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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-27
(54)【発明の名称】多能性幹細胞から角膜内皮細胞様細胞を分化させる方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0735 20100101AFI20230920BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230920BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20230920BHJP
C12N 5/079 20100101ALI20230920BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230920BHJP
A61K 35/30 20150101ALI20230920BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0735
C12N5/10
C12N1/00 G
C12N5/079
A61P27/02
A61K35/30
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023513751
(86)(22)【出願日】2021-09-01
(85)【翻訳文提出日】2023-03-31
(86)【国際出願番号】 FI2021050588
(87)【国際公開番号】W WO2022049328
(87)【国際公開日】2022-03-10
(31)【優先権主張番号】20205857
(32)【優先日】2020-09-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FI
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521438799
【氏名又は名称】ステムサイト オイ
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100205659
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 拓也
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(74)【代理人】
【識別番号】100185269
【弁理士】
【氏名又は名称】小菅 一弘
(72)【発明者】
【氏名】グロンルース ピリー
(72)【発明者】
【氏名】スコットマン ヘリ
(72)【発明者】
【氏名】イルマリネン タニヤ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB63
4C087NA14
4C087ZA33
(57)【要約】
本発明は、多能性幹細胞からの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）様細胞の分化に関する。本発明は、この分化方法によって得ることができるＣＥＣ様細胞、その使用及びそれを含む調製物にも関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多能性幹細胞から角膜内皮細胞（ＣＥＣ）様細胞を生成する方法であって、ａ）少なくとも１種のトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）阻害剤、少なくとも１種のウイングレス関連組込み部位（Ｗｎｔ）活性化剤及びレチノイン酸の存在下で前記多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ）工程ａ）からの細胞を、少なくとも１種のＴＧＦ－β阻害剤及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化剤の存在下であるが、レチノイン酸の不存在下又は漸減濃度のレチノイン酸の存在下で培養する工程と
を含み、これによりＣＥＣ様細胞を生成する方法。
【請求項2】
前記ＴＧＦ－β阻害剤がＳＢ４３１５４２及びＳＢ５０５１２４からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記Ｗｎｔ活性化剤がグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤及びＲ－スポンジンファミリーのタンパク質からなる群から選択される請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記レチノイン酸が全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）である請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
工程ａ）の継続時間が３～１０日、好ましくは３～５日である請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
工程ｂ）の継続時間が１～２０日、好ましくは１～１０日である請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
ＳＢ４３１５４２又はＳＢ５０５１２４の濃度が約１μＭ～約１００μＭ、好ましくは約１～約３０μＭ、より好ましくは約５μＭ～約１５μＭ、さらにより好ましくは約１０μＭである請求項２に記載の方法。
【請求項9】
ＣＨＩＲ９９０２１の濃度が、約１μＭ～約１５μＭ、好ましくは約１μＭ～約１０μＭ、より好ましくは約１μＭ～約５μＭ、さらにより好ましくは約４μＭである請求項４に記載の方法。
【請求項10】
工程ａ）におけるレチノイン酸の濃度が約１０μＭである請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
レチノイン酸の濃度が、工程ｂ）において０～１μＭの濃度に徐々に減少する請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞及び胚性幹細胞からなる群から選択されるが、ただしヒト胚性幹細胞が使用される場合、前記方法はヒト胚の破壊を伴わない請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記細胞が、ラミニン、コラーゲン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ニドゲン、プロテオグリカン、及びＥ－カドヘリン、並びにそれらのアイソフォーム、断片及びペプチド配列からなる群から選択される１種以上のＥＣＭタンパク質でコーティングされた細胞培養基材上で培養される請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記ＥＣＭタンパク質がラミニン－５２１である請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ＣＥＣ様細胞が、密着帯１（ＺＯ－１）、ＡＴＰアーゼＮａ＋／Ｋ＋輸送サブユニットα１（ＡＴＰ１Ａ１）、溶質輸送体ファミリー４メンバー（ＳＬＣ４Ａ４）、ＣＤ１６６、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ペアード様ホメオドメイン２（ＰＩＴＸ２）、及びフォークヘッドボックスＣ１（ＦＯＸＣ１）からなる群から選択される１種以上のマーカーを発現する請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の方法によって得ることができるＣＥＣ様細胞。
【請求項17】
ヒトＣＥＣ様細胞である請求項１６に記載のＣＥＣ様細胞。
【請求項18】
多能性幹細胞からＣＥＣ様細胞を誘導するための、ＴＧＦ－β阻害剤、Ｗｎｔ活性化剤及びレチノイン酸の組合せの使用。
【請求項19】
角膜内皮機能不全の治療に使用するため、又は薬物開発に使用するための請求項１６又は請求項１７に記載のＣＥＣ様細胞。
【請求項20】
請求項１６又は請求項１７に記載のＣＥＣ様細胞と、溶液、担体、アジュバント及び／又は賦形剤、好ましくは薬学的に許容できる溶液、担体、アジュバント及び／又は賦形剤とを含む調製物。
【請求項21】
前記ＣＥＣ様細胞が細胞単層として提供される請求項２０に記載の調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、多能性幹細胞からの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）様細胞の分化に関する。本発明は、この分化方法によって得ることができるＣＥＣ様細胞、その治療的使用、及びそれを含む調製物にも関する。
【背景技術】
【0002】
ヒト角膜内皮は、角膜の最も内側の薄い細胞層である。これは、角膜から流体をポンピングすることによって視力を明瞭に保つ。ヒトの眼において角膜内皮自体を再生できないため、損傷した角膜内皮は、失明及び疼痛の両方の原因となる角膜の腫脹をもたらす。現在、唯一の臨床的に関連する処置は角膜移植であるが、これは屍体ドナーを必要とする。残念ながら、ドナー角膜の大量の不足がある。
【0003】
角膜内皮細胞（ＣＥＣ）様細胞を多能性幹細胞から分化させる試みがなされている。例えば、Ｚｈａｎｇら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ． ２０１４；２３（１２）：１３４０－５４）は、最初にヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を角膜実質細胞と共培養して眼周囲間葉系前駆体（ＰＯＭＰ）を得ることによって、ｈＥＳＣからＣＥＣ様細胞を誘導した。次いで、ＣＥＣ様細胞は、未規定の(明確ではない)水晶体上皮細胞馴化培地を用いてＰＯＭＰから誘導された。ＭｃＣａｂｅら（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１５；１０（１２）：ｅ０１４５２６６）もｈＥＳＣを使用し、最初にＴＧＦβシグナル伝達遮断薬（ＳＢ４３１５４２）及びノギンによるＳｍａｄ二重阻害（Ｄｕａｌ Ｓｍａｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を使用し、続いて血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ－ＢＢ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＤＫＫ－２）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を使用することによるＷｎｔ阻害を使用することによってＣＥＣ様細胞を生成して、化学的により明確な方法を使用して２段階生成手順を創出することによってＣＥＣ様細胞を分化させた。Ｗａｇｏｎｅｒら、Ｂｉｏｌ Ｏｐｅｎ． ２０１８；７（５）：１－１０は、わずかに改変されたＭｃＣａｂｅのプロトコルを使用することによって、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からＣＥＣ様細胞を誘導した。Ｚｈａｏ及びＡｆｓｈａｒｉ（Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． ２０１６；５７（１５）：６８７８－８４）は、ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９並びにＷｎｔ阻害剤ＩＷＰ２による最初のＳｍａｄ二重阻害を含む３工程法によってＣＥＣ様細胞を分化させて、眼野幹細胞を生成した。次いで、彼らはＣＨＩＲ９９０２１を使用して眼神経堤幹細胞を生成し、最後の工程で、彼らはＳＢ４３１５４２及びＲＯＣＫ阻害剤Ｈ－１１２５を使用して、ＣＥＣ様細胞を分化させた。米国特許第９，３４７，０４２号明細書では、Ｓｈｉｍｍｕｒａらは、ＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ＴＧＦｂ２、インスリン及びＹ－２７６３２を誘導剤として使用することによって、接着培養物中のｈｉＰＳＣ由来神経堤幹細胞からのＣＥＣ様細胞の分化を実証したが、米国特許第１０，５０１，７２５号明細書では、Ｓｈｉｍｍｕｒａらは、Ｎ２サプリメント、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ｂＦＧＦ、ＡＴＲＡ、ＢＩＯ及びＹ－２７６３２を使用することによって、懸濁培養物中で同じことを実証した。
【0004】
既存の分化方法にもかかわらず、ＣＥＣ様細胞を再現可能な様式で大量に生成するための迅速かつ単純なプロトコルが依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】米国特許第９，３４７，０４２号明細書
【特許文献2】米国特許第１０，５０１，７２５号明細書
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｚｈａｎｇら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ． ２０１４；２３（１２）：１３４０－５４
【非特許文献2】ＭｃＣａｂｅら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１５；１０（１２）：ｅ０１４５２６６
【非特許文献3】Ｗａｇｏｎｅｒら、Ｂｉｏｌ Ｏｐｅｎ． ２０１８；７（５）：１－１０
【非特許文献4】Ｚｈａｏ及びＡｆｓｈａｒｉ、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． ２０１６；５７（１５）：６８７８－８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、既存の分化プロトコルに関連する課題を克服するために、多能性幹細胞から角膜内皮細胞（ＣＥＣ）様細胞を迅速かつ単純に生成する方法を提供することである。この目的は、独立請求項に記載される内容によって特徴付けられる方法によって達成される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項に開示されている。
【課題を解決するための手段】
【0008】
従って、本発明は、多能性幹細胞からＣＥＣ様細胞を生成する方法であって、ａ）少なくとも１種の形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）阻害剤、少なくとも１種のウイングレス関連組込み部位（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ、Ｗｎｔ）活性化剤及びレチノイン酸の存在下で多能性幹細胞を培養する工程と、ｂ）工程ａ）からの細胞を、少なくとも１種のＴＧＦ－β阻害剤及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化剤の存在下であるが、レチノイン酸の不存在下又は減少濃度のレチノイン酸の存在下で培養する工程とを含み、これによりＣＥＣ様細胞を生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β阻害剤は、ＳＢ４３１５４２及びＳＢ５０５１２４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ活性化剤は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤及びＲ－スポンジンファミリーのタンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。
【0009】
加えて、本発明は、当該分化方法によって得ることができるＣＥＣ様細胞を提供する。
【0010】
多能性幹細胞からＣＥＣ様細胞を誘導するための、ＴＧＦ－β阻害剤、Ｗｎｔ活性化剤及びレチノイン酸の組合せの使用も提供される。
【0011】
さらなる態様では、本発明は、角膜内皮機能不全の治療に使用するための、又は薬物開発に使用するための当該ＣＥＣ様細胞を提供する。
【0012】
本発明のＣＥＣ様細胞と、溶液、担体、アジュバント及び／又は賦形剤、好ましくは薬学的に許容できる溶液、担体、アジュバント及び／又は賦形剤とを含む調製物、例えば医薬調製物も提供される。
【0013】
本発明のさらなる態様、実施形態、客体、詳細及び利点は、以下の図面、詳細な説明及び実施例に記載される。
【図面の簡単な説明】
【0014】
添付の図面は、開示される主題のいくつかの実施形態を示し、本明細書とともに、開示される分化誘導方法の原理を説明する役割を果たす。
【0015】
【図1】図１は、培養の最初の３日間のＲＡあり又はなしの１２日目におけるｈＰＳＣ－ＣＥＣ細胞の形態の位相差光学顕微鏡画像を示す。黒い矢印は、ポンピング活性を示す、細胞単層に存在するドーム構造を示す。対応する結果は、Ｒｅｇｅａ０８／０１７ ｈＥＳＣ株を用いて得られた。画像はニコン（Ｎｉｋｏｎ） Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００－Ｓで４倍及び１０倍の倍率で撮影された。
【図2】図２は、培養の最初の３日間のＲＡあり又はなしの、ｈＰＳＣ－ＣＥＣ分化プロトコルの１２日目におけるＺＯ－１、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰアーゼ及びＣＤ１６６の発現の免疫蛍光画像を示す。対応する結果は、Ｒｅｇｅａ０８／０１７ ｈＥＳＣ株を用いて得られた。画像はオリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ） ＩＸ５１で１０倍の倍率を用いて撮影された。
【図3】図３は、培養された初代ヒト角膜内皮細胞におけるＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰアーゼの発現の免疫蛍光画像を示す。対応する結果は、２２歳のドナーの角膜から得られた。画像はオリンパス ＩＸ５１で１０倍の倍率を用いて撮影された。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明は、多能性幹細胞から角膜内皮細胞（ＣＥＣ）様細胞を生成する方法を提供する。当該方法によって得ることができるＣＥＣ様細胞、このＣＥＣ様細胞を含む調製物、及びその様々な使用も提供される。
【0017】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の表現「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、１つ又は複数を意味する。従って、単数の名詞は、特段の記載がない限り、対応する複数の名詞の意味も有する。
【0018】
簡潔に述べると、本発明は、３つの分化誘導剤、すなわちＴＧＦ－ｂ阻害剤、Ｗｎｔ活性化剤及びレチノイン酸を下記のスケジュールで使用することに基づく。
【0019】
細胞
本明細書で使用する場合、用語「多能性幹細胞」（ＰＳＣ）は、胚外組織を含まない、ヒト又は動物の体のすべての細胞型に分化する潜在能力を有するあらゆる幹細胞を指す。これらの幹細胞には、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）の両方が含まれる。従って、本発明における使用に適した細胞は、ｉＰＳＣ及びＥＳＣから選択される幹細胞を含む。従って、本発明における使用に適した細胞には、ｉＰＳＣ及びＥＳＣから選択される幹細胞が含まれる。この用語は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）改変ＰＳＣ等の遺伝子改変ＰＳＣも包含する。従って、遺伝子改変されたｉＰＳＣ及びＥＳＣを含む遺伝子改変ＰＳＣは、本発明のいくつかの実施形態において用いられてもよい。
本明細書で使用する場合、用語「多能性幹細胞」（ＰＳＣ）は、胚外組織を含まない、ヒト又は動物の体のすべての細胞型に分化する潜在能力を有するあらゆる幹細胞を指す。これらの幹細胞には、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）の両方が含まれる。従って、本発明における使用に適した細胞は、ｉＰＳＣ及びＥＳＣから選択される幹細胞を含む。従って、本発明における使用に適した細胞には、ｉＰＳＣ及びＥＳＣから選択される幹細胞が含まれる。この用語は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）改変ＰＳＣ等の遺伝子改変ＰＳＣも包含する。従って、遺伝子改変されたｉＰＳＣ及びＥＳＣを含む遺伝子改変ＰＳＣは、本発明のいくつかの実施形態において用いられてもよい。
【0020】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）が好ましく、それらには、ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）及びヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）が含まれる。ＥＳＣ、とりわけｈＥＳＣは、培養中に無限の増殖が可能であり、従って、故障や欠陥のあるヒト組織の代替となる細胞及び組織を供給することができるため、治療上非常に興味深い。しかしながら、ヒト胚性幹細胞から角膜内皮細胞を製造することは、倫理的な課題に直面する可能性がある。本発明の一実施形態によれば、当該方法自体又はあらゆる関連する行為が、ヒト胚の破壊を伴わないという但し書きの下、ヒト胚性幹細胞が使用されてもよい。
【0021】
一般にｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣと略される人工多能性幹細胞は、非多能性細胞、典型的には成体の体細胞から、当該技術分野で周知の手段及び方法によって特定の遺伝子の強制的な発現を誘導することにより、人工的に誘導される一種の多能性幹細胞である。ｉＰＳ細胞を使用する利点は、胚細胞を一切使用する必要がないため、倫理的な問題を回避できることである。さらなる利点は、ｉＰＳＣ技術を採用することで、免疫拒絶反応の問題がない患者特異的な細胞の生成が可能になることである。それゆえ、本発明の一実施形態によれば、ｉＰＳ細胞の使用が好ましい。臨床用途では、ｈｉＰＳ細胞が好ましい。
【0022】
人工多能性幹細胞は、多くの側面において、胚性幹細胞等の天然の多能性幹細胞と類似している。例示的な側面としては、特定の幹細胞遺伝子及びタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫（テラトーマ）形成、生存可能なキメラ形成、並びに効力及び分化能等が挙げられるが、天然の多能性幹細胞との関係の全容はまだ評価されているところである。人工多能性細胞は、典型的には、成体の皮膚細胞、血液細胞、胃又は肝臓から作られるが、他の代替物も可能である場合がある。当業者は、研究及び治療目的のためのｉＰＳ細胞の可能性を熟知している。
【0023】
多能性マーカーの非限定的な例としては、当該技術分野において周知のように、ＰＯＵクラス５ホメオボックス１（ＰＯＵ５Ｆ１、ＯＣＴ３／４）が挙げられる。
【0024】
本明細書で使用する場合、用語「初代角膜内皮細胞」（ＣＥＣ）は、角膜の内表面上の細胞の単層である角膜内皮の細胞を指す。ＣＥＣは、角膜ホメオスタシスにおいていくつかの不可欠な役割を果たし、角膜の水和及び透明性の調節に特化している。
【0025】
本明細書で使用する場合、用語「ＣＥＣ様細胞」は、ＰＳＣからの分化によって得られることができ、初代ＣＥＣの本質的な特徴を有する細胞を指す。従って、用語「ｈＰＳＣ－ＣＥＣ」は、本明細書で使用する場合、本発明の分化誘導方法によってヒト多能性幹細胞から分化したＣＥＣ様細胞を指す。
【0026】
初代ＣＥＣ及び本発明のＣＥＣ様細胞は、主に六角形の頂端表面及び不規則な基底面を有する均一なサイズの細胞の単層を形成する能力を特徴とする。密着結合は六角形を形成し維持する役割を果たし、角膜の相対的な脱水を維持するのに必要である。実際、初代ＣＥＣ及び本ＣＥＣ様細胞は、密着帯１（ｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ－１、ＺＯ－１）等の密着結合タンパク質の発現を特徴とする。
【0027】
加えて、初代ＣＥＣ及び本発明のＣＥＣ様細胞は、角膜と眼房水との間にイオン勾配を作り出す異なるタイプの酵素ポンプを備え、間質からの水の持続的な抽出に関与する。角膜内皮ポンプマーカーの非限定的な例としては、ＡＴＰアーゼＮａ＋／Ｋ＋輸送サブユニットα１（ＡＴＰ１Ａ１）及び溶質輸送体ファミリー４メンバー４（ＳＬＣ４Ａ４）が挙げられる。
【0028】
さらなるＣＥＣマーカーとしては、ＣＤ１６６及びアクアポリン１（ＡＱＰ１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0029】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＳＣからのＣＥＣ様細胞の分化は、神経堤細胞（ＮＣＣ）特異的マーカーの出現によって判断されるように、ＮＣＣを介して達成されるが、ＰＳＣがＮＣＣに分化し、次いでＣＥＣ様細胞にさらに分化した時点を正確に特定することは困難である可能性がある。
【0030】
本明細書で使用する場合、用語「神経堤細胞」（ＮＣＣ）は、胚性外胚葉胚葉から生じ、次いで多様な細胞系譜を生じる脊椎動物に特有の細胞の一過性群を指す。神経堤は、頭蓋神経堤、体幹神経堤、迷走神経堤及び仙骨神経堤、並びに心臓神経堤を含む、４つの主要機能ドメインに分割することができる。角膜発達中、頭蓋ＮＣＣは角膜内皮及び間質を生じる。
【0031】
ＮＣＣ特異的マーカーは、当該技術分野において周知である。頭蓋ＮＣＣに特異的なマーカーの非限定的な例としては、ＡＰ２α、ＡＰ２β及び神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ、ｐ７５）が挙げられる。加えて、Ｐａｘ６の低発現又は発現の不存在は、頭蓋ＮＣＣにおいて特徴的である。
【0032】
さらに、後期ＮＣＣ及び初期ＣＥＣにおいて生じる眼周囲間葉マーカーの非限定的な例としては、ペアード様ホメオドメイン２（ｐａｉｒｅｄ ｌｉｋｅ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ２、ＰＩＴＸ２）及びフォークヘッドボックスＣ１（ＦＯＸＣ１）が挙げられる。
【0033】
上記に従って、本発明の生成方法によって得ることができるＣＥＣ様細胞は、少なくとも１つの密着結合マーカー、少なくとも１つのポンプマーカー及び少なくとも１つのＣＥＣマーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＣＥＣ様細胞は、ＺＯ－１、ＡＴＰ１Ａ１、ＳＬＣ４Ａ４、ＣＤ１６６、ＡＱＰ１、ＰＩＴＸ２及びＦＯＸＣ１からなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する。
【0034】
上に列挙したもの等の細胞型特異的マーカーの存在は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、免疫蛍光及びフローサイトメトリー、例えば蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を含むがこれらに限定されない、この目的に適した任意の利用可能な技術によって定量化されてもよい。
【0035】
分化誘導方法及び誘導剤
当該分化方法では、まず、ＰＳＣが、ＴＧＦ－ｂ阻害剤、Ｗｎｔ活性化剤及びレチノイン酸（ＲＡ）の存在下で培養され、次いで、ＴＧＦ－β阻害剤及びＷｎｔ活性化剤のみの存在下で、又はＲＡの濃度を下げて培養される。
当該分化方法では、まず、ＰＳＣが、ＴＧＦ－ｂ阻害剤、Ｗｎｔ活性化剤及びレチノイン酸（ＲＡ）の存在下で培養され、次いで、ＴＧＦ－β阻害剤及びＷｎｔ活性化剤のみの存在下で、又はＲＡの濃度を下げて培養される。
【0036】
本発明の方法の第１の工程では、ＰＳＣが、ＴＧＦ－β阻害剤、Ｗｎｔ活性化剤及びレチノイン酸の存在下で、好ましくはＣＥＣ様細胞の出現を可能にする期間培養される。
【0037】
いかなる理論又は作用機序にも限定されるものではないが、本発明につながる実験は、分化誘導剤としてのＳＢ４３１５４２及びＣＨＩＲ９９０２１がＮＣＣマーカーの出現に寄与することを示した。上記出現の正確なタイミングは、用いられるＴＧＦ－β阻害剤及びＷｎｔ活性化剤種並びに細胞培養培地中のその濃度等の異なる変数に依存してもよいことを理解されたい。
【0038】
いくつかの実施形態では、培養培地が、ＴＧＦ－β阻害剤及びＷｎｔ活性化剤として、それぞれ約１０μＭのＳＢ４３１５４２及び約４μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含有した場合、ＮＣＣマーカーは、分化誘導方法の３日目付近に出現した。
【0039】
次いで、レチノイン酸は、５日目以降に、眼周囲間葉マーカー（例えば、ＰＩＴＸ２及びＦＯＸＣ１）について陽性であるＣＥＣ様細胞及び間葉様領域の形成に寄与した。さらに、ＲＡは、細胞におけるバリア特性及びポンピング活性を示すドーム様構造の形成を誘導した。これらの特徴は、細胞がＲＡの不存在下で（すなわち、ＳＢ４３１５４２及びＣＨＩＲ９９０２１のみの存在下で）培養された場合に存在しなかった。
【0040】
いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、ＴＧＦ－β阻害剤、Ｗｎｔ活性化剤及びＲＡの存在下で約３日～約１０日、好ましくは約３日～約５日培養される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１及びＲＡの存在下で約３日～約１０日、好ましくは約３日～約５日培養される。ＲＡへの長すぎる曝露は、空胞上での形成及び脂肪細胞様細胞の出現をもたらし、この両方の特徴は回避されるべきである。それゆえ、ＲＡは、当該分化方法の開始から３～１０日後、好ましくは３～７日後に培地から排除される（引き上げられる）か、又はその濃度が減少される。次いで、細胞は、ＴＧＦ－β阻害剤（好ましくはＳＢ４３１５４２）及びＷｎｔ活性化剤（ＣＨＩＲ９９０２１）の存在下で、ＲＡなしで、又は減少したＲＡ濃度で、さらに約１～約２０日間以上培養される。いくつかの実施形態では、上記細胞は、ＴＧＦ－β阻害剤及びＷｎｔ活性化剤に約３週間より長く曝露された場合には悪影響を呈し始める。
【0041】
いくつかの実施形態では、ＲＡは、ＲＡを含有する培養培地をＲＡを含有しない培養培地に単に置き換えることによって、少なくとも１種のＴＧＦ－β阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）を含有する培養培地からすべて一度に排除される。いくつかの代替的な実施形態では、ＲＡは培養培地から徐々に、例えば２～５工程で排除され、各工程において、指定量のＲＡを含有する培養培地は、より少量のＲＡを含有する培養培地と交換される。各工程の継続時間は、例えば、１～３日間で変わってもよい。言い換えれば、上記細胞は、さらに低いＲＡ濃度を有する又はＲＡを含まない次の培養培地に培養培地を交換する前に、減少したＲＡ濃度を含有する各培養培地中で１～３日間培養されてもよい。ＲＡは、すべて一度に又は徐々に、完全に又は大きく低下した濃度まで、例えばＲＡの初期濃度から１０倍減少した濃度（すなわち、ＲＡの濃度は、その初期濃度の１０分の１に低下する）まで排除されてもよいことも理解されたい。例示的な実施形態では、本発明の方法の工程ａ）は、（少なくとも１種のＴＧＦ－β阻害剤、例えばＳＢ４３１５４２、及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化剤、例えばＣＨＩＲ９９０２１に加えて）１０μＭのＲＡを含む培養培地中でＰＣＳを３日間培養することを含み、続いて、ＲＡの濃度が次の１～３日間５μＭに低下され、さらに続いてＲＡを完全に除去される工程ｂ）が行われる。別の例示的な実施形態では、本発明の方法の工程ａ）は、（少なくとも１種のＴＧＦ－β阻害剤、例えばＳＢ４３１５４２、及び少なくとも１種のＷｎｔ活性化剤、例えばＣＨＩＲ９９０２１に加えて）１０μＭのＲＡを含む培養培地中でＰＣＳを３日間培養することを含み、続いて、ＲＡの濃度が最初に次の１～３日間５μＭに、次いで当該分化方法の残りの継続時間中１μＭに低下される工程ｂ）が行われる。
【0042】
特に、本発明の方法は、好ましくは、インスリン、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ノギン、ＰＤＧＦ、ＤＫＫ－２、例えばＨ－１１２５等のＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ、Ｒｈｏ関連キナーゼ）阻害剤、及びＩＷＰ２等のＷｎｔ阻害剤などの、ＣＥＣ様細胞の分化について以前に示唆されたいくつかの薬剤の不存在下で行われる。
【0043】
【表1】
【0044】
いくつかの実施形態では、本発明の分化誘導方法は、接着培養として、すなわち、天然抽出細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質及び組換えＥＣＭタンパク質の両方を含む１種以上の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質でコーティングされた細胞培養ボトル又は細胞培養プレート等の基材上で行われる。適切なＥＣＭタンパク質としては、ラミニン、コラーゲン（例えば、ＩＶ型コラーゲン）、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ニドゲン、プロテオグリカン、及びＥ－カドヘリン、並びにそれらのアイソフォーム、断片及びペプチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。このＥＣＭアイソフォームの非限定的な例としては、ラミニン－５１１、ラミニン－５２１、ラミニン－３２２及びラミニン－４１１等のラミニンアイソフォームが挙げられ、上記断片の非限定的な例としては、上記ヒトラミニンアイソフォームのＥ８断片が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、細胞培養基材は、例えば、約０．５μｇ／ｃｍ２～約１．５μｇ／ｃｍ２以上の濃度範囲で、ラミニン－５２１でコーティングされる。いくつかの他の実施形態では、細胞培養基材は、例えば、それぞれ５μｇ／ｃｍ２及び０．７５μｇ／ｃｍ２の濃度で、ＩＶ型コラーゲン及びラミニン－５２１の混合物でコーティングされる。
【0045】
臨床的に受け入れられるために、当該ＣＥＣ様細胞は、初代ＣＥＣのものに対応する、明瞭な視覚に重要な機能的特徴を保有しなければならない。従って、ＣＥＣ様細胞は、角膜実質から流体をポンピングすることによって視力を明瞭に保つのに充分なポンピング活性を有していなければならない。加えて、ＣＥＣ様細胞は、漏出しない密着結合の結果として充分なバリア特性を有していなければならない。実施例に示すように、本発明の分化誘導方法により生成されたＣＥＣ様細胞は、これらの要件の両方を満たす。
【0046】
さらに、安全性の理由から、より具体的には奇形腫又は他の腫瘍の形成のリスクを回避するために、臨床的に使用される分化細胞集団中に幹細胞が残っていないことが重要である。実際に、これは、免疫蛍光染色（図４）及びｑＰＣＲ（図５）の両方においてＯＣＴ３／４（ＰＯＵ５Ｆ１）の欠如によって実証されるように、本発明の方法によって生成されたＣＥＣ様細胞に当てはまる。
【0047】
ＴＧＦ－ベータ（ＴＧＦ－β）阻害剤
本明細書で使用する場合、「ＴＧＦ－β阻害剤」は、機能的に、トランスフォーミング増殖因子β１を阻害できる物質を指す。トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）は、病気の状態及び正常な状態での成長、分化、遊走、細胞の生存、接着等、多くの生物学的活動に関与する多面的サイトカインの大規模なスーパーファミリーのメンバーである。このスーパーファミリーでは３０種近いメンバーが同定されている。これらは２つの主要な枝、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ／Ｎｏｄａｌ及びＢＭＰ／ＧＤＦ（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ（骨形成タンパク質）／Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（成長分化因子））、に分類されると考えられている。これらは非常に多様で、しばしば補完的な機能を持っている。胚の発生過程で短期間しか発現しないものや、限られた種類の細胞でしか発現しないもの（例えば、抗ミュラー管ホルモン、ＡＭＨ、インヒビン）もあれば、胚形成の間及び成体の組織において広く発現するもの（例えば、ＴＧＦβ１、ＢＭＰ４）もある。ＴＧＦ－β１は、細胞外マトリクス（線維化因子）の合成における強力な制御因子であり、創傷治癒にも関与している。
本明細書で使用する場合、「ＴＧＦ－β阻害剤」は、機能的に、トランスフォーミング増殖因子β１を阻害できる物質を指す。トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）は、病気の状態及び正常な状態での成長、分化、遊走、細胞の生存、接着等、多くの生物学的活動に関与する多面的サイトカインの大規模なスーパーファミリーのメンバーである。このスーパーファミリーでは３０種近いメンバーが同定されている。これらは２つの主要な枝、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ／Ｎｏｄａｌ及びＢＭＰ／ＧＤＦ（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ（骨形成タンパク質）／Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（成長分化因子））、に分類されると考えられている。これらは非常に多様で、しばしば補完的な機能を持っている。胚の発生過程で短期間しか発現しないものや、限られた種類の細胞でしか発現しないもの（例えば、抗ミュラー管ホルモン、ＡＭＨ、インヒビン）もあれば、胚形成の間及び成体の組織において広く発現するもの（例えば、ＴＧＦβ１、ＢＭＰ４）もある。ＴＧＦ－β１は、細胞外マトリクス（線維化因子）の合成における強力な制御因子であり、創傷治癒にも関与している。
【0048】
化学的、構造的に見て、適切なＴＧＦ－β阻害機能は、タンパク質及び低分子有機化合物の中に見出されてもよい。当業者であれば、生物学的マトリクスからタンパク質を単離する手段、又は組換え技術によってタンパク質を生成する手段を知っている。ＴＧＦ－β阻害活性を示す化合物は、スクリーニングによって見つけられてもよい。好ましくは、ＴＧＦ－β阻害剤は、比較的低いモル質量を有する有機分子、例えば、８００ｇ／モル未満、好ましくは５００ｇ／モル未満のモル質量を有する低分子である。一般的な構造として、好適な低モル質量のＴＧＦ－β阻害剤である式Ｉは、以下のように記述されてもよい。
上記式Ｉ中、Ｒ１はＣ１～Ｃ５脂肪族アルキル基、カルボン酸、アミドを表し、Ｒ２はＣ１～Ｃ５脂肪族アルキルを表し、Ｒ３及びＲ４はヘテロ原子、Ｏ又はＮを含む脂肪族アルキルを表し、これらは互いに連結して５員又は６員のヘテロ環を形成してもよい。
【化1】
【0049】
典型的な構造は、２個の酸素原子を有するヘテロ環を含み、一般式ＩＩの低分子と呼べる場合である。
上記式ＩＩ中、Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ５脂肪族アルキル基、芳香族カルボン酸又はアミドを表し、Ｒ２は、Ｃ１～Ｃ５脂肪族アルキルを表す。
【化2】
【0050】
このようなＴＧＦ－β阻害剤の１つの非限定的な例は、ＳＢ４３１５４２としても知られている４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミドであり、これは、複数の供給元から市販されており、トランスフォーミング増殖因子－βＩ型受容体（ＡＬＫ５）、ＡＬＫ４及びＡＬＫ７の選択的阻害剤として販売されている。特異的なＴＧＦ阻害剤の別の非限定的な例は、ＳＢ５０５１２４としても知られている２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－３Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン塩酸塩水和物である。
【0051】
しかしながら、ＴＧＦ－β阻害活性を示すか、又はＴＧＦ阻害剤として市販されている他の小分子も、本発明の文脈において同様に好適である可能性がある。化学合成又は組換え生産によって得られる物質から上記ＴＧＦ－β阻害剤を選択する場合、規定培地を提供することができる。これは、ゼノフリー及び無血清（セラムフリー）の条件の要件にも適合する。
【0052】
当業者であれば、当該技術分野で容易に利用可能な様々な方法を用いて、所与の薬剤がＴＧＦ－β阻害活性を有するか否か、及び当該方法における使用に適しているか否かを容易に判断することができる。
【0053】
いくつかの好ましい実施形態では、誘導培地中のＳＢ４３１５４２等のＴＧＦ－β阻害剤の濃度は、約１μＭ～約１００μＭ、好ましくは約１～約３０μＭ、より好ましくは約５μＭ～約１５μＭ、さらにより好ましくは約１０μＭである。
【0054】
Ｗｎｔ活性化剤
癌原遺伝子のＷｎｔ（ウイングレス関連組み込み部位）ファミリーは、少なくとも１６種の公知のメンバーから構成されており、これらのメンバーは、発癌、並びに細胞運命及び胚発生の制御等のいくつかの他の発生プロセスに関与する分泌シグナル伝達タンパク質をコードしている。本明細書で使用する場合、用語「Ｗｎｔ活性化剤」は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化することができる物質を指す。タンパク質及び低分子のＷｎｔ活性化剤の両方が当該技術分野で公知である。
癌原遺伝子のＷｎｔ（ウイングレス関連組み込み部位）ファミリーは、少なくとも１６種の公知のメンバーから構成されており、これらのメンバーは、発癌、並びに細胞運命及び胚発生の制御等のいくつかの他の発生プロセスに関与する分泌シグナル伝達タンパク質をコードしている。本明細書で使用する場合、用語「Ｗｎｔ活性化剤」は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化することができる物質を指す。タンパク質及び低分子のＷｎｔ活性化剤の両方が当該技術分野で公知である。
【0055】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤は、本発明で使用するための好ましいＷｎｔ活性化剤の例示的なクラスである。複数の提供元から市販されているＣＨＩＲ９９０２１は、ＧＳＫ３の最も選択的な阻害剤であり、従って、本発明で使用するための特に好ましいＷｎｔ活性化剤である。さらなるＧＳＫ３阻害剤としては、ＳＢ－２１６７６３、ＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、ＬＹ２０９０３１４及び塩化リチウムが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、これらはすべて市販されている。いくつかの好ましい実施形態では、分化培地中のＣＨＩＲ９９０２１等のＧＳＫ３阻害剤の量は、約１μＭ～約１５μＭ、好ましくは約１μＭ～約１０μＭ、より好ましくは約１μＭ～約５μＭ、さらにより好ましくは約４μＭである。
【0056】
本発明における使用に適していると考えられるＷｎｔ活性化剤の別のクラスは、Ｒ－スポンジンタンパク質ファミリーであり、その４つのメンバーは、Ｒ－スポンジン－１、Ｒ－スポンジン－２、Ｒ－スポンジン－３及びＲ－スポンジン－４として指定され、古典的なＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の分泌されたアゴニストである。
【0057】
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ活性化剤はＲ－スポンジン－１である。好ましい濃度範囲としては、約１００ｎｇ／ｍｌ～約２μｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ～約２μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌが挙げられる。
【0058】
ＲＳ－２４６２０４は、低分子のＲ－スポンジン－１代用物であり、これも本発明における使用に適していることが想定される。好ましい濃度範囲としては、約６．２５μＭ～約２００μＭ、及び約２５μＭ～約５０μＭが挙げられる。
【0059】
当業者は、当該技術分野で容易に利用できる様々な方法を用いて、所与の薬剤がＷｎｔ活性化特性を有するか否か、及び当該方法における使用に適しているか否かを容易に判断することができる。化合物は、Ｗｎｔ活性化剤として作用する能力について、例えば、市販の試験キット、Ｅｎｚｏ（エンゾ）から入手可能なＬＥＡＤＩＮＧ ＬＩＧＨＴ（登録商標） Ｗｎｔレポーターアッセイスターターキットによって試験することができる。
【0060】
レチノイン酸
本明細書で使用する場合、用語「レチノイン酸」（ＲＡ）は、主要な全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ；表現を簡単にするために一般にレチノイン酸と称される）を含むレチノイン酸のすべての異性体、及びその少数の異性体、例えば９－ｃｉｓ－レチノイン酸、１１－ｃｉｓ－レチノイン酸及び１３－ｃｉｓ－レチノイン酸を包含する。いくつかの実施形態では、用いられるレチノイン酸はＡＴＲＡである。
本明細書で使用する場合、用語「レチノイン酸」（ＲＡ）は、主要な全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ；表現を簡単にするために一般にレチノイン酸と称される）を含むレチノイン酸のすべての異性体、及びその少数の異性体、例えば９－ｃｉｓ－レチノイン酸、１１－ｃｉｓ－レチノイン酸及び１３－ｃｉｓ－レチノイン酸を包含する。いくつかの実施形態では、用いられるレチノイン酸はＡＴＲＡである。
【0061】
ＡＴＲＡは、異なる組のデヒドロゲナーゼによって触媒される２つの連続した酵素反応によって誘導されるビタミンＡ１（全トランス型レチノール）の代謝産物である。ＡＴＲＡは、細胞増殖、分化、及び器官形成において重要な役割を果たす。
【0062】
いくつかの実施形態では、ＲＡ、好ましくはＡＴＲＡは、約１μＭ～約２０μＭ、好ましくは約１０μＭの範囲の濃度で本発明の方法の工程ａ）において使用されるのに対して、ＲＡ、好ましくはＡＴＲＡは、０～約１μＭの範囲の濃度で本発明の方法の工程ｂ）において使用される。上記で説明したように、工程ａ）で使用されるＲＡの濃度は、工程ｂ）で使用されるＲＡの濃度まで徐々に又は一度に低下されてもよい。
【0063】
レチノイン酸は、様々な供給源から市販されている。
【0064】
細胞培養培地
本発明の方法及びその様々な実施形態では、基本的に、幹細胞の分化に適した任意の細胞培養培地が、本発明の分化誘導剤を補充する基礎培地として使用されてもよい。本明細書で使用する場合、用語「基礎培地」は、当該技術分野で周知のように、アミノ酸、グルコース、並びにカルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及びリン酸アニオン等のイオンを含む成分から構成される細胞培養培地を指す。本発明の方法における使用に適した市販の基礎培地の非限定的な例としては、ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ－ＤＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）及びその任意の組み合わせが挙げられる。
本発明の方法及びその様々な実施形態では、基本的に、幹細胞の分化に適した任意の細胞培養培地が、本発明の分化誘導剤を補充する基礎培地として使用されてもよい。本明細書で使用する場合、用語「基礎培地」は、当該技術分野で周知のように、アミノ酸、グルコース、並びにカルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及びリン酸アニオン等のイオンを含む成分から構成される細胞培養培地を指す。本発明の方法における使用に適した市販の基礎培地の非限定的な例としては、ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ－ＤＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）及びその任意の組み合わせが挙げられる。
【0065】
分化誘導剤に加えて、基礎培地は、抗生物質、Ｌ－グルタミン、及び血清、血清アルブミン又は血清代替物、好ましくは規定の血清代替物を含む、事実上あらゆる細胞培養培地において使用される成分を補充されてもよい。当該技術分野で一般的なさらなる補充物質も、それが角膜内皮以外の組織へのＰＳＣの分化を導くことが公知である場合を除き、適用されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される誘導培地は、誘導剤、基礎培地、抗生物質、Ｌ－グルタミン、及び規定血清代替物以外の成分を含有しない。
【0066】
使用時又は使用準備が整っているとき、本発明の細胞培養培地は、上述した適切な必須サプリメントを含んでいる。しかしながら、当該分野での一般的な慣行によれば、培地の材料は、上記成分を含む濃縮物として提供されてもよいし、提供される指示に従って実験室で使用する前に適切な組み合わせを調製するためのバイアルのセットとして提供されてもよい。多くの場合、培養培地は使用直前に希釈して最終組成物に調製される。それゆえ、そのような即時調製に使用するのに適した任意のストック溶液又は調製キットが当該方法で使用する細胞培養培地を得るために使用されてもよいことが理解される。
【0067】
臨床的により良く受け入れられるために、当該方法及びその様々な実施形態で使用するすべての培養培地は、好ましくは実質的にゼノフリー、実質的に無血清、又は実質的に規定のものであり、より好ましくはこれらの組み合わせであり、最も好ましくは同時に実質的にゼノフリー、実質的に無血清、及び実質的に規定のものである。本明細書では、「実質的に」は、意図しない痕跡は無関係であることを意味し、臨床又は実験室の規則の下で、ゼノフリー、無血清、又は規定のものとして考えられ、受け入れられているものは、ここにも適用される。
【0068】
本明細書で使用する場合、用語「ゼノフリー」は、異物や外来成分が含まれていないことを意味する。従って、ヒトの細胞培養の場合は、用語「ゼノフリー」は、ヒト以外の動物成分を含まない状態を指す。言い換えれば、ヒトでの使用のための角膜細胞を製造するためにゼノフリーの条件が望まれる場合、あらゆる細胞培養培地のすべての成分は、ヒト又は組換え体由来のものでなければならない。
【0069】
伝統的に、血清、特にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、真核細胞のインビトロ細胞培養のための必須の成長及び生存成分を提供する細胞培養において価値を見出されてきた。ＦＢＳは、食肉用に飼育された牛の食肉処理場で採取された血液から製造される。「無血清」は、培養培地が動物性又はヒト性の血清を含まないことを示す。
【0070】
規定培地（限定培地）は、未規定の（不明確な）培地、例えば、培養細胞から回収した使用済みの培地であって、培養細胞によって培地中に分泌された代謝産物、増殖因子及び細胞外マトリクスタンパク質を含有する培地を指す「馴化培地」を使用することに矛盾がある場合に価値を見出される。未規定の培地は、生物学的な自然の変動により、かなりの相違点を帯びる可能性がある。細胞培養における未規定の成分は、例えば、創薬及び毒性研究における細胞モデル実験の再現性を損なう。従って、「規定培地」又は「規定の培養培地」は、培地がすべて既知の量の材料を有する組成物を指す。
【0071】
典型的には、細胞培養のために培養培地に通常添加される血清は、既知の量の血清成分、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、及び場合によっては特定の増殖因子（例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子又は血小板由来増殖因子）で置き換えられる。
【0072】
合成培地（既知組成培地）は、化学成分がすべて既知である成長培地である。合成培地は、動物由来の成分を全く含まず、最も純粋で一貫性のある細胞培養環境を意味する。当然のこととして、合成培地は、ウシ胎仔血清も、ウシ血清アルブミンも、ヒト血清アルブミンも含むことができない。というのも、これらの産物は、ウシ又はヒトの供給元に由来し、アルブミン及び脂質の複雑な混合物を含有するからである。
【0073】
合成培地は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が、化学的に明確な組換え体（アルブミンに関連する脂質を欠く）又はＢＳＡ／ＨＳＡの機能の一部を再現できるポリマーであるポリビニルアルコール等の合成化学物質のいずれかに置き換えられている点で、無血清培地とは異なる。
【0074】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、血清代替製剤を含む。１つの例は、本発明の文脈で適用可能なゼノフリーの血清代替物を記述した、参考として本明細書に組み込まれるＲａｊａｌａら、２０１０に記載されている。適切な血清代替物のさらなる非限定的な例としては、どちらもＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ライフ・テクノロジーズ）から市販されているＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標） Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｋｏ－ＳＲ）及びゼノフリーバージョンのＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標） ＳＲ ＸｅｎｏＦｒｅｅ ＣＴＳ（商標）が挙げられる。
【0075】
治療的使用及び医薬組成物
本発明は、必要とする対象において角膜内皮機能不全を治療する方法も提供する。この方法は、有効量の本発明に従って生成されたＣＥＣ様細胞を上記対象に眼内移植する工程を含む。
本発明は、必要とする対象において角膜内皮機能不全を治療する方法も提供する。この方法は、有効量の本発明に従って生成されたＣＥＣ様細胞を上記対象に眼内移植する工程を含む。
【0076】
上記に従って、本発明は、角膜内皮機能不全を治療することにおいて使用のための、本発明に従って生成されたＣＥＣ様細胞も提供する。
【0077】
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、あらゆる哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【0078】
本明細書で使用する場合、用語「治療」又は「治療する（こと）」は、角膜内皮機能不全の改善、軽減、阻害又は治癒を含んでもよい目的で、眼内移植による対象への本発明のＣＥＣ様細胞の投与を含む。
【0079】
本明細書で使用する場合、用語「角膜内皮機能不全」は、角膜内皮細胞に影響を及ぼす任意の障害又は状態を指す。このような障害又は状態の非限定的な例としては、フックス角膜内皮ジストロフィー、水疱性角膜症、先天性遺伝性内皮ジストロフィー、後部多形性ジストロフィー（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｕｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、虹彩角膜内皮症候群、角膜浮腫、角膜白斑、角膜内皮炎症、化学熱傷及び外科的又は他の外傷が挙げられる。これらの障害及び状態の主な治療は、正常なドナー組織による異常な角膜層の置換である。
【0080】
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、角膜内皮機能不全の有害な影響が最低でも改善されるＣＥＣ様細胞の量を指す。
【0081】
治療に使用するためのＣＥＣ様細胞は、同種異系又は自己由来のいずれかであってもよい。
【0082】
本発明のＣＥＣ様細胞の移植のための量及びレジメンは、眼疾患、特に角膜内皮機能不全を治療する臨床分野の当業者によって容易に決定することができる。概して、投薬は、治療される対象の年齢、性別及び全身健康状態；もしあれば、同時治療の種類；問題の疾患又は状態の重症度及びタイプ；疾患の原因因子、並びに個々の医師によって調整されるべきである他の変数等の考慮事項に応じて変動することになる。
【0083】
移植のために、ＣＥＣ様細胞は医薬調製物で提供される。本明細書で使用する場合、用語「医薬調製物」は、ＣＥＣ様細胞並びに１つ以上の生理学的に許容できる成分、例えば、溶液、担体、アジュバント及び／又は賦形剤、の調製物を広く指す。好ましくは、上記成分は無菌である。
【0084】
本明細書で使用する場合、用語「生理学的に許容できる」及び「薬学的に許容できる」は交換可能であり、毒性、著しい刺激及び／又はアレルギー反応等の過度の有害な副作用なしに、対象、好ましくはヒト対象に投与するのに適した材料を指す。言い換えると、効果／リスク比は妥当でなければならない。さらに、生理学的に許容できる成分は、ＣＥＣ様細胞を害してはならない。
【0085】
いくつかの実施形態では、ＣＥＣ様細胞は、生理学的に許容できる溶液で提供される。適切な溶液としては、リン酸緩衝生理食塩水及びリンゲル液等の他の等張水性緩衝溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
【0086】
好ましくは前眼房への直接の眼内注射による移植のために、ＣＥＣ様細胞は、生理学的に許容できる溶液中の懸濁液として提供される。懸濁液中の細胞の密度は、所望に応じて変動してもよいが、典型的には、約１×１０６～約５×１０６細胞／ｍｌである。いくつかの実施形態では、懸濁液は、微粒子、マイクロビーズ、ゲル様マトリクス等の担体を含んでもよい。
【0087】
いくつかの実施形態では、ＣＥＣ様細胞は、ＣＥＣ様細胞の単層として提供される。単層は、約１０００細胞／ｍｍ２～約６０００細胞／ｍｍ２、好ましくは約２０００細胞／ｍｍ２～約５０００細胞／ｍｍ２、好ましくは約３０００細胞／ｍｍ２～約４０００細胞／ｍｍ２の範囲の細胞密度を有してもよい。いくつかの実施形態では、上記単層は、生理学的に許容できる担体膜上に提供される。通常、担体膜上にＣＥＣ様細胞の単層を含む医薬調製物は、細胞の生存率を維持しそれらが乾燥するのを防ぐために、生理学的に許容できる溶液も含む。
【0088】
担体膜は、ＣＥＣ様細胞を支持することができ、透明であり、そうでなくとも眼内移植に適している限り、特に限定されない。適切な担体膜の非限定的な例としては、フィブリンベースのマトリクス、内皮脱細胞化（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ－ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ）角膜ボタン、脱細胞化デスメ膜、ヒト又は非ヒト動物由来の新鮮な角膜実質ディスク、脱細胞化羊膜、魚鱗由来の足場、コラーゲン、ゼラチン、絹フィブロイン、セルロース等から調製された膜、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）等の合成ポリマー材料、半合成ヒドロゲルゼラチン－メタクリロイル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、ポリカプロラクトン等の生分解性ポリマー材料、及び鉱物系ヒドロキシアパタイトが挙げられる。
【0089】
いくつかの実施形態では、担体膜は、眼内移植に使用される最終担体膜の所望の横方向寸法に対応する横方向寸法を有する。言い換えれば、担体膜のサイズ及び形状は、使用前に膜を切断又は別様にサイズ変更することなくそのまま使用されることが意図される担体膜のサイズ及び形状に対応してもよい。いくつかの他の実施形態では、担体膜の横方向寸法は、使用される最終担体膜の横方向寸法よりも大きくてもよい。そのような実施形態では、膜のサイズ及び形状は、限定されないが例えば生検パンチ又はトレフィンによる切断及び穿孔を含む、当該技術分野で利用可能な任意の好適な技術によって、使用前に所望のサイズ及び形状に調整される。典型的には、担体膜は、約５ｍｍ～約１０ｍｍ、好ましくは約７．５ｍｍ～約８ｍｍの直径を有する円形の形状を有する。いくつかの実施形態では、担体膜の最終的なサイズ及び形状は、ヒト角膜のものに対応する。通常、担体膜の厚さは、約１００μｍ未満であり、好ましくは約５μｍ～約５０μｍの範囲にある。
【0090】
薬物開発及び基礎研究における使用
本発明は、薬物開発及び基礎研究にも適用されてもよい。例えば、本発明に従って生成されたＣＥＣ様細胞は、例えば、候補化合物によって影響を受ける生体分子相互作用及び経路を含む、候補化合物の生物学的及び薬理学的効果を研究することによって、その候補化合物の作用についての機構的洞察を得るために用いられてもよい。当該細胞は、機構的研究に加えて、例えば薬物スクリーニング又は毒物学的研究において用いられてもよい。
本発明は、薬物開発及び基礎研究にも適用されてもよい。例えば、本発明に従って生成されたＣＥＣ様細胞は、例えば、候補化合物によって影響を受ける生体分子相互作用及び経路を含む、候補化合物の生物学的及び薬理学的効果を研究することによって、その候補化合物の作用についての機構的洞察を得るために用いられてもよい。当該細胞は、機構的研究に加えて、例えば薬物スクリーニング又は毒物学的研究において用いられてもよい。
【0091】
いくつかの実施形態では、薬物開発の目的は、ＣＥＣ様細胞に対する薬理学的効果の有無について候補化合物を特定することであってもよい。薬理学的効果の存在又は不存在は、対照細胞、例えば、対照化合物と接触させたＣＥＣ様細胞又は何らの試験化合物とも接触させていないＣＥＣ様細胞、における対応する効果と比較した、マーカー発現、形態、ポンピング活性、生存率、増殖速度、及びタンパク質、サイトカイン又は細胞外マトリクス成分の分泌の変化を含むがこれらに限定されない様々な読み取り値に基づいて判定されてもよい。
【0092】
当業者によって容易に理解されるように、用いられる読み取り値は、存在又は不存在が判定される対象である薬理学的効果に依存する。判定される薬理学的効果は、所望の薬理学的効果又は有害効果であってもよい。従って、ＣＥＣ様細胞は、所望の薬理学的効果についてのスクリーニングにおいてだけでなく、有害な薬理学的効果又は任意の副作用、例えば毒性についてのスクリーニングにおいても使用されてもよい。
【0093】
従って、本発明は、本発明のＣＥＣ様細胞と、例えば上記の目的のための、細胞適合性溶液、担体、アジュバント及び／又は賦形剤等の１種以上の追加の成分とを含む調製物を提供する。いくつかの実施形態では、この担体は上記の担体膜であり、ＣＥＣ様細胞は担体膜上に提供される。本明細書で使用する場合、用語「細胞適合性」は、細胞に著しい有害作用を及ぼすことなく生細胞を維持するのに使用するのに適した成分を広く指す。
【実施例】
【0094】
実験部
以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されることが意図されているわけではない。
以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されることが意図されているわけではない。
【0095】
材料及び方法
細胞
胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株Ｒｅｇｅａ０８／０１７を、Ｓｋｏｔｔｍａｎ、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ａｎｉｍ． ２０１０；４６（３－４）：２０６－９によって記載され特徴付けられたように誘導した。
細胞
胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株Ｒｅｇｅａ０８／０１７を、Ｓｋｏｔｔｍａｎ、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ａｎｉｍ． ２０１０；４６（３－４）：２０６－９によって記載され特徴付けられたように誘導した。
【0096】
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を、ＣｙｔｏＴｕｎｅ（商標）－ｉＰＳ２．０ Ｓｅｎｄａｉ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｋｉｔを製造者の指示に従って使用して、末梢血単核球から生成した。
【0097】
ヒト初代ＣＥＣは、臨床使用に適さない提供された角膜から得た。
【0098】
研究のための余剰ヒト胚由来のｈＥＳＣ株の使用（Ｒ０５１１６）並びに患者及び健康な自発的なドナーを含む眼科研究のためのｈｉＰＳＣ株の産生（Ｒ１６１１６）に関するピルカンマー（Ｐｉｒｋａｎｍａａ）病院地域の倫理委員会からの適切な声明の下で、すべての細胞実験を実施した。さらには、Ｒｅｇｅａ組織バンクとともに、Ｔａｍｐｅｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（タンペレ大学）は、移植に適さないヒトドナー角膜の研究使用について倫理的承認（Ｒ１１１３４）を得ている。
【0099】
提供された組織の使用の書面及び口頭による説明の後に、各提供について自由かつ完全なインフォームドコンセントを受け取った。
【0100】
角膜内皮細胞（ＣＥＣ）へのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化
胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を使用してＣＥＣを生成した。簡潔には、ｈＰＳＣを、ラミニン５２１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ（バイオラミナ））コーティングＣｅｌｌＢｉｎｄ ６／１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（コーニング））上に１００００～６００００細胞／ｃｍ２細胞密度で播種した。この細胞をＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（サーモフィッシャー））中で２４時間培養した。１日目に、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地を、１０μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ（ステムセル））、４μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）及び１０μＭレチノイン酸（ＲＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマ・アルドリッチ））を補充した誘導培地と交換した。誘導培地のベースは、ＫＯ－ＤＭＥＭ、１５％ノックアウト血清代替物、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ－Ｉ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（すべてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製）、１％非必須アミノ酸、５０Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンからなった。４～７日目の間、ＲＡを完全に除去するか、又はその濃度を、例えば１０μＭ ＲＡを３日間使用し、続いて次の１～３日間５μＭに低下させ、さらに続いてこの分化方法の残りの期間中ＲＡを完全に省略するか、若しくはＲＡの濃度を１μＭに低下させることによって、濃度を徐々に低下させた。９日目の後、ＣＥＣ様細胞は形成され、これを分析のために回収した。
胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を使用してＣＥＣを生成した。簡潔には、ｈＰＳＣを、ラミニン５２１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ（バイオラミナ））コーティングＣｅｌｌＢｉｎｄ ６／１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（コーニング））上に１００００～６００００細胞／ｃｍ２細胞密度で播種した。この細胞をＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（サーモフィッシャー））中で２４時間培養した。１日目に、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地を、１０μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ（ステムセル））、４μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）及び１０μＭレチノイン酸（ＲＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマ・アルドリッチ））を補充した誘導培地と交換した。誘導培地のベースは、ＫＯ－ＤＭＥＭ、１５％ノックアウト血清代替物、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ－Ｉ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（すべてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製）、１％非必須アミノ酸、５０Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンからなった。４～７日目の間、ＲＡを完全に除去するか、又はその濃度を、例えば１０μＭ ＲＡを３日間使用し、続いて次の１～３日間５μＭに低下させ、さらに続いてこの分化方法の残りの期間中ＲＡを完全に省略するか、若しくはＲＡの濃度を１μＭに低下させることによって、濃度を徐々に低下させた。９日目の後、ＣＥＣ様細胞は形成され、これを分析のために回収した。
【0101】
免疫細胞化学によるｈＰＳＣ由来ＣＥＣの特性決定
ｈＰＳＣ由来ＣＥＣを免疫細胞化学によって分析した。簡潔には、この細胞を１％又は４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１５分間固定した。次に、この細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間透過処理し、続いて３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロッキングした。次いで、この細胞を最初に、１：４００ 密着帯１（ＺＯ－１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：２００ α１ナトリウムカリウムＡＴＰアーゼ（Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰアーゼ、Ａｂｃａｍ（アブカム））及び１：４００ ＣＤ１６６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ビーディー・バイオサイエンシーズ））一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。次に、この細胞をＺＯ－１に対して１：８００のロバ抗ウサギＩｇＧ二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）；Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰアーゼ及びＣＤ１６６に対して１：８００のロバ抗マウスＩｇＧ二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）；ＯＣＴ－３／４に対して１：８００のロバ抗ヤギＩｇＧ二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で処理した。核を４’，６－ジアミジン－２’－フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ベクター・ラボラトリーズ））で対比染色した。マウントした細胞の像を、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ５１；オリンパス、東京、日本）を用いて取り込み、画像編集ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＣ２０１８；Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（アドビシステムズ））を用いて調製した。
ｈＰＳＣ由来ＣＥＣを免疫細胞化学によって分析した。簡潔には、この細胞を１％又は４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１５分間固定した。次に、この細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間透過処理し、続いて３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロッキングした。次いで、この細胞を最初に、１：４００ 密着帯１（ＺＯ－１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：２００ α１ナトリウムカリウムＡＴＰアーゼ（Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰアーゼ、Ａｂｃａｍ（アブカム））及び１：４００ ＣＤ１６６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ビーディー・バイオサイエンシーズ））一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。次に、この細胞をＺＯ－１に対して１：８００のロバ抗ウサギＩｇＧ二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）；Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰアーゼ及びＣＤ１６６に対して１：８００のロバ抗マウスＩｇＧ二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）；ＯＣＴ－３／４に対して１：８００のロバ抗ヤギＩｇＧ二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で処理した。核を４’，６－ジアミジン－２’－フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ベクター・ラボラトリーズ））で対比染色した。マウントした細胞の像を、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ５１；オリンパス、東京、日本）を用いて取り込み、画像編集ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＣ２０１８；Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（アドビシステムズ））を用いて調製した。
【0102】
位相差顕微鏡法
ＤＳ－Ｆｉ１カメラを備えた位相差光学顕微鏡Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００－Ｓ（ニコン、東京、日本）を使用して、細胞形態の像を取り込んだ。
ＤＳ－Ｆｉ１カメラを備えた位相差光学顕微鏡Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００－Ｓ（ニコン、東京、日本）を使用して、細胞形態の像を取り込んだ。
【0103】
ｑＰＣＲ
Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉｋｉｔ Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン））を用いて、未分化ｈＰＳＣ（ｄ０）から、及びｈＣＥＣ誘導の時間の間の３つの時間点（ｄ３、ｄ６及びｄ９）から全ＲＮＡを抽出した。各試料のＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ－１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ナノドロップ・テクノロジーズ））を使用して決定した。各ＲＮＡ試料から、４００ｎｇを使用して、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ＲＴキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アプライド・バイオシステムズ））を使用してｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ試料を、配列特異的ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ＯＣＴ４（Ｈｓ００９９９６３２＿ｇ１）、ＰＩＴＸ２（Ｈｓ０１５５３１７９＿ｍ１）、ＡＱＰ１（Ｈｓ０１０２８９１６＿ｍ１）、ＳＬＣ４Ａ４（Ｈｓ００１８６７９８＿ｍ１）、及びＦＯＸＣ１（Ｈｓ００５５９４７３＿ｓ１）についてｑＰＣＲにより分析した。すべての試料を、７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて３回の反応として実行した。結果を７３００ Ｓｙｓｔｅｍ ＳＤＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（マイクロソフト・エクセル）（登録商標）で分析した。このソフトウェアによって与えられるサイクル閾値（ＣＴ）の値に基づいて、各遺伝子の相対的定量を、－２ΔΔＣｔ法（Ｌｉｖａｋ及びＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ、２００１）を適用することによって計算した。結果をＧＡＰＤＨ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）に対して正規化し、未分化ｈＰＳＣを較正物質として用いて、各試料における遺伝子発現の相対量を決定した。
Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉｋｉｔ Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン））を用いて、未分化ｈＰＳＣ（ｄ０）から、及びｈＣＥＣ誘導の時間の間の３つの時間点（ｄ３、ｄ６及びｄ９）から全ＲＮＡを抽出した。各試料のＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ－１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ナノドロップ・テクノロジーズ））を使用して決定した。各ＲＮＡ試料から、４００ｎｇを使用して、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ＲＴキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アプライド・バイオシステムズ））を使用してｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ試料を、配列特異的ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ＯＣＴ４（Ｈｓ００９９９６３２＿ｇ１）、ＰＩＴＸ２（Ｈｓ０１５５３１７９＿ｍ１）、ＡＱＰ１（Ｈｓ０１０２８９１６＿ｍ１）、ＳＬＣ４Ａ４（Ｈｓ００１８６７９８＿ｍ１）、及びＦＯＸＣ１（Ｈｓ００５５９４７３＿ｓ１）についてｑＰＣＲにより分析した。すべての試料を、７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて３回の反応として実行した。結果を７３００ Ｓｙｓｔｅｍ ＳＤＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（マイクロソフト・エクセル）（登録商標）で分析した。このソフトウェアによって与えられるサイクル閾値（ＣＴ）の値に基づいて、各遺伝子の相対的定量を、－２ΔΔＣｔ法（Ｌｉｖａｋ及びＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ、２００１）を適用することによって計算した。結果をＧＡＰＤＨ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）に対して正規化し、未分化ｈＰＳＣを較正物質として用いて、各試料における遺伝子発現の相対量を決定した。
【0104】
結果
以前の研究において、ＳＢ４３１５４２及びＣＨＩＲ９９０２１は、神経堤細胞の分化に使用され、その後、Ｂ２７、ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＤＫＫ２等の様々な誘導カクテルの添加が続いた（Ｗａｇｏｎｅｒら、２０１８）。本発明者らは、分化開始時に３～５日間、ＳＢ４３１５４２及びＣＨＩＲ９９０２１とともにレチノイン酸（ＲＡ）を添加することにより、角膜内皮細胞（ＣＥＣ）様細胞をより簡単かつ迅速に分化させることができることを見出した。７日間の分化後、細胞の形態は多角形になり、天然の六角形の外観に近くなった。最初の３～５日間のＲＡの存在は、細胞単層をドーム様構造にし、これは、細胞におけるバリア特性及びポンピング活性を示す。ＲＡを用いない細胞培養物は、これらの特徴を有さなかった（図１）。
以前の研究において、ＳＢ４３１５４２及びＣＨＩＲ９９０２１は、神経堤細胞の分化に使用され、その後、Ｂ２７、ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＤＫＫ２等の様々な誘導カクテルの添加が続いた（Ｗａｇｏｎｅｒら、２０１８）。本発明者らは、分化開始時に３～５日間、ＳＢ４３１５４２及びＣＨＩＲ９９０２１とともにレチノイン酸（ＲＡ）を添加することにより、角膜内皮細胞（ＣＥＣ）様細胞をより簡単かつ迅速に分化させることができることを見出した。７日間の分化後、細胞の形態は多角形になり、天然の六角形の外観に近くなった。最初の３～５日間のＲＡの存在は、細胞単層をドーム様構造にし、これは、細胞におけるバリア特性及びポンピング活性を示す。ＲＡを用いない細胞培養物は、これらの特徴を有さなかった（図１）。
【0105】
このＣＥＣ様細胞をさらに特徴付けるために、免疫蛍光染色を実施して、正しいタンパク質発現及び局在を検証した。この細胞を、基本的なＣＥＣマーカーである密着帯１（ＺＯ－１）、密着結合マーカーであるＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ、ＣＥＣにとって重要なポンプタンパク質、及びＣＤ１６６、ＣＥＣに比較的特異的であることが認められている表面マーカー、について免疫染色した（図２）。ＺＯ－１は細胞の境界に局在し、細胞が強固に接着していることを実証した（図２）。ＲＡを用いた細胞は、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ免疫染色を比較すると、培養したヒト初代ＣＥＣによく似ていた（図３）。ＣＤ１６６は、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼと同じ領域の表面上に局在していた（図２）。
【0106】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【国際調査報告】