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特表2023-540831末梢体液の多重バイオマーカーによる中枢神経系疾患の検出方法及びシステム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-27
(54)【発明の名称】末梢体液の多重バイオマーカーによる中枢神経系疾患の検出方法及びシステム
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20230920BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230920BHJP
G01N 33/536 20060101ALI20230920BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20230920BHJP
C07K 16/40 20060101ALI20230920BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230920BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20230920BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
G01N33/53 D
G01N33/536 B
G01N33/536 C
G01N33/536 D
G01N33/536 E
C07K16/18
C07K16/40
C12N15/13
C12M1/34 F
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022568816
(86)(22)【出願日】2021-05-11
(85)【翻訳文提出日】2023-01-04
(86)【国際出願番号】 CN2021092983
(87)【国際公開番号】W WO2021228067
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】202010390614.0
(32)【優先日】2020-05-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522441046
【氏名又は名称】ザ ファースト アフィリエイテッド ホスピタル チョーチアン ユニヴァーシティー スクール オブ メディシン
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＦＩＲＳＴ ＡＦＦＩＬＩＡＴＥＤ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＺＨＥＪＩＡＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＳＣＨＯＯＬ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．７９ Ｑｉｎｇｃｈｕｎ Ｒｏａｄ， Ｓｈａｎｇｃｈｅｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１０００３， Ｃｈｉｎａ
(71)【出願人】
【識別番号】517000704
【氏名又は名称】エックスワイ エバーグリーン テクノロジー カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】郭▲貞▼
(72)【発明者】
【氏名】宋雪茹
(72)【発明者】
【氏名】韓卿卿
【テーマコード（参考）】
2G045
4B029
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CA25
2G045CA26
2G045DA13
2G045DA14
2G045DA36
2G045FB02
2G045FB03
4B029AA07
4B029BB17
4B029CC01
4B029FA15
4B029GA03
4B029GA08
4B029GB06
4B029GB10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA70
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA50
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は中枢神経系疾患を診断する方法、システム、組成物及びキットを提供し、診断するシステムは、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する第１検出モジュールと、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する第２検出モジュールと、第１検出モジュール及び第２検出モジュールのそれぞれによって取得された中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーの検出結果に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断する診断モジュールと、を含む。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
中枢神経系疾患を診断する方法であって、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出するステップと、
被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出するステップと、
中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーの検出結果に基づいて被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断するステップとを含む方法。
【請求項2】
被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーの検出と被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーの検出は同時に行われる請求項１に記載の方法。
【請求項3】
被験者の生体体液を取得して前処理し、生体体液中の生体サンプルを濃縮するステップをさらに含み、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出することは、被験者の濃縮生体サンプル中の中枢神経系由来マーカーを検出することであり、
被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出することは被験者の濃縮生体サンプル中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出することである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの数を統計する、及び／又は中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの粒径を測定するステップと、
前記生体サンプルの数及び／又は前記生体サンプルの粒径に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断するステップと、をさらに含む請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記生体サンプルは細胞外小胞であり、好ましくは、前記細胞外小胞はニューロン由来の細胞外小胞、アストロサイト由来の細胞外小胞、オリゴデンドロサイト由来の細胞外小胞又はミクログリア由来の細胞外小胞である請求項３又は４に記載の方法。
【請求項6】
前記生体体液は血液、血清、血漿、唾液、尿、リンパ液、精液又は乳汁から選択される１種又は２種以上である請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記中枢神経系疾患は、脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上である請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、
前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、
前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、
前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、
前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、
前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含む請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記変性性痴呆はアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉痴呆症（ＦＴＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含み、前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症（ＷＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記中枢神経系由来マーカーは、成熟ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ミクログリア、未成熟ニューロン、シュワン細胞、放射状グリア細胞、中間型前駆細胞、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンのニューロン又は細胞に由来するバイオマーカーである請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記中枢神経系由来マーカー及び／又は中枢神経系疾患関連マーカーはそれぞれタンパク質、核酸、脂質から選択される１種又は２種又は３種類である請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記中枢神経系由来マーカーは、Ｇタンパク質共役型受容体１６２（ＧＰＲ１６２：Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １６２）、過分極活性化環状ヌクレオチドゲートカリウムチャネル１（ＨＣＮ１：Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｙｃｌｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｇａｔｅｄ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ １）、γ－アミノ酪酸Ａ型受容体サブユニットδ（ＧＡＢＲＤ：Ｇａｍｍａ－Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｙｐｅ Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｄｅｌｔａ）、ニューロリギン３（ＮＬＧＮ３：Ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ ３）、ＳＨＩＳＡ９、コンタクチン－１（ＣＮＴＮ１：ｃｏｎｔａｃｔｉｎ－１）、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、ニューロフィラメント－Ｌ（ＮＦ－Ｌ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｌｉｇｈｔ）、ニューロフィラメント－Ｍ（ＮＦ－Ｍ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ）、ニューロフィラメント－Ｈ（ＮＦ－Ｈ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｈｅａｖｙ）、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、シンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）、ＰＳＤ９５、Ｌ１ＣＡＭ、ダブルコルチン（ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）、β３－チューブリン（ｂｅｔａ ＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ）、ＮｅｕｒｏＤ１、ＴＢＲ１、スタスミン１（ｓｔａｔｈｍｉｎ １）、ＭＰＺ、ＮＣＡＭ、ＧＡＰ４３、Ｓ１００、ＣＮＰ酵素（ＣＮＰａｓｅ）、ｏｌｉｇ １、ｏｌｉｇ ２、ｏｌｉｇ ３、ＭＢＰ、ＯＳＰ、ＭＯＧ、ＳＯＸ１０、ＮＧ２、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ（ＥＡＡＴ１）、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、Ｓ１００－β、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、Ｉｂａ１、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ４０、ビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）、ＰＡＸ６、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、ＴＮ－Ｃ、Ｎカドヘリン（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＳＯＸ２、ＴＢＲ２、ＭＡＳＨ１（Ａｓｃｌ１）、ｖＧｌｕＴ１、ｖＧｌｕＴ２、ＮＭＤＡＲ、グルタミナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ＧＡＢＡ トランスポータ１（ＧＡＴ１：ＧＡＢＡ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体１（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体２（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ：ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、ドーパミントランスポータ（ＤＡＴ：ｄｏｐａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、ＦＯＸＡ２、ＧＩＲＫ２、Ｎｕｒｒ１、ＬＭＸ１Ｂ、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、セロトニントランスポータ（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、Ｐｅｔ１、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ：ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、小胞アセチルコリントランスポータ（ＶＡＣｈＴ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ：ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）から選択される１種又は２種以上であり、好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーは中枢神経系由来の細胞外小胞の表面に位置するマーカーであり、
さらに好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーはＬ１ＣＡＭ、ＳＨＩＳＡ９、ＣＮＰ酵素、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）から選択される１種又は２種以上である請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項13】
前記中枢神経系疾患関連マーカーは、Ａβ１－４０（Ａβ４０）タンパク質、Ａβ１－４２（Ａβ４２）タンパク質、オリゴマーＡβ（ｏｌｉｇｏ－Ａβ：ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）タンパク質、ｔａｕタンパク質、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質、α－シヌクレインタンパク質（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質）、１２９位リン酸化α－シヌクレイン（ｐＳ１２９）タンパク質、オリゴマーα－シヌクレイン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ, ｏｌｉｇｏ－α－ｓｙｎ）タンパク質、プリオンタンパク質から選択される１種又は２種以上のタンパク質である請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記中枢神経系疾患関連マーカーは、アルツハイマー病（ＡＤ）のバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡ、パーキンソン病（ＰＤ）及びパーキンソン症候群（例えば、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ））のバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡから選択される１種又は２種以上の核酸である請求項１１に記載の方法。
【請求項15】
前記ＡＤのバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡは、遺伝子ＵＢＡＰ２Ｌ、ＹＢＸ１、ＳＥＲＦ２、ＵＢＥ２Ｂ、ＲＰＬ１０Ａ、Ｈ３Ｆ３ＡＰ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＮＭＤ３、ＲＮＦ７、ＲＰＬＰ０、ＳＰＡＲＣ、ＷＴＡＰ、ＨＮＲＮＰＵ、ＬＩＮＣ００２６５、ＩＮＭＴ、ＳＬＣ３５Ｅ２、ＣＴ６０、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＲＧＳ２、ＳＭＣ６、ＡＲＳＡ、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＭＩＭ１７、ＴＲＡＦ３ＩＰ２－ＡＳ１、ＫＣＮＣ２、ＳＬＣ２４Ａ１、ＨＬＣＳ、ＧＯＳＲ１、ＭＮ１、ＭＧＡＴ５、ＮＢＰＦ１４、ＦＢＸＯ３１、ＷＤＲ５２、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＺＮＦ６４８、ＮＢＰＦ１６、ＰＡＧＲ１、ＡＱＰ２、ＰＲＫＣＩ、ＳＣＮ２Ｂ、ＤＰＹＳＬ３、ＴＭＥＭ２６、ＴＳＰＡＮ１１、ＥＬＬ２、ＦＡＭ１８６Ａ、ＣＤ５９、ＴＨＳＤ４、ＧＯＬＧＡ６Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ５、ＰＫＤ１、ＢＰＴＦ、ＦＬＧ、ＰＯＭ１２１Ｌ１０Ｐ、ＮＸＰＨ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＳＨ３ＴＣ２、ＧＧＣＸ、及びＧＲＥＢ１に関連するＤＮＡ又はＲＮＡを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記ＰＤのバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡは、遺伝子ＢＬＯＣ１Ｓ１、ＵＢＥ２Ｌ３、ＲＮＦ１４９、ＦＡＭ８９Ｂ、ＬＣＥ６Ａ、ＮＴ５ＤＣ２、ＰＰＰ１ＣＣ、ＣＣＬ５、ＨＤＬＢＰ、ＨＮＲＮＰＡＢ、ＮＸＮ、ＳＬＣ９Ａ４、ＥＩＦ２ＡＫ１、ＰＡＰＯＬＡ、ＴＲＩＭ５０、ＳＩＸ４、ＲＡＢ３ＩＰ、ＶＡＮＧＬ２、ＤＨＲＳＸ、ＦＯＸＰ４、ＳＹＮＭ、ＺＮＦ５４３、ＡＴＦ６、ＬＯＣ１００１３２８３２、及びＢＬＯＣ１Ｓ１－ＲＤＨ５に関連するＤＮＡ又はＲＮＡを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
被験者の生体体液を取得して前処理し、生体サンプルを濃縮する方法は遠心分離、超遠心分離、限外ろ過管によるろ過、重合沈降、特異的抗体捕捉から選択される１種又は２種以上を含む請求項３に記載の方法。
【請求項18】
前記中枢神経系由来マーカーはタンパク質であり、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系由来マーカーに特異的に反応する標識抗体と反応させることと、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系由来マーカーの存在及び含有量を判断することとを含む請求項１１に記載の方法。
【請求項19】
前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系疾患関連マーカーに特異的に反応する標識抗体と反応させることと、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系疾患関連マーカーの存在及び含有量を判断することとを含む請求項１１に記載の方法。
【請求項20】
前記標識は、蛍光標識、同位体標識、酵素標識、化学発光剤標識、量子ドット標識又は金コロイド標識から選択される１種又は２種以上である請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項21】
前記中枢神経系由来マーカーは核酸であり、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を溶解し、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はシーケンシング技術によって中枢神経系由来の核酸の存在及び含有量を検出することを含む請求項１１に記載の方法。
【請求項22】
前記中枢神経系疾患関連マーカーは核酸であり、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を溶解し、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はシーケンシング技術によって中枢神経系疾患に関連する核酸の存在及び含有量を検出することを含む請求項１１に記載の方法。
【請求項23】
中枢神経系疾患を診断するシステムであって、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する第１検出モジュールと、
被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する第２検出モジュールと、
第１検出モジュール及び第２検出モジュールのそれぞれによって取得された中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーの検出結果に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断する診断モジュールと、を含むシステム。
【請求項24】
前記第１検出モジュール及び前記第２検出モジュールは被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーの検出と被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーの検出とを同時に行い、又は前記第１検出モジュール及び前記第２検出モジュールは、同一モジュールとして、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーと被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを同時に検出する請求項２３に記載のシステム。
【請求項25】
被験者の生体体液を取得して前処理し、生体体液中の生体サンプルを濃縮する濃縮モジュールをさらに含み、第１検出モジュール及び第２検出モジュールは被験者の濃縮生体サンプル中の中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーを検出する請求項２３又は２４に記載のシステム。
【請求項26】
中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの数を統計する数量統計モジュール、及び／又は中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの粒径を測定する粒径測定モジュールと、
前記生体サンプルの数及び／又は前記生体サンプルの粒径に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断する診断モジュールと、をさらに含む請求項２３～２５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項27】
前記生体サンプルは細胞外小胞であり、好ましくは、前記細胞外小胞はニューロン由来の細胞外小胞、アストロサイト由来の細胞外小胞、オリゴデンドロサイト由来の細胞外小胞又はミクログリア由来の細胞外小胞である請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項28】
前記生体体液は血液、血清、血漿、唾液、尿、リンパ液、精液又は乳汁から選択される１種又は２種以上である請求項２３～２７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項29】
前記中枢神経系疾患は脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上である請求項２３～２８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項30】
前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、
前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、
前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、
前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、
前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、
前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含む請求項２９に記載のシステム。
【請求項31】
前記変性痴呆はアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉痴呆症（ＦＴＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含み、前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症（ＷＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む請求項３０に記載のシステム。
【請求項32】
前記中枢神経系由来マーカーは、成熟ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ミクログリア、未成熟ニューロン、シュワン細胞、放射状グリア細胞、中間型前駆細胞、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンのニューロン又は細胞に由来するバイオマーカーである請求項２３～３１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項33】
前記中枢神経系由来マーカー及び／又は中枢神経系疾患関連マーカーはそれぞれタンパク質、核酸、脂質から選択される１種又は２種又は３種類である請求項２３～３２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項34】
前記中枢神経系由来マーカーは、Ｇタンパク質共役型受容体１６２（ＧＰＲ１６２：Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １６２）、過分極活性化環状ヌクレオチドゲートカリウムチャネル１（ＨＣＮ１：Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｙｃｌｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｇａｔｅｄ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ １）、γ－アミノ酪酸Ａ型受容体サブユニットδ（ＧＡＢＲＤ：Ｇａｍｍａ－Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｙｐｅ Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｄｅｌｔａ）、ニューロリギン３（ＮＬＧＮ３：Ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ ３）、ＳＨＩＳＡ９、コンタクチン－１（ＣＮＴＮ１：ｃｏｎｔａｃｔｉｎ－１）、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、ニューロフィラメント－Ｌ（ＮＦ－Ｌ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｌｉｇｈｔ）、ニューロフィラメント－Ｍ（ＮＦ－Ｍ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ）、ニューロフィラメント－Ｈ（ＮＦ－Ｈ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｈｅａｖｙ）、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、シンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）、ＰＳＤ９５、Ｌ１ＣＡＭ、ダブルコルチン（ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）、β３－チューブリン（ｂｅｔａ ＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ）、ＮｅｕｒｏＤ１、ＴＢＲ１、スタスミン１（ｓｔａｔｈｍｉｎ １）、ＭＰＺ、ＮＣＡＭ、ＧＡＰ４３、Ｓ１００、ＣＮＰ酵素（ＣＮＰａｓｅ）、ｏｌｉｇ １、ｏｌｉｇ ２、ｏｌｉｇ ３、ＭＢＰ、ＯＳＰ、ＭＯＧ、ＳＯＸ１０、ＮＧ２、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ（ＥＡＡＴ１）、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、Ｓ１００－β、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、Ｉｂａ１、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ４０、ビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）、ＰＡＸ６、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、ＴＮ－Ｃ、Ｎカドヘリン（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＳＯＸ２、ＴＢＲ２、ＭＡＳＨ１（Ａｓｃｌ１）、ｖＧｌｕＴ１、ｖＧｌｕＴ２、ＮＭＤＡＲ、グルタミナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ＧＡＢＡ トランスポータ１（ＧＡＴ１：ＧＡＢＡ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体１（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体２（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ：ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、ドーパミントランスポータ（ＤＡＴ：ｄｏｐａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、ＦＯＸＡ２、ＧＩＲＫ２、Ｎｕｒｒ１、ＬＭＸ１Ｂ、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、セロトニントランスポータ（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、Ｐｅｔ１、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ：ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、小胞アセチルコリントランスポータ（ＶＡＣｈＴ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ：ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ））から選択される１種又は２種以上であり、好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーは中枢神経系由来の細胞外小胞の表面に位置するマーカーであり、
さらに好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーはＬ１ＣＡＭ、ＳＨＩＳＡ９、ＣＮＰ酵素、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）から選択される１種又は２種以上である請求項３２又は３３に記載のシステム。
【請求項35】
前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、前記タンパク質は、Ａβ１－４０（Ａβ４０）タンパク質、Ａβ１－４２（Ａβ４２）タンパク質、オリゴマーＡβ（ｏｌｉｇｏ－Ａβ：ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）タンパク質、ｔａｕタンパク質、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質、α－シヌクレインタンパク質（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質）、１２９位リン酸化α－シヌクレイン（ｐＳ１２９）タンパク質、オリゴマーα－シヌクレイン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ, ｏｌｉｇｏ－α－ｓｙｎ）タンパク質、プリオンタンパク質から選択される１種又は２種以上である請求項３４に記載のシステム。
【請求項36】
前記中枢神経系疾患関連マーカーは核酸であり、前記核酸は、アルツハイマー病（ＡＤ）のバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡ、パーキンソン病（ＰＤ）及びパーキンソン症候群（例えば、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ））のバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡから選択される１種又は２種以上である請求項３４に記載のシステム。
【請求項37】
前記ＡＤのバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡは、遺伝子ＵＢＡＰ２Ｌ、ＹＢＸ１、ＳＥＲＦ２、ＵＢＥ２Ｂ、ＲＰＬ１０Ａ、Ｈ３Ｆ３ＡＰ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＮＭＤ３、ＲＮＦ７、ＲＰＬＰ０、ＳＰＡＲＣ、ＷＴＡＰ、ＨＮＲＮＰＵ、ＬＩＮＣ００２６５、ＩＮＭＴ、ＳＬＣ３５Ｅ２、ＣＴ６０、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＲＧＳ２、ＳＭＣ６、ＡＲＳＡ、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＭＩＭ１７、ＴＲＡＦ３ＩＰ２－ＡＳ１、ＫＣＮＣ２、ＳＬＣ２４Ａ１、ＨＬＣＳ、ＧＯＳＲ１、ＭＮ１、ＭＧＡＴ５、ＮＢＰＦ１４、ＦＢＸＯ３１、ＷＤＲ５２、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＺＮＦ６４８、ＮＢＰＦ１６、ＰＡＧＲ１、ＡＱＰ２、ＰＲＫＣＩ、ＳＣＮ２Ｂ、ＤＰＹＳＬ３、ＴＭＥＭ２６、ＴＳＰＡＮ１１、ＥＬＬ２、ＦＡＭ１８６Ａ、ＣＤ５９、ＴＨＳＤ４、ＧＯＬＧＡ６Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ５、ＰＫＤ１、ＢＰＴＦ、ＦＬＧ、ＰＯＭ１２１Ｌ１０Ｐ、ＮＸＰＨ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＳＨ３ＴＣ２、ＧＧＣＸ、及びＧＲＥＢ１に関連するＤＮＡ又はＲＮＡを含む請求項３６に記載のシステム。
【請求項38】
前記ＰＤのバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡは、遺伝子ＢＬＯＣ１Ｓ１、ＵＢＥ２Ｌ３、ＲＮＦ１４９、ＦＡＭ８９Ｂ、ＬＣＥ６Ａ、ＮＴ５ＤＣ２、ＰＰＰ１ＣＣ、ＣＣＬ５、ＨＤＬＢＰ、ＨＮＲＮＰＡＢ、ＮＸＮ、ＳＬＣ９Ａ４、ＥＩＦ２ＡＫ１、ＰＡＰＯＬＡ、ＴＲＩＭ５０、ＳＩＸ４、ＲＡＢ３ＩＰ、ＶＡＮＧＬ２、ＤＨＲＳＸ、ＦＯＸＰ４、ＳＹＮＭ、ＺＮＦ５４３、ＡＴＦ６、ＬＯＣ１００１３２８３２、及びＢＬＯＣ１Ｓ１－ＲＤＨ５に関連するＤＮＡ又はＲＮＡを含む請求項３６に記載のシステム。
【請求項39】
前記濃縮モジュールは、遠心分離、超遠心分離、限外ろ過管によるろ過、重合沈降、特異的抗体捕捉のうちの１種又は２種以上のステップを行うサブモジュールを有する請求項２５に記載のシステム。
【請求項40】
前記中枢神経系由来マーカーはタンパク質であり、第１検出モジュールは被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系由来マーカーに特異的に反応する標識抗体と反応させ、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系由来マーカーの存在及び含有量を判断する請求項３３に記載のシステム。
【請求項41】
前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、第２検出モジュールは被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系疾患関連マーカーに特異的に反応する標識抗体と反応させ、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系疾患関連マーカーの存在及び含有量を判断する請求項３３に記載のシステム。
【請求項42】
前記標識は蛍光標識、同位体標識、酵素標識、化学発光剤標識、量子ドット標識又は金コロイド標識から選択される１種又は２種以上である請求項４０又は４１に記載のシステム。
【請求項43】
前記中枢神経系由来マーカーは核酸であり、第１検出モジュールは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を溶解し、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はシーケンシング技術によって中枢神経系由来の核酸の存在及び含有量を検出する請求項３３に記載のシステム。
【請求項44】
前記中枢神経系疾患関連マーカーは核酸であり、第２検出モジュールは被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を溶解し、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はシーケンシング技術によって中枢神経系疾患に関連する核酸の存在及び含有量を検出する請求項３３に記載のシステム。
【請求項45】
中枢神経系疾患を検出する組成物であって、中枢神経系由来マーカーを標的とする抗体と、中枢神経系疾患関連マーカーを標的とする抗体と、を含む組成物。
【請求項46】
前記中枢神経系疾患は脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上である請求項４５に記載の組成物。
【請求項47】
前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、
前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、
前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、
前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、
前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、
前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含む請求項４６に記載の組成物。
【請求項48】
前記変性性痴呆はアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉痴呆症（ＦＴＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含み、前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症（ＷＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む請求項４７に記載の組成物。
【請求項49】
前記中枢神経系由来マーカーは、成熟ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ミクログリア、未成熟ニューロン、シュワン細胞、放射状グリア細胞、中間型前駆細胞、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンのニューロン又は細胞に由来するバイオマーカーである請求項４５～４８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項50】
前記中枢神経系由来マーカーは、Ｇタンパク質共役型受容体１６２（ＧＰＲ１６２：Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １６２）、過分極活性化環状ヌクレオチドゲートカリウムチャネル１（ＨＣＮ１：Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｙｃｌｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｇａｔｅｄ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ １）、γ－アミノ酪酸Ａ型受容体サブユニットδ（ＧＡＢＲＤ：Ｇａｍｍａ－Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｙｐｅ Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｄｅｌｔａ）、ニューロリギン３（ＮＬＧＮ３：Ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ ３）、ＳＨＩＳＡ９、コンタクチン－１（ＣＮＴＮ１：ｃｏｎｔａｃｔｉｎ－１）、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、ニューロフィラメント－Ｌ（ＮＦ－Ｌ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｌｉｇｈｔ）、ニューロフィラメント－Ｍ（ＮＦ－Ｍ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ）、ニューロフィラメント－Ｈ（ＮＦ－Ｈ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｈｅａｖｙ）、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、シンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）、ＰＳＤ９５、Ｌ１ＣＡＭ、ダブルコルチン（ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）、β３－チューブリン（ｂｅｔａ ＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ）、ＮｅｕｒｏＤ１、ＴＢＲ１、スタスミン１（ｓｔａｔｈｍｉｎ １）、ＭＰＺ、ＮＣＡＭ、ＧＡＰ４３、Ｓ１００、ＣＮＰ酵素（ＣＮＰａｓｅ）、ｏｌｉｇ １、ｏｌｉｇ ２、ｏｌｉｇ ３、ＭＢＰ、ＯＳＰ、ＭＯＧ、ＳＯＸ１０、ＮＧ２、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ（ＥＡＡＴ１）、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、Ｓ１００－β、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、Ｉｂａ１、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ４０、ビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）、ＰＡＸ６、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、ＴＮ－Ｃ、Ｎカドヘリン（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＳＯＸ２、ＴＢＲ２、ＭＡＳＨ１（Ａｓｃｌ１）、ｖＧｌｕＴ１、ｖＧｌｕＴ２、ＮＭＤＡＲ、グルタミナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ＧＡＢＡ トランスポータ１（ＧＡＴ１：ＧＡＢＡ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体１（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体２（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ：ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、ドーパミントランスポータ（ＤＡＴ：ｄｏｐａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、ＦＯＸＡ２、ＧＩＲＫ２、Ｎｕｒｒ１、ＬＭＸ１Ｂ、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、セロトニントランスポータ（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、Ｐｅｔ１、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ：ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、小胞アセチルコリントランスポータ（ＶＡＣｈＴ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ：ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）から選択される１種又は２種以上であり、好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーは中枢神経系由来の細胞外小胞の表面に位置するマーカーであり、
さらに好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーはＬ１ＣＡＭ、ＳＨＩＳＡ９、ＣＮＰ酵素、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）から選択される１種又は２種以上である請求項４５～４９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項51】
前記中枢神経系疾患関連マーカーは、Ａβ１－４０（Ａβ４０）タンパク質、Ａβ１－４２（Ａβ４２）タンパク質、オリゴマーＡβ（ｏｌｉｇｏ－Ａβ：ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）タンパク質、ｔａｕタンパク質、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質、α－シヌクレインタンパク質（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質）、１２９位リン酸化α－シヌクレイン（ｐＳ１２９）タンパク質、オリゴマーα－シヌクレイン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ, ｏｌｉｇｏ－α－ｓｙｎ）タンパク質、プリオンタンパク質から選択される１種又は２種以上である請求項４５～５０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項52】
前記中枢神経系由来マーカーを標的とする抗体及び前記中枢神経系疾患関連マーカーを標的とする抗体は標識抗体であり、好ましくは、前記標識は蛍光標識、同位体標識、酵素標識、化学発光剤標識、量子ドット標識又は金コロイド標識から選択される１種又は２種以上である請求項４５～５１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項53】
被験者の中枢神経系疾患を検出するキットであって、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬と、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬と、を含むキット。
【請求項54】
前記被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬及び被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬は請求項４５～５２のいずれか１項に記載の組成物である請求項５３に記載のキット。
【請求項55】
前記被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬は中枢神経系由来マーカーを標的とするプライマー又はプローブであり、前記被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬は中枢神経系疾患関連マーカーを標的とするプライマー又はプローブである請求項５３に記載のキット。
【請求項56】
被験者の生体サンプルを取得する試薬と装置、好ましくは、被験者の細胞外小胞を取得する試薬と装置をさらに含む請求項５３に記載のキット。
【請求項57】
前記中枢神経系疾患は脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上である請求項５３に記載のキット。
【請求項58】
前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、
前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、
前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、
前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、
前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、
前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含む請求項５７に記載のキット。
【請求項59】
前記変性性痴呆はアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉痴呆症（ＦＴＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含み、前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症（ＷＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む請求項５８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は生物医薬の技術分野に関し、特にインビトロ診断及び検出の技術分野に関し、特に二重マーカー及び／又は多重マーカーを用いた検出方法及びシステム、好ましくは、二重マーカー及び／又は多重マーカーを用いた同時検出方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【0002】
科学技術の発展に伴い、バイオマーカーの検出は疾患の診断、鑑別診断や病状進展のモニタリングにますます重要な役割を果たしている。
【0003】
現在、中枢神経系疾患バイオマーカーの検出は主に脳脊髄液の検出と末梢体液の直接検出に基づいて開発が進められている。脳脊髄液を用いた検出は、脳脊髄液が脳と脊髄に直接接触し、中枢神経系の変化をよりよく反映できるため、良好なパフォーマンスを示した。しかし、脳脊髄液の取得は侵襲性であり、患者の受容度が悪いため、脳脊髄液バイオマーカーの更なる開発、臨床転化や広範な応用が極めて制限された。末梢体液を用いた検出はパフォーマンスが悪く、主に以下の２つの問題が存在する。１つは、血液脳関門が存在するため、全ての中枢神経系由来の成分が末梢体液中で検出されるわけではなく、末梢体液中に存在する中枢神経系由来のバイオマーカー、特にタンパク質でも、その存在度は非常に低いことであり、もう１つは、多くの中枢神経疾患関連マーカーは中枢神経系で特異的に発現されるものではなく、末梢の他の器官及び／又は系でも産生されるので、中枢神経系由来のシグナルは末梢成分の影響を受けやすいことである。
【0004】
そして、中枢神経系疾患は脳領域特異性の特徴を持つ。例えば、アルツハイマー病の主な病理変化は頭頂葉、側頭葉、海馬などの大脳皮質の萎縮であり、パーキンソン病は主に基底核の黒質－線条体のドーパミン回路病変や損傷によるドーパミン分泌不足によるものである。現在、異なる脳領域に対してマーカーの検出分析を特異的に行うことができるのは脳部生検しかなく、現在のインビトロ検出技術はいずれも由来の区別を行うことができず、異なる疾患に対する診断効果に差異が存在し、また、疾患診断の精度も一定の向上の余地が存在する。
【0005】
そのため、如何に末梢体液から中枢神経系疾患の変化を反映できるバイオマーカーを効率的に濃縮し、かつ特異的に標識するかが当分野の研究の焦点である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記した通り、本分野では、末梢体液を利用して中枢神経系疾患を効果的に検出するシステム、方法及びキットが存在しておらず、本願は、末梢体液中で様々な中枢神経系由来のマーカーを効果的に認識し、疾患関連マーカーと組み合わせて検出することができ、多重標識を同時に検出することにより、脳脊髄液を取得することなく、末梢体液サンプルを用いて中枢神経系変化を反映する効果を果たすことを意図している。
【0007】
すなわち、本願は、初めて、末梢体液中で中枢神経系由来のバイオマーカーを認識することにより中枢神経系疾患を診断する概念及び検出方法を提案している。
【課題を解決するための手段】
【0008】
具体的には、本願は以下の内容に関する。
１． 中枢神経系疾患を診断する方法であって、
被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出するステップと、
被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出するステップと、
中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーの検出結果に基づいて被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断するステップと、を含む、方法。
２． 被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーの検出と被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーの検出は同時に行われる、前記項１に記載の方法。
３． 被験者の生体体液を取得して前処理し、生体体液中の生体サンプルを濃縮するステップをさらに含み、
被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出することは、被験者の濃縮生体サンプル中の中枢神経系由来マーカーを検出することであり、
被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出することは被験者の濃縮生体サンプル中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出することである、前記項１又は２に記載の方法。
４． 中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの数を統計するステップ、及び／又は
中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの粒径を測定するステップと、
前記生体サンプルの数及び／又は前記生体サンプルの粒径に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断するステップと、をさらに含む、前記項１～３のいずれか１項に記載の方法。
５． 前記生体サンプルは細胞外小胞であり、
好ましくは、前記細胞外小胞はニューロン由来の細胞外小胞、アストロサイト由来の細胞外小胞、オリゴデンドロサイト由来の細胞外小胞又はミクログリア由来の細胞外小胞である、前記項３又は４に記載の方法。
１． 中枢神経系疾患を診断する方法であって、
被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出するステップと、
被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出するステップと、
中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーの検出結果に基づいて被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断するステップと、を含む、方法。
２． 被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーの検出と被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーの検出は同時に行われる、前記項１に記載の方法。
３． 被験者の生体体液を取得して前処理し、生体体液中の生体サンプルを濃縮するステップをさらに含み、
被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出することは、被験者の濃縮生体サンプル中の中枢神経系由来マーカーを検出することであり、
被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出することは被験者の濃縮生体サンプル中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出することである、前記項１又は２に記載の方法。
４． 中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの数を統計するステップ、及び／又は
中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの粒径を測定するステップと、
前記生体サンプルの数及び／又は前記生体サンプルの粒径に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断するステップと、をさらに含む、前記項１～３のいずれか１項に記載の方法。
５． 前記生体サンプルは細胞外小胞であり、
好ましくは、前記細胞外小胞はニューロン由来の細胞外小胞、アストロサイト由来の細胞外小胞、オリゴデンドロサイト由来の細胞外小胞又はミクログリア由来の細胞外小胞である、前記項３又は４に記載の方法。
【0009】
６． 前記生体体液は血液、血清、血漿、唾液、尿、リンパ液、精液又は乳汁から選択される１種又は２種以上である、前記項１～５のいずれか１項に記載の方法。
７． 前記中枢神経系疾患は脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上である、前記項１～６のいずれか１項に記載の方法。
８． 前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、
前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、
前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、
前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、
前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、
前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、
前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含む、前記項７に記載の方法。
９． 前記変性性痴呆はアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉痴呆症（ＦＴＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含み、
前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症（ＷＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む、前記項８に記載の方法。
１０． 前記中枢神経系由来マーカーは、ニューロン又は細胞として、成熟ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ミクログリア、未成熟ニューロン、シュワン細胞、放射状グリア細胞、中間型前駆細胞、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンに由来するバイオマーカーである、前記項１～９のいずれか１項に記載の方法。
７． 前記中枢神経系疾患は脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上である、前記項１～６のいずれか１項に記載の方法。
８． 前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、
前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、
前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、
前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、
前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、
前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、
前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含む、前記項７に記載の方法。
９． 前記変性性痴呆はアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉痴呆症（ＦＴＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含み、
前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症（ＷＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む、前記項８に記載の方法。
１０． 前記中枢神経系由来マーカーは、ニューロン又は細胞として、成熟ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ミクログリア、未成熟ニューロン、シュワン細胞、放射状グリア細胞、中間型前駆細胞、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンに由来するバイオマーカーである、前記項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【0010】
１１． 前記中枢神経系由来マーカー及び／又は中枢神経系疾患関連マーカーはそれぞれタンパク質、核酸、脂質から選択される１種又は２種又は３種類である、前記項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
１２． 前記中枢神経系由来マーカーは、Ｇタンパク質共役型受容体１６２（ＧＰＲ１６２：Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １６２）、過分極活性化環状ヌクレオチドゲートカリウムチャネル１（ＨＣＮ１：Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｙｃｌｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｇａｔｅｄ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ １）、γ－アミノ酪酸Ａ型受容体サブユニットδ（ＧＡＢＲＤ：Ｇａｍｍａ－Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｙｐｅ Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｄｅｌｔａ）、ニューロリギン３（ＮＬＧＮ３：Ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ ３）、ＳＨＩＳＡ９、コンタクチン－１（ＣＮＴＮ１：ｃｏｎｔａｃｔｉｎ－１）、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、ニューロフィラメント－Ｌ（ＮＦ－Ｌ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｌｉｇｈｔ）、ニューロフィラメント－Ｍ（ＮＦ－Ｍ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ）、ニューロフィラメント－Ｈ（ＮＦ－Ｈ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｈｅａｖｙ）、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、シンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）、ＰＳＤ９５、Ｌ１ＣＡＭ、ダブルコルチン（ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）、β３－チューブリン（ｂｅｔａ ＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ）、ＮｅｕｒｏＤ１、ＴＢＲ１、スタスミン１（ｓｔａｔｈｍｉｎ １）、ＭＰＺ、ＮＣＡＭ、ＧＡＰ４３、Ｓ１００、ＣＮＰ酵素（ＣＮＰａｓｅ）、ｏｌｉｇ １、ｏｌｉｇ ２、ｏｌｉｇ ３、ＭＢＰ、ＯＳＰ、ＭＯＧ、ＳＯＸ１０、ＮＧ２、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ（ＥＡＡＴ１）、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、Ｓ１００－β、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、Ｉｂａ１、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ４０、ビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）、ＰＡＸ６、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、ＴＮ－Ｃ、Ｎ－カドヘリン（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＳＯＸ２、ＴＢＲ２、ＭＡＳＨ１（Ａｓｃｌ１）、ｖＧｌｕＴ１、ｖＧｌｕＴ２、ＮＭＤＡＲ、グルタミナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ＧＡＢＡ トランスポータ１（ＧＡＴ１：ＧＡＢＡ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体１（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体２（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ：ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、ドーパミントランスポータ（ＤＡＴ：ｄｏｐａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、ＦＯＸＡ２、ＧＩＲＫ２、Ｎｕｒｒ１、ＬＭＸ１Ｂ、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、セロトニントランスポータ（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、Ｐｅｔ１、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ：ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、小胞アセチルコリントランスポータ（ＶＡＣｈＴ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ：ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）から選択される１種又は２種以上であり、
好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーは中枢神経系由来の細胞外小胞の表面に位置するマーカーであり、
さらに好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーはＬ１ＣＡＭ、ＳＨＩＳＡ９、ＣＮＰ酵素、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）から選択される１種又は２種以上である、前記項１０又は１１に記載の方法。
１３． 前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、前記タンパク質は、Ａβ１－４０（Ａβ４０）タンパク質、Ａβ１－４２（Ａβ４２）タンパク質、オリゴマーＡβ（ｏｌｉｇｏ－Ａβ：ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）タンパク質、ｔａｕタンパク質、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質、α－シヌクレインタンパク質（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質）、１２９位リン酸化α－シヌクレイン（ｐＳ１２９）タンパク質、オリゴマーα－シヌクレイン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ, ｏｌｉｇｏ－α－ｓｙｎ）タンパク質、プリオンタンパク質から選択される１種又は２種以上である、前記項１１に記載の方法。
１４． 前記中枢神経系疾患関連マーカーは核酸であり、前記核酸は、アルツハイマー病（ＡＤ）のバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡ、パーキンソン病（ＰＤ）及びパーキンソン症候群（例えば、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ））のバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡから選択される１種又は２種以上である、前記項１１に記載の方法。
１５． 前記ＡＤのバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡは、遺伝子ＵＢＡＰ２Ｌ、ＹＢＸ１、ＳＥＲＦ２、ＵＢＥ２Ｂ、ＲＰＬ１０Ａ、Ｈ３Ｆ３ＡＰ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＮＭＤ３、ＲＮＦ７、ＲＰＬＰ０、ＳＰＡＲＣ、ＷＴＡＰ、ＨＮＲＮＰＵ、ＬＩＮＣ００２６５、ＩＮＭＴ、ＳＬＣ３５Ｅ２、ＣＴ６０、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＲＧＳ２、ＳＭＣ６、ＡＲＳＡ、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＭＩＭ１７、ＴＲＡＦ３ＩＰ２－ＡＳ１、ＫＣＮＣ２、ＳＬＣ２４Ａ１、ＨＬＣＳ、ＧＯＳＲ１、ＭＮ１、ＭＧＡＴ５、ＮＢＰＦ１４、ＦＢＸＯ３１、ＷＤＲ５２、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＺＮＦ６４８、ＮＢＰＦ１６、ＰＡＧＲ１、ＡＱＰ２、ＰＲＫＣＩ、ＳＣＮ２Ｂ、ＤＰＹＳＬ３、ＴＭＥＭ２６、ＴＳＰＡＮ１１、ＥＬＬ２、ＦＡＭ１８６Ａ、ＣＤ５９、ＴＨＳＤ４、ＧＯＬＧＡ６Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ５、ＰＫＤ１、ＢＰＴＦ、ＦＬＧ、ＰＯＭ１２１Ｌ１０Ｐ、ＮＸＰＨ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＳＨ３ＴＣ２、ＧＧＣＸ、及びＧＲＥＢ１に関連するＤＮＡ又はＲＮＡを含む、前記項１４に記載の方法。
１２． 前記中枢神経系由来マーカーは、Ｇタンパク質共役型受容体１６２（ＧＰＲ１６２：Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １６２）、過分極活性化環状ヌクレオチドゲートカリウムチャネル１（ＨＣＮ１：Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｙｃｌｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｇａｔｅｄ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ １）、γ－アミノ酪酸Ａ型受容体サブユニットδ（ＧＡＢＲＤ：Ｇａｍｍａ－Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｙｐｅ Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｄｅｌｔａ）、ニューロリギン３（ＮＬＧＮ３：Ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ ３）、ＳＨＩＳＡ９、コンタクチン－１（ＣＮＴＮ１：ｃｏｎｔａｃｔｉｎ－１）、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、ニューロフィラメント－Ｌ（ＮＦ－Ｌ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｌｉｇｈｔ）、ニューロフィラメント－Ｍ（ＮＦ－Ｍ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ）、ニューロフィラメント－Ｈ（ＮＦ－Ｈ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｈｅａｖｙ）、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、シンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）、ＰＳＤ９５、Ｌ１ＣＡＭ、ダブルコルチン（ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）、β３－チューブリン（ｂｅｔａ ＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ）、ＮｅｕｒｏＤ１、ＴＢＲ１、スタスミン１（ｓｔａｔｈｍｉｎ １）、ＭＰＺ、ＮＣＡＭ、ＧＡＰ４３、Ｓ１００、ＣＮＰ酵素（ＣＮＰａｓｅ）、ｏｌｉｇ １、ｏｌｉｇ ２、ｏｌｉｇ ３、ＭＢＰ、ＯＳＰ、ＭＯＧ、ＳＯＸ１０、ＮＧ２、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ（ＥＡＡＴ１）、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、Ｓ１００－β、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、Ｉｂａ１、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ４０、ビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）、ＰＡＸ６、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、ＴＮ－Ｃ、Ｎ－カドヘリン（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＳＯＸ２、ＴＢＲ２、ＭＡＳＨ１（Ａｓｃｌ１）、ｖＧｌｕＴ１、ｖＧｌｕＴ２、ＮＭＤＡＲ、グルタミナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ＧＡＢＡ トランスポータ１（ＧＡＴ１：ＧＡＢＡ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体１（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体２（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ：ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、ドーパミントランスポータ（ＤＡＴ：ｄｏｐａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、ＦＯＸＡ２、ＧＩＲＫ２、Ｎｕｒｒ１、ＬＭＸ１Ｂ、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、セロトニントランスポータ（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、Ｐｅｔ１、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ：ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、小胞アセチルコリントランスポータ（ＶＡＣｈＴ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ：ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）から選択される１種又は２種以上であり、
好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーは中枢神経系由来の細胞外小胞の表面に位置するマーカーであり、
さらに好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーはＬ１ＣＡＭ、ＳＨＩＳＡ９、ＣＮＰ酵素、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）から選択される１種又は２種以上である、前記項１０又は１１に記載の方法。
１３． 前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、前記タンパク質は、Ａβ１－４０（Ａβ４０）タンパク質、Ａβ１－４２（Ａβ４２）タンパク質、オリゴマーＡβ（ｏｌｉｇｏ－Ａβ：ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）タンパク質、ｔａｕタンパク質、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質、α－シヌクレインタンパク質（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質）、１２９位リン酸化α－シヌクレイン（ｐＳ１２９）タンパク質、オリゴマーα－シヌクレイン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ, ｏｌｉｇｏ－α－ｓｙｎ）タンパク質、プリオンタンパク質から選択される１種又は２種以上である、前記項１１に記載の方法。
１４． 前記中枢神経系疾患関連マーカーは核酸であり、前記核酸は、アルツハイマー病（ＡＤ）のバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡ、パーキンソン病（ＰＤ）及びパーキンソン症候群（例えば、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ））のバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡから選択される１種又は２種以上である、前記項１１に記載の方法。
１５． 前記ＡＤのバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡは、遺伝子ＵＢＡＰ２Ｌ、ＹＢＸ１、ＳＥＲＦ２、ＵＢＥ２Ｂ、ＲＰＬ１０Ａ、Ｈ３Ｆ３ＡＰ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＮＭＤ３、ＲＮＦ７、ＲＰＬＰ０、ＳＰＡＲＣ、ＷＴＡＰ、ＨＮＲＮＰＵ、ＬＩＮＣ００２６５、ＩＮＭＴ、ＳＬＣ３５Ｅ２、ＣＴ６０、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＲＧＳ２、ＳＭＣ６、ＡＲＳＡ、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＭＩＭ１７、ＴＲＡＦ３ＩＰ２－ＡＳ１、ＫＣＮＣ２、ＳＬＣ２４Ａ１、ＨＬＣＳ、ＧＯＳＲ１、ＭＮ１、ＭＧＡＴ５、ＮＢＰＦ１４、ＦＢＸＯ３１、ＷＤＲ５２、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＺＮＦ６４８、ＮＢＰＦ１６、ＰＡＧＲ１、ＡＱＰ２、ＰＲＫＣＩ、ＳＣＮ２Ｂ、ＤＰＹＳＬ３、ＴＭＥＭ２６、ＴＳＰＡＮ１１、ＥＬＬ２、ＦＡＭ１８６Ａ、ＣＤ５９、ＴＨＳＤ４、ＧＯＬＧＡ６Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ５、ＰＫＤ１、ＢＰＴＦ、ＦＬＧ、ＰＯＭ１２１Ｌ１０Ｐ、ＮＸＰＨ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＳＨ３ＴＣ２、ＧＧＣＸ、及びＧＲＥＢ１に関連するＤＮＡ又はＲＮＡを含む、前記項１４に記載の方法。
【0011】
１６． 前記ＰＤのバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡは、遺伝子ＢＬＯＣ１Ｓ１、ＵＢＥ２Ｌ３、ＲＮＦ１４９、ＦＡＭ８９Ｂ、ＬＣＥ６Ａ、ＮＴ５ＤＣ２、ＰＰＰ１ＣＣ、ＣＣＬ５、ＨＤＬＢＰ、ＨＮＲＮＰＡＢ、ＮＸＮ、ＳＬＣ９Ａ４、ＥＩＦ２ＡＫ１、ＰＡＰＯＬＡ、ＴＲＩＭ５０、ＳＩＸ４、ＲＡＢ３ＩＰ、ＶＡＮＧＬ２、ＤＨＲＳＸ、ＦＯＸＰ４、ＳＹＮＭ、ＺＮＦ５４３、ＡＴＦ６、ＬＯＣ１００１３２８３２、及びＢＬＯＣ１Ｓ１－ＲＤＨ５に関連するＤＮＡ又はＲＮＡを含む、前記項１４に記載の方法。
１７． 被験者の生体体液を取得して前処理し、生体サンプルを濃縮する方法は、遠心分離、超遠心分離、限外ろ過管によるろ過、重合沈降、特異的抗体捕捉から選択される１種又は２種以上である、前記項３に記載の方法。
１８． 前記中枢神経系由来マーカーはタンパク質であり、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系由来マーカーに特異的に反応する標識した抗体と反応させることと、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系由来マーカーの存在及び含有量を判断することとを含む、前記項１１に記載の方法。
１９． 前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系疾患関連マーカーに特異的に反応する標識した抗体と反応させることと、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系疾患関連マーカーの存在及び含有量を判断することとを含む、前記項１１に記載の方法。
２０． 前記標識は蛍光標識、同位体標識、酵素標識、化学発光剤標識、量子ドット標識又は金コロイド標識から選択される１種又は２種以上である、前記項１８又は１９に記載の方法。
２１． 前記中枢神経系由来マーカーは核酸であり、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を溶解し、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はシーケンシング技術によって中枢神経系由来の核酸の存在及び含有量を検出することを含む、前記項１１に記載の方法。
２２． 前記中枢神経系疾患関連マーカーは核酸であり、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を溶解し、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はシーケンシング技術によって中枢神経系疾患に関連する核酸の存在及び含有量を検出することを含む、前記項１１に記載の方法。
１７． 被験者の生体体液を取得して前処理し、生体サンプルを濃縮する方法は、遠心分離、超遠心分離、限外ろ過管によるろ過、重合沈降、特異的抗体捕捉から選択される１種又は２種以上である、前記項３に記載の方法。
１８． 前記中枢神経系由来マーカーはタンパク質であり、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系由来マーカーに特異的に反応する標識した抗体と反応させることと、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系由来マーカーの存在及び含有量を判断することとを含む、前記項１１に記載の方法。
１９． 前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系疾患関連マーカーに特異的に反応する標識した抗体と反応させることと、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系疾患関連マーカーの存在及び含有量を判断することとを含む、前記項１１に記載の方法。
２０． 前記標識は蛍光標識、同位体標識、酵素標識、化学発光剤標識、量子ドット標識又は金コロイド標識から選択される１種又は２種以上である、前記項１８又は１９に記載の方法。
２１． 前記中枢神経系由来マーカーは核酸であり、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を溶解し、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はシーケンシング技術によって中枢神経系由来の核酸の存在及び含有量を検出することを含む、前記項１１に記載の方法。
２２． 前記中枢神経系疾患関連マーカーは核酸であり、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を溶解し、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はシーケンシング技術によって中枢神経系疾患に関連する核酸の存在及び含有量を検出することを含む、前記項１１に記載の方法。
【0012】
２３． 中枢神経系疾患を診断するシステムであって、
被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する第１検出モジュールと、
被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する第２検出モジュールと、
第１検出モジュール及び第２検出モジュールのそれぞれによって取得された中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーの検出結果に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断する診断モジュールと、を含む、システム。
２４． 前記第１検出モジュール及び前記第２検出モジュールは被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーの検出と被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーの検出とを同時に行い、又は
前記第１検出モジュール及び前記第２検出モジュールは、同一モジュールとして、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーと被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを同時に検出する、前記項２３に記載のシステム。
２５． 被験者の生体体液を取得して前処理し、生体体液中の生体サンプルを濃縮する濃縮モジュールをさらに含み、
第１検出モジュール及び第２検出モジュールは被験者の濃縮生体サンプル中の中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーを検出する、前記項２３又は２４に記載のシステム。
２６． 中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの数を統計する数量統計モジュール、及び／又は
中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの粒径を測定する粒径測定モジュールと、
前記生体サンプルの数及び／又は前記生体サンプルの粒径に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断する診断モジュールと、をさらに含む、前記項２３～２５のいずれか１項に記載のシステム。
２７． 前記生体サンプルは細胞外小胞であり、
好ましくは、前記細胞外小胞はニューロン由来の細胞外小胞、アストロサイト由来の細胞外小胞、オリゴデンドロサイト由来の細胞外小胞又はミクログリア由来の細胞外小胞である、前記項２５又は２６に記載のシステム。
２８． 前記生体体液は血液、血清、血漿、唾液、尿、リンパ液、精液又は乳汁から選択される１種又は２種以上である、前記項２３～２７のいずれか１項に記載のシステム。
２９． 前記中枢神経系疾患は脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上である、前記項２３～２８のいずれか１項に記載のシステム。
３０． 前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、
前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、
前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、
前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、
前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、
前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、
前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含む、前記項２９に記載のシステム。
被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する第１検出モジュールと、
被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する第２検出モジュールと、
第１検出モジュール及び第２検出モジュールのそれぞれによって取得された中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーの検出結果に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断する診断モジュールと、を含む、システム。
２４． 前記第１検出モジュール及び前記第２検出モジュールは被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーの検出と被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーの検出とを同時に行い、又は
前記第１検出モジュール及び前記第２検出モジュールは、同一モジュールとして、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーと被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを同時に検出する、前記項２３に記載のシステム。
２５． 被験者の生体体液を取得して前処理し、生体体液中の生体サンプルを濃縮する濃縮モジュールをさらに含み、
第１検出モジュール及び第２検出モジュールは被験者の濃縮生体サンプル中の中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーを検出する、前記項２３又は２４に記載のシステム。
２６． 中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの数を統計する数量統計モジュール、及び／又は
中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの粒径を測定する粒径測定モジュールと、
前記生体サンプルの数及び／又は前記生体サンプルの粒径に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断する診断モジュールと、をさらに含む、前記項２３～２５のいずれか１項に記載のシステム。
２７． 前記生体サンプルは細胞外小胞であり、
好ましくは、前記細胞外小胞はニューロン由来の細胞外小胞、アストロサイト由来の細胞外小胞、オリゴデンドロサイト由来の細胞外小胞又はミクログリア由来の細胞外小胞である、前記項２５又は２６に記載のシステム。
２８． 前記生体体液は血液、血清、血漿、唾液、尿、リンパ液、精液又は乳汁から選択される１種又は２種以上である、前記項２３～２７のいずれか１項に記載のシステム。
２９． 前記中枢神経系疾患は脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上である、前記項２３～２８のいずれか１項に記載のシステム。
３０． 前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、
前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、
前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、
前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、
前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、
前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、
前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含む、前記項２９に記載のシステム。
【0013】
３１． 前記変性性痴呆はアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉痴呆症（ＦＴＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含み、
前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症（ＷＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む、前記項３０に記載のシステム。
３２． 前記中枢神経系由来マーカーは、ニューロン又は細胞として、成熟ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ミクログリア、未成熟ニューロン、シュワン細胞、放射状グリア細胞、中間型前駆細胞、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンに由来するバイオマーカーである、前記項２３～３１のいずれか１項に記載のシステム。
３３． 前記中枢神経系由来マーカー及び／又は中枢神経系疾患関連マーカーはそれぞれタンパク質、核酸、脂質から選択される１種又は２種又は３種類である、前記項２３～３２のいずれか１項に記載のシステム。
３４． 前記中枢神経系由来マーカーは、Ｇタンパク質共役型受容体１６２（ＧＰＲ１６２：Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １６２）、過分極活性化環状ヌクレオチドゲートカリウムチャネル１（ＨＣＮ１：Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｙｃｌｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｇａｔｅｄ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ １）、γ－アミノ酪酸Ａ型受容体サブユニットδ（ＧＡＢＲＤ：Ｇａｍｍａ－Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｙｐｅ Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｄｅｌｔａ）、ニューロリギン３（ＮＬＧＮ３：Ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ ３）、ＳＨＩＳＡ９、コンタクチン－１（ＣＮＴＮ１：ｃｏｎｔａｃｔｉｎ－１）、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、ニューロフィラメント－Ｌ（ＮＦ－Ｌ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｌｉｇｈｔ）、ニューロフィラメント－Ｍ（ＮＦ－Ｍ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ）、ニューロフィラメント－Ｈ（ＮＦ－Ｈ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｈｅａｖｙ）、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、シンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）、ＰＳＤ９５、Ｌ１ＣＡＭ、ダブルコルチン（ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）、β３－チューブリン（ｂｅｔａ ＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ）、ＮｅｕｒｏＤ１、ＴＢＲ１、スタスミン１（ｓｔａｔｈｍｉｎ １）、ＭＰＺ、ＮＣＡＭ、ＧＡＰ４３、Ｓ１００、ＣＮＰ酵素（ＣＮＰａｓｅ）、ｏｌｉｇ １、ｏｌｉｇ ２、ｏｌｉｇ ３、ＭＢＰ、ＯＳＰ、ＭＯＧ、ＳＯＸ１０、ＮＧ２、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ（ＥＡＡＴ１）、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、Ｓ１００－β、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、Ｉｂａ１、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ４０、ビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）、ＰＡＸ６、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、ＴＮ－Ｃ、Ｎ－カドヘリン（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＳＯＸ２、ＴＢＲ２、ＭＡＳＨ１（Ａｓｃｌ１）、ｖＧｌｕＴ１、ｖＧｌｕＴ２、ＮＭＤＡＲ、グルタミナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ＧＡＢＡ トランスポータ１（ＧＡＴ１：ＧＡＢＡ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体１（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体２（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ：ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、ドーパミントランスポータ（ＤＡＴ：ｄｏｐａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、ＦＯＸＡ２、ＧＩＲＫ２、Ｎｕｒｒ１、ＬＭＸ１Ｂ、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、セロトニントランスポータ（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、Ｐｅｔ１、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ：ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、小胞アセチルコリントランスポータ（ＶＡＣｈＴ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ：ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ））から選択される１種又は２種以上であり、
好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーは中枢神経系由来の細胞外小胞の表面に位置するマーカーであり、
さらに好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーはＬ１ＣＡＭ、ＳＨＩＳＡ９、ＣＮＰ酵素、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）から選択される１種又は２種以上である、前記項３２又は３３に記載のシステム。
前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症（ＷＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む、前記項３０に記載のシステム。
３２． 前記中枢神経系由来マーカーは、ニューロン又は細胞として、成熟ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ミクログリア、未成熟ニューロン、シュワン細胞、放射状グリア細胞、中間型前駆細胞、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンに由来するバイオマーカーである、前記項２３～３１のいずれか１項に記載のシステム。
３３． 前記中枢神経系由来マーカー及び／又は中枢神経系疾患関連マーカーはそれぞれタンパク質、核酸、脂質から選択される１種又は２種又は３種類である、前記項２３～３２のいずれか１項に記載のシステム。
３４． 前記中枢神経系由来マーカーは、Ｇタンパク質共役型受容体１６２（ＧＰＲ１６２：Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １６２）、過分極活性化環状ヌクレオチドゲートカリウムチャネル１（ＨＣＮ１：Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｙｃｌｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｇａｔｅｄ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ １）、γ－アミノ酪酸Ａ型受容体サブユニットδ（ＧＡＢＲＤ：Ｇａｍｍａ－Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｙｐｅ Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｄｅｌｔａ）、ニューロリギン３（ＮＬＧＮ３：Ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ ３）、ＳＨＩＳＡ９、コンタクチン－１（ＣＮＴＮ１：ｃｏｎｔａｃｔｉｎ－１）、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、ニューロフィラメント－Ｌ（ＮＦ－Ｌ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｌｉｇｈｔ）、ニューロフィラメント－Ｍ（ＮＦ－Ｍ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ）、ニューロフィラメント－Ｈ（ＮＦ－Ｈ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｈｅａｖｙ）、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、シンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）、ＰＳＤ９５、Ｌ１ＣＡＭ、ダブルコルチン（ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）、β３－チューブリン（ｂｅｔａ ＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ）、ＮｅｕｒｏＤ１、ＴＢＲ１、スタスミン１（ｓｔａｔｈｍｉｎ １）、ＭＰＺ、ＮＣＡＭ、ＧＡＰ４３、Ｓ１００、ＣＮＰ酵素（ＣＮＰａｓｅ）、ｏｌｉｇ １、ｏｌｉｇ ２、ｏｌｉｇ ３、ＭＢＰ、ＯＳＰ、ＭＯＧ、ＳＯＸ１０、ＮＧ２、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ（ＥＡＡＴ１）、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、Ｓ１００－β、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、Ｉｂａ１、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ４０、ビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）、ＰＡＸ６、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、ＴＮ－Ｃ、Ｎ－カドヘリン（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＳＯＸ２、ＴＢＲ２、ＭＡＳＨ１（Ａｓｃｌ１）、ｖＧｌｕＴ１、ｖＧｌｕＴ２、ＮＭＤＡＲ、グルタミナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ＧＡＢＡ トランスポータ１（ＧＡＴ１：ＧＡＢＡ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体１（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体２（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ：ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、ドーパミントランスポータ（ＤＡＴ：ｄｏｐａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、ＦＯＸＡ２、ＧＩＲＫ２、Ｎｕｒｒ１、ＬＭＸ１Ｂ、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、セロトニントランスポータ（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、Ｐｅｔ１、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ：ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、小胞アセチルコリントランスポータ（ＶＡＣｈＴ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ：ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ））から選択される１種又は２種以上であり、
好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーは中枢神経系由来の細胞外小胞の表面に位置するマーカーであり、
さらに好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーはＬ１ＣＡＭ、ＳＨＩＳＡ９、ＣＮＰ酵素、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）から選択される１種又は２種以上である、前記項３２又は３３に記載のシステム。
【0014】
３５． 前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、前記タンパク質は、Ａβ１－４０（Ａβ４０）タンパク質、Ａβ１－４２（Ａβ４２）タンパク質、オリゴマーＡβ（ｏｌｉｇｏ－Ａβ：ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）タンパク質、ｔａｕタンパク質、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質、α－シヌクレインタンパク質（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質）、１２９位リン酸化α－シヌクレイン（ｐＳ１２９）タンパク質、オリゴマーα－シヌクレイン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ, ｏｌｉｇｏ－α－ｓｙｎ）タンパク質、プリオンタンパク質から選択される１種又は２種以上である、前記項３４に記載のシステム。
３６． 前記中枢神経系疾患関連マーカーは核酸であり、前記核酸は、アルツハイマー病（ＡＤ）のバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡ、パーキンソン病（ＰＤ）及びパーキンソン症候群（例えば、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ））のバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡから選択される１種又は２種以上である、前記項３４に記載のシステム。
３７． 前記ＡＤのバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡは、遺伝子ＵＢＡＰ２Ｌ、ＹＢＸ１、ＳＥＲＦ２、ＵＢＥ２Ｂ、ＲＰＬ１０Ａ、Ｈ３Ｆ３ＡＰ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＮＭＤ３、ＲＮＦ７、ＲＰＬＰ０、ＳＰＡＲＣ、ＷＴＡＰ、ＨＮＲＮＰＵ、ＬＩＮＣ００２６５、ＩＮＭＴ、ＳＬＣ３５Ｅ２、ＣＴ６０、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＲＧＳ２、ＳＭＣ６、ＡＲＳＡ、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＭＩＭ１７、ＴＲＡＦ３ＩＰ２－ＡＳ１、ＫＣＮＣ２、ＳＬＣ２４Ａ１、ＨＬＣＳ、ＧＯＳＲ１、ＭＮ１、ＭＧＡＴ５、ＮＢＰＦ１４、ＦＢＸＯ３１、ＷＤＲ５２、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＺＮＦ６４８、ＮＢＰＦ１６、ＰＡＧＲ１、ＡＱＰ２、ＰＲＫＣＩ、ＳＣＮ２Ｂ、ＤＰＹＳＬ３、ＴＭＥＭ２６、ＴＳＰＡＮ１１、ＥＬＬ２、ＦＡＭ１８６Ａ、ＣＤ５９、ＴＨＳＤ４、ＧＯＬＧＡ６Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ５、ＰＫＤ１、ＢＰＴＦ、ＦＬＧ、ＰＯＭ１２１Ｌ１０Ｐ、ＮＸＰＨ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＳＨ３ＴＣ２、ＧＧＣＸ、及びＧＲＥＢ１に関連するＤＮＡ又はＲＮＡを含む、前記項３６に記載のシステム。
３８． 前記ＰＤのバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡは、遺伝子ＢＬＯＣ１Ｓ１、ＵＢＥ２Ｌ３、ＲＮＦ１４９、ＦＡＭ８９Ｂ、ＬＣＥ６Ａ、ＮＴ５ＤＣ２、ＰＰＰ１ＣＣ、ＣＣＬ５、ＨＤＬＢＰ、ＨＮＲＮＰＡＢ、ＮＸＮ、ＳＬＣ９Ａ４、ＥＩＦ２ＡＫ１、ＰＡＰＯＬＡ、ＴＲＩＭ５０、ＳＩＸ４、ＲＡＢ３ＩＰ、ＶＡＮＧＬ２、ＤＨＲＳＸ、ＦＯＸＰ４、ＳＹＮＭ、ＺＮＦ５４３、ＡＴＦ６、ＬＯＣ１００１３２８３２、及びＢＬＯＣ１Ｓ１－ＲＤＨ５に関連するＤＮＡ又はＲＮＡを含む、前記項３６に記載のシステム。
３６． 前記中枢神経系疾患関連マーカーは核酸であり、前記核酸は、アルツハイマー病（ＡＤ）のバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡ、パーキンソン病（ＰＤ）及びパーキンソン症候群（例えば、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ））のバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡから選択される１種又は２種以上である、前記項３４に記載のシステム。
３７． 前記ＡＤのバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡは、遺伝子ＵＢＡＰ２Ｌ、ＹＢＸ１、ＳＥＲＦ２、ＵＢＥ２Ｂ、ＲＰＬ１０Ａ、Ｈ３Ｆ３ＡＰ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＮＭＤ３、ＲＮＦ７、ＲＰＬＰ０、ＳＰＡＲＣ、ＷＴＡＰ、ＨＮＲＮＰＵ、ＬＩＮＣ００２６５、ＩＮＭＴ、ＳＬＣ３５Ｅ２、ＣＴ６０、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＲＧＳ２、ＳＭＣ６、ＡＲＳＡ、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＭＩＭ１７、ＴＲＡＦ３ＩＰ２－ＡＳ１、ＫＣＮＣ２、ＳＬＣ２４Ａ１、ＨＬＣＳ、ＧＯＳＲ１、ＭＮ１、ＭＧＡＴ５、ＮＢＰＦ１４、ＦＢＸＯ３１、ＷＤＲ５２、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＺＮＦ６４８、ＮＢＰＦ１６、ＰＡＧＲ１、ＡＱＰ２、ＰＲＫＣＩ、ＳＣＮ２Ｂ、ＤＰＹＳＬ３、ＴＭＥＭ２６、ＴＳＰＡＮ１１、ＥＬＬ２、ＦＡＭ１８６Ａ、ＣＤ５９、ＴＨＳＤ４、ＧＯＬＧＡ６Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ５、ＰＫＤ１、ＢＰＴＦ、ＦＬＧ、ＰＯＭ１２１Ｌ１０Ｐ、ＮＸＰＨ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＳＨ３ＴＣ２、ＧＧＣＸ、及びＧＲＥＢ１に関連するＤＮＡ又はＲＮＡを含む、前記項３６に記載のシステム。
３８． 前記ＰＤのバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡは、遺伝子ＢＬＯＣ１Ｓ１、ＵＢＥ２Ｌ３、ＲＮＦ１４９、ＦＡＭ８９Ｂ、ＬＣＥ６Ａ、ＮＴ５ＤＣ２、ＰＰＰ１ＣＣ、ＣＣＬ５、ＨＤＬＢＰ、ＨＮＲＮＰＡＢ、ＮＸＮ、ＳＬＣ９Ａ４、ＥＩＦ２ＡＫ１、ＰＡＰＯＬＡ、ＴＲＩＭ５０、ＳＩＸ４、ＲＡＢ３ＩＰ、ＶＡＮＧＬ２、ＤＨＲＳＸ、ＦＯＸＰ４、ＳＹＮＭ、ＺＮＦ５４３、ＡＴＦ６、ＬＯＣ１００１３２８３２、及びＢＬＯＣ１Ｓ１－ＲＤＨ５に関連するＤＮＡ又はＲＮＡを含む、前記項３６に記載のシステム。
【0015】
３９． 前記濃縮モジュールは、遠心分離、超遠心分離、限外ろ過管によるろ過、重合沈降、特異的抗体捕捉のうちの１種又は２種以上のステップを行うサブモジュールを有する、前記項２５に記載のシステム。
４０． 前記中枢神経系由来マーカーはタンパク質であり、第１検出モジュールは被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系由来マーカーに特異的に反応する標識した抗体と反応させ、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系由来マーカーの存在及び含有量を判断する、前記項３３に記載のシステム。
４１． 前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、第２検出モジュールは被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系疾患関連マーカーに特異的に反応する標識した抗体と反応させ、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系疾患関連マーカーの存在及び含有量を判断する、前記項３３に記載のシステム。
４２． 前記標識は蛍光標識、同位体標識、酵素標識、化学発光剤標識、量子ドット標識又は金コロイド標識から選択される１種又は２種以上である、前記項４０又は４１に記載のシステム。
４３． 前記中枢神経系由来マーカーは核酸であり、第１検出モジュールは被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を溶解し、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はシーケンシング技術によって中枢神経系由来の核酸の存在及び含有量を検出する、前記項３３に記載のシステム。
４４． 前記中枢神経系疾患関連マーカーは核酸であり、第２検出モジュールは被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を溶解し、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はシーケンシング技術によって中枢神経系疾患に関連する核酸の存在及び含有量を検出する、前記項３３に記載のシステム。
４０． 前記中枢神経系由来マーカーはタンパク質であり、第１検出モジュールは被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系由来マーカーに特異的に反応する標識した抗体と反応させ、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系由来マーカーの存在及び含有量を判断する、前記項３３に記載のシステム。
４１． 前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、第２検出モジュールは被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系疾患関連マーカーに特異的に反応する標識した抗体と反応させ、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系疾患関連マーカーの存在及び含有量を判断する、前記項３３に記載のシステム。
４２． 前記標識は蛍光標識、同位体標識、酵素標識、化学発光剤標識、量子ドット標識又は金コロイド標識から選択される１種又は２種以上である、前記項４０又は４１に記載のシステム。
４３． 前記中枢神経系由来マーカーは核酸であり、第１検出モジュールは被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を溶解し、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はシーケンシング技術によって中枢神経系由来の核酸の存在及び含有量を検出する、前記項３３に記載のシステム。
４４． 前記中枢神経系疾患関連マーカーは核酸であり、第２検出モジュールは被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を溶解し、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はシーケンシング技術によって中枢神経系疾患に関連する核酸の存在及び含有量を検出する、前記項３３に記載のシステム。
【0016】
４５． 中枢神経系疾患を検出する組成物であって、
中枢神経系由来マーカーを標的とする抗体と、中枢神経系疾患関連マーカーを標的とする抗体と、を含む、組成物。
４６． 前記中枢神経系疾患は脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上である、前記項４５に記載の組成物。
４７． 前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、
前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、
前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、
前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、
前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、
前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、
前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含む、前記項４６に記載の組成物。
４８． 前記変性性痴呆はアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉痴呆症（ＦＴＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含み、
前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症（ＷＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む、前記項４７に記載の組成物。
４９． 前記中枢神経系由来マーカーは、ニューロン又は細胞として、成熟ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ミクログリア、未成熟ニューロン、シュワン細胞、放射状グリア細胞、中間型前駆細胞、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンに由来するバイオマーカーである、前記項４５～４８のいずれか１項に記載の組成物。
中枢神経系由来マーカーを標的とする抗体と、中枢神経系疾患関連マーカーを標的とする抗体と、を含む、組成物。
４６． 前記中枢神経系疾患は脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上である、前記項４５に記載の組成物。
４７． 前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、
前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、
前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、
前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、
前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、
前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、
前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含む、前記項４６に記載の組成物。
４８． 前記変性性痴呆はアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉痴呆症（ＦＴＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含み、
前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症（ＷＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む、前記項４７に記載の組成物。
４９． 前記中枢神経系由来マーカーは、ニューロン又は細胞として、成熟ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ミクログリア、未成熟ニューロン、シュワン細胞、放射状グリア細胞、中間型前駆細胞、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンに由来するバイオマーカーである、前記項４５～４８のいずれか１項に記載の組成物。
【0017】
５０． 前記中枢神経系由来マーカーは、Ｇタンパク質共役型受容体１６２（ＧＰＲ１６２：Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １６２）、過分極活性化環状ヌクレオチドゲートカリウムチャネル１（ＨＣＮ１：Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｙｃｌｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｇａｔｅｄ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ １）、γ－アミノ酪酸Ａ型受容体サブユニットδ（ＧＡＢＲＤ：Ｇａｍｍａ－Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｙｐｅ Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｄｅｌｔａ）、ニューロリギン３（ＮＬＧＮ３：Ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ ３）、ＳＨＩＳＡ９、コンタクチン－１（ＣＮＴＮ１：ｃｏｎｔａｃｔｉｎ－１）、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、ニューロフィラメント－Ｌ（ＮＦ－Ｌ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｌｉｇｈｔ）、ニューロフィラメント－Ｍ（ＮＦ－Ｍ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ）、ニューロフィラメント－Ｈ（ＮＦ－Ｈ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｈｅａｖｙ）、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、シンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）、ＰＳＤ９５、Ｌ１ＣＡＭ、ダブルコルチン（ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）、β３－チューブリン（ｂｅｔａ ＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ）、ＮｅｕｒｏＤ１、ＴＢＲ１、スタスミン１（ｓｔａｔｈｍｉｎ １）、ＭＰＺ、ＮＣＡＭ、ＧＡＰ４３、Ｓ１００、ＣＮＰ酵素（ＣＮＰａｓｅ）、ｏｌｉｇ １、ｏｌｉｇ ２、ｏｌｉｇ ３、ＭＢＰ、ＯＳＰ、ＭＯＧ、ＳＯＸ１０、ＮＧ２、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ（ＥＡＡＴ１）、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、Ｓ１００－β、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、Ｉｂａ１、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ４０、ビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）、ＰＡＸ６、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、ＴＮ－Ｃ、Ｎ－カドヘリン（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＳＯＸ２、ＴＢＲ２、ＭＡＳＨ１（Ａｓｃｌ１）、ｖＧｌｕＴ１、ｖＧｌｕＴ２、ＮＭＤＡＲ、グルタミナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ＧＡＢＡ トランスポータ１（ＧＡＴ１：ＧＡＢＡ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体１（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体２（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ：ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、ドーパミントランスポータ（ＤＡＴ：ｄｏｐａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、ＦＯＸＡ２、ＧＩＲＫ２、Ｎｕｒｒ１、ＬＭＸ１Ｂ、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、セロトニントランスポータ（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、Ｐｅｔ１、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ：ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、小胞アセチルコリントランスポータ（ＶＡＣｈＴ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ：ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）から選択される１種又は２種以上であり、
好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーは中枢神経系由来の細胞外小胞の表面に位置するマーカーであり、
さらに好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーはＬ１ＣＡＭ、ＳＨＩＳＡ９、ＣＮＰ酵素、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）から選択される１種又は２種以上である、前記項４５～４９のいずれか１項に記載の組成物。
５１． 前記中枢神経系疾患関連マーカーは、Ａβ１－４０（Ａβ４０）タンパク質、Ａβ１－４２（Ａβ４２）タンパク質、オリゴマーＡβ（ｏｌｉｇｏ－Ａβ：ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）タンパク質、ｔａｕタンパク質、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質、α－シヌクレインタンパク質（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質）、１２９位リン酸化α－シヌクレイン（ｐＳ１２９）タンパク質、オリゴマーα－シヌクレイン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ, ｏｌｉｇｏ－α－ｓｙｎ）タンパク質、プリオンタンパク質から選択される１種又は２種以上である、前記項４５～５０のいずれか１項に記載の組成物。
５２． 前記中枢神経系由来マーカーを標的とする抗体及び前記中枢神経系疾患関連マーカーを標的とする抗体は標識した抗体であり、好ましくは、前記標識は蛍光標識、同位体標識、酵素標識、化学発光剤標識、量子ドット標識又は金コロイド標識から選択される１種又は２種以上である、前記項４５～５１のいずれか１項に記載の組成物。
好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーは中枢神経系由来の細胞外小胞の表面に位置するマーカーであり、
さらに好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーはＬ１ＣＡＭ、ＳＨＩＳＡ９、ＣＮＰ酵素、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）から選択される１種又は２種以上である、前記項４５～４９のいずれか１項に記載の組成物。
５１． 前記中枢神経系疾患関連マーカーは、Ａβ１－４０（Ａβ４０）タンパク質、Ａβ１－４２（Ａβ４２）タンパク質、オリゴマーＡβ（ｏｌｉｇｏ－Ａβ：ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）タンパク質、ｔａｕタンパク質、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質、α－シヌクレインタンパク質（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質）、１２９位リン酸化α－シヌクレイン（ｐＳ１２９）タンパク質、オリゴマーα－シヌクレイン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ, ｏｌｉｇｏ－α－ｓｙｎ）タンパク質、プリオンタンパク質から選択される１種又は２種以上である、前記項４５～５０のいずれか１項に記載の組成物。
５２． 前記中枢神経系由来マーカーを標的とする抗体及び前記中枢神経系疾患関連マーカーを標的とする抗体は標識した抗体であり、好ましくは、前記標識は蛍光標識、同位体標識、酵素標識、化学発光剤標識、量子ドット標識又は金コロイド標識から選択される１種又は２種以上である、前記項４５～５１のいずれか１項に記載の組成物。
【0018】
５３． 被験者の中枢神経系疾患を検出するキットであって、
被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬と、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬と、を含む、キット。
５４． 前記被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬及び被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬は項４５～５２のいずれか１項に記載の組成物である、前記項５３に記載のキット。
５５． 前記被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬は中枢神経系由来マーカーを標的とするプライマー又はプローブであり、
前記被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬は中枢神経系疾患関連マーカーを標的とするプライマー又はプローブである、前記項５３に記載のキット。
５６． 被験者の生体サンプルを取得する試薬と装置、好ましくは、被験者の細胞外小胞を取得する試薬と装置をさらに含む、前記項５３に記載のキット。
５７． 前記中枢神経系疾患は脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上である、前記項５３に記載のキット。
５８． 前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、
前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、
前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、
前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、
前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、
前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、
前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含む、前記項５７に記載のキット。
５９． 前記変性性痴呆はアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉痴呆症（ＦＴＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含み、
前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症（ＷＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む、前記項５８に記載のキット。
被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬と、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬と、を含む、キット。
５４． 前記被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬及び被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬は項４５～５２のいずれか１項に記載の組成物である、前記項５３に記載のキット。
５５． 前記被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬は中枢神経系由来マーカーを標的とするプライマー又はプローブであり、
前記被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬は中枢神経系疾患関連マーカーを標的とするプライマー又はプローブである、前記項５３に記載のキット。
５６． 被験者の生体サンプルを取得する試薬と装置、好ましくは、被験者の細胞外小胞を取得する試薬と装置をさらに含む、前記項５３に記載のキット。
５７． 前記中枢神経系疾患は脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上である、前記項５３に記載のキット。
５８． 前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、
前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、
前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、
前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、
前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、
前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、
前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含む、前記項５７に記載のキット。
５９． 前記変性性痴呆はアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉痴呆症（ＦＴＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含み、
前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症（ＷＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む、前記項５８に記載のキット。
【発明の効果】
【0019】
本願の方法、システム、キット及び組成物によれば、被験者の末梢体液だけでも、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断することができる。
本願の方法、システム、キット及び組成物によれば、末梢体液から中枢神経系疾患変化を反映できるバイオマーカーを効果的に濃縮し、かつ特異的に標識することができ、末梢体液中の疾患関連マーカーを直接検出する場合よりも、診断効果がより高い。
本願の方法、システム、キット及び組成物によれば、末梢体液を効果的に利用して検出を行い、これによって、被験者の脳脊髄液を侵襲的に取得することを回避し、被験者からのサンプリングのリスクを大幅に低減させ、検出し難さを大幅に低減させ、検出の臨床的な使用及び普及を大きく促進する。
本願の方法、システム、キット及び組成物によれば、中枢神経系由来マーカーと疾患関連マーカーを同時に検出することができ、サンプルの検出時間を短縮させ、より効率的かつ簡便にする。
本願のカギは二重マーカー及び／又は多重マーカーを用いた検出方法及びシステムであり、二重マーカー及び／又は多重マーカーの同時検出が可能であり、すなわちマーカーを利用して生体サンプル、特に細胞外小胞中の中枢神経系由来の部分を確認し、これに基づいて、疾患関連マーカーを利用し、このように共検出の結果として、疾患の診断、鑑別診断、追跡及び薬品評価に寄与する。
本願の方法、システム、キット及び組成物によれば、末梢体液から中枢神経系疾患変化を反映できるバイオマーカーを効果的に濃縮し、かつ特異的に標識することができ、末梢体液中の疾患関連マーカーを直接検出する場合よりも、診断効果がより高い。
本願の方法、システム、キット及び組成物によれば、末梢体液を効果的に利用して検出を行い、これによって、被験者の脳脊髄液を侵襲的に取得することを回避し、被験者からのサンプリングのリスクを大幅に低減させ、検出し難さを大幅に低減させ、検出の臨床的な使用及び普及を大きく促進する。
本願の方法、システム、キット及び組成物によれば、中枢神経系由来マーカーと疾患関連マーカーを同時に検出することができ、サンプルの検出時間を短縮させ、より効率的かつ簡便にする。
本願のカギは二重マーカー及び／又は多重マーカーを用いた検出方法及びシステムであり、二重マーカー及び／又は多重マーカーの同時検出が可能であり、すなわちマーカーを利用して生体サンプル、特に細胞外小胞中の中枢神経系由来の部分を確認し、これに基づいて、疾患関連マーカーを利用し、このように共検出の結果として、疾患の診断、鑑別診断、追跡及び薬品評価に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1A】図１Ａは、実施例１において、血漿中の単一標識ＳＨＩＳＡ９タンパク質陽性細胞外小胞の、細胞外小胞総数に対する比に関しては、６０～１００ｎｍの粒径、１００～１５０ｎｍの粒径及び全粒径範囲で、ＡＤ群と健常対照群（ＣＴ群）のいずれにおいても、有意差が認められる（＊＊：ｐ＜０．０１）ことを示している。
【図1B】図１Ｂは、実施例１において、血漿中の単一標識ｐ－ｔａｕ２１７タンパク質陽性細胞外小胞の、細胞外小胞総数に対する比に関しては、６０～１００ｎｍの粒径、及び全粒径範囲で、ＡＤ群とＣＴ群のいずれにおいても、非常に大きな有意差が認められ（＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）、１００～１５０ｎｍの粒径範囲で、ＡＤ群とＣＴ群のいずれにおいても、有意差が認められる（＊＊：ｐ＜０．０１）ことを示している。
【図1C】図１Ｃは、実施例１において、血漿中のＳＨＩＳＡ９タンパク質－ｐ－ｔａｕ２１７タンパク質二重陽性細胞外小胞の、細胞外小胞総数に対する比に関しては、１００～１５０ｎｍの粒径範囲、及び全粒径範囲で、ＡＤ群とＣＴ群のいずれにおいても、非常に大きな有意差が認められる（＊＊＊：ｐ＜０．００１）ことを示している。
【図1D】図１Ｄは、実施例１において、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ：ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）分析の結果、ＳＨＩＳＡ９タンパク質一重マーカーは、６０～１００ｎｍの粒径範囲での曲線下面積（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ, ＡＵＣ）が０．７４９であり、ＳＨＩＳＡ９タンパク質とｐ－ｔａｕ２１７タンパク質の二重マーカーは、１００～１５０ｎｍの粒径範囲でのＡＵＣが０．８９０であり、ロジスティック回帰分析Ｅｎｔｅｒ方法によりＳＨＩＳＡ９ ６０～１００ｎｍ及びＳＨＩＳＡ９＋ ｐ－ｔａｕ２１７ １００～１５０ｎｍデータを導入すると、ＡＵＣは０．８９１であることを示している。
【図1E】図１Ｅは、実施例１において、ＲＯＣ分析の結果、ｐ－ｔａｕ２１７タンパク質一重マーカーは、６０～１００ｎｍの粒径範囲でのＡＵＣが０．８７７、ＳＨＩＳＡ９タンパク質とｐ－ｔａｕ２１７タンパク質の二重マーカーは１００～１５０ｎｍの粒径範囲のＡＵＣが０．８９０であり、ロジスティック回帰分析Ｅｎｔｅｒ方法によりｐ－ｔａｕ２１７ ６０～１００ｎｍ及びＳＨＩＳＡ９＋ ｐ－ｔａｕ２１７ １００～１５０ｎｍデータを導入すると、ＡＵＣは０．９１０であることを示している。
【図2A】図２Ａは、実施例２において、血漿中の単一標識ＧＬＴ１タンパク質陽性細胞外小胞の数及び単一標識α－ｓｙｎタンパク質（ｓｙｎ２１１とＭＪＦＲ１４は全て抗α－ｓｙｎタンパク質抗体である）陽性細胞外小胞の数を示している。
【図2B-C】図２ＢおよびＣは、実施例２において、血漿中の単一標識ＧＬＴ１タンパク質又はα－ｓｙｎタンパク質陽性細胞外小胞の数、ＧＬＴ１タンパク質－α－ｓｙｎタンパク質二重陽性細胞外小胞の数を示している。
【図3】図３ＡおよびＢは、実施例２において、血漿中のＧＬＴ１タンパク質－α－ｓｙｎタンパク質二重陽性細胞外小胞の数について、ＰＤ群ではＭＳＡ群とＣＴ群よりも有意に高く（＊＊＊：ｐ＜０．００１）、ＭＳＡ群とＣＴ群との間で有意差が認められないことを示している。
【図4A】図４Ａは、実施例３において、血漿中のＣＮＰａｓｅタンパク質陽性細胞外小胞の数について、ＭＳＡ群とＰＤ群との間で有意差が認められず、ＭＳＡ群とＨＣ群との間で有意差が認められる（＊：ｐ＜０．０５）ことを示している。
【発明を実施するための形態】
【0021】
以下、図面を参照して本発明の具体的な実施例をさらに詳細に説明する。図面において本発明の具体的な実施例が示されているが、本発明は各種の形態で実施されてもよく、ここでの実施例に限定されないことが理解されるべきである。むしろ、これらの実施例は本発明をより完全に理解し、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるために提供されるものである。
【0022】
なお、明細書及び特許請求の範囲において特定の用語が特定の構成要素を指すために使用される。当業者によって明らかなように、技術者が異なる名詞を利用して同一の構成要素を記載してもよい。本明細書及び特許請求の範囲では、構成要素は名詞の相違により区別されるのではなく、機能の違いを区別の原則とする。明細書及び特許請求の範囲を通じて使用される「包含」又は「含む」はオープンな用語であるので、「を含むが、これに限定されない」として解釈されるべきである。以下の明細書では本発明を実施する好適な実施形態が記載されているが、前記説明は明細書の一般的な原則を目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の特許範囲は添付の特許請求の範囲により定められる。
【0023】
本願の１つの特定実施形態では、本願は、中枢神経系疾患を診断する方法であって、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出するステップと、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出するステップと、中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーの検出結果に基づいて被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断するステップと、を含む方法に関する。
【0024】
本願の１つの特定実施形態では、本願は、中枢神経系疾患を診断する方法であって、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出するステップと、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出するステップと、中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーの検出結果に基づいて被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断するステップと、を含み、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーの検出と被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーの検出は同時に行われる方法に関する。
【0025】
本願の１つの特定実施形態では、本願は、中枢神経系疾患を診断するシステムであって、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する第１検出モジュールと、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する第２検出モジュールと、第１検出モジュール及び第２検出モジュールのそれぞれによって取得された中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーの検出結果に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断する診断モジュールと、を含むシステムに関する。
【0026】
本願の１つの特定実施形態では、本願は、中枢神経系疾患を診断するシステムであって、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する第１検出モジュールと、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する第２検出モジュールと、第１検出モジュール及び第２検出モジュールのそれぞれによって取得された中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーの検出結果に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断する診断モジュールと、を含むシステムに関する。前記第１検出モジュール及び前記第２検出モジュールは被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーの検出と被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーの検出とを同時に行い、又は前記第１検出モジュール及び前記第２検出モジュールは、同一モジュールとして、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーと被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを同時に検出する。
【0027】
前記の通り、本願の方法及びシステムにおいて、本発明者らは新しい方法及びシステムを開発し、すなわち、異なる作用を有する二重マーカー及び／又は多重マーカーを用いて検出し、特にこのような二重マーカー及び／又は多重マーカーを用いて同時検出を行うことができ、これにより、末梢体液だけでも中枢神経系疾患を効果的に検出することができる。このような検出方法及びシステムでは、患者の脳脊髄液を抽出する必要がないため、患者のサンプリングのリスクを大幅に低減させる。また、中枢系由来のマーカーと検出対象疾患に関連するマーカーを標識する二重標識及び／又は多重標識を採用するため、検出精度を大幅に向上させ、さらに同時検出を行うと、全体の検出効率を高めることもできる。一方、従来の他の方法では、診断用の生体サンプルを取得するのに複雑な抽出、濃縮や精製ステップなどが必要である。本願は、操作ステップを簡素化し、中枢神経系由来のマーカーを革新的に利用して由来を表記し、疾患関連マーカーと組み合わせることにより、疾患検出の精度や効率の向上を図る。
【0028】
さらに、本願の方法は、被験者の生体体液を取得して前処理し、生体体液中の生体サンプルを濃縮するステップをさらに含み、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出することは、被験者の濃縮生体サンプル中の中枢神経系由来マーカーを検出することであり、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出することは被験者の濃縮生体サンプル中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出することである。
【0029】
さらに、本願の方法は、中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの数を統計するステップ、及び／又は中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの粒径を測定するステップと、前記生体サンプルの数及び／又は前記生体サンプルの粒径に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断するステップと、をさらに含む。具体的には、通常、中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルは二重陽性生体サンプルと呼ばれ、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かは二重陽性生体サンプルの数及び／又は粒径に基づいて診断される。
【0030】
さらに、本願のシステムは、被験者の生体体液を取得して前処理し、生体体液中の生体サンプルを濃縮する濃縮モジュールをさらに含み、第１検出モジュール及び第２検出モジュールは被験者の濃縮生体サンプル中の中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーを検出する。
【0031】
さらに、本願のシステムは、中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの数を統計する数量統計モジュール、及び／又は、中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの粒径を測定する粒径測定モジュールと、前記生体サンプルの数及び／又は前記生体サンプルの粒径に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断する診断モジュールと、をさらに含む。具体的には、通常、中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルは二重陽性生体サンプルと呼ばれ、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かは二重陽性生体サンプルの数及び／又は粒径に基づいて診断される。
【0032】
本願はまた、中枢神経系由来マーカーを標的とする抗体と、中枢神経系疾患関連マーカーを標的とする抗体と、を含む中枢神経系疾患を検出する組成物に関する。
【0033】
本願はまた、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬と、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬と、を含む被験者の中枢神経系疾患を検出するキットに関する。
【0034】
１つの特定実施形態では、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬及び被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬は本願に記載の上記組成物である。
【0035】
１つの特定実施形態では、前記被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬は中枢神経系由来マーカーを標的とするプライマー又はプローブであり、前記被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬は中枢神経系疾患関連マーカーを標的とするプライマー又はプローブである。
【0036】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、生体体液は血液、血清、血漿、唾液、尿、リンパ液、精液又は乳汁である。好ましい生体体液は血液、血清、血漿、唾液又は尿である。被験者の生体体液を取得する方法は当業者に公知の任意の方法であってもよい。当業者は選択される生体体液の取得方法によって被験者から取得してもよい。
【0037】
１つの特定実施形態では、本願の生体サンプルは細胞外小胞である。本明細書に係る細胞外の小胞（ＥＶ：Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ、細胞外小胞とも呼ばれる）は、細胞膜から脱落した又は細胞から分泌された二重膜構造の小胞状の小体であり、直径が４０ｎｍ～１０００ｎｍである。細胞外小胞は主に微小小胞体（ＭＶ：Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）とエクソソーム（Ｅｘ：Ｅｘｏｓｏｍｅｓ）から構成され、微小小胞体は細胞の活性化、損傷又はアポトーシス後に細胞膜から脱落した直径約１００ｎｍ～１０００ｎｍの微小小胞である。エクソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅｓ）は細胞内の多胞体（Ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｂｏｄｉｅｓ）が細胞膜と融合してエクソソームの形態として細胞外に放出され、直径が約３０～１５０ｎｍであり、多くの異なるタイプの細胞により放出され、細胞間通信、抗原提示、タンパク質や核酸移動など、様々な細胞機能を発揮することができる。細胞外小胞は細胞培養上清及び各種の体液（血液、リンパ液、唾液、尿、精液、乳汁）に広く存在しており、細胞由来の複数の関連タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ｍＲＡＮ、ｍｉＲＮＡなどを持っており、細胞間通信、細胞移動、血管新生や免疫調節などのプロセスに関与する。１つの特定実施形態では、好ましくは、前記細胞外小胞はニューロン由来の細胞外小胞、アストロサイト由来の細胞外小胞、オリゴデンドロサイト由来の細胞外小胞又はミクログリア由来の細胞外小胞である。
【0038】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、被験者の生体体液を取得して前処理し、生体体液中の生体サンプルを濃縮し、特に細胞外小胞を取得する方法は遠心分離、超遠心分離、限外ろ過管によるろ過、重合沈降又は特異的抗体捕捉であってもよい。本明細書では、遠心分離、超遠心分離、限外ろ過管によるろ過、重合沈降又は特異的抗体捕捉は全て当業者が理解できる意味であり、当業者は取得対象の細胞外小胞によって適切な方法を選択してもよい。
【0039】
本願の方法又はシステムの一実施形態では、超遠心分離方法を用いて、生体体液から細胞外小胞、特にニューロン由来の細胞外小胞、アストロサイト由来の細胞外小胞、オリゴデンドロサイト由来の細胞外小胞又はミクログリア由来の細胞外小胞を濃縮する。
【0040】
本願の方法又はシステムの一実施形態では、通常の遠心分離又は限外ろ過管によるろ過によって、細胞外小胞、特にニューロン由来の細胞外小胞、アストロサイト由来の細胞外小胞、オリゴデンドロサイト由来の細胞外小胞又はミクログリア由来の細胞外小胞を濃縮する。
【0041】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、中枢神経系疾患は脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上である。
【0042】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含む。さらに、前記変性性痴呆はアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉痴呆症（ＦＴＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含み、前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む。
【0043】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系疾患はアルツハイマー病である。
【0044】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系疾患はパーキンソン病である。
【0045】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカー及び／又は中枢神経系疾患関連マーカーはそれぞれタンパク質、核酸、脂質から選択される１種又は２種又は３種類である。
【0046】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーは全てタンパク質である。
【0047】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーは全て核酸である。
【0048】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーは全て脂質である。
【0049】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカーはタンパク質であり、中枢神経系疾患関連マーカーは核酸である。
【0050】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカーは核酸であり、中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質である。
【0051】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカーはタンパク質であり、中枢神経系疾患関連マーカーは脂質である。
【0052】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカーは核酸であり、中枢神経系疾患関連マーカーは脂質である。
【0053】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカーは脂質であり、中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質である。
【0054】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカーは脂質であり、中枢神経系疾患関連マーカーは核酸である。
【0055】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカーは、ニューロン又は細胞として、成熟ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ミクログリア、未成熟ニューロン、シュワン細胞、放射状グリア細胞、中間型前駆細胞、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンに由来するバイオマーカーである。本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、好ましくは、中枢神経系由来マーカーはニューロン由来のバイオマーカーである。本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、好ましくは、中枢神経系由来マーカーはアストロサイト及び／又はオリゴデンドロサイト由来のバイオマーカーである。
【0056】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカーは中枢神経系由来の細胞外小胞の表面に位置するマーカーである。
【0057】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来のマーカーは、Ｇタンパク質共役型受容体１６２（ＧＰＲ１６２：Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １６２）、過分極活性化環状ヌクレオチドゲートカリウムチャネル１（ＨＣＮ１：Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｙｃｌｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－Ｇａｔｅｄ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ １）、γ－アミノ酪酸Ａ型受容体サブユニットδ（ＧＡＢＲＤ：Ｇａｍｍａ－Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｙｐｅ Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｄｅｌｔａ）、ニューロリギン３（ＮＬＧＮ３：Ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ ３）、ＳＨＩＳＡ９、コンタクチン－１（ＣＮＴＮ１：ｃｏｎｔａｃｔｉｎ－１）、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、ニューロフィラメント－Ｌ（ＮＦ－Ｌ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｌｉｇｈｔ）、ニューロフィラメント－Ｍ（ＮＦ－Ｍ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ）、ニューロフィラメント－Ｈ（ＮＦ－Ｈ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｈｅａｖｙ）、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、シンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）、ＰＳＤ９５、Ｌ１ＣＡＭ、ダブルコルチン（ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）、β３－チューブリン（ｂｅｔａ ＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ）、ＮｅｕｒｏＤ１、ＴＢＲ１、スタスミン１（ｓｔａｔｈｍｉｎ １）、ＭＰＺ、ＮＣＡＭ、ＧＡＰ４３、Ｓ１００、ＣＮＰ酵素（ＣＮＰａｓｅ）、ｏｌｉｇ １、ｏｌｉｇ ２、ｏｌｉｇ ３、ＭＢＰ、ＯＳＰ、ＭＯＧ、ＳＯＸ１０、ＮＧ２、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ（ＥＡＡＴ１）、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、Ｓ１００－β、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、Ｉｂａ１、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ４０、ビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）、ＰＡＸ６、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、ＴＮ－Ｃ、Ｎカドヘリン（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＳＯＸ２、ＴＢＲ２、ＭＡＳＨ１（Ａｓｃｌ１）、ｖＧｌｕＴ１、ｖＧｌｕＴ２、ＮＭＤＡＲ、グルタミナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ＧＡＢＡ トランスポータ１（ＧＡＴ１：ＧＡＢＡ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体１（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体２（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ：ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、ドーパミントランスポータ（ＤＡＴ：ｄｏｐａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、ＦＯＸＡ２、ＧＩＲＫ２、Ｎｕｒｒ１、ＬＭＸ１Ｂ、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、セロトニントランスポータ（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、Ｐｅｔ１、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ：ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、小胞アセチルコリントランスポータ（ＶＡＣｈＴ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ：ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ））から選択される１種又は２種以上である。
【0058】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカーはＬ１ＣＡＭ、ＳＨＩＳＡ９、ＣＮＰ酵素、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）から選択される１種又は２種以上である。これらのマーカーのうち、Ｌ１ＣＡＭ及びＳＨＩＳＡ９はニューロン由来のバイオマーカーであり、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）はアストロサイト由来のバイオマーカーであり、ＣＮＰ酵素はオリゴデンドロサイト由来のバイオマーカーである。
【0059】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、成熟ニューロン由来のバイオマーカーはＬ１ＣＡＭ、ＳＨＩＳＡ９、コンタクチン－１（ＣＮＴＮ１：ｃｏｎｔａｃｔｉｎ－１）、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、ニューロフィラメント－Ｌ（ＮＦ－Ｌ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｌｉｇｈｔ）、ニューロフィラメント－Ｍ（ＮＦ－Ｍ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ）、ニューロフィラメント－Ｈ（ＮＦ－Ｈ：ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｈｅａｖｙ）、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、シンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）、ＰＳＤ９５などを含む。
【0060】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、オリゴデンドロサイト（Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）由来のバイオマーカーは、ＣＮＰ酵素（ＣＮＰａｓｅ）、ｏｌｉｇ １、ｏｌｉｇ ２、ｏｌｉｇ ３、ＭＢＰ、ＯＳＰ、ＭＯＧ、ＳＯＸ１０、ＮＧ２などを含む。本明細書では、ＣＮＰ酵素は２’,３’－環状ヌクレオチド３’－ホスホジエステラーゼである。
【0061】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、アストロサイト（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）由来のバイオマーカーはＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ（ＥＡＡＴ１）、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、Ｓ１００－β、ＡＬＤＨ１Ｌ１などを含む。本明細書では、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）はグルタミン酸トランスポータ１である。ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）は中枢神経系内のアストロサイト特異的グルタミン酸トランスポータであり、アストロサイトのマーカーの１つである。
【0062】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、ミクログリア（Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）由来のバイオマーカーはＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、Ｉｂａ１、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ４０などを含む。
【0063】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、未成熟ニューロン（Ｉｍｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｎｓ）由来のバイオマーカーはダブルコルチン（ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）、β３－チューブリン（ｂｅｔａ ＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ）、ＮｅｕｒｏＤ１、ＴＢＲ１、スタスミン１（ｓｔａｔｈｍｉｎ １）などを含む。
【0064】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、シュワン細胞（Ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌｓ）由来のバイオマーカーはＭＰＺ、ＮＣＡＭ、ＧＡＰ４３、Ｓ１００などを含む。
【0065】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、放射状グリア細胞（Ｒａｄｉａｌ ｇｌｉａ）由来のバイオマーカーはビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）、ＰＡＸ６、ＨＥＳ１、ＨＥＳ５、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、ＴＮ－Ｃ、Ｎカドヘリン（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＳＯＸ２などを含む。
【0066】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、中間型前駆細胞（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）由来のバイオマーカーはＴＢＲ２、ＭＡＳＨ１（Ａｓｃｌ１）などを含む。
【0067】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、グルタミン酸作動性ニューロン（Ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）由来のバイオマーカーはｖＧｌｕＴ１、ｖＧｌｕＴ２、ＮＭＤＡＲ、グルタミナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）などを含む。
【0068】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）由来のバイオマーカーはＧＡＢＡ トランスポータ１（ＧＡＴ１：ＧＡＢＡ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体１（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、ＧＡＢＡＢ 受容体２（ＧＡＢＡＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７などを含む。
【0069】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、ドーパミン作動性ニューロン（Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）由来のバイオマーカーはチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ：ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、ドーパミントランスポータ（ＤＡＴ：ｄｏｐａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、ＦＯＸＡ２、ＧＩＲＫ２、Ｎｕｒｒ１、ＬＭＸ１Ｂなどを含む。
【0070】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、セロトニン作動性ニューロン（Ｓｅｒｏｔｏｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）由来のバイオマーカーはトリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、セロトニントランスポータ（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、Ｐｅｔ１などを含む。
【0071】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、コリン作動性ニューロン（Ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）由来のバイオマーカーはコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ：ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、小胞アセチルコリントランスポータ（ＶＡＣｈＴ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ：ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）などを含む。
【0072】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、前記タンパク質は、Ａβ１－４０（Ａβ４０）タンパク質、Ａβ１－４２（Ａβ４２）タンパク質、オリゴマーＡβ（ｏｌｉｇｏ－Ａβ：ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）タンパク質、ｔａｕタンパク質、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質、α－シヌクレインタンパク質（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質）、１２９位リン酸化α－シヌクレイン（ｐＳ１２９）タンパク質、オリゴマーα－シヌクレイン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ, ｏｌｉｇｏ－α－ｓｙｎ）タンパク質、プリオンタンパク質から選択される１種又は２種以上である。
【0073】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、アルツハイマー病（ＡＤ）に関連するバイオマーカーは、Ａβ１－４０（Ａβ４０）タンパク質、Ａβ１－４２（Ａβ４２）タンパク質、オリゴマーＡβ（ｏｌｉｇｏ－Ａβ：ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）タンパク質、ｔａｕタンパク質、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質を含むが、これらに限定されない。
【0074】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、パーキンソン病（ＰＤ）及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、およびレビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含むパーキンソン症候群に関連するバイオマーカーは、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質、１２９位リン酸化α－シヌクレイン（ｐＳ１２９）タンパク質、オリゴマーα－シヌクレイン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ, ｏｌｉｇｏ－α－ｓｙｎ）タンパク質、ｔａｕタンパク質、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質を含むが、これらに限定されない。α－シヌクレインタンパク質（α－ｓｙｎタンパク質）はレビー小体（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ）の主なタンパク質成分であり、多くの研究から明らかなように、パーキンソン病の発症に緊密に関連している。
【0075】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、プリオン病に関連するバイオマーカーはプリオンタンパク質である。
【0076】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系疾患関連マーカーは核酸であり、前記核酸は、アルツハイマー病（ＡＤ）のバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡ、パーキンソン病（ＰＤ）及びパーキンソン症候群（例えば、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ））のバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡから選択される１種又は２種以上である。
【0077】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記ＡＤのバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡは、遺伝子ＵＢＡＰ２Ｌ、ＹＢＸ１、ＳＥＲＦ２、ＵＢＥ２Ｂ、ＲＰＬ１０Ａ、Ｈ３Ｆ３ＡＰ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＮＭＤ３、ＲＮＦ７、ＲＰＬＰ０、ＳＰＡＲＣ、ＷＴＡＰ、ＨＮＲＮＰＵ、ＬＩＮＣ００２６５、ＩＮＭＴ、ＳＬＣ３５Ｅ２、ＣＴ６０、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＲＧＳ２、ＳＭＣ６、ＡＲＳＡ、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＭＩＭ１７、ＴＲＡＦ３ＩＰ２－ＡＳ１、ＫＣＮＣ２、ＳＬＣ２４Ａ１、ＨＬＣＳ、ＧＯＳＲ１、ＭＮ１、ＭＧＡＴ５、ＮＢＰＦ１４、ＦＢＸＯ３１、ＷＤＲ５２、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＺＮＦ６４８、ＮＢＰＦ１６、ＰＡＧＲ１、ＡＱＰ２、ＰＲＫＣＩ、ＳＣＮ２Ｂ、ＤＰＹＳＬ３、ＴＭＥＭ２６、ＴＳＰＡＮ１１、ＥＬＬ２、ＦＡＭ１８６Ａ、ＣＤ５９、ＴＨＳＤ４、ＧＯＬＧＡ６Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ５、ＰＫＤ１、ＢＰＴＦ、ＦＬＧ、ＰＯＭ１２１Ｌ１０Ｐ、ＮＸＰＨ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＳＨ３ＴＣ２、ＧＧＣＸ、及びＧＲＥＢ１に関連するＤＮＡ又はＲＮＡを含む。被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬は中枢神経系由来マーカーを標的とするプライマー又はプローブであり、上記ＤＮＡ又はＲＮＡを標的とするプライマー又はプローブである。
【0078】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記ＰＤのバイオマーカーであるＤＮＡ又はＲＮＡは、遺伝子ＢＬＯＣ１Ｓ１、ＵＢＥ２Ｌ３、ＲＮＦ１４９、ＦＡＭ８９Ｂ、ＬＣＥ６Ａ、ＮＴ５ＤＣ２、ＰＰＰ１ＣＣ、ＣＣＬ５、ＨＤＬＢＰ、ＨＮＲＮＰＡＢ、ＮＸＮ、ＳＬＣ９Ａ４、ＥＩＦ２ＡＫ１、ＰＡＰＯＬＡ、ＴＲＩＭ５０、ＳＩＸ４、ＲＡＢ３ＩＰ、ＶＡＮＧＬ２、ＤＨＲＳＸ、ＦＯＸＰ４、ＳＹＮＭ、ＺＮＦ５４３、ＡＴＦ６、ＬＯＣ１００１３２８３２、及びＢＬＯＣ１Ｓ１－ＲＤＨ５に関連するＤＮＡ又はＲＮＡを含む。被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬は中枢神経系由来マーカーを標的とするプライマー又はプローブであり、上記ＤＮＡ又はＲＮＡを標的とするプライマー又はプローブである。
【0079】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカーはタンパク質であり、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系由来マーカーに特異的に反応する標識抗体と反応させることと、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系由来マーカーの存在及び含有量を判断することとを含み、前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系疾患関連マーカーに特異的に反応する標識抗体と反応させることと、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系疾患関連マーカーの存在及び含有量を判断することとを含む。さらに、特定実施形態では、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系由来マーカーに特異的に反応する標識抗体と、中枢神経系疾患関連マーカーに特異的に反応する標識抗体との両方と反応させ、これにより、二重マーカー及び／又は多重マーカー陽性細胞外小胞を効率的に追跡することができる。
【0080】
さらに、本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプル（例えば細胞外小胞）の数を統計する、及び／又は中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプル（例えば細胞外小胞）の粒径を測定するステップをさらに含み、これにより、二重マーカー及び／又は多重マーカー陽性生体サンプル、例えば細胞外小胞を追跡した後、このような生体サンプルの数及び／又はその粒径を十分に考慮して、これらの指標の結果と組み合わせて被験者の罹患リスクを分析することができる。
【0081】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記標識は蛍光標識、同位体標識、酵素標識、化学発光剤標識、量子ドット標識又は金コロイド標識から選択される１種又は２種以上である。
【0082】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、蛍光標識物はＱｄｏｔ５２５、Ｑｄｏｔ５４５、Ｑｄｏｔ５６５、Ｑｄｏｔ５８５、Ｑｄｏｔ６０５、Ｑｄｏｔ６２５、Ｑｄｏｔ６５５、Ｑｄｏｔ７０５、Ｑｄｏｔ８００、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ ４０５、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ ５３２、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ ５６８、Ａｌｅｘａ ５９４、Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ７００、Ａｌｅｘａ７５０から選択される１種又は２種以上である。
【0083】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、同位体標識、酵素標識、化学発光剤標識、量子ドット標識又は金コロイド標識は全て当業者に公知の方法を用いてもよい。
【0084】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカーは核酸であり、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を溶解し、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はシーケンシング技術によって中枢神経系由来の核酸の存在及び含有量を検出することを含み、前記中枢神経系疾患関連マーカーは核酸であり、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出するステップは、被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を溶解し、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はシーケンシング技術によって中枢神経系疾患に関連する核酸の存在及び含有量を検出することを含む。さらに、特定実施形態では、好ましくは、被験者の細胞外小胞について、ＤＮＡ及びＲＮＡプローブを利用して中枢神経系由来の核酸の存在及び含有量と中枢神経系疾患に関連する核酸の存在及び含有量を同時に検出することによって、二重マーカー及び／又は多重マーカー陽性細胞外小胞を効率的に追跡する。
【0085】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系由来マーカーの存在及び含有量を判断することは、例えばイムノアッセイを採用してもよく、例えばＥＬＩＳＡ、Ｌｕｍｉｎｅｘ、ＭＳＤ、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ、ｅＣＬ８０００、Ｃｏｂａｓはタンパク質バイオマーカーを測定するのに好適な方法である。
【0086】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの数を統計する、及び／又は中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの粒径を測定する検出装置は、粒度計（Ｇｒａｎｕｌｏｍｅｔｅｒ）、ナノフローサイトメータを含むが、これらに限定されない。例えば、ナノ粒子追跡技術を用いて細胞外小胞の粒径を検出し、ナノフロー分析技術を用いて上記二重陽性細胞外小胞の数を検出する。
【0087】
本願の方法、システム、組成物又はキットの特定実施形態では、核酸をバイオマーカーとする場合、核酸バイオマーカーを測定するに先立って、生体体液又は細胞外小胞を溶解する必要がある。核酸検出は当業者に公知の任意の方法、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ、又は公知のいずれかのシーケンシング技術によって行われてもよい。
【0088】
本願の１つの特定実施形態では、中枢神経系由来マーカーを標的とする抗体と、中枢神経系疾患関連マーカーを標的とする抗体と、を含む中枢神経系疾患を検出する組成物に関する。
【0089】
本願の１つの特定実施形態では、前記中枢神経系由来マーカーを標的とする抗体及び前記中枢神経系疾患関連マーカーを標的とする抗体は標識抗体であり、好ましくは、前記標識は蛍光標識、同位体標識、酵素標識、化学発光剤標識、量子ドット標識又は金コロイド標識から選択される１種又は２種以上である。
【0090】
本願の１つの特定実施形態では、中枢神経系疾患を検出する組成物であって、ＳＨＩＳＡ９タンパク質を標的とする抗体と、リン酸化ｔａｕ２１７（ｐ－ｔａｕ２１７）タンパク質を標的とする抗体と、を含む。
【0091】
本願の１つの特定実施形態では、中枢神経系疾患を検出する組成物であって、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）タンパク質を標的とする抗体と、ｔａｕタンパク質を標的とする抗体と、を含む。本願の１つの特定実施形態では、中枢神経系疾患を検出する組成物は、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）タンパク質を標的とする抗体と、α－シヌクレインタンパク質（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質）を標的とする抗体と、を含む。本願の１つの特定実施形態では、中枢神経系疾患を検出する組成物であって、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）タンパク質を標的とする抗体と、オリゴマーα－シヌクレイン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ, ｏｌｉｇｏ－α－ｓｙｎ）タンパク質を標的とする抗体と、を含む。本願の１つの特定実施形態では、中枢神経系疾患を検出する組成物であって、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）タンパク質を標的とする抗体と、１２９位リン酸化α－シヌクレイン（ｐＳ１２９）タンパク質を標的とする抗体と、を含む。本願の１つの特定実施形態では、中枢神経系疾患を検出する組成物であって、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）タンパク質を標的とする抗体と、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質を標的とする抗体と、を含む。
【0092】
本願の１つの特定実施形態では、中枢神経系疾患を検出する組成物であって、ＣＮＰ酵素（ＣＮＰａｓｅ）を標的とする抗体と、ｔａｕタンパク質を標的とする抗体と、を含む。本願の１つの特定実施形態では、中枢神経系疾患を検出する組成物であって、ＣＮＰ酵素（ＣＮＰａｓｅ）を標的とする抗体と、α－シヌクレインタンパク質（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質）を標的とする抗体と、を含む。
【0093】
本願は、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬と、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬とを含む、被験者の中枢神経系疾患を検出するキットに関する。前記被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬及び被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬は本願の上記組成物である。
【0094】
本願は、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬と、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬とを含む、被験者の中枢神経系疾患を検出するキットに関する。前記被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬は中枢神経系由来マーカーを標的とするプライマー又はプローブであり、前記被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬は中枢神経系疾患関連マーカーを標的とするプライマー又はプローブである。
【0095】
本願に係るキットでは、被験者の生体サンプルを取得する試薬と装置、好ましくは、被験者の細胞外小胞を取得する試薬と装置をさらに含む。細胞外小胞を取得する試薬と装置は当業者に公知の一般的なキットと装置を含んでもよい。
【0096】
本願の方法、システム、キット及び組成物によれば、被験者の末梢体液だけで被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断することができる。例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多系統萎縮症などの疾患の診断や鑑別診断を効果的に行い、健常対照や他の疾患と効果的に区別することができる。
【0097】
本願の方法、システム、キット及び組成物によれば、末梢体液から中枢神経系疾患変化を反映できるバイオマーカーを効果的に濃縮し、かつ特異的に標識することができ、末梢体液中の疾患関連マーカーを直接検出する場合よりも、診断効果がより高い。例えば、Ｌ１ＣＡＭタンパク質、ＳＨＩＳＡ９タンパク質、ＧＬＴ１タンパク質、ＣＮＰａｓｅタンパク質などの中枢神経系由来の細胞外小胞バイオマーカーを生かして、中枢神経系疾患変化を反映できるバイオマーカーと組み合わせることができ、そして、好ましい形態では、Ｌ１ＣＡＭタンパク質、ＳＨＩＳＡ９タンパク質、ＧＬＴ１タンパク質、ＣＮＰａｓｅタンパク質などの中枢神経系由来の細胞外小胞バイオマーカーとＡβ１－４０タンパク質、Ａβ１－４２タンパク質、オリゴマーＡβ（ｏｌｉｇｏ－Ａβ）タンパク質、ｔａｕタンパク質、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質、α－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）タンパク質などの中枢神経系疾患変化を反映できるバイオマーカーと、を同時に検出し、同時検出結果に基づいて診断を行うことができる。２種のマーカーの二重陽性細胞外小胞の数及び／又はこのような細胞外小胞の粒径を同時に検出して診断を行ってもよい。例えば２種のマーカーの二重陽性細胞外小胞の、あるマーカー陽性細胞外小胞又は細胞外小胞の総数に対する比を補助として算出してもよく、これにより、診断効果をさらに高めることができる。
【0098】
本願の方法、システム、キット及び組成物によれば、末梢体液を効果的に利用して検出を行い、これによって、被験者の脳脊髄液を侵襲的に取得することを回避し、被験者からのサンプリングのリスクを大幅に低減させ、検出し難さを大幅に低減させ、検出の臨床的な使用及び普及を大きく促進する。本願の方法、システム、キット及び組成物によれば、中枢神経系由来マーカーと疾患関連マーカーを同時に検出することができ、サンプルの検出時間を短縮させ、より効率的かつ簡便にする。
【0099】
本願の方法、システム、組成物又はキットによれば、ＳＨＩＳＡ９タンパク質とリン酸化ｔａｕ２１７（ｐ－ｔａｕ２１７）タンパク質を二重マーカーとして検出を効果的に行うことで、アルツハイマー病患者を健常人群と区別することができる。
【0100】
本願の方法、システム、組成物又はキットによれば、ＧＬＴ１タンパク質とα－ｓｙｎタンパク質を二重マーカーとして検出を効果的に行うことで、パーキンソン病患者、多系統萎縮症患者を健常人群と区別することができる。
【0101】
本願の方法、システム、組成物又はキットによれば、ＣＮＰａｓｅタンパク質とα－ｓｙｎタンパク質を二重マーカーとして検出を効果的に行うことで、パーキンソン病患者、多系統萎縮症患者を健常人群と区別することができる。
【実施例】
【0102】
実験方法１：
（ａ）末梢体液前処理－細胞外小胞の超遠心分離及び濃縮
１． 被験者由来の血漿を３７℃恒温インキュベータで１０～１５分間溶解し、均一にボルテックス混合する。
２． ４℃の条件下で、１０,０００ｇ回転数の遠心分離を３０分間行う。
３． 遠心分離後の血漿１００μＬを超遠心分離管に吸引し、ＰＢＳ緩衝液（０．２２μｍろ過）９００μＬを加え、均一に混合する。
４． ４℃の条件下で、１００,０００ｇ回転数の超遠心分離を１時間行う。
５． 上清を捨てて、約１００μＬの沈殿を残す。
６． ＰＢＳ緩衝液（０．２２μｍろ過）２００μＬを加え、２００μＬピペットで２００回ピペッティングし、再懸濁させる。
７． 再懸濁液体にＰＢＳ緩衝液（０．２２μｍろ過）７００μＬを加え、均一に混合する。
８． ４℃の条件下で、１００,０００ｇ回転数の超遠心分離を１時間行う。
９． 上清を捨てて、約５０μＬの沈殿を残す。
１０． ＰＢＳ緩衝液（０．２２μｍろ過）１００μＬを加え、２００μＬピペットを用いて２００回ピペッティングし、再懸濁させ、使用時まで保管する。
（ｂ）標識方法によるバイオマーカー検出用の抗体の標識
使用される試薬：
Ａｌｅｘａ蛍光標識を用いて、中枢神経系由来の細胞外小胞バイオマーカーを標的とする抗体とアルツハイマー病バイオマーカーを標的とする抗体を標識する。中枢神経系由来の細胞外小胞バイオマーカーを標的とする抗体はＳＨＩＳＡ９ポリクローナル抗体である。アルツハイマー病バイオマーカーを標的とする抗体はｐ－ｔａｕ２１７ポリクローナル抗体である。ここで、標識した試薬について、ＳＨＩＳＡ９ポリクローナルの抗体標識は、Ｚｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４０５として購入され、ｐ－ｔａｕ２１７ポリクローナルの抗体標識はＺｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８として購入される。
１． サンプルのブロック
１．１ 上記方法によって超遠心分離した細胞外小胞１０μＬを１．５ｍＬ遠心分離管又はＰＣＲ管に入れる。
１．２ 等体積の２％ＢＳＡ溶液（０．２２μｍろ過）を加え、均一に混合する。
１．３ 室温でインキュベートして１時間ブロックする。
１．４ ＰＢＳ緩衝液（０．２２μｍろ過）１０μＬを加え、ブロック後のサンプルを希釈する。
２． サンプルの標識
本実験は神経特異的マーカー抗体ＳＨＩＳＡ９、疾患関連マーカー抗体ｐ－ｔａｕ２１７に関し、Ｚｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４０５によりＳＨＩＳＡ９を標識し、Ｚｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８によりｐ－ｔａｕ２１７を標識する。
２．１ ＰＢＳ緩衝液中の抗体（０．２μｇ／μＬを５μＬＰＢＳに）１μｇを用意する。
２．２ 染料５μＬを抗体（１μｇ）に加え、均一に混合した後、室温（２５℃）、遮光下２０分間インキュベートする。
２．３ ３．２ステップの溶液に遮断剤（ＩｇＧ遮断剤を１μｇ／μＬに希釈したもの）３μＬ（３μｇ）を加え、均一に混合した後、室温（２５℃）、遮光下１０分間インキュベートする。
２．４ ＰＢＳ緩衝液（０．２２μｍろ過）を用いて上記混合物を全体積５０μＬまで希釈する。
２．５ Ｚｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８標識ｐ－ｔａｕ２１７ ５μＬをステップ（ａ）で製造されたサンプルに加え、均一に混合した後、室温（２５℃）、遮光下５分間インキュベートする。
２．６ Ｚｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４０５標識ＳＨＩＳＡ９ ３μＬをステップ２．５のサンプルに加え、均一に混合した後、４℃、遮光下一晩インキュベートする。
３． サンプルの固定化
３．１ 標識サンプルに４％ＰＦＡ ２０μＬを加え、均一に混合した後、室温（２５℃）、遮光下２０分間インキュベートする。
３．２ ＰＢＳ緩衝液（０．２２μｍろ過）１７０μＬを用いて、固定化後のサンプルを希釈し、使用時まで保管する。
（ｃ）検出
ＮａｎｏＦＣＭナノフローアナライザによって、標識シグナル強度と粒径分布を検出し、関連するバイオマーカーの存在及び含有量を確認する。
（ａ）末梢体液前処理－細胞外小胞の超遠心分離及び濃縮
１． 被験者由来の血漿を３７℃恒温インキュベータで１０～１５分間溶解し、均一にボルテックス混合する。
２． ４℃の条件下で、１０,０００ｇ回転数の遠心分離を３０分間行う。
３． 遠心分離後の血漿１００μＬを超遠心分離管に吸引し、ＰＢＳ緩衝液（０．２２μｍろ過）９００μＬを加え、均一に混合する。
４． ４℃の条件下で、１００,０００ｇ回転数の超遠心分離を１時間行う。
５． 上清を捨てて、約１００μＬの沈殿を残す。
６． ＰＢＳ緩衝液（０．２２μｍろ過）２００μＬを加え、２００μＬピペットで２００回ピペッティングし、再懸濁させる。
７． 再懸濁液体にＰＢＳ緩衝液（０．２２μｍろ過）７００μＬを加え、均一に混合する。
８． ４℃の条件下で、１００,０００ｇ回転数の超遠心分離を１時間行う。
９． 上清を捨てて、約５０μＬの沈殿を残す。
１０． ＰＢＳ緩衝液（０．２２μｍろ過）１００μＬを加え、２００μＬピペットを用いて２００回ピペッティングし、再懸濁させ、使用時まで保管する。
（ｂ）標識方法によるバイオマーカー検出用の抗体の標識
使用される試薬：
Ａｌｅｘａ蛍光標識を用いて、中枢神経系由来の細胞外小胞バイオマーカーを標的とする抗体とアルツハイマー病バイオマーカーを標的とする抗体を標識する。中枢神経系由来の細胞外小胞バイオマーカーを標的とする抗体はＳＨＩＳＡ９ポリクローナル抗体である。アルツハイマー病バイオマーカーを標的とする抗体はｐ－ｔａｕ２１７ポリクローナル抗体である。ここで、標識した試薬について、ＳＨＩＳＡ９ポリクローナルの抗体標識は、Ｚｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４０５として購入され、ｐ－ｔａｕ２１７ポリクローナルの抗体標識はＺｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８として購入される。
１． サンプルのブロック
１．１ 上記方法によって超遠心分離した細胞外小胞１０μＬを１．５ｍＬ遠心分離管又はＰＣＲ管に入れる。
１．２ 等体積の２％ＢＳＡ溶液（０．２２μｍろ過）を加え、均一に混合する。
１．３ 室温でインキュベートして１時間ブロックする。
１．４ ＰＢＳ緩衝液（０．２２μｍろ過）１０μＬを加え、ブロック後のサンプルを希釈する。
２． サンプルの標識
本実験は神経特異的マーカー抗体ＳＨＩＳＡ９、疾患関連マーカー抗体ｐ－ｔａｕ２１７に関し、Ｚｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４０５によりＳＨＩＳＡ９を標識し、Ｚｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８によりｐ－ｔａｕ２１７を標識する。
２．１ ＰＢＳ緩衝液中の抗体（０．２μｇ／μＬを５μＬＰＢＳに）１μｇを用意する。
２．２ 染料５μＬを抗体（１μｇ）に加え、均一に混合した後、室温（２５℃）、遮光下２０分間インキュベートする。
２．３ ３．２ステップの溶液に遮断剤（ＩｇＧ遮断剤を１μｇ／μＬに希釈したもの）３μＬ（３μｇ）を加え、均一に混合した後、室温（２５℃）、遮光下１０分間インキュベートする。
２．４ ＰＢＳ緩衝液（０．２２μｍろ過）を用いて上記混合物を全体積５０μＬまで希釈する。
２．５ Ｚｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８標識ｐ－ｔａｕ２１７ ５μＬをステップ（ａ）で製造されたサンプルに加え、均一に混合した後、室温（２５℃）、遮光下５分間インキュベートする。
２．６ Ｚｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４０５標識ＳＨＩＳＡ９ ３μＬをステップ２．５のサンプルに加え、均一に混合した後、４℃、遮光下一晩インキュベートする。
３． サンプルの固定化
３．１ 標識サンプルに４％ＰＦＡ ２０μＬを加え、均一に混合した後、室温（２５℃）、遮光下２０分間インキュベートする。
３．２ ＰＢＳ緩衝液（０．２２μｍろ過）１７０μＬを用いて、固定化後のサンプルを希釈し、使用時まで保管する。
（ｃ）検出
ＮａｎｏＦＣＭナノフローアナライザによって、標識シグナル強度と粒径分布を検出し、関連するバイオマーカーの存在及び含有量を確認する。
【0103】
実施例１
性別と年齢が一致するアルツハイマー病被験者（ＡＤ群）９８例、健常対照（ＣＴ群）１２例の血漿サンプルをそれぞれ採取し、上記実験方法１に従って実験を行った。
ＮａｎｏＦＣＭナノフローアナライザによって、ＳＨＩＳＡ９抗体単一蛍光標識、ｐ－ｔａｕ２１７抗体単一蛍光標識、ＳＨＩＳＡ９とｐ－ｔａｕ２１７抗体二重蛍光標識の細胞外小胞の数をそれぞれ検出し、細胞外小胞総数に対するこれらの比を算出し、各粒径範囲の場合の各群の差を分析した。
血漿中の単一標識ＳＨＩＳＡ９タンパク質陽性細胞外小胞の、細胞外小胞総数に対する比に関しては、６０～１００ｎｍの粒径、１００～１５０ｎｍの粒径、及び全粒径範囲では、ＡＤ群とＣＴ群のいずれにおいても、有意差が認められ（＊＊：ｐ＜０．０１）（図１Ａ）、血漿中の単一標識ｐ－ｔａｕ２１７タンパク質陽性細胞外小胞の、細胞外小胞総数に対する比に関しては、６０～１００ｎｍの粒径、及び全粒径範囲では、ＡＤ群とＣＴ群のいずれにおいても、非常に大きい有意差が認められ（＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）、１００～１５０ｎｍの粒径範囲では、ＡＤ群とＣＴ群において有意差が認められ（＊＊：ｐ＜０．０１）（図１Ｂ）、血漿中のＳＨＩＳＡ９タンパク質－ｐ－ｔａｕ２１７タンパク質二重陽性細胞外小胞の、細胞外小胞総数に対する比に関しては、１００～１５０ｎｍの粒径範囲、及び全粒径範囲では、ＡＤ群とＣＴ群のいずれにおいても、非常に大きい有意差が認められた（＊＊＊：ｐ＜０．００１）（図１Ｃ）。
受信者動作特性曲線（ＲＯＣ：ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）分析によって診断効率評価を行った結果、ＳＨＩＳＡ９タンパク質一重マーカーは、６０～１００ｎｍの粒径範囲での曲線下面積（ＡＵＣ：ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）が０．７４９であり、ＳＨＩＳＡ９タンパク質及びｐ－ｔａｕ２１７タンパク質二重マーカーは、１００～１５０ｎｍの粒径範囲でのＡＵＣが０．８９０であり、ロジスティック回帰分析Ｅｎｔｅｒ方法によってＳＨＩＳＡ９ ６０～１００ｎｍ及びＳＨＩＳＡ９＋ｐ－ｔａｕ２１７ １００～１５０ｎｍデータを導入すると、ＡＵＣは０．８９１（図１Ｄ）である。ｐ－ｔａｕ２１７タンパク質一重マーカーは、６０～１００ｎｍの粒径範囲でのＡＵＣが０．８７７であり、ＳＨＩＳＡ９タンパク質及びｐ－ｔａｕ２１７タンパク質二重マーカーは、１００～１５０ｎｍの粒径範囲でのＡＵＣが０．８９０であり、ロジスティック回帰分析Ｅｎｔｅｒ方法によってｐ－ｔａｕ２１７ ６０～１００ｎｍ及びＳＨＩＳＡ９＋ｐ－ｔａｕ２１７ １００～１５０ｎｍデータを導入すると、ＡＵＣは０．９１０（図１Ｅ）である。
実施例１の結果から、ＳＨＩＳＡ９タンパク質陽性細胞外小胞、ｐ－ｔａｕ２１７タンパク質陽性細胞外小胞、及びＳＨＩＳＡ９タンパク質－ｐ－ｔａｕ２１７タンパク質二重陽性細胞外小胞は、全てアルツハイマー病診断において、特にｐ－ｔａｕ２１７タンパク質陽性細胞外小胞とＳＨＩＳＡ９タンパク質＋ｐ－ｔａｕ２１７タンパク質二重陽性細胞外小胞とを併用して診断する場合、潜在力が高かった。
性別と年齢が一致するアルツハイマー病被験者（ＡＤ群）９８例、健常対照（ＣＴ群）１２例の血漿サンプルをそれぞれ採取し、上記実験方法１に従って実験を行った。
ＮａｎｏＦＣＭナノフローアナライザによって、ＳＨＩＳＡ９抗体単一蛍光標識、ｐ－ｔａｕ２１７抗体単一蛍光標識、ＳＨＩＳＡ９とｐ－ｔａｕ２１７抗体二重蛍光標識の細胞外小胞の数をそれぞれ検出し、細胞外小胞総数に対するこれらの比を算出し、各粒径範囲の場合の各群の差を分析した。
血漿中の単一標識ＳＨＩＳＡ９タンパク質陽性細胞外小胞の、細胞外小胞総数に対する比に関しては、６０～１００ｎｍの粒径、１００～１５０ｎｍの粒径、及び全粒径範囲では、ＡＤ群とＣＴ群のいずれにおいても、有意差が認められ（＊＊：ｐ＜０．０１）（図１Ａ）、血漿中の単一標識ｐ－ｔａｕ２１７タンパク質陽性細胞外小胞の、細胞外小胞総数に対する比に関しては、６０～１００ｎｍの粒径、及び全粒径範囲では、ＡＤ群とＣＴ群のいずれにおいても、非常に大きい有意差が認められ（＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）、１００～１５０ｎｍの粒径範囲では、ＡＤ群とＣＴ群において有意差が認められ（＊＊：ｐ＜０．０１）（図１Ｂ）、血漿中のＳＨＩＳＡ９タンパク質－ｐ－ｔａｕ２１７タンパク質二重陽性細胞外小胞の、細胞外小胞総数に対する比に関しては、１００～１５０ｎｍの粒径範囲、及び全粒径範囲では、ＡＤ群とＣＴ群のいずれにおいても、非常に大きい有意差が認められた（＊＊＊：ｐ＜０．００１）（図１Ｃ）。
受信者動作特性曲線（ＲＯＣ：ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）分析によって診断効率評価を行った結果、ＳＨＩＳＡ９タンパク質一重マーカーは、６０～１００ｎｍの粒径範囲での曲線下面積（ＡＵＣ：ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）が０．７４９であり、ＳＨＩＳＡ９タンパク質及びｐ－ｔａｕ２１７タンパク質二重マーカーは、１００～１５０ｎｍの粒径範囲でのＡＵＣが０．８９０であり、ロジスティック回帰分析Ｅｎｔｅｒ方法によってＳＨＩＳＡ９ ６０～１００ｎｍ及びＳＨＩＳＡ９＋ｐ－ｔａｕ２１７ １００～１５０ｎｍデータを導入すると、ＡＵＣは０．８９１（図１Ｄ）である。ｐ－ｔａｕ２１７タンパク質一重マーカーは、６０～１００ｎｍの粒径範囲でのＡＵＣが０．８７７であり、ＳＨＩＳＡ９タンパク質及びｐ－ｔａｕ２１７タンパク質二重マーカーは、１００～１５０ｎｍの粒径範囲でのＡＵＣが０．８９０であり、ロジスティック回帰分析Ｅｎｔｅｒ方法によってｐ－ｔａｕ２１７ ６０～１００ｎｍ及びＳＨＩＳＡ９＋ｐ－ｔａｕ２１７ １００～１５０ｎｍデータを導入すると、ＡＵＣは０．９１０（図１Ｅ）である。
実施例１の結果から、ＳＨＩＳＡ９タンパク質陽性細胞外小胞、ｐ－ｔａｕ２１７タンパク質陽性細胞外小胞、及びＳＨＩＳＡ９タンパク質－ｐ－ｔａｕ２１７タンパク質二重陽性細胞外小胞は、全てアルツハイマー病診断において、特にｐ－ｔａｕ２１７タンパク質陽性細胞外小胞とＳＨＩＳＡ９タンパク質＋ｐ－ｔａｕ２１７タンパク質二重陽性細胞外小胞とを併用して診断する場合、潜在力が高かった。
【0104】
実験方法２：
（ａ）末梢体液前処理－細胞外小胞の超遠心分離及び濃縮
１． 被験者の血漿を３７℃水浴にて１分間かけて急速に溶解し、４℃の条件下で２,０００ｇの遠心分離を１５ｍｉｎ行い、別の１．５ｍＬ遠心分離管に移した後、４℃で、１２,０００ｇの遠心分離を３０分間行う。
２． 血漿１００μＬを１．５ｍｌ超遠心分離管に移し、０．２２μｍろ過後のＰＢＳ ９００μＬを加えて希釈し、４℃で、１００,０００ｇの遠心分離を３０分間行う。
３． 上清８００μＬを慎重に捨てた後、等体積の０．２２μｍろ過後のＰＢＳを加え、均一に混合した後、さらに４℃で１００,０００ｇの遠心分離を３０分間行い、上清２００μＬを残し、ガンヘッドを用いて管壁を繰り返してピペッティングし、細胞外小胞を再懸濁させて均一に混合し、個包装して－８０℃で保存する。
４． 細胞外小胞２０μＬを１００ｋＤａ限外ろ過管に移し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ ２００μＬを加え、室温で３０分間インキュベートする。
５． 限外ろ過管を４℃で１２,０００ｇの遠心分離を３分間行い、０．２２μｍろ過後のＰＢＳ ２００μＬを加え、さらに遠心分離する。
６． 限外ろ過管に残った液体を新しい１．５ｍｌ遠心分離管に移し、使用時まで保管する。
（ｂ）標識方法によるバイオマーカー検出用の抗体の標識
Ａｌｅｘａ蛍光標識を用いて、中枢神経系由来の細胞外小胞バイオマーカーを標的とする抗体とアルツハイマー病バイオマーカーを標的とする抗体を標識する。中枢神経系由来の細胞外小胞バイオマーカーを標的とする抗体はＧＬＴ１モノクローナル抗体であり、パーキンソン病バイオマーカーを標的とする抗体はα－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）モノクローナル抗体（ｓｙｎ２１１及びＭＪＦＲ１４）である。ここで、標識した試薬について、ＧＬＴ１モノクローナル抗体の標識は、Ｚｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４０５として購入され、α－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）モノクローナル抗体の標識はＺｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８として購入される。
１． 製品の取扱書に従ってＺｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４０５キットを利用してＧＬＴ１抗体を標識する：５μＬ 蛍光二次抗体＋１μｇ ＧＬＴ１抗体を用いて、室温、遮光下５分間インキュベートした後、ＩｇＧ５μＬを加え、室温、避光下５分間インキュベートする。
２． サンプルごとにＧＬＴ１抗体０．２μｇを加え、室温、遮光下３０ｍｉｎインキュベートする。
３． 製品の取扱書に従ってＺｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８キットを使用してα－シヌクレインモノクローナル抗体（ｓｙｎ２１１又はＭＪＦＲ１４）を標識する：５μＬ 蛍光二次抗体＋１μｇ α－ｓｙｎ抗体を用いて、室温、遮光下５分間インキュベートした後、ＩｇＧ５μＬを加え、室温、遮光下５分間インキュベートする。
４． サンプルごとにα－ｓｙｎ抗体（ｓｙｎ２１１又はＭＪＦＲ１４）０．２μｇを加え、室温、遮光下３０ｍｉｎインキュベートする。
５． ０．２２μｍろ過後のＰＢＳを用いてサンプルを４００μＬまで希釈し、使用時まで保管する。
（ｃ）検出
Ａｐｏｇｅｅナノフローアナライザによって標識シグナル強度を検出し、末梢体液中の中枢神経系由来の疾患関連バイオマーカーの存在及び含有量を確認する。
（ａ）末梢体液前処理－細胞外小胞の超遠心分離及び濃縮
１． 被験者の血漿を３７℃水浴にて１分間かけて急速に溶解し、４℃の条件下で２,０００ｇの遠心分離を１５ｍｉｎ行い、別の１．５ｍＬ遠心分離管に移した後、４℃で、１２,０００ｇの遠心分離を３０分間行う。
２． 血漿１００μＬを１．５ｍｌ超遠心分離管に移し、０．２２μｍろ過後のＰＢＳ ９００μＬを加えて希釈し、４℃で、１００,０００ｇの遠心分離を３０分間行う。
３． 上清８００μＬを慎重に捨てた後、等体積の０．２２μｍろ過後のＰＢＳを加え、均一に混合した後、さらに４℃で１００,０００ｇの遠心分離を３０分間行い、上清２００μＬを残し、ガンヘッドを用いて管壁を繰り返してピペッティングし、細胞外小胞を再懸濁させて均一に混合し、個包装して－８０℃で保存する。
４． 細胞外小胞２０μＬを１００ｋＤａ限外ろ過管に移し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ ２００μＬを加え、室温で３０分間インキュベートする。
５． 限外ろ過管を４℃で１２,０００ｇの遠心分離を３分間行い、０．２２μｍろ過後のＰＢＳ ２００μＬを加え、さらに遠心分離する。
６． 限外ろ過管に残った液体を新しい１．５ｍｌ遠心分離管に移し、使用時まで保管する。
（ｂ）標識方法によるバイオマーカー検出用の抗体の標識
Ａｌｅｘａ蛍光標識を用いて、中枢神経系由来の細胞外小胞バイオマーカーを標的とする抗体とアルツハイマー病バイオマーカーを標的とする抗体を標識する。中枢神経系由来の細胞外小胞バイオマーカーを標的とする抗体はＧＬＴ１モノクローナル抗体であり、パーキンソン病バイオマーカーを標的とする抗体はα－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）モノクローナル抗体（ｓｙｎ２１１及びＭＪＦＲ１４）である。ここで、標識した試薬について、ＧＬＴ１モノクローナル抗体の標識は、Ｚｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４０５として購入され、α－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）モノクローナル抗体の標識はＺｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８として購入される。
１． 製品の取扱書に従ってＺｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４０５キットを利用してＧＬＴ１抗体を標識する：５μＬ 蛍光二次抗体＋１μｇ ＧＬＴ１抗体を用いて、室温、遮光下５分間インキュベートした後、ＩｇＧ５μＬを加え、室温、避光下５分間インキュベートする。
２． サンプルごとにＧＬＴ１抗体０．２μｇを加え、室温、遮光下３０ｍｉｎインキュベートする。
３． 製品の取扱書に従ってＺｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８キットを使用してα－シヌクレインモノクローナル抗体（ｓｙｎ２１１又はＭＪＦＲ１４）を標識する：５μＬ 蛍光二次抗体＋１μｇ α－ｓｙｎ抗体を用いて、室温、遮光下５分間インキュベートした後、ＩｇＧ５μＬを加え、室温、遮光下５分間インキュベートする。
４． サンプルごとにα－ｓｙｎ抗体（ｓｙｎ２１１又はＭＪＦＲ１４）０．２μｇを加え、室温、遮光下３０ｍｉｎインキュベートする。
５． ０．２２μｍろ過後のＰＢＳを用いてサンプルを４００μＬまで希釈し、使用時まで保管する。
（ｃ）検出
Ａｐｏｇｅｅナノフローアナライザによって標識シグナル強度を検出し、末梢体液中の中枢神経系由来の疾患関連バイオマーカーの存在及び含有量を確認する。
【0105】
実施例２
上記実験方法２によって、臨床コホート（パーキンソン病（ＰＤ）被験者１０３名、多系統萎縮症（ＭＳＡ）被験者４５名及び年齢と性別が一致する健常対照（ＣＴ）１０６名）の血漿サンプルを採取し、Ａｐｏｇｅｅナノフローサイトメータを用いた免疫蛍光標識技術により検出した。
Ａｐｏｇｅｅナノフローアナライザを用いた免疫蛍光標識技術によって、ＧＬＴ１タンパク質陽性細胞外小胞、及びα－ｓｙｎタンパク質（ｓｙｎ２１１とＭＪＦＲ１４は全て抗α－ｓｙｎタンパク質抗体）陽性細胞外小胞（図２Ａ）をそれぞれ検出してもよく、ＧＬＴ１タンパク質－α－ｓｙｎタンパク質二重陽性細胞外小胞を同時に検出してもよく、優れた信頼性及び再現性がある（図２Ｂ及びＣ）。
上記実験方法２によって、臨床コホート（パーキンソン病（ＰＤ）被験者１０３名、多系統萎縮症（ＭＳＡ）被験者４５名及び年齢と性別が一致する健常対照（ＣＴ）１０６名）の血漿サンプルを採取し、Ａｐｏｇｅｅナノフローサイトメータを用いた免疫蛍光標識技術によって、血漿中のＧＬＴ１タンパク質－α－ｓｙｎタンパク質二重陽性細胞外小胞の数を検出した結果、ＰＤ群では、ＭＳＡ群及びＣＴ群よりも有意に高く（＊＊＊：ｐ＜０．００１）、一方、ＭＳＡ群とＣＴ群との間で有意差が認められなかった（図３Ａ及びＢ）。
ＧＬＴ１タンパク質－α－ｓｙｎタンパク質二重陽性細胞外小胞の数は、臨床診断に用いると、ＰＤ患者と健常対照、ＰＤ患者とＭＳＡ患者を効果的に区別することができ、パーキンソン病の診断やＭＳＡ鑑別診断において、臨床的な潜在力があった。
ＣＮ１０６０６２５５９Ｂにおいて、Ｌ１ＣＡＭをマーカーとして、まず、中枢神経系由来のエクソソーム（細胞外小胞の１種、直径が約３０～１５０ｎｍ範囲）を濃縮し、次に、Ｌｕｍｉｎｅｘ検出プラットフォームを用いてエクソソーム中の関連マーカーを検出することが報告されている。
パーキンソン病患者（ＰＤ群）２６７名と、年齢と性別が一致する健常者対照（ＣＴ群）２１５名のコホートを用いて、血漿関連タンパク質マーカーα－ｓｙｎの検出を行い、すなわち、血漿中のα－ｓｙｎタンパク質を直接検出した結果、ＰＤ群とＣＴ群との間では、統計学的差がなく（ＣＮ１０６０６２５５９Ｂの図１及び図２参照）、一方、抗Ｌ１ＣＡＭにより捕捉された血漿エクソソーム中のα－ｓｙｎタンパク質、及び血漿の総α－ｓｙｎタンパク質に対するこのα－ｓｙｎタンパク質の比は、ＰＤ群では、統計学的に有意に上昇し（＊＊：ｐ＜０．０１）（ＣＮ１０６０６２５５９Ｂの図１及び図２参照）、脳脊髄液中のα－ｓｙｎタンパク質と比較すると、差の有意性が相当した（臨床コホート：パーキンソン病患者１００名、健常対照１００名）（＊＊：ｐ＜０．０１）（ＣＮ１０６０６２５５９Ｂの図１及び図２参照）。
さらに、抗Ｌ１ＣＡＭにより捕捉された血漿エクソソーム中のα－ｓｙｎタンパク質の、パーキンソン病の臨床診断に対する補助潜在力を評価し、このα－ｓｙｎタンパク質について、Ｐｅａｒｓｏｎ相関性分析及び受信者動作特性曲線（ＲＯＣ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）分析を行った。その結果、抗Ｌ１ＣＡＭにより捕捉された血漿エクソソーム中のα－ｓｙｎタンパク質のレベルは、パーキンソンＵＰＤＲＳ運動スコアや疾患の重篤度とは相関性があることを見出した（ｒ＝０．１７６,ｐ＝０．００４,Ｐｅａｒｓｏｎ相関）（ＣＮ１０６０６２５５９Ｂの図３Ｃ参照）。エクソソーム中のα－ｓｙｎタンパク質の濃度（ＡＵＣ＝０．６５４、感度＝７０．１％、特異性＝５２．９％）（ＣＮ１０６０６２５５９Ｂの図３Ａ参照）及びこの濃度と血漿の総α－ｓｙｎタンパク質との比（ＡＵＣ＝０．６５７、感度＝７１．２％、特異性＝５０．０％）は全て中程度の診断効率を提供でき、脳脊髄液中のα－ｓｙｎタンパク質の診断効率に相当した（ＡＵＣ＝０．７２４、感度＝７６．８％、特異性＝５３．５％）（ＣＮ１０６０６２５５９Ｂの図３Ｂ参照）。
出願番号２０１８１０１３６７４７．８の中国発明特許出願においては、臨床コホート（多系統萎縮症患者（ＭＳＡ群）４６名、パーキンソン病患者（ＰＤ群）４９名、及び年齢と性別が一致する健常対照（ＣＴ群）５０名）の血漿サンプルを採取し、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔナノ粒子追跡アナライザを用いて、蛍光標識ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）細胞外小胞濃度を測定し、ＧＬＴ１蛍光標識を含有する細胞外小胞濃度のＰＤ診断における潜在力を評価した。受信者動作特性曲線分析（ＲＯＣ ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。多系統萎縮症とパーキンソン病の鑑別診断効率を観察した結果、パーキンソン病に対する診断効率は中程度であり（ＡＵＣ＝０．６７５０、敏感性＝６６．００％、特異性＝７０．４５％）、パーキンソン病と多系統萎縮症の鑑別診断効率は中程度であった（ＡＵＣ＝０．６９４８、敏感性＝６５．９１％、特異性＝７８．５７％）（中国出願２０１８１０１３６７４７．８の図３参照）。
前記の通り、報告されている方法と比較すると、本願のシステム又は方法は、類似のＰＤ診断効果を達成させ、一方、本願の方法は生体体液中の２種以上のマーカーを同時に検出するため、多重マーカーの検出により時間を短縮させ、効率を高め、臨床への適用が広くなり、使用性が期待できる。
上記実験方法２によって、臨床コホート（パーキンソン病（ＰＤ）被験者１０３名、多系統萎縮症（ＭＳＡ）被験者４５名及び年齢と性別が一致する健常対照（ＣＴ）１０６名）の血漿サンプルを採取し、Ａｐｏｇｅｅナノフローサイトメータを用いた免疫蛍光標識技術により検出した。
Ａｐｏｇｅｅナノフローアナライザを用いた免疫蛍光標識技術によって、ＧＬＴ１タンパク質陽性細胞外小胞、及びα－ｓｙｎタンパク質（ｓｙｎ２１１とＭＪＦＲ１４は全て抗α－ｓｙｎタンパク質抗体）陽性細胞外小胞（図２Ａ）をそれぞれ検出してもよく、ＧＬＴ１タンパク質－α－ｓｙｎタンパク質二重陽性細胞外小胞を同時に検出してもよく、優れた信頼性及び再現性がある（図２Ｂ及びＣ）。
上記実験方法２によって、臨床コホート（パーキンソン病（ＰＤ）被験者１０３名、多系統萎縮症（ＭＳＡ）被験者４５名及び年齢と性別が一致する健常対照（ＣＴ）１０６名）の血漿サンプルを採取し、Ａｐｏｇｅｅナノフローサイトメータを用いた免疫蛍光標識技術によって、血漿中のＧＬＴ１タンパク質－α－ｓｙｎタンパク質二重陽性細胞外小胞の数を検出した結果、ＰＤ群では、ＭＳＡ群及びＣＴ群よりも有意に高く（＊＊＊：ｐ＜０．００１）、一方、ＭＳＡ群とＣＴ群との間で有意差が認められなかった（図３Ａ及びＢ）。
ＧＬＴ１タンパク質－α－ｓｙｎタンパク質二重陽性細胞外小胞の数は、臨床診断に用いると、ＰＤ患者と健常対照、ＰＤ患者とＭＳＡ患者を効果的に区別することができ、パーキンソン病の診断やＭＳＡ鑑別診断において、臨床的な潜在力があった。
ＣＮ１０６０６２５５９Ｂにおいて、Ｌ１ＣＡＭをマーカーとして、まず、中枢神経系由来のエクソソーム（細胞外小胞の１種、直径が約３０～１５０ｎｍ範囲）を濃縮し、次に、Ｌｕｍｉｎｅｘ検出プラットフォームを用いてエクソソーム中の関連マーカーを検出することが報告されている。
パーキンソン病患者（ＰＤ群）２６７名と、年齢と性別が一致する健常者対照（ＣＴ群）２１５名のコホートを用いて、血漿関連タンパク質マーカーα－ｓｙｎの検出を行い、すなわち、血漿中のα－ｓｙｎタンパク質を直接検出した結果、ＰＤ群とＣＴ群との間では、統計学的差がなく（ＣＮ１０６０６２５５９Ｂの図１及び図２参照）、一方、抗Ｌ１ＣＡＭにより捕捉された血漿エクソソーム中のα－ｓｙｎタンパク質、及び血漿の総α－ｓｙｎタンパク質に対するこのα－ｓｙｎタンパク質の比は、ＰＤ群では、統計学的に有意に上昇し（＊＊：ｐ＜０．０１）（ＣＮ１０６０６２５５９Ｂの図１及び図２参照）、脳脊髄液中のα－ｓｙｎタンパク質と比較すると、差の有意性が相当した（臨床コホート：パーキンソン病患者１００名、健常対照１００名）（＊＊：ｐ＜０．０１）（ＣＮ１０６０６２５５９Ｂの図１及び図２参照）。
さらに、抗Ｌ１ＣＡＭにより捕捉された血漿エクソソーム中のα－ｓｙｎタンパク質の、パーキンソン病の臨床診断に対する補助潜在力を評価し、このα－ｓｙｎタンパク質について、Ｐｅａｒｓｏｎ相関性分析及び受信者動作特性曲線（ＲＯＣ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）分析を行った。その結果、抗Ｌ１ＣＡＭにより捕捉された血漿エクソソーム中のα－ｓｙｎタンパク質のレベルは、パーキンソンＵＰＤＲＳ運動スコアや疾患の重篤度とは相関性があることを見出した（ｒ＝０．１７６,ｐ＝０．００４,Ｐｅａｒｓｏｎ相関）（ＣＮ１０６０６２５５９Ｂの図３Ｃ参照）。エクソソーム中のα－ｓｙｎタンパク質の濃度（ＡＵＣ＝０．６５４、感度＝７０．１％、特異性＝５２．９％）（ＣＮ１０６０６２５５９Ｂの図３Ａ参照）及びこの濃度と血漿の総α－ｓｙｎタンパク質との比（ＡＵＣ＝０．６５７、感度＝７１．２％、特異性＝５０．０％）は全て中程度の診断効率を提供でき、脳脊髄液中のα－ｓｙｎタンパク質の診断効率に相当した（ＡＵＣ＝０．７２４、感度＝７６．８％、特異性＝５３．５％）（ＣＮ１０６０６２５５９Ｂの図３Ｂ参照）。
出願番号２０１８１０１３６７４７．８の中国発明特許出願においては、臨床コホート（多系統萎縮症患者（ＭＳＡ群）４６名、パーキンソン病患者（ＰＤ群）４９名、及び年齢と性別が一致する健常対照（ＣＴ群）５０名）の血漿サンプルを採取し、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔナノ粒子追跡アナライザを用いて、蛍光標識ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）細胞外小胞濃度を測定し、ＧＬＴ１蛍光標識を含有する細胞外小胞濃度のＰＤ診断における潜在力を評価した。受信者動作特性曲線分析（ＲＯＣ ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。多系統萎縮症とパーキンソン病の鑑別診断効率を観察した結果、パーキンソン病に対する診断効率は中程度であり（ＡＵＣ＝０．６７５０、敏感性＝６６．００％、特異性＝７０．４５％）、パーキンソン病と多系統萎縮症の鑑別診断効率は中程度であった（ＡＵＣ＝０．６９４８、敏感性＝６５．９１％、特異性＝７８．５７％）（中国出願２０１８１０１３６７４７．８の図３参照）。
前記の通り、報告されている方法と比較すると、本願のシステム又は方法は、類似のＰＤ診断効果を達成させ、一方、本願の方法は生体体液中の２種以上のマーカーを同時に検出するため、多重マーカーの検出により時間を短縮させ、効率を高め、臨床への適用が広くなり、使用性が期待できる。
【0106】
実験方法３：
（ａ）末梢体液前処理－限外ろ過及び遠心分離
１． 約１００μＬの被験者の血漿を３７℃水浴にて溶融し、４℃の条件下で２,０００ｇの遠心分離を１５ｍｉｎ行い、新しい１．５ｍＬ遠心分離管に移した後、４℃の条件下で、１２,０００ｇの遠心分離を３０分間行う。
２． 遠心分離後の血漿上清を新しい１．５ｍｌ遠心分離管に移し、均一に混合する。
３． １００ｋＤａ限外ろ過管に０．２２μｍろ過後の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ ２００μＬを加え、次に、遠心分離後の血漿５０μＬを加え、室温で３０分間インキュベートする。
４． インキュベート終了後、４℃の条件下で、１２,０００ｇの遠心分離を３．５分間行う。
５． 限外ろ過管に０．２２μｍろ過後の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ ２００μＬを加え、さらに、４℃の条件下で、１２,０００ｇの遠心分離を３．５分間行う。
６． ろ過後に残った部分（限外ろ過管内芯の部分）をピペットで吸引し、２０μＬ／本で反応単位毎に必要な体積分注し、使用時まで保管する。
（ｂ）標識方法によるバイオマーカー検出用の抗体の標識
使用される試薬：
Ａｌｅｘａ蛍光標識によって、中枢神経系由来の細胞外小胞バイオマーカーを標的とする抗体とアルツハイマー病バイオマーカーを標的とする抗体を標識する。中枢神経系由来の細胞外小胞バイオマーカーを標的とする抗体はＣＮＰａｓｅモノクローナル抗体である。多系統萎縮症バイオマーカーを標的とするのはα－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）モノクローナル抗体である。標識試薬について、ＣＮＰａｓｅモノクローナル抗体の標識は、Ｚｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８として購入され、α－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）モノクローナル抗体の標識はＺｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４０５として購入される。
１． 製品の取扱書に従ってＺｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８キットを使用してＣＮＰａｓｅ抗体を標識する：５μＬ 蛍光二次抗体＋１μｇ ＣＮＰａｓｅ抗体を用いて、室温、遮光下１５分間インキュベートした後、ＩｇＧ ５μＬを加え、室温、遮光下５分間インキュベートする。
２． サンプル（２０μＬ）毎にＣＮＰａｓｅ抗体０．２μｇを加え、室温、遮光下３０ｍｉｎインキュベートする。
３． 製品の取扱書に従ってＺｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４０５キットを使用してα－シヌクレインモノクローナル抗体を標識する：５μＬ 蛍光二次抗体＋１μｇ α－ｓｙｎ抗体を用いて、室温、遮光下１５分間インキュベートした後、ＩｇＧ ５μＬを加え、室温、遮光下５分間インキュベートする。
４． サンプル（２０μＬ）毎にα－ｓｙｎ抗体０．２μｇを加え、室温、遮光下３０ｍｉｎインキュベートする。
５． ０．２２μｍろ過後のＰＢＳを用いてサンプルを４００μＬまで希釈し、使用時まで保管する。
（ｃ）検出
Ａｐｏｇｅｅナノフローアナライザによって標識シグナル強度を検出し、末梢体液中の中枢神経系由来の疾患関連バイオマーカーの存在及び含有量を確認する。
（ａ）末梢体液前処理－限外ろ過及び遠心分離
１． 約１００μＬの被験者の血漿を３７℃水浴にて溶融し、４℃の条件下で２,０００ｇの遠心分離を１５ｍｉｎ行い、新しい１．５ｍＬ遠心分離管に移した後、４℃の条件下で、１２,０００ｇの遠心分離を３０分間行う。
２． 遠心分離後の血漿上清を新しい１．５ｍｌ遠心分離管に移し、均一に混合する。
３． １００ｋＤａ限外ろ過管に０．２２μｍろ過後の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ ２００μＬを加え、次に、遠心分離後の血漿５０μＬを加え、室温で３０分間インキュベートする。
４． インキュベート終了後、４℃の条件下で、１２,０００ｇの遠心分離を３．５分間行う。
５． 限外ろ過管に０．２２μｍろ過後の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ ２００μＬを加え、さらに、４℃の条件下で、１２,０００ｇの遠心分離を３．５分間行う。
６． ろ過後に残った部分（限外ろ過管内芯の部分）をピペットで吸引し、２０μＬ／本で反応単位毎に必要な体積分注し、使用時まで保管する。
（ｂ）標識方法によるバイオマーカー検出用の抗体の標識
使用される試薬：
Ａｌｅｘａ蛍光標識によって、中枢神経系由来の細胞外小胞バイオマーカーを標的とする抗体とアルツハイマー病バイオマーカーを標的とする抗体を標識する。中枢神経系由来の細胞外小胞バイオマーカーを標的とする抗体はＣＮＰａｓｅモノクローナル抗体である。多系統萎縮症バイオマーカーを標的とするのはα－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）モノクローナル抗体である。標識試薬について、ＣＮＰａｓｅモノクローナル抗体の標識は、Ｚｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８として購入され、α－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）モノクローナル抗体の標識はＺｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４０５として購入される。
１． 製品の取扱書に従ってＺｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４８８キットを使用してＣＮＰａｓｅ抗体を標識する：５μＬ 蛍光二次抗体＋１μｇ ＣＮＰａｓｅ抗体を用いて、室温、遮光下１５分間インキュベートした後、ＩｇＧ ５μＬを加え、室温、遮光下５分間インキュベートする。
２． サンプル（２０μＬ）毎にＣＮＰａｓｅ抗体０．２μｇを加え、室温、遮光下３０ｍｉｎインキュベートする。
３． 製品の取扱書に従ってＺｅｎｏｎ（商標） Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標） ４０５キットを使用してα－シヌクレインモノクローナル抗体を標識する：５μＬ 蛍光二次抗体＋１μｇ α－ｓｙｎ抗体を用いて、室温、遮光下１５分間インキュベートした後、ＩｇＧ ５μＬを加え、室温、遮光下５分間インキュベートする。
４． サンプル（２０μＬ）毎にα－ｓｙｎ抗体０．２μｇを加え、室温、遮光下３０ｍｉｎインキュベートする。
５． ０．２２μｍろ過後のＰＢＳを用いてサンプルを４００μＬまで希釈し、使用時まで保管する。
（ｃ）検出
Ａｐｏｇｅｅナノフローアナライザによって標識シグナル強度を検出し、末梢体液中の中枢神経系由来の疾患関連バイオマーカーの存在及び含有量を確認する。
【0107】
実施例３
Ａｐｏｇｅｅナノフローサイトメータを用いた免疫蛍光標識技術によって、上記実験方法３に従って、小型臨床コホート（パーキンソン病（ＰＤ）被験者１５名、多系統萎縮症（ＭＳＡ）被験者１７名、及び年齢と性別が一致する健常対照（ＨＣ）１７名）の血漿サンプルを検出した結果、血漿中のＣＮＰａｓｅタンパク質陽性細胞外小胞を検出しており、その数に関しては、ＭＳＡ群とＰＤ群との間で有意差が認められず、一方、ＭＳＡ群とＨＣ群との間で有意差が認められた（＊：ｐ＜０．０５）（図４Ａ）。ＣＮＰａｓｅタンパク質－α－ｓｙｎタンパク質（抗ＭＪＦＲ１４抗体標識）二重陽性細胞外小胞の数に関しては、ＭＳＡ群、ＰＤ群及びＨＣ群の間で有意差が認められず（図４Ｂ）、血漿中の細胞外小胞総数で正規化したところ、ＭＳＡ群とＨＣ群、ＭＳＡ群とＰＤ群との間で有意差が認められた（＊：ｐ＜０．０５）（図４Ｃ）。
ＣＮＰａｓｅタンパク質－α－ｓｙｎタンパク質二重陽性細胞外小胞の数は、多系統萎縮症（ＭＳＡ）の診断及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）とパーキンソン病（ＰＤ）との鑑別診断において、潜在力が期待できる。
Ａｐｏｇｅｅナノフローサイトメータを用いた免疫蛍光標識技術によって、上記実験方法３に従って、小型臨床コホート（パーキンソン病（ＰＤ）被験者１５名、多系統萎縮症（ＭＳＡ）被験者１７名、及び年齢と性別が一致する健常対照（ＨＣ）１７名）の血漿サンプルを検出した結果、血漿中のＣＮＰａｓｅタンパク質陽性細胞外小胞を検出しており、その数に関しては、ＭＳＡ群とＰＤ群との間で有意差が認められず、一方、ＭＳＡ群とＨＣ群との間で有意差が認められた（＊：ｐ＜０．０５）（図４Ａ）。ＣＮＰａｓｅタンパク質－α－ｓｙｎタンパク質（抗ＭＪＦＲ１４抗体標識）二重陽性細胞外小胞の数に関しては、ＭＳＡ群、ＰＤ群及びＨＣ群の間で有意差が認められず（図４Ｂ）、血漿中の細胞外小胞総数で正規化したところ、ＭＳＡ群とＨＣ群、ＭＳＡ群とＰＤ群との間で有意差が認められた（＊：ｐ＜０．０５）（図４Ｃ）。
ＣＮＰａｓｅタンパク質－α－ｓｙｎタンパク質二重陽性細胞外小胞の数は、多系統萎縮症（ＭＳＡ）の診断及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）とパーキンソン病（ＰＤ）との鑑別診断において、潜在力が期待できる。
【0108】
以上は本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を何ら制限するものではなく、当業者であれば、上記した技術内容を変更したり、等同変化を受けた等価実施例に変形したりすることができる。本発明の技術案の内容を逸脱することなく、本発明の技術の趣旨に基づいて以上の実施例について行われる簡単な修正、同等変化や変形は全て本発明の技術案の特許範囲に属する。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【手続補正書】
【提出日】2023-01-04
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
中枢神経系疾患を診断するシステムであって、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する第１検出モジュールと、
被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する第２検出モジュールと、
第１検出モジュール及び第２検出モジュールのそれぞれによって取得された中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーの検出結果に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断する診断モジュールと、を含み
前記第１検出モジュール及び前記第２検出モジュールは被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーの検出と被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーの検出とを同時に行い、又は
前記第１検出モジュール及び前記第２検出モジュールは、同一モジュールとして、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーと被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを同時に検出し、
前記中枢神経系由来マーカーはＬ１ＣＡＭ、ＳＨＩＳＡ９、ＣＮＰ酵素、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）から選択される１種又は２種以上であり、
前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、前記タンパク質は、Ａβ１－４０（Ａβ４０）タンパク質、Ａβ１－４２（Ａβ４２）タンパク質、オリゴマーＡβ（ｏｌｉｇｏ－Ａβ：ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）タンパク質、ｔａｕタンパク質、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質、α－シヌクレインタンパク質（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質）、１２９位リン酸化α－シヌクレイン（ｐＳ１２９）タンパク質、オリゴマーα－シヌクレイン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ, ｏｌｉｇｏ－α－ｓｙｎ）タンパク質、プリオンタンパク質から選択される１種又は２種以上である、
システム。
【請求項2】
被験者の生体体液を取得して前処理し、生体体液中の生体サンプルを濃縮する濃縮モジュールをさらに含み、第１検出モジュール及び第２検出モジュールは被験者の濃縮生体サンプル中の中枢神経系由来マーカー及び中枢神経系疾患関連マーカーを検出し、
好ましくは、前記濃縮モジュールは、遠心分離、超遠心分離、限外ろ過管によるろ過、重合沈降、特異的抗体捕捉のうちの１種又は２種以上のステップを行うサブモジュールを有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの数を統計する数量統計モジュール、及び／又は中枢神経系由来マーカーと中枢神経系疾患関連マーカーの両方が検出された生体サンプルの粒径を測定する粒径測定モジュールと、
前記生体サンプルの数及び／又は前記生体サンプルの粒径に基づいて、被験者が中枢神経系疾患に罹患しているか否かを診断する診断モジュールと、をさらに含む請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項4】
前記生体サンプルは細胞外小胞であり、好ましくは、前記細胞外小胞はニューロン由来の細胞外小胞、アストロサイト由来の細胞外小胞、オリゴデンドロサイト由来の細胞外小胞又はミクログリア由来の細胞外小胞であり、又は
前記生体体液は血液、血清、血漿、唾液、尿、リンパ液、精液又は乳汁から選択される１種又は２種以上である
請求項２又は３に記載の方法。
【請求項5】
前記中枢神経系疾患は脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上であり、
好ましくは、前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、
前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、
前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、
前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、
前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、
前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、
前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含み；
前記変性痴呆はアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉痴呆症（ＦＴＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含み、
前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症（ＷＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む；
請求項１～４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項6】
前記中枢神経系由来マーカーは、成熟ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ミクログリア、未成熟ニューロン、シュワン細胞、放射状グリア細胞、中間型前駆細胞、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンのニューロン又は細胞に由来するバイオマーカーであり、
好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーは中枢神経系由来の細胞外小胞の表面に位置するマーカーである、請求項１～５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項7】
前記第１検出モジュールは被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系由来マーカーに特異的に反応する標識抗体と反応させ、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系由来マーカーの存在及び含有量を判断する請求項１に記載のシステム。
【請求項8】
前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、第２検出モジュールは被験者の生体体液、好ましくは、被験者の細胞外小胞を中枢神経系疾患関連マーカーに特異的に反応する標識抗体と反応させ、反応後の標識シグナルの強度を検出して、中枢神経系疾患関連マーカーの存在及び含有量を判断する請求項１に記載のシステム。
【請求項9】
前記標識は蛍光標識、同位体標識、酵素標識、化学発光剤標識、量子ドット標識又は金コロイド標識から選択される１種又は２種以上である請求項７又は８に記載のシステム。
【請求項10】
中枢神経系疾患を検出する組成物であって、中枢神経系由来マーカーを標的とする抗体と、中枢神経系疾患関連マーカーを標的とする抗体と、を含み、
前記中枢神経系由来マーカーはＬ１ＣＡＭ、ＳＨＩＳＡ９、ＣＮＰ酵素、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）から選択される１種又は２種以上であり、
前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、前記タンパク質は、Ａβ１－４０（Ａβ４０）タンパク質、Ａβ１－４２（Ａβ４２）タンパク質、オリゴマーＡβ（ｏｌｉｇｏ－Ａβ：ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）タンパク質、ｔａｕタンパク質、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質、α－シヌクレインタンパク質（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質）、１２９位リン酸化α－シヌクレイン（ｐＳ１２９）タンパク質、オリゴマーα－シヌクレイン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ, ｏｌｉｇｏ－α－ｓｙｎ）タンパク質、プリオンタンパク質から選択される１種又は２種以上である、
前記組成物。
【請求項11】
前記中枢神経系疾患は脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上であり、
前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、
前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、
前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、
前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、
前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、
前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、
前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含み、
前記変性性痴呆はアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉痴呆症（ＦＴＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含み、
前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症（ＷＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む、
請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記中枢神経系由来マーカーは、成熟ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ミクログリア、未成熟ニューロン、シュワン細胞、放射状グリア細胞、中間型前駆細胞、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロンのニューロン又は細胞に由来するバイオマーカーであり、
好ましくは、前記中枢神経系由来マーカーは中枢神経系由来の細胞外小胞の表面に位置するマーカーである、
請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記中枢神経系由来マーカーを標的とする抗体及び前記中枢神経系疾患関連マーカーを標的とする抗体は標識抗体であり、好ましくは、前記標識は蛍光標識、同位体標識、酵素標識、化学発光剤標識、量子ドット標識又は金コロイド標識から選択される１種又は２種以上である請求項１０～１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項14】
被験者の中枢神経系疾患を検出するキットであって、被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬と、被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬と、を含み、
前記中枢神経系由来マーカーはＬ１ＣＡＭ、ＳＨＩＳＡ９、ＣＮＰ酵素、ＧＬＴ１（ＥＡＡＴ２）から選択される１種又は２種以上であり、
前記中枢神経系疾患関連マーカーはタンパク質であり、前記タンパク質は、Ａβ１－４０（Ａβ４０）タンパク質、Ａβ１－４２（Ａβ４２）タンパク質、オリゴマーＡβ（ｏｌｉｇｏ－Ａβ：ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）タンパク質、ｔａｕタンパク質、リン酸化ｔａｕ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質、α－シヌクレインタンパク質（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎタンパク質）、１２９位リン酸化α－シヌクレイン（ｐＳ１２９）タンパク質、オリゴマーα－シヌクレイン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ, ｏｌｉｇｏ－α－ｓｙｎ）タンパク質、プリオンタンパク質から選択される１種又は２種以上であり、
好ましくは、前記被験者の生体体液中の中枢神経系由来マーカーを検出する試薬及び被験者の生体体液中の中枢神経系疾患関連マーカーを検出する試薬は請求項１０～１３のいずれか１項に記載の組成物であり、
さらに好ましくは、被験者の生体サンプルを取得する試薬と装置、好ましくは、被験者の細胞外小胞を取得する試薬と装置をさらに含む、前記キット。
【請求項15】
前記中枢神経系疾患は脳血管障害、脊髄病変、中枢神経系感染症、神経系遺伝性疾患、神経系発達異常症、自律神経系疾患、神経系脱髄性病変、てんかん、及び神経系変性疾患から選択される１種又は２種以上であり、
前記脳血管障害は脳梗塞、脳出血、脳血流不足、一過性脳虚血発作を含み、
前記脊髄病変は急性脊髄炎、ポリオ、脊髄空洞症を含み、
前記中枢神経系感染症は脳炎、髄膜炎を含み、
前記神経系遺伝性疾患は神経皮膚症候群、脊髄小脳性失調症を含み、
前記神経系発達異常症は先天性水頭症、脳性麻痺を含み、
前記自律神経系疾患は自律神経機能不全であり、
前記神経系変性疾患は変性性痴呆、運動障害性疾患、プリオン病（Ｐｒｉｏｎ病）を含み；
前記変性性痴呆はアルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉痴呆症（ＦＴＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）を含み、
前記運動障害性疾患は運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、小舞踏病（Ｓｙｄｅｎｈａｍ舞踏病）、肝レンズ核変性症（ＷＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む、請求項１４に記載のキット。
【国際調査報告】