特表 2023-540797 塩基編集酵素

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-26

(54)【発明の名称】塩基編集酵素

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20230919BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20230919BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20230919BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230919BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230919BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230919BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230919BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230919BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230919BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N9/22 ZNA

C12N15/55

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K19/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023516057

(86)(22)【出願日】2021-09-10

(85)【翻訳文提出日】2023-05-10

(86)【国際出願番号】 US2021049962

(87)【国際公開番号】W WO2022056324

(87)【国際公開日】2022-03-17

(31)【優先権主張番号】63/077,057

(32)【優先日】2020-09-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/222,351

(32)【優先日】2021-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＹＴＨＯＮ

２．ＭＡＴＬＡＢ

(71)【出願人】

【識別番号】522185863

【氏名又は名称】メタゲノミ，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リン，ジュン－リャン

(72)【発明者】

【氏名】ブルックス，アラン

(72)【発明者】

【氏名】バターフィールド，クリスティーナ

(72)【発明者】

【氏名】ブラウン，クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】カステレ，シンディー

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA26X

4B065AA93X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4H045AA10

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA89

4H045FA74

(57)【要約】

【解決手段】本開示は、際立ったドメイン特徴を有するエンドヌクレアーゼ酵素と、上記のような酵素またはその変異体を使用する方法とを提供する。
【選択図】図９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

操作された核酸編集系であって、前記操作された核酸編集系は、
（ａ）ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、前記エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、前記エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼと、
（ｂ）前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、
（ｃ）前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された、操作されたガイドリボ核酸構造であって、
ｉ．標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、
ｉｉ．前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列、を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、
を含む、操作された核酸編集系。

【請求項2】

前記ＲｕｖＣドメインは、ヌクレアーゼ活性を欠いている、請求項１に記載の操作された核酸編集系。

【請求項3】

前記エンドヌクレアーゼは二本鎖標的のデオキシリボ核酸の１つの鎖を切断するように構成される、請求項１に記載の操作された核酸編集系。

【請求項4】

前記クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼは、ニッカーゼ変異を含む、請求項１または２に記載の操作された核酸編集系。

【請求項5】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～４のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項6】

前記クラス２、タイプＩＩのエンドヌクレアーゼは、最適に整列した際、配列番号７０に対する残基９、配列番号７１、７２、または７４に対する残基１３、配列番号７３に対する残基１２、配列番号７５に対する残基１７、配列番号７６に対する残基２３、または配列番号５９７に対する残基１０においてアスパラギン酸からアラニンへの変異を含む、請求項１～５のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項7】

前記エンドヌクレアーゼは、最適に整列した際、配列番号７０に対する残基９、配列番号７２に対する残基１３、または配列番号７５に対する残基１７においてアスパラギン酸からアラニンへの変異を含む、請求項１～５のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項8】

操作された核酸編集系であって、前記操作された核酸編集系は、
（ａ）配列番号７０～７８、５９６、または５９７～５９８のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼと、
（ｂ）前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、
（ｃ）前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された、操作されたガイドリボ核酸構造であって、
ｉ．標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、
ｉｉ．前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列、を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、
を含む、操作された核酸編集系。

【請求項9】

操作された核酸編集系であって、前記操作された核酸編集系は、
（ａ）配列番号３６０～３６８または５９８のいずれか１つあるいはその変異体を含む、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されたエンドヌクレアーゼであって、
前記エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、
前記エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼと、
（ｂ）前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、
（ｃ）前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された、操作されたガイドリボ核酸構造であって、
ｉ．標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、
ｉｉ．前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列、を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、
を含む、操作された核酸編集系。

【請求項10】

前記エンドヌクレアーゼは、ニッカーゼ変異を含む、請求項９に記載の操作された核酸編集系。

【請求項11】

前記エンドヌクレアーゼは二本鎖標的のデオキシリボ核酸の１つの鎖を切断するように構成される、請求項９に記載の操作された核酸編集系。

【請求項12】

前記クラス２、タイプＩＩのエンドヌクレアーゼは、最適に整列した際、配列番号７０に対する残基９、配列番号７１、７２、または７４に対する残基１３、配列番号７３に対する残基１２、配列番号７５に対する残基１７、配列番号７６に対する残基２３、または配列番号５９７に対する残基１０においてアスパラギン酸からアラニンへの変異を含む、請求項９に記載の操作された核酸編集系。

【請求項13】

前記塩基エディターは、配列番号１～５１、５７～６６、３８５～４４３、４４４～４７５、または５９４～５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む、請求項９に記載の操作された核酸編集系。

【請求項14】

前記塩基エディターは、配列番号５０～５１または３８５～３９０のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む、請求項９に記載の操作された核酸編集系。

【請求項15】

前記エンドヌクレアーゼはヌクレアーゼ活性が欠けているＲｕｖＣドメインを含む、請求項８～１４のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項16】

前記エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する、請求項８～１５のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項17】

前記エンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼに対して８０％未満の同一性を有する、請求項８～１６のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項18】

前記エンドヌクレアーゼはＨＮＨドメインをさらに含む、請求項８～１７のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項19】

前記操作されたガイドリボ核酸配列は、配列番号８８～９６または４８８～４８９のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～１８のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項20】

操作された核酸編集系であって、前記操作された核酸編集系は、
（ａ）操作されたガイドリボ核酸構造であって、前記操作されたガイドリボ核酸構造が、
（ｉ）標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、
（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列を含み、
前記操作されたリボ核酸配列は、配列番号８８～９６または４８８～４８９のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、
（ｂ）前記操作されたガイドリボ核酸に結合するように構成された、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼと、
（ｃ）前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、
を含む、操作された核酸編集系。

【請求項21】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号３６０～３６８または５９８からなる群から選択されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成される、請求項２０に記載の操作された核酸編集系。

【請求項22】

前記塩基エディターは、配列番号１～５１、５７～６６、３８５～４４３、４４４～４７５、または５９４～５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１～２１のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項23】

前記塩基エディターは、配列番号５０～５１または３８５～３９０のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１～２２のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項24】

前記塩基エディターはアデニンデアミナーゼである、請求項１～２２のいずれかつに記載の操作された核酸編集系。

【請求項25】

前記アデノシンデアミナーゼは、配列番号５０～５１、５７、３８５～４４３、４４８～４７５、または５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２３に記載の操作された核酸編集系。

【請求項26】

前記塩基エディターはシトシンデアミナーゼである、請求項１～２２のいずれかつに記載の操作された核酸編集系。

【請求項27】

前記シトシンデアミナーゼは、配列番号１～４９、４４４～４４７、５９４、または５８～６６のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２６に記載の操作された核酸編集系。

【請求項28】

前記エンドヌクレアーゼまたは前記塩基エディターに連結されたウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を含む、請求項１～２７のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項29】

前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）は、配列番号５２～５６または配列番号６７のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２８に記載の操作された核酸編集系。

【請求項30】

前記操作されたガイドリボ核酸構造は、少なくとも２つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む、請求項１～２９のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項31】

前記操作されたガイドリボ核酸構造は、前記ガイドリボ核酸配列と、エンドヌクレアーゼに結合するように構成された前記リボ核酸配列とを含む１つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む、請求項１～２９のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項32】

前記ガイドリボ核酸配列は、原核生物、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、またはヒトのゲノム配列に相補的である、請求項１～３１のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項33】

前記ガイドリボ核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である、請求項１～３２のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項34】

前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端に近接する１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項１～３３のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項35】

前記ＮＬＳは、配列番号３６９～３８４から選択されたものまたはその変異体に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項３４に記載の操作された核酸編集系。

【請求項36】

前記エンドヌクレアーゼは、前記塩基エディターに直接共有結合されるか、リンカーを介して前記塩基エディターに共有結合される、請求項１～３５のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項37】

ポリペプチドは前記エンドヌクレアーゼと前記塩基エディターを含む、請求項３６に記載の操作された核酸編集系。

【請求項38】

前記エンドヌクレアーゼは二本鎖標的のデオキシリボ核酸の１つの鎖を切断するように構成される、請求項１～３７のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項39】

前記核酸編集系は、Ｍｇ^２＋の供給源をさらに含む、請求項１～３８のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項40】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号７０、７１、７３、７４、７６、７８、７７、または７８のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一の配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号８８、８９、９１、９２、９４、９６、９５、または４８８のいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一の配列を含み、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号３６０、３６１、３６３、３６５、３６７、または３６８のいずれか１つを含むＰＡＭに結合するよう構成され、あるいは、
ｄ）前記塩基エディターは、配列番号５８または５９５あるいはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一の配列を含む、
請求項１～３９のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項41】

ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号７０、７１、または７８のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一の配列を含み、
ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号８８、８９、または９６の少なくとも１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一の配列を含み、
ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号３６０、３６２、または３６８のいずれか１つを含むＰＡＭに結合するよう構成され、あるいは、
ｄ）前記塩基エディターは、配列番号５９４またはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一の配列を含む、
請求項１～３９のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項42】

前記配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される、請求項１～４１のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項43】

前記配列同一性は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびイグジステンス１１、エクステンション１でのギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスのパラメータを使用して、および条件付き構成スコアマトリックス調整を使用する前記ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される、請求項４２に記載の操作された核酸編集系。

【請求項44】

前記エンドヌクレアーゼは、触媒的に死滅するように構成される、請求項１～４３のいずれか１つに記載の操作された核酸編集系。

【請求項45】

生物における発現のために最適化された操作された核酸配列を含む核酸であって、前記核酸は、塩基エディターに連結したクラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼをコードし、前記エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する、核酸。

【請求項46】

生物における発現のために最適化された操作された核酸配列を含む核酸であって、前記核酸は、塩基エディターに連結した配列番号７０～７８のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼをコードする、核酸。

【請求項47】

前記エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端に近接する１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をコードする配列を含んでいる、請求項４４～４６のいずれか１つに記載の核酸。

【請求項48】

前記ＮＬＳは、配列番号３６９～３８４から選択されたものまたはその変異体に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項４７に記載の核酸。

【請求項49】

前記生物は、原核生物、細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、げっ歯類、またはヒトである、請求項４４～４８のいずれか１つに記載の核酸。

【請求項50】

塩基エディターに連結されたクラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むベクターであって、前記エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する、ベクター。

【請求項51】

請求項４４～４９のいずれかに記載の核酸を含むベクター。

【請求項52】

前記ベクターは、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造をコードする核酸をさらに含み、前記操作されたガイドリボ核酸構造は、
ａ）標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、
ｂ）前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列を含む、
請求項５０～５１のいずれかに記載のベクター。

【請求項53】

前記ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ＣＥＬｉＤ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のビリオン、またはレンチウイルスである、請求項５０～５２のいずれかに記載のベクター。

【請求項54】

請求項５０～５３のいずれかに記載のベクターを含む細胞。

【請求項55】

請求項５４に記載の細胞を培養する工程を含む、エンドヌクレアーゼを製造する方法。

【請求項56】

二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを改変するための方法であって、前記方法は、
複合体に前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを接触させる工程を含み、前記複合体は、
ａ．ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、前記エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、前記ＲｕｖＣドメインはヌクレアーゼ活性を欠いている、エンドヌクレアーゼと、
ｂ．前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、
ｃ．前記エンドヌクレアーゼおよび前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドに結合するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造であって、前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、
を含む、方法。

【請求項57】

ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含む前記エンドヌクレアーゼは、前記塩基エディターに直接共有結合されるか、リンカーを介して前記塩基エディターに共有結合される、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインを含む前記エンドヌクレアーゼは、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項５６または５７に記載の方法。

【請求項59】

前記エンドヌクレアーゼは、最適に整列した際、配列番号７０に対する残基９、配列番号７１、７２、または７４に対する残基１３、配列番号７３または７８に対する残基１２、配列番号７５に対する残基１７、配列番号７６に対する残基２３、配列番号７７に対する残基８、あるいは配列番号５９７に対する残基１０においてアスパラギン酸からアラニンへの変異を含む、請求項５６～５７のいずれか１つに記載の方法。

【請求項60】

前記エンドヌクレアーゼは、最適に整列した際、配列番号７０に対する残基９、配列番号７２に対する残基１３、または配列番号７５に対する残基１７においてアスパラギン酸からアラニンへの変異を含む、請求項５６～５７のいずれか１つに記載の方法。

【請求項61】

二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを改変するための方法であって、前記方法は、
複合体に前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを接触させる工程を含み、前記複合体は、
クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼと、
前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、
前記エンドヌクレアーゼおよび前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドに結合するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造と、
を含み、
ここで、前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、前記ＰＡＭが配列番号７０～７８または５９７からなる群から選択された配列を含む、方法。

【請求項62】

前記クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼは、前記塩基エディターに共有結合されるか、リンカーを介して前記塩基エディターに共有結合される、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記塩基エディターは、配列番号１～５１、５７～６６、３８５～４４３、４４４～４７５、または５９４～５９５から選択される配列あるいはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項６１または６２に記載の方法。

【請求項64】

前記塩基エディターはアデニンデアミナーゼを含み、
前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドはアデニンを含み、および、
前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリペプチドの改変は、前記アデニンをグアニンに変換することを含む、請求項６１～６３のいずれか１つに記載の方法。

【請求項65】

前記アデニンデアミナーゼは、配列番号５０～５１、５７、３８５～４４３、４４８～４７５、または５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記塩基エディターはシトシンデアミナーゼを含み、
前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドはシトシンを含み、および、
前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリペプチドの改変は、前記シトシンをウラシルに変換することを含む、請求項６１～６３のいずれか１つに記載の方法。

【請求項67】

前記シトシンデアミナーゼは、配列番号１～４９、４４４～４４７、５９４、または５８～６６のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記複合体は、前記エンドヌクレアーゼまたは前記塩基エディターに連結されたウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項６１～６７のいずれか１つに記載の方法。

【請求項69】

前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号５２～５６または配列番号６７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、前記操作されたガイドリボ核酸構造の配列に相補的な配列を含む第１の鎖と、前記ＰＡＭを含む第２の鎖とを含む、請求項６１～６９のいずれか１つに記載の方法。

【請求項71】

前記ＰＡＭは、前記操作されたガイドリボ核酸構造の前記配列に相補的な前記配列の３’末端に直接隣接する、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない、請求項６１～７１のいずれか１つに記載の方法。

【請求項73】

前記クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼは、未培養の微生物に由来する、請求項６１～７２のいずれか１つに記載の方法。

【請求項74】

前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、真核生物、植物、真菌、哺乳動物、げっ歯類、またはヒト二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドである、請求項６１～７３のいずれか１つに記載の方法。

【請求項75】

標的核酸遺伝子座を改変する方法であって、前記方法は、前記標的核酸遺伝子座に、請求項１～４４のいずれか１つに記載の前記操作された核酸編集系を送達する工程を含み、前記エンドヌクレアーゼが、前記操作されたガイドリボ核酸構造と複合体を形成するように構成され、前記複合体は、前記標的核酸遺伝子座に結合すると、前記標的核酸遺伝子座のヌクレオチドを改変するように構成される、方法。

【請求項76】

前記操作された核酸編集系は、アデニンデアミナーゼを含み、前記ヌクレオチドはアデニンであり、前記標的核酸遺伝子座を改変することは、前記アデニンをグアニンに変換することを含む、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記操作された核酸編集系は、シチジンデアミナーゼおよびウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤を含み、前記ヌクレオチドはシトシンであり、前記標的核酸遺伝子座を改変することは、前記アデニンをウラシルに変換することを含む、請求項７５に記載の方法。

【請求項78】

前記標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または細菌ＤＮＡを含む、請求項７５～７７のいずれか１つに記載の方法。

【請求項79】

前記標的核酸遺伝子座は、インビトロである、請求項７５～７８のいずれか１つに記載の方法。

【請求項80】

前記標的核酸遺伝子座は、細胞内にある、請求項７５～７８のいずれか１つに記載の方法。

【請求項81】

前記細胞は、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、霊長類細胞、またはヒト細胞である、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記細胞は動物内にある、請求項８０～８１のいずれか１つに記載の方法。

【請求項83】

前記細胞は蝸牛内にある、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記細胞は胚内にある、請求項８０～８１のいずれか１つに記載の方法。

【請求項85】

前記胚は２細胞胚である、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記胚はマウス胚である、請求項８４に記載の方法。

【請求項87】

前記標的核酸遺伝子座に前記操作された核酸編集系を送達することは、請求項４６～４９のいずれかに記載の核酸、あるいは請求項５０～５３のいずれかに記載のベクターを送達することを含む、請求項７５～８６のいずれか１つに記載の方法。

【請求項88】

前記操作された核酸編集系を前記標的核酸遺伝子座に送達することは、前記エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を送達することを含む、請求項７５～８７のいずれか１つに記載の方法。

【請求項89】

前記核酸は、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

前記操作された核酸編集系を前記標的核酸遺伝子座に送達することは、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡを送達することを含む、請求項７５～８９のいずれか１つに記載の方法。

【請求項91】

前記操作された核酸編集系を前記標的核酸遺伝子座に送達することは、ポリペプチドを送達することを含む、請求項７５～８６のいずれか１つに記載の方法。

【請求項92】

前記操作された核酸編集系を前記標的核酸遺伝子座に送達することは、リボ核酸（ＲＮＡ）ポリＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された前記操作されたガイドリボ核酸構造をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を送達することを含む、請求項７５～８６のいずれか１つに記載の方法。

【請求項93】

操作された核酸編集ポリペプチドであって、前記操作された核酸編集ポリペプチドは、
ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、前記エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、前記ＲｕｖＣドメインはヌクレアーゼ活性を欠いている、エンドヌクレアーゼと、
前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、
を含む、操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項94】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項９３に記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項95】

操作された核酸編集ポリペプチドであって、前記操作された核酸編集ポリペプチドは、
配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼはヌクレアーゼ活性が欠けているＲｕｖＣドメインを含む、エンドヌクレアーゼと、
前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、
を含む、操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項96】

操作された核酸編集ポリペプチドであって、前記操作された核酸編集ポリペプチドは、
配列番号３６０～３６８または５９８のいずれか１つを含む、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されたエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、前記エンドヌクレアーゼはヌクレアーゼ活性が欠けているＲｕｖＣドメインを含む、エンドヌクレアーゼと、
前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、
を含む、操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項97】

前記エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する、請求項９５または請求項９６に記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項98】

前記エンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼに対して８０％未満の同一性を有する、請求項９３～９７のいずれか１つに記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項99】

前記エンドヌクレアーゼはＨＮＨドメインをさらに含む、請求項９５～９８のいずれか１つに記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項100】

前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、配列番号８８～９６、４８８、および４８９のいずれか１つから選択される約６０～９０個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項９５～９９のいずれか１つに記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項101】

前記塩基エディターは、配列番号１～５１、５７～６６、３８５～４４３、４４４～４７５、または５９４～５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む、請求項９３～１００のいずれか１つに記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項102】

前記塩基エディターはアデニンデアミナーゼである、請求項９３～１０１のいずれか１つに記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項103】

前記アデノシンデアミナーゼは、配列番号５０～５１、５７、３８５～４４３、４４８～４７５、または５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０２に記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項104】

前記塩基エディターはシトシンデアミナーゼである、請求項９３～１０１のいずれか１つに記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項105】

前記シトシンデアミナーゼは、配列番号１～４９、４４４～４４７、５９４、または５８～６６のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０４に記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項106】

操作された核酸編集ポリペプチドであって、前記操作された核酸編集ポリペプチドは、
ヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼと、
前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターであって、前記塩基エディターは、配列番号１～５１、３８５～３８６、３８７～４４３、４４４～４４７、４８８～４７５、または５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む、塩基エディターと、
を含む、操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項107】

前記エンドヌクレアーゼは二本鎖標的のデオキシリボ核酸の１つの鎖を切断するように構成される、請求項１０６に記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項108】

前記エンドヌクレアーゼは、触媒的に死滅するように構成される、請求項１０６に記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項109】

前記エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、請求項１０６～１０８のいずれか１つに記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項110】

前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼ、またはクラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエンドヌクレアーゼである、請求項１０９に記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項111】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０６に記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項112】

前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ニッカーゼ変異を含む、請求項１０９～１１１のいずれか１つに記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項113】

前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号７０に対する残基９、配列番号７１、７２、または７４に対する残基１３、配列番号７３に対する残基１２、配列番号７５に対する残基１７、配列番号７６に対する残基２３、または配列番号５９７に対する残基１０においてアスパラギン酸からアラニンへの変異を含む、請求項１１２に記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項114】

前記エンドヌクレアーゼは、配列番号３６０～３６８または５９８からなる群から選択されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成される、請求項１０９～１１３のいずれか１つに記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項115】

前記塩基エディターはアデニンデアミナーゼである、請求項１０６～１１４のいずれか１つに記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項116】

前記アデノシンデアミナーゼは、配列番号５０～５１、３８５～４４３、４４８～４７５、または５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１１５に記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項117】

前記アデノシンデアミナーゼは、配列番号５０～５１、３８５～３９０、または５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１１６に記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項118】

前記塩基エディターはシトシンデアミナーゼである、請求項１０６～１１４のいずれか１つに記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項119】

前記シトシンデアミナーゼは、配列番号１～４９、４４４～４４７のいずれか１つまたはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１１８に記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項120】

前記エンドヌクレアーゼまたは前記塩基エディターに連結されたウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をさらに含む、請求項１０６～１１９のいずれか１つに記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項121】

前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号５２～５６または配列番号６７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１２０に記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項122】

前記エンドヌクレアーゼを含むポリペプチドは、前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端に近接する１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、請求項１０６～１２１のいずれか１つに記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項123】

前記ＮＬＳは、配列番号３６９～３８４から選択されたものまたはその変異体に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項１２２に記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項124】

前記エンドヌクレアーゼは、前記塩基エディターに直接共有結合されるか、リンカーを介して前記塩基エディターに共有結合される、請求項１０６～１２３のいずれか１つに記載の操作された核酸編集ポリペプチド。

【請求項125】

生物における発現のために最適化された操作された核酸配列を含む核酸であって、前記核酸は、配列番号１～５１、３８５～３８６、３８７～４４３、４４４～４４７、４８８～４７５、または５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列をコードする、核酸。

【請求項126】

前記生物は、原核生物、細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、げっ歯類、またはヒトである、請求項１２５に記載の核酸。

【請求項127】

請求項１２５～１２６のいずれかに記載の核酸を含むベクター。

【請求項128】

前記ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ＣＥＬｉＤ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のビリオン、またはレンチウイルスである、請求項１２７に記載のベクター。

【請求項129】

請求項１２７～１２８のいずれかに記載のベクターを含む細胞。

【請求項130】

請求項１２９に記載の細胞を培養する工程を含む、塩基エディターを製造する方法。

【請求項131】

系であって、
（ａ）請求項１０６～１２４のいずれか１つに記載の核酸編集ポリペプチドと、
（ｂ）前記核酸編集ポリペプチドと複合体を形成するように構成された、操作されたガイドリボ核酸構造であって、
ｉ．標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、
ｉｉ．前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列、を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、
を含む、系。

【請求項132】

前記操作されたガイドリボ核酸配列は、配列番号８８～９６または４８８～４８９のいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１３１に記載の系。

【請求項133】

標的核酸遺伝子座を改変する方法であって、前記方法は、前記標的核酸遺伝子座に、請求項１０６～１２４のいずれか１つに記載の前記操作された核酸編集ポリペプチド、あるいは請求項１３１～１３２に記載の系を送達する工程を含み、前記複合体は、前記標的核酸遺伝子座に結合すると、前記標的核酸遺伝子座のヌクレオチドを改変するように構成される、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０２０年９月１１日に出願された「ＢＡＳＥ ＥＤＩＴＩＮＧ ＥＮＺＹＭＥＳ」という表題の米国仮特許出願第６３／０７７，０５７号、および、２０２１年７月１５日に出願された「ＢＡＳＥ ＥＤＩＴＩＮＧ ＥＮＺＹＭＥＳ」という表題の米国仮特許出願第６３／２２２，３５１号の利益を主張するものであり、上記文献はそれぞれ全体として本明細書に組み込まれている。

【背景技術】

【0002】

Ｃａｓ酵素は、それらに関連するＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し）（ＣＲＩＳＰＲ）ガイドリボ核酸（ＲＮＡ）とともに、原核生物免疫系の広範な（細菌の約４５％、古細菌の約８４％）成分であると思われ、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡガイド核酸切断によって感染ウイルスおよびプラスミドなどの非自己核酸に対してその微生物を守る役割を担う。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡエレメントをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エレメントは、構造および長さにおいて比較的保存され得る一方で、そのＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は非常に多様であり、様々な核酸相互作用ドメインを含む。ＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡエレメントは１９８７年に発見されているが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ切断能力は比較的最近になって認識され、多様なＤＮＡ操作や遺伝子編集用途に組換えＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が使用されるようになっている。

【0003】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０２１年９月９日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、５５９２１－７１５＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、７０５，３０５バイトのサイズである。

【発明の概要】

【0004】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集系を提供し、前記操作された核酸編集系は、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、前記エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、前記エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼと、前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された、操作されたガイドリボ核酸構造であって、標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列、を含む、操作されたガイドリボ核酸構造とを含む。いくつかの実施形態では、前記ＲｕｖＣドメインは、ヌクレアーゼ活性を欠いている。いくつかの実施形態では、前記クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼは、ニッカーゼ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼは、最適に整列した際、配列番号７０に対する残基９、配列番号７１、７２、または７４に対する残基１３、配列番号７３に対する残基１２、配列番号７５に対する残基１７、配列番号７６に対する残基２３、または配列番号５９７に対する残基１０においてアスパラギン酸からアラニンへの変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、最適に整列した際、配列番号７０に対する残基９、配列番号７２に対する残基１３、または配列番号７５に対する残基１７においてアスパラギン酸からアラニンへの変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集系を提供し、前記操作された核酸編集系は、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼと、前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された、操作されたガイドリボ核酸構造であって、標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列、を含む、操作されたガイドリボ核酸構造とを含む。いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集系を提供し、前記操作された核酸編集系は、配列番号３６０～３６８または５９８のいずれか１つあるいはその変異体を含む、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されたエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、前記エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼと、前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された、操作されたガイドリボ核酸構造であって、標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列、を含む、操作されたガイドリボ核酸構造とを含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、ニッカーゼ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは二本鎖標的のデオキシリボ核酸の１つの鎖を切断するように構成される。いくつかの実施形態では、前記クラス２、タイプＩＩのエンドヌクレアーゼは、最適に整列した際、配列番号７０に対する残基９、配列番号７１、７２、または７４に対する残基１３、配列番号７３に対する残基１２、配列番号７５に対する残基１７、配列番号７６に対する残基２３、または配列番号５９７に対する残基１０においてアスパラギン酸からアラニンへの変異を含む。いくつかの実施形態では、前記塩基エディターは、配列番号１～５１、５７～６６、３８５～４４３、４４４～４７５、または５９４～５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記塩基エディターは、配列番号５０～５１または３８５～３９０のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＲｕｖＣドメインは、ヌクレアーゼ活性を欠いている。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼに対して８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼはＨＮＨドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドリボ核酸配列は、配列番号８８～９６または４８８～４８９のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集系を提供し、前記操作された核酸編集系は、操作されたガイドリボ核酸構造であって、前記操作されたガイドリボ核酸構造が、標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列を含み、前記操作されたリボ核酸配列は、配列番号８８～９６または４８８～４８９のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、前記操作されたガイドリボ核酸に結合するように構成された、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼと、前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、を含む。いくつかの実施形態では、前記塩基エディターは、配列番号５０～５１または３８５～３９０のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、配列番号３６０～３６８または５９８からなる群から選択されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成される。いくつかの実施形態では、前記塩基エディターは、配列番号１～５１、５７～６６、３８５～４４３、４４４～４７５、または５９４～５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記塩基エディターはアデニンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼは、配列番号５０～５１、５７、３８５～４４３、４４８～４７５、または５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記塩基エディターはシトシンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、前記シトシンデアミナーゼは、配列番号１～４９、４４４～４４７、５９４、または５８～６６のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、系は、前記エンドヌクレアーゼまたは前記塩基エディターに連結されたウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号５２～５６または配列番号６７のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドリボ核酸構造は、少なくとも２つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドリボ核酸構造は、前記ガイドリボ核酸配列と前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列とを含む１つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドリボ核酸配列は、原核生物、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、またはヒトのゲノム配列に相補的である。いくつかの実施形態では、前記ガイドリボ核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端に近接する１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、前記ＮＬＳは、配列番号３６９～３８４から選択されたものまたはその変異体に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、前記塩基エディターに直接共有結合されるか、リンカーを介して前記塩基エディターに共有結合される。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、最適に整列した際、配列番号７０に対する残基９、配列番号７１、７２、または７４に対する残基１３、配列番号７３または７８に対する残基１２、配列番号７５に対する残基１７、配列番号７６に対する残基２３、配列番号７７に対する残基８、あるいは配列番号５９７に対する残基１０においてアスパラギン酸からアラニンへの変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、最適に整列した際、配列番号７０に対する残基９、配列番号７２に対する残基１３、または配列番号７５に対する残基１７においてアスパラギン酸からアラニンへの変異を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは前記エンドヌクレアーゼと前記塩基エディターを含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは二本鎖標的のデオキシリボ核酸の１つの鎖を切断するように構成される。いくつかの実施形態では、システムは、Ｍｇ^２＋の供給源をさらに含む。いくつかの実施形態では、（ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号７０、７１、７３、７４、７６、７８、７７、または７８のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一の配列を含み、（ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号８８、８９、９１、９２、９４、９６、９５、または４８８のいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一の配列を含み、（ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号３６０、３６１、３６３、３６５、３６７、または３６８のいずれか１つを含むＰＡＭに結合するよう構成され、あるいは、（ｄ）前記塩基エディターは、配列番号５８または５９５あるいはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号７０、７１、または７８のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一の配列を含み、（ｂ）前記ガイドＲＮＡ構造は、配列番号８８、８９、または９６の少なくとも１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一の配列を含み、（ｃ）前記エンドヌクレアーゼは、配列番号３６０、３６２、または３６８のいずれか１つを含むＰＡＭに結合するよう構成され、あるいは、（ｄ）前記塩基エディターは、配列番号５９４またはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、前記配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される。いくつかの実施形態では、前記配列同一性は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびイグジステンス１１、エクステンション１でのギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリ
ックスのパラメータを使用して、および条件付き構成スコアマトリックス調整を使用する前記ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、触媒的に死滅するように構成される。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは二本鎖標的のデオキシリボ核酸の１つの鎖を切断するように構成される。

【0005】

いくつかの態様において、本開示は、生物における発現のために最適化された操作された核酸配列を含む核酸を提供し、前記核酸は、塩基エディターに連結したクラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼをコードし、前記エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する。

【0006】

いくつかの態様において、本開示は、生物における発現のために最適化された操作された核酸配列を含む核酸を提供し、前記核酸は、塩基エディターに連結した配列番号７０～７８のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端に近接する１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をコードする配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、前記ＮＬＳは、配列番号３６９～３８４から選択されたものまたはその変異体に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記生物は、原核生物、細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、げっ歯類、またはヒトである。

【0007】

いくつかの態様において、本開示は、塩基エディターに連結されたクラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むベクターを提供し、前記エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する。

【0008】

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかの核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造をコードする核酸を含み、操作されたガイドリボ核酸構造は、標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ＣＥＬｉＤ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のビリオン、またはレンチウイルスである。

【0009】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される態様または実施形態のうちのいずれかのベクターを含む細胞を提供する。

【0010】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される態様または実施形態のうちのいずれかの細胞を培養する工程を含む、エンドヌクレアーゼを製造する方法を提供する。

【0011】

いくつかの態様では、本開示は、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを改変するための方法を提供し、上記方法は、複合体に前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを接触させる工程を含み、前記複合体は、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、前記エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、前記エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼと、前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、前記エンドヌクレアーゼおよび前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドに結合するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造であって、前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、を含む。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含む前記エンドヌクレアーゼは、前記塩基エディターに直接共有結合されるか、リンカーを介して前記塩基エディターに共有結合される。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインを含む前記エンドヌクレアーゼは、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。

【0012】

いくつかの態様では、本開示は、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを改変するための方法を提供し、上記方法は、複合体に前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを接触させる工程を含み、前記複合体は、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼと、前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、前記エンドヌクレアーゼおよび前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドに結合するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造とを含み、ここで、前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、前記ＰＡＭは配列番号７０～７８または５９７からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、前記クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼは、前記塩基エディターに共有結合されるか、リンカーを介して前記塩基エディターに共有結合される。いくつかの実施形態では、前記塩基エディターは、配列番号１～５１、５７～６６、３８５～４４３、４４４～４７５、または５９４～５９５から選択される配列あるいはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記塩基エディターはアデニンデアミナーゼを含み、前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドはアデニンを含み、および、前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリペプチドの改変は、前記アデニンをグアニンに変換することを含む。いくつかの実施形態では、前記アデニンデアミナーゼは、配列番号５０～５１、５７、３８５～４４３、４４８～４７５、または５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記塩基エディターはシトシンデアミナーゼを含み、前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドはシトシンを含み、および、前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリペプチドの改変は、前記シトシンをウラシルに変換することを含む。いくつかの実施形態では、前記シトシンデアミナーゼは、配列番号１～４９、４４４～４４７、５９４、または５８～６６のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記複合体は、前記エンドヌクレアーゼまたは前記塩基エディターに連結されたウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号５２～５６または配列番号６７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、前記操作されたガイドリボ核酸構造の配列に相補的な配列を含む第１の鎖と、前記ＰＡＭを含む第２の鎖とを含む。いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭは、前記操作されたガイドリボ核酸構造の前記配列に相補的な前記配列の３’末端に直接隣接する。いくつかの実施形態では、前記クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない。いくつかの実施形態では、前記クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼは、未培養の微生物に由来する。いくつかの実施形態では、前記二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、真核生物、植物、真菌、哺乳動物、げっ歯類、またはヒト二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドである。

【0013】

いくつかの態様において、本開示は、標的核酸遺伝子座を改変する方法を提供し、前記方法は、前記標的核酸遺伝子座に、本明細書に記載されるいずれかの態様または実施形態の前記操作された核酸編集系を送達する工程を含み、前記エンドヌクレアーゼが、前記操作されたガイドリボ核酸構造と複合体を形成するように構成され、前記複合体は、前記標的核酸遺伝子座に結合すると、前記標的核酸遺伝子座のヌクレオチドを改変するように構成される。いくつかの実施形態では、前記操作された核酸編集系は、アデニンデアミナーゼを含み、前記ヌクレオチドはアデニンであり、前記標的核酸遺伝子座を改変することは、前記アデニンをグアニンに変換することを含む。いくつかの実施形態では、前記操作された核酸編集系は、シチジンデアミナーゼおよびウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤を含み、前記ヌクレオチドはシトシンであり、前記標的核酸遺伝子座を改変することは、前記アデニンをウラシルに変換することを含む。いくつかの実施形態では、前記標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または細菌ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記標的核酸遺伝子座は、インビトロである。いくつかの実施形態では、前記標的核酸遺伝子座は、細胞内にある。いくつかの実施形態では、前記細胞は、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、霊長類細胞、またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は動物内にある。いくつかの実施形態では、前記細胞は蝸牛内にある。いくつかの実施形態では、前記細胞は胚内にある。いくつかの実施形態では、前記胚は２細胞胚である。いくつかの実施形態では、前記胚は、マウス胚である。いくつかの実施形態では、前記標的核酸遺伝子座に前記操作された核酸編集系を送達することは、本明細書に記載されるいずれかの態様または実施形態の核酸、あるいは本明細書に記載されるいずれかの態様または実施形態のベクターを送達することを含む。いくつかの実施形態では、前記操作された核酸編集系を前記標的核酸遺伝子座に送達することは、前記エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を送達することを含む。いくつかの実施形態では、前記核酸は、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、前記操作された核酸編集系を前記標的核酸遺伝子座に送達することは、前記エンドヌクレアーゼをコードする前記オープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡを送達することを含む。いくつかの実施形態では、前記操作された核酸編集系を前記標的核酸遺伝子座に送達することは、翻訳されたポリペプチドを送達することを含む。いくつかの実施形態では、前記操作された核酸編集系を前記標的核酸遺伝子座に送達することは、リボ核酸（ＲＮＡ）ポリＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された前記操作されたガイドリボ核酸構造をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を送達することを含む。

【0014】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集ポリペプチドを提供し、前記操作された核酸編集ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、前記エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、前記エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼと、前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。

【0015】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集ポリペプチドを提供し、前記操作された核酸編集ポリペプチドは、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼと、前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、を含む。いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集ポリペプチドを提供し、前記操作された核酸編集ポリペプチドは、配列番号３６０～３６８または５９８のいずれか１つを含む、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されたエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、前記エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼと、前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼに対して８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼはＨＮＨドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、配列番号８８～９６、４８８、および４８９のいずれか１つから選択される約６０～９０個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記塩基エディターは、配列番号１～５１、５７～６６、３８５～４４３、４４４～４７５、または５９４～５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記塩基エディターはアデニンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼは、配列番号５０～５１、５７、３８５～４４３、４４８～４７５、または５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記塩基エディターはシトシンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、前記シトシンデアミナーゼは、配列番号１～４９、４４４～４４７、５９４、または５８～６６のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む。

【0016】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集ポリペプチドを提供し、前記操作された核酸編集ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼと、前記エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターであって、前記塩基エディターは、配列番号１～５１、３８５～３８６、３８７～４４３、４４４～４４７、４８８～４７５、または５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む、塩基エディターとを含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは二本鎖標的のデオキシリボ核酸の１つの鎖を切断するように構成される。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、触媒的に死滅するように構成される。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼ、またはクラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ニッカーゼ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、最適に整列した際、配列番号７０に対する残基９、配列番号７１、７２、または７４に対する残基１３、配列番号７３に対する残基１２、配列番号７５に対する残基１７、配列番号７６に対する残基２３、または配列番号５９７に対する残基１０においてアスパラギン酸からアラニンへの変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、配列番号３６０～３６８または５９８からなる群から選択されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成される。いくつかの実施形態では、前記塩基エディターはアデニンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼは、配列番号５０～５１、３８５～４４３、または４４８～４７５のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼは、配列番号５０～５１、３８５～３９０、または５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記塩基エディターはシトシンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、前記シトシンデアミナーゼは、配列番号１～４９、４４４～４４７のいずれか１つまたはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、前記エンドヌクレアーゼまたは前記塩基エディターに連結されたウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号５２～５６または配列番号６７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端に近接する１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、前記ＮＬＳは、配列番号３６９～３８４から選択されたものまたはその変異体に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、前記塩基エディターに直接共有結合されるか、リンカーを介して前記塩基エディターに共有結合される。

【0017】

いくつかの態様において、本開示は、生物における発現のために最適化された操作された核酸配列を含む核酸を提供し、前記核酸は、配列番号１～５１、３８５～３８６、３８７～４４３、４４４～４４７、または４８８～４７５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列をコードする。いくつかの実施形態では、前記生物は、原核生物、細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、げっ歯類、またはヒトである。

【0018】

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかの核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ＣＥＬｉＤ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のビリオン、またはレンチウイルスである。

【0019】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される態様または実施形態のいずれか１つのベクターを含む細胞を提供する。

【0020】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される態様または実施形態のいずれか１つの前記細胞を培養する工程を含む、塩基エディターを製造する方法を提供する。

【0021】

いくつかの態様では、本開示は、系を提供し、前記系は、（ａ）本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかの核酸編集ポリペプチドと、（ｂ）標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列を含む、前記核酸編集ポリペプチドと複合体を形成するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造とを含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドリボ核酸配列は、配列番号８８～９６または４８８～４８９のいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。

【0022】

いくつかの態様において、本開示は、標的核酸遺伝子座を改変する方法を提供し、前記方法は、前記標的核酸遺伝子座に、本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかの前記操作された核酸編集ポリペプチド、あるいは本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかの前記系を送達する工程を含み、前記複合体は、前記標的核酸遺伝子座に結合すると、前記標的核酸遺伝子座のヌクレオチドを改変するように構成される。

【0023】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集系を提供し、前記操作された核酸編集系は、（ａ）ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、ＲｕｖＣドメインはヌクレアーゼ活性を欠いている、エンドヌクレアーゼと、（ｂ）エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、（ｃ）エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された、操作されたガイドリボ核酸構造であって、（ｉ）標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造とを含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、配列番号７０～７８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。

【0024】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集系を提供し、前記操作された核酸編集系は、（ａ）配列番号７０～７８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼであって、ヌクレアーゼ活性が欠けているＲｕｖＣドメインを含む、エンドヌクレアーゼと、エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された、操作されたガイドリボ核酸構造であって、（ｉ）標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造とを含む。

【0025】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集系を提供し、前記操作された核酸編集系は、（ａ）配列番号３６０～３６８を含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されたエンドヌクレアーゼであって、エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、エンドヌクレアーゼが、ヌクレアーゼ活性が欠けているＲｕｖＣドメインを含む、エンドヌクレアーゼと、（ｂ）エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、（ｃ）エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された、操作されたガイドリボ核酸構造であって、（ｉ）標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造とを含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼに対して８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＨＮＨドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、配列番号８８～９６、４８８、および４８９のいずれか１つから選択される約６０～９０個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。

【0027】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集系を提供し、前記操作された核酸編集系は、（ａ）（ｉ）標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造であって、ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、配列番号８８～９６、４８８、および４８９のいずれか１つから選択される約６０～９０個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、操作されたガイドリボ核酸構造に結合するように構成されたクラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼと、を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号３６０～３６８からなる群から選択されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成される。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、配列番号１～５１および３８５～４７５のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターはアデニンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号５７に対して少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターはシトシンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼは、配列番号５８に対して少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼは、配列番号５９～６６のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。

【0029】

いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号５２～５６または配列番号６７のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、操作されたガイドリボ核酸構造は、少なくとも２つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、操作されたガイドリボ核酸構造は、ガイドリボ核酸配列とｔｒａｃｒリボ核酸配列とを含む１つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドリボ核酸配列は、原核生物、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、またはヒトのゲノム配列に相補的である。いくつかの実施形態では、ガイドリボ核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端に近接する１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、塩基エディターに直接共有結合されるか、リンカーを介して塩基エディターに共有結合される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはエンドヌクレアーゼと塩基エディターを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは二本鎖標的のデオキシリボ核酸の１つの鎖を切断するように構成される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号３７０を含む。いくつかの実施形態では、システムは、Ｍｇ^２＋の供給源をさらに含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７０に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号８８に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、エンドヌクレアーゼは、配列番号３６０を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0032】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７１に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号８９に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、エンドヌクレアーゼは、配列番号３６１を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0033】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７３に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号９１に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、エンドヌクレアーゼは、配列番号３６３を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0034】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７５に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号９３に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、エンドヌクレアーゼは、配列番号３６５を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0035】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７６に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号９４に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、エンドヌクレアーゼは、配列番号３６６を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0036】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７７に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号９５に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、エンドヌクレアーゼは、配列番号３６７を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0037】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７８に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号９６に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、エンドヌクレアーゼは、配列番号３６８を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0038】

いくつかの実施形態では、塩基エディターはアデニンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、アデニンデアミナーゼは、配列番号５７を含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターはシトシンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼは、配列番号５８を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作された核酸編集系は、ウラシルＤＮＡグリコシル化阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ウラシルＤＮＡグリコシル化阻害剤は、配列番号６７を含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される。いくつかの実施形態では、配列同一性は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびイグジステンス１１、エクステンション１でのギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスのパラメータを使用して、および条件付き構成スコアマトリックス調整を使用する前記ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される。

【0040】

いくつかの態様において、本開示は、生物における発現のために最適化された操作された核酸配列を含む核酸を提供し、核酸は、塩基エディターに連結したクラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼをコードし、エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する。

【0041】

いくつかの態様において、本開示は、生物における発現のために最適化された操作された核酸配列を含む核酸を提供し、核酸は、塩基エディターに連結した配列番号７０～７８のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端に近接する１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をコードする配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、生物は、原核生物、細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、げっ歯類、またはヒトである。

【0042】

いくつかの態様において、本開示は、塩基エディターに連結されたクラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むベクターを提供し、前記エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する。いくつかの実施形態では、ベクターは本明細書に記載される核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターはさらに、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された、操作されたガイドリボ核酸構造をコードする核酸を含み、操作されたガイドリボ核酸構造は、標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、およびエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ＣＥＬｉＤ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のビリオン、またはレンチウイルスである。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるベクターを含む細胞を提供する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される細胞を培養する工程を含む、エンドヌクレアーゼを製造する方法を提供する。

【0043】

いくつかの態様では、本開示は、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを改変するための方法を提供し、上記方法は、複合体に二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを接触させる工程を含み、前記複合体は、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、ＲｕｖＣドメインはヌクレアーゼ活性を欠いている、エンドヌクレアーゼと、エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、エンドヌクレアーゼおよび二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドに結合するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造であって、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、を含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼは、塩基エディターに直接共有結合されるか、リンカーを介して塩基エディターに共有結合される。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼは、配列番号７０～７８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。

【0045】

いくつかの態様では、本開示は、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを改変するための方法を提供し、上記方法は、複合体に二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを接触させる工程を含み、前記複合体は、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼと、エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、エンドヌクレアーゼおよび二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドに結合するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造とを含み、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、ＰＡＭは配列番号３６０～３６８からなる群から選択された配列を含む。

【0046】

いくつかの実施形態では、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼは、塩基エディターに共有結合されるか、リンカーを介して塩基エディターに共有結合される。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、配列番号１～５１および３８５～４７５から選択される配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターはアデニンデアミナーゼを含み、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドはアデニンを含み、および、二本鎖デオキシリボ核酸ポリペプチドの改変は、アデニンをグアニンに変換することを含む。いくつかの実施形態では、アデニンデアミナーゼは、配列番号５７に対して少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、塩基エディターはシトシンデアミナーゼを含み、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドはシトシンを含み、および、二本鎖デオキシリボ核酸ポリペプチドの改変は、シトシンをウラシルに変換することを含む。いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼは、配列番号５８に対して少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼは、配列番号５９～６６のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、複合体は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号５２～５６または配列番号６７のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、操作されたガイドリボ核酸構造の配列に相補的な配列を含む第１の鎖と、前記ＰＡＭを含む第２の鎖とを含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、操作されたガイドリボ核酸構造の配列に相補的な配列の３’末端に直接隣接する。

【0049】

いくつかの実施形態では、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない。いくつかの実施形態では、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼは、未培養の微生物に由来する。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、真核生物、植物、真菌、哺乳動物、げっ歯類、またはヒト二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドである。

【0050】

いくつかの態様において、本開示は、標的核酸遺伝子座を改変する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載される操作された核酸編集系を前記標的核酸遺伝子座に送達する工程を含み、エンドヌクレアーゼは、操作されたガイドリボ核酸構造と複合体を形成するように構成され、複合体は、標的核酸遺伝子座に結合すると、標的核酸遺伝子座のヌクレオチドを改変するように構成される。

【0051】

いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系は、アデニンデアミナーゼを含み、ヌクレオチドはアデニンであり、標的核酸遺伝子座を改変することは、アデニンをグアニンに変換することを含む。いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系は、シチジンデアミナーゼおよびウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤を含み、ヌクレオチドはシトシンであり、標的核酸遺伝子座を改変することは、アデニンをウラシルに変換することを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または細菌ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、インビトロである。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、細胞内にある。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、霊長類細胞、またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は動物内にある。

【0052】

いくつかの実施形態では、細胞は蝸牛内にある。いくつかの実施形態では、細胞は胚内にある。いくつかの実施形態では、胚は２細胞胚である。いくつかの実施形態では、胚はマウス胚である。いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系を標的核酸遺伝子座に送達する工程は、本明細書に記載される核酸または本明細書に記載されるベクターを送達することを含む。いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系を標的核酸遺伝子座に送達する工程は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を送達することを含む。

【0053】

いくつかの実施形態では、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系を標的核酸遺伝子座に送達する工程は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡを送達することを含む。いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系を標的核酸遺伝子座に送達する工程は、翻訳されたポリペプチドを送達することを含む。いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系を標的核酸遺伝子座に送達する工程は、リボ核酸（ＲＮＡ）ポリＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された操作されたガイドリボ核酸構造をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を送達することを含む。

【0054】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集ポリペプチドを提供し、前記操作された核酸編集ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、ＲｕｖＣドメインはヌクレアーゼ活性を欠いている、エンドヌクレアーゼと、エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、配列番号７０～７８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。

【0055】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集ポリペプチドを提供し、前記操作された核酸編集ポリペプチドは、配列番号７０～７８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼであって、ヌクレアーゼ活性が欠けているＲｕｖＣドメインを含む、エンドヌクレアーゼと、エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、を含む。

【0056】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集ポリペプチドを提供し、前記操作された核酸編集ポリペプチドは、配列番号３６０～３６８を含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されたエンドヌクレアーゼであって、エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、エンドヌクレアーゼが、ヌクレアーゼ活性が欠けているＲｕｖＣドメインを含む、エンドヌクレアーゼと、エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、を含む。

【0057】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼに対して８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＨＮＨドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、配列番号８８～９６、４８８、および４８９のいずれか１つから選択される約６０～９０個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、配列番号１～５１および３８５～４７５のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターはアデニンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号５７に対して少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターはシトシンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼは、配列番号５８に対して少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンシトシンデアミナーゼは、配列番号５９～６６のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。

【0058】

本開示のさらなる態様および利点は、以下の詳細な記載から当業者に容易に明白となり、ここでは、本開示の例示的な実施形態のみが示され、記載されている。理解されるように、本開示は、他の実施形態および異なる実施形態においても可能であり、その様々な詳細は、そのすべてが本開示から逸脱することなく様々な明白な点で修正することができる。したがって、図面および説明は本来、例示的なものとしてみなされ、限定的なものであるとはみなされない。

【0059】

引用による組み込み
本明細書で言及されるすべての公開物、特許、および特許出願は、あたかも個々の公開物、特許、または特許出願がそれぞれ参照により本明細書に具体的かつ個別に組み込まれるのと同じ程度にまで、参照により本明細書に組み込まれている。

【図面の簡単な説明】

【0060】

本発明の新規な特徴は、とりわけ添付の請求項で説明される。本発明の特徴と利点は、本発明の原理が用いられる例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面（本明細書では「図（“Ｆｉｇｕｒｅ”および“ＦＩＧ．”）」とも称される）とを参照することにより、より良く理解されるであろう。

【図1】様々なクラスおよびタイプのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座の典型的な組織を描く。

【図2】本明細書に記載される系のＴ７プロモーター駆動発現を含む塩基エディタープラスミドの構造を示す。

【図3】本明細書に記載される系のプラスミドマップを示す。ＭＧＡはＴａｄＡ＊（ＡＢＥ８．１７ｍ）－ＳＶ４０ ＮＬＳを含んでおり、ＭＧＣは、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤およびＳＶ４０ ＮＬＳに連結された（ＢＥ３からの）ＡＰＯＢＥＣ１を含んでいる。

【図4】ニッカーゼ酵素を生成するためにヌクレアーゼ活性を破壊するように突然変異した、本明細書に記載される選択されたエンドヌクレアーゼのＲｕｖＣＩドメインにおける予測される触媒残基を示す。

【図5】単一ガイドＲＮＡ発現カセットを本明細書に記載される系にクローニングするための例示的な方法を描いている。１つの断片はＴ７プロモーター＋スペーサーを含む。他の断片は、スペーサー＋単一ガイド足場配列＋双方向性ターミネーターを含む。断片は発現プラスミドに組み入れられ、ｓｇＲＮＡと塩基エディターを同時に発現できる機能的構築物が生じる。

【図6A】大腸菌におけるｌａｃＺ標的化のためのｓｇＲＮＡ設計を示す。本明細書に記載される系に使用されるスペーサー長は、２２ヌクレオチドであった。本明細書に記載される選択された系について、編集ウインドウを決定するために、大腸菌のｌａｃＺを標的とする３つのｓｇＲＮＡを設計した。

【図6B】大腸菌におけるｌａｃＺ標的化のためのｓｇＲＮＡ設計を示す。本明細書に記載される系に使用されるスペーサー長は、２２ヌクレオチドであった。本明細書に記載される選択された系について、編集ウインドウを決定するために、大腸菌のｌａｃＺを標的とする３つのｓｇＲＮＡを設計した。

【図7】選択された突然変異したエフェクターのニッカーゼ活性を示す。両方の５’末端にフルオロフォア（６－ＦＡＭ）で標識した６００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を、それらの同族ｓｇＲＮＡを補充した精製された酵素とインキュベートした。反応生成物を１０％ＴＢＥ－Ｕｒｅａ変性ゲルで分解した。二本鎖切断により、４００塩基と２００塩基のバンドが得られる。ニッカーゼ活性により、６００塩基と２００塩基のバンドが得られる。

【図8A】本明細書に記載される選択された系による塩基編集を実証するサンガーシーケンシング結果を示す。

【図8B】本明細書に記載される選択された系による塩基編集を実証するサンガーシーケンシング結果を示す。

【図8C】本明細書に記載される選択された系による塩基編集を実証するサンガーシーケンシング結果を示す。

【図9】本明細書に記載される系が、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼおよび塩基エディターを用いて塩基編集能力をどのように拡大するかを示している。

【図10A】ＴａｄＡ（ＡＢＥ８．１７ｍ）およびＭＧニッカーゼを含むアデニン塩基エディター（ＡＢＥｓ）の塩基編集効率を示す。ＴａｄＡは、ｔＲＮＡアデニンデアミナーゼであり、ＴａｄＡ（ＡＢＥ８．１７ｍ）は、大腸菌ＴａｄＡの操作された変異体である。ＴａｄＡ（ＡＢＥ８．１７ｍ）と融合した１２個のＭＧニッカーゼを構築し、大腸菌で試験した。３つのガイドはｌａｃＺを標的とするように設計された。ボックス内に示された数字は、Ｅｄｉｔ Ｒによって定量化されたＡからＧへの変換のパーセンテージを示す。ＡＢＥ８．１７ｍは実験の陽性対照として用いられた。

【図10B】ＴａｄＡ（ＡＢＥ８．１７ｍ）およびＭＧニッカーゼを含むアデニン塩基エディター（ＡＢＥｓ）の塩基編集効率を示す。ＴａｄＡは、ｔＲＮＡアデニンデアミナーゼであり、ＴａｄＡ（ＡＢＥ８．１７ｍ）は、大腸菌ＴａｄＡの操作された変異体である。ＴａｄＡ（ＡＢＥ８．１７ｍ）と融合した１２個のＭＧニッカーゼを構築し、大腸菌で試験した。３つのガイドはｌａｃＺを標的とするように設計された。ボックス内に示された数字は、Ｅｄｉｔ Ｒによって定量化されたＡからＧへの変換のパーセンテージを示す。ＡＢＥ８．１７ｍは実験の陽性対照として用いられた。

【図11A】ラットＡＰＯＢＥＣ１、ＭＧニッカーゼ、およびバチルススブチリスバクテリオファージのウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ（ＰＢＳ１））を含むシトシン塩基エディター（ＣＢＥｓ）の塩基編集効率を示す。ＡＰＯＢＥＣ１はシトシンデアミナーゼである。Ｎ末端にｒＡＰＯＢＥＣ１を、Ｃ末端にＵＧＩを融合させた１２個のＭＧニッカーゼを構築して、大腸菌で試験した。３つのガイドはｌａｃＺを標的とするように設計された。ボックス内に示された数字は、Ｅｄｉｔ Ｒによって定量化されたＣからＴへの変換のパーセンテージを示す。ＢＥ３は実験の陽性対照として用いられた。

【図11B】ラットＡＰＯＢＥＣ１、ＭＧニッカーゼ、およびバチルススブチリスバクテリオファージのウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ（ＰＢＳ１））を含むシトシン塩基エディター（ＣＢＥｓ）の塩基編集効率を示す。ＡＰＯＢＥＣ１はシトシンデアミナーゼである。Ｎ末端にｒＡＰＯＢＥＣ１を、Ｃ末端にＵＧＩを融合させた１２個のＭＧニッカーゼを構築して、大腸菌で試験した。３つのガイドはｌａｃＺを標的とするように設計された。ボックス内に示された数字は、Ｅｄｉｔ Ｒによって定量化されたＣからＴへの変換のパーセンテージを示す。ＢＥ３は実験の陽性対照として用いられた。

【図12】ＣＢＥの塩基編集活性に対するＭＧウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）の効果を示す。パネル（ａ）は、Ｎ末端のＡＰＯＢＥＣ１、ＭＧ１５－１ニッカーゼ、およびＣ末端のＵＧＩを含む、ＭＧＣ１５－１および変異体の塩基編集活性を示すグラフを描いている。大腸菌におけるシトシン塩基編集活性の改善について３つのＭＧ ＵＧＩを試験した。パネル（ｂ）は、Ｎ末端のｒＡＰＯＢＥＣ１、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ、およびＣ末端のＵＧＩを含む、ＢＥ３の塩基編集活性を示すグラフである。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるシトシン塩基編集活性の改善について、２個のＭＧ ＵＧＩを試験した。編集効率はＥｄｉｔ Ｒによって定量化した。

【図13A】Ａ０Ａ２Ｋ５ＲＤＮ７、ＭＧニッカーゼ、およびＭＧ ＵＧＩを含むシトシン塩基エディターの編集効率を示す編集部位のマップを描いている。構築物は、Ｎ末端のＡ０Ａ２Ｋ５ＲＤＮ７、ＭＧニッカーゼ、およびＣ末端のＭＧ６９－１を含む。簡略化のために、図にはＭＧニッカーゼの同一性のみを示している。塩基編集の陽性対照としてＢＥ３を使用した。陽性対照には、空のベクターを使用した。３つの独立した実験が異なる日に行われた。略語：Ｒはリピート、ＮＥＧは陰性対照である。

【図13B】Ａ０Ａ２Ｋ５ＲＤＮ７、ＭＧニッカーゼ、およびＭＧ ＵＧＩを含むシトシン塩基エディターの編集効率を示す編集部位のマップを描いている。構築物は、Ｎ末端のＡ０Ａ２Ｋ５ＲＤＮ７、ＭＧニッカーゼ、およびＣ末端のＭＧ６９－１を含む。簡略化のために、図にはＭＧニッカーゼの同一性のみを示している。塩基編集の陽性対照としてＢＥ３を使用した。陽性対照には、空のベクターを使用した。３つの独立した実験が異なる日に行われた。略語：Ｒはリピート、ＮＥＧは陰性対照である。

【図14】大腸菌におけるＴａｄＡ特徴付けのための陽性選択方法を示す。パネル（ａ）は、ＴａｄＡ選択に使用される１つのプラスミド系のマップを示す。このベクターは、ＣＡＴ（Ｈ１９３Ｙ）、ＣＡＴを標的とするｓｇＲＮＡ発現カセット、およびＡＢＥ発現カセットを含む。この図では、大腸菌由来のＮ末端のＴａｄＡと、化膿性連鎖球菌由来のＣ末端のＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）が示されている。パネル（ｂ）は、大腸菌細胞に導入／形質転換すると、ＣＡＴ（Ｈ１９３Ｙ）の鋳型鎖のＡ２位が編集され、Ｈ１９３Ｙ変異体が野生型に戻り、その活性を回復させることを実証するシーケンシングトレースを示す。略語：ＣＡＴはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである。

【図15】ＴａｄＡによって引き起こされる変異がクロラムフェニコール（Ｃｍ）の高い耐性を可能にすることを示す。パネル（ａ）は、大腸菌の抗生物質耐性を選択するために、異なる濃度のクロラムフェニコールが使用された成長プレートの写真を示す。この例では、大腸菌由来のＴａｄＡ（ＥｃＴａｄＡ）の野生型と２つの変異体とが試験された。パネル（ｂ）は、変異型ＴａｄＡを有するＡＢＥが野生型よりも高い編集効率を示すことを実証する結果の概要表を示す。これらの実験では、０．５μｇ／ｍＬ以上のＣｍを有するプレートからコロニーを採取した。簡略化のために、デアミナーゼの同一性のみを表に示す。

【図16A】陽性選択におけるＭＧ ＴａｄＡ活性を調査するための成長プレートの写真を示す。８つのＭＧ６８ ＴａｄＡ候補を、０～２μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールに対して試験した（ＡＢＥは、Ｎ末端のＴａｄＡ変異体とＣ末端のＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）ニッカーゼを含んでいた）。簡略化のために、デアミナーゼの同一性のみを示す。この試験では、０．５μｇ／ｍＬ以上のＣｍを有するプレートからコロニーを採取した。

【図16B】ＭＧ ＴａｄＡ候補の編集効率を要約したものであり、ＭＧ６８－３およびＭＧ６８－４がアデニンの塩基編集を駆動したことを実証する。

【図17】ＭＧ６８－４におけるＤ１０９Ｎ突然変異を介するＭＧ６８－４＿ｎＳｐＣａｓ９の塩基編集効率の改善を示す。パネル（ａ）は、野生型ＭＧ６８－４およびその変異体を０～４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールに対して試験した成長プレートの写真を示す。簡略化のために、デアミナーゼの同一性のみを示す。この実験におけるアデニン塩基エディターは、Ｎ末端のＴａｄＡ変異体とＣ末端のＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）ニッカーゼを含む。パネル（ｂ）は、ＭＧ ＴａｄＡ候補の編集効率を示す概要表を示す。パネル（ｂ）は、ＭＧ６８－４およびＭＧ６８－４（Ｄ１０９Ｎ）がアデニンの塩基編集を示し、Ｄ１０９Ｎ変異体が活性の増加を示すことを実証している。この試験では、０．５μｇ／ｍＬ以上のＣｍを有するプレートからコロニーを採取した。

【図18】ＭＧ６８－４（Ｄ１０９Ｎ）＿ｎＭＧ３４－１の塩基編集を示す。パネル（ａ）は、Ｎ末端のＭＧ６８－４（Ｄ１０９Ｎ）およびＣ末端のＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）ニッカーゼを含むＡＢＥが、０～２μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールに対して試験された実験の成長プレートの写真を示す。パネル（ｂ）は、ｓｇＲＮＡを用いた場合と用いない場合の編集効率を描いた概要表を示す。この試験では、１μｇ／ｍＬ以上のＣｍを有するプレートからコロニーを採取した。

【図19】ＭＧ６８－４－ｎＭＧ３４－１塩基編集活性（配列番号４４８～４７５）の改善のために設計された２８個のＭＧ６８－４変異体を示す。酵素の編集を改善するために、１２個の残基が標的化変異誘発のために選択された。

【0061】

配列表の簡単な記載
本明細書とともに提出された配列表は、本開示にかかる方法、組成物、および系において使用するための例示的なポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列を提供する。以下は、その中の配列の例示的な説明である。

【0062】

配列番号１～４７は、本明細書に記載される操作された核酸編集系に適切なＭＧ６６デアミナーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0063】

配列番号４８～４９は、本明細書に記載される操作された核酸編集系に適切なＭＧ６７デアミナーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0064】

配列番号５０～５１は、本明細書に記載される操作された核酸編集系に適切なＭＧ６８デアミナーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0065】

配列番号５２～５６は、本明細書に記載される操作された核酸編集系に適切なウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤の配列を示す。

【0066】

配列番号５７～６６は、参照デアミナーゼの配列を示す。

【0067】

配列番号６７は、参照ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤の配列を示す。

【0068】

配列番号６８は、アデニン塩基エディターの配列を示す。

【0069】

配列番号６９は、シトシン塩基エディターの配列を示す。

【0070】

配列番号７０～７８は、本明細書に記載される操作された核酸編集系に適切なＭＧニッカーゼの完全長のペプチド配列を示す。

【0071】

配列番号７９～８７は、本明細書に記載されるインビトロニッカーゼアッセイで使用されるプロトスペーサーおよびＰＡＭを示す。

【0072】

配列番号８８～９６は、本明細書に記載されるインビトロニッカーゼアッセイで使用される単一ガイドＲＮＡのペプチド配列を示す。

【0073】

配列番号９７～１５６は、大腸菌ｌａｃＺを標的とする場合のスペーサーの配列を示す。

【0074】

配列番号１５７～１７６は、部位特異的突然変異誘発を行う場合のプライマーの配列を示す。

【0075】

配列番号１７７～１７８は、ｌａｃＺシーケンシングに関するプライマーの配列を示す。

【0076】

配列番号１７９～３４２は、増幅中に使用されるプライマーの配列を示す。

【0077】

配列番号３４３～３４５は、ｌａｃＺシーケンシングのためのプライマーの配列を示す。

【0078】

配列番号３４６～３５９は、増幅中に使用されるプライマーの配列を示す。

【0079】

配列番号３６０～３６８は、本明細書に記載される操作された核酸編集系に適切なプロトスペーサー隣接モチーフを示す。

【0080】

配列番号３６９～３８４は、本明細書に記載される操作された核酸編集系に適切な核局在化配列（ＮＬＳ’ｓ）を示す。

【0081】

配列番号３８５～４４３は、本明細書に記載される操作された核酸編集系に適切なＭＧ６８デアミナーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0082】

配列番号４４４～４４７は、本明細書に記載される操作された核酸編集系に適切なＭＧ１２１デアミナーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0083】

配列番号４４８～４７５は、本明細書に記載される操作された核酸編集系に適切なＭＧ６８デアミナーゼの完全長ペプチド配列を示す。

【0084】

配列番号４７６および４７７は、アデニン塩基編集エディターの配列を示す。

【0085】

配列番号４７８～４８２は、シトシン塩基エディターの配列を示す。

【0086】

配列番号４８３～４８７は、本明細書に記載される操作された核酸編集系をコードするのに適切なプラスミドの配列を示す。

【0087】

配列番号４８８および４８９は、ＭＧ１５－１およびＭＧ３４－１のｓｇＲＮＡ足場配列を示す。

【0088】

配列番号４９０～５２２は、大腸菌およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてゲノム遺伝子座を標的とするために使用されるスペーサーの配列を示す。

【0089】

配列番号５２３～５８５は、増幅およびサンガーシーケンシング中に使用されたプライマーの配列を示す。

【発明を実施するための形態】

【0090】

本発明の実施形態が本明細書中で示され、記載されているが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明らかであろう。ここで、本発明から逸脱することなく、多数の変更、変化、および置換がなされることが、当業者によって理解され得る。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が利用され得ることを理解されたい。

【0091】

本明細書で開示されるいくつかの方法の実施は、特段の定めのない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡの技術を利用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２０１２）； ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．）； ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）， ＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ． （１９９５））， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ｅｄｓ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ．（２０１０））（引用により本明細書に完全に組み込まれる）を参照。

【0092】

本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明白に示していない限り、複数形を同様に含むことが意図されている。さらに、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「とともに（ｗｉｔｈ）」という用語またはその変形が、詳細な記載および／または請求項のいずれかで使用される程度まで、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語に類似した方法で含まれるように意図されている。

【0093】

「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定されるような特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、その値がどのように測定または決定されるか、つまり、測定系の制限に部分的に依存している。例えば、「約」とは、当該技術分野での実践につき１または１を超える標準偏差を意味し得る。代替的に、「約」は、任意の値の最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味することができる。

【0094】

本明細書で使用されるように、「細胞」は通常、生体細胞を指す。細胞は、生体の基本的な構造的、機能的、および／または生物学的な単位であり得る。細胞は、１つ以上の細胞を有する任意の生物に由来してもよい。いくつかの非限定的な例としては、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原虫細胞、植物からの細胞（例えば、植物作物、果物、野菜、穀物、大豆、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、小麦、種子、トマト、米、カッサバ、サトウキビ、カボチャ、干し草、ジャガイモ、綿、大麻、タバコ、顕花植物、針葉樹、裸子植物、シダ類、クラブモス類、ツノゴケ類、肝臓植物、コケ類）、藻類細胞、（例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ・ピレノイド（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、ヤツマタモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ Ｃ． Ａｇａｒｄｈ）など）、海草（例えば、コンブ）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、キノコの細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）の細胞、哺乳動物（ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類、ラット、ネズミ、非ヒト霊長類、ヒトなど）の細胞などが挙げられる。細胞は、天然生物に由来しない細胞（例えば、合成的に作られた細胞、しばしば人工細胞と呼ばれることもある）である。

【0095】

「ヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用されるように、一般に、塩基－糖－リン酸の組み合わせを指す。ヌクレオチドは合成ヌクレオチドを含んでいてもよい。ヌクレオチドは合成ヌクレオチドアナログを含んでいてもよい。ヌクレオチドは、核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ））の単量体単位であり得る。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはその誘導体を含み得る。そのような誘導体は、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７－デアザ－ｄＧＴＰ、および７－デアザ－ｄＡＴＰ、ならびに、それらを含有している核酸分子に対するヌクレアーゼ耐性を与えるヌクレオチド誘導体を含み得る。本明細書に使用されるようなヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰｓ）およびそれらの誘導体を指すこともある。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例示的な例としては、限定されないが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが挙げられ得る。光学的に検出可能な部分（例えば、フルオロフォア）を含む部分を使用するなどして、ヌクレオチドは非標識であり得るか、検出可能なように標識され得る。標識化も量子ドットを用いて行なわれてもよい。検出可能な標識としては、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、および酵素標識が挙げられ得る。ヌクレオチドの蛍光標識は、限定されないが、フルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’－ジメトキシ－４’５－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６－カルボキシルローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、 ６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、４－（４’ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、カスケードブルー、オレゴングリーン、テキサスレッド、シアニン、および５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を含んでもよい。蛍光標識されたヌクレオチドの特定の例は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆ）から入手可能な［Ｒ６Ｇ］ｄＵＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＵＴＰ、［Ｒ１１０］ｄＣＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＣＴＰ、［ＪＯＥ］ｄｄＡＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ＦＡＭ］ｄｄＣＴＰ、［Ｒ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、［ＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、［ｄＲ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ｄＲ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ｄＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、および［ｄＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， Ｉｌｌ．）から入手可能なＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ ＤｅｏｘｙＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３－ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５－ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｆｌｕｏｒ Ｘ－ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３－ｄＵＴＰ、およびＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５－ｄＵＴＰ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄ．）から入手可能なフルオレセイン－１５－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、テトラメチル－ローダミン－６－ｄＵＴＰ、ＩＲ７７０－９－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、およびフルオレセイン－１５－２’－ｄＡＴＰ、ならびに、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇ．）から利用可能な染色体標識されたヌクレオチド、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ｄＵＴＰ、カスケードブルー－７－ＵＴＰ、カスケードブルー－７－ｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、オレゴングリーン ４８８－５－ｄＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ｄＵＴＰ、テキサスレッド－５－ＵＴＰ、テキサスレッド－５－ｄＵＴＰ、およびテキサスレッド－１２－ｄＵＴＰを含み得る。ヌクレオチドはさらに化学修飾によって標識またはマークされ得る。化学修飾された単一ヌクレオチドは、ビオチン－ｄＮＴＰであり得る。ビオチン化ｄＮＴＰのいくつかの非限定的な例としては、ビオチン－ｄＡＴＰ（例えば、バイオ－Ｎ６－ｄｄＡＴＰ、ビオチン－１４－ｄＡＴＰ）、ビオチン－ｄＣＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＣＴＰ、ビオチン－１４－ｄＣＴＰ）、およびビオチン－ｄＵＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＵＴＰ、ビオチン－１６－ｄＵＴＰ、ビオチン－２０－ｄＵＴＰ）を挙げることができる。

【0096】

「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、一般に、一本鎖、二本鎖、または多鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、あるいはそれらのアナログの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、細胞に対して外来性であっても内因性であってもよい。ポリヌクレオチドは、細胞を含まない環境において存在することができる。ポリヌクレオチドは、遺伝子またはその断片であってもよい。ポリヌクレオチドはＤＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドはＲＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有してもよく、任意の機能を果たしてもよい。ポリヌクレオチドは１つ以上のアナログ（例えば、変化した骨格、糖、または核酸塩基）を含んでいてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後で与えられ得る。アナログのいくつかの非限定的な例としては、５－ブロモウラシル、ペプチド核酸、ゼノ核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン、７－デアザ－ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に結合したローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光塩基アナログ、ＣｐＧ島、メチル－７－グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ケオシン、およびワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（複数の遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）と無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を含む無細胞ポリヌクレオチド、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断されてもよい。

【0097】

「トランスフェクション」または「トランスフェクトされた」という用語は一般に、非ウイルスベースまたはウイルスベースの方法による細胞への核酸の導入を指す。核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能的部分をコードする遺伝子配列であってもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １８．１－１８．８８を参照。

【0098】

「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は一般に、ペプチド結合によって結合された少なくとも２つのアミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書で互換的に使用される。この用語は、ポリマーの特定の長さを意味するものではなく、ペプチドが組換え技術、化学的または酵素的な合成を使用して生成されたか、あるいは天然に存在するかを示唆または区別することを意図するものでもない。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーだけでなく、少なくとも１つの修飾アミノ酸を含むアミノ酸ポリマーにも適用される。場合によっては、ポリマーは非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語は、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖、ならびに、二次構造および／または三次構造（例えば、ドメイン）を有するまたは有していないタンパク質を含んでいる。この用語はさらに、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、酸化、および標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。「アミノ酸」および「アミノ酸」という用語は一般に、本明細書で使用されるように、限定されないが、修飾アミノ酸およびアミノ酸アナログを含む天然および非天然のアミノ酸を指す。修飾アミノ酸は、アミノ酸上に天然には存在しない基または化学部分を含むように化学修飾された、天然のアミノ酸および非天然のアミノ酸を含み得る。アミノ酸アナログはアミノ酸誘導体を指すこともある。「アミノ酸」という用語は、Ｄ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸の両方を含む。

【0099】

本明細書で使用されるように、「非天然」とは、一般に、天然の核酸またはタンパク質では見られない核酸またはポリペプチドの配列を指すことができる。非天然とはアフィニティタグを指すことがある。非天然とは融合を指すことがある。非天然とは、変異、挿入、および／または欠失を含む天然に存在する核酸またはポリペプチドの配列を指すことがある。非天然配列は、非天然配列が融合された核酸および／またはポリペプチド配列によっても示され得る活性（例えば、酵素活性、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）を示すおよび／またはコードすることができる。非天然核酸またはポリペプチド配列は、キメラ核酸および／またはポリペプチドをコードするキメラ核酸および／またはポリペプチド配列を生成するために、遺伝子操作によって天然に存在する核酸またはポリペプチド配列（またはその変異体）に連結され得る。

【0100】

「プロモーター」という用語は一般に、本明細書で使用されるように、遺伝子の転写または発現を制御し、ＲＮＡ転写が開始されるヌクレオチドまたはヌクレオチドの領域に隣接または重複して配置され得る制御性ＤＮＡ領域を指す。プロモーターは、しばしば転写因子と呼ばれるタンパク質因子に結合する特定のＤＮＡ配列を含むことができ、遺伝子の転写につながるＤＮＡへのＲＮＡポリメラーゼの結合を容易にする。「基本プロモーター」は、「コアプロモーター」とも呼ばれ、一般に、動作可能に連結されたポリヌクレオチドの転写発現を促進するために必要なすべての基本的なエレメントを含むプロモーターを指すことがある。真核生物の基本プロモーターは、必ずしもそうではないが、典型的には、ＴＡＴＡ－ボックスおよび／またはＣＡＡＴボックスを含む。

【0101】

「発現」という用語は一般に、本明細書で使用されるように、核酸配列またはポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物などに）転写されるプロセス、および／または、転写されたｍＲＮＡがその後、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写産物およびコードされたポリペプチドはまとめて「遺伝子産物」と呼ばれることがある。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞中にｍＲＮＡのスプライシングを含むことがある。

【0102】

本明細書で使用されるように、「動作可能に連結された」、「動作可能な連結」、「作動可能に連結された」、またはその文法的な同等物は一般に、遺伝要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの並置を指し、これらのエレメントは、期待される方法で動作することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列を含み得る調節エレメントは、調節エレメントがコード配列の転写を開始するのを助ける場合に、コード領域と作動可能に連結される。この機能的関係が維持される限り、調節エレメントとコード領域との間に介在する残基が存在してもよい。

【0103】

「ベクター」は一般に、本明細書で使用されるように、ポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドと会合する高分子または高分子の会合を指し、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するために使用され得る。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。ベクターは一般に、標的における遺伝子の発現を促進するために遺伝子に作動可能に連結された遺伝要素、例えば、調節エレメントを含む。

【0104】

本明細書で使用されるように、「発現カセット」および「核酸カセット」は、一緒に発現されるか、または発現のために動作可能に連結される核酸配列または要素の組み合わせを指すために一般的に交換可能に使用される。場合によっては、発現カセットは、調節エレメント、およびそれらが発現のために動作可能に連結されている遺伝子または複数の遺伝子の組み合わせを指す。

【0105】

ＤＮＡまたはタンパク質配列の「機能的断片」とは一般に、完全長ＤＮＡまたはタンパク質配列の生物学的活性に実質的に類似する生物学的活性（機能的または構造的のいずれか）を保持する断片を指す。ＤＮＡ配列の生物学的活性は、完全長配列に起因することが知られている方法で発現に影響を及ぼすその能力であり得る。

【0106】

本明細書で使用されるように、「操作された」物体は一般に、その物体がヒトの介入によって改変されたことを示す。非限定的な例によると、核酸は、その配列を、自然界に存在しない配列に変えることによって修飾されてもよい。核酸は、自然界では会合しない核酸にライゲーションすることで修飾されてもよく、ライゲーションした生成物が元の核酸に存在しない機能を有するようになる。操作された核酸は、自然界に存在しない配列でインビトロで合成されてもよい。タンパク質は、そのアミノ酸配列を、自然界に存在しない配列に変えることによって、修飾されてもよい。操作されたタンパク質は、新しい機能または特性を獲得することがある。「操作された」系は、少なくとも１つの操作された成分を含んでいる。

【0107】

本明細書で使用されるように、「合成」および「人工」は、天然に存在するヒトタンパク質に対して低い配列同一性（例えば、５０％未満の配列同一性、２５％未満の配列同一性、１０％未満の配列同一性、５％未満の配列同一性、１％未満の配列同一性）を有するタンパク質またはそのドメインを指すために交換可能に使用される。例えば、ＶＰＲおよびＶＰ６４ドメインは、合成のトランス活性化ドメインである。

【0108】

「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒ配列」という用語は一般に、本明細書で使用されるように、野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｓ．ａｕｒｅｕｓなど、または配列番号：＊＿＊からのｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有する核酸を指すことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｓ．ａｕｒｅｕｓなどに由来するｔｒａｃｒＲＮＡなど）に対して最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有する核酸を指すことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、欠失、挿入、または置換、変異、突然変異、またはキメラなどのヌクレオチド変化を含むことができるｔｒａｃｒＲＮＡの修飾形態を指してもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、少なくとも６個の連続するヌクレオチドのストレッチにわたって、野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｓ．ａｕｒｅｕｓなどに由来するｔｒａｃｒＲＮＡなど）配列に対して少なくとも約６０％同一であり得る核酸を指してもよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６個の連続するヌクレオチドのストレッチにわたって野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌などに由来するｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対して少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であり得る。タイプＩＩのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、隣接するＣＲＩＳＰＲアレイの反復配列の一部と相補性を有する領域を同定することにより、ゲノム配列上で予測することができる。

【0109】

本明細書で使用されるように、「ガイド核酸」は一般に、別の核酸にハイブリダイズし得る核酸を指すことができる。ガイド核酸はＲＮＡであってもよい。ガイド核酸はＤＮＡであってもよい。ガイド核酸は核酸の配列に部位特異的に結合するようにプログラムされていてもよい。標的とする核酸、すなわち、標的核酸は、ヌクレオチドを含んでもよい。ガイド核酸はヌクレオチドを含んでもよい。標的核酸の一部はガイド核酸の一部に相補的であってもよい。ガイド核酸に相補的であり、ガイド核酸とハイブリダイズする二本鎖の標的ポリヌクレオチドの鎖を、相補鎖と呼ぶことがある。相補鎖に相補的であり、したがってガイド核酸に相補的ではない可能性のある二本鎖標的ポリヌクレオチドの鎖を、非相補鎖と呼ぶことがある。ガイド核酸はポリヌクレオチド鎖を含んでもよく、「シングルガイド核酸」と呼ばれることがある。ガイド核酸は２つのポリヌクレオチド鎖を含んでも良く、「ダブルガイド核酸」と呼ばれることがある。特に指定がない限り、「ガイド核酸」という用語は、シングルガイド核酸およびダブルガイド核酸の両方を指す、包括的なものであってもよい。ガイド核酸は、「核酸標的化セグメント」または「核酸標的化配列」と呼ぶことができるセグメントを含んでもよい。核酸標的化セグメントは、「タンパク質結合セグメント」または「タンパク質結合配列」または「Ｃａｓタンパク質結合セグメント」と呼ぶことがあるサブセグメントを含んでもよい。

【0110】

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「パーセント同一性」という用語は一般に、配列比較アルゴリズムを使用して測定されるように、局所的または全体的な比較ウインドウにわたって最大の対応について比較しておよび整列させたときに、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基または核酸を特定の割合で有する２つの（例えば、ペアワイズアライメントにおいて）または複数の（例えば、多重配列アライメントにおいて）配列を指す。ポリペプチド配列の好適な配列比較アルゴリズムとしては、例えば、ワード長（Ｗ）が３、期待値（Ｅ）が１０、および、イグジステンス１１、エクステンション１でのギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスのパラメータを使用して、および３０残基よりも長いポリペプチド配列の条件付き構成スコアマトリックス調整を使用するＢＬＡＳＴＰ、ワード長（Ｗ）が２、期待値（Ｅ）が１００００００、３０残基未満の配列に対して、ギャップを開くギャップコストを９、ギャップを拡張するギャップコストを１に設定するＰＡＭ３０スコアリングマトリックスを使用するＢＬＡＳＴＰ（これらは、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能なＢＬＡＳＴ一式のＢＬＡＳＴＰのデフォルトパラメータである）、マッチ２、ミスマッチ－１、およびギャップ－１のスミス－ウォーターマン相同性検索アルゴリズムのパラメータを使用するＣＬＵＳＴＡＬＷ、デフォルトのパラメータを使用するＭＵＳＣＬＥ、ｒｅｔｒｅｅ：２、ｍａｘｉｔｅｒａｔｉｏｎｓ：１０００のパラメータを使用するＭＡＦＦＴ、デフォルトのパラメータを使用するＮｏｖａｆｏｌｄ、デフォルトのパラメータＨＭＭＥＲ ｈｍｍａｌｉｇｎが挙げられる。

【0111】

本明細書で使用されるように、「ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメイン」という用語は一般に、ＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインは、ＲｕｖＣ＿Ｉ、ＲｕｖＣ＿ＩＩ、およびＲｕｖＣ＿ＩＩＩという３つの不連続なセグメントで構成される）の第３の不連続セグメントを指す。ＲｕｖＣドメインまたはそのセグメントは一般に、既知のドメイン配列へのアラインメント、注釈付きドメインを有するタンパク質への構造的アラインメント、または既知のドメイン配列に基づいて構築された隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）（例えば、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩに対するＰｆａｍ ＨＭＭ ＰＦ１８５４１）との比較によって特定することができる。

【0112】

本明細書で使用されるように、「ＨＮＨドメイン」という用語は一般に、特徴的なヒスチジンおよびアスパラギン残基を有するエンドヌクレアーゼドメインを指す。ＨＮＨドメインは一般に、既知のドメイン配列へのアラインメント、注釈付きドメインを有するタンパク質への構造的アラインメント、または既知のドメイン配列に基づいて構築された隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）との比較（例えば、ドメインＨＮＨに対するＰｆａｍ ＨＭＭ ＰＦ０１８４４）により特定することができる。

【0113】

本明細書で使用されるように、「塩基エディター」という用語は一般に、二本鎖切断の生成および修復を必要とすることなく、１つの標的塩基または塩基対を別のものに変換する（例えば、Ａ：ＴからＧ：Ｃ、Ｃ：ＧからＴ：Ａ）触媒する酵素を指す。いくつかの実施形態では、塩基エディターはデアミナーゼである。

【0114】

本明細書で使用されるように、「デアミナーゼ」という用語は一般に、脱アミノ化反応を触媒するタンパク質または酵素を指す。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは、アデニンまたはアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼである（例えば、ＤＮＡ中のアデノシンを脱アミノ化する操作されたアデノシンデアミナーゼ）。いくつかの実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、シチジン（またはシトシン）あるいはデオキシシチジンの、ウリジン（またはウラシル）あるいはデオキシウリジンへの加水分解的脱アミノ化をそれぞれ触媒する、シチジン（またはシトシン）デアミナーゼである。いくつかの実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、シトシン（またはシトシン）の、ウラシル（またはウリジン）への加水分解的脱アミノ化を触媒する、シチジン（またはシトシン）デアミナーゼドメインである。いくつかの実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、生物、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、マウス、または細菌（例えば、大腸菌）由来の天然に存在するデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、自然界に存在しない生物由来のデアミナーゼの変異体である。

【0115】

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「最適に整列された」という用語は一般に、例えば、最高または「最適化された」パーセント同一性スコアをもたらす整列によって決定されるように、アミノ酸残基またはヌクレオチドの最大限の対応関係に整列した２つの（例えば、ペアワイズアラインメントで）またはそれ以上の（例えば、多重配列アラインメントで）配列を指す。

【0116】

１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する、本明細書に記載される酵素のいずれかの変異体変種が本開示に含まれている。そのような保存的置換は、ポリペプチドの三次元構造または機能を破壊することなく、ポリペプチドのアミノ酸配列において行われ得る。保存的置換は、互いに類似する疎水性、極性、およびＲ鎖長を持つアミノ酸を置換することにより達成することができる。さらにまたは代替的に、異なる種からの相同タンパク質の整列させた配列を比較することにより、保存的置換は、コードされたタンパク質の基本機能を変えることなく、種間で変異したアミノ酸残基（例えば、保存されていない残基）の位置を突き止めることにより特定され得る。このような保存的に置換された変異体は、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼタンパク質配列のいずれか１つに対して少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような保存的に置換された変異体は、機能的変異体である。そのような機能的変異体は、エンドヌクレアーゼの１つ以上の重要な活性部位残基またはガイドＲＮＡ結合残基の活性が破壊されないような置換を有する配列を包含することができる。

【0117】

本開示には、酵素の活性を減少または除去するために１つ以上の触媒残基の置換を有する本明細書に記載される酵素のいずれかの変異体（例えば、活性低下型変異体）も含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質としての活性低下型変異体は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべての触媒残基の破壊的置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのいずれかは、ニッカーゼ変異を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのいずれかは、ヌクレアーゼ活性を欠くＲｕｖＣドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのいずれかは、二本鎖標的デオキシリボ核酸の一方の鎖を切断するように構成され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのいずれかは、エンドヌクレアーゼ活性を欠くか、または触媒的に死滅するように構成され得る。

【0118】

機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、様々な文献から入手可能である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ （Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．； ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３））を参照。以下の８つのグループは、それぞれ互いに保存的な置換であるアミノ酸を含んでいる。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、および、
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）

【0119】

概要

【0120】

固有の機能性および構造を有する新しいＣａｓ酵素の発見は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）編集技術をさらに破壊し、速度、特異性、機能性、および使いやすさを改善する可能性を提供することができる。微生物およびまさに多種多様な微生物種におけるＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し）系の普及が予測されるなか、文献には機能的に特徴づけられたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は比較的少ない。これは、膨大な数の微生物種が実験室での培養が容易ではないことも理由の一つである。多くの微生物種を代表する自然環境ニッチからのメタゲノム配列決定により、新たなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の既知数が飛躍的に増加し、新たなオリゴヌクレオチド編集機能の発見を加速する可能性がある。このようなアプローチの有用性を示す最近の例は、２０１６年に天然微生物群集のメタゲノム解析からＣａｓＸ／ＣａｓＹ ＣＲＩＳＰＲ系が発見されたことである。

【0121】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、微生物における適応免疫系として機能することが記載されているＲＮＡ指向性ヌクレアーゼ複合体である。その自然の文脈では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）オペロンまたは遺伝子座で起こり、これは一般に２つの部分、（ｉ）ＲＮＡベースの標的化エレメントをコードする、同じく短いスペーサー配列で区切られた短い反復配列（３０～４０ｂｐ）のアレイ、および、（ｉｉ）アクセサリータンパク質／酵素と一緒にＲＮＡベースの標的化エレメントによって指向されるヌクレアーゼポリペプチドをコードするＣａｓをコードするＯＲＦを含む。特定の標的核酸配列の効率的なヌクレアーゼ標的化は一般に、（ｉ）標的の最初の６～８個の核酸（標的シード）とｃｒＲＮＡガイドとの間の相補的なハイブリダイゼーション、および、（ｉｉ）標的シードの定義された近傍にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が存在すること（ＰＡＭは通常、宿主ゲノム内で一般的に表されない配列である）の両方を必要とする。系の正確な機能と組織に応じて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は一般的に、共有の機能的特徴と進化的類似性に基づいて、２つのクラス、５つのタイプ、および１６のサブタイプに整理されている（図１参照）。

【0122】

クラスＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、大型マルチサブユニットエフェクター複合体を有し、Ｉ、ＩＩＩ、およびＩタイプＶを含む。

【0123】

タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、成分の点で中程度の複雑さを有すると考えられる。タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系では、ＲＮＡ標的化エレメントのアレイは、長い前駆体ｃｒＲＮＡ（プレｃｒＲＮＡ）として転写され、これは、リピートエレメントで処理されることで、短い成熟したｃｒＲＮＡを遊離させ、ｃｒＲＮＡはプロトスペーサー－隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる適切な短いコンセンサス配列が後に続くときに、ヌクレアーゼ複合体を核酸標的に向ける。この処理は、カスケードと呼ばれる大型エンドヌクレアーゼ複合体のエンドリボヌクレアーゼサブユニット（Ｃａｓ６）を介して生じ、この複合体は、ｃｒＲＮＡ指向性ヌクレアーゼ複合体のヌクレアーゼ（Ｃａｓ３）タンパク質成分も含んでいる。Ｃａｓ Ｉヌクレアーゼは主にＤＮＡヌクレアーゼとして機能する。

【0124】

タイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲ系は、ＣｓｍまたはＣｍｒタンパク質サブユニットを含むリピート関連ミステリアスタンパク質（ＲＡＭＰ）と並んで、Ｃａｓ１０として知られる中央ヌクレアーゼの存在によって特徴付けられることがある。タイプＩの系と同様に、成熟ｃｒＲＮＡはＣａｓ６様酵素を用いてプレｃｒＲＮＡから処理される。タイプＩおよびタイプＩＩの系とは異なり、ＩタイプＩＩの系は、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖（ＲＮＡポリメラーゼの鋳型として使用されているＤＮＡ鎖など）を標的として切断すると思われる。

【0125】

タイプＩＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、高度に減少した大型サブユニットヌクレアーゼ（ｃｓｆ１）、Ｃａｓ５（ｃｓｆ３）とＣａｓ７（ｃｓｆ２）の基のＲＡＭＰタンパク質に対する２つの遺伝子、および、場合によっては予測される小さなサブユニットに対する遺伝子からなるエフェクター複合体を有し、このような系は一般的に内因性プラスミド上に存在する。

【0126】

タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は一般に、単一ポリペプチドマルチドメインヌクレアーゼエフェクターを有し、タイプＩＩ、タイプＶ、およびタイプＶＩを含む。

【0127】

タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は成分の点で最も単純であると考えられている。タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系では、ＣＲＩＳＰＲアレイの成熟ｃｒＲＮＡへの処理は、特別なエンドヌクレアーゼサブユニットの存在を必要とせず、むしろアレイ反復配列に相補的な領域を有する小さなトランスコードされたｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、対応するエフェクターヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）および反復配列の両方と相互作用して前駆体ｄｓＲＮＡ構造を形成し、これは内因性ＲＮＡｓｅ ＩＩＩによって切断されることで、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの両方を負荷した成熟エフェクター酵素が生成される。Ｃａｓ ＩＩヌクレアーゼは、ＤＮＡヌクレアーゼとして知られている。タイプ２のエフェクターは一般に、ＲＮａｓｅ Ｈフォールドを採用したＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインと、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのフォールド内に挿入された挿入された無関係なＨＮＨヌクレアーゼドメインからなる構造を示す。ＲｕｖＣ様ドメインは標的（例えば、ｃｒＲＮＡの相補体）ＤＮＡ鎖の切断を担い、ＨＮＨドメインは変位したＤＮＡ鎖の切断を担う。

【0128】

タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＲｕｖＣ様ドメインを含むタイプＩＩのエフェクターと同様のヌクレアーゼエフェクター（例えば、Ｃａｓ１２）構造を特徴とする。タイプＩＩと同様に、ほとんどの（すべてではないが）タイプＶのＣＲＩＳＰＲ系は、プレｃｒＲＮＡを成熟ｃｒＲＮＡへと処理するためにｔｒａｃｒＲＮＡを使用する。しかしながら、プレｃｒＲＮＡを切断して複数のｃｒＲＮＡにするためにＲＮＡｓｅ ＩＩＩを必要とするタイプＩＩの系とは異なり、タイプＶの系はプレｃｒＲＮＡを切断するためにエフェクターヌクレアーゼ自体を使用することができる。タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のように、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は再度、ＤＮＡヌクレアーゼとして知られている。タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系とは異なり、いくつかのタイプＶの酵素（例えば、Ｃａｓ１２ａ）は、二本鎖標的配列の最初のｃｒＲＮＡ指向切断によって活性化される強固な一本鎖非特異的デオキシリボヌクレアーゼ活性を有すると思われる。

【0129】

タイプＶＩのＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓ系は、ＲＮＡガイドされたＲＮＡエンドヌクレアーゼを有する。ＲｕｖＣ様ドメインの代わりに、タイプＶＩの系の単一ポリペプチドエフェクター（例えば、Ｃａｓ１３）は、２つのＨＥＰＮリボヌクレアーゼドメインを含む。タイプＩＩおよびタイプＶの系とは異なり、タイプＶＩの系も、プレｃｒＲＮＡをｃｒＲＮＡへと処理するためにｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないと思われる。しかしながら、タイプＶの系と同様に、いくつかのタイプＶＩの系（例えば、Ｃ２Ｃ２）は、標的ＲＮＡの最初のｃｒＲＮＡ指向性切断によって活性化される強固な一本鎖非特異的ヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼ）活性を有すると思われる。

【0130】

より単純なアーキテクチャであることから、クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、デザイナーヌクレアーゼ／ゲノム編集用途としての操作および開発のために最も広く採用されている。

【0131】

インビトロでの使用のためのこのような系の初期の適応の１つは、Ｊｉｎｅｋら（Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２１。参照により本明細書に完全に組み込まれる）で見つけることができる。Ｊｉｎｅｋの研究は、最初に、（ｉ）化膿性連鎖球菌ＳＦ３７０から単離した組換え発現した、精製された完全長Ｃａｓ９（例えば、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓ酵素）、（ｉｉ）切断される標的ＤＮＡ配列に相補的な約２０ｎｔの５’配列と、その後の３’ｔｒａｃｒ結合配列とを有する精製された成熟した約４２ｎｔ ｃｒＲＮＡ（全ｃｒＲＮＡは合成ＤＮＡ鋳型からインビトロ転写されている）、（ｉｉｉ）Ｔ７プロモーター配列を運ぶ合成ＤＮＡ鋳型からインビトロ転写された精製されたｔｒａｃｒＲＮＡ、および、（ｉｖ）Ｍｇ^２＋を含んでいた系を記載した。Ｊｉｎｅｋは後に、（ｉｉ）のｃｒＲＮＡがリンカー（例えば、ＧＡＡＡ）によって（ｉｉｉ）の５’末端に結合されて、それ自体でＣａｓ９を標的に導くことができる単一の融合合成ガイドＲＮＡｓｇＲＮＡ）を形成する、改良型の操作された系を記載した。

【0132】

参照により本明細書に完全に組み込まれるＭａｌｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｆｅｂ １５； ３３９（６１２１）：８２３－８２６．）はその後、以下、（ｉ）Ｃ末端核局在化配列（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ）および適切なポリアデニル化シグナル（例えば、ＴＫ ｐＡシグナル）を有する適切な哺乳動物プロモーター下でコドン最適化Ｃａｓ９（例えば、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓ酵素）をコードするＯＲＦ、および、（ｉｉ）適切なポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）下で、ｓｇＲＮＡをコードするＯＲＦ（Ｇで始まる５’配列と、その後の、３’ｔｒａｃｒ結合配列、リンカー、およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列に連結した２０ｎｔの相補的標的核酸配列とを有する）をコードするＤＮＡベクターを提供することにより、哺乳動物細胞で使用するためにこの系を適合させた。

【0133】

塩基編集

【0134】

塩基編集とは、二本鎖切断の生成と修復を必要とすることなく、ある標的塩基または塩基対を別のものに変換することである（例えば、Ａ：ＴからＧ：Ｃ、Ｃ：ＧからＴ：Ａ）。塩基編集は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかにおいて、特定の部位に点変異を導入することを可能にするＤＮＡおよびＲＮＡ塩基エディターの助けを借りて達成され得る。一般に、ＤＮＡ塩基エディターは、触媒的に不活性なヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）にのみ作用する触媒的に活性な塩基修飾酵素の融合体を含み得る。ＲＮＡ塩基エディターは、同様のＲＮＡ特異的な酵素で構成され得る。塩基編集は、ＤＮＡのオフターゲットおよびランダムな変異を減少させつつ、遺伝子修飾の効率を増加させることができる。

【0135】

ＤＮＡ塩基エディターは、細胞や生物における一塩基置換のためのツールとして機能する、操作されたリボ核タンパク質複合体である。この複合体は、塩基修飾酵素と、ｄｓＤＮＡを切断することはできないが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に依存的なやり方でｄｓＤＮＡを展開することができる触媒的に欠損したＣａｓ変異体とを融合することによって作成することができ、ガイドＲＮＡがｓｓＤＮＡ切断部位を示すためにその補完ターゲットを見つけることができるようにする。ガイドＲＮＡは相補的なＤＮＡにアニールし、ｓｓＤＮＡの断片をずらし、Ｃａｓの「はさみ」を塩基修飾部位に向かわせる。細胞修復機構は、相補的な編集鋳型からの情報を用いて、切れ目の入った非編集鎖を修復する。

【0136】

これまで、２種類のＤＮＡエディター、シトシン塩基エディター（ＣＢＥ）とアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）が開発されている。これらは、オフターゲットＤＮＡ編集を最小限に抑えつつ、ＤＮＡの点変異を効率的かつ正確に編集することが示された（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１７；３５：４３５－４３７， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１７；３５：４３８－４４０、およびＮａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１７；３５：４７５－４８０を参照。上記文献の各々は参照により完全に本明細書に組み込まれる）。しかしながら、最近の知見は、オフターゲット修飾がＤＮＡに存在し、多くのオフターゲット修飾がＤＮＡ塩基エディターによってＲＮＡにも導入されることを示している。

【0137】

ＭＧ塩基エディター

【0138】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集系を提供し、前記操作された核酸編集系は、（ａ）ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、前記エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼと、（ｂ）エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、（ｃ）エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された、操作されたガイドリボ核酸構造であって、（ｉ）標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造とを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合によっては、ＲｕｖＣドメインは、ヌクレアーゼ活性を欠いている。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ニッカーゼ変異を含む。場合によっては、エンドヌクレアーゼは二本鎖標的のデオキシリボ核酸の１つの鎖を切断するように構成される。場合によっては、エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列は、ｔｒａｃｒ配列を含む。

【0139】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集系を提供し、前記操作された核酸編集系は、（ａ）配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼと、エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された、操作されたガイドリボ核酸構造であって、（ｉ）標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造とを含む。場合によっては、エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列は、ｔｒａｃｒ配列を含む。場合によっては、ＲｕｖＣドメインは、ヌクレアーゼ活性を欠いている。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ニッカーゼ変異を含む。場合によっては、エンドヌクレアーゼは二本鎖標的のデオキシリボ核酸の１つの鎖を切断するように構成される。

【0140】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集系を提供し、前記操作された核酸編集系は、（ａ）配列番号３６０～３６８または５９８のいずれか１つを含む、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されたエンドヌクレアーゼであって、エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、前記エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼと、（ｂ）エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、（ｃ）エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された、操作されたガイドリボ核酸構造であって、（ｉ）標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造とを含む。場合によっては、エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列は、ｔｒａｃｒ配列を含む。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ニッカーゼ変異を含む。場合によっては、ＲｕｖＣドメインは、ヌクレアーゼ活性を欠いている。場合によっては、エンドヌクレアーゼは二本鎖標的のデオキシリボ核酸の１つの鎖を切断するように構成される。

【0141】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼに対して８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＨＮＨドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、配列番号８８～９６または４８８～４８９のいずれか１つあるいはその変異体から選択される約６０～９０個の連続したヌクレオチドに対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、配列番号８８～９６または４８８～４８９のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0142】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集系を提供し、前記操作された核酸編集系は、（ａ）操作されたガイドリボ核酸構造であって、前記操作されたガイドリボ核酸構造が、（ｉ）標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、および、（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含み、ｔｒａｃｒリボ核酸配列が、配列番号８８～９６または４８８～４８９のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、操作されたガイドリボ核酸構造に結合するように構成されたクラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼと、を含む。

【0143】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは配列番号３６０、３６２、または３６８のいずれか１つを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成される。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、配列番号１～５１、５７～６６、３８５～４４３、４４４～４７５、または５９４～５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターはアデニンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号５０～５１、５７、３８５～４４３、４４８～４７５、または５９５あるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターはシトシンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼは、配列番号１～４９、４４４～４４７、５９４、または５８～６６のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0144】

いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号５２～５６または配列番号６７のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0145】

いくつかの実施形態では、操作されたガイドリボ核酸構造は、少なくとも２つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、操作されたガイドリボ核酸構造は、ガイドリボ核酸配列とｔｒａｃｒリボ核酸配列とを含む１つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドリボ核酸配列は、原核生物、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、またはヒトのゲノム配列に相補的である。いくつかの実施形態では、ガイドリボ核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端に近接する１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。

【0146】

ＮＬＳは、以下の表１の配列のいずれか、またはその組み合わせを含むことができる。

【0147】

【表1】

【0148】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、塩基エディターに直接共有結合されるか、リンカーを介して塩基エディターに共有結合される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される酵素またはドメインのいずれかを連結するリンカーは、ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＡ、ＧＳＧＧＳ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ、ＳＧＧＳＳ、またはＧＡＡＡ、あるいは本明細書に記載される任意の他のリンカー配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列の１つまたは複数のコピーを含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはエンドヌクレアーゼと塩基エディターを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは二本鎖標的のデオキシリボ核酸の１つの鎖を切断するように構成される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、システムは、Ｍｇ^２＋の供給源をさらに含む。

【0149】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７０またはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号８８の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、エンドヌクレアーゼは、配列番号３６０を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0150】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７１またはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号８９の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、エンドヌクレアーゼは、配列番号３６１を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0151】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７３またはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号９１の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、エンドヌクレアーゼは、配列番号３６３を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0152】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７５またはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号９３の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、エンドヌクレアーゼは、配列番号３６５を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0153】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７６またはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号９４の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、エンドヌクレアーゼは、配列番号３６６を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0154】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７７またはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号９５の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、エンドヌクレアーゼは、配列番号３６７を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0155】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７８またはその変異体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、ガイドＲＮＡ構造は、配列番号９６の少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一である配列を含み、エンドヌクレアーゼは、配列番号３６８を含むＰＡＭに結合するように構成される。

【0156】

いくつかの実施形態では、塩基エディターはアデニンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、アデニンデアミナーゼは、配列番号５７またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターはシトシンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼは、配列番号５８またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作された核酸編集系は、ウラシルＤＮＡグリコシル化阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ウラシルＤＮＡグリコシル化阻害剤は、配列番号６７またはその変異体を含む。

【0157】

いくつかの実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される。いくつかの実施形態では、配列同一性は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびイグジステンス１１、エクステンション１でのギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスのパラメータを使用して、および条件付き構成スコアマトリックス調整を使用する前記ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定される。

【0158】

いくつかの態様において、本開示は、生物における発現のために最適化された操作された核酸配列を含む核酸を提供し、核酸は、塩基エディターに連結したクラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼをコードし、エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する。

【0159】

いくつかの態様において、本開示は、生物における発現のために最適化された操作された核酸配列を含む核酸を提供し、核酸は、塩基エディターに連結した配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、前記エンドヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端に近接する１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をコードする配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、生物は、原核生物、細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、げっ歯類、またはヒトである。

【0160】

いくつかの態様において、本開示は、塩基エディターに連結されたクラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むベクターを提供し、前記エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する。いくつかの実施形態では、ベクターは本明細書に記載される核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターはさらに、エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された、操作されたガイドリボ核酸構造をコードする核酸を含み、操作されたガイドリボ核酸構造は、標的のデオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、およびエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ＣＥＬｉＤ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のビリオン、またはレンチウイルスである。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるベクターを含む細胞を提供する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される細胞を培養する工程を含む、エンドヌクレアーゼを製造する方法を提供する。

【0161】

いくつかの態様では、本開示は、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを改変するための方法を提供し、上記方法は、複合体に二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを接触させる工程を含み、前記複合体は、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、ＲｕｖＣドメインはヌクレアーゼ活性を欠いている、エンドヌクレアーゼと、エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、エンドヌクレアーゼおよび二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドに結合するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造であって、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、操作されたガイドリボ核酸構造と、を含む。

【0162】

いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼは、塩基エディターに直接共有結合されるか、リンカーを介して塩基エディターに共有結合される。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼは、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0163】

いくつかの態様では、本開示は、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを改変するための方法を提供し、上記方法は、複合体に二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドを接触させる工程を含み、前記複合体は、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼと、エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、エンドヌクレアーゼおよび二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドに結合するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造とを含み、ここで、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、ＰＡＭは配列番号３６０～３６８または５９８、あるいはその変異体からなる群から選択された配列を含む。

【0164】

いくつかの実施形態では、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼは、塩基エディターに共有結合されるか、リンカーを介して塩基エディターに共有結合される。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、配列番号１～５１、５７～６６、３８５～４４３、４４４～４７５、または５９４～５９５から選択される配列あるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターはアデニンデアミナーゼを含み、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドはアデニンを含み、および、二本鎖デオキシリボ核酸ポリペプチドの改変は、アデニンをグアニンに変換することを含む。いくつかの実施形態では、アデニンデアミナーゼは、配列番号５７またはその変異体に対して少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。

【0165】

いくつかの実施形態では、塩基エディターはシトシンデアミナーゼを含み、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドはシトシンを含み、および、二本鎖デオキシリボ核酸ポリペプチドの改変は、シトシンをウラシルに変換することを含む。いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼは、配列番号５８またはその変異体に対して少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼは、配列番号５９～６６のいずれか１つまたはその変異体に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。

【0166】

いくつかの実施形態では、複合体は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号５２～５６または配列番号６７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、操作されたガイドリボ核酸構造の配列に相補的な配列を含む第１の鎖と、前記ＰＡＭを含む第２の鎖とを含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、操作されたガイドリボ核酸構造の配列に相補的な配列の３’末端に直接隣接する。

【0167】

いくつかの実施形態では、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、またはＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない。いくつかの実施形態では、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼは、未培養の微生物に由来する。いくつかの実施形態では、二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドは、真核生物、植物、真菌、哺乳動物、げっ歯類、またはヒト二本鎖デオキシリボ核酸ポリヌクレオチドである。

【0168】

いくつかの態様において、本開示は、標的核酸遺伝子座を改変する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載される操作された核酸編集系を前記標的核酸遺伝子座に送達する工程を含み、エンドヌクレアーゼは、操作されたガイドリボ核酸構造と複合体を形成するように構成され、複合体は、標的核酸遺伝子座に結合すると、標的核酸遺伝子座のヌクレオチドを改変するように構成される。

【0169】

いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系は、アデニンデアミナーゼを含み、ヌクレオチドはアデニンであり、標的核酸遺伝子座を改変することは、アデニンをグアニンに変換することを含む。いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系は、シチジンデアミナーゼおよびウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤を含み、ヌクレオチドはシトシンであり、標的核酸遺伝子座を改変することは、アデニンをウラシルに変換することを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または細菌ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、インビトロである。いくつかの実施形態では、標的核酸遺伝子座は、細胞内にある。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、霊長類細胞、またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は動物内にある。

【0170】

いくつかの実施形態では、細胞は蝸牛内にある。いくつかの実施形態では、細胞は胚内にある。いくつかの実施形態では、胚は２細胞胚である。いくつかの実施形態では、胚はマウス胚である。いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系を標的核酸遺伝子座に送達する工程は、本明細書に記載される核酸または本明細書に記載されるベクターを送達することを含む。いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系を標的核酸遺伝子座に送達する工程は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を送達することを含む。

【0171】

いくつかの実施形態では、核酸は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームが動作可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系を標的核酸遺伝子座に送達する工程は、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むキャップされたｍＲＮＡを送達することを含む。いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系を標的核酸遺伝子座に送達する工程は、翻訳されたポリペプチドを送達することを含む。いくつかの実施形態では、操作された核酸編集系を標的核酸遺伝子座に送達する工程は、リボ核酸（ＲＮＡ）ポリＩＩＩプロモーターに動作可能に連結された操作されたガイドリボ核酸構造をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を送達することを含む。

【0172】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集ポリペプチドを提供し、操作された核酸編集ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0173】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集ポリペプチドを提供し、操作された核酸編集ポリペプチドは、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼと、エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、を含む。

【0174】

いくつかの態様において、本開示は、操作された核酸編集ポリペプチドを提供し、操作された核酸編集ポリペプチドは、配列番号３６０～３６８または５９８のいずれか１つを含む、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されたエンドヌクレアーゼであって、エンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩのＣａｓエンドヌクレアーゼであり、前記エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性が欠けるように構成される、エンドヌクレアーゼと、エンドヌクレアーゼに連結された塩基エディターと、を含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは未培養の微生物に由来する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼに対して８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＨＮＨドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列は、配列番号８８～９６または４８８～４８９のいずれか１つあるいはその変異体から選択される約６０～９０個の連続したヌクレオチドに対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列は、配列番号８８～９６または４８８～４８９のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、配列番号７０～７８または５９７のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターはアデニンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号５０～５１、５７、３８５～４４３、４４８～４７５、または５９５のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターはシトシンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼは、配列番号１～４９、４４４～４４７、５９４、または５８～６６のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0176】

本開示の系は、例えば、核酸編集（例えば、遺伝子編集）、核酸分子への結合（例えば、配列特異的結合）などの様々な用途に使用され得る。そのような系は、例えば、対象の疾患を引き起こし得る遺伝的に受け継がれた変異に対処（例えば、除去または置換）するために、細胞におけるその機能を確認するべく遺伝子を不活性化するために、疾患を引き起こす遺伝要素を検出する診断ツールとして（例えば、逆転写したウイルスＲＮＡ、または疾患を引き起こす変異をコードする増幅ＤＮＡ配列の切断を介して）、特定のヌクレオチド配列（例えば、抗生物質耐性を細菌にコードする配列）を標的として検出するためのプローブと組み合わせた不活性化酵素として、ウイルスゲノムを標的とすることによってウイルスを不活性化するか、宿主細胞に感染できないようにするために、遺伝子を追加するか、代謝経路を修正することで価値ある低分子、高分子、または二次代謝産物を生成するように生物を操作するために、進化的選択のための遺伝子駆動要素を確立するために、バイオセンサーとして外来低分子やヌクレオチドによる細胞障害を検出するために、使用することができる。

【0177】

【表2-1】

【0178】

【表2-2】

【0179】

【表2-3】

【実施例】

【0180】

実施例１．－塩基エディターのためのプラスミド構成
塩基編集を標的とするためにＣＲＩＳＰＲ機能を利用する塩基編集酵素を作成するために、Ｃａｓエフェクター酵素を、様々な構成で、本明細書に記載される例示的なデアミナーゼに融合した。このプロセスは、融合酵素の生成に適切なベクターを構築する第一段階を含んでいた。２つのエントリープラスミドベクター、ＭＧＡ、およびＭＧＣをまず構築した。

【0181】

Ｔ７プロモーターＨｉｓタグ－ＴａｄＡ＊（ＡＢＥ８．１７ｍ）－ＳＶ４０ ＮＬＳを含むＭＧＡ（Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉのアデニン塩基エディター）エントリープラスミドを構築するために、ｐＡＬ６から３つのＤＮＡ断片を増幅した。Ｔ７プロモーター－Ｈｉｓタグ－ＡＰＯＢＥＣ１（ＢＥ３）－ＵＧＩ－ＳＶ４０ ＮＬＳを含むＭＧＣ（Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉのシトシン塩基エディター）エントリープラスミドを構築するために、ｐＡＬ９からＡＰＯＢＥＣ１とＵＧＩ－ＳＶ４０ ＮＬＳを増幅し、ｐＡＬ６からベクターバックボーンの２つのピースを増幅した（図３参照）。

【0182】

エフェクターに変異を導入するために、ＭＧ１－４、ＭＧ１－６、ＭＧ３－６、ＭＧ３－７、ＭＧ３－８、ＭＧ４－５、ＭＧ１４－１、ＭＧ１５－１、またはＭＧ１８－１のエフェクター遺伝子配列を含むソースプラスミドを、適切な変異を組み込んだフォワードプライマーとリバースプライマーを有するＱ５ ＤＮＡポリメラーゼによって増幅した。その後、直鎖ＤＮＡ断片をリン酸化し、ライゲーションした。ＤＮＡ鋳型は、製造元の説明書に従って、ＫＬＤ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ＤｐｎＩで消化された。

【0183】

ｐＭＧＡおよびｐＭＧＣ発現プラスミドを生成するために、変異エフェクターを運ぶプラスミドから遺伝子を増幅し、それぞれＸｈｏＩ部位とＳａｃＩＩ部位を介してＭＧＡとＭＧＣのエントリープラスミドにクローニングした。Ｔ７プロモーター－ｓｇＲＮＡ－双方向性ターミネーターを含むｓｇＲＮＡ発現カセットをＢＥ発現プラスミドにクローニングするために、１セットのプライマー（フォワードプライマーとしてＰ３６６）を用いてＴ７プロモーター－スペーサー配列を増幅する一方で、別のプライマーセット（リバースプライマーとしてＰ３６７）を用いてスペーサー配列－ｓｇＲＮＡ足場－双方向性ターミネーターを増幅し、ｐＴＣＭプラスミドは鋳型として使用された（図２参照）。この２つの断片を、ＸｂａＩ部位を介してｐＭＧＡとｐＭＧＣに組み入れ、それぞれｐＭＧＡ－ｓｇＲＮＡとｐＭＧＣ－ｓｇＲＮＡが得られた。

【0184】

【表3-1】

【0185】

【表3-2】

【0186】

すべての増幅ＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を介して組み立て、得られた集合体を製造元の説明書に従ってＥｎｄｕｒａ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｌｕｃｅｒｇｅｎ）を介して増殖させた（図４および５参照）。すべてのクローニングした遺伝子のＤＮＡ配列は、ＥＬＩＭ ＢＩＯＰＨＡＲＭで確認された。

【0187】

【表4】

【0188】

実施例２．－タンパク質の発現および精製

【0189】

上記実施例１に記載されるそれぞれのプラスミドの各々で形質転換することにより、ｐＭＧＡおよびｐＭＧＣプラスミド中のＴ７プロモーター駆動変異エフェクター遺伝子を、製造元の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ）に従って、Ｍａｇｉｃ Ｍｅｄｉａ中の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中で発現させた。１６℃で４０時間インキュベートした後、形質転換細胞を収集し、溶解バッファー（ＨｉｓＴｒａｐ 平衡バッファー：２０ｍＭのトリス（Ｓｉｇｍａ Ｔ２３１９－１００ ＭＬ）、３００ｍＭの塩化ナトリウム（ＶＷＲ ＶＷＲＶＥ５２９－５００ ＭＬ）、５％グリセロール、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ ６８２６８－１００ ＭＬ－Ｆ）、ｐＨ７．５）、およびＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ））に懸濁し、－８０℃の冷凍庫内で冷凍した。その後、親和性精製の前に、細胞を氷上で解凍し、超音波処理し、清澄化し、および濾過した。製造元の仕様に従って、タンパク質をＡｋｔａ Ａｖａｎｔ ＦＰＬＣ上のＣｙｔｉｖａ ５ ｍｌ ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラムに適用し、２０ｍＭのトリス（Ｓｉｇｍａ Ｔ２３１９－１００ ＭＬ）、３００ｍＭの塩化ナトリウム（ＶＷＲ ＶＷＲＶＥ５２９－５００ ＭＬ）、５％グリセロール、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、および２５０ｍＭのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ ６８２６８－１００ ＭＬ－Ｆ）ｐＨ７．５の均一濃度の溶出液中に溶出した。Ｈｉｓタグ付きエフェクタータンパク質を含む溶出画分を濃縮し、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰ、５％グリセロール、ｐＨ７．５へとバッファー交換した。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ）により決定し、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のＳＤＳ ＰＡＧＥデンシトメトリーにより相対純度を決定した後に調整した（図７参照）。

【0190】

実施例３－インビトロニッカーゼアッセイ

【0191】

ＩＤＴによって合成された６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）標識プライマーＰ１４１およびＰ１４６（配列番号１７９および１８０）を用いて、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼを用いてエフェクターの標的配列を含むＬａｃＺの直鎖断片を増幅した。Ｔ７プロモーターと、その後に２０ｂｐまたは２２ｂｐのスペーサー配列を含むｓｇＲＮＡを含むＤＮＡ断片を、製造元の説明書に従ってＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてインビトロで転写した。配列表の命名されたｓｇＲＮＡに対応する配列を有する合成ｓｇＲＮＡを、ユーザーマニュアルに従ってＭｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により精製し、濃度をＮａｎｏｄｒｏｐによって測定した。

【0192】

ＤＮＡニッカーゼ活性を決定するために、精製された変異エフェクターの各々にまずその同族ｓｇＲＮＡを補充した。反応は、１０ｍＭのトリスｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、および１００ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｎＭの酵素、１５０ｎＭのＲＮＡ、および１５ｎＭのＤＮＡを含む１５μＬの反応混合物中に直鎖ＤＮＡ基質を加えることにより開始された。反応を３７℃で２時間インキュベートした。ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩ常磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、消化させたＤＮＡを精製し、６μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で溶出した。切れ目を入れたＤＮＡを１０％ＴＢＥ－尿素変性ゲル（Ｂｉｏｒａｄ）上で分解し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で画像化した（図７を参照。これは、描かれた酵素が、野生型酵素の場合に、６００塩基と２００塩基対４００塩基と２００塩基に対してのバンドの生成によってニッカーゼ活性を示すことを示している）。その結果、図７において試験したニッカーゼ変異体はすべて、結論には至らなかったＭＧ４－５（Ｄ１７Ａ）を除いて、野生型の切断活性ではなく、予想されるニッカーゼ活性を示すことが示された。

【0193】

実施例４－大腸菌への塩基エディターの導入

【0194】

プラスミドは、製造元の説明書に従い、ＬｕｃｅｒｇｅｎのエレクトロコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換された。エレクトロポレーション後、細胞を３７℃で１時間、発現回復培地で回収し、１００Ｌ／ｍｇのアンピシリンと０．１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢプレート上に広げた。３７℃で一晩増殖後、コロニーを採取し、プライマーＰ１３７およびＰ３６０を用いてＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によりｌａｃＺ遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物を精製し、ＥＬＩＭ ＢＩＯＰＨＡＲＭでサンガーシーケンシングにより配列決定した。塩基編集は、シトシン塩基エディターまたはアデニン塩基エディターについてそれぞれ、標的としたプロトスペーサー領域にＣからＴへの変換またはＡからＧへの変換が存在するかどうかを調べることによって決定された。

【0195】

大腸菌での編集効率を評価するために、プラスミドをエレクトロコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｌｕｃｅｒｇｅｎ）に形質転換し、エレクトロポレーションした細胞を発現回復培地にて３７℃で１時間回収した。次に、回収した細胞１０μＬを、９６ウェルのディープウェルプレートに入れた１００μＬ／ｍｇのアンピシリンと０．１ｍＭのＩＰＴＧを含む９９０μＬのＳＯＢに接種し、３７℃で２０時間増殖させた。塩基エディター発現のために誘導した１μＬの細胞を、プライマーＰ１３７およびＰ３６０を用いた２０μＬのＰＣＲ反応（Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ）においてｌａｃＺ遺伝子の増幅に使用した。得られたＰＣＲ産物を精製し、ＥＬＩＭ ＢＩＯＰＨＡＲＭでサンガーシーケンシングにより配列決定した。編集効率の定量化を、実施例１２に記載されるように、Ｅｄｉｔ Ｒで処理した。

【0196】

【表5】

【0197】

実施例５．－哺乳動物細胞中のタンパク質ヌクレオフェクションとアンプリコンシーケンス（予測的）

【0198】

ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）は、Ｌｏｎｚａ ４Ｄヌクレオフェクター（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）とＬｏｎｚａ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘ Ｋｉｔ Ｓ（ｃａｔ． ｎｏ． Ｖ４ＸＣ－２０３２）を用いて、製造元の推奨に従って哺乳動物細胞（例えば、Ｋ－５６２、Ｎｅｕ－２Ａ、またはＲＡＷ２６４．７）において実施する。ＳＦヌクレオフェクションバッファーを製剤化した後に、１回のヌクレオフェクションにつき２０万個の細胞を５μｌのバッファーに再懸濁する。ヌクレオフェクションあたり残りの１５μｌのバッファーにおいて、Ｓｙｎｔｈｅｇｏからの２０ｐｍｏｌの化学修飾ｓｇＲＮＡを、１８ｐｍｏｌの塩基エディター酵素（例えば、ＡＢＥ８ｅ）と組み合わせ、室温で５分間インキュベートして複合化する。細胞を２０μｌのヌクレオフェクションキュベットに加え、その後、タンパク質溶液を加え、混合物を粉砕して混合する。細胞をプログラムＣＭ－１３０でヌクレオフェクションし、その直後に８０μｌの温めた培地を各ウェルに加えて、回収する。５分後、各サンプルから２５μｌを４８ウェルのポリ－ｄ－リジンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の２５０μｌの新鮮な培地に加える。その後、細胞を上記のリポフェクション細胞と同様に処理し、さらに３日間培養した後にゲノムＤＮＡを抽出する。

【0199】

Ｉｌｌｕｍｉｎａのバーコーディングの後に、ＰＣＲ産物をプールし、３０μｌのＨ_２Ｏで溶出するＭｏｎａｒｃｈ ＤＮＡゲル抽出キット（Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、２％アガロースゲルで電気泳動することにより精製する。ＤＮＡ濃度をＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ高感度アッセイキット（Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量化し、製造元のプロトコルに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ器具（ペアエンドリード、Ｒ１：２５０～２８０サイクル、Ｒ２：０サイクル）で配列決定する。

【0200】

ＭｉＳｅｑ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、シーケンシングリードをデマルチプレックスし、ＦＡＳＴＱファイルはＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２を用いて解析される。個々の対立遺伝子における二重編集は、Ｐｙｔｈｏｎスクリプトによって解析される。塩基編集値は、異なる研究者によって収集されたｎ＝３の独立した生物学的複製を代表しており、平均±ｓ．ｄ．で示されている。塩基編集値は、整列した全リードに対するアデニン突然変異誘発を有するリードの数の割合として報告される。

【0201】

実施例６．－哺乳動物細胞におけるプラスミドヌクレオフェクションおよび全ゲノムシーケンス（予測的）

【0202】

すべてのプラスミドは、ウラシル特異的切除試薬（ＵＳＥＲ）クローニング法によって組み立てられる。ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、およびすべての操作された変異体のためのガイドＲＮＡプラスミドが組み立てられる。哺乳動物細胞トランスフェクション用のプラスミドは、ＺｙｍｏＰＵＲＥプラスミドＭｉｄｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて調製される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）は、１０％ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で培養し、３７℃にて５％ＣＯ２で維持する。

【0203】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、同じ培養培地中で４８ウェルのポリ－ｄ－リジンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種する。細胞は、トランスフェクション対照として、７５０ｎｇの塩基エディタープラスミド、２５０ｎｇのガイドＲＮＡプラスミド、および１０ｎｇの緑色蛍光タンパク質を用いて、１．５μｌのリポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でプレーティング後、１２～１６時間トランスフェクションされる。細胞を初日後に培地交換しながら３日間培養し、Å～１ ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄し、その後、１００μｌの新しく調製した溶解バッファー（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．０５％ＳＤＳ、２５μｇ ｍｌ－１ プロテイナーゼＫ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））をトランスフェクトした各ウェルに直接添加することによってゲノムＤＮＡを抽出する。混合物を３７℃で１時間インキュベートし、その後、８０℃で３０分間熱不活性化する。ゲノムＤＮＡ溶解物はその後、ハイスループットシーケンシング（ＨＴＳ）のためにすぐに使用される。

【0204】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのゲノムＤＮＡのＨＴＳが実行される。Ｉｌｌｕｍｉｎａのバーコーディングの後に、ＰＣＲ産物をプールし、３０μｌのＨ_２Ｏで溶出するＭｏｎａｒｃｈ ＤＮＡゲル抽出キット（Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（ＮＥＢ）を用いて、２％アガロースゲルで電気泳動することにより精製する。ＤＮＡ濃度をＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ高感度アッセイキット（Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量化し、製造元のプロトコルに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ器具（ペアエンドリード、Ｒ１：２５０～２８０サイクル、Ｒ２：０サイクル）で配列決定する。

【0205】

実施例７．－編集ウインドウを決定する（予測的）

【0206】

編集ウインドウ領域を調べるために、指定されたｓｇＲＮＡにおいて最も高いＣ－Ｔ変換頻度を示すシトシンを１に正規化し、同じｓｇＲＮＡのＰＡＭ配列の３０ｎｔ上流から１０ｎｔ下流（合計４３ｂｐ）にわたる位置の他のシトシンもその後に正規化する。次に、正規化したＣ－Ｔ変換頻度を、指定された塩基エディターの試験されたすべてのｓｇＲＮＡについて、その位置に従って分類および比較する。包括的編集ウインドウ（ＣＥＷ）は、正規化後に０．６を超える平均Ｃ－Ｔ変換効率を有する位置にまたがるように定義される。

【0207】

各シチジンデアミナーゼの基質選択性を調べるために、Ｃ部位は、最初にｓｇＲＮＡ標的領域におけるそれらの位置に応じて分類され、０．８以上の正規化Ｃ－Ｔ変換頻度の少なくとも１つのＣ部位を含むそれらの位置が、その後の解析に含まれる。選択されたＣ部位は、編集されたシトシンの上流または下流の塩基タイプ（ＮＣまたはＣＮ）に応じて比較される。エンドヌクレアーゼのＮ末端とＣ末端の両方で効率的なＣ－Ｔ変換を示すシチジンデアミナーゼについては、それぞれのＮＴ－ＣＢＥとＣＴ－ＣＢＥを一緒に組み込むことで基質選択性を評価する。統計解析には一元配置分散分析が使用され、ｐ＜０．０５を有意とみなす。

【0208】

実施例８ａ．－哺乳動物細胞における全ゲノムシーケンシングとトランスクリプトミクスによるオフターゲット解析の試験（予測的）

【0209】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、抗生物質を含まないＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でウェルあたり３．１０４細胞の密度でリポフェクションの１６～２０時間前に４８ウェルのポリ－ｄ－リジンコーティングプレート上にプレーティングする。７５０ｎｇのニッカーゼまたは塩基エディター発現プラスミドＤＮＡを、１５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ中で２５０ｎｇのｓｇＲＮＡ発現プラスミドＤＮＡと組み合わせる。これを、１ウェルあたり１．５μｌのリポフェクタミン２０００と８．５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸを含む１０μｌの脂質混合物と組み合わせる。トランスフェクションの３日後に細胞を採取し、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを採取する。ＤＮＡ解析のために、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、製造元の説明書に従って１００μｌのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に溶解させる。ＲＮＡの採取には、ＭａｇＭＡＸ ｍｉｒＶａｎａの全ＲＮＡ単離キット（Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘとともに使用する。

【0210】

哺乳動物細胞からのゲノムＤＮＡを断片化し、製造元の説明書に従って、９６ウェルプレートのＮｅｘｔｅｒａインデックスプライマー（ｉｎｄｅｘｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、Ｎｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、アダプターライゲートする。ライブラリーのサイズと濃度をＦｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって確認し、ＤＮＡをＮｏｖｏｇｅｎｅに送り、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑシステムを用いてＷＧＳを行う。

【0211】

標的としたＮＧＳデータはすべて一般的な４つの工程、（１）アラインメント、（２）重複マーキング（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｍａｒｋｉｎｇ）、（３）変異体コール（ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌｉｎｇ）、および、（４）アーチファクトや生殖系列突然変異を取り除くための変異体のバックグラウンドフィルタリングを実施することによって分析される。変異基準および代替対立遺伝子は、参照ゲノムのプラス鎖に対して報告される。

【0212】

全トランスクリプトームシーケンシングのために、ｍＲＮＡの選択は、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気単離モジュール（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて行われる。ＲＮＡライブラリー調製は、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて行われる。ＲＮＡ入力量に基づいて、アダプターライゲートされたＤＮＡのＰＣＲ濃縮には、１２のサイクル数が使用される。ＮＥＢＮｅｘｔのサンプル精製ビーズ（Ｓａｍｐｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｅａｄｓ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）は、本方法によって実施されるサイズ選択のすべてに使用される。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｌｉｇｏｓ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）は、プロトコルに概説されているＰＣＲレシピに従って、マルチプレックスインデックスに使用される。シーケンシングの前に、４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）のＨｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅを使用して、サンプルの品質をチェックする。ライブラリーをプールし、ＮｏｖａＳｅｑ（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ）を用いて配列決定する。その後、標的としたＲＮＡシーケンシングが行われる。相補的なＤＮＡは、製造元の説明書に従って、ＥＺＤｎａｓｅを有するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、単離したＲＮＡからの逆転写を伴うＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）により生成される。

【0213】

以下のプログラム、１２分間５８℃、２分間９８℃、その後の、ＣＴＮＮＢ１とＩＰ９０について、アンプリコンによって変化するＰＣＲサイクル、３２サイクルの（１０秒間９８℃、１０秒間６０℃、３０秒間７２℃）を使用する。組み合わせたＲＴ－ＰＣＲの後に、アンプリコンをバーコード化し、上記のようにＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンサーを使用して配列決定する。各アンプリコンのフォワードプライマーの終了後の最初の塩基から始まる各アンプリコンの最初の１２５塩基を参照配列に整列させ、各アンプリコンにおける最大Ａ対Ｉ頻度の解析に使用する。オフターゲットＤＮＡシーケンシングを、プライマーを用いて、２段階ＰＣＲとバーコーディング法を用いて行うことで、上記のようにＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンサーを用いるシーケンシングのためのサンプルを調製する。

【0214】

実施例８ｂ。－全ゲノムシーケンシングとトランスクリプトミクスによるオフターゲット編集の解析（予測的）

【0215】

実施例８ａのように調製されたトランスフェクト細胞を３日後に採取し、製造元の説明書に従ってＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてゲノムＤＮＡを単離する。オンターゲットおよびオフターゲットの関心対象のゲノム領域は、隣接するＨＴＳプライマーペアを用いたＰＣＲにより増幅される。ＰＣＲ増幅は、５ｎｇのゲノムＤＮＡを鋳型として、製造元の説明書に従って、Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて行われる。サイクル数は、反応が増幅の線形範囲で停止したことを確認するために、各プライマーペアについて別々に決定する（ＥＭＸ１、ＦＡＮＣＦ、ＨＥＫ２９３部位２、ＨＥＫ２９３部位３、ＨＥＫ２９３部位４、およびＲＮＦ２プライマーについて、それぞれ３０、２８、２８、２８、３２、および３２サイクル）。ＰＣＲ産物はＲａｐｉｄＴｉｐｓ（Ｄｉｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて精製される。精製したＤＮＡを、シーケンシングアダプターを含むプライマーでＰＣＲにより増幅させる。産物をゲル精製し、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ－Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量化する。サンプルは、前述したようにＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑで配列決定する。

【0216】

シーケンシングリードを、ＭｉＳｅｑ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて自動的にデマルチプレックスして、個々のＦＡＳＴＱファイルはカスタムＭａｔｌａｂスクリプトで解析される。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して、各リードを適切な参照配列にペアワイズアライメントする。Ｑスコアが３１未満のベースコール（ｂａｓｅ ｃａｌｌ）はＮに置き換えられ、ヌクレオチド頻度を計算する際に除外される。この処理により、予想されるＭｉＳｅｑのベースコールエラー率は約１，０００分の１となる。リードと参照配列にギャップがないアラインメント配列は、アラインメント表に保存され、そこから各遺伝子座について塩基頻度が作表された。インデル頻度は、カスタムＭａｔｌａｂスクリプトで定量化された。

【0217】

シーケンシングリードは、インデルが発生する可能性のあるウインドウの両側に隣接する２つの１０ｂｐ配列と正確に一致するようにスキャンされる。完全な一致が見つからなかった場合、そのリードは解析から除外される。このインデルのウインドウの長さが参照配列と完全に一致する場合、リードはインデルを含まないものとして分類される。インデルウインドウが参照配列よりも２塩基以上長いか短い場合、シーケンシングリードは、それぞれ挿入または欠失として分類される。

【0218】

実施例９．－マウス編集実験（予測的）

【0219】

新規のデアミナーゼドメインと融合した新規のＤＮＡ標的化ヌクレアーゼドメインからなる塩基エディターが、疾患の適切なマウスモデルでの試験により治療候補として検証できることが想定される。

【0220】

適切なモデルの一例は、例えば、Ｈｅｒｂｅｒｔら（１０．１１６１／ＡＴＶＢＡＨＡ．１１０．２０４０４０）により記載されているように、ヒトＰＣＳＫ９タンパク質を発現するように操作されたマウスを含む。ＰＣＳＫ９タンパク質は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）レベルを調節し、血清コレステロールレベルに影響を与える。ヒトＰＣＳＫ９タンパク質を発現しているマウスは、コレステロールレベルの上昇と、動脈硬化の急速な進行を呈する。ＰＣＳＫ９は、血漿中の脂質濃度が異常に高いため、心血管疾患のリスクが増加している人々の脂質レベルを低下させる有効な薬物標的である（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５６９－０１８－０１０７－８）。ゲノム編集によりＰＣＳＫ９のレベルを低下させることで、個人の生涯にわたって脂質レベルを恒久的に低下させ、心血管疾患のリスクを生涯にわたって低下させることが期待される。１つのゲノム編集アプローチは、未成熟停止コドンを作成し、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの機能的タンパク質への翻訳を防ぐために配列を編集することを目標として、ＰＣＳＫ９遺伝子のコード配列を標的とすることを含むことができる。コード配列の５’末端に近い領域を標的とすることは、タンパク質の大部分の翻訳をブロックするために有用である。高い効率と特異性で停止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）を作成するために、ＰＣＳＫ９コード配列の領域を標的とする必要があり、最も頻度の高い編集事象が停止コドンをもたらすように、編集ウインドウが適切な配列上に配置される。したがって、幅広いＰＡＭを有する複数の塩基編集系、または縮重ＰＡＭを有する塩基編集系の利用可能性は、ＰＣＳＫ９遺伝子のより多くの潜在的な標的部位にアクセスするのに有用である。さらに、オフターゲット編集の頻度が低い（例えば、オンターゲット編集事象の１％以下の範囲）追加の編集系も、この文脈で遺伝子編集を行うのに有用である。

【0221】

治療効果に必要な塩基編集の効率は、血漿脂質レベルの有意な減少を達成するために５０％以上の範囲にある。ＰＣＳＫ９遺伝子中の停止コドンを作成するための塩基エディターの使用の例は、Ｃａｒｒｅｒａｓら（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１２９１５－０１８－０６２４－２）のものであり、ＰＣＳＫ９対立遺伝子の１０％～３４％が停止コドンを作成するために編集された。このレベルの編集は、マウスにおける血漿脂質レベルの測定可能な減少をもたらすのに十分であったが、ヒトにおける治療的使用には、より高い編集効率が必要とされるであろう。

【0222】

ＰＣＳＫ９遺伝子における停止コドンの導入に最適な塩基編集（ＢＥ）系およびガイドを同定するために、Ｈｅｐａ１－６細胞などのマウス肝細胞株でスクリーニングを実施することができる。インシリコスクリーニングはまず、利用可能な様々なＢＥ系でＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするガイドを同定するために使用され得る。多数の可能なガイドの中から選択するために、インシリコ解析を実施することで、編集時に停止コドンを作製することができる配列を包含する編集ウインドウを有するガイドを決定することができる。その後、コード配列の５’末端に近いガイドを優先することができる。得られたガイドとＢＥタンパク質のセットを、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成するために組み合わせ、Ｈｅｐａ１－６細胞にヌクレオフェクションすることができる。７２時間後、標的部位における編集の効率は、ＮＧＳ分析によって決定することができる。これらのインビトロの結果に基づいて、停止コドン形成の頻度が最も高い１つ以上のＢＥ／ガイドの組み合わせを、インビボの試験用に選択することができる。

【0223】

ヒトの治療に応用するために、塩基エディターとガイドＲＮＡとを含む塩基編集成分を安全かつ効果的に送達する方法が必要である。インビボでの送達方法は、ウイルス性または非ウイルス性の方法に分けることができる。ウイルスベクターの中でもアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、その安全記録、複数の組織や細胞種への効率的な送達、および確立された製造プロセスから、臨床で使用される最適なウイルスである。大きなサイズの塩基エディター（ＢＥ）はＡＡＶのパッケージング能力を超えるため、単一のアデノ随伴ウイルスにパッケージングすることが妨げられる。スプリットインテイン（ｓｐｌｉｔ ｉｎｔｅｉｎ）技術を使用してＢＥを２つのＡＡＶにパッケージングするアプローチは、マウスで成功することが実証されているが（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１９－０５０１－５）、２つのウイルスが必要なため、開発および製造が複雑になる。ＡＡＶのさらなる欠点は、ウイルスが宿主細胞のゲノムへの組み込みを促進する機構を持たず、ＡＡＶゲノムのほとんどがエピソームのままである一方で、ＡＡＶゲノムの一部は細胞内で自然に発生するランダム二本鎖切断で組み込まれるということである（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００９ Ａｕｇｕｓｔ； １１（４）： ４４２～４４７）。これにより、ＢＥを発現する遺伝子配列が生物の一生にわたって存続する可能性がある。さらに、ＡＡＶゲノムは、形質転換された細胞の核内にエピソームとして残存し、何年も維持される可能性があり、その結果、これらの細胞においてＢＥが長期的に発現し、ゆえに、オフターゲット事象が発生するリスクは、編集酵素が活性である時間に応じるため、オフターゲット効果のリスクが増大する。Ａｄ５などのアデノウイルス（Ａｄ）は、ＤＮＡペイロードを哺乳動物の肝臓に効率的に送達することができ、最大４５ｋｂのＤＮＡをパッケージングすることができる。しかしながら、アデノウイルスは哺乳動物において強い免疫反応を引き起こすことが知られており（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１３６／ｇｕｔ．４８．５．７３３）、患者においても、死亡を含む重大な有害事象を引き起こすことがある（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０２０．０２．０１０）。

【0224】

脂質ナノ粒子および高分子ナノ粒子を含む非ウイルス性送達ベクター（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１２．７９でレビュー）は、ウイルス性送達ベクターと比較して、免疫原性が低いことや核酸カーゴの一過性の発現などのいくつかの利点を有する。非ウイルス性送達ベクターにより誘発された一過性の発現は、オフターゲットの事象を最小限に抑えることが期待されるため、特にゲノム編集の応用に適している。加えて、ウイルスベクターとは異なり、非ウイルス性送達は治療効果を達成するために繰り返し投与することが可能である。また、非ウイルス性ベクターにパッケージングできる核酸分子のサイズに理論的な制限はないが、実際には、核酸のサイズが大きくなるにつれパッケージングの効率が悪くなり、粒子サイズが大きくなることがある。

【0225】

ＢＥは、ＢＥをコードする合成ｍＲＮＡをガイドＲＮＡとともにＬＮＰにカプセル化することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）などの非ウイルス性ベクターを用いてインビボで送達することができる。これは、例えば、Ｆｉｎｎら（ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１８．０２．０１４）、またはＹｉｎら（ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３４７１）に記載されているように、当技術分野で周知の方法論を用いて実施することができる。通常、ＬＮＰは、主に肝臓の肝細胞にそのカーゴを送達し、これは、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を妨害しようとする場合の標的器官／細胞タイプでもある。このアプローチの概念実証を示すために、デアミナーゼドメインと融合した新規ゲノム編集タンパク質で構成されるＢＥを合成ｍＲＮＡにコードし、マウスのＰＣＳＫ９遺伝子の選択部位を標的とする適切なガイドＲＮＡとともにＬＮＰにパッケージ化することを想定している。ヒトＰＣＳＫ９遺伝子を発現するように操作されたマウスの場合、ガイドはヒトＰＣＳＫ９遺伝子のみを標的とするか、またはヒトおよびマウスのＰＣＳＫ９遺伝子の両方を標的とするように設計することができる。これらのＬＮＰの注入後、肝細胞のゲノム内のオンターゲット部位における編集効率は、アンプリコンシーケンシングまたは分解によるインデルの追跡などの他の方法によって分析することができる（ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ９３６）。生理的影響は、標準的な方法を用いて、総コレステロールおよびトリグリセリドレベルを含む、マウスの血液中の脂質レベルを測定することによって決定することができる。

【0226】

新規ＢＥを評価するためにマウスでモデル化することができる疾患の別の例は、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型である。原発性高シュウ酸尿症Ｉ型（ＰＨ１）は、アラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼという酵素をコードするＡＧＸＴ遺伝子の欠損によって起こる稀な常染色体劣性遺伝疾患である。その結果、グリオキシル酸代謝に異常が生じ、毒性代謝物であるシュウ酸が蓄積される。この疾患を処置する１つのアプローチは、グリコール酸からグリオキシル酸を生成する酵素グリコール酸オキシダーゼ（ＧＯ）の発現量を減らし、それによってシュウ酸の生成に利用できる基質（グリオキシル酸）の量を減らすことである。ＰＨ１は、ＡＧＸＴ遺伝子の両コピーをノックアウトしたマウス（ａｇｘｔ －／－マウス）でモデル化することができ、その結果、尿中のシュウ酸濃度が野生型の対照に比べて有意に３倍上昇する。このため、ａｇｘｔ －／－マウスを用いて、内因性マウスＧＯ遺伝子のコード配列に停止コドンを作製するように設計した新規の塩基エディターの有効性を評価することができる。ＢＥ系およびＧＯ遺伝子における停止コドンの導入に最適なガイドを同定するために、Ｈｅｐａ１－６細胞などのマウス肝細胞株でスクリーニングを実施することができる。インシリコスクリーニングはまず、利用可能な様々なＢＥ系でＧＯ遺伝子を標的とするガイドを同定するために使用され得る。多数の可能なガイドの中から選択するために、インシリコ解析を実施することで、編集時に停止コドンを作製することができる配列を包含する編集ウインドウを有するガイドを決定することができる。その後、コード配列の５’末端に近いガイドを優先することができる。得られたガイドとＢＥタンパク質のセットを、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成するために組み合わせ、Ｈｅｐａ１－６細胞にヌクレオフェクションすることができる。７２時間後、標的部位における編集の効率は、ＮＧＳ分析によって決定することができる。これらのインビトロの結果に基づいて、停止コドン形成の頻度が最も高い１つ以上のＢＥ／ガイドの組み合わせを、マウスにおけるインビボの試験用に選択することができる。

【0227】

ＢＥとガイドは、ＢＥを発現させるためのスプリットインテイン系と、ガイドを送達するための第３のＡＡＶを有するＡＡＶウイルスを使用してマウスに送達され得る。代替的に、アデノウイルスの４０Ｋｂを超えるパッケージング能力のため、アデノウイルス５型を使用して、ＢＥとガイドを単一のウイルスで送達することができる。さらに、ＢＥは、適切なＬＮＰにパッケージングされたガイドＲＮＡとともにｍＲＮＡとして送達されることもある。ＬＮＰをａｇｘｔ －／－マウスに静脈注射した後、尿中のシュウ酸レベルを経時的にモニタリングすることで、ＢＥが活性で期待通りの治療効果があったことを示し得るシュウ酸レベルの低下があったかどうかを調べることができる。ＢＥが停止コドンを導入したかどうかを判定するために、処理したマウスと対照マウスの肝臓から抽出したゲノムＤＮＡからＧＯ遺伝子の適切な領域をＰＣＲ増幅することができる。得られたＰＣＲ産物は、次世代シーケンシングを用いて配列決定することで、配列変化の頻度を決定することができる。

【0228】

実施例１０．－新規なデアミナーゼの遺伝子発見

【0229】

多様な環境（土壌、堆積物、地下水、好熱性、ヒト、および非ヒトの微生物群）から得られた４Ｔｂｐ（テラ塩基対）の独自仕様のおよび公開の組み立てられたメタゲノム配列決定データをマイニングすることで、新規デアミナーゼを発見した。既知のデアミナーゼのＨＭＭプロファイルを構築し、ＨＭＭＥＲ３（ｈｍｍｅｒ．ｏｒｇ）を用いてすべての予測されたタンパク質を検索して、我々のデータベースからデアミナーゼを同定した。予測されたデアミナーゼと参照（例えば、真核生物のＡＰＯＢＥＣ１、細菌のＴａｄＡ）のデアミナーゼをＭＡＦＦＴとアラインメントして、ＦａｓｔＴｒｅｅ２を用いて系統樹を推論した。本明細書で開示した配列で構成されるクレードを同定することにより、新規ファミリーおよびサブファミリーを定義した。候補は、酵素機能を示す重要な触媒残基の存在に基づいて選択した（例えば、配列番号１～５１、３８５～３８６、３８７～４４３、４４４～４４７、または４８８～４７５を参照）。

【0230】

実施例１１．－プラスミド構築

【0231】

遺伝子のＤＮＡ断片は、Ｔｗｉｓｔ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）のいずれかで合成された。プラスミドＤＮＡは、Ｅｎｄｕｒａエレクトロコンピテント細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）で増幅し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって単離した。ベクターバックボーンはプラスミドの制限酵素消化により調製された。Ｅｌｉｍ ＢＩＯＰＨＡＲＭまたはＩＤＴから取り寄せたプライマーを用いて、Ｑ５高忠実度（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により、挿入物を増幅した。ベクターバックボーンと挿入物の両方を、Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてゲル抽出により精製した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を介して１つまたは複数のＤＮＡ断片をベクターに組み入れた（配列番号４８３～４８７）。

【0232】

実施例１２．－シーケンシングによる大腸菌における塩基編集効率の評価

【0233】

実施例４と同様に調製した５ｎｇの抽出ＤＮＡを鋳型として使用し、プライマー（Ｐ１３７およびＰ３６０）を用いてＰＣＲ増幅を行い、得られた産物をＥＬＩＭ ＢＩＯＰＨＡＲＭでのサンガーシーケンシングに供した。シーケンシングに用いたプライマーを表６および表７に示す（配列番号５２３～５３１）。

【0234】

【表6-1】

【0235】

【表6-2】

【0236】

【表6-3】

【0237】

【表6-4】

【0238】

【表6-5】

【0239】

【表7】

【0240】

図８は、サンガーシーケンシングによって評価されるような、この実験によって調べられる酵素による例示的な塩基編集を示す。

【0241】

図１０は、表３に従ってＴａｄＡ（ＡＢＥ８．１７ｍ）（配列番号５９６）およびＭＧニッカーゼを用いたアデニン塩基エディター（ＡＢＥｓ）の塩基編集効率を示す。ＴａｄＡは、ｔＲＮＡアデニンデアミナーゼであり、ＴａｄＡ（ＡＢＥ８．１７ｍ）は、大腸菌ＴａｄＡの操作された変異体である。ＴａｄＡ（ＡＢＥ８．１７ｍ）と融合した１２個のＭＧニッカーゼを構築し、大腸菌で試験した。３つのガイドはｌａｃＺを標的とするように設計された。ボックス内に示された数字は、各位置におけるＥｄｉｔ Ｒによって定量化されたＡからＧへの変換のパーセンテージを示す。ＡＢＥ８．１７ｍは実験の陽性対照として用いられた。

【0242】

図１１は、ラットＡＰＯＢＥＣ１、ＭＧニッカーゼ、およびバチルススブチリスバクテリオファージのウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ（ＰＢＳ１））を含むシトシン塩基エディター（ＣＢＥｓ）の塩基編集効率を示す。ＡＰＯＢＥＣ１はシトシンデアミナーゼである。Ｎ末端にｒＡＰＯＢＥＣ１を、Ｃ末端にＵＧＩを融合させた１２個のＭＧニッカーゼを構築して、大腸菌で試験した。３つのガイドはｌａｃＺを標的とするように設計された。ボックス内に示された数字は、Ｅｄｉｔ Ｒによって定量化されたＣからＴへの変換のパーセンテージを示す。ＢＥ３は実験の陽性対照として用いられた。

【0243】

図１２は、ＣＢＥに加えた場合の塩基編集活性に対するＭＧウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）の効果を示す。（ａ）ＭＧＣ１５－１は、Ｎ末端のＡＰＯＢＥＣ１、ＭＧ１５－１ニッカーゼ、およびＣ末端のＵＧＩを含む。大腸菌でシトシン塩基編集活性の改善について３つのＭＧ ＵＧＩを試験した。（ｂ）ＢＥ３はＮ末端のｒＡＰＯＢＥＣ１、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ、およびＣ末端のＵＧＩを含む。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるシトシン塩基編集活性の改善について、２個のＭＧ ＵＧＩを試験した。編集効率はＥｄｉｔ Ｒによって定量化した。

【0244】

実施例１３．－細胞培養、トランスフェクション、次世代シーケンシング、および塩基編集解析

【0245】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）中で３７℃、５％ＣＯ２で増殖させ、継代した。５×１０^４個の細胞を細胞接着のために処理した９６ウェル細胞培養プレートに播種し（Ｃｏｓｔａｒ）、２０～２４時間培養し、トランスフェクションの直前に使用済み培地を新しい培地でリフレッシュした。製造元の説明書に従って、１ウェルあたり２００ｎｇの発現プラスミドと１μＬのリポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をトランスフェクションに使用した。トランスフェクトした細胞を３日間培養し、採取し、製造元の説明書に従ってＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を用いてｇＤＮＡを抽出した。表８および表９に列挙したプライマー（配列番号５３８～５８５）と抽出したＤＮＡを鋳型として、Ｑ５高忠実度（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて塩基編集の標的とする領域を増幅した。

【0246】

【表8】

【0247】

【表9-1】

【0248】

【表9-2】

【0249】

【表9-3】

【0250】

【表9-4】

【0251】

ＰＣＲ産物は、ＨｉｇｈＰｒｅｐ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＧＢＩＯ）を用いて、製造元の説明書に従って精製した。候補酵素の塩基編集に対するウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）の効果は、ＰＣＲ産物をＥｌｉｍ ＢＩＯＰＨＡＲＭに提出してサンガーシーケンスを行うことで解析され、その効率をＥｄｉｔ Ｒによって定量化した。Ａ０Ａ２Ｋ５ＲＮＤ７－ＭＧ ニッカーゼ－ＭＧ６９－１の塩基編集を解析するために、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）とＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔｓ（ｉｌｕｍｉｎ）に適合するプライマーとを用いてその後のＰＣＲ反応によって、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に使用するアダプターをＰＣＲ産物に付加した。得られた産物のＤＮＡ濃度をＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって定量化し、サンプルをまとめてプールしてＮＧＳ解析用のライブラリーを調製した。得られたライブラリーを、Ａｒｉａ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてｑＰＣＲによって定量化し、製造元の説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ装置でハイスルーシーケンシングを行った。配列決定データは、Ｃｒｉｐｒｅｓｓｏ２によって塩基編集について解析された。

【0252】

図１３は、ＣＭＰ／ＤＣＭＰタイプのデアミナーゼドメイン含有タンパク質（ｕｎｉｐｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ａ０Ａ２Ｋ５ＲＤＮ７）、ＭＧニッカーゼ、およびＭＧ ＵＧＩを含むシトシン塩基エディターの塩基編集効率を示す塩基エディターによって標的とされる部位のマップを示す。構築物は、Ｎ末端のＡ０Ａ２Ｋ５ＲＤＮ７、ＭＧニッカーゼ、およびＣ末端のＭＧ６９－１を含む。簡略化のために、図にはＭＧニッカーゼの同一性のみを示している。塩基編集の陽性対照としてＢＥ３（ＡＰＯＢＥＣ１）を使用した。陽性対照には、空のベクターを使用した。３つの独立した実験が異なる日に行われた。略語：Ｒはリピート、ＮＥＧは陰性対照である。

【0253】

【表9-5】

【0254】

実施例１４．－大腸菌中の塩基エディター変異体の陽性選択

【0255】

図１４は、大腸菌におけるＴａｄＡ特徴付けのための陽性選択方法を示す。パネル（ａ）は、ＴａｄＡ選択に使用される１つのプラスミド系のマップを示す。このベクターは、ＣＡＴ（Ｈ１９３Ｙ）、ＣＡＴを標的とするｓｇＲＮＡ発現カセット、およびＡＢＥ発現カセットを含む。この図では、大腸菌由来のＮ末端のＴａｄＡと、化膿性連鎖球菌由来のＣ末端のＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）が示されている。パネル（ｂ）は、大腸菌細胞に導入／形質転換すると、ＣＡＴ（Ｈ１９３Ｙ）の鋳型鎖のＡ２位が編集され、Ｈ１９３Ｙ変異体が野生型に戻り、その活性を回復させることを実証するシーケンシングトレースを示す。略語：ＣＡＴはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである。

【0256】

１０ｎｇ／μＬの濃度のプラスミド溶液１μＬを２５μＬのＢＬ２１（ＤＥ３）エレクトロコンピテント細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に形質転換し、３７℃で１時間、９７５μＬの発現回復培地で回収した。得られた細胞５０μＬを、１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ、および適量のクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに広げた。コロニーが採取できるようになるまで、プレートを３７℃でインキュベートした。コロニーＰＣＲを使用して塩基編集を含むゲノム領域を増幅し、得られた産物をＥＬＩＭ ＢＩＯＰＨＡＲＭでのサンガーシーケンシングのために提出した。ＰＣＲとシーケンシングに使用したプライマーを表１０に列挙する（配列番号５３２～５３７）。

【0257】

【表10】

【0258】

図１５は、ＴａｄＡによって引き起こされる変異がクロラムフェニコール（Ｃｍ）の高い耐性を可能にすることを示す。パネル（ａ）は、大腸菌の抗生物質耐性を選択するために、異なる濃度のクロラムフェニコールが使用された成長プレートの写真を示す。この例では、大腸菌由来のＴａｄＡ（ＥｃＴａｄＡ）の野生型と２つの変異体とが試験された。パネル（ｂ）は、変異型ＴａｄＡを有するＡＢＥが野生型よりも高い編集効率を示すことを実証する結果の概要表を示す。これらの実験では、０．５μｇ／ｍＬ以上のＣｍを有するプレートからコロニーを採取した。簡略化のために、表にはデアミナーゼの同一性のみを示すが、エフェクター（ＳｐＣａｓ９）および構築物の構成は上記の図に示す。

【0259】

図１６は、陽性選択におけるＭＧ ＴａｄＡ活性の調査を示す。パネル（ａ）はある実験からの成長プレートの写真を示し、ここでは、８つのＭＧ６８ ＴａｄＡ候補を、０～２μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールに対して試験した（ＡＢＥは、Ｎ末端のＴａｄＡ変異体とＣ末端のＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）ニッカーゼを含んでいた）。簡略化のために、デアミナーゼの同一性のみを示す。パネル（ｂ）は、ＭＧ ＴａｄＡ候補の編集効率を示す概要表を示す。パネル（ｂ）は、ＭＧ６８－３およびＭＧ６８－４がアデニンの塩基編集を駆り立てたことを実証している。この試験では、０．５μｇ／ｍＬ以上のＣｍを有するプレートからコロニーを採取した。

【0260】

図１７は、ＭＧ６８－４におけるＤ１０９Ｎ突然変異を介するＭＧ６８－４＿ｎＳｐＣａｓ９の塩基編集効率の改善を示す。パネル（ａ）は、野生型ＭＧ６８－４およびその変異体を０～４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールに対して試験した成長プレートの写真を示す。簡略化のために、デアミナーゼの同一性のみを示す。この実験におけるアデニン塩基エディターは、Ｎ末端のＴａｄＡ変異体とＣ末端のＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）ニッカーゼを含む。パネル（ｂ）は、ＭＧ ＴａｄＡ候補の編集効率を示す概要表を示す。パネル（ｂ）は、ＭＧ６８－４およびＭＧ６８－４（Ｄ１０９Ｎ）がアデニンの塩基編集を示し、Ｄ１０９Ｎ変異体が活性の増加を示すことを実証している。この試験では、０．５μｇ／ｍＬ以上のＣｍを有するプレートからコロニーを採取した。

【0261】

図１８は、ＭＧ６８－４（Ｄ１０９Ｎ）＿ｎＭＧ３４－１の塩基編集を示す。パネル（ａ）は、Ｎ末端のＭＧ６８－４（Ｄ１０９Ｎ）およびＣ末端のＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）ニッカーゼを含むＡＢＥが、０～２μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールに対して試験された実験の成長プレートの写真を示す。パネル（ｂ）は、ｓｇＲＮＡを用いた場合と用いない場合の編集効率を描いた概要表を示す。この試験では、１μｇ／ｍＬ以上のＣｍを有するプレートからコロニーを採取した。

【0262】

図１９は、ＭＧ６８－４－ｎＭＧ３４－１塩基編集活性の改善のために設計された２８のＭＧ６８－４変異体を示す。酵素の編集を改善するために、１２個の残基が標的化変異誘発のために選択された。

【0263】

本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないことが当業者に明らかであろう。本発明が明細書内で提供される特定の例によって制限されることは意図していない。本発明は前述の明細書に関して記載されているが、本明細書中の実施形態の記載および例示は、限定的な意味で解釈されることを意味するものではない。当業者であれば、多くの変更、変化、および置換を、本発明から逸脱することなく思いつくだろう。さらに、本発明のすべての態様は、様々な条件および変数に依存する、本明細書で説明された特定の描写、構成、または相対的な比率に限定されないことが理解されよう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替物が、本発明の実施に際して利用され得ることを理解されたい。それゆえ、本発明は、任意のそのような代替物、修正物、変形物、または同等物にも及ぶものと企図される。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその同等物の範囲内の方法および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

2023540797000001.app

【国際調査報告】