2023-540800 リフォールディングされたヒト血清アルブミン及びその抗腫瘍ための使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-26

(54)【発明の名称】リフォールディングされたヒト血清アルブミン及びその抗腫瘍ための使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/765 20060101AFI20230919BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230919BHJP

   C07K 1/34 20060101ALI20230919BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230919BHJP

   A61K 38/38 20060101ALI20230919BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20230919BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20230919BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20230919BHJP

【ＦＩ】

C07K14/765 ZNA

C12P21/02 A

C07K1/34

A61P35/00

A61K38/38

A61K39/00 H

A61K39/39

G01N33/68

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023516078

(86)(22)【出願日】2021-09-10

(85)【翻訳文提出日】2023-04-21

(86)【国際出願番号】 US2021049816

(87)【国際公開番号】W WO2022056233

(87)【国際公開日】2022-03-17

(31)【優先権主張番号】63/077,585

(32)【優先日】2020-09-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】596118493

【氏名又は名称】アカデミア シニカ

【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ

【住所又は居所原語表記】１２８ Ｓｅｃ ２，Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ，Ｎａｎｋａｎｇ，Ｔａｉｐｅｉ １１５２９ ＴＷ

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】リャン， チーミン

(72)【発明者】

【氏名】シエ， ジェンジェル

(72)【発明者】

【氏名】チェン， チュンシュアン

(72)【発明者】

【氏名】リャン， シュウメイ

【テーマコード（参考）】

2G045

4B064

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA26

2G045CB02

2G045DA36

4B064AG24

4B064CA10

4B064CC15

4B064CE06

4B064CE10

4B064DA01

4B064DA14

4C084AA01

4C084AA02

4C084DA36

4C084NA14

4C084ZB262

4C085AA03

4C085AA38

4C085BB01

4C085CC01

4C085FF24

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045DA70

4H045EA20

4H045EA51

4H045FA71

4H045GA01

4H045GA10

4H045GA22

(57)【要約】

リフォールディングされたヒト血清アルブミン（ｒｆＨＳＡ）及びその抗腫瘍での使用が開示される。前記ｒｆＨＳＡは、ナイーブヒト血清アルブミンの一次アミノ酸配列を含み、溶液中のｒｆＨＳＡが繊維状ではなく楕円形であり、ナイーブＨＡＳが球状である。前記ｒｆＨＳＡは、対象のがん又は腫瘍を治療するために使用される。前記ｒｆＨＳＡは、腫瘍サンプルにおけるインテグリンβ１又はセリン／スレオニンプロテインキナーゼＡｋｔ及び細胞外シグナル調節キナーゼ１／２ （ＥＲＫ１／２）に関するがん細胞の存在を検出するための試薬、又はがん細胞サンプルにおけるＡｋｔ及びＥＲＫ１／２のリン酸化を阻害するための試薬としても使用することができる。ｒｆＨＳＡで処理したがん細胞の細胞溶解物、前記がん細胞溶解物を含むワクチン組成物、それらの使用も開示される。ｒｆＨＳＡの製造方法も開示される。
【選択図】図１４Ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

リフォールディングされたヒト血清アルブミン（ｒｆＨＳＡ）分子であって、
前記ｒｆＨＳＡ分子は、ナイーブヒト血清アルブミン（ナイーブＨＳＡ）分子の一次アミノ酸配列を含み、溶液中の前記ｒｆＨＳＡ分子は、繊維状ではなく楕円形であり、前記ナイーブＨＳＡ分子は、球状である、リフォールディングされたヒト血清アルブミン（ｒｆＨＳＡ）分子。

【請求項2】

（ｉ）Ｃ１２４－Ｃ１６８及びＣ１６９－Ｃ１７７；
（ｉｉ）Ｃ５６７－Ｃ７５及びＣ６２－Ｃ３６１；
（ｉｉｉ）Ｃ４８７－Ｃ３６０及びＣ３６１－Ｃ６２；並びに
（ｉｖ）それらの任意の組み合わせ；
からなる群より選択される２つ以上の分子内ジスルフィド架橋を欠いている、請求項１に記載のｒｆＨＳＡ分子。

【請求項3】

分子内ジスルフィド架橋Ｃ１２４－Ｃ１６８、Ｃ１６９－Ｃ１７７、Ｃ５６７－Ｃ７５、Ｃ６２－Ｃ３６１及びＣ４８７－Ｃ３６０を欠いている、請求項１に記載のｒｆＨＳＡ分子。

【請求項4】

非還元条件下でのトリプシンによる限定的なタンパク質分解後に、質量電荷比（ｍ／ｚ）が４５５９、５７２９及び７２２３の質量スペクトルフラグメントイオンを欠いており、前記ｍ／ｚが４５５９、５７２９及び７２２３のフラグメントイオンは、ナイーブＨＳＡのトリプシンによる限定的なタンパク質分解後に存在する、請求項１に記載のｒｆＨＳＡ分子。

【請求項5】

非還元条件下でのトリプシンによる限定的なタンパク質分解後にペプチド断片を産生し、産生した断片は、配列番号２、３、４及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上のペプチド断片を欠いており、欠いている１つの前記ペプチド断片は、前記ナイーブＨＳＡ分子のトリプシンによる限定的なタンパク質分解後に存在する、請求項１に記載のｒｆＨＳＡ分子。

【請求項6】

非還元条件下でのトリプシンによる限定的なタンパク質分解後に、ペプチド断片を産生し、産生した断片は、配列番号２、３及び４のアミノ酸配列をそれぞれ含むペプチド断片を欠いており、欠いている前記ペプチド断片は、前記ナイーブＨＳＡ分子のトリプシンによる限定的なタンパク質分解後に存在する、請求項１に記載のｒｆＨＳＡ分子。

【請求項7】

対象のがんを治療するための医薬品の製造における請求項１から６のいずれか１項に記載のｒｆＨＳＡ分子の使用。

【請求項8】

前記がんは、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、食道がん、腎臓がん、肝臓がん、喉頭がん、肺がん、メラノーマがん、口腔がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がんからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項７に記載の使用。

【請求項9】

腫瘍細胞又は腫瘍サンプルにおけるインテグリンβ１又はセリン／スレオニンプロテインキナーゼＡｋｔ及び細胞外シグナル調節キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）に関連するがん細胞の存在を検出するための試薬の製造における、請求項１から６のいずれか１項に記載のｒｆＨＳＡ分子の使用。

【請求項10】

がん細胞を含むサンプルにおけるＡｋｔ及びＥＲＫ１／２のリン酸化を阻害するための試薬の製造における、請求項１から６のいずれか１項に記載のｒｆＨＳＡ分子の使用。

【請求項11】

腫瘍サンプルにおけるインテグリンβ１又はＡｋｔ及びＥＲＫ１／２に関連するがん細胞の存在を検出するための請求項１に記載のｒｆＨＳＡ分子を含む、キット。

【請求項12】

前記使用の前に、前記対象からの腫瘍サンプルにおけるＡｋｔ及びＥＲＫ１／２に関連するがん細胞の存在を検出するためのｒｆＨＳＡを含むキットの使用をさらに含む、請求項７に記載の使用。

【請求項13】

請求項１に記載のｒｆＨＳＡ分子で処理したがん細胞の細胞溶解物。

【請求項14】

前記がん細胞は、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、食道がん、腎臓がん、肝臓がん、喉頭がん、肺がん、メラノーマがん、口腔がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん細胞からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１３に記載の細胞溶解物。

【請求項15】

請求項１３に記載の細胞溶解物を含む、ワクチン組成物。

【請求項16】

アジュバントをさらに含む、請求項１５に記載のワクチン組成物。

【請求項17】

対象の腫瘍を治療し、又は対象の腫瘍の増殖を阻害するための医薬品の製造における請求項１５に記載のワクチン組成物の使用。

【請求項18】

請求項１に記載のｒｆＨＳＡ分子の製造方法であって、
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を洗浄剤含有緩衝液に溶解して洗浄剤処理ＨＳＡ溶液を得るステップ（ａ）と、
前記洗浄剤処理ＨＳＡ溶液を超音波処理して超音波処理した洗浄剤処理ＨＳＡ溶液を得るステップ（ｂ）と、
前記超音波処理した洗浄剤処理ＨＳＡ溶液を分子量が１０，０００から６００，０００ダルトン（Ｄａ）のサイズ排除クロマトグラフィーカラムにかけるステップ（ｃ）と、
前記洗浄剤を含む溶出剤で前記カラムを溶出するステップ（ｄ）と、
前記洗浄剤処理ＨＳＡを含むカラム溶出画分を収集するステップ（ｅ）と、
前記カラム溶出画分をプールしてプールされたカラム溶出液を得るステップ（ｆ）と、
分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が１２，０００－１４，０００Ｄａの透析膜を用いて前記プールされたカラム溶出液を、洗浄剤を含まない透析液に対して透析するステップ（ｇ）と、
透析膜溶出液を収集するステップ（ｈ）と、
前記透析膜溶出液を濃縮し、前記洗浄剤を含まない透析液に対して透析して濃縮透析膜溶出液を得るステップ（ｉ）と、
濃縮と透析ステップ（ｉ）を繰り返し、請求項１に記載のｒｆＨＳＡを含む最終濃縮透析膜溶出液を得るステップであって、前記最終濃縮透析膜溶出液が洗浄剤を含まないか又はほとんど含まないステップ（ｊ）と、
を含む、製造方法。

【請求項19】

溶出ステップ（ｄ）における前記溶出剤中の洗浄剤の濃度が、溶解ステップ（ａ）における前記緩衝液中の洗浄剤の濃度よりも低い、請求項１８に記載の製造方法。

【請求項20】

透析ステップ（ｇ）の実行は、
洗浄剤を含まない透析液を、洗浄剤を含まない新鮮な透析液で少なくとも２又は３回交換するステップ（ｇ'）をさらに含む、請求項１８に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗腫瘍活性を有するリフォールディングされたヒト血清アルブミンに関する。

【背景技術】

【0002】

米国特許第８３５７６５２及び９２２６９５１号には、Ａｋｔシグナル伝達経路を調節することによって多くの種類の癌細胞においてアポトーシスを引き起こすことができる繊維状ヒト血清アルブミンが開示されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。ナイーブヒト血清アルブミンから繊維状ヒト血清アルブミンが形成されることは実証できたが、これらの２つのアルブミンを分離して、各生産バッチにおける繊維状ヒト血清アルブミンの純度及び一貫性を検証することは、そこに開示された方法によって実行可能ではなかった。繊維状タンパク質はより抗原性があることが知られているため、繊維状ヒト血清アルブミンは一部の被験者にとってより抗原性が高く、臨床使用中に望ましくない副作用を引き起こす可能性がある。

【発明の概要】

【0003】

一態様において、本発明は、ナイーブヒト血清アルブミン（ナイーブＨＳＡ）の一次アミノ酸配列を含み、溶液中のｒｆＨＳＡ分子が楕円形であり、繊維状ではなく、前記ナイーブＨＳＡが球状であるリフォールディングされたヒト血清アルブミン（ｒｆＨＳＡ）分子に関する。

【0004】

別の態様において、本発明は、対象におけるがん又は腫瘍を治療するための医薬品の製造における本発明のｒｆＨＳＡ分子、医薬組成物、又はワクチン組成物の使用に関する。

【0005】

別の態様において、本発明は、腫瘍細胞又は腫瘍サンプルにおけるインテグリンβ１又はセリン／スレオニンプロテインキナーゼＡｋｔ及び細胞外シグナル調節キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）に関連するがん細胞の存在を検出するための試薬の製造における本発明のｒｆＨＳＡ分子の使用に関する。

【0006】

別の態様において、本発明は、がん細胞を含むサンプルにおけるＡｋｔ及びＥＲＫ１／２のリン酸化を阻害するための試薬の製造における本発明のｒｆＨＳＡ分子の使用に関する。

【0007】

別の態様において、本発明は、腫瘍サンプルにおけるインテグリンβ１又はＡｋｔ及びＥＲＫ１／２に関するがん細胞の存在を検出するための本発明のｒｆＨＳＡ分子を含むキットに関する。

【0008】

さらなる態様において、本発明は、本発明のｒｆＨＳＡ分子で処理したがん細胞の細胞溶解物に関する。

【0009】

さらなる態様において、本発明は、本発明の細胞溶解物を含むワクチン組成物に関する。

【0010】

さらなる態様において、本発明は、
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を洗浄剤含有緩衝液に溶解して洗浄剤処理ＨＳＡ溶液を得るステップ（ａ）と、
前記洗浄剤処理ＨＳＡ溶液を超音波処理して超音波処理した洗浄剤処理ＨＳＡ溶液を得るステップ（ｂ）と、
前記超音波処理した洗浄剤処理ＨＳＡ溶液を分子量が１０，０００から６００，０００ダルトン（Ｄａ）のサイズ排除クロマトグラフィーカラムにかけるステップ（ｃ）と、
前記洗浄剤を含む溶出剤で前記カラムを溶出するステップ（ｄ）と、
前記洗浄剤処理ＨＳＡを含むカラム溶出画分を収集するステップ（ｅ）と、
前記カラム溶出画分をプールしてプールされたカラム溶出液を得るステップ（ｆ）と、
分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が１２，０００－１４，０００Ｄａの透析膜を用いて前記プールされたカラム溶出液を、洗浄剤を含まない透析液に対して透析するステップ（ｇ）と、
透析膜溶出液を収集するステップ（ｈ）と、
前記透析膜溶出液を濃縮し、前記洗浄剤を含まない透析液に対して透析して濃縮透析膜溶出液を得るステップ（ｉ）と、
濃縮と透析ステップ（ｉ）を繰り返し、本発明のｒｆＨＳＡを含む最終濃縮透析膜溶出液を得るステップ（ｊ）と、
を含み、ステップ（ｊ）における前記最終濃縮透析膜溶出液が洗浄剤を含まないか又はほとんど含まない、本発明のｒｆＨＳＡ分子の製造方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１Ａ及び図１Ｂは、それぞれ生物学的小角Ｘ線散乱により分析された溶液における（Ａ）ｒｆＨＳＡ及び（Ｂ）ナイーブＨＳＡの構造を示すドッキングモデルである。図１Ａは、ＳＵＰＣＯＭＢによる１ｅ７８．ｐｄｂ結晶構造とｒｆＨＳＡエンベロープのモデルドッキングであり、ｒｆＨＳＡの形状が楕円形であることを示す。図１（Ｂ）は、ＳＵＰＣＯＭＢによる１ｅ７８．ｐｄｂ結晶構造とナイーブＨＳＡエンベロープのモデルドッキングであり、ナイーブＨＳＡの形状が球状であることを示す。

【0012】

【図2】図２Ａ及び図２Ｂは、それぞれ還元条件下でのタンパク質限定分解後に液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ）により分析された（Ａ）ナイーブＨＳＡ（球状ＨＳＡ又はｇＨＳＡ）及び（Ｂ）ｒｆＨＳＡの質量スペクトルである。

【0013】

【図3】図３Ａ及び図３Ｂは、それぞれ非還元条件下での限定的なタンパク質分解後にＬＣ－ＭＳ－ＭＳにより分析された（Ａ）ナイーブＨＳＡ及び（Ｂ）ｒｆＨＳＡの質量スペクトルである。

【0014】

【図4A】質量電荷比（ｍ／ｚ）４５５９の質量スペクトルフラグメントイオンに対応する４１個のアミノ酸ペプチド（ナイーブＨＳＡに存在するが、ｒｆＨＳＡに存在しない）の配列（配列番号２）を示す。

【0015】

【図4B】ナイーブＨＳＡ（配列番号１）並びに分子内ジスルフィド架橋Ｃｙｓ１２４－Ｃｙｓ１６８及びＣｙｓ１６９－Ｃｙｓ１７７の配列を示す。

【0016】

【図5A】ｍ／ｚ５７２９の質量スペクトルフラグメントイオンに対応する５３個のアミノ酸ポリペプチド（ナイーブＨＳＡに存在するが、ｒｆＨＳＡに存在しない）の配列（配列番号３）を示す。

【0017】

【図5B】ナイーブＨＳＡ（配列番号１）並びに分子内ジスルフィド架橋Ｃｙｓ６２－Ｃｙｓ３６１及びＣｙｓ７５－Ｃｙｓ５６７の配列を示す。

【0018】

【図6A】ｍ／ｚ７２２３の質量スペクトルフラグメントイオンに対応する６５個のアミノ酸ポリペプチド（ナイーブＨＳＡに存在するが、ｒｆＨＳＡに存在しない）の配列（配列番号４）を示す。

【0019】

【図6B】ナイーブＨＳＡ（配列番号１）並びに分子内ジスルフィド架橋Ｃｙｓ６２－Ｃｙｓ３６１及びＣｙｓ３６０－Ｃｙｓ４８７を示す。

【0020】

【図7】様々ながん細胞に対するｒｆＨＳＡの細胞毒性効果を示す。

【0021】

【図8】臨床的に関連する卵巣がん細胞型に対するｒｆＨＳＡの細胞毒性効果を示す。

【0022】

【図9A】卵巣がん細胞担持マウスに対する治療レジメンを示す模式図である。

【0023】

【図9B】対照群（左図）及びｒｆＨＳＡ治療群（右図）の腫瘍サイズを示す一連の蛍光画像である。Ｍｓ１、Ｍｓ２、Ｍｓ３は、それぞれマウス１、２及び３を示す。

【0024】

【図9C】卵巣がん細胞担持マウスの体重（左図）及び生物発光イメージング（ＢＬＩ）レベル（右図）を示す一対のグラフである。

【0025】

【図10】ヒト膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ－３、ＭＩＡ ＰａＣａ－２及びＰＡＮＣ－１に対するｒｆＨＳＡの細胞毒性効果を示すグラフである。

【0026】

【図11】ｒｆＨＳＡがＡｋｔ及びＥＲＫのリン酸化を阻害し、ｒｆＨＳＡの阻害効果がＢｘＰＣ－３における抗インテグリン抗体によって逆転されることを示すウエスタンブロットの画像である。

【0027】

【図12】ｒｆＨＳＡが正常細胞であるヒト初代末梢血単核細胞の生存率に影響を与えないことを示すグラフである。

【0028】

【図13】Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に対するｒｆＨＳＡの細胞毒性効果を示す棒グラフである。

【0029】

【図14A】マウスのワクチン接種レジメン及びメラノーマがん細胞チャレンジを示す模式図である。ｒｆＨＳＡ処理Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞の溶解物で前記マウスをワクチン接種した。

【0030】

【図14B】図１４Ａにおけるマウスの腫瘍サイズを示すグラフである。

【0031】

【図14C】図１４Ａにおけるマウスの生存率を示すグラフである。

【0032】

【図14D】図１４Ａにおける無腫瘍マウスの割合を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0033】

定義

【0034】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含む本文書が優先する。

【0035】

「球状」という用語は、球又はボールの形をしている球形を意味する。

【0036】

「楕円形」という用語は、卵の一般的な形態、形又は輪郭（卵形）を持つことを意味する。

【0037】

「繊維状」という用語は、フィブリルに関することを意味する。フィブリルは、小さい又は細い繊維又はフィラメント、又は糸状の構造若しくはフィラメントである。フィラメントは、非常に細い糸又は糸状の構造である。

【0038】

「ポリペプチド又はペプチド断片」という用語は、アミノ末端又はカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が推定される天然配列（例えば、完全長ｃＤＮＡ配列から）の対応する位置と同一であるポリペプチド又はペプチドを指す。断片は、典型的には、少なくとも５、６、８又は１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１４アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、通常は少なくとも５０アミノ酸長、さらにより好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。

【0039】

ｒｆＨＳＡは、追加の活性剤及び薬学的に許容される担体、ビヒクル、賦形剤、又は補助剤と共に医薬組成物に含めることができる。

【0040】

「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与に適合する、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。補助的な活性化合物も組成物に組み込むことができる。

【0041】

医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、腹腔内、動脈内、筋肉内、病巣内、及び直腸投与が含まれる。

【0042】

本明細書で使用される「対象」は、ヒト及びヒト以外の動物を指す。

【0043】

本明細書で使用される用語「ナイーブヒト血清アルブミン」と「球状ヒト血清アルブミン」は、交換可能である。

【0044】

アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフは、細胞接着モチーフである。それはもともと、細胞接着を媒介するフィブロネクチン内の配列として同定された。インテグリンとして知られる膜タンパク質のファミリーは、ＲＧＤモチーフを介してこれらの細胞接着分子の受容体として機能する。

【0045】

「Ａｋｔ」という用語は、「セリン／スレオニンプロテインキナーゼＡｋｔ（プロテインキナーゼＢ）」を指す。Ａｋｔシグナル伝達経路又はＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達経路は、細胞外シグナルに応答して生存と成長を促進するシグナル伝達経路である。関連する重要なタンパク質は、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ）及びＡｋｔ（プロテインキナーゼＢ）である。

【0046】

本発明のｒｆＨＳＡ分子を含む組成物は、身体からの急速な排出に対して有効成分を保護する担体を用いて調製することができる（例えば、インプラントやマイクロカプセル化された送達システムを含む制御放出製剤）。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかである。これらの材料は、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（細胞特異的抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞を標的とするリポソームを含む）も、薬学的に許容される担体として使用することができる。

【0047】

投与を容易にし、投与量を均一にするために、経口又は非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが有利である。本明細書で使用される投与単位形態は、治療される対象の単位投与量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な薬学的担体と所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活性化合物を含む。

【0048】

このような化合物の毒性（例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％の致死量））と治療効果（例えば、ＥＤ_５０（集団の５０％の治療有効量））は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を使用することができるが、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、副作用を軽減するために、このような化合物を患部組織の部位を標的とする送達システムを設計するように注意する必要がある。

【0049】

細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトへの使用に適切な投与量範囲を策定するために使用することができる。このような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんど又は全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される投与形態及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化することができる。本開示の方法で使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。投与量は、細胞培養で決定されるＩＣ５０（即ち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて確定することができる。このような情報は、ヒトに対する有用な投与量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。

【0050】

「治療」又は「処置」という用語は、疾患を治癒、軽減、緩和、解決又は改善する目的で、それを必要とする対象に有効量の治療薬を投与することを指す。このような対象は、任意の適切な診断方法からの結果に基づいて、ヘルスケアの専門家によって特定することができる。

【0051】

「有効量」は、処置される対象に治療的効果を与えるために必要とされる活性薬剤の量を指す。当業者によって認識されるように、投与の経路、添加剤の使用、及び他の治療との併用の可能性に応じて、有効な投与量は変化するだろう。

【0052】

「化学療法剤」という用語は、がんの治療に有用であることが知られている薬理学的薬剤を指す。

【0053】

米国保健福祉省食品医薬品局によって出版されている「成人の健康なボランティアの治療学についての臨床試験における安全開始用量を推定する、産業界、及び審査官のためのガイダンス（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｅｒｓ Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ）」は、「治療有効量」が以下の式からの計算によって得ることができることを開示している。

【0054】

ＨＥＤ＝動物用量（ｍｇ／ｋｇ）×（動物体重（ｋｇ）／ヒト体重（ｋｇ））^０．３３

【0055】

以下に示される研究で使用されるマウスの体重は、１６～２２ｇの範囲である。

【0056】

略語
ナイーブヒト血清アルブミン：ナイーブＨＳＡ
球状ヒト血清アルブミン：ｇＨＳＡ
リフォールディングされたヒト血清アルブミン：ｒｆＨＳＡ
アルギニン－グリシン－アスパラギン酸：ＲＧＤ
液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析：ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ
質量電荷比：ｍ／ｚ
生物発光イメージング：ＢＬＩ
室温：ＲＴ

【0057】

配列表：ナイーブヒト血清アルブミン（配列番号１）
ＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡ ＣＬＬＰＫ（配列番号２；４１ａａ）
ＫＧＥＥＡＦＣＴＥＫＬＴＡＶＴＣＬＫＤＧＦＬＴＨＬＳＫＤＣＮＥＡＳＥＤＡＶＣＴＫＡＹＣＥＨＰＤＡＡＡＣＣＫ（配列番号３；５３ａａ）
ＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫ（配列番号４；６５ａａ）

【0058】

本発明は、抗がん性リフォールディングされたヒト血清アルブミン（ｒｆＨＳＡ）、その使用方法及び使用方法を提供する。ｒｆＨＳＡは、ナイーブＨＳＡと同じ一次配列を含む単量体である。ｒｆＨＳＡの調製に使用される方法には、純度検証の容易さ、生産の一貫性、スケールアップの実現可能性などの利点がある。

【0059】

生物学小角Ｘ線散乱は、ｒｆＨＳＡがナイーブＨＳＡの球状ではなく、楕円形であることを示している（図１）。限定的なタンパク質分解とそれに続く液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ）分析によって証明されるように、ｒｆＨＳＡはナイーブＨＳＡの１７個の分子内ジスルフィド結合のうち少なくとも３個がｒｆＨＳＡで破壊されているという点で、ナイーブＨＳＡと区別できる。非還元条件下でのトリプシンによる限定的なタンパク質分解後のｒｆＨＳＡのＬＣ－ＭＳ－ＭＳ分析は、いくつかの主要なフラグメントイオン、特にｍ／ｚ４５５９、５７２９及び７２２３のフラグメントイオンが存在しないことを示している（図２－３）。

【0060】

ｍ／ｚ４５５９のフラグメントイオンに対応するＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣ（＄１）ＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＡＡＦＴＥＣ（＄１）Ｃ（＄２）ＱＡＡＤＫＡＡＣ（＄２）ＬＬＰＫ（配列番号２）の配列を有する４１個のアミノ酸（ａａ）ペプチドは、ナイーブＨＳＡに存在するが、ｒｆＨＳＡに存在しない。この４１ａａペプチドは、システイン１２４をシステイン１６８に、システイン１６９をＨＳＡのシステイン１７７に結合させることによって形成される（図４）。

【0061】

ｍ／ｚ５７２９のフラグメントイオンに対応するＫＧＥＥＡＦＣ（＄１）ＴＥＫＬＴＡＶＴＣ（＄１）ＬＫＤＧＦＬＴＨＬＳＫＤＣ（＄２）ＮＥＡＳＥＤＡＶＣＴＫＡＹＣＥＨＰＤＡＡＡＣ（＄２）ＣＫ（配列番号３）の配列を有する５３個のアミノ酸ポリペプチドは、ナイーブＨＳＡに存在するが、ｒｆＨＳＡに存在しない。この５３ａａペプチドは、システイン５６７をシステイン７５に、システイン６２をシステイン３６１に結合させることによって形成される（図５）。

【0062】

ＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣ（＄１）ＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣ（＄１）Ｃ（＄２）ＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣ（＄２）ＤＫ（配列番号４）の配列を有するｍ／ｚ７２２３のフラグメントイオンに対応する６５個のアミノ酸ポリペプチドは、ナイーブＨＳＡに存在するが、ｒｆＨＳＡに存在しない。この６５ａａは、システイン４８７をシステイン３６０に、システイン３６１をシステイン６２に結合させることによって形成される（図６）。

【0063】

ナイーブＨＳＡは、繊維状ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を作成するプロセス中にＳＤＳが徹底的に（できれば＜０．１８ｍｇのＳＤＳ／ｍｇのｒｆＨＳＡのレベルまで）除去された後、予想外にｒｆＨＳＡに変換された。繊維状ＨＳＡの製造方法は、米国特許第５，１１１，１１２号に開示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0064】

本発明の一実施形態において、ｒｆＨＳＡは、ナイーブＨＳＡを１％ＳＤＳ溶液に溶解させ、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）－２００ゲル濾過カラムに通過させ、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＮａＣｌ及び０．０５％ＳＤＳを含む透析液で溶出することによって調製された。透析液で透析した後、透析チューブ内の溶出液を収集し、濃縮し、再度透析液に対して透析した。同じ手順を数回繰り返して、ＳＤＳをできるだけ徹底的に除去した。繊維状ＨＳＡとは異なり、ｒｆＨＳＡは繊維形態を形成しないことが分かった。

【0065】

ｒｆＨＳＡは、様々ながん細胞に対して細胞毒性効果を有し、その効力が繊維状ＨＳＡとほぼ同じである。繊維状ＨＳＡの代わりにｒｆＨＳＡを抗がん剤として使用する利点は、ｒｆＨＳＡが繊維状タンパク質ではないことである。繊維状ＨＳＡは一部の対象にとってより抗原性が高く、臨床使用中に望ましくない副作用を引き起こす可能性がある。さらに、ｒｆＨＳＡの純度と一貫性は、繊維状ＨＳＡよりも検証可能である。

【0066】

一実施形態において、ｒｆＨＳＡは、腎臓がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、肝臓がん、メラノーマ、又は卵巣がんを治療するために使用される（図７）。

【0067】

臨床的に関連する卵巣がん細胞（ＴＯＶ２１Ｇ、ＫＵＲＡＭＯＣＨＩ、ＯＶＳＡＨＯ）、膵臓がん細胞（ＢｘＰＣ３、ＭＩＡ－ｐａｃａ２及びＰａｎｃ１）及びメラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）がん細胞に対するｒｆＨＳＡの細胞毒性効果及びＩＣ_５０は、それぞれ図８、１０及び１３に示される。図９は、卵巣がんを有するマウスに対するｒｆＨＳＡのインビボ抗癌効果を示す。

【0068】

ｒｆＨＳＡは、膵臓がん細胞（ＢｘＰＣ３）においてインテグリン依存的にＡｋｔ及びＥＲＫのリン酸化を阻害する（図１１）。ｒｆＨＳＡは細胞表面のインテグリンなどの受容体に結合するが、球状血清アルブミンは結合できないため、血清アルブミンの構造を球状からリフォールディング状態に変化させることで、タンパク質が正常細胞よりも多くのインテグリンα５β１を発現する癌細胞を選択的に標的にすることが可能になったと考えられている。

【0069】

正常細胞（ヒト末梢血単核細胞）をｒｆＨＳＡ（０～１．６μＭ）で２４～７２時間処理した。正常細胞の生存率に対する影響はほとんど検出されなかった（図１２）。

【0070】

ｒｆＨＳＡで処理したがん細胞の溶解物は、がん患者のワクチンとして使用することができる。前記がん細胞は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマであり得る。

【0071】

ｒｆＨＳＡタンパク質、変異体、誘導体、オルソログ、又はがんを治療するためのヒト血清アルブミンと実質的に同一性を有する他のタンパク質は、疾患の重症度及びがん細胞に対する所望の細胞毒性に応じて選択することができる。

【0072】

がん細胞に対する細胞毒性を高めるために、ＲＧＤモチーフ又はそれ以上の分子量を持つタンパク質が選択される。ＲＧＤモチーフはインテグリンのリガンドである。リフォールディングされたタンパク質は、インテグリン／Ａｋｔシグナル伝達経路の調節を介して細胞死を誘導することが示されている。ｒＶＰ１－Ｓ２００やＦＮ－Ｓ２００などのＲＧＤモチーフを持つリフォールディングされたタンパク質は、ウシ血清アルブミンなどのＲＧＤモチーフを持たないタンパク質よりも細胞毒性が高いことが分かっている。

【0073】

一態様において、本発明は、ナイーブヒト血清アルブミン（ナイーブＨＳＡ）の一次アミノ酸配列を含むリフォールディングされたヒト血清アルブミン（ｒｆＨＳＡ）を提供し、溶液中の前記ｒｆＨＳＡは繊維状ではなく楕円形であり、前記ナイーブはＨＳＡ球状である。

【0074】

一実施形態において、本発明のｒｆＨＳＡは、（ｉ）Ｃ１２４－Ｃ１６８及びＣ１６９－Ｃ１７７、（ｉｉ）Ｃ５６７－Ｃ７５及びＣ６２－Ｃ３６１、（ｉｉｉ）Ｃ４８７－Ｃ３６０及びＣ３６１－Ｃ６２、並びに（ｉｖ）それらの任意の組み合わせからなる群より選択される２つ以上の分子内ジスルフィド架橋を欠いている。

【0075】

別の実施形態において、本発明のｒｆＨＳＡは、分子内ジスルフィド架橋Ｃ１２４－Ｃ１６８、Ｃ１６９－Ｃ１７７、Ｃ５６７－Ｃ７５、Ｃ６２－Ｃ３６１及びＣ４８７－Ｃ３６０を欠いている。

【0076】

別の実施形態において、本発明のｒｆＨＳＡは、非還元条件下でのトリプシンによる限定的なタンパク質分解（ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｒｙｐｓｉｎ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）後に、ナイーブＨＡＳに存在する質量電荷比（ｍ／ｚ）４５５９、５７２９及び７２２３の質量スペクトルフラグメントイオンを欠いている。

【0077】

別の実施形態において、本発明のｒｆＨＳＡは、非還元条件下でのトリプシンによる限定的なタンパク質分解後に、質量電荷比（ｍ／ｚ）４５５９、５７２９及び７２２３の質量スペクトルフラグメントイオンを欠いている。前記ｍ／ｚ４５５９、５７２９及び７２２３のフラグメントイオンは、ナイーブＨＡＳのトリプシンによる限定的なタンパク質分解後に存在する。

【0078】

別の実施形態において、本発明のｒｆＨＳＡは、非還元条件下でのトリプシンによる限定的なタンパク質分解後にペプチド断片を産生する。産生された断片は、配列番号２、３、４及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１つ以上のペプチド断片を欠いている。欠いている１つ以上のペプチド断片は、ナイーブＨＳＡのトリプシンによる限定的なタンパク質分解後に存在する。

【0079】

別の実施形態において、本発明のｒｆＨＳＡは、非還元条件下でのトリプシンによる限定的なタンパク質分解後にペプチド断片を産生する。産生された断片は、配列番号２、３及び４のアミノ酸配列を含むペプチド断片を欠いている。欠いている配列番号２、３及び４のアミノ酸配列を含むペプチド断片は、ナイーブＨＳＡのトリプシンによる限定的なタンパク質分解後に存在する。

【0080】

本発明は、本発明のｒｆＨＳＡ、及び薬学的に許容される担体、賦形剤又はビヒクルを含む医薬組成物も提供する。

【0081】

本発明は、本発明のｒｆＨＳＡで処理されたがん細胞の細胞溶解物をさらに提供する。

【0082】

本発明は、ｒｆＨＳＡ処理がん細胞の溶解物を含むワクチン組成物をさらに提供する。前記ワクチン組成物は、アジュバントをさらに含んでもよい。

【0083】

前記がん細胞は、がん由来細胞株であってもよい。一実施形態において、前記がん由来細胞株は、前記対象のがんと同じがん又は前記対象のがんと同じタイプに由来する。

【0084】

本発明は、対象のがん又は腫瘍を治療するための医薬品の製造における本発明のｒｆＨＳＡ、医薬組成物又はワクチン組成物の使用をさらに提供する。

【0085】

一実施形態において、前記がん細胞は、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、食道がん、腎臓がん、肝臓がん、喉頭がん、肺がん、メラノーマがん、口腔がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん細胞からなる群より選択される少なくとも１つである。

【0086】

本発明は、腫瘍細胞又は腫瘍サンプルにおけるインテグリンβ１又はセリン／スレオニンプロテインキナーゼＡｋｔ及び細胞外シグナル調節キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）に関連するがん細胞の存在を検出するか、或いはがん細胞を含むサンプルにおけるＡｋｔ及びＥＲＫ１／２のリン酸化を阻害するための試薬の製造における本発明のｒｆＨＳＡの使用をさらに提供する。

【0087】

本発明は、腫瘍サンプルにおけるインテグリンβ１又はＡｋｔ及びＥＲＫ１／２に関連するがん細胞の存在を検出するための、本発明のｒｆＨＳＡを含むキットをさらに提供する。

【0088】

別の実施形態において、対象のがん又は腫瘍を治療するための医薬品の製造に本発明のｒｆＨＳＡを使用する前に、前記使用は、前記対象からの腫瘍サンプルにおけるＡｋｔ及びＥＲＫ１／２に関連するがん細胞の存在を検出するための本発明のｒｆＨＳＡｆを含むキットの使用をさらに含んでもよい。

【0089】

本発明のｒｆＨＳＡの製造方法は、上記のステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）を含む。

【0090】

一実施形態において、溶出ステップ（ｄ）における溶出剤中の洗浄剤の濃度は、溶解ステップ（ａ）における緩衝液中の洗浄剤の濃度よりも低い。

【0091】

別の実施形態において、透析ステップ（ｇ）は、洗浄剤を含まない新鮮な透析液で洗浄剤を含まない透析液を２回又は３回交換するステップ（ｇ'）をさらに含んでもよい。

【0092】

別の実施形態において、前記洗浄剤は、ＳＤＳであってもよい。

【0093】

別の実施形態において、前記サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、分子量７０ｋＤａ以上のタンパク質を分離するためのポアサイズを有する。

【0094】

別の実施形態において、前記洗浄剤を含まない透析液は、リン酸緩衝生理食塩水である。

【0095】

本発明の方法によれば、本発明の方法における繰り返しステップは洗浄剤を徹底的に除去し、最終濃縮透析膜溶出液は検出可能な繊維形態のヒト血清アルブミンを含まない。

【0096】

本発明は、対象のがん又は腫瘍の治療方法をさらに提供する。前記方法は、前記対象に治療有効量の本発明のｒｆＨＳＡ、前記医薬組成物又は前記ワクチン組成物を投与することを含む。

【0097】

前記対象に前記ワクチン組成物を投与する前に、前記治療方法は、本発明のｒｆＨＳＡを用いて前記対象と同じがん又は組織タイプに由来するがん細胞株を治療するステップをさらに含んでもよい。

【0098】

実施例

【0099】

材料と方法

【0100】

ｒｆＨＳＡの調製
２０ｍｇの臨床グレードのヒト血清アルブミンを１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）を含む１０ｍｌのＰＢＳに溶解した。溶液を５分間超音波処理し、その後、溶出液（２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＮａＣｌ及び０．０５％ＳＤＳ）で事前に平衡化したＳＵＰＥＲＤＥＸ^ＴＭ－２００に添加した。カラムを１ｍｌ／分の速度で溶出し、ヒト血清アルブミンを含む画分Ｃ３からＣ７をプールした。次にプールされた画分をＣＥＬＬＵ－ＳＥＰ（登録商標）Ｔ４／名目（ＭＷＣＯ：１２，０００～１４，０００Ｄａ）透析膜を用いてＰＢＳで透析した。新しいＰＢＳ緩衝液を室温（ＲＴ）で２時間ごとに３回交換した。透析液で透析した後、透析チューブ内の溶出液を収集し、濃縮し、再度透析液で透析した。同じ手順を数回繰り返して、ＳＤＳをできるだけ徹底的に除去し、本発明のｒｆＨＳＡを得た。繊維状ヒト血清アルブミンとは異なり、ｒｆＨＳＡは繊維形態を形成しないことが分かった。

【0101】

液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）
ナイーブＨＳＡ及びｒｆＨＳＡタンパク質は、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ^ＴＭ、マサチューセッツ州）を用いて高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により分析及び検証された。簡単に言えば、タンパク質をトリプシンで限定的にタンパク質分解し、或いは還元剤であるトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ；２０ｍＭ）で処理した後、遊離スルフヒドリル基を過剰のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）でアルキル化し、トリプシンで限定的にタンパク質分解した。得られたペプチドを高速液体クロマトグラフィーで分離し、溶出したペプチドをナノスプレーイオン化によりイオン化し、オンライン結合ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分析計により分析し、上位５つの衝突誘起解離（ＣＩＤ）法により６０，０００解像度でサーベイスキャンを行い、イオントラップにおいて通常のスキャン速度でフラグメントイオンを検出した。

【0102】

細胞生存は、ＭＴＴ比色アッセイによって決定された。指数関数的に増殖する細胞を、１０％ＦＢＳを含む培地で９６ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした。無血清培地中、３７℃で、一連の濃度のタンパク質を用いて細胞を１６時間処理した。処理した後、ＭＴＴ溶液を各ウェル（０．５ｍｇ／ｍｌ）に加え、その後、４時間インキュベートした。生細胞の数はホルマザンの産生に正比例し、イソプロパノールで溶解した後、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて５７０ ｎｍの分光測光法により測定することができる。

【0103】

ウエスタンブロッティングで調べたＡｋｔ及びＥＲＫのリン酸化に対するｒｆＨＳＡの影響
細胞を異なる濃度のｒｆＨＳＡの有無にかかわらず処理した。がんサンプルの細胞抽出物（４０～６０μｇ）を、示されるように２つのＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルにロードした。ゲル電気泳動後、ゲル上のタンパク質を２枚のＰＶＤＦ膜に転写した。２枚の膜上のタンパク質を分子量に従って切断し、チョップドブロット（ｃｈｏｐｐｅｄ ｂｌｏｔ）を作成した。染色に使用される抗体を示すために各チョップドブロットを標識した。５％脱脂乳を用いてチョップドブロットをＲＴで１時間ブロックし、１ｘトリス緩衝生理食塩水とＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ＴＢＳＴ）で十分に洗浄し、それぞれの一次抗体を用いて４℃で一晩処理した。チョップドブロットを１×ＴＢＳＴで十分に洗浄し、ペルオキシダーゼ標識二次抗体で室温で１時間処理し、次いで１×ＴＢＳＴで十分に洗浄した。化学発光（ＥＣＬ）を増強するために前記ブロットをペルオキシダーゼ基質で処理した。その後、ＢＩＯＭＡＸ（登録商標）ＭＬフィルム上でＫＯＤＡＫ（登録商標）医療用Ｘ線プロセッサーを使用してブロットを検出し、スキャンしてコンピューターでまとめて完成グラフを作成した。

【0104】

Ｂ１６Ｆ１０ワクチン接種実験
ｒｆＨＳＡ誘導免疫原性細胞死（ＩＣＤ）全細胞溶解物（ＴＣＬ）については、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を１．５μＭのｒｆＨＳＡで２４時間処理してＩＣＤを誘導した。かき取り、遠心分離、ＰＢＳで２回洗浄した後、１ｍＬあたり１×１０^７のＢ１６Ｆ１０をＰＢＳに懸濁し、凍結融解を４回繰り返した。遠心分離後、上清を収集し、ワクチン接種のために保存した。ワクチン接種のために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６Ｆ１０細胞からの１００μｌのｒｆＨＳＡ誘導ＩＣＤ ＴＣＬを左側腹部に皮下注射した（プライム群（ｐｒｉｍｅ ｇｒｏｕｐ）として２週間に１回、ブースト群（ｂｏｏｓｔ ｇｒｏｕｐ）として週に１回で２週間）。最後のワクチン接種の１週間後、右側腹部に１×１０^４個の同じ生Ｂ１６Ｆ１０細胞を皮下注射した。腫瘍形成をモニターした。腫瘍体積を所定の日に直ちに記録し、算式：体積＝（長さ×幅^２×π）／６に従って計算した。生がん細胞を注射した後の３２日目に安楽死させた。生存率と無腫瘍マウスの数を記録した。安楽死後の所定の日に腫瘍重量を直ちに記録した。

【0105】

結果

【0106】

生物学的小角Ｘ線散乱に示されるように、ｒｆＨＳＡは楕円形を示し、ナイーブＨＳＡは溶液中で球状を示す。

【0107】

小角Ｘ線散乱を用いてｒｆＨＳＡ及びナイーブＨＡＳの構造を分析した。図１Ａ及び図１Ｂは、ＳＵＰＣＯＭＢプログラム（Ｍ．Ｋｏｚｉｎ＆Ｄ．Ｓｖｅｒｇｕｎ"Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ｈｉｇｈ－ａｎｄｌｏｗ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｅｌｓ"Ｊ Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔ．２００１，３４：３３－４１）を用いた１ｅ７８．ｐｄｂ結晶構造、ｒｆＨＳＡエンベロープ及びナイーブＨＳＡエンベロープモデルドッキングを示す。結果は、ｒｆＨＳＡの形状がナイーブＨＳＡの形状と異なることを示している。ｒｆＨＳＡの形状は、ナイーブＨＳＡのような球状ではなく、楕円形である。

【0108】

非還元条件下での限定的なタンパク質分解後の液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析によりｒｆＨＳＡはナイーブＨＳＡと異なることを示している。

【0109】

上記のように製造されたタンパク質は、ｒｆＨＳＡとナイーブＨＳＡの混合物ではなく、主にｒｆＨＳＡである。

【0110】

トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ；２０ｍＭ）を用いてジスルフィド架橋を還元した後、ヨードアセトアミドで遊離スルフヒドリル基をアルキル化する還元条件下で、トリプシンによる限定的なタンパク質分解（５０μｇ／ｍｌで１分間）後のｒｆＨＳＡ質量スペクトルは、ナイーブＨＳＡのものと同様であることが見出された（図２Ａ～Ｂ）。

【0111】

非還元条件下で、トリプシンによる限定的タンパク質分解後のｒｆＨＳＡ質量スペクトルは、ナイーブＨＳＡのものとは異なり、特にｍ／ｚ４５５９、５７２９及び７２２３の３つの主要なフラグメントイオンを欠いていた（図３Ａ－Ｂ）。ｒｆＨＳＡにおけるこの３つの主要なフラグメントイオンの欠如は、ｒｆＨＳＡがナイーブＨＳＡと区別可能であり、本発明のｒｆＨＳＡの調製バッチにナイーブＨＳＡがほとんど又は完全にないことを示している。ナイーブＨＳＡの本来の構造は、主に１７個の分子内ジスルフィド架橋によって保持される。還元条件下で、トリプシンによる限定的なタンパク質分解後のｒｆＨＳＡ質量スペクトルは、ナイーブＨＡＳと同様に、ｍ／ｚ３０３０の親イオン及びいくつかのフラグメントイオン、特にｍ／ｚ２７０６、２２５９、２０４４及び１１４８のフラグメントイオンを示している。非還元条件で現れるナイーブＨＳＡの３つの主要なフラグメントイオンｍ／ｚ４５５９、５７２９及び７２２３は、質量電荷比が３０３０よりも高く、ジスルフィド結合を有するペプチドフラグメントイオンである可能性が最も高い。

【0112】

ｒｆＨＳＡには、システイン１２４をシステイン１６８に、システイン１６９をシステイン１７７に結合させるジスルフィド架橋がない。

【0113】

ナイーブＨＳＡのトリプシン消化物を分離し、分取液体クロマトグラフィーで分画した。質量分析シーケンシングによりｍ／ｚ４５５９のフラグメントイオンに対応するペプチド配列を確認した。結果として、ｍ／ｚ４５５９のフラグメントイオンは、ＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣ（＄１）ＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＡＡＦＴＥＣ（＄１）Ｃ（＄２）ＱＡＡＤＫＡＡＣ（＄２）ＬＬＰＫ（配列番号２）のアミノ酸配列を有する４１アミノ酸ペプチドであることを示している。ナイーブＨＳＡのアミノ酸配列の検索により、このペプチドは、システイン１２４をシステイン１６８に、システイン１６９をシステイン１７７に結合させるジスルフィド架橋によって形成されることが明らかになった（図４Ａ及び図４Ｂ）。ｍ／ｚ４５５９のフラグメントイオンがナイーブＨＳＡに存在し、ｒｆＨＳＡに存在しないため、この結果は、ｒｆＨＳＡには、システイン１２４をシステイン１６８に、システイン１６９をシステイン１７７に結合させるジスルフィド架橋がないことを示している。

【0114】

ｒｆＨＳＡには、システイン５６７をシステイン７５に、システイン６２をシステイン３６１に結合させるジスルフィド架橋がない。

【0115】

ナイーブＨＳＡのトリプシン消化物を分離し、分取液体クロマトグラフィーで分画した。タンデム質量分析シーケンシングによりｍ／ｚ５７２９のフラグメントイオンに対応するペプチド配列を確認した。結果として、ｍ／ｚ５７２９のフラグメントイオンは、ＫＧＥＥＡＦＣ（＄１）ＴＥＫＬＴＡＶＴＣ（＄１）ＬＫＤＧＦＬＴＨＬＳＫＤＣ（＄２）ＮＥＡＳＥＤＡＶＣＴＫＡＹＣＥＨＰＤＡＡＡＣ（＄２）ＣＫ（配列番号３）の配列を有する５３アミノ酸ポリペプチドであることを示している。。ナイーブＨＳＡのアミノ酸配列の検索により、このポリペプチドは、ＨＳＡ配列のシステイン５６７をシステイン７５に、システイン６２をシステイン３６１に結合させるジスルフィド架橋によって形成されることが明らかになった（図５Ａ及び図５Ｂ）。ｍ／ｚ５７２９のフラグメントイオンがナイーブＨＳＡに存在し、ｒｆＨＳＡでは隠されているため、この結果は、ｒｆＨＳＡの大部分が、システイン５６７をシステイン７５に、システイン６２をシステイン３６１に結合させるジスルフィド架橋を有しないことを示している。

【0116】

ｒｆＨＳＡには、システイン４８７をシステイン３６０に、システイン３６１をシステイン６２に結合させるジスルフィド架橋がない。

【0117】

ナイーブＨＳＡのトリプシン消化物を分離し、分取液体クロマトグラフィーで分画した。タンデム質量分析シーケンシングによりｍ／ｚ７２２３のフラグメントイオンに対応するペプチド配列を確認した。結果として、ＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣ（＄１）ＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣ（＄１）Ｃ（＄２）ＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣ（＄２）ＤＫ（配列番号４）の配列を有するｍ／ｚ７２２３のフラグメントイオンは、６５アミノ酸ポリペプチドであることを示している。ナイーブＨＳＡのアミノ酸配列の検索により、このペプチドは、システイン４８７をシステイン３６０に、システイン３６１をシステイン６２に結合させるジスルフィド架橋によって形成されることが明らかになった（図６Ａ及び図６Ｂ）。ｍ／ｚ７２２３のフラグメントイオンがナイーブＨＳＡに存在し、ｒｆＨＳＡに存在しないため、この結果は、ｒｆＨＳＡにはシステイン４８７をシステイン３６０に、システイン３６１をシステイン６２に結合させるジスルフィド架橋がないことを示している。

【0118】

ｒｆＨＳＡは、様々ながん細胞に対して細胞毒性を有する。

【0119】

それぞれの細胞型を、無血清培養培地中で様々な濃度のｒｆＨＳＡで１６時間処理した。細胞生存率を、ＭＴＴ細胞増殖アッセイにより調べられ、各がん細胞株の生存率に対するｒｆＨＳＡのＩＣ５０を決定した。図７は、様々な癌細胞に対するｒｆＨＳＡの半数阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。

【0120】

ｒｆＨＳＡは、臨床的に関連する卵巣がん細胞株に対して細胞毒性効果を有する。

【0121】

卵巣腺がん細胞株ＴＯＶ－２１Ｇ、ＯＶＳＡＨＯ及び卵巣がんＫＵＲＡＭＯＣＨＩ細胞株に対するｒｆＨＳＡの細胞毒性を調査した（図８の上図）。細胞をｒｆＨＳＡで処理し、細胞生存率をＭＴＴ細胞増殖アッセイによって調べた。ｒｆＨＳＡの濃度に対する細胞の生存率をプロットした（図８の下図）。

【0122】

ｒｆＨＳＡは、インビボで卵巣がんの増殖を阻害する。

【0123】

図９は、ｒｆＨＳＡが腹腔内（Ｉ．Ｐ．）卵巣マウスモデルにおいて腫瘍細胞増殖を阻害するのに有効であったことを示す。緑色蛍光タンパク質とホタルルシフェラーゼ（ＳＫＯＶ３－ＧＬ）で事前に標識された卵巣がんＳＫＯＶ３細胞をヌードマウスに腹腔内投与し、次いで、対照ビヒクル又はｒｆＨＳＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）を、示されるように週に１回注射した（図９Ａ）。生物発光イメージング（ＢＬＩ）及び体重の測定により、ｒｆＨＳＡがマウスの体重に影響を与えることなく腫瘍細胞の増殖を顕著に減少させることが明らかになった（図９Ｂ及び図９Ｃ）。

【0124】

ｒｆＨＳＡは、膵臓がん細胞株に対して細胞毒性効果を有する。

【0125】

図１０は、ｒｆＨＳＡが膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ３、ＭＩＡ－ｐａｃａ２及びＰａｎｃ１をそれぞれインビトロで阻害したことを示す。細胞をｒｆＨＳＡで処理し、細胞生存率を上記のようにＭＴＴ細胞増殖アッセイで調べた。ｒｆＨＳＡの濃度に対する細胞生存率をプロットした。

【0126】

ｒｆＨＳＡは、膵臓がん細胞におけるＡｋｔ及びＥＲＫ１／２のリン酸化をインテグリンβ１依存的に阻害する。

【0127】

図１１は、抗インテグリンβ１抗体が、Ａｋｔ及びＥＲＫ１／２のリン酸化に対するｒｆＨＳＡの阻害効果を逆転させたことを示す。ＢｘＰＣ３細胞を対照ＩｇＧ又は抗インテグリンβ１抗体（２μｇ／ｍｌ）で３０分間前処理し、次いでＩＬ１７Ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はｒｆＨＳＡ（０．２μＭ）で０．１％ＦＢＳ培地中で２４時間処理した。リン酸化Ａｋｔ、総Ａｋｔ、リン酸化ＥＲＫ１／２、及び総ＥＲＫ１／２の発現レベルを、ウェスタンブロットにより決定した。β－アクチンをローディング対照として使用した。ブロットは、３つの独立した実験の代表である。

【0128】

ｒｆＨＳＡは、正常細胞に対して細胞毒性を有しない。

【0129】

図１２は、ｒｆＨＳＡがヒト初代末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において細胞死を誘導しなかったことを示す。示されるように、ヒトＰＢＭＣを一連の濃度のｒｆＨＳＡで２４、４８及び７２時間処理した。細胞生存率をＭＴＴ細胞増殖アッセイによって調べ、ｒｆＨＳＡの濃度に対する細胞生存率をプロットした。

【0130】

ｒｆＨＳＡは、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマがん細胞に対して細胞毒性効果を誘導する。

【0131】

Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を、異なる量のｒｆＨＳＡで２４時間処理した。細胞を回収し、トリパンブルー染色により生細胞のパーセンテージを計数することにより細胞生存率を測定した。図１３は、ｒｆＨＳＡが細胞生存率を用量依存的に阻害したことを示す。

【0132】

ｒｆＨＳＡ処理Ｂ１６Ｆ１０細胞溶解物でのワクチン接種は、インビボで抗腫瘍免疫応答と腫瘍クリアランスを誘導する。

【0133】

がん細胞をｒｆＨＳＡで２４時間処理し、細胞質溶解物をマウスに接種し、１週間後に再度ブーストした。次に、このマウスに生Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（１ｘ１０^４細胞／マウス）を注射した。図１４Ａ～１４Ｄは、ｒｆＨＳＡ処理Ｂ１６Ｆ１０細胞溶解物でのワクチン接種が、インビボで抗腫瘍免疫応答及び腫瘍クリアランスを誘導したことを示す。図１４Ａは、この研究の模式的な予防接種プロトコルを示す。ｒｆＨＳＡ（１．５μＭ）で２４時間処理した。チャレンジ後、（Ｂ）腫瘍増殖率、（Ｃ）マウス生存率、及び（Ｄ）無腫瘍転帰をモニターした。細胞質溶解物でのワクチン接種を受けたマウスの腫瘍体積と生存率から、腫瘍がはるかに少なく、生存が顕著に長くなったこと分かった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【配列表】

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【国際調査報告】