミドの複製能力の結果（トランスフェクションの６日後）を提示した（図１０４）。ＤｐｎＩ消化によるカナマイシン耐性コロニーに含まれるプラスミドを調製し、配列決定した。識別されると、自発的に複製できるベクターは個別に迅速複製アッセイに再提出された。トランスフェクションの６日後、複製が明確に検出される。ただし、ウイルス複製タンパク質（Ｔ抗原）をコードする２９３Ｔ細胞では、ＳＶ４０複製起点を含むベクターと比較してその速度は低くなる。しかし、ＳＶ４０には細胞周期を調節解除する能力があり、同じ細胞周期内でウイルスＤＮＡを再複製することができる。これは、細胞複製起点ではまったく不可能であり、その主要な規則は、各起点が同じ細胞周期中に一度だけしか使用できないことである。実際、再複製は遺伝子増幅現象を引き起こし、ゲノムの不安定性をもたらす。本発明者等は、連続する細胞分裂中に複製されるベクターの数をより正確に推定するために、ｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲによる定量化並びにその後の評価（トランスフェクションの１２～１３日後）を行った。これらのデータは、複製起点が真核生物細胞内でそれらを含むベクターの自己複製を可能にすることを示している。
【表8】
【0164】
３．二量体ベクターの複製の特殊な場合
ベクターライブラリのサブクローニング中に、本発明者等は、対称的な二量体ベクターの存在を強調し（図１０８）、予想よりも２倍高いプラスミドのスーパーコイル形態のバンドプロファイルを示し、二重消化プロファイルは、単一プラスミドに対して予想されたものである（図１０５、例えば１６．２）。他の場合において、本発明者等は、一重形態及び二重形態の両方を含むプラスミド調製物を観察した（１４．１の場合、図１０５）。単一ベクターの単一部位を切断する制限酵素によるこれらのベクターの部分消化（例、１５．２、図１０６及び１０７）により、二量体プラスミドの二重サイズが確認される。興味深いことに、本発明者等は、二量体プラスミドがそれらの単純な形態よりも優れた複製能力を有することを観察した（図１０９）（特にベクター１０．３の場合）。この観察は、必要に応じて、複数の起点を含むベクターの作成を動機付ける。
ベクターライブラリのサブクローニング中に、本発明者等は、対称的な二量体ベクターの存在を強調し（図１０８）、予想よりも２倍高いプラスミドのスーパーコイル形態のバンドプロファイルを示し、二重消化プロファイルは、単一プラスミドに対して予想されたものである（図１０５、例えば１６．２）。他の場合において、本発明者等は、一重形態及び二重形態の両方を含むプラスミド調製物を観察した（１４．１の場合、図１０５）。単一ベクターの単一部位を切断する制限酵素によるこれらのベクターの部分消化（例、１５．２、図１０６及び１０７）により、二量体プラスミドの二重サイズが確認される。興味深いことに、本発明者等は、二量体プラスミドがそれらの単純な形態よりも優れた複製能力を有することを観察した（図１０９）（特にベクター１０．３の場合）。この観察は、必要に応じて、複数の起点を含むベクターの作成を動機付ける。
【0165】
４．ベクターの配列
－空のベクター（ヒト起点なし）ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：配列番号：４３２８９
以下のベクターは、本発明で定義される複製起点を含む：
＞１＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９０
＞１＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９１
＞１＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９２
＞１＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９３
＞１０＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９４
＞１０＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９５
＞１０＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９６
＞１０＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９７
＞１１＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９８
＞１１＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９９
＞１２＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３００
＞１２＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０１
＞１２＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０２
＞１３＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０３
＞１４＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０４
＞１４＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０５
＞１５＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０６
＞１５＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０７
＞１５＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０８
＞１５＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０９
＞１６＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１０
＞１６＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１１
＞１７＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１２
＞１７＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１３
＞１７＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１４
＞１８＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１５
＞１９＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１６
＞２０＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１７
＞２１＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１８
＞５＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１９
＞６＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２０
＞６＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２１
＞６＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２２
＞７＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２３
＞９＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２４
＞９＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２５
＞９＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２６
＞１＿５＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２７
＞１１＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２８
＞１１＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２９
＞１４＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３０
＞１６＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３１
＞１７＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３２
＞１７＿５＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３３
＞１７＿６＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３４
＞１９＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３５
＞１９＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３６
＞１９＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３７
＞１９＿５＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３８
＞１９＿６＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３９
＞１９＿７＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４０
＞１９＿８＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４１
＞１９＿９＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４２
＞２＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４３
＞２＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４４
＞２０＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４５
＞２２＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４６
＞３＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４７
＞３＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４８
＞３＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４９
＞３＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５０
＞６＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５１
＞６＿５＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５２
＞６＿６＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５３
＞６＿７＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５４
＞８＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５５
＞８＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５６
＞８＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５７
＞８＿４＿Ｍｙｃ＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５８
－空のベクター（ヒト起点なし）ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：配列番号：４３２８９
以下のベクターは、本発明で定義される複製起点を含む：
＞１＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９０
＞１＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９１
＞１＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９２
＞１＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９３
＞１０＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９４
＞１０＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９５
＞１０＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９６
＞１０＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９７
＞１１＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９８
＞１１＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３２９９
＞１２＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３００
＞１２＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０１
＞１２＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０２
＞１３＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０３
＞１４＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０４
＞１４＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０５
＞１５＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０６
＞１５＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０７
＞１５＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０８
＞１５＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３０９
＞１６＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１０
＞１６＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１１
＞１７＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１２
＞１７＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１３
＞１７＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１４
＞１８＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１５
＞１９＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１６
＞２０＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１７
＞２１＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１８
＞５＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３１９
＞６＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２０
＞６＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２１
＞６＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２２
＞７＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２３
＞９＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２４
＞９＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２５
＞９＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２６
＞１＿５＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２７
＞１１＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２８
＞１１＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３２９
＞１４＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３０
＞１６＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３１
＞１７＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３２
＞１７＿５＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３３
＞１７＿６＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３４
＞１９＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３５
＞１９＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３６
＞１９＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３７
＞１９＿５＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３８
＞１９＿６＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３３９
＞１９＿７＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４０
＞１９＿８＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４１
＞１９＿９＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４２
＞２＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４３
＞２＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４４
＞２０＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４５
＞２２＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４６
＞３＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４７
＞３＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４８
＞３＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３４９
＞３＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５０
＞６＿４＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５１
＞６＿５＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５２
＞６＿６＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５３
＞６＿７＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５４
＞８＿１＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５５
＞８＿２＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５６
＞８＿３＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５７
＞８＿４＿Ｍｙｃ＿ｐＰｕｒｏＤｅｌ－ＭＡＲ５＿ＭＣＳ：配列番号：４３３５８
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
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【図20】
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【国際調査報告】