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特表2023-540717Ｌ－バリン生産微生物及びそれを用いたＬ－バリン生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-26
(54)【発明の名称】Ｌ－バリン生産微生物及びそれを用いたＬ－バリン生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20230919BHJP
C12P 13/08 20060101ALI20230919BHJP
C12N 9/88 20060101ALI20230919BHJP
C12N 15/60 20060101ALN20230919BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21
C12P13/08 D ZNA
C12N9/88
C12N15/60
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023514054
(86)(22)【出願日】2021-09-01
(85)【翻訳文提出日】2023-03-14
(86)【国際出願番号】 KR2021011717
(87)【国際公開番号】W WO2022050671
(87)【国際公開日】2022-03-10
(31)【優先権主張番号】10-2020-0111084
(32)【優先日】2020-09-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514199250
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダング コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100097456
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 徹
(72)【発明者】
【氏名】ジン スク チャング
(72)【発明者】
【氏名】ソン ヒェ キム
(72)【発明者】
【氏名】ビョン フン ユン
(72)【発明者】
【氏名】ジュ‐ヨン キム
(72)【発明者】
【氏名】ヒュン ジュン キム
(72)【発明者】
【氏名】ソン ヒョン チェ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AE05
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA10
4B065AA24X
4B065AA24Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA17
4B065CA41
4B065CA44
(57)【要約】
本出願は、Ｌ－バリン生産微生物及び前記微生物を用いたＬ－バリンの生産方法に関し、本出願の活性強化または活性減少した酵素の組合わせを含む微生物を培養する場合、高収率のＬ－バリン生産が可能である。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）の活性；及び下記（１）～（３）から選択されるいずれか一つ以上の組合わせを有する、Ｌ－バリン生産微生物。（１）減少したトランスアミナーゼＣ（ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ Ｃ）の活性
（２）弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の活性
（３）減少したクエン酸シンターゼ（Ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性
【請求項2】
前記微生物は、強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性；及び減少したトランスアミナーゼＣの活性を有する、請求項１に記載の微生物。
【請求項3】
前記微生物は、強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性；及び弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を有する、請求項１に記載の微生物。
【請求項4】
前記微生物は、強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性；及び減少したクエン酸シンターゼの活性を有する、請求項１に記載の微生物。
【請求項5】
前記微生物は、減少したトランスアミナーゼＣの活性または弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性をさらに有する、請求項４に記載の微生物。
【請求項6】
前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼは、ｉｌｖＤ遺伝子によりコードされる、請求項１に記載の微生物。
【請求項7】
前記トランスアミナーゼＣは、ａｖｔＡ遺伝子によりコードされる、請求項１に記載の微生物。
【請求項8】
前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、ａｃｅＥ遺伝子によりコードされる、請求項１に記載の微生物。
【請求項9】
前記クエン酸シンターゼは、ｇｌｔＡ遺伝子によりコードされる、請求項１に記載の微生物。
【請求項10】
前記弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端から４３２番目または４３５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項11】
前記減少したクエン酸シンターゼは、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端から２４１番目または３１２番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項12】
前記Ｌ－バリン生産微生物は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）である、請求項１に記載の微生物。
【請求項13】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項１２に記載の微生物。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の微生物を培養する段階を含む、Ｌ－バリンの生産方法。
【請求項15】
前記培養された微生物または培地からＬ－バリンを回収する段階をさらに含む、請求項１４に記載のＬ－バリンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、Ｌ－バリン生産微生物及び前記微生物を用いたＬ－バリンの生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
分岐鎖アミノ酸の一つであるＬ－バリンは、微生物においてピルビン酸から出発してアセト乳酸（ａｃｅｔｏｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、ジヒドロキシイソ吉草酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ｉｓｏｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、ケトイソ吉草酸（ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）を経由して生合成される。このような中間代謝産物は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ ａｃｉｄ ｉｓｏｍｅｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）、トランスアミナーゼＢ（ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ Ｂ）により触媒された反応により生成される。しかし、前記酵素はケト酪酸（ｋｅｔｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）とピルビン酸から始まるＬ－イソロイシン生合成にも関与し、中間代謝物であるケトイソ吉草酸から２－イソプロピルリンゴ酸（２－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、３－イソプロピルリンゴ酸（３－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）、ケトイソカプロン酸（ｋｅｔｏｉｓｏｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）を経由してＬ－ロイシンが生合成されることもある。従って、前記のように分岐鎖アミノ酸、即ち、Ｌ－バリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシンはその生合成過程に同一の酵素を用いるため、一つの分岐鎖アミノ酸を発酵を通じて工業的に製造するには困難があることが知られており、さらに最終産物であるＬ－バリンまたはその誘導体によるフィードバック阻害が発生し、これを工業的に大量製造するには制約が伴うという問題を有している。
【0003】
ただし、これまでフィードバック阻害を通じたバリンの生産方法に関する研究はあったが（米国登録特許第１０４５７９１９号）、本出願の活性強化または活性減少した酵素の組合わせを通じたバリンの生産能の増大に関する研究はなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】米国登録特許第１０４５７９１９号
【特許文献2】米国特許ＵＳ ７６６２９４３ Ｂ２
【特許文献3】米国登録特許ＵＳ １０５８４３３８ Ｂ２
【特許文献4】米国登録特許ＵＳ １０２７３４９１ Ｂ２
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０， Ｖｏｌ． ２． １－１６
【非特許文献2】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２
【非特許文献3】Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） ［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］： ２４４４
【非特許文献4】Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６－２７７
【非特許文献5】Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３
【非特許文献6】Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７ （１９８４）
【非特許文献7】Ａｔｓｃｈｕｌ， ［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ， Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］： ４０３ （１９９０）
【非特許文献8】Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ， ［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４
【非特許文献9】［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８： １０７３
【非特許文献10】Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２
【非特許文献11】Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７９）
【非特許文献12】Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６７４５
【非特許文献13】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｊｕｎｅ ２０１４， Ｖｏｌｕｍｅ １９， Ｉｓｓｕｅ ３， ｐｐ ４５６－４６７
【非特許文献14】ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５， １９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
これに対し、本発明者は、効果的なＬ－バリン生産方法について持続的な研究を行った結果、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）の活性強化；及びトランスアミナーゼＣ（ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ Ｃ）の活性減少、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の活性弱化、クエン酸シンターゼ（Ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性減少またはこれらの組合わせを含む微生物が前記酵素の野生型に比べてＬ－バリン生産能に優れることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本出願の一つの目的は、強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性；及び下記（１）～（３）から選択されるいずれか一つ以上の組合わせを有する、Ｌ－バリン生産微生物を提供することにある。
（１）減少したトランスアミナーゼＣの活性
（２）弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性
（３）減少したクエン酸シンターゼの活性
本出願の他の目的は、前記微生物を培養する段階を含む、Ｌ－バリンの生産方法を提供することにある。
（１）減少したトランスアミナーゼＣの活性
（２）弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性
（３）減少したクエン酸シンターゼの活性
本出願の他の目的は、前記微生物を培養する段階を含む、Ｌ－バリンの生産方法を提供することにある。
【発明の効果】
【0008】
本出願のＬ－バリン生産微生物を培養する場合、高収率のＬ－バリン生産が可能である。これにより、産業的な面で生産の便宜性及び製造原価節減の効果が期待できる。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下では、本出願をより詳細に説明する。
【0010】
一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本出願で開示された様々な要素の全ての組み合わせが、本出願の範囲に属する。また、以下に記載される具体的な記述により本出願の範囲が制限されるとは見られない。
【0011】
また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定様態に対する多数の等価物を認知したり確認することができる。また、このような等価物は、本出願に含まれることが意図される。
【0012】
本出願の一つの様態は、強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性；及び下記（１）～（３）から選択されるいずれか一つ以上の組合わせを有することを特徴とするＬ－バリン生産微生物を提供することである。
【0013】
（１）減少したトランスアミナーゼＣの活性
（２）弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性
（３）減少したクエン酸シンターゼの活性
（２）弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性
（３）減少したクエン酸シンターゼの活性
【0014】
一つの具体例として、前記バリン生産微生物は、前記微生物は強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性及び減少したトランスアミナーゼＣの活性を有する微生物であってもよい。
【0015】
他の具体例として、前記バリン生産微生物は、強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性及び弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を有する微生物であってもよい。
【0016】
他の具体例として、前記バリン生産微生物は、強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性及び減少したクエン酸シンターゼの活性を有する微生物であってもよい。
【0017】
他の具体例として、強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性及び減少したクエン酸シンターゼの活性に、減少したトランスアミナーゼＣの活性または弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性をさらに有する微生物であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0018】
本出願において、用語「ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）」はピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）からアセトラクテート（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ）を経てジヒドロキシイソ吉草酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ｉｓｏｖａｌａｅｒａｔｅ）からケトイソ吉草酸（ｋｅｔｏｉｓｏ－ｖａｌｅｒａｔｅ）を経てＬ－バリンを生産する生合成経路においてＬ－バリンの前駆体であるケトイソ吉草酸（ｋｅｔｏｉｓｏ－ｖａｌｅｒａｔｅ）の合成に関与する酵素を意味する。本出願では、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性を強化させてケトイソ吉草酸の合成を増加させることによりＬ－バリンの生産量増加を図ることができる。
【0019】
本出願において、用語「トランスアミナーゼＣ（ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ Ｃ）」は、ピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）からＬ－アラニンを合成する経路に関与する酵素を意味する。
【0020】
本出願において、用語「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）」は、ピルビン酸からアセチル助酵素Ａ（ａｃｅｔｙｌ－ｃｏＡ）の合成に関与する酵素を意味する。
【0021】
本出願において、用語「クエン酸シンターゼ（Ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）」は、アセチル助酵素Ａからクエン酸（ｃｉｔｒａｔｅ）を合成する酵素を意味する。
【0022】
本出願において、用語「強化」とは、タンパク質の活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。前記強化は、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、上方制御（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）などの用語と混用され得る。ここで、活性化、強化、上方制御、過剰発現、増加は、本来有していなかった活性を示すこと、または内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すようになることを全て含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化した場合、形質転換前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が、内在的活性に比べて「強化」、「上方制御」、「過剰発現」または「増加」するとは、形質転換前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性及び／または濃度（発現量）に比べて向上したことを意味する。
【0023】
前記強化は、外来のポリペプチドを導入するか、または内在的なポリペプチドの活性強化及び／または濃度（発現量）増加を通じて達成することができる。前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性の強化有無は、当該ポリペプチドの活性度、発現量または当該ポリペプチドから排出される産物の量の増加から確認することができる。
【0024】
前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性の強化は、当技野においてよく知られた様々な方法の適用が可能であり、目的のポリペプチドの活性を改変前の微生物より強化させることができる限り、限定されない。具体的には、分子生物学の日常的な方法である当業者の通常の技術界によく知られた遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を利用したものであってもよいが、これに限定されない（例えば、Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０， Ｖｏｌ． ２． １－１６， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。
【0025】
具体的には、本出願のジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性の強化は、
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性の強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’-ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化されるように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように変形されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはそれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形するか、または化学的に変形；または
９）前記１）～８）から選択される２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性の強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’-ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化されるように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように変形されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはそれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形するか、または化学的に変形；または
９）前記１）～８）から選択される２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
【0026】
より具体的には、
前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの宿主細胞内への導入により達成されるものであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行うことができるが、これらに限定されない。前記ベクターは、前述の通りである。
前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの宿主細胞内への導入により達成されるものであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行うことができるが、これらに限定されない。前記ベクターは、前述の通りである。
【0027】
前記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域（または発現調節配列）を活性の強力な配列での交換は、例えば、前記発現調節領域の活性をさらに強化するように欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはそれらの組合せにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。一例として、本来のプロモーターを強力なプロモーターと交換させることであってもよいが、これらに限定されない。
【0028】
公知の強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（米国特許ＵＳ ７６６２９４３ Ｂ２）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０５８４３３８ Ｂ２）、Ｏ２プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０２７３４９１ Ｂ２）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどがあるが、これらに限定されない。
【0029】
前記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’-ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がより高い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換することであってもよいが、これらに限定されない。
【0030】
前記４）及び５）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を強化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列または活性が増加するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記交換は、具体的には、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行うことができるが、これらに限定されない。このときに使用されるベクターは、染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは下記に詳しく記述する内容の通りである。
【0031】
前記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドの導入は、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドの宿主細胞内の導入であってもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限はない。前記導入に用いられる方法は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによりポリペプチドが生成し、その活性が増加されてもよい。
【0032】
前記７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化は、内在ポリヌクレオチドが宿主細胞内で転写または翻訳が増加するようにコドン最適化したものであるか、または外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化したものであってもよい。
【0033】
前記８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形または化学的に修飾することは、例えば、分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が格納されたデータベースと比較することにより、配列の類似性の程度にしたがって、鋳型タンパク質候補を決定し、それに基づいて構造を確認し、変形または化学的に修飾する露出部位を選択して変形または修飾することであってもよい。
【0034】
本出願のベクターは、外来遺伝物質を他の細胞に人工的に運搬する媒介体として使用されるＤＮＡ分子であり、具体的には、適切な宿主内で目的のポリペプチドを発現させるように、適切な発現調節領域（または発現調節配列）に作動可能に連結された前記目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ製造物を含んでもよい。前記発現調節領域は、転写を開始するプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノム自体に統合されてもよい。
【0035】
本出願で使用されるベクターは特に限定されず、当技術分野で知られている任意のベクターを使用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしてｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
【0036】
一例として、細胞内における染色体挿入用ベクターを通じて目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、即ち、目的核酸分子の挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが使用されてもよい。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみが生存するか、または他の発現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
【0037】
本出願における用語「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞または微生物内に導入し、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できる限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、または染色体外に位置するかに関係なく、それらいずれも含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むことができる。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形態でも導入されてもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体で発現されるのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位、及び翻訳終結信号を含んでもよい。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに制限されない。
【0038】
また、前記において用語「作動可能に連結」されたとは、本出願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。
【0039】
このようなタンパク質活性の強化は、対応するタンパク質の活性がなかったことが示されたり、またはその活性または濃度が野生型タンパク質や初期の微生物菌株における活性または濃度を基準として一般に、１％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％または５００％、最大１０００％または２０００％まで増加することであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0040】
具体的には、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性の強化は、微生物内におけるジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性が野生型、変異前の微生物または当該タンパク質が非変形された微生物に比べて強化されてジヒドロキシイソ吉草酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ｉｓｏｖａｌａｅｒａｔｅ）からＬ－バリンの前駆体であるケトイソ吉草酸（ｋｅｔｏｉｓｏ－ｖａｌｅｒａｔｅ）の合成が増加することにより、Ｌ－バリン生産能が増加したものであってもよい。
【0041】
本出願において、用語「減少」とは、本来微生物が天然の状態、または変異前の状態で示すタンパク質の活性、即ち、内在的活性またはタンパク質をコードする遺伝子の細胞内１コピーである時と比較した時、その活性が弱化されたりまたは活性がないこと（欠損）をいずれも含む概念であり、活性が０％以上～１００％未満であることを意味する。
【0042】
このようなタンパク質「活性の減少」は、特にこれに制限されないが、前記タンパク質自体の活性が除去された場合または本来機能以下の効果を導き出すことを意味することである。すなわち、活性の減少は、具体的に「活性の欠損」と「活性の弱化」の両方を含む意味である。
【0043】
前記「活性の欠損」は、酵素またはタンパク質の発現が天然の野生型菌株、親株または当該タンパク質が非変形された菌株に比べて全く発現されていないか、または発現されてもその活性がないことを意味する。
【0044】
本出願において、前記活性の欠損は、当該分野においてよく知られている様々な方法の適用により達成されてもよい。前記方法の例として、１）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の全体または一部を欠損させる方法；２）前記タンパク質の活性が除去されるようにタンパク質をコードする前記遺伝子配列の変形、３）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；４）前記タンパク質をコードする前記遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加して２次構造物を形成させてリボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着を不可能にさせる方法；５）前記タンパク質をコードする前記遺伝子のポリヌクレオチド配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’末端に反対方向に転写されるプロモーターを付加する方法（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ＲＴＥ）などがあり、これらの組合わせでも達成することができるが、これについて、特に制限されるものではない。
【0045】
また、前記「活性の弱化」は、特にこれに制限されないが、本来の機能以下の効果を導き出すことを意味することであり、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の一部を欠失させる方法；当該タンパク質の活性が減少するように突然変異された遺伝子で、染色体上の前記タンパク質をコードする遺伝子を代替する方法；前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法；前記タンパク質をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が弱い配列で交換する方法（例えば、前記遺伝子のプロモーターを内在的プロモーターより弱いプロモーターで交換する方法）などからなってもよいが、これに制限されるものではなく、活性弱化のために公知となった方法が制限なく用いられる。
【0046】
このようなタンパク質活性の減少は、対応するタンパク質の活性が除去されたり、またはこの活性または濃度が野生型タンパク質や初期の微生物菌株における活性または濃度を基準として、一般に、０％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％に減少されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0047】
具体的には、前記微生物においてトランスアミナーゼＣの活性は、自然の野生型菌株、変異前の親株または当該タンパク質が非変形の菌株に比べて減少したものであってもよい。一つの具体例として、前記微生物は、トランスアミナーゼＣ遺伝子が欠損してトランスアミナーゼＣタンパク質の活性がなかったりトランスアミナーゼＣ遺伝子の開始コドンコード配列がＧＴＧに変形されてトランスアミナーゼＣタンパク質の発現が減少して活性が弱化されたものであってもよい。
【0048】
また、具体的には、前記微生物においてピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性は、自然の野生型菌株、変異前の親株または当該タンパク質が非変形の菌株に比べて減少したものであってもよい。一つの具体例として、前記微生物は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が欠損してピルビン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の活性がなかったりピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の開始コドンコード配列がＧＴＧに変形されてピルビン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の発現が減少して活性が弱化されたものであってもよい。もう一つの具体例として、前記微生物においてピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の配列が変異されて前記微生物は、配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端から４３２番目または４３５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、野生型タンパク質より弱化された活性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼ変異体が発現するものであってもよい。この時、前記野生型タンパク質より弱化された活性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼ変異体は、それぞれ配列番号５または配列番号６の配列を含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【0049】
また、具体的には、前記微生物においてクエン酸シンターゼの活性は、自然の野生型菌株、変異前の親株または当該タンパク質が非変形の菌株に比べて減少したものであってもよい。一つの具体例として、前記微生物は、クエン酸シンターゼ遺伝子の欠損によりクエン酸シンターゼタンパク質活性を示さなかったりクエン酸シンターゼ遺伝子の開始コドンコード配列がＧＴＧに変異されることにより、クエン酸シンターゼタンパク質の発現が減少し、この活性が弱化されたものであってもよい。もう一つの具体例として、前記微生物においてクエン酸シンターゼ遺伝子の配列が変異され、前記微生物は、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端から２４１番目または３１２番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、野生型タンパク質より減少した活性を有するクエン酸シンターゼ変異体を発現するものであってもよい。この時、前記野生型タンパク質より減少した活性を有するクエン酸シンターゼ変異体は、それぞれ配列番号７または配列番号８の配列を含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【0050】
「他のアミノ酸で置換」は、置換前のアミノ酸と他のアミノ酸で置換されるものであれば、制限されない。具体的には、リシン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、アルギニン及びグルタミンのいずれか一つのアミノ酸で置換されたものであってもよい。
【0051】
より具体的には、弱化された活性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端から４３２番目または４３５番目の位置に対応するアミノ酸が非極性アミノ酸で置換されたものであってもよい。
【0052】
また、より具体的には、減少した活性を有するクエン酸シンターゼは、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端から２４１番目または３１２番目の位置に対応するアミノ酸が極性または非極性アミノ酸で置換されたものであってもよい。
【0053】
本出願において用語「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」は、タンパク質またはペプチドで列挙される位置のアミノ酸残基であるか、またはタンパク質またはペプチドで列挙される残基と類似または同一または相同のアミノ酸残基を指す。本出願で使用される「対応する領域」は、一般に、関連タンパク質または比較タンパク質における類似の位置を指す。
【0054】
本出願において、本出願に用いられるタンパク質内のアミノ酸残基位置に特定のナンバリングが用いられる。例えば、比較しようとする対象タンパク質と本出願のタンパク質配列を整列することにより、本出願のタンパク質のアミノ酸残基位置に対応する位置に対して再ナンバリングすることが可能である。
【0055】
本出願において、用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列相互間の類似度を意味し、百分率で表すことができる。用語の相同性及び同一性はしばしば互換的に使用することができる。
【0056】
保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準的な配列アルゴリズムにより決定され、使用されるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に使用されてもよい。実質的に、相同性を有したり（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般に、配列の全部または一部と中程度または高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドにおける一般のコドンまたはコドン縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることが自明である。
【0057】
任意の２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） ［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］： ２４４４でのようなデフォルトパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを使用して決定されてもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６－２７７）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３）を使用して決定されてもよい（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７ （１９８４））， ＢＬＡＳＴＰ， ＢＬＡＳＴＮ， ＦＡＳＴＡ （Ａｔｓｃｈｕｌ， ［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ， Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］： ４０３ （１９９０）； Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ， ［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４，及び［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８： １０７３を含む）。 例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定することができる。
【0058】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２において公知となっているように、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９７０）， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定されてもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を除した値と定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）二進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非－同一性のために０の値を含む）、及びＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７９）により開示されているように、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６７４５の加重比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。
【0059】
本出願において、用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、一つ以上のアミノ酸が保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び／又は変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）において、前記列挙された配列（ｔｈｅ ｒｅｃｉｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と相違するが、前記タンパク質の機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）または特性（ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）が維持されたタンパク質を指す。変異体は、数個のアミノ酸置換、欠失または付加により識別される配列（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と相違する。そのような変異体は、一般に、前記タンパク質のアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸を変形し、前記変形されたタンパク質の特性を評価して識別されてもよい。即ち、変異体の能力は、本来タンパク質（ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）に比べて増加したり、変わらなかったり、または減少される。他の変異体は、成熟タンパク質（ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＮ及び／又はＣ末端から一部分が除去された変異体を含んでもよい。前記用語「変異体」は、変異型変形、変異されたタンパク質、変異型ポリペプチド、変異などの用語（英文表現では、ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ， ｍｕｔａｎｔ， ｍｕｔｅｉｎ，ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ， ｖａｒｉａｎｔなど）が用いられ、変異された意味として用いられる用語であれば、これに制限されない。本出願の目的上、前記変異体は、天然の野生型または非変形タンパク質と対比してタンパク質の活性が減少または弱化されたものであってもよいが、これに制限されない。
【0060】
本出願において用語「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、あるアミノ酸を類似した構造的及び／または化学的性質を有する他のアミノ酸で置換させることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷（塩基性、酸性）、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）における類似性に基づいて起こり得る。
【0061】
また、変異体は、ポリペプチドの特性と２次構造に最小限の影響を有するアミノ酸配列の欠損または付加を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時に（ｃｏ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）または翻訳後に（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）タンパク質の移転（ｔｒａｎｓｆｅｒ）に関与するタンパク質Ｎ末端のシグナル（またはリーダ）配列とコンジュゲートすることができる。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製、または合成できるように他の配列またはリンカーとコンジュゲートされてもよい。
【0062】
本出願の用語、「Ｌ－バリン生産微生物」は、培地中の炭素源からＬ－バリンを野生型や非変形微生物と比較して過量で生産できる微生物を意味する。また、前記Ｌ－バリンを生産する微生物は、組換え微生物であってもよい。具体的には、Ｌ－バリンを生産することができれば、その種類が特に制限されないが、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｂａｃｔｅｒ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及びブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物であってもよい。より具体的には、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物であってもよい。
【0063】
より一層具体的には、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であってもよく、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であってもよいが、強化された活性を有するジヒドロキシ酸デヒドラターゼ；及び減少した活性を有するトランスアミナーゼＣ、弱化した活性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼまたは減少した活性を有するクエン酸シンターゼから選択されるいずれか一つ以上の組合わせが導入されたＬ－バリン生産量が増加されるエシェリキア属または、コリネバクテリウム属に属する微生物は、制限なく含まれてもよい。
【0064】
本出願で強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性；及び下記（１）～（３）から選択されるいずれか一つ以上の組合わせを有する変形されたＬ－バリンを生産する微生物の親株は、Ｌ－バリンを生産する微生物であれば、特に制限されない。
【0065】
（１）減少したトランスアミナーゼＣの活性
（２）弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性
（３）減少したクエン酸シンターゼの活性
（２）弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性
（３）減少したクエン酸シンターゼの活性
【0066】
Ｌ－バリンを生産する微生物は、天然型微生物自体または外部のＬ－バリン生産機序と関連した遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性を強化させたり減少（弱化または抑制）させて向上したＬ－バリン生産能を有するようになった微生物であってもよい。
【0067】
一つの具体例として、前記微生物は、野生型または変異前の親株よりジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性が強化され、野生型または変異前の親株よりトランスアミナーゼＣの活性が減少したＬ－バリン生産微生物であってもよい。この時、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼはｉｌｖＤ遺伝子によりコードされ、前記トランスアミナーゼＣはａｖｔＡ遺伝子によりコードされてもよい。前記遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカム由来であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0068】
他の具体例として、前記微生物は、野生型または変異前の親株よりジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性が強化され、野生型または変異前の親株よりピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が弱化されたＬ－バリン生産微生物であってもよい。この時、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼはｉｌｖＤ遺伝子によりコードされ、前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼはａｃｅＥ遺伝子によりコードされてもよい。前記遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカム由来であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0069】
他の具体例として、前記微生物は、野生型または変異前の親株よりジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性が強化され、野生型または変異前の親株よりクエン酸シンターゼの活性が減少したＬ－バリン生産微生物であってもよい。この時、前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼはｉｌｖＤ遺伝子によりコードされ、前記クエン酸シンターゼはｇｌｔＡ遺伝子によりコードされてもよい。前記遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカム由来であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0070】
また、前記微生物にさらに野生型または変異前の親株よりトランスアミナーゼＣの活性が減少またはピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が減少したＬ－バリン生産微生物であってもよく、もしくは野生型または変異前の親株よりトランスアミナーゼＣの活性が減少し、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が減少したＬ－バリン生産微生物であってもよい。
【0071】
本出願のもう一つの様態は、前記強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性；及び下記（１）～（３）から選択されるいずれか一つ以上の組合わせを有することを特徴とするＬ－バリン生産微生物を培地で培養することを含む、Ｌ－バリンの生産方法に関する。
【0072】
（１）減少したトランスアミナーゼＣの活性
（２）弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性
（３）減少したクエン酸シンターゼの活性
（２）弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性
（３）減少したクエン酸シンターゼの活性
【0073】
本出願の「Ｌ－バリン」は、Ｌ－バリンそれ自体の形態だけでなく、その塩の形態も全て含まれる。
【0074】
本出願において、用語「培養」とは、前記微生物を適切に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当業界に知られている適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。このような培養過程は、選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して使用することができる。具体的には、前記培養は、回分式、連続式及び流加式であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0075】
本出願において、用語「培地」とは、前記微生物を培養するために必要とする栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質及び発育因子などを供給する。具体的には、本出願の微生物の培養に用いられる培地及びその他の培養条件は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば、特に制限なくいずれも使用できるが、本出願の微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地内で好気性条件下で温度、ｐＨ等を調節しながら培養することができる。
【0076】
本出願において、前記炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトースなどのような炭水化物；マンニトール、ソルビトールなどのような糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などのような有機酸；グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのようなアミノ酸などを含むことができる。また、澱粉加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米ぬか、キャッサバ、バカス及びトウモロコシ浸漬液のような天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖蜜（すなわち、還元糖に転換された糖蜜）などのような炭水化物を使用することができ、その他の適量の炭素源を制限なく多様に利用することができる。これらの炭素源は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよく、これに限定されるものではない。
【0077】
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのような無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのようなアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などのような有機窒素源が使用されてもよい。これらの窒素源は、単独で使用し、２種以上を組み合わせて使用してもよく、これに限定されるものではない。
【0078】
前記リン源としては、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、またはそれに対応するナトリウム含有塩などが含まれてもよい。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用されてもよく、それ以外にアミノ酸、ビタミン及び／または適切な前駆体などが含まれてもよい。これらの構成成分または前駆体は、培地に回分式または連続式で添加されてもよい。しかし、これに限定されるものではない。
【0079】
本出願において、微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などのような化合物を培地に適切な方法で添加し、培地のｐＨを調整することができる。また、培養中は脂肪酸ポリグリコールエステルなどのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培地の好気状態を維持するために、培地内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができ、これに限定されるものではない。
【0080】
培地の温度は２０℃～５０℃、具体的には、３０℃～３７℃であってもよいが、これに制限されない。培養期間は、有用物質の所望の生成量が得られるまで続けることができ、具体的には、１０時間～１００時間であってもよいが、これに制限されない。
【0081】
本出願の培養により生産されたＬ－バリンは、培地中に分泌されるか、または細胞内に残留存する。
【0082】
本出願のＬ－バリン生産方法は、本出願の微生物を準備する段階、前記菌株を培養するための培地を準備する段階、またはこれらの組み合わせ（順は無関係、ｉｎ ａｎｙ ｏｒｄｅｒ）を、例えば、前記培養段階の前に、さらに含むことができる。
【0083】
本出願のＬ－バリン生産方法は、前記培養による培地（培養済み培地）または本出願の微生物からＬ－バリンを回収する段階をさらに含むことができる。前記回収する段階は、前記培養する段階の後にさらに含むことができる。
【0084】
前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などにより当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて所望のＬ－バリンを収集（ｃｏｌｌｅｃｔ）することであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣまたはそれらの方法を組み合わせて使用することができ、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて培地または微生物から所望のＬ－バリンを回収することができる。
【0085】
また、本出願のＬ－バリン生産方法は、さらに精製段階を含んでもよい。前記精製は、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて行うことができる。一例として、本出願のＬ－バリン生産方法が回収段階と精製段階の両方を含む場合、前記回収段階及び精製段階は、順序に関係なく連続的または非連続的に行われるか、または同時にまたは一つの段階に統合されて行うことができるが、これに限定されるものではない。
【0086】
本出願の方法において、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物、Ｌ－バリンなどは、前記他の態様で記載された通りである。
【0087】
本出願のもう一つの様態は、強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性；及び下記（１）～（３）から選択されるいずれか一つ以上の組合わせを有することを特徴とする微生物への変形を含む、Ｌ－バリン生産能を増加させる方法を提供する。
【0088】
（１）減少したトランスアミナーゼＣの活性
（２）弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性
（３）減少したクエン酸シンターゼの活性
（２）弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性
（３）減少したクエン酸シンターゼの活性
【0089】
本出願のもう一つの様態は、強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性；及び下記（１）～（３）から選択されるいずれか一つ以上の組合わせを有する微生物のＬ－バリンの生産用途を提供する。
【0090】
（１）減少したトランスアミナーゼＣの活性
（２）弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性
（３）減少したクエン酸シンターゼの活性発明の効果
（２）弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性
（３）減少したクエン酸シンターゼの活性発明の効果
【0091】
以下、本出願を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【0092】
実施例１：バリン生産基盤菌株の製作及び評価
野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７とＡＴＣＣ１３８６９にそれぞれ１種の変異［ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｊｕｎｅ ２０１４， Ｖｏｌｕｍｅ １９， Ｉｓｓｕｅ ３， ｐｐ ４５６－４６７］を導入してＬ－バリン生産能が向上した菌株を製作した。
野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７とＡＴＣＣ１３８６９にそれぞれ１種の変異［ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｊｕｎｅ ２０１４， Ｖｏｌｕｍｅ １９， Ｉｓｓｕｅ ３， ｐｐ ４５６－４６７］を導入してＬ－バリン生産能が向上した菌株を製作した。
【0093】
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型であるＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡをＧ－ｓｐｉｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出ミニキット（Ｉｎｔｒｏｎ社、Ｃａｔ．Ｎｏ １７０４５）を用いてキットに提供されたプロトコルにより抽出した。前記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号９と配列番号１０のプライマー対及び配列番号１１と配列番号１２のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、それぞれ５３７ｂｐの遺伝子断片をそれぞれ得た。ＰＣＲは、９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応の条件で行った。
【0094】
前記両断片を鋳型とし、配列番号９と配列番号１２をプライマー対を用いてオーバーラッピング（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを実施して１０４４ｂｐのＰＣＲ結果物（以下、「変異導入断片２」と命名する）を得た。
【0095】
前記得られた変異導入断片２を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で処理した後、同一の制限酵素で処理されたｐＤＺベクターとＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いてライゲーションして変異導入断片２を含むベクターを製作した。前記ｉｌｖＮ遺伝子のＡ４２Ｖ変異導入を目的とするベクターをｐＤＺ－ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）と命名した。
【0096】
【表1】
【0097】
その後、前記ｐＤＺ－ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）を野生型であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７とＡＴＣＣ１３８６９菌株にそれぞれ形質転換させ、染色体上で相同性組換えを誘導した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５， １９９９）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。
【0098】
その後、前記で選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号１８と配列番号２１を用いたＰＣＲを通じて遺伝子断片を増幅した後、遺伝子配列の分析を通じて変異が正確に導入されていることを確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖ及びＣＪ８Ｖとそれぞれ命名した。
【0099】
野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７とＡＴＣＣ１３８６９菌株、前記ＣＪ７Ｖ及びＣＪ８Ｖ菌株を対象に発酵力価実験を実施した。栄養培地で継代培養された各菌株を、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに接種し、３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。その後、ＨＰＬＣを用いてＬ－バリンの濃度を分析し、下記表２に示した。
【0100】
＜栄養培地（ｐＨ７．２）＞
ブドウ糖１０ｇ、肉汁５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、酵母エキス５ｇ、寒天２０ｇ、ウレア２ｇ（蒸溜水１リットル基準）
ブドウ糖１０ｇ、肉汁５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、酵母エキス５ｇ、寒天２０ｇ、ウレア２ｇ（蒸溜水１リットル基準）
【0101】
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖１００ｇ、硫酸アンモニウム４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、第２リン酸カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １ｍｇ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ、炭酸カルシウム３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）
ブドウ糖１００ｇ、硫酸アンモニウム４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、第２リン酸カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １ｍｇ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ、炭酸カルシウム３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）
【0102】
【表2】
【0103】
前記結果から見られるように、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７及び１３８６９菌株と対比してｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）遺伝子変異が導入されたＣＪ７Ｖ及びＣＪ８Ｖ菌株のバリン生産能が増加したことを確認した。
【0104】
実施例２：バリン高生産能菌株の製作及び評価
実施例２－１．バリン生合成遺伝子ｉｌｖＤ強化菌株の製作及び評価
バリン生合成遺伝子であるｉｌｖＤ発現を強化したバリン高生産能の菌株を製作するために、下記配列番号１３及び１４のプライマー対、配列番号１５及び１６のプライマー対及び配列番号１７及び１８のプライマー対を用いて前記ｉｌｖＤ遺伝子のプロモーター交換のためのｐＤＺ－Ｐｃｊ７－ｉｌｖＤベクターを製作した。
実施例２－１．バリン生合成遺伝子ｉｌｖＤ強化菌株の製作及び評価
バリン生合成遺伝子であるｉｌｖＤ発現を強化したバリン高生産能の菌株を製作するために、下記配列番号１３及び１４のプライマー対、配列番号１５及び１６のプライマー対及び配列番号１７及び１８のプライマー対を用いて前記ｉｌｖＤ遺伝子のプロモーター交換のためのｐＤＺ－Ｐｃｊ７－ｉｌｖＤベクターを製作した。
【0105】
ｉｌｖＤ強化ベクター製作プライマー配列
【表3】
【0106】
具体的には、ｐＤＺ－Ｐｃｊ７－ｉｌｖＤベクターの製作のために、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型であるＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３と配列番号１４のプライマー対、配列番号１５と配列番号１６のプライマー対及び配列番号１７と配列番号１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、それぞれの断片を得た。ＰＣＲは、９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で６０秒の重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応の条件で行った。
【0107】
前記断片を鋳型とし、配列番号１３と配列番号１８のプライマー対を用いたオーバーラッピング（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを実施して得られた変異導入断片３に制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を処理し、同一の制限酵素で処理されたｐＤＺベクターにＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）でライゲーションしてｐＤＺ－Ｐｃｊ７－ｉｌｖＤベクターを製作した。
【0108】
その後、前記製作されたｐＤＺ－Ｐｃｊ７－ｉｌｖＤをバリン生産基盤菌株であるＣＪ７Ｖ、ＣＪ８Ｖ及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐにそれぞれ形質転換させて染色体上で相同性組換えを誘導した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５， １９９９）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号１３と配列番号１８のプライマー対を用いたＰＣＲを通じて遺伝子断片を増幅した後、遺伝子配列の分析を通じて変異が正確に導入されたことを確認した後、前記選別された組換え菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖ：ｉｌｖＤ、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤと命名した。選別されたｉｌｖＤ遺伝子強化菌株の発酵力価を実施例１と同様の方法で行い、その結果は下記の通りである。
【0109】
ｉｌｖＤ強化菌株Ｌ－バリン生産能
【表4】
【0110】
前記結果から見られるように、バリン生合成遺伝子の一つであるｉｌｖＤを強化した時にバリン生産基盤菌株のＣＪ７Ｖ、ＣＪ８Ｖ及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株がいずれもバリン生産能が増加することを確認した。
【0111】
実施例２－２．ａｖｔＡ欠損及び弱化（ａ１ｇ）菌株の製作及び評価
バリン高生産能の菌株を製作するために、ａｖｔＡを弱化（ａｖｔＡ遺伝子の開始コドンをＧＴＧに変形）または欠損させようとした。これに、下記配列番号１９及び２０のプライマー対及び配列番号２１及び２２のプライマ一対を用いてａｖｔＡ弱化菌株（ａｖｔＡ遺伝子の開始コドンをＧＴＧに変形）製作用ベクター及び下記配列番号２３及び２４のプライマー対及び配列番号２５及び２６のプライマー対を用いてａｖｔＡ欠損菌株製作用ベクターを製作し、それぞれｐＤＺ－ａｖｔＡ（Ａ１ｇ）、ｐＤＺ－ａｖｔＡ（ｄｅｌ）と命名した。
バリン高生産能の菌株を製作するために、ａｖｔＡを弱化（ａｖｔＡ遺伝子の開始コドンをＧＴＧに変形）または欠損させようとした。これに、下記配列番号１９及び２０のプライマー対及び配列番号２１及び２２のプライマ一対を用いてａｖｔＡ弱化菌株（ａｖｔＡ遺伝子の開始コドンをＧＴＧに変形）製作用ベクター及び下記配列番号２３及び２４のプライマー対及び配列番号２５及び２６のプライマー対を用いてａｖｔＡ欠損菌株製作用ベクターを製作し、それぞれｐＤＺ－ａｖｔＡ（Ａ１ｇ）、ｐＤＺ－ａｖｔＡ（ｄｅｌ）と命名した。
【0112】
具体的には、ａｖｔＡ弱化ベクター（ｐＤＺ－ａｖｔＡ（Ａ１ｇ））を製作するために、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型ＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１９と配列番号２０のプライマー対及び配列番号２１及び２２のプライマーセットを用いて９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で６０秒の重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応の条件でＰＣＲを行った。それぞれの得られた断片を鋳型とし、配列番号１９と配列番号２２のプライマー対を用いてオーバーラッピング（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを行い、得られた変異導入断片４を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で処理した後、同一の制限酵素で処理されたｐＤＺベクターにＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）でライゲーションしてｐＤＺ－ａｖｔＡ（Ａ１ｇ）ＤＮＡを製作した。
【0113】
ａｖｔＡ欠損ベクター（ｐＤＺ－ａｖｔＡ（ｄｅｌ））を製作するために、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型ＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２３と配列番号２４のプライマー対及び配列番号２５及び２６のプライマー対を用いて９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で６０秒の重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応の条件でＰＣＲを行った。それぞれの得られた断片を鋳型とし、配列番号２３と配列番号２６のプライマー対を用いてオーバーラッピング（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを行い、得られた変異導入断片５を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で処理した後、同一の制限酵素で処理されたｐＤＺベクターにＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）でライゲーションしてｐＤＺ－ａｖｔＡ（ｄｅｌ）ベクターＤＮＡを製作した。
【0114】
ａｖｔＡ弱化及び欠損菌株ベクター製作プライマー配列
【表5】
【0115】
その後、ｐＤＺ－ａｖｔＡ（ｄｅｌ）、ｐＤＺ－ａｖｔＡ（Ａ１ｇ）をバリン生産菌株であるＣＪ７Ｖ：ｉｌｖＤ、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤにそれぞれ形質転換させ、染色体上で相同性組換えを誘導した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５， １９９９）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。
【0116】
その後、前記で選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、それぞれ配列番号１９及び２０、配列番号２１及び２２、配列番号２３及び２４、配列番号２５及び２６のプライマー対を用いたＰＣＲを通じて遺伝子断片を増幅した後、前記実施例１と同様な方法で遺伝子配列の分析を通じて変異が正確に導入されていることを確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカム ＣＪ７Ｖ：ｉｌｖＤ－ａｖｔＡ（ｄｅｌ）、ＣＪ７Ｖ：ｉｌｖＤ－ａｖｔＡ（ａ１ｇ）、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ－ａｖｔＡ（ｄｅｌ）、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ－ａｖｔＡ（ａ１ｇ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤ－ａｖｔＡ（ｄｅｌ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤ－ａｖｔＡ（ａ１ｇ）と下記のように命名し、実施例１と同様の方法で力価評価を行った。
【0117】
ａｖｔＡ欠損及び弱化菌株Ｌ－バリン生産能
【表6】
【0118】
前記結果から見られるように、ａｖｔＡ欠損の場合、バリン生産能強化の効果があり、ａｖｔＡ発現を弱化させた場合には、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ－ａｖｔＡ（ａ１ｇ）菌株でＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ菌株比バリン生産能の増加を確認し、対照菌であるｉｌｖＤ強化菌株と同等またはそれ以上の水準のバリン生産能を示した。表４におけるＣＪ７Ｖ、ＣＪ８Ｖ及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株と比較すると、ｉｌｖＤ強化及びａｖｔＡ欠損や弱化の場合、いずれもバリン生産能が強化されたことを確認した。
【0119】
実施例２－３．ａｃｅＥ欠損及び弱化（ａ１ｇ、Ｑ４３２Ａ、Ｋ４３５Ａ）菌株の製作及び評価
バリン高生産能の菌株を製作するために、ａｃｅＥを弱化または欠損させることにした。これにａｃｅＥが弱化した菌株を製作するために、配列番号２７及び２８、配列番号２９及び３０のプライマー対を用いてａｃｅＥ遺伝子の開始コドンＧＴＧに変形された菌株製作用ベクターを下記配列番号２７及び３２、配列番号３３及び３６のプライマー対を用いてａｃｅＥ（Ｑ４３２Ａ）菌株製作用ベクター及び配列番号２７及び３４、配列番号３５及び３６のプライマー対を用いてａｃｅＥ（Ｋ４３５Ａ）菌株製作用ベクターを製作し、また、配列番号３７及び３８、配列番号３９及び４０のプライマー対を用いてａｃｅ欠損（ａｃｅＥ（ｄｅｌ））菌株製作用ベクターを製作した。前記製作されたベクターをそれぞれｐＤＺ－ａｃｅＥ（Ａ１ｇ）、ｐＤＺ－ａｃｅＥ（Ｑ４３２Ａ）、ｐＤＺ－ａｃｅＥ（Ｋ４３５Ａ）、ｐＤＺ－ａｃｅＥ（ｄｅｌ）と命名した。
バリン高生産能の菌株を製作するために、ａｃｅＥを弱化または欠損させることにした。これにａｃｅＥが弱化した菌株を製作するために、配列番号２７及び２８、配列番号２９及び３０のプライマー対を用いてａｃｅＥ遺伝子の開始コドンＧＴＧに変形された菌株製作用ベクターを下記配列番号２７及び３２、配列番号３３及び３６のプライマー対を用いてａｃｅＥ（Ｑ４３２Ａ）菌株製作用ベクター及び配列番号２７及び３４、配列番号３５及び３６のプライマー対を用いてａｃｅＥ（Ｋ４３５Ａ）菌株製作用ベクターを製作し、また、配列番号３７及び３８、配列番号３９及び４０のプライマー対を用いてａｃｅ欠損（ａｃｅＥ（ｄｅｌ））菌株製作用ベクターを製作した。前記製作されたベクターをそれぞれｐＤＺ－ａｃｅＥ（Ａ１ｇ）、ｐＤＺ－ａｃｅＥ（Ｑ４３２Ａ）、ｐＤＺ－ａｃｅＥ（Ｋ４３５Ａ）、ｐＤＺ－ａｃｅＥ（ｄｅｌ）と命名した。
【0120】
具体的には、ａｃｅＥの開始コドンを弱化するベクターを製作するために、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型ＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７と配列番号２８のプライマー対及び配列番号２９と配列番号３０を用いて９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で６０秒の重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応の条件でＰＣＲを行った。それぞれの得られた断片を鋳型とし、配列番号２７と配列番号３０のプライマー対を用いてオーバーラッピング（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを行い、得られた変異導入断片６を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で処理した後、同一の制限酵素で処理されたｐＤＺベクターにＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いてライゲーションしてＰＤＺ－ａｃｅＥ（Ａ１ｇ）ベクターＤＮＡを製作した。
【0121】
ａｃｅＥ（Ｑ４３２Ａ）変異を導入するベクターを製作するために、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型ＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７と配列番号２８及び配列番号３３と配列番号３６のプライマー対を用いて９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で６０秒の重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応の条件でＰＣＲを行った。それぞれの得られた断片を鋳型とし、配列番号２７と配列番号３６のプライマー対を用いてオーバーラッピング（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを行い、得られた変異導入断片７を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で処理した後、同一の制限酵素で処理されたｐＤＺベクターにＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いてライゲーションしてＰＤＺ－ａｃｅＥ（Ｑ４３２Ａ）ベクターＤＮＡを製作した。
【0122】
ａｃｅＥ（Ｋ４３５Ａ）変異を導入するベクターを製作するために、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型ＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７と配列番号３４及び配列番号３５と配列番号３６のプライマー対を用いて９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で６０秒の重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応の条件でＰＣＲを行った。それぞれの得られた断片を鋳型とし、配列番号２７と配列番号３６のプライマー対を用いてオーバーラッピング（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを行い、得られた変異導入断片８を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で処理した後、同一の制限酵素で処理されたｐＤＺベクターにＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いてライゲーションしてｐＤＺ－ａｃｅＥ（Ｋ４３５Ａ）ベクターＤＮＡを製作した。
【0123】
ａｃｅＥ（ｄｅｌ）変異を導入するベクターを製作するために、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型ＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３７と配列番号３８及び配列番号３９と配列番号４０のプライマー対を用いて９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で６０秒の重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応の条件でＰＣＲを行った。それぞれの得られた断片を鋳型とし、配列番号３７と配列番号４０のプライマー対を用いてオーバーラッピング（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを行い、得られた変異導入断片９を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で処理した後、同一の制限酵素で処理されたｐＤＺベクターとＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いてライゲーションしてＰＤＺ－ａｃｅＥ（ｄｅｌ）ベクターＤＮＡを製作した。
【0124】
ａｃｅＥ欠損及び弱化菌株ベクター製作プライマー配列
【表7】
【0125】
その後、ｐＤＺ－ａｃｅＥ（ｄｅｌ）、ｐＤＺ－ａｃｅＥ（Ａ１ｇ）、ｐＤＺ－ａｃｅＥ（Ｑ４３２Ａ）、ｐＤＺ－ａｃｅＥ（Ｋ４３５Ａ）をバリン生産菌株であるＣＪ７Ｖ：ｉｌｖＤ、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤにそれぞれ形質転換させ、染色体上で相同性組換えを誘導した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５， １９９９）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。
【0126】
その後、前記で選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号２７と配列番号３６のプライマー対を用いたＰＣＲを通じて遺伝子断片を増幅した後、遺伝子配列の分析を通じて変異が正確に導入されていることを確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖ：ｉｌｖＤ－ａｃｅＥ（ｄｅｌ）、ＣＪ７Ｖ：ｉｌｖＤ－ａｃｅＥ（ａ１ｇ）、ＣＪ７Ｖ：ｉｌｖＤ－ａｃｅＥ（Ｑ４３２Ａ）、ＣＪ７Ｖ：ｉｌｖＤ－ａｃｅＥ（Ｋ４３５Ａ）、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ－ａｃｅＥ（ｄｅｌ）、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ－ａｃｅＥ（ａ１ｇ）、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ－ａｃｅＥ（Ｑ４３２Ａ）、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ－ａｃｅＥ（Ｋ４３５Ａ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤ－ａｃｅＥ（ｄｅｌ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤ－ａｃｅＥ（ａ１ｇ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤ－ａｃｅＥ（Ｑ４３２Ａ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤ－ａｃｅＥ（Ｋ４３５Ａ）と下記のように命名し、実施例１と同様の方法で力価評価を行った。
【0127】
ａｃｅＥ欠損及び弱化菌株Ｌ－バリン生産能
【表8】
【0128】
前記結果から見られるように、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）の活性が強化された菌株においてａｃｅＥが追加で欠損した菌株の場合、生育及び糖消耗速度が急激に低下してバリン生産能が減少した。これに対し、ａｃｅＥが弱化された菌株の場合、弱化程度に応じて差があるものの、生育及び糖消耗速度の低下がわずかであり、バリン生産能が増加することを確認した。
【0129】
実施例２－４．ｇｌｔＡ弱化（ａ１ｇ、Ｎ２４１Ｔ、Ｍ３１２Ｉ）菌株の製作及び評価
バリン高生産能の菌株を製作するために、ｇｌｔＡを弱化させようとした。これに配列番号４１及び４２、配列番号４３及び４４のプライマー対を用いてｇｌｔＡ遺伝子の開始コドンがＧＴＧに変形されたｇｌｔＡ弱化菌株製作用ベクター、配列番号４５及び４６、配列番号４７及び５０のプライマー対を用いてｇｌｔＡ（Ｎ２４１Ｔ）菌株製作用ベクター及び配列番号４５及び４８、配列番号４９及び５０のプライマー対を用いてｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）菌株製作用ベクターを製作し、それぞれそれぞれ、ｐＤＺｇｌｔＡ（Ａ１ｇ）、ｐＤＺ－ｇｌｔＡ（Ｎ２４１Ｔ）、ｐＤＺ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）と命名した。
バリン高生産能の菌株を製作するために、ｇｌｔＡを弱化させようとした。これに配列番号４１及び４２、配列番号４３及び４４のプライマー対を用いてｇｌｔＡ遺伝子の開始コドンがＧＴＧに変形されたｇｌｔＡ弱化菌株製作用ベクター、配列番号４５及び４６、配列番号４７及び５０のプライマー対を用いてｇｌｔＡ（Ｎ２４１Ｔ）菌株製作用ベクター及び配列番号４５及び４８、配列番号４９及び５０のプライマー対を用いてｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）菌株製作用ベクターを製作し、それぞれそれぞれ、ｐＤＺｇｌｔＡ（Ａ１ｇ）、ｐＤＺ－ｇｌｔＡ（Ｎ２４１Ｔ）、ｐＤＺ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）と命名した。
【0130】
ｇｌｔＡ開始コドン弱化変異を導入するベクターを作製するために、コドンコリネバクテリウム・グルタミカム野生型ＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４１と配列番号４２及び配列番号４３と配列番号４４のプライマー対を用いて９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で６０秒の重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応の条件でＰＣＲを行った。それぞれの得られた断片（Ａ、Ｂ）を鋳型とし、配列番号４１と配列番号４４のプライマー対を用いてオーバーラッピング（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを行い、得られた変異導入断片１０を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で処理した後、同一の制限酵素で処理されたｐＤＺベクターにＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）でライゲーションしてｐＤＺ－ｇｌｔＡ（Ａ１ｇ）ベクターＤＮＡを製作した。
【0131】
ｇｌｔＡ（Ｎ２４１Ｔ）変異を導入するベクターを製作するために、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型ＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４５と配列番号４６及び配列番号４７と配列番号５０のプライマー対を用いて９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で６０秒の重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応の条件でＰＣＲを行った。それぞれの得られた断片（Ａ、Ｂ）を鋳型とし、配列番号４５と配列番号５０のプライマー対を用いてオーバーラッピング（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを行い、得られた変異導入断片１１を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で処理した後、同一の制限酵素で処理されたｐＤＺベクターにＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）でライゲーションしてｐＤＺ－ｇｌｔＡ（Ｎ２４１Ｔ）ベクターＤＮＡを製作した。
【0132】
ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）変異を導入するベクターを製作するために、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型ＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４５と配列番号４８及び配列番号４９と配列番号５０のプライマー対を用いて９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で６０秒の重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応の条件でＰＣＲを行った。それぞれの得られた断片（Ａ、Ｂ）を鋳型とし、配列番号４５と配列番号５０のプライマー対を用いてオーバーラッピング（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを行い、得られた変異導入断片１２を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で処理した後、同一の制限酵素で処理されたｐＤＺベクターにＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）でライゲーションしてｐＤＺ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）ベクターＤＮＡを製作した。
【0133】
ｇｌｔＡ弱化菌株ベクター製作プライマー配列
【表9】
【0134】
その後、ｐＤＺ－ｇｌｔＡ（Ａ１ｇ）、ｐＤＺ－ｇｌｔＡ（Ｎ２４１Ｔ），ｐＤＺ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）をバリン生産菌株であるＣＪ７Ｖ：ｉｌｖＤ、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤにそれぞれ形質転換させ、染色体上で相同性組換えを誘導した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５， １９９９）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。
【0135】
その後、前記で選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号４５と配列番号５０のプライマー対を用いたＰＣＲを通じて遺伝子断片を増幅した後、遺伝子配列の分析を通じて変異が正確に導入されていることを確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ（ａ１ｇ）、ＣＪ７Ｖ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ（Ｎ２４１Ｔ）、ＣＪ７Ｖ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ（ａ１ｇ）、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ（Ｎ２４１Ｔ）、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ（ａ１ｇ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ（Ｎ２４１Ｔ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ（Ｍ３１２Ｉ）と命名し、実施例１と同様の方法で力価評価行った。
【0136】
ｇｌｔＡ弱化菌株Ｌ－バリン生産能
【表10】
【0137】
前記結果から見られるように、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）の活性が強化された菌株でｇｌｔＡ弱化菌株の場合、弱化程度に応じて差があるものの、生育及び糖消耗速度が低下がわずかであり、バリン生産能が増加することを確認した。
【0138】
実施例２－５．有効変異形質組合わせ菌株の製作及び評価
前記実施例２－２～２－４で確認した結果から各変異の多様な組合わせ時にバリン生産能にシナジー効果があるかを確認することにした。ｐＤＺ－ａｖｔＡ（ｄｅｌ）、ｐＤＺ－ａｃｅＥ（Ｋ４３５Ａ）ベクターを実施例２－４で製作したバリン生産菌株であるＣＪ７Ｖ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ弱化（Ｎ２４１Ｔ）、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ弱化（Ｎ２４１Ｔ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ弱化（Ｎ２４１Ｔ）にそれぞれ形質転換させた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５， １９９９）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。
前記実施例２－２～２－４で確認した結果から各変異の多様な組合わせ時にバリン生産能にシナジー効果があるかを確認することにした。ｐＤＺ－ａｖｔＡ（ｄｅｌ）、ｐＤＺ－ａｃｅＥ（Ｋ４３５Ａ）ベクターを実施例２－４で製作したバリン生産菌株であるＣＪ７Ｖ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ弱化（Ｎ２４１Ｔ）、ＣＪ８Ｖ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ弱化（Ｎ２４１Ｔ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ弱化（Ｎ２４１Ｔ）にそれぞれ形質転換させた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５， １９９９）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。
【0139】
その後、２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号２３と配列番号２６のプライマー対及び配列番号２７と配列番号３６のプライマー対を用いたＰＣＲを通じて遺伝子断片を増幅した後、遺伝子配列の分析を通じて変異挿入菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカム下記のように命名し、実施例１と同様の方法で力価評価を行った。
【0140】
有効組合わせ菌株Ｌ－バリン生産能
【表11】
【0141】
前記結果から見られるように、ｉ１ｖＤ強化及びｇｌｔＡ弱化形質にａｃｅＥ弱化形質及びａｖｔＡ欠損形質がそれぞれ導入されたとき、生育及び糖消耗速度は同等水準であり、バリン生産能がさらに増加することを確認した。
【0142】
前記においてｐＤＺ－ａｃｅＥ（Ｋ４３５Ａ）ベクターをＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：ｉｌｖＤ－ｇｌｔＡ弱化（Ｎ２４１Ｔ）菌株に形質転換させ、相同性配列の組換えにより染色体上にａｃｅ（Ｋ４３５Ａ）変異が導入された菌株をＣＡ０８－１５９２と命名し、２０２０年７月３日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に国際寄託してＫＣＣＭ１２７６１Ｐとして寄託番号の付与を受けた。
【0143】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【0144】
【表12】
【手続補正書】
【提出日】2023-03-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-03-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0144】
【表12】
（態様１）
強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）の活性；及び下記（１）～（３）から選択されるいずれか一つ以上の組合わせを有する、Ｌ－バリン生産微生物。
（１）減少したトランスアミナーゼＣ（ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ Ｃ）の活性
（２）弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の活性
（３）減少したクエン酸シンターゼ（Ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性
（態様２）
前記微生物は、強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性；及び減少したトランスアミナーゼＣの活性を有する、態様１に記載の微生物。
（態様３）
前記微生物は、強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性；及び弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を有する、態様１に記載の微生物。
（態様４）
前記微生物は、強化されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性；及び減少したクエン酸シンターゼの活性を有する、態様１に記載の微生物。
（態様５）
前記微生物は、減少したトランスアミナーゼＣの活性または弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性をさらに有する、態様４に記載の微生物。
（態様６）
前記ジヒドロキシ酸デヒドラターゼは、ｉｌｖＤ遺伝子によりコードされる、態様１に記載の微生物。
（態様７）
前記トランスアミナーゼＣは、ａｖｔＡ遺伝子によりコードされる、態様１に記載の微生物。
（態様８）
前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、ａｃｅＥ遺伝子によりコードされる、態様１に記載の微生物。
（態様９）
前記クエン酸シンターゼは、ｇｌｔＡ遺伝子によりコードされる、態様１に記載の微生物。
（態様１０）
前記弱化したピルビン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端から４３２番目または４３５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものである、態様１に記載の微生物。
（態様１１）
前記減少したクエン酸シンターゼは、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端から２４１番目または３１２番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものである、態様１に記載の微生物。
（態様１２）
前記Ｌ－バリン生産微生物は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）である、態様１に記載の微生物。
（態様１３）
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、態様１２に記載の微生物。
（態様１４）
態様１～１３のいずれか一項に記載の微生物を培養する段階を含む、Ｌ－バリンの生産方法。
（態様１５）
前記培養された微生物または培地からＬ－バリンを回収する段階をさらに含む、態様１４に記載のＬ－バリンの生産方法。
【国際調査報告】