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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-27
(54)【発明の名称】細胞内の標的部位を遺伝子編集する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230920BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230920BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230920BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230920BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230920BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20230920BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230920BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230920BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20230920BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230920BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N1/15 ZNA
C12N1/21
C12N1/19
C12N5/10
C12N15/86 Z
A61P35/00
A61P37/02
A61K35/12
A61K48/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023515399
(86)(22)【出願日】2021-09-03
(85)【翻訳文提出日】2023-03-07
(86)【国際出願番号】 CN2021116531
(87)【国際公開番号】W WO2022052877
(87)【国際公開日】2022-03-17
(31)【優先権主張番号】202010949701.5
(32)【優先日】2020-09-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522021985
【氏名又は名称】上海邦耀生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＬ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チャン、チーチン
(72)【発明者】
【氏名】トゥー、ピン
(72)【発明者】
【氏名】リウ、ミンヤオ
(72)【発明者】
【氏名】シー、ツァイシー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB07
4C084ZB26
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB63
4C087NA14
4C087ZB07
4C087ZB26
(57)【要約】
細胞内の標的部位を遺伝子編集する方法であって、具体的に、（ａ）遺伝子編集しようとする細胞を提供し；（ｂ）（ｉ）遺伝子編集酵素又はそれをコードする核酸、又は前記遺伝子編集酵素を発見する第一発現ベクター；と（ｉｉ）ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡを発現する第二発現ベクターを前記細胞に導入し、前記細胞ゲノムの標的部位の遺伝子を編集し、前記ｇＲＮＡは遺伝子編集酵素を誘導して、標的部位の特異的切断を実行し；ここで、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号１～９に示される配列の１つ又は複数が含まれ、細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集する方法である。当該方法は、標的部位を効率的に編集することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）遺伝子編集しようとする細胞を提供するステップ；（ｂ）（ｉ）遺伝子編集酵素又はそれをコードする核酸、又は前記遺伝子編群酵素を発見する第一発現ベクター；と（ｉｉ）ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡを発現する第二発現ベクターを前記細胞に導入して、前記細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集し、前記ｇＲＮＡは遺伝子編集酵素を誘導して、標的部位を特異的切断するステップ；を含み、
ここで、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号１～９に示される配列の１つ又は複数が含まれることを特徴とする、細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集する方法。
【請求項2】
前記遺伝子編集には、遺伝子ノックアウトと遺伝子標的統合が含まれることを特徴とする、請求項１に記載方法。
【請求項3】
前記遺伝子編集酵素は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＴＡＬＥＮ酵素、ＺＦＮ酵素、又はそれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載方法。
【請求項4】
前記標的部位が、ＡＡＶＳ１、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、又はそれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載方法。
【請求項5】
前記遺伝子編集には、部位特異的ノックインドナーＤＮＡが含まれることを特徴とする、請求項１に記載方法。
【請求項6】
ターゲットとする標的配列には、配列番号１～９に示される配列の１つ又は複数が含まれることを特徴とする、細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集するｇＲＮＡ。
【請求項7】
（ａ）二本鎖ＤＮＡであるドナーＤＮＡ；（ｂ）遺伝子編集酵素又はそれをコードする核酸、又は前記遺伝子編集酵素を発現する第一発現ベクター；
（ｃ）ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡを発現する第二発現ベクター；
を含み、
ここで、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号１～９に示される配列の１つ又は複数が含まれることを特徴とする、細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集する反応系。
【請求項8】
ｉ）第一容器と第一容器内に位置する二本鎖ＤＮＡであるドナーＤＮＡ、ｉｉ）第二容器と第二容器内に位置する遺伝子編集酵素又はそれをコードする核酸、又は前記遺伝子編集酵素を発現する第一発現ベクター、と
ｉｉｉ）第三容器と第三容器内に位置するｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡを発現する第二発現ベクターを含み、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号１～９に示される配列の１つ又は複数が含まれることを特徴とする、遺伝子編集用キット。
【請求項9】
請求項１に記載の方法で製造される遺伝子編集された細胞。
【請求項10】
腫瘍免疫治療又は癌免疫治療製品の製造における、請求項９に記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、具体的に、細胞内の標的部位を遺伝子編集する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、プラスミド、ファージなどの外因性ＤＮＡ断片の侵入に抵抗する、古細菌や細菌に由来する獲得免疫メカニズムである。当該系は主にＣＲＩＳＰＲ配列とＣａｓタンパク質をコードする遺伝子座によって機能し、現在、最も一般的に使用されているのはタイプＩＩファミリーのＣａｓ９ヌクレアーゼであり、当該系は、単一のエフェクタータンパク質のみで機能する。外因性ＤＮＡが細菌に侵入すると、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は最初に侵入したＤＮＡをＣＲＩＳＰＲ重複配列間に統合する。続いて、侵入したＤＮＡ配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が転写され、処理される。その後、トランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ）がｃｒＲＮＡと結合し、最終的にＣａｓ９タンパク質と複合体を形成する。最後に、Ｃａｓ９タンパク質は、そのＨＮＨ及びＲｕｖＣ様構造ドメインを介してエンドヌクレアーゼとして機能し、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導する。ＤＮＡの二本鎖の切断は損傷修復メカニズムを引き起こし、相同性テンプレートが存在する場合、細胞に正確な相同組換え修復が発生し、外因性配列の挿入又は置換を実現する。これまでのところ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術は多くの分野で成功的に使用されており、幅広い展望を示している。しかし、相同組換えを用いた正確な遺伝子治療は依然として多くの困難に直面しており、主な制限要因の１つは相同組換えの効率が非常に低いことである。多くの研究で相同組換え率を高めるさまざまな方法が報告されているが、これらの方法がすべての種類の細胞に適用できるわけではなく、効果も一貫していないことを示す証拠がますます増えている。従って、特定の細胞における相同組換えを効果的に強化するためのパーソナライズされたアプローチを見つけることは、細胞型ベースの細胞療法にとって特に重要である。
【0003】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞技術（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ-Ｃｅｌｌ、ＣＡＲ-Ｔ）は、近年登場した新規な養子免疫療法である。それはインビトロで患者のＴ細胞の遺伝子を改変し、ある程度増幅後に患者の体内に再注入して、腫瘍の標的殺傷を達成する。現在、３つのＣＡＲ-Ｔ製品が米国食品医薬品局によって血液腫瘍の臨床治療に承認されており、ＣＡＲ-Ｔ技術の大きな成功を示している。しかし、新興技術として、ＣＡＲ-Ｔ技術は依然としてあらゆる面で多くの挑戦に直面しており、大きいな改善の余地がある。まず、現在最も一般的に使用されている方法は、ウイルス系を使用して外因性配列を導入することである。しかし、ウイルス系の使用には、高い製造コスト、ランダムな挿入による潜在的な安全上の問題などの問題がある。次に、ウイルス製造を含む従来の技術は、ゲノムへの外因性配列の正確な挿入を実現できないため、細胞の均一性が低下し、治療効果に影響を与え、Ｔ細胞に対してさらに多くの改変を実行することが不可能である。また、現在のＣＡＲ-Ｔ療法は全部個別化治療であり、製造コストが高く、サイクルが長く、効果が限定的であるなどの問題がある。従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などの技術を使用して、ＣＡＲなどの人為的に改変された要素を部位特異的にＴ細胞に統合することは、既存のＴ細胞療法の発展を促進する上で非常に重要である。一つの方面で、外因性配列のランダムな挿入によって引き起こされる不確実性を回避でき、細胞製品の均一性と安定性を向上させることができる。もう一つの方面で、Ｔ細胞の多様な改変を実現することができ、一般的なＣＡＲ-Ｔ細胞をワンステップで構築でき、内因性遺伝子を調節することで強化された細胞製品を構築できるだけではなく、人工的なコンポーネントの動的な表現を実現でき、既存の技術のアプリケーションを拡張するのに大いに役立つ。しかし、Ｔ細胞自体の細胞型の特殊性により、相同組換えによる外因性配列の部位特異的統合の効率は常に低い。従って、当技術分野では、Ｔ細胞における相同組換えの効率を改善する方法を開発することが緊急となっている。
【発明の概要】
【0004】
本発明の目的の１つは、細胞（特にＴ細胞）における外因性配列の相同組換えの効率を改善するための新規な方法を提供することである。
【0005】
本発明は、ＡＡＶＳ１、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ遺伝子それぞれに対する遺伝子編集方法を提供する。
【0006】
本発明の第一方面は、下記のステップの含む、細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集する方法を提供する。
（ａ）遺伝子編集しようとする細胞を提供するステップ；
（ｂ）（ｉ）遺伝子編集酵素又はそれをコードする核酸、又は前記遺伝子編群酵素を発見する第一発現ベクター；と（ｉｉ）ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡを発現する第二発現ベクターを前記細胞に導入して、前記細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集し、前記ｇＲＮＡは遺伝子編集酵素を誘導して、標的部位を特異的切断するステップ；
ここで、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号１～９に示される配列の１つ又は複数が含まれる。
（ａ）遺伝子編集しようとする細胞を提供するステップ；
（ｂ）（ｉ）遺伝子編集酵素又はそれをコードする核酸、又は前記遺伝子編群酵素を発見する第一発現ベクター；と（ｉｉ）ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡを発現する第二発現ベクターを前記細胞に導入して、前記細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集し、前記ｇＲＮＡは遺伝子編集酵素を誘導して、標的部位を特異的切断するステップ；
ここで、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号１～９に示される配列の１つ又は複数が含まれる。
【0007】
もう一つの好ましい実施形態において、前記遺伝子編集には、遺伝子ノックアウトと遺伝子標的統合が含まれる。
【0008】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列に、配列番号１～６に示される配列の１つ又は複数が含まれる時、前記遺伝子編集は遺伝子標的統合である。
【0009】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列に、配列番号７～９に示される配列の１つ又は複数が含まれる時、前記遺伝子編集は遺伝子ノックアウトである。
【0010】
もう一つの好ましい実施形態において、遺伝子編集酵素は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＴＡＬＥＮ酵素、ＺＦＮ酵素、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0011】
もう一つの好ましい実施形態において、前記遺伝子編集酵素は微生物由来であり、好ましくは細菌由来である。
【0012】
もう一つの好ましい実施形態において、前記遺伝子編集酵素は化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、カニス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｎｉｓ）、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0013】
もう一つの好ましい実施形態において、前記遺伝子編集酵素には、野生型又は突然変異型の遺伝子編集酵素が含まれる。
【0014】
もう一つの好ましい実施形態において、前記遺伝子編集酵素はＣａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃｍｓ１、ＭＡＤ７、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋ１、Ｃｐｆ１、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0015】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡにはｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡが含まれる。
【0016】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡはゲノムの標的部位にターゲットとして結合する。
【0017】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡには未修飾及び修飾されたｇＲＮＡが含まれる。
【0018】
もう一つの好ましい実施形態において、前記修飾されたｇＲＮＡには、塩基の化学修飾が含まる。
【0019】
もう一つの好ましい実施形態において、前記化学修飾には、メチル化修飾、メトキシ修飾、フッ素化修飾又はチオール修飾が含まる。
【0020】
もう一つの好ましい実施形態において、前記遺伝子編集には、インビボ遺伝子編集、インビトロ遺伝子編集が含まれる。
【0021】
もう一つの好ましい実施形態において、前記遺伝子編集にはＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集が含まれる。
【0022】
もう一つの好ましい実施形態において、前記標的部位は、ＡＡＶＳ１、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0023】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡのＡＡＶＳ１をターゲットとする標的配列には、配列番号３に示される配列が含まれる。
【0024】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡのＰＤ１をターゲットとする標的配列には、配列番号１及び／又は配列番号２に示される配列が含まれる。
【0025】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡのＴＲＡＣをターゲットとする標的配列には、配列番号４及び／又は配列番号５に示される配列が含まれる。
【0026】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡのＢ２Ｍをターゲットとする標的配列には、配列番号６に示される配列が含まれる。
【0027】
もう一つの好ましい実施形態において、前記遺伝子編集には、ドナーＤＮＡに部位特異的ノックインすることが含まれる。
【0028】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ドナーＤＮＡは二本鎖ＤＮＡである。
【0029】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ドナーＤＮＡには、第一相同性アームと第二相同性アームが含まれ、ここで、前記第一相同性アームと第二相同性アームは前記細胞ゲノムの標的部位でドナーＤＮＡの細胞媒介性相同性組換えを開始させることができ、前記第一相同性アームと第二相同性アームの配列長さはそれぞれ独立して２００～２０００ｂｐであり、好ましくは、４００～１０００ｂｐであり、より好ましくは、７００～９００ｂｐである。
【0030】
もう一つの好ましい実施形態において、前記第一相同性アームは前記ゲノムの標的部位の切断部位上流側（又は左側）の配列と相同性があり、前記第二相同性アームは前記ゲノムの標的部位の切断部位下流側（又は右側）の配列と相同性がある。
【0031】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ドナーＤＮＡには更に標的遺伝子が含まれる。
【0032】
もう一つの好ましい実施形態において、前記標的遺伝子にはキメラ抗原受容体又はＴＣＲのコード配列が含まれる。
【0033】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ドナーＤＮＡの配列長さは５０ｂｐ～５０００ｂｐであり、好ましくは、８０ｂｐ～４０００ｂｐである。
【0034】
もう一つの好ましい実施形態において、前記標的遺伝子の配列長さは５０ｂｐ～３０００ｂｐであり、好ましくは、１０００ｂｐ～２０００ｂｐである。
【0035】
もう一つの好ましい実施形態において、前記キメラ抗原受容体又はＴＣＲのコード配列の長さは５０ｂｐ～３０００ｂｐであり、好ましくは、１０００ｂｐ～２０００ｂｐである。
【0036】
もう一つの好ましい実施形態において、前記第一相同性アームの配列長さＤ１と第二相同性アームの配列長さＤ２の比（Ｄ１／Ｄ２）は（０．８～１．２）：（０．５～１．５）であり、好ましくは、（０．９～１．１）：（０．７～１．３）であり、より好ましくは、１：１である。
【0037】
もう一つの好ましい実施形態において、前記キメラ抗原受容体には、腫瘍細胞マーカーを標的とする抗原結合構造ドメインが含まれる。
【0038】
もう一つの好ましい実施形態において、前記キメラ抗原受容体には、腫瘍細胞マーカーを標的とする抗原結合構造ドメイン、任意のヒンジ領域、膜貫通構造ドメイン及び細胞内シグナル伝達結合ドメインが含まれる。
【0039】
もう一つの好ましい実施形態において、前記腫瘍細胞マーカーは、α葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７-Ｈ３、Ｂ７-Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン-３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ-Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ１＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＩＬ-１１Ｒα、ＩＬ-１３Ｒα２、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ-Ｙ、Ｋａｐｐａ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、ＷＴ-１、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0040】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８、Ｉｇ（免疫グロブリン）ヒンジ、ＣＤ２８、又はそれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質ヒンジ領域である。
【0041】
もう一つの好ましい実施形態において、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＩＣＯＳ、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、又はそれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質膜貫通ドメインである。
【0042】
もう一つの好ましい実施形態において、前記細胞内シグナル伝達結合ドメインには、共刺激シグナル伝達分子及び／又は一次シグナル伝達ドメインが含まれる。
【0043】
もう一つの好ましい実施形態において、前記共刺激シグナル伝達分子は、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ１３４、４-１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＬＩＧＨＴ、ＤＡＰ１０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ-１、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0044】
もう一つの好ましい実施形態において、前記一次シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0045】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ドナーＤＮＡの配列は、配列番号１２～３８のいずれか一つに示される通りである。
【0046】
もう一つの好ましい実施形態において、前記細胞には、初代細胞及び継代細胞が含まれる。
【0047】
もう一つの好ましい実施形態において、前記細胞には、Ｔ細胞が含まれる。
【0048】
もう一つの好ましい実施形態において、前記細胞には、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＴ細胞が含まれる。
【0049】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ベクターには、ウイルスベクターが含まれる。
【0050】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0051】
もう一つの好ましい実施形態において、前記導入方法には、エレクトロポレーション、ベクター形質転換、トランスフェクション、ヒートショック、電気穿孔法、形質導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、リポソームトランスフェクション、レンチウイルス感染などが含まれる。
【0052】
もう一つの好ましい実施形態において、前記方法はインビトロ法である。
【0053】
もう一つの好ましい実施形態において、前記方法は非診断的かつ非治療的である。
【0054】
本発明の第二方面は、細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集するｇＲＮＡを提供し、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号１～９に示される配列の１つ又は複数が含まれる。
【0055】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号１～６に示される配列の１つ又は複数が含まれる。
【0056】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号７～９に示される配列の１つ又は複数が含まれる。
【0057】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡには、未修飾及び修飾されたｇＲＮＡが含まれる。
【0058】
もう一つの好ましい実施形態において、前記修飾されたｇＲＮＡには、塩基の化学修飾が含まれる。
【0059】
もう一つの好ましい実施形態において、前記化学修飾には、メチル化修飾、メトキシ修飾、フッ素化修飾又はチオール修飾が含まれる。
【0060】
本発明の第三方面は、細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集する反応系を提供し、前記反応系には、
（ａ）二本鎖ＤＮＡであるドナーＤＮＡ；
（ｂ）遺伝子編集酵素又はそれをコードする核酸、又は前記遺伝子編集酵素を発現する第一発現ベクター；
（ｃ）ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡを発現する第二発現ベクター；
が含まれる。
（ａ）二本鎖ＤＮＡであるドナーＤＮＡ；
（ｂ）遺伝子編集酵素又はそれをコードする核酸、又は前記遺伝子編集酵素を発現する第一発現ベクター；
（ｃ）ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡを発現する第二発現ベクター；
が含まれる。
【0061】
ここで、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号１～９に示される配列の１つ又は複数が含まれる。
【0062】
もう一つの好ましい実施形態において、前記遺伝子編集には、遺伝子ノックアウトと遺伝子標的統合が含まれる。
【0063】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列に、配列番号１～６に示される配列の１つ又は複数が含まれる時、前記遺伝子編集は遺伝子標的統合である。
【0064】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列に、配列番号７～９に示される配列の１つ又は複数が含まれる時、前記遺伝子編集は遺伝子ノックアウトである。
【0065】
もう一つの好ましい実施形態において、前記標的部位は、ＡＡＶＳ１、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0066】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡのＡＡＶＳ１をターゲットとする標的配列には、配列番号３に示される配列が含まれる。
【0067】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡのＰＤ１をターゲットとする標的配列には、配列番号１及び／又は配列番号２に示される配列が含まれる。
【0068】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡのＴＲＡＣをターゲットとする標的配列には、配列番号４及び／又は配列番号５に示される配列が含まれる。
【0069】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ｇＲＮＡのＢ２Ｍをターゲットとする標的配列には、配列番号６に示される配列が含まれる。
【0070】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ドナーＤＮＡには、第一相同性アームと第二相同性アームが含まれ、ここで、前記第一相同性アームと第二相同性アームは細胞ゲノムの標的部位でドナーＤＮＡの細胞媒介性相同組換えを開始させることができ、前記第一相同性アームと第二相同性アームの配列長さはそれぞれ独立して２００～２０００ｂｐであり、好ましくは、４００～１０００ｂｐであり、より好ましくは、７００～９００ｂｐである。
【0071】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ドナーＤＮＡには更に標的遺伝子が含まれる。
【0072】
もう一つの好ましい実施形態において、前記標的遺伝子にはキメラ抗原受容体又はＴＣＲのコード配列が含まれる。
【0073】
もう一つの好ましい実施形態において、前記キメラ抗原受容体には、腫瘍細胞マーカーを標的とする抗原結合構造ドメインが含まれる。
【0074】
もう一つの好ましい実施形態において、前記キメラ抗原受容体には、腫瘍細胞マーカーを標的とする抗原結合構造ドメイン、任意のヒンジ領域、膜貫通構造ドメイン及び細胞内シグナル伝達結合ドメインが含まれる。
【0075】
もう一つの好ましい実施形態において、前記腫瘍細胞マーカーは、α葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７-Ｈ３、Ｂ７-Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン-３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ-Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ１＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＩＬ-１１Ｒα、ＩＬ-１３Ｒα２、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ-Ｙ、Ｋａｐｐａ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、ＷＴ-１、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0076】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８、Ｉｇ（免疫グロブリン）ヒンジ、ＣＤ２８、又はそれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質ヒンジ領域である。
【0077】
もう一つの好ましい実施形態において、前記膜貫通構造ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＩＣＯＳ、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、又はそれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質膜貫通ドメインである。
【0078】
もう一つの好ましい実施形態において、前記細胞内シグナル伝達結合ドメインには、共刺激シグナル伝達分子及び／又は一次シグナル伝達構造ドメインが含まれる。
【0079】
もう一つの好ましい実施形態において、前記共刺激シグナル伝達分子は、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ１３４、４-１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＬＩＧＨＴ、ＤＡＰ１０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ-１、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0080】
もう一つの好ましい実施形態において、前記一次シグナル伝達構造ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0081】
もう一つの好ましい実施形態において、前記細胞には、初代細胞及び継代細胞が含まれる。
【0082】
もう一つの好ましい実施形態において、前記細胞には、Ｔ細胞が含まれる。
【0083】
もう一つの好ましい実施形態において、前記細胞には、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＴ細胞が含まれる。
【0084】
もう一つの好ましい実施形態において、前記第一相同性アームは前記ゲノムの標的部位の切断部位上流側（又は左側）の配列と相同性があり、前記第二相同性アームは前記ゲノムの標的部位の切断部位下流側（又は右側）の配列と相同性がある。
【0085】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ドナーＤＮＡの配列長さは５０ｂｐ～５０００ｂｐであり、好ましくは、８０ｂｐ～４０００ｂｐである。
【0086】
もう一つの好ましい実施形態において、前記標的遺伝子の配列長さは５０ｂｐ～３０００ｂｐであり、好ましくは、１０００ｂｐ～２０００ｂｐである。
【0087】
もう一つの好ましい実施形態において、前記キメラ抗原受容体又はＴＣＲのコード配列の長さは５０ｂｐ～３０００ｂｐであり、好ましくは、１０００ｂｐ～２０００ｂｐである。
【0088】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ドナーＤＮＡの配列は、配列番号１２～３８のいずれか一つに示される通りである。
【0089】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ベクターには、ウイルスベクターが含まれる。
【0090】
もう一つの好ましい実施形態において、前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0091】
本発明の第四方面は、遺伝子編集用キットを提供し、前記キットには、
ｉ）第一容器と第一容器内に位置する二本鎖ＤＮＡであるドナーＤＮＡ；
ｉｉ）第二容器と第二容器内に位置する遺伝子編集酵素又はそれをコードする核酸、又は前記遺伝子編集酵素を発現する第一発現ベクター；と
ｉｉｉ）第三容器と第三容器内に位置するｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡを発現する第二発現ベクターが含まれ、
ここで、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号１～９に示される配列の１つ又は複数が含まれる。
ｉ）第一容器と第一容器内に位置する二本鎖ＤＮＡであるドナーＤＮＡ；
ｉｉ）第二容器と第二容器内に位置する遺伝子編集酵素又はそれをコードする核酸、又は前記遺伝子編集酵素を発現する第一発現ベクター；と
ｉｉｉ）第三容器と第三容器内に位置するｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡを発現する第二発現ベクターが含まれ、
ここで、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号１～９に示される配列の１つ又は複数が含まれる。
【0092】
もう一つの好ましい実施形態において、前記第一容器、第二容器、第三容器は同じ容器であるか、又は異なる容器である。
【0093】
本発明の第五方面は、本発明の第一方面に記載の方法により製造された遺伝子編集された細胞を提供する。
【0094】
本発明の第六方面は、腫瘍免疫治療又は癌免疫治療製品の製造における本発明の第５方面に記載の方法細胞の使用を提供する。
【0095】
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴及び以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴（実施形態など）を互いに組み合わせて、新しい又は好ましい技術的解決策を形成できることを理解されたい。スペースの都合上、ここでは一一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【0096】
本出願の図面において、「Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ Ｔ」は未処理のＴ細胞を示し、「対照」は相同テンプレートとＣａｓ９のみをエレクトロポレーションしたＴ細胞を示し、「ＬＶ-１９ｂｂｚ」はレンチウイルスで製造されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞を示し、「ＡＡＶＳ１-１９ｂｂｚ」は非ウイルス性ＡＡＶＳ１部位特異的統合ＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞を示し、「ＰＤ１-１９ｂｂｚ」は非ウイルス性ＰＤ１部位特異的統合ＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞を示す。
【図1】非ウイルス部位特異的統合ＣＡＲ-Ｔ細胞の構築原理の模式図である。「ＴＲＡＣ-１９ｂｂｚ」は非ウイルス性ＴＲＡＣ部位特異的統合ＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞を示し、「Ｂ２Ｍ-１９ｂｂｚ」は非ウイルス性Ｂ２Ｍ部位特異的統合ＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞を示す。
【図2】プラスミド又は線状二本鎖ＤＮＡのエレクトロポレーション後のＴ細胞生存率を示す。対照群では、プラスミド又は線状二本鎖ＤＮＡのみをエレクトロポレーションし、試料群では、テンプレート、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを同時にエレクトロポレーションする。
【図3】異なるテンプレートを使用したエレクトロポレーション後のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２陽性率である。対照群はＨＤＲテンプレートとＣａｓ９のみのエレクトロポレーションであり、試料群は直鎖二本鎖ＤＮＡテンプレート、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡのエレクトロポレーションであり、ｐｂは両側に保護塩基を付加することを示す。
【図4】長さが異なる相同性アームのテンプレートのエレクトロポレーション後のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２陽性率と細胞生存率を示す。対照群は８００ｂｐ相同性テンプレートとＣａｓ９のみのエレクトロポレーションであり、試料群は異なる長さの相同性アームテンプレート、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡのエレクトロポレーションであり；図ＡはｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の陽性率であり、図Ｂは生細胞の相対数であり、図ＣはｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２陽性生細胞の相対数である。
【図5】ＡＡＶＳ１部位のｓｇＲＮＡスクリーニングを示す。図ＡはＴ７Ｅ１によって検出されたＡＡＶＳ１部位のノックアウト率であり、図ＢはＡＡＶＳ１位置での蛍光タンパク質ｍＴｕｒｑｕｉｏｉｓｅ２配列の組換え率を示す。図において、「ｓｇＲＮＡ-１」は本出願のＡＡＶＳ１-ｓｇＲＮＡ１を示し、「ｓｇＲＮＡ-２」は本出願のＡＡＶＳ１-ｓｇＲＮＡ２を示し、「ｓｇＲＮＡ-３」は本出願のＡＡＶＳ１-ｓｇＲＮＡ３を示し、「ｓｇＲＮＡ-４」は本出願のＡＡＶＳ１-ｓｇＲＮＡ３を示す。
【図6】ＰＤ１部位での蛍光タンパク質ｍＴｕｒｑｕｉｏｉｓｅ２配列の組換え率であるＰＤ１部位でのｓｇＲＮＡのスクリーニングを示す。図において、「ｓｇＲＮＡ-１」は本出願のＰＤ１-ｓｇＲＮＡ１を示し、「ｓｇＲＮＡ-２」は本出願のＰＤ１-ｓｇＲＮＡ２を示す。
【図7】ＴＲＡＣ部位でのｓｇＲＮＡスクリーニングを示す。図ＡはＣＤ３発現により検出されたＴＲＡＣ部位のノックアウト率であり、図ＢはＴＲＡＣ部位での蛍光タンパク質ｍＴｕｒｑｕｉｏｉｓｅ２配列の組換え率である。図において、「ｓｇＲＮＡ-１」は本出願のＴＲＡＣ-ｓｇＲＮＡ１を示し、「ｓｇＲＮＡ-２」は本出願のＴＲＡＣ-ｓｇＲＮＡ２を示し、「ｓｇＲＮＡ-３」は本出願のＴＲＡＣ-ｓｇＲＮＡ３を示す。
【図8】Ｂ２Ｍ部位でのｓｇＲＮＡスクリーニングを示す。図ＡはＢ２Ｍ発現により検出されたＢ２Ｍ部位のノックアウト率であり、図ＢはＢ２Ｍ部位での蛍光タンパク質ｍＴｕｒｑｕｉｏｉｓｅ２配列の組換え率である。図において、「ｓｇＲＮＡ-１」は本出願のＢ２Ｍ-ｓｇＲＮＡ１を示し、「ｓｇＲＮＡ-２」は本出願のＢ２Ｍ-ｓｇＲＮＡ２を示す。
【図9】異なる長さの相同性アームテンプレートのエレクトロポレーション後のＣＡＲ陽性率と細胞生存率である。対照群は８００ｂｐ相同性テンプレートとＣａｓ９のみのエレクトロポレーションであり、試料群は異なる長さの相同性アームテンプレート、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡのエレクトロポレーションであり；図ＡはＣＡＲの陽性率であり、図Ｂは生細胞の相対数であり、図ＣはＣＡＲ陽性生細胞の相対数である。
【図10】ＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞の陽性率を示す。
【図11】ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ｄＣＡＲＴ細胞の陽性率とノックアウト率である。図Ａは、異なるヒトドナー細胞から調製されたＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞の陽性率であり；図Ｂは、代表的な５つの異なるヒトドナー細胞から調製されたＡＡＶＳ１部位特異的統合ＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞の陽性率及びノックアウト率であり；図Ｃは、フローサイトメトリー解析によるＡＡＶＳ１部位特異的統合ＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞の陽性率を示す。対照群は相同性テンプレートとＣａｓ９のみのエレクトロポレーションである。
【図12】ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞のＤＮＡ配列決定の結果である。ＨＡは相同性アームを示す。
【図13】ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＴ細胞生存率を示す。
【図14】ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＴ細胞のインビトロ増殖を示す。
【図15】ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞及び標的細胞を共培養したインビトロ拡大を示す。
【図16】標識法によって検出されたＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と標的細胞を共培養したインビトロ増殖である。対照群は相同性テンプレートとＣａｓ９のみのエレクトロポレーションである。
【図17】ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞表面マーカーの発現を示す。対照群は相同性テンプレートとＣａｓ９のみのエレクトロポレーションである。
【図18】ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞サブタイプの比率を示す。対照群は相同性テンプレートとＣａｓ９のみのエレクトロポレーションである。
【図19】ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞分泌因子の検出を示す。対照群は相同性テンプレートとＣａｓ９のみのエレクトロポレーションである。
【図20】ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞のインビトロ死滅を示す。対照群は相同性テンプレートとＣａｓ９のみのエレクトロポレーションである。
【図21】ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞のインビボ死滅を示す。腫瘍標的細胞はＲａｊｉ細胞である。
【図22】ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞の陽性率とノックアウト率を示す。図Ａは、異なるヒトドナー細胞から調製されたＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞の陽性率であり、図Ｂは、代表的な５つの異なるヒトドナー細胞から調製されたＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞の陽性率及びノックアウト率であり；図Ｃは、フローサイトメトリー解析によるＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞の陽性率であり；図Ｄは、ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞とレンチウイルスで調製されたＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞とのＰＤ１発現の比較である。対照群は相同性テンプレートとＣａｓ９のみのエレクトロポレーションである。
【図23】ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞のＤＮＡ配列決定結果である。ＨＡは相同性アームである。
【図24】ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞と標的細胞を共培養したインビトロ増殖を示す。
【図25】ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞表面マーカーの発現を示す。対照群は相同性テンプレートとＣａｓ９のみのエレクトロポレーションである。
【図26】ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞分泌因子の検出を示す。対照群は相同性テンプレートとＣａｓ９のみのエレクトロポレーションである。
【図27】ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞のインビトロ死滅を示す。対照群は相同性テンプレートとＣａｓ９のみのエレクトロポレーションである。
【図28】ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞のインビボ死滅を示す。腫瘍標的細胞は、ＰＤＬ１を過剰発現するＲａｊｉ細胞である。
【発明を実施するための形態】
【0097】
広範かつ綿密な研究の後、多数のスクリーニングを通じて、発明者らは標的部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ）を効率的に編集できるｇＲＮＡを予想外にスクリーニングした。さらに、異なる長さの第一相同性アームと第二相同性アームを比較することにより、本発明者らはまた、Ｔ細胞の外因性核酸細胞ゲノムへの効率的な統合条件（例えば、特定の長さの第一相同性アームと第二相同性アームがゲノム標的部位で効率的な統合を行うことができる条件）を確認できた。本発明は、これに基づいて完成されたものである。
【0098】
（用語）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介される遺伝子編集法
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、細菌や古細菌の長期的な進化の過程で形成された適応免疫防御であり、侵入するウイルスや外因性ＤＮＡと戦うために使用できる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、侵入するファージとプラスミドＤＮＡのフラグメントをＣＲＩＳＰＲに統合し、対応するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）を使用して相同配列の分解を誘導することにより、免疫を提供する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介される遺伝子編集法
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、細菌や古細菌の長期的な進化の過程で形成された適応免疫防御であり、侵入するウイルスや外因性ＤＮＡと戦うために使用できる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、侵入するファージとプラスミドＤＮＡのフラグメントをＣＲＩＳＰＲに統合し、対応するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）を使用して相同配列の分解を誘導することにより、免疫を提供する。
【0099】
前記系の動作原理は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ-ｄｅｒｉｖｅｄ ＲＮＡ）が塩基対を介してｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ-ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＲＮＡ）と結合して、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ複合体を形成し、当該複合体は、ヌクレアーゼＣａｓ９タンパク質を誘導してｃｒＲＮＡと対になった配列標的部位で二本鎖ＤＮＡを切断する。これら２つのＲＮＡを人工的に設計することにより、Ｃａｓ９を特定の部位でＤＮＡを切断するように誘導するのに十分なガイド機能を備えたｇＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ）を設計できる。
【0100】
ＲＮＡ誘導ｄｓＤＮＡ結合タンパク質として、Ｃａｓ９エフェクターヌクレアーゼは、最初に知られた統一因子（ｕｎｉｆｙｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）であり、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質を共に定位させることができる。タンパク質をヌクレアーゼフリーのＣａｓ９（ｎｕｃｌｅａｓｅ-ｎｕｌｌ Ｃａｓ９）と融合させ、適切なｇＲＮＡを発現させることにより、任意のｄｓＤＮＡ配列をターゲットとすることができ、ｇＲＮＡの末端はターゲットＤＮＡに接続でき、Ｃａｓ９の結合に影響を与えるない。従って、Ｃａｓ９は任意のｄｓＤＮＡ配列で任意の融合タンパク質とＲＮＡをもたらすことができる。このような技術は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムと呼ばれる。
【0101】
標的統合メカニズム
本発明の標的統合戦略では、特定の長さの相同性アームを含む線形化されたドナー（即ち、ドナーＤＮＡ又は外因性核酸）を提供し、このようなドナーは、ＰＣＲ増幅又は正確な酵素消化によって得られた特定の長さ（例えば、７００～９００ｂｐ）を含む相同性アームのトランスジェニックドナーであり；ドナーＤＮＡ又は外因性核酸をＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇｕｉｄｅ ＲＮＡと一緒に細胞にエレクトロトランスファーする。既存の遺伝子ターゲティング戦略と比較して、本発明によって提供される標的統合戦略は、より高い統合効率を有する。
本発明の標的統合戦略では、特定の長さの相同性アームを含む線形化されたドナー（即ち、ドナーＤＮＡ又は外因性核酸）を提供し、このようなドナーは、ＰＣＲ増幅又は正確な酵素消化によって得られた特定の長さ（例えば、７００～９００ｂｐ）を含む相同性アームのトランスジェニックドナーであり；ドナーＤＮＡ又は外因性核酸をＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇｕｉｄｅ ＲＮＡと一緒に細胞にエレクトロトランスファーする。既存の遺伝子ターゲティング戦略と比較して、本発明によって提供される標的統合戦略は、より高い統合効率を有する。
【0102】
本発明において、ＣＲＩＳＰＲによって媒介されるゲノムの編集においてトランスジーンフラグメント及び両側の７００～９００ｂｐの相同性アームからなる線形化されたｄｓＤＮＡドナー（即ち、ドナーＤＮＡ又は外因性核酸）は、効率的な標的化統合を達成するための鍵である。ＭＭＥＪ（マイクロ相同性アームによって媒介される末端結合）又はＨＩＴＩ（非相同性配列の末端結合）によって媒介される方法と比較して、本発明の標的統合技術は最高の組換え率を有する。
【0103】
細胞ゲノムの標的部位に対して遺伝子編集する方法
本発明は下記のステップを含む細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集する方法を提供する。
（ａ）遺伝子編集しようとする細胞を提供するステップ；
（ｂ）（ｉ）遺伝子編集酵素又はそれをコードする核酸、又は前記遺伝子編群酵素を発見する第一発現ベクター；と（ｉｉ）ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡを発現する第二発現ベクターを前記細胞に導入して、前記細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集し、前記ｇＲＮＡが遺伝子編集酵素を誘導して、標的部位を特異的切断するステップ；
ここで、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号１～９に示される配列の１つ又は複数が含まれる。
本発明は下記のステップを含む細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集する方法を提供する。
（ａ）遺伝子編集しようとする細胞を提供するステップ；
（ｂ）（ｉ）遺伝子編集酵素又はそれをコードする核酸、又は前記遺伝子編群酵素を発見する第一発現ベクター；と（ｉｉ）ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡを発現する第二発現ベクターを前記細胞に導入して、前記細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集し、前記ｇＲＮＡが遺伝子編集酵素を誘導して、標的部位を特異的切断するステップ；
ここで、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号１～９に示される配列の１つ又は複数が含まれる。
【0104】
本発明の方法は、標的部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍなど）に対して高効率の遺伝子ノックアウト又は遺伝子標的統合を実行することができる。
【0105】
反応系
本発明は、下記を含む細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集するための反応系を提供する。
（ａ）二本鎖ＤＮＡであるドナーＤＮＡ；
（ｂ）遺伝子編集酵素又はそれをコードする核酸、又は前記遺伝子編集酵素を発現する第一発現ベクター；
（ｃ）ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡを発現する第二発現ベクター；
ここで、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号１～９に示される配列の１つ又は複数が含まれる。
本発明は、下記を含む細胞ゲノムの標的部位を遺伝子編集するための反応系を提供する。
（ａ）二本鎖ＤＮＡであるドナーＤＮＡ；
（ｂ）遺伝子編集酵素又はそれをコードする核酸、又は前記遺伝子編集酵素を発現する第一発現ベクター；
（ｃ）ｇＲＮＡ又は前記ｇＲＮＡを発現する第二発現ベクター；
ここで、前記ｇＲＮＡがターゲットとする標的配列には、配列番号１～９に示される配列の１つ又は複数が含まれる。
【0106】
一つの好ましい実施形態において、前記ドナーＤＮＡには第一相同性アームと第二相同性アームが含まれ、ここで、前記第一相同性アームと前記第二相同性アームは前記免疫細胞ゲノムの標的部位でドナーＤＮＡの免疫細胞によって媒介される相同組換えを開始させることができ、前記第一相同性アームと第二相同性アームの配列長さはそれぞれ独立して２００～２０００ｂｐであり、好ましくは、４００～１０００ｂｐであり、より好ましくは、７００～９００ｂｐである。
【0107】
本発明において、統合しようとするドナーＤＮＡの配列長さは、５０ｂｐ～５０００ｂｐであってもよい。本発明のドナーＤＮＡにおける標的遺伝子（又は標的遺伝子と呼ぶ）の長さは、５０ｂｐ～３０００ｂｐであってもよい。
【0108】
本発明において、標的部位は特に限定されないが、好ましい標的部位には、ＡＡＶＳ１、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍが含まれる。
【0109】
本発明の好ましい実施形態において、前記第一相同性アームの配列長さＤ１と第二相同性アームの配列長さＤ２の比（Ｄ１／Ｄ２）は、（０．８～１．２）：（０．５～１．５）であり、好ましくは（０．９～１．１）：（０．７～１．３）であり、より好ましくは１：１である。
【0110】
本発明の反応系において、２つの相同性アームの配列長さは完全に一致する必要はなく、両者の間にはある程度の長さ差が許容される。
【0111】
本発明の主な利点は下記を含む。
１）本発明の方法の遺伝子編集（例えば、部位特異的統合）効率は、他の既存の遺伝子編集技術よりも有意に高い。
２）導入方法は簡便で、エレクトロポレーションなどの方法で導入できる。
３）本発明は、Ｔ細胞における外因性核酸の部位特異的統合効率を改善することができる。
４）本発明の方法を用いると、部位特異的統合Ｔ細胞製品を調製することが可能になる。
５）本発明の方法は、ＡＡＶＳ１、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ等の部位の非ウイルス性部位特異的統合ＣＡＲ-Ｔ細胞を調製でき、ウイルス調製の多くの欠点を回避でき、ＣＡＲ-Ｔ製品の均一性と安定性を向上させることができる。さらに、強化型、誘導可能型などのＣＡＲ-Ｔ製品の調製に技術サポートを提供する。
１）本発明の方法の遺伝子編集（例えば、部位特異的統合）効率は、他の既存の遺伝子編集技術よりも有意に高い。
２）導入方法は簡便で、エレクトロポレーションなどの方法で導入できる。
３）本発明は、Ｔ細胞における外因性核酸の部位特異的統合効率を改善することができる。
４）本発明の方法を用いると、部位特異的統合Ｔ細胞製品を調製することが可能になる。
５）本発明の方法は、ＡＡＶＳ１、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ等の部位の非ウイルス性部位特異的統合ＣＡＲ-Ｔ細胞を調製でき、ウイルス調製の多くの欠点を回避でき、ＣＡＲ-Ｔ製品の均一性と安定性を向上させることができる。さらに、強化型、誘導可能型などのＣＡＲ-Ｔ製品の調製に技術サポートを提供する。
【0112】
以下では、具体的な実施例に結合して、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定することを意図していないことを理解されたい。下記の実施例で具体的な条件を示していない実験方法は、通常、Ｓａｍｂｒｏｏｋらなどの、分子クローニング：実験室ハンドブック（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている条件、又は「微生物：実験マニュアル」（Ｊａｍｅｓ ＣａｐｐｕｃｃｉｎｏとＮａｔａｌｉｅ Ｓｈｅｒｍａｎ編集、Ｐｅａｒｓｏｎ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ出版社）に記載された条件、又は製造業者の提案条件のような従来の条件に従う。本特許に関連する実験で使用されたヒトドナー細胞はすべて、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｉｌｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手したものである。
【0113】
特に説明しない限り、実施例で使用された材料と試薬は、市販品として入手できる。
【0114】
通常の方法
Ｉ．Ｔ細胞のエレクトロポレーション
Ｔ細胞のエレクトロポレーションは、Ｔ細胞の遺伝子編集を実現する技術的な方法であり、手順はＬｏｎｚａ社のＰ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｘキットを参照する。
Ｉ．Ｔ細胞のエレクトロポレーション
Ｔ細胞のエレクトロポレーションは、Ｔ細胞の遺伝子編集を実現する技術的な方法であり、手順はＬｏｎｚａ社のＰ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｘキットを参照する。
【0115】
機器と材料：
（ｉ）Ｌｏｎｚａ ４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標） Ｓｙｓｔｅｍ核移植装置
（ｉｉ）キットはＰ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）TMＸキット（Ｌｏｎｚａ、Ｖ４ＸＰ-３０２４）である。
（ｉｉｉ）ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズ刺激の２～４日後のＴ細胞
（ｉｖ）市販のｓｐＣａｓ９タンパク質（５ｕｇ／ｕｌ）（ＴｒｕｅＣｕｔ（登録商標）Ｃａｓ９タンパク質ｖ２、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）
（ｖ）合成されたｓｇＲＮＡ（合成されたｓｇＲＮＡをＴＥ緩衝液に溶解させ、最終濃度１０ｕｇ／ｕＬに希釈）
（ｖｉ）相同テンプレートを含む線形化された二本鎖ＤＮＡ
（ｉ）Ｌｏｎｚａ ４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標） Ｓｙｓｔｅｍ核移植装置
（ｉｉ）キットはＰ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）TMＸキット（Ｌｏｎｚａ、Ｖ４ＸＰ-３０２４）である。
（ｉｉｉ）ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズ刺激の２～４日後のＴ細胞
（ｉｖ）市販のｓｐＣａｓ９タンパク質（５ｕｇ／ｕｌ）（ＴｒｕｅＣｕｔ（登録商標）Ｃａｓ９タンパク質ｖ２、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）
（ｖ）合成されたｓｇＲＮＡ（合成されたｓｇＲＮＡをＴＥ緩衝液に溶解させ、最終濃度１０ｕｇ／ｕＬに希釈）
（ｖｉ）相同テンプレートを含む線形化された二本鎖ＤＮＡ
【0116】
具体的な操作手順：
１００μｌのエレクトロポレーションカップに適している。
（１）８２μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ＋１８μｌのサプリメント／各エレクトロポレーションカップに従って、エレクトロポレーションの総数に応じて、エレクトロポレーション溶液混合物を調製し、均一に混合して、室温に放置する。
（２）Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡ９を共培養し、室温で１０分間放置してＲＮＰを形成させる。
（３）線形化された相同性テンプレート二本鎖ＤＮＡ（ＰＤ１の２つの部位に相同性アームを含む蛍光タンパク質ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２配列を含み、ＡＡＶＳ１、ＰＤ１、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍの相同性アームのＣＤ１９-ＣＡＲＴ配列が含まれる）をＲＮＰに加え、室温で２分間培養する。
前記ＣＤ１９-ＣＡＲＴには、ＣＤ１９をターゲットとする細胞外構造ドメイン、ＣＤ８αから選択される膜貫通領域、及びＣＤ３ζとＣＤ１３７から選択される細胞内シグナル伝達構造ドメインが含まれる。
（４）活性化された状態のＴ細胞を収集し、５×１０６まで計数してエレクトロポレーション反応を実行する。
（５）細胞と「ＲＮＰ＋相同性テンプレート」を十分に混合・再懸濁して、エレクトロポレーションカップに加える。
（６）エレクトロポレーション装置の電源を入れ、エレクトロポレーションカップをスロットに入れ、対応するプログラムＥＯ１１５を選択してエレクトロポレーションを実行する。
（７）細胞を予熱した細胞培地に加え、細胞培養インキュベーターで培養する。
１００μｌのエレクトロポレーションカップに適している。
（１）８２μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ＋１８μｌのサプリメント／各エレクトロポレーションカップに従って、エレクトロポレーションの総数に応じて、エレクトロポレーション溶液混合物を調製し、均一に混合して、室温に放置する。
（２）Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡ９を共培養し、室温で１０分間放置してＲＮＰを形成させる。
（３）線形化された相同性テンプレート二本鎖ＤＮＡ（ＰＤ１の２つの部位に相同性アームを含む蛍光タンパク質ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２配列を含み、ＡＡＶＳ１、ＰＤ１、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍの相同性アームのＣＤ１９-ＣＡＲＴ配列が含まれる）をＲＮＰに加え、室温で２分間培養する。
前記ＣＤ１９-ＣＡＲＴには、ＣＤ１９をターゲットとする細胞外構造ドメイン、ＣＤ８αから選択される膜貫通領域、及びＣＤ３ζとＣＤ１３７から選択される細胞内シグナル伝達構造ドメインが含まれる。
（４）活性化された状態のＴ細胞を収集し、５×１０６まで計数してエレクトロポレーション反応を実行する。
（５）細胞と「ＲＮＰ＋相同性テンプレート」を十分に混合・再懸濁して、エレクトロポレーションカップに加える。
（６）エレクトロポレーション装置の電源を入れ、エレクトロポレーションカップをスロットに入れ、対応するプログラムＥＯ１１５を選択してエレクトロポレーションを実行する。
（７）細胞を予熱した細胞培地に加え、細胞培養インキュベーターで培養する。
【0117】
ＩＩ．外因性配列組換え率の検出
１）滅菌した１．５ｍｌの遠心分離チューブに１×１０６個の細胞を取り、遠心分離した後上清を捨てる。
２）フローバッファー（２％の血清を含むＰＢＳ）を細胞沈殿に加え、細胞を洗浄する。
３）室温で遠心分離機に置き、遠心分離した後、上清を可能な限り吸引する。
４）検出抗体又はタンパク質と共培養し、氷上で３０分間培養する。
５）細胞をフローバッファーで２回洗浄し、遠心分離した後、上清を可能な限り吸引する。
６）適切な体積のフローバッファーで細胞を再懸濁させ、機器でストリーミング分析を実行する。
１）滅菌した１．５ｍｌの遠心分離チューブに１×１０６個の細胞を取り、遠心分離した後上清を捨てる。
２）フローバッファー（２％の血清を含むＰＢＳ）を細胞沈殿に加え、細胞を洗浄する。
３）室温で遠心分離機に置き、遠心分離した後、上清を可能な限り吸引する。
４）検出抗体又はタンパク質と共培養し、氷上で３０分間培養する。
５）細胞をフローバッファーで２回洗浄し、遠心分離した後、上清を可能な限り吸引する。
６）適切な体積のフローバッファーで細胞を再懸濁させ、機器でストリーミング分析を実行する。
【0118】
ＩＩＩ．生細胞数の検出
生存細胞の数は、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌｔｉｔｅｒ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙキットを使用して検出され、操作手順は説明書を参照する。
１）ＭＴＳ試薬を室温に平衡化させる。
２）３つの複製ウェルを設定し、１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートに取り、２０μｌのＭＴＳ試薬を加える。
３）３７℃の５％ＣＯ２を含むインキュベーターで４時間培養する。
４）マイクロプレートリーダー４９０ｎｍで検出し、データを統計・分析する。
生存細胞の数は、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌｔｉｔｅｒ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙキットを使用して検出され、操作手順は説明書を参照する。
１）ＭＴＳ試薬を室温に平衡化させる。
２）３つの複製ウェルを設定し、１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートに取り、２０μｌのＭＴＳ試薬を加える。
３）３７℃の５％ＣＯ２を含むインキュベーターで４時間培養する。
４）マイクロプレートリーダー４９０ｎｍで検出し、データを統計・分析する。
【0119】
例えば、本発明の方法を使用し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術と結合して、非ウイルス性部位特異的統合のＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞（ＡＡＶＳ１安全部位統合のＣＡＲ-Ｔ細胞、免疫チェックポイントＰＤ１部位統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞、ＴＲＡＣ部位統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞、Ｂ２Ｍ部位統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞が含まれる）を１ステップで構築することができる。
【0120】
１．標的配列の情報：
ＡＡＶＳ１-ｓｇＲＮＡ１：ＣＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧ（配列番号７）
ＡＡＶＳ１-ｓｇＲＮＡ２：ＡＧＡＧＣＴＡＧＣＡＣＡＧＡＣＴＡＧＡＧ（配列番号３）
ＡＡＶＳ１-ｓｇＲＮＡ３：ＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＡＧＧ（配列番号８）
ＡＡＶＳ１-ｓｇＲＮＡ４：ＧＡＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＧＧ（配列番号９）
ＰＤ１-ｓｇＲＮＡ１：ＣＧＡＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＴＧＴ（配列番号１）
ＰＤ１-ｓｇＲＮＡ２：ＧＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＧＣ（配列番号２）
ＴＲＡＣ-ｓｇＲＮＡ１：ＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＧ（配列番号４）
ＴＲＡＣ-ｓｇＲＮＡ２：ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号５）
ＴＲＡＣ-ｓｇＲＮＡ３：ＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ（配列番号１０）
Ｂ２Ｍ-ｓｇＲＮＡ１：ＡＣＴＣＡＣＧＣＴＧＧＡＴＡＧＣＣＴＣＣ（配列番号１１）
Ｂ２Ｍ-ｓｇＲＮＡ２：ＧＡＧＴＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡ（配列番号６）
２、ｓｇＲＮＡは会社で合成され、ＴＥ緩衝液に溶解させ、最終濃度１０ｕｇ／ｕＬに希釈する。
３、エレクトロポレーションで非ウイルス性部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴを調製する。
ＡＡＶＳ１-ｓｇＲＮＡ１：ＣＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧ（配列番号７）
ＡＡＶＳ１-ｓｇＲＮＡ２：ＡＧＡＧＣＴＡＧＣＡＣＡＧＡＣＴＡＧＡＧ（配列番号３）
ＡＡＶＳ１-ｓｇＲＮＡ３：ＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＡＧＧ（配列番号８）
ＡＡＶＳ１-ｓｇＲＮＡ４：ＧＡＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＧＧ（配列番号９）
ＰＤ１-ｓｇＲＮＡ１：ＣＧＡＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＣＣＴＧＴ（配列番号１）
ＰＤ１-ｓｇＲＮＡ２：ＧＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＧＣ（配列番号２）
ＴＲＡＣ-ｓｇＲＮＡ１：ＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＧ（配列番号４）
ＴＲＡＣ-ｓｇＲＮＡ２：ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号５）
ＴＲＡＣ-ｓｇＲＮＡ３：ＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ（配列番号１０）
Ｂ２Ｍ-ｓｇＲＮＡ１：ＡＣＴＣＡＣＧＣＴＧＧＡＴＡＧＣＣＴＣＣ（配列番号１１）
Ｂ２Ｍ-ｓｇＲＮＡ２：ＧＡＧＴＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡ（配列番号６）
２、ｓｇＲＮＡは会社で合成され、ＴＥ緩衝液に溶解させ、最終濃度１０ｕｇ／ｕＬに希釈する。
３、エレクトロポレーションで非ウイルス性部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴを調製する。
【0121】
機器と材料：（ｉ）Ｌｏｎｚａ ４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標） Ｓｙｓｔｅｍ核移植装置
（ｉｉ）キットはＰ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｘキット（Ｌｏｎｚａ、Ｖ４ＸＰ-３０２４）である。
（ｉｉｉ）ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズ刺激の２～３日後のＴ細胞
（ｉｖ）市販のｓｐＣａｓ９タンパク質（５ｕｇ／ｕｌ）（ＴｒｕｅＣｕｔ（登録商標） Ｃａｓ９タンパク質ｖ２、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）
（ｖ）会社で合成れたｓｇＲＮＡ
（ｖｉ）相同性テンプレートを含む線形化された二本鎖Ｄ
（ｉｉ）キットはＰ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ-Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｘキット（Ｌｏｎｚａ、Ｖ４ＸＰ-３０２４）である。
（ｉｉｉ）ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズ刺激の２～３日後のＴ細胞
（ｉｖ）市販のｓｐＣａｓ９タンパク質（５ｕｇ／ｕｌ）（ＴｒｕｅＣｕｔ（登録商標） Ｃａｓ９タンパク質ｖ２、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）
（ｖ）会社で合成れたｓｇＲＮＡ
（ｖｉ）相同性テンプレートを含む線形化された二本鎖Ｄ
【0122】
具体的な操作手順：
１００μｌのエレクトロポレーションカップに適している。
（１）８２μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ＋１８μｌのサプリメント／各エレクトロポレーションカップに従って、エレクトロポレーションの総数に応じて、エレクトロポレーション溶液混合物を調製し、均一に混合し、室温に放置する。
（２）Ｃａｓ９タンパク質をそれぞれＡＡＶＳ１-ｓｇＲＮＡ、ＰＤ１-ｓｇＲＮＡ１、ＰＤ１-ｓｇＲＮＡ２、ＴＲＡＣ-ｓｇＲＮＡ及びＢ２Ｍ-ｓｇＲＮＡと共培養し、室温で１０分間放置してＲＮＰを形成させる。
（３）各部位に相同性アームを含む線形化された二本鎖ＤＮＡをＲＮＰに加え、室温で２分間培養する。
（４）活性化状態のＴ細胞を収集し、５×１０６まで計数してエレクトロポレーション反応を実行する。
（５）細胞と「ＲＮＰ＋相同テンプレート」を十分に混合・再懸濁して、エレクトロポレーションカップに加える。
（６）エレクトロポレーション装置の電源を入れ、エレクトロポレーションカップをスロットに入れ、対応するプログラムＥＯ１１５を選択してエレクトロポレーションを実行する。
（７）細胞を予熱した細胞培地に入れ、細胞インキュベーターで培養する。
１００μｌのエレクトロポレーションカップに適している。
（１）８２μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ＋１８μｌのサプリメント／各エレクトロポレーションカップに従って、エレクトロポレーションの総数に応じて、エレクトロポレーション溶液混合物を調製し、均一に混合し、室温に放置する。
（２）Ｃａｓ９タンパク質をそれぞれＡＡＶＳ１-ｓｇＲＮＡ、ＰＤ１-ｓｇＲＮＡ１、ＰＤ１-ｓｇＲＮＡ２、ＴＲＡＣ-ｓｇＲＮＡ及びＢ２Ｍ-ｓｇＲＮＡと共培養し、室温で１０分間放置してＲＮＰを形成させる。
（３）各部位に相同性アームを含む線形化された二本鎖ＤＮＡをＲＮＰに加え、室温で２分間培養する。
（４）活性化状態のＴ細胞を収集し、５×１０６まで計数してエレクトロポレーション反応を実行する。
（５）細胞と「ＲＮＰ＋相同テンプレート」を十分に混合・再懸濁して、エレクトロポレーションカップに加える。
（６）エレクトロポレーション装置の電源を入れ、エレクトロポレーションカップをスロットに入れ、対応するプログラムＥＯ１１５を選択してエレクトロポレーションを実行する。
（７）細胞を予熱した細胞培地に入れ、細胞インキュベーターで培養する。
【0123】
４、ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞に対して評価する
（１）本発明を使用すると、ウイルスを使用せずにＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＡＲ-Ｔ細胞を構築でき、ＣＡＲの陽性率は約１０％～２０％であり（図１１）、ノックアウト率は約６５％～９０％であり（図１１）、前記方法はＣＤ３＋、ＣＤ４＋、Ｄ８＋Ｔ細胞のいずれでもＣＡＲ要素の部位特異的統合を実現できる（図１０）。
（２）本発明によって構築されたＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞の使用は、比較的に高い生存率を有する（図１３）。エレクトロポレーションのステップ自体はある程度の細胞死を引き起こすが、ＡＡＶＳ１部位特異的統合ＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞の効果的な増殖には影響しない（図１４～１６）。
（３）ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、レンチウイルスで調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と比較して、若干の違いはあるが、全体的に見ると、細胞表面マーカーの発現、細胞サブタイプの変化、サイトカインの分泌などの方面において類似的な特性を示している（図１７～１９）。
（４）レンチウイルスによって調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と同様に、本発明によって構築されたＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、インビトロ及びインビボのいいずれにおいても腫瘍細胞を効果的に殺すことができる（図２０、２１）。
（１）本発明を使用すると、ウイルスを使用せずにＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＡＲ-Ｔ細胞を構築でき、ＣＡＲの陽性率は約１０％～２０％であり（図１１）、ノックアウト率は約６５％～９０％であり（図１１）、前記方法はＣＤ３＋、ＣＤ４＋、Ｄ８＋Ｔ細胞のいずれでもＣＡＲ要素の部位特異的統合を実現できる（図１０）。
（２）本発明によって構築されたＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞の使用は、比較的に高い生存率を有する（図１３）。エレクトロポレーションのステップ自体はある程度の細胞死を引き起こすが、ＡＡＶＳ１部位特異的統合ＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞の効果的な増殖には影響しない（図１４～１６）。
（３）ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、レンチウイルスで調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と比較して、若干の違いはあるが、全体的に見ると、細胞表面マーカーの発現、細胞サブタイプの変化、サイトカインの分泌などの方面において類似的な特性を示している（図１７～１９）。
（４）レンチウイルスによって調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と同様に、本発明によって構築されたＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、インビトロ及びインビボのいいずれにおいても腫瘍細胞を効果的に殺すことができる（図２０、２１）。
【0124】
５、ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞に対して評価する
（１）本発明を使用すると、ウイルスを使用せずＰＤ１部位特異的統合のＣＡＲ-Ｔ細胞を構築することができ、ＣＡＲの陽性率は約１０％～３０％であり（図２２）、ノックアウト率は約８０％～９５％である（図２２）。
（２）本発明によって構築されたＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、レンチウイルスによって調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞よりも強い増殖能力を有している（図２４）。
（３）レンチウイルスによって調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と同様に、ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、腫瘍細胞の刺激に応答して表面マーカーの発現を活性化することができ、その中で、ＣＤ１３７の発現レベルの増加はより有意である（図２５）。
（４）レンチウイルスによって調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と同様に、ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、腫瘍細胞の刺激に応答してサイトカインを分泌することができ、その中で、ＩＦＮ-γ分泌レベルの増加はより有意である（図２６）。
（５）レンチウイルスにより調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と比較して、本発明を使用して構築されたＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、インビボ及びインビトロの両方でより優れた殺腫瘍能を示している（図２７、２８）。
（１）本発明を使用すると、ウイルスを使用せずＰＤ１部位特異的統合のＣＡＲ-Ｔ細胞を構築することができ、ＣＡＲの陽性率は約１０％～３０％であり（図２２）、ノックアウト率は約８０％～９５％である（図２２）。
（２）本発明によって構築されたＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、レンチウイルスによって調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞よりも強い増殖能力を有している（図２４）。
（３）レンチウイルスによって調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と同様に、ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、腫瘍細胞の刺激に応答して表面マーカーの発現を活性化することができ、その中で、ＣＤ１３７の発現レベルの増加はより有意である（図２５）。
（４）レンチウイルスによって調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と同様に、ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、腫瘍細胞の刺激に応答してサイトカインを分泌することができ、その中で、ＩＦＮ-γ分泌レベルの増加はより有意である（図２６）。
（５）レンチウイルスにより調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と比較して、本発明を使用して構築されたＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、インビボ及びインビトロの両方でより優れた殺腫瘍能を示している（図２７、２８）。
【0125】
なお、本出願では、下記の線型二本鎖ＤＮＡ（ドナーＤＮＡ）を例として実験を実行していることを説明する。
【0126】
ここで、プラスミド配列に対して下記のように説明する。
（１）ＰＤ１サイト１特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡプラスミドドナー配列を例としてベクターとドナーＤＮＡの状況を説明する。
ベクターは環状構造であり、ベクターのバックボーンは、Ｌｏｎｚａ社から購入したプラスミドｐｍａｘＧＦＰ（登録商標）からのものである。
ドナーＤＮＡ配列は線状二本鎖ＤＮＡ配列における「ＰＤ１サイト１特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）」と同じであり、即ち、配列番号１２に示される通りである。
（１）ＰＤ１サイト１特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡプラスミドドナー配列を例としてベクターとドナーＤＮＡの状況を説明する。
ベクターは環状構造であり、ベクターのバックボーンは、Ｌｏｎｚａ社から購入したプラスミドｐｍａｘＧＦＰ（登録商標）からのものである。
ドナーＤＮＡ配列は線状二本鎖ＤＮＡ配列における「ＰＤ１サイト１特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）」と同じであり、即ち、配列番号１２に示される通りである。
【0127】
（２）ＰＤ１サイト１特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡプラスミドドナー配列を例としてベクターとドナーＤＮＡの状況を説明する。
ベクターは環状構造であり、ベクターのバックボーンは、Ｌｏｎｚａ社から購入したプラスミドｐｍａｘＧＦＰ（登録商標）からのものである。
ドナーＤＮＡ配列は線状二本鎖ＤＮＡ配列の「ＰＤ１サイト２特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）」と同じであり、即ち、配列番号１３に示される通りである。
ベクターは環状構造であり、ベクターのバックボーンは、Ｌｏｎｚａ社から購入したプラスミドｐｍａｘＧＦＰ（登録商標）からのものである。
ドナーＤＮＡ配列は線状二本鎖ＤＮＡ配列の「ＰＤ１サイト２特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）」と同じであり、即ち、配列番号１３に示される通りである。
【0128】
線状二本鎖ＤＮＡ（ドナーＤＮＡ）は配列番号１２～３８のいずれか一つに示される通りである。
【0129】
ここで、ＰＤ１サイト１特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は、配列番号１２に示される通りであり、ＰＤ１サイト２特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡのドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号１３に示される通りであり、ＰＤ１サイト１特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの２００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号１４に示される通りであり、ＰＤ１サイト１特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの４００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号１５に示される通りであり、ＰＤ１サイト１特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの１６００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号１６に示される通りであり、ＰＤ１サイト２特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの２００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号１７に示される通りであり、ＰＤ１サイト２特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの４００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号１８に示される通りであり、ＰＤ１サイト２特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの１６００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号１９に示される通りであり、ＡＡＶＳ１サイト１／４特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号２０に示される通りであり、ＡＡＶＳ１サイト２特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）配列番号２１に示される通りであり、ＡＡＶＳ１サイト３特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号２２に示される通りであり、ＴＲＡＣサイト１特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号２３に示される通りであり、ＴＲＡＣサイト２特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号２４に示される通りであり、ＴＲＡＣサイト３特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号２５に示される通りであり、Ｂ２Ｍサイト２特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号２６に示される通りであり、ＡＡＶＳ１サイト２特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲの相同性アームの２００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号２７に示される通りであり、ＡＡＶＳ１サイト２特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲの相同性アームの４００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号２８に示される通りであり、ＡＡＶＳ１サイト２特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲの相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号２９に示される通りであり、ＰＤ１サイト１特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲの相同性アームの２００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号３０に示される通りであり、ＰＤ１サイト１特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲの相同性アームの４００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号３１に示される通りであり、ＰＤ１サイト１特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲの相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号３２に示される通りであり、ＴＲＡＣサイト２特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲの相同性アームの２００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号３３に示される通りであり、ＴＲＡＣサイト２特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲの相同性アームの４００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号３４に示される通りであり、ＴＲＡＣサイト２特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲの相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号３５に示される通りであり、Ｂ２Ｍサイト２特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲの相同性アームの２００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号３６に示される通りであり、Ｂ２Ｍサイト２特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲの相同性アームの４００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号３７に示される通りであり、Ｂ２Ｍサイト２特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲの相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＤＲ）は配列番号３８に示される通りである。
【0130】
比較例としての線状二本鎖ＤＮＡ（ドナーＤＮＡ）の配列は配列番号３９～４４のいずれか一つに示される通りである。
【0131】
ここで、ＰＤ１サイト１特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＩＴＩ-ｐｂ又は「ＨＩＴＩ（ｐｂ）」と書く）は配列番号３９に示される通りであり、ＰＤ１サイト１特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＩＴＩ）は配列番号４０に示される通りであり、ＰＤ１サイト１特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＭＭＥＪ）は配列番号４１に示される通りであり、ＰＤ１サイト２特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＩＴＩ-ｐｂ又は「ＨＩＴＩ（ｐｂ）」と書く）は配列番号４２に示される通りであり、ＰＤ１サイト２特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＨＩＴＩ）は配列番号４３に示される通りであり、ＰＤ１サイト２特異的統合のｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の相同性アームの８００ｂｐＤＮＡドナー配列（ＭＭＥＪ）は配列番号４４に示される通りである。
【0132】
本出願の図面において、「Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ Ｔ」は未処理のＴ細胞を示し、「対照」は相同性テンプレートとＣａｓ９のみをエレクトロポレーションしたＴ細胞を示し、「ＬＶ-１９ｂｂｚ」はレンチウイルスで製造されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞を示し、「ＡＡＶＳ１-１９ｂｂｚ」は非ウイルス性ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞を示し、「ＰＤ１-１９ｂｂｚ」は非ウイルス性ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞を示す。
【0133】
実施例１ 線状二本鎖ＤＮＡを相同性テンプレートとする方法は、プラスミドより優れており、相同性テンプレートの相同性アームの長さを８００ｂｐに設定する時、最高の組換え率を有し、最も多い陽性細胞を得ることができ、最適条件である。
【0134】
最初に、Ｔ細胞に対するプラスミドと線状二本鎖ＤＮＡの形でテンプレートを送達する効果を比較した。その結果、テンプレートが線状二本鎖ＤＮＡの形で送達された場合、細胞の生存率がプラスミドよりも有意に高いことが示された（図２）。次に、組換え率に対する異なるテンプレート設計の効果を比較し、その中で、ＨＤＲは８００ｂｐの相同性アームを含むテンプレートであり、ＭＭＥＪは２０ｂｐのマイクロ相同性アームを含むテンプレートであり、ＨＩＴＩは両側にｓｇＲＮＡ標的を含むが相同性アームがないテンプレートであり、ＨＩＴＩ（ｐｂ）は、ＨＩＴＩに基づいて両端に５０ｂｐの保護塩基を付加し、ＰＤ１サイト１のＨＩＴＩ、ＨＩＴＩ（ｐｂ）、ＭＭＥＪのドナー配列はそれぞれ配列番号３９～４１に示される通りであり、ＰＤ１サイト２のＨＩＴＩ、ＨＩＴＩ（ｐｂ）、ＭＭＥＪのドナー配列は、それぞれ配列番号４２～４４に示される通りであった。その結果、ＨＤＲテンプレートが最も高い組換え率を有していることが分かった（図３）。上記の結果に基づいて、相同性アームを含む線状二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして使用して、非ウイルス性部位特異的統合のＣＡＲ-Ｔ細胞を構築することが最適方法であることが分かった（図１）。
【0135】
その後、相同性アームの長さに対する影響を比較した。先ずは、蛍光タンパク質ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２配列を外因性配列として使用し、２つのＰＤ１サイトで組換え実験を実行した（図４）。その結果、相同性アームの長さが２００ｂｐ、４００ｂｐ、８００ｂｐ、１６００ｂｐである時、いずれも良好な統合効果を示し、相同性アームの長さが長くなるにつれてｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２の統合率は増加したが、１６００ｂｐは８００ｂｐと比較して統合率の有意な増加を示さなかった。一方、細胞の生存率は、相同性アームの長さと有意に負の関係を示した。組換え率と細胞の生存率を考慮して、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２陽性の生存細胞の数を分析した。その結果、相同性アームの長さが８００ｂｐである時、最も多くの陽性細胞が得られることが示された。これに基づいて、ＰＤ１の高効率統合サイトに対して再度検証を実行し、ＡＡＶＳ１、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍの高効率統合サイトに対してスクリーニングを実行した。ノックアウト率とｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２組換え率を比較することで、最終的にＰＤ１-ｓｇＲＮＡ１、ＡＡＶＳ１-ｓｇＲＮＡ２、ＴＲＡＣ-ｓｇＲＮＡ２、Ｂ２Ｍ-ｓｇＲＮＡ２が好ましい配列であることを確定した（図５～８）。最後に、外因性配列としてＣＡＲ要素を使用して、ＡＡＶＳ１、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞をそれぞれ構築し、異なる長さの相同性アームの効果を比較した。ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２組換えの結果と一致して、相同性アームが８００ｂｐである時、最大数の陽性細胞を調製することができた（図９）。従って、８００ｂｐの相同性アームを含むＨＤＲテンプレートが、部位特異的統合のＴ細胞を構築するための最適条件であることを確認した。
【0136】
この前の実験では、主にＣＤ３＋Ｔ細胞の部位特異的統合条件を調査及び最適化した。これに基づいて、同じ方法を使用してＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を編集する試みをした。結果は、この方法がＣＤ３＋、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋Ｔ細胞において近似した部位特異的統合率を有していることを示した（図１０）。
【0137】
実施例２ 本発明の方法を使用して、非ウイルス性ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞を構築し、その機能を検出する
本発明の方法を使用して、異なるドナー細胞でＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞を成功的に構築し、配列決定の検証を実行し、総陽性率は約１０％～２０％であり、ノックアウト率は約６５％～９０％であり、より優れた調製安定性を示した（図１１、１２）。これに基づいて、ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＤ１９-ＣＡＲＴの生物学的機能をテストした。実験結果は、ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞が高い生存率を有していることを示した（図１３）。エレクトロポレーションステップ自体はある程度の細胞死を引き起こしたが、Ｔ細胞のインビトロ増殖能力は有意な影響を受けなかった（図１４）。腫瘍標的細胞との接触後も、ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は十分に増殖した（図１５、１６）。その後、細胞表面マーカーの発現、細胞サブタイプの変化、サイトカインの分泌等を検出した。全体として、レンチウイルスによって調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と同様に、ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、腫瘍細胞に対して有意な応答を生み出すことができた（図１７～１９）。しかし、いくつかの点で、両者には所定の違いがあった。最後に、ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞の殺腫瘍能力を評価した。インビボ及びインビトロの結果は、レンチウイルスで調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と同様に、腫瘍細胞に対して良好な殺傷効果を有していることを証明した（図２０、２１）。
本発明の方法を使用して、異なるドナー細胞でＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞を成功的に構築し、配列決定の検証を実行し、総陽性率は約１０％～２０％であり、ノックアウト率は約６５％～９０％であり、より優れた調製安定性を示した（図１１、１２）。これに基づいて、ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＤ１９-ＣＡＲＴの生物学的機能をテストした。実験結果は、ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞が高い生存率を有していることを示した（図１３）。エレクトロポレーションステップ自体はある程度の細胞死を引き起こしたが、Ｔ細胞のインビトロ増殖能力は有意な影響を受けなかった（図１４）。腫瘍標的細胞との接触後も、ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は十分に増殖した（図１５、１６）。その後、細胞表面マーカーの発現、細胞サブタイプの変化、サイトカインの分泌等を検出した。全体として、レンチウイルスによって調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と同様に、ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、腫瘍細胞に対して有意な応答を生み出すことができた（図１７～１９）。しかし、いくつかの点で、両者には所定の違いがあった。最後に、ＡＡＶＳ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞の殺腫瘍能力を評価した。インビボ及びインビトロの結果は、レンチウイルスで調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と同様に、腫瘍細胞に対して良好な殺傷効果を有していることを証明した（図２０、２１）。
【0138】
実施例３ 本発明の方法を使用して、非ウイルス性ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞を構築し、その機能を検出する
本発明の方法を使用して、異なるドナー細胞でＰＤ１部位特異的統合ＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞を成功的に構築し、配列決定の検証を実行し、総陽性率は約１０％～３０％であり、ノックアウト率は約８０％～９５％であり、より優れた調製安定性を示した（図２２、２３）。これに基づいて、ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞の生物学的機能をテストした。実験結果は、腫瘍標的細胞と接触した後、ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞が、レンチウイルスによって調製されたＣＡＲ-Ｔ細胞よりも強い増殖能を有していることを示した（図２４）。レンチウイルスによって調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と同様に、ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、腫瘍細胞の刺激に応答して表面マーカーの発現を活性化し、サイトカインを分泌し、その中で、ＣＤ１３７の発現レベルの増加はより明らかであり（図２５）、ＩＦＮ-γ分泌レベルの増加はより有意であった（図２６）。最後に、インビボ及びインビトロ実験により、レンチウイルスによって調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と比較して、本発明によって構築されたＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞がより強い腫瘍殺傷能力を有していることを証明した（図２７、２８）。
本発明の方法を使用して、異なるドナー細胞でＰＤ１部位特異的統合ＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞を成功的に構築し、配列決定の検証を実行し、総陽性率は約１０％～３０％であり、ノックアウト率は約８０％～９５％であり、より優れた調製安定性を示した（図２２、２３）。これに基づいて、ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞の生物学的機能をテストした。実験結果は、腫瘍標的細胞と接触した後、ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞が、レンチウイルスによって調製されたＣＡＲ-Ｔ細胞よりも強い増殖能を有していることを示した（図２４）。レンチウイルスによって調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と同様に、ＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞は、腫瘍細胞の刺激に応答して表面マーカーの発現を活性化し、サイトカインを分泌し、その中で、ＣＤ１３７の発現レベルの増加はより明らかであり（図２５）、ＩＦＮ-γ分泌レベルの増加はより有意であった（図２６）。最後に、インビボ及びインビトロ実験により、レンチウイルスによって調製されたＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞と比較して、本発明によって構築されたＰＤ１部位特異的統合のＣＤ１９-ＣＡＲＴ細胞がより強い腫瘍殺傷能力を有していることを証明した（図２７、２８）。
【0139】
要約すると、本発明の方法を使用して、サイトスクリーニングを組み合わせて、ＡＡＶＳ１、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ部位特異的統合のＣＡＲ-Ｔ細胞を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集ツールを使用して成功的に構築することができる。本発明は、先行技術と比較して、本発明の方法によって調製された部位特異的統合のＣＡＲ-Ｔ細胞がより高い陽性率を有し、有効に機能できることが証明された。従来のレンチウイルス調製法と比較して、この技術的方法は、ＣＡＲ-Ｔの調製プロセスでウイルスを使用する高コストを削減し、無作為なウイルスの挿入によって引き起こされる安全上の問題を軽減し、ＣＡＲ-Ｔ製品の均一性を向上させることができる。さらに、この方法は、ＣＡＲ-Ｔ細胞の多様な変換を実現し、ＣＡＲ-Ｔ細胞の抗腫瘍能力を高めることもできる。この実施例は、本発明によって保護されたＴ細胞における外因性配列の部位特異的統合を提供する方法の重要性及び価値を証明したが、ＡＡＶＳ１、ＰＤ１、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍの部位特異的統合のＣＡＲ-Ｔ細胞の調製に限定されず、他の部位の外因性配列の部位特異的統合及び他のＴ細胞免疫療法の開発にまで拡張することができる。
【0140】
本出願で言及されるすべての文献は、あたかもそれぞれの文献が参照により個別に組み込まれるかのように、参照により本出願に組み込まれる。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に対して様々な変更又は修正を加えることができ、これらの均等な形態も添付の特許請求の範囲によって定義される範囲内に落ちることを理解されたい。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【配列表】
【国際調査報告】