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特表2023-540997免疫細胞を感染、活性化、および拡大させる方法および組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-27
(54)【発明の名称】免疫細胞を感染、活性化、および拡大させる方法および組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 7/01 20060101AFI20230920BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230920BHJP
C12N 15/48 20060101ALI20230920BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230920BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230920BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20230920BHJP
A61K 35/54 20150101ALI20230920BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230920BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230920BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230920BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230920BHJP
【ＦＩ】
C12N7/01 ZNA
C12N5/10
C12N15/48
C12N15/62 Z
A61K35/17
A61K35/545
A61K35/54
A61P35/00
A61P37/02
A61P43/00 105
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023515125
(86)(22)【出願日】2021-09-07
(85)【翻訳文提出日】2023-05-02
(86)【国際出願番号】 US2021049307
(87)【国際公開番号】W WO2022055892
(87)【国際公開日】2022-03-17
(31)【優先権主張番号】63/075,651
(32)【優先日】2020-09-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/075,747
(32)【優先日】2020-09-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518096526
【氏名又は名称】サイトイミューン セラピューティクス， インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣｙｔｏＩｍｍｕｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ジャン， レイ
(72)【発明者】
【氏名】チャダ， スニル
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AA97X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB071
4C084ZB211
4C084ZB261
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB57
4C087BB64
4C087BB65
4C087CA04
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB07
4C087ZB21
4C087ZB26
(57)【要約】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびγδＴ細胞などの免疫細胞を有効に感染させる、活性化する、および拡大させるための方法および組成物が提供される。一態様では、改変ＲＤ１１４ネコ内因性レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＲＤ１１４ＴＲ）および改変ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶＴＲ）を含むシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子が本明細書で提供される。一部の実施形態では、ＲＤ１１４ＴＲ糖タンパク質は、ＲＤ１１４糖タンパク質の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびに両種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ－Ａ）糖タンパク質の細胞質ドメインを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
改変ＲＤ１１４ネコ内因性レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＲＤ１１４ＴＲ）および改変ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶＴＲ）を含むシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子であって、ａ．前記ＲＤ１１４ＴＲ糖タンパク質が、ＲＤ１１４糖タンパク質の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびに両種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ－Ａ）糖タンパク質の細胞質ドメインを含み、
ｂ．前記ＢａＥＶＴＲ糖タンパク質が、ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびにＭＬＶ－Ａ糖タンパク質の細胞質ドメインを含み、
必要に応じて、前記ＲＤ１１４ＴＲおよび前記ＢａＥＶＴＲが、前記ガンマレトロウイルス粒子のエンベロープに膜タンパク質として組み入れられており、
さらに必要に応じて、前記シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子が、前記エンベロープに封入されたベクターゲノム、必要に応じた逆転写酵素、および必要に応じたインテグラーゼをさらに含み、前記ベクターゲノムが、２つの長いターミナルリピート（ＬＴＲ）に挟まれた以下：
（Ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、もしくは、必要に応じて抗体もしくはその断片、酵素、リガンドもしくは受容体から選択される別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｂ）（Ａ）のリバース相補体、または
（Ｃ）１つもしくは複数の認識部位を含むポリヌクレオチドであって、必要に応じて、前記認識部位が、ＣＡＲコード配列もしくはそのリバース相補体を前記ポリヌクレオチドに挿入するために適した制限酵素によって認識され、切断されるものである、ポリヌクレオチド
のうちの１つまたは複数を含む、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子。
【請求項2】
前記ベクターゲノムが、以下：５’ＬＴＲ、５’キャップ、３’ポリＡ尾部、および３’ＬＴＲのうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１に記載のシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子。
【請求項3】
以下の種：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、フレンドマウス胚性幹細胞ウイルス（ＦＭＥＶ）、異種指向性ＭｕＬＢ関連ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）およびネコ白血病ウイルスのうちのいずれか１つから選択される、請求項１または２に記載のシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子。
【請求項4】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を調製するための方法であって、以下：ＮＫ細胞、ＮＫ細胞の誘導が可能な前駆細胞、またはＮＫ細胞の誘導が可能な幹細胞のうちの１つまたは複数を含む細胞集団を、免疫細胞活性化因子（例えば、ＮＫ細胞活性化因子など）と一緒に培養するステップを含み、前記細胞集団が、細胞集団中のＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖、ＴＣＲ β鎖、またはαβＴＣＲのうちの１つまたは複数を発現する細胞が枯渇したものであり、前記免疫細胞活性化因子が、以下の（ｉ）～（ｉｖ）：（ｉ）必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／もしくは刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）もしくはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、
（ｉｉ）前記ＮＫ細胞、前記前駆細胞もしくは前記幹細胞のうちの１つもしくは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させる抗体もしくはその抗原結合性断片であって、必要に応じて、前記抗体が、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、抗ＤＮＡＭ－１抗体、抗２Ｂ４抗体、抗ＮＴＢ－Ａ抗体、もしくは抗ＮＫｐ４６（天然細胞傷害性受容体１（ＮＣＲ１））抗体のうちの１つもしくは複数から選択される、抗体もしくはその抗原結合性断片のうちの１つもしくは複数、
（ｉｉｉ）それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させるサイトカインのうちの１つもしくは複数、または
（ｉｖ）必要に応じて、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤もしくはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）から選択される、それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させる化学的部分のうちの１つもしくは複数
のうちの１つまたは複数から選択される、方法。
【請求項5】
以下：ＣＡＲ、もしくは必要に応じて抗体もしくはその断片、酵素、リガンドもしくは受容体から選択される別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、発現させるために、培養された細胞集団に導入するステップであって、前記ＣＡＲが、前記腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）もしくはウイルス抗原を特異的に認識し、これに結合するものである、ステップ；または、
請求項４の導入するステップの後に前記細胞集団を免疫細胞活性化因子と一緒に培養するステップであって、前記免疫細胞活性化因子が、以下の（ｉ）～（ｉｖ）：
（ｉ）必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／もしくは刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）もしくはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、
（ｉｉ）前記ＮＫ細胞、前記前駆細胞もしくは前記幹細胞のうちの１つもしくは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させる抗体もしくはその抗原結合性断片のうちの１つもしくは複数、
（ｉｉｉ）それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させるサイトカインのうちの１つもしくは複数、もしくは
（ｉｖ）必要に応じて、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤もしくはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）から選択される、それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させる化学的部分のうちの１つもしくは複数
のうちの１つもしくは複数から選択される、ステップ
のうちの一方または両方をさらに含み、
必要に応じて、前記培養するステップを、同じまたは異なる免疫細胞活性化因子またはこれらの組合せを用いて１回、２回、３回、またはこれよりも多く繰り返す、
請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ａＡＰＣが、４－１ＢＢＬ、膜結合（ｍｂ）ＩＬ－１５、ｍｂ ＩＬ－２１、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、ＭＩＣＡ、ＣＤ ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ｍｂ ＩＬ－２、ｍｂ ＩＬ－１８、ｍｂ ＩＬ－１２、ＣＤ２５結合性を欠くｍｂ ＩＬ－２変異体、ｍｂ ＩＬ－１５－Ｎ７２ＤスーパーアゴニストとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合タンパク質の複合体（ＩＬ－１５ＳＡ／ＩＬ－１５ＲαＳｕ－Ｆｃ）ＡＬＴ－８０３、またはＣＤ１２２／ＣＤ１３２シグナル伝達を媒介する細胞表面マーカーのうちの１つまたは複数をさらに発現し、必要に応じて、前記ａＡＰＣが、ｍｂ ＩＬ－２１および４－１ＢＢＬをさらに発現し、必要に応じて、前記ａＡＰＣが、操作されたＫ５６２細胞であり、必要に応じて、前記ａＡＰＣが、照射処理され、それによって細胞増殖を欠くまたは長期生存を欠くものであり、さらに必要に応じて、前記ａＡＰＣが、５０Ｇｙ、１００Ｇｙ、１５０Ｇｙまたは２００Ｇｙで照射処理されており、必要に応じて、前記ａＡＰＣを、前記細胞集団と一緒に、約１０：１、約５：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、または約１：１０の細胞数の比で培養する、請求項４または５に記載の方法。
【請求項7】
前記サイトカインが、Ｂ７．１、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、低毒性ＩＬ－２、ＣＤ２５結合性を欠くＩＬ－２変異体、ＩＬ－７、ＩＬ－１５－Ｎ７２ＤスーパーアゴニストとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合タンパク質の複合体（ＩＬ－１５ＳＡ／ＩＬ－１５ＲαＳｕ－Ｆｃ；可溶性ＡＬＴ－８０３）、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＬＥＣ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、またはＭＩＣＡからなる群から選択され、必要に応じて、前記細胞集団を、１００～５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５、または２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１のうちのいずれか１つまたはいずれか２つまたは３つ全てと一緒に培養し、必要に応じて、前記細胞集団を、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２および０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５のいずれかまたは両方と一緒に培養し、必要に応じて、前記細胞集団を、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２と一緒に培養する、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記導入するステップの前後に前記細胞集団と一緒に培養される前記活性化因子が、同じものである、または、前記導入するステップの前後に前記細胞集団と一緒に培養される前記活性化因子が、互いに異なるものである、請求項５から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を前記培養された細胞集団に導入し、それによって、前記ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを前記培養された細胞に導入するステップであって、前記粒子が、２つの長いターミナルリピート（ＬＴＲ）に挟まれた前記ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたはそのリバース相補体、ＲＤ１１４ＴＲ、およびＢａＥＶＴＲを含み、必要に応じて、前記シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子が、５’ＬＴＲ、５’キャップ、前記ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたはそのリバース相補体、３’ポリＡ尾部、および３’ＬＴＲを含むベクターゲノムを含み、必要に応じて、前記シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子が、逆転写酵素およびインテグラーゼのいずれかまたは両方をさらに含み、必要に応じて、前記シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、フレンドマウス胚性幹細胞ウイルス（ＦＭＥＶ）、異種指向性ＭｕＬＢ関連ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）およびネコ白血病ウイルスのうちの任意の種から選択され、必要に応じて、前記シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を、前記培養された細胞集団に、約０．１、約０．２、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９または約１０の感染多重度（ＭＯＩ）で導入する、ステップを含む、請求項５から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞集団を、前記導入するステップの前に少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、または少なくとも約１０日間にわたって培養し、必要に応じて、前記細胞集団を、前記導入するステップの前に７日間以下、８日間以下、９日間以下、１０日間以下、１１日間以下、１２日間以下、１３日間以下、１４日間以下、１５日間以下、３週間以下、または１カ月以下にわたって培養し、必要に応じて、前記細胞集団を、前記導入するステップの前に約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、または約１０日間にわたって培養する、請求項５から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを、前記細胞集団に、前記ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたはそのリバース相補体を含むウイルスベクターをＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎの存在下で形質導入することによって導入し、必要に応じて、前記ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎが、前記細胞集団への形質導入を行う容器の内部表面にコーティングされており、さらに必要に応じて、前記細胞集団が、インテグリンα４β１（ＶＬＡ－４）およびインテグリンα５β１（ＶＬＡ－５）のいずれかまたは両方を発現する、請求項５から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記細胞集団中のＣＤ５６、ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ２１２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１８、ＣＤ３６０、ＴＧＦ－βＲ、またはＩＬ－１０Ｒのうちの任意の１つまたは複数を発現する細胞を富化させるステップをさらに含み、必要に応じて、ＣＤ５６ｄｉｍ細胞およびＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞のいずれかまたは両方を富化させるステップをさらに含む、請求項４から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
任意の細胞集団が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはその実質的に精製された組成物を含み、必要に応じて、枯渇を有する細胞集団が、以下：ＮＫ細胞、前駆細胞、ＨＳＣ、ｉＰＳＣまたはそのそれぞれの実質的に精製された集団のうちの１つまたは複数を含み、必要に応じて、前記ＮＫ細胞が、以下：前駆細胞、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来細胞、胚性生殖細胞、胚性生殖細胞由来細胞、幹細胞、幹細胞由来細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または不死化細胞のうちの１つまたは複数から誘導されたものを含み、さらに必要に応じて、前記前駆細胞、ＨＳＣ、またはｉＰＳＣのうちの１つまたは複数が、ＮＫ細胞の誘導が可能なものであり、必要に応じて、いずれの細胞集団も、Ｔ細胞を実質的に含まず、必要に応じて、いずれの細胞集団も、Ｔ制御細胞を実質的に含まず、必要に応じて、いずれの細胞集団も、単離、富化または精製されたものである、請求項４から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記ＣＡＲ発現集団を組成物として製剤化するステップ；または前記ＣＡＲ発現集団を凍結保存するステップのいずれかまたは両方をさらに含む、請求項４から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
がん細胞の成長を阻害するための方法であって、請求項５から１４のいずれか一項に記載の方法によって調製されたＣＡＲ発現細胞の集団を前記がん細胞と接触させるステップを含み、前記ＣＡＲによって認識される抗原が、前記がん細胞によって発現されるＴＡＡである、方法。
【請求項16】
対象におけるがんを処置するための方法であって、請求項５から１４のいずれか一項に記載の方法によって調製されたＣＡＲ発現免疫細胞の集団を前記対象に投与するステップを含み、前記ＣＡＲによって認識される抗原が、前記がんの細胞によって発現されるＴＡＡである、方法。
【請求項17】
請求項４から１４のいずれか一項に記載の方法によって作製または調製されたＮＫ細胞またはその集団。
【請求項18】
請求項１７に記載の細胞またはその集団、および担体、必要に応じて薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項19】
０．５％未満のａＡＰＣ、必要に応じて、０．１％未満、または０．２％未満、または０．３％未満、０．４％未満、または０．５％未満のａＡＰＣを含む、請求項１７に記載の細胞もしくはその集団、または請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
抗原および細胞表面マーカー：４－１ＢＢＬ、膜結合（ｍｂ）ＩＬ－１５、ｍｂ ＩＬ－２１、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、ＭＩＣＡ、ＣＤ ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ｍｂ ＩＬ－２、ｍｂ ＩＬ－１８、ｍｂ ＩＬ－１２、ＣＤ２５結合性を欠くｍｂ ＩＬ－２変異体、ｍｂ ＩＬ－１５－Ｎ７２ＤスーパーアゴニストとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合タンパク質の複合体（ＩＬ－１５ＳＡ／ＩＬ－１５ＲαＳｕ－Ｆｃ）ＡＬＴ－８０３、またはＣＤ１２２／ＣＤ１３２シグナル伝達を媒介する細胞表面マーカーのうちの１つまたは複数を発現する操作されたａＡＰＣであって、必要に応じて、操作されたＫ５６２細胞であり、必要に応じて、照射処理され、それによって細胞増殖または長期生存または両方を欠くものであり、さらに必要に応じて、５０Ｇｙ、１００Ｇｙ、１５０Ｇｙまたは２００Ｇｙで照射処理されており、必要に応じて、１４日間よりも長くは実質的に生存しない、操作されたａＡＰＣ。
【請求項21】
本明細書に開示される方法における使用に適した１つまたは複数の薬剤および必要に応じた説明書を含むキットであって、必要に応じて、前記薬剤が、以下：ＣＡＲまたは別の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、細胞表現型を検出するための抗体、免疫細胞を単離または富化または精製するための抗体、前記ポリヌクレオチドを検出するためのプライマー、サイトカイン、およびａＡＰＣのうちの１つまたは複数から選択される、キット。
【請求項22】
γδＴ細胞の集団を調製するための方法であって、以下：γδＴ細胞、γδＴ細胞の誘導が可能な前駆細胞、またはγδＴ細胞の誘導が可能な幹細胞、のうちの１つまたは複数を含む細胞集団を、免疫細胞活性化因子（例えば、γδＴ細胞活性化因子など）と一緒に培養するステップを含み、前記細胞集団が、細胞集団中の、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖、ＴＣＲ β鎖、またはαβＴＣＲのうちの１つまたは複数を発現する細胞が枯渇したものであり、前記活性化因子が、以下の（ｉ）～（ｉｖ）：（ｉ）必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／または刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）またはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、
（ｉｉ）前記γδＴ細胞、前記前駆細胞または前記幹細胞のうちの１つまたは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってγδＴ細胞を活性化するまたは増殖させる抗体またはその抗原結合性断片のうちの１つまたは複数、
（ｉｉｉ）それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させるサイトカインのうちの１つもしくは複数、または、必要に応じて、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤もしくはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）から選択される、それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させる化学的部分のうちの１つもしくは複数
のうちの１つまたは複数から選択される、方法。
【請求項23】
ＣＡＲ、または必要に応じて抗体もしくはその断片、酵素、リガンドもしくは受容体から選択される別の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、発現させるために、培養された細胞集団に導入するステップであって、前記ＣＡＲが、前記腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または前記ウイルス抗原を特異的に認識し、これに結合する、ステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記細胞集団を、請求項２３に記載の導入するステップの後に、免疫細胞活性化因子（例えば、γδＴ細胞活性化因子など）と一緒に培養するステップであって、前記活性化因子が、以下の（ｉ）～（ｉｖ）：（ｉ）必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／もしくは刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）もしくはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、
（ｉｉ）前記γδＴ細胞、前記前駆細胞もしくは前記幹細胞のうちの１つもしくは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させる抗体もしくはその抗原結合性断片のうちの１つもしくは複数、
（ｉｉｉ）それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させるサイトカインのうちの１つもしくは複数、または
（ｉｖ）必要に応じて、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤もしくはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）から選択される、それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させる化学的部分のうちの１つもしくは複数；
のうちの１つまたは複数から選択されるステップをさらに含み、
必要に応じて、前記培養するステップを、同じまたは異なる活性化因子を用いて１回、２回、３回、またはこれよりも多く繰り返す、
請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を作製するためのウイルスパッケージングシステムであって、（ａ）ベクターゲノムを発現するプラスミド；（ｂ）パッケージングプラスミド；ならびに（ｃ）ＲＤ１１４ＴＲ、およびＢａＥＶＴＲを発現するエンベローププラスミドのうちの１つまたは複数を含み、必要に応じて、前記ベクターゲノムが、２つの長いターミナルリピート（ＬＴＲ）に挟まれた以下：（Ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、もしくは必要に応じて抗体もしくはその断片、酵素、リガンドもしくは受容体から選択される別の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｂ）（Ａ）のリバース相補体、または
（Ｃ）ＣＡＲコード配列もしくはそのリバース相補体を前記ポリヌクレオチドに挿入するために適した制限酵素によって認識される１つもしくは複数の認識部位を含むポリヌクレオチド
のうちの１つまたは複数を含み、
必要に応じて、前記ベクターゲノムが、以下：５’ＬＴＲ、５’キャップ、３’ポリＡ尾部、および３’ＬＴＲのうちの１つまたは複数をさらに含み、
必要に応じて、前記シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、フレンドマウス胚性幹細胞ウイルス（ＦＭＥＶ）、異種指向性ＭｕＬＢ関連ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）およびネコ白血病ウイルスのうちの任意の種から選択される、
ウイルスパッケージングシステム。
【請求項26】
パッケージング細胞株をさらに含み、必要に応じて、前記パッケージング細胞株が、２９３Ｔ細胞株である、請求項２５に記載のウイルスパッケージングシステム。
【請求項27】
シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を作製するための方法であって、パッケージング細胞株に、請求項２５または２６に記載のシステムを、前記シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子のパッケージングに適した条件下で形質導入するステップであって、必要に応じて、前記パッケージング細胞株が、２９３Ｔ細胞株であり、必要に応じて、前記細胞株に、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のプラスミドを１．５：１．５：１の比で用いて形質導入し、必要に応じて、前記パッケージングシステムが、少なくとも２つのエンベローププラスミドを含み、その一方がＲＤ１１４ＴＲを発現し、他方がＢａＥＶＴＲを発現し、さらに必要に応じて、前記細胞株に、（ａ）のプラスミド、（ｂ）のプラスミド、前記ＲＤ１１４ＴＲ発現プラスミド、および前記ＢａＥＶＴＲ発現プラスミドを１．５：１．５：１：１の比で用いて形質導入する、ステップを含む、方法。
【請求項28】
レトロウイルス粒子を作製するための方法であって、（ｉ）ベクター、必要に応じてベクターゲノムを発現するプラスミドを、前記ベクターゲノムを第１のレトロウイルス粒子にパッケージングするために適した第１のパッケージング細胞株に導入するステップと、
（ｉｉ）前記第１のレトロウイルス粒子を、前記第１のレトロウイルス粒子を複製するために適した第２のパッケージング細胞株に形質導入するステップと、
（ｉｉｉ）複製されたレトロウイルス粒子を単離するステップと
を含む、方法。
【請求項29】
前記第２のパッケージング細胞株が、細胞膜にレトロウイルスエンベロープタンパク質を含むが、前記細胞膜に前記レトロウイルスエンベロープタンパク質の侵入受容体を含まず、必要に応じて、前記レトロウイルスエンベロープタンパク質が、ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）であり、その侵入受容体が、アラニン／セリン／システイン／トレオニントランスポーター１（ＡＳＣＴ１）または２型ナトリウム依存性中性アミノ酸トランスポーター（ＡＳＣＴ２）であり、必要に応じて、前記レトロウイルスエンベロープタンパク質が、ＲＤ１１４レトロウイルス（ＲＤ１１４）のエンベロープ糖タンパク質であり、その侵入受容体が、ＡＳＣＴ２であり、必要に応じて、前記レトロウイルスエンベロープタンパク質が、テナガザル白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＧＡＬＶ）であり、その侵入受容体が、ナトリウム依存性リン酸トランスポーター（Ｐｉｔ１）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
請求項２８または２９に記載の方法によって作製されたレトロウイルス粒子。
【請求項31】
操作された免疫細胞を作製するための方法であって、請求項３０に記載のレトロウイルス粒子を免疫細胞またはその前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）に形質導入するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で、それぞれの内容全体がこれによって参照により本出願に組み込まれる２０２０年９月８日出願の米国仮出願第６３／０７５，６５１号；および２０２０年９月８日出願の同第６３／０７５，７４７号の優先権を主張するものである。
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で、それぞれの内容全体がこれによって参照により本出願に組み込まれる２０２０年９月８日出願の米国仮出願第６３／０７５，６５１号；および２０２０年９月８日出願の同第６３／０７５，７４７号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【0002】
背景
ＮＫ細胞は、腫瘍細胞を直接かつ迅速に殺滅することができるので、腫瘍免疫療法における潜在性が高い。遺伝子操作を用いてＮＫ細胞の機能を改めて方向付けること（ＣＡＲ－ＮＫ）は、ＮＫ細胞上に発現される多数の抑制性受容体に打ち勝つため、および、標的療法の使用を強化するための効果的な戦略である。現在のところ、前臨床試験および臨床試験により、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＮＫ細胞が、重要な抗腫瘍の役割を果たすことができ、また、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法よりも安全であることが示されている。例えば、Wang et al. Int. Immunopharmacol. 2019; 74: 105695を参照されたい。
それにもかかわらず、ＣＡＲ－ＮＫ細胞療法は、依然として、例えば、初代ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける拡大および活性化、ＮＫ細胞製品の保管および輸送の難しさ、ならびに低形質導入効率など、いくつかの難題に直面している。したがって、療法のためのＮＫ細胞を効率的に調製する組成物および方法が依然として必要とされている。本開示は、これらの必要を満たし、関連する利点も提供するものである。
ＮＫ細胞は、腫瘍細胞を直接かつ迅速に殺滅することができるので、腫瘍免疫療法における潜在性が高い。遺伝子操作を用いてＮＫ細胞の機能を改めて方向付けること（ＣＡＲ－ＮＫ）は、ＮＫ細胞上に発現される多数の抑制性受容体に打ち勝つため、および、標的療法の使用を強化するための効果的な戦略である。現在のところ、前臨床試験および臨床試験により、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＮＫ細胞が、重要な抗腫瘍の役割を果たすことができ、また、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法よりも安全であることが示されている。例えば、Wang et al. Int. Immunopharmacol. 2019; 74: 105695を参照されたい。
それにもかかわらず、ＣＡＲ－ＮＫ細胞療法は、依然として、例えば、初代ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける拡大および活性化、ＮＫ細胞製品の保管および輸送の難しさ、ならびに低形質導入効率など、いくつかの難題に直面している。したがって、療法のためのＮＫ細胞を効率的に調製する組成物および方法が依然として必要とされている。本開示は、これらの必要を満たし、関連する利点も提供するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Wang et al. Int. Immunopharmacol. 2019; 74: 105695
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本開示の要旨
一態様では、改変ＲＤ１１４ネコ内因性レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＲＤ１１４ＴＲ）および改変ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶＴＲ）を含むシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子が本明細書で提供される。一部の実施形態では、ＲＤ１１４ＴＲ糖タンパク質は、ＲＤ１１４糖タンパク質の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびに両種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ－Ａ）糖タンパク質の細胞質ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。それに加えてまたはその代わりに、ＢａＥＶＴＲ糖タンパク質は、ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびにＭＬＶ－Ａ糖タンパク質の細胞質ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ＲＤ１１４ＴＲおよびＢａＥＶＴＲは、粒子のエンベロープに膜タンパク質として組み入れられている。一部の実施形態では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、フレンドマウス胚性幹細胞ウイルス（ＦＭＥＶ）、異種指向性ＭｕＬＢ関連ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）およびネコ白血病ウイルスの種から選択される。
一態様では、改変ＲＤ１１４ネコ内因性レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＲＤ１１４ＴＲ）および改変ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶＴＲ）を含むシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子が本明細書で提供される。一部の実施形態では、ＲＤ１１４ＴＲ糖タンパク質は、ＲＤ１１４糖タンパク質の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびに両種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ－Ａ）糖タンパク質の細胞質ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。それに加えてまたはその代わりに、ＢａＥＶＴＲ糖タンパク質は、ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびにＭＬＶ－Ａ糖タンパク質の細胞質ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ＲＤ１１４ＴＲおよびＢａＥＶＴＲは、粒子のエンベロープに膜タンパク質として組み入れられている。一部の実施形態では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、フレンドマウス胚性幹細胞ウイルス（ＦＭＥＶ）、異種指向性ＭｕＬＢ関連ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）およびネコ白血病ウイルスの種から選択される。
【0005】
別の態様では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を調製する（これだけに限定されないが、感染、活性化、または拡大させることを含む）ための方法が提供される。方法は、以下：ＮＫ細胞、ＮＫ細胞の誘導が可能な前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、またはＮＫ細胞の誘導が可能な幹細胞のうちの１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる細胞集団を、１つまたは複数のＮＫ細胞活性化因子などの免疫細胞活性化因子と一緒に培養するステップを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、この培養するステップを、同じまたは異なる免疫細胞活性化因子（例えば、ＮＫ細胞活性化因子など）またはこれらの組合せを用いて１回、２回、３回、またはこれよりも多く繰り返す。一部の実施形態では、細胞集団は、細胞集団中のＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖、ＴＣＲ β鎖、またはαβＴＣＲのうちの１つまたは複数を発現する細胞が枯渇したものである。
【0006】
一部の実施形態では、免疫細胞活性化因子（例えば、ＮＫ細胞活性化因子など）は、以下：必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／もしくは刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および／もしくはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）；ＮＫ細胞、前駆細胞もしくは幹細胞のうちの１つもしくは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させる抗体もしくはその抗原結合性断片のうちの１つもしくは複数；それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させるサイトカインのうちの１つもしくは複数；またはそれによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させる化学的部分のうちの１つもしくは複数であるか、これらのうちの１つまたは複数から選択される。
【0007】
一態様では、γδＴ細胞の集団を調製するための方法が提供され、方法は、以下：γδＴ細胞、γδＴ細胞の誘導が可能な前駆細胞、またはγδＴ細胞の誘導が可能な幹細胞のうちの１つまたは複数を含む細胞集団を、１つまたは複数の免疫細胞活性化因子（例えば、γδＴ細胞活性化因子など）と一緒に培養するステップを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、細胞集団は、細胞集団中の、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖、ＴＣＲ β鎖、またはαβＴＣＲのうちの１つまたは複数を発現する細胞が枯渇したものである。一部の実施形態では、この培養するステップを、同じまたは異なる免疫細胞活性化因子（例えば、γδＴ細胞活性化因子など）またはこれらの組合せを用いて、１回、２回、３回、またはこれよりも多く繰り返す。
【0008】
一部の実施形態では、免疫細胞活性化因子（例えば、γδＴ細胞活性化因子など）は、必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／もしくは刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および／もしくはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）；γδＴ細胞、前駆細胞もしくは幹細胞のうちの１つもしくは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させる抗体もしくはその抗原結合性断片のうちの１つもしくは複数；それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させるサイトカインのうちの１つもしくは複数；またはそれによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させる化学的部分のうちの１つもしくは複数のうちの１つもしくは複数から選択される。
【0009】
本開示の任意の態様に関し得る一部の実施形態では、ａＡＰＣは、４－１ＢＢＬ、膜結合（ｍｂ）ＩＬ－１５、ｍｂ ＩＬ－２１、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（誘導可能なＴ細胞共刺激因子リガンド、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、ＭＩＣＡ（ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ）、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ｍｂ ＩＬ－２、ｍｂ ＩＬ－１８、ｍｂ ＩＬ－１２、ＣＤ２５結合性を欠くｍｂ ＩＬ－２変異体、ｍｂ ＩＬ－１５－Ｎ７２ＤスーパーアゴニストとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合タンパク質の複合体（ＩＬ－１５ＳＡ／ＩＬ－１５ＲαＳｕ－Ｆｃ）ＡＬＴ－８０３、またはＣＤ１２２／ＣＤ１３２シグナル伝達を媒介する細胞表面マーカーのうちの１つまたは複数をさらに発現する。一実施形態では、ａＡＰＣは、ｍｂ ＩＬ－２１および４－１ＢＢＬをさらに発現する。
【0010】
本開示の任意の態様に関し得る一部の実施形態では、サイトカインは、Ｂ７．１、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、低毒性ＩＬ－２、ＣＤ２５結合性を欠くＩＬ－２変異体、ＩＬ－７、ＩＬ－１５－Ｎ７２ＤスーパーアゴニストとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合タンパク質の複合体（ＩＬ－１５ＳＡ／ＩＬ－１５ＲαＳｕ－Ｆｃ；可溶性ＡＬＴ－８０３）、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＬＥＣ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、またはＭＩＣＡからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞集団を、１００～５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５、または２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１のうちのいずれか１つまたはいずれか２つまたは３つ全てと一緒に培養する。一部の実施形態では、細胞集団を、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２および０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５のいずれかまたは両方と一緒に培養する。一部の実施形態では、細胞集団を、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２と一緒に培養する。
【0011】
本明細書に開示される任意の方法の一部の実施形態は、例えば、ポリヌクレオチドを、本明細書に開示される１つまたは複数の培養するステップの前および／またはその後に、発現させるために、培養された細胞集団に導入するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＡＲおよび／または抗体もしくはその断片、酵素、リガンドもしくは受容体などの別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードする。
【0012】
本明細書に開示される任意の方法の一部の実施形態は、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を培養された細胞集団に導入し、それによって、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを培養された細胞に導入するステップをさらに含む。一部の実施形態では、粒子は、ＲＤ１１４ＴＲおよびＢａＥＶＴＲをエンベロープタンパク質として含む。一部の実施形態では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、フレンドマウス胚性幹細胞ウイルス（ＦＭＥＶ）、異種指向性ＭｕＬＢ関連ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）およびネコ白血病ウイルスの種から選択される。
【0013】
本明細書に開示される任意の方法の一部の実施形態は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、本明細書に開示されるシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子など）を含むレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターとポリヌクレオチドが導入される細胞の共局在を促進するためにＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎを使用することをさらに含む。１つの例は、細胞集団への本明細書に開示されるポリヌクレオチドの導入を行う容器の内部表面にＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎをコーティングすることである。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎは、レンチウイルスに媒介される遺伝子形質導入およびレトロウイルスに媒介される遺伝子形質導入を増強する、組換えヒトフィブロネクチン断片の６３ｋＤの断片である。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎは、ＴａＫａＲａから市販されている（ｗｗｗ．ｔａｋａｒａｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｅｎｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ／ｔ－ｃｅｌｌ－ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ－ａｎｄ－ｃｕｌｔｕｒｅ／ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ－ｒｅａｇｅｎｔ、２０２０年９月４日に最後に閲覧）。
【0014】
レトロウイルス粒子（例えば、ガンマレトロウイルス粒子など）を作製するための方法がさらに提供される。方法は、（ｉ）ベクターゲノムを第１のレトロウイルス粒子にパッケージングするために適した第１のパッケージング細胞株に、ベクターゲノムを発現するベクターを導入するステップ、（ｉｉ）第１のレトロウイルス粒子を複製するために適した第２のパッケージング細胞株に、第１のレトロウイルス粒子を形質導入するステップ；および（ｉｉｉ）複製されたレトロウイルス粒子を単離するステップを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、方法は、ベクターが導入された第１のパッケージング細胞株を培養するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、方法は、ベクターが導入された第１のパッケージング細胞株を培養するために第１のレトロウイルス粒子を単離するステップをさらに含む。それに加えてまたはその代わりに、方法は、形質導入された第２のパッケージング細胞株を培養するステップをさらに含む。したがって、方法によって作製されたレトロウイルス粒子、これと共に、作製されたレトロウイルス粒子の、操作された免疫細胞、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作された免疫細胞などの作製における使用が提供される。
【0015】
本開示の任意の態様に関し得る一部の実施形態では、細胞集団を、導入するステップの前に少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、または少なくとも約１０日間にわたって培養する。それに加えてまたはその代わりに、細胞集団を、導入するステップの前に７日間以下、８日間以下、９日間以下、１０日間以下、１１日間以下、１２日間以下、１３日間以下、１４日間以下、１５日間以下、３週間以下、または１カ月以下にわたって培養する。一実施形態では、細胞集団を、導入するステップの前に約５日間～約１０日間にわたって培養する。
【0016】
本開示の任意の態様に関し得る一部の実施形態では、細胞集団は、ＮＫ細胞、γδＴ細胞、幹細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、幹細胞、ＨＳＣもしくはｉＰＳＣのうちの任意の１つもしくは複数から誘導されたＮＫ細胞、または幹細胞、ＨＳＣもしくはｉＰＳＣのうちの任意の１つもしくは複数から誘導されたγδＴ細胞のうちの任意の１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。それに加えてまたはその代わりに、細胞集団は、対象の臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、対象の末梢血、または対象の骨髄から単離されたものである。
【0017】
一態様では、がん細胞の成長を阻害するための方法が提供される。方法は、本明細書に開示される方法によって調製されたＣＡＲ発現細胞の集団をがん細胞と接触させるステップを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、ＣＡＲによって認識される抗原は、がん細胞上に発現されるＴＡＡである。接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏであり得る。
【0018】
別の態様では、対象におけるがんを処置するための方法が提供される。方法は、本明細書に開示される方法によって調製されたＣＡＲ発現細胞の集団を投与するステップを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、ＣＡＲによって認識される抗原は、がんの細胞によって発現されるＴＡＡである。
【0019】
なお別の態様では、抗原および細胞表面マーカー：４－１ＢＢＬ、膜結合（ｍｂ）ＩＬ－１５、ｍｂ ＩＬ－２１、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、ＭＩＣＡ、ＣＤ ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ｍｂ ＩＬ－２、ｍｂ ＩＬ－１８、ｍｂ ＩＬ－１２、ＣＤ２５結合性を欠くｍｂ ＩＬ－２変異体、ｍｂ ＩＬ－１５－Ｎ７２ＤスーパーアゴニストとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合タンパク質の複合体（ＩＬ－１５ＳＡ／ＩＬ－１５ＲαＳｕ－Ｆｃ）ＡＬＴ－８０３、またはＣＤ１２２／ＣＤ１３２シグナル伝達を媒介する細胞表面マーカーのうちの１つまたは複数を発現する操作されたａＡＰＣが提供される。
【0020】
さらなる態様では、本明細書に開示される方法によって調製されたＮＫ細胞、γδＴ細胞、またはこれらの一方もしくは両方の細胞集団が提供される。一部の実施形態では、細胞および／または細胞集団は、ＣＡＲおよび／または抗体もしくはその断片、酵素、リガンドもしくは受容体などの別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドを発現する。
【0021】
一態様では、本明細書に開示される細胞またはその集団および担体、必要に応じて薬学的に許容される担体を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる組成物が提供される。
【0022】
別の態様では、本明細書に開示される方法における使用に適した１つまたは複数の薬剤および必要に応じた説明書を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるキットが提供される。一部の実施形態では、薬剤は、以下：ＣＡＲまたは別の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、細胞表現型を検出するための抗体、免疫細胞を単離または富化または精製するための抗体、ポリヌクレオチドを検出するためのプライマー、サイトカイン、およびａＡＰＣのうちの１つまたは複数から選択される。
【0023】
さらに別の態様では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を作製するためのウイルスパッケージングシステム、ならびにシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を作製するための方法が提供される。システムは、（ａ）ベクターゲノムを発現するプラスミド；（ｂ）パッケージングプラスミド；および（ｃ）ＲＤ１１４ＴＲおよびＢａＥＶＴＲを発現するエンベローププラスミドのうちの１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなり、方法は、システムをパッケージング細胞株に、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子のパッケージングに適した条件下で導入するステップを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
【0024】
上記の一般的な記述および以下の詳細な説明は例示的かつ説明的であり、特許を請求する本開示のさらなる説明を提供することを意図している。その他の目的物、利点、および新規な特徴は、以下の図面の簡単な説明および本開示の詳細な説明から当業者には容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【0026】
【図2A】図２Ａ～２Ｂは、遺伝子送達のための、成長曲線および初代ＮＫ細胞が顕著な増殖状態（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓｔａｔｅ）に入った時点の決定を提示する。拡大された初代ＮＫ細胞へのレトロウイルスによる形質導入の時点を最適化した。遺伝子送達のために、成長曲線を初代ＮＫ細胞が顕著な増殖状態に入った時点と一緒に決定した。本開示において使用した初代ヒトＮＫ細胞は、末梢血（ＰＢ）由来のものであり、ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９８－１８５）を用いて単離されたものであった。細胞をＣＤ５６およびＣＤ３抗体で染色することによって純度を決定し、ＮＫ細胞をＣＤ５６＋／ＣＤ３－集団と定義した（図２Ａ）。ＮＫ細胞を、ＮＫ ＭＡＣＳ培地（１３０－１１４－４２９）を用い、５０ＩＵ／ｍｌのヒトＩＬ－２と照射処理されたＫ５６２－ｍｂ２１－４１ＢＢＬフィーダーが１：１の比で存在する状況で培養した。明白に、単離し、５日間培養した後、初代ＮＫ細胞は顕著な増殖状態に入り、したがって、６～１０日目の活性化されたＮＫ細胞を遺伝子送達のために使用した（図２Ｂ）。
【図2B】図２Ａ～２Ｂは、遺伝子送達のための、成長曲線および初代ＮＫ細胞が顕著な増殖状態（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓｔａｔｅ）に入った時点の決定を提示する。拡大された初代ＮＫ細胞へのレトロウイルスによる形質導入の時点を最適化した。遺伝子送達のために、成長曲線を初代ＮＫ細胞が顕著な増殖状態に入った時点と一緒に決定した。本開示において使用した初代ヒトＮＫ細胞は、末梢血（ＰＢ）由来のものであり、ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９８－１８５）を用いて単離されたものであった。細胞をＣＤ５６およびＣＤ３抗体で染色することによって純度を決定し、ＮＫ細胞をＣＤ５６＋／ＣＤ３－集団と定義した（図２Ａ）。ＮＫ細胞を、ＮＫ ＭＡＣＳ培地（１３０－１１４－４２９）を用い、５０ＩＵ／ｍｌのヒトＩＬ－２と照射処理されたＫ５６２－ｍｂ２１－４１ＢＢＬフィーダーが１：１の比で存在する状況で培養した。明白に、単離し、５日間培養した後、初代ＮＫ細胞は顕著な増殖状態に入り、したがって、６～１０日目の活性化されたＮＫ細胞を遺伝子送達のために使用した（図２Ｂ）。
【0027】
【図3A】図３Ａ～３Ｄは、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎで実現される、ＲＤ１１４ＴＲおよびＢａＥＶＴＲでシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子（ＰＣＩＲ）の、高い生存率および収率を伴う高度なレベルのＮＫ細胞への遺伝子移入を可能にする有効性を示す。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ結合ウイルス（ＲＢＶ）感染戦略を本開示において使用し、詳細が図３Ａに例示されている。感染後に７３．５１％から８２．８１％までにわたる別個の生存率が高いＮＫ細胞（大まかな生存細胞ゲートを、低前方散乱（ＦＳＣ）および高側方散乱（ＳＳＣ）事象を除外することによって線引きすることができる）（図３Ｂ）、３ドナーの間で６５．１１％から７２．７５％までにわたるＥＧＦＲ ＣＡＲ遺伝子（Ｆａｂ－ＡＦ６４７陽性）形質導入効率（図３Ｃ）、ならびに感染後８日目に３ドナーにおいて最初の感染ＮＫ数と比較して２５倍、３４倍および４５倍の高度の増殖状態の収率（図３Ｄ）が認められた。
【図3B-3D】図３Ａ～３Ｄは、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎで実現される、ＲＤ１１４ＴＲおよびＢａＥＶＴＲでシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子（ＰＣＩＲ）の、高い生存率および収率を伴う高度なレベルのＮＫ細胞への遺伝子移入を可能にする有効性を示す。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ結合ウイルス（ＲＢＶ）感染戦略を本開示において使用し、詳細が図３Ａに例示されている。感染後に７３．５１％から８２．８１％までにわたる別個の生存率が高いＮＫ細胞（大まかな生存細胞ゲートを、低前方散乱（ＦＳＣ）および高側方散乱（ＳＳＣ）事象を除外することによって線引きすることができる）（図３Ｂ）、３ドナーの間で６５．１１％から７２．７５％までにわたるＥＧＦＲ ＣＡＲ遺伝子（Ｆａｂ－ＡＦ６４７陽性）形質導入効率（図３Ｃ）、ならびに感染後８日目に３ドナーにおいて最初の感染ＮＫ数と比較して２５倍、３４倍および４５倍の高度の増殖状態の収率（図３Ｄ）が認められた。
【0028】
【図4】図４は、同じ送達戦略を用いた、同じ増殖状態（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ ｓｔａｔｅ）における活性化されたＮＫ細胞の直接感染に基づくレトロウイルス力価測定を提示する。ヒト初代ＮＫ細胞への治療的遺伝子送達に基づくガンマレトロウイルスベクター（ＰＣＩＲ）を開発するための本開示では、力価測定方法は、７日目における同じ増殖状態の活性化されたＮＫ細胞についての厳密に同じ感染戦略に基づくものであった。図３Ａ～３Ｄに示されているこのＰＣＩＲ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫ送達アッセイに関して、使用した空ベクターは、ＰＣＩＲ－ＥＶ－ＥＧＦＰであった。トランスフェクションの４８時間後および７２時間後に回収しプールした未加工のウイルス上清の段階希釈物をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎがコーティングされたプレートに添加し、手順は図１および図３Ａと同じであった。ＣＡＲのためのマウスが供給源である可変一本鎖断片（ＳｃＦｖ）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＿１１５－６０５－００６）を使用して検出した。形質導入単位／ｍＬを、式：ＴＵ／ｍＬ＝（形質導入した細胞の数×パーセント蛍光×希釈係数）／（ｍＬ単位の形質導入体積）を使用して算出した。より正確な力価のために、複数の希釈物の平均を取った。本試験ではＭＯＩ３を使用した（図３Ａ～３Ｄを参照されたい）。
【0029】
【図5A】図５Ａ～５Ｃは、ガンマレトロウイルスベクターにより操作されたＣＡＲ－ＮＫが、レンチウイルスベクターにより操作されたＣＡＲ－ＮＫよりも優れ、長期培養下で、形質導入された遺伝子が高度に安定して発現されたことを示す。レンチウイルスにより操作されたＰＣＩＬ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫおよびＥＶ－ＧＦＰ対照はＧＦＰ陽性集団の選別に基づいて富化させ、レトロウイルスにより操作されたＰＣＩＲ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫは、ヤギ抗マウスＦａｂ－ＡＦ６４７陽性細胞の選別に基づくものであった。選別後１０日目に、ＰＣＩＬ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫ形質導入率および発現を評価するためにフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡イメージングの両方を使用し、ＧＦＰ陽性細胞がＰＣＩＬ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫおよびＰＣＩＬ－ＧＦＰ空ベクター対照のどちらに関してもおよそ１００％から３９％まで有意に減少した（図５Ａおよび５Ｃ）。しかし、フロー分析により、選別後１０日目、１４日目および２５日目に、ＰＣＩＲ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫについて形質導入された遺伝子の高度に安定な発現が認められたことが実証された（図５Ｂおよび５Ｃ）。
【図5B】図５Ａ～５Ｃは、ガンマレトロウイルスベクターにより操作されたＣＡＲ－ＮＫが、レンチウイルスベクターにより操作されたＣＡＲ－ＮＫよりも優れ、長期培養下で、形質導入された遺伝子が高度に安定して発現されたことを示す。レンチウイルスにより操作されたＰＣＩＬ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫおよびＥＶ－ＧＦＰ対照はＧＦＰ陽性集団の選別に基づいて富化させ、レトロウイルスにより操作されたＰＣＩＲ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫは、ヤギ抗マウスＦａｂ－ＡＦ６４７陽性細胞の選別に基づくものであった。選別後１０日目に、ＰＣＩＬ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫ形質導入率および発現を評価するためにフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡イメージングの両方を使用し、ＧＦＰ陽性細胞がＰＣＩＬ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫおよびＰＣＩＬ－ＧＦＰ空ベクター対照のどちらに関してもおよそ１００％から３９％まで有意に減少した（図５Ａおよび５Ｃ）。しかし、フロー分析により、選別後１０日目、１４日目および２５日目に、ＰＣＩＲ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫについて形質導入された遺伝子の高度に安定な発現が認められたことが実証された（図５Ｂおよび５Ｃ）。
【図5C】図５Ａ～５Ｃは、ガンマレトロウイルスベクターにより操作されたＣＡＲ－ＮＫが、レンチウイルスベクターにより操作されたＣＡＲ－ＮＫよりも優れ、長期培養下で、形質導入された遺伝子が高度に安定して発現されたことを示す。レンチウイルスにより操作されたＰＣＩＬ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫおよびＥＶ－ＧＦＰ対照はＧＦＰ陽性集団の選別に基づいて富化させ、レトロウイルスにより操作されたＰＣＩＲ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫは、ヤギ抗マウスＦａｂ－ＡＦ６４７陽性細胞の選別に基づくものであった。選別後１０日目に、ＰＣＩＬ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫ形質導入率および発現を評価するためにフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡イメージングの両方を使用し、ＧＦＰ陽性細胞がＰＣＩＬ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫおよびＰＣＩＬ－ＧＦＰ空ベクター対照のどちらに関してもおよそ１００％から３９％まで有意に減少した（図５Ａおよび５Ｃ）。しかし、フロー分析により、選別後１０日目、１４日目および２５日目に、ＰＣＩＲ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫについて形質導入された遺伝子の高度に安定な発現が認められたことが実証された（図５Ｂおよび５Ｃ）。
【0030】
【図6A】図６Ａおよび６Ｂは、リアルタイム細胞分析（ＲＴＣＡ）を使用した、ガンマレトロウイルスベクターＰＣＩＲ／ＢａＥＶＴＲにより操作されたＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の高度な形質導入効率および細胞傷害性の有効性を示す。ＮｏｖｏＣｙｔｅ ３００５フローサイトメトリー分析により、４ドナーからのガンマレトロウイルスベクターＰＣＩＲ／ＢａＥＶＴＲにより操作されたＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫについて高度な形質導入効率が実証された。切断型ＣＤ１９（ＥＶ－Ｔｃｄ１９）およびＥＧＦＲ導入遺伝子を別々に担持する空ベクターについて、形質導入率は平均８５％（ＣＤ１９－ＰＥ陽性）および７９．６％（ヤギ抗マウスＦａｂ－ＡＦ６４７陽性）であった（図６Ａ）。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＭＰ Ｂｕｎｄｌｅ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃ ００３８０６０１０４０）を使用して免疫細胞殺滅アッセイを実施した。これらのプロットは、２ドナーからの、細胞５，０００個／ウェルのＬＮ２２９を用い、細胞５００個／ウェルのエフェクターを添加した（１：１０ Ｅ：Ｔ）実験についてのインピーダンスデータを示すものであった。操作されたＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫについて、空ベクターニセ形質導入および形質導入されていないＮＫ群と比較して動的なリアルタイム殺滅が認められ、生細胞指標が最低であった（図６Ｂ）。
【図6B】図６Ａおよび６Ｂは、リアルタイム細胞分析（ＲＴＣＡ）を使用した、ガンマレトロウイルスベクターＰＣＩＲ／ＢａＥＶＴＲにより操作されたＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の高度な形質導入効率および細胞傷害性の有効性を示す。ＮｏｖｏＣｙｔｅ ３００５フローサイトメトリー分析により、４ドナーからのガンマレトロウイルスベクターＰＣＩＲ／ＢａＥＶＴＲにより操作されたＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫについて高度な形質導入効率が実証された。切断型ＣＤ１９（ＥＶ－Ｔｃｄ１９）およびＥＧＦＲ導入遺伝子を別々に担持する空ベクターについて、形質導入率は平均８５％（ＣＤ１９－ＰＥ陽性）および７９．６％（ヤギ抗マウスＦａｂ－ＡＦ６４７陽性）であった（図６Ａ）。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＭＰ Ｂｕｎｄｌｅ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃ ００３８０６０１０４０）を使用して免疫細胞殺滅アッセイを実施した。これらのプロットは、２ドナーからの、細胞５，０００個／ウェルのＬＮ２２９を用い、細胞５００個／ウェルのエフェクターを添加した（１：１０ Ｅ：Ｔ）実験についてのインピーダンスデータを示すものであった。操作されたＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫについて、空ベクターニセ形質導入および形質導入されていないＮＫ群と比較して動的なリアルタイム殺滅が認められ、生細胞指標が最低であった（図６Ｂ）。
【0031】
【図8A】図８Ａ～８Ｃは、２９３Ｖｅｃ－ＧａｌＶならびに２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶパッケージング細胞、および力価測定に使用した２種の細胞株Ｊｕｒｋａｔ ＴおよびＨＴ１０８０におけるレトロウイルス侵入受容体の発現を提示する。図８Ａに示されている通り、レトロウイルスの中で、ヒヒ内因性ウイルス（ＢａＥＶ）とネコ内因性レトロウイルス（ＲＤ１１４）は細胞への侵入のために共通の細胞表面受容体であるＡＳＣＴ２（ナトリウム依存性中性アミノ酸トランスポーター）を使用する。ヒヒ内因性ウイルス（ＢａＥＶ）はＡＳＣＴ２に加えてＡＳＣＴ１も細胞侵入受容体として使用する。テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）は侵入受容体としてナトリウム依存性リン酸トランスポーター（Ｐｉｔ１）を使用する。図８Ｂは、２種のパッケージング細胞株、２９３Ｖｅｃ－ＧａｌＶおよび２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶ、ならびに力価測定用細胞株、Ｊｕｒｋａｔ ＴおよびＨＴ１０８０に対するＡＳＣＴ１、ＡＳＣＴ２、およびＰｉｔ１についての免疫染色を提示する。ヒストグラムは、ウサギＩｇＧアイソタイプ対照（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃０２－６１０２）および対応する二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａ－２１２４５； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色した細胞、抗ＡＳＣＴ１（ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＬＳ－Ｃ１７９２２２）および対応する二次抗体を用いて染色した細胞、抗ＡＳＣＴ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８０５７Ｓ）および対応する二次抗体を用いて染色した細胞、ならびに抗Ｐｉｔ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＰＡ５－９８６５０）を用いて染色した細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。図８Ｃは、どちらの細胞株（Ｊｕｒｋａｔ ＴおよびＨＴ１０８０）も、３種のレトロウイルスエンベロープタンパク質（ＢａＥＶ、ＲＤ１１４およびＧＡＬＶ）の対応する侵入受容体を遍在的に発現しているので、これらのレトロウイルスエンベロープタンパク質力価測定に使用することができることを示す。２９３に基づくパッケージング細胞株、２９３Ｖｅｃ ＧＡＬＶおよび２９３Ｖｅｃ ＢａＥＶに関しては、ＧＡＬＶでシュードタイピングされたレトロウイルスのみが、侵入受容体Ｐｉｔ１を使用してこれらの細胞株に感染することができる。細胞型について、図８Ｃに３つの棒がプロットされている：左側の棒はＡＳＣＴ１の発現を表し、真ん中の棒はＡＳＣＴ２の発現を表し、右側の棒はＰｉｔ１の発現を表す。
【図8B】図８Ａ～８Ｃは、２９３Ｖｅｃ－ＧａｌＶならびに２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶパッケージング細胞、および力価測定に使用した２種の細胞株Ｊｕｒｋａｔ ＴおよびＨＴ１０８０におけるレトロウイルス侵入受容体の発現を提示する。図８Ａに示されている通り、レトロウイルスの中で、ヒヒ内因性ウイルス（ＢａＥＶ）とネコ内因性レトロウイルス（ＲＤ１１４）は細胞への侵入のために共通の細胞表面受容体であるＡＳＣＴ２（ナトリウム依存性中性アミノ酸トランスポーター）を使用する。ヒヒ内因性ウイルス（ＢａＥＶ）はＡＳＣＴ２に加えてＡＳＣＴ１も細胞侵入受容体として使用する。テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）は侵入受容体としてナトリウム依存性リン酸トランスポーター（Ｐｉｔ１）を使用する。図８Ｂは、２種のパッケージング細胞株、２９３Ｖｅｃ－ＧａｌＶおよび２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶ、ならびに力価測定用細胞株、Ｊｕｒｋａｔ ＴおよびＨＴ１０８０に対するＡＳＣＴ１、ＡＳＣＴ２、およびＰｉｔ１についての免疫染色を提示する。ヒストグラムは、ウサギＩｇＧアイソタイプ対照（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃０２－６１０２）および対応する二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａ－２１２４５； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色した細胞、抗ＡＳＣＴ１（ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＬＳ－Ｃ１７９２２２）および対応する二次抗体を用いて染色した細胞、抗ＡＳＣＴ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８０５７Ｓ）および対応する二次抗体を用いて染色した細胞、ならびに抗Ｐｉｔ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＰＡ５－９８６５０）を用いて染色した細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。図８Ｃは、どちらの細胞株（Ｊｕｒｋａｔ ＴおよびＨＴ１０８０）も、３種のレトロウイルスエンベロープタンパク質（ＢａＥＶ、ＲＤ１１４およびＧＡＬＶ）の対応する侵入受容体を遍在的に発現しているので、これらのレトロウイルスエンベロープタンパク質力価測定に使用することができることを示す。２９３に基づくパッケージング細胞株、２９３Ｖｅｃ ＧＡＬＶおよび２９３Ｖｅｃ ＢａＥＶに関しては、ＧＡＬＶでシュードタイピングされたレトロウイルスのみが、侵入受容体Ｐｉｔ１を使用してこれらの細胞株に感染することができる。細胞型について、図８Ｃに３つの棒がプロットされている：左側の棒はＡＳＣＴ１の発現を表し、真ん中の棒はＡＳＣＴ２の発現を表し、右側の棒はＰｉｔ１の発現を表す。
【図8C】図８Ａ～８Ｃは、２９３Ｖｅｃ－ＧａｌＶならびに２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶパッケージング細胞、および力価測定に使用した２種の細胞株Ｊｕｒｋａｔ ＴおよびＨＴ１０８０におけるレトロウイルス侵入受容体の発現を提示する。図８Ａに示されている通り、レトロウイルスの中で、ヒヒ内因性ウイルス（ＢａＥＶ）とネコ内因性レトロウイルス（ＲＤ１１４）は細胞への侵入のために共通の細胞表面受容体であるＡＳＣＴ２（ナトリウム依存性中性アミノ酸トランスポーター）を使用する。ヒヒ内因性ウイルス（ＢａＥＶ）はＡＳＣＴ２に加えてＡＳＣＴ１も細胞侵入受容体として使用する。テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）は侵入受容体としてナトリウム依存性リン酸トランスポーター（Ｐｉｔ１）を使用する。図８Ｂは、２種のパッケージング細胞株、２９３Ｖｅｃ－ＧａｌＶおよび２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶ、ならびに力価測定用細胞株、Ｊｕｒｋａｔ ＴおよびＨＴ１０８０に対するＡＳＣＴ１、ＡＳＣＴ２、およびＰｉｔ１についての免疫染色を提示する。ヒストグラムは、ウサギＩｇＧアイソタイプ対照（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃０２－６１０２）および対応する二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａ－２１２４５； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色した細胞、抗ＡＳＣＴ１（ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＬＳ－Ｃ１７９２２２）および対応する二次抗体を用いて染色した細胞、抗ＡＳＣＴ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８０５７Ｓ）および対応する二次抗体を用いて染色した細胞、ならびに抗Ｐｉｔ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＰＡ５－９８６５０）を用いて染色した細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。図８Ｃは、どちらの細胞株（Ｊｕｒｋａｔ ＴおよびＨＴ１０８０）も、３種のレトロウイルスエンベロープタンパク質（ＢａＥＶ、ＲＤ１１４およびＧＡＬＶ）の対応する侵入受容体を遍在的に発現しているので、これらのレトロウイルスエンベロープタンパク質力価測定に使用することができることを示す。２９３に基づくパッケージング細胞株、２９３Ｖｅｃ ＧＡＬＶおよび２９３Ｖｅｃ ＢａＥＶに関しては、ＧＡＬＶでシュードタイピングされたレトロウイルスのみが、侵入受容体Ｐｉｔ１を使用してこれらの細胞株に感染することができる。細胞型について、図８Ｃに３つの棒がプロットされている：左側の棒はＡＳＣＴ１の発現を表し、真ん中の棒はＡＳＣＴ２の発現を表し、右側の棒はＰｉｔ１の発現を表す。
【0032】
【図9】図９は、安定なレトロウイルスウイルスプロデューサー－２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶを生成するための形質導入戦略のワークフローを例示する。モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ－ＭｕＬＶ）に基づくレトロウイルスベクター（ＰＣＩＲ）を標的導入遺伝子送達ビヒクルとして使用した。ＢａＥＶでシュードタイピングされた２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶパッケージング細胞株を、臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）由来ＮＫ細胞への感染のためのビヒクル作製のために使用した。２種のパッケージング細胞株をこの作製のために使用した：一過性テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）でシュードタイピングされた上清の作製のために２９３Ｖｅｃ－ＧＡＬＶ、および、最終的なベクターの生成のために２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶ。どちらの細胞株もＢｉｏＶｅｃ Ｐｈａｒｍａから供給されるものであった。次いで、バルクプロデューサーを作製するために、この上清を使用してＢａＥＶでシュードタイピングされたパッケージング細胞株２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶに形質導入した。高力価クローンを生成するために、この２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶバルクプロデューサーをさらに選別するか、または限界希釈によって、および各クローンから生成された上清の力価測定によって選択された高力価クローンを使用して単一細胞をクローニングすることができる。次いで、高力価の安定なレトロウイルスウイルスプロデューサー－２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶから上清を継続的に作製することができる。
【0033】
【図10A】図１０Ａおよび１０Ｂは、サイズが大きい導入遺伝子を有するベクターを作製する安定なレトロウイルスウイルスプロデューサー－２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶからの未加工の上清の力価の改善を示す。「複数の標的を組み合わせて１つにする（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｏｎｅ）」は、出願人によって開発された独特の治療戦略である。ＢａＥＶでシュードタイピングされた２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶパッケージング細胞株をビヒクル作製のために使用した。図１０Ａは、大きな導入遺伝子挿入断片（＞１１ｋｂ）を有する代表的なレトロウイルスが、２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶパッケージング細胞によって一過性にもおよび安定にも作製されたことを提示する。合計３５０万個の２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶパッケージング細胞を１００ｍｍの組織培養皿に播種し、３７℃で４８～７２時間インキュベートした。細胞が９０～１００％集密に達したら、未加工の上清を収集し、１５００ｇで５分間高速回転させた。上記の上清の力価測定をＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞で実施した。ウイルス上清の段階希釈物を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎが予めコーティングされた組織培養処理されていない２４ウェルプレートにローディングし、１０％熱失活ウシ胎仔血清を補充した完全ＤＭＥＭ培地を用いて５００μｌにした。プレートを３２℃、２０００ｇで２時間高速回転させ、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞１０万個を添加し、１０００ｇで５分間高速回転させた。プレートを３７℃で４８時間インキュベートし、次いで、力価（形質導入単位／ｍｌ）を次式に従って決定するためにフロー分析を実施した：形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬ＝［（標的細胞数）×（％陽性細胞）］。この例では、レポーター遺伝子ＲＱＲ８の発現を、ヒトＣＤ３４抗体に対するフロー抗体（ＱＢＥｎｄ／１０）（アロフィコシアニン）（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＬＬＣ、＃ＦＡＢ７２２７Ａ）によって検出した。図１０Ｂに示されている通り、サイズが大きい導入遺伝子を有するベクターについて、安定なレトロウイルスウイルスプロデューサー－２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶからの未加工の上清の力価（ＴＵ＝７．２Ｅ５）が、一過性に作製されたウイルス（ＴＵ＝２．２Ｅ５）と比較して改善された。
【図10B】図１０Ａおよび１０Ｂは、サイズが大きい導入遺伝子を有するベクターを作製する安定なレトロウイルスウイルスプロデューサー－２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶからの未加工の上清の力価の改善を示す。「複数の標的を組み合わせて１つにする（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｏｎｅ）」は、出願人によって開発された独特の治療戦略である。ＢａＥＶでシュードタイピングされた２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶパッケージング細胞株をビヒクル作製のために使用した。図１０Ａは、大きな導入遺伝子挿入断片（＞１１ｋｂ）を有する代表的なレトロウイルスが、２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶパッケージング細胞によって一過性にもおよび安定にも作製されたことを提示する。合計３５０万個の２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶパッケージング細胞を１００ｍｍの組織培養皿に播種し、３７℃で４８～７２時間インキュベートした。細胞が９０～１００％集密に達したら、未加工の上清を収集し、１５００ｇで５分間高速回転させた。上記の上清の力価測定をＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞で実施した。ウイルス上清の段階希釈物を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎが予めコーティングされた組織培養処理されていない２４ウェルプレートにローディングし、１０％熱失活ウシ胎仔血清を補充した完全ＤＭＥＭ培地を用いて５００μｌにした。プレートを３２℃、２０００ｇで２時間高速回転させ、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞１０万個を添加し、１０００ｇで５分間高速回転させた。プレートを３７℃で４８時間インキュベートし、次いで、力価（形質導入単位／ｍｌ）を次式に従って決定するためにフロー分析を実施した：形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬ＝［（標的細胞数）×（％陽性細胞）］。この例では、レポーター遺伝子ＲＱＲ８の発現を、ヒトＣＤ３４抗体に対するフロー抗体（ＱＢＥｎｄ／１０）（アロフィコシアニン）（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＬＬＣ、＃ＦＡＢ７２２７Ａ）によって検出した。図１０Ｂに示されている通り、サイズが大きい導入遺伝子を有するベクターについて、安定なレトロウイルスウイルスプロデューサー－２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶからの未加工の上清の力価（ＴＵ＝７．２Ｅ５）が、一過性に作製されたウイルス（ＴＵ＝２．２Ｅ５）と比較して改善された。
【発明を実施するための形態】
【0034】
詳細な説明
定義
理解されるように、セクションまたはサブセクションの見出しは、本明細書で使用される場合、文書構成の目的のために過ぎず、記載される主題を限定および／または分けるものとして解釈されるべきではない。
定義
理解されるように、セクションまたはサブセクションの見出しは、本明細書で使用される場合、文書構成の目的のために過ぎず、記載される主題を限定および／または分けるものとして解釈されるべきではない。
【0035】
他に定義されなければ、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が本開示の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、デバイス、および材料がこれより記載される。本明細書において引用される全ての技術的および特許刊行物は参照により全体が本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいかなる記載も、本開示は先行開示を理由としてそのような開示に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。
【0036】
本開示の実施は、他に示されなければ、当技術分野の技術的範囲内にある、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来技術を用いる。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Herzenberg et al. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)); Sohail (ed.) (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press)を参照されたい。
【0037】
全ての数値的指定、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、範囲を含めて、おおよそのものであり、適切な場合に、０．１または１．０の増分により（＋）または（－）に変動される。常に明示的に述べられるわけではないが、全ての数値的指定は「約」という用語により先行されることが理解されるべきである。常に明示的に述べられるわけではないが、本明細書に記載される試薬は単に例示的なものであり、そのような均等物は当技術分野において公知であることもまた理解されるべきである。
【0038】
「約」という用語は、測定可能な値、例えば量または濃度などを指す場合に本明細書で使用される場合、指定される量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変動を包含することが意味される。
【0039】
本明細書および請求項において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に規定しなければ、複数への言及を含む。例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」という用語は、これらの混合物を含む、複数の細胞を含む。
【0040】
当業者には理解される通り、ありとあらゆる目的に関して、本明細書に開示される全ての範囲には、ありとあらゆる可能性のある部分範囲およびその部分範囲の組合せも包含される。さらに、当業者には理解される通り、範囲には、個々のメンバーそれぞれが含まれる。
【0041】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、組成物および方法は列挙される要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することが意図される。「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、記載される目的のために組合せに対して何らかの本質的な意義を持つ他の要素を除外することを意味するものとする。そのため、本明細書において定義されている要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量の夾雑物ならびに薬学的に許容される担体、例えばリン酸緩衝食塩水および保存剤などを除外しない。「からなる」は、他の成分の微量要素を超えるものおよび本開示の組成物を投与するための実質的な方法ステップまたは組成物を生成するかもしくは意図される結果を達成するための実質的なプロセスステップを除外することを意味するものとする。これらの移行句のそれぞれにより定義される実施形態は本開示の範囲内にある。
【0042】
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載される状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、その結果、記載は、状況が起こる事例およびそれが起こらない事例を含む。
【0043】
本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連付けられて列挙される項目の１つまたは複数の任意のおよび全ての可能な組合せ、ならびに選択肢（「または」）において解釈される場合の組合せの欠如を指し、かつ包含する。
【0044】
「実質的に」または「本質的に」は、何らかの所与の量のほぼ全体または完全、例えば、９５％またはそれより高いを意味する。一部の実施形態では、「実質的に」または「本質的に」は、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％を意味する。
【0045】
一部の実施形態では、成分の名称における「第１」、「第２」、「第３」、「第４」または類似した用語は、それらの名称においてある特定の同一性を共有する１つより多くの成分を区別および同定するために使用される。例えば、「第１の細胞株」および「第２の細胞株」は、２つの細胞株を区別するために使用される。
【0046】
「単離された」という用語は、核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡに関して本明細書で使用される場合、高分子の天然の供給源において存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞれ分離された分子を指す。「単離された核酸」という用語は、断片として天然に存在せず、天然の状態において見出されない核酸断片を含むことが意味される。「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチド、タンパク質、ウイルスおよび／または宿主細胞を指すために本明細書で使用され、精製されたポリペプチド、タンパク質、ウイルスおよび／または宿主細胞、ならびに組換えポリペプチド、タンパク質、ウイルスおよび／または宿主細胞の両方を包含することが意味される。他の実施形態では、「単離された」という用語は、構成成分、細胞およびその他、通常は天然において付随する細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ウイルス、抗体またはその断片から分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離されている細胞である。当業者に明らかなように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ウイルス、または抗体もしくはその断片は、その天然に存在する対応物からそれを区別するために「単離」を要求しない。
【0047】
一部の実施形態では、「操作された」または「組換え」という用語は、参照される種の天然に存在するタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、系統、野生型系統または親宿主系統において通常は見出されない少なくとも１つの改変を有することを指す。一部の実施形態では、「操作された」または「組換え」という用語は、ヒトの介入により合成されていることを指す。本明細書で使用される場合、「組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技術により産生されたポリペプチドを指し、一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡは好適な発現ベクターに挿入され、発現ベクターは次いで、宿主細胞を形質転換して異種タンパク質を産生するために使用される。
【0048】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそのアナログのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、既知または未知の、任意の機能を行うことができる。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えばメチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって遮られ得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより、さらに改変され得る。用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。他に指定または要求されなければ、ポリヌクレオチドである本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態および二本鎖形態を構成することが既知であるかまたは予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれ両方を包含する。
【0049】
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡである場合にチミンの代わりにウラシル（Ｕ）の特定の配列から構成される。そのため、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現である。このアルファベット表現は、中央処理装置を有するコンピュータ中のデータベースに入力し、バイオインフォマティクス応用、例えば機能ゲノミクスおよび相同性検索のために使用され得る。
【0050】
「ポリヌクレオチドの増幅」という表現は、方法、例えばＰＣＲ、ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）および増幅方法を含む。これらの方法は、当技術分野において公知であり、広く実施されている。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号ならびにInnis et al., 1990（ＰＣＲについて）；およびWu et al. (1989) Genomics 4:560-569（ＬＣＲについて）を参照されたい。一般に、ＰＣＲ手順は、（ｉ）ＤＮＡ試料（またはライブラリー）内の特定の遺伝子へのプライマーの配列特異的なハイブリダイゼーション、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼを使用する複数ラウンドのアニーリング、伸長、および変性を伴うその後の増幅、ならびに（ｉｉｉ）正確なサイズのバンドについてのＰＣＲ生成物のスクリーニングから構成される遺伝子増幅の方法を記載する。使用されるプライマーは、重合の開始を提供するための十分な長さおよび適切な配列のオリゴヌクレオチドであり、すなわち各プライマーは、増幅されるべきゲノム座位の各鎖に相補的であるように特異的に設計される。
【0051】
ＰＣＲを実行するための試薬およびハードウェアは市販されている。特定の遺伝子領域から配列を増幅するために有用なプライマーは、好ましくは、標的領域またはその隣接領域中の配列に相補的であり、その配列に特異的にハイブリダイズする。増幅により生成される核酸配列は、直接的にシークエンシングされてもよい。あるいは、増幅された配列は、配列解析の前にクローニングされてもよい。酵素的に増幅されたゲノムセグメントの直接的なクローニングおよび配列解析の方法は当技術分野において公知である。
【0052】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードする能力を有する少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。
【0053】
「発現する」という用語は、遺伝子産物、例えばｍＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の産生を指す。本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシングを含んでもよい。
【0054】
「遺伝子産物」あるいは「遺伝子発現産物」は、遺伝子が転写および翻訳された場合に生成されるアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を指す。一部の実施形態では、遺伝子産物は、遺伝子が転写された場合に生成されるｍＲＮＡを指すことができる。
【0055】
「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、そのネイティブな状態で、または当業者に周知の方法によって操作された場合に、転写および／または翻訳されて、ポリペプチドおよび／またはその断片のｍＲＮＡを生じさせることができる場合にポリペプチドを「コードする」といえるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補体であり、アンチセンス鎖からコード配列を推定することができる。
【0056】
「～の発現を方向付ける」としても本明細書で使用される、「転写制御下で」は、当技術分野においてよく理解される用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常はＤＮＡ配列の転写が、それが、転写の開始に寄与するか、または転写を促進するエレメントに作動可能に連結されていることに依存することを示す。「作動可能に連結された」は、ポリヌクレオチドが、それらが細胞中で機能することを可能とする方式で配置されていることを意図する。
【0057】
「制御配列」、「発現制御エレメント」または「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、転写および／または複製されるべき標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結されており、標的ポリヌクレオチドの発現および／または複製を促すポリヌクレオチドを意図する。プロモーターは、発現制御エレメントまたは制御配列の例である。プロモーターは、遺伝子または他のポリヌクレオチドの５’または上流に位置することができ、調節された遺伝子転写のための制御点を提供する。ポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩはプロモーターの例である。
【0058】
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、コード配列、例えば遺伝子の発現を調節する任意の配列を指す。プロモーターは、例えば、構成的、誘導可能、抑制性、または組織特異的であってもよい。「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域であるコントロール配列である。それは、調節タンパク質および分子が、例えばＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子を結合し得る遺伝子エレメントを含有してもよい。プロモーターの非限定的な例はＥＦ１アルファプロモーターおよびＣＭＶプロモーターを含む。ＥＦ１アルファ配列は当技術分野において公知である（例えば、addgene.org/11154/sequences/; ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J04617、それぞれ最終アクセス日2019年3月13日、およびZheng and Baum (2014) Int’l. J. Med. Sci. 11(5):404-408を参照されたい）。ＣＭＶプロモーター配列は当技術分野において公知である（例えば、snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=basic_cloning_vectors&plasmid=CMV_promoter、最終アクセス日2019年3月13日、およびZheng and Baum (2014)、上掲を参照されたい）。例は、ＥＦ１アルファプロモーター配列：配列番号１４８、および必要に応じてその等価物である。
【0059】
エンハンサーは、標的配列の発現を増加させる調節エレメントである。「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を提供する能力を有する配列を含有するポリヌクレオチドである。例えば、レトロウイルスの長いターミナルリピートは、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を含有する。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」または「外因性」または「異種」であってもよい。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム中の所与の遺伝子と天然に連結されているエンハンサー／プロモーターである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子マニピュレーション（すなわち、分子生物学技術）により遺伝子に並置されているエンハンサー／プロモーターであって、その結果、その遺伝子の転写が、連結されたエンハンサー／プロモーターにより方向付けられる。
【0060】
「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基の間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン－クリック塩基対合、フーグスティーン結合により、または任意の他の配列特異的な方式において起こってもよい。複合体は、デュプレックス構造を形成する２つの鎖、多鎖複合体を形成する３つもしくはより多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組合せを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、より大規模なプロセス中のステップ、例えばＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断を構成してもよい。
【0061】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行われ得る。一般に、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、約４０℃で１０×ＳＳＣまたは同等のイオン強度／温度の溶液中で実行される。中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは典型的には約５０℃で６×ＳＳＣ中で行われ、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は一般に約６０℃で１×ＳＳＣ中で行われる。ハイブリダイゼーション反応はまた、当業者に周知の「生理学的条件」下で行われ得る。生理学的条件の非限定的な例は、細胞において通常見出される温度、イオン強度、ｐＨおよびＭｇ２＋の濃度である。
【0062】
ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖ポリヌクレオチドの間の逆平行の構成において起こる場合、反応は「アニーリング」と呼ばれ、それらのポリヌクレオチドは「相補的」として記載される。二本鎖ポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドに対して、ハイブリダイゼーションが第１のポリヌクレオチドの鎖のうちの１つと第２のポリヌクレオチドの間で起こり得る場合に、「相補的」または「相同的」であり得る。「相補性」または「相同性」（１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般に許容される塩基対合規則にしたがって、互いと水素結合を形成することが予想される対向する鎖中の塩基の割合の観点で定量化可能である。
【0063】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチドの間または２つの核酸分子の間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的のためにアライメントされ得る各配列中の位置を比較することにより決定され得る。比較される配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸により占有される場合には、分子はその位置において相同的である。配列の間の相同性の程度は、配列により共有されるマッチするまたは相同的な位置の数の関数である。「無関連の」または「非相同的な」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、あるいは２５％未満の同一性を共有する。
【0064】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有し、すなわち、アライメントされた場合に、そのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が、２つの配列の比較において同じである。このアライメントおよび相同性または配列同一性パーセントは、当技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biologyに記載されているものを使用して決定され得る。好ましくは、デフォルトのパラメータがアライメントのために使用される。１つのアライメントプログラムは、デフォルトのパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、以下のデフォルトのパラメータ：遺伝コード＝標準的；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソーティング方法＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLASTにおいて見出され得る。別の実施形態では、プログラムは、www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/においてアクセス可能なＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/においてアクセス可能なＮｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳ）、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_stretcher/においてアクセス可能なＳｔｒｅｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/においてアクセス可能なＷａｔｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_matcher/においてアクセス可能なＭａｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/においてアクセス可能なＬＡＬＩＧＮのいずれか１つである。さらなる実施形態では、デフォルトの設定が使用される。
【0065】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているポリヌクレオチドはＲＮＡである。一部の実施形態では、本明細書に開示されているポリヌクレオチドはＤＮＡである。一部の実施形態では、本明細書に開示されているポリヌクレオチドはＤＮＡおよびＲＮＡのハイブリッドである。
【0066】
一部の実施形態では、参照核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに対する等価物は、参照によりコードされる同じ配列をコードする。一部の実施形態では、参照核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに対する等価物は、必要に応じて高いストリンジェンシーの条件下で、参照、相補体参照、リバース参照、および／またはリバース相補体参照にハイブリダイズする。
【0067】
追加的あるいは、等価物核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、参照核酸、ポリヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％、もしくは少なくとも８０％の配列同一性、あるいは少なくとも８５％の配列同一性、あるいは少なくとも９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９２％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性、あるいは少なくとも９７％の配列同一性、あるいは少なくとも９８％の配列同一性を有するものであるか、あるいは等価物核酸は、参照ポリヌクレオチドもしくはその相補体に高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。一態様では、等価物は、必要に応じて本明細書に記載される１つもしくは複数のアッセイを通じて同定され得る機能的タンパク質をコードしなければならない。追加的あるいは、ポリヌクレオチドの等価物は、参照または親ポリヌクレオチドと同じまたは類似した機能のタンパク質またはポリペプチドをコードする。
【0068】
「形質導入する」または「形質導入」という用語は、操作された細胞、例えばキメラ抗原受容体細胞の産生に適用される場合、外来ヌクレオチド配列が細胞に導入されるプロセスを指す。一部の実施形態では、この形質導入は、ベクター（例えば、ウイルス性ベクターまたは非ウイルス性ベクター）を介して行われる。
【0069】
本明細書で使用される場合、制限酵素は、制限部位として公知の分子内の特異的な認識部位においてまたはその近くでＤＮＡを断片に切断する酵素である。それらは、遺伝子クローニングおよびタンパク質産生実験の間にポリヌクレオチド、例えば遺伝子の、プラスミドベクターへの挿入を補助するために使用される。最適な使用のために、遺伝子クローニングのために一般的に使用されるプラスミド、例えばウイルスベクターゲノムをコードするプラスミドは、制限酵素認識配列に富んだ短いポリリンカー配列（多重クローニング部位、またはＭＣＳと呼ばれる）を含むように改変される。これは、遺伝子断片をプラスミドベクターに挿入する場合に柔軟性を可能とし；遺伝子内に天然に含有される制限部位は、ＤＮＡを消化するためのエンドヌクレアーゼの選択に影響を及ぼし、その理由は、望まれるＤＮＡの末端を意図的に切断しながら該ＤＮＡの制限を回避することが必要であるからである。遺伝子断片をベクターにクローニングするために、プラスミドＤＮＡおよび遺伝子挿入物の両方は、典型的には同じ制限酵素で切断され、次にＤＮＡリガーゼとして公知の酵素の補助により一緒に接着される。
【0070】
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、交換可能におよびそれらの最も広い意味において使用されて、２つまたはより多くのサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチド模倣物の化合物を指す。サブユニットはペプチド結合により連結されてもよい。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどにより連結されてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤとＬの両方の光学異性体、アミノ酸アナログならびにペプチド模倣物を含む、天然のおよび／もしくは非天然のまたは合成のアミノ酸を指す。
【0071】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子を総称的に指し、これは、例としておよび限定なく、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、これらの組合せ、ならびに任意の脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えばヒト、ヤギ、ウサギおよびマウス、ならびに非哺乳動物種において免疫応答の間に産生される類似した分子、例えばサメ免疫グロブリンを含む。特に他に記載されなければ、「抗体」という用語は、他の分子への結合が実質的に除外されて、目的の分子（または高度に類似した目的の分子の群）に特異的に結合するインタクトな免疫グロブリンおよび「抗体断片」または「抗原結合性断片」（例えば、生体試料中の他の分子に対する結合定数よりも少なくとも１０３Ｍ－１高い、少なくとも１０４Ｍ－１高いまたは少なくとも１０５Ｍ－１高い目的の分子に対する結合定数を有する抗体および抗体断片）を含む。「抗体」という用語はまた、遺伝子操作された形態、例えばキメラ抗体（例えば、マウスまたはヒト化非霊長類抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば二特異性抗体）を含む。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Owen et al., Kuby Immunology, 7th Ed., W.H. Freeman & Co., 2013; Murphy, Janeway’s Immunobiology, 8th Ed., Garland Science, 2014; Male et al., Immunology (Roitt), 8th Ed., Saunders, 2012; Parham, The Immune System, 4th Ed., Garland Science, 2014もまた参照。
【0072】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、Ｂリンパ球の単一のクローンによりまたは単一の抗体の軽鎖および重鎖遺伝子がトランスフェクトされている細胞により産生される抗体を指す。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により、例えば免疫脾臓細胞との骨髄腫細胞の融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製することにより産生される。モノクローナル抗体はヒト化モノクローナル抗体を含む。
【0073】
抗体構造の観点において、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合により相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。２種類の軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）がある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがある。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する（領域は「ドメイン」としても公知である）。組合せにおいて、重鎖および軽鎖可変領域は抗原に特異的に結合する。軽鎖および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域により遮られた「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は定義されている（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照されたい；該文献はこれにより参照により本明細書に組み込まれる）。Ｋａｂａｔデータベースは現在ではオンラインで維持されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は種内で相対的に保存されている。構成成分の軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域は、概してはβ－シートコンホメーションをとり、ＣＤＲは、β－シート構造を接続する、および一部の場合においてその部分を形成する、ループを形成する。そのため、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用により正確な配向性でのＣＤＲの配置を提供するスカフォールドを形成するように作用する。
【0074】
ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合に主に関与する。各鎖のＣＤＲは、一般には、Ｎ末端から出発して逐次的に番号付けされてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称され、また、一般には特定のＣＤＲが位置する鎖によっても識別される（ＣＤＲＨと標識される重鎖領域、例えば、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３など、ならびにＣＤＲＬと標識される軽鎖領域、例えば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３など）。したがって、ＣＤＲＨ３は、それが見いだされる抗体の重鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ３であり、一方、ＣＤＲＬ１は、それが見いだされる抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。例えば、ＴＮＴ抗体は、ＴＮＴ関連抗原に独特の特定のＶＨ領域およびＶＬ領域配列、したがって、特定のＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原のための異なる結合部位）を有する抗体は異なるＣＤＲを有する。抗体毎に異なるのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接的に関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。
【0075】
本明細書で使用される場合、断片結晶性（Ｆｃ）領域は、一部の実施形態では、抗体の安定化に役立ち得、必要に応じて、免疫細胞もしくは血小板上のＦｃ受容体と相互作用（例えば、結合）する、または補体タンパク質と結合する、抗体の尾部領域を指す。一部の実施形態では、配列番号８１などのヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域の相当する位置のＦｃまたはその等価物にヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＮ２９７Ｑのうちの１つまたは２つまたは３つ全ての突然変異を含むものなどのＦｃ変異体を使用することができ、相当する位置は、配列番号８１のアミノ酸（ａａ）１６、ａａ１７およびａａ７９である。
【0076】
ポリペプチドまたはそのそれぞれの等価物には、カルボキシ末端にさらなる５０アミノ酸、あるいは約４０アミノ酸、あるいは約３０アミノ酸、あるいは約２０アミノ酸、あるいは約１０アミノ酸、あるいは約５アミノ酸、あるいは約４、または３、または２または１アミノ酸が続き得る。
【0077】
その等価物は、ＣＡＲ、またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドの相補体と高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、ここで、高ストリンジェンシーの条件は、インキュベーション温度、約５５℃～約６８℃；緩衝剤濃度、約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約５５％～約７５％；および洗浄溶液、約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水を含む。
【0078】
代替的な実施形態は、ＬＣ可変領域由来の１つまたは複数のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を他の抗体ＣＤＲ由来の適当なＣＤＲと共に含む。およびそのそれぞれの等価物。したがって、例として、ＬＣ可変領域由来のＣＤＲ１およびＣＤＲ２を別の抗体のＬＣ可変領域のＣＤＲ３と組み合わせることができ、一部の態様では、カルボキシ末端にさらなる５０アミノ酸、あるいは約４０アミノ酸、あるいは約３０アミノ酸、あるいは約２０アミノ酸、あるいは約１０アミノ酸、あるいは約５アミノ酸、あるいは約４、または３、または２または１アミノ酸を含み得る。別の態様では、ＥＧＦＲ ＣＡＲは、ＷＯ２０１６／１６４３７０に開示されているＣＡＲである。
【0079】
一態様では、抗体の「等価物」または「生物学的等価物」という用語は、ＥＬＩＳＡまたは他の適切な方法によって測定して、抗体がそのエピトープタンパク質またはその断片に選択的に結合することができることを意味する。生物学的に等価の抗体には、これだけに限定されないが、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、ペプチド、抗体断片、抗体バリアント、抗体誘導体および抗体模倣体が含まれる。
【0080】
本開示が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関する場合、その等価物または生物学的等価物は本開示の範囲内であることが意図されると、明示的な記載なしでおよび他に意図されなければ推測されるべきである。本明細書で使用される場合、「その生物学的等価物」という用語は、参照タンパク質、抗体、ポリペプチドまたは核酸に言及する場合に「その等価物」と同義であることが意図され、所望される構造または機能性を依然として維持しながら最小の相同性を有するものを意図する。特に本明細書に記載されなければ、本明細書において言及される任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質はまた、その等価物を含むことが企図される。例えば、等価物は、少なくとも約７０％の相同性または同一性、または少なくとも８０％の相同性または同一性、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは９８％のパーセント相同性または同一性が意図されたものであり、参照タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と実質的に等価の生物活性を示す。あるいは、ポリヌクレオチドに言及する場合、その等価物は、ストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【0081】
「抗体バリアント」という用語は、マウス以外の種において産生される抗体を含むことを意図する。それはまた、抗体または断片の直鎖状ポリペプチド配列に対する翻訳後修飾を含有する抗体を含む。それは、完全ヒト抗体をさらに包含する。
【0082】
「抗体誘導体」という用語は、上記に定義されているエピトープに結合し、本開示のネイティブなモノクローナル抗体の改変または誘導体である分子を包含することが意図される。誘導体は、例えば、二特異性、多特異性、ヘテロ特異性、三特異性、四特異性、多特異性抗体、ダイアボディ、キメラ、組換えおよびヒト化されたものを含むが、これらに限定されない。
【0083】
本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、抗体と抗原との間の、少なくとも１０－６Ｍの結合親和性での接触を意味する。ある特定の態様では、抗体は、少なくとも約１０－７Ｍ、および好ましくは１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、または１０－１２Ｍの親和性で結合する。
【0084】
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、特定の液性または細胞性免疫の生成物、例えば抗体分子またはＴ細胞受容体が特異的に結合し得る化合物、組成物、または物質を指す。抗原は、任意の種類の分子であり得、これは、例えば、ハプテン、単純な中間代謝物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質、およびホルモン、ならびに高分子、例えば複合炭水化物（例えば、多糖）、リン脂質、およびタンパク質を含む。抗原の一般的なカテゴリーは、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物および他の寄生生物抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギーおよびグラフト拒絶に関与する抗原、毒素、ならびに他の種々雑多な抗原を含むが、これらに限定されない。
【0085】
一部の実施形態では、結合部分、例えば抗体、その抗原結合性断片、またはＣＡＲの抗原は、「抗原」に続いて結合部分（例えばＢＣＭＡ ＣＡＲ）のフォーマット、または抗原の前の「抗」および抗原の後の結合部分（例えば抗ＢＣＭＡ抗体）を有するフォーマット、または結合部分に続いて「～に対する」もしくは「～に方向付けられた」および次に抗原（例えばＣＳ１に対する抗体）のフォーマットにおいて本明細書において提供され得る。
【0086】
本明細書で使用される場合、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、がん抗原、腫瘍抗原、がん関連抗原、および腫瘍関連抗原という用語は、本明細書において交換可能に使用され、がんまたは腫瘍細胞の抗原物質を指す。一部の実施形態では、ＴＡＡは、一部の腫瘍またはがん細胞上に存在し、そしてまた、必要に応じてより低いレベルで、一部の正常細胞上に存在する。一部の実施形態では、ＴＡＡは、腫瘍またはがん細胞上にのみ存在し、正常細胞上に存在しない。一部の実施形態では、ＴＡＡは、Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９）、ＥＧＦＲ、野生型上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲｗｔ）、上皮細胞増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、ＦＬＴ３、ＣＤ７０、メソテリン、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１３３、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣＬ１）、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、ＣＤ５、インターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ１３Ｒａ２）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、腫瘍関連糖タンパク質－７２（ＴＡＧ－７２）、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）、がん／精巣（ＣＴ）、ＣＤ３３、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、上皮細胞接着分子前駆体（ＥｐＣａｍまたはＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－１１Ｒα、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＳＳ２１、血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ムチン１（Ｍｕｃ１）、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、エフリンタイプＡ受容体２前駆体（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、タイ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サービビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ＦＣＲＬ５、またはＩＧＬＬ１から選択される。
【0087】
本明細書で使用される場合、ウイルス抗原とは、ウイルスにおいて発現される、および／またはウイルスゲノムによってコードされる抗原を指す。非限定的な例としては、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ならびにＣＯＶＩＤ－１９のスパイクタンパク質、Ｓ１、Ｓ２、ヌクレオカプシドエンベロープタンパク質が挙げられる。
【0088】
本明細書で使用される場合、「抗原結合性ドメイン」という用語は、抗原標的に特異的に結合することができる任意のタンパク質またはポリペプチドドメインを指す。
【0089】
本明細書で使用される場合、細胞に関する「自家」という用語は、単離され、同じ対象（レシピエントまたは宿主）に再び注入される細胞を指す。「同種異系」は非自家細胞を指す。
【0090】
「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に結合する能力を有する細胞外ドメイン、細胞外ドメインが由来するポリペプチドとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合したタンパク質を指す。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、「キメラ受容体」、「Ｔボディ」、または「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれることがある。「抗原に結合する能力を有する細胞外ドメイン」は、ある特定の抗原に結合することができる任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。「細胞内ドメイン」または「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、シグナルを伝達して細胞において生物学的プロセスの活性化または阻害を引き起こすドメインとして機能することが公知の任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。ある特定の実施形態では、細胞内ドメインは、一次シグナル伝達ドメインに加えて１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含むか、あるいはから本質的になるか、またはさらには含んでもよい。「膜貫通ドメイン」は、細胞膜を貫通することが公知であり、細胞外およびシグナル伝達ドメインを連結するように機能することができる任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のリンカーとして役立つ「ヒンジドメイン」を必要に応じて含んでもよい。そのようなドメインの非限定的な例は本明細書に提示され、例えば、ヒンジドメイン：ＩｇＧ１重鎖ヒンジコード配列：配列番号１１２である。さらなる非限定的な例としては、当技術分野で公知のＩｇＧ４ヒンジ領域、ＩｇＤおよびＣＤ８ドメインが挙げられる。さらなる例示される配列は配列表に提示され、例えば、膜貫通ドメイン：ＣＤ２８膜貫通領域コード配列：配列番号１１３；細胞内ドメイン：４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域コード配列：配列番号１１４；細胞内ドメイン：ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域コード配列：配列番号１１５；および細胞内ドメイン：ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域コード配列：配列番号１１６などである。
【0091】
各例示的なドメイン成分のさらなる実施形態は、上に開示された核酸配列によってコードされるタンパク質と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他のタンパク質を含む。さらに、そのようなドメインの非限定的な例は本明細書に提示される。
【0092】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ８αヒンジドメイン」という用語は、この名称に関連付けられる特定のタンパク質断片、および本明細書で示されるＣＤ８αヒンジドメイン配列と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ヒト、マウス、および他の種のＣＤ８αヒンジドメインの配列の例はPinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110: 169-177に提示されている。ＣＤ８ αヒンジドメインに関連付けられる配列は、Pinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110: 169-177に提示されている。そのような配列の非限定的な例としては、ヒトＣＤ８アルファヒンジドメイン：配列番号１１７；マウスＣＤ８アルファヒンジドメイン：配列番号１１８；およびネコＣＤ８アルファヒンジドメイン：配列番号１１９が挙げられる。
【0093】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ８α膜貫通ドメイン」という用語は、この名称に関連付けられる特定のタンパク質断片、および本明細書で示されるＣＤ８α膜貫通ドメイン配列と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ヒトＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００１７５９．３）のアミノ酸位１８３～２０３、またはマウスＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００１０７４５７９．１）のアミノ酸位１９７～２１７、およびラットＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿１１３７２６．１）のアミノ酸位１９０～２１０に関連付けられる断片配列により、ＣＤ８α膜貫通ドメインの配列のさらなる例が提供される。列挙された受託番号のそれぞれに関連付けられる配列は以下の通り提示される：ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：配列番号１２０；マウスＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：配列番号１２１；およびラットＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：配列番号１２２。
【0094】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８膜貫通ドメイン」という用語は、この名称に関連付けられる特定のタンパク質断片、および本明細書で示されるＣＤ２８膜貫通ドメイン配列と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＭ＿００６７１２８６２．２およびＸＭ＿００９４４４０５６．１に関連付けられる断片配列により、ＣＤ２８膜貫通ドメインのさらなる非限定的な配列の例が提供される。列挙された受託番号のそれぞれに関連付けられる配列は本明細書に提示される。
【0095】
本明細書で使用される場合、「４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域」という用語は、この名称に関連付けられる特定のタンパク質断片、および本明細書で示される４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域の非限定的な配列の例は、例えば、以下に提示される例示的な配列：４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域：配列番号１２３など、米国特許出願公開第２０１３０２６６５５１Ａ１号に提示されている。
【0096】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域」という用語は、この名称に関連付けられる特定のタンパク質断片、および本明細書で示されるＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインの配列の例は、米国特許第５，６８６，２８１号；Geiger, T.L. et al., Blood 98: 2364-2371 (2001)；Hombach, A. et al., J Immunol 167: 6123-6131 (2001)；Maher, J. et al. Nat Biotechnol 20: 70-75 (2002)；Haynes, N.M. et al., J Immunol 169: 5780-5786 (2002)；Haynes, N.M. et al., Blood 100: 3155-3163 (2002)に提示されている。非限定的な例としては、以下のＣＤ２８配列：配列番号１２４の残基１１４～２２０、およびその等価物が挙げられる。
【0097】
本明細書で使用される場合、「ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域」という用語は、この名称に関連付けられる特定のタンパク質断片、および本明細書で示されるＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域の非限定的な配列の例は、米国特許出願公開第２０１５／００１７１４１Ａ１号に提示されている。以下に提示される例示的なポリヌクレオチド配列：ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域コード配列：配列番号１２５。
【0098】
本明細書で使用される場合、「ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域」という用語は、この名称に関連付けられる特定のタンパク質断片、および本明細書で示されるＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域の非限定的な配列の例は、米国特許出願公開第２０１２／２０１４８５５２Ａ１号に開示されており、以下に提示される例示的な配列：ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域コード配列：配列番号１２６、およびその等価物が含まれる。
【0099】
ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、および／またはＴＬＲのものなどの他の共刺激シグナル伝達領域を使用することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１６０３４０４０６Ａ１号における開示を参照されたい。
【0100】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン」という用語は、この名称に関連付けられる特定のタンパク質断片、および本明細書で示されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン配列と少なくとも７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの非限定的な配列の例は、米国特許出願公開第２０１３０２６６５５１Ａ１号に提示されており、例えば、配列番号３である。
【0101】
シグナルペプチドは、本明細書で使用される場合、分泌経路に入ることが運命付けられている、大多数の新たに合成されたタンパク質のＮ末端に存在する短いペプチド（通常１６～３０アミノ酸長）を指す（時には、シグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、輸送ペプチド、リーダー配列またはリーダーペプチドと称される）。一実施形態では、シグナルペプチドは、分泌シグナルである。
【0102】
分泌シグナルは、サイトゾルから分泌経路へのタンパク質のエクスポートを可能とする分泌シグナルペプチドを意図する。タンパク質は、差次的なレベルの成功裏の分泌を示すことができ、多くの場合に、ある特定のシグナルペプチドは、特定のタンパク質とパートナーとなった場合により低いまたはより高いレベルを引き起こすことができる。真核生物において、シグナルペプチドは、真核細胞のサイトゾル中のシグナル認識粒子（ＳＲＰ）により認識されるアミノ酸の疎水性ストリングである。シグナルペプチドがｍＲＮＡ－リボソーム複合体から産生された後に、ＳＲＰはペプチドに結合し、タンパク質翻訳を停止させる。ＳＲＰは次に、ｍＲＮＡ／リボソーム複合体を粗面小胞体に輸送し、タンパク質が小胞体の内腔中に翻訳される。シグナルペプチドは次にタンパク質から切断されて、小胞体中で可溶性の、または膜にタグ付加された（膜貫通領域もまた存在する場合）、タンパク質が産生される。これらは当技術分野において公知であり、ベンダー、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓから市販されている。
【0103】
本明細書で使用される場合、切断可能なリンカーとも称される切断可能なペプチドは、例えば酵素により、切断され得るペプチドを意味する。そのような切断可能なペプチドを含む１つの翻訳されたポリペプチドは、２つの最終生成物を産生することができ、したがって、１つのオープンリーディングフレームから１つより多くのポリペプチドを発現することが可能となる。切断可能なペプチドの１つの例は、自己切断性ペプチド、例えば２Ａ自己切断性ペプチドである。２Ａ自己切断性ペプチドは、１８～２２ａａの長さのペプチドのクラスであり、細胞中で組換えタンパク質の切断を誘導することができる。一部の実
施形態では、２Ａ自己切断性ペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２ＡおよびＢｍＣＰＶ２Ａから選択される。例えば、Wang Y, et al. 2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori. Sci Rep. 2015;5:16273. Published Nov 5，2015を参照されたい。
施形態では、２Ａ自己切断性ペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２ＡおよびＢｍＣＰＶ２Ａから選択される。例えば、Wang Y, et al. 2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori. Sci Rep. 2015;5:16273. Published Nov 5，2015を参照されたい。
【0104】
本明細書で使用される場合、「Ｔ２Ａ」および「２Ａペプチド」という用語は、交換可能に使用され、任意の２Ａペプチドもしくはその断片、任意の２Ａ様ペプチドもしくはその断片、またはコンセンサスポリペプチドモチーフＤ－Ｖ／Ｉ－Ｅ－Ｘ－Ｎ－Ｐ－Ｇ－Ｐ（配列番号１７７）（Ｘは、自己切断性であると一般に考えられる任意のアミノ酸を指す）を含有する相対的に短いペプチド配列（起源のウイルスに依存して２０アミノ酸ほどの長さ）中に必要なアミノ酸を含む人工ペプチドを指す。
【0105】
「検出可能な標識」、「標識」、「検出可能マーカー」または「マーカー」は、交換可能に使用され、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含むタンパク質を含むが、これらに限定されない。検出可能な標識はまた、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体または組成物に取り付けられ得る。
【0106】
本明細書で使用される場合、「標識」または検出可能な標識という用語は、検出されるべき組成物に直接的または間接的にコンジュゲートされる直接的または間接的に検出可能な化合物または組成物、例えば、Ｎ末端ヒスチジンタグ（Ｎ－Ｈｉｓ）、磁気活性同位体、例えば、１１５Ｓｎ、１１７Ｓｎおよび１１９Ｓｎ、非放射活性同位体、例えば１３Ｃおよび１５Ｎ、ポリヌクレオチドまたはタンパク質、例えば抗体であって、「標識された」組成物を生成するようなものを意図する。用語はまた、挿入された配列の発現でシグナルを提供するポリヌクレオチドにコンジュゲートされる配列、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などを含む。標識は、それ自体が検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識）、または、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学的な変更を触媒してもよい。標識は、小スケール検出のために好適であり得るか、またはハイスループットスクリーニングのためにより好適であり得る。そのため、好適な標識は、磁気活性同位体、非放射活性同位体、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含むタンパク質を含むが、これらに限定されない。標識は単純に検出されてもよく、または定量化されてもよい。単純に検出される応答は、その存在が単に確認される応答を一般に含む一方、定量化される応答は、定量化可能な（例えば、数値的に報告可能な）値、例えば強度、極性化、および／または他の特性を有する応答を一般に含む。発光または蛍光アッセイにおいて、検出可能な応答は、結合に実際に関与するアッセイ成分と会合した発光団もしくはフルオロフォアを使用して直接的に、または別の（例えば、レポーターもしくはインジケーター）成分と会合した発光団もしくはフルオロフォアを使用して間接的に生成されてもよい。シグナルを生成する発光標識の例は、生物発光および化学発光を含むが、これらに限定されない。検出可能な発光応答は、発光シグナルにおける変化、またはその発生を一般に含む。アッセイ成分を発光的に標識するための好適な方法および発光団は当技術分野において公知であり、例えばHaugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed)において記載されている。発光プローブの例は、エクオリンおよびルシフェラーゼを含むが、これらに限定されない。
【0107】
本明細書で使用される場合、「イムノコンジュゲート」という用語は、第２の薬剤、例えば細胞傷害剤、検出可能な薬剤、放射活性剤、標的化剤、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、半合成抗体、または多特異性抗体と会合または連結された抗体または抗体誘導体を含む。
【0108】
好適な蛍光標識の例は、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル－クマリン、ピレン、Ｍａｌａｃｉｔｅ ｇｒｅｅｎ、スチルベン、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標）、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄを含むが、これらに限定されない。他の好適な光学色素は、Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research
Chemicals (6th ed.)において記載されている。
Chemicals (6th ed.)において記載されている。
【0109】
別の態様では、蛍光標識は、細胞または組織の中またはその表面上に存在する細胞成分、例えば細胞表面マーカーへの共有結合性取付けを促すために官能化される。好適な官能基は、イソチオシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステル、およびハロゲン化スルホニルを含むが、これらに限定されず、これらの全ては、蛍光標識を第２の分子に取り付けるために使用され得る。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、薬剤、マーカー、または第２の標識化剤のいずれかへの取付けの部位に依存する。
【0110】
本明細書で使用される場合、精製標識またはマーカーは、標識がコンジュゲートされた分子または成分の精製において使用され得る標識を指し、例えばエピトープタグ（Ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグを含むがこれらに限定されない）、親和性タグ（グルタチオン－Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を含むがこれらに限定されない）、または蛍光タグである。
【0111】
本明細書で使用される場合、ＣＤ１２２／ＣＤ１３２シグナル伝達を媒介する細胞表面マーカーは、免疫細胞などの細胞上に発現され、ＣＤ１２２シグナル伝達経路および／またはＣＤ１３２シグナル伝達経路などのＩＬ２経路を活性化することが可能なタンパク質またはポリペプチドまたは別の部分を指す。ＣＤ１２２はインターロイキン２受容体サブユニットベータとしても公知であり、ＣＤ１３２はインターロイキン２受容体サブユニットガンマとしても公知である。インターロイキン２受容体は、Ｔ細胞性免疫応答に関与し、インターロイキン２に結合する能力に関して３つの形態で存在する。親和性が低い形態は、アルファサブユニットの単量体であり（ＣＤ２５とも称される）、シグナルトランスダクションには関与しない。親和性が中間である形態はガンマ／ベータサブユニットヘテロ二量体からなり、一方、親和性が高い形態はアルファ／ベータ／ガンマサブユニットヘテロ三量体からなる。この受容体の親和性が中間である形態と親和性が高い形態はどちらも、受容体媒介性エンドサイトーシスおよびインターロイキン２からの分裂促進シグナルのトランスダクションに関与する。これらのタンパク質はまた、ＩＬ－１５受容体の３つのサブユニットのうちの１つを形成し、同時に、ＣＤ１３２は、他のリガンド特異的受容体とパートナーを組んで、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、およびＩＬ２１を含めたサイトカインに応答するようにリンパ球を方向付ける。受容体が活性化されると、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の増殖が増大する。例えば、Noguch et al. Science. 262 (5141): 1877-80を参照されたい。したがって、ＣＤ１２２／ＣＤ１３２シグナル伝達を媒介する細胞表面マーカーの非限定的な例としては、ＩＬ２受容体、ＩＬ４受容体、ＩＬ７受容体、ＩＬ９受容体、ＩＬ１５受容体、ＩＬ２１受容体、膜結合ＩＬ２、膜結合ＩＬ４、膜結合ＩＬ７、膜結合ＩＬ９、膜結合ＩＬ１５、または膜結合ＩＬ２１が挙げられる。ＣＤ１２２、ＣＤ１３２、ＩＬ２受容体、ＩＬ４受容体、ＩＬ７受容体、ＩＬ９受容体、ＩＬ１５受容体、またはＩＬ２１受容体の任意の膜貫通ドメインおよび細胞質基質ドメインと融合した任意の細胞外ドメインなどの他の組換えタンパク質を使用することができる。
【0112】
本明細書で使用される場合、インターロイキン（ＩＬ）とは、最初、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））によって発現されることが分かったサイトカインを指す。免疫系の機能は、大部分がインターロイキンに依存する。大多数のインターロイキンは、ヘルパーＣＤ４Ｔリンパ球によって、ならびに単球、マクロファージ、および内皮細胞を通じて合成される。これらはＴリンパ球およびＢリンパ球、ならびに造血細胞の発生および分化を促進する。本明細書で使用される場合、インターロイキンは、細胞から分泌される可溶性サイトカイン、および／または細胞表面上に発現される膜結合（ｍｂ）サイトカインであり得る。サイトカインの可溶性形態と膜結合形態は、例えば、サイトカインの膜貫通ドメインおよび／またはシグナルペプチドを操作することなど、当業者が変換することができる。
【0113】
インターロイキン２（ＩＬ－２）は、インターロイキンであり、免疫系におけるサイトカインシグナル伝達分子の１つの型である。ＩＬ－２は、免疫に関与する白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）、多くの場合、リンパ球）の活性を制御する１５．５～１６ｋＤａのタンパク質である。一部の実施形態では、ＩＬ－２は、ヒトＩＬ－２である。一部の実施形態では、ＩＬ－２は、ＸＰ＿５１７４２５．１のＮＣＢＩ参照配列を有するチンパンジーＩＬ－２などの他の種のものである。このタンパク質または基礎をなす遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ０４Ｍ１２２４５１、ＨＧＮＣ（６００１）、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ（３５５８）、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ＥＮＳＧ０００００１０９４７１）、ＯＭＩＭ（登録商標）（１４７６８０）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ（Ｐ６０５６８）、およびＯｐｅｎ Ｔａｒｇｅｔｓ ａｔｆｏｒｍ（ＥＮＳＧ０００００１０９４７１）の下に見いだすことができ、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0114】
したがって、一部の実施形態では、ＩＬ－２は、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１７８）を含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、ＩＬ－２は、配列番号１７８のアミノ酸（ａａ）２１～ａａ１５３を含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
【0115】
一部の実施形態では、ＩＬ－２は、本明細書で使用される場合、野生型ＩＬ－２またはその等価物である。一部の実施形態では、ＩＬ－２は、本明細書で使用される場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏで宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、またはＣＨＯ細胞、またはＥ．ｃｏｌｉ、またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなど）によって産生された組換えＩＬ－２である。例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈによって販売されているヒトＩＬ－２（ＳＲＰ３０８５、ＳＲＰ６１７０、Ｉ７９０８、Ｉ２６４４、Ｈ７０４１、またはＩ１７００２）、およびＳＴＥＭＣＥＬＬ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって販売されているヒトＩＬ－２（７８０３６）を参照されたい。さらなる実施形態では、ＩＬ－２等価物は、野生型ＩＬ－２と著しく同様にＮＫ細胞の増殖を刺激する、またはＮＫ細胞の細胞傷害機能を活性化する、またはその両方である。ＮＫ細胞の増殖および細胞傷害機能を評価するためのアッセイ、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ培養および細胞計数（例えば、Choi et al. J Immunother Cancer. 2019 Jul 5; 7 (1): 168を参照されたい）、５１クロム放出アッセイ（例えば、Dong et al. Cancer Discov. 2019 Oct; 9 (10): 1422-1437. doi: 10.1158/2159-8290.CD-18-1259. Epub 2019 Jul 24を参照されたい）、比色定量測定に基づく細胞傷害アッセイ（例えば、Chava et al. J Vis Exp. 2020 Feb 22; (156): 10.3791/60714を参照されたい）、またはフローサイトメトリーに基づく細胞傷害アッセイ（例えば、Kim et al. Front Immunol. 2020 Aug 14; 11: 1851を参照されたい）などが当業者には利用可能である。一部の実施形態では、ＩＬ－２等価物は、野生型ＩＬ－２の断片、例えば、配列番号１７９のａａ２２～ａａ１５３などを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。それに加えてまたはその代わりに、ＩＬ－２等価物は、例えば、Ｎ末端に追加のメチオニンが付加されている、または１つもしくは複数の以下の突然変異：必要に応じてメチオニンに突然変異した、配列番号１７８のａａ３８の位置にあるアミノ酸残基、必要に応じてセリンに突然変異した、配列番号１７８のａａ３９の位置にあるアミノ酸残基、必要に応じてアラニンもしくはリシンに突然変異した、配列番号１７８のａａ５８の位置にあるアミノ酸残基、必要に応じてリシンもしくはイソロイシンもしくはアラニンもしくはグルタミンに突然変異した、配列番号１７８のａａ６２の位置にあるアミノ酸残基、必要に応じてアスパラギンもしくはグルタミン酸もしくはアラニンもしくはアルギニンに突然変異した、配列番号１７８のａａ６５の位置にあるアミノ酸残基、必要に応じてロイシンもしくはアラニンに突然変異した、配列番号１７８のａａ８２の位置にあるアミノ酸残基、必要に応じてバリンに突然変異した、配列番号１７８のａａ８８の位置にあるアミノ酸残基、必要に応じてセリンもしくはアラニンに突然変異した、配列番号１７８のａａ１４５の位置にあるアミノ酸残基、もしくはこれらの任意の組合せを有する、野生型ＩＬ－２のバリアントまたはその断片を含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。非限定的な例としては、ＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１７９）からなるアルデスロイキン（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、ＭＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１８０）からなるテセロイキン（Ｔｅｃｅｌｅｕｋｉｎ）、ネオロイキン（Ｎｅｏｌｅｕｋｉｎ）２／１５（例えば、Silva et al. Nature. 2019 Jan; 565 (7738): 186-191を参照されたい）、ならびにＵＳ９２０６２４３Ｂ２またはＵＳ８０１２４６５Ｂ２に開示されているものが挙げられる。それに加えてまたはその代わりに、ＩＬ－２等価物は、グリコシル化、アセチル化、またはリン酸化によって修飾されたものなどのＩＬ－２誘導体を含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
【0116】
インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）は、インターロイキン２（ＩＬ－２）と構造的に類似したサイトカインである。ＩＬ－２と同様に、ＩＬ－１５は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５受容体ベータ鎖（ＣＤ１２２）および共通ガンマ鎖（ガンマ－Ｃ、ＣＤ１３２）で構成される複合体に結合し、それを通じてシグナルを伝達する。ＩＬ－１５は、ウイルスによる感染後に単核食細胞（およびいくつかの他の細胞）によって分泌される。このサイトカインは、ナチュラルキラー細胞の増殖を誘導する。一部の実施形態では、ＩＬ－１５は、ヒトＩＬ－１５である。このタンパク質または基礎をなす遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ０４Ｐ１４１６３６、ＨＧＮＣ：５９７７、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：３６００、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６４１３６、ＯＭＩＭ（登録商標）：６００５５４、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ４０９３３の下に見いだすことができ、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＩＬ－１５は、ヒトＩＬ－１５アイソフォーム１である。したがって、一部の実施形態では、ＩＬ－１５は、ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡＧＩＨＶＦＩＬＧＣＦＳＡＧＬＰＫＴＥＡＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ（配列番号１８１）を含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、ＩＬ－１５は、配列番号１８１のアミノ酸（ａａ）３０～ａａ１６２を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ＩＬ－１５は、ヒトＩＬ－１５アイソフォーム２である。したがって、一部の実施形態では、ＩＬ－１５は、ＭＶＬＧＴＩＤＬＣＳＣＦＳＡＧＬＰＫＴＥＡＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ（配列番号１８２）を含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、ＩＬ－１５は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ参照ＩＤ Ｐ４８０９２を有するアカゲザルＩＬ－１５などの、他の種のものである。
【0117】
一部の実施形態では、ＩＬ－１５は、本明細書で使用される場合、野生型ＩＬ－１５またはその等価物である。一部の実施形態では、ＩＬ－１５は、本明細書で使用される場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏで宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、またはＥ．ｃｏｌｉなど）によって産生された組換えＩＬ－１５である。例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈによって販売されているヒトＩＬ－１５（ＳＲＰ６２９３、またはＳＲＰ３０７７）、およびＳＴＥＭＣＥＬＬ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって販売されているヒトＩＬ－１５（７８０３１）を参照されたい。さらなる実施形態では、ＩＬ－１５等価物は、野生型ＩＬ－１５と著しく同様にＮＫ細胞の増殖を刺激する、またはＮＫ細胞の細胞傷害機能を活性化する、またはその両方である。ＮＫ細胞の増殖および細胞傷害機能を評価するためのアッセイが当業者には利用可能であり、本明細書に記載されている。ＩＬ－１５等価物の非限定的な例としては、ＵＳ２０１９０２６３８７７Ａ１、ＵＳ１０４５０３５９Ｂ２、およびＵＳ１０５３７６１５Ｂ２に開示されているものが挙げられる。それに加えてまたはその代わりに、ＩＬ－１５等価物は、グリコシル化、アセチル化、またはリン酸化によって修飾されたものなどのＩＬ－１５誘導体を含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
【0118】
インターロイキン２１（ＩＬ－２１）は、本明細書ではＩＬ－２１ポリペプチドとも称され、ウイルスに感染した細胞またはがん性細胞を破壊し得るナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を含めた免疫系の細胞に対する強力な制御効果を有するサイトカインである。このサイトカインは、その標的細胞における細胞分裂／増殖を誘導する。一部の実施形態では、ＩＬ－２１は、ヒトＩＬ－２１である。このタンパク質または基礎をなす遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ０４Ｍ１２２６１２、ＨＧＮＣ：６００５、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：５９０６７、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１３８６８４、ＯＭＩＭ（登録商標）：６０５３８４、およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ９ＨＢＥ４の下に見いだすことができ、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0119】
さらなる実施形態では、ＩＬ－２１等価物は、野生型ＩＬ－２１と著しく同様に免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞など）の増殖を刺激する、または生存率を持続させる、またはその両方である。細胞増殖および生存率を評価するためのアッセイ、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ培養および細胞計数、または生／死細胞染色（例えば、生存細胞についてのテトラゾリウム還元アッセイ、レサズリン還元アッセイ、プロテアーゼ生存率マーカーアッセイ、ＡＴＰアッセイ、またはリアルタイムアッセイ）などが当業者には利用可能である。例えば、Choi et al. J Immunother Cancer. 2019 Jul 5; 7 (1): 168、およびRiss et al. Cell Viability Assays. 2013 May 1. In: Markossian et al., editors. Assay Guidance Manual. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences; 2004-（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ１４４０６５／、２０２１年５月１４日からアクセス可能）を参照されたい。
【0120】
ＣＤ１２２は、インターロイキン２の受容体であり、インターロイキン２受容体サブユニットベータとも称される。このベータサブユニットは、受容体媒介性エンドサイトーシスに関与し、ＩＬ２の分裂促進シグナルをトランスダクションする。ＣＤ１２２はたいていＩＬ１５ＲＡと関連して、ＩＬ１５による好中球ファゴサイトーシスの刺激に関与する。このタンパク質または基礎をなす遺伝子またはこのタンパク質を検出するために適した抗体の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ２２Ｍ０３７１２５、ＨＧＮＣ：６００９、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：３５６０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１００３８５、ＯＭＩＭ（登録商標）：１４６７１０、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ１４７８４の下に見いだすことができ、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0121】
本明細書で使用される場合、参照配列中の同定された位置に「相当する」目的の配列中のアミノ酸（ａａ）またはヌクレオチド（ｎｔ）残基位置は、残基位置が、目的の配列と参照配列との間の配列アライメントにおいて同定された位置にアライメントされることを指す。そのような配列アライメントを行うためのＣｌｕｓｔａｌ ＯｍｅｇａおよびＢＬＡＳＴなどの様々なプログラムが利用可能である。
【0122】
一部の実施形態では、「ベクター」という用語は、分裂していない細胞および／または緩徐に分裂している細胞に感染し、それに形質導入し、標的細胞のゲノムに組み込まれる能力を保持する組換えベクターを意図するものである。
【0123】
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡと分離された染色体外のＤＮＡ分子であり、染色体ＤＮＡとは独立に複製することができる。これは多くの場合に環状で二本鎖である。プラスミドは微生物の集団の中で遺伝子の水平移動の機構を提供し、典型的には所与の環境状況の下で選択的な利点を提供する。プラスミドは、競合的な環境ニッチの中で天然に存在する抗生剤への耐性を提供する遺伝子を運搬するか、あるいは産生するタンパク質が同様の状況の下で毒素として作用することがある。多くのプラスミドがそのような用途のために市販で入手できる。複製すべき遺伝子は、特定の抗生剤に対して細胞を耐性にする遺伝子および多重クローニング部位（ＭＣＳ、またはポリリンカー）を含むプラスミドのコピーに挿入される。ＭＣＳは、一般に使用されるいくつかの制限部位を含む短い領域であり、この位置におけるＤＮＡ断片の挿入を容易にする。プラスミドの別の主要な使用は、大量のタンパク質の作製である。この場合には、研究者は目的の遺伝子を含むプラスミドを含む細菌を増殖させる。細菌がその抗生剤耐性を付与するタンパク質を産生するのと同時に、挿入された遺伝子から大量のタンパク質を産生するように細菌を誘起することもできる。これは、遺伝子またはこれがコードするタンパク質を大量生産する安価で容易な方法である。
【0124】
「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで宿主細胞中に送達すべきポリヌクレオチドを含む、組換え産生されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。当業者には知られているように、ウイルスには６つのクラスがある。ＤＮＡウイルスはクラスＩおよびＩＩからなっている。ＲＮＡウイルスおよびレトロウイルスが残りのクラスを構成する。クラスＩＩＩのウイルスは二本鎖ＲＮＡゲノムを有している。クラスＩＶのウイルスはポジティブな一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、ゲノムそれ自体はｍＲＮＡとして作用する。クラスＶウイルスはｍＲＮＡ合成の鋳型として使用されるネガティブな一本鎖ＲＮＡゲノムを有している。クラスＶＩウイルスはポジティブな一本鎖ＲＮＡゲノムを有しているが、複製のみでなくｍＲＮＡ合成においてもＤＮＡ中間体を有している。レトロウイルスはその遺伝情報をＲＮＡの形で運搬するが、ウイルスが細胞に感染すれば、ＲＮＡはＤＮＡ形態に逆転写され、ＤＮＡが感染細胞のゲノムＤＮＡの中に一体化される。一体化されたＤＮＡ形態はプロウイルスと称される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター等が含まれる。アルファウイルスベクター、例えばセミリキフォレストウイルス系ベクターおよびシンドビスウイルス系ベクターも、遺伝子療法および免疫療法における使用のために開発されてきた。Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 およびYing, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827を参照されたい。
【0125】
いくつかの実施形態では、ベクターは野生型ウイルスから誘導されるか、これに基づいている。さらなる実施形態では、ベクターは野生型のアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレトロウイルス、例えばガンマレトロウイルスもしくはレンチウイルスから誘導されるか、これらに基づいている。レトロウイルスの例には、制限なくモロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ネズミ幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、またはフレンドネズミ胚幹細胞ウイルス（ＦＭＥＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が含まれる。ウイルスベクターは２つまたはそれより多い異なるウイルスから誘導された成分を含んでよく、合成成分を含んでもよい。ベクター成分は、標的細胞特異性等の所望の特性を得るために操作することができる。
【0126】
本開示の組換えベクターは、霊長類および非霊長類から誘導してよい。霊長類レンチウイルスの例には、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。非霊長類レンチウイルスの群には、プロトタイプ「スローウイルス」ｖｉｓｎａ／ｍａｅｄｉウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連するヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）および最近記載されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。先行技術の組換えレンチウイルスベクターは当技術で公知であり、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９２４，１２３号、第７，０５６，６９９号、第７，４１９，８２９号、および第７，４４２，５５１号を参照されたい。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは自己不活化レンチウイルスベクターである。さらなる実施形態では、レンチウイルスベクターはＴＡＴＡボックスを欠くＵ３領域を有している。さらにまたはその代わりに、レンチウイルスベクターは転写因子結合部位の１つまたは複数を欠くＵ３領域を有している。
【0127】
ガンマレトロウイルスおよび／またはレンチウイルス等のレトロウイルスは、（ａ）脂質および糖タンパク質を含むエンベロープ、（ｂ）標的細胞に送達されるＲＮＡ（通常、ＬＴＲに隣接する、５’末端にキャップおよび３’末端にポリＡテイルを含むダイマーＲＮＡ）であるベクターゲノム、（ｃ）カプシド、および（ｄ）プロテアーゼ等のタンパク質を含む。米国特許第６，９２４，１２３号は、ある種のレトロウイルス配列が標的細胞ゲノムへの一体化を容易にしていることを開示している。この特許は、それぞれのレトロウイルスゲノムが、ビリオンタンパク質および酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖと称される遺伝子を含んでいることを教示している。これらの遺伝子は両端において長いターミナルリピート（ＬＴＲ）と称される領域に隣接している。ＬＴＲはプロウイルスの一体化および転写に関与している。これらは、エンハンサー－プロモーター配列としても働く。換言すれば、ＬＴＲはウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レトロウイルスＲＮＡのカプシド化は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列によって生じる。ＬＴＲそれ自体は、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と称される３つのエレメントに分割できる同一の配列である。Ｕ３はＲＮＡの３’末端に特有の配列から誘導される。ＲはＲＮＡの両末端において繰り返される配列から誘導され、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に特有の配列から誘導される。３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルスの間でかなり変動することがある。ウイルスゲノムについては、ポリ（Ａ）付加（終止）の部位は、右手側ＬＴＲのＲとＵ５の境界にある。Ｕ３はプロウイルスの転写制御エレメントの大部分を含み、細胞の、またある場合にはウイルスの、転写アクチベータータンパク質に関与するプロモーターおよび多重エンハンサー配列を含む。
【0128】
構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖそれ自体に関しては、ｇａｇはウイルスの内部構造タンパク質をコードする。ｇａｇタンパク質はタンパク質分解によって成熟タンパク質ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（カプシド）、およびＮＣ（ヌクレオカプシド）に処理される。ｐｏｌ遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼ、付随するＲＮアーゼＨ、およびインテグラーゼ（ＩＮ）を含む逆転写酵素（ＲＴ）をコードし、これらがゲノムの複製を媒介する。一部の実施形態では、これらの構造遺伝子のうちの１つまたは複数は、ベクターゲノム自体ではなく、ウイルスベクターを産生するパッケージング細胞（本明細書では宿主細胞とも称される）によって提供される。
【0129】
ウイルスベクター粒子の産生のため、ベクターＲＮＡゲノムが、宿主細胞中で、それをコードするＤＮＡ構築物から発現される。ベクターゲノムによってコードされない粒子の成分は、宿主細胞中で発現される追加の核酸配列（通常、ｇａｇ／ｐｏｌの一方または両方、およびｅｎｖ遺伝子を含む「パッケージングシステム」）によってトランスで提供される。ウイルスベクター粒子の産生に必要な配列の組は、過渡的なトランスフェクションによって宿主細胞に導入されるか、宿主細胞ゲノムに一体化されるか、または様々な方法の組合せで提供されてよい。関連する手法は、当業者には公知である。
【0130】
ガンマレトロウイルスは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科の属であり、本開示において使用することができる。種の例は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、フレンドマウス胚性幹細胞ウイルス（ＦＭＥＶ）、異種指向性ＭｕＬＢ関連ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）およびネコ白血病ウイルスである。ガンマレトロウイルスは、直径８０ｎｍから１００ｎｍにわたる球状のエンベロープを有するビリオンである。ガンマレトロウイルスは、ヌクレオカプシド、逆転写酵素、インテグラーゼ、カプシド、プロテアーゼ、エンベロープおよび表面単位を含有する。ヌクレオカプシドは、ウイルス粒子内の核酸タンパク質アセンブリであり、ビリオンの下部構造である。逆転写酵素は、ビリオン複製サイクルの間のＲＮＡからＤＮＡへの転換に関与する酵素である。インテグラーゼは、逆転写酵素と共に機能してＲＮＡをＤＮＡに変換する。ガンマレトロウイルスのゲノムは、サイズがおよそ８．３ｋｂの一本鎖ＲＮＡ（＋）ゲノムである。ガンマレトロウイルスのゲノムは、５’キャップと３’ポリＡ尾部を有し、２つの、５’末端および３’末端の両方における長いターミナルリピーター領域を含有する。これらの長いターミナルリピート領域は、Ｕ５領域、Ｒ領域、およびＵ３領域、ならびに３’末端におけるポリプリントラクトおよび５’末端におけるプライマー結合性部位を有する。典型的なガンマレトロウイルスゲノムは、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含有し、これらは全て、遺伝子療法ベクターでは省くことができる。カプシドは、ウイルス粒子のゲノムを取り囲むタンパク質の殻であり、その主要な機能は、ゲノムを保護することおよび宿主細胞に送達することである。ウイルスエンベロープは、ウイルスカプシドを取り囲む膜であり、宿主細胞に由来する脂質二重層である。遺伝子療法のための潜在的なベクターとして、ガンマレトロウイルスには、レンチウイルスベクターとしてのＨＩＶに勝るいくつかの利点がある。具体的には、ガンマレトロウイルスパッケージングシステムでは、ｇａｇ、ｐｏｌ、またはアクセサリー遺伝子のコード配列とオーバラップするいかなる配列も組み入れる必要がない。例えば、Tobias Maetzig et al. Viruses. 2011 Jun; 3 (6): 677-713. Epub 2011 Jun 3を参照されたい。
【0131】
本明細書で使用される場合、シュードタイピングは、ウイルスまたはウイルスベクターを外来ウイルスエンベロープタンパク質と組み合わせて作製するプロセスである。結果としてシュードタイピングされたウイルス粒子が得られ、これは、シュードウイルスとも称される。この方法を用いると、外来ウイルスエンベロープタンパク質を使用して、宿主トロピズムを変更すること、またはウイルス粒子の安定性を増大もしくは低下させることができる。シュードタイピングされた粒子は、さらなるウイルスエンベロープタンパク質を産生するための遺伝子材料を担持せず、したがって、表現型の変化を後代ウイルス粒子に渡すことはできない。一部の場合では、ウイルスエンベロープタンパク質を産生することができないことにより、シュードウイルスが複製インコンピテントなものになる。このように、より低リスクの状況において、危険なウイルスの特性を検討することができる。シュードタイピングにより、エンベロープタンパク質の発現をコントロールすることが可能になる。頻繁に使用されるタンパク質は、ＬＤＬ受容体を介した侵入を媒介する、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）由来の糖タンパク質Ｇ（ＶＳＶ－Ｇ）である。シュードウイルスに組み入れられたエンベロープタンパク質により、ウイルスを、種々の細胞型に、対応する宿主受容体を用いて容易に侵入させることが可能になる。
【0132】
レトロウイルスは、特定の受容体を使用して細胞に結合し、侵入する；ＲＤ１１４エンベロープおよびＢａＥＶエンベロープを両方含有するレトロウイルスは、中性アミノ酸（ａａ）トランスポーター（ＡＳＣＴ２）を使用する。ＲＤ１１４シュードタイプウイルスベクターは、それらの侵入受容体としてナトリウム依存性中性アミノ酸トランスポーター（ＡＳＣＴ２）のみを使用し、一方、ＢａＥＶは、２つの受容体、ＡＳＣＴ１およびＡＳＣＴ２の両方を細胞への侵入のために使用する。ＡＳＣＴ１ ｍＲＮＡおよびＡＳＣＴ２ ｍＲＮＡは、ＩＬ－１５－ＮＫ細胞およびＩＬ－２１－ＮＫ細胞のどちらにおいても、新しく単離されたＮＫと比較して上昇し、このことが、ＢａＥＶがＮＫ形質導入に好ましいレトロウイルスシュードタイプである理由である可能性が高い（Colmartino et al., Front Immunol. 2019 Dec 16; 10: 2873）。本発明において、出願人は、ＢａＥＶエンベロープおよびＲＤ１１４エンベロープの両方を発現し、その結果、各ビリオンに両方のエンベロープを有するウイルスをもたらし、標的細胞上の両方の受容体を利用することによって形質導入効率の上昇を容易にするレトロウイルス産生細胞株を開発した。
【0133】
本明細書に開示される通り、改変ＲＤ１１４ネコ内因性レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＲＤ１１４ＴＲ）および改変ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶＴＲ）である、ガンマレトロウイルスに対して外来である２つの組換えエンベロープタンパク質を使用する。ヒト初代リンパ球の形質導入効率は、レトロウイルスベクターを被覆するために使用されるエンベロープタンパク質の型に依存し、活性化されたＮＫ細胞は、標的への侵入に使用されるヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ－ＴＲ）である、中性アミノ酸トランスポーターＡ（ＳＬＣ１Ａ４、本明細書ではＡＳＣＴ－１とも称される）および中性アミノ酸トランスポーターＢ（０）（ＳＬＣ１Ａ５、本明細書ではＡＳＣＴ－２とも称される）という受容体を高度に発現する。ＡＳＣＴ－２受容体は、細胞への侵入に使用されるネコ内因性レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＲＤ１１４ＴＲ）である。
【0134】
「侵入受容体」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルス、例えば、ウイルスのエンベロープ糖タンパク質に結合することにより、レトロウイルスなどのウイルスと細胞との間の膜融合を引き起こす受容体を意味する。一部の実施形態では、レトロウイルス侵入受容体、ＡＳＣＴ１、ＡＳＣＴ２およびＰｉｔ１は、ヒト造血系の細胞上に発現される。さらなる実施形態では、ＡＳＣＴ１、ＡＳＣＴ２またはＰｉｔ１のうちのいずれか１つまたはいずれか２つまたはいずれか３つが、活性化され、増殖したＮＫおよびＴ細胞上に発現され、それにより、対応するエンベロープ糖タンパク質を含むウイルスの形質導入効率が著しく改善される。
【0135】
アラニン／セリン／システイン／トレオニントランスポーター１（ＡＳＣＴ１）は、溶質運搬体ファミリー１メンバー４（ＳＬＣ１Ａ４）または中性アミノ酸トランスポーターＡとも称される。一部の実施形態では、ＡＳＣＴ１は、ヒトＡＳＣＴ１である。このタンパク質または基礎をなす遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ０２Ｐ０６４９８８、ＨＧＮＣ：１０９４２、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：６５０９、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１１５９０２、ＯＭＩＭ（登録商標）：６００２２９、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ４３００７の下に見いだすことができ、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0136】
２型ナトリウム依存性中性アミノ酸トランスポーター（ＡＳＣＴ２）は、溶質運搬体ファミリー１メンバー５（ＳＬＣ１Ａ５）または中性アミノ酸トランスポーターＢ（０）とも称される。ＡＳＣＴ２は、ＲＤ１１４／サルＤ型レトロウイルス受容体、ヒヒＭ７ウイルス受容体、およびＲＤ１１４ウイルス受容体である。一部の実施形態では、ＡＳＣＴ２は、ヒトＡＳＣＴ２である。このタンパク質または基礎をなす遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ１９Ｍ０５１４８３、ＨＧＮＣ：１０９４３、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：６５１０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０５２８１、ＯＭＩＭ（登録商標）：１０９１９０、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ１５７５８の下に見いだすことができ、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0137】
リン酸トランスポーター１（Ｐｉｔ１またはＰｉＴ－１またはＰｉＴ１）は、溶質運搬体ファミリー２０メンバー１（ＳＬＣ２０Ａ１）、またはナトリウム依存性リン酸トランスポーター１、またはテナガザル白血病ウイルス受容体１、または白血病ウイルス受容体１ホモログとも称される。Ｐｉｔ１は、レトロウイルス受容体であり、ヒト細胞を、テナガザル白血病ウイルス、サル肉腫関連ウイルス、ネコ白血病ウイルスサブグループＢ、および１０Ａ１マウス白血病ウイルスに感染しやすくする。一部の実施形態では、Ｐｉｔ１は、ヒトＰｉｔ１である。このタンパク質または基礎をなす遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ０２Ｐ１１８０６１、ＨＧＮＣ：１０９４６、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：６５７４、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１４４１３６、ＯＭＩＭ（登録商標）：１３７５７０、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ８ＷＵＭ９の下に見いだすことができ、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0138】
「４－１ＢＢＬ」、「腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー９」、「ＴＮＦＳＦ９」、または「４－１ＢＢＬポリペプチド」という用語は、ＡＰＣ（抗原提示細胞）上に見いだされ、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７としても公知）に結合する２型膜貫通糖タンパク質受容体である。４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬ複合体は、活性化されたＴリンパ球上に発現されるＴＮＦＲ：ＴＮＦスーパーファミリーに属する。一部の実施形態では、４－１ＢＢＬは、ヒト４－１ＢＢＬである。このタンパク質または基礎をなす遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ１９Ｐ００６５３１、ＨＧＮＣ：１１９３９、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：８７４４、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１２５６５７、ＯＭＩＭ（登録商標）：６０６１８２、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ４１２７３の下に見いだすことができ、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0139】
ＣＤ５６は、神経系細胞接着分子１（ＮＣＡＭ）とも称され、細胞接着タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、発生および分化の間の細胞間相互作用ならびに細胞－マトリックス相互作用に関与する。ＣＤ５６は、ＮＫ細胞マーカーとして使用されている。例えば、Freud et al. Immunity. 2017 Nov 21; 47 (5): 820-833を参照されたい。このタンパク質または基礎をなす遺伝子またはこのタンパク質を検出するために適した抗体の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ１１Ｐ１１２９６１、ＨＧＮＣ：７６５６、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：４６８４、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１４９２９４、ＯＭＩＭ（登録商標）：１１６９３０、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ１３５９１の下に見いだすことができ、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヒトでは、２つの主要なＮＫ細胞サブセットを区別することができ、これらは、接着分子ＣＤ５６の示差的な発現および低親和性Ｆｃ受容体ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）を特徴とする。これらは、一般に、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞およびＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞と称される。ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞は、末梢血において優位を占め、一方、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞は二次リンパ組織（例えば、リンパ節）およびいくつかの器官組織（例えば、肝臓、子宮、および腎臓）におけるＮＫ細胞の大部分を構成する。
【0140】
本明細書で言及されるタンパク質または基礎をなす遺伝子またはこのタンパク質を検出するために適した抗体の非限定的な例示的な配列は、ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／でアクセス可能なＧｅｎｅＣａｒｄｓ、またはｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔでアクセス可能なＵｎｉＰｒｏｔＫＢなどの公的に利用可能なデータベースにおいて見いだすことができる。
【0141】
一部の実施形態では、ＲＤ１１４ＴＲは、ＲＤ１１４糖タンパク質の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびに両種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ－Ａ）糖タンパク質の細胞質ドメインを含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、またはさらにこれらからなる。例えば、Sandrin et al. Blood (2002) 100 (3): 823-832を参照されたい。一部のさらなる実施形態では、ＲＤ１１４ＴＲは、ＭＫＬＰＴＧＭＶＩＬＣＳＬＩＩＶＲＡＧＦＤＤＰＲＫＡＩＡＬＶＱＫＱＨＧＫＰＣＥＣＳＧＧＱＶＳＥＡＰＰＮＳＩＱＱＶＴＣＰＧＫＴＡＹＬＭＴＮＱＫＷＫＣＲＶＴＰＫＩＳＰＳＧＧＥＬＱＮＣＰＣＮＴＦＱＤＳＭＨＳＳＣＹＴＥＹＲＱＣＲＲＩＮＫＴＹＹＴＡＴＬＬＫＩＲＳＧＳＬＮＥＶＱＩＬＱＮＰＮＱＬＬＱＳＰＣＲＧＳＩＮＱＰＶＣＷＳＡＴＡＰＩＨＩＳＤＧＧＧＰＬＤＴＫＲＶＷＴＶＱＫＲＬＥＱＩＨＫＡＭＴＰＥＬＱＹＨＰＬＡＬＰＫＶＲＤＤＬＳＬＤＡＲＴＦＤＩＬＮＴＴＦＲＬＬＱＭＳＮＦＳＬＡＱＤＣＷＬＣＬＫＬＧＴＰＴＰＬＡＩＰＴＰＳＬＴＹＳＬＡＤＳＬＡＮＡＳＣＱＩＩＰＰＬＬＶＱＰＭＱＦＳＮＳＳＣＬＳＳＰＦＩＮＤＴＥＱＩＤＬＧＡＶＴＦＴＮＣＴＳＶＡＮＶＳＳＰＬＣＡＬＮＧＳＶＦＬＣＧＮＮＭＡＹＴＹＬＰＱＮＷＴＲＬＣＶＱＡＳＬＬＰＤＩＤＩＮＰＧＤＥＰＶＰＩＰＡＩＤＨＹＩＨＲＰＫＲＡＶＱＦＩＰＬＬＡＧＬＧＩＴＡＡＦＴＴＧＡＴＧＬＧＶＳＶＴＱＹＴＫＬＳＨＱＬＩＳＤＶＱＶＬＳＧＴＩＱＤＬＱＤＱＶＤＳＬＡＥＶＶＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＴＡＥＱＧＧＩＣＬＡＬＱＥＫＣＣＦＹＡＮＫＳＧＩＶＲＮＫＩＲＴＬＱＥＥＬＱＫＲＲＥＳＬＡＴＮＰＬＷＴＧＬＱＧＦＬＰＹＬＬＰＬＬＧＰＬＬＴＬＬＬＩＬＴＩＧＰＣＶＦＮＲＬＶＱＦＶＫＤＲＩＳＶＶＱＡＬＶＬＴＱＱＹＨＱＬＫＰＬＥＹＥＰ（配列番号１７２）またはその等価物を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
【0142】
一部の実施形態では、ＢａＥＶＴＲは、ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびにＭＬＶ－Ａ糖タンパク質の細胞質ドメインを含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。例えば、Girard-Gagnepain, Blood (2014) 124 (8): 1221-1231を参照されたい。さらなる実施形態では、ＢａＥＶＴＲは、ＭＧＦＴＴＫＩＩＦＬＹＮＬＶＬＶＹＡＧＦＤＤＰＲＫＡＩＥＬＶＱＫＲＹＧＲＰＣＤＣＳＧＧＱＶＳＥＰＰＳＤＲＶＳＱＶＴＣＳＧＫＴＡＹＬＭＰＤＱＲＷＫＣＫＳＩＰＫＤＴＳＰＳＧＰＬＱＥＣＰＣＮＳＹＱＳＳＶＨＳＳＣＹＴＳＹＱＱＣＲＳＧＮＫＴＹＹＴＡＴＬＬＫＴＱＴＧＧＴＳＤＶＱＶＬＧＳＴＮＫＬＩＱＳＰＣＮＧＩＫＧＱＳＩＣＷＳＴＴＡＰＩＨＶＳＤＧＧＧＰＬＤＴＴＲＩＫＳＶＱＲＫＬＥＥＩＨＫＡＬＹＰＥＬＱＹＨＰＬＡＩＰＫＶＲＤＮＬＭＶＤＡＱＴＬＮＩＬＮＡＴＹＮＬＬＬＭＳＮ ＴＳＬＶＤＤＣＷＬＣＬＫＬＧＰＰＴＰＬＡＩＰＮＦＬＬＳＹＶＴＲＳＳＤＮＩＳＣＬＩＩＰＰＬＬＶＱＰＭＱＦＳＮＳＳＣＬＦＳＰＳＹＮＳＴＥＥＩＤＬＧＨＶＡＦＳＮＣＴＳＩＴＮＶＴＧＰＩＣＡＶＮＧＳＶＦＬＣＧＮＮＭＡＹＴＹＬＰＴＮＷＴＧＬＣＶＬＡＴＬＬＰＤＩＤＩＩＰＧＤＥＰＶＰＩＰＡＩＤＨＦＩＹＲＰＫＲＡＩＱＦＩＰＬＬＡＧＬＧＩＴＡＡＦＴＴＧＡＴＧＬＧＶＳＶＴＱＹＴＫＬＳＮＱＬＩＳＤＶＱＩＬＳＳＴＩＱＤＬＱＤＱＶＤＳＬＡＥＶＶＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＴＡＥＱＧＧＩＣＬＡＬＱＥＫＣＣＦＹＶＮＫＳＧＩＶＲＤＫＩＫＴＬＱＥＥＬＥＲＲＲＫＤＬＡＳＮＰＬＷＴＧＬＱＧＬＬＰＹＬＬＰＦＬＧＰＬＬＴＬＬＬＬＬＴＩＧＰＣＩＦＮＲＬＶＱ ＦＶＫＤＲＩＳＶＶＱＡＬＶＬＴＱＱＹＨＱＬＫＰＬＥＹＥＰ（配列番号１７３）またはその等価物を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
【0143】
一部の実施形態では、野生型ＭＬＶ－Ａは、ＭＡＡＲＳＴＬＳＫＰＰＱＤＫＩＮＰＷＫＰＬＩＶＭＧＶＬＬＧＶＧＭＡＥＳＰＨＱＶＦＮＶＴＷＲＶＴＮＬＭＴＧＲＴＡＮＡＴＳＬＬＧＴＶＱＤＡＦＰＫＬＹＦＤＬＣＤＬＶＧＥＥＷＤＰＳＤＱＥＰＹＶＧＹＧＣＫＹＰＡＧＲＱＲＴＲＴＦＤＦＹＶＣＰＧＨＴＶＫＳＧＣＧＧＰＧＥＧＹＣＧＫＷＧＣＥＴＴＧＱＡＹＷＫＰＴＳＳＷＤＬＩＳＬＫＲＧＮＴＰＷＤＴＧＣＳＫＶＡＣＧＰＣＹＤＬＳＫＶＳＮＳＦＱＧＡＴＲＧＧＲＣＮＰＬＶＬＥＦＴＤＡＧＫＫＡＮＷＤＧＰＫＳＷＧＬＲＬＹＲＴ ＧＴＤＰＩＴＭＦＳＬＴＲＱＶＬＮＶＧＰＲＶＰＩＧＰＮＰＶＬＰＤＱＲＬＰＳＳＰＩＥＩＶＰＡＰＱＰＰＳＰＬＮＴＳＹＰＰＳＴＴＳＴＰＳＴＳＰＴＳＰＳＶＰＱＰＰＰＧＴＧＤＲＬＬＡＬＶＫＧＡＹＱＡＬＮＬＴＮＰＤＫＴＱＥＣＷＬＣＬＶＳＧＰＰＹＹＥＧＶＡＶＶＧＴＹＴＮＨＳＴＡＰＡＮＣＴＡＴＳＱＨＫＬＴＬＳＥＶＴＧＱＧＬＣＭＧＡＶＰＫＴＨＱＡＬＣＮＴＴＱＳＡＧＳＧＳＹＹＬＡＡＰＡＧＴＭＷＡＣＳＴＧＬＴＰＣＬＳＴＴＶＬＮＬＴＴＤＹＣＶＬＶＥＬＷＰＲＶＩＹＨＳＰＤＹＭＹＧＱ ＬＥＱＲＴＫＹＫＲＥＰＶＳＬＴＬＡＬＬＬＧＧＬＴＭＧＧＩＡＡＧＩＧＴＧＴＴＡＬＩＫＴＱＱＦＥＱＬＨＡＡＩＱＴＤＬＮＥＶＥＫＳＩＴＮＬＥＫＳＬＴＳＬＳＥＶＶＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＬＫＥＧＧＬＣＡＡＬＫＥＥＣＣＦＹＡＤＨＴＧＬＶＲＤＳＭＡＫＬＲＥＲＬＮＱＲＱＫＬＦＥＴＧＱＧＷＦＥＧＬＦＮＲＳＰＷＦＴＴＬＩＳＴＩＭＧＰＬＩＶＬＬＬＩＬＬＦＧＰＣＩＬＮＲＬＶＱＦＶＫＤＲＩＳＶＶＱＡＬＶＬＴＱＱＹＨＱＬＫＰＬＥＹＥＰ（配列番号１７４）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。さらなる実施形態では、野生型ＭＬＶ－Ａのシグナルペプチドは、ＭＡＡＲＳＴＬＳＫＰＰＱＤＫＩＮＰＷＫＰＬＩＶＭＧＶＬＬＧＶＧＭＡ（配列番号１７４のアミノ酸（ａａ）１～ａａ３３）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＭＬＶ－Ａの外部ドメインドメインは、配列番号１７４のａａ１～ａａ５９９を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＭＬＶ－Ａの膜貫通領域は、ＬＩＳＴＩＭＧＰＬＩＶＬＬＬＩＬＬＦＧＰＣＩＬ（配列番号１７４のａａ６００～ａａ６２２）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＭＬＶ－Ａの細胞質ドメインは、ＮＲＬＶＱＦＶＫＤＲＩＳＶＶＱＡＬ（配列番号１７４のａａ６２３～ａａ６３９）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＭＬＶ－Ａの細胞質ドメインは、ＮＲＬＶＱＦＶＫＤＲＩＳＶＶＱＡＬＶＬＴＱＱＹＨＱＬＫＰＬＥＹＥＰ（配列番号１７４のａａ６２３～ａａ６５５）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
【0144】
一部の実施形態では、タンパク質について言及する場合、ＢａＥＶは、ヒヒ内因性ウイルスのエンベロープ糖タンパク質を意味する。このタンパク質の非限定的な例示的な配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１０２６９またはＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００９１０９６９１．１において見いだすことができ、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、野生型ＢａＥＶは、ＭＧＦＴＴＫＩＩＦＬＹＮＬＶＬＶＹＡＧＦＤＤＰＲＫＡＩＥＬＶＱＫＲＹＧＲＰＣＤＣＳＧＧＱＶＳＥＰＰＳＤＲＶＳＱＶＴＣＳＧＫＴＡＹＬＭＰＤＱＲＷＫＣＫＳＩＰＫＤＴＳＰＳＧＰＬＱＥＣＰＣＮＳＹＱＳＳＶＨＳＳＣＹＴＳＹＱＱＣＲＳＧＮＫＴＹＹＴＡＴＬＬＫＴＱＴＧＧＴＳＤＶＱＶＬＧＳＴＮＫＬＩＱＳＰＣＮＧＩＫＧＱＳＩＣＷＳＴＴＡＰＩＨＶＳＤＧＧＧＰＬＤＴＴＲＩＫＳＶＱＲＫＬＥＥＩＨＫＡＬＹＰＥＬＱＹＨＰＬＡＩＰＫＶＲＤＮＬＭＶＤＡＱＴＬＮＩＬＮＡＴＹＮＬＬＬＭＳＮ ＴＳＬＶＤＤＣＷＬＣＬＫＬＧＰＰＴＰＬＡＩＰＮＦＬＬＳＹＶＴＲＳＳＤＮＩＳＣＬＩＩＰＰＬＬＶＱＰＭＱＦＳＮＳＳＣＬＦＳＰＳＹＮＳＴＥＥＩＤＬＧＨＶＡＦＳＮＣＴＳＩＴＮＶＴＧＰＩＣＡＶＮＧＳＶＦＬＣＧＮＮＭＡＹＴＹＬＰＴＮＷＴＧＬＣＶＬＡＴＬＬＰＤＩＤＩＩＰＧＤＥＰＶＰＩＰＡＩＤＨＦＩＹＲＰＫＲＡＩＱＦＩＰＬＬＡＧＬＧＩＴＡＡＦＴＴＧＡＴＧＬＧＶＳＶＴＱＹＴＫＬＳＮＱＬＩＳＤＶＱＩＬＳＳＴＩＱＤＬＱＤＱＶＤＳＬＡＥＶＶＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＴＡＥＱＧＧＩＣＬＡＬＱＥＫＣＣＦＹＶＮＫＳＧＩＶＲＤＫＩＫＴＬＱＥＥＬＥＲＲＲＫＤＬＡＳＮＰＬＷＴＧＬＱＧＬＬＰＹＬＬＰＦＬＧＰＬＬＴＬＬＬＬＬＴＩＧＰＣＩＦＮＲＬＴＡＦＩＮＤＫＬＮＩＩＨＡＭＶＬＴＱＱＹＱＶＬＲＴＤＥＥＡＱＤ（配列番号１７５）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。さらなる実施形態では、野生型ＢａＥＶのシグナルペプチドは、ＭＧＦＴＴＫＩＩＦＬＹＮＬＶＬＶＹＡ（配列番号１７５のアミノ酸（ａａ）１～ａａ１８）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＢａＥＶの外部ドメインドメインは、配列番号１７５のａａ１～ａａ５０６を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＢａＥＶの膜貫通領域は、ＹＬＬＰＦＬＧＰＬＬＴＬＬＬＬＬＴＩＧＰＣＩＦ（配列番号１７５のａａ５０７～ａａ５２９）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＢａＥＶの細胞質ドメインは、ＮＲＬＴＡＦＩＮＤＫＬＮＩＩＨＡＭ（配列番号１７５のａａ５３０～ａａ５４６）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＢａＥＶの細胞質ドメインは、ＮＲＬＴＡＦＩＮＤＫＬＮＩＩＨＡＭＶＬＴＱＱＹＱＶＬＲＴＤＥＥＡＱＤ（配列番号１７５のａａ５３０～ａａ５６３）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
【0145】
一部の実施形態では、タンパク質について言及する場合、ＲＤ１１４は、ＲＤ１１４レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質を意味する。このタンパク質の非限定的な例示的な配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ６１０９３．１、ＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００１４９７１４９．１、またはＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＭ１７３０８．１において見いだすことができ、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、野生型ＲＤ１１４は、ＭＫＬＰＴＧＭＶＩＬＣＳＬＩＩＶＲＡＧＦＤＤＰＲＫＡＩＡＬＶＱＫＱＨＧＫＰＣＥＣＳＧＧＱＶＳＥＡＰＰＮＳＩＱＱＶＴＣＰＧＫＴＡＹＬＭＴＮＱＫＷＫＣＲＶＴＰＫＩＳＰＳＧＧＥＬＱＮＣＰＣＮＴＦＱＤＳＭＨＳＳＣＹＴＥＹＲＱＣＲＲＩＮＫＴＹＹＴＡＴＬＬＫＩＲＳＧＳＬＮＥＶＱＩＬＱＮＰＮＱＬＬＱＳＰＣＲＧＳＩＮＱＰＶＣＷＳＡＴＡＰＩＨＩＳＤＧＧＧＰＬＤＴＫＲＶＷＴＶＱＫＲＬＥＱＩＨＫＡＭＴＰＥＬＱＹＨＰＬＡＬＰＫＶＲＤＤＬＳＬＤＡＲＴＦＤＩＬＮＴＴＦＲＬＬＱＭＳＮＦＳＬＡＱＤＣＷＬＣＬＫＬＧＴＰＴＰＬＡＩＰＴＰＳＬＴＹＳＬＡＤＳＬＡＮＡＳＣＱＩＩＰＰＬＬＶＱＰＭＱＦＳＮＳＳＣＬＳＳＰＦＩＮＤＴＥＱＩＤＬＧＡＶＴＦＴＮＣＴＳＶＡＮＶＳＳＰＬＣＡＬＮＧＳＶＦＬＣＧＮＮＭＡＹＴＹＬＰＱＮＷＴＲＬＣＶＱＡＳＬＬＰＤＩＤＩＮＰＧＤＥＰＶＰＩＰＡＩＤＨＹＩＨＲＰＫＲＡＶＱＦＩＰＬＬＡＧＬＧＩＴＡＡＦＴＴＧＡＴＧＬＧＶＳＶＴＱＹＴＫＬＳＨＱＬＩＳＤＶＱＶＬＳＧＴＩＱＤＬＱＤＱＶＤＳＬＡＥＶＶＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＴＡＥＱＧＧＩＣＬＡＬＱＥＫＣＣＦＹＡＮＫＳＧＩＶＲＮＫＩＲＴＬＱＥＥＬＱＫＲＲＥＳＬＡＴＮＰＬＷＴＧＬＱＧＦＬＰＹＬＬＰＬＬＧＰＬＬＴＬＬＬＩＬＴＩＧＰＣＶＦＳＲＬＭＡＦＩＮＤＲＬＮＶＶＨＡＭＶＬＡＱＱＹＱＡＬＫＡＥＥＥＡＱＤ（配列番号１７６）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。さらなる実施形態では、野生型ＲＤ１１４のシグナルペプチドは、ＭＫＬＰＴＧＭＶＩＬＣＳＬＩＩＶＲＡ（配列番号１７６のアミノ酸（ａａ）１～ａａ１８）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＲＤ１１４の外部ドメインドメインは、配列番号１７６のａａ１～ａａ５０４を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＲＤ１１４の外部ドメインドメインは、配列番号１７６のａａ１～ａａ５０７を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＲＤ１１４の膜貫通領域は、ＦＬＰＹＬＬＰＬＬＧＰＬＬＴＬＬＬＩＬＴＩＧＰＣＶＦ（配列番号１７６のａａ５０５～ａａ５３０）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＲＤ１１４の膜貫通領域は、ＹＬＬＰＬＬＧＰＬＬＴＬＬＬＩＬＴＩＧＰＣＶＦ（配列番号１７６のａａ５０８～ａａ５３０）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＲＤ１１４の細胞質ドメインは、ＳＲＬＭＡＦＩＮＤＲＬＮＶＶＨＡＭ（配列番号１７６のａａ５３１～ａａ５４７）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＲＤ１１４の細胞質ドメインは、ＳＲＬＭＡＦＩＮＤＲＬＮＶＶＨＡＭＶＬＡＱＱＹＱＡＬＫＡＥＥＥＡＱＤ（配列番号１７６のａａ５３１～ａａ５６４）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
【0146】
一部の実施形態では、タンパク質について言及する場合、ＧＡＬＶは、テナガザル白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質のエンベロープ糖タンパク質を意味する。このタンパク質の非限定的な例示的な配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２１４１５（ＥＮＶ＿ＧＡＬＶ）において見いだすことができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、野生型ＧＡＬＶは、ＭＶＬＬＰＧＳＭＬＬＴＳＮＬＨＨＬＲＨＱＭＳＰＧＳＷＫＲＬＩＩＬＬＳＣＶＦＧＧＧＧＴＳＬＱＮＫＮＰＨＱＰＭＴＬＴＷＱＶＬＳＱＴＧＤＶＶＷＤＴＫＡＶＱＰＰＷＴＷＷＰＴＬＫＰＤＶＣＡＬＡＡＳＬＥＳＷＤＩＰＧＴＤＶＳＳＳＫＲＶＲＰＰＤＳＤＹＴＡＡＹＫＱＩＴＷＧＡＩＧＣＳＹＰＲＡＲＴＲＭＡＳＳＴＦＹＶＣＰＲＤＧＲＴＬＳＥＡＲＲＣＧＧＬＥＳＬＹＣＫＥＷＤＣＥＴＴＧＴＧＹＷＬＳＫＳＳＫＤＬＩＴＶＫＷＤＱＮＳＥＷＴＱＫＦＱＱＣＨＱＴＧＷＣＮＰＬＫＩＤＦＴＤＫＧＫＬＳＫＤＷＩＴＧＫＴＷＧＬＲＦＹＶＳＧＨＰＧＶＱＦＴＩＲＬＫＩＴＮＭＰＡＶＡＶＧＰＤＬＶＬＶＥＱＧＰＰＲＴＳＬＡＬＰＰＰＬＰＰＲＥＡＰＰＰＳＬＰＤＳＮＳＴＡＬＡＴＳＡＱＴＰＴＶＲＫＴＩＶＴＬＮＴＰＰＰＴＴＧＤＲＬＦＤＬＶＱＧＡＦＬＴＬＮＡＴＮＰＧＡＴＥＳＣＷＬＣＬＡＭＧＰＰＹＹＥＡＩＡＳＳＧＥＶＡＹＳＴＤＬＤＲＣＲＷＧＴＱＧＫＬＴＬＴＥＶＳＧＨＧＬＣＩＧＫＶＰＦＴＨＱＨＬＣＮＱＴＬＳＩＮＳＳＧＤＨＱＹＬＬＰＳＮＨＳＷＷＡＣＳＴＧＬＴＰＣＬＳＴＳＶＦＮＱＴＲＤＦＣＩＱＶＱＬＩＰＲＩＹＹＹＰＥＥＶＬＬＱＡＹＤＮＳＨＰＲＴＫＲＥＡＶＳＬＴＬＡＶＬＬＧＬＧＩＴＡＧＩＧＴＧＳＴＡＬＩＫＧＰＩＤＬＱＱＧＬＴＳＬＱＩＡＩＤＡＤＬＲＡＬＱＤＳＶＳＫＬＥＤＳＬＴＳＬＳＥＶＶＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＬＫＥＧＧＬＣＡＡＬＫＥＥＣＣＦＹＩＤＨＳＧＡＶＲＤＳＭＫＫＬＫＥＫＬＤＫＲＱＬＥＲＱＫＳＱＮＷＹＥＧＷＦＮＮＳＰＷＦＴＴＬＬＳＴＩＡＧＰＬＬＬＬＬＬＬＬＩＬＧＰＣＩＩＮＫＬＶＱＦＩＮＤＲＩＳＡＶＫＩＬＶＬＲＱＫＹＱＡＬＥＮＥＧＮＬ（配列番号１８３）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＧＡＬＶは、配列番号１８３のａａ４２～ａａ６８５を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。さらなる実施形態では、野生型ＧＡＬＶのシグナルペプチドは、配列番号１８３のａａ１～ａａ４１を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＧＡＬＶの外部ドメインドメインは、配列番号１８３のａａ１～ａａ４８９または配列番号１８３のａａ４２～ａａ４８９を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＧＡＬＶの膜貫通領域は、配列番号１８３のａａ４９０～ａａ６７０を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、野生型ＧＡＬＶの細胞質ドメインは、配列番号１８３のａａ６７１～ａａ６８５を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
【0147】
本明細書で使用される場合、感染多重度（ＭＯＩ）とは、感染の間に細胞当たりに添加されるウイルス粒子の数を指す。
【0148】
ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ試薬は、レンチウイルス媒介性遺伝子形質導入およびレトロウイルス媒介性遺伝子形質導入の効率を増強する、組換えヒトフィブロネクチン断片（ｒＦＮ－ＣＨ－２９６とも称される）の６３ｋＤの断片である。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ試薬は、造血細胞および他のトランスフェクトすることが困難な細胞型に関して特に重要である。形質導入の増強は、ウイルス粒子と標的細胞の共局在に起因するものと考えられる。これは、ウイルス粒子とヘパリン結合性ドメイン内の配列の直接結合および標的細胞インテグリンとｒＦＮ－ＣＨ－２９６内の２つの他のドメインとの相互作用によって実現される。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎは、インテグリンであるインテグリンα４β１（ＶＬＡ－４）および／またはインテグリンα５β１（ＶＬＡ－５）を発現する細胞に対して高度に効果的である。ＶＬＡ－４発現細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ＮＫ細胞、好酸球、骨髄単核球細胞、およびリンパ球前駆細胞が挙げられる。胸腺細胞、活性化Ｔ細胞、および肥満細胞はＶＬＡ－５を発現する。
【0149】
遺伝子導入がレンチウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、レンチウイルスゲノムまたはその一部および治療用遺伝子を含むポリヌクレオチドを意味する。本明細書で使用される場合、「レンチウイルス媒介遺伝子導入」または「レンチウイルス形質導入」は同じ意味を有し、細胞中に進入し、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに一体化するウイルスによって遺伝子または核酸配列が宿主細胞中に安定的に導入されるプロセスを意味する。ウイルスは、その正常な感染機構を介して宿主細胞中に進入することができ、または細胞に進入するために異なる宿主細胞表面受容体またはリガンドに結合するように改変することもできる。レトロウイルスはその遺伝情報をＲＮＡの形態で有しているが、ウイルスがいったん細胞に感染すれば、ＲＮＡはＤＮＡ形態に逆転写され、これが感染した細胞のゲノムＤＮＡの中に一体化される。一体化されたＤＮＡ形態はプロウイルスと称される。本明細書で使用される場合、レンチウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス様の進入機構によって外因性核酸を細胞内に導入することができるウイルス粒子を意味する。「レンチウイルスベクター」は、非分割細胞の形質導入において他のレトロウイルスベクターと比較してある種の利点を有する、当技術で周知のレトロウイルスベクターの型である。Trono D. (2002) Lentiviral vectors, New York: Spring-Verlag Berlin Heidelbergを参照されたい。
【0150】
本開示のレンチウイルスベクターは、オンコレトロウイルス（ＭＬＶを含むレトロウイルスのサブグループ）およびレンチウイルス（ＨＩＶを含むレトロウイルスのサブグループ）に基づくか、これらから誘導される。例には、ＡＳＬＶ、ＳＮＶ、およびＲＳＶが含まれ、これらの全てはレンチウイルスベクター粒子産生系のパッケージングおよびベクター成分に分割されている。本開示によるレンチウイルスベクター粒子は、特定のレトロウイルスの遺伝的にまたはその他に（例えばパッケージング細胞系の特定の選択によって）変更されたバージョンに基づいてよい。
【0151】
本明細書で使用される用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、この名称に随伴し、ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーに属するウイルスのクラスのメンバーを意味する。このウイルスの多数の血清型は遺伝子送達に好適であることが知られており、公知の全ての血清型が種々の組織型由来の細胞に感染することができる。連続的に番号付けされた少なくとも１１種のＡＡＶ血清型が当技術で公知である。本明細書で開示する方法において有用な非限定的で例示的な血清型には、１１種の血清型、例えばＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９のいずれか、またはバリアントもしくは合成の血清型、例えばＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂが含まれる。ＡＡＶ粒子は、３つの主要なウイルス粒子：ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ、またはＡＡＶ ｒｈ７４を意味する。これらのベクターは市販で入手可能であるか、または特許もしくは技術文献に記載されている。
【0152】
本開示によるベクター粒子が特定のレトロウイルスに「基づいている」ということは、そのベクターがその特定のレトロウイルスから誘導されることを意味する。ベクター粒子のゲノムは、そのレトロウイルスに由来する成分を骨格として含む。ベクター粒子は、逆転写および一体化の系を含む、ＲＮＡゲノムと適合性のある基本的なベクター成分を含む。通常、これらは、特定のレトロウイルスから誘導されたｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を含むことになる。すなわち、ベクター粒子の構造成分の大多数は、通常はそのレトロウイルスに由来することになるが、これらは所望の有用な特性を提供するように遺伝子的にまたはその他に変更されていてよい。しかし、ある種の構造成分および特にｅｎｖタンパク質は、異なるウイルスに起源してもよい。ベクター宿主範囲および感染または形質導入された細胞型を、ベクター粒子産生系における様々なｅｎｖ遺伝子を使用して変更し、ベクター粒子に異なる特異性を付与することができる。
【0153】
本明細書で使用される場合、細胞は原核生物または真核生物の細胞であってよい。さらなる実施形態では、細胞は免疫細胞である。
【0154】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」には、例えば骨髄で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）から誘導されてよい白血球（ロイコサイト、例えば顆粒細胞（好中球、好酸球、および好塩基球）、単球、およびリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＮＫＴ細胞））、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＮＫＴ細胞）、および骨髄から誘導される細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が含まれる。一部の実施形態では、免疫細胞は以下：前駆細胞、胚幹細胞、胚幹細胞から誘導された細胞、胚胎芽細胞、胚胎芽細胞から誘導された細胞、幹細胞、幹細胞から誘導された細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または不死化細胞の１つまたは複数から誘導される。一部の実施形態では、ＨＳＣは、対象の臍帯血、対象の末梢血、または対象の骨髄から誘導される。
【0155】
「宿主細胞」は、特定の対象細胞のみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫を意味する。ある種の改変は突然変異または環境の影響によって継続する世代において起こり得るので、そのような子孫は、事実上、親細胞と同一ではないかもしれないが、それでも本明細書で使用される用語の範囲の中に含まれる。
【0156】
「パッケージング細胞」は、異種ヌクレオチド配列の安定なまたは一過性のトランスフェクションまたは形質導入によって、ウイルスヘルパー構築物を含む核酸分子を持った宿主細胞を指し、ここで、構築物は、ウイルス粒子の産生に対してトランスでもたらすことができる、パッケージング機能、例えば、複製およびカプシド形成のために必要なタンパク質の安定なまたは一過性の発現をもたらすことが可能なものである。ウイルスヘルパー機能の発現は、構成的なものであるか、または、例えば、ヘルパー機能が誘導性プロモーターのコントロール下にある場合など、誘導性のものであり得る。
【0157】
細胞の「富化された集団」は、ある種の定義された特徴を有する実質的に均一な細胞の集団を意図している。細胞は定義された特徴において７０％を超え、あるいは７５％を超え、あるいは８０％を超え、あるいは８５％を超え、あるいは９０％を超え、あるいは９５％を超え、あるいは９８％を超えて同一である。
【0158】
用語「増殖させる」は、細胞または細胞の集団を成長させることを意味する。用語「成長させる」も、支持培地、栄養素、増殖因子、支持細胞、または所望の数の細胞もしくは細胞型を得るために必要な任意の化学的または生物学的な化合物の存在下における細胞の増殖を意味する。
【0159】
用語「培養する」は、様々な種類の培地の上または中における細胞または生命体のｉｎ ｖｉｔｒｏの増殖を意味する。培養で増殖した細胞の子孫は親細胞と完全に同一ではないかもしれない（すなわち形態的、遺伝的、または表現型的に）ことが理解される。
【0160】
改変されていない細胞は、時には、「供給源細胞」または「供給源幹細胞」と称される。この細胞は、原核生物の細胞または真核生物の細胞であり得、これだけに限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞、例えば、ネコ科動物、イヌ科動物、ウマ科動物、マウス、ラット、サル、ウシ、ブタおよびヒトの細胞が含まれる。
【0161】
一実施形態では、「未成熟細胞」は、所望の（成体）表現型または遺伝子型を有さない細胞を指す。例えば、一実施形態では、成熟細胞は、置き換えられている細胞である。細胞の表現型または遺伝子型を「成熟細胞」のものに変化させる、変化を開始させる、または変更する物理学的、生物学的、または化学的プロセスを含む技法に未成熟細胞を供することができる。「成熟細胞」は、所望の表現型または遺伝子型を有する細胞を指す。
【0162】
本明細書で使用される場合、用語「ＮＫ細胞」はナチュラルキラー細胞としても知られており、骨髄起源で先天性の免疫系において重要な役割を果たすリンパ球の型を意味する。ＮＫ細胞は、細胞表面上の抗体および主要組織適合性複合体の非存在下であってもウイルス感染細胞、腫瘍細胞、またはその他のストレスを受けた細胞に対する迅速な免疫応答を提供する。ＮＫ細胞は、市販で入手可能な供給源から単離または取得できる。市販のＮＫ細胞系の非限定的な例には、ＮＫ－９２系（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０７（商標））、ＮＫ－９２ＭＩ系（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０８（商標））が含まれる。さらなる例には、それだけに限らないが、ＮＫ系ＨＡＮＫ１、ＫＨＹＧ－１、ＮＫＬ、ＮＫ－ＹＳ、ＮＯＩ－９０、およびＹＴが含まれる。そのような市販で入手可能な細胞系の非限定的で例示的な供給源には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、すなわちＡＴＣＣ（www.atcc.org/）およびＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（www.dsmz.de/）が含まれる。
【0163】
本明細書で使用される場合、細胞（例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、またはγδＴ細胞など）の効力は、例えば標的細胞の殺滅に関する細胞の細胞傷害性、および／または細胞によるＩＦＮ－γ（本明細書ではＩＦＮγまたはＩＦＮ－ガンマとも称される）などのサイトカイン放出を含む。
【0164】
天然に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、抗原を、Ｔ細胞などのある特定のリンパ球によって認識されるようにプロセシングし、提示することによって細胞の免疫応答を媒介する免疫細胞を指す。古典的なＡＰＣとしては、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞およびＢ細胞が挙げられる。本明細書で使用される場合、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、これらのＡＰＣの合成バージョンであり、特定の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞など）刺激シグナルを種々のマクロおよびミクロ生体適合性表面および／または細胞に付着させることによって作出される。これにより、費用を潜在的に低減させることができるのと同時に、生成される、療法のための多数の機能的な病原体特異的免疫細胞をコントロールすることが可能になる。
【0165】
用語「幹細胞」は、非分化または部分的分化の状態にあり、自己更新する能力および／もしくは分化した子孫を生成する能力を有する細胞を意味する。自己更新は、増殖してより多くのそのような幹細胞を生じる一方、その発達可能性（すなわち分化全能性、多能性（pluripotent）、多能性（multipotent）、その他）を維持する幹細胞の能力として定義される。用語「体性幹細胞」は、本明細書で胎児、若年、および成年の組織を含む非胚組織から誘導された任意の幹細胞を意味するために使用される。天然の体性幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵、骨格筋、および心筋を含む広範囲の成年組織から単離されている。天然に存在する例示的な体性幹細胞には、それだけに限らないが、間充織幹細胞（ＭＳＣ）および神経系またはニューロンの幹細胞（ＮＳＣ）が含まれる。一部の実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、胚幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってよい。本明細書で使用される場合、「胚幹細胞」は、前胚組織（例えば胚盤胞）、胚組織、または典型的には妊娠約１０～１２週の前であるが必ずしもそうでなくてもよい妊娠中の任意の時期に採取された胎児組織を含む、受精後で妊娠の終了前に形成された組織から誘導される幹細胞を意味する。最も頻繁には、胚幹細胞は早期の胚または胚盤胞から誘導された多能性細胞である。胚幹細胞は、ヒト組織を含むがそれに限らない好適な組織から、または確立された胚細胞系から直接得ることができる。「胚様幹細胞」は、胚幹細胞の１つまたは複数であるが全てではない特徴を共有する細胞を意味する。
【0166】
「分化」は、専門化されていない細胞が、心細胞、肝細胞、または筋肉細胞等の専門化された細胞の特徴を獲得するプロセスを表現している。「方向付けられた分化」は、特定の細胞型への分化を誘起するための幹細胞の培養条件の操作を意味する。「脱分化した」は、細胞のリニエージの中で関わりが少ない立場に逆行する細胞を定義している。本明細書で使用される場合、用語「分化するまたは分化した」は、細胞のリニエージの中で関わりが大きい（「分化した」）立場をとる細胞を定義している。本明細書で使用される場合、「中胚葉（または外胚葉または内胚葉）リニエージに分化する細胞」は、それぞれ、特定の中胚葉リニエージ、外胚葉リニエージまたは内胚葉リニエージに委ねられる細胞を定義するものである。中胚葉リニエージに分化するまたは特定の中胚葉系細胞を生じさせる細胞の例としては、これだけに限定されないが、脂肪生成性細胞、平滑筋形成（ｌｅｉｏｍｙｏｇｅｎｉｃ）細胞、軟骨形成細胞、心臓形成（ｃａｒｄｉｏｇｅｎｉｃ）細胞、皮膚形成（ｄｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃ）細胞、造血性細胞、血管形成（ｈｅｍａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）細胞、筋原性細胞、腎形成細胞、泌尿生殖器形成（ｕｒｏｇｅｎｉｔｏｇｅｎｉｃ）細胞、骨形成細胞、心膜形成（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｏｇｅｎｉｃ）細胞、または間質細胞が挙げられる。
【0167】
本明細書で使用される場合、用語「分化するまたは分化した」は、細胞のリニエージの中で関わりが大きい（「分化した」）立場をとる細胞を定義している。「脱分化した」は、細胞のリニエージの中で関わりが少ない立場に逆行する細胞を定義している。誘導多能性幹細胞は、脱分化した細胞の例である。
【0168】
一部の実施形態では、第２の細胞に由来する第１の細胞とは、第２の細胞から分化した第１の細胞を指す。それに加えてまたはその代わりに、第２の細胞に由来する第１の細胞は、第２の細胞から、操作により作製された第１の細胞を指す。
【0169】
本明細書で使用される場合、細胞の「リニエージ」は、細胞の遺伝性、すなわちその祖先および子孫を定義している。細胞のリニエージは、細胞を発達および分化の遺伝的スキームの中に置く。
【0170】
「マルチリニエージ幹細胞」または「多能性幹細胞」は、それ自体および区別できる発達リニエージに由来する少なくとも２つのさらに分化した子孫細胞を再生産する幹細胞を意味する。リニエージは、同じ胚葉（すなわち中胚葉、外胚葉、または内胚葉）由来または異なる胚葉由来であってよい。マルチリニエージ幹細胞の分化からの発生リニエージが別個の２つの後代細胞の例は、筋原細胞と脂肪生成性細胞である（どちらも中胚葉系起源であるにもかかわらず、異なる組織を生じさせる）。別の例は、神経形成細胞（外胚葉系起源）と脂肪生成性細胞（中胚葉系起源）である。
【0171】
「前駆体」または「前駆細胞」は、特定の細胞の型に分化する能力を有する細胞を意味することを意図している。前駆細胞は幹細胞であってよい。前駆細胞は幹細胞より特異的であってよい。前駆細胞は単能性または多能性であってよい。成年幹細胞と比較して、前駆細胞は細胞分化の遅い段階にあってよい。前駆細胞の例には、限定なく前駆神経細胞が含まれる。
【0172】
本明細書で使用される場合、「多能性細胞」は、少なくとも２つの区別できる（遺伝型および／もしくは表現型として）さらに分化した子孫細胞を生じることができる低分化の細胞を定義している。別の態様では、「多能性細胞」には、歴史的には１つまたは複数の幹細胞特異的遺伝子の発現を誘起することによって産生されてきた、非多能性細胞、典型的には成年体細胞から人工的に誘導された幹細胞である誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が含まれる。そのような幹細胞特異的遺伝子には、それだけに限らないが、オクタマー転写因子のファミリー、すなわちＯｃｔ－３／４；Ｓｏｘ遺伝子のファミリー、すなわちＳｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、およびＳｏｘ１８；Ｋｌｆ遺伝子のファミリー、すなわちＫｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５；Ｍｙｃ遺伝子のファミリー、すなわちｃ－ｍｙｃおよびＬ－ｍｙｃ；Ｎａｎｏｇ遺伝子のファミリー、すなわちＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびＲＥＸ１；またはＬＩＮ２８が含まれる。ｉＰＳＣの例は、Takahashi et al. (2007) Cell advance online publication 20 November 2007; Takahashi & Yamanaka (2006) Cell 126:663-76; Okita et al. (2007) Nature 448:260-262; Yu et al. (2007) Science advance online publication 20 November 2007; およびNakagawa et al. (2007) Nat. Biotechnol. Advance online publication 30 November 2007に記載されている。
【0173】
「胚様体またはＥＢ」は、培養中に形成される、その後の分化を促進する胚性幹細胞の３次元（３Ｄ）凝集体である。浮遊培養下で成長させると、ＥＢ細胞は、近位内胚葉の外層で囲まれた細胞の小さな凝集体を形成する。増殖および分化すると、ＥＢは、流体が満たされた腔および外胚葉様細胞の内部層を有する嚢胞性胚様体に発達する。
【0174】
「誘導多能性細胞」は、成年細胞から未成熟表現型に再プログラミングされた胚様細胞を意図している。当技術において種々の方法、例えば"A simple new way to induce pluripotency: Acid." Nature, 29 January 2014 が知られており、sciencedaily.com/releases/2014/01/140129184445（２０１４年２月５日に最後に閲覧）、および米国特許出願公開第２０１０／００４１０５４号で入手可能である。ヒトｉＰＳＣは幹細胞マーカーも発現しており、３つ全ての肺葉に特徴的な細胞を生成することができる。
【0175】
「単為発生幹細胞」は、卵の単為活性化から生じる幹細胞を意味する。単為発生幹細胞を創成する方法は当技術で公知である。例えばCibelli et al. (2002) Science 295(5556):819 およびVrana et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(Suppl. 1)11911-6を参照されたい。
【0176】
本明細書で使用される場合、用語「多能性遺伝子またはマーカー」は、未成熟または未分化の表現型、例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ－Ｍｙｃ、およびＬＩＮ－２８に相関された、発現した遺伝子またはタンパク質を意図している。これらを同定する方法は当技術で公知であり、これらを同定するシステムは、例えばＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）Ｍａｐ Ｋｉｔ）から市販で入手可能である。
【0177】
用語「表現型」は、集団の中の個体のサブセットにおいてのみ測定可能であり、発現される個体の形質または特徴の表現を意味する。本開示の一態様では、個体の表現型には、単一細胞、細胞の実質的に均一な集団、分化した細胞の集団、または細胞の集団からなる組織の表現型が含まれる。
【0178】
一部の実施形態では、細胞の集団は、表現型および／または遺伝型において同一の（クローナルな）または非同一の２つ以上の細胞の集合を意図している。集団は、本明細書に記載したように、精製され、高度に精製され、実質的に均一または不均一であり得る。
【0179】
用語「有効な期間（または時間）」および「有効な条件」は、薬剤または組成物が、その意図した結果、例えば所定の細胞型への細胞の分化または脱分化を達成するために必要なまたは好ましい期間またはその他の制御可能な条件（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏの方法における温度、湿度）を意味する。
【0180】
「実質的に均一」は、細胞の約５０％超、あるいは約６０％超、あるいは７０％超、あるいは７５％超、あるいは８０％超、あるいは８５％超、あるいは９０％超、あるいは９５％超が同じまたは同様の表現型である細胞の集団を表現している。表現型は、予め選択した細胞表面マーカーまたはその他のマーカーによって決定することができる。
【0181】
本明細書で使用される場合、「枯渇」という用語は、実質的に欠くことを指す。例えば、ＣＤ３＋細胞が枯渇した細胞集団は、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．３％未満、約０．４％未満、約０．５％未満、約０．６％未満、約０．７％未満、約０．８％未満、約０．９％未満、約１．０％未満、約１．１％未満、約１．２％未満、約１．３％未満、約１．４％未満、約１．５％未満、約１．６％未満、約１．７％未満、約１．８％未満、約１．９％未満、または約２．０％未満のＣＤ３＋細胞を含む細胞集団を指す。
【0182】
用語「許容できる」、「有効な」、または「十分な」は、本明細書で開示する任意の成分、範囲、用量形態、その他の選択を表現するために使用される場合には、前記成分、範囲、用量形態、その他が開示した目的に適していることを意図している。
【0183】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」等は、所望の薬学的および／または生理学的な効果を得ることを意味するために本明細書で使用される。一部の実施形態では、効果は、障害またはその兆候もしくは症状を完全にまたは部分的に防止するという観点で予防的であってよく、および／または障害および／もしくは障害に起因する有害効果の部分的または完全な治癒の観点で治療的であってよい。「処置」の例には、それだけに限らないが、障害に罹患する傾向があるが障害を有するとは診断されていない対象において障害が生じることを防止すること、障害を阻止すること、すなわちその進行を阻むこと、および／または障害の症状を緩和もしくは改善することが含まれる。一態様では、処置は、疾患または障害、例えばがんの症状の進行を阻止することである。一部の実施形態では、処置は、（１）罹患する傾向があるか疾患の症状を呈していない対象において症状または疾患が生じることを防止すること；（２）疾患を阻止するかその進行を阻むこと；または（３）疾患または疾患の症状を改善するか寛解を惹起することを意味する。当技術で理解されるように、「処置」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本技術の目的のため、有益なまたは所望の結果には、検出可能であっても検出可能でなくても、１つまたは複数の症状の緩和または改善、状態（疾患を含む）の程度の消失、状態（疾患を含む）の状況の安定化（すなわち悪化しないこと）、状態（疾患を含む）の遅延または遅くすること、状態（疾患を含む）の進行、改善、または軽減、状況および寛解（部分的であっても全体的であっても）の１つまたは複数を含み得るが、これらに限らない。疾患ががんである場合には、以下の臨床的エンドポイントが、処置の非限定的な例である：腫瘍負荷の低減、腫瘍成長の遅延、全生存期間の延長、腫瘍進行の長期化、転移の阻止、または腫瘍の転移の低減。一態様では、処置は予防を除外する。一態様では、処置は予防を除外する。
【0184】
本明細書で使用される場合、治療用タンパク質またはポリペプチドとは、これだけに限定されないが、抗体もしくはその断片、酵素、リガンドまたは受容体を含めた、処置に適するタンパク質および／またはポリペプチドを指す。そのような治療用のタンパク質またはポリペプチドは、処置すべき疾患に基づいて医師または当業者によって選択され得る。例えば、がんを処置するためには、免疫チェックポイント受容体またはそのリガンドに対する抗体、例えば抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を使用してよい。
【0185】
一実施形態では、本明細書で使用される用語「疾患」または「障害」は、がん、がんを有すると診断される状態、がんを有すると疑われる状態、またはがんを有する高いリスクにある状態を意味する。
【0186】
本明細書で使用される場合、「がん」は、対象における異常な制御できない複製を示す細胞の存在によって特徴付けられる疾患状態であり、一部の態様では、この用語は用語「腫瘍」と相互交換可能に使用してよい。用語「がんまたは腫瘍の抗原」は、がん細胞または腫瘍の細胞もしくは組織に付随し、その表面に発現されることが知られている抗原を意味し、用語「がんまたは腫瘍を標的とする抗体」は、そのような抗原を標的とする抗体を意味する。
【0187】
「固形腫瘍」は、通常は嚢胞または液体区域を含まない組織の異常な密集体である。固形腫瘍は良性または悪性、転移性または非転移性であることがある。様々な型の固形腫瘍が、これを形成する細胞の型について命名されている。固形腫瘍の例には、肉腫、癌腫、およびリンパ腫が含まれる。
【0188】
「組成物」は、活性薬剤と不活性（例えば検出可能な薬剤または標識）または活性な別の化合物または組成物、例えばアジュバント、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバント、その他の組合せを意味し、薬学的に許容される担体を含むことを意図している。
【0189】
担体にも、医薬用の賦形剤および添加剤タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物（例えば単糖、二オリゴ糖、三オリゴ糖、四オリゴ糖、およびオリゴ糖を含む糖類；アルジトール、アルドン酸、エステル化糖類等の誘導糖類；ならびに多糖または糖ポリマー類）が含まれ、これらは、個別にまたは組合せで存在し、単独でまたは組合せで重量もしくは体積の１～９９．９９％を構成してよい。例示的なタンパク質賦形剤には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）等の血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン等が含まれる。緩衝容量においても機能し得る代表的なアミノ酸／抗体成分には、アラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム等が含まれる。炭水化物賦形剤も本技術の範囲内であることを意図しており、その例には、それだけに限らないが、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボース等の単糖；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等の二糖；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖；ならびにマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、およびミオイノシトール等のアルジトールが含まれる。
【0190】
「医薬組成物」は、活性なポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体と、組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏにおける診断または治療の用途に好適にする、固体支持体等の不活性または活性の担体との組合せを含むことを意図している。
【0191】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、標準的な医薬用担体のいずれか、例えばリン酸塩緩衝食塩溶液、水、およびエマルション、例えば油／水もしくは水／油エマルション、および種々の型の湿潤剤を包含する。組成物は、安定剤および保存剤を含んでもよい。担体、安定剤、およびアジュバントの例については、Martin (1975) Remington’s Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton)を参照されたい。用語「薬学的に許容される担体（または媒体）」は、用語「生物学的に適合する担体または媒体」と相互交換可能に使用されてよく、治療用に投与される細胞およびその他の薬剤と適合するのみでなく、妥当な医学的判断の範囲内で過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の合併症がなく、適正な利益／リスク比に相応する、人類および動物の組織と接触する用途に適した、薬剤、細胞、化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を意味する。本開示における使用のために好適な薬学的に許容される担体には、液体、半固体（例えばゲル）、および固体の材料（例えば細胞のスカフォールドおよびマトリックス、チューブ、シートおよびその他の当技術で公知で本明細書でより詳細に記載した材料）が含まれる。これらの半固体および固体の材料は、体内での分解に抵抗する（非生分解性）ように設計してよく、または体内で分解する（生分解性、生浸食性）ように設計してもよい。生分解性材料はさらに生体再吸収性または生体吸収性であってよく、すなわち体液に溶解され吸収されてもよく（水溶性インプラントが１つの例である）、または他の材料への変換もしくは天然の経路を通る分解および排除によって分解され、最終的には身体から排除されてもよい。
【0192】
「薬学的に許容される担体」は、本明細書で開示する組成物中で使用され得る任意の希釈剤、賦形剤、または担体を意味する。薬学的に許容される担体には、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、リン酸塩等の緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、プロタミン硫酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩等の塩または電解質、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス類、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が含まれる。好適な医薬用担体は、この分野における標準的な参照教科書であるRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Companyに記載されている。これらは、意図した投与の形態、すなわち経口錠剤、カプセル、エリキシル、シロップ等に関連し、従来の医薬業務と合致するように選択されてよい。
【0193】
本開示に従って使用される組成物は、投与を容易にし、投薬量を均一にするために、投薬単位形態で包装することができる。用語「単位用量」または「投薬量」は、対象における使用のために好適な物理的に離散的な単位を意味し、各単位はその投与、すなわち適切な経路およびレジメンに付随する所望の応答を産生するように計算された所定の量の組成物を含む。投与すべき量は処置の数および単位用量の両方に従い、望ましい結果および／または保護に依存する。組成物の正確な量は臨床医の判断にもより、それぞれの個体に特有である。用量に影響する因子には、対象の身体的および臨床的な状態、投与の経路、意図した処置の目標（症状の緩和と治癒）、ならびに特定の組成物の能力、安定性、および毒性が含まれる。製剤化に際しては、溶液は、投薬製剤と適合する様式で、治療的または予防的に有効な量で、投与される。製剤は、種々の投薬形態、例えば本明細書に記載した注射可能な溶液の型で容易に投与される。
【0194】
本明細書で使用される場合、用語「接触させる」は、２つまたはそれより多い分子の間の直接的または間接的な結合または相互作用を意味する。直接的相互作用の特定の例は結合である。間接的な相互作用の特定の例は、１つの実体が中間の分子に作用し、これが次に第２の参照した実体に作用する場合である。本明細書で使用される接触は、溶液中、固相中、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、細胞中、およびｉｎ ｖｉｖｏを含む。ｉｎ ｖｉｖｏにおける接触は、投与すること、または投与と称することができる。
【0195】
細胞もしくはベクターまたはその他の薬剤およびこれらを含む組成物の「投与」または「送達」は、処置の経過を通して連続的または間欠的に、１つの用量で実施することができる。最も効果的な投与の手段および投薬量を決定する方法は当業者には公知であり、治療に使用される組成物、治療の目的、処置される標的細胞、および処置される対象に応じて変動することになる。単回投与または複数回投与は、処置を施す医師または動物の場合には処置を施す獣医によって選択される用量レベルおよびパターンで行うことができる。好適な投薬製剤および薬剤を投与する方法は、当技術で公知である。投与経路を決定することもでき、最も有効な投与経路を決定する方法は当業者には公知であり、処置に使用される組成物、処置の目的、処置される対象の健康状態または疾患のステージ、および標的の細胞または組織によって変動することになる。投与経路の非限定的な例には、経口投与、腹腔内、注入、経鼻投与、吸入、注射、および局所的適用が含まれる。
【0196】
用語「投与」は、限定なく経口、非経口（例えば筋肉内、腹腔内、静脈内、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内、嚢内の注射または注入、皮下注射、またはインプラント）、吸入スプレイ経鼻、経膣、経直腸、経舌下腺、経尿道（例えば尿道坐剤）による投与または局所投与経路（例えばゲル、軟膏、クリーム、エアロゾル等）を含み、単独で、または従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、および各投与経路に適したビヒクルを含む好適な投薬単位製剤で、製剤化することができる。本開示は、投与経路、製剤、または投薬スケジュールによって限定されない。
【0197】
「投与」は、処置の経過を通して連続的または間欠的に、１つの用量で実施することができる。最も効果的な投与の手段および投薬量を決定する方法は当業者には公知であり、治療に使用される組成物、治療の目的、処置される標的細胞、および処置される対象に応じて変動することになる。単回投与または複数回投与は、処置を施す医師によって選択される用量レベルおよびパターンで行うことができる。好適な投薬製剤および薬剤を投与する方法は、当技術で公知である。投与経路を決定することもでき、最も有効な投与経路を決定する方法は当業者には公知であり、処置に使用される組成物、処置の目的、処置される対象の健康状態または疾患のステージ、および標的の細胞または組織によって変動することになる。
【0198】
本開示の薬剤は、任意の好適な投与経路による治療のために投与することができる。最適な経路はレシピエントの状態および年齢、ならびに処置される疾患によって変動することも認識されよう。
【0199】
「対象」、「個体」、または「患者」は本明細書で相互交換可能に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを意味する。哺乳動物には、それだけに限らないが、ネズミ、ラット、ウサギ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、家畜、運動動物、ペット、ウマ、および霊長類、特にヒトが含まれる。ヒトの処置に有用である他に、本開示は哺乳動物、げっ歯類を含むコンパニオン哺乳動物、外来動物、および家畜化された動物の獣医処置にも有用である。一実施形態では、哺乳動物はウマ、イヌ、およびネコを含む。本開示の別の実施形態では、ヒトは胎児、小児、思春期前の対象、青年、小児患者、または成人である。一態様では、対象は発症前の哺乳動物またはヒトである。別の態様では、対象は疾患の最小限の臨床症状を有している。対象は男性または女性、成人、新生児、または小児対象であってよい。さらなる態様では、対象は成人である。一部の例では、成人は成人のヒト、例えば年齢１８歳を超える成人のヒトである。
【0200】
「罹患している」という用語は、「処置」という用語に関連する場合、患者または個体が症候群、がんまたはウイルス感染の診断を受けているまたはその素因があることを指す。患者はまた、１つまたは複数の遺伝子突然変異を有することが原因で疾患に「罹患するリスクがある」とも称され得る。この患者には、まだ特徴的な疾患病理が発生していない。
【0201】
「有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすために十分な量である。有効量は、１回もしくは複数回の投与、適用、または投薬量で投与することができる。そのような送達は、個別の投薬単位が使用される期間、治療剤の生体利用効率、投与経路等を含むいくつかの変数に依存する。しかし、いずれかの特定の対象に対する本開示の治療剤の特定の用量レベルは、採用した特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的健康状態、性別、および食事、投与の時期、排泄速度、薬物の組合せ、および処置される特定の障害の重症度、および投与の形態を含む種々の因子に依存することが理解される。処置投薬量は、一般に安全性および有効性を最適化するために増減してよい。一般には、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ試験から得られた投薬量と効果の関連性により、患者への投与のための適当な用量に関する有用な指針が最初に提供され得る。一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて効果的であることが見いだされた濃度と釣り合う血清レベルを実現するために効果的な量の化合物を投与することが望まれる。これらのパラメータの決定は、当技術分野の技術の範囲内に十分に入る。これらの考察、ならびに効果的な製剤および投与手順は当技術分野で周知であり、標準の教本に記載されている。
【0202】
薬物または薬剤の「治療有効量」とは、受動免疫などの薬理学的反応を得るために十分な量である、薬物または薬剤の量を指す；あるいは、特定の障害または疾患を有する患者に投与した場合に、意図された効果、例えば、患者における特定の障害または疾患の１つまたは複数の兆候の処置、軽減、好転、緩和または除去を有するために十分である薬物または薬剤の量である。治療効果は、必ずしも１回用量の投与によって生じず、一連の用量を投与して初めて生じる可能性がある。したがって、治療有効量は、１回または複数回の投与で投与される場合がある。
【0203】
「別の療法」は、本明細書で使用される場合、それだけに限らないが、外科的切除、化学療法、凍結療法、放射線療法、免疫療法、および標的療法を含む。細胞増殖を低減するように作用する薬剤は当技術で公知であり、広く使用されている。がん細胞が分裂している場合にのみがん細胞を殺滅する化学療法薬物は、細胞サイクル特異的と称される。これらの薬物には、トポイソメラーゼ阻害剤および代謝拮抗剤を含む、Ｓ相で作用する薬剤が含まれる。
【0204】
トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ酵素（トポイソメラーゼＩおよびＩＩ）の作用に干渉する薬物である。化学処置のプロセスの間、トポイソメラーゼ酵素は複製のために必要なＤＮＡの構造の操作を制御し、したがって細胞サイクル特異的である。トポイソメラーゼＩ阻害剤の例には、上で列挙したカンプトテカンアナログ、イリノテカン、およびトポテカンが含まれる。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の例には、アムサクリン、エトポシド、エトポシドホスフェート、およびテニポシドが含まれる。
【0205】
代謝拮抗剤は通常、正常な代謝基質のアナログであり、染色体の複製に関与するプロセスに干渉することが多い。これらは、サイクルの極めて特異的な相で細胞を攻撃する。代謝拮抗剤には、葉酸アンタゴニスト、例えばメトトレキサート；ピリミジンアンタゴニスト、例えば５－フルオロウラシル、フォクスウリジン、シタラビン、カペシタビン、およびゲムシタビン；プリンアンタゴニスト、例えば６－メルカプトプリンおよび６－チオグアニン；アデノシンデアミナーゼ阻害剤、例えばクラドリビン、フルダラビン、ネララビン、およびペントスタチン；その他が含まれる。
【0206】
植物アルカロイドは、ある種の植物から誘導される。ビンカアルカロイドは、ニチニチソウ（Catharanthus rosea）から作られる。タキサン類はタイヘイヨウイチイ（taxus）の樹皮から作られる。ビンカアルカロイドおよびタキサン類は抗微小管剤としても知られている。ポドフィロトキシンはポドフィルム植物から誘導される。カンプトテカンアナログはアジアの「ハッピーツリー」（Camptotheca acuminata）から誘導される。ポドフィロトキシンおよびカンプトテカンアナログは、トポイソメラーゼ阻害剤としても分類されている。植物アルカロイドは一般に細胞サイクル特異的である。
【0207】
これらの薬剤の例には、ビンカアルカロイド類、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビノレルビン；タキサン類、例えばパクリタキセルおよびドセタキセル；ポドフィロトキシン類、例えばエトポシドおよびテニソピド；ならびにカンプトテカンアナログ、例えばイリノテカンおよびトポテカンが含まれる。
【0208】
凍結療法には、それだけに限らないが、温度の低下が関与する療法、例えば低体温療法が含まれる。
【0209】
放射線療法には、それだけに限らないが、当技術で知られているように、放射線、例えばイオン化放射線、ＵＶ放射線への曝露が含まれる。例示的な投与量には、それだけに限らないが、少なくとも約２Ｇｙ～約１０Ｇｙを超えない範囲のイオン化放射線の用量、および／または少なくとも約５Ｊ／ｍ２～約５０Ｊ／ｍ２を超えない範囲、通常約１０Ｊ／ｍ２の紫外放射線の用量が含まれる。
【0210】
語句「第１線」または「第２線」または「第３線」は、患者が受ける処置の順を意味する。第１線療法レジメンは最初に与えられる処置であり、第２線または第３線の療法は、それぞれ第１線療法の後または第２線療法の後で与えられる。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは、第１線療法を「疾患または状態に対する最初の処置」と定義している。がんを有する患者においては、第１次の処置は手術、化学療法、放射線療法、またはこれらの療法の組合せであってよい。第１線療法は、当業者には「第１次の療法および第１次の処置」とも称される。２００８年５月１日に最後に閲覧したＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトwww.cancer.govを参照されたい。典型的には、患者が第１線療法に対して肯定的な臨床的または準臨床的な応答を示さなかった、または第１線療法が中止されたために、患者には引き続く化学療法レジメンが与えられる。
【0211】
本開示を実施するための様式
本明細書に開示される組成物および／または方法のいくつかの有利な点が観察され、図ならびに実験方法に例示されている。これらの利点としては、これだけに限定されないが、ＮＫ細胞などの免疫細胞への遺伝子送達が効率的であること、送達された遺伝子が安定であること、細胞の拡大が上首尾であること、および形質導入された細胞の生存率が高いこと、したがって、形質導入された免疫細胞（例えば、ＣＡＲを発現する免疫細胞など）の開発および製造が容易になり、改善されることが挙げられる。
本明細書に開示される組成物および／または方法のいくつかの有利な点が観察され、図ならびに実験方法に例示されている。これらの利点としては、これだけに限定されないが、ＮＫ細胞などの免疫細胞への遺伝子送達が効率的であること、送達された遺伝子が安定であること、細胞の拡大が上首尾であること、および形質導入された細胞の生存率が高いこと、したがって、形質導入された免疫細胞（例えば、ＣＡＲを発現する免疫細胞など）の開発および製造が容易になり、改善されることが挙げられる。
【0212】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法によって調製された細胞集団のうちの少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の細胞が、ＣＡＲおよび／または別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドを発現する。様々な方法、例えば、ＣＡＲおよび／または治療用タンパク質もしくはポリペプチドを特異的に認識し、これに結合する抗体またはその抗原結合性断片を利用する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または別の免疫染色法などを使用して、そのような発現を評定することができる。
【0213】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法によって調製された細胞集団は、例えば、細胞培養物中で、ＣＡＲおよび／または別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドを、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約２８日間、少なくとも約２９日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約１カ月、少なくとも約４０日間、少なくとも約５０日間、少なくとも約６０日間、少なくとも約７０日間、少なくとも約８０日間、少なくとも約９０日間、少なくとも約１００日間、少なくとも約１２０日間、少なくとも約１５０日間、少なくとも約１８０日間またはより長くにわたって発現する。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法によって調製された細胞集団のうち少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の細胞が、例えば、細胞培養物中で、ＣＡＲおよび／または別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドを少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約２８日間、少なくとも約２９日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約１カ月、少なくとも約４０日間、少なくとも約５０日間、少なくとも約６０日間、少なくとも約７０日間、少なくとも約８０日間、少なくとも約９０日間、少なくとも約１００日間、少なくとも約１２０日間、少なくとも約１５０日間、少なくとも約１８０日間またはより長くにわたって発現する。
【0214】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法により、１×１０８個の細胞から、１×１０９個よりも多くの細胞、２×１０９個よりも多くの細胞、３×１０９個よりも多くの細胞、４×１０９個よりも多くの細胞、５×１０９個よりも多くの細胞、６×１０９個よりも多くの細胞、７×１０９個よりも多くの細胞、８×１０９個よりも多くの細胞、９×１０９個よりも多くの細胞、１×１０１０個よりも多くの細胞、２×１０１０個よりも多くの細胞、３×１０１０個よりも多くの細胞、４×１０１０個よりも多くの細胞、５×１０１０個よりも多くの細胞、６×１０１０個よりも多くの細胞、７×１０１０個よりも多くの細胞、８×１０１０個よりも多くの細胞、９×１０１０個よりも多くの細胞、１×１０１１個よりも多くの細胞、２×１０１１個よりも多くの細胞、３×１０１１個よりも多くの細胞、４×１０１１個よりも多くの細胞、５×１０１１個よりも多くの細胞、６×１０１１個よりも多くの細胞、７×１０１１個よりも多くの細胞、８×１０１１個よりも多くの細胞、９×１０１１個よりも多くの細胞、１×１０１２個よりも多くの細胞、２×１０１２個よりも多くの細胞、３×１０１２個よりも多くの細胞、４×１０１２個よりも多くの細胞、５×１０１２個よりも多くの細胞、６×１０１２個よりも多くの細胞、７×１０１２個よりも多くの細胞、８×１０１２個よりも多くの細胞、９×１０１２個よりも多くの細胞、または１×１０１３個よりも多くの細胞が生成される、またはこれに相当する。それに加えてまたはその代わりに、本明細書に開示される方法により、１×１０８個の細胞から、最大５×１０１０個の細胞、最大６×１０１０個の細胞、最大７×１０１０個の細胞、最大８×１０１０個の細胞、最大９×１０１０個の細胞、最大１×１０１１個の細胞、最大２×１０１１個の細胞、最大３×１０１１個の細胞、最大４×１０１１個の細胞、最大５×１０１１個の細胞、最大６×１０１１個の細胞、最大７×１０１１個の細胞、最大８×１０１１個の細胞、最大９×１０１１個の細胞、最大１×１０１２個の細胞、最大２×１０１２個の細胞、最大３×１０１２個の細胞、最大４×１０１２個の細胞、最大５×１０１２個の細胞、最大６×１０１２個の細胞、最大７×１０１２個の細胞、最大８×１０１２個の細胞、最大９×１０１２個の細胞、または最大１×１０１３個の細胞が生成される、またはこれに相当する。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法により、１×１０８個の細胞から、約５×１０１０個の細胞、約６×１０１０個の細胞、約７×１０１０個の細胞、約８×１０１０個の細胞、約９×１０１０個の細胞、約１×１０１１個の細胞、約２×１０１１個の細胞、約３×１０１１個の細胞、約４×１０１１個の細胞、約５×１０１１個の細胞、または約６×１０１１個の細胞が生成される、またはこれに相当する。当業者は、このような相当する状況を、生成される細胞数と最初の細胞数の両方を同じ正の数で割るまたは生成される細胞数と最初の細胞数の両方に同じ正の数を掛けることによって算出することができる。
【0215】
一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞集団の生存率は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％であり得る。例えば、ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイまたはＡＰＴ測定アッセイなど、細胞生存率を試験する多数の方法が利用可能である。
【0216】
シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子
一態様では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子が提供される。一部の実施形態では、ガンマレトロウイルス粒子は、改変ＲＤ１１４ネコ内因性レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＲＤ１１４ＴＲ）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。それに加えてまたはその代わりに、ガンマレトロウイルス粒子は、改変ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶＴＲ）を含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。さらなる実施形態では、ＲＤ１１４ＴＲ糖タンパク質は、ＲＤ１１４糖タンパク質の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびに両種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ－Ａ）糖タンパク質の細胞質ドメインを含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、ＢａＥＶＴＲ糖タンパク質は、ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびにＭＬＶ－Ａ糖タンパク質の細胞質ドメインを含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ＲＤ１１４ＴＲおよびＢａＥＶＴＲは、粒子のエンベロープに膜タンパク質として組み込まれている。
一態様では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子が提供される。一部の実施形態では、ガンマレトロウイルス粒子は、改変ＲＤ１１４ネコ内因性レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＲＤ１１４ＴＲ）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。それに加えてまたはその代わりに、ガンマレトロウイルス粒子は、改変ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶＴＲ）を含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。さらなる実施形態では、ＲＤ１１４ＴＲ糖タンパク質は、ＲＤ１１４糖タンパク質の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびに両種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ－Ａ）糖タンパク質の細胞質ドメインを含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、ＢａＥＶＴＲ糖タンパク質は、ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびにＭＬＶ－Ａ糖タンパク質の細胞質ドメインを含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ＲＤ１１４ＴＲおよびＢａＥＶＴＲは、粒子のエンベロープに膜タンパク質として組み込まれている。
【0217】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子は、エンベロープに封入されたベクターゲノムをさらに含む。さらなる実施形態では、ベクターゲノムは、２つの長いターミナルリピート（ＬＴＲ）に挟まれた、以下：（Ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／もしくは別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（Ｂ）（Ａ）のリバース相補体；または（Ｃ）１つもしくは複数の認識部位を含むポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、治療用タンパク質またはポリペプチドは、抗体もしくはその断片、酵素、リガンドまたは受容体から選択される。一部の実施形態では、認識部位は、（Ａ）および（Ｂ）のいずれかまたは両方などの目的の配列をポリヌクレオチドに挿入するための適切な制限酵素によって認識され、切断される。
【0218】
一部の実施形態では、ベクターゲノムは、以下：５’ＬＴＲ、５’キャップ、３’ポリＡ尾部、および３’ＬＴＲのうちの１つまたは複数をさらに含む。
【0219】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子は、逆転写酵素またはインテグラーゼのいずれかまたは両方をさらに含む。
【0220】
一部の実施形態では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子は、以下の種：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、フレンドマウス胚性幹細胞ウイルス（ＦＭＥＶ）、異種指向性ＭｕＬＢ関連ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）、またはネコ白血病ウイルスのうちのいずれか１つに基づくか、これらに由来するか、これらから選択される。
【0221】
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）
別の態様では、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）が本明細書に提示される。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、本明細書に開示される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）またはウイルス抗原またはその両方のうちの１つまたは複数を発現する。さらなる実施形態では、ａＡＰＣは、以下：４－１ＢＢＬ、膜結合（ｍｂ）ＩＬ－１５、ｍｂ ＩＬ－２１、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、ＭＩＣＡ、ＣＤ ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ｍｂ ＩＬ－２、ｍｂ ＩＬ－１８、ｍｂ ＩＬ－１２、ＣＤ２５結合性を欠くｍｂ ＩＬ－２変異体、ｍｂ ＩＬ－１５－Ｎ７２ＤスーパーアゴニストとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合タンパク質の複合体（ＩＬ－１５ＳＡ／ＩＬ－１５ＲαＳｕ－Ｆｃ）ＡＬＴ－８０３、またはＣＤ１２２／ＣＤ１３２シグナル伝達を媒介する細胞表面マーカーのうちの１つまたは複数を発現する。一実施形態では、ａＡＰＣは、ｍｂ ＩＬ－２１および４－１ＢＢＬをさらに発現する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるａＡＰＣは、ＮＫ細胞またはγδＴ細胞などの免疫細胞の成長を活性化および／または刺激する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および／またはウイルス抗原を発現する。
別の態様では、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）が本明細書に提示される。一部の実施形態では、ａＡＰＣは、本明細書に開示される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）またはウイルス抗原またはその両方のうちの１つまたは複数を発現する。さらなる実施形態では、ａＡＰＣは、以下：４－１ＢＢＬ、膜結合（ｍｂ）ＩＬ－１５、ｍｂ ＩＬ－２１、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、ＭＩＣＡ、ＣＤ ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ｍｂ ＩＬ－２、ｍｂ ＩＬ－１８、ｍｂ ＩＬ－１２、ＣＤ２５結合性を欠くｍｂ ＩＬ－２変異体、ｍｂ ＩＬ－１５－Ｎ７２ＤスーパーアゴニストとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合タンパク質の複合体（ＩＬ－１５ＳＡ／ＩＬ－１５ＲαＳｕ－Ｆｃ）ＡＬＴ－８０３、またはＣＤ１２２／ＣＤ１３２シグナル伝達を媒介する細胞表面マーカーのうちの１つまたは複数を発現する。一実施形態では、ａＡＰＣは、ｍｂ ＩＬ－２１および４－１ＢＢＬをさらに発現する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるａＡＰＣは、ＮＫ細胞またはγδＴ細胞などの免疫細胞の成長を活性化および／または刺激する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および／またはウイルス抗原を発現する。
【0222】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、操作されたＫ５６２細胞である。
【0223】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、細胞増殖を欠く、および／または長期生存を欠く。細胞増殖および長期生存は、当業者が、例えば、培養および生細胞の計数によって評価することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるａＡＰＣは、約５日間より長く、約７日間より長く、約１０日間より長く、約１４日間より長く、約１５日間より長く、約２１日間より長くまたは約３０日間より長くは実質的に生存しない。
【0224】
一部の実施形態では、ａＡＰＣを、細胞増殖を阻害し、かつ／または長期生存を低減させるために照射処理する。さらなる実施形態では、ａＡＰＣを、５０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、６０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、７０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、７５Ｇｙまたはこれよりも高い線量、８０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、９０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、１００Ｇｙまたはこれよりも高い線量、１１０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、１２０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、１３０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、１４０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、１５０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、１６０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、１７０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、１８０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、１９０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、２００Ｇｙまたはこれよりも高い線量、２１０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、２２０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、２３０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、２４０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、２５０Ｇｙまたはこれよりも高い線量、および／または３００Ｇｙまたはこれよりも高い線量で照射処理する。それに加えてまたはその代わりに、ａＡＰＣを、１０００Ｇｙまたはこれよりも低い線量、９００Ｇｙまたはこれよりも低い線量、８００Ｇｙまたはこれよりも低い線量、７００Ｇｙまたはこれよりも低い線量、６００Ｇｙまたはこれよりも低い線量、５００Ｇｙまたはこれよりも低い線量、４００Ｇｙまたはこれよりも低い線量、３５０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、３００Ｇｙまたはこれよりも低い線量、２５０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、２４０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、２３０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、２２０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、２１０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、２００Ｇｙまたはこれよりも低い線量、１９０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、１８０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、１７０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、１６０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、１５０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、１４０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、１３０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、１２０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、１１０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、１００Ｇｙまたはこれよりも低い線量、９０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、８０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、７０Ｇｙまたはこれよりも低い線量、または６０Ｇｙまたはこれよりも低い線量で照射処理する。一部の実施形態では、ａＡＰＣを、これだけに限定されないが、約５０Ｇｙ～約１００Ｇｙ、約５０Ｇｙ～約１５０Ｇｙ、約５０Ｇｙ～約２００Ｇｙ、約５０Ｇｙ～約２５０Ｇｙ、約１００Ｇｙ～約１５０Ｇｙ、約１００Ｇｙ～約２００Ｇｙ、約１００Ｇｙ～約１５０Ｇｙ、約１５０Ｇｙ～約２００Ｇｙ、約１５０Ｇｙ～約２５０Ｇｙ、約２００Ｇｙ～約２５０Ｇｙを含めた、約５０Ｇｙ～約３００Ｇｙで照射処理する。さらなる実施形態では、ａＡＰＣを、約５０Ｇｙ、約１００Ｇｙ、約１５０Ｇｙまたは約２００Ｇｙで照射処理する。一部の実施形態では、照射処理は、ａＡＰＣを免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞および／もしくはγδＴ細胞のうちの１つもしくは複数など）またはその細胞集団と一緒に培養する前に実施される。
【0225】
ＮＫの感染および拡大
さらなる態様では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を調製するための方法が提示される。方法は、以下：ＮＫ細胞、ＮＫ細胞の誘導が可能な前駆細胞、またはＮＫ細胞の誘導が可能な幹細胞のうちの１つまたは複数を含む細胞集団を、免疫細胞活性化因子（例えば、ＮＫ細胞活性化因子など）と一緒に培養するステップを含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、細胞集団は、細胞集団中のＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖、ＴＣＲ β鎖、またはαβＴＣＲのうちの１つまたは複数を発現する細胞が枯渇したものである。
さらなる態様では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を調製するための方法が提示される。方法は、以下：ＮＫ細胞、ＮＫ細胞の誘導が可能な前駆細胞、またはＮＫ細胞の誘導が可能な幹細胞のうちの１つまたは複数を含む細胞集団を、免疫細胞活性化因子（例えば、ＮＫ細胞活性化因子など）と一緒に培養するステップを含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、細胞集団は、細胞集団中のＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖、ＴＣＲ β鎖、またはαβＴＣＲのうちの１つまたは複数を発現する細胞が枯渇したものである。
【0226】
本明細書のいずれかの開示に関する一部の実施形態では、免疫細胞活性化因子（例えば、ＮＫ細胞活性化因子など）は、以下：必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／または刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および／またはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）；ＮＫ細胞、前駆細胞または幹細胞のうちの１つまたは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってＮＫ細胞を活性化するまたは増殖させる抗体またはその抗原結合性断片のうちの１つまたは複数；それによってＮＫ細胞を活性化するまたは増殖させるサイトカインのうちの１つまたは複数；および／または、必要に応じて、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤またはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）から選択される、それによってＮＫ細胞を活性化するまたは増殖させる化学的部分のうちの１つまたは複数のうちの１つまたは複数から選択される。
【0227】
一部の実施形態では、刺激性受容体は、以下：ＣＤ２、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）、２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４、ＣＤ２４４）、ＮＴＢ－Ａ（ＳＬＡＭファミリーメンバー６、ＳＬＡＭＦ６）、および／またはＮＫｐ４６のうちの１つまたは複数である。例えば、Zamai L, Del Zotto G, Buccella F, et al. Understanding the Synergy of NKp46 and Co-Activating Signals in Various NK Cell Subpopulations: Paving the Way for More Successful NK-Cell-Based Immunotherapy. Cells. 2020; 9 (3): 753. Published 2020 Mar 19. doi: 10.3390/cells9030753を参照されたい。
【0228】
一部の実施形態では、ａＡＰＣは、本明細書に開示されるａＡＰＣである。一部の実施形態では、ａＡＰＣを、細胞集団と一緒に、細胞数の比（細胞集団中のａＡＰＣの細胞数：細胞集団の細胞数および／またはａＡＰＣの細胞数：免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞および／またはγδＴ細胞のうちの１つまたは複数など）の細胞数）を約１００：１またはこれよりも大きい比、約５０：１またはこれよりも大きい比、約２０：１またはこれよりも大きい比、約１０：１またはこれよりも大きい比、約９：１またはこれよりも大きい比、約９：１またはこれよりも大きい比、約８：１またはこれよりも大きい比、約７：１またはこれよりも大きい比、約６：１またはこれよりも大きい比、約５：１またはこれよりも大きい比、約４：１またはこれよりも大きい比、約３：１またはこれよりも大きい比、約２：１またはこれよりも大きい比、約１：１またはこれよりも大きい比、約１：２またはこれよりも大きい比、約１：３またはこれよりも大きい比、約１：４またはこれよりも大きい比、約１：５またはこれよりも大きい比、約１：６またはこれよりも大きい比、約１：７またはこれよりも大きい比、約１：８またはこれよりも大きい比、約１：９またはこれよりも大きい比、約１：１０またはこれよりも大きい比、約１：２０またはこれよりも大きい比、約１：５０またはこれよりも大きい比、または約１：１００またはこれよりも大きい比として培養する。それに加えてまたはその代わりに、ａＡＰＣを、細胞集団と一緒に、細胞数の比（細胞集団中のａＡＰＣの細胞数：細胞集団の細胞数および／またはａＡＰＣの細胞数：免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞および／またはγδＴ細胞のうちの１つまたは複数など）の細胞数）を、約１００：１またはこれよりも小さい比、約５０：１またはこれよりも小さい比、約２０：１またはこれよりも小さい比、約１０：１またはこれよりも小さい比、約９：１またはこれよりも小さい比、約９：１またはこれよりも小さい比、約８：１またはこれよりも小さい比、約７：１またはこれよりも小さい比、約６：１またはこれよりも小さい比、約５：１またはこれよりも小さい比、約４：１またはこれよりも小さい比、約３：１またはこれよりも小さい比、約２：１またはこれよりも小さい比、約１：１またはこれよりも小さい比、約１：２またはこれよりも小さい比、約１：３またはこれよりも小さい比、約１：４またはこれよりも小さい比、約１：５またはこれよりも小さい比、約１：６またはこれよりも小さい比、約１：７またはこれよりも小さい比、約１：８またはこれよりも小さい比、約１：９またはこれよりも小さい比、約１：１０またはこれよりも小さい比、約１：２０またはこれよりも小さい比、約１：５０またはこれよりも小さい比、または約１：１００またはこれよりも小さい比として培養する。一部の実施形態では、ａＡＰＣを、細胞集団と一緒に、細胞数の比（細胞集団中のａＡＰＣの細胞数：細胞集団の細胞数および／またはａＡＰＣの細胞数：免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞および／またはγδＴ細胞のうちの１つまたは複数など）の細胞数）を約１０：１～約１：１０、約５：１～約１：５、約３：１～約１：３、約２：１～約１：２として培養する。一部の実施形態では、ａＡＰＣを、細胞集団と一緒に、細胞数の比（細胞集団中のａＡＰＣの細胞数：細胞集団の細胞数および／またはａＡＰＣの細胞数：免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞および／またはγδＴ細胞のうちの１つまたは複数など）の細胞数）を約１０：１、約５：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、または約１：１０として培養する。
【0229】
一部の実施形態では、サイトカインは、Ｂ７．１、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、低毒性ＩＬ－２、ＣＤ２５結合性を欠くＩＬ－２変異体、ＩＬ－７、ＩＬ－１５－Ｎ７２ＤスーパーアゴニストとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合タンパク質の複合体（ＩＬ－１５ＳＡ／ＩＬ－１５ＲαＳｕ－Ｆｃ；可溶性ＡＬＴ－８０３）、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＬＥＣ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、またはＭＩＣＡからなる群から選択される。
【0230】
一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。さらなる実施形態では、細胞集団を、約１ＩＵ／ｍＬ～約１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２と一緒に培養する。一部の実施形態では、細胞集団を、約１ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約２ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約３ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約５ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約１０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約２０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約３０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約４０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約５０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約６０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約７０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約８０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約９０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約１００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約１１０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約１２０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約１３０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約１４０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約１５０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約１６０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約１７０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約１８０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約１９０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約２００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約２５０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約３００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約４００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約５００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約６００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約７００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約８００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、約９００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多く、または約１０００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも多くのＩＬ２と一緒に培養する。それに加えてまたはその代わりに、細胞集団を、約２０００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約１５００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約１０００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約９００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約８００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約７００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約６００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約５００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約４００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約３００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約２５０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約２００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約１００ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約９０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約８０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約７０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約６０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約５０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約４０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約３０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約２０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約１０ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ない、約５ＩＵ／ｍＬまたはこれよりも少ないＩＬ２と一緒に培養する。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２を含む。さらなる実施形態では、細胞集団を、これだけに限定されないが、約１０ＩＵ／ｍｌ～約１００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ～２００ＩＵ／ｍｌ、約２００ＩＵ／ｍｌ～約３００ＩＵ／ｍｌ、約３００ＩＵ／ｍｌ～約４００ＩＵ／ｍｌ、約４００～約５００ＩＵ／ｍｌ、約１００ＩＵ／ｍｌ～約５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２を含め、約１ＩＵ／ｍＬ～約１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２と一緒に培養する。一部の実施形態では、細胞集団を、約１０ＩＵ／ｍＬ、約２０ＩＵ／ｍＬ、約３０ＩＵ／ｍＬ、約４０ＩＵ／ｍＬ、約５０ＩＵ／ｍＬ、約６０ＩＵ／ｍＬ、約７０ＩＵ／ｍＬ、約８０ＩＵ／ｍＬ、約９０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１１０ＩＵ／ｍＬ、約１２０ＩＵ／ｍＬ、約１３０ＩＵ／ｍＬ、約１４０ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約１６０ＩＵ／ｍＬ、約１７０ＩＵ／ｍＬ、約１８０ＩＵ／ｍＬ、約１９０ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約２５０ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約５００ＩＵ／ｍＬ、約６００ＩＵ／ｍＬ、約７００ＩＵ／ｍＬ、約８００ＩＵ／ｍＬ、約９００ＩＵ／ｍＬ、または約１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２と一緒に培養する。
【0231】
一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１５を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。さらなる実施形態では、細胞集団を、この中に入るあらゆる範囲および／または数を含め、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＩＬ１５と一緒に培養する。一部の実施形態では、細胞集団を、これだけに限定されないが、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～約４０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１５を含め、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ１５と一緒に培養する。一部の実施形態では、細胞集団を、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、または約１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ１５と一緒に培養する。
【0232】
一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２１を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。さらなる実施形態では、細胞集団を、この中に入るあらゆる範囲および／または数を含め、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＩＬ２１と一緒に培養する。一部の実施形態では、細胞集団を、これだけに限定されないが、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～約４０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ２１を含め、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ２１と一緒に培養する。一部の実施形態では、細胞集団を、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約４５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約５５ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約６５ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、または約１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ２１と一緒に培養する。
【0233】
一部の実施形態では、細胞集団を、１種よりも多くのサイトカイン、例えば、本明細書に開示されるサイトカインの組合せと一緒に培養する。一部の実施形態では、細胞集団を、１００～５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５、または２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１のうちのいずれか１つまたはいずれか２つまたは３つ全てと一緒に培養する。さらなる実施形態では、細胞集団を、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２および０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５のいずれかまたは両方と一緒に培養する。
【0234】
一部の実施形態では、化学的部分を免疫細胞活性化因子（例えば、ＮＫ活性化因子）として使用することもでき、例えば、ＡＤＡＭ１７の阻害剤を用いた処理により、ＣＤ１６受容体の脱落が防止されることによってＮＫ細胞によるＡＤＣＣが強化され、また、ＮＫ細胞をニコチンアミドで処理することにより、細胞輸送に必須であることが公知であるＬ－セレクチンのＮＫ細胞による発現が増強されることが示されている。例えば、Peled et al., Blood (2017) 130 (Supplement 1): 657およびChilds RW, Carlsten M. Nat Rev Drug Discov. 2015; 14 (7): 487-498を参照されたい。さらなる例は、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、および／またはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）である。
【0235】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＣＡＲおよび／または別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、発現させるために、培養された細胞集団に導入するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および／またはウイルス抗原を特異的に認識し、これに結合する。さらなる実施形態では、ＣＡＲが認識し、結合する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および／またはウイルス抗原は、ａＡＰＣによって発現されるものである。一部の実施形態では、治療用タンパク質またはポリペプチドは、抗体もしくはその断片、酵素、リガンドまたは受容体から選択される。
【0236】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、導入するステップの前および／またはその後に、細胞集団を免疫細胞活性化因子（例えば、ＮＫ細胞活性化因子など）と一緒に培養するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、培養するステップを、同じまたは異なる免疫細胞活性化因子（例えば、ＮＫ細胞活性化因子など）またはこれらの組合せを用いて１回、２回、３回、またはこれよりも多く繰り返す。
【0237】
一部の実施形態では、導入するステップの前後に活性化因子を細胞集団と一緒に培養する。さらなる実施形態では、導入するステップの前後に細胞集団と一緒に培養する活性化因子の２つは同じである。一部の実施形態では、導入するステップの前後に細胞集団と一緒に培養する活性化因子の２つは互いに異なる。
【0238】
方法の一部の実施形態は、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を培養された細胞集団に導入し、それによって本明細書に開示されるＣＡＲおよび／または別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを培養された細胞集団に導入するステップを含む。一部の実施形態では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子は本明細書に開示される。一部の実施形態では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子は、本明細書に開示されるＣＡＲおよび／または別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはそのリバース相補体を含む。さらなる実施形態では、コードするポリヌクレオチドおよび／またはそのリバース相補体は、２つの長いターミナルリピート（ＬＴＲ）に挟まれている。それに加えてまたはその代わりに、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子は、本明細書に開示されるＲＤ１１４ＴＲおよび／またはＢａＥＶＴＲを含む。一部の実施形態では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子は、５’ＬＴＲ、５’キャップ、コードするポリヌクレオチドまたはそのリバース相補体、３’ポリＡ尾部、および３’ＬＴＲを含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるベクターゲノムを含む。さらなる実施形態では、本明細書に開示される成分は、ベクターゲノムにおいて、５’から３’に位置する。一部の実施形態では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子は、逆転写酵素およびインテグラーゼのいずれかまたは両方をさらに含む。一部の実施形態では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、フレンドマウス胚性幹細胞ウイルス（ＦＭＥＶ）、異種指向性ＭｕＬＢ関連ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）およびネコ白血病ウイルスのうちの任意の種に基づく、および／またはこれらに由来する、および／またはこれらから選択される。
【0239】
一部の実施形態では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を、培養された細胞集団に、この中に入るあらゆる範囲および／または数を含め、約０．０１～約１００の感染多重度（ＭＯＩ）で導入する。一部の実施形態では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を、培養された細胞集団に、約０．１～約１０、約０．２～約５、約１～約１０、または約１～約５のＭＯＩで導入する。一部の実施形態では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を、培養された細胞集団に、約０．１、約０．２、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９または約１０のＭＯＩで導入する。
【0240】
一部の実施形態では、細胞集団を、導入するステップの前に少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、または少なくとも約１０日間にわたって培養する。それに加えてまたはその代わりに、細胞集団を、導入するステップの前に７日間以下、８日間以下、９日間以下、１０日間以下、１１日間以下、１２日間以下、１３日間以下、１４日間以下、１５日間以下、３週間以下、または１カ月以下にわたって培養する。一部の実施形態では、細胞集団を、導入するステップの前に、この中に入るあらゆる範囲および／または数を含め、約１日間～約１８０日間にわたって培養する。一部の実施形態では、細胞集団を、導入するステップの前に、約５日間～約１０日間、例えば、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、または約１０日間などにわたって培養する。
【0241】
一部の実施形態では、コードするポリヌクレオチドを、細胞集団に、コードするポリヌクレオチドまたはそのリバース相補体を含むウイルスベクターをＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎの存在下で形質導入することによって導入する。一部の実施形態では、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎは、細胞集団への形質導入を行う容器の内部表面にコーティングされている。さらなる実施形態では、容器は、細胞培養に適したバッグである。さらなる実施形態では、容器は、細胞培養に適したプレートである。別の実施形態では、容器は、細胞培養に適したフラスコである。一部の実施形態では、細胞集団は、インテグリンα４β１（ＶＬＡ－４）およびインテグリンα５β１（ＶＬＡ－５）のいずれかまたは両方を発現する。
【0242】
一部の実施形態では、細胞集団を対象の生体試料（例えば、血液試料など）から単離する。一部の実施形態では、細胞集団は、対象の臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、対象の末梢血、または対象の骨髄のうちの１つまたは複数から単離される。一部の実施形態では、細胞集団は、前駆細胞、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来細胞、胚性生殖細胞、胚性生殖細胞由来細胞、幹細胞、幹細胞由来細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または不死化細胞を含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、またはさらにはこれらからなる。
【0243】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、細胞集団中の、ＣＤ５６、ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ２１２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１８、ＣＤ３６０、ＴＧＦ－βＲ、またはＩＬ－１０Ｒのうちの任意の１つまたは複数を発現する細胞を富化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＣＤ５６ｄｉｍ細胞を富化させる、誘導するおよび／または生成するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、ＣＤ５６ｄｉｍ細胞は、Ｄ５６表面抗原を低密度に発現し、細胞傷害機能に特化している。それに加えてまたはその代わりに、本明細書に開示される方法は、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞を富化させる、誘導するおよび／または生成するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞は、ＣＤ５６表面抗原を高密度に発現し、サイトカイン分泌に特化している。例えば、Jacobs et al. Eur J Immunol. 2001 Oct; 31 (10): 3121-7を参照されたい。一部の実施形態では、細胞集団は、末梢血ＮＫ細胞および／または臍帯血ＮＫ細胞を含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、末梢血ＮＫ細胞および／または臍帯血ＮＫ細胞は、ＮＣＲ、ＣＤ５６、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ１６、ＩＬ－２Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＫＩＲＳ、ＣＤ８、ＣＤ５７、接着分子、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、および／またはＮＫＧ２Ａのうちの任意の１つまたは複数を発現する。さらなる実施形態では、末梢血ＮＫ細胞および／または臍帯血ＮＫ細胞の発現レベルは異なる。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、細胞集団中の、ＮＣＲ、ＣＤ５６、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ１６、ＩＬ－２Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＫＩＲＳ、ＣＤ８、ＣＤ５７、接着分子、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、および／またはＮＫＧ２Ａのうちの任意の１つまたは複数を発現する細胞を富化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、細胞集団中の、末梢血ＮＫ細胞および／または臍帯血ＮＫ細胞を富化させるステップをさらに含む。
【0244】
一部の実施形態では、任意のステップおよび／または実施形態および／または態様の細胞集団は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはその実質的に精製された組成物を含み得るか、あるいは本質的にこれからなり得るか、さらにこれからなり得る。
【0245】
一部の実施形態では、任意のステップおよび／または実施形態および／または態様の細胞集団（例えば、枯渇を有する細胞集団など）は、以下：ＮＫ細胞、前駆細胞、ＨＳＣ、ｉＰＳＣまたはそのそれぞれの実質的に精製された集団のうちの１つまたは複数を含み得るか、あるいは本質的にこれらからなり得るか、さらにこれらからなり得る。
【0246】
一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、以下：前駆細胞、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来細胞、胚性生殖細胞、胚性生殖細胞由来細胞、幹細胞、幹細胞由来細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または不死化細胞のうちの１つまたは複数から誘導されたものを含み得るか、あるいは本質的にこれらからなり得るか、さらにこれらからなり得る。
【0247】
一部の実施形態では、前駆細胞、ＨＳＣ、またはｉＰＳＣのうちの１つまたは複数は、ＮＫ細胞の誘導が可能なものである。
【0248】
一部の実施形態では、任意のステップおよび／または実施形態および／または態様の細胞集団は、Ｔ細胞を実質的に含まない。一部の実施形態では、任意のステップおよび／または実施形態および／または態様の細胞集団は、Ｔ制御細胞を実質的に含まない。
【0249】
本明細書に開示される方法の一部の実施形態は、細胞集団を単離する、富化させるおよび／または精製するステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、任意のステップおよび／または実施形態および／または態様の細胞集団は、単離、富化または精製されたものである。
【0250】
一部の実施形態では、培養するステップにおいて、細胞集団およびａＡＰＣは、ＳｔｅｍＳｐａｎ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ＃０９９６０）；ＮＫ ＭＡＣＳ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０－１１４－４２９；ＧＭＰ：１７０－０７６－３５６）、ＴｅｘＭＡＣＳ（１７０－０７６－３０６ ＧＭＰ培地）、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＣＧＭ、＃２０８０６－０５００）、またはＳｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＸＦ Ｍｅｄｉｕｍから選択される細胞培養培地中で培養される。
【0251】
本明細書に開示される方法の一部の実施形態は、ＣＡＲを発現するものなどの、本明細書に開示される細胞集団を組成物として製剤化するステップ；および／またはＣＡＲを発現するものなどの、本明細書に開示される細胞集団を組成物として凍結保存するステップのいずれかまたは両方をさらに含む。
【0252】
本明細書に開示される方法の一部の実施形態は、ステップのうちの１つまたは複数の前またはその後に、細胞集団を洗浄するステップと、および／またはステップのうちの１つまたは複数の前またはその間またはその後に、以下：（ｉ）細胞集団の生存率；（ｉｉ）細胞集団の無菌性；（ｉｉｉ）細胞集団中のマイコプラズマ；（ｉｖ）細胞集団のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型；（ｖ）細胞集団の細胞数；（ｖｉ）細胞集団の細胞表現型；（ｖｉｉ）細胞集団または細胞集団を含む組成物中のＨＨＶ６またはＨＨＶ７またはその両方；（ｖｉｉｉ）細胞集団または細胞集団を含む組成物中の１型および２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｉ型およびＩＩ型ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＣＭＶ、ジカ、ウエストナイル、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍのうちの１つまたは複数；（ｉｘ）ａＡＰＣの細胞表現型；（ｘ）細胞集団を含む組成物中のＩＬ－１５レベル；（ｘｉ）細胞集団中のＣＡＲの発現；（ｘｉｉ）細胞集団または細胞集団を含む組成物中の内毒素；（ｘｉｉｉ）細胞集団を含む組成物の残留腫瘍負荷および／またはａＡＰＣによる夾雑；（ｘｉｖ）細胞集団の効力；（ｘｖ）細胞集団によって放出されるＩＦＮ－γ、ＩＬ－１５およびＴＮＦ－アルファ；（ｘｖｉ）細胞集団の細胞傷害活性；（ｘｖｉｉ）細胞集団の脱顆粒；ならびに（ｘｖｉｉｉ）培養物についての以下：細胞凝集、グルコース、または乳酸のうちの１つまたは複数のモニタリングまたは決定、のうちの１つまたは複数を検出するステップとのいずれかまたは両方をさらに含む。さらなる実施形態では、表現型の検出は、細胞集団（例えば、ａＡＰＣおよび／または免疫細胞）によって発現される、以下：ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ１９などの抗原、ＣＤ４５、ＨＬＡ、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ１６、ＩＬ－２Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＫＩＲＳ、ＣＤ８、ＣＤ５７、接着分子、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ１０７ａ、ＣＡＲ、または細胞表面マーカーのうちの１つまたは複数の細胞での発現および／または発現レベルを検出することを含む。
【0253】
γδＴ細胞の感染および拡大
さらなる態様では、γδＴ細胞の集団を調製するための方法が提供される。方法は、以下：γδＴ細胞、γδＴ細胞の誘導が可能な前駆細胞、またはγδＴ細胞の誘導が可能な幹細胞のうちの１つまたは複数を含む細胞集団を、免疫細胞活性化因子（例えば、γδＴ細胞活性化因子など）と一緒に培養するステップを含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、細胞集団は、細胞集団中の、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖、ＴＣＲ β鎖、またはαβＴＣＲのうちの１つまたは複数を発現する細胞が枯渇したものである。
さらなる態様では、γδＴ細胞の集団を調製するための方法が提供される。方法は、以下：γδＴ細胞、γδＴ細胞の誘導が可能な前駆細胞、またはγδＴ細胞の誘導が可能な幹細胞のうちの１つまたは複数を含む細胞集団を、免疫細胞活性化因子（例えば、γδＴ細胞活性化因子など）と一緒に培養するステップを含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、細胞集団は、細胞集団中の、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖、ＴＣＲ β鎖、またはαβＴＣＲのうちの１つまたは複数を発現する細胞が枯渇したものである。
【0254】
一部の実施形態では、免疫細胞活性化因子（例えば、γδＴ細胞活性化因子など）は、以下：必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／もしくは刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および／もしくはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、γδＴ細胞、前駆細胞もしくは幹細胞のうちの１つもしくは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させる抗体もしくはその抗原結合性断片のうちの１つもしくは複数、それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させるサイトカインのうちの１つもしくは複数、または、必要に応じて、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤もしくはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）から選択される、それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させる化学的部分のうちの１つもしくは複数のうちの１つまたは複数から選択される。
【0255】
本明細書に開示される方法の一部の実施形態は、ＣＡＲおよび／または別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、発現させるために、培養された細胞集団に導入するステップをさらに含む。一部の実施形態では、治療用タンパク質またはポリペプチドは、抗体もしくはその断片、酵素、リガンドまたは受容体から選択される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および／またはウイルス抗原を特異的に認識し、これに結合する。さらなる実施形態では、ＣＡＲが認識し、結合する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および／またはウイルス抗原は、ａＡＰＣ上に発現されるものである。
【0256】
本明細書に開示される方法の一部の実施形態は、細胞集団を、導入するステップの後に、免疫細胞活性化因子（例えば、γδＴ細胞活性化因子など）またはこれらの組合せと一緒に培養するステップをさらに含む。一部の実施形態では、培養するステップを、同じまたは異なる活性化因子を用いて１回、２回、３回、またはこれよりも多く繰り返す。
【0257】
一部の実施形態では、任意のステップおよび／または実施形態および／または態様の細胞集団は、以下：γδＴ細胞またはその実質的に精製された組成物のうちの１つまたは複数を含み得るか、あるいは本質的にこれからなり得るか、さらにこれからなり得る。一部の実施形態では、任意のステップおよび／または実施形態および／または態様の細胞集団（例えば、本明細書に開示される枯渇を有する細胞集団など）は、以下：γδＴ細胞、ＨＳＣ、ｉＰＳＣまたはそのそれぞれの実質的に精製された集団のうちの１つまたは複数を含み得るか、あるいは本質的にこれからなり得るか、さらにこれからなり得る。
【0258】
一部の実施形態では、前駆細胞、ＨＳＣ、またはｉＰＳＣのうちの１つまたは複数は、γδＴ細胞の誘導が可能なものである。一部の実施形態では、γδ Ｔ細胞は、以下：前駆細胞、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来細胞、胚性生殖細胞、胚性生殖細胞由来細胞、幹細胞、幹細胞由来細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または不死化細胞のうちの１つまたは複数から誘導されたものを含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、細胞集団は、ＴＣＲ α鎖またはＴＣＲ β鎖を発現する細胞を実質的に含まない。
【0259】
抗原およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書に開示されるいずれかの態様の一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、以下またはそのそれぞれの断片のうちの１つまたは複数から選択される：Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９）、ＥＧＦＲ、野生型上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲｗｔ）、上皮細胞増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、ＦＬＴ３、ＣＤ７０、メソテリン、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１３３、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣＬ１）、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、ＣＤ５、インターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ１３Ｒａ２）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、腫瘍関連糖タンパク質－７２（ＴＡＧ－７２）、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）、がん／精巣（ＣＴ）、ＣＤ３３、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、上皮細胞接着分子前駆体（ＥｐＣａｍまたはＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－１１Ｒα、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＳＳ２１、血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ムチン１（Ｍｕｃ１）、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、エフリンタイプＡ受容体２前駆体（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、タイ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サービビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ＦＣＲＬ５、またはＩＧＬＬ１。
本明細書に開示されるいずれかの態様の一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、以下またはそのそれぞれの断片のうちの１つまたは複数から選択される：Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９）、ＥＧＦＲ、野生型上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲｗｔ）、上皮細胞増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、ＦＬＴ３、ＣＤ７０、メソテリン、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１３３、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣＬ１）、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、ＣＤ５、インターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ１３Ｒａ２）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、腫瘍関連糖タンパク質－７２（ＴＡＧ－７２）、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）、がん／精巣（ＣＴ）、ＣＤ３３、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、上皮細胞接着分子前駆体（ＥｐＣａｍまたはＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－１１Ｒα、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＳＳ２１、血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ムチン１（Ｍｕｃ１）、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、エフリンタイプＡ受容体２前駆体（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、タイ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サービビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ＦＣＲＬ５、またはＩＧＬＬ１。
【0260】
本明細書に開示されるいずれかの態様の一部の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲは、（１）抗原を特異的に認識し、これに結合する抗体の抗原結合性ドメイン；（２）ヒンジドメイン；（３）膜貫通ドメイン；および（４）シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ＣＡＲは、シグナルペプチドをさらに含む。
【0261】
本明細書に開示されるいずれかの態様の一部の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、以下：Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９）、ＥＧＦＲ、野生型上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲｗｔ）、上皮細胞増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、ＦＬＴ３、ＣＤ７０、メソテリン、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１３３、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣＬ１）、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、ＣＤ５、インターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ１３Ｒａ２）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、腫瘍関連糖タンパク質－７２（ＴＡＧ－７２）、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）、がん／精巣（ＣＴ）、ＣＤ３３、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、上皮細胞接着分子前駆体（ＥｐＣａｍまたはＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－１１Ｒα、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＳＳ２１、血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ムチン１（Ｍｕｃ１）、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、エフリンタイプＡ受容体２前駆体（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、タイ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サービビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ＦＣＲＬ５、またはＩＧＬＬ１のうちの１つまたは複数を特異的に認識し、これに結合する。
【0262】
本明細書に開示されるいずれかの態様の一部の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、以下：Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９）、ＥＧＦＲ、野生型上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲｗｔ）、上皮細胞増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、ＦＬＴ３、ＣＤ７０、メソテリン、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１３３、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣＬ１）、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、ＣＤ５、インターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ１３Ｒａ２）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、腫瘍関連糖タンパク質－７２（ＴＡＧ－７２）、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）、がん／精巣（ＣＴ）、ＣＤ３３、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、上皮細胞接着分子前駆体（ＥｐＣａｍまたはＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－１１Ｒα、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＳＳ２１、血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ムチン１（Ｍｕｃ１）、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、エフリンタイプＡ受容体２前駆体（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、タイ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サービビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ＦＣＲＬ５、またはＩＧＬＬ１のうちの１つまたは複数を特異的に認識し、これに結合する抗体の６つのＣＤＲを含む。
【0263】
本明細書に開示されるいずれかの態様の一部の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、抗ＥＧＦＲｗｔおよび抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ抗体、抗ＦＬＴ３抗体、抗ＢＣＭＡ抗体および／または抗ＣＳ１抗体から選択される抗体またはそのそれぞれの断片の６つのＣＤＲを含む。
【0264】
一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインを含む。
【0265】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。
【0266】
一部の実施形態では、細胞内ドメインは、（１）１つもしくは２つもしくはそれより多い共刺激シグナル伝達領域、または（２）ＪＡＫ－ＳＴＡＴ活性化ドメインを含むＩＬ２Ｒβもしくはその断片、または（１）および（２）の両方をさらに含む。さらなる実施形態では、共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域または４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域またはその両方を含む。
【0267】
一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
【0268】
一部の実施形態では、導入されたポリヌクレオチドは、１つまたは複数のサイトカインおよび抗体をさらに発現する、または、方法は、サイトカインおよび／または抗体の１つまたは複数を発現する別のポリヌクレオチドを、枯渇を有する細胞集団に導入するステップをさらに含む。
【0269】
さらなる実施形態では．ポリヌクレオチドによって発現されるサイトカインは、以下：Ｂ７．１（可溶性または膜結合）、ＣＣＬ１９（可溶性または膜結合）、ＣＣＬ２１（可溶性または膜結合）、ＣＤ４０Ｌ（可溶性または膜結合）、ＣＤ１３７Ｌ（可溶性または膜結合）、ＧＩＴＲＬ（可溶性または膜結合）、ＧＭ－ＣＳＦ（可溶性または膜結合）、ＩＬ－１２（可溶性または膜結合）、ＩＬ－２（可溶性または膜結合）、低毒性ＩＬ－２（可溶性または膜結合）、ｃｄ２５結合性を欠くＩＬ－２類似体（可溶性または膜結合）、ＩＬ－１５－Ｎ７２ＤスーパーアゴニストとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合タンパク質（可溶性または膜結合）、ＩＬ－１５（可溶性または膜結合）、ＩＬ－１８（可溶性または膜結合）、ＩＬ－２１（可溶性または膜結合）、ＬＥＣ（可溶性または膜結合）、ＯＸ４０Ｌ（可溶性または膜結合）、ＩＬ－７（可溶性または膜結合）、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１、可溶性または膜結合）、またはＭＩＣＡ（可溶性または膜結合）のうちの１つまたは複数から選択される。
【0270】
それに加えてまたはその代わりに、ポリヌクレオチドによって発現される抗体は、単一特異性抗体、または二特異性抗体、または多特異性抗体である。それに加えてまたはその代わりに、ポリヌクレオチドによって発現される抗体は、ＮＫ細胞活性化因子などの免疫細胞活性化因子である。
【0271】
一部の実施形態では、調製されるＣＡＲ発現細胞集団は、がん細胞の成長を阻害するために適したものであり、抗原は、がん細胞によって発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。
【0272】
コードするポリヌクレオチドおよびベクター
一部の実施形態では、ＣＡＲおよび／または治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（本明細書ではコードするポリヌクレオチドとも称される）は、シグナルペプチドをさらにコードする。それに加えてまたはその代わりに、ＣＡＲおよび／または治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、自殺遺伝子をさらに含む。さらなる実施形態では、自殺遺伝子産物は、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシルエステラーゼ、シトクロムＰ４５０もしくはＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）、切断型ＥＧＦＲ、または誘起可能なカスパーゼ（「ｉＣａｓｐ」）の１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、コードするポリヌクレオチドは、自殺遺伝子の発現を方向付ける制御配列をさらに含む。さらなる実施形態では、制御配列は、誘導性である。
一部の実施形態では、ＣＡＲおよび／または治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（本明細書ではコードするポリヌクレオチドとも称される）は、シグナルペプチドをさらにコードする。それに加えてまたはその代わりに、ＣＡＲおよび／または治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、自殺遺伝子をさらに含む。さらなる実施形態では、自殺遺伝子産物は、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシルエステラーゼ、シトクロムＰ４５０もしくはＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）、切断型ＥＧＦＲ、または誘起可能なカスパーゼ（「ｉＣａｓｐ」）の１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、コードするポリヌクレオチドは、自殺遺伝子の発現を方向付ける制御配列をさらに含む。さらなる実施形態では、制御配列は、誘導性である。
【0273】
一部の実施形態では、コードするポリヌクレオチドは、ＣＡＲまたは治療用タンパク質またはポリペプチドの発現を方向付ける制御配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をさらに含む。さらなる実施形態では、ＣＡＲまたは治療用タンパク質の発現を方向付ける制御配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、誘導性または構成的に活性なものである。
【0274】
一部の実施形態では、コードするポリヌクレオチドを細胞集団にベクターを介して導入する。さらなる実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、プラスミドである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターから選択される。さらなる実施形態では、ウイルス骨格は、コードするポリヌクレオチドの標的細胞のゲノムへの組込みのために必須の核酸または配列を含有する。一部の実施形態では、標的細胞のゲノムへの組込みのために必要である、必須の核酸は、５’末端および３’末端に、ベクターの組込みのために必要な最小ＬＴＲ領域を含む。
【0275】
本開示は、必要に応じてウイルス骨格に挿入された本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、コードするポリヌクレオチドなど）を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなるベクターも提供する。一部の実施形態では、ベクターは、原核細胞または真核細胞における発現のために選択される。一部の実施形態では、ベクターは、改変されたタンパク質をコードする本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチドの複製を可能にする本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結しており、ポリヌクレオチドの複製を方向付ける制御配列をさらに含む。さらなる実施形態では、制御配列は、プロモーター、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、サイレンサー、ＴＡＴＡボックス、またはウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）のうちの１つまたは複数を含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
【0276】
一部の実施形態では、コード配列を標的細胞に本明細書に開示されるシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を介して導入する。
【0277】
パッケージングシステム
本開示は、本明細書に記載のベクターを含むウイルスパッケージングシステムであって、必要に応じて、骨格が、ウイルス；パッケージングプラスミド；およびエンベローププラスミドに由来するものである、ウイルスパッケージングシステムも提供する。パッケージングプラスミドは、ヌクレオシド、マトリックスタンパク質、カプシド、およびベクターゲノムをウイルス粒子にパッケージングするために必要な他の成分をコードするポリヌクレオチドを含有する。パッケージングプラスミドは、特許文献、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２６２，０４９号；同第６，９９５，２５８号；同第７，２５２，９９１号および同第５，７１０，０３７号に記載されている。
本開示は、本明細書に記載のベクターを含むウイルスパッケージングシステムであって、必要に応じて、骨格が、ウイルス；パッケージングプラスミド；およびエンベローププラスミドに由来するものである、ウイルスパッケージングシステムも提供する。パッケージングプラスミドは、ヌクレオシド、マトリックスタンパク質、カプシド、およびベクターゲノムをウイルス粒子にパッケージングするために必要な他の成分をコードするポリヌクレオチドを含有する。パッケージングプラスミドは、特許文献、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２６２，０４９号；同第６，９９５，２５８号；同第７，２５２，９９１号および同第５，７１０，０３７号に記載されている。
【0278】
システムは、エンベローププラスミドによってもたらされるシュードタイピングされたエンベロープタンパク質をコードするプラスミドも含有し得る。シュードタイピングされたウイルスベクターは、他のエンベロープを有するウイルスに由来する糖タンパク質を有するか、あるいは機能的部分を含有するベクター粒子からなる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２６２，０４９号を参照されたい。一部の実施形態では、エンベローププラスミドは、必要に応じてウイルス粒子の細胞または細胞の集団への非特異的結合を引き起こさない、エンベロープタンパク質をコードする。ウイルス粒子の特異性は、粒子エンベロープに挿入される抗体結合性ドメインなどのタンパク質またはポリペプチドによって付与することができる。適切なエンベロープタンパク質の例としては、これだけに限定されないが、ＶＳＶＧまたはＲＤ１１４ドメインを含有するものが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書で使用されるエンベロープタンパク質としては、これだけに限定されないが、ＲＤ１１４ＴＲおよび／またはＢａＥＶＴＲが挙げられる。
【0279】
本開示は、適切なパッケージング細胞株も提供する。一態様では、パッケージング細胞株は、ＨＥＫ－２９３細胞株である。他の適切な細胞株は、当技術分野で公知であり、例えば、特許文献、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７０，９９４号；同第６，９９５，９１９号；同第６，４７５，７８６号；同第６，３７２，５０２号；同第６，３６５，１５０号および同第５，５９１，６２４号に記載されている。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、２９３Ｖｅｃ－Ｇａｌｖ、２９３Ｖｅｃ－Ａｍｐｈｏ、２９３Ｖｅｃ－ＲＤ１１４、または２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶのうちの１つまたは複数から選択されるか、これらに由来するものである。例えば、Ghani et al., Gene Ther. 2007 Dec; 14 (24): 1705-11; Dakiw Piaceski A et al, Eur Cell Mater. 2018 Feb 14; 35: 73-86；Ghani et al., Hum Gene Ther. 2009 Sep; 20 (9): 966-74；米国特許出願公開第ＵＳ２００６０２７００４２号；および米国特許第８０３４３３５号を参照されたい。
【0280】
本開示は、本明細書に開示されるウイルス粒子を作製するための方法であって、パッケージング細胞株に上記のウイルスシステムを、ウイルスベクターのパッケージングに適した条件下で形質導入するステップを含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる、方法をさらに提供する。そのような条件は、当技術分野で公知であり、本明細書に簡単に記載されている。ウイルス粒子は、細胞の上清から、当業者に公知の方法、例えば、遠心分離を使用して単離することができる。そのような単離された粒子が本開示によってさらに提供される。
【0281】
本開示は、この方法によって作製される単離されたウイルス粒子をさらに提供する。ウイルス粒子は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
【0282】
本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、例えば、本明細書に開示されるコードするポリヌクレオチドなどを含むウイルス粒子（例えば、ガンマレトロウイルス粒子）を、本明細書に記載のパッケージング細胞株にベクター、エンベローププラスミドおよびパッケージングプラスミドをベクターのエンベロープ粒子へのパッケージングが容易になる条件下で形質導入することによって調製するための方法も提供する。一部の実施形態では、ウイルス粒子は、シュードタイピングされたウイルス粒子である。さらなる実施形態では、粒子を細胞上清から分離し、細胞特異的標的化のために抗体とコンジュゲートする。
【0283】
レトロウイルス粒子（例えば、ガンマレトロウイルス粒子など）を作製するための方法も提供される。方法は、（ｉ）ベクターゲノムを発現するベクターを、ベクターゲノムを第１のレトロウイルス粒子にパッケージングするために適した第１のパッケージング細胞株に導入するステップ、（ｉｉ）第１のレトロウイルス粒子を、第１のレトロウイルス粒子を複製するために適した第２のパッケージング細胞株に形質導入するステップ；および（ｉｉｉ）複製されたレトロウイルス粒子を単離するステップを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
【0284】
一部の実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。さらなる実施形態では、ベクターは、プラスミドである。
【0285】
一部の実施形態では、方法は、ベクターが導入された第１のパッケージング細胞株を培養するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、方法は、ベクターが導入された第１のパッケージング細胞株の培養物から、例えば、上清から、第１のレトロウイルス粒子を単離するステップをさらに含む。
【0286】
一部の実施形態では、方法は、形質導入された第２のパッケージング細胞株を培養するステップをさらに含む。
【0287】
一部の実施形態では、ベクターを、２つのステップを使用して作製する：
ステップ１：プラスミド（レトロウイルスベクターゲノムを発現する）を２９３Ｖｅｃ－ＧＡＬＶ細胞にトランスフェクトして、レトロウイルスベクターを作製する。このように作製されたレトロウイルスベクターは、ＧＡＬＶを含む脂質膜のエンベロープを有する。また、このステップでは２９３Ｖｅｃ－ＧＡＬＶ細胞が一過性にトランスフェクトされるので、作製されたレトロウイルスベクターは、一過性ベクターとも称され、図１０において試験された。
ステップ２：作製されたレトロウイルスベクターを２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶ細胞に形質導入して、レトロウイルスベクターを複製させる。複製されたレトロウイルスベクターは、親レトロウイルスベクターと同じベクターゲノムを有するが、ＢａＥＶを含む脂質膜のエンベロープを有する。また、このステップでは２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶ細胞が安定に形質導入されるので、複製されたレトロウイルスベクターは、本明細書では安定なベクターとも称され、図１０において試験された。
ステップ１：プラスミド（レトロウイルスベクターゲノムを発現する）を２９３Ｖｅｃ－ＧＡＬＶ細胞にトランスフェクトして、レトロウイルスベクターを作製する。このように作製されたレトロウイルスベクターは、ＧＡＬＶを含む脂質膜のエンベロープを有する。また、このステップでは２９３Ｖｅｃ－ＧＡＬＶ細胞が一過性にトランスフェクトされるので、作製されたレトロウイルスベクターは、一過性ベクターとも称され、図１０において試験された。
ステップ２：作製されたレトロウイルスベクターを２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶ細胞に形質導入して、レトロウイルスベクターを複製させる。複製されたレトロウイルスベクターは、親レトロウイルスベクターと同じベクターゲノムを有するが、ＢａＥＶを含む脂質膜のエンベロープを有する。また、このステップでは２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶ細胞が安定に形質導入されるので、複製されたレトロウイルスベクターは、本明細書では安定なベクターとも称され、図１０において試験された。
【0288】
驚くべきことに、Ｔ細胞（ＲＱＲ８をコードするレトロウイルスベクターゲノムを用いて形質導入したもの）は、安定なベクターを使用すると一過性ベクターと比較して高レベルでＲＱＲ８を発現する。さらに、生成されたこれらの安定なウイルス産生細胞（プロデューサーとも称される）は、安定であり、目的の導入遺伝子が組み込まれている。一部の実施形態では、導入遺伝子によってコードされるタンパク質産物は無毒性である。したがって、理論に縛られることは望まないが、産生細胞はちょうど親パッケージング細胞株と同様であり、これは、対数増殖期にある世代数と同数の世代にわたって継続的にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、プロデューサーをｉｎ ｖｉｔｒｏの培養下で３０以下の世代にわたって維持することができる。
【0289】
一部の実施形態では、細胞を、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、または少なくとも約１０日間にわたって培養する。それに加えてまたはその代わりに、細胞を、７日間以下、８日間以下、９日間以下、１０日間以下、１１日間以下、１２日間以下、１３日間以下、１４日間以下、１５日間以下、３週間以下、または１カ月以下にわたって培養する。一部の実施形態では、細胞を、この中に入るあらゆる範囲および／または数を含め、約１日間～約１８０日間にわたって培養する。一部の実施形態では、細胞を、約５日間～約１０日間、例えば、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、または約１０日間などにわたって培養する。
【0290】
一部の実施形態では、第１のパッケージング細胞株および第２のパッケージング細胞株は、レトロウイルス粒子のパッケージングのために必要な成分を発現する。さらなる実施形態では、レトロウイルス粒子のパッケージングのために必要な成分は、レトロウイルスｇａｇ、レトロウイルスｐｏｌ、レトロウイルスｅｎｖ、そのそれぞれの断片、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数から選択される。
【0291】
一部の実施形態では、第２のパッケージング細胞株は、細胞膜にレトロウイルスエンベロープタンパク質を含むが、細胞膜にレトロウイルスエンベロープタンパク質の侵入受容体は含まない。
【0292】
形質導入された第２のパッケージング細胞株、その細胞、またはその細胞集団がさらに提供される。一部の実施形態では、細胞によりレトロウイルス粒子が安定に産生される。
【0293】
一部の実施形態では、レトロウイルスエンベロープタンパク質はＢａＥＶであり、その侵入受容体はＡＳＣＴ１またはＡＳＣＴ２である。一部の実施形態では、レトロウイルスエンベロープタンパク質はＲＤ１１４であり、その侵入受容体はＡＳＣＴ２である。一部の実施形態では、レトロウイルスエンベロープタンパク質はＧＡＬＶであり、その侵入受容体はＰｉｔ１である。
【0294】
一部の実施形態では、第１のパッケージング細胞株は、第１のレトロウイルス粒子のレトロウイルスエンベロープタンパク質の侵入受容体を含む。他の実施形態では、第１のパッケージング細胞株は、第１のレトロウイルス粒子のレトロウイルスエンベロープタンパク質の侵入受容体を含まない。
【0295】
一部の実施形態では、ベクターを第１のパッケージング細胞株に、この中に入るあらゆる範囲および／または数を含め、約０．０１～約１００の感染多重度（ＭＯＩ）で導入する。一部の実施形態では、ベクターを第１のパッケージング細胞株に約０．１～約１０、約０．２～約５、約１～約１０、または約１～約５のＭＯＩで導入する。一部の実施形態では、ベクターを第１のパッケージング細胞株に約０．１、約０．２、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９または約１０のＭＯＩで導入する。
【0296】
一部の実施形態では、第１のレトロウイルス粒子を第２のパッケージング細胞株に、この中に入るあらゆる範囲および／または数を含め、約０．０１～約１００の感染多重度（ＭＯＩ）で導入（例えば、形質導入）する。一部の実施形態では、第１のレトロウイルス粒子を第２のパッケージング細胞株に約０．１～約１０、約０．２～約５、約１～約１０、または約１～約５のＭＯＩで導入（例えば、形質導入）する。一部の実施形態では、第１のレトロウイルス粒子を第２のパッケージング細胞株に約０．１、約０．２、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９または約１０のＭＯＩで導入（例えば、形質導入）する。
【0297】
したがって、本明細書に開示される方法によって作製されるレトロウイルス粒子が提供される。
【0298】
さらなる態様では、ＣＡＲを発現する免疫細胞などの操作された免疫細胞を作製するための方法が提供される。方法は、本明細書に開示される方法を使用して作製されたレトロウイルス粒子を免疫細胞またはその前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）に導入（例えば、形質導入）するステップを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
【0299】
一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子の遺伝情報（本明細書ではベクターゲノムまたはウイルスゲノムとも称される）は、５’末端および３’末端にベクターの組込みのために必要な最小ＬＴＲ領域、ならびに、２つのＬＴＲ領域の間に本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるＲＮＡである。一部の実施形態では、２つのＬＴＲ領域の間に、ベクターＲＮＡの粒子へのパッケージングのために必要なカプシド形成シグナル（ｐｓｉ領域）がさらに含まれる。一部の実施形態では、ｐｓｉ領域の後に、ベクター粒子への効率的なパッケージングのために全長ベクター転写物を核外に輸送することによってベクター産生を増強する、Ｒｅｖ応答エレメント（Ｒｅｖ－Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＲＲＥ）および中心ポリプリントラクト配列（ｃＰＰＴ）が続く。
【0300】
一部の実施形態では、列挙された遺伝子エレメントが全長ＲＮＡ分子に転写され、これは、ベクター粒子にパッケージングされ、また、形質導入された細胞に組み込まれる遺伝情報の全てを含有する。
【0301】
一部の実施形態では、全長ＲＮＡ転写物を、パッケージングプラスミドから生成されるヌクレオカプシド、カプシド、およびマトリックスタンパク質を含有するベクター粒子のカプシドの内側にパッケージングする。一部の実施形態では、パッケージングプラスミドから生成される逆転写酵素ポリメラーゼもカプシド内にＲＮＡ転写物と共に位置させる。一部の実施形態では、カプシドにより全長ＲＮＡ転写物が包まれ、保護される。
【0302】
一部の実施形態では、パッケージング細胞株の細胞、例えばＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に完全ＤＭＥＭ培地に７５％集密でプレーティングした。細胞をプレーティングしてから少なくとも２４時間経った後、トランスフェクション混合物を調製する。無血清培地３ミリリットルをリポフェクション試薬１５０μｌと一緒に室温で２０分間インキュベートする。次いで、プラスミドを培地／リポフェクション試薬混合物にある特定の比（パッケージングプラスミド：ウイルスベクタープラスミド：エンベローププラスミド）で添加し、３０分間インキュベートする。この最終的なインキュベーション期間後、次いで、培地／リポフェクション試薬／ＤＮＡ混合物をＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に添加し、一晩放置してトランスフェクションを生じさせる。翌日、トランスフェクション培地を除去し、新鮮な完全ＤＭＥＭを添加する。７２時間後、細胞培養上清を収集し、２０，０００ｒｐｍで１．５時間にわたって超遠心分離することによって濃縮することができる。
【0303】
ベクター粒子がパッケージング細胞から出芽し、上清中に放出され、このベクター粒子を、粒子を特異的に認識するもしくはこれに結合する抗体によって、および／またはコンジュゲートした抗体を本明細書で定義されている粒子のエンベロープ上にのせることによって単離および／または精製することができる。
【0304】
したがって、一態様では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を作製するためのウイルスパッケージングシステムであって、（ａ）ベクターゲノムを発現するプラスミド；（ｂ）パッケージングプラスミド；ならびに（ｃ）ＲＤ１１４ＴＲ、およびＢａＥＶＴＲを発現するエンベローププラスミドのうちの１つまたは複数を含む、ウイルスパッケージングシステムが本明細書で提供される。一部の実施形態では、パッケージングシステムは、パッケージング細胞株をさらに含む。さらなる実施形態では、パッケージング細胞株は、２９３Ｔ細胞株である。
【0305】
一部の実施形態では、ベクターゲノムは、２つの長いターミナルリピート（ＬＴＲ）に挟まれた以下：（Ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／または別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（Ｂ）（Ａ）のリバース相補体、または（Ｃ）コード配列またはそのリバース相補体をポリヌクレオチドに挿入するための適切な制限酵素によって認識される１つまたは複数の認識部位を含むポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、治療用タンパク質またはポリペプチドは、抗体もしくはその断片、酵素、リガンドまたは受容体から選択される。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、以下：５’ＬＴＲ、５’キャップ、３’ポリＡ尾部、および３’ＬＴＲのうちの１つまたは複数をさらに含む。さらなる実施形態では、コードするポリペプチドは、５’キャップと３’ポリＡ尾部の間に位置する。
【0306】
一部の実施形態では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、フレンドマウス胚性幹細胞ウイルス（ＦＭＥＶ）、異種指向性ＭｕＬＢ関連ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）およびネコ白血病ウイルスのうちの任意の種に基づく、および／またはこれらに由来する、および／またはこれらから選択される。
【0307】
さらなる態様では、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を作製するための方法が提供される。方法は、パッケージング細胞株に、本明細書に開示されるパッケージングシステムを、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子のパッケージングに適した条件下で形質導入するステップを含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。さらなる実施形態では、パッケージング細胞株は、２９３Ｔ細胞株である。
【0308】
一部の実施形態では、細胞株に、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のプラスミド、すなわち、（ウイルスベクタープラスミド：パッケージングプラスミド：エンベローププラスミド）を、約５：５：１、５：４：１、５：３：１、５：２：１、５：１：１、４：５：１、３：５：１、２：５：１、１：５：１；４：４：１、４：３：１、４：２：１、４：１：１、３：４：１、２：４：１、１：４：１；３：３：１、３：２：１、３：１：１、２：３：１、１：３：１；２：２：１、２：１：１、１：２：１；１．５：１．５：１、１．５：１：１、１：１．５：１；または１：１：１の比で形質導入する。さらなる実施形態では、パッケージングシステムは、少なくとも２つのエンベローププラスミドを含み、一方はＲＤ１１４ＴＲを発現するものであり、他方はＢａＥＶＴＲを発現するものである。さらなる実施形態では、ＲＤ１１４ＴＲ発現プラスミドおよびＢａＥＶＴＲ発現プラスミドを３：１、２：１、１．５：１、１：１、１：１．５、１：２、または１：３の比で形質導入する。一部の実施形態では、細胞株に（ａ）のプラスミド、（ｂ）のプラスミド、ＲＤ１１４ＴＲ発現プラスミド、およびＢａＥＶＴＲ発現プラスミドを３：３：１：１、２：２：１：１、１．５：１．５：１：１、１：１：１：１、５：５：１：１、５：４：１：１、５：３：１：１、５：２：１：１、５：１：１：１、４：５：１：１、３：５：１：１、２：５：１：１、１：５：１：１；４：４：１：１、４：３：１：１、４：２：１：１、４：１：１：１、３：４：１：１、２：４：１：１、１：４：１：１；３：３：１：１、３：２：１：１、３：１：１：１、２：３：１：１、１：３：１：１；２：２：１：１、２：１：１：１、１：２：１：１；１．５：１．５：１：１、１．５：１：１：１、１：１．５：１：１；または１：１：１：１；２．５：２．５：１：１：１、２．５：２：１：１、２．５：１．５：１：１、２．５：１：１：１、２．５：０．５：１：１、２：２．５：１：１、１．５：２．５：１：１、１：２．５：１：１、０．５：２．５：１：１；２：２：１：１、２：１．５：１：１、２：１：１：１、２：０．５：１：１、１．５：２：１：１、１：２：１：１、０．５：２：１：１；１．５：１．５：１：１、１．５：１：１：１、１．５：０．５：１：１、１：１．５：１：１、０．５：１．５：１：１；１：１：１：１、１：０．５：１：１、０．５：１：１：１；０．７５：０．７５：１：１、０．７５：０．５：１：１、０．５：０．７５：１：１；または０．５：０．５：１：１の比で形質導入する。
【0309】
細胞および細胞集団
一態様では、本明細書に開示される細胞集団および／またはその後代が提供される。一部の実施形態では、細胞集団は、クローナルである。一部の実施形態では、細胞集団は、単離および／または富化および／または操作されたものである。
一態様では、本明細書に開示される細胞集団および／またはその後代が提供される。一部の実施形態では、細胞集団は、クローナルである。一部の実施形態では、細胞集団は、単離および／または富化および／または操作されたものである。
【0310】
一態様では、本明細書に開示される方法によって作製または調製された免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞などおよび／またはγδＴ細胞）またはその集団が提供される。細胞またはその集団および担体、必要に応じて薬学的に許容される担体を含む組成物がさらに提供される。一部の実施形態では、免疫細胞またはその集団は、単離および／または富化および／または操作されたものである。
【0311】
それに加えてまたはその代わりに、本明細書に開示される細胞は、幹細胞から誘導されたまたは分化したものである。一部の実施形態では、誘導されたおよび／または分化した細胞および／またはその細胞集団は、免疫細胞を含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の場合では、免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞、骨髄リニエージの細胞、および／または好中球から選択される。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３を発現しない、すなわち、ＣＤ３－Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４を発現しない、すなわち、ＣＤ４－Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８を発現しない、すなわち、ＣＤ８－Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖、ＴＣＲ β鎖、またはαβＴＣＲのうちのいずれか１つまたは複数を発現しない。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＴＣＲ γ鎖を発現する。それに加えてまたはその代わりに、Ｔ細胞は、ＴＣＲ δ鎖を発現する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。一部の場合では、単離された細胞または免疫細胞の富化された集団は、単球、マクロファージ、および／またはミクログリアを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
【0312】
一部の実施形態では、細胞集団は、必要に応じてＨＳＣおよび／または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの幹細胞から誘導された免疫細胞を実質的に含む。一部の実施形態では、細胞集団は、必要に応じて免疫細胞へと誘導される、ＨＳＣおよび／またはｉＰＳＣなどの幹細胞を実質的に含む。
【0313】
一部の実施形態では、細胞集団は、実質的に均一であり、例えば、集団中の少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の細胞が同じものである。
【0314】
さらなる態様では、本明細書に開示される方法によって作製または調製されたＮＫ細胞またはその集団が提供される。細胞またはその集団および担体、必要に応じて薬学的に許容される担体を含む組成物がさらに提供される。
【0315】
さらなる態様では、本明細書に開示される方法によって作製または調製されたγδＴ細胞またはその集団が提供される。細胞またはその集団および担体、必要に応じて薬学的に許容される担体を含む組成物がさらに提供される。
【0316】
一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞および／もしくはその集団、ならびに／または組成物は、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．３％未満、約０．４％未満、約０．５％未満、約０．６％未満、約０．７％未満、約０．８％未満、約０．９％未満、約１．０％未満、約１．１％未満、約１．２％未満、約１．３％未満、約１．４％未満、約１．５％未満、約１．６％未満、約１．７％未満、約１．８％未満、約１．９％未満、または約２．０％未満のａＡＰＣを含む。
【0317】
それに加えてまたはその代わりに、本明細書に開示される細胞および／もしくはその集団、ならびに／または組成物は、生存率が３０％以上、４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上である。
【0318】
一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞および／もしくはその集団、ならびに／または組成物は無菌性である。
【0319】
一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞および／もしくはその集団、ならびに／または組成物に含まれる内毒素は、試験対象（例えば、ウサギなど、例えば、Wachtel and Tsuji, 1976；Dabbah, et al, 1980を参照されたい）における発熱の誘導に要する内毒素活性のレベルの統計学的評定である内毒素の閾値発熱用量（ＴＰＤ）未満である。そのようなＴＰＤは、投与経路に基づいて決定することができる。一実施形態では、ＴＰＤは、例えば、静脈内または筋肉内投与に関して、５ＥＵＫｇ－１ｈ－１の内毒素である。一実施形態では、ＴＰＤは、例えば、くも膜下腔内投与に関して、０．２ＥＵＫｇ－１ｈ－１の内毒素である。
【0320】
一部の実施形態では、開示される細胞および／もしくはその集団、ならびに／または組成物は、マイコプラズマ、外来ウイルス、またはＨＨＶ（例えば、ＨＨＶ６および／またはＨＨＶ７など）のうちの１つまたは複数について陰性である。
【0321】
一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞集団および／または組成物は、総細胞中、約２５％を超える、約３０％を超える、４０％を超える、約４５％を超える、約５０％を超える、約５５％を超える、約６０％を超える、約６５％を超える、約７０％を超える、約７５％を超える、約８０％を超える、約８５％を超える、約９０％を超える、または約９５％を超える、ＣＡＲを発現する細胞を含む。さらなる実施形態では、本明細書に開示される細胞集団および／または組成物は、総細胞中、約２５％、約３０％、４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の、ＣＡＲを発現する細胞を含む。
【0322】
一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞集団および／または組成物は、総細胞中、約２５％を超える、約３０％を超える、４０％を超える、約４５％を超える、約５０％を超える、約５５％を超える、約６０％を超える、約６５％を超える、約７０％を超える、約７５％を超える、約８０％を超える、約８５％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、または約９９％を超える、ＣＤ５６を発現する細胞を含む。さらなる実施形態では、本明細書に開示される細胞集団および／または組成物は、総細胞中、約２５％、約３０％、４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％の、ＣＤ５６を発現する細胞を含む。
【0323】
一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞集団および／または組成物は、総細胞中、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．３％未満、約０．４％未満、約０．５％未満、約０．６％未満、約０．７％未満、約０．８％未満、約０．９％未満、約１．０％未満、約１．１％未満、約１．２％未満、約１．３％未満、約１．４％未満、約１．５％未満、約１．６％未満、約１．７％未満、約１．８％未満、約１．９％未満、または約２．０％未満の、ＣＤ３を発現する細胞を含む。
【0324】
一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞および／もしくはその集団、ならびに／または組成物は、細胞当たり、約２コピー未満、約３コピー未満、約４コピー未満、約５コピー未満、約６コピー未満、約７コピー未満、約８コピー未満、約９コピー未満、または約１０コピー未満のポリヌクレオチドを含む。
【0325】
一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞および／もしくはその集団、ならびに／または組成物は、ＩＬ－２および／またはＩＬ－２１の非存在下では、増殖を欠く。
【0326】
一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞および／もしくはその集団、ならびに／または組成物は、本明細書に開示される培養するステップおよび／または導入するステップのいずれによっても調製されていない免疫細胞と比較して、強力な能力（すなわち、効力）、例えば、１倍よりも高い、２倍よりも高い、３倍よりも高い、４倍よりも高い、１０倍よりも高い上昇、１５倍よりも高い、２０倍よりも高いまたはそれよりも高いレベルを有する。そのような効力は、ＩＦＮγおよび／もしくは他の炎症促進性サイトカインの分泌ならびに／またはＣＤ１０７（例えば、ＣＤ１０７ａなど）の発現によって測定することができる。例えば、Orange et al. J Exp Med. 1995 Oct 1; 182 (4): 1045-56；およびMcElroy et al. J Immunol Methods. 2007 Dec 1; 328 (1-2): 45-52を参照されたい。
【0327】
一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞および／もしくはその集団、ならびに／または組成物は、ＣＤ１９などの抗原、ＮＫｐ４６、またはＮＫＧ２Ｄのうちの１つまたは複数を発現する。
【0328】
さらなる実施形態では、これらの細胞、細胞集団、および／または組成物は、それを必要とする対象におけるがんを処置および／もしくは予防するため、または新しい療法を試験するために有用である。
【0329】
一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞および／もしくはその集団、ならびに／または組成物、例えば、それを必要とする対象に投与されるものは、これだけに限定されないが、１キログラム当たり２×１０６個よりも多くの細胞、１キログラム当たり３×１０６個よりも多くの細胞、１キログラム当たり４×１０６個よりも多くの細胞、１キログラム当たり５×１０６個よりも多くの細胞、１キログラム当たり６×１０６個よりも多くの細胞、１キログラム当たり７×１０６個よりも多くの細胞、１キログラム当たり８×１０６個よりも多くの細胞、１キログラム当たり９×１０６個よりも多くの細胞、１キログラム当たり１×１０７個よりも多くの細胞、１キログラム当たり２×１０７個よりも多くの細胞、１キログラム当たり３×１０７個よりも多くの細胞、１キログラム当たり４×１０７個よりも多くの細胞、１キログラム当たり５×１０７個よりも多くの細胞、１キログラム当たり６×１０７個よりも多くの細胞、１キログラム当たり７×１０７個よりも多くの細胞、１キログラム当たり８×１０７個よりも多くの細胞、１キログラム当たり９×１０７個よりも多くの細胞、または１キログラム当たり１×１０８個よりも多くの細胞を含め、処置される対象の体重１キログラム当たり１×１０６個よりも多くの細胞を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
【0330】
処置方法
一態様では、がん細胞の成長を阻害するための方法が提供される。方法は、例えば、有効量の、本明細書に開示される方法によって調製されたＣＡＲ発現細胞の集団をがん細胞と接触させるステップを含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、ＣＡＲによって認識される抗原は、がん細胞によって発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏである。
一態様では、がん細胞の成長を阻害するための方法が提供される。方法は、例えば、有効量の、本明細書に開示される方法によって調製されたＣＡＲ発現細胞の集団をがん細胞と接触させるステップを含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、ＣＡＲによって認識される抗原は、がん細胞によって発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏである。
【0331】
さらなる実施形態では、対象におけるがんを処置するための方法が提供される。方法は、例えば、有効量の、本明細書に開示される方法によって調製されたＣＡＲ発現免疫細胞の集団を対象に投与するステップを含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、ＣＡＲによって認識される抗原は、がんの細胞によって発現されるＴＡＡである。一部の実施形態では、投与は、第１選択療法、第２選択療法、第３選択療法、または第４選択療法である。
【0332】
本明細書に開示される方法の一部の実施形態では、細胞集団は、ＮＫ細胞を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。それに加えてもしくはその代わりに、細胞集団は、約０．１％未満もしくはこれと等しい、約０．２％未満もしくはこれと等しい、約０．３％未満もしくはこれと等しい、約０．４％未満もしくはこれと等しい、約０．５％未満もしくはこれと等しい、約０．６％未満もしくはこれと等しい、約０．７％未満もしくはこれと等しい、約０．８％未満もしくはこれと等しい、約０．９％未満もしくはこれと等しい、約１．０％未満もしくはこれと等しい、約１．１％未満もしくはこれと等しい、約１．２％未満もしくはこれと等しい、約１．３％未満もしくはこれと等しい、約１．４％未満もしくはこれと等しい、約１．５％未満もしくはこれと等しい、約１．６％未満もしくはこれと等しい、約１．７％未満もしくはこれと等しい、約１．８％未満もしくはこれと等しい、約１．９％未満もしくはこれと等しい、または約２．０％未満もしくはこれと等しいＣＤ３＋細胞を含む。
【0333】
一部の実施形態では、対象に、体重１キログラム当たり１×１０２未満、２×１０２未満、３×１０２未満、４×１０２未満、５×１０２未満、６×１０２未満、７×１０２未満、８×１０２未満、９×１０２未満、１×１０３未満、２×１０３未満、３×１０３未満、４×１０３未満、５×１０３未満、６×１０３未満、７×１０３未満、８×１０３未満、９×１０３未満、１×１０４未満のＴ細胞を投与する。
【0334】
一部の実施形態では、がん細胞は、循環系、例えば、心臓（肉腫［血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫］、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、および脂肪腫）、縦隔および胸膜、ならびに他の胸腔内臓器、血管腫瘍および腫瘍関連血管組織；気道、例えば、鼻腔および中耳、副鼻腔、喉頭、気管、気管支および肺、例えば小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、気管支原性癌（扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様過誤腫、中皮腫；胃腸系、例えば、食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）、膵臓（腺管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；任意の部位において生じる消化管間質腫瘍および神経内分泌腫瘍；泌尿生殖路、例えば、腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱および／または尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（精上皮腫、胚性癌腫、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；肝臓、例えば、ヘパトーマ（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫、膵臓内分泌腫瘍（例えば褐色細胞腫、インスリノーマ、血管作動性腸管ペプチド腫瘍、膵島細胞腫瘍およびグルカゴノーマ）；骨、例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網細胞肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍、脊索腫、骨軟骨腫（osteochronfroma）（骨軟骨性外骨腫）、良性軟骨腫、軟骨芽腫、軟骨粘液様線維腫（chondromyxofibroma）、類骨腫および巨細胞腫瘍；神経系、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、頭蓋がん（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫（meningiosarcoma）、神経膠腫症）、脳のがん（星細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形神経膠芽腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；生殖系、例えば、婦人科、子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、前腫瘍子宮頸部異形成）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、未分類癌腫］、顆粒膜－髄膜細胞腫瘍、セルトリ－ライディッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、胎盤、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、卵管（癌腫）および女性生殖器と関連付けられる他の部位；陰茎、前立腺、精巣、および男性生殖器と関連付けられる他の部位；血液系、例えば、血液（骨髄性白血病［急性および慢性］、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；口腔、例えば、唇、舌、歯肉、口腔底、口蓋、および口の他の部分、耳下腺、および唾液腺の他の部分、扁桃腺、中咽頭、鼻咽頭、梨状洞、下咽頭、ならびに唇、口腔および咽頭中の他の部位；皮膚、例えば、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、黒子形成異常母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、およびケロイド；副腎：神経芽腫；ならびに結合組織および軟組織、後腹膜および腹膜、目、眼内黒色腫、および付属器、乳房、頭部および／または頸部、肛門領域、甲状腺、副甲状腺、副腎および他の内分泌腺および関連する構造を含む他の組織、リンパ節の二次的なおよび不特定の悪性新生物、呼吸器および消化器系の二次的な悪性新生物ならびに他の部位の二次的な悪性新生物のがん細胞から選択される。
【0335】
一部の実施形態では、がん細胞は、固形腫瘍細胞である。他の実施形態では、がん細胞は、固形腫瘍の細胞ではない。さらなる実施形態では、がん細胞は、白血病がん細胞である。一部の実施形態では、がん細胞は、原発がん細胞または転移性がん細胞である。一部の実施形態では、がん細胞は、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、またはリンパ腫に由来するものである。
【0336】
必要に応じてさらなる効果的な療法を本開示と組み合わせるおよび／または追加することができる。本明細書に開示される方法の一部の実施形態は、細胞を別の療法と接触させるまたは別の療法を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、別の療法は、外科的切除、化学療法、放射線療法、免疫療法および標的療法を含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、別の療法は、第１選択療法、第２選択療法、第３選択療法、または第４選択療法である。
【0337】
一部の実施形態では、「有効量」、すなわち、有益なまたは所望の結果をもたらすために十分な量が送達される。有効量を１回または複数回の投与、適用または投薬で投与することができる。そのような送達は、個々の投薬単位が使用される期間、治療剤の生体利用効率、投与経路などを含めた多数の変数に依存する。しかし、任意の特定の対象に対する本開示の治療剤の特定の用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全般的な健康、性別、および食事、投与時間、排泄速度、薬物の組合せ、ならびに処置される特定の障害の重症度および投与形態を含めた種々の因子に依存することが理解される。一般に、処置投薬量の力価測定を行って、安全性および有効性を最適化することができる。一般には、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ試験から得られた投薬量と効果の関連性により、患者への投与のための適当な用量に関する有用な指針が最初に提供され得る。一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて効果的であることが見いだされた濃度と釣り合う血清レベルを実現するために効果的な量の遺伝子またはタンパク質を投与することが望まれる。これらのパラメータの決定は、当技術分野の技術の範囲内に十分に入る。これらの考察、ならびに効果的な製剤および投与手順は当技術分野で周知であり、標準の教本に記載されている。この定義と一致して、本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、治療的利益をもたらすために十分な量である。
【0338】
投与という用語は、これだけに限定することなく、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、脳室内（ＩＣＶ）、くも膜下腔内、大槽内注射または注入、皮下注射、または埋込）による、吸入噴霧による経鼻、膣内、直腸内、舌下、尿道内（例えば、尿道坐薬）、頭蓋内、または局部投与経路（例えば、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、エアロゾルなど）による局所投与または全身投与を包含するものとし、単独でまたは一緒に、各投与経路に適した従来の無毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、およびビヒクルを含有する適切な投薬単位製剤として製剤化することができる。本開示は、投与経路、製剤、または投薬スケジュールに限定されない。一部の実施形態では、投与は、局所的に、例えば、骨髄にまたは脳内に実施される。一部の実施形態では、投与は、全身的に実施される。一部の実施形態では、投与は、例えば、約１時間、約１．５時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約１２時間、または約１日にわたる注入である。
【0339】
本明細書に開示される方法における使用に適した１つまたは複数の薬剤および必要に応じた説明書を含むか、あるいは本質的にこれからなるか、さらにこれからなるキットがさらに提供される。一部の実施形態では、薬剤は、以下：ＣＡＲまたは別の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、細胞表現型を検出するための抗体、免疫細胞を単離または富化または精製するための抗体、ポリヌクレオチドを検出するためのプライマー、サイトカイン、および本明細書に開示されるａＡＰＣのうちの１つまたは複数から選択される。
【実施例】
【0340】
以下の実施例は、例示することを意図したものであり、本明細書に開示される実施形態を限定するものではない。
実験方法
実験番号１：ヒト初代ＮＫ細胞にキメラ抗原受容体を送達し、ヒト初代ＮＫ細胞におけるキメラ抗原受容体の機能を試験するための、ガンマレトロウイルスベクター（ＰＣＩＲ）媒介性遺伝子移入の独特の使用
実験方法
実験番号１：ヒト初代ＮＫ細胞にキメラ抗原受容体を送達し、ヒト初代ＮＫ細胞におけるキメラ抗原受容体の機能を試験するための、ガンマレトロウイルスベクター（ＰＣＩＲ）媒介性遺伝子移入の独特の使用
【0341】
ヒト初代ＮＫ細胞に遺伝子送達するための効率的な方法がないこと、導入遺伝子が不安定であること、および形質導入されたＣＡＲ－ＮＫ細胞の生存率が低いことが、上首尾のＣＡＲ－ＮＫ開発および製造の最も大きな障害である。患者の望ましくない待ち時間は予後不良と相関し、また、不十分なＴ細胞機能、調製時間および／または再発までの時間が原因で全ての適格患者が療法を受けることができるとは限らないので、ｖｅｉｎ－ｔｏ－ｖｅｉｎ ｔｉｍｅが極めて重要である。現在利用可能な療法の効力および／または毒性は変動する。簡単に述べると、患者においてＴ細胞に欠陥があると、製品の効力が影響を受けることがある。そのような変動性により、予測不可能な処置転帰が引き起こされ得る。さらに、少なくないグレード３～４サイトカイン放出により症候群および神経毒性が引き起こされる。ロジスティックスが複雑であること、規模が非効率なものであること、および利用可能性が限定的であることを考慮すると、作製費用が高い。したがって、製造不首尾として、これだけに限定されないが、患者の出発材料が限定されていることに起因して、個別化療法における在庫を創出することができないこと、および再処置が困難になる恐れがあることが挙げられる。
【0342】
これらの問題に対処するために、ヒト初代ＮＫ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を送達し、ヒト初代ＮＫ細胞におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の機能を試験するための、ガンマレトロウイルスベクター（ＰＣＩＲ）媒介性遺伝子移入の独特の使用が本発明で提供される。
【0343】
レンチウイルスおよびレトロウイルスベクター媒介性遺伝子送達は、遺伝子操作のための安全なやり方であることが証明されている。しかし、多くの報告およびさらには出願人自身の実験においても、従来のレンチウイルスベクター媒介性形質導入が、ＮＫ細胞に対しては、導入遺伝子の発現がＣＡＲ－ＮＫ拡大中に劇的に減少することに起因して非効率である。例えば、図５Ａおよび５Ｃを参照されたい。したがって、レンチウイルスベクターの非効率性を克服するために、代替の遺伝子送達方法を見いだすことにさらに務めた。
【0344】
第１に、モロニーマウス白血病ウイルス由来ＳＦＧガンマレトロウイルスベクターを、末梢血（ＰＢ）由来ヒト初代ＮＫ細胞への遺伝子送達に関して試験した。
【0345】
図１に示されている通り、本開示において使用した初代ヒトＮＫ細胞は、末梢血（ＰＢ）由来であり、ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９８－１８５）を用いて単離したものであった。細胞をＣＤ５６およびＣＤ３抗体で染色することによって純度を決定し（図２Ａ）、ＮＫ細胞をＣＤ５６＋／ＣＤ３－集団と定義した。ＮＫ細胞を、ＮＫ ＭＡＣＳ培地（１３０－１１４－４２９）を用い、５０ＩＵ／ｍｌのヒトＩＬ－２および照射処理したＫ５６２－ｍｂ２１－４１ＢＢＬフィーダーの存在下、１：１の比で培養した。全てのガンマレトロウイルスプラスミド（ＰＣＩＲ）をＰＥＱ－ＰＥＭ３（－Ｅ）を用いてパッケージングし、ＢａＥＶＴＲまたはＲＤ１１４ＴＲプラスミドを１．５：１．５：１の比で用いてエンベロープを持たせ、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）にリポフェクタミン３０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｌ３００００７５）またはＰＥＩ ＭＡＸ ４０Ｋ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ、Ｃａｔ＃２４７６５）によって一過性にトランスフェクトした。ＢａＥＶＴＲプラスミドは、ＲＤ１１４ＴＲによって認識されるＡＳＣＴ－２と比較して、２種のウイルス侵入受容体ＡＳＣＴ－１およびＡＳＣＴ－２を発現する活性化されたＮＫ細胞へのより大きな挿入断片の送達に関して、実際に有益である。レトロネクチン試薬（ＴａｋａＲａ、Ｔ１００Ａ／Ｂ）がコーティングされた非組織培養プレートを使用して、上記のレトロウイルス粒子を活性化されたＮＫ細胞（７日間培養したもの）に感染させて直接力価測定を実施し、ＣＡＲ－ＮＫ生成のためにＭＯＩ３を使用した。明白に、単離し、５日間培養した後、初代ＮＫ細胞は顕著な増殖状態に入り、したがって、６～１０日目の活性化されたＮＫ細胞を遺伝子送達のために使用した（図２Ｂ）。
【0346】
次いで、感染後３日目に形質導入効率を評定した。富化、拡大、機能および他の治療適用を実施した。
【0347】
実験結果から、感染後、７３．５１％～８２．８１％までにわたる別個の生存率が高いＮＫ細胞（大まかな生存細胞ゲートを、低前方散乱（ＦＳＣ）および高側方散乱（ＳＳＣ）事象を除外することによって線引きすることができる）（図３Ｂ）、３ドナーの間で６５．１１％～７２．７５％までにわたるＥＧＦＲ ＣＡＲ遺伝子（Ｆａｂ－ＡＦ６４７陽性）形質導入効率（図３Ｃ）、ならびに感染後８日目において３ドナーにおいて最初の感染ＮＫ数と比較して２５倍、３４倍および４５倍の高度の増殖状態の収率（図３Ｄ）が示された。この広範囲にわたる最適化により、初代ヒトＮＫ細胞へのＣＡＲ構築物の５０％～８０％の効率；８日間でＣＡＲ ＮＫ細胞の１，０００～２，０００万個から数億個までの２５～４５倍のｅｘ ｖｉｖｏ拡大；およびｅｘ ｖｉｖｏにおけるＮＫ細胞拡大でのＣＡＲの十分な保持での一貫した形質導入が可能になる。
【0348】
より長期間にわたる培養の試験を行った。例えば、図７を参照されたい。この本明細書に開示される広範囲にわたる最適化により、１７～２４日間でＮＫ細胞数千万個から数百億個までの拡大が可能になり、解凍時に優れた生存率を有する凍結した真に既製品として使える製品がもたらされた。商業的製造の費用は、少なくとも、用量当たり約２０００ドルであり、バッチ当たり５００を超える用量である。
【0349】
同じ送達戦略を用いた、同じ増殖状態（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ ｓｔａｔｅ）にある活性化されたＮＫ細胞の直接感染に基づくレトロウイルス力価測定が図４に提示されている。
【0350】
さらに、選別後１０日目に、ＰＣＩＬ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫおよびＰＣＩＬ－ＧＦＰ空ベクター対照についてはどちらもＧＦＰ陽性細胞がおよそ１００％から３９％まで有意に減少した（図５Ａおよび５Ｃ）。しかし、フロー分析により、選別後１０日目、１４日目および２５日目に、ＰＣＩＲ－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫについて高度に安定な形質導入された遺伝子の発現が認められたことが実証された（図５Ｂおよび５Ｃ）。
【0351】
空ベクター切断型ＣＤ１９（ＥＶ－Ｔｃｄ１９）およびＥＧＦＲ導入遺伝子について別々に平均８５％（ＣＤ１９－ＰＥ陽性）および７９．６％（ヤギ抗マウスＦａｂ－ＡＦ６４７陽性）の形質導入率がさらに観察された（図６Ａ）。また、操作されたＥＧＦＲ－ＣＡＲ－ＮＫについて、空ベクターニセ形質導入および形質導入されていないＮＫ群と比較して動的なリアルタイム殺滅が認められ、生細胞指標が最低であった（図６Ｂ）。
【0352】
第２に、拡大された初代ＮＫ細胞のレトロウイルスによる形質導入の時点を最適化した。ガンマ－レトロウイルスは分裂している細胞に効率的に感染することができるので、遺伝子送達のための、成長曲線および初代ＮＫ細胞が顕著な増殖状態に入った時点を決定した。
【0353】
第３に、いくつかの試験により、ヒト初代リンパ球の形質導入効率が、レトロウイルスベクターを被覆するために使用したエンベロープタンパク質の型に依存し、活性化されたＮＫ細胞が、標的への侵入に使用されるヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ－ＴＲ）である受容体ＡＳＣＴ－１およびＡＳＣＴ－２を高度に発現することが実際に示されている。ＡＳＣＴ－２受容体は、細胞への侵入に使用されるネコ内因性レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＲＤ１１４ＴＲ）でもあり、したがって、ＢａＥＶＴＲおよびＲＤ１１４ＴＲの両方を試験した。ＢａＥＶＴＲプラスミドは、タンデムＣＡＲ、デュアルＣＡＲおよびＢｉＴＥ ＣＡＲなどのより大きな挿入断片の送達のために実際に使用されている。
【0354】
次に、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ試薬は、標的細胞およびビリオンの共局在を補助することによってレトロウイルス媒介性遺伝子形質導入を増強することができることが証明されている。具体的には、ウイルス粒子がＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ試薬とＨ－ドメインとの相互作用によって結合し、標的細胞が主に細胞表面インテグリン受容体ＶＬＡ－５およびＶＬＡ－４とそれぞれフィブロネクチンＣ－ドメインおよびＣＳ－１部位との相互作用を通じて結合する。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ試薬は、接近を容易にすることにより、インテグリン受容体ＶＬＡ－４および／またはＶＬＡ－５を発現する標的細胞へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入を増強することができる。
【0355】
さらに、異なる細胞型に基づく間接的な測定方法によって算出される力価測定の過大評価または過小評価を回避するために、同じ送達戦略を用いた、同じ増殖状態（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ ｓｔａｔｅ）における活性化されたＮＫ細胞の直接感染に基づくレトロウイルス力価測定についての決定を行った。
【0356】
本明細書に開示される所見から、ＲＤ１１４－ＴＲまたはＢａＥＶ－ＴＲでシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎと組み合わせて使用することが、ヒト初代ＮＫ細胞に治療用遺伝子を高い形質導入効率、持続的な導入遺伝子発現、ならびに高度な細胞生存率および拡大率で送達するための上首尾の戦略であることが示される。
【0357】
一部の実施形態では、ＮＫ細胞を健康な新生児の臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）から採取した。最良のＮＫ細胞候補の選択を開示されている通り実施した。次いで、フィーダー細胞（例えば、本明細書に開示されるａＡＰＣなど）を使用してＮＫ細胞を拡大させた。拡大したＮＫ細胞に形質導入を行って、ＣＡＲならびに／または自殺スイッチ、抗体およびサイトカインなどの他の成分を発現するようにした。また外因性ＩＬ－２により、ｅｘ ｖｉｖｏにおける拡大の継続を駆動した。次いで、最終的な細胞産物を回収し、凍結保存し、患者に既製品として投与するために高い生存率で解凍した。
【0358】
一部の実施形態では、そのような方法により、ＮＫ細胞拡大のための最良の臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）産物を選択することが可能になる。本明細書に開示されるａＡＰＣと共培養することにより、大規模なＮＫ細胞拡大が実現される。この作製方法により、必要なレトロウイルスの数量が大幅に減少し、ＮＫ細胞拡大のための時間の２０％の短縮がもたらされる。ＣＡＲを発現させる高い形質導入効率が実現される。
【0359】
実験番号２：細胞療法：プロセス開発試験
これだけに限定されないが、ＳｔｅｍＳｐａｎ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ＃０９９６０）、ＮＫ ＭＡＣＳ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０－１１４－４２９；ＧＭＰ：１７０－０７６－３５６）、ＴｅｘＭＡＣＳ（１７０－０７６－３０６ ＧＭＰ培地（ｍｅｄｉｕｍ））、およびＣｅｌｌｇｅｎｉｘ Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＣＧＭ、＃２０８０６－０５００）を含めた、ＮＫの成長および／または増幅を支持するための培地および／または添加剤についての試験を行った。
これだけに限定されないが、ＳｔｅｍＳｐａｎ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ＃０９９６０）、ＮＫ ＭＡＣＳ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０－１１４－４２９；ＧＭＰ：１７０－０７６－３５６）、ＴｅｘＭＡＣＳ（１７０－０７６－３０６ ＧＭＰ培地（ｍｅｄｉｕｍ））、およびＣｅｌｌｇｅｎｉｘ Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＣＧＭ、＃２０８０６－０５００）を含めた、ＮＫの成長および／または増幅を支持するための培地および／または添加剤についての試験を行った。
【0360】
収率を最適化するために、以下：１００～５００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１のうちの１つまたは複数、またはこれらの任意の組合せなどのサイトカイン添加剤を比較した。
【0361】
ＮＫ細胞富化を実施した。以下の市販のキットを試験し、比較した：Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ＮＫ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ＥａｓｙＳｅｐ ＮＫ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（１７９５５ＲＦ）、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ＮＫ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（＃１５０６５）とＭｉｌｔｅｎｙｉ ＮＫ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（１３０－０９２－６５７）およびＣＤ５６＋ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（１３０－０９２－６６０）。
【0362】
種々のＣＤ３枯渇キットを、ＣＤ３＋細胞の＜０．３％（すなわち、枯渇を有する細胞集団の０．３％未満）までの減少について試験する。これらのキットには、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｔｉ １３０－０９６－５３５を含む。
【0363】
操作されたＫ５６２細胞（例えば、膜結合ＩＬ－１５（ｓｕｓｈｉドメイン）および／またはＩＬ－２１を発現するものなど）を生成した。操作された細胞のマスターセルバンク（ＭＣＢ）および／またはワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を現行の医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）に従って開発した。
【0364】
さらに、これだけに限定されないが、以下の試験：無菌性、内毒素、マイコプラズマ、外来ウイルス試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ）、ＰＣＲに基づくウイルス試験、アイソザイムアッセイ、核型分析、Ｓ＋Ｌ－などのうちの１つまたは複数を含めた、Ｋ５６２ ＭＣＢおよびＷＣＢバンクのリリース試験を完了させる。さらに、Ｋ５６２マーカー同時発現の安定性、例えば、ＣＤ６４／ＦｃγＲＩ、ＣＤ８６／Ｂ７－２、ＣＤ１３７Ｌ／４－１ＢＢＬ、切断型ＣＤ１９および膜結合ＩＬ－２１を４週間の培養時間にわたって、および照射処理後（２１日間の培養）に決定する。Ｋ５６２細胞の照射処理を試験して、照射装置が適格／有効であることを確実にする。５０、１００、１５０Ｇｙでの照射処理の照射処理後１～１４日目にプレーティングした後、成長および／または生存率のカイネティクスを試験する。
【0365】
臍帯血由来ＮＫ細胞の拡大を、照射処理されたＫ５６２細胞を種々のＮＫ：Ｋ５６２比、例えば、１：２；１：１；１：３、１：５の比で使用して試験する。
【0366】
形質導入効率を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎをコーティングしたプレートと比較する形で、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎをコーティングしたＡＦＣバッグを使用して比較する。
【0367】
次いで、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ、Ｘｕｒｉ、ＢｉｏｆｌｏｗおよびＸｃｅｌｌｅｒｅｘバイオリアクターシステムを比較することにより、プロセスをスケールアップする。
【0368】
１×１０８個のＣＤ５６＋細胞から出発して、１×１０１１個よりも多くのＣＤ５６＋細胞が生成された。最初に小規模の培養を使用して試験を実施して、成長および増幅パラメータを定義し、機能性を確認した。理論に縛られることは望まないが、細胞は、高レベルの増幅に伴って効力を失い、したがって、細胞増幅と機能の間の平衡がスケールアップの重要な考慮事項である。
【0369】
使用した試験抗体／試薬には、これらに限定されないが、抗ＣＤ５６Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ６０５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、抗ＣＤ３ ＡＰＣ－Ｈ７、グランザイムＢ－ＰＥ－ＣＦ５９４、ＣＣＲ４－ＢＶ４２１、ＣＸＣＲ３－ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５、ＮＫｐ４６－ＢＶ７１１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）、ＣＤ５７－ＰｅｒＣＰ（Ｂｉｏｓｓ Ｗｏｂｕｒｎ ＭＡ）、抗ＣＤ１６ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ６５０、および抗ＣＤ１９ ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．）、ＣＤ４４－ＢＶ７８５、ＣＸＣＲ４－ＢＶ６０５、２Ｂ４－ＰＥ、ＮＫＧ２Ｄ－ＰＥ、ＤＮＡＭ－ＦＩＴＣ、ＴｂｅｔＢＶ７１１、ＣＤ１６－ＢＶ６５０、ＣＸ３ＣＲ１－ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ６２Ｌ－ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＸＣＲ１－ＰＥ、ＣＣＲ７－ＦＩＴＣ、ＰＤ－１－ＢＶ４２１、ＮＫｐ３０－ビオチン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから）、ＮＫｐ４４－ＰｅｒＣＰ－ｅｆｌｏｕｒ ７１０、エオメソデルミン－ｅｆｌｕｏｒ－６６０、ＫＬＲＧ－１－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）、ＤＡＰ１２－ＰＥ、ＣＤ１５８－ＦＩＴＣ（Ｒ＆Ｄ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）、ＤＡＰ１０－ＦＩＴＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｏｎｌｉｎｅ Ａｔｌａｎｔａ ＧＡ）、ＮＫＧ２Ａ－ＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｒｖｉｎｇ、ＴＸ）が含まれる。
【表1】
【0370】
上記の通り、これだけに限定されないが、クローナルなＫ５６２－遺伝子改変細胞のバンクを創出すること（細胞がクローナルでない場合には再クローニング）；バンクの生存率、無菌性、マイコプラズマ、内毒素、ＨＬＡ、および／または遺伝子改変された表面マーカー（例えば、ｍｂ ＩＬ－１５、ｍｂ ＩＬ－２１、ＣＤ６４、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌなど）について試験すること；Ｋ５６２－遺伝子改変細胞について試験成績書を作成すること；照射装置が較正されたものであり、用量投与が有効であることを確実にすること、ならびに細胞を１００Ｇｙ、２００Ｇｙで照射処理し、１４日間にわたって増殖／生存を試験することを含めたＫ５６２試験を実施する。
【表2】
【0371】
これだけに限定されないが、以下：１型および２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；Ｉ型およびＩＩ型ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；ＣＭＶ、ジカ、ウエストナイル；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ；ＨＨＶ６／ＨＨＶ７のうちの１つまたは複数を試験することを含めた、ドナー適格性スクリーニングおよび同種異系製品の試験を実施した。
【0372】
臍帯血は、およそ５×１０８個の総有核細胞（ＴＮＣ）を含有し、そのうちの３０％がＮＫ細胞である。したがって、核臍帯血単位（６０ｍＬ）には約１～２×１０８個のＮＫ細胞が含有される。
【表3】
【表4】
【表5】
【0373】
ＮＫ純度を試験した。理論に縛られることは望まないが、患者に急性移植片対宿主病（体重１ｋｇ当たり≧０．５×１０５個のＴ細胞を受けた場合にＧｖＨＤ≧グレードＩＩ）が発生し、また、Ｔ細胞夾雑が体重１ｋｇ当たり０．０３×１０５個のＴ細胞であればＮＫ細胞の投薬は忍容性が良好であるので、ＮＫ製品からＴ細胞を減少させることが極めて重要であり、したがって、許容性基準が≦０．３％のＣＤ３＋細胞と規定される。例えば、Stern M, Passweg JR, Meyer-Monard S, et al. Preemptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective Phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant 2013; 48: 433-438を参照されたい。
【0374】
効力アッセイを実施した。ＣＡＲ＋およびＣＡＲ－標的細胞をＣＡＲ－ＮＫ細胞と共に、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１５およびＴＮＦ－アルファについのＥＬＩＳＡ；ならびに／または細胞傷害活性についてのアッセイ（例えば、殺滅アッセイ、ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイについてのＦＡＣＳなどの脱顆粒アッセイ、および細胞内サイトカインＩＦＮ－ガンマおよび／またはＴＮＦ－アルファについてのＦＡＣＳなど）使用して試験する。
実験番号３：サイズが大きい導入遺伝子を有するベクターを生成するための安定なレトロウイルスウイルスプロデューサー－２９３ＶＥＣ－ＢａＥＶ
実験番号３：サイズが大きい導入遺伝子を有するベクターを生成するための安定なレトロウイルスウイルスプロデューサー－２９３ＶＥＣ－ＢａＥＶ
【0375】
レトロウイルス侵入受容体の発現を、２９３Ｖｅｃ－ＧａｌＶおよび２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶパッケージング細胞、ならびに力価測定に使用した２種の細胞株Ｊｕｒｋａｔ ＴおよびＨＴ１０８０において評価した。
【0376】
レトロウイルスの中で、ヒヒ内因性ウイルス（ＢａＥＶ）とネコ内因性レトロウイルス（ＲＤ１１４）は、細胞への侵入のために共通の細胞表面受容体であるＡＳＣＴ２（ナトリウム依存性中性アミノ酸トランスポーター）を使用する。ＡＳＣＴ２に加えて、ＢａＥＶは、ＡＳＣＴ１も細胞侵入受容体として使用する。テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）は、ナトリウム依存性リン酸トランスポーター（Ｐｉｔ１）を侵入受容体として使用する。図８Ａを参照されたい。ＡＳＣＴ１、ＡＳＣＴ２、およびＰｉｔ１についての免疫染色を２種のパッケージング細胞株、２９３Ｖｅｃ－ＧａｌＶおよび２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶ、ならびに２種の力価測定用細胞株、Ｊｕｒｋａｔ ＴおよびＨＴ１０８０について実施した。図８Ｂに示されている結果を参照されたい。Ｊｕｒｋａｔ ＴおよびＨＴ１０８０のどちらの細胞株も、３種のレトロウイルスエンベロープタンパク質、ＢａＥＶ、ＲＤ１１４およびＧＡＬＶの侵入受容体を遍在的に発現しているので、これらの３種のレトロウイルスエンベロープタンパク質の力価測定のために使用することができる。２９３に基づくパッケージング細胞株、２９３Ｖｅｃ ＧＡＬＶおよび２９３Ｖｅｃ ＢａＥＶに関しては、ＧＡＬＶでシュードタイピングされたレトロウイルスのみが侵入受容体Ｐｉｔ１を使用して感染することができる。
【0377】
安定なレトロウイルスウイルスプロデューサー－２９３ＶＥＣ－ＢａＥＶを生成するための形質導入戦略のワークフローが本明細書に提示される。
【0378】
モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ－ＭｕＬＶ）に基づくレトロウイルスベクター（ＰＣＩＲ）を標的導入遺伝子送達ビヒクルとして使用する。ＢａＥＶでシュードタイピングされた２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶパッケージング細胞株を、臍帯血由来ＮＫ細胞への感染のためのビヒクル作製のために使用した。
【0379】
２種のパッケージング細胞株をこの作製のために使用した：一過性テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）でシュードタイピングされた上清を作製するために、２９３Ｖｅｃ－ＧＡＬＶ、および最終的なベクターを生成するために、２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶ。どちらの細胞株もＢｉｏＶｅｃ Ｐｈａｒｍａから供給されたものであった。
【0380】
第１に、ＧＡＬＶでシュードタイピングされたレトロウイルス上清を、パッケージング細胞株２９３Ｖｅｃ－ＧＡＬＶに試薬ＰＥＩ ＭＡＸ ４０Ｋ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ、Ｃａｔ＃２４７６５）を一過性にトランスフェクトすることによって生成した。簡単に述べると、トランスフェクションの前日に、６０万個の２９３Ｖｅｃ－ＧＡＬＶを、１０％熱失活ウシ胎仔血清を補充した完全ＤＭＥＭ培地３ｍｌ中、６ウェルプレートのウェルに播種した。トランスフェクション日に、２９３Ｖｅｃ－ＧＡＬＶは８０％集密であるべきである。標的導入遺伝子を含有する単一のＭｏ－ＭｕＬＶに基づくレトロウイルスベクター合計２．５μｇをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ－Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ１５０μｌ中に希釈した。その間に、合計１０μｇ／１０μｌのＰＥＩ ＭＡＸ ４０ＫもＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ－Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ１５０μｌ中に希釈した。プラスミド／ＤＮＡとＰＥＩ ＭＡＸ ４０Ｋの比は１：４である。次いで、希釈したＤＮＡをＰＥＩ ４０Ｋに添加し、十分に混合し、フード内、室温で１２分間インキュベートした。インキュベーション後、ＤＮＡ－ＰＥＩ ＭＡＸ ４０Ｋ複合体３００μｌを培養物３ｍｌ中の細胞に穏やかに一滴ずつ添加した。
【0381】
次いで、バルクプロデューサーを作製するために、この上清を使用してＢａＥＶでシュードタイピングされたパッケージング細胞株２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶに形質導入した。高力価クローンを生成するために、この２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶバルクプロデューサーを限界希釈によってさらに単一細胞クローニングし、各クローンから生成された上清の力価測定によって選択された高力価クローンについてスクリーニングすることができる。
【0382】
次いで、高力価の安定なレトロウイルスウイルスプロデューサー－２９３ＶＥＣ－ＢａＥＶから上清を継続的に作製することができる。
【0383】
サイズが大きい導入遺伝子を有するベクターについて、安定なレトロウイルスウイルスプロデューサー－２９３ＶＥＣ－ＢａＥＶからの未加工の上清の力価の改善が観察された。図１０を参照されたい。
【0384】
「複数の標的を組み合わせて１つにする（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｏｎｅ）」は、出願人によって開発された独特の治療戦略である。ＢａＥＶでシュードタイピングされた２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶパッケージング細胞株をビヒクル作製のために使用した。大きな導入遺伝子挿入断片（＞１１ｋｂ）を有するプラスミドのための代表的なレトロウイルスが２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶパッケージング細胞によって一過性にも安定にも作製された。合計３５０万個の２９３Ｖｅｃ－ＢａＥＶパッケージング細胞を１００ｍｍの組織培養皿に播種し、３７℃で４８～７２時間インキュベートした。プレートの集密度を９０～１００％に到達させるべきである。次いで、未加工の上清を収集し、１５００ｇで５分間高速回転させた。上記の上清の力価測定をＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞で実施した。ウイルス上清の段階希釈物を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎが予めコーティングされた組織培養処理されていない２４ウェルプレートにローディングし、１０％熱失活ウシ胎仔血清を補充した完全ＤＭＥＭ培地を用いて５００μｌにした。プレートを３２℃、２０００ｇで２時間にわたって遠心沈澱させ、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞１０万個を添加し、１０００ｇで５分間高速回転させた。プレートを３７℃で４８時間インキュベートし、次いで、力価（形質導入単位／ｍｌ）を形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬ＝［（標的細胞数）×（％陽性細胞）］の式に従って決定するためにフローサイトメトリー分析を実施した。この例では、レポーター遺伝子ＲＱＲ８をヒトＣＤ３４抗体に対するフロー抗体（ＱＢＥｎｄ／１０）（アロフィコシアニン）（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＬＬＣ、＃ＦＡＢ７２２７Ａ）によって検出した。Ｂ）。サイズが大きい導入遺伝子を有するベクターについて、安定なレトロウイルスウイルスプロデューサー－２９３ＶＥＣ－ＢａＥＶ（ＴＵ＝７．２Ｅ５）からの未加工の上清の力価が、一過性に作製されたウイルス（ＴＵ＝２．２Ｅ５）と比較して改善されている。
【0385】
均等物
本発明を上記の実施形態と併せて記載したが、前述の説明および例は、例示することを意図したものであり、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内に入る他の態様、利点および改変が、本発明が関する分野の当業者には明らかになるであろう。
本発明を上記の実施形態と併せて記載したが、前述の説明および例は、例示することを意図したものであり、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内に入る他の態様、利点および改変が、本発明が関する分野の当業者には明らかになるであろう。
【0386】
本開示を特定の実施形態および必要に応じた特色によって具体的に開示したが、本明細書において開示されているその中の実施形態の改変、改善および変形を当業者が行うことができること、ならびに、そのような改変、改善および変形が本開示の範囲内に入るとみなされることが理解されるべきである。本明細書で提供される材料、方法および実施例は、特定の実施形態を代表するものであり、例示であり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【0387】
本開示の範囲を本明細書において広範かつ包括的に記載した。包括的な開示の範囲内に入る狭義の種および下位概念の分類のそれぞれも本開示の一部を形成する。これには、排除される材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、類概念から何らかの対象物を排除する条件または否定的な限定を伴う、包括的な説明が含まれる。
【0388】
さらに、本発明の特色または態様がマーカッシュ群で記載されている場合、それによって、本発明がマーカッシュ群の全ての個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されることが当業者には理解されよう。
【0389】
本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それぞれが個別に参照により組み込まれる場合と同じ程度に、明白にその全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含めた本明細書が優先される。
【0390】
部分配列一覧表
ＩｇＧ１ヒンジドメイン：LEPKSCDKTHTCPPCPDPKGT（配列番号１）
ＩｇＧ１ヒンジドメイン：LEPKSCDKTHTCPPCPDPKGT（配列番号１）
【0391】
ＣＤ２８膜貫通および細胞質ドメイン：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（配列番号２）
【0392】
ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号３）
【0393】
ＩＬ２シグナルペプチド：MYRMQLLSCIALSLALVTNS（配列番号４）、
【0394】
ＩｇＧ１シグナルペプチド：MGWSSIILFLVATATGVH（配列番号５）
【0395】
抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性ドメインのＣＤＲ：
CDRL1:SGSSSNIGNNAVN（配列番号６）
CDRL2: YDDLLPS（配列番号７）
CDRL3: AAWDDSLNGPV（配列番号８）
CDRH1: GFTFSSY（配列番号９）
CDRH2: RYDGSN（配列番号１０）
CDRH3: DRGLGDGTYFDY（配列番号１１）
CDRL1:SGSSSNIGNNAVN（配列番号６）
CDRL2: YDDLLPS（配列番号７）
CDRL3: AAWDDSLNGPV（配列番号８）
CDRH1: GFTFSSY（配列番号９）
CDRH2: RYDGSN（配列番号１０）
CDRH3: DRGLGDGTYFDY（配列番号１１）
【0396】
抗ＮＫＧ２Ｄ軽鎖可変領域：QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL（配列番号１２）
【0397】
抗ＮＫＧ２Ｄ重鎖可変領域：QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS（配列番号１３）
【0398】
ペプチドリンカー：GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号１４）
【0399】
ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域：ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号８１）
【0400】
Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＮ２９７Ｑ突然変異（すなわち、それぞれ配列番号８１のａａ１６、ａａ１７およびａａ７９における突然変異）を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域等価物ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号８２）
【0401】
ヒト筋肉アルドラーゼ（ＨＭＡ）ペプチドリンカー：PSGQAGAAASESLFVSNHAY（配列番号８３）
【0402】
検出可能マーカー：YPYDVPDYA（配列番号８４）
【0403】
Ｔ２Ａペプチド：HVGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号８５）
【0404】
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列：ATGGGGTGGTCAAGCATTATTCTGTTTCTGGTCGCTACCGCTACAGGCGTCCAT（配列番号８６）
【0405】
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列：ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT（配列番号８７）
【0406】
リンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列：GGTGGGGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGAGGTGGCAGT（配列番号８８）
【0407】
膜貫通および細胞質ドメインをコードするヌクレオチド配列：TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC（配列番号８９）
【0408】
シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列：AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC（配列番号９０）またはその等価物；
【0409】
切断可能なペプチドをコードするヌクレオチド配列：CACGTGGGTTCTGGAGAAGGACGCGGTTCCTTGTTGACGTGTGGCGATGTAGAGGAAAATCCGGGTCCA（配列番号９１）
【0410】
リンカーをコードするヌクレオチド配列：CCGAGCGGCCAGGCGGGCGCGGCGGCATCGGAGTCCCTGTTTGTGTCAAATCACGCCTAC（配列番号９２）
【0411】
ヒンジドメインをコードするヌクレオチド配列：CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCGGATCCCAAAGGTACC（配列番号１０９）
【0412】
ペプチドリンカー：（グリシン－セリン）ｎ（ｎは１から６までの整数である）（配列番号１１０）
【0413】
６×Ｈｉｓタグ：His His His His His His（配列番号１１１）
【0414】
ヒンジドメイン：ＩｇＧ１重鎖ヒンジコード配列：CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG（配列番号１１２）
【0415】
ＣＤ２８膜貫通領域コード配列：TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG（配列番号１１３）
【0416】
４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域コード配列：AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG（配列番号１１４）
【0417】
ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域コード配列：AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC（配列番号１１５）
【0418】
ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域コード配列：AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA（配列番号１１６）
【0419】
ヒトＣＤ８アルファヒンジドメイン：PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY（配列番号１１７）。
【0420】
マウスＣＤ８アルファヒンジドメイン：KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY（配列番号１１８）。
【0421】
ネコＣＤ８アルファヒンジドメイン：PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY（配列番号１１９）。
【0422】
ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT（配列番号１２０）。
【0423】
マウスＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：IWAPLAGICVALLLSLIITLI（配列番号１２１）。
【0424】
ラットＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：IWAPLAGICAVLLLSLVITLI（配列番号１２２）。
【0425】
４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号１２３）
【0426】
ＣＤ２８配列：MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS（配列番号１２４）
【0427】
ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域コード配列：acaaaaaaga agtattcatc cagtgtgcac gaccctaacg gtgaatacat gttcatgaga gcagtgaaca cagccaaaaa atccagactc acagatgtga cccta（配列番号１２５）
【0428】
ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域コード配列：AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT GGGGGAGGCA GTTTCCGGAC CCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC（配列番号１２６）
【0429】
リンカー：ＧＧＧＧＳ（配列番号１３４）。
【0430】
リンカー：（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎは１（配列番号１３４）、または２（配列番号１３５）、または３（配列番号１４）、または４（配列番号１３６）、または５（配列番号１３７）、または６（配列番号１３８）、または７（配列番号１３９）、または８（配列番号１４０）、または９（配列番号１４１）、または１０（配列番号１４２）、または１１（配列番号１４３）、または１２（配列番号１４４）、または１３（配列番号１４５）、または１４（配列番号１４６）、または１５（配列番号１４７）、またはそれよりも大きい整数であり得る）。
【0431】
ＥＦ１アルファプロモーター配列：AAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC（配列番号１４８）
【0432】
配列番号７１のリバース配列：AVGTIVDQSAK（配列番号１５１）
【0433】
ＩｇＧ１重鎖シグナルペプチドＤＮＡ
ATGGAATTTGGGCTGCGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGATGTCCAGTGT（配列番号１６８）
ATGGAATTTGGGCTGCGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGATGTCCAGTGT（配列番号１６８）
【0434】
タンパク質
MEFGLRWVFLVAILKDVQC（配列番号１６９）
MEFGLRWVFLVAILKDVQC（配列番号１６９）
【0435】
ＩｇＧ１ ＦｃＤＮＡ
GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGAGCTGCAACTGGAGGAGAGCTGTGCGGAGGCGCAGGACGGGGAGCTGGACGGGCTGTGGACGACCATCACCATCTTCATCACACTCTTCCTGTTAAGCGTGTGCTACAGTGCCACCGTCACCTTCTTCAAGGTGAAGTGGATCTTCTCCTCGGTGGTGGACCTGAAGCAGACCATCATCCCCGACTACAGGAACATGATCGGACAGGGGGCC（配列番号１７０）
GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGAGCTGCAACTGGAGGAGAGCTGTGCGGAGGCGCAGGACGGGGAGCTGGACGGGCTGTGGACGACCATCACCATCTTCATCACACTCTTCCTGTTAAGCGTGTGCTACAGTGCCACCGTCACCTTCTTCAAGGTGAAGTGGATCTTCTCCTCGGTGGTGGACCTGAAGCAGACCATCATCCCCGACTACAGGAACATGATCGGACAGGGGGCC（配列番号１７０）
【0436】
ＩｇＧ１ ＦｃＤＮＡによってコードされるタンパク質
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESCAEAQDGELDGLWTTITIFITLFLLSVCYSATVTFFKVKWIFSSVVDLKQTIIPDYRNMIGQGA（配列番号１７１）
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESCAEAQDGELDGLWTTITIFITLFLLSVCYSATVTFFKVKWIFSSVVDLKQTIIPDYRNMIGQGA（配列番号１７１）
【0437】
本開示の例示される実施形態
実施形態１．改変ＲＤ１１４ネコ内因性レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＲＤ１１４ＴＲ）および改変ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶＴＲ）を含むシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子であって、
ａ．ＲＤ１１４ＴＲ糖タンパク質が、ＲＤ１１４糖タンパク質の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびに両種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ－Ａ）糖タンパク質の細胞質ドメインを含み、
ｂ．ＢａＥＶＴＲ糖タンパク質が、ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびにＭＬＶ－Ａ糖タンパク質の細胞質ドメインを含む、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子。
実施形態１．改変ＲＤ１１４ネコ内因性レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＲＤ１１４ＴＲ）および改変ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶＴＲ）を含むシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子であって、
ａ．ＲＤ１１４ＴＲ糖タンパク質が、ＲＤ１１４糖タンパク質の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびに両種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ－Ａ）糖タンパク質の細胞質ドメインを含み、
ｂ．ＢａＥＶＴＲ糖タンパク質が、ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびにＭＬＶ－Ａ糖タンパク質の細胞質ドメインを含む、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子。
【0438】
実施形態２．ＲＤ１１４ＴＲおよびＢａＥＶＴＲが、ガンマレトロウイルス粒子のエンベロープに膜タンパク質として組み入れられている、実施形態１に記載のシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子。
【0439】
実施形態３．エンベロープに封入されたベクターゲノムをさらに含み、ベクターゲノムが、２つの長いターミナルリピート（ＬＴＲ）に挟まれた以下：
（Ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、もしくは、必要に応じて抗体もしくはその断片、酵素、リガンドもしくは受容体から選択される別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｂ）（Ａ）のリバース相補体、または
（Ｃ）１つもしくは複数の認識部位を含むポリヌクレオチドであって、必要に応じて、認識部位が、ＣＡＲコード配列もしくはそのリバース相補体をポリヌクレオチドに挿入するために適した制限酵素によって認識され、切断されるものである、ポリヌクレオチド
のうちの１つまたは複数を含む、実施形態１または２に記載のシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子。
（Ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、もしくは、必要に応じて抗体もしくはその断片、酵素、リガンドもしくは受容体から選択される別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（Ｂ）（Ａ）のリバース相補体、または
（Ｃ）１つもしくは複数の認識部位を含むポリヌクレオチドであって、必要に応じて、認識部位が、ＣＡＲコード配列もしくはそのリバース相補体をポリヌクレオチドに挿入するために適した制限酵素によって認識され、切断されるものである、ポリヌクレオチド
のうちの１つまたは複数を含む、実施形態１または２に記載のシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子。
【0440】
実施形態４．ベクターゲノムが、以下：５’ＬＴＲ、５’キャップ、３’ポリＡ尾部、および３’ＬＴＲのうちの１つまたは複数をさらに含む、実施形態１から３のいずれか１つに記載のシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子。
【0441】
実施形態５．逆転写酵素またはインテグラーゼのいずれかまたは両方をさらに含む、実施形態１から４のいずれか１つに記載のシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子。
【0442】
実施形態６．以下の種：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、フレンドマウス胚性幹細胞ウイルス（ＦＭＥＶ）、異種指向性ＭｕＬＢ関連ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）およびネコ白血病ウイルスのうちのいずれか１つから選択される、実施形態１から５のいずれか１つに記載のシュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子。
【0443】
実施形態７．ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を調製するための方法であって、以下：ＮＫ細胞、ＮＫ細胞の誘導が可能な前駆細胞、またはＮＫ細胞の誘導が可能な幹細胞のうちの１つまたは複数を含む細胞集団を、免疫細胞活性化因子（例えば、ＮＫ細胞活性化因子など）と一緒に培養するステップを含み、細胞集団が、細胞集団中のＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖、ＴＣＲ β鎖、またはαβＴＣＲのうちの１つまたは複数を発現する細胞が枯渇したものであり、免疫細胞活性化因子が、以下の（ｉ）～（ｉｖ）：
（ｉ）必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／もしくは刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）もしくはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、
（ｉｉ）ＮＫ細胞、前駆細胞もしくは幹細胞のうちの１つもしくは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させる抗体もしくはその抗原結合性断片であって、必要に応じて、抗体が、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、抗ＤＮＡＭ－１抗体、抗２Ｂ４抗体、抗ＮＴＢ－Ａ抗体、もしくは抗ＮＫｐ４６（天然細胞傷害性受容体１（ＮＣＲ１））抗体のうちの１つもしくは複数から選択される、抗体もしくはその抗原結合性断片のうちの１つもしくは複数、
（ｉｉｉ）それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させるサイトカインのうちの１つもしくは複数、または
（ｉｖ）必要に応じて、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤もしくはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）から選択される、それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させる化学的部分のうちの１つもしくは複数
のうちの１つまたは複数から選択される、方法。
（ｉ）必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／もしくは刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）もしくはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、
（ｉｉ）ＮＫ細胞、前駆細胞もしくは幹細胞のうちの１つもしくは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させる抗体もしくはその抗原結合性断片であって、必要に応じて、抗体が、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、抗ＤＮＡＭ－１抗体、抗２Ｂ４抗体、抗ＮＴＢ－Ａ抗体、もしくは抗ＮＫｐ４６（天然細胞傷害性受容体１（ＮＣＲ１））抗体のうちの１つもしくは複数から選択される、抗体もしくはその抗原結合性断片のうちの１つもしくは複数、
（ｉｉｉ）それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させるサイトカインのうちの１つもしくは複数、または
（ｉｖ）必要に応じて、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤もしくはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）から選択される、それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させる化学的部分のうちの１つもしくは複数
のうちの１つまたは複数から選択される、方法。
【0444】
実施形態８．ＣＡＲ、もしくは必要に応じて抗体もしくはその断片、酵素、リガンドもしくは受容体から選択される別の治療用タンパク質もしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、発現させるために、培養された細胞集団に導入するステップであって、ＣＡＲが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）もしくはウイルス抗原を特異的に認識し、これに結合するものである、ステップをさらに含む、実施形態７に記載の方法。
【0445】
実施形態９．実施形態８の導入するステップの後に細胞集団を免疫細胞活性化因子と一緒に培養するステップをさらに含み、免疫細胞活性化因子が、以下の（ｉ）～（ｉｖ）：
（ｉ）必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／もしくは刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）もしくはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、
（ｉｉ）ＮＫ細胞、前駆細胞もしくは幹細胞のうちの１つもしくは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させる抗体もしくはその抗原結合性断片のうちの１つもしくは複数、
（ｉｉｉ）それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させるサイトカインのうちの１つもしくは複数、もしくは
（ｉｖ）必要に応じて、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤もしくはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）から選択される、それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させる化学的部分のうちの１つもしくは複数
のうちの１つもしくは複数から選択され、
必要に応じて、培養するステップを、同じまたは異なる免疫細胞活性化因子またはこれらの組合せを用いて１回、２回、３回、またはこれよりも多く繰り返す、
実施形態８に記載の方法。
（ｉ）必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／もしくは刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）もしくはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、
（ｉｉ）ＮＫ細胞、前駆細胞もしくは幹細胞のうちの１つもしくは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させる抗体もしくはその抗原結合性断片のうちの１つもしくは複数、
（ｉｉｉ）それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させるサイトカインのうちの１つもしくは複数、もしくは
（ｉｖ）必要に応じて、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤もしくはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）から選択される、それによってＮＫ細胞を活性化するもしくは増殖させる化学的部分のうちの１つもしくは複数
のうちの１つもしくは複数から選択され、
必要に応じて、培養するステップを、同じまたは異なる免疫細胞活性化因子またはこれらの組合せを用いて１回、２回、３回、またはこれよりも多く繰り返す、
実施形態８に記載の方法。
【0446】
実施形態１０．ａＡＰＣが、４－１ＢＢＬ、膜結合（ｍｂ）ＩＬ－１５、ｍｂ ＩＬ－２１、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、ＭＩＣＡ、ＣＤ ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ｍｂ ＩＬ－２、ｍｂ ＩＬ－１８、ｍｂ ＩＬ－１２、ＣＤ２５結合性を欠くｍｂ ＩＬ－２変異体、ｍｂ ＩＬ－１５－Ｎ７２ＤスーパーアゴニストとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合タンパク質の複合体（ＩＬ－１５ＳＡ／ＩＬ－１５ＲαＳｕ－Ｆｃ）ＡＬＴ－８０３、またはＣＤ１２２／ＣＤ１３２シグナル伝達を媒介する細胞表面マーカーのうちの１つまたは複数をさらに発現する、実施形態７から９のいずれか１つに記載の方法。
【0447】
実施形態１１．ａＡＰＣが、ｍｂ ＩＬ－２１および４－１ＢＢＬをさらに発現する、実施形態７から１０のいずれか１つに記載の方法。
【0448】
実施形態１２．ａＡＰＣが、操作されたＫ５６２細胞である、実施形態７から１１のいずれか１つに記載の方法。
【0449】
実施形態１３．ａＡＰＣが、照射処理され、それによって細胞増殖を欠くまたは長期生存を欠くものである、実施形態７から１２のいずれか１つに記載の方法。
【0450】
実施形態１４．ａＡＰＣが、５０Ｇｙ、１００Ｇｙ、１５０Ｇｙまたは２００Ｇｙで照射処理されている、実施形態１３に記載の方法。
【0451】
実施形態１５．ａＡＰＣを、細胞集団と一緒に、約１０：１、約５：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：５、または約１：１０の細胞数の比で培養する、実施形態７から１４のいずれか１つに記載の方法。
【0452】
実施形態１６．サイトカインが、Ｂ７．１、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、低毒性ＩＬ－２、ＣＤ２５結合性を欠くＩＬ－２変異体、ＩＬ－７、ＩＬ－１５－Ｎ７２ＤスーパーアゴニストとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合タンパク質の複合体（ＩＬ－１５ＳＡ／ＩＬ－１５ＲαＳｕ－Ｆｃ；可溶性ＡＬＴ－８０３）、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＬＥＣ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、またはＭＩＣＡからなる群から選択される、実施形態７から１５のいずれか１つに記載の方法。
【0453】
実施形態１７．細胞集団を、１００～５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５、または２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１のうちのいずれか１つまたはいずれか２つまたは３つ全てと一緒に培養する、実施形態１６に記載の方法。
【0454】
実施形態１８．細胞集団を、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２および０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５のいずれかまたは両方と一緒に培養する、実施形態１６に記載の方法。
【0455】
実施形態１９．細胞集団を、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２と一緒に培養する、実施形態１６に記載の方法。
【0456】
実施形態２０．導入するステップの前後に細胞集団と一緒に培養される活性化因子が、同じものである、実施形態９から１９のいずれか１つに記載の方法。
【0457】
実施形態２１．導入するステップの前後に細胞集団と一緒に培養される活性化因子が、互いに異なるものである、実施形態９から１９のいずれか１つに記載の方法。
【0458】
実施形態２２．シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を培養された細胞集団に導入し、それによって、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを培養された細胞に導入するステップを含み、粒子が、２つの長いターミナルリピート（ＬＴＲ）に挟まれたＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたはそのリバース相補体、ＲＤ１１４ＴＲ、およびＢａＥＶＴＲを含む、実施形態８から２１のいずれか１つに記載の方法。
【0459】
実施形態２３．シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子が、５’ＬＴＲ、５’キャップ、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたはそのリバース相補体、３’ポリＡ尾部、および３’ＬＴＲを含むベクターゲノムを含む、実施形態２２に記載の方法。
【0460】
実施形態２４．シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子が、逆転写酵素およびインテグラーゼのいずれかまたは両方をさらに含む、実施形態２２または２３に記載の方法。
【0461】
実施形態２５．シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、フレンドマウス胚性幹細胞ウイルス（ＦＭＥＶ）、異種指向性ＭｕＬＢ関連ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）およびネコ白血病ウイルスのうちの任意の種から選択される、実施形態２２から２４のいずれか１つに記載の方法。
【0462】
実施形態２６．シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を、培養された細胞集団に、約０．１、約０．２、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９または約１０の感染多重度（ＭＯＩ）で導入する、実施形態２２から２５のいずれか１つに記載の方法。
【0463】
実施形態２７．細胞集団を、導入するステップの前に少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、または少なくとも約１０日間にわたって培養する、実施形態８から２６のいずれか１つに記載の方法。
【0464】
実施形態２８．細胞集団を、導入するステップの前に７日間以下、８日間以下、９日間以下、１０日間以下、１１日間以下、１２日間以下、１３日間以下、１４日間以下、１５日間以下、３週間以下、または１カ月以下にわたって培養する、実施形態８から２７のいずれか１つに記載の方法。
【0465】
実施形態２９．細胞集団を、導入するステップの前に約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、または約１０日間にわたって培養する、実施形態８から２７のいずれか１つに記載の方法。
【0466】
実施形態３０．ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを、細胞集団に、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたはそのリバース相補体を含むウイルスベクターをＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎの存在下で形質導入することによって導入する、実施形態８から２９のいずれか１つに記載の方法。
【0467】
実施形態３１．ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎが、細胞集団への形質導入を行う容器の内部表面にコーティングされている、実施形態３０に記載の方法。
【0468】
実施形態３２．細胞集団が、インテグリンα４β１（ＶＬＡ－４）およびインテグリンα５β１（ＶＬＡ－５）のいずれかまたは両方を発現する、実施形態３０または３１に記載の方法。
【0469】
実施形態３３．細胞集団が、対象の血液試料から単離されたものである、実施形態７から３２のいずれか１つに記載の方法。
【0470】
実施形態３４．細胞集団が、対象の臍帯血、対象の末梢血、または対象の骨髄のうちの１つまたは複数から単離されたものである、実施形態７から３３のいずれか１つに記載の方法。
【0471】
実施形態３５．細胞集団が、前駆細胞、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来細胞、胚性生殖細胞、胚性生殖細胞由来細胞、幹細胞、幹細胞由来細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または不死化細胞を含む、実施形態７から３４のいずれか１つに記載の方法。
【0472】
実施形態３６．細胞集団中のＣＤ５６、ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ２１２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１８、ＣＤ３６０、ＴＧＦ－βＲ、またはＩＬ－１０Ｒのうちの任意の１つまたは複数を発現する細胞を富化させるステップをさらに含み、必要に応じて、ＣＤ５６ｄｉｍ細胞およびＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞のいずれかまたは両方を富化させるステップをさらに含む、実施形態７から３５のいずれか１つに記載の方法。
【0473】
実施形態３７．任意の細胞集団が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはその実質的に精製された組成物を含む、実施形態７から３６のいずれか１つに記載の方法。
【0474】
実施形態３８．枯渇を有する細胞集団が、以下：ＮＫ細胞、前駆細胞、ＨＳＣ、ｉＰＳＣまたはそのそれぞれの実質的に精製された集団のうちの１つまたは複数を含む、実施形態７から３７のいずれか１つに記載の方法。
【0475】
実施形態３９．ＮＫ細胞が、以下：前駆細胞、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来細胞、胚性生殖細胞、胚性生殖細胞由来細胞、幹細胞、幹細胞由来細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または不死化細胞のうちの１つまたは複数から誘導されたものを含む、実施形態３７または３８に記載の方法。
【0476】
実施形態４０．前駆細胞、ＨＳＣ、またはｉＰＳＣのうちの１つまたは複数が、ＮＫ細胞の誘導が可能なものである、実施形態３８に記載の方法。
【0477】
実施形態４１．いずれの細胞集団もＴ細胞を実質的に含まない、実施形態７から４０のいずれか１つに記載の方法。
【0478】
実施形態４２．いずれの細胞集団もＴ制御細胞を実質的に含まない、実施形態７から４１のいずれか１つに記載の方法。
【0479】
実施形態４３．いずれの細胞集団も、単離、富化または精製されたものである、実施形態７から４２のいずれか１つに記載の方法。
【0480】
実施形態４４．培養するステップにおいて、細胞集団およびａＡＰＣを、ＳｔｅｍＳｐａｎ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ＃０９９６０）；ＮＫ ＭＡＣＳ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０－１１４－４２９；ＧＭＰ：１７０－０７６－３５６）、ＴｅｘＭＡＣＳ（１７０－０７６－３０６ ＧＭＰ培地）、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＣＧＭ、＃２０８０６－０５００）、またはＳｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＸＦ Ｍｅｄｉｕｍから選択される細胞培養培地中で培養する、実施形態７から４３のいずれか１つに記載の方法。
【0481】
実施形態４５．ＣＡＲ発現集団を組成物として製剤化するステップ；およびＣＡＲ発現集団を凍結保存するステップのいずれかまたは両方をさらに含む、実施形態７から４４のいずれか１つに記載の方法。
【0482】
実施形態４６．１×１０８個の細胞から、１×１０１１個よりも多くの細胞が生成される、実施形態７から４５のいずれか１つに記載の方法。
【0483】
実施形態４７．ステップのうちの１つまたは複数の前またはその後に、細胞集団を洗浄するステップと、
ステップのうちの１つまたは複数の前またはその間またはその後に、以下：
（ｉ）細胞集団の生存率；
（ｉｉ）細胞集団の無菌性；
（ｉｉｉ）細胞集団中のマイコプラズマ；
（ｉｖ）細胞集団のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型；
（ｖ）細胞集団の細胞数；
（ｖｉ）細胞集団の細胞表現型；
（ｖｉｉ）細胞集団または細胞集団を含む組成物中のＨＨＶ６またはＨＨＶ７またはその両方；
（ｖｉｉｉ）細胞集団または細胞集団を含む組成物中の１型および２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｉ型およびＩＩ型ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＣＭＶ、ジカ、ウエストナイル、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍのうちの１つまたは複数；
（ｉｘ）ａＡＰＣの細胞表現型；
（ｘ）細胞集団を含む組成物中のＩＬ－１５レベル；
（ｘｉ）細胞集団中のＣＡＲの発現；
（ｘｉｉ）細胞集団または細胞集団を含む組成物中の内毒素；
（ｘｉｉｉ）細胞集団を含む組成物の残留腫瘍負荷および／またはａＡＰＣによる夾雑；
（ｘｉｖ）細胞集団の効力；
（ｘｖ）細胞集団によって放出されるＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１５およびＴＮＦ－アルファ；
（ｘｖｉ）細胞集団の細胞傷害活性；
（ｘｖｉｉ）細胞集団の脱顆粒；ならびに
（ｘｖｉｉｉ）培養物についての以下：細胞凝集、グルコース、または乳酸のうちの１つまたは複数のモニタリングまたは決定
のうちの１つまたは複数を検出するステップと
のいずれかまたは両方をさらに含む、実施形態７から４６のいずれか１つに記載の方法。
ステップのうちの１つまたは複数の前またはその間またはその後に、以下：
（ｉ）細胞集団の生存率；
（ｉｉ）細胞集団の無菌性；
（ｉｉｉ）細胞集団中のマイコプラズマ；
（ｉｖ）細胞集団のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型；
（ｖ）細胞集団の細胞数；
（ｖｉ）細胞集団の細胞表現型；
（ｖｉｉ）細胞集団または細胞集団を含む組成物中のＨＨＶ６またはＨＨＶ７またはその両方；
（ｖｉｉｉ）細胞集団または細胞集団を含む組成物中の１型および２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｉ型およびＩＩ型ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＣＭＶ、ジカ、ウエストナイル、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍのうちの１つまたは複数；
（ｉｘ）ａＡＰＣの細胞表現型；
（ｘ）細胞集団を含む組成物中のＩＬ－１５レベル；
（ｘｉ）細胞集団中のＣＡＲの発現；
（ｘｉｉ）細胞集団または細胞集団を含む組成物中の内毒素；
（ｘｉｉｉ）細胞集団を含む組成物の残留腫瘍負荷および／またはａＡＰＣによる夾雑；
（ｘｉｖ）細胞集団の効力；
（ｘｖ）細胞集団によって放出されるＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１５およびＴＮＦ－アルファ；
（ｘｖｉ）細胞集団の細胞傷害活性；
（ｘｖｉｉ）細胞集団の脱顆粒；ならびに
（ｘｖｉｉｉ）培養物についての以下：細胞凝集、グルコース、または乳酸のうちの１つまたは複数のモニタリングまたは決定
のうちの１つまたは複数を検出するステップと
のいずれかまたは両方をさらに含む、実施形態７から４６のいずれか１つに記載の方法。
【0484】
実施形態４８．表現型の検出が、細胞集団によって発現される、以下：ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ１９などの抗原、ＣＤ４５、ＨＬＡ、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ１６、ＩＬ－２Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＫＩＲＳ、ＣＤ８、ＣＤ５７、接着分子、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ１０７ａ、ＣＡＲ、または細胞表面マーカーのうちの１つまたは複数の細胞での発現または発現レベルを検出することを含む、実施形態４７に記載の方法。
【0485】
実施形態４９．表現型の検出が、細胞集団によるＣＤ５６の細胞での発現レベルを検出することを含む、実施形態４８に記載の方法。
【0486】
実施形態５０．ＣＡＲの抗原結合性ドメインが、以下：Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９）、ＥＧＦＲ、野生型上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲｗｔ）、上皮細胞増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、ＦＬＴ３、ＣＤ７０、メソテリン、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１３３、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣＬ１）、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、ＣＤ５、インターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ１３Ｒａ２）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、腫瘍関連糖タンパク質－７２（ＴＡＧ－７２）、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）、がん／精巣（ＣＴ）、ＣＤ３３、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、上皮細胞接着分子前駆体（ＥｐＣａｍまたはＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－１１Ｒα、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＳＳ２１、血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ムチン１（Ｍｕｃ１）、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、エフリンタイプＡ受容体２前駆体（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、タイ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サービビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ＦＣＲＬ５、またはＩＧＬＬ１のうちの１つまたは複数を特異的に認識し、これに結合する、実施形態８から４９のいずれか１つに記載の方法。
【0487】
実施形態５１．抗原が、以下：Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９）、ＥＧＦＲ、野生型上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲｗｔ）、上皮細胞増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、ＦＬＴ３、ＣＤ７０、メソテリン、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１３３、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣＬ１）、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、ＣＤ５、インターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ１３Ｒａ２）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、腫瘍関連糖タンパク質－７２（ＴＡＧ－７２）、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）、がん／精巣（ＣＴ）、ＣＤ３３、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、上皮細胞接着分子前駆体（ＥｐＣａｍまたはＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－１１Ｒα、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＳＳ２１、血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ムチン１（Ｍｕｃ１）、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、エフリンタイプＡ受容体２前駆体（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、タイ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サービビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ＦＣＲＬ５、またはＩＧＬＬ１またはそのそれぞれの断片のうちの１つまたは複数から選択される、実施形態８から５０のいずれか１つに記載の方法。
【0488】
実施形態５２．ＣＡＲが、（１）抗原を特異的に認識し、これに結合する抗体の抗原結合性ドメイン；（２）ヒンジドメイン；（３）膜貫通ドメイン；および（４）シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含む、実施形態８から５１のいずれか１つに記載の方法。
【0489】
実施形態５３．ＣＡＲが、（１）抗原を特異的に認識し、これに結合する抗体の抗原結合性ドメイン；（２）ヒンジドメイン；（３）膜貫通ドメイン；ならびに（４）シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む、実施形態８から５２のいずれか１つに記載の方法。
【0490】
実施形態５４．ＣＡＲが、シグナルペプチドをさらに含む、実施形態８から５３のいずれか１つに記載の方法。
【0491】
実施形態５５．ヒンジドメインが、ＣＤ８αヒンジドメインを含む、実施形態５３または５４に記載の方法。
【0492】
実施形態５６．膜貫通ドメインが、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、実施形態５３から５５のいずれか１つに記載の方法。
【0493】
実施形態５７．細胞内ドメインが、（１）１つまたは２つまたはそれより多い共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、実施形態５３から５６のいずれか１つに記載の方法。
【0494】
実施形態５８．共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域または４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域またはその両方を含む、実施形態５７に記載の方法。
【0495】
実施形態５９．シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、実施形態５３から５８のいずれか１つに記載の方法。
【0496】
実施形態６０．導入されたポリヌクレオチドが、１つまたは複数のサイトカインおよび抗体をさらに発現する、または、方法が、１つまたは複数のサイトカインおよび抗体を発現する別のポリヌクレオチドを、枯渇を有する細胞集団に導入するステップをさらに含む、実施形態８から５９のいずれか１つに記載の方法。
【0497】
実施形態６１．ポリヌクレオチドによって発現されるサイトカインが、以下：Ｂ７．１（可溶性または膜結合）、ＣＣＬ１９（可溶性または膜結合）、ＣＣＬ２１（可溶性または膜結合）、ＣＤ４０Ｌ（可溶性または膜結合）、ＣＤ１３７Ｌ（可溶性または膜結合）、ＧＩＴＲＬ（可溶性または膜結合）、ＧＭ－ＣＳＦ（可溶性または膜結合）、ＩＬ－１２（可溶性または膜結合）、ＩＬ－２（可溶性または膜結合）、低毒性ＩＬ－２（可溶性または膜結合）、ｃｄ２５結合性を欠くＩＬ－２類似体（可溶性または膜結合）、ＩＬ－１５－Ｎ７２ＤスーパーアゴニストとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合タンパク質（可溶性または膜結合）、ＩＬ－１５（可溶性または膜結合）、ＩＬ－１８（可溶性または膜結合）、ＩＬ－２１（可溶性または膜結合）、ＬＥＣ（可溶性または膜結合）、ＯＸ４０Ｌ（可溶性または膜結合）、ＩＬ－７（可溶性または膜結合）、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１、可溶性または膜結合）、またはＭＩＣＡ（可溶性または膜結合）のうちの１つまたは複数から選択される、実施形態６０に記載の方法。
【0498】
実施形態６２．ポリヌクレオチドによって発現される抗体が、単一特異性抗体、または二特異性抗体、または多特異性抗体である、実施形態６０または６１に記載の方法。
【0499】
実施形態６３．ポリヌクレオチドによって発現される抗体が、免疫細胞活性化因子である、実施形態６０から６２のいずれか１つに記載の方法。
【0500】
実施形態６４．ポリヌクレオチドが、シグナルペプチドをさらにコードする、実施形態８から６３のいずれか１つに記載の方法。
【0501】
実施形態６５．ポリヌクレオチドが、自殺遺伝子をさらに含む、実施形態８から６４のいずれか１つに記載の方法。
【0502】
実施形態６６．自殺遺伝子産物が、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシルエステラーゼ、シトクロムＰ４５０もしくはＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）、切断型ＥＧＦＲ、または誘起可能なカスパーゼ（「ｉＣａｓｐ」）の１つまたは複数から選択される、実施形態６５に記載の方法。
【0503】
実施形態６７．ポリヌクレオチドが、自殺遺伝子の発現を方向付ける制御配列をさらに含み、制御配列が、誘導性である、実施形態６５または６６に記載の方法。
【0504】
実施形態６８．ポリヌクレオチドが、ＣＡＲまたは治療用タンパク質の発現を方向付ける制御配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をさらに含む、実施形態８から６７のいずれか１つに記載の方法。
【0505】
実施形態６９．ＣＡＲまたは治療用タンパク質の発現を方向付ける制御配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が、誘導性または構成的に活性なものである、実施形態６８に記載の方法。
【0506】
実施形態７０．ポリヌクレオチドが、細胞集団にベクターを介して導入される、実施形態８から６９のいずれか１つに記載の方法。
【0507】
実施形態７１．ベクターが、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、実施形態７０に記載の方法。
【0508】
実施形態７２．非ウイルスベクターが、プラスミドである、実施形態７１に記載の方法。
【0509】
実施形態７３．ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターから選択される、実施形態７１に記載の方法。
【0510】
実施形態７４．調製されるＣＡＲ発現細胞集団が、がん細胞の成長を阻害するために適したものであり、抗原が、がん細胞によって発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、実施形態８から７３のいずれか１つに記載の方法。
【0511】
実施形態７５．がん細胞の成長を阻害するための方法であって、実施形態８から７４のいずれか１つに記載の方法によって調製されたＣＡＲ発現細胞の集団をがん細胞と接触させるステップを含み、ＣＡＲによって認識される抗原が、がん細胞によって発現されるＴＡＡである、方法。
【0512】
実施形態７６．対象におけるがんを処置するための方法であって、実施形態８から７４のいずれか１つに記載の方法によって調製されたＣＡＲ発現免疫細胞の集団を対象に投与するステップを含み、ＣＡＲによって認識される抗原が、がんの細胞によって発現されるＴＡＡである、方法。
【0513】
実施形態７７．細胞集団が、ＮＫ細胞および０．３％未満または０．３％と等しいＣＤ３＋細胞を含む、実施形態７６に記載の方法。
【0514】
実施形態７８．対象に、体重１キログラム当たり３×１０３個未満のＴ細胞を投与する、実施形態７６または７７に記載の方法。
【0515】
実施形態７９．がん細胞が、循環系、例えば、心臓（肉腫［血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫］、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、および脂肪腫）、縦隔および胸膜、ならびに他の胸腔内臓器、血管腫瘍および腫瘍関連血管組織；気道、例えば、鼻腔および中耳、副鼻腔、喉頭、気管、気管支および肺、例えば小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、気管支原性癌（扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様過誤腫、中皮腫；胃腸系、例えば、食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）、膵臓（腺管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；任意の部位において生じる消化管間質腫瘍および神経内分泌腫瘍；泌尿生殖路、例えば、腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱および／または尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（精上皮腫、胚性癌腫、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；肝臓、例えば、ヘパトーマ（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫、膵臓内分泌腫瘍（例えば褐色細胞腫、インスリノーマ、血管作動性腸管ペプチド腫瘍、膵島細胞腫瘍およびグルカゴノーマ）；骨、例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網細胞肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍、脊索腫、骨軟骨腫（osteochronfroma）（骨軟骨性外骨腫）、良性軟骨腫、軟骨芽腫、軟骨粘液様線維腫（chondromyxofibroma）、類骨腫および巨細胞腫瘍；神経系、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、頭蓋がん（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫（meningiosarcoma）、神経膠腫症）、脳のがん（星細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形神経膠芽腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；生殖系、例えば、婦人科、子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、前腫瘍子宮頸部異形成）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、未分類癌腫］、顆粒膜－髄膜細胞腫瘍、セルトリ－ライディッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、胎盤、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、卵管（癌腫）および女性生殖器と関連付けられる他の部位；陰茎、前立腺、精巣、および男性生殖器と関連付けられる他の部位；血液系、例えば、血液（骨髄性白血病［急性および慢性］、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；口腔、例えば、唇、舌、歯肉、口腔底、口蓋、および口の他の部分、耳下腺、および唾液腺の他の部分、扁桃腺、中咽頭、鼻咽頭、梨状洞、下咽頭、ならびに唇、口腔および咽頭中の他の部位；皮膚、例えば、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、黒子形成異常母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、およびケロイド；副腎：神経芽腫；ならびに結合組織および軟組織、後腹膜および腹膜、目、眼内黒色腫、および付属器、乳房、頭部および／または頸部、肛門領域、甲状腺、副甲状腺、副腎および他の内分泌腺および関連する構造を含む他の組織、リンパ節の二次的なおよび不特定の悪性新生物、呼吸器および消化器系の二次的な悪性新生物ならびに他の部位の二次的な悪性新生物のがん細胞から選択される、実施形態７４から７８のいずれか１つに記載の方法。
【0516】
実施形態８０．がん細胞が、固形腫瘍細胞である、実施形態７４から７９のいずれか１つに記載の方法。
【0517】
実施形態８１．がん細胞が、固形腫瘍の細胞ではなく、必要に応じて、がん細胞が、白血病がん細胞である、実施形態７４から７９のいずれか１つに記載の方法。
【0518】
実施形態８２．がん細胞が、原発がん細胞または転移性がん細胞である、実施形態７４から８１のいずれか１つに記載の方法。
【0519】
実施形態８３．がん細胞が、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、またはリンパ腫に由来するものである、実施形態７４から８２のいずれか１つに記載の方法。
【0520】
実施形態８４．接触させるステップが、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏである、実施形態７５および７９から８３のいずれか１つに記載の方法。
【0521】
実施形態８５．細胞を別々の療法と接触させるまたは別々の療法を投与するステップをさらに含む、実施形態７４から８４のいずれか１つに記載の方法。
【0522】
実施形態８６．別々の療法が、外科的切除、化学療法、放射線療法、免疫療法および標的療法を含む、実施形態８５に記載の方法。
【0523】
実施形態８７．別々の療法が、第１選択療法、第２選択療法、第３選択療法、または第４選択療法である、実施形態８５または８６に記載の方法。
【0524】
実施形態８８．実施形態７から７４のいずれか１つに記載の方法によって作製または調製されたＮＫ細胞またはその集団。
【0525】
実施形態８９．実施形態８８に記載の細胞またはその集団、および担体、必要に応じて薬学的に許容される担体を含む組成物。
【0526】
実施形態９０． ０．５％未満のａＡＰＣを含む、実施形態８８に記載の細胞もしくはその集団、または実施形態８９に記載の組成物。
【0527】
実施形態９１． ０．１％未満、または０．２％未満、または０．３％未満、０．４％未満、または０．５％未満のａＡＰＣを含む、実施形態８８もしくは９０に記載の細胞もしくはその集団、または実施形態８９もしくは９０に記載の組成物。
【0528】
実施形態９２．以下の特性：
（Ａ）生存率が７０％を下回らない；
（Ｂ）無菌である；
（Ｃ）含有する内毒素が５ＥＵＫｇ－１ｈ－１未満である；
（Ｄ）マイコプラズマ、外来ウイルス、またはＨＨＶ（ＨＨＶ６またはＨＨＶ７）のうちの１つまたは複数について陰性である；
（Ｅ）処置される対象の体重１キログラム当たり１×１０６個より多くの細胞を含む；
（Ｆ）総細胞中４０％を超える、ＣＡＲを発現する細胞を含む；
（Ｇ）総細胞中９５％を超える、ＣＤ５６を発現する細胞を含む；
（Ｈ）総細胞中０．３％未満の、ＣＤ３を発現する細胞を含む；
（Ｉ）細胞当たり４コピー未満のポリヌクレオチドを含む；
（Ｊ）ＩＬ－２またはＩＬ－２１の非存在下では増殖しない；
（Ｋ）効力を有する、例えば、ＩＦＮγ分泌またはＣＤ１０７アッセイにおいて１０倍を超える増大を有する；および
（Ｌ）ＣＤ１９などの抗原、ＮＫｐ４６、またはＮＫＧ２Ｄのうちの１つまたは複数を発現する
のうちの１つまたは複数を有する、実施形態８８および９０から９１のいずれか１つに記載の細胞もしくはその集団または実施形態８９から９１のいずれか１つに記載の組成物。
（Ａ）生存率が７０％を下回らない；
（Ｂ）無菌である；
（Ｃ）含有する内毒素が５ＥＵＫｇ－１ｈ－１未満である；
（Ｄ）マイコプラズマ、外来ウイルス、またはＨＨＶ（ＨＨＶ６またはＨＨＶ７）のうちの１つまたは複数について陰性である；
（Ｅ）処置される対象の体重１キログラム当たり１×１０６個より多くの細胞を含む；
（Ｆ）総細胞中４０％を超える、ＣＡＲを発現する細胞を含む；
（Ｇ）総細胞中９５％を超える、ＣＤ５６を発現する細胞を含む；
（Ｈ）総細胞中０．３％未満の、ＣＤ３を発現する細胞を含む；
（Ｉ）細胞当たり４コピー未満のポリヌクレオチドを含む；
（Ｊ）ＩＬ－２またはＩＬ－２１の非存在下では増殖しない；
（Ｋ）効力を有する、例えば、ＩＦＮγ分泌またはＣＤ１０７アッセイにおいて１０倍を超える増大を有する；および
（Ｌ）ＣＤ１９などの抗原、ＮＫｐ４６、またはＮＫＧ２Ｄのうちの１つまたは複数を発現する
のうちの１つまたは複数を有する、実施形態８８および９０から９１のいずれか１つに記載の細胞もしくはその集団または実施形態８９から９１のいずれか１つに記載の組成物。
【0529】
実施形態９３．以下の特性：
（Ｅ’）処置される対象の体重１キログラム当たり１×１０７個よりも多くの細胞を含む；または
（Ｆ’）総細胞中５０％を超える、ＣＡＲを発現する細胞を含む
の一方または両方を有する、実施形態９２に記載の細胞もしくはその集団または実施形態９２に記載の組成物。
（Ｅ’）処置される対象の体重１キログラム当たり１×１０７個よりも多くの細胞を含む；または
（Ｆ’）総細胞中５０％を超える、ＣＡＲを発現する細胞を含む
の一方または両方を有する、実施形態９２に記載の細胞もしくはその集団または実施形態９２に記載の組成物。
【0530】
実施形態９４．抗原および細胞表面マーカー：４－１ＢＢＬ、膜結合（ｍｂ）ＩＬ－１５、ｍｂ ＩＬ－２１、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、ＭＩＣＡ、ＣＤ ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ｍｂ ＩＬ－２、ｍｂ ＩＬ－１８、ｍｂ ＩＬ－１２、ＣＤ２５結合性を欠くｍｂ ＩＬ－２変異体、ｍｂ ＩＬ－１５－Ｎ７２ＤスーパーアゴニストとＩＬ－１５ＲαＳｕｓｈｉ－Ｆｃ融合タンパク質の複合体（ＩＬ－１５ＳＡ／ＩＬ－１５ＲαＳｕ－Ｆｃ）ＡＬＴ－８０３、またはＣＤ１２２／ＣＤ１３２シグナル伝達を媒介する細胞表面マーカーのうちの１つまたは複数を発現する操作されたａＡＰＣ。
【0531】
実施形態９５．操作されたＫ５６２細胞である、実施形態９４に記載のａＡＰＣ。
【0532】
実施形態９６．照射処理されており、それによって細胞増殖または長期生存またはその両方を欠くものである、実施形態９４または９５に記載のａＡＰＣ。
【0533】
実施形態９７．５０Ｇｙ、１００Ｇｙ、１５０Ｇｙまたは２００Ｇｙで照射処理されたものである、実施形態９６に記載のａＡＰＣ。
【0534】
実施形態９８．１４日間よりも長くは実質的に生存しない、実施形態９４から９７のいずれか１つに記載のａＡＰＣ。
【0535】
実施形態９９．実施形態７から８７のいずれか１つに記載の方法における使用に適した１つまたは複数の薬剤、および必要に応じた説明書を含むキット。
【0536】
実施形態１００．薬剤が、以下：ＣＡＲまたは別の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、細胞表現型を検出するための抗体、免疫細胞を単離または富化または精製するための抗体、ポリヌクレオチドを検出するためのプライマー、サイトカイン、およびａＡＰＣのうちの１つまたは複数から選択される、実施形態９９に記載のキット。
【0537】
実施形態１０１．γδＴ細胞の集団を調製するための方法であって、以下：γδＴ細胞、γδＴ細胞の誘導が可能な前駆細胞、またはγδＴ細胞の誘導が可能な幹細胞、のうちの１つまたは複数を含む細胞集団を、免疫細胞活性化因子（例えば、γδＴ細胞活性化因子など）と一緒に培養するステップを含み、細胞集団が、細胞集団中の、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖、ＴＣＲ β鎖、またはαβＴＣＲのうちの１つまたは複数を発現する細胞が枯渇したものであり、活性化因子が、以下の（ｉ）～（ｉｖ）：
（ｉ）必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／または刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）またはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、
（ｉｉ）γδＴ細胞、前駆細胞または幹細胞のうちの１つまたは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってγδＴ細胞を活性化するまたは増殖させる抗体またはその抗原結合性断片のうちの１つまたは複数、
（ｉｉｉ）それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させるサイトカインのうちの１つもしくは複数、または、
（ｉｖ）必要に応じて、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤もしくはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）から選択される、それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させる化学的部分のうちの１つもしくは複数
のうちの１つまたは複数から選択される、方法。
（ｉ）必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／または刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）またはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、
（ｉｉ）γδＴ細胞、前駆細胞または幹細胞のうちの１つまたは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってγδＴ細胞を活性化するまたは増殖させる抗体またはその抗原結合性断片のうちの１つまたは複数、
（ｉｉｉ）それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させるサイトカインのうちの１つもしくは複数、または、
（ｉｖ）必要に応じて、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤もしくはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）から選択される、それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させる化学的部分のうちの１つもしくは複数
のうちの１つまたは複数から選択される、方法。
【0538】
実施形態１０２．ＣＡＲ、または必要に応じて抗体もしくはその断片、酵素、リガンドもしくは受容体から選択される別の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、発現させるために、培養された細胞集団に導入するステップであって、ＣＡＲが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）またはウイルス抗原を特異的に認識し、これに結合する、ステップをさらに含む、実施形態１０１に記載の方法。
【0539】
実施形態１０３．細胞集団を、実施形態１０２に記載の導入するステップの後に、免疫細胞活性化因子（例えば、γδＴ細胞活性化因子など）と一緒に培養するステップであって、活性化因子が、以下の（ｉ）～（ｉｖ）：
（ｉ）必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／もしくは刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）もしくはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、
（ｉｉ）γδＴ細胞、前駆細胞もしくは幹細胞のうちの１つもしくは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させる抗体もしくはその抗原結合性断片のうちの１つもしくは複数、
（ｉｉｉ）それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させるサイトカインのうちの１つもしくは複数、または
（ｉｖ）必要に応じて、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤もしくはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）から選択される、それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させる化学的部分のうちの１つもしくは複数；
のうちの１つまたは複数から選択されるステップをさらに含み、
必要に応じて、培養するステップを、同じまたは異なる活性化因子を用いて１回、２回、３回、またはこれよりも多く繰り返す、
実施形態１０２に記載の方法。
（ｉ）必要に応じて免疫細胞成長を活性化および／もしくは刺激するものである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）もしくはウイルス抗原を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、
（ｉｉ）γδＴ細胞、前駆細胞もしくは幹細胞のうちの１つもしくは複数における刺激性受容体を特異的に認識かつ結合し、それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させる抗体もしくはその抗原結合性断片のうちの１つもしくは複数、
（ｉｉｉ）それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させるサイトカインのうちの１つもしくは複数、または
（ｉｖ）必要に応じて、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤もしくはＳＴＩＮＧ活性化環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）から選択される、それによってγδＴ細胞を活性化するもしくは増殖させる化学的部分のうちの１つもしくは複数；
のうちの１つまたは複数から選択されるステップをさらに含み、
必要に応じて、培養するステップを、同じまたは異なる活性化因子を用いて１回、２回、３回、またはこれよりも多く繰り返す、
実施形態１０２に記載の方法。
【0540】
実施形態１０４．細胞集団が、以下：γδＴ細胞またはその実質的に精製された組成物のうちの１つまたは複数を含む、実施形態１０１から１０３のいずれか１つに記載の方法。
【0541】
実施形態１０５．枯渇を有する細胞集団が、以下：γδＴ細胞、ＨＳＣ、ｉＰＳＣまたはそのそれぞれの実質的に精製された集団のうちの１つまたは複数を含む、実施形態１０１から１０４のいずれか１つに記載の方法。
【0542】
実施形態１０６．前駆細胞、ＨＳＣ、またはｉＰＳＣのうちの１つまたは複数が、γδＴ細胞の誘導が可能なものである、実施形態１０５に記載の方法。
【0543】
実施形態１０７．γδ Ｔ細胞が、以下：前駆細胞、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来細胞、胚性生殖細胞、胚性生殖細胞由来細胞、幹細胞、幹細胞由来細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または不死化細胞のうちの１つまたは複数から誘導されたものを含む、実施形態１０１から１０６のいずれか１つに記載の方法。
【0544】
実施形態１０８．細胞集団が、ＴＣＲ α鎖またはＴＣＲ β鎖を発現する細胞を実質的に含まない、実施形態１０１から１０７のいずれか１つに記載の方法。
【0545】
実施形態１０９．シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を作製するためのウイルスパッケージングシステムであって、（ａ）ベクターゲノムを発現するプラスミド；（ｂ）パッケージングプラスミド；ならびに（ｃ）ＲＤ１１４ＴＲ、およびＢａＥＶＴＲを発現するエンベローププラスミドのうちの１つまたは複数を含む、ウイルスパッケージングシステム。
【0546】
実施形態１１０．ベクターゲノムが、２つの長いターミナルリピート（ＬＴＲ）に挟まれた以下：
（Ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、もしくは必要に応じて抗体もしくはその断片、酵素、リガンドもしくは受容体から選択される別の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｂ）（Ａ）のリバース相補体、または
（Ｃ）ＣＡＲコード配列もしくはそのリバース相補体をポリヌクレオチドに挿入するために適した制限酵素によって認識される１つもしくは複数の認識部位を含むポリヌクレオチド
のうちの１つまたは複数を含む、実施形態１０９に記載のウイルスパッケージングシステム。
（Ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、もしくは必要に応じて抗体もしくはその断片、酵素、リガンドもしくは受容体から選択される別の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（Ｂ）（Ａ）のリバース相補体、または
（Ｃ）ＣＡＲコード配列もしくはそのリバース相補体をポリヌクレオチドに挿入するために適した制限酵素によって認識される１つもしくは複数の認識部位を含むポリヌクレオチド
のうちの１つまたは複数を含む、実施形態１０９に記載のウイルスパッケージングシステム。
【0547】
実施形態１１１．ベクターゲノムが、以下：５’ＬＴＲ、５’キャップ、３’ポリＡ尾部、および３’ＬＴＲのうちの１つまたは複数をさらに含む、実施形態１０９または１１０に記載のウイルスパッケージングシステム。
【0548】
実施形態１１２．シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、フレンドマウス胚性幹細胞ウイルス（ＦＭＥＶ）、異種指向性ＭｕＬＢ関連ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）およびネコ白血病ウイルスのうちの任意の種から選択される、実施形態１０９から１１１のいずれか１つに記載のウイルスパッケージングシステム。
【0549】
実施形態１１３．パッケージング細胞株をさらに含む、実施形態１０９から１１２のいずれか１つに記載のウイルスパッケージングシステム。
【0550】
実施形態１１４．パッケージング細胞株が、２９３Ｔ細胞株である、実施形態１１３に記載のウイルスパッケージングシステム。
【0551】
実施形態１１５．シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子を作製するための方法であって、パッケージング細胞株に、実施形態１０９から１１２のいずれか１つに記載のシステムを、シュードタイピングされたガンマレトロウイルス粒子のパッケージングに適した条件下で形質導入するステップを含む、方法。
【0552】
実施形態１１６．パッケージング細胞株が、２９３Ｔ細胞株である、実施形態１１５に記載の方法。
【0553】
実施形態１１７．細胞株に、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のプラスミドを１．５：１．５：１の比で用いて形質導入する、実施形態１１５または１１６に記載の方法。
【0554】
実施形態１１８．パッケージングシステムが、少なくとも２つのエンベローププラスミドを含み、その一方がＲＤ１１４ＴＲを発現し、他方がＢａＥＶＴＲを発現する、実施形態１１５から１１６のいずれか１つに記載の方法。
【0555】
実施形態１１９．細胞株に、（ａ）のプラスミド、（ｂ）のプラスミド、ＲＤ１１４ＴＲ発現プラスミド、およびＢａＥＶＴＲ発現プラスミドを１．５：１．５：１：１の比で用いて形質導入する、実施形態１１８に記載の方法。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B-3D】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【配列表】
【国際調査報告】