特表 2023-540980 ニコチンアミドリボシドクロリドからのジヒドロニコチンアミドリボシドの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-27

(54)【発明の名称】ニコチンアミドリボシドクロリドからのジヒドロニコチンアミドリボシドの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07H 19/04 20060101AFI20230920BHJP

【ＦＩ】

C07H19/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023514915

(86)(22)【出願日】2021-09-14

(85)【翻訳文提出日】2023-03-03

(86)【国際出願番号】 EP2021075245

(87)【国際公開番号】W WO2022058312

(87)【国際公開日】2022-03-24

(31)【優先権主張番号】63/078,526

(32)【優先日】2020-09-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】590002013

【氏名又は名称】ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー

(71)【出願人】

【識別番号】508065732

【氏名又は名称】コーネル ユニヴァーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100140453

【弁理士】

【氏名又は名称】戸津 洋介

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】ザレイ， アミン

(72)【発明者】

【氏名】カズドゥーズ， レイラ

(72)【発明者】

【氏名】エナヤティヌーク， モジタバ

(72)【発明者】

【氏名】マダルシャヒアン， サラ

(72)【発明者】

【氏名】アッバスプーラド， アリレザ

(72)【発明者】

【氏名】ウハイル， ゲルハルト

【テーマコード（参考）】

4C057

【Ｆターム（参考）】

4C057AA19

4C057BB02

4C057CC03

4C057DD01

4C057LL03

4C057LL18

(57)【要約】

１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）の製造方法が開示される。この方法は、ニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）の溶液を準備する工程と、金属ジチオナイトを第１の温度下で溶液に添加する工程と、第２の温度下、溶液中で金属ジチオナイトをニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）と反応させて混合物を形成する工程と、を含み、混合物の少なくとも一部分は、１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）を含む。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）の製造方法であって、
ニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）の溶液を準備する工程と、
金属ジチオナイトを第１の温度下で前記溶液に添加する工程と、
第２の温度下、前記溶液中で前記金属ジチオナイトを前記ニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）と反応させて混合物を形成する工程と、
を含み、前記混合物の少なくとも一部分は、前記１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）を含む、方法。

【請求項2】

前記ニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）が、β－ニコチンアミドリボシドクロリド（β－ＮＲＣｌ）を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記溶液が、塩基性溶液である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記塩基性溶液が、ＮａＨＣＯ_３を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記塩基性溶液のｐＨ値を８．０～８．５に維持する工程を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記塩基性溶液が、１．０Ｍ～１．５ＭのＮａＨＣＯ_３濃度を有する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記塩基性溶液が、約１．２ＭのＮａＨＣＯ_３濃度を有する、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記金属ジチオナイトが、亜ジチオン酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記第１の温度が、約０℃である、請求項１に記載の方法°。

【請求項10】

前記第２の温度が、室温である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記溶液から酸素をパージする工程、及び前記溶液を不活性ガス下に保持する工程を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記不活性ガスが、窒素ガスを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記混合物を凍結乾燥して黄色固体粉末を得る工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

塩基性アルミナとシリカとの混合物を用いるカラムクロマトグラフィーによって前記黄色固体粉末を精製する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記塩基性アルミナ及び前記シリカが、約２：３の重量比を有する、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）が、少なくとも９０％の純度を有する、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）の前記純度が、少なくとも９３％である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）の前記純度が、少なくとも９５％である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）の前記純度が、少なくとも９６％である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）の収率が、少なくとも４０％である、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

前記１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）の前記収率が、少なくとも４５％である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）の前記収率が、少なくとも５０％である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）の前記収率が、少なくとも５５％である、請求項２２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［背景技術］
[0001]本開示は、概して、ニコチンアミドリボシドクロリドからのジヒドロニコチンアミドリボシドの製造方法、並びに関連する精製及び安定化の方法に関する。

【0002】

[0002]ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）及びその還元型１，４－ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）は、電子伝達によるエネルギー代謝及びミトコンドリア機能において重要な分子である。さらに、ＮＡＤ^＋は、アデノシン二リン酸リボース（ＡＤＰ－リボース）に、２種類の必須タンパク質ファミリー、サーチュイン（ＳＩＲＴ）及びポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の機能を酵素触媒させることから、数多くの非酸化還元反応における重要な補因子である。サーチュインは、核、ミトコンドリア、細胞質又は代謝の恒常性を維持するいくつかの重要な役割を有する。ＰＡＲＰの最も重要な役割は、ＤＮＡの修復、並びにクロマチンの構造及び機能の維持である。老化、及び急性傷害又は慢性の代謝若しくは炎症状態などのいくつかの破壊的な因子は、ＮＡＤ^＋のレベルを重度に低下させ得る。

【0003】

[0003]ＮＡＤ^＋の低下は、エネルギー産生の減少につながり、その後、細胞機能、細胞恒常性及び免疫細胞機能を悪化させる。損傷を修復するには大量のＮＡＤ^＋が必要であるため、この現象は、細胞が通常の環境因子によって損傷を受けた場合、さらにより重要になる。損傷が重度である場合、損傷が生じた細胞は、恒常性維持に必要なＮＡＤ^＋を提供するのに十分な貯蔵エネルギーを有しなくなるため、損傷は不可逆的なものになる。不可欠な器官である脳、心臓、肝臓、腎臓及び骨格筋は、多数のミトコンドリアを有する器官であり、したがってＮＡＤ^＋枯渇に対してより感受性が高い。したがって、組織に損傷を受けた細胞のエネルギーを正常レベルに保つためには、エネルギーに富んだＮＡＤ^＋前駆体が必要とされる。ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）、ニコチン酸（ナイアシン）及びニコチンアミドは、市販されている天然化合物であり、ＮＡＤ^＋の濃度を増加させるための栄養補助食品として用いられている。

【0004】

[0004]ＮＲは、哺乳動物細胞においてより少ないステップでＮＡＤ^＋に代謝されることから、ナイアシン及びニコチンアミドと比較して、より効率的なＮＡＤ^＋前駆体である（スキーム１）。研究によって、栄養補助食品としてＮＲを摂取することが、ＮＡＤ^＋の代謝を刺激するのに有効であり、ＮＡＤ^＋のレベルを６０パーセント上昇させることができることが示されている。

【0005】

【化1】

【0006】

[0005]ＮＲは、細胞のＮＡＤ^＋レベルを増加させ、細胞の健康状態を改善することができるが、効果を発揮させるためには、ＮＲを大量に摂取しなければならない。最近、Ｓａｕｖｅ ｅｔ ａｌ．は、１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）を合成し、この化合物がインビトロ条件及びインビボ条件の両方において強力なＮＡＤ^＋濃度増強剤であることを実証した。彼らは、ＮＲＨの哺乳動物細胞への投与後に、この投与がＮＡＤ^＋濃度を僅か１時間で対照値よりも２．５～１０倍増加させることを見出した。彼らの発見は、ＮＲＨの使用がＮＲ又はＮＭＮのいずれよりも有効であることを示している。さらに、ＮＲＨは、細胞におけるアポトーシスマーカーを誘導せずに又は乳酸レベルを実質的に上昇させずに、培養細胞のＮＡＤ^＋／ＮＡＤＨ比を大きく高める。さらに最近になって、Ｃａｎｔｏ ｅｔ ａｌ．は、ＮＲＨが、ＮＲ経路とは対照的に、異なるステップ及び酵素を用いてＮＡＤ^＋を合成していることを見出した。このことは、哺乳動物細胞において、ＮＲＨがＮＲと比較してより有効であり、かつより効き目の速いＮＡＤ^＋前駆体である理由を説明するものである。同研究者らはまた、マウスを用いた実験において、ＮＲＨが、経口投与によりＮＡＤ^＋前駆体として生体利用可能であり、シスプラチン誘導性の急性腎傷害を予防することも実証した。ＮＡＤ^＋レベルを増加させることに加えて、ＮＲＨはまた、過酸化水素及びメチルメタンスルホネートなどのいくつかの遺伝毒性物質を枯渇させることもできる。結果として、ＮＲＨで処理されたマウス細胞は、細胞死に対して耐性を有する。

【0007】

[0006]ＮＲＨの製造方法はごく少ない。この化合物は、アルカリホスファターゼの存在下での５’－リン酸エステルの加水分解によって、ジヒドロニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮＨ）から製造することができる。ＮＭＮＨを前駆体とする場合、ＮＡＤＨから酵素作用により加水分解しなければならないことから、ＮＭＮＨからの方法は、時間がかかり、費用対効果が低い。ＮＲＨの別の合成方法は、還元剤としての亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４）の存在下でのＮＲの還元である。この方法では、ニコチンアミドリボシドトリフレートが、亜ジチオン酸ナトリウム及びリン酸水素カリウムの水溶液中でＮＲＨに還元される（スキーム２）。Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４の水溶液は、周囲条件で非常に不安定であることから、この反応は、低温で、嫌気性アルカリ条件下で行わなければならない。さらに、実施例の結果及び考察に示されるように、ＮＲＨは周囲条件で加水分解及び酸化の両方に感受性が高いことから、粗生成物は、Ｃ１８樹脂を用いたＨＰＬＣで直ちに精製しなければならない。

【0008】

【化2】

【0009】

[0007]この方法は少量のＮＲＨ合成には適しているものの、この方法をＮＲＨの商業生産にスケールアップすることを妨げるいくつかの欠点がある。前駆体であるニコチンアミドリボシドトリフレートは、非常に高価であり、非常に吸湿性の材料であり、不活性雰囲気下の－２０℃で保存しなければならない。さらに、この化合物は、ニコチンアミドリボシドトリフレートの構造中にトリフレートアニオンが存在するため、食品用ではない。したがって、還元後に、残存するＮＲ（トリフレート）からＮＲＨを完全に精製することが必要である。

【0010】

[0008]ＮＲＨの別の合成方法は、ニコチンアミドリボシドトリフレートの代わりにトリアセチル化ニコチンアミドリボシドトリフレートを使用することである（スキーム３）。この間接的手法の第１の工程では、トリアセチル化ＮＲが、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４によりトリアセチル化ＮＲＨに変換される。次の工程では、ボールミリングしながらのトリアセチル化ＮＲＨのメタノリシスによって、ＮＲＨが形成される。この方法は、良好な収率が得られることから、ＮＲＨのスケールアップ可能な合成に適している可能性がある。しかしながら、高価で食品用ではない物質であるトリアセチル化ニコチンアミドリボシドトリフレートの使用は、この手法を制限し得る。

【0011】

【化3】

[0009]ＮＲＨの合成に用いられてきたニコチンアミドリボシドのほとんどは、α体及びβ体の２種類のアノマーの混合物であることには留意されたい。しかしながら、ＮＲのβ－アノマーのみが、生物活性及び医薬特性を示す。ＮＲ誘導体の中で、ニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）のみが、ダイエタリー・サプリメントとして市販されている。

【0012】

［発明の概要］
[0010]本開示は、ＮＲＨを合成するための前駆体としてβ－ＮＲＣｌを使用することが、所望される有用な生成物であるＮＲＨの商業化のためのブレークスルーとなるという認識を含む。実際、本明細書に開示されるＮＲＨの製造方法は、市販のＮＲ又はβ－ＮＲＣｌなどのその誘導体からの収率が有利に高い。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】本開示によって提供される実施形態による、ニコチンアミドリボシドクロリドからのジヒドロニコチンアミドリボシドの例示的な製造方法を示す図である。

【図2A】本開示によって提供される実施形態による、ｐＨ８．１で合成したＮＲＨの精製後のＴＬＣを、ＮＲ及びＮＡと比較して示す写真のセット（ＦＩＧ．２Ａ）、並びに精製後のＮＲＨ及び元のＮＲのＦＴ－ＩＲを示すグラフのセットである。

【図2B】本開示によって提供される実施形態による、ｐＨ８．１で合成したＮＲＨの精製後のＴＬＣを、ＮＲ及びＮＡと比較して示す写真のセット（ＦＩＧ．２Ａ）、並びに精製後のＮＲＨ及び元のＮＲのＦＴ－ＩＲを示すグラフのセットである。

【図3-1】本開示によって提供される実施形態による、Ｄ_２Ｏ中の精製ＮＲＨの^１Ｈ ＮＭＲを示すグラフのセットである。

【図3-2】本開示によって提供される実施形態による、Ｄ_２Ｏ中の精製ＮＲＨの^１Ｈ ＮＭＲを示すグラフのセットである。

【図4AC】本開示によって提供される実施形態による、Ｄ_２Ｏ中のＮＲＣｌ（図４ａ）、ＮＲＨ（ＦＩＧ．４Ｂ）及びＮＡ（ＦＩＧ．４Ｃ）の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示すグラフのセットである。

【図5A】本開示によって提供される実施形態による、ｐＨ８．５で合成したＮＲＨの精製後のＴＬＣを、ＮＲＣｌ及びＮＡと比較して示す写真のセット（ＦＩＧ．５Ａ）、並びにｐＨ８．５で合成したＮＲＨの精製後の^１Ｈ ＮＭＲを示すグラフのセット（ＦＩＧ．５Ｂ）である。

【図5B】本開示によって提供される実施形態による、ｐＨ８．５で合成したＮＲＨの精製後のＴＬＣを、ＮＲＣｌ及びＮＡと比較して示す写真のセット（ＦＩＧ．５Ａ）、並びにｐＨ８．５で合成したＮＲＨの精製後の^１Ｈ ＮＭＲを示すグラフのセット（ＦＩＧ．５Ｂ）である。

【図6A】Ｎ_２雰囲気下、２５～９００℃の範囲における、ＮＲＣｌと比較したＮＲＨのＴＧＡサーモグラムを示すグラフのセットである。本開示によって提供される実施形態による、重量減少対温度（ＦＩＧ．６Ａ）、微分重量減少対温度（ＦＩＧ．６Ｂ）。

【図6B】Ｎ_２雰囲気下、２５～９００℃の範囲における、ＮＲＣｌと比較したＮＲＨのＴＧＡサーモグラムを示すグラフのセットである。本開示によって提供される実施形態による、重量減少対温度（ＦＩＧ．６Ａ）、微分重量減少対温度（ＦＩＧ．６Ｂ）。

【図7A】ＮＲＨの分解動態試験を示すグラフのセットである。本開示によって提供される実施形態による、暗所／明所及び空気中／Ｎ_２下での６０日間の保存の過程における水溶液試料中のＮＲＨ回収率（％）（ＦＩＧ．７Ａ）、空気中／Ｎ_２下での６０日間の保存の過程において、４℃及び２５℃で保持されている水溶液中のＮＲＨの回収率（ＦＩＧ．７Ｂ）、空気中及びＮ_２下、２５℃での６０日間の保存の過程におけるＮＲＨの安定性に対するｐＨ５、７、及び９の緩衝剤の影響（ＦＩＧ．７Ｃ）、４℃及び２５℃での３０日間及び６０日間の保存の過程における水溶液試料中のＮＲ及びＮＲＨの回収率（％）（ＦＩＧ．７Ｄ）。

【図7B】ＮＲＨの分解動態試験を示すグラフのセットである。本開示によって提供される実施形態による、暗所／明所及び空気中／Ｎ_２下での６０日間の保存の過程における水溶液試料中のＮＲＨ回収率（％）（ＦＩＧ．７Ａ）、空気中／Ｎ_２下での６０日間の保存の過程において、４℃及び２５℃で保持されている水溶液中のＮＲＨの回収率（ＦＩＧ．７Ｂ）、空気中及びＮ_２下、２５℃での６０日間の保存の過程におけるＮＲＨの安定性に対するｐＨ５、７、及び９の緩衝剤の影響（ＦＩＧ．７Ｃ）、４℃及び２５℃での３０日間及び６０日間の保存の過程における水溶液試料中のＮＲ及びＮＲＨの回収率（％）（ＦＩＧ．７Ｄ）。

【図7C】ＮＲＨの分解動態試験を示すグラフのセットである。本開示によって提供される実施形態による、暗所／明所及び空気中／Ｎ_２下での６０日間の保存の過程における水溶液試料中のＮＲＨ回収率（％）（ＦＩＧ．７Ａ）、空気中／Ｎ_２下での６０日間の保存の過程において、４℃及び２５℃で保持されている水溶液中のＮＲＨの回収率（ＦＩＧ．７Ｂ）、空気中及びＮ_２下、２５℃での６０日間の保存の過程におけるＮＲＨの安定性に対するｐＨ５、７、及び９の緩衝剤の影響（ＦＩＧ．７Ｃ）、４℃及び２５℃での３０日間及び６０日間の保存の過程における水溶液試料中のＮＲ及びＮＲＨの回収率（％）（ＦＩＧ．７Ｄ）。

【図7D】ＮＲＨの分解動態試験を示すグラフのセットである。本開示によって提供される実施形態による、暗所／明所及び空気中／Ｎ_２下での６０日間の保存の過程における水溶液試料中のＮＲＨ回収率（％）（ＦＩＧ．７Ａ）、空気中／Ｎ_２下での６０日間の保存の過程において、４℃及び２５℃で保持されている水溶液中のＮＲＨの回収率（ＦＩＧ．７Ｂ）、空気中及びＮ_２下、２５℃での６０日間の保存の過程におけるＮＲＨの安定性に対するｐＨ５、７、及び９の緩衝剤の影響（ＦＩＧ．７Ｃ）、４℃及び２５℃での３０日間及び６０日間の保存の過程における水溶液試料中のＮＲ及びＮＲＨの回収率（％）（ＦＩＧ．７Ｄ）。

【図8】Ｄ_２Ｏ中のＮＲＨの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示すグラフである。

【図9】Ｄ_２Ｏ中のＮＲＨの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示すグラフのセットである（５．００～７．２０ｐｐｍを拡大）。

【図10】Ｄ_２Ｏ中のＮＲＨの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示すグラフのセットである（４．１１～４．９５ｐｐｍを拡大）。

【図11】Ｄ_２Ｏ中のＮＲＨの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示すグラフのセットである（３．０９～４．０３ｐｐｍを拡大）。

【図12】Ｄ_２Ｏ中のＮＲＨの^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを示すグラフである。

【図13】ＣＤ_３ＯＤ中のＮＲＨの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示すグラフである。

【図14】ＣＤ_３ＯＤ中のＮＲＨの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示すグラフのセットである（４．７６～７．２２ｐｐｍを拡大）。

【図15】ＣＤ_３ＯＤ中のＮＲＨの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示すグラフのセットである（３．０６～４．１２ｐｐｍを拡大）。

【図16】ＣＤ_３ＯＤ中のＮＲＨの^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを示すグラフである。

【図17】ＮＲＨのＭＳを示すグラフである。

【図18】ＮＲＨの選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を示すグラフである。

【図19】Ｈ_２Ｏ中のＮＲＨのＵＶ－ＶＩＳスペクトルを示すグラフである。

【図20A】ＦＩＧ．２０Ａ）２２０ｎｍでのＵＶ検出器による、精製ＮＲＨのＨＰＬＣクロマトグラム。ＦＩＧ．２０Ｂ）３４０ｎｍでのＵＶ検出器による、精製ＮＲＨのＨＰＬＣクロマトグラム。ＦＩＧ．２０Ｃ）蛍光検出器による、精製ＮＲＨのＨＰＬＣクロマトグラム。

【図20B】ＦＩＧ．２０Ａ）２２０ｎｍでのＵＶ検出器による、精製ＮＲＨのＨＰＬＣクロマトグラム。ＦＩＧ．２０Ｂ）３４０ｎｍでのＵＶ検出器による、精製ＮＲＨのＨＰＬＣクロマトグラム。ＦＩＧ．２０Ｃ）蛍光検出器による、精製ＮＲＨのＨＰＬＣクロマトグラム。

【図20C】ＦＩＧ．２０Ａ）２２０ｎｍでのＵＶ検出器による、精製ＮＲＨのＨＰＬＣクロマトグラム。ＦＩＧ．２０Ｂ）３４０ｎｍでのＵＶ検出器による、精製ＮＲＨのＨＰＬＣクロマトグラム。ＦＩＧ．２０Ｃ）蛍光検出器による、精製ＮＲＨのＨＰＬＣクロマトグラム。

【図21A】異なる条件で６０日間保存したＮＲＨ水溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２１Ａ）４℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｂ）４℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｃ）２５℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｄ）２５℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｅ）２５℃でＮ２及び明所下。ＦＩＧ．２１Ｆ）２５℃で空気及び明所下。

【図21B】異なる条件で６０日間保存したＮＲＨ水溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２１Ａ）４℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｂ）４℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｃ）２５℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｄ）２５℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｅ）２５℃でＮ２及び明所下。ＦＩＧ．２１Ｆ）２５℃で空気及び明所下。

【図21C】異なる条件で６０日間保存したＮＲＨ水溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２１Ａ）４℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｂ）４℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｃ）２５℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｄ）２５℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｅ）２５℃でＮ２及び明所下。ＦＩＧ．２１Ｆ）２５℃で空気及び明所下。

【図21D】異なる条件で６０日間保存したＮＲＨ水溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２１Ａ）４℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｂ）４℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｃ）２５℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｄ）２５℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｅ）２５℃でＮ２及び明所下。ＦＩＧ．２１Ｆ）２５℃で空気及び明所下。

【図21E】異なる条件で６０日間保存したＮＲＨ水溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２１Ａ）４℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｂ）４℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｃ）２５℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｄ）２５℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｅ）２５℃でＮ２及び明所下。ＦＩＧ．２１Ｆ）２５℃で空気及び明所下。

【図21F】異なる条件で６０日間保存したＮＲＨ水溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２１Ａ）４℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｂ）４℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｃ）２５℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｄ）２５℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２１Ｅ）２５℃でＮ２及び明所下。ＦＩＧ．２１Ｆ）２５℃で空気及び明所下。

【図22A】異なる条件で６０日間保存したＮＲＨ水溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２２Ａ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２２Ｂ）ｐＨ＝７．０、４℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２２Ｃ）ｐＨ＝９．０、２５℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２２Ｄ）ｐＨ＝９．０、２５℃で空気及び暗所下。

【図22B】異なる条件で６０日間保存したＮＲＨ水溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２２Ａ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２２Ｂ）ｐＨ＝７．０、４℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２２Ｃ）ｐＨ＝９．０、２５℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２２Ｄ）ｐＨ＝９．０、２５℃で空気及び暗所下。

【図22C】異なる条件で６０日間保存したＮＲＨ水溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２２Ａ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２２Ｂ）ｐＨ＝７．０、４℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２２Ｃ）ｐＨ＝９．０、２５℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２２Ｄ）ｐＨ＝９．０、２５℃で空気及び暗所下。。

【図22D】異なる条件で６０日間保存したＮＲＨ水溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２２Ａ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２２Ｂ）ｐＨ＝７．０、４℃で空気及び暗所下。ＦＩＧ．２２Ｃ）ｐＨ＝９．０、２５℃でＮ２及び暗所下。ＦＩＧ．２２Ｄ）ｐＨ＝９．０、２５℃で空気及び暗所下。

【図23A】ＮＲＨ試料の一部についての動態グラフ及び一次分解速度を示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２３Ａ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｂ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｃ、ＦＩＧ．２３Ｄ）ｐＨ＝９．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｅ）ＤＩ水、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｆ）ＤＩ水、２５℃でＮ２及び空気下。

【図23B】ＮＲＨ試料の一部についての動態グラフ及び一次分解速度を示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２３Ａ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｂ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｃ、ＦＩＧ．２３Ｄ）ｐＨ＝９．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｅ）ＤＩ水、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｆ）ＤＩ水、２５℃でＮ２及び空気下。

【図23C】ＮＲＨ試料の一部についての動態グラフ及び一次分解速度を示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２３Ａ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｂ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｃ、ＦＩＧ．２３Ｄ）ｐＨ＝９．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｅ）ＤＩ水、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｆ）ＤＩ水、２５℃でＮ２及び空気下。

【図23D】ＮＲＨ試料の一部についての動態グラフ及び一次分解速度を示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２３Ａ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｂ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｃ、ＦＩＧ．２３Ｄ）ｐＨ＝９．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｅ）ＤＩ水、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｆ）ＤＩ水、２５℃でＮ２及び空気下。

【図23E】ＮＲＨ試料の一部についての動態グラフ及び一次分解速度を示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２３Ａ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｂ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｃ、ＦＩＧ．２３Ｄ）ｐＨ＝９．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｅ）ＤＩ水、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｆ）ＤＩ水、２５℃でＮ２及び空気下。

【図23F】ＮＲＨ試料の一部についての動態グラフ及び一次分解速度を示すグラフのセットである。ＦＩＧ．２３Ａ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｂ）ｐＨ＝７．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｃ、ＦＩＧ．２３Ｄ）ｐＨ＝９．０、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｅ）ＤＩ水、２５℃でＮ２及び空気下。ＦＩＧ．２３Ｆ）ＤＩ水、２５℃でＮ２及び空気下。

【発明を実施するための形態】

【0014】

[0011]定義
[0012]以下、いくつかの定義を示す。しかしながら定義が以下の「実施形態」の項にある場合もあり、上記の見出し「定義」は、「実施形態」の項におけるそのような開示が定義ではないことを意味するものではない。

【0015】

[0013]本明細書に記載する全ての百分率は、別途記載のない限り、組成物の総重量によるものである。本明細書で使用するとき、「約」、「およそ」、及び「実質的に」は、数値のある範囲内、例えば、参照数字の－１０％から＋１０％の範囲内、好ましくは参照数字の－５％から＋５％の範囲内、より好ましくは、参照数字の－１％から＋１％の範囲内、最も好ましくは参照数字の－０．１％から＋０．１％の範囲内の数を指すものと理解される。本明細書における全ての数値範囲は、その範囲内の全ての整数又は分数を含むと理解されるべきである。更に、これらの数値範囲は、この範囲内の任意の数又は数の部分集合を対象とする請求項をサポートすると解釈されたい。例えば、１～１０という開示は、１～８、３～７、１～９、３．６～４．６、３．５～９．９などの範囲をサポートするものと解釈されたい。

【0016】

[0014]本開示及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、別段の指示がない限り、複数の参照物も含まれる。したがって、例えば、「１つの構成要素（ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」又は「その構成要素（ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」についての言及は、２つ以上の構成成分を含む。

【0017】

[0015]用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含んでいる／備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的なものではなく、他を包含し得るものとして解釈されるべきである。同様にして、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「又は（ｏｒ）」は全て、このような解釈が文脈から明確に妨げられない限りは他を包含し得るものであると解釈されるべきである。しかしながら、本明細書に開示されている組成物は、本明細書において具体的に開示されていない要素を含まない場合がある。したがって、「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を用いた実施形態の開示は、特定されている構成要素「を本質的に含む（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」実施形態、及び特定されている構成要素「を含む（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」実施形態の開示を含む。

【0018】

[0016]「Ｘ及び／又はＹ」という文脈で使用される用語「及び／又は」は、「Ｘ」若しくは「Ｙ」又は「Ｘ及びＹ」と解釈するものとする。同様に、「Ｘ又はＹのうちの少なくとも１つ」は、「Ｘ」若しくは「Ｙ」又は「Ｘ及びＹ」と解釈するものとする。例えば、「少なくとも１つのジチオナイト又は機能的に同等の還元剤」は、「ジチオナイト」若しくは「機能的に同等の還元剤」又は「ジチオナイトと機能的に同等の還元剤との両方」と解釈するものとする。

【0019】

[0017]本明細書において使用する場合、用語「例」及び「例えば～など（ｓｕｃｈ ａｓ）」は、その後に用語の列挙が続くときは特に、単に例示的かつ説明的なものにすぎず、排他的又は包括的なものとみなされるべきではない。本明細書で使用するとき、別の状態「に関連する／伴う（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）」又は「と関連付けられる（ｌｉｎｋｅｄ ｗｉｔｈ）」状態は、これらの状態が同時に起こることを意味し、好ましくは、これらの状態が同じ基礎症状によって引き起こされることを意味し、最も好ましくは、特定されている状態のうちの一方が他方の特定されている状態によって引き起こされることを意味する。

【0020】

[0018]本明細書で使用するとき、「塩基性溶液」という用語は、７．０を超えるｐＨを有する溶液を指す。例えば、塩基性溶液は、約７．５～約１０．０、約７．８～約９．０、約７．９～約８．８、又は好ましくは約８．０～約８．５の範囲のｐＨを有し得る。本明細書においてｐＨについて言及されるとき、値は、標準的な装置を使用して２５℃で測定したｐＨに相当する。

【0021】

[0019]本明細書で使用されるとき、「中性ｐＨ」という用語は、約７．０のｐＨを指す。本明細書においてｐＨについて言及されるとき、値は、標準的な装置を使用して２５℃で測定したｐＨに相当する。

【0022】

[0020]本明細書で使用されるとき、「室温」という用語は、物理学及び化学で一般的に使用される温度、すなわち本質的に約２９３Ｋ（又は約２０℃）の温度を指す。

【0023】

[0021]本明細書で使用されるとき、「嫌気性条件」という用語は、遊離酸素が存在しない条件を指す。

【0024】

[0022]本明細書で使用されるとき、「好気性条件」という用語は、遊離酸素が存在する条件を指す。

【0025】

[0023]本明細書で使用されるとき、「ジチオナイト」という用語は、Ｓ_２Ｏ_４ ^２－のアニオンを指す。

【0026】

[0024]本明細書で使用されるとき、「ニコチンアミドリボシド」又は「ＮＲ」という用語は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又はＮＡＤ^＋への前駆体として機能するビタミンＢ３のピリジン－ヌクレオシドの形態を指す。ニコチンアミドリボシド又はＮＲは、α体又はβ体のいずれかを有する。例えば、ニコチンアミドリボシド又はＮＲのβ体は、以下の化学構造式Ｉを有する。

【0027】

【化4】

【0028】

[0025]本明細書で使用されるとき、「アルカリ塩」又は「塩基性塩」という用語は、強塩基と弱酸との中和生成物である塩を指す。アルカリ塩又は塩基性塩は、加水分解されると、塩基性溶液を形成し得る。アルカリ塩又は塩基性塩の例としては、金属炭酸塩、金属重炭酸塩、金属酢酸塩、及び金属リン酸塩誘導体などが挙げられ得る。

【0029】

[0026]用語「高収率」は、本明細書で使用されるとき、合成の合計収率が少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％であることを指す。好ましくは、本開示の高収率は、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％である。

【0030】

[0027]用語「高純度」は、本明細書で使用されるとき、化合物又は物質の純度が少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％であることを指す。好ましくは、本開示の高純度は、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％である。

【0031】

[0028]用語「有効量」は、本明細書で使用されるとき、還元生成物の収率を（直接又は間接的に）増加させることができる、又は１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）に対する選択性を増加させることができる物質の量を指す。所与の物質の最適量は、反応条件に基づいて異なり得るものであるが、それでも他の成分の識別は、所与の適用の別個の状況に照らして、容易に決定され得る。

【0032】

[0029]本明細書で使用されるとき、「クロマトグラフィー」という用語は、例えば、固体の基材と、溶液、緩衝液又は溶媒を含むがこれらに限定されない移動相との間の分配の違いによって、混合物中の他の分子から目的の化合物を分離し、目的の化合物の単離を可能とする任意の種類の精製技術を指す。

【0033】

[0030]本明細書で使用されるとき、「溶離液」という用語は、固定支持体材料から１つ以上の物質を移動又は溶離させるためにクロマトグラフィープロセスで用いられる溶媒又は２種類以上の溶媒の混合物を指す。一実施形態では、メタノールなどの極性溶媒を溶離液として使用して、クロマトグラフィープロセスの過程で固定相からＮＲＨを洗い流すことができる。

【0034】

[0031]本明細書で使用されるとき、「吸着剤」又は「固定相」という用語は、クロマトグラフィープロセスにおいて固体状態で流体流中に存在する材料を指す。一実施形態では、塩基性アルミナとシリカとの混合物が、クロマトグラフィープロセスにおける吸着剤として使用され得る。

【0035】

[0032]本明細書で使用されるとき、「溶媒」という用語は、別の物質（溶質）を溶解することができる物質を指す。

【0036】

[0033]実施形態
[0034]本開示の一態様は、ニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）などの市販の化学物質からの１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）の製造方法である。ニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）は、唯一市販されているＮＲ誘導体である（例えば、ダイエタリー・サプリメントとして）。したがって、本発明の方法は、１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）の製造及び商業化のための新しい経路である。

【0037】

[0035]本出願者は、驚くべきことに、溶液中のジチオナイトなどの還元剤による市販のニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）の還元が、１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）の効果的な形成及び製造をもたらし得ることを見出した。本出願者は、さらに驚くべきことに、得られた１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）が、カラムクロマトグラフィーを使用することによって高収率で単離、精製され得ることも見出した。

【0038】

[0036]一態様において、本開示は、ニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）からの１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）の製造方法に関する。

【0039】

[0037]図１は、本開示によって提供される実施形態による、ニコチンアミドリボシドクロリドからの１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシドの例示的な製造方法（１００）を示す。

【0040】

[0038]図１に示されるように、方法１００は、ニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）の溶液を準備すること（１０２）を含む。

【0041】

[0039]ニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）は、市販されており、例えばＮｉａｇｅｎ（商標）としてＣｈｒｏｍａＤｅｘから購入することが可能である。

【0042】

[0001]ニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）は、α体ＮＲＣｌ（α－ＮＲＣｌ）又はβ体ＮＲＣｌ（β－ＮＲＣｌ）のいずれかを含む。一実施形態では、本開示のニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）は、β－ＮＲＣｌを含む。一実施形態では、本開示のニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）は、β－ＮＲＣｌである。

【0043】

[0041]一実施形態では、ＮＲのβ－アノマーのみが生物活性及び医薬特性を示すことから、本開示は、１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）を製造するための例示的な出発物質としてβ－ＮＲＣｌを用いる。１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）を製造する本発明の方法はまた、出発物質としてα－ＮＲＣｌを用いることにも適用され得る。

【0044】

[0042]化学的有効量のニコチンアミドリボシドクロリド（β－ＮＲＣｌ）が、固体（例えば、粉末）の形態として提供される。一実施形態では、ニコチンアミドリボシドクロリド（β－ＮＲＣｌ）の固体形態は、１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）を製造するための固相反応で用いられ得る。例示的な固相反応を実施例に記載した。

【0045】

[0043]別の実施形態では、β－ニコチンアミドリボシドクロリド（β－ＮＲＣｌ）の固体形態は、水などの溶媒に溶解されて、１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）を製造するための溶液を形成する。

【0046】

[0044]好ましい実施形態では、化学的有効量のβ－ニコチンアミドリボシドクロリド（β－ＮＲＣｌ）が、まず水などの溶液に溶解されて、１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）の液体ベースでの製造のための溶液を形成する。

【0047】

[0045]図１に示されるように、化学的有効量のβ－ニコチンアミドリボシドクロリド（β－ＮＲＣｌ）が溶液中に提供された後、方法１００は、金属ジチオナイトを第１の温度下で溶液中に添加すること（１０４）を含み得る。このように、金属ジチオナイトなどの還元剤が、溶液に添加され得る。

【0048】

[0046]一実施形態では、還元剤は、亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４）などの金属ジチオナイトを含み得る。一実施形態では、唯一の還元剤が、亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４）などの金属ジチオナイトであってもよい。スキーム４は、溶液中での亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４）によるβ－ニコチンアミドリボシドクロリド（β－ＮＲＣｌ）の例示的な還元反応を示す。

【0049】

【化5】

【0050】

[0047]スキーム５は、還元剤としてＮａ_２Ｓ_２Ｏ_４を用いることによる、ＮＲからのＮＲＨ合成の反応機構を示す。スキーム５に示されるように、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４を用いることによるＮＲの還元反応は、最初に、塩基性条件で安定であるスルフィネート中間体を形成する。

【0051】

[0048]プロトン化後、スルフィネート中間体は、そのスルフィン酸誘導体を形成する。このスルフィン酸中間体は、周囲条件で不安定であり、ＳＯ_２の脱離を介してＮＲＨに変換される。

【0052】

[0049]このため、特に好ましい実施形態が、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４を安定化させるだけでなく、スルホネート中間体をプロトン化してＮＲＨを生成することにもなるｐＨを用いることに、本出願者は注目する。さらに、ＮＲＨは、その構造中にＮ－グリコシド結合を有するため、加水分解を受けやすい。したがって、特に好ましい実施形態は、ＮＲＨが加水分解されないように、反応の全過程にわたってｐＨを調節し、ｐＨを正確に維持する。

【0053】

[0050]したがって、本発明の方法は、ＮＲＨの効果的な製造のために、関連する溶液のｐＨを調節する工程、及びそれを特定の範囲内に（例えば、８．０～８．５、好ましくは８．１に）正確に維持する工程を含む。

【0054】

【化6】

【0055】

[0051]本開示を通して、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４を例示的な還元剤として用いた。機能が類似する他の還元剤が用いられてもよい。好ましくは、還元剤は、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４である。

【0056】

[0052]β－ニコチンアミドリボシドクロリド（β－ＮＲＣｌ）とＮａ_２Ｓ_２Ｏ_４などの還元剤とのモル比は、好ましくは約１：１～約１：５、約１：１．５～約１：４、又は約１：２～約１：３、好ましくは約１：２～約１：３、より好ましくは約１：２．７である。

【0057】

[0053]Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４の水溶液は、中性ｐＨ（例えば、ｐＨ＝７）の好気性条件下では不安定であることから、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４を用いてβ－ニコチンアミドリボシドクロリド（β－ＮＲＣｌ）を還元反応させるための溶液は、嫌気及び塩基性の条件下で維持されることが好ましい。

【0058】

[0054]例えば、溶液中の遊離酸素を除去するために、溶液は不活性ガスでパージされ得る。不活性ガスは、窒素（Ｎ_２）、又はアルゴン（Ａｒ）などを含み得る。一実施形態では、窒素又はアルゴンのいずれかが、不活性ガスとして用いられる。還元反応全体を通して、溶液が不活性ガスでパージされてもよい。

【0059】

[0055]一実施形態では、不活性ガスは、窒素ガスを含む。一実施形態では、唯一の不活性ガスが、窒素ガスである。

【0060】

[0056]一実施形態では、溶液は、塩基性溶液を含む。一実施形態では、溶液は、塩基性溶液である。

【0061】

[0057]一実施形態では、塩基性溶液は、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）を含む。例えば、溶液は、塩基性溶液を形成するために、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）などの少なくとも１つのアルカリ塩又は塩基性塩を含み得る。一実施形態では、唯一のアルカリ塩又は塩基性塩が、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）である。しかしながら、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム及び類似の化合物などの他のアルカリ塩又は塩基性塩が、任意選択で用いられてもよい。

【0062】

[0058]一実施形態では、溶液のｐＨ値は、溶液中の少なくとも１つのアルカリ塩又は塩基性塩の濃度によって制御することができる。例えば、１～１．５Ｍ、好ましくは１．１～１．４Ｍ、より好ましくは１．２ＭのＮａＨＣＯ_３を用いることによって、溶液のｐＨ値を、約８．０～約８．５、約８．０５～約８．４５、約８．０７～約８．３５、約８．０８～約８．２９、約８．０９～約８．１９の範囲内に、好ましくは約８．１に制御することができる。

【0063】

[0059]一実施形態では、方法１００は、ＮａＨＣＯ_３溶液のｐＨ値を８．０～８．５に維持する工程を含む。一実施形態では、方法１００は、ＮａＨＣＯ_３溶液のｐＨ値を約８．０～約８．５に維持する工程を含む。一実施形態では、方法１００は、ＮａＨＣＯ_３溶液のｐＨ値を約８．１に維持する工程を含む。

【0064】

[0060]一実施形態では、ＮａＨＣＯ_３溶液は、約１．０～約１．５Ｍの濃度を有する。一実施形態では、ＮａＨＣＯ_３溶液は、約１．２Ｍの濃度を有する。

【0065】

[0061]一実施形態では、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４などの還元剤は、不活性ガス雰囲気下、第１の温度で、β－ニコチンアミドリボシドクロリド（β－ＮＲＣｌ）の溶液に徐々に添加され得る。一実施形態では、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４などの還元剤は、水などの溶媒に予め溶解されてもよく、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４などの還元剤のこの溶液は、不活性ガス雰囲気下、第１の温度で、β－ニコチンアミドリボシドクロリド（β－ＮＲＣｌ）の溶液に滴下され得る。

【0066】

[0062]一実施形態では、第１の温度は、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４などの還元剤の添加中に還元反応を制御することができるように、約０℃などの低温である（例えば、氷水を用いて制御することによる）。

【0067】

[0063]図１に戻ると、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４などの還元剤の添加後、方法１００は、第２の温度下、溶液中で金属ジチオナイトをニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）と反応させて混合物を形成する工程を含んでよく、混合物の一部分は、１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）である（１０６）。

【0068】

[0064]このように、溶液の温度は、好ましくは、第１の温度から第２の温度に上昇される。第２の温度下では、溶液中のニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）は、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４などの還元剤と完全かつ効果的に反応して、１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）を形成することができる。一実施形態では、第２の温度は室温である。

【0069】

[0065]室温下では、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４などの還元剤及びβ－ニコチンアミドリボシドクロリド（β－ＮＲＣｌ）は、連続的かつ完全に反応して混合物を形成することができ、混合物の少なくとも一部分は、１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）である。

【0070】

[0066]一実施形態では、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４などの還元剤とβ－ニコチンアミドリボシドクロリド（β－ＮＲＣｌ）との間の還元反応の進行は、クロマトグラフィー技術を使用することによってモニタリングすることができる。例えば、図２Ａに示されるように、β－ＮＲＣｌ、ＮＲＨ及びニコチンアミド（ＮＡ：ＮＲＨからの分解生成物；スキーム６を参照）の全ての化合物が、２５４ｎｍの波長で視認可能であった。しかし、３６５ｎｍの波長では、ＮＲＨのみが視認可能であった。出発物質β－ＮＲＣｌ及び得られた生成物ＮＲＨに対応するピークの強度及び位置をモニタリングすることによって、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４などの還元剤とβ－ニコチンアミドリボシドクロリド（β－ＮＲＣｌ）との間の還元反応の進行を判断することができる。

【0071】

[0067]Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４などの還元剤とβ－ニコチンアミドリボシドクロリド（β－ＮＲＣｌ）との間の還元反応が完了した後、得られた混合物を乾燥して、混合物の固体を得ることができる。一実施形態では、得られた混合物を凍結乾燥して、混合物の黄色固体を得ることができる。

【0072】

[0068]本開示の別の態様では、生成されるＮＲＨを高純度で得るための精製方法が開示される。本出願者は、驚くべきことに、得られた１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）は、カラムクロマトグラフィーを使用することによって高収率で単離、精製することができることを見出した。以下の実施例は、カラムクロマトグラフィーを使用することによる詳細な例示的精製方法を提供する（例えば、吸着剤として塩基性アルミナとシリカとの混合物を用いる）。

【0073】

[0069]一実施形態では、得られたＮＲＨは、クロマトグラフィー法を使用して混合物から単離することができる。例えば、カラムクロマトグラフィーを使用して、吸着剤への化合物の示差的吸着に基づいてβ－ＮＲＣｌ又は他の不純物質からＮＲＨを分離することができ、化合物はカラムを異なる速度で通って移動して、複数の画分に分離され得る。

【0074】

[0070]一実施形態では、カラムクロマトグラフ法は、その溶離液としてアルコールを用いる。一実施形態では、溶離液はメタノールを含む。一実施形態では、唯一の溶離液がメタノールである。しかしながら、任意選択で、メタノールとエタノールとの混合物などの他の溶媒が、追加的に又は代替的に溶離液として用いられてもよい。

【0075】

[0071]一実施形態では、カラムクロマトグラフの吸着剤は、少なくとも塩基性アルミナ及びシリカを含む。一実施形態では、塩基性アルミナ及びシリカが、カラムクロマトグラフの唯一の吸着剤である。

【0076】

[0072]塩基性アルミナ及びシリカは、約１：１０～約１０：１、約１：９～約９：１、約１：８～約８：１、約１：７～約７：１、約１：６～約６：１、約１：５～約５：１、約１：４～約４：１、約１：３～約３：１、又は約１：２～約２：１、好ましくは約２：３の重量比を有し得る。

【0077】

[0073]一実施形態では、カラムクロマトグラフ精製法は、少なくとも７０％、少なくとも７２％、少なくとも７５％、少なくとも７７％、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、又は少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９６％の純度を有するＮＲＨを単離するために、例えば約２：３の重量比で塩基性アルミナをシリカと共に用い得る。

【0078】

[0074]一実施形態では、塩基性アルミナをシリカと共に用いることによるカラムクロマトグラフ精製法は、混合物中の未反応ＮＲＣｌの少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、又は少なくとも９９．９９９％を除去し得る。好ましい実施形態では、塩基性アルミナをシリカと共に用いることによるカラムクロマトグラフ精製法は、混合物中の未反応のＮＲＣｌからＮＲＨ生成物を完全に精製し得る。

【0079】

[0075]一実施形態では、実施例において実証されるように、本出願者の結果は、シリカ又は塩基性アルミナのいずれか単独でのカラムクロマトグラフィーが、ＮＲＨからＮＲを分離するのに有効でなかったことを示す。したがって、塩基性アルミナとシリカとの混合物が、カラムクロマトグラフに必須の吸着剤であり得る。

【0080】

[0076]塩基性アルミナは、その上に多くのヒドロキシル基を有する極性表面として、ＮＲＨからＮＲを中程度に（それらの極性の差によって）物理的に分離し得るものと考えられる。さらに、塩基性アルミナはその表面上に負電荷を有し、ＮＲは正電荷を有することから、塩基性アルミナは、塩基性アルミナの表面上にＮＲを固定するためのカチオン交換樹脂として作用する可能性もある。

【0081】

[0077]このことが、シリカと比較してアルミナがＮＲＨの精製のためのより良好な固定相である主な理由であると考えられ得る。しかし、本出願者は、カラムクロマトグラフィーでのＮＲＨの精製中に、塩基性アルミナが目詰まりし、ＮＲＨの分解につながる非常に遅い流速をもたらすことを発見した。

【0082】

[0078]一実施形態では、本方法におけるＮＲＨの合計収率は、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、好ましくは少なくとも５５％であり得る。

【0083】

[0079]一実施形態では、本発明の溶液中でのＮＲＨの製造方法は、固相法の収率よりも著しく高い収率をもたらす。例えば、本発明の溶液中でのＮＲＨの製造方法は、固相法の収率よりも少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１２０％、少なくとも１４０％、少なくとも１６０％、少なくとも１８０％、少なくとも２００％、少なくとも２２０％、少なくとも２４０％、少なくとも２６０％、少なくとも２８０％、少なくとも３００％、少なくとも３２０％、少なくとも３４０％、少なくとも３６０％、少なくとも３８０％、少なくとも４００％、少なくとも４２０％、少なくとも４４０％、少なくとも４６０％、少なくとも４８０％、少なくとも５００％、又は少なくとも６００％高い収率をもたらす。

【0084】

[0080]以下の実施例は、約１５％～約１７％の収率であるＮＲＨの詳細な例示的固相製造方法を提供する。

【0085】

[0081]実施例に示されるように、本開示の特定の実施形態による、ＮＲＨを製造及び精製する例示的な溶液ベースの方法は、約４２％～約５５％の範囲内の収率を示す。

【0086】

[0082]したがって、本発明の溶液中でのＮＲＨの製造方法は、例示的な固相法の収率よりも少なくとも２６７％高い収率をもたらし得る。

【0087】

[0083]別の態様では、本開示は、本明細書で論じられる方法から製造されるＮＲＨの安定性に関する。

【0088】

[0084]一実施形態では、製造された状態のＮＲＨのある特定の割合が加水分解して、１，４－ジヒドロニコチンアミド（ＤＨＮＡ）を形成する。ＦＩＧ．５Ａのスキームに示されるように、１，４－ジヒドロニコチンアミド（ＤＨＮＡ）は、反応過程で（例えば、ｐＨ＝８．５）、ＮＲＨの加水分解によって形成された可能性が高い。

【0089】

[0085]ＦＩＧ．２に示されるように、ｐＨ＝８．１の場合、精製ＮＲＨの^１Ｈ ＮＭＲにおいて、ＮＡに対応するピークは、微量しか存在しなかった。このことは、反応過程で加水分解してＮＡを形成するＮＲが（スキーム６参照）、ほんの微量であることを意味する。

【0090】

[0086]一実施形態では、ＮＲＨの製造方法の溶液のｐＨ値を操作して、方法の反応速度、並びに出発物質のＮＲＣｌ及び生成物のＮＲＨの両方の加水分解を制御することができる。

【0091】

[0087]例えば、ｐＨを８．１から８．５に増加させることによって、反応速度は明らかに低下し、続いて、ＮＲ及びＮＲＨの両方の加水分解などの副反応の可能性が増加する。

【0092】

[0088]一実施形態では、ＮＲ及びＮＲＨの両方の加水分解などの副反応の可能性を減少させながら還元の反応速度を上昇させるためには約８．１のｐＨ値が好ましいものであり得る。

【0093】

[0089]一実施形態では、ＮＲＨ製造のための反応物のｐＨは、ＮＡ及びＤＨＮＡの形成を最小限に抑えて反応時間を短縮するように必然的に調節され得る。例えば、これらの副生成物ＮＡ及びＤＨＮＡの遅延因子（Ｒｆ）値は、ＮＲＨのＲ_ｆ値に近い。したがって、ＮＡ及びＤＨＮＡは、一般的なカラムクロマトグラフィーによって生成物ＮＲＨから分離することができない（ＦＩＧ．５Ａ参照）。好ましい実施形態では、ＮＲＨを製造するための反応物のｐＨは、約８．１に調節され得る。

【0094】

[0090]一実施形態では、ＮＲＨは、窒素雰囲気下において、ＮＲＣｌよりも熱的に安定である。ＦＩＧ．６Ａ及びＦＩＧ．６Ｂは、ＮＲＨ及びＮＲがいずれも、それぞれ約２１８℃及び９１０℃で最大の重量減少を示す一方で、ＮＲＨは、この温度で約５０％の重量減少しか示さないのに対し、ＮＲＣｌは、この温度で約６５％の重量減少を示すことを示したものである。ＮＲＨは、３０％の重量減少に寄与する、８００℃付近にピークを有する別の特徴的な重量減少を示す。

【0095】

[0091]一実施形態では、ＦＩＧ．７に示されるように、ＮＲＨは、空気の存在下で酸化されやすい可能性があり、ＮＲＨは、空気の存在下よりもＮ_２雰囲気下でより安定であり得る。さらに、純粋なＮＲＨ（粉末として）は、冷蔵庫中、密封管内で、まったく劣化することなく数ヶ月間安定であり得る。

【0096】

[0092]一実施形態では、ＦＩＧ．７Ｃ及びＦＩＧ．２２に示されるように、生成物ＮＲＨは、ｐＨ５では、１日未満で完全に分解され得るが、一方ｐＨ７の酢酸アンモニウム緩衝液中で調製された生成物ＮＲＨは、１日目の約７０％から３０日目の約２％までのＮＲＨ濃度の線形減少を示し得る。

【0097】

[0093]さらに、ｐＨ９の炭酸塩緩衝液中で調製された生成物ＮＲＨは、空気中（例えば、６０日後に測定して約４５％の分解）及びＮ_２下（例えば、６０日後に測定して約４２％の分解）の両方で、空気安定性を有し得る。

【0098】

[0094]一実施形態では、水溶液中のＮＲは、６０日後に検出可能な分解を示さず非常に安定であり得るが、一方空気中で保存された水溶液中のＮＲＨは、３０日後及び６０日後に、それぞれ９％及び１０％の分解を示し得る。

【0099】

[0095]一実施形態では、Ｎ_２ブランケット下で保存された水溶液中のＮＲＨは、６０日間の保存後に検出可能な分解を示さず、かなり安定であり得る。

【実施例】

【0100】

[0096]以下の非限定的な実施例は、ニコチンアミドリボシドクロリドから１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシドを製造するための方法及びプロセス並びに関連する精製及び安定性実験の概念を発展させ、支持する科学的データを提示する。

【0101】

[0097]本研究において、本発明者らは、市販のニコチンアミドリボシドクロリド（ＮＲＣｌ）から、還元剤としての亜ジチオン酸ナトリウムの存在下で、１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシド（ＮＲＨ）を合成し、精製するための効率的な方法を記載する。この方法は、スケールアップ可能である可能性がある。ＮＲＨは、最も有効な合成ＮＡＤ^＋前駆体として工業的な価値を有する。

【0102】

[0098]本発明者らは、固相合成が高収率でのＮＲＣｌのＮＲＨへの還元に用いることができない一方で、嫌気性条件下、室温で水中での還元反応は非常に有効であり、５５％の単離収率に達することを実証した。一般的なカラムクロマトグラフィーを使用することによって、本発明者らは初めて、この感受性の高い生体化合物を良好な収率で高度に精製することができた。ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＬＣ－ＭＳ、ＦＴＩＲ及びＵＶ－可視分光法を含む一連の同定及び分析を、精製された試料に対して行い、ＮＲＨの構造、さらにはその純度が９６％であることを確認した。ＮＲＨの熱分析から、ＮＲＣｌと比較して熱安定性がより高いこと、及び１つは２１８℃、もう１つは８０５℃で２つの主要な重量減少を伴うことが示された。本発明者らはまた、水溶液中のＮＲＨに対する温度、ｐＨ、光、及び酸素（空気として）の長期安定性の影響についても調べた。本発明者らの結果から、ＮＲＨが酸素の存在下で酸化され得ること、及び酸性条件下で迅速に加水分解されたことが示される。本発明者らはまた、Ｎ_２雰囲気下、より低い温度、及び塩基性ｐＨにおいて、分解速度が低下することも見出した。

【0103】

[0099]実験項
[0100]材料：ＮＲクロリド（ベータ体）は、ＣｈｒｏｍａＤｅｘ Ｃｏｍｐａｎｙから贈与された。亜ジチオン酸ナトリウムはＶＷＲから購入し、炭酸水素ナトリウムはＡｌｄｒｉｃｈから購入し、シリカゲル（Ｐ６０、４０～６３μｍ、６０Å）はＳｉｌｉＣｙｃｌｅから購入し、塩基性アルミナ（５０～２００μｍ、６０Å、ｐＨ８）はＡｃｒｏｓから購入した。メタノール（９９．９％、ＡＣＳ認証、Ｆｉｓｈｅｒ）、アセトン（９９．８％、ＡＣＳ認証、Ｆｉｓｈｅｒ）、水酸化ナトリウム（ＡＣＳ認証、Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ヘキサン（≧９８．５％、ＧＲ ＡＣＳ）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、＞９９．９％、ＡＣＳ認証）及びＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４ Ｃｏａｔｅｄ Ａｌｕｍｉｎｕｍ－Ｂａｃｋｅｄ ＴＬＣ Ｓｈｅｅｔは、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。重水及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ６，Ｄ，９９．９％）は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。

【0104】

[0101]特性評価．５００ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ ＩＮＯＶＡ）分光計を使用し、重水中で^１Ｈ－ＮＭＲ及び^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを得た。フーリエ変換赤外スペクトル（ＦＴＩＲ）は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ－１Ｓ分光光度計により、８ｃｍ^－１の分解能で１２８スキャンを収集することによって記録した。ＮＲ溶液及びＮＲＨ溶液のＵＶ－可視スペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－２６００分光光度計で記録した。熱重量分析（ＴＧＡ）サーモグラムは、ＴＡ Ｑ１００機器を使用し、Ｎ２流下、１０℃／分の温度速度で２０～９００℃の範囲で得た。Ｂｉｎａｒｙ ＳＬ Ｐｕｍｐ＆Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ及びＳｈｏｄｅｘ ＲＩ－５０１ Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（単一チャネル）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定を行った。逆相ＨＰＬＣは、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１８カラム、１８０Å（細孔径）、直径５μｍ、寸法２５０×４．６ｍｍで行った。酢酸アンモニウム（２０ｍＭ）を移動相として用い、２５℃で３０分間又は４５分間にわたる１．０ｍＬ／分の流速とした。測定前に、全ての試料を、０．２２μｍの細孔径を有する１３ｍｍのナイロンシリンジフィルターを使用して濾過した。ＬＣ－ＭＳ分析には、本発明者らは、質量分析計と連結したＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）を使用した。逆相クロマトグラフィーを、１００×４．６ｍｍ、３μｍ、極性Ｃ１８、細孔径１００Åの仕様であるＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｏｍｅｇａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）ＬＣカラムにより、０．３ｍＬ／分の流速で使用した。ＬＣ溶離液は、２０ｍＭ酢酸アンモニウム（溶液Ａ）及びアセトニトリル（溶液Ｂ）を含み、勾配溶離を使用する（溶液Ａ：Ｂ組成の経時変化：０分 ９５：５、３分 ９５：５、１５分 ８５：１５、１７分 ９０：１０、２０分 ９５：５）。質量分析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱ質量分析計）は、ＮＲＨを分析するためのポジティブエレクトロスプレーイオン化モードに設定したエレクトロスプレーインターフェース（ＥＳＩ）を備えていた。最適化されたパラメータは、２０任意単位のシースガス流量、４．００ｋＶに設定したスプレー電圧、３５０℃のキャピラリー温度、４１．０Ｖのキャピラリー電圧、及び１２５．０Ｖに設定したチューブレンズであった。

【0105】

[0102]β－ニコチンアミドリボシドクロリドからの１，４－ジヒドロニコチンアミドリボシドの合成
[0103]０．５ｇのＮＲＣｌ（１．７２ｍｍｏｌ）及び２０ｍＬのＮａＨＣＯ_３溶液（１．２Ｍ）を、マグネティックスターラーバーを入れた丸底フラスコに加えた。この系を氷浴中に置き、酸素をパージし、窒素ガス下に保持した。次いで、０．８０ｇの亜ジチオン酸ナトリウム（４．６０ｍｍｏｌ）を、反応混合物に少しずつ添加した。Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４を添加した後、フラスコを氷浴から取り出し、続いて室温でさらに３時間反応を行った。反応混合物を凍結乾燥して、黄色固体を得た。最後に、溶離液としてメタノールを用い、それぞれ２：３の重量比の塩基性アルミナとシリカとの混合物を用いたカラムクロマトグラフィーにより、残渣を精製した。余分なメタノールをロータリーエバポレーターによって室温で除去することで、淡黄色の粘着性固体が得られ、次にこれを、酢酸エチルを添加することによって黄色粉末（沈殿物）に変換した。最後に、単離された生成物をｎ－ヘキサンで洗浄し、室温で減圧乾燥して、純粋なＮＲＨを収率５５％（０．２４ｇ）で得た。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ），δｐｐｍ：７．１９（ｓ，１Ｈ），６．１４（ｄｄ，Ｊ_１＝８．２Ｈｚ，Ｊ_２＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），５．０５－５．０２（ｍ，１Ｈ），４．９２（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，１Ｈ），４．２４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１８－４．１６（ｍ，１Ｈ），４．０３－３．９９（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｄｄ，Ｊ_１＝１２．５Ｈｚ，Ｊ_２＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｄｄ，Ｊ_１＝１２．５Ｈｚ，Ｊ_２＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１１（ｓ，２Ｈ）（ＦＩＧ．８～１１）。^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ），δｐｐｍ：１７３．０３，１３７．９２，１２５．３２，１０５．３０，１０１．０５，９５．０１，８３．６２，７１．０６，７０．２４，６１．６４，２２．０９（ＦＩＧ．１２）。加えて、ＣＤ_３ＯＤ中の精製ＮＲＨの^１Ｈ ＮＭＲ及び^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルの画像は、支持情報セクションにある（ＦＩＧ．１３～１６）。ＭＳ：実測値ｍ／ｚ＝２５７．１８（Ｍ＋１）。Ｃ_１１Ｈ_１７Ｎ_２Ｏ_５（Ｍ＋１）に対する計算値：２５７．１１（ＦＩＧ．１７及び１８）。ＵＶ（Ｈ_２Ｏ中のλ_ｍａｘ）：３３８ｎｍ（ＦＩＧ．１９）。

【0106】

[0104]ＮＲＣｌからのＮＲＨの固相合成
[0105]第１段階として、反応過程でのＮＲＨの加水分解を低減するために、本発明者らは、無溶媒環境での還元反応を設定した。本発明者らは、反応が起こる表面を増加させるために、固体支持体としてＳｉＯ_２を用いた。この手順では、ＳｉＯ_２（０．２５ｇ）、ＮＲＣｌ（０．１ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４（０．２ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）、及びＮａＨＣＯ_３（０．２５ｇ）を乳鉢に入れ、５分間粉砕して均質な粉末を得た。次に、１ｍＬのＤＩ水を反応混合物に滴下し、反応物を室温で１０分間粉砕した（表１、エントリー１）。固体支持体を用いないと、反応混合物は粘着性になり、粉砕が容易ではなくなることには留意されたい。粉砕後、生成物をＭｅＯＨで抽出し、反応の進行をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）で追跡した。結果は、さらなる同定のための単離及び精製を行うことができない１つの生成物が微量のＮＲＨであることを示した。本発明者らは、十分な水が存在しない状況下では、スルフィネート中間体をプロトン化してスルフィン酸中間体を生成し、続いて生成物としてのＮＲＨを生成することができないという仮説を立てた（スキーム５）。この仮説を試験するために、本発明者らは、別の最終工程を用いてこの手順を繰り返した。最後に、反応混合物を、マグネティックスターラーバーを備えた丸底フラスコに移し、８ｍＬのＮａＨＣＯ_３溶液（１Ｍ）を添加し、反応を室温で３０分間継続させた。次に、反応混合物を凍結乾燥し、溶離液としてメタノールを用いた塩基性アルミナとシリカとの混合物でのカラムクロマトグラフィーにより、残渣を精製した。単離したＮＲＨは、１５％の収率で得られた（表１、エントリー３）。固体支持体を変更することによっては（ＳｉＯ_２の代わりにＡｌ_２Ｏ_３）、生成物の収率において顕著な改善は観察されなかった（表１、エントリー２、エントリー４）。

【0107】

[0106]周囲条件下で操作可能であることはこの手順の利点ではあるが、生成物の低収率は重大な欠点である。したがって、高収率を得るための手段を求めて、本発明者らは、嫌気性条件下の水溶液中での反応に進めることを決断した（表1、エントリー５～９）。

【0108】

【表1】

【0109】

[0107]結果及び考察
[0108]本実験において、本発明者らは、市販のβ－ＮＲＣｌを用いることによるＮＲＨのスケールアップ可能な合成のための直接的な手順を導入する。反応は、窒素雰囲気下、ＮａＨＣＯ_３及びＮａ_２Ｓ_２Ｏ_４の水溶液中で行った（スキーム４）。本発明者らは、反応混合物からＮＲＨを精製するための高速カラムクロマトグラフィー法を開発した。該方法では、９６％の純度が得られる。ＮＲＨの主な用途の１つは、栄養補助飲料であることから、本発明者らはまた、水溶液中のＮＲＨの安定性に対する温度、光、ｐＨ、及び酸素の影響も調べ、これらの結果を同様の条件でのＮＲの安定性と比較した。

【0110】

[0109]最も重要なパラメータの１つであり、ＮＲＨ合成反応及び生成物ＮＲＨに直接影響を及ぼすものは、ｐＨである。一定のｐＨに調節し、維持することは、反応過程において重要である。この問題は、反応の機構を検討することによって、より良く理解することができる（スキーム５）。Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４の水溶液は、ｐＨ＝７の好気性条件下で不安定である。したがって、この反応は、嫌気性及びアルカリ性の条件下で行わなければならない。まず、ＮＲとＳ_２Ｏ_４ ^２－との反応は、塩基性条件で安定であるスルフィネート中間体の形成をもたらす。この化合物をプロトン化することにより、そのスルフィン酸誘導体が形成される。このスルフィン酸中間体は、周囲条件で不安定であり、ＳＯ_２の脱離を介してＮＲＨに変換される。したがって、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４を安定化させるだけでなく、スルホネート中間体をプロトン化してＮＲＨを生成することにもなるｐＨを見出し、確立することが重要である。さらに、ＮＲＨは、その構造中にＮ－グリコシド結合を有するため、加水分解を受けやすい。したがって、ＮＲＨが加水分解されないように、反応の全過程にわたってｐＨを調節し、正確に維持することが必要である。

【0111】

[0110]還元剤としての活性を低下させることなくＮａ_２Ｓ_２Ｏ_４の水溶液を安定化させるための最小ｐＨは、８．０～８．５である。最初に、ＮａＨＣＯ_３（１．２Ｍ）の溶液を用いることによって、反応をｐＨ８．１に設定した。次に、ＮＲＣｌをこの溶液に溶解し、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４を窒素雰囲気下、０℃で反応混合物に少しずつ添加した。Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４を溶液に添加することによって、その酸化を通して、ｐＨは低下した。しかし、１．２Ｍの濃度を有する重炭酸ナトリウム溶液は、反応過程にわたってｐＨを一定に保つのに十分であった。Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４を添加した後、室温で３時間反応させた。次に、混合物を凍結乾燥して、黄色固体を得た。最後に、残渣を、塩基性アルミナとシリカとの混合物（溶離液としてメタノール）を用いた短カラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋なＮＲＨ生成物を収率５５％で得た（表１、エントリー７）。ＮＲＣｌ及びＮａ_２Ｓ_２Ｏ_４の最適化されたモル比は、１対２．７であり、亜ジチオン酸ナトリウムの量を増加させても、生成物収率は改善されなかった（表１、エントリー８）。粗生成物の精製後、本発明者らは、溶媒としてメタノールを用いて、精製ＮＲＨで薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行い、元のＮＲＣｌ及びニコチンアミド（ＮＡ）と比較した（ＦＩＧ．１Ａ）。全ての化合物は、２５４ｎｍの波長で活性であった。しかし、波長を３６５ｎｍに切り替えることによって、本発明者らは、ＮＲＨのみが蛍光を発することを見出した。ＮＲＨは、３４０ｎｍ付近で強い蛍光を発することが報告されている。ＮＲＨ及びＮＡのＲ_ｆ値はほとんど同じであったことから、ＮＲＨの蛍光特性は、ＴＬＣの過程でこの化合物の正確な位置を識別するのに役立った。ＦＩＧ．１Ａに示されるように、精製ＮＲＨは、ＴＬＣプレート上で高い純度を示す。

【0112】

[0111]合成及び精製したＮＲＨのＦＴ－ＩＲスペクトルを調べ、元のＮＲＣｌのスペクトルと比較した（ＦＩＧ．２Ｂ）。ＮＲＨのＦＴ－ＩＲスペクトルにおいて、１６４３ｃｍ^－１に存在する特異的なピークは、Ｃ＝Ｃバンドの伸縮振動に帰属させることができ、ＮＲピリジニウム環の還元が確認される。３３４０ｃｍ^－１及び３２０９ｃｍ^－１の２つのピークは、ＮＲＨ構造中のＮＨ_２基の非対称及び対称伸縮バンドを指し、これは、アミド基が反応過程で無傷であることを示唆している。１６８５ｃｍ^－１のシャープなピークは、アミド基の伸縮Ｃ＝Ｏバンドを示す。２９２０ｃｍ^－１及び２８４０ｃｍ^－１の２つのピークから、ＮＲＨ構造のリボース環及びジヒドロニコチンアミド環の両方における脂肪族Ｃ－Ｈの伸縮振動が確認される。ＮＲＨの構造中にヒドロキシル基が存在することは、３５００ｃｍ^－１～３０００ｃｍ^－１の範囲に現れるブロードなピークによって確認される。

【0113】

[0112]ＮＲＨ合成の成功及びその純度をさらに確認するために、本発明者らは、重水中での精製ＮＲＨの^１Ｈ ＮＭＲスペクトル及び^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルも取った。Ｄ_２Ｏと交換可能ではない１１個のプロトンの存在から、合成されたＮＲＨの構造が完全に確認される（ＦＩＧ．３）。各プロトンの化学シフト及び対応するカップリング定数は、科学文献にこれまでに報告されたものと一致している。^１３Ｃ ＮＭＲ及びさらなる詳細をＦＩＧ．１２に示す。

【0114】

[0113]ＮＲＨの精製に使用したカラムの効率を調べるために、本発明者らは、精製されたＮＲＨの^１Ｈ ＮＭＲを、純粋なＮＲＣｌ及びＮＡの^１Ｈ ＮＭＲと比較した（ＦＩＧ．４）。反応混合物中の主な不純物は、未反応のＮＲであり、精製後、精製されたＮＲＨの^１Ｈ ＮＭＲスペクトル中に特異的なＮＲピークは観察されなかった。ＮＲＨのスペクトルをＮＡのスペクトルと比較することによって、本発明者らは、精製ＮＲＨの^１Ｈ ＮＭＲ中に、そのようにＮＡを示すピークが微量しか存在しないことを見出した。このことは、反応過程で加水分解してＮＡを形成するＮＲが、ほんの微量であることを意味する。本発明者らはまた、逆相クロマトグラフィーＨＰＬＣを使用して、ＮＲＨ試料の純度をさらに確認した（ＦＩＧ．２０）。ＨＰＬＣの結果は、^１Ｈ ＮＭＲデータと一致し、ＮＲＨの純度が９６％であったこと、及び不純物のＮＡが４％であったことの両方を示した。興味深いことに、^１Ｈ ＮＭＲではＮＲは存在したが、ＨＰＬＣではＮＲは検出されなかった。これは、塩基性アルミナとシリカとの混合物上でのカラムクロマトグラフィーが非常に効率的であり、残留ＮＲＣｌからＮＲＨ生成物を完全に精製することができることを意味する。

【0115】

[0114]次に、本発明者らは、溶離液としてメタノールを用い、シリカ上でのカラムクロマトグラフィーを使用し、粗ＮＲＨを精製するよう試みた。結果から、シリカ単独でのカラムクロマトグラフィーが、ＮＲＨからＮＲを分離するのに有効でないことが示された。塩基性アルミナは、その上に多くのヒドロキシル基を有する極性表面として、中程度に、ＮＲＨからＮＲを（それらの極性の差によって）物理的に分離し得る。さらに、塩基性アルミナはその表面上に負電荷を有し、ＮＲは正電荷を有することから、塩基性アルミナは、その表面上にＮＲを固定するためのカチオン交換樹脂として作用し得る。本発明者らは、このことが、シリカと比較してアルミナがＮＲＨの精製のためのより良好な固定相である主な理由であると考えている。しかしながら、本発明者らは、カラムクロマトグラフィーでのＮＲＨの精製中に、塩基性アルミナが目詰まりし、ＮＲＨの分解につながる非常に遅い流速をもたらすことを発見した。本発明者らは、塩基性アルミナをシリカと、それぞれ２：３の重量比で混合することによって、この問題を容易に解決するための手段を講じた。したがって、本発明者らは初めて、塩基性アルミナとシリカとの混合物上での一般的なカラムクロマトグラフィー法を使用して、メタノールを溶離液として用いながら、分取モードで（ＨＰＬＣを使用することなく）ＮＲＨを定量的に精製することができた。

【0116】

[0115]次に、本発明者らは、ＮａＨＣＯ_３及びＮａ_２ＣＯ_３の溶液を用いることによって、ｐＨ８．５でのＮＲＣｌの還元反応を設定した（表１、エントリー９）。ＮＲＣｌをこの溶液に溶解し、次にＮａ_２Ｓ_２Ｏ_４を、窒素雰囲気下、０℃で反応混合物に少しずつ添加した。Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４を添加した後、室温で１５時間反応させた。反応の完了後（ＴＬＣで追跡）、混合物を凍結乾燥して黄色固体を得た。最後に、溶離液としてメタノールを用いて、塩基性アルミナ上での短カラムクロマトグラフィーにより、残渣を精製した。定性試験として、本発明者らは、この精製ＮＲＨからＴＬＣを行い、溶媒としてメタノールを用いてＮＲ及びＮＡと比較した（ＦＩＧ．５Ａ）。結果は、得られたＮＲＨが、カラムクロマトグラフィー後に純粋ではないことを示した。この時点で、本発明者らの観察によると、ＴＬＣ上で新たな不純物がＮＲＨのほんの僅か上に位置していた。本発明者らの観察は、この汚染物を一般的なカラムクロマトグラフィーによってＮＲＨから分離することができない理由を説明する手助けとなった。興味深いことに、この新たな不純物の蛍光特性はＮＲＨと類似しており、それらの両方が、ＴＬＣ上、３６５ｎｍで蛍光発光している。文献を調べることによって、本発明者らは、それが反応過程でＮＲＨの加水分解によって形成される１，４－ジヒドロニコチンアミド（ＤＨＮＡ）である可能性が高いことを見出した。

【0117】

[0116]さらなる証拠のために、本発明者らは、Ｄ_２Ｏ中でのこの試料の^１Ｈ ＮＭＲを取った（ＦＩＧ．５Ｂ）。得られた結果は、この試料中に残留ＮＲＣｌが存在しないことを示した。しかしながら、７．５ｐｐｍ～９ｐｐｍの低強度の４つのピークの存在は、精製されたＮＲＨ中に微量のＮＡが存在することを確認するものであった。ＦＩＧ．５Ｂに示されるように、７．１９ｐｐｍ、６．１４ｐｐｍ、５．０３ｐｐｍ及び３．１１ｐｐｍにおける４つの主ピークは、ＮＲＨの構造中にある１，４－ジヒドロニコチンアミド環を強く確認するものである。各主ピークの右側には、強度の低いピークが存在し、形状は対応する主ピークと類似している。これらのピークの化学シフトは、それぞれ７．１２ｐｐｍ、６．０５ｐｐｍ及び４．９８ｐｐｍである。各ピークの積分値は約０．１２であり、各主ピークの積分値は０．８９である。

【0118】

[0117]これらの結果は、精製ＮＲＨ中に約１２％のＤＨＮＡが存在することを示している。言い換えると、これは、ｐＨを上昇させることによって反応速度が低下し、ＮＲＨが、この反応条件下で１５時間以内に加水分解されることを意味する。ＮＲＨの加水分解により、Ｄ－リボース及びＤＨＮＡが同時に形成されることは明らかである。ＦＩＧ．５Ｂに示されるように、５．１９ｐｐｍ及び５．１０ｐｐｍにおける対応する不純物ピークは、それぞれ、Ｄ－リボースのα及びβアノマープロトンに帰属される。リボースの他の不純物ピークは、３．６５ｐｐｍ～４．６５ｐｐｍに現れる。

【0119】

[0118]ｐＨを８．１から８．５に上昇させることによって、反応速度は明らかに低下し、その後、ＮＲ及びＮＲＨの両方の加水分解などの副反応の可能性が増加する。

【0120】

[0119]これらの観察結果は、スキーム５に見られるように、ＮＲのＮＲＨへの還元の反応機構と一致する。この機構において、反応には、アルカリ条件下で安定であるスルフィネート中間体が関与しており、その結果、プロトン化によりＮＲＨを生成することは容易ではない。ＮＲＨ合成のプロセスにおいて、チオサルフェートアニオン及びバイサルファイトアニオンが、ジチオナイトの加水分解及び酸化の生成物として形成される。高い求核性を有するこれらのアニオンは、ＮＲＨの構造中の炭素１’を攻撃して、ＤＨＮＡに代わって置換し得る。これは、ＮＲＨの加水分解速度を間接的に増加させる。ｐＨを上昇させることによって、ＮＲＨ加水分解の可能性は減少するが、同時に、求核剤として作用するいくつかのアニオンの存在は、ＮＲＨ加水分解を増加させる可能性がある。これらのアニオンによるＮＲＨの加水分解は、より激しく、ＮＲＨ合成の反応時間を増加させる。したがって、最も重要なパラメータとして、ＮＡ及びＤＨＮＡの形成を最小限に抑えて反応時間を短縮するように、反応物のｐＨを調整しなければならない。これは、これらの副生成物のＲ_ｆ値がＮＲＨのＲ_ｆ値に近く、したがって、これらの副生成物を、一般的なカラムクロマトグラフィーによって生成物ＮＲＨから分離することができないことから（ＦＩＧ．４Ａ参照）、非常に重要な因子である。本研究において、本発明者らは、ＮＲからＮＲＨを合成するための最適ｐＨが８．１であることを見出し、このｐＨ（８．１）では、ＤＨＮＡは全く観察されず、ＮＡの量は無視できる程度であった。

【0121】

[0120]食品での使用の可能性を有する薬物及び栄養補助食品の場合、工業的加工において高温が必要とされることが多いことから、熱安定性は非常に重要である。ＮＲＨの熱安定性を調べるために、本発明者らは、純粋なＮＲＨに対するＴＧＡを２５～９００℃で行い、結果を元のＮＲＣｌと比較した。ＦＩＧ．６は、ＮＲＨ及びＮＲＣｌに対する２５～９００℃の範囲でのＴＧＡサーモグラムを示す。ＦＩＧ．６Ａ及びＦＩＧ．６Ｂから分かるように、ＮＲＨは明らかにＮＲＣｌよりも熱的に安定である。ＮＲＨ及びＮＲがいずれも、それぞれ約２１８℃及び９１０℃で最大の重量減少を示す一方で、ＮＲＨは、この温度で約５０％の重量減少しか示さないのに対し、ＮＲＣｌは、この温度で約６５％の重量減少を示す。ＮＲＨは、３０％の重量減少に寄与する、８００℃付近にピークを有する別の特徴的な重量減少を示す。これらの結果から、ＮＲＨが、窒素雰囲気下において、ＮＲＣｌと比較して熱的により安定であることが確認される。これは、ＮＲＣｌの構造中に存在する塩化物イオンが、温度が上昇したときにＨＣｌの形態で脱離し得ることに起因する可能性がある。

【0122】

[0121]ＮＲＨ水溶液及びＮＲ水溶液の安定性試験
[0122]新たに合成し、精製したＮＲＨ（１０，０００ｐｐｍ）のストック溶液を、脱酸素ＤＩ水で調製した。このストック溶液を、安定性測定のための1０００ｐｐｍのＮＲＨ溶液の調製に使用した。光、ｐＨ（緩衝液）、温度及び酸素（空気として）の影響を、６０日間の保存期間中に調べた。ＨＰＬＣを用いて残留ＮＲＨ濃度を測定した。この手順を、ＮＲ安定性測定にも使用し、結果を同じ条件でＮＲＨ試料と比較した。

【0123】

[0123]異なる条件におけるＮＲＨの安定性試験
[0124]ＮＲＨは、そのＮ－グリコシド結合のために不安定で感受性の高い分子であり、高温、求核試薬及び酸素への曝露中に分解、加水分解及び酸化を受ける可能性がある。ＮＲＨの場合のこれらの分解反応の主要生成物のいくつかをスキーム６に示す。異なるバリエーションの条件下でのＮＲＨの分解を調べることは、新規の栄養補助食品又は将来的な飲料製品の開発において重要である。ここでは、本発明者らは、新たに合成及び精製したＮＲＨの水溶液中における分解速度に対する、６０日間にわたる光、温度、酸素及びｐＨの影響について調べる。

【0124】

【化7】

【0125】

[0125]酸素及び光の影響
[0126]ジヒドロニコチンアミド誘導体としてのＮＲＨの酸化感受性はよく知られている。ＮＲの還元型として、ＮＲＨは高い酸化電位を有する。水溶液中のＮＲＨの安定性に対する空気、さらには周囲光の影響を調べるために、本発明者らは、空気中及びＮ_２ブランケット下、さらには暗所及び周囲光中で、新たに精製したＮＲＨ（カラムクロマトグラフィーによる）のＤＩ水溶液を調製した。本発明者らは、ＨＰＬＣにより、６０日間にわたってＮＲＨ濃度をモニタリングした。ＦＩＧ．７Ａは、暗所／明所及び空気中／Ｎ_２下での試料の両方についてのＨＰＬＣ結果に基づく、６０日間の保存中のＮＲＨ回収率（％）を示す。

【0126】

[0127]ＦＩＧ．７Ａに示される結果から、暗所に保持された試料と比較して、ＮＲＨの安定性に対する光の影響は無視できる程度であるが、酸素（空気として）は、ＮＲＨの安定性に対して劇的な影響を有することは明らかである。暗所でＤＩ水中に２５℃で保持された試料は、空気下、６０日間で５０％に達する、より速い分解を示す。対照的に、Ｎ_２ブランケット下で保持された同じ条件の試料では、観察された分解は約２７％である。これらの結果は、ＮＲＨが空気の存在下で酸化されやすいことを示している。

【0127】

[0128]温度の影響
[0129]温度は、Ｎ－グリコシド結合を有する分子の安定性に対して重大な影響を及ぼし得る。ＮＲ分子の分解は、一次反応速度則に従う温度依存性のものである。この分解は、ニコチンアミド（ＮＡ）が良好な脱離基であるために、Ｎ－グリコシド結合の解離を起こし易いことに起因する可能性が最も高い。しかし、ＮＲＨの脱離基はジヒドロニコチンアミド（ＤＨＮＡ）であり、ＮＲＨはイオン性ではない（環中の窒素は正電荷を有しない）。したがって、ＮＲＨは、温度に起因するＮ－グリコシド結合の自発的解離に関して、ＮＲ分子と比較してより安定であるはずであると予想される可能性がある。しかしながら、上記セクションで示したように、ＮＲＨの酸化分解も、その安定性に関して重要な役割を担っている。

【0128】

[0130]本発明者らは、空気中及びＮ_２ブランケット下の両方で、２つの異なる温度におけるＮＲＨの安定性について調べる。ＦＩＧ．７Ｂは、６０日間の保存中に４℃及び２５℃で保持された水溶液中のＮＲＨ回収の結果を示す。ＦＩＧ．２１は、６０日間の保存での、試料の一部の対応するＨＰＬＣクロマトグラムを示す。これらの結果から、ＮＲＨの、４℃と比較してより速い分解が２５℃で確認され、及び２５℃でのＮＲＨの酸化分解が空気により加速されたことによる影響も示される。Ｎ_２ブランケット下で４℃で保持された試料は、６０日間の保存後に検出可能な分解を示さないが、空気中で４℃の試料は、６０日間で約１０％の分解を呈している。２５℃での試料の場合、６０日間の保存後の分解は、Ｎ_２雰囲気下で約２７％、空気中で約５０％である。純粋なＮＲＨ（粉末として）は、冷蔵庫中、密封管内で、まったく劣化することなく数ヶ月間安定であった。

【0129】

[0131]ｐＨ（緩衝液）の影響
[0132]ＮＲ分子の解離分解は、ｐＨに依存しない。ＮＲＨ分子は、１０時間のモニタリング期間中、塩基性媒体中では比較的良好な安定性を示し（本発明者らが結果と考察においても強調するように）、酸性条件下では急速な分解を示した。本発明者らは、それぞれクエン酸緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液及び炭酸緩衝液を用いて調製したｐＨ５、ｐＨ７及びｐＨ９が、空気中及びＮ_２下の両方で、さらには暗所で６０日間にわたって２５℃で保持された水溶液中のＮＲＨの安定性に対して及ぼす影響を調べた（ＦＩＧ．７Ｃ及びＦＩＧ．２２）。ＦＩＧ．７Ｃの本発明者らの結果から、ｐＨ５では、ＮＲＨの１日未満での完全な分解が確認されるが、一方ｐＨ７の酢酸アンモニウム緩衝液中で調製した試料は、１日目の約７０％から３０日目の約２％までのＮＲＨ濃度の線形減少を示した。しかし、ｐＨ９の炭酸緩衝液中で調製した試料は、空気中（６０日後に約４５％の分解を測定）及びＮ_２下（６０日後に約４２％の分解を測定）の両方でかなりの安定性を示し、これは他からの短期データと一致する。

【0130】

[0133]ＦＩＧ．７Ｃ（２５℃、ｐＨ７、空気及びＮ_２）をＦＩＧ．７Ｂ（２５℃、ＤＩ水）と比較すると、ｐＨ７でのＮＲＨの急速な分解が、緩衝液の調製に用いた酢酸アンモニウム塩に起因することは明らかである。塩化物イオン及び酢酸イオンなどのいくつかのアニオンの存在は、ＮＲＨのＮＲへの酸化を加速する。なぜなら、この酸化プロセスでは、ＮＲの対イオンとしてのアニオンの存在が必要だからである。さらに、酢酸イオンは、求核試薬として作用し得、ＮＲＨの加水分解を促進し得る。酢酸アニオンを消費することによって、酢酸イオンに対するアンモニウムの比が増加し、この余分な量のアンモニウムの加水分解によって、溶液は徐々に酸性となり、ＮＲＨの加水分解速度が上昇する。したがって、酢酸アンモニウムを用いて調製された緩衝液を使用したｐＨ７．０の場合、ＮＲＨの分解に対する相乗効果があると言える。

【0131】

[0134]ＮＲＨの分解速度の動態グラフは、かなり速い分解速度の試料に関して６０日間の保存中に収集されたＨＰＬＣデータに基づく。ＦＩＧ．２３は、ｐＨ７．０、２５℃、Ｎ_２及び空気下で保存されたＮＲＨ試料（ＦＩＧ．２３Ａ及びＦＩＧ．２３Ｂ）、ｐＨ９．０、２５℃、Ｎ_２及び空気下で保存された試料（ＦＩＧ．２３Ｃ及びＦＩＧ．２３Ｄ）、並びにＤＩ水中、２５℃、Ｎ_２及び空気下で保存されたＮＲＨ試料（ＦＩＧ．２３Ｅ及びＦＩＧ．２３Ｆ）に対する動態グラフ及び一次分解速度を示す。空気下、ＤＩ水中、２５℃で保持された試料の分解速度は、１．２７×１０^－７ｓ^－１であり、これは６３日の半減期に相当する。比較として、Ｎ_２下、ＤＩ水中、２５℃で保持されたＮＲＨ試料の場合は、分解速度は５．９０×１０^－８ｓ^－１であり、これは１３６日の半減期に相当する（ＦＩＧ．２３）。

【0132】

[0135]水溶液中でのＮＲＨ対ＮＲの安定性の比較
[0136]ＮＲＨはＮＲの還元された形態であり、非常により高い生物学的活性を有する。しかし、ＮＲの安定性をＮＲＨと比較することは不可欠である。ＮＲＨがＮＲほど安定でない場合、後者はより多くの用途に有用であろう。ここで、本発明者らは、水溶液中のＮＲ及びＮＲＨの両方の安定性を比較する。水溶液中のＮＲの安定性はｐＨに依存しないことから、本発明者らは、６０日間にわたる４℃及び２５℃のＤＩ水中でのＮＲ及びＮＲＨの安定性について調べた。ＦＩＧ．６Ｄは、３０日間及び６０日間にわたるこの実験の結果を比較するものである。

【0133】

[0137]ＦＩＧ．７Ｄの結果から、４℃において、水溶液中のＮＲは非常に安定であり、６０日後に検出可能な分解がないことは明らかである。しかしながら、空気中で保存された水溶液中のＮＲＨは、３０日及び６０日後にそれぞれ９％及び１０％の分解を示す一方で、Ｎ_２ブランケット下で保存された水溶液中のＮＲＨは、６０日間の保存後に検出可能な分解がなく、かなり安定である。一方、２５℃（周囲温度を表す）で保持されたＮＲ溶液は、３０及び６０日間の保存後に４８％及び６８％の分解を示すが、この分解は、それぞれ、３０及び６０日後の空気下で保持されたＮＲＨ溶液の場合は３６％及び５０％であり、３０及び６０日後のＮ_２下で保持されたＮＲＨ溶液の場合は１３％及び２７％である。このことは、水溶液中において、熱分解がＮＲＨよりもＮＲに対してより深刻であること、及び空気を避けてＮＲＨを保存することがその安定性を改善することを明らかに示す。

【0134】

[0138]結論
市販のＮＲＣｌからＮＲＨを合成し、精製するための便利で、効率的であり、スケールアップ可能な手順が開発された。本発明の方法では、亜ジチオン酸ナトリウムを、異なる条件下で還元剤として用いた。好気性固相合成からは、高収率を得ることができなかったが、ｐＨ＝８．１の重炭酸ナトリウム溶液（１．２Ｍ）中での嫌気性合成では、３時間の反応時間後に約５５％の収率に達した。塩基性アルミナを用いた一般的な短カラムクロマトグラフィーを使用することによる精製プロセスを初めて行った。本発明者らは、反応のｐＨの影響が非常に重要であり、８．１で最適化されることを見出した。このｐＨを維持することは、反応全体を通して不可欠である。本発明者らは、ｐＨ＝８．１からｐＨ＝８．５への上昇が、反応時間の増加並びにＮＲＨのリボース及びジヒドロニコチンアミドへの加水分解を含むいくつかの有意な副反応をもたらすことを示した。ＮＭＲ、ＦＴＩＲ、ＬＣ－ＭＳ、ＵＶ－可視及びＨＰＬＣから、この方法によって合成されたＮＲＨの構造、さらには高い純度が確認された。水溶液中のＮＲＨの分解に対する温度、ｐＨ、光及び酸素（空気）の影響を調べるために、本発明者らは、長期安定性試験を行った。結果は、ＮＲＨが酸素の存在下で酸化され、酸性条件下で急速に加水分解されることを示した。分解速度は、Ｎ_２雰囲気下、より低い温度及び塩基性ｐＨにおいて低下した。

【0135】

[0139]本明細書に記載される実施例に対する様々な変更及び改変が、当業者には明らかであることは理解されるべきである。そのような変更及び修正は、本主題の趣旨及び範囲から逸脱することなく、かつ意図される利点を損なわずに、なされ得る。したがって、このような変更及び修正は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3-1】

【図3-2】

【図4A-4C】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【図21E】

【図21F】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図23E】

【図23F】

【国際調査報告】