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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-25
(54)【発明の名称】癌を患う患者を処置し、層別化する方法。
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6851 20180101AFI20230915BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230915BHJP
A61K 31/495 20060101ALI20230915BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20230915BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20230915BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230915BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6851 ZNA
A61K45/00
A61K31/495
A61K31/496
A61K31/5377
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023516081
(86)(22)【出願日】2021-09-13
(85)【翻訳文提出日】2023-05-09
(86)【国際出願番号】 EP2021075132
(87)【国際公開番号】W WO2022053691
(87)【国際公開日】2022-03-17
(31)【優先権主張番号】20306025.6
(32)【優先日】2020-09-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591100596
【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル
(71)【出願人】
【識別番号】522478330
【氏名又は名称】アンスティチュ・ドゥ・カンセロロジー・ドゥ・ルゥエスト
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＤＥ ＣＡＮＣＥＲＯＬＯＧＩＥ ＤＥ Ｌ‘ＯＵＥＳＴ
(71)【出願人】
【識別番号】507421289
【氏名又は名称】ナント・ユニヴェルシテ
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＴＥＳ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】カルトロン，ピエール－フランソワ
(72)【発明者】
【氏名】ブーグラス－カルトロン，グヴェノラ
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QX02
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC411
4C084ZC412
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC50
4C086BC73
4C086CB05
4C086GA12
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB26
4C086ZC41
(57)【要約】
癌を患う患者を治療および層別化する方法
本発明は、癌に罹患している患者の層別化と治療に関する。抗ＰＤ１療法はリンパ球を標的とし、抗癌剤治療の効率は腫瘍細胞への影響によって測定されるという事実に起因して、本発明者らは、抗ＰＤ１療法の耐性の分子メカニズムを研究することは、リンパ球と腫瘍細胞の間の既存の細胞間コミュニケーションを考慮に入れるべきだと仮定した。エキソソームは、化学療法抵抗性の原因となるｍｉＲＮＡの細胞間伝達のためのキャリアであるため、彼らは、抗ＰＤ１療法にＴ細胞を曝露することで、がん細胞の化学療法抵抗性を引き起こすエキソソームｍｉＲＮＡ（ｅｘｏｍｉＲ）の発現を促進できるかどうかを調べた。その結果、抗ＰＤ１療法を受けたＴ細胞は、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の濃縮を促進することが判明した。また、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５を受け取ったがん細胞は、従来の化学療法に対してアポトー抵抗性という現象を引き起こすことを指摘した。分子レベルでは、このアポトーシス抵抗性現象は、ｍｉＲＮＡ－４３１５を介したアポトーシス促進タンパク質であるＢｉｍのダウンレギュレーションと関連していることを発見した。また、細胞やマウスモデルにおいて、ＢＨ３模倣剤ＡＢＴ２６３がこの抵抗性を回避することが確認された。したがって、本発明は、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５を用いた層別化方法およびＢＨ３模倣剤を用いた癌に苦しむ患者の治療方法に関するものである。
本発明は、癌に罹患している患者の層別化と治療に関する。抗ＰＤ１療法はリンパ球を標的とし、抗癌剤治療の効率は腫瘍細胞への影響によって測定されるという事実に起因して、本発明者らは、抗ＰＤ１療法の耐性の分子メカニズムを研究することは、リンパ球と腫瘍細胞の間の既存の細胞間コミュニケーションを考慮に入れるべきだと仮定した。エキソソームは、化学療法抵抗性の原因となるｍｉＲＮＡの細胞間伝達のためのキャリアであるため、彼らは、抗ＰＤ１療法にＴ細胞を曝露することで、がん細胞の化学療法抵抗性を引き起こすエキソソームｍｉＲＮＡ（ｅｘｏｍｉＲ）の発現を促進できるかどうかを調べた。その結果、抗ＰＤ１療法を受けたＴ細胞は、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の濃縮を促進することが判明した。また、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５を受け取ったがん細胞は、従来の化学療法に対してアポトー抵抗性という現象を引き起こすことを指摘した。分子レベルでは、このアポトーシス抵抗性現象は、ｍｉＲＮＡ－４３１５を介したアポトーシス促進タンパク質であるＢｉｍのダウンレギュレーションと関連していることを発見した。また、細胞やマウスモデルにおいて、ＢＨ３模倣剤ＡＢＴ２６３がこの抵抗性を回避することが確認された。したがって、本発明は、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５を用いた層別化方法およびＢＨ３模倣剤を用いた癌に苦しむ患者の治療方法に関するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉ）患者からのサンプルにおけるエキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、ｉｉｉ）エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルが所定の基準値より優れている場合、患者が抗ＰＤ１療法に対する耐性を有するかまたは発症する危険性があると結論付け、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルが所定の基準値より劣る場合、患者が抗ＰＤ１療法に対する耐性を有するかまたは発症しない危険がないと結論付けることからなる工程を含む、抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有するか又は発症するリスクのある患者を特定する方法。
【請求項2】
ｉ）患者から得られたサンプルにおいて、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、ｉｉｉ）エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルが所定の基準値より優れている場合に、患者が抗ＰＤ１療法に反応しないと結論付け、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルが所定の基準値より劣っている場合に患者が抗ＰＤ１療法に反応すると結論付けることを含む、その必要がある癌に罹患している患者の抗ＰＤ－１療法の奏効を予測するための方法。
【請求項3】
抗ＰＤ－１療法が、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはセミピリマブである、請求項１に記載の識別方法または請求項２に記載の予測方法。
【請求項4】
試料が、血液、血漿、血清試料、Ｔ細胞由来エキソソームまたは癌生検である、請求項１に記載の識別方法または請求項２に記載の予測方法。
【請求項5】
患者が、抗ＰＤ－１療法と同時に、別々に、または逐次的に標準化学療法を受けることができる、請求項１、３または４に記載の識別方法または請求項２、３または４に記載の予測方法。
【請求項6】
標準化学療法が、オキサリプラチン、シスプラチン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ドキソルビシンまたはパクリタキセルである、請求項５に記載の識別方法または予測方法。
【請求項7】
請求項１に記載の抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有する、または有するであろう、または発症するであろうとして同定された対象における癌の治療において使用するためのＢＨ３模倣剤。
【請求項8】
請求項２に記載の抗ＰＤ－１療法に反応しない被験者の治療に使用するための、ＢＨ３模倣剤。
【請求項9】
ＢＨ３模倣剤が、以下：ＡＢＴ－７３７、ベネトクラックス（ＡＢＴ－１９９）およびナビトクラックス（ＡＢＴ－２６３）からなる群から選択され得る、請求項７または８に記載の使用のためのＢＨ３模倣剤。
【請求項10】
がんが、膠芽腫（ＧＢＭ）、肺がん、乳がんまたは卵巣がんである、請求項１に記載の同定方法または請求項２に記載の予測方法、または請求項７～９に記載のＢＨ３模倣剤。
【請求項11】
本発明による抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有するか、または有するであろう、または発症するであろうとして識別された対象に、治療有効量のＢＨ３模倣剤を投与することを含む、癌を治療するための方法。
【請求項12】
請求項１に記載の抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有するか、または有するであろうか、または発症するであろうとして識別された対象における癌の治療において使用するための、本発明によるＢＨ３模倣剤を含む治療組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、癌に罹患している患者の層別化と処置に関する。
本発明は、癌に罹患している患者の層別化と処置に関する。
【0002】
発明の背景
免疫チェックポイントインヒビターは、ファーストラインまたは従来の化学療法との併用で、抗がん剤治療として大きな期待が寄せられている（１）。抗ＰＤ１療法は、現在までのところ、最も効果的な抗がん剤免疫療法の１つである。この成功にもかかわらず、かなりの数の患者がこの治療法に対して耐性を獲得し、あるいは将来的に獲得する（２－３－４－５）。抗ＰＤ１療法に対する生得的な耐性は、メラノーマ患者の６０％に認められ（６）、２５％は客観的奏効の初期段階の後に耐性を獲得する（７）。非小細胞肺がんでは、Ｇｅｔｔｉｎｇｅｒらが抗ＰＤ１療法に対する獲得抵抗性という現象を特徴とする患者を同定した（８）。抗ＰＤ１療法に対する耐性は臨床で観察されているが、その分子的な原因は完全には解明されていない。そのため、抗ＰＤ１療法への耐性に関連するバイオマーカーの記述を完成させるためには、広範な研究を行う必要がある。さらに、これらの革新的なバイオマーカーが明らかになれば、抗ＰＤ１療法に対する耐性に対する治療標的を提供できる可能性がある。
免疫チェックポイントインヒビターは、ファーストラインまたは従来の化学療法との併用で、抗がん剤治療として大きな期待が寄せられている（１）。抗ＰＤ１療法は、現在までのところ、最も効果的な抗がん剤免疫療法の１つである。この成功にもかかわらず、かなりの数の患者がこの治療法に対して耐性を獲得し、あるいは将来的に獲得する（２－３－４－５）。抗ＰＤ１療法に対する生得的な耐性は、メラノーマ患者の６０％に認められ（６）、２５％は客観的奏効の初期段階の後に耐性を獲得する（７）。非小細胞肺がんでは、Ｇｅｔｔｉｎｇｅｒらが抗ＰＤ１療法に対する獲得抵抗性という現象を特徴とする患者を同定した（８）。抗ＰＤ１療法に対する耐性は臨床で観察されているが、その分子的な原因は完全には解明されていない。そのため、抗ＰＤ１療法への耐性に関連するバイオマーカーの記述を完成させるためには、広範な研究を行う必要がある。さらに、これらの革新的なバイオマーカーが明らかになれば、抗ＰＤ１療法に対する耐性に対する治療標的を提供できる可能性がある。
【0003】
発明の概要
抗ＰＤ１療法はリンパ球を標的とし、抗癌剤治療の効率は腫瘍細胞への影響によって測定されるという事実のため、本発明者らは、抗ＰＤ１療法の耐性の分子メカニズムを研究するには、リンパ球と腫瘍細胞間の既存の細胞間コミュニケーションを考慮するべきだと仮定した。エキソソームは、化学療法抵抗性の原因となるｍｉＲＮＡの細胞間移動のためのキャリアであることから（９－１０－１１－１２）、彼らは、抗ＰＤ１療法にＴ細胞を曝露することにより、がん細胞の化学療法抵抗性を引き起こすエキソソームｍｉＲＮＡ（ｅｘｏｍｉＲ）の発現が促進されるかどうかを調べた。その結果、抗ＰＤ１療法を受けたＴ細胞は、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の濃縮を促進することが判明した。また、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５を受け取ったがん細胞は、従来の化学療法に対してアポトー抵抗性という現象を引き起こすことを指摘した。分子レベルでは、このアポトーシス抵抗性現象は、ｍｉＲＮＡ－４３１５を介したアポトーシス促進タンパク質であるＢｉｍのダウンレギュレーションと関連していることを発見した。細胞およびマウスモデルでは、ＢＨ３模倣剤ＡＢＴ２６３がこの抵抗性を回避することが確認された。エキソソームの血液を用いた縦断的研究により、ｍｉＲＮＡ－４３１５とシトクロムｃを用いて、ＡＢＴ２６３療法の追加によりがん細胞死が効果的に増加し、抗ＰＤ１耐性を回避できる期間を定義できることが示された。この研究のおかげで、本発明者らは、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５が、抗ＰＤ１抗体療法に対する耐性現象を発症している患者の層別化のための血液バイオマーカーとして使用できることを示し、この耐性現象を制限するための治療代替法（ＢＨ３模倣薬の使用）を特定した。
したがって、本発明は、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５を用いた層別化方法およびＢＨ３模倣薬を用いた癌に苦しむ患者の治療方法に関するものである。特に、本発明は、その特許請求の範囲によって定義される。
抗ＰＤ１療法はリンパ球を標的とし、抗癌剤治療の効率は腫瘍細胞への影響によって測定されるという事実のため、本発明者らは、抗ＰＤ１療法の耐性の分子メカニズムを研究するには、リンパ球と腫瘍細胞間の既存の細胞間コミュニケーションを考慮するべきだと仮定した。エキソソームは、化学療法抵抗性の原因となるｍｉＲＮＡの細胞間移動のためのキャリアであることから（９－１０－１１－１２）、彼らは、抗ＰＤ１療法にＴ細胞を曝露することにより、がん細胞の化学療法抵抗性を引き起こすエキソソームｍｉＲＮＡ（ｅｘｏｍｉＲ）の発現が促進されるかどうかを調べた。その結果、抗ＰＤ１療法を受けたＴ細胞は、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の濃縮を促進することが判明した。また、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５を受け取ったがん細胞は、従来の化学療法に対してアポトー抵抗性という現象を引き起こすことを指摘した。分子レベルでは、このアポトーシス抵抗性現象は、ｍｉＲＮＡ－４３１５を介したアポトーシス促進タンパク質であるＢｉｍのダウンレギュレーションと関連していることを発見した。細胞およびマウスモデルでは、ＢＨ３模倣剤ＡＢＴ２６３がこの抵抗性を回避することが確認された。エキソソームの血液を用いた縦断的研究により、ｍｉＲＮＡ－４３１５とシトクロムｃを用いて、ＡＢＴ２６３療法の追加によりがん細胞死が効果的に増加し、抗ＰＤ１耐性を回避できる期間を定義できることが示された。この研究のおかげで、本発明者らは、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５が、抗ＰＤ１抗体療法に対する耐性現象を発症している患者の層別化のための血液バイオマーカーとして使用できることを示し、この耐性現象を制限するための治療代替法（ＢＨ３模倣薬の使用）を特定した。
したがって、本発明は、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５を用いた層別化方法およびＢＨ３模倣薬を用いた癌に苦しむ患者の治療方法に関するものである。特に、本発明は、その特許請求の範囲によって定義される。
【0004】
発明の詳細な説明
予後診断法
第１の態様において、本発明は、ｉ）前記患者からのサンプルにおけるエキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較し、ｉｉｉ）エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルが所定の基準値より優れている場合、患者が抗ＰＤ１療法に対する耐性を有するか又は発現するリスクがあると結論付け、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルが所定の基準値より劣る場合、患者が抗ＰＤ１療法に対する耐性を有しないか又は発現しないリスクがないと結論付ける工程を含む、抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有するかまたは発症するリスクのある患者を特定する方法に関する。
予後診断法
第１の態様において、本発明は、ｉ）前記患者からのサンプルにおけるエキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較し、ｉｉｉ）エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルが所定の基準値より優れている場合、患者が抗ＰＤ１療法に対する耐性を有するか又は発現するリスクがあると結論付け、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルが所定の基準値より劣る場合、患者が抗ＰＤ１療法に対する耐性を有しないか又は発現しないリスクがないと結論付ける工程を含む、抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有するかまたは発症するリスクのある患者を特定する方法に関する。
【0005】
すなわち、本発明は、抗ＰＤ－１療法により治療される患者の層別化方法に関するものである。
【0006】
また、本発明は、ｉ）患者から得られたサンプルにおいて、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、ｉｉｉ）エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルが所定の基準値より優れている場合に、患者が抗ＰＤ１療法に反応しないと結論付け、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルが所定の基準値より劣っている場合に患者が抗ＰＤ１療法に反応すると結論付けることを含む、癌に罹患している患者の抗ＰＤ－１療法の奏効を予測するための方法に関する。
【0007】
本発明によれば、本発明の方法は、特にｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
【0008】
一実施形態では、癌は、任意の固体癌または液体癌であってもよい。典型的には、癌は、胆管癌（たとえば、肝周囲癌、遠位胆管癌、肝内胆管癌）、膀胱癌、骨癌（例えば。骨芽細胞腫、骨軟骨腫、血管腫、軟骨性線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨巨細胞腫、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳・中枢神経系がん（たとえば、髄膜腫、星細胞腫、乏突起膠腫、膠芽腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、シュワノーマ、胚芽腫、頭蓋咽頭腫）、乳癌（たとえば、in situ乳管がん、浸潤性乳管がん、浸潤性、小葉がん、ｉｎ、ｓｉｔｕ小葉がん、女性化乳房）、キャッスルマン病（たとえば、巨大リンパ節過形成、血管毛包性リンパ節過形成）、頸がん、大腸がん、子宮内膜がん（たとえば、子宮内膜腺癌、腺癌、乳頭状漿液腺癌、明細胞）、食道癌、胆嚢癌（粘液性腺癌、小細胞癌）、消化管カルチノイド腫瘍（たとえば、絨毛癌、絨毛腺腫デストルエンス）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓がん（腎細胞がんなど）、喉頭・下咽頭がん、肝臓がん（たとえば、血管腫、肝腺腫、巣状結節性過形成、肝細胞がん）、肺がん（たとえば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔・副鼻腔がん（たとえば、エステシオネーロブラストーマ、正中線肉芽腫）、上咽頭がん、神経芽腫、口腔・中咽頭がん、卵巣がん、すい臓がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（たとえば、胚性横紋筋肉腫、肺胞性横紋筋肉腫、多形横紋筋肉腫）、唾液腺がん、皮膚がん（たとえば、メラノーマ、非メラノーマ皮膚がん）、胃がん、精巣がん（たとえば、セミノーマ、非セミノーマ胚細胞がんなど）、胸腺がん、甲状腺がん（たとえば、濾胞がん、未分化がん、低分化がん、甲状腺髄質がん、甲状腺リンパ腫）、膣がん、外陰がん、子宮がん（たとえば、子宮平滑筋肉腫）である。
【0009】
特定の実施形態では、癌は、膠芽腫（ＧＢＭ）、肺癌、乳癌または卵巣癌である。
【0010】
特定の実施形態では、膠芽腫は多形膠芽腫（ＧＢＭ）であり、肺癌は肺腺癌である。
【0011】
典型的には、本発明による試料は、血液、血漿、血清試料、Ｔ細胞由来エキソソーム又は癌生検であり得る。
【0012】
本発明によれば、用語「患者」または「対象」は、齧歯類、ネコ、イヌ、および霊長類のような哺乳類を示す。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトの乳児である。特に、対象は、癌、特に、ＧＢＭ、肺癌、乳癌または卵巣癌を有するヒトを示す。
【0013】
本明細書で使用される場合、用語「ｍｉＲＮＡ－４３１５」は、１７番染色体（１７ｑ２１．３１）上に位置し、ｍｉＲＢａｓｅデータベースにおいてＩＤ番号ＭＩ００１５８４４の下でアクセス可能なｍｉＲＮＡ遺伝子を示す。
【0014】
特に、ｍｉＲＮＡ－４３１５は、ｈｓａ－ｍｉｒ－４３１５－１であり、成熟ｍｉＲＮＡ－４３１５の核酸配列は、（５’－３’）：ＣＣＧＣＵＵＣＵＧＡＧＣＵＧＧＡＣ（配列番号１）である。
【0015】
本明細書で使用する場合、用語「エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５」は、エキソソームにおけるｍｉＲＮＡ－４３１５の存在を示す。特定の実施形態では、「エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５」は、抗ＰＤ－１療法に曝露したＴ細胞由来のｍｉＲＮＡ－４３１５を含むエキソソームである。
【0016】
本明細書で使用されるように、用語「エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベル」又は「エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５のレベル」は、ｍｉＲＮＡ－４３１５の全体と比較したエキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５のレベルを表す。
【0017】
本明細書で使用されるように、用語「抗ＰＤ－１療法」は、患者の癌を治療するための少なくとも１つの抗体抗ＰＤ－１の使用を示す。例えば、抗体抗ＰＤ－１は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ又はセミプリマブであり得る。
【0018】
特定の実施形態では、患者は、抗ＰＤ－１療法と同時に、別々に、または逐次的に、標準化学療法を受けることができる。
【0019】
本明細書で使用する場合、用語「標準化学療法」は、シタラビン、アントラサイクリン、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メトトレキサート、タキソール、タキソテール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シクロホスファミド、イフォスファミド、ニトロソウレア、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなどの白金錯体、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルビジン、エトポシド、テニポシド、カンパテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノミシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ドキソルビシン、エピンビム、５－フルオロウラシル、ドセタキセルやパクリタキセルなどのタキサン系、ロイコボリン、レバミソール、イリノテカン、エストラムスチン、エトポシド、ナイトロジェンマスタード、ＢＣＮＵ、カルムストメやロムスチンなどのニトロソウレア剤、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド、メシル酸イマチン、ヘキサメチルアミン、トポテカン、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ＡＴＰａｓｅ阻害剤、ティルホスチン、プロテアーゼ阻害剤、阻害剤ハービミクイフォスファミド、エルブスタチンおよびラベントスチンＡからなるがそれだけに限らない群から選択される古典的抗癌剤を示す。
一実施形態では、追加の抗癌剤は、以下のクラスの薬剤の１つまたは組み合わせから選択され得るが、これらに限定されるものではない：アルキル化剤、植物アルカロイド、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、抗フォレート、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、ＤＮＡ代謝拮抗剤、タキサン、ポドフィロトキシン、ホルモン療法、レチノイド、光増感剤または光力学的療法、血管形成阻害剤、抗微生物剤、アイソプレニル化阻害剤、細胞周期阻害剤、アクティノマイシン、ブレオマイシン、ＭＤＲ阻害剤およびＣａ２＋ＡＴＰａｓｅ阻害剤。
一実施形態では、追加の抗癌剤は、以下のクラスの薬剤の１つまたは組み合わせから選択され得るが、これらに限定されるものではない：アルキル化剤、植物アルカロイド、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、抗フォレート、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、ＤＮＡ代謝拮抗剤、タキサン、ポドフィロトキシン、ホルモン療法、レチノイド、光増感剤または光力学的療法、血管形成阻害剤、抗微生物剤、アイソプレニル化阻害剤、細胞周期阻害剤、アクティノマイシン、ブレオマイシン、ＭＤＲ阻害剤およびＣａ２＋ＡＴＰａｓｅ阻害剤。
【0020】
特に、標準化学療法は、オキサリプラチン、シスプラチン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ドキソルビシンまたはパクリタキセルであり得る。
【0021】
別の実施形態では、癌、特に膠芽腫に罹患した患者は、最大限の外科的切除、放射線療法、およびテモゾロミドのような補助標準化学療法の併用からなる標準治療で治療することもできる。
【0022】
一実施形態において、また本発明の方法によれば、本発明のエキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルの決定は、患者の抗ＰＤ－１療法による治療の開始前または開始後に決定され得る。
【0023】
上記で使用される「発現レベルの決定」という用語は、対照を参照するか否かを問わず、定性的及び／又は定量的な検出（レベルを測定すること）を含む。典型的には、本発明のｍｉＲの発現レベルは、例えば、ＲＮＡ－免疫沈降法、架橋免疫沈降法、ｑＲＴ－ＰＣＲの実施、及び試料に対する全てのＲＮＡ配列決定法によって測定され得る。
【0024】
基準値」は、健康な対象、すなわち、いかなる癌、特に膠芽腫にも罹患していない対象であってもよい。特に、前記対照は、健常者でない対象である。別の実施形態では、「基準値」は、抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有しない癌を有する対象であり得る。
【0025】
ｍｉＲの発現レベルの測定は、当技術分野でよく知られている様々な技術によって行うことができる。本発明の場合、本発明のｍｉＲのレベルを決定する前に、Ｔ細胞由来のエキソソーム（Ｔ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅ）は、それを可能にする任意の技術によって単離および定量される（例えば、本願の材料および方法部分を参照）。特に、エキソソームの単離には、「ＥｘｏＱｕｉｃｋ」（材料及び方法の部分を参照）を使用することができる。
【0026】
ｍｉＲの量を決定するための方法は、当該技術分野において周知である。たとえば、試料（たとえば、患者から調製した細胞または組織）に含まれる核酸は、まず標準的な方法に従って抽出され、たとえば、溶解酵素または化学溶液を使用するか、または製造者の指示に従って核酸結合樹脂によって抽出される。次に、抽出されたｍｉＲは、ハイブリダイゼーション（たとえば、ノーザンブロット分析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）及び／又は増幅（たとえば、ＲＴ－ＰＣＲ）により検出される。
【0027】
増幅の他の方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）などが挙げられる。
【0028】
少なくとも１０ヌクレオチドを有し、本明細書で関心のあるｍｉＲに対して配列相補性または相同性を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーとして有用である。そのような核酸は同一である必要はないが、典型的には、同等のサイズの相同領域と少なくとも約８０％同一、より詳細には８５％同一、さらに詳細には９０～９５％同一であることが理解される。特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションを検出するために、検出可能なラベルなどの適切な手段と組み合わせて核酸を使用することが有利になるであろう。
【0029】
典型的には、核酸プローブは、たとえば、開示されたプローブを用いた標的核酸分子の検出を可能にするために、１つまたは複数のラベルを含む。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション手順などの様々な用途において、核酸プローブは標識（たとえば、検出可能な標識）を含む。検出可能な標識」とは、サンプル中のプローブ（特に、結合またはハイブリダイズしたプローブ）の存在または濃度を示す検出可能なシグナルを生成するために使用できる分子または材料である。したがって、標識核酸分子は、サンプル中の標的核酸配列（たとえば、ゲノム標的核酸配列）（標識一意性核酸分子が結合またはハイブリダイズしたもの）の存在または濃度の指標を提供する。１つまたは複数の核酸分子（開示された方法によって生成されたプローブなど）に関連する標識は、直接的または間接的に検出され得る。ラベルは、光子（無線周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視周波数および紫外線周波数の光子を含む）の吸収、放出および／または散乱を含む任意の既知のまたはまだ発見されていないメカニズムによって検出され得る。検出可能なラベルには、着色、蛍光、燐光および発光の分子および材料、ある物質を別の物質に変換して検出可能な差異を提供する触媒（酵素など）（たとえば、無色物質を着色物質に変換することまたはその逆、あるいは沈殿物を生成またはサンプル濁度を増加させることによって）、抗体結合相互作用によって検出できるハプテン、ならびに常磁および磁気分子または材料が挙げられる。
【0030】
検出可能なラベルの特定の例には、蛍光分子（またはフルオロクロム）が含まれる。多数のフルオロクロムが当業者に知られており、たとえば、Life Technologies（旧Invitrogen）、たとえば、The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies）参照から選択することができる。核酸分子（一意的に特異的な結合領域など）に付着（たとえば、化学的に結合）させることができる特定のフルオロフォアの例は、Ｎａｚａｒｅｎｋｏらの米国特許第５，８６６，３６６号、たとえば、４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’ジスルホン酸、アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネートなどの誘導体、５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４－アミノ－Ｎ－［３ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド－３，５ ジスルホン酸塩（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ－（４－アニリノ－１－ナフチル）マレイミド、アントル１ラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリン及びクマリンなどの誘導体、７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７－アミノ－４－トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）；シアノシン；４’，６－ジアルニジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５”ジブロモピロガロール－スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’－ジイソチオシアナトジヒドロチルベン－２，２’－ジスルホン酸；４，４”－ジイソチオシアナトチルベン－２，２’－ビスルホ１酸．５－［ジメチルアミノ］ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ＤＮＳ、塩化ダンシル）；４－（４’－ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４－ジメチルアミノフェニルアゾフェニル－４’－イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよびエオシンイソチオシアネートなどの派生物；エリスロジンおよびエリスロジンＢ、エリスロジンイソチオシアネートなどの派生物など；エチジウム；フルオレセインおよび５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５－（４，６ ジクロトリアジン－２－ｙダルミノフルオレセイン）（ＤＴＡＦ）、２’７’ジメトキシ－４’５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオロセイン、フルオロセンシアン（ＦＩＴＣ）およびＱＦＩＴＣ Ｑ（ＲＩＴＣ）といった誘導体など；２’，７’－ジフルオロフルオレセイン（ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮＲ）；フルオレアミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４－メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロサニリン；フェノールレッド；Ｂ－フィコエリスリン；ｏ－フタルアルデヒド；ピレンおよびピレン、ピレンブチレートおよびスクシンイミドリル１ピレンブチレートなどの誘導体など；リアクティブレッド４（シバクロン ブリリアントレッド３Ｂ－Ａ）；ローダミンおよびその誘導体（６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸ イソチオシアネート、ローダムグリーン、サルフォローダムＢ、シルフォルローダム１０１およびサルフォルローダム１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサスレッド））； Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ローソク酸およびテルビウムキレート誘導体などである。他の適切なフルオロフォアとしては、約６１７ｍｎで発光するチオール反応性ユーロピウムキレート（Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem. 248:216-27, 1997; J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999）、ならびにＧＦＰ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（商標）、ジエチルアミノクマリン、フルオレッセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレッセイン、４，７－ジクロロローダムおよびキサンテン（リーらへの米国特許第５，８００，９９６号に記載）およびそれらの誘導体である。当業者に知られている他のフルオロフォアも使用することができ、たとえば、Life Technologies（Invitrogen；Molecular Probes（Eugene，Oreg.））から入手可能で、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲＲシリーズの色素を含む（たとえば、米国特許第５，６９６，１５７号、６，１３０，１０１号および６，７１６，９７９号に記載）、ＢＯＤＩＰＹシリーズ色素（ジピロメテンボロンジフルオリド色素、たとえば、米国特許第４，７７４，３３９号、第５，１８７，２８８号、第５，２４８，７８２号、第５，２７４，１１３号、第５，３３８，８５４号、第５，４５１，６６３号、第５，４３３，８９６号）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．１ に記載のスルフォン化ピレンのアミン反応型誘導体）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（Ｕ．Ｓ． Ｎｏ． ５，１３２，４３２号）、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（米国特許第５，８３０，９１２号）に記載されているような色素を含む。
【0031】
上述の蛍光色素に加えて、蛍光ラベルは、蛍光ナノ粒子、たとえば、半導体ナノ結晶、たとえば、ＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴＴＭ（たとえば、Life Technologies（QuantumDot Corp、Invitrogen Nanocrystal Technologies、Eugene、Oreg）から入手できる；また、米国特許第６，８１５，０６４号；同第６，６８２，５９６号；および同第６，６４９，１３３号を参照。半導体ナノ結晶は、サイズに依存した光学的および/または電気的特性を有する微小な粒子である。半導体ナノ結晶を一次エネルギー源で照射すると、半導体ナノ結晶に使用されている半導体材料のハンドギャップに対応する周波数のエネルギーの二次放出が発生する。この発光は、特定の波長の色光や蛍光として検出することができます。異なる分光特性を有する半導体ナノ結晶は、たとえば、米国特許第６，６０２，６６０号、６，６０２，６７１号などに記載されている。たとえば、Bruchezら、Science 281 :20132016, 1998; Chanら、Science 281:2016-2018, 1998; および米国特許第６，２７４，３２３号に記載の技術により、種々の生体分子（dNTPsおよび／または核酸を含む）または基質に結合できる半導体ナノクリスタルが挙げられる。様々な組成の半導体ナノ結晶の形成は、たとえば、米国特許第６，９２７，０６９号、第６，９１４，２５６号、第６，８５５，２０２号、第６，７０９，９２９号、第６，６８９，３３８号、第６，５００，６２２号、第６，３０６，７３６号、第６，２２５，１９８号、第６，２０７，３９２号、第６，１１４，０３８号、第６，０４８，６１６号、第５，９９０，４７９号、第５，６９０，８０７号、第５，５７１，０１８号、第５，５０５，９２８号、第５，２６２，３５７号及び米国特許公開第２００３／０１６５９５１号、ＰＣＴ公開第９９／２６２９９号（１９９９年５月２７日発行）にも記載されている。半導体ナノ結晶の別個の集団は、それらの異なるスペクトル特性に基づいて識別可能であるように製造することができる。たとえば、半導体ナノ結晶は、その組成、サイズ、またはサイズと組成に依存して異なる色の光を放出するように製造することができる。たとえば、本明細書で開示するプローブの蛍光ラベルとして好適な、サイズに基づいて異なる波長で発光する量子ドット（５６５ｍｎ、６５５ｍｎ、７０５ｍｎ、または８００ｍｎ発光波長）は、ライフテクノロジー（カリフォルニア州カールシャッド）から入手できる。
【0032】
その他のラベルとしては、たとえば、放射性同位元素（３Ｈなど）、Ｇｄ３＋などの放射性または常磁性金属イオンのＤＯＴＡやＤＰＴＡキレートなどの金属キレート、およびリポソームがある。
【0033】
核酸分子と共に使用できる検出可能なラベルには、酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、またはベータラクタマーゼなどもある。
【0034】
あるいは、酵素はメタログラフィック検出スキームで使用され得る。たとえば、銀インサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）手順は、ハイブリダイズしたゲノム標的核酸配列の同定および局在化のためのメタログラフィック検出スキームを含む。メタログラフィック検出方式は、アルカリホスファターゼなどの酵素を、水溶性金属イオンと酵素の酸化還元活性基質と組み合わせて使用することを含む。基質は酵素によって酸化還元活性剤に変換され、酸化還元活性剤は金属イオンを還元し、検出可能な沈殿物を形成させる。（たとえば、米国特許出願公開第２００５／０１００９７６号、ＰＣＴ公開第２００５／００３７７７号および米国特許出願公開第２００４／０２６５９２２号を参照）。メタログラフィーの検出方法はまた、水溶性金属イオン、酸化剤および還元剤とともにオキシド－還元酵素（ワサビペルオキシダーゼなど）を使用して、再び検出可能な沈殿物を形成することを含む。（たとえば、米国特許第６，６７０，１１３号参照）。
【0035】
開示された方法を用いて製造されたプローブは、ＩＳＨ手順（例えば、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、発色ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）および銀ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ））または比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）などの核酸検出に使用できる。
【0036】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、メタフェーズまたはインターフェーズの染色体調製（スライドにマウントした細胞または組織サンプルなど）の文脈で、標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）を含むサンプルを、標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）に対して特異的に混成可能または特異的に標識したプローブと接触させる。スライドは任意に前処理され、例えば、均一なハイブリダイゼーションを妨害し得るパラフィンまたは他の材料を除去するために処理される。サンプルとプローブは、二本鎖核酸を変性させるために、例えば、加熱処理される。プローブ（適切なハイブリダイゼーションバッファーに配合）とサンプルを、ハイブリダイゼーションが起こるのに十分な条件と時間（通常は平衡に達するまで）で結合させる。染色体を洗浄し、過剰なプローブを除去し、染色体標識の検出を標準的な手法で行う。
【0037】
たとえば、ビオチン化プローブは、フルオレセイン標識アビジンまたはアビジン－アルカリホスファターゼを用いて検出することができる。フルオロクロム検出の場合、フルオロクロムを直接検出することもできるし、たとえばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識アビジンと共に試料をインキュベートすることもできる。ＦＩＴＣシグナルの増幅は、必要に応じて、ビオチン結合ヤギ抗アビジン抗体とのインキュベーション、洗浄、ＦＩＴＣ結合アビジンとの２回目のインキュベーションによって行うことができる。酵素活性による検出の場合、サンプルは、たとえば、ストレプトアビジンとインキュベートし、洗浄し、ビオチン結合アルカリホスファターゼとインキュベートし、再度洗浄し、（たとえば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）バッファー中で）予め平衡化することができる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション手順の一般的な説明については、たとえば、米国特許第４，８８８，２７８号に記載されている。
【0038】
ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、およびＳＩＳＨのための多数の手順が、当技術分野で知られている。たとえば、ＦＩＳＨを行うための手順は、米国特許第５，４４７，８４１号；第５，４７２，８４２号；および第５，４２７，９３２号；ならびにたとえば、Pir1kelら、Proc. Natl. Acad. Sci. 83:2934-2938, 1986;Pinkelら, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9138-9142, 1988;およびLichterら, Proc. Natl. Acad. Sci.85:9664-9668、1988に記載されている。ＣＩＳＨは、たとえば、Tannerら、Am.1.Pathol. 157:1467-1472, 2000および米国特許第６，９４２，９７０号に記載されている。追加の検出方法は、米国特許第６，２８０，９２９号に記載されている。
【0039】
感度、分解能、または他の望ましい特性を改善するために、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、およびＳＩＳＨ手順と併用して多数の試薬および検出スキームを採用することができる。上述のように、蛍光色素で標識されたプローブ（蛍光色素およびＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴＳＲを含む）は、ＦＩＳＨを行う際に直接光学的に検出することができる。あるいは、プローブは、ハプテンなどの非蛍光分子で標識することができる（以下の非限定的な例のようなもの： ビオチン、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ、および種々のオキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリル、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノン、クマリン、クマリン系化合物、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン系化合物およびそれらの組み合わせ）、リガンドまたは他の間接検出可能部分）。このような非蛍光性分子で標識されたプローブ（およびそれらが結合する標的核酸配列）は、次に、サンプル（たとえば、プローブが結合している細胞または組織サンプル）を、選択したハプテンまたはリガンドに特異的な抗体（または受容体、または他の特異的結合パートナー）等の標識検出試薬に接触させて検出できる。検出試薬は、フルオロフォア（たとえば、ＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴＲ）または別の間接的に検出可能な部分で標識することができ、またはフルオロフォアで標識することができる１つまたは複数の追加の特異的結合剤（たとえば、二次抗体または特異的抗体）と接触させることができる。
【0040】
他の例では、プローブ、または特異的結合剤（抗体、たとえば一次抗体、受容体または他の結合剤など）は、蛍光性または発色性組成物を検出可能な蛍光、着色または他の検出可能なシグナル（たとえば、ＳＩＳＨにおける検出可能な金属粒子の沈着におけるように）に変換することができる酵素でラベル化される。上記に示したように、酵素は、関連するプローブまたは検出試薬にリンカーを介して直接または間接的に付着させることができる。適切な試薬（たとえば、結合試薬）および化学物質（たとえば、リンカーおよび付着化学物質）の例は、米国特許出願公開第２００６／０２４６５２４号；第２００６／０２４６５２３号、および２００７／０１１７１５３号に記載されている。
【0041】
標識されたプローブ特異的結合剤ペアを適切に選択することにより、単一のアッセイ（たとえば、単一の細胞または組織サンプル上、または複数の細胞または組織サンプル上）において複数の標的核酸配列（たとえば、ゲノム標的核酸配列）の検出を促進する多重検出スキームを製造できることが当業者には理解されるであろう。たとえば、第一標的配列に対応する第一プローブは、ビオチンなどの第一ハプテンで標識することができ、第二標的配列に対応する第二プローブは、ＤＮＰなどの第二ハプテンで標識することができる。サンプルをプローブに曝露した後、結合したプローブを検出するには、サンプルを第１の特異的結合剤（この場合、第１の蛍光体、たとえば、第１のスペクトル的に異なるＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴＲで標識したアビジン、たとえば、５８５ｍｎで発光する）および第２の特異的結合剤（この場合、第２の蛍光体（たとえば、７０５ｍｎで発光する第２の蛍光体）で標識された抗ＤＮＰ抗体、または抗体フラグメント）。プローブと結合剤のペアは、他の蛍光色素を使用して、多重検出スキームに追加することができる。直接法、間接法（１段階、２段階、またはそれ以上）の多くのバリエーションが想定されるが、これらはすべて、開示したプローブとアッセイの文脈に適している。
【0042】
プローブは、通常、１０～１０００ヌクレオチドの長さの一本鎖核酸からなり、例えば、１０～８００、より詳細には１５～７００、典型的には２０～５００の長さである。プライマーは、通常、１０～２５ヌクレオチド長の短い一本鎖核酸であり、増幅されるべき目的の核酸と完全に、またはほぼ完全に一致するように設計される。プローブとプライマーは、それらがハイブリダイズする核酸に対して「特異的」であり、すなわち、それらは特に高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（最高融解温度Ｔｍに対応し、例えば、５０％ホルムアミド、５ｘまたは６ｘＳＣＣ．（ＳＣＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ Ｎａ－クエン酸）。
【0043】
上記増幅・検出方法に用いられる核酸プライマーまたはプローブは、キットとして組み立てることができる。このようなキットには、コンセンサスプライマーと分子プローブが含まれる。また、特定のキットは、増幅が起こったかどうかを判定するために必要な成分を含む。キットはまた、例えば、ＰＣＲ緩衝液および酵素；陽性対照配列、反応制御プライマー；ならびに特定の配列を増幅および検出するための説明書を含み得る。
【0044】
特定の実施形態では、本発明の方法は、卵丘細胞から抽出された全ｍｉＲを提供するステップと、ｍｉＲを増幅および特定のプローブへのハイブリダイゼーション、より詳細には定量または半定量ＲＴ－ＰＣＲによる方法に供するステップとを含む。
【0045】
別の特定の実施形態では、発現レベルは、ＤＮＡチップ分析によって決定される。このようなＤＮＡチップ又は核酸マイクロアレイは、マイクロチップ、スライドガラス又はミクロスフェアサイズのビーズであり得る基板に化学的に付着された異なる核酸プローブからなる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカまたはシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、またはニトロセルロースで構成することができる。プローブは、約１０～約６０塩基対のｃＤＮＡやオリゴヌクレオチドなどの核酸で構成される。発現レベルを決定するために、被験体からのサンプルは、任意で最初に逆転写に供され、標識され、ハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイと接触し、マイクロアレイ表面に付着したプローブ配列に相補的な標的核酸間の複合体の形成に至る。標識されたハイブリダイゼーション複合体は、その後検出され、定量化または半定量化することができる。標識化は、例えば放射性標識または蛍光標識の使用など、様々な方法によって達成され得る。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変形が、当業者に利用可能である（たとえば、Hoheiselによるレビュー、Nature Reviews、Genetics、2006、7:200-210を参照）。
【0046】
遺伝子の発現量は、絶対発現量または正規化発現量として表すことができる。典型的には、発現レベルは、患者の癌ステージを決定するのに関連しない遺伝子、たとえば、構成的に発現するハウスキーピング遺伝子の発現と比較することにより、遺伝子の絶対発現レベルを補正することによって正規化される。正規化に適した遺伝子としては、アクチン遺伝子ＡＣＴＢ、リボソーム１８Ｓ遺伝子、ＧＵＳＢ、ＰＧＫ１及びＴＦＲＣのようなハウスキーピング遺伝子が挙げられる。本発明によれば、使用されたハウスキーピング遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＴＢＰおよびＡＢＬ１であった。この正規化により、１つのサンプル、たとえば患者サンプルにおける発現レベルを、別のサンプルと、または異なる供給源からのサンプル間で比較することができる。
【0047】
典型的には、「閾値」、「閾値レベル」、「基準値」または「カットオフ値」は、実験的、経験的、または理論的に決定することができる。閾値はまた、当業者によって認識されるであろう、既存の実験及び／又は臨床条件に基づいて任意に選択することができる。特に、当業者は、本発明の方法に従って得られた本発明のｍｉＲの発現レベルを、定義された閾値と比較することができる。
【0048】
特に、前記閾値は、健康な個体の集団の本発明のｍｉＲの平均発現レベルである。本明細書で使用する場合、用語「健康な個体」は、健康であることが知られているヒト、すなわち、癌、特に膠芽腫を患っておらず、医療を必要としないヒトを表す。
【0049】
典型的には、当業者は、健康であるか否かが知られている１００人の生物学的試料、特に、たとえば、膠芽腫癌の生検における本発明のｍｉＲの発現レベルを決定し得る。次に、得られた発現レベルの平均値を、周知の統計解析に従って決定し、本発明のｍｉＲの平均発現レベルを得る。この値は、正常であるとみなされるため、閾値となる。本発明のｍｉＲの発現量をこの閾値と比較することで、医師は癌を分類し、予後を診断することができるようになる。
【0050】
したがって、医師は、癌に罹患している生命を脅かす重篤な状態にある患者に対して、適切な医療を適応し最適化することができるようになる。前記予後の決定は、フォローアップケアおよび臨床的意思決定に非常に適切である。
【0051】
本発明はまた、本発明のｍｉＲを検出するための手段を含む、本発明の方法に有用なキットに関する。
【0052】
治療方法
本発明の第２の態様は、本発明による抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有する、または有するであろう、または発症するであろうとして同定された対象における癌の治療において使用するためのＢＨ３模倣剤に関連する。
本発明の第２の態様は、本発明による抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有する、または有するであろう、または発症するであろうとして同定された対象における癌の治療において使用するためのＢＨ３模倣剤に関連する。
【0053】
言い換えれば、本発明は、本発明による抗ＰＤ－１療法に反応しない対象の処置に使用するためのＢＨ３模倣剤に関する。
【0054】
したがって、本発明はまた、ｉ）前記患者からのサンプルにおけるエキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較し、ｉｉｉ）エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルが所定の基準値より優れている場合、患者が抗ＰＤ１療法に対する耐性を有するかまたは発現する危険性があると結論づけ、患者が抗ＰＤ１療法に対する耐性を有するかまたは発現しない危険がないと結論づけることからなる工程を含む、抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有するかまたはそのリスクを有する患者を特定する方法に関する。エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現量が所定の基準値より劣る場合にＰＤ１療法を行い、抗ＰＤ１療法に対する耐性を有するか、またはそのおそれがある患者に対してＢＨ３模倣薬を投与することになる。
【0055】
すなわち、本発明は、ｉ）患者から得られたサンプルにおいて、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現レベルを決定すること、ｉｉ）前記発現レベルを所定の基準値と比較すること、およびｉｉｉ）エキソソームｍｉＲＮＡ－の発現レベルが高い場合、患者が抗ＰＤ１療法に反応しないと結論づけること、４３１５が所定の基準値より優れており、エキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５の発現量が所定の基準値より劣る場合に、患者が抗ＰＤ１療法に反応すると結論付け、抗ＰＤ１療法に反応しない患者にＢＨ３模倣薬を投与することを含む、その必要があるがんを患う患者の抗ＰＤ－１療法の効果を予測する方法に関する。
【0056】
本明細書で使用される場合、用語「ＢＨ３模倣剤」は、抗アポトーシスタンパク質であるＢｃｌ－２に対する作用（阻害）を有する全ての化合物を示し、ＢＨ３のみのタンパク質を模倣することができ、したがってアポトーシスを誘発する全ての小分子を含む（たとえば、Haiming Dai et al. Mitochondrial apoptosis and BH3 mimeticsを参照。2016)。ＢＨ３模倣剤は、ＡＢＴ－７３７、ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ（ＡＢＴ－１９９）およびｎａｖｉｔｏｃｌａｘ（ＡＢＴ－２６３）で構成される群から選択され得る。
【0057】
別の実施形態では、本発明はまた、本発明による抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有するか、または有するであろう、または発症するであろうとして識別された対象における癌の治療における使用のための抗ｍｉＲＮＡ－４３１５（ａｎｔａｇｏ－ｍｉＲ）にも関連する。
【0058】
言い換えれば、本発明は、本発明による抗ＰＤ－１療法に反応しない対象の治療に使用するための抗ｍｉＲＮＡ－４３１５（ａｎｔａｇｏ－ｍｉＲ）にも関する。
【0059】
本明細書で使用する場合、用語「処置」または「処置する」は、予防的または予防的治療と、治癒的または疾患修飾的治療の両方を指し、疾患に罹患するリスクのある、または疾患に罹患した疑いのある対象、ならびに疾患または病状に苦しんでいると診断された対象に対する治療を含み、臨床再発の抑制を含む。治療法は、疾患または再発する障害の１つまたは複数の症状を予防、治癒、発症の遅延、重症度の軽減、または改善するために、またはそのような治療がない場合に予想されるよりも被験者の生存期間を延長するために、医学的障害を有する被験者に投与され得るか、最終的にその障害を獲得し得る被験者に適用される。治療レジメン」とは、病気の治療のパターン、例えば、治療中に使用される投薬のパターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含み得る。導入レジメン」又は「導入期間」という語句は、疾患の初期治療に使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を意味する。導入レジメンの一般的な目標は、治療レジメンの初期期間中に被験者に高レベルの薬物を提供することである。導入レジメンは、（部分的又は全体的に）「負荷レジメン」を採用することができ、これには、医師が維持レジメン中に採用するよりも多量の薬剤を投与すること、医師が維持レジメン中に薬剤を投与するよりも頻繁に薬剤を投与すること、又はその両方を含むことができる。維持レジメン」又は「維持期間」という語句は、病気の治療中に被験者の維持のために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指し、例えば、被験者を長期間（数ヶ月又は数年）寛解状態に維持するためである。維持レジメンは、連続療法（例えば、一定間隔、例えば、毎週、毎月、毎年、薬剤を投与する）又は間欠療法（例えば、中断治療、間欠治療、再発時の治療、又は特定の所定の基準［例えば、疾患発現など］を達成したときの治療）を採用し得る。
【0060】
本発明はまた、ｉ）抗ＰＤ－１療法およびｉｉ）ＢＨ３模倣剤であって、本発明による抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有する、または有するであろう、もしくは発症するであろう対象における癌の治療において使用するための、同時、別々、または逐次用の組み合わせ調製物に関する。
【0061】
本発明はまた、ｉ）抗ＰＤ－１療法およびｉｉ）ＢＨ３模倣剤であって、本発明による抗ＰＤ１療法に反応しない対象における癌の治療に使用するための、同時、別々または逐次の組み合わせ製剤に関する。
【0062】
本発明はまた、ｉ）本発明による抗ＰＤ－１療法、ｉｉ）ＢＨ３模倣剤およびｉｉｉ）標準化学療法を、本発明による抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有するかまたは有するようになるかまたは発症すると識別された対象における癌の処置に使用するための、同時、分離または連続の組み合わせ調製物に関する。本発明はまた、ｉ）本発明による抗ＰＤ－１療法、ｉｉ）ＢＨ３模倣剤およびｉｉｉ）標準化学療法を、本発明による抗ＰＤ１療法に反応しない対象における癌の治療に使用するための、同時、別々または逐次の組み合わせ調製物に関する。
【0063】
特定の実施形態では、対象は、放射線療法または放射線療法剤によって治療することもできる。
【0064】
本明細書で使用する場合、「放射線治療」は、ガンマ線照射、Ｘ線照射、電子または光子、外部放射線治療またはキュリセラピーからなり得る。
【0065】
本明細書で使用されるように、用語「放射線治療剤」、は、限定されることなく、癌を治療または改善するのに有効であることが当業者に知られている任意の放射線治療剤を指すことが意図される。たとえば、放射線治療剤は、ブラキセラピーまたは放射性核種治療において投与されるような薬剤であり得る。そのような方法は、任意に、化学療法、および／または別の放射線療法に限定されないが、そのような１つまたは複数の追加の癌治療薬の投与をさらに含むことができる。
【0066】
一実施形態において、本発明による癌は、ＧＢＭ、肺癌、乳癌または卵巣癌である。
【0067】
一実施形態において、および処置の方法に従って、癌は、任意の固体または液体の癌であってもよい。典型的には、癌は、癌は、胆管癌（たとえば、肝周囲癌、遠位胆管癌、肝内胆管癌）、膀胱癌、骨癌（例えば。骨芽細胞腫、骨軟骨腫、血管腫、軟骨性線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨巨細胞腫、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳・中枢神経系がん（たとえば、髄膜腫、星細胞腫、乏突起膠腫、膠芽腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、シュワノーマ、胚芽腫、頭蓋咽頭腫）、乳癌（たとえば、in situ乳管がん、浸潤性乳管がん、浸潤性、小葉がん、in、situ小葉がん、女性化乳房）、キャッスルマン病（たとえば、巨大リンパ節過形成、血管毛包性リンパ節過形成）、頸がん、大腸がん、子宮内膜がん（たとえば、子宮内膜腺癌、腺癌、乳頭状漿液腺癌、明細胞）、食道癌、胆嚢癌（粘液性腺癌、小細胞癌）、消化管カルチノイド腫瘍（たとえば、絨毛癌、絨毛腺腫デストルエンス）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓がん（腎細胞がんなど）、喉頭・下咽頭がん、肝臓がん（たとえば、血管腫、肝腺腫、巣状結節性過形成、肝細胞がん）、肺がん（たとえば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔・副鼻腔がん（たとえば、エステシオネーロブラストーマ、正中線肉芽腫）、上咽頭がん、神経芽腫、口腔・中咽頭がん、卵巣がん、すい臓がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（たとえば、胚性横紋筋肉腫、肺胞性横紋筋肉腫、多形横紋筋肉腫）、唾液腺がん、皮膚がん（たとえば、メラノーマ、非メラノーマ皮膚がん）、胃がん、精巣がん（たとえば、セミノーマ、非セミノーマ胚細胞がんなど）、胸腺がん、甲状腺がん（たとえば、濾胞がん、未分化がん、低分化がん、甲状腺髄質がん、甲状腺リンパ腫）、膣がん、外陰がん、子宮がん（たとえば、子宮平滑筋肉腫）である。
【0068】
特定の実施形態では、膠芽腫は、ＧＢＭ、肺がん、乳がんまたは卵巣がんである。
【0069】
本発明の別の目的は、本発明による抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有する、または有するであろう、または発症するであろうとして識別された対象に、治療上有効な量のＢＨ３模倣剤を投与することを含む、癌を治療するための方法に関する。
【0070】
治療用組成物
本発明の別の目的は、本発明による抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有する、または有するであろう、または発症するであろう、と識別された対象における癌の治療において使用するための、本発明によるＢＨ３模倣剤を含む治療組成物に関する。
本発明の別の目的は、本発明による抗ＰＤ－１療法に対する耐性を有する、または有するであろう、または発症するであろう、と識別された対象における癌の治療において使用するための、本発明によるＢＨ３模倣剤を含む治療組成物に関する。
【0071】
本発明のさらに別の目的では、本発明による抗ＰＤ－１療法に反応しない対象における癌の治療に使用するための、本発明によるＢＨ３模倣剤を含む治療組成物に関するものである。
【0072】
本発明の任意の治療薬は、薬学的に許容される賦形剤、および任意で生分解性ポリマーなどの徐放性マトリックスと組み合わせて、治療用組成物を形成することができる。
【0073】
「薬学的に」または「薬学的に許容される」とは、哺乳類、特にヒトに投与したときに、有害反応、アレルギー反応または他の不快な反応を生じない分子実体および組成物を適宜示す。薬学的に許容される担体または賦形剤とは、任意のタイプの非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤補助剤を指す。
【0074】
医薬組成物の形態、投与経路、投与量及びレジメンは、当然ながら、治療すべき状態、疾患の重症度、患者の年齢、体重及び性別等に依存する。
【0075】
本発明の医薬組成物は、外用、経口、鼻腔内、非経口、眼内、静脈内、筋肉内または皮下投与等の目的で製剤化することができる。
【0076】
特に、医薬組成物は、注射可能な製剤として薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは、特に等張、無菌、生理食塩水（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウムなどまたはこれらの塩の混合物）、または乾燥、特に凍結乾燥組成物で、場合により滅菌水または生理食塩水を加えることにより、注射液の構成が可能となる。
【0077】
投与に使用される用量は、様々なパラメーターの関数として、特に、使用される投与様式、関連する病態の関数として、または代替的に治療の望ましい期間の関数として、適合させることが可能である。
【0078】
さらに、他の薬学的に許容される形態としては、例えば、経口投与用の錠剤または他の固体；タイムリリースカプセル；および現在使用できる他の任意の形態が挙げられる。
【0079】
本発明の医薬組成物は、さらなる治療用活性剤を含んでいてもよい。本発明はまた、本発明による化合物およびさらなる治療活性剤を含むキットに関する。
【0080】
一実施形態では、前記治療用活性剤は、抗がん剤であり得る。
【0081】
抗がん剤としては、メルファラン、ビンクリスチン（オンコビン）、シクロホスファミド（サイトキサン）、エトポシド（ＶＰ－１６）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、リポソームドキソルビシン（ドキシル）、ベンダムスチン（トレアンダ）などが考えられる。
【0082】
その他の抗癌剤としては、例えばシタラビン、アントラサイクリン、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メトトレキサート、タキソール、タキソテール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シクロホスファミド、イフォスファミド、ニトロソウレアなどを挙げることができる、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなどの白金錯体、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルビジン、エトポシド、テニポシド、カンパテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、マイトキサントロン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ドキソルビシン、エピンビシル、５－フルオロウラシル、ドセタキセルやパクリタキセルなどのタキサン系、ロイコボリン、レバミソール、イリノテカン、エストラムスチン、エトポシド、ナイトロンジャード、ＢＣＮＵ、カルムストメやロムスチンなどのニトロソウレア、ビンブラスチンなどのビンカアルカロイド、ビンクリスチンおよびビノレルビン、メシル酸イマチン、ヘキサメチルアミン、トポテカン、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ＡＴＰａイフォスファミドホスチン、プロテアーゼ阻害剤、阻害剤ハービミクＡ、ゲニスチン、エルブスタチン、およびラベントスチンＡ。一実施形態では、追加の抗癌剤は、以下のクラスの薬剤の１つまたは組み合わせから選択され得るが、これらに限定されるものではない：アルキル化剤、植物アルカロイド、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、抗フォレート、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、ＤＮＡ代謝拮抗剤、タキサン、ポドフィロトキシン、ホルモン療法、レチノイド、光増感剤または光力学的療法、血管形成阻害剤、抗微生物剤、アイソプレニル化阻害剤、細胞周期阻害剤、アクティノマイシン、ブレオマイシン、ＭＤＲ阻害剤およびＣａ２＋ＡＴＰａｓｅ阻害剤。
【0083】
追加の抗癌剤は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、成長抑制因子、ホルモン、可溶性受容体、デコイ受容体、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、単一特異性、二重特異性または多特異性抗体、モノボディ、ポリボディから選択できるが、これらに限定はされない。
【0084】
追加の抗がん剤は、エリスロポエチンやトロンボポエチンなどの成長因子または造血因子、およびそれらの成長因子模倣物から選択することができるが、これらに限定されるものではない。
【0085】
癌を治療するための本発明の方法において、さらなる治療活性剤は、制吐剤であり得る。好適な制吐剤としては、メトクロプロミド、ドンペリドン、プロクロルペラジン、プロメタジン、クロルプロマジン、トリメトベンザミド、オンダンセトロン、グラニセトロン、ヒドロキシジン、アセチルロイシンモノエタノールアミン、アリザプリド、アザセトロン、ベンズキンアミドなどがあるが、それだけにとどまらない、ビエタナウチン、ブロモプライド、ブクリジン、クレボプライド、シクリジン、デュネンヒドリナート、ジフェニドール、ドラセトロン、メクリスム、メタラタル、メトピマジン、ナビロン、オキシペムジル、ピバマジン、スコポラミン・サルピリド、テトラヒドロカンビノール、シーフイルペラジン、チオプロペラジン及びトロピセトロンのいずれか。好ましい実施形態では、制吐剤は、グラニセトロンまたはオンダンセトロンである。
【0086】
別の実施形態では、さらなる治療活性剤は、造血コロニー刺激因子であり得る。好適な造血コロニー刺激因子としては、フィルグラスチム、サルグラモスチム、モルグラモスチムおよびエポエチンαが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0087】
さらに別の実施形態では、他の治療活性剤は、オピオイドまたは非オピオイド鎮痛剤であり得る。好適なオピオイド鎮痛剤としては、モルヒネ、ヘロイン、ヒドロモルフォン、ヒドロコドン、オキシモルフォン、オキシコドン、メトポン、アポモルフィン、ノミオイプヒネ、エトイプビン、ブプレノルフィン、メペジン、ロパミドがあるが、これらに限定はされない、アニレジン、エトヘプタジン、ピミニジン、ベタプロジン、ジフェノキシレート、フェンタニル、スフェンタニル、アルフェンタニル、レミフェンタニル、レボルファノール、デキストロメトルファン、フェナゾドン、ペマゾシン、シクラゾシン、メタドン、イソメタドンおよびプロポキシフェン。好適な非オピオイド鎮痛剤としては、アスピリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、ジクロフィナク、ジフルジナル、エトドラク、フェノプロフェン、フルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、メクロフェナマート、メファナム酸、ナブメトン、ナプロクセン、ピロキシカム、スリンダクなどがあるがこれに限定はない。
【0088】
さらに別の実施形態では、さらなる治療活性剤は、抗不安剤であり得る。好適な抗不安剤としては、ブスピロン、およびジアゼパム、ロラゼパム、オキサザパム、クロラゼペート、クロナゼパム、クロルジアゼポキシドおよびアルプラゾラムなどのベンゾジアゼピンが挙げられるが、これらに限定はされない。
【0089】
さらに別の実施形態では、さらなる治療活性剤は、チェックポイント遮断癌免疫療法剤であり得る。
【0090】
典型的には、チェックポイント阻害癌免疫療法剤は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）やプログラム細胞死１（ＰＤＣＤ１）など、活性化Ｔリンパ球が発現する免疫抑制受容体を阻害する薬剤である、ＰＤ－１として最もよく知られている）、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ファミリーの様々なメンバーのようにＮＫ細胞によって、またはＰＤ－１リガンドＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１またはＢ７－Ｈ１として最もよく知られている）のようにこれらの受容体の主要リガンドをブロックする薬剤である。
【0091】
一般的に、チェックポイント阻害型がん免疫療法剤は、抗体である。
【0092】
いくつかの実施形態において、チェックポイント遮断癌免疫療法剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＰＤＬ２抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＩＤＯ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、及び抗Ｂ７Ｈ６からなる群から選択される抗体である。
【0093】
本発明は、以下の図および実施例によってさらに説明される。しかし、これらの実施例および図は、本発明の範囲を限定するものとしていかなる意味でも解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0094】
【図1A】図１：抗ＰＤ１療法に曝露したＴ細胞のエキソソームは、ｍｉＲ－４３１５を介してテモゾロミドによる細胞死を減少させる。Ａ．１４日目に、抗ＰＤ－１曝露がｍｉＲ－４３１５のエキソソームレベルを増加させることを示すために、ＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。Ｂ．指示されたエキソソームに曝露した後のＡ１エキソソームｍｉＲ－４３１５レベルを検証するために、ＲＴ－ｑＰＣＲを実行した。
【図1B】図１：抗ＰＤ１療法に曝露したＴ細胞のエキソソームは、ｍｉＲ－４３１５を介してテモゾロミドによる細胞死を減少させる。Ａ．１４日目に、抗ＰＤ－１曝露がｍｉＲ－４３１５のエキソソームレベルを増加させることを示すために、ＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。Ｂ．指示されたエキソソームに曝露した後のＡ１エキソソームけるｍｉＲ－４３１５レベルを検証するために、ＲＴ－ｑＰＣＲを実行した。
【図2】図２：αＰＤ１に曝露したＴ細胞由来のエキソソーム（Ｅｘｏ／αＰＤ１）は、ｍｉＲ－４３１５を介してＡ５４９細胞のシスプラチン誘導アポトーシスの表現型を促進する。シスプラチン誘導性細胞死測定、ＰＡＲＰおよびＣａｓｐａｓｅ－３切断を適用して、αＰＤ１に曝露したＴ細胞由来のエキソソーム（Ｅｘｏ／αＰＤ１）がシスプラチン誘導性アポトーシスのフェノタイプを促進することを示しました。ＲＴ－ｑＰＣＲと細胞内ＥＬＩＳＡにより、この現象がｍｉＲ－４３１５を介したＢｉｍのダウンレギュレーションと関連していることを明らかにした。
【実施例】
【0095】
材料及び方法および
細胞培養。
Ｔ細胞はＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（フランス）から入手し、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地で培養された。Ａ１７２細胞およびＭＣＦ７細胞は、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（４．５ｇ／Ｌグルコース）培地中で培養した。ＳＫＯＶ３細胞およびＡ５４９細胞は、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＭＰＩ培地で培養した。ＭＣＦ７細胞は、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＥＭＥＭで培養された。すべての細胞は、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃の温度で培養された。
細胞培養。
Ｔ細胞はＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（フランス）から入手し、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地で培養された。Ａ１７２細胞およびＭＣＦ７細胞は、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（４．５ｇ／Ｌグルコース）培地中で培養した。ＳＫＯＶ３細胞およびＡ５４９細胞は、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＭＰＩ培地で培養した。ＭＣＦ７細胞は、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＥＭＥＭで培養された。すべての細胞は、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃の温度で培養された。
【0096】
ＦＯＸＯ１活性。
ＦＯＸＯ１活性の推定には、ＴｒａｎｓＡＭ（登録商標） ＦＫＨＲ／ＦＯＸＯ１ ｋｉｔ （Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ， Ｆｒａｎｃｅ）を使用しました。 簡単に言うと、指示された時間と条件で、細胞を採取し、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ， Ｆｒａｎｃｅ）を用いてタンパク質の核抽出に使用した。各ポイント（技術的二重、独立した生物学的三重）には、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆの説明書に従って、１５μｇの核抽出物を使用した。ＥＬＩＳＡプレートのＯ．Ｄ．は、Ｖｉｃｔｏｒ（商標）ｘ３分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）で読み取った。
ＦＯＸＯ１活性の推定には、ＴｒａｎｓＡＭ（登録商標） ＦＫＨＲ／ＦＯＸＯ１ ｋｉｔ （Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ， Ｆｒａｎｃｅ）を使用しました。 簡単に言うと、指示された時間と条件で、細胞を採取し、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ， Ｆｒａｎｃｅ）を用いてタンパク質の核抽出に使用した。各ポイント（技術的二重、独立した生物学的三重）には、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆの説明書に従って、１５μｇの核抽出物を使用した。ＥＬＩＳＡプレートのＯ．Ｄ．は、Ｖｉｃｔｏｒ（商標）ｘ３分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）で読み取った。
【0097】
細胞の細胞毒性アッセイ
Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ａｂｃａｍ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、細胞生存率を推定した。簡単に言うと、細胞を９６ウェルプレートに播種した。製造者の指示に従った後、Ｖｉｃｔｏｒ（商標）ｘ３分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて５７０ｎｍと６０５ｎｍで吸光度を読み取った。
Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ａｂｃａｍ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、細胞生存率を推定した。簡単に言うと、細胞を９６ウェルプレートに播種した。製造者の指示に従った後、Ｖｉｃｔｏｒ（商標）ｘ３分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて５７０ｎｍと６０５ｎｍで吸光度を読み取った。
【0098】
カスパーゼ３およびポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断の測定。
切断型カスパーゼ－３および切断型ＰＡＲＰのレベルは、いずれもアポトーシスのバイオマーカーとして考えられています。これら２つのパラメーターの測定は、Ｈｕｍａｎ Ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰ１ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ－３ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔｓ （Ａｂｃａｍ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、製造者のプロトコールに従って実施された。
切断型カスパーゼ－３および切断型ＰＡＲＰのレベルは、いずれもアポトーシスのバイオマーカーとして考えられています。これら２つのパラメーターの測定は、Ｈｕｍａｎ Ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰ１ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ－３ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔｓ （Ａｂｃａｍ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、製造者のプロトコールに従って実施された。
【0099】
Ｉｎ－Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ。
細胞内ＥＬＩＳＡは、Ｂｉｍ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｃｅｌｌ－Ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡキット（Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、フランス）を用いて、製造者の説明書に従って実施した。簡単に説明すると、５，０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、指示したエキソソームまたはｍｉＲＮＡに曝露するかしないかを決定した。その後、細胞を固定液（４％パラホルムアルデヒド溶液）で、室温で１０分間処理しエキソソームは、４℃で一晩インキュベートした。適切なＨＲＰ標識二次抗体を、室温で１時間インキュベートした。検出は４５０ｎｍで行った。
細胞内ＥＬＩＳＡは、Ｂｉｍ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｃｅｌｌ－Ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡキット（Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、フランス）を用いて、製造者の説明書に従って実施した。簡単に説明すると、５，０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、指示したエキソソームまたはｍｉＲＮＡに曝露するかしないかを決定した。その後、細胞を固定液（４％パラホルムアルデヒド溶液）で、室温で１０分間処理しエキソソームは、４℃で一晩インキュベートした。適切なＨＲＰ標識二次抗体を、室温で１時間インキュベートした。検出は４５０ｎｍで行った。
【0100】
洗浄後、各ウェルの細胞を、製造者の指示に従って、クリスタルバイオレット溶液と室温で５分間インキュベートした。吸光度を５９５ｎｍで読み取り、「Ｂｉｍシグナル」を正規化するために使用した。
【0101】
ルシフェラーゼプロモーターおよび３’ＵＴＲレポーターアッセイ。
細胞を２４ウェルプレートに播種し、ＳＶ４０－ｒｅｎｉｌｌａコントロールベクターとともに、指示したホタルルシフェラーゼ構築物でトランスフェクトした。４０時間後に溶解液を調製し、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｆｒａｎｃｅ）とルミノメーター（ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ Ｐｌｕｓ，ＥＧ＆Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。
細胞を２４ウェルプレートに播種し、ＳＶ４０－ｒｅｎｉｌｌａコントロールベクターとともに、指示したホタルルシフェラーゼ構築物でトランスフェクトした。４０時間後に溶解液を調製し、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｆｒａｎｃｅ）とルミノメーター（ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ Ｐｌｕｓ，ＥＧ＆Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。
【0102】
細胞由来のエキソソームの単離
抗ＰＤ１曝露後、製造者の説明書に従って、ＥｘｏＱｕｉｃｋキット（Ｏｚｙｍｅ、フランス）を用いてＴ細胞由来のエキソソームを単離した。簡単に言うと、細胞培養上清を採取し、３０００ｇ／１５分で遠心分離した。ＥｘｏＱｕｉｃｋ溶液を上清とともに４℃／一晩でインキュベートした。最初の遠心分離（１５００ｇ／３０分）の後、上清を吸引し、残留溶液を遠心分離した（１５００ｇ／５分）。エキソソームペレットをＰＢＳに再懸濁した。ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて精製エキソソーム総タンパク質濃度を測定し、精製エキソソームを使用するまで－８０℃で保存した。
抗ＰＤ１曝露後、製造者の説明書に従って、ＥｘｏＱｕｉｃｋキット（Ｏｚｙｍｅ、フランス）を用いてＴ細胞由来のエキソソームを単離した。簡単に言うと、細胞培養上清を採取し、３０００ｇ／１５分で遠心分離した。ＥｘｏＱｕｉｃｋ溶液を上清とともに４℃／一晩でインキュベートした。最初の遠心分離（１５００ｇ／３０分）の後、上清を吸引し、残留溶液を遠心分離した（１５００ｇ／５分）。エキソソームペレットをＰＢＳに再懸濁した。ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて精製エキソソーム総タンパク質濃度を測定し、精製エキソソームを使用するまで－８０℃で保存した。
【0103】
ナノサイト実験により、Ｅｘｏｑｕｉｃｋ製剤は主に８０～１２０ｎｍのサイズ範囲に含まれる細胞外ベスクル、すなわちエキソソームを定義するサイズ範囲からなることが示された（追加ファイル１）。従って、本稿では「エキソソーム」という用語を使用した。
【0104】
エキソソームおよび／またはｍｉＲによる細胞処理。
Ｔ０では、７．１０５個の細胞を１２ウェルプレートに播種した。１日後、細胞をＴ細胞由来のエキソソーム（１５０μｇ）及びα－アマニチン（５０ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ，Ｆｒａｎｃｅ）と共インキュベートした。残留するエキソソームは、ＰＢＳ溶液で３回の細胞洗浄を経て除去した。α－ａｍａｎｉｔｉｎは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性を阻害するため、実験条件によって引き起こされる推定ｍｉＲＮＡの転写をブロックするために使用された３９。細胞内のエキソソームが送達したｍｉＲＮＡの量は、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて、エキソソームのあるα－ａｍａｎｉｔｉｎ処理細胞とない細胞とのＣｔ値の差により推定した。
Ｔ０では、７．１０５個の細胞を１２ウェルプレートに播種した。１日後、細胞をＴ細胞由来のエキソソーム（１５０μｇ）及びα－アマニチン（５０ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ，Ｆｒａｎｃｅ）と共インキュベートした。残留するエキソソームは、ＰＢＳ溶液で３回の細胞洗浄を経て除去した。α－ａｍａｎｉｔｉｎは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性を阻害するため、実験条件によって引き起こされる推定ｍｉＲＮＡの転写をブロックするために使用された３９。細胞内のエキソソームが送達したｍｉＲＮＡの量は、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて、エキソソームのあるα－ａｍａｎｉｔｉｎ処理細胞とない細胞とのＣｔ値の差により推定した。
【0105】
抗ｍｉＲＮＡを用いたエキソソームローディング。
Ｅｘｏ－Ｆｅｃｔ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｏｚｙｍｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、エキソソームをａｎｔｉ－ｍｉＲＮＡでトランスフェクションした。簡単に説明すると、抗ｍｉＲＮＡをエキソソーム（３００μｇのエキソソームタンパク）とシェーカーで３７℃、１５分間インキュベートした。ＥｘｏＱｕｉｃｋ－ＴＣ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて反応を停止させた後、混合物を氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離後、トランスフェクトされたエキソソームペレットを３００μＬのＰＢＳに再懸濁させてから使用した。ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて精製エキソソーム総タンパク質濃度を測定した。
Ｅｘｏ－Ｆｅｃｔ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｏｚｙｍｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、エキソソームをａｎｔｉ－ｍｉＲＮＡでトランスフェクションした。簡単に説明すると、抗ｍｉＲＮＡをエキソソーム（３００μｇのエキソソームタンパク）とシェーカーで３７℃、１５分間インキュベートした。ＥｘｏＱｕｉｃｋ－ＴＣ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて反応を停止させた後、混合物を氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離後、トランスフェクトされたエキソソームペレットを３００μＬのＰＢＳに再懸濁させてから使用した。ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて精製エキソソーム総タンパク質濃度を測定した。
【0106】
ミミック－ｍｉＲ，ミミック－突然変異－ｍｉＲ，ｍｉＲインヒビター（ａｎｔｉ－ｍｉＲとも呼ばれる）を用いた細胞のトランスフェクションには、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ （Ｑｉａｇｅｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用した。これらの試薬は、ミミック－ｍｉＲ－４３１５：５’ＣＣＧＣＵＵＣＵＧＡＧＣＵＧＧＡＣ（Ｓｙｎ－ｈｓａ－ｍｉＲ－４３１５ ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ミミック），ミミック－突然変異－ｍｉＲ－４３１５：５’ＣＣＧＡＡＡＵＣＵＧＡＧＣＵＧＧＡＣ，およびａｎｔｉ－ｍｉＲ－４３１５（ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｍｉＳｃｒｉｐｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｎｅｇ． Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ、フランス）。
【0107】
血漿サンプル。
血漿は、”Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｃａｎｃｅｒｏｌｏｇｉｅ ｄｅ ｌ’Ｏｕｅｓｔ”（ＩＣＯ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｏ－ｃａｎｃｅｒ．ｆｒ）で治療を受けたＧＢＭ患者から収集した。採取した患者はすべて、署名入りのインフォームドコンセントを行った。収集したすべてのサンプルと関連する臨床情報は、フランス研究省によって検証されたデータベース（Ｎ°ＤＣ－２０１８－３３２１）に登録された。生物資源は「Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ－Ｔｕｍｏｒｏｔｈｅｑｕｅ」（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｃａｎｃｅｒｏｌｏｇｉｅ ｄｅ ｌ’Ｏｕｅｓｔ，Ｓａｉｎｔ－Ｈｅｒｂｌａｉｎ，Ｆ４４８００，Ｆｒａｎｃｅ）で保管した。
血漿は、”Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｃａｎｃｅｒｏｌｏｇｉｅ ｄｅ ｌ’Ｏｕｅｓｔ”（ＩＣＯ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｏ－ｃａｎｃｅｒ．ｆｒ）で治療を受けたＧＢＭ患者から収集した。採取した患者はすべて、署名入りのインフォームドコンセントを行った。収集したすべてのサンプルと関連する臨床情報は、フランス研究省によって検証されたデータベース（Ｎ°ＤＣ－２０１８－３３２１）に登録された。生物資源は「Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ－Ｔｕｍｏｒｏｔｈｅｑｕｅ」（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｃａｎｃｅｒｏｌｏｇｉｅ ｄｅ ｌ’Ｏｕｅｓｔ，Ｓａｉｎｔ－Ｈｅｒｂｌａｉｎ，Ｆ４４８００，Ｆｒａｎｃｅ）で保管した。
【0108】
血液からのエキソソームｍｉＲＮＡの単離。
Ｋ＋ＥＤＴＡチューブで採取した血液サンプルから、１０ｍｌ全血の２回の遠心分離（１０分／１９００ｇ／４℃、１０分／１６０００ｇ／４℃）を介して、４～５ｍｌの血漿を分離した。１ｍｌの血漿を、ＥｘｏｍｉＲＮｅａｓｙ ｓｅｒｕｍ／ｐｌａｓｍａ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ， Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、メーカーの説明書に従って、ｍｉＲＮＡの分離のために処理した。
Ｋ＋ＥＤＴＡチューブで採取した血液サンプルから、１０ｍｌ全血の２回の遠心分離（１０分／１９００ｇ／４℃、１０分／１６０００ｇ／４℃）を介して、４～５ｍｌの血漿を分離した。１ｍｌの血漿を、ＥｘｏｍｉＲＮｅａｓｙ ｓｅｒｕｍ／ｐｌａｓｍａ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ， Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、メーカーの説明書に従って、ｍｉＲＮＡの分離のために処理した。
【0109】
ｍｉＲＮＡ ＲＴ－ｑＰＣＲ．
ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ ｗｉｔｈ ｍｉＳｃｒｉｐｔＨｉＳｐｅｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｋｉｔｓ、ｍｉＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙｓ（Ｑｉａｇｅｎ、フランス）を用いて、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ（Ｑｉａｇｅｎ、フランス）上でＲＴ－ｑＰＣＲを実施しました。ｍｉＲＮＡの定量と純度は、それぞれＱｕｂｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ， Ｆｒａｎｃｅ）とＡｇｉｌｅｎｔ ２１００（Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｋｉｔ， Ａｇｉｌｅｎｔ， Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、それぞれメーカーの説明書に従って解析した。
ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ ｗｉｔｈ ｍｉＳｃｒｉｐｔＨｉＳｐｅｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｋｉｔｓ、ｍｉＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙｓ（Ｑｉａｇｅｎ、フランス）を用いて、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ（Ｑｉａｇｅｎ、フランス）上でＲＴ－ｑＰＣＲを実施しました。ｍｉＲＮＡの定量と純度は、それぞれＱｕｂｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ， Ｆｒａｎｃｅ）とＡｇｉｌｅｎｔ ２１００（Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｋｉｔ， Ａｇｉｌｅｎｔ， Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、それぞれメーカーの説明書に従って解析した。
【0110】
ＲＴ－ｑＰＣＲ解析。
ＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ＱＩＡｃｕｂｅ ＫｉｔおよびＱＩＡｃｕｂｅ（Ｑｉａｇｅｎ、フランス）を用いて行う。ＲＴ－ｑＰＣＲは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙｓ、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ ａｓ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｆｒａｎｃｅ）を使用して行う。参照遺伝子ＲＰＬＰ０を使用し、２－ΔΔＣｔ相対定量法で行った。
ＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ＱＩＡｃｕｂｅ ＫｉｔおよびＱＩＡｃｕｂｅ（Ｑｉａｇｅｎ、フランス）を用いて行う。ＲＴ－ｑＰＣＲは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙｓ、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ ａｓ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｆｒａｎｃｅ）を使用して行う。参照遺伝子ＲＰＬＰ０を使用し、２－ΔΔＣｔ相対定量法で行った。
【0111】
Ｉｎ ｖｉｖｏ実験。
動物を用いた実験手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓおよびＦｒｅｎｃｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｅｔｈｉｃｓに従った。また、すべての実験は、「Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ ｅｎ Ｓａｎｔｅ ｄｅ ｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄｅ Ｎａｎｔｅｓ（ＩＲＳ－ＵＮ）」内の「Ｐｌａｔｅ－ｆｏｒｍｅ Ａｎｉｍａｌｅｒｉｅ」での動物実験に関する規則に従って行われ、フランス国家倫理委員会から承認を受けた。培養したＡ５４９細胞をトリプシン処理で回収し、洗浄後、生理食塩水に再懸濁した。細胞懸濁液を７－８週齢のマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ、フランス）の脇腹に皮下注射（ｓ．ｃ．）した。ノギス測定に基づく腫瘍体積は、修正楕円体式（腫瘍体積＝１／２（長さ×幅２））を使用して算出した。
動物を用いた実験手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓおよびＦｒｅｎｃｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｅｔｈｉｃｓに従った。また、すべての実験は、「Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ ｅｎ Ｓａｎｔｅ ｄｅ ｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄｅ Ｎａｎｔｅｓ（ＩＲＳ－ＵＮ）」内の「Ｐｌａｔｅ－ｆｏｒｍｅ Ａｎｉｍａｌｅｒｉｅ」での動物実験に関する規則に従って行われ、フランス国家倫理委員会から承認を受けた。培養したＡ５４９細胞をトリプシン処理で回収し、洗浄後、生理食塩水に再懸濁した。細胞懸濁液を７－８週齢のマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ、フランス）の脇腹に皮下注射（ｓ．ｃ．）した。ノギス測定に基づく腫瘍体積は、修正楕円体式（腫瘍体積＝１／２（長さ×幅２））を使用して算出した。
【0112】
統計解析と結果
指示がある場合を除き、データは３回の独立した実験から算出された平均値と標準偏差の代表値である。平均値±標準偏差の差の有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ検定を用いて計算した。２つのパラメーター間の相関の有意性は、ピアソン検定を用いて計算された。Ｐ＜０．０５を統計的有意性の基準として使用した。
指示がある場合を除き、データは３回の独立した実験から算出された平均値と標準偏差の代表値である。平均値±標準偏差の差の有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ検定を用いて計算した。２つのパラメーター間の相関の有意性は、ピアソン検定を用いて計算された。Ｐ＜０．０５を統計的有意性の基準として使用した。
【0113】
結果
抗ＰＤ１療法を受けたＴ細胞のエキソソームは、ｍｉＲ－４３１５を介してテモゾロミド誘発細胞死を減少させた
抗ＰＤ１抗体（αＰＤ１）療法がＴ細胞に与える影響については、精製したヒトＴ細胞をαＰＤ１に曝露することで解析した（データは未掲載）。抗ＰＤ１療法がＴリンパ球のＦｏｘＯ１の転写活性を促進することは、これまでに証明されている１。本モデルでは、１μｇ／ｍＬのαＰＤ１で処理したＴ細胞におけるＦｏｘＯ１の転写活性が強く上昇した（ｐ＜０．０００１）（データ未掲載）。そこで、ｍｉＲＧｅｎ．ｖ３プログラムで行った予測研究に従って、ＦｏｘＯ１が制御する５つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１０１－５ｐ，ｍｉＲ－６１２，ｍｉＲ－３６７１，ｍｉＲ－４３１５，ｍｉＲ－ｌｅｔ７ｉ）の発現を解析した。ＲＴ－ｑＰＣＲにより、これら５つのｍｉＲＮＡのＴ細胞における発現が確認され（図１Ａ）、αＰＤ１処理によってその発現が変化することはないようであった。しかし、驚くべきことに、ｍｉＲ－４３１５は、αＰＤ１に曝露したＴ細胞由来のエキソソーム（Ｅｘｏ／αＰＤ１）において、ＩｇＧコントロール（Ｅｘｏ）に曝露したＴ細胞由来のエキソソームよりも１０倍多く発現していた（図１Ａ）。
抗ＰＤ１療法を受けたＴ細胞のエキソソームは、ｍｉＲ－４３１５を介してテモゾロミド誘発細胞死を減少させた
抗ＰＤ１抗体（αＰＤ１）療法がＴ細胞に与える影響については、精製したヒトＴ細胞をαＰＤ１に曝露することで解析した（データは未掲載）。抗ＰＤ１療法がＴリンパ球のＦｏｘＯ１の転写活性を促進することは、これまでに証明されている１。本モデルでは、１μｇ／ｍＬのαＰＤ１で処理したＴ細胞におけるＦｏｘＯ１の転写活性が強く上昇した（ｐ＜０．０００１）（データ未掲載）。そこで、ｍｉＲＧｅｎ．ｖ３プログラムで行った予測研究に従って、ＦｏｘＯ１が制御する５つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１０１－５ｐ，ｍｉＲ－６１２，ｍｉＲ－３６７１，ｍｉＲ－４３１５，ｍｉＲ－ｌｅｔ７ｉ）の発現を解析した。ＲＴ－ｑＰＣＲにより、これら５つのｍｉＲＮＡのＴ細胞における発現が確認され（図１Ａ）、αＰＤ１処理によってその発現が変化することはないようであった。しかし、驚くべきことに、ｍｉＲ－４３１５は、αＰＤ１に曝露したＴ細胞由来のエキソソーム（Ｅｘｏ／αＰＤ１）において、ＩｇＧコントロール（Ｅｘｏ）に曝露したＴ細胞由来のエキソソームよりも１０倍多く発現していた（図１Ａ）。
【0114】
次に、コントロールまたはαＰＤ１処理したＴ細胞が産生するエキソソームが、神経膠腫細胞株Ｕ１７２に与える影響を解析した。ＲＴ－ｑＰＣＲにより、Ａ１７２膠芽腫細胞におけるｍｉＲ－４３１５の細胞内レベルは、Ｅｘｏ／αＰＤ１、α－ａｍａｎｉｔｉｎおよびＩｇＧコントロール（Ｅｘｏ）に曝露したＴ細胞由来のエキソソーム存在下で用量依存的に増加した（図１Ｂ）。この観察から、Ｅｘｏ／αＰＤ１から腫瘍細胞へのｍｉＲ－４３１５の取り込みと移動の可能性が示唆された（α－ａｍａｎｉｔｉｎはｍｉＲ－４３１５のｄｅ ｎｏｖｏ産生をブロックするために使用したため）。
【0115】
テモゾロミド（ＴＭＺ）は、膠芽腫（ＧＢＭ）細胞の死滅に用いられる標準的な化学療法剤である。そこで我々は、Ｅｘｏ／αＰＤ１の存在下または非存在下で、Ａ１７２に対するＴＭＺの効果を、その細胞毒性およびＰＡＲＰ１およびＣａｓｐａｓｅ－３の切断型（アポトーシスバイオマーカー）の検出によるアポトーシス誘導能の測定によって調べた。本実験では、ＴＭＺ（５０μＭ、７２時間）処理前の細胞に、表示されたエキソソームを４８時間曝露しました。その結果、Ｅｘｏ／αＰＤ１がＴＭＺによるアポトーシスを抑制することが確認された（データ示さず）。このプロセスにおけるｍｉＲ－４３１５の寄与を決定するために、Ｅｘｏ／αＰＤ１を抗ｍｉＲ－４３１５でトランスフェクトした。データは、抗ｍｉＲ－４３１５の存在が、Ｅｘｏ／αＰＤ１の添加に関連するＴＭＺ耐性を有意に減少させたことを示している。全体として、我々のデータは、エキソソームｍｉＲ－４３１５が化学療法薬によって誘導されるアポトーシスを制限することを実証した。また、この効果は、ｍｉＲ－４３１５単独で見られた効果と同様である（データは示さず）。
【0116】
抗ＰＤ１への曝露は、ｅｘｏｍｉＲ－４３１５／Ｂｉｍ軸を介して、いくつかのがん細胞タイプにおいて化学療法抵抗性の表現型を促進する
エキソソームｍｉＲ－４３１５がアポトーシスを制限することを示す以前のデータから、このｍｉＲはＢＣＬ２ファミリーのプロアポトーシス蛋白質を標的とする可能性があると推測された。これらの蛋白質はアポトーシス実行の中心であるため。Ｔａｒｇｅｔ Ｓｃａｎ Ｈｕｍａｎのウェブサイトは、アポトーシス促進タンパク質であるＢｉｍがｍｉＲ－４３１５の標的である可能性を示唆している（データは示されていない）。そこで、このタンパク質に着目して研究を行った。不活性変異体ではないものの、ｍｉＲ－４３１５のミミックは、タンパク質およびｍＲＮＡレベルでＢｉｍをダウンレギュレートし（データ示さず）、Ａ１７２の３’ＵＴＲ／Ｂｉｍプラスミドに関連したルシフェラーゼ活性を低下させた（データ示さず）。Ｅｘｏ／αＰＤ１はＡ１７２細胞のＢｉｍ発現を減少させ、抗ｍｉＲ－４３１５はＥｘｏ／αＰＤ１によって誘導されるＢｉｍ発現の減少を有意に制限した。ＧＷ１８２－ＣＬＩＰ－ｑＰＣＲにより、Ｔ細胞由来Ｅｘｏ／αＰＤ１で処理したＡ１７２細胞において、ｍｉＲ－４３１５は３’ＵＴＲ／Ｂｉｍと共沈していたが、Ｔ細胞由来Ｅｘｏでは共沈していなかった（データ示さず）。同様に、抗ｍｉＲ－４３１５も、３’ＵＴＲ／ＢｉｍおよびＧＷ１８２と共沈したｍｉＲ－４３１５のレベルを低下させたが、抗ｍｉＲ－Ｃｔｒｌは影響を与えなかった（データは示さず）。
エキソソームｍｉＲ－４３１５がアポトーシスを制限することを示す以前のデータから、このｍｉＲはＢＣＬ２ファミリーのプロアポトーシス蛋白質を標的とする可能性があると推測された。これらの蛋白質はアポトーシス実行の中心であるため。Ｔａｒｇｅｔ Ｓｃａｎ Ｈｕｍａｎのウェブサイトは、アポトーシス促進タンパク質であるＢｉｍがｍｉＲ－４３１５の標的である可能性を示唆している（データは示されていない）。そこで、このタンパク質に着目して研究を行った。不活性変異体ではないものの、ｍｉＲ－４３１５のミミックは、タンパク質およびｍＲＮＡレベルでＢｉｍをダウンレギュレートし（データ示さず）、Ａ１７２の３’ＵＴＲ／Ｂｉｍプラスミドに関連したルシフェラーゼ活性を低下させた（データ示さず）。Ｅｘｏ／αＰＤ１はＡ１７２細胞のＢｉｍ発現を減少させ、抗ｍｉＲ－４３１５はＥｘｏ／αＰＤ１によって誘導されるＢｉｍ発現の減少を有意に制限した。ＧＷ１８２－ＣＬＩＰ－ｑＰＣＲにより、Ｔ細胞由来Ｅｘｏ／αＰＤ１で処理したＡ１７２細胞において、ｍｉＲ－４３１５は３’ＵＴＲ／Ｂｉｍと共沈していたが、Ｔ細胞由来Ｅｘｏでは共沈していなかった（データ示さず）。同様に、抗ｍｉＲ－４３１５も、３’ＵＴＲ／ＢｉｍおよびＧＷ１８２と共沈したｍｉＲ－４３１５のレベルを低下させたが、抗ｍｉＲ－Ｃｔｒｌは影響を与えなかった（データは示さず）。
【0117】
同様の検討を、Ａ５４９（肺がん細胞株）、ＯＶ９０（卵巣がん細胞株）、ＭＣＦ７（乳がん細胞株）に、それぞれのがんの化学療法であるオキサリプラチン、シスプラチン、パクリタキセルを投与または非投与で行った。Ａ１７２神経膠腫細胞株で見られたように、Ｅｘｏ／αＰＤ１は各薬剤によって誘導される細胞死を減少させ、これらの効果は抗ｍｉＲ－４３１５によって打ち消された（図２、図３Ａおよび３Ｂ）。予想通り、細胞死の抑制は、Ｂｉｍ発現のダウンレギュレーションとＰＡＲＰおよびＣａｓｐａｓｅ－３切断の減少に関連していた（図２、図３Ａおよび３Ｂ）。
【0118】
ここでは、αＰＤ１に曝露したＴ細胞由来のエキソソームが、ｅｘｏｍｉＲ－４３１５を介してＢｉｍの発現を低下させることを明らかにした。また、ｍｉＲ－４３１５をがん細胞株に取り込むと、アポトーシスが抑制され、化学療法に対する耐性が向上することを明らかにした。
【0119】
抗ＰＤ１療法を受けた肺がん患者において、ｅｘｏｍｉＲ－４３１５の縦断的な発現がアポトー抵抗性の血清バイオマーカーと関連する
今回の観察結果の臨床的関連性を判断するため、αＰＤ１で治療した肺がん患者４名において、ｅｘｏｍｉＲ－４３１５の発現と血清シトクロムｃ濃度を調べた（データ示さず）。血清シトクロムｃ濃度は、細胞死バイオマーカーとして選択された１３。ｅｘｏｍｉＲ－４３１５とシトクロムｃの血清濃度は、抗ＰＤ１治療期間中、動的に調節されていた（データは示さず）。患者における２回のαＰＤ１投与間のｅｘｏｍｉＲ－４３１５発現を比較することにより、１０／１５例でｅｘｏｍｉＲ－４３１５発現が増加することに注目した。また、ｅｘｏｍｉＲ－４３１５と血清チトクロームｃ濃度は、αＰＤ１投与期間中、反平行または鏡像的に変化していることが確認された（データ示さず）。さらに、ピアソンの相関検定により、採用したすべての患者において、縦断的なｅｘｏｍｉＲ－４３１５の発現が血清シトクロムｃ濃度と逆相関していることが明らかになった（データは示さず）。全体として、これらのデータは、ｅｘｏｍｉＲ－４３１５の縦断的な発現が、αＰＤ１による治療を受けた肺がん患者におけるアポトーシス抵抗性の血清バイオマーカーと逆相関していたことを実証している。
今回の観察結果の臨床的関連性を判断するため、αＰＤ１で治療した肺がん患者４名において、ｅｘｏｍｉＲ－４３１５の発現と血清シトクロムｃ濃度を調べた（データ示さず）。血清シトクロムｃ濃度は、細胞死バイオマーカーとして選択された１３。ｅｘｏｍｉＲ－４３１５とシトクロムｃの血清濃度は、抗ＰＤ１治療期間中、動的に調節されていた（データは示さず）。患者における２回のαＰＤ１投与間のｅｘｏｍｉＲ－４３１５発現を比較することにより、１０／１５例でｅｘｏｍｉＲ－４３１５発現が増加することに注目した。また、ｅｘｏｍｉＲ－４３１５と血清チトクロームｃ濃度は、αＰＤ１投与期間中、反平行または鏡像的に変化していることが確認された（データ示さず）。さらに、ピアソンの相関検定により、採用したすべての患者において、縦断的なｅｘｏｍｉＲ－４３１５の発現が血清シトクロムｃ濃度と逆相関していることが明らかになった（データは示さず）。全体として、これらのデータは、ｅｘｏｍｉＲ－４３１５の縦断的な発現が、αＰＤ１による治療を受けた肺がん患者におけるアポトーシス抵抗性の血清バイオマーカーと逆相関していたことを実証している。
【0120】
ＡＢＴ２６３は、肺がんのｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、抗ＰＤ１／ｅｘｏｍｉＲ－４３１５が誘発する化学療法への抵抗性を無効化する
ｅｘｏｍｉＲ－４３１５とシトクロムｃの血清レベルの動的かつ反平行な発現は、がん細胞死を誘導する治療法の有効性が、有効・無効の異なる段階を経て変動し、治療を通して細胞死を促進することを示唆している。シスプラチン＋αＰＤ１療法の無効とｅｘｏｍｉＲ－４３１５によるＢｉｍダウン発現を関連付けた上述のデータに鑑み、次に、Ｅｘｏ／αＰＤ１に曝露したＡ５４９細胞のシスプラチンに対する耐性に対するＡＢＴ２６３などの「Ｂｉｍ／ＢＨ３模倣薬」の効果について検討した。次に、Ａ５４９肺がん細胞を、シスプラチン（ＣＩＳ、５μＭ）および／またはＡＢＴ２６３（１５μＭ）の添加前にＥｘｏ／αＰＤ１およびＥｘｏに曝露した。ＡＢＴ２６３は、Ｅｘｏ／αＰＤ１が誘導するＣＩＳに対する耐性を無効にした（図４Ａ）。
ｅｘｏｍｉＲ－４３１５とシトクロムｃの血清レベルの動的かつ反平行な発現は、がん細胞死を誘導する治療法の有効性が、有効・無効の異なる段階を経て変動し、治療を通して細胞死を促進することを示唆している。シスプラチン＋αＰＤ１療法の無効とｅｘｏｍｉＲ－４３１５によるＢｉｍダウン発現を関連付けた上述のデータに鑑み、次に、Ｅｘｏ／αＰＤ１に曝露したＡ５４９細胞のシスプラチンに対する耐性に対するＡＢＴ２６３などの「Ｂｉｍ／ＢＨ３模倣薬」の効果について検討した。次に、Ａ５４９肺がん細胞を、シスプラチン（ＣＩＳ、５μＭ）および／またはＡＢＴ２６３（１５μＭ）の添加前にＥｘｏ／αＰＤ１およびＥｘｏに曝露した。ＡＢＴ２６３は、Ｅｘｏ／αＰＤ１が誘導するＣＩＳに対する耐性を無効にした（図４Ａ）。
【0121】
次に、ＡＢＴ２６３の有効性をＡ５４９を接種した異種移植マウスで評価した（データは示さず）。予想通り、ＣＩＳ投与は、Ａ５４９誘導腫瘍の体積を減少させた（図４Ｂ）。Ｅｘｏの投与は、Ａ５４９腫瘍に対するＣＩＳの効果を変化させず、Ｅｘｏ／αＰＤ１接種がＣＩＳの抗腫瘍活性を無効化したのとは対照的であった。また、Ｅｘｏ／αＰＤ１接種により、腫瘍におけるＢｉｍの発現量（タンパク質およびｍＲＮＡレベル）が低下することも確認された。ＡＢＴ２６３は同様の活性を誘導し、Ｅｘｏ／αＰＤ１によるがん細胞のＣＩＳ耐性に対する有害な効果を抑制した（図４Ｂ）。この結果から、ＡＢＴ２６３はＥｘｏ／αＰＤ１が誘導するシスプラチン治療への耐性を無効にするために使用できることが示された。さらに、腫瘍に対する治療の影響と血清シトクロムｃレベルとの間に有意な逆相関が観察された（ｒ＝－０．９５６６；ｐ＝０．００２８）（データは示さず）。
【0122】
結論
抗ＰＤ１耐性という現象を支配する分子メカニズムの理解における最近の進歩により、この現象のいくつかの主要な原因（１４－１５）：ネオアンチゲンランドスケープの進化（１６）、ＪＡＫ１／２変異の存在（１７）、β２－ミクログロブリン変異の存在（１８）、ＣＤ８＋Ｔ細胞の記憶能の限定的獲得（１９－２０）を明らかにすることが可能になった。最新の論文では、抗ＰＤ１耐性という現象を支配する分子メカニズムに関連するシグネチャーを特定したり、説明したりしているが、Ｂｅｒｔｒａｎｄら（２０１７）は、ＴＮＦα遮断がマウス実験メラノーマモデルにおいて抗ＰＤ１に対する耐性を克服することを示し、抗ＰＤ１抗体と抗ＴＮＦ抗体の使用が抗ＰＤ１耐性というプロセスを抑制する治療ソリューションとなり得ることを示唆した（２１）。Ｔ細胞由来のＥｘｏｍｉＲ－４３１５発現／Ｂｉｍｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ軸を、抗ＰＤ１療法への耐性現象に関連する事象の「汎癌カスケード」として特定することにより、本研究は、この現象を支配する分子メカニズムのリストを完成させた。このように、私たちの研究は、抗ＰＤ１療法に対する耐性現象の伝達において、水平的なＲＮＡ転移のプロセスが重要であることを初めて明らかにした。この水平ＲＮＡ転移（２２）では、ドナー細胞は抗ＰＤ１療法にさらされたＴ細胞、レシピエントＴ細胞は腫瘍細胞、エキソソームは転移の手段、そしてｍｉＲ－４３１５は転移した生物情報である。
抗ＰＤ１耐性という現象を支配する分子メカニズムの理解における最近の進歩により、この現象のいくつかの主要な原因（１４－１５）：ネオアンチゲンランドスケープの進化（１６）、ＪＡＫ１／２変異の存在（１７）、β２－ミクログロブリン変異の存在（１８）、ＣＤ８＋Ｔ細胞の記憶能の限定的獲得（１９－２０）を明らかにすることが可能になった。最新の論文では、抗ＰＤ１耐性という現象を支配する分子メカニズムに関連するシグネチャーを特定したり、説明したりしているが、Ｂｅｒｔｒａｎｄら（２０１７）は、ＴＮＦα遮断がマウス実験メラノーマモデルにおいて抗ＰＤ１に対する耐性を克服することを示し、抗ＰＤ１抗体と抗ＴＮＦ抗体の使用が抗ＰＤ１耐性というプロセスを抑制する治療ソリューションとなり得ることを示唆した（２１）。Ｔ細胞由来のＥｘｏｍｉＲ－４３１５発現／Ｂｉｍｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ軸を、抗ＰＤ１療法への耐性現象に関連する事象の「汎癌カスケード」として特定することにより、本研究は、この現象を支配する分子メカニズムのリストを完成させた。このように、私たちの研究は、抗ＰＤ１療法に対する耐性現象の伝達において、水平的なＲＮＡ転移のプロセスが重要であることを初めて明らかにした。この水平ＲＮＡ転移（２２）では、ドナー細胞は抗ＰＤ１療法にさらされたＴ細胞、レシピエントＴ細胞は腫瘍細胞、エキソソームは転移の手段、そしてｍｉＲ－４３１５は転移した生物情報である。
【0123】
過去１０年間、がん分野におけるｍｉＲ研究は、ｍｉＲが診断、予後、薬効予測のためのバイオマーカーとして、またオンコまたは腫瘍抑制ｍｉＲのような治療薬として特定されてきた（２３－２４）。このような多方面にわたる文献の中で、ｍｉＲ－４３１５に関する文献は乏しいように思われる。しかし、ｍｉＲ－４３１５は、乳がん組織では非がん組織と比較してがん組織で発現が増加し（２５）、大腸がんでは発現が減少し（２６）、原発性肺腺がん組織では非がん組織と比較して発現が増加する（２７）ことが確認されている。このように、我々の研究は、ｅｘｏｍｉＲ－４３１５の発現を、ｍｉＲ－４３１５の抗がん剤治療効果を予測するための推定バイオマーカー値と関連付けた最初のものである。
【0124】
転移性メラノーマ患者において、Ｂｉｍの発現量が抗ＰＤ１療法に対する反応を予測するために使用できることは、すでに文献で報告されている（２８－２９）。これらの論文では、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＢｉｍレベルの測定は、抗ＰＤ－１療法に対する反応を予測するための有望な低侵襲戦略であると述べられている。本研究は、１）ＣＤ８＋Ｔ細胞だけでなくＴ細胞を含むこと、２）Ｂｉｍの制御は免疫細胞ではなく腫瘍細胞で起こること、３）Ｔ細胞だけでなくＴ細胞とがん細胞との細胞間コミュニケーションに関わること、からこれらの知見とは大きく異なっている。さらに、Ｄｒｏｎｃａ ａｎｄ ａｌ． （２０１６） （２９）では分子的な原因は指摘されていなかったが、本研究ではエキソソームｍｉＲＮＡ－４３１５をＢｉｍ発現制御の分子的原因として同定した。このように、我々のデータは腫瘍細胞のＢｉｍに着目し、Ｔ細胞のＢｉｍに着目していないため、文献に存在するデータと重複することはない。
【0125】
こ の論文は、抗ＰＤ－１薬や抗ＰＤ－１薬と化学療法の併用に反応しない特定の患者を（ｅｘｏｍｉＲ－４３１５のレベルをモニターすることによって）検出する可能性を開くものである。
【0126】
参考文献
本出願を通じて、様々な参考文献が、本発明が関係する技術の状態を記述している。これらの文献の開示は、参照により本開示に組み込まれる。
本出願を通じて、様々な参考文献が、本発明が関係する技術の状態を記述している。これらの文献の開示は、参照により本開示に組み込まれる。
【0127】
【表1】
【0128】
【表2】
【0129】
【表3】
【0130】
【表4】
【0131】
【表5】
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【配列表】
【国際調査報告】