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特表2023-540754非結合型ビリルビンのためのマイクロ流体に基づく検定評価
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-26
(54)【発明の名称】非結合型ビリルビンのためのマイクロ流体に基づく検定評価
(51)【国際特許分類】
G01N 1/00 20060101AFI20230919BHJP
G01N 37/00 20060101ALI20230919BHJP
G01N 33/72 20060101ALI20230919BHJP
【ＦＩ】
G01N1/00 101F
G01N37/00 101
G01N33/72 B
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023514971
(86)(22)【出願日】2021-09-07
(85)【翻訳文提出日】2023-04-13
(86)【国際出願番号】 US2021049203
(87)【国際公開番号】W WO2022051703
(87)【国際公開日】2022-03-10
(31)【優先権主張番号】63/074,580
(32)【優先日】2020-09-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/123,138
(32)【優先日】2020-12-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518371445
【氏名又は名称】バービーズ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＥＢＩＥＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100167623
【弁理士】
【氏名又は名称】塚中 哲雄
(72)【発明者】
【氏名】マイケル エイ バスマジアン
(72)【発明者】
【氏名】ジェニファー エルダーブルーム
(72)【発明者】
【氏名】マイスリ クリシュナムルティ
(72)【発明者】
【氏名】エリック ブルデ
(72)【発明者】
【氏名】マイケル ボソ
(72)【発明者】
【氏名】ダニエル ハル
(72)【発明者】
【氏名】レイナー ウン
(72)【発明者】
【氏名】ビジェイ スリニバサン
(72)【発明者】
【氏名】ラマクリシュナ シスタ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァムシー パムラ
【テーマコード（参考）】
2G045
2G052
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CA25
2G045CA26
2G045DA53
2G045FB01
2G045FB12
2G045HA01
2G045HA10
2G045JA07
2G052AA30
2G052AB16
2G052AD06
2G052AD26
2G052AD46
2G052CA03
2G052CA04
2G052CA08
2G052DA05
2G052DA22
2G052DA23
2G052GA28
2G052GA29
2G052HA12
2G052HA19
2G052HC03
2G052HC06
2G052HC32
2G052HC42
2G052JA06
2G052JA07
2G052JA08
2G052JA13
(57)【要約】
血液試料をマイクロ流体デバイスに装填することと、血液試料を、界面活性剤を含む緩衝試薬と結合させて、希釈された血液試料を提供し、検定評価を行うこととによって、血液試料中の分析物を検定評価する方法。界面活性剤は、血液試料を使用した液滴操作を行うように、電気湿潤の使用を許可し、かつ、蛍光に基づく液滴操作の使用を許可するように選択される。検定評価は、非結合型ビリルビン検定評価であることができる。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血液試料中の分析物を検定評価する方法であって、ａ．検定評価される１つ以上の分析物を含む血液試料をマイクロ流体デバイスに装填することと、
ｂ．前記血液試料を、界面活性剤を含む緩衝試薬と結合させて、希釈された血液試料を提供することであって、前記界面活性剤は、前記血液試料を使用した液滴操作を行うよう電気湿潤を可能とするように選択されることと、
ｃ．前記希釈された血液試料から１つ以上の試料液滴を前記マイクロ流体デバイスの液滴操作ギャップに分注することであって、前記ギャップがオイル填隙剤液体を含むことによって、希釈された血液試料液滴を提供することと、
ｄ．希釈された血液試料液滴を検定評価反応ゾーンに移送することと、
ｅ．生化学的検定評価を開始することと、
ｆ．任意に、ステップ（ｄ）および（ｅ）を１回以上繰り返すことと、
を含む、方法。
【請求項2】
前記血液試料は、全血試料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
更に、前記希釈された血液試料を処理して、検定評価される１つ以上の分析物を含む処理済み血液試料を提供することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記処理は、前記希釈された血液試料を溶解することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記処理済み血液試料は、血液成分を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記血液成分は、血漿を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記緩衝試薬は、更に、グルコース試薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記界面活性剤は、前記全血試料の有意な溶解を引き起こすことなく、全血試料液滴を電気湿潤することを提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記界面活性剤は、蛍光信号を最小化または排除するように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記非イオン性界面活性剤は、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
前記界面活性剤は、双性イオン界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記双性イオン界面活性剤は、１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記生化学的検定評価は、血漿液滴中の非結合型ビリルビンを測定するための酵素的蛍光に基づく検定評価である、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
血漿液滴中の非結合型ビリルビンを測定する方法であって、ａ．グルコース緩衝剤を含む血漿液滴と、電気湿潤媒介液滴操作を使用して蛍光に基づく非結合型ビリルビン検定評価を実施して、検定評価ステップを実行するのに適した界面活性剤とを提供することと、
ｂ．前記血漿液滴を少なくとも３つの試料液滴に分裂させ、前記非結合型ビリルビン検定評価を開始することであって、
ｉ．第１の試料液滴を緩衝剤液滴と結合させて、対照反応液滴を提供し、
ｉｉ．第２の試料液滴を酵素試薬液滴と結合させて、短い反応液滴を提供し、
ｉｉｉ．第３の試料液滴を第２の酵素試薬液滴と結合させて、長い反応液滴を提供する
ことと、
ｃ．時間ｔ１にて、前記対照反応液滴および前記短い反応液滴を停止反応液滴と結合させて、対照反応液滴および短い反応液滴を提供し、前記短い反応液滴中のあらゆる非結合型ビリルビンを酸化することによって、ｔ１分解物液滴を提供することと、
ｄ．時間ｔ２にて、前記長い反応液滴を停止反応液滴と結合させて、長い反応液滴を提供し、前記長い反応液滴中に残っているあらゆる非結合型ビリルビンを酸化することによって、ｔ２分解物液滴を提供することと、
ｅ．前記対照反応液滴、ｔ１分解物液滴、およびｔ２分解物液滴を緩衝試薬で希釈して、検出試薬と結合するための希釈された対照反応液滴、希釈されたｔ１分解物液滴、および希釈されたｔ２分解物液滴を提供することと、
ｆ．前記希釈された対照反応液滴、ｔ１分解物液滴、およびｔ２分解物液滴を検出試薬と結合させて、対照／検出試薬液滴、短い反応／検出試薬液滴および長い反応／検出試薬液滴を提供することと、
ｇ．前記対照／検出試薬液滴、短い反応／検出試薬液滴、および長い反応／検出試薬液滴中の反応生成物を検出して、前記血漿液滴中の非結合型ビリルビンの量を決定することと、
を含む、方法。
【請求項17】
前記酵素試薬液滴は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）およびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記停止反応液滴は、アスコルビン酸を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
時間ｔ１は、約４８秒である、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
前記時間ｔ２は、約１２０秒である、請求項１６に記載の方法。
【請求項21】
希釈された各反応液滴を検出試薬と結合させることは、希釈された反応液滴を、乾燥検出試薬を含む特定の液滴操作電極に移送し、前記乾燥検出試薬を再構成することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項22】
非結合型ビリルビンを検出するための前記乾燥検出試薬は、ＵｎａＧである、請求項１６に記載の方法。
【請求項23】
反応生成物の検出は、ＵｎａＧ蛍光信号を測定することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項24】
前記血漿液滴中の非結合型ビリルビンの前記量を決定することは、前記対照／検出試薬液滴と、短いおよび長い反応／検出試薬液滴との間の前記ＵｎａＧ蛍光信号の差を決定することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項25】
血液試料中の分析物を検定評価する方法であって、ａ．血液試料または希釈された血液試料から１つ以上の試料液滴を前記マイクロ流体デバイスの液滴操作ギャップに分注することと、
ｂ．前記１つ以上の試料液滴のそれぞれに対して生化学的検定評価を開始して、前記希釈された血液試料液滴中の非結合型ビリルビンを検出することと、
を含む、方法。
【請求項26】
前記試料液滴はそれぞれ、約５ｍＬ未満の体積を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記マイクロ流体デバイスは、電気湿潤カートリッジを含み、前記装填すること、結合すること、分注すること、および／または開始することは、電気湿潤媒介液滴操作を使用して実行される、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
前記血液試料は、全血、血漿または血清である、請求項２５に記載の方法。
【請求項29】
コンピュータプロセッサおよび電気湿潤カートリッジを備えるシステムであって、前記プロセッサが前述した請求項のいずれか一項に記載の前記方法を実行するようにプログラムされている、システム。
【請求項30】
電気湿潤カートリッジと、前述した請求項のいずれか一項に記載の前記方法を実行するのに十分な試薬とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
(関連出願の相互参照)
本出願は、２０２０年９月４日に出願された米国仮特許出願第６３／０７４５８０号および２０２０年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６３／１２３１３８号の優先権および利益を主張するものであり、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年９月４日に出願された米国仮特許出願第６３／０７４５８０号および２０２０年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６３／１２３１３８号の優先権および利益を主張するものであり、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
主題は、血液中の高ビリルビンレベル（高ビリルビン血症）について新生児をスクリーニングするためのデバイスおよび方法に関し、より具体的には、マイクロ流体プラットフォームを利用して、血液中の結合していない高レベルの非抱合型（間接）ビリルビンについて新生児をスクリーニングすることに関する。
【背景技術】
【0003】
ビリルビンスクリーニングは、血液中の高ビリルビンレベル（高ビリルビン血症）について新生児をスクリーニングする一般的な方法である。ビリルビンは、結合型および非結合型の２つの形態で血液中に存在し得る。結合型ビリルビンは、アルブミンに結合した非抱合型（または間接）ビリルビンである。非結合型ビリルビンには、アルブミンに結合していない非抱合型（間接）ビリルビンおよび抱合型（直接）ビリルビンが含まれる。新生児の場合、問題となり得るのは、高レベルの結合していない非抱合型（間接）ビリルビンであり、何故なら、分子が比較的小さく、血液脳関門を通過して核黄疸として知られる状態を引き起こし得るからである。
【0004】
血液試料中の非結合型ビリルビンを測定するために、様々な検定評価が開発されてきた。例えば、酸化分解反応を使用して、非結合型ビリルビンを酸化し、吸光度損失率を使用して試料中の非結合型ビリルビンの量を判定することができる（非特許文献１および非特許文献２、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。しかしながら、酸化分解法は、非抱合型ビリルビンに特異的なものではない。
【0005】
より最近では、非抱合型ビリルビンに特異的なタンパク質であるＵｎａＧを使用して非抱合型ビリルビンを検出するための蛍光に基づく方法が記載されている（非特許文献３、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。酸化分解とＵｎａＧ結合との組み合わせを使用した非結合型ビリルビンのスクリーニング方法が記載されている（「Measurement method for unbound bilirubin in blood sample」と題された特許文献１、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。しかしながら、非結合型（非抱合型）ビリルビンをスクリーニングするための現在の技術は、出生時の検査システムでは容易に提供されない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０６０３２７号明細書
【特許文献2】米国特許第６９１１１３２号明細書
【特許文献3】米国特許出願第１１／３４３２８４号明細書
【特許文献4】国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４７４８６号明細書
【特許文献5】米国特許第６７７３５６６号明細書
【特許文献6】米国特許第６５６５７２７号明細書
【特許文献7】米国特許出願第１０／３４３２６１号明細書
【特許文献8】米国特許出願第１１／２７５６６８号明細書
【特許文献9】米国特許出願第１１／４６０１８８号明細書
【特許文献10】米国特許出願第１２／４６５９３５号明細書
【特許文献11】米国特許出願第１２／５１３１５７号明細書
【特許文献12】米国特許第７５４７３８０号明細書
【特許文献13】米国特許第７１６３６１２号明細書
【特許文献14】米国特許第７６４１７７９号明細書
【特許文献15】米国特許第６９７７０３３号明細書
【特許文献16】米国特許第７３２８９７９号明細書
【特許文献17】米国特許出願公開第２００６／００３９８２３号明細書
【特許文献18】国際公開第２００９／００３１８４号パンフレット
【特許文献19】米国特許出願公開第２００９／０１９２０４４号明細書
【特許文献20】米国特許第７０５２２４４号明細書
【特許文献21】米国特許出願公開第２００８／０１２４２５２号明細書
【特許文献22】米国特許出願公開第２００９／０３２１２６２号明細書
【特許文献23】米国特許出願公開第２００５／０１７９７４６号明細書
【特許文献24】国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４０７０５号明細書
【特許文献25】米国特許第７７２７４６６号明細書
【特許文献26】国際公開第２００８／１０１１９４号パンフレット
【特許文献27】米国特許出願公開第２０１１／０１１８１３２号明細書
【特許文献28】国際公開第２０１０／０２７８９４号パンフレット
【特許文献29】国際公開第２００９／０２１１７３号パンフレット
【特許文献30】国際公開第２００８／０９８２３６号パンフレット
【特許文献31】米国特許出願公開第２００８／０２８３４１４号明細書
【特許文献32】国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７２６０４号明細書
【特許文献33】国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３０４２５号明細書
【特許文献34】国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０６０３２７号明細書
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Jacobsen, J. and R.P. Wennberg, Clin Chem. (1974) 20(7):783
【非特許文献2】Nakamura, H., and Y. Lee, Clin Chim Acta. (1977) 79(2): 411-417
【非特許文献3】Kumagai, A., et. al., Cell (2013) 153:1602-1611
【非特許文献4】Dhindsa et al., “Virtual Electrowetting Channels: Electronic Liquid Transport with Continuous Channel Functionality,” Lab Chip, 10:832-836 (2010)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、血液試料中の非結合型ビリルビンを検定評価する方法を提供する。この方法は、血液試料または希釈された血液試料から１つ以上の試料液滴をマイクロ流体デバイスの液滴操作ギャップに分注することを含むことができる。この方法は、１つ以上の試料液滴のそれぞれに対して生化学的検定評価を開始することで、希釈された血液試料液滴中の非結合型ビリルビンを検出することを含み得る。試料液滴は、例えば、それぞれ約５ｍＬ未満の体積を有することができる。マイクロ流体デバイスは、電気湿潤カートリッジであってもよい。装填すること、結合すること、分注すること、および／または開始することは、電気湿潤媒介液滴操作を使用して実行することができる。血液試料は、例えば、全血、血漿あるいは血清、または前述のいずれかの処理済みまたは希釈されたバージョンであることができる。
【0009】
本発明は、血液試料中の分析物を検定評価する方法を提供する。この方法は、例えば、検定評価される１つ以上の分析物を有する血液試料をマイクロ流体デバイス上に装填することを含むことができる。この方法は、例えば、血液試料を、界面活性剤を有する緩衝試薬と結合させて、希釈された血液試料を提供することを含むことができ、界面活性剤は、例えば、電気湿潤により、血液試料を使用して液滴操作を行うことを可能にするように選択することができる。この方法は、例えば、希釈された血液試料から１つ以上の試料液滴をマイクロ流体デバイスの液滴操作ギャップに分注することを含むことができ、このギャップがオイル填隙剤液体を有することによって、希釈された血液試料液滴を提供する。この方法は、例えば、希釈された血液試料液滴を検定評価反応ゾーンに移送することを含むことができる。この方法は、例えば、生化学的検定評価を開始することを含むことができる。緩衝試薬は、例えば、グルコース試薬を含み得る。
【0010】
血液試料は、例えば、全血試料を含み得る。この方法は、例えば、希釈された血液試料を処理して、検定評価される１つ以上の分析物を有する処理済み血液試料を提供することを含み得る。処理は、例えば、希釈された血液試料を溶解することを含み得る。処理済み血液試料は、例えば、血液成分を含み得る。血液成分は、例えば、血漿であることができる。
【0011】
界面活性剤は、例えば、全血試料の有意な溶解を引き起こすことなく、全血試料液滴の電気湿潤を可能にするように選択することができる。界面活性剤は、例えば、蛍光信号を最小化または除去するように選択することができる。界面活性剤は、例えば、非イオン性界面活性剤を含み得る。非イオン性界面活性剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含み得る。非イオン性界面活性剤は、例えば、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭを含み得る。界面活性剤は、例えば、双性イオン界面活性剤を含み得る。双性イオン界面活性剤は、例えば、１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣを含み得る。
【0012】
生化学的検定評価は、例えば、血漿液滴中の非結合型ビリルビンを測定するための酵素的蛍光に基づく検定評価であることができる。
【0013】
この方法は、血漿液滴中の非結合型ビリルビンを測定する方法を提供する。この方法は、例えば、グルコース緩衝剤を有する血漿液滴と、電気湿潤媒介液滴操作を使用して蛍光に基づく非結合型ビリルビン検定評価を実行して、検定評価ステップを実行するのに適した界面活性剤とを提供することを含み得る。この方法は、例えば、血漿液滴を少なくとも３つの試料液滴に分裂させ、非結合型ビリルビン検定評価を開始することを含み得る。第１の試料液滴は、例えば、緩衝液滴と結合させて、対照反応液滴を提供することができる。第２の試料液滴は、例えば、酵素試薬液滴と結合させて、短い反応液滴を提供することができる。第３の試料液滴は、例えば、第２の酵素試薬液滴と結合させて、長い反応液滴を提供することができる。この方法は、例えば、時間ｔ１にて、対照反応液滴および短い反応液滴を停止反応液滴と結合させて、対照反応液滴および短い反応液滴を提供することを含むことができ、短い反応液滴中のあらゆる非結合型ビリルビンを、例えば、酸化することによって、ｔ１分解物液滴を提供することができる。この方法は、例えば、時間ｔ２にて、長い反応液滴を停止反応液滴と結合させて、長い反応液滴を提供することを含むことができ、長い反応液滴中に残っているあらゆる非結合型ビリルビンを、例えば、酸化することによって、ｔ２分解物液滴を提供することができる。この方法は、例えば、対照反応液滴、ｔ１分解物液滴およびｔ２分解物液滴を緩衝試薬で希釈して、検出試薬と結合させるための希釈された対照反応液滴、希釈されたｔ１分解物液滴、および希釈されたｔ２分解物液滴を提供することを含むことができる。この方法は、例えば、希釈された対照反応液滴、ｔ１分解物液滴、およびｔ２分解物液滴を検出試薬と結合させて、対照／検出試薬液滴、短い反応／検出試薬液滴および長い反応／検出試薬液滴を提供することを含み得る。この方法は、例えば、対照／検出試薬液滴、短い反応／検出試薬液滴、および長い反応／検出試薬液滴中の反応生成物を検出して、血漿液滴中の非結合型ビリルビンの量を決定することを含み得る。
【0014】
酵素試薬液滴は、例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）およびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を含み得る。停止反応液滴は、例えば、アスコルビン酸を含み得る。時間ｔ１は、例えば、約４８秒であることができる。時間ｔ２は、例えば、約１２０秒であることができる。
【0015】
希釈された各反応液滴を検出試薬と結合させることは、例えば、希釈された反応液滴を、乾燥検出試薬を有する特定の液滴操作電極に移送し、乾燥検出試薬を再構成することを含み得る。非結合型ビリルビンを検出するための乾燥検出試薬は、例えば、ＵｎａＧであり得る。反応生成物を検出することは、例えば、ＵｎａＧ蛍光信号を測定することを含み得る。
【0016】
血漿液滴中の非結合型ビリルビンの量を決定することは、例えば、対照／検出試薬液滴と、短いおよび長い反応／検出試薬液滴との間のＵｎａＧ蛍光信号の差を決定することを含み得る。
【0017】
本発明は、コンピュータプロセッサおよび電気湿潤カートリッジを有するシステムを提供し、プロセッサは、例えば、本発明の方法のうちのいずれか１つの方法をカートリッジ上で実行するようにプログラムすることができる。カートリッジは、例えば、電気湿潤媒介液滴操作デバイスであってもよい。本発明は、電気湿潤カートリッジと、本発明の方法のいずれかを電気湿潤媒介液滴操作デバイス上で実行するのに十分な試薬とを有するキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】液滴中で生化学的検定評価を実施するための、例示的なマイクロ流体デバイスの一部を示す断面図である。
【図2】マイクロ流体デバイス上で非結合型ビリルビンについてＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価を行うように構成された、液滴操作電極の配置例を示す概略図である。
【図3】マイクロ流体デバイス上でＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価を使用して血液試料中の非結合型ビリルビンを測定するための、例示的な方法を示すフローチャートである。
【図4】試験した９６個の洗浄剤に対する、ｔ＝３分におけるＲＦＵの％バイアスを示すプロット図である。
【図5】ＵｎａＧ－ビリルビン蛍光検定評価における干渉をスクリーニングするのに使用される、Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎキット中の９６個の洗浄剤のマイクロタイタープレートレイアウトを示す表である。
【図7】ｎ＝３５の選択範囲を狭められた界面活性剤のうちの一部のプライミング／分注検定評価のためのデータシートを示すスクリーンショットである。
【図8】変更された界面活性剤濃度を使用する、ｎ＝８の界面活性剤の第２の選択範囲を狭められたセットの電気湿潤検定評価のためのデータシートを示すスクリーンショットである。
【図9】図９Ａは、蛍光干渉をスクリーニングするのに使用される７個の界面活性剤および１２個の血漿試料についての対照からのパーセントバイアスを示す表である。図９Ｂは、試験した７個の界面活性剤についての、ｔ＝３分における界面活性剤なしの対照からのパーセントバイアスを示すプロット図である。
【図10】図１０Ａは、蛍光干渉をスクリーニングするのに使用される３個の界面活性剤および１０個の血漿試料についての、ｔ＝３分における対照からのパーセントバイアスを示す表である。図１０Ｂは、蛍光干渉をスクリーニングするのに使用される３個の界面活性剤および１０個の血漿試料についての、ｔ＝１０分における対照からのパーセントバイアスを示す表である。
【図11】変動性を検定評価するのに使用されるオンベンチ蛍光干渉検定評価についての経時的なＲＦＵを示す表である。
【図12】変更された蛍光干渉検定評価を使用して実施した、例示的なＵｎａＧ－ビリルビン結合測定を示すプロット図である。
【図13】図１３Ａは、５．５ｍｇ／ｄＬのＴＢＩＬ血漿試料および界面活性剤Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を使用した反応における、経時的なＲＦＵを示すプロット図である。図１３Ｂは、５．５ｍｇ／ｄＬのＴＢＩＬ血漿試料および界面活性剤Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭを使用した反応における、経時的なＲＦＵを示すプロット図である。
【図14】図１４Ａは、ＵｎａＧ蛍光検定評価におけるＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２０についての、ｔ＝３分における対照からのパーセントバイアスを示す表である。図１４Ｂは、ＵｎａＧ蛍光検定評価におけるＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２０についての、ｔ＝１０分における対照からのパーセントバイアスを示す表である。
【図15】図１５Ａは、１３．１ｍｇ／ｄＬのＴＢＩＬ血漿試料および界面活性剤なしの対照を使用した、ｎ＝２の反応についての、経時的なＲＦＵを示すプロット図である。図１５Ｂは、１３．１ｍｇ／ｄＬのＴＢＩＬ血漿試料および０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を使用した、ｎ＝２の反応についての、経時的なＲＦＵを示すプロット図である。図１５Ｃは、１３．１ｍｇ／ｄＬのＴＢＩＬ血漿試料および０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を使用した、ｎ＝２の反応についての、経時的なＲＦＵを示すプロット図である。
【図16】Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、およびＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭランについてのＧ６ＰＤ、アルブミン（ＡＬＢ）、およびＴＢＩＬの検定評価値を示す表である。
【図17】ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ蛍光検定評価におけるＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、およびＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭについての対照からのパーセントバイアスを示す表である。
【図18】図１８Ａは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０についてＡｒｒｏｗ ＵＢ Ａｎａｌｙｚｅｒが割り当てた値に対するＲＦＵ（対照－反応試料）値の比較を示すプロット図である。図１８Ｂは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０についてＡｒｒｏｗ ＵＢ Ａｎａｌｙｚｅｒが割り当てた値に対するＲＦＵ（対照－反応試料）値の比較を示すプロット図である。図１８Ｃは、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭについてＡｒｒｏｗ ＵＢ Ａｎａｌｙｚｅｒが割り当てた値に対するＲＦＵ（対照－反応試料）値の比較を示すプロット図である。
【図20】カートリッジ上で実施したＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価のＲＦＵ値と、オンベンチで実施したＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価の「対照－反応」ＲＦＵ値とを示す表である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
１．定義
本明細書で使用されている次の用語は、以下に示す意味を有する。
本明細書で使用されている次の用語は、以下に示す意味を有する。
【0020】
１つ以上の電極に関して「活性化する」とは、１つ以上の電極の電気的状態の変化に影響を及ぼすことを意味し、液滴の存在下では、液滴操作をもたらす。電極の活性化は、交流または直流を使用して実施することができる。任意の適切な電圧を使用することができる。例えば、電極は、約１５０Ｖを超える、または約２００Ｖを超える、または約２５０Ｖを超える、または約２７５Ｖ～約１０００Ｖ、または約３００Ｖの電圧を使用して活性化することができる。交流が使用される場合、任意の適切な周波数を使用することができる。例えば、電極は、約１Ｈｚ～約１０ＭＨｚ、または約１０Ｈｚ～約６０Ｈｚ、または約２０Ｈｚ～約４０Ｈｚ、または約３０Ｈｚの周波数を有する交流を使用して活性化することができる。
【0021】
「液滴アクチュエータ」は、液滴を操作するためのデバイスを意味する。液滴アクチュエータの例としては、２００５年６月２８日に発行された「Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting-Based Techniques」と題するＰａｍｕｌａ氏等の特許文献２；２００６年１月３０日に出願された「Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board」と題するＰａｍｕｌａ氏等の特許文献３；２００６年１２月１１日に出願された「Droplet-Based Biochemistry」と題するＰｏｌｌａｃｋ氏等の特許文献４；２００４年８月１０日に発行された「Electrostatic Actuators for Microfluidics and Methods for Using Same」と題するＳｈｅｎｄｅｒｏｖ氏の特許文献５および２０００年１月２４日に発行された「Actuators for Microfluidics Without Moving Parts」と題する特許文献６；２００３年１月２７日に出願された「Electrowetting-driven Micropumping」と題するＫｉｍおよび／またはＳｈａｈ氏等の特許文献７、２００６年１月２３日に出願された「Method and Apparatus for Promoting the Complete Transfer of Liquid Drops from a Nozzle」と題する特許文献８、２００６年１月２３日に出願された「Small Object Moving on Printed Circuit Board」と題する特許文献９、２００９年５月１４日に出願された「Method for Using Magnetic Particles in Droplet Microfluidics」と題する特許文献１０、および２００９年４月３０日に出願された「Method and Apparatus for Real-time Feedback Control of Electrical Manipulation of Droplets on Chip」と題する特許文献１１；２００９年６月１６日に発行された「Droplet Transportation Devices and Methods Having a Fluid Surface」と題するＶｅｌｅｖ氏の特許文献１２；２００７年１月１６日に発行された「Method, Apparatus and Article for Microfluidic Control via Electrowetting, for Chemical, Biochemical and Biological Assays and the Like」と題するＳｔｅｒｌｉｎｇ氏等の特許文献１３；２０１０年１月５日に発行された「Method and Apparatus for Programmable fluidic Processing」と題するＢｅｃｋｅｒおよびＧａｓｃｏｙｎｅ氏等の特許文献１４および２００５年１２月２０日に発行された「Method and Apparatus for Programmable Fluidic Processing」と題する特許文献１５；２００８年２月１２日に発行された「System for Manipulation of a Body of Fluid」と題するＤｅｃｒｅ氏等の特許文献１６；２００６年２月２３日に公開された「Chemical Analysis Apparatus」と題するＹａｍａｋａｗａ氏等の特許文献１７；２００８年１２月３１日に公開された「Digital Microfluidics Based Apparatus for Heat-exchanging Chemical Processes」と題するＷｕ氏の特許文献１８；２００９年７月３０日に公開された「Electrode Addressing Method」と題するＦｏｕｉｌｌｅｔ氏等の特許文献１９；２００６年５月３０日に発行された「Device for Displacement of Small Liquid Volumes Along a Micro-catenary Line by Electrostatic Forces」と題するＦｏｕｉｌｌｅｔ氏等の特許文献２０；２００８年５月２９日に公開された「Droplet Microreactor」と題するＭａｒｃｈａｎｄ氏等の特許文献２１；２００９年１２月３１日に公開された「Liquid Transfer Device」と題するＡｄａｃｈｉ氏等の特許文献２２；２００５年８月１８日に公開された「Device for Controlling the Displacement of a Drop Between two or Several Solid Substrates」と題するＲｏｕｘ氏等の特許文献２３；Ｄｈｉｎｄｓａ氏等の非特許文献４を参照されたい。これら文献の開示全体が、それらの優先権書類と共に、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【0022】
若干の液滴アクチュエータは、液滴操作ギャップを基板間に配置した１つ以上の基板と、１つ以上の基板に関連した（例えば、層状に積層、付着、および／または埋設した）電極であって、１回以上の液滴操作を行うよう配列した、該電極とを有する。例えば、若干の液滴アクチュエータは、ベース（または底部）基板、基板に関連した液滴操作電極、基板および／または電極上の１つ以上の誘電体層、並びに、任意に、液滴操作表面を形成する基板、誘電体層および／または電極上の１つ以上の疎水性層を有する。
【0023】
頂部基板も設けることができ、この頂部基板は、液滴操作表面からギャップを介して分離させ、一般に、このギャップは液滴操作ギャップと称することができる。頂部および／または底部基板における種々の電極構成は、上で参照した特許および出願に記載されており、若干の新規の電極構成が本発明の明細書に記載されている。液滴操作中、液滴は、接地または基準電極と連続接触または頻繁な接触を維持することが好適である。接地または基準電極は、ギャップに対向する頂部基板もしくはギャップに対向する底部基板に関連させる、またはギャップ内に配置することができる。電極を双方の基板に設ける場合、電極を液滴アクチュエータ機器に接続して電極を制御またはモニタリングするための電気接点は、一方または双方の基板に関連させることができる。いくつかの事例において、一方の基板における電極は、他方の基板に電気的に接続し、一方の基板のみが液滴アクチュエータに接触するようにする。
【0024】
一実施形態において、導電性材料（例えば、ニュージャージー州ハッケンサックのマスターボンド社から入手可能なＭＡＳＴＥＲ ＢＯＮＤ（登録商標）ポリマーシステムＥＰ７９のようなエポキシ）が一方の基板における電極と他方の基板における電気経路との間に電気的接続を生じ、例えば、頂部基板における接地電極が底部基板における電気経路に対してこのような導電性材料によって接続される。
【0025】
複数の基板を使用する場合、基板間にスペーサを設けて、基板間ギャップの高さを決定し、また分注リザーバを画定する。スペーサ高さは、例えば、約５μｍ～約６００μｍ、または約１００μｍ～約４００μｍ、または約２００μｍ～約３５０μｍ、または約２５０μｍ～約３００μｍ、または約２７５μｍであることができる。スペーサは、例えば、頂部または底部の基板から突出する突起層、および／または頂部基板と底部基板との間に挿入した材料から形成することができる。
【0026】
１個以上の開口部を１つ以上の基板に設け、液滴操作ギャップに液体を送給できる液体経路を形成することができる。１個以上の開口部は、場合によっては、１つ以上の電極と相互作用するように整列されてもよく、例えば、開口部を通って流れる液体が１つ以上の液滴操作電極と十分に近接して、液滴操作が液体を用いた液滴操作電極によって影響を受けることを可能にするように整列されてもよい。ベース（または底部）および頂部の基板は、いくつかの事例において、１個の一体コンポーネントとして形成することができる。１個以上の基準電極をベース（または底部）および／または頂部の基板上および／またはギャップ内に設けることができる。基準電極構成の例は、上に参照した特許および特許出願に記載されている。
【0027】
種々の実施形態において、液滴アクチュエータによる液滴の操作は、電極媒介、例えば、電気湿潤媒介または誘電泳動媒介またはクーロン力媒介で行うことができる。
【0028】
本発明の液滴アクチュエータで使用し得る液滴操作を制御する他の技術の例としては、流体力学的流体圧力を誘発するデバイス、例えば、機械的原理（例えば、外部シリンジポンプ、空気圧薄膜ポンプ、振動薄膜ポンプ、真空デバイス、遠心力、圧電／超音波ポンプおよび音響放射力）；電気的または磁気的な原理（例えば、電気浸透流、動電学的ポンプ、磁性流体プラグ、電気流体力学的ポンプ、磁力を用いる吸引または反発および磁気流体力学的ポンプ）；熱力学的原理（例えば、気体バブル発生器／相転移誘発体積膨張）；他の種類の表面湿潤原理（例えば、電気湿潤、および光電湿潤、並びに化学的、熱的、構造的および放射能誘発表面張力勾配）；重力；表面張力（例えば、毛細管作用）；静電気（例えば、電気浸透流）；遠心フロー（コンパクトディスク上に配置して回転させられる基板）；磁力（例えば、周期振動するイオンが流れを発生させる）；磁気流体力学的力；および真空または差圧に基づいて動作するデバイスがある。
【0029】
若干の実施形態において、上述した技術の２つ以上の組合せを用いて本発明の液滴アクチュエータにおける液滴操作を行うことができる。同様に、上述した技術のうち１つ以上を使用して液体を液滴操作ギャップ内に送給する、例えば、他のデバイスにおけるリザーバまたは液滴アクチュエータの外部リザーバ（例えば、液滴アクチュエータ基板に関連させたリザーバおよびリザーバから液滴操作ギャップ内に至る流路）から送給することができる。
【0030】
本発明の若干の液滴アクチュエータの液滴操作表面は、疎水性材料から形成する、または疎水性を持たせるようコーティングまたは処理することができる。例えば、いくつかの事例において、液滴操作表面の一部または全部に対して低表面エネルギー材料または化学物質で誘導体化し、この誘導体化は、例えば、溶液内または重合可能なモノマー内におけるポリフッ素化合物または過フッ素化合物のような化合物を用いた析出またはその場の合成によって行うことができる。例としては、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ（デラウェア州ウィルミントンのデュポン社から入手可能である）、サイトップ（ｃｙｔｏｐ）材料群のうちの材料、疎水性および超疎水性コーティングであるＦＬＵＯＲＯＰＥＬ（登録商標）群（メリーランド州ベルツビルのサイトニクッス社から入手可能である）におけるコーティング、シランコーティング、フルオロシランコーティング、疎水性ホスホン酸誘導体（例えば、アクロン社によって市販されている）、およびＮＯＶＥＣ（登録商標）電子コーティング（ミネソタ州セントポールの３Ｍ社から入手可能である）、プラズマ助長化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）用の他のフッ素化モノマー、およびＰＥＣＶＤ用のオルガノシロキサン（例えば、ＳｉＯＣ）がある。いくつかの事例において、液滴操作表面に、約１０ｎｍ～約１，０００ｎｍの範囲にわたる厚さを有する疎水性コーティングを設けることができる。
【0031】
更に、いくつかの実施形態において、液滴アクチュエータの頂部基板は、導電性有機ポリマーを有し、次にこの導電性有機ポリマーに疎水性コーティングをコーティングする、または液滴操作表面を疎水性にする処理を施す。例えば、プラスチック基板上に堆積する導電性有機ポリマーは、ポリ（３，４－エチレンジオキシチオフェン）ポリ（スチレンスルホン酸塩）（ＰＥＤＯＴ：ＰＳＳ）とすることができる。導電性有機ポリマーおよび代替的導電層の他の例は、「Droplet Actuator Devices and Methods」と題するＰｏｌｌａｃｋ氏等の特許文献２４に記載されており、この特許文献は参照により全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【0032】
一方または双方の基板は、印刷回路板（ＰＣＢ）、ガラス、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）被覆ガラス、および／または半導体材料を基板として用いて作製することができる。基板がＩＴＯ被覆ガラスであるとき、ＩＴＯコーティングは、約２０～約２００ｎｍ、好ましくは約５０～約１５０ｎｍ、または約７５～約１２５ｎｍ、または約１００ｎｍの範囲の厚さであることが好ましい。
【0033】
いくつかの事例において、頂部および／または底部の基板は、ＰＣＢ基板を有し、この基板をポリイミド誘電体のような誘電体でコーティングし、いくつかの事例においては、このような誘電体に対して液滴操作表面を疎水性にするコーティングまたは他の処理を施すことができる。基板がＰＣＢを有するとき、以下の材料が適当な材料の例であり、即ち、ＭＩＴＳＵＩ（登録商標）ＢＮ－３００（カリフォルニア州サンホセの三井ケミカル・アメリカ社から入手可能である）；ＡＲＬＯＮ（登録商標）１１Ｎ（カリフォルニア州サンタアンナのアーロン社から入手可能である）；ＮＥＬＣＯ（登録商標）Ｎ４０００－６およびＮ５０００－３０／３２（ニューヨーク州メルヴィルのパーク・エレクトロケミカル社から入手可能である）；ＩＳＯＬＡ（登録商標）ＦＲ４０６（アリゾナ州チャンドラーのイソラグループ社から入手可能である）、特に、ＩＳ６２０；フッ素ポリマー群（低背景蛍光発光を有するために蛍光発光検出に適する）；ポリイミド群；ポリエステル；ポリエチレンナフタレート；ポリカーボネート；ポリエーテルエーテルケトン；液晶ポリマー；シクロオレフィン共重合体（ＣＯＣ）；シクロオレフィン重合体（ＣＯＰ）；アラミド；ＴＨＥＲＭＯＵＮＴ（登録商標）不織アラミド補強材（デラウェア州ウィルミントンのデュポン社から入手可能である）；ＮＯＭＥＸ（登録商標）ブランドのファイバ（デラウェア州ウィルミントンのデュポン社から入手可能である）；および紙が適当である。
【0034】
種々の材料も基板の誘電体コンポーネントとして使用するのに適する。例としては、ＰＡＲＹＬＥＮＥ（登録商標）Ｃ（特に、ガラス上の）、ＰＡＲＹＬＥＮＥ（登録商標）Ｎ、およびＰＡＲＹＬＥＮＥ（登録商標）ＨＴ（～３００℃の高温用）のような蒸着誘電体（テキサス州カティのパリレーンコーティングサービス社から入手可能である）；ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦコーティング；サイトップ；液体写真品質画像はんだマスクのようなはんだマスク（例えば、ＰＣＢ上の）であって、例えば、ＴＡＩＹＯ（登録商標）ＰＳＲ４０００シリーズ、ＴＡＩＹＯ（登録商標）ＰＳＲおよびＡＵＳシリーズ（ネバダ州カーソンシティーのタイヨーアメリカ社から入手可能である）（熱制御を含む用途向けの良好な熱特性を有する）、およびＰＲＯＢＩＭＥＲ（登録商標）８１６５（カリフォルニア州ロスアンゼルスのハンツマン・アドバンスド・マテリアル・アメリカ社から入手可能である）のようなはんだマスク；ＶＡＣＲＥＬ（登録商標）乾式フィルムはんだマスク製品群（デラウェア州ウィルミントンのデュポン社から入手可能である）におけるような乾式フィルムはんだマスク；ポリイミドフィルム（例えば、デラウェア州ウィルミントンのデュポン社から入手可能なＫＡＰＴＯＮ（登録商標）ポリイミドフィルム）、ポリエチレン、およびフッ素ポリマー（例えば、ＦＥＰ）のようなフィルム誘電体；ポロテトラフルオロエチレン；ポリエステル；ポリエチレンナフタレート；シクロオレフィン共重合体（ＣＯＣ）；シクロオレフィン重合体（ＣＯＰ）；および任意な他の先に列挙したＰＣＢ基板材料；ブラックマトリクス樹脂；およびポリプロピレンが含まれる。
【0035】
液滴移送電圧および周波数は、特定の検定評価プロトコルに使用する試薬とともに使用するよう選択することができる。策定パラメータは変動し、例えば、アクチュエータ上リザーバの数および配置、独立電極接続部の数、異なるリザーバのサイズ（容積）、磁石／ビード洗浄ゾーンの配置、電極サイズ、電極間ピッチ、およびギャップ高さ（頂部基板と底部基板との間における）は、特定試薬、プロトコル、液滴体積量等での使用によって変動し得る。いくつかの事例において、本発明の基板は、例えば、溶液内または重合可能なモノマー内におけるポリフッ素化合物または過フッ素化合物のような化合物を用いた析出またはその場の合成によって誘導体化することができる。例としては、浸漬または噴霧コーティング用のＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦコーティングおよびＦＬＯＲＯＰＥＬ（登録商標）コーティング、プラズマ助長化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）用の他のフッ素化モノマー、およびＰＥＣＶＤ用のオルガノシロキサン（例えば、ＳｉＯＣ）がある。
【0036】
更に、いくつかの事例において、液滴操作表面の一部または全部を、ＰＣＢ基板からの背景蛍光発光のような背景ノイズを減少する物質でコーティングすることができる。例えば、ノイズ減少コーティングには、日本の東レ株式会社から入手可能なブラックマトリクス樹脂のようなブラックマトリクス樹脂がある。
【0037】
液滴アクチュエータの電極は、典型的には、それ自体システムの一部をなすコントローラまたはプロセッサによって制御され、このコントローラまたはプロセッサは、処理機能並びにデータおよびソフトウェアの保存、並びに入力および出力能力を有することができる。
【0038】
試薬は、液滴操作ギャップ内または液滴操作ギャップに流体接続したリザーバ内における液滴アクチュエータに供給することができる。試薬は、液滴のような液状形態とし、または液滴操作ギャップ内または液滴操作ギャップに流体接続したリザーバ内で、再構成可能な形態で供給することができる。再構成可能な試薬は、典型的には、再構成のために液体と組み合わせることができる。本発明と共に使用に適した再構成可能な試薬の例は、２０１０年６月１日に特許が付与された「Disintegratable films for diagnostic devices」と題するＭｅａｔｈｒｅｌ氏等の特許文献２５に記載された試薬を含む。
【0039】
「液滴操作」は、液滴アクチュエータにおける液滴の任意な取扱い操作を意味する。液滴操作としては、例えば、液滴を液滴アクチュエータ内に装填する；液滴源から１滴またはそれ以上の液滴を分注する；一滴の液滴を２滴またはそれ以上の液滴に分裂、分離または分割する；液滴を１つの場所から任意な方向に他の場所に移送する；２滴またはそれ以上の液滴を単独液滴に合体または結合する；液滴を希釈する；液滴を混合する；液滴を撹拌する；液滴を変形させる；液滴を所定位置に保持する；液滴を培養する；液滴を加熱する；液滴を蒸発させる；液滴を冷却する；液滴を廃棄する；液滴を液滴アクチュエータから送出する；本明細書に記載した他の液滴操作をする；および／または上述の行為の任意の組合せをすることがあり得る。
【0040】
用語「合体する（ｍｅｒｇｅ）」、「合体させる（ｍｅｒｇｉｎｇ）」、「組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｅ）」、「組み合わさる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）」等は、２滴以上の液滴から１滴の液滴を生ずることを記述するのに使用する。このような用語は、２滴以上の液滴につき使用するとき、２滴以上の液滴が１滴の液滴に組み合わさるのに十分な液滴操作の任意な組合せで使用できる。例えば、「液滴Ａを液滴Ｂに合体させる」は、液滴Ａを静止している液滴Ｂに接触するよう移送する、液滴Ｂを静止している液滴Ａに接触するよう移送する、または液滴ＡおよびＢを互いに接触するよう移送することによって達成することができる。
【0041】
用語「分裂する（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）」、「分離（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ）」、および「分割（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）」は、結果として生じた液滴の特定の分量を含意することは意図しない（即ち、結果として生じた液滴の量は、同一または異なるものであり得る）、または結果として生じた液滴の個数を含意することは意図しない（結果として生じた液滴の数は、２、３、４、５またはそれ以上であり得る）。
【0042】
用語「混合（ｍｉｘｉｎｇ）」は、液滴内で１つ以上の成分がより均一に分布する結果となる液滴操作に言及する。
【0043】
「装填（ｌｏａｄｉｎｇ）」液滴操作の例としては、微小透析装填、圧力支援装填、ロボット装填、受動的装填、およびピペット装填がある。
【0044】
液滴操作は、電極媒介で行うことがあり得る。いくつかの事例において、液滴操作は、更に、表面上における親水性および／または疎水性の領域の使用、および／または物理的障害物によって容易になる。液滴操作の例としては、「液滴アクチュエータ」の定義につき上に引用した特許および特許出願を参照されたい。時折、インピーダンスまたは容量に関する感知、または撮像技術を使用して、液滴操作の成果を決定または確認することあり得る。このような技術の例は、２００８年８月２１日に公開された「Capacitance Detection in a Droplet Actuator」と題するＳｔｕｒｍｅｒ氏等の特許文献２６に記載されており、この文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【0045】
概して、感知または撮像技術を使用して、特定電極における液滴の存在または不在または量を確認することができる。例えば、液滴分注操作に続いての行き先電極における分注された液滴の存在は、液滴分注操作が有効であったことを確認する。
【0046】
同様に、検定評価プロトコルの適切ステップにおける検出スポットに液滴が存在することは、一連の先行液滴操作が検出用液滴生成に成功していたことを確認し得る。
【0047】
液滴移送時間は、極めて迅速にすることができる。例えば、様々な実施形態において、１つの電極から次の電極への液滴移送は約１秒よりも、または約０.１秒よりも、または約０.０１秒よりも、または約０．００１秒よりも速くすることができる。
【0048】
一実施形態において、電極はＡＣモードで動作するが、撮像用にＤＣモードに切り換える。液滴操作を行うためには、液滴の占有面積が電気湿潤面積に類似するようにすることが有用であり、換言すると、それぞれ１×、２×、３×液滴は、１個、２個および３個の電極を使用して、制御および操作されることが有用である。液滴占有面積が所定時刻での液滴操作を行うのに利用可能な電極の数より大きい場合、液滴サイズと電極の数との間の差は、一般的に、１より大きくないようにすべきであり、換言すると、２×液滴は、１個の電極を使用して制御するのが有用であり、また３×液滴は、２個の電極を使用して制御するのが有用である。液滴がビードを含むとき、液滴サイズは、液滴を制御する、例えば、液滴を移送する電極の数に等しくするのが有用である。
【0049】
「填隙剤液体」は、液滴アクチュエータの液滴操作基板に関連する液体を意味し、この液体は、液滴相と十分には混和せず、液滴相が電極媒介液滴操作を受けるようにする。例えば、液滴アクチュエータの液滴操作ギャップは、典型的には、填隙剤液体で充満する。填隙剤液体は、例えば、シリコーンオイルまたはヘキサデカンによる填隙剤液体のような低粘性オイルとするまたはそれを含むものとすることができる。填隙剤液体は、フッ素化または過フッ素化したオイルのようなハロゲン化オイルとするまたはそれを含むものとすることができる。填隙剤液体は、液滴アクチュエータのギャップ全体を填隙する、または液滴アクチュエータの１つ以上の表面を被覆することができる。填隙剤液体は、導電性または非導電性とすることができる。填隙剤液体は、液滴操作を改善および／または液滴から試薬または標的物質の損失を減少、微小液滴形成を促進、液滴相互間の交差汚染を減少、液滴アクチュエータ表面の汚染を減少、液滴アクチュエータ材料の劣化を減少、等々をするよう選択することができる。例えば、填隙剤液体は、液滴アクチュエータ材料に対する適合性を有するよう選択することができる。
【0050】
例として、フッ素化填隙剤液体は、フッ素化表面コーティングに採用するのが有用であり得る。フッ素化填隙剤液体は、ウンベリフェロン物質、例えば、６－ヘキサデカノイルアミド－４－メチルウンベリフェロン物質（例えば、クラッベ、ニーマン－ピック、または他の検定評価に使用する）のような脂溶性の化合物の損失を減少するのに有用であり、他のウンベリフェロン物質は、２０１１年５月１９日に公開された特許文献２７に記載されており、この文献は参照により全体が本明細書に組み込まれるものとする。適当なフッ素化オイルの例としては、ガルデン製品群、例えば、ガルデンＨＴ１７０（ｂｐ＝１７０℃、粘度＝１.８ｃＳｔ、密度＝１.７７）、ガルデンＨＴ２００（ｂｐ＝２００℃、粘度＝２.４ｃＳｔ、密度＝１.７９）、ガルデンＨＴ２３０（ｂｐ＝２３０℃、粘度＝４.４ｃＳｔ、密度＝１.８２）（全てソルヴェイ・ソレキス社から入手可能である）；ノベック製品群、例えば、ノベック７５００（ｂｐ＝１２８℃、粘度＝０.８ｃＳｔ、密度＝１.６１）、フルオリナートＦＣ－４０（ｂｐ＝１５５℃、粘度＝１.８ｃＳｔ、密度＝１.８５）、フルオリナートＦＣ－４３（ｂｐ＝１７４℃、粘度＝２.５ｃＳｔ、密度＝１.８６）（全て３Ｍ社から入手可能である）がある。
【0051】
概して、過フッ素化填隙剤液体の選択は、動粘性率（＜７ｃＳｔが好適であるが、必ずしも必須ではない）、および沸点（＞１５０℃が好適であるが、ＤＮＡ／ＲＮＡに基づく用途（ＰＣＲ、等々）での使用には必須ではない）に基づいて行われる。
【0052】
填隙剤液体には、例えば、界面活性剤または他の添加物をドーピングすることができる。例えば、添加剤は、液滴操作を改善および／または液滴から試薬または標的物質の損失を減少、微小液滴形成を促進、液滴相互間の交差汚染を減少、液滴アクチュエータ表面の汚染を減少、液滴アクチュエータ材料の劣化を減少、等々をするよう選択することができる。界面活性剤ドーピングを含む填隙剤液体の組成は、特定検定評価プロトコルに使用される試薬の性能、および液滴アクチュエータ材料との有効な相互作用または非相互作用が得られるように選択することができる。本発明での使用に適した填隙剤液体および填隙剤液体調製の例は、２０１０年５月１１日に公開された「Droplet Actuators, Modified Fluids and Methods」と題するＳｒｉｎｉｖａｓａｎ氏等の特許文献２８および２００９年２月１２日に公開された「Use of Additives for Enhancing Droplet Operations」と題する特許文献２９；２００８年８月１４日に公開された「Droplet Actuator Devices and Methods Employing Magnetic Beads」と題するＳｉｓｔａ氏等の特許文献３０；および２００７年５月１７日に公開された「Electrowetting Devices」と題するＭｏｎｒｏｅ氏等の特許文献３１に記載されており、これら文献は参照により全体が本明細書に組み込まれるものとし、また本明細書で引用した他の特許および特許出願にも記載されている。フッ素化オイルは、いくつかの事例において、例えば、ゾニールＦＳＯ－１００（シグマ・アルドリッチ社）のようなフッ素化界面活性剤、および／または他のフッ素化界面活性剤をドーピングできる。
【0053】
用語「頂部」、「底部」、「上方」、「下方」、および「上」は、本明細書全体を通して、液滴アクチュエータのコンポーネントの相対位置、例えば、液滴アクチュエータの頂部基板および底部基板の相対位置について説明するのに使用される。当然のことながら、液滴アクチュエータは、空間における向きとは無関係に機能する。
【0054】
任意な形態の液体（例えば、移動または静止状態であっても液滴または連続体である）が電極、アレイ、マトリクスまたは表面「上」、「に」、または「上方」に存在すると記載するとき、このような液体は、電極／アレイ／マトリクス／表面に直接接触するか、または液体と電極／アレイ／マトリクス／表面との間に介在する１つ以上の層または薄膜に接触するか、のいずれかとすることができる。一実施例において、填隙剤液体は、このような液体と電極／アレイ／マトリクス／表面との間における薄膜と見なすことができる。
【0055】
液滴が液滴アクチュエータ「上」に存在するまたは液滴を液滴アクチュエータ「上に装填する」と記載するとき、液滴が液滴アクチュエータ上に配置され、この配置は、液滴アクチュエータ使用での１つ以上の液滴操作を液滴に対して行うのが容易となるように行う、または液滴の特性または液滴からの信号を感知するのが容易になるように行う、および／または液滴が液滴アクチュエータで液滴操作を受けて、液滴が液滴アクチュエータ上に配置されるものと理解されたい。
【0056】
２．新生児スクリーニング出生時プラットフォームのための非結合型ビリルビン検定評価
本発明は、生化学的検定評価を実施するデバイスおよび方法を提供する。
本発明は、生化学的検定評価を実施するデバイスおよび方法を提供する。
【0057】
本発明は、デバイスによる操作を受ける液滴を含むマイクロ流体デバイスを提供し、液滴は、本発明の界面活性剤を含む。液滴は、血液を含むことが好ましい。液滴は、シリコーンオイル等の低粘性オイルのような填隙剤液体によって取り囲まれてもよい。このデバイスは、「Use of additives for enhancing droplet operations」と題する特許文献３２に記載されているデバイスのような電気湿潤デバイスであることができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0058】
様々な態様において、本発明は、入力として全血試料を使用して生化学的検定評価を実施する方法を提供し、全血試料は、分析のために全血試料の１つ以上のフラクションに処理することができる。
【0059】
一態様では、全血試料は、マイクロ流体デバイス上で液滴操作を受ける。
【0060】
一態様では、本発明は、蛍光に基づく生化学的検定評価を実施する方法を提供する。
【0061】
一態様では、蛍光に基づく生化学的検定評価は、非結合型ビリルビンの新生児スクリーニング検定評価である。
【0062】
一態様では、非結合型ビリルビンについての蛍光に基づく検定評価は、非結合型／非抱合型ビリルビンに特異的に結合する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用する。
【0063】
本発明の方法は、例えば、「Point-of-birth system and instrument, biochemical cartridge, and methods for newborn screening」と題する特許文献３３に記載されるポイントオブバースシステムおよび器具のような、ポイントオブバースシステムおよび器具で処理することができ、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【0064】
２．１．界面活性剤の選択
本発明の方法は、界面活性剤を利用する。
本発明の方法は、界面活性剤を利用する。
【0065】
一態様では、界面活性剤は、全血試料の有意な溶解を生じさせることなく、マイクロ流体カートリッジ上で全血試料を電気湿潤するために選択される。
【0066】
全血試料の有意な溶解を生じさせることなく、マイクロ流体カートリッジ上で全血試料を電気湿潤するのに適した界面活性剤の例には、以下の構造を有する非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ミズーリ州セントルイスのミリポア・シグマ社から入手可能である）と、
以下の構造を有するＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ（アラバマ州アラバスターのＡｖａｎｔｉ（登録商標）ポーラーリピッズ社から入手可能である）と、
以下の構造を有する双性イオン界面活性剤１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ（アラバマ州アラバスターのＡｖａｎｔｉ（登録商標）ポーラーリピッズ社から入手可能である）と、が含まれる。
【化1】
【化2】
【化3】
【0067】
一態様では、界面活性剤は、蛍光信号に干渉することなく、マイクロ流体カートリッジ上で蛍光に基づく検定評価を実施するために選択される。
【0068】
一態様では、界面活性剤は、非特許文献３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるタンパク質ＵｎａＧのような、非結合型／非抱合型ビリルビンに特異的に結合する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用する蛍光に基づく検定評価を行うために選択される。
【0069】
２．２．マイクロ流体デバイスおよび方法
本発明は、デバイスによる操作を受ける液滴を含むマイクロ流体デバイスを提供し、液滴は、本発明の界面活性剤を含む。
本発明は、デバイスによる操作を受ける液滴を含むマイクロ流体デバイスを提供し、液滴は、本発明の界面活性剤を含む。
【0070】
図１は、液滴において生化学的検定評価を実施するための、例示的なマイクロ流体デバイス１００の一部を示す断面図である。マイクロ流体デバイス１００は、ギャップ１１４によって分離された底部基板１１０および頂部基板１１２を含む。一組の液滴操作電極１１６、例えば、電気湿潤電極が、例えば、底部基板１１０上に配置されている。液滴操作電極１１６は、液滴の装填、分注、分裂、移送、合体、および混合等の液滴操作を行うように配置されている。ギャップ１１４は、填隙剤液体１１８で充満されている。填隙剤液体１１８は、例えば、シリコーンオイルのような低粘性オイルであり得る。
【0071】
水性液滴１２０は、マイクロ流体デバイス１００のギャップ１１４に存在し得る。一例では、液滴１２０は、全血液滴または血液成分液滴、または血球を含む液滴、または赤血球を含む液滴のような、評価される試料液体の液滴である。別の例では、液滴１２０は、酵素液滴、または停止液液滴、または希釈緩衝剤液滴、または検出試薬液滴のような、生化学的検定評価を行うための試薬液滴である。オイル填隙剤液体１１８は、ギャップ１１４を満たし、液滴１２０を取り囲む。
【0072】
液滴１２０は、電気湿潤を使用して生化学的検定評価を行うのに適した界面活性剤を含むことで、液滴操作を行う。一例では、界面活性剤は、赤血球の有意な溶解を生じさせることなく、血液に基づく検定評価を行うのに適している。一例では、界面活性剤は、酵素的蛍光に基づく生化学的検定評価を行うのに適している。一例では、界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０である。
【0073】
２．３．ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価
本発明は、蛍光に基づく生化学的検定評価を使用して、マイクロ流体デバイス上の非結合型ビリルビンを測定するためのシステム、カートリッジおよび方法を提供する。
本発明は、蛍光に基づく生化学的検定評価を使用して、マイクロ流体デバイス上の非結合型ビリルビンを測定するためのシステム、カートリッジおよび方法を提供する。
【0074】
本発明は、非結合型ビリルビン（即ち、アルブミンに結合していない抱合型および非抱合型ビリルビン）の酵素媒介酸化分解およびＵｎａＧ特異的結合を利用して、全血試料中の非結合型（非抱合型）ビリルビンのレベルを測定する。「Measurement method for unbound bilirubin in blood sample」と題する特許文献３４（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）には、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）およびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）をＵｎａＧと組み合わせて使用することにより、血液試料中の非結合型ビリルビンを測定する方法が記載されている。ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価には、（１）ＧＯＤ－ＰＯＤ反応を使用して非結合型ビリルビンを酸化する分解ステップと、（２）分解反応を停止させ、分解物を得る「停止」分解ステップと、（３）（ステップ１の）分解物および未反応試料（即ち、分解ステップ１を受けていない血液試料）を、非抱合型ビリルビンに結合するＵｎａＧと接触させる「接触」ステップと、（４）分解物試料および未反応試料からＵｎａＧの蛍光を検出する検出ステップと、が含まれる。非結合型ビリルビンの量は、検出された値の差から決定される。
【0075】
本発明の方法は、非結合型ビリルビンについてＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価を行うように構成された液滴操作電極の配置を含むマイクロ流体デバイスを使用する。一態様では、ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価を行うための全ての検定評価試薬（例えば、希釈液、緩衝剤、酵素試薬、停止試薬、ＵｎａＧ検出試薬）は、マイクロ流体デバイス上に「事前装填」されて供給される。
【0076】
図２は、マイクロ流体デバイス上で非結合型ビリルビンについてＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価を行うために構成された液滴操作電極の配置例を示す概略図２００である。液滴操作電極の配置には、希釈溶液、蛍光標準溶液、酵素試薬溶液（例えば、ＧＯＤおよびＰＯＤ溶液）、緩衝液、停止試薬（例えば、アスコルビン酸）を分注するための電極リザーバと、１つ以上の検定評価反応ゾーンと、血液試料を装填および希釈するための試料リザーバと、が含まれる。液滴操作電極の配置には、ＵｎａＧ検出試薬を乾燥する検出試薬電極も含まれる。
【0077】
図３は、マイクロ流体デバイス上でＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価を使用して血液試料中の非結合型ビリルビンを測定するための例示的な方法３００を示すフローチャートである。方法３００は、以下のステップのいずれかまたは全て、並びに追加の不特定のステップを含むことができる。
【0078】
ステップ３１０にて、試料をマイクロ流体デバイスに装填する。例えば、５０μＬの全血試料をマイクロ流体デバイスの試料リザーバに装填し、グルコース緩衝剤にて希釈する（例えば、グルコース緩衝剤にて１：２７に希釈する）。
【0079】
ステップ３１５にて、試料液滴を分注し、ＧＯＤ－ＰＯＤおよび対照反応を開始する。例えば、第１の試料液滴を分注し、緩衝剤液滴と結合させて、対照反応液滴（試料希釈１：５４）を生成し、第２の試料液滴を分注し、酵素試薬液滴と結合させて、「短い」反応液滴（試料希釈１：５４）を生成し、第３の試料液滴を分注し、酵素試薬液滴と結合させて、「長い」反応液滴（試料希釈１：５４）を生成する。ＧＯＤ－ＰＯＤ酵素試薬は、試料中の非結合型ビリルビンの量に応じた速度で試料を酸化する。
【0080】
ステップ３２０にて、ＧＯＤ－ＰＯＤおよび対照反応を、時間＝ｔ１および時間＝ｔ２で停止する。例えば、第１の時点ｔ１＝４８秒にて、停止試薬液滴が分注され、対照反応液滴と結合して、対照反応液滴が生成され、第２の停止試薬液滴が分注され、「短い」酵素反応液滴と結合して、「短い」反応液滴が生成される。時点ｔ＝１２０秒にて、停止試薬液滴が分注され、「長い」酵素反応液滴と結合して、「長い」反応液滴が生成される。
【0081】
ステップ３２５にて、反応した試料液滴を希釈し、それを用いてＵｎａＧ試薬スポットを再水和する。例えば、対照反応液滴、「短い」酵素反応液滴、および「長い」酵素反応液滴を、１：３２４に希釈する。次に、希釈した各液滴を使用して、乾燥したＵｎａＧ試薬スポットを再水和する。
【0082】
ステップ３３０にて、ＵｎａＧ／反応液滴を培養する。例えば、対照反応液滴をＵｎａＧ試薬と培養して、全ての非抱合型ビリルビン（即ち、非結合型＋アルブミン結合）を測定する。「短い」酵素反応液滴および「長い」酵素反応液滴をＵｎａＧ試薬と培養して、残りの非抱合型ビリルビンを測定する。
【0083】
ステップ３３５にて、蛍光を読み取り、非結合型ビリルビンの量を計算する。
【実施例】
【0084】
界面活性剤スクリーニングプロトコルを使用して、電気湿潤フルイディクスカートリッジでのビリルビンに対するＵｎａＧに基づく蛍光検定評価の実施に適合する１つ以上の界面活性剤を識別する。スクリーニングプロトコルは、９６個の異なる界面活性剤のパネルで開始され、段階的に進められて、蛍光干渉、全血試料の溶血、並びに電気湿潤の適合性および限界を評価し、その後の各ステップでは、元の界面活性剤パネルのうちの選択範囲を狭めたセットを使用した。
【0085】
３．１．蛍光干渉
オンカートリッジ検定評価において試料および／または反応液滴を電気湿潤する際に使用される界面活性剤は、ビリルビンに結合するＵｎａＧによって生成される蛍光信号と干渉し得る。オンベンチマイクロタイタープレート検定評価を実施して、ビリルビン誘導ＵｎａＧ蛍光に対する異なる界面活性剤の効果を評価した。
オンカートリッジ検定評価において試料および／または反応液滴を電気湿潤する際に使用される界面活性剤は、ビリルビンに結合するＵｎａＧによって生成される蛍光信号と干渉し得る。オンベンチマイクロタイタープレート検定評価を実施して、ビリルビン誘導ＵｎａＧ蛍光に対する異なる界面活性剤の効果を評価した。
【0086】
この検定評価のために、Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）キット（カリフォルニア州アリソ・ビエホのハンプトン・リサーチ社から入手可能である）から９６個の異なる洗浄剤を使用した。キットの洗浄剤には、イオン性洗浄剤（ｎ＝１３）、非イオン性洗浄剤（ｎ＝４６）、双性イオン洗浄剤（ｎ＝３１）、および非イオン性スルホベタイン（ｎ＝６）を含めた。全ての洗浄剤を、０．５×臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）または非ミセル形成界面活性剤用に提供されたストックの１：２０の希釈のいずれかで使用した。使用したビリルビン試料は、ＵｎａＧ結合反応で０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０からの有意な蛍光干渉があることが知られている単一の総ビリルビン（ＴＢＩＬ）試料であった。試験用洗浄剤は、試験試料のアリコートにのみ添加し、ＵｎａＧ試薬には添加しなかった。
【0087】
要約すると、試験ＴＢＩＬ試料をグルコース緩衝剤（１ｍｇ／ｍＬグルコースを含むｐＨ７．４の２５～１００ｍＭリン酸緩衝剤）で１：９に希釈した。各洗浄剤は、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（即ち、ＣＭＣまたは提供されたストックから１：１０）で２×ストック溶液に希釈した。個々のマイクロタイタープレートウェルで、１０μＬの希釈試料と１０μＬの２×ストック洗浄剤とを結合して（即ち、１：１で混合）、室温で７分間培養した。マイクロタイタープレートにわたってピペッティングするのにかかる時間量を考慮して、マイクロタイタープレートの各列には洗浄剤を含まない対照を含めた。培養期間の終わりに、２０μＬのＵｎａＧ（洗浄剤を含まないリン酸緩衝剤中に２０μＭ）を各ウェルに添加し、室温（２４．４°）および４８８／５２８ｎｍのＥｘ／Ｅｍにて蛍光を直ちに読み取った。データ分析では、相対蛍光単位（ＲＦＵ）のパーセントバイアス（％バイアス；洗浄剤を含まない対照と比較した洗浄剤を含む試料）をｔ＝３分で比較し、カットオフを±１０％に設定した。
【0088】
図４は、試験した９６個の洗浄剤について、ｔ＝３分でのＲＦＵの％バイアスを示すプロット図４００およびプロット図４１０である。データは、洗浄剤が蛍光信号を減少させるのではなく増加させる可能性が高いことを示しており、これは、以前の観察と一致する観察である。
【0089】
図５は、ＵｎａＧ－ビリルビン蛍光検定評価における干渉をスクリーニングするのに使用されるＤｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）キット中の９６個の洗浄剤のマイクロタイタープレートレイアウトを示す表５００である。灰色で陰影付けされたセルは、ｔ＝３分で＜１０％バイアスであった３５個の洗浄剤の選択範囲を狭められたセットを示している。ｎ＝３５の洗浄剤の選択範囲を狭められたセットには、１４：０ Ｌｙｓｏ ＰＧ、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、ＡＰＯ ９、ＡＰＯ １１、Ｃ１２Ｅ９、Ｂｒｉｊ（登録商標）５６、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＥＭ、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＥＰＣ、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＧ、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＦＡ１、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド、ｎ－ヘキサデシル－β－Ｄ－マルトシド、ｎ－テトラデシル－β－Ｄ－マルトシド、ウンデシル－β－Ｄ－マルトシド、ＩＰＴＧ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ＬＤＡＯ、スルホベタイン１４、スルホベタイン１６、０６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ、０７：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ、１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ、１４：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ、１５：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ、１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ、１８：１ Ｌｙｓｏ ＰＣ、ＭＡＰＣＨＯ－１４、ＭＡＰＣＨＯ－１６、およびＮＤＳＢ－２１１が含まれる。
【0090】
３．２．全血試料の溶血
新生児スクリーニングのためのマルチプレックスオンカートリッジ検定評価では、典型的には、全血試料は、異なる生化学的試験を実施するためにカートリッジ上で２つ以上のアリコートに分裂される。試験のうちの１セット（例えば、アルブミンまたはビリルビン）は、全血試料の血漿フラクション（即ち、全血試料をカートリッジ上で凝集させて血漿試料を生成）を使用して実施することができ、試験のうちの第２のセット（例えば、ヘモグロビンまたはグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ））は、溶解した全血試料を使用して実行することができる（即ち、全血試料は、カートリッジ上で溶解される）。
新生児スクリーニングのためのマルチプレックスオンカートリッジ検定評価では、典型的には、全血試料は、異なる生化学的試験を実施するためにカートリッジ上で２つ以上のアリコートに分裂される。試験のうちの１セット（例えば、アルブミンまたはビリルビン）は、全血試料の血漿フラクション（即ち、全血試料をカートリッジ上で凝集させて血漿試料を生成）を使用して実施することができ、試験のうちの第２のセット（例えば、ヘモグロビンまたはグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ））は、溶解した全血試料を使用して実行することができる（即ち、全血試料は、カートリッジ上で溶解される）。
【0091】
界面活性剤が全血試料の溶血を誘発できるか否かを判定するために、オンベンチマイクロタイタープレート検定評価を実施した。この検定評価では、蛍光干渉検定評価から選択範囲を狭められたｎ＝３５の界面活性剤のセットを使用した。全ての界面活性剤は、２０×所望の試験濃度であった（即ち、非ミセル形成界面活性剤については、０．５×ＣＭＣまたは１：２０；２１個の界面活性剤については、元のプレートストックで２０倍であり、１４個の界面活性剤については、使用前に希釈し、ボルテックスした）。
【0092】
要約すると、７６μＬのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を含有する個々のマイクロチューブに、４μＬの各２０×界面活性剤ストックを添加した。次に、全血試料のアリコート（８０μＬ）を各マイクロチューブに加え、マイクロチューブをフリック／反転させることによって、界面活性剤－全血溶液を混合した。試料を室温で１０分間培養し、培養期間中に更に２回混合した。培養期間の終わりに、マイクロチューブを２５００ＲＰＭで５分間遠心分離した。各上清のアリコート（４０μＬ）を取り出し、９６－ウェルハーフエリアプレートに移動した。プレートをスキャンし、ヘモグロビンの光学密度（吸光度）を測定した。ヘモグロビンの量は、ベールの法則および以下：Ｌ＝０．１８３ｃｍ；Ｅ＝５３，２３６Ｌ／ｃｍ＊ｍｏｌ；ＭＷ＝６４，５００ｇ／ｍｏｌ；ＤＦ＝３（～５０％ＨＣＴ試料を想定）を使用して、ｇＨｂ／Ｌとして定量化した。溶血を誘発するためのカットオフは、対照から＞１．５倍の変化に設定した。
【0093】
図６Ａおよび図６Ｂは、ｎ＝３５の界面活性剤試料におけるヘモグロビンのスペクトルスキャンを示すプロット図６００である。図６Ｂは、図６Ａのプロット図６００の四角で囲まれた領域の拡大図である。データは、３つの界面活性剤試料（ＬＤＡＯ、ＭＡＰＣＨＯ－１４、および１５：０ ＬＹＳＯ ＰＣ；図６Ｂ参照）が有意な溶血を引き起こし、他の３２個の界面活性剤については引き起こさなかったことを示している。
【0094】
３．３．電気湿潤の適合性および限界
電気湿潤との適合性を定性的に評価するために、ｎ＝３５の界面活性剤の選択範囲を狭められたセットをＦＩＮＤＥＲ（登録商標）カートリッジ（ノースカロライナ州ダーラムのバービーズインコーポレイテッドから入手可能である）で試験した。全ての界面活性剤を０．５×ＣＭＣで、または非ミセル形成界面活性剤については１：２０で試験した。この評価のために、１６０μＬの界面活性剤をＦＩＮＤＥＲ（登録商標）カートリッジの希釈剤リザーバに装填し、次に、カートリッジをＦＩＮＤＥＲ（登録商標）機器（ノースカロライナ州ダーラムのバービーズインコーポレイテッドから入手可能である）に入れた。ＦＩＮＤＥＲ（登録商標）機器でパネル１スクリプトを実行して、各界面活性剤の界面活性剤／希釈剤のプライミングおよび分注を評価した。電気湿潤操作を視覚的に評価し、次のように文字スケールで等級付けした：Ａ＋＝望ましい；ＡおよびＡ－＝次のラウンドのスクリーニングに受け入れ可能である。評価には、界面活性剤／希釈剤がリザーバにどのように装填されたか、界面活性剤／希釈溶液がリザーバを上って分配電極までどれだけ速く移動したか、リザーバ外に分配されたか、および通過した電極の数等の観察を含めた。
電気湿潤との適合性を定性的に評価するために、ｎ＝３５の界面活性剤の選択範囲を狭められたセットをＦＩＮＤＥＲ（登録商標）カートリッジ（ノースカロライナ州ダーラムのバービーズインコーポレイテッドから入手可能である）で試験した。全ての界面活性剤を０．５×ＣＭＣで、または非ミセル形成界面活性剤については１：２０で試験した。この評価のために、１６０μＬの界面活性剤をＦＩＮＤＥＲ（登録商標）カートリッジの希釈剤リザーバに装填し、次に、カートリッジをＦＩＮＤＥＲ（登録商標）機器（ノースカロライナ州ダーラムのバービーズインコーポレイテッドから入手可能である）に入れた。ＦＩＮＤＥＲ（登録商標）機器でパネル１スクリプトを実行して、各界面活性剤の界面活性剤／希釈剤のプライミングおよび分注を評価した。電気湿潤操作を視覚的に評価し、次のように文字スケールで等級付けした：Ａ＋＝望ましい；ＡおよびＡ－＝次のラウンドのスクリーニングに受け入れ可能である。評価には、界面活性剤／希釈剤がリザーバにどのように装填されたか、界面活性剤／希釈溶液がリザーバを上って分配電極までどれだけ速く移動したか、リザーバ外に分配されたか、および通過した電極の数等の観察を含めた。
【0095】
図７は、ｎ＝３５の選択範囲を狭められた界面活性剤の一部のプライミング／分注評価のためのデータシートを示すスクリーンショット７００である。列挙されている各界面活性剤について、データシートには試験濃度、電気湿潤スコア（ＥＷスコア）および観察メモが示されている。各界面活性剤について、データシートには、図４を参照して説明した最初の蛍光干渉スクリーンからのパーセントバイアス（％バイアス）も列挙する。電気湿潤観察およびパーセントバイアスを使用して、最良のパフォーマンスを示す（即ち、最小の％バイアス、電気湿潤スコア「Ａ」、蛍光干渉なし、および溶血なし）ｎ＝８（ＡＰＯ ９、ＡＰＯ １１、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＦＡ１、ｎ－テトラデシル－β－Ｄ－マルトシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、スルホベタイン１６、および１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）の第２の選択範囲を狭められた界面活性剤のセットを選択した。
【0096】
第２の電気湿潤スクリーニングを実施して、「Ａ＋」スコアで電気湿潤する最低界面活性剤濃度を定義した。この評価では、ｎ＝８の界面活性剤の第２の選択範囲を狭められたセットを使用した。この電気湿潤スクリーニングでは、図７にて以前に「Ａ」または「Ａ－」として記録された界面活性剤の濃度が４倍に増加し、また、以前に「Ａ＋」として記録された界面活性剤の濃度は、１０倍減少した。
【0097】
図８は、変更された界面活性剤濃度を使用するｎ＝８の界面活性剤の第２の選択範囲を狭められたセットの電気湿潤評価のためのデータシートを示すスクリーンショット８００である。電気湿潤操作のプライミング／分注の視覚的観察を、図７を参照して説明したように実施した。列挙されている各界面活性剤について、データシートには、試験濃度、電気湿潤スコア（ＥＷスコア）、並びに元の評価および変更された界面活性剤濃度を使用した評価からの観察メモが示されている。データシートには、図４を参照して説明した最初の蛍光干渉スクリーニングからの％バイアスも記載されている。この評価から、１つの界面活性剤（ｎ－テトラデシル－β－Ｄ－マルトシド）は、４倍の濃度増加を使用して「Ａ＋」段階にもっていくことができなかった。変更された界面活性剤濃度を使用した電気湿潤観察を使用して、ｎ＝７（ＡＰＯ ９、ＡＰＯ １１、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＦＡ１、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、スルホベタイン１６、および１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）の第３の選択範囲を狭められた界面活性剤セットを選択した。
【0098】
３．４．ＵｎａＧにおける試料バイアス（変動性）＋ビリルビン蛍光検定評価
ｎ＝７の界面活性剤（ＡＰＯ ９、ＡＰＯ １１、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＦＡ１、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、スルホベタイン１６、および１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）の第３の選択範囲を狭められたセットのビリルビン誘導ＵｎａＧ蛍光における試料間の変動性に対する効果を評価するために、３．５～２３．７ｍｇ／ｄＬの範囲にわたる既知のＴＢＩＬ濃度を有する血漿試料（ｎ＝１２血漿試料）を用いてオンベンチマイクロタイタープレート検定評価を実施した。
ｎ＝７の界面活性剤（ＡＰＯ ９、ＡＰＯ １１、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＦＡ１、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、スルホベタイン１６、および１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）の第３の選択範囲を狭められたセットのビリルビン誘導ＵｎａＧ蛍光における試料間の変動性に対する効果を評価するために、３．５～２３．７ｍｇ／ｄＬの範囲にわたる既知のＴＢＩＬ濃度を有する血漿試料（ｎ＝１２血漿試料）を用いてオンベンチマイクロタイタープレート検定評価を実施した。
【0099】
要約すると、全ての界面活性剤を、グルコース緩衝剤中で２倍の所望の試験濃度に調整した。血漿試料（ｎ＝１２）を、洗浄剤を含まないグルコース緩衝剤で１：９に希釈した。ＵｎａＧを、洗浄剤を含まないリン酸バッファで２０μＭに希釈した。希釈した血漿試料のアリコート（１０μＬ）をマイクロタイタープレートの指定されたウェルに装填した（列あたりｎ＝８ウェル：ｎ＝１２血漿試料に対して１２列）。マルチチャンネルピペットを使用して、１０μＬアリコートの洗浄剤をｎ＝１２血漿試料の行（即ち、ｎ＝７洗浄剤ごとに１行およびグルコースバッファ対照に対して１行）にわたって分注した。プレートを室温で５分間振盪しながら培養した。培養期間の終わりに、２０μＬのＵｎａＧを各ウェルに添加し、動的蛍光を読み取った。データ分析のために、パーセントバイアス（％バイアス；グルコース緩衝剤のみの対照と比較した洗浄剤を含む試料）をｔ＝３分で比較した。
【0100】
図９Ａは、蛍光干渉をスクリーニングするのに使用された７個の界面活性剤および１２個の血漿試料についての対照からのパーセントバイアスを示す表９００である。表９００の一番上の行（灰色の影部）は、試験した各試料のＴＢＩＬ値である（即ち、３．５＝血漿試料１のＴＢＩＬ値、５．１Ｓ＝血漿試料２のＴＢＩＬ値等）。表９００の第１の列は、界面活性剤なしの対照（「グルコース緩衝剤」）および７つの洗浄剤（ＡＰＯ ９、ＡＰＯ １１、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＦＡ１、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、スルホベタイン１６、および１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）と、検定評価において使用される濃度（カッコ内）と、を示す。
【0101】
図９Ｂは、試験した７個の界面活性剤について、ｔ＝３分での界面活性剤なしの対照からのパーセントバイアスを示すプロット図９１０である。データポイントは、１２個の異なる血漿試料であり、データポイントの「列」は、Ａ＝界面活性剤なしの対照（グルコース緩衝剤のみ）、Ｂ＝ＡＰＯ９、Ｃ＝ＡＰＯ１１、Ｄ＝Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、Ｅ＝Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＦＡ１、Ｆ＝Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｇ＝スルホベタイン１６、およびＨ＝１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣである。データは、ｔ＝３分で、全てのＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ試料および１つを除く全てのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０試料が界面活性剤なしの対照の１０％以内であることを示している。Ａ＋電気湿潤（図７、変更された濃度）で増加した濃度で使用された界面活性剤の１つ（Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＦＡ１）は、ここで蛍光と干渉する。３個の界面活性剤（ＡＰＯ９、ＡＰＯ１１、およびスルホベタイン１６）は、異なる血漿試料間で非常にノイズの多い信号を有した（即ち、試料間の変動性；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０について以前に指摘された観察結果）。界面活性剤のうちの３つ（Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、および１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）は、試験した１２個の血漿試料全てで一貫していた。全ての血漿試料にわたるパーセントバイアスの一貫性を使用して、ｎ＝３の第４の選択範囲を狭められた界面活性剤セット（Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、および１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）を選択した。
【0102】
ビリルビン誘導ＵｎａＧ蛍光に対するＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、および１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ界面活性剤の効果を、１．２～１０ｍｇ／ｄＬの範囲にわたる既知のＴＢＩＬ濃度を有する６つの追加の検定評価された血漿試料を使用して更に評価した。図８では、以前に、４つの血漿試料（即ち、６．９、１３．１、１４、および２３．７）を使用した。この例では、対照（界面活性剤なし）およびＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ反応の複製を全ての血漿試料に使用した。
【0103】
図１０Ａは、蛍光干渉をスクリーニングするのに使用された３個の界面活性剤および１０の血漿試料について、ｔ＝３分での対照からのパーセントバイアスを示す表１０００である。表１０００の一番上の行（灰色の影部）は、試験した各試料のＴＢＩＬ値である（即ち、１．２＝血漿試料１のＴＢＩＬ値；４＝血漿試料２のＴＢＩＬ値、等）。表１０００の第１の列は、対照（グルコース緩衝剤）および３つの洗浄剤（Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、および１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）を示す。対照およびＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ反応に対する対照データからのパーセントバイアスは、反復値の平均である。データは、ｔ＝３分にて、１つを除く全てのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０試料が対照の１０％以内であることを示している。
【0104】
図１０Ｂは、蛍光干渉をスクリーニングするために使用された３個の界面活性剤および１０個の血漿試料について、ｔ＝１０分での対照からのパーセントバイアスを示す表１０１０である。データは、ｔ＝１０分にて、全てのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０およびＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ試料が対照の６％以内であることを示している。
【0105】
対照試料およびＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ試料の複製全体にわたっていくらかのノイズが観察された。また、ｔ＝３分での対照からのパーセントバイアスと比較して、ｔ＝１０分での対照からのパーセントバイアスが減少したことも観察された。この変動性（ノイズ）を調査するために、単一試料の複製（ｎ＝８）を使用してオンベンチ蛍光干渉検定評価を実施した。
【0106】
図１１は、変動性を評価するために使用されたオンベンチ蛍光干渉検定評価についての経時的なＲＦＵを示す表１１００である。蛍光干渉検定評価の変動係数（ＣＶ）は、ＣＶ＝５．４％（ｎ＝８複製全体にわたる）であると決定され、平均から－９．７％～＋６．４％バイアスの範囲であった。
【0107】
オンベンチ蛍光検定評価における変動は、使用される混合／ピペッティング方法（例えば、マルチチャネルピペッティング）、不十分なＵｎａＧ試薬（例えば、より高いレベルのＴＢＩＬに対する不十分なＵｎａＧ）、反応量（信号検出の経路長に対する）、および／または蛍光読み取り時間および温度（例えば、室温対３７℃）に起因し得る。これらの可能性に対処するために、オンベンチプロトコルに対していくつかの変更を加えた：（１）ＵｎａＧの濃度を１０μＭに維持しながら、試料希釈を１：３６から１：２４０（または１：１２０）に増加させた；（２）個々の試料および界面活性剤溶液をマイクロチューブで調製し、次に、マイクロタイタープレートウェルに装填した（マルチチャンネルピペッティングの使用を排除した）；（３）ハーフエリアマイクロタイタープレートにおいて、最終的な反応量を４０μＬから５０μＬに増加させた（２５％だけより長い経路長を提供する）；（４）結合反応を開始する前に、試料／界面活性剤溶液およびＵｎａＧ試薬を３７℃に予熱した；および（５）読み取り時間を１０分から２０分に増加させた。
【0108】
【0109】
３．５．Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、および１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣに対する電気湿潤改良
電気湿潤スクリーニングを実施して、蛍光干渉検定評価において使用可能であり、かつ効率的な電気湿潤を維持できる最低界面活性剤濃度を更に定義した。（図７および図８を参照して説明した）以前の電気湿潤スクリーニングは、０．０９５ｍＭおよび０．００９５ｍＭにてＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭを；０．００６ｍＭおよび０．０２４ｍＭにてＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を；０．２５ｍＭおよび１ｍＭにて１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣを使用した。
電気湿潤スクリーニングを実施して、蛍光干渉検定評価において使用可能であり、かつ効率的な電気湿潤を維持できる最低界面活性剤濃度を更に定義した。（図７および図８を参照して説明した）以前の電気湿潤スクリーニングは、０．０９５ｍＭおよび０．００９５ｍＭにてＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭを；０．００６ｍＭおよび０．０２４ｍＭにてＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を；０．２５ｍＭおよび１ｍＭにて１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣを使用した。
【0110】
この電気湿潤スクリーニングでは、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ（アラバマ州アラバスターのＡｖａｎｔｉ（登録商標）ポーラーリピッズ社から入手可能である）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ミズーリ州セントルイスのミリポア・シグマ社から入手可能である）、および１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ（アラバマ州アラバスターのＡｖａｎｔｉ（登録商標）ポーラーリピッズ社から入手可能である）の原液を作製した。以前に試験した濃度の２～３倍上下に調整した濃度を使用した。電気湿潤スクリーニングを実行して、「Ａ＋」またはボーダーラインの「Ａ」スコアで電気湿潤する最低の界面活性剤濃度を定義した。
【0111】
電気湿潤との適合性を定性的に評価するために、選択範囲を狭められたｎ＝３の界面活性剤のセットをＦＩＮＤＥＲ（登録商標）カートリッジ（ノースカロライナ州ダーラムのバービーズインコーポレイテッドから入手可能である）で試験した。この評価では、１６０μＬの界面活性剤をＦＩＮＤＥＲ（登録商標）カートリッジの希釈液リザーバに装填し、次に、カートリッジをＦＩＮＤＥＲ（登録商標）機器に配置した。ＦＩＮＤＥＲ（登録商標）機器でパネル１スクリプトを実行して、各界面活性剤の界面活性剤／希釈剤のプライミングおよび分注を個別に評価した。電気湿潤操作を（図７を参照して説明したように）視覚的に評価し、次のように文字スケールで等級付けした：Ａ＋＝望ましい、ＡおよびＡ－＝次のラウンドのスクリーニングに受け入れ可能である。
【0112】
この評価から、０．０４７５ｍＭのＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、０．０４５ｍＭのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（または０．００６％）、および１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣの自社製ストックが、蛍光干渉検定評価において効率的な電気湿潤に使用可能であることが決定された。
【0113】
３．６．更新されたＵｎａＧ蛍光プロトコルを使用した、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭおよびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０の試料バイアス（変動性）についての再試験
図１０および図１１を参照して説明した、更新されたＵｎａＧ蛍光プロトコルを使用して、既知のＴＢＩＬ濃度が１．２～１３．１ｍｇ／ｄＬの範囲にわたる血漿試料（ｎ＝４）（ディスカバリー・ライフ・サイエンス社から入手可能である）を使用して、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭおよびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０の試料間の変動性について再試験した。
図１０および図１１を参照して説明した、更新されたＵｎａＧ蛍光プロトコルを使用して、既知のＴＢＩＬ濃度が１．２～１３．１ｍｇ／ｄＬの範囲にわたる血漿試料（ｎ＝４）（ディスカバリー・ライフ・サイエンス社から入手可能である）を使用して、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭおよびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０の試料間の変動性について再試験した。
【0114】
要約すると、血漿試料（ｎ＝４）を、０．００６％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０または０．０５－ｍＭのＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭまたは０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（正の干渉対照として使用）の最終的な界面活性剤（即ち、対照試料）濃度を有するまたは有しないグルコース緩衝液で１：２４０に希釈した。ＵｎａＧは、界面活性剤を含まないリン酸緩衝液で２０μＭに希釈した。試料およびＵｎａＧ試薬は、３７℃に予熱した。次に、試料をマイクロタイタープレートの別個のウェルに、試料ごとにｎ＝２の複製で個別に装填した。次いで、ＵｎａＧを、マルチチャネルピペットを使用して各試料ウェルに等分し、ｔ＝３分およびｔ＝１０分で蛍光を読み取った。
【0115】
図１３Ａは、５．５ｍｇ／ｄＬのＴＢＩＬ血漿試料および界面活性剤Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を使用した反応における経時的なＲＦＵを示すプロット図１３００である。データは、曲線プラトーにて、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０試料（プロットライン１３２５）が対照値（プロットライン１３１５）の約５％以内であり、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０試料（プロットライン１３２０）が対照値の約９％以内であったことを示している。データは、データ曲線の形状の変化によって証明されるように、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の干渉がより早い時点でより顕著であることも示している。
【0116】
図１３２Ｂは、５．５ｍｇ／ｄＬのＴＢＩＬ血漿試料および界面活性剤Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭを使用した反応における経時的なＲＦＵを示すプロット図１３１０である。データは、曲線プラトーにて、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ試料（プロットライン１３３０）が対照値（プロットライン１３１５）の約５％以内であったことを示している。
【0117】
図１４Ａは、ＵｎａＧ蛍光検定評価におけるＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２０についてのｔ＝３分での対照からのパーセントバイアスを示す表１４００である。表１４００の一番上の行（灰色の影部）は、試験した各試料のＴＢＩＬ値である（即ち、１．２（４．０）＝血漿試料１のＴＢＩＬ値；５．５＝血漿試料２のＴＢＩＬ値、等）。反応に対する対照データ（即ち、界面活性剤なし）からのパーセントバイアスは、反復値の平均である。
【0118】
図１４Ｂは、ＵｎａＧ蛍光検定評価におけるＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭ、およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２０についてのｔ＝１０分での対照からのパーセントバイアスを示す表１４１０である。表１３１０の一番上の行（灰色の影部）は、試験した各試料のＴＢＩＬ値である（即ち、１．２（４．０）＝血漿試料１のＴＢＩＬ値；５．５＝血漿試料２のＴＢＩＬ値、等）。反応に対する対照データ（即ち、界面活性剤なし）からのパーセントバイアスは、反復値の平均である。
【0119】
図１５Ａは、１３．１ｍｇ／ｄＬのＴＢＩＬ血漿試料および界面活性剤なしの対照を使用した、ｎ＝２の反応についての経時的なＲＦＵを示すプロット図である。
【0120】
図１５Ｂは、１３．１ｍｇ／ｄＬのＴＢＩＬ血漿および０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を使用した、ｎ＝２の反応について経時的なＲＦＵを示すプロット図である。
【0121】
図１５Ｃは、１３．１ｍｇ／ｄＬのＴＢＩＬ血漿および０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を使用した、ｎ＝２の反応について経時的なＲＦＵを示すプロット図である。
【0122】
３．７．Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭを使用したＦＩＮＤＥＲ（登録商標）パネル１検定評価
新生児スクリーニングのためのマルチプレックスオンカートリッジ検定評価では、典型的に、異なる生化学的試験を実施するために、全血試料をカートリッジ上で２つ以上のアリコートに分裂させる。一例では、ＦＩＮＤＥＲ（登録商標）パネル１カートリッジは、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、アルブミン、および総ビリルビン（ＴＢＩＬ）の試験を含む。ＦＩＮＤＥＲ（登録商標）カートリッジには、全ての試料調製および検定評価試薬が含まれる。
新生児スクリーニングのためのマルチプレックスオンカートリッジ検定評価では、典型的に、異なる生化学的試験を実施するために、全血試料をカートリッジ上で２つ以上のアリコートに分裂させる。一例では、ＦＩＮＤＥＲ（登録商標）パネル１カートリッジは、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、アルブミン、および総ビリルビン（ＴＢＩＬ）の試験を含む。ＦＩＮＤＥＲ（登録商標）カートリッジには、全ての試料調製および検定評価試薬が含まれる。
【0123】
ＦＩＮＤＥＲ（登録商標）検定評価には、分注、分裂、移送、合体、および混合して、試料および試薬液滴を操作する等の複数の電気湿潤操作が含まれる。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭがＦＩＮＤＥＲ（登録商標）パネル１検定評価と干渉するか否か、および／または、検定評価においてノイズに寄与し得る電気湿潤あるいは流体不良（例えば、液滴サイズの変化によって証明される）を生じさせるか否かを判断するために、完全な検定評価プロトコルを実行した。
【0124】
要約すると、カバーを外したＦＩＮＤＥＲ（登録商標）カートリッジに、通常の希釈液、または希釈液として０．００６％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、または０．０５－ｍＭのＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭのいずれかを装填した。ＴＢＩＬレベルが高いことが知られている血漿試料を添加した全血試料を各カートリッジに装填した。カートリッジをＦＩＮＤＥＲ（登録商標）機器に挿入し、試料調製、Ｇ６ＰＤ、アルブミン、およびＴＢＩＬに対する完全なパネル１プロトコルを実行した。
【0125】
図１６は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、およびＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭランについてのＧ６ＰＤ、アルブミン（ＡＬＢ）、およびＴＢＩＬの検定評価値を示す表１６００である。全ての検定評価値は、予想した範囲およびノイズの範囲内であった。全ての電気湿潤操作が予想どおりであることを示す実行「フラグ」は、３つの実行のいずれについてもトリガーされなかった。
【0126】
３．８．Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭを使用したＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０またはＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭがＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価と（例えば、ペルオキシダーゼ反応または停止ステップにて）干渉するか否かを判断するために、完全なオンベンチＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価プロトコルを実施した。
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０またはＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭがＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価と（例えば、ペルオキシダーゼ反応または停止ステップにて）干渉するか否かを判断するために、完全なオンベンチＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価プロトコルを実施した。
【0127】
要約すると、５．１～１４ｍｇ／ｄＬの範囲の公知のＴＢＩＬ値を有する４個の血漿試料を使用して、オンベンチＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価を行った。血漿試料は、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（正の干渉対照として使用）、０．００６％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、または０．０５－ｍＭのＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭの最終的な界面活性剤（即ち、対照試料）濃度を有するまたは有しないグルコース緩衝剤で希釈した。酵素試薬（即ち、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）およびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）および停止試薬（即ち、１％のアスコルビン酸）を０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（正の干渉対照として使用）、０．００６％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０－、または０．０５－ｍＭのＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭの最終的な界面活性剤（即ち、対照試料）濃度を有するまたは有しないグルコース緩衝剤にて調製した。ＵｎａＧは、界面活性剤を含まないリン酸緩衝剤で２０μＭに希釈した。試料および酵素試薬を結合させて、一定期間培養した。培養期間の終わりに、停止緩衝剤の添加により反応を停止させ、マイクロタイタープレートの個々のウェルに移送した。次に、マルチチャンネルピペットを使用してＵｎａＧを各試料ウェルに等分し、約１分後～約２０分後に蛍光を読み取った。この例では、蛍光は、ｔ＝３分で読み取った。
【0128】
図１７は、ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ蛍光検定評価におけるＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、およびＦａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭについての対照からのパーセントバイアスを示す表１７００である。表１７００の左側の列は、試験した各試料に割り当てられたＴＢＩＬ値である（即ち、５．１ｍｇ／ｄＬ＝血漿試料１のＴＢＩＬ値；１４ｍｇ／ｄＬ＝血漿試料２のＴＢＩＬ値、等）。データは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０について界面活性剤なしの対照からのパーセントバイアス（対照－全ての試料の反応したＲＦＵ値±洗浄剤として計算）が全ての試料について５％以内であることを示しており、０．００６％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０がＵｎａＧ蛍光、ＰＯＤによるビリルビンの酸化、または１％のアスコルビン酸を使用して酸化反応を停止する能力と干渉しないことを示している。このデータはまた、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭの対照からのバイアスが２０％にも及ぶほど高かったことも示している。
【0129】
比較のために、ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ蛍光検定評価からの値（「対照－反応ＲＦＵ」；ｙ軸）を、Ａｒｒｏｗ ＵＢ Ａｎａｌｙｚｅｒ（日本、大阪のアローズ社）上で割り当てられた値（ｘ軸）に対してプロットした。「対照－反応ＲＦＵ」は、ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ酸化反応からＲＦＵを差し引いた、対照反応からのＲＦＵである（これは、非抱合型ビリルビンの総量を測定する）。「対照－反応ＲＦＵ」値は、試料中に存在する非結合型ビリルビンの代用測定を提供する。Ａｒｒｏｗ ＵＢ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、アルブミンに結合していないが非抱合型ビリルビンを特異的に検出しないビリルビンを試験する。割り当てられた非結合型ビリルビン（「Ａｒｒｏｗｓ ＵＢ（μｇ／ｄＬ）」）は、それぞれ、０．２８、０．９５、１．６７、および＞３．０μｇ／ｄＬであった。
【0130】
図１８Ａは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０についてＡｒｒｏｗ ＵＢ Ａｎａｌｙｚｅｒが割り当てた値に対するＲＦＵ（対照－反応試料）値（「対照」）の比較を示すプロット図１８００である。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０のデータポイントを矢印によって示す。
【0131】
図１８Ｂは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０についてＡｒｒｏｗ ＵＢ Ａｎａｌｙｚｅｒが割り当てた値（「シリーズ２」）に対するＲＦＵ（対照－反応試料）値（「シリーズ１」）の比較を示すプロット図１８１０である。対照データポイントと重複しないＴｗｅｅｎ８０データポイントを矢印によって示す。
【0132】
図１８Ｃは、Ｆａｃａｄｅ（登録商標）－ＴＥＭについてＡｒｒｏｗ ＵＢ Ａｎａｌｙｚｅｒが割り当てた値に対するＲＦＵ（対照－反応試料）値（「対照」）の比較を示すプロット図１８２０である。対照データポイントと重複しないＦａcａｄｅ－ＴＥＭデータポイントを矢印によって示す。
【0133】
図１９は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０についてＡｒｒｏｗ ＵＢ Ａｎａｌｙｚｅｒが割り当てた値（プロットライン１９２０）に対するＲＦＵ（対照－反応試料）値（プロットライン１９１０）の下位３つのデータポイントの比較を示すプロット図１８１０の拡大図である。対照：ｙ＝２６３７．１ｘ＋１１４９．２、Ｒ２＝０．９９２８；Ｔｗｅｅｎ８０：ｙ＝２５５３．５ｘ＋１０９１．６、Ｒ２＝０．９９２。
【0134】
３．９．Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を使用した方法の比較
オンベンチＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価とオンカートリッジＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価との間の比較を、０．３～２３．７ｍｇ／ｄＬの範囲の既知のＴＢＩＬ値を有する７個の血漿試料を使用して実施した。オンベンチ検定評価は、界面活性剤なしで実施した。オンカートリッジ検定評価は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を使用して実施した。オンカートリッジ検定評価では、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の濃度は、約０．０１％～約１％であることができ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０の濃度は、約０．００６％～約０．０２４％であることができる。この例では、オンカートリッジ検定評価で使用された濃度は、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０および０．００６％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０であった。
オンベンチＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価とオンカートリッジＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価との間の比較を、０．３～２３．７ｍｇ／ｄＬの範囲の既知のＴＢＩＬ値を有する７個の血漿試料を使用して実施した。オンベンチ検定評価は、界面活性剤なしで実施した。オンカートリッジ検定評価は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を使用して実施した。オンカートリッジ検定評価では、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の濃度は、約０．０１％～約１％であることができ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０の濃度は、約０．００６％～約０．０２４％であることができる。この例では、オンカートリッジ検定評価で使用された濃度は、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０および０．００６％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０であった。
【0135】
図２０は、オンカートリッジＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価についてのＲＦＵ値およびオンベンチＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価についての「対照－反応」ＲＦＵ値を示す表２０００である。ＴＢＩＬ血漿試料およびそのＴＢＩＬ値は、「試料」列に示されている。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を使用して実行されたオンカートリッジ検定評価の生のＲＦＵ値は、表２０００の第２および第３の列に示されている（即ち、「Ｔｗｅｅｎ ２０ ＲＦＵ」および「Ｔｗｅｅｎ ８０ ＲＦＵ」）。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０検定評価で得られたＲＦＵデータには、機器に依存する蛍光変動の補正係数を適用し、表２０００の第４および第５の列に示した（即ち、「Ｔｗｅｅｎ ２０ Ｃ＿ＲＦＵ」および「Ｔｗｅｅｎ ８０ Ｃ＿ＲＦＵ」）。オンベンチＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ検定評価の対照－反応ＲＦＵ値（界面活性剤を添加していない）は、「ベンチ」と表示された列に示されている。
【0136】
図２１Ａは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を使用してカートリッジ上で得られたＲＦＵ（対照－反応試料）値対ＤＬＳ ＴＢＩＬを示すプロット図２１００である。データは、機器に依存する蛍光変動の補正を適用してプロットした。
【0137】
図２１Ｂは、オンベンチ検定評価で得られたＲＦＵに対する、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を使用してカートリッジ上で得られたＲＦＵ（対照－反応試料）値を示すプロット図２１１０である。データは、機器に依存する蛍光変動の補正を適用してプロットした。
【0138】
前述の主題を、理解を明確にする目的で図解および例示としてある程度詳細に説明してきたが、当業者は、特定の変更および修正が添付の特許請求の範囲の範囲内で実施され得ることを理解されよう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【国際調査報告】