ホーム > 特許ランキング > ユニベルシテ ドゥ ロレーヌ
▶ ユニベルシテ ドゥ ロレーヌの特許一覧 ▶ センター ナショナル デ ラ レシェルシェ サイエンティフィークの特許一覧 ▶ センター ホスピタリエ リージョナル ユニベルシターレ ドゥ ナンシーの特許一覧
特表2023-541087ＦＲＺＢタンパク質の「ネトリン様」ドメインに由来するペプチドの治療可能性
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-28
(54)【発明の名称】ＦＲＺＢタンパク質の「ネトリン様」ドメインに由来するペプチドの治療可能性
(51)【国際特許分類】
C07K 7/08 20060101AFI20230921BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20230921BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230921BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20230921BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230921BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20230921BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230921BHJP
【ＦＩ】
C07K7/08
C07K14/00
A61P19/02
A61K38/10
A61K38/16
A61P19/10
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022571252
(86)(22)【出願日】2021-05-18
(85)【翻訳文提出日】2022-11-18
(86)【国際出願番号】 EP2021063109
(87)【国際公開番号】W WO2021233896
(87)【国際公開日】2021-11-25
(31)【優先権主張番号】20315243.4
(32)【優先日】2020-05-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】512079439
【氏名又は名称】ユニベルシテ ドゥ ロレーヌ
(71)【出願人】
【識別番号】504007888
【氏名又は名称】センター ナショナル デ ラ レシェルシェ サイエンティフィーク
(71)【出願人】
【識別番号】522453393
【氏名又は名称】センター ホスピタリエ リージョナル ユニベルシターレ ドゥ ナンシー
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カイロット，フレデリック
(72)【発明者】
【氏名】クローデル，マリオン
(72)【発明者】
【氏名】シャロン，クリストフ
(72)【発明者】
【氏名】ジョゾ，ジャン－イブ
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA18
4C084BA19
4C084BA20
4C084BA23
4C084NA14
4C084ZA96
4C084ZA97
4C084ZB26
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045EA20
4H045EA28
(57)【要約】
本発明は、Ｗｎｔ／β－カテニン及び／又はＨｉｐｐｏ／ＹＡＰ／ＴＡＺ経路関連疾患、特に変形性関節症の予防又は治療において有用である、ＦＲＺＢタンパク質のネトリン様ドメインに由来する新規ペプチドに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の配列を有するペプチドを含む、１６～５０アミノ酸のペプチドであって、ＤＲＸ３ＧＫＫＶＫＲＷＤＭＫＸ１４ＲＨ（配列番号１）
式中、Ｘ３及びＸ１４が、互いに独立して、任意のアミノ酸である、ペプチド。
【請求項2】
Ｘ３及びＸ１４が、互いに独立して、アラニン、ロイシン、イソロイシン、又はセリンである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項3】
配列番号２（ＤＲＬＧＫＫＶＫＲＷＤＭＫＬＲＨ）、配列番号３（ＤＲＡＧＫＫＶＫＲＷＤＭＫＡＲＨ）、配列番号９（ＤＲＩＧＫＫＶＫＲＷＤＭＫＩＲＨ）、又は配列番号１０（ＤＲＳＧＫＫＶＫＲＷＤＭＫＳＲＨ）の配列を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項4】
薬物として使用するための、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項5】
請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチドと、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項6】
変形性関節症、骨粗鬆症、がんからなる群から選択されるＷｎｔ／β－カテニン及び／又はＨｉｐｐｏ／ＹＡＰ／ＴＡＺ経路関連疾患の予防又は治療において使用するための、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記変形性関節症の予防又は治療における、請求項６に記載の使用のためのペプチド又は医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｗｎｔ／β－カテニン及び／又はＨｉｐｐｏ／ＹＡＰ／ＴＡＺ経路関連疾患、特に変形性関節症の予防又は治療において有用である、ＦＲＺＢタンパク質のネトリン様ドメインに由来する新規ペプチドに関する。
【0002】
以下の説明において、角括弧（［］）の参照は、明細書の終わりにある参照文献のリストを指す。
【背景技術】
【0003】
滑膜関節は、骨を接続し、動きを支持すると同時に、異なる骨格要素間の運動範囲を制限する特殊な構造である。これらの特殊な器官様構造において、骨の支持部は、硝子質の薄層又は関節軟骨で頂部を覆われている。間にある関節腔は、滑膜によって内側を覆われている。これらの異なる組織は、一緒になって、関節面間の非常に低摩擦かつ十分に潤滑な、滑らかな動きを可能にしている。関節のホメオスタシス、特に関節軟骨及び軟骨下骨のホメオスタシスは、関節機能の維持に不可欠であり、同化シグナル伝達経路と異化シグナル伝達経路との間のバランスに決定的に依存する（Ｌｏｒｉｅｓ ａｎｄ Ｌｕｙｔｅｎ，２０１１）［１］。ホメオスタシスは、全タンパク質又は切断されたタンパク質のいずれかの形態で、可溶性因子及び細胞外マトリックス（extracellular matrix、ＥＣＭ）によって制御される、関節軟骨を特徴付ける安定した軟骨細胞表現型の維持を必要とする。ＯＡの過程における主要な表現型の変化を、図１に示す。
【0004】
ホメオスタシスの喪失は、軟骨の質の段階的な劣化及び軟骨下骨の肥厚化、並びに低度～中程度の滑膜炎症をもたらし、変形性関節症（osteoarthritis、ＯＡ）につながる。ＯＡ疾患は、慢性自己免疫機構の非存在下での関節痛及び機能の喪失を特徴とする障害の群である。ＯＡの有病率は年齢とともに増加し、世界中で数百万人の人々が影響を受けている大きな社会経済的課題を表す（Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｆｅｌｓｏｎ，２００６）［２］。人口の高齢化及び肥満などのリスク因子のうちのいくつかにおける流行の増加は、ＯＡ関連の問題及び障害が社会への影響を増加させるばかりであることを示唆している。今日の薬物療法の選択肢は依然として非常に限定されており、鎮痛剤及び非ステロイド性抗炎症薬が挙げられる。進行したＯＡにおいては、多くの場合、関節プロテーゼ手術が必要とされる（Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｆｅｌｓｏｎ，２００６）［２］。
【0005】
疫学データ及び臨床データは、ＯＡが、遺伝的及び後天的又は環境的要因の両方が寄与する複雑な病因を有する疾患であるという見解を支持する（Ｖａｌｄｅｓ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｏｒ，２００８）［３］。これらの要因は相互作用し、疾患の発症、進行、及び結果を決定する。ＯＡに関連する遺伝的要因の特定はまた、骨格発達又は成体関節組織におけるホメオスタシスの維持に重要な経路に関する重要な情報を伝達し、関節ホメオスタシスを維持するための治療標的を特定する。感受性遺伝子における多形は、顕性骨格異常を引き起こすことなくＯＡに関連している。これらの関連には、当初ＦＲＺＢと名付けられた天然Ｗｎｔモジュレーターである、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（secreted
frizzled-related protein、ＳＦＲＰ）３などの骨格発達におけるそれらの役割から既
知である遺伝子における多型が含まれる。ＦＲＺＢは、Ｗｎｔリガンドとの相互作用に関与するシステインリッチドメイン（ＣＲＤＦＲＺＢ）及び、ネトリン様ドメイン（ＮＴＮＦＲＺＢ）の、２つの顕著なドメインを含む。Ｐｒ．Ｌｏｒｉｅｓの実験室の研究は、異なるマウスモデルにおいてＦＲＺＢの欠損がＯＡにつながることを実証している（Ｌｏｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７）［４］。次いで、この実験室において、ＦＲＺＢを欠
損したマウスが、それらのトランスクリプトームの有意な修飾を受けて、古典的Ｗｎｔ経路の活性を増加させたことが示された（Ｌｏｄｅｗｙｃｋｘ ｅｔ ａｌ．，２０１２）［５］。更に、Ｄｉｃｋｏｐｆ関連タンパク質－１（Ｄｋｋ１、Ｗｎｔ拮抗剤）の濃度の増加は、関節腔狭小化（ヒトＯＡにおける関節軟骨損失のマーカーとして認められた放射線的兆候である）のリスクの低減と関連付けられている（Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）［６］。
frizzled-related protein、ＳＦＲＰ）３などの骨格発達におけるそれらの役割から既
知である遺伝子における多型が含まれる。ＦＲＺＢは、Ｗｎｔリガンドとの相互作用に関与するシステインリッチドメイン（ＣＲＤＦＲＺＢ）及び、ネトリン様ドメイン（ＮＴＮＦＲＺＢ）の、２つの顕著なドメインを含む。Ｐｒ．Ｌｏｒｉｅｓの実験室の研究は、異なるマウスモデルにおいてＦＲＺＢの欠損がＯＡにつながることを実証している（Ｌｏｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７）［４］。次いで、この実験室において、ＦＲＺＢを欠
損したマウスが、それらのトランスクリプトームの有意な修飾を受けて、古典的Ｗｎｔ経路の活性を増加させたことが示された（Ｌｏｄｅｗｙｃｋｘ ｅｔ ａｌ．，２０１２）［５］。更に、Ｄｉｃｋｏｐｆ関連タンパク質－１（Ｄｋｋ１、Ｗｎｔ拮抗剤）の濃度の増加は、関節腔狭小化（ヒトＯＡにおける関節軟骨損失のマーカーとして認められた放射線的兆候である）のリスクの低減と関連付けられている（Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）［６］。
【0006】
更に、β－カテニン活性化に関与する古典的Ｗｎｔ経路は、軟骨ホメオスタシスの制御に寄与する。一方で、一部の研究は、β－カテニンが関節軟骨の完全性を維持し得ることを実証した。例えば、ごく近年の研究は、β－カテニンの活性化が成熟関節軟骨におけるヘッジホッグ誘導性軟骨劣化を防止することを実証した（Ｒｏｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１６）［７］。更に、Ｄｉ Ｃｈｅｎのグループは、特に関節軟骨においてβ－カテニン及びＴ細胞因子（Ｗｎｔ古典的経路を調節する転写因子）の阻害剤を発現するトランスジェニックマウス（Ｃｏｌ２ａ１プロモーターの制御下）が、対照と比較して有意な軟骨破壊を発症することを示した（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）［８］。一方、いくつかの研究は、その過剰が軟骨劣化をもたらすβ－カテニン活性化の有害な影響に光を当てている（Ｔａｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００５）［９］。更に、Ｄｉ Ｃｈｅｎのグループはまた、成人マウス由来の関節軟骨細胞におけるβ－カテニンの構成的活性化（Ｃｏｌ２ａ１プロモーターの制御下での構成的に活性なβ－カテニンのノックイン）が、高ＭＭＰ－１３、Ｘ型コラーゲン、及びオステオカルシン発現を含むＯＡ様特徴をもたらすことを示した（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）［１０］。
【0007】
別のシグナル伝達経路であるＨｉｐｐｏ／ＹＡＰ／ＴＡＺ経路もまた、ＯＡの病態生理学に関連している（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９）［１１］。この研究において、ｓｉＲＮＡを使用してＹＡＰ経路を遮断すること（ＹＡＰを標的とすること）が、その病理のマウスモデルにおけるインビボでのＯＡの進行を軽減させた。ごく近年、ＹＡＰ阻害剤であるベルテポルフィンの使用が、ＯＡのマウスモデルにおける軟骨ホメオスタシスの維持を可能にした（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２０）［１２］。
【0008】
カルモジュリン－キナーゼＩＩ（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－Ｋｉｎａｓｅ ＩＩ、ＣａｍｋＩＩ）の活性化は成長板軟骨細胞の肥大化を誘発することが示されたが（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１）［１３］、この効果は、β－カテニンの同時活性化を必要とした。更に、ＣａｍｋＩＩ活性化の選択的拮抗作用がマウスモデルにおけるＯＡの発症及び進行を悪化させることが、２０１６年の変形性関節症についての世界会議で示された（Ｎａｌｅｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）［１４］。最後に、近年、ネトリン様ドメイン（ＮＴＮＦＲＺＢ）のみを含むＦＲＺＢの短縮型が、古典的Ｗｎｔ経路を阻害しながら、（ＣａｍＫＩＩの活性化を通じて）非古典的Ｗｎｔ経路を強力に活性化できることが実証された。これは、骨形成において（Ｔｈｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）［１５］及び軟骨形成モデルにおいて（Ｔｈｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）［１６］示され、その両方がＷｎｔシグナルによって厳密に制御されており、その場合、初期軟骨形成プロセスの増加をもたらす（ＩＩ型コラーゲン及びアグリカンが増加する）。
【0009】
非常に興味深いことに、Ｗｎｔ／β－カテニン（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）［１７］及びＨｉｐｐｏ／ＹＡＰ／ＴＡＺ（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９）［１８］の両方の経路は、がんの発症及び／又は発生に対する重要な要因として広範に記載されている。したがって、そのような経路の阻害剤は、がん治療の分野において潜在的に興味深い手がかりを表し得る。
【0010】
変形性関節症に関与するシグナル伝達経路の調節において有効であることが既に示されている全タンパク質ＦＲＺＢ（並びにそのネトリン様ドメインのみを含む短縮型）のサイ
ズは、３４ｋＤａである。サイズが大きいことから、このタンパク質又はその短縮型は、インビボ実験において免疫原性であり得る。これが、免疫系反応のリスクを低減するために、全タンパク質と同じ又は同様の特性（生物学的活性）を有するタンパク質ＦＲＺＢからペプチドを導出することが興味深い場合がある理由である。
ズは、３４ｋＤａである。サイズが大きいことから、このタンパク質又はその短縮型は、インビボ実験において免疫原性であり得る。これが、免疫系反応のリスクを低減するために、全タンパク質と同じ又は同様の特性（生物学的活性）を有するタンパク質ＦＲＺＢからペプチドを導出することが興味深い場合がある理由である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明者らは、変形性関節症において過剰発現されるＷｎｔ／β－カテニン典型的経路の発現を減少させ、変形性関節症の病態生理学に関与するＨｉｐｐｏ／ＹＡＰ／ＴＡＺ経路の発現を減少させ、かつ関節の保護的役割を有する非古典的ＣａｍＫＩＩ経路の発現を増加させる能力を有する、ＦＲＺＢタンパク質のネトリン様ドメインに由来する新規ペプチドを予想外に特定している。
【0012】
ペプチドは元来、ＦＲＺＢタンパク質のネトリン様ドメインの配列において、アルファ螺旋構造化を示す要素が存在し得、当該ドメインの他のタンパク質パートナーとの相互作用を可能にするという考えで設計されている。したがって、ネトリン様ドメインに由来し、かつこの基準に対応する、２つのペプチド配列ＰＥＰ１２（ＡＴＱＫＴＹＦＲＮＮＹＮ、配列番号４）及びＰＥＰ１６（ＤＲＬＧＫＫＶＫＲＷＤＭＫＬＲＨ、配列番号２）が試験されている。しかしながら、ＰＥＰ１２は、ＰＥＰ１６のものと同様の二次アルファ螺旋立体配座を有するようにコンピュータ予測によって選択されたものの、ＰＥＰ１６とは異なり、以下に記載の試験されたシステムにおいて完全に無効であることが判明した。その時点では、ＦＲＺＢタンパク質のネトリン様ドメインから活性ペプチドを導出することは、予想したほど明白ではないように思われた。
【0013】
ＰＥＰ１６は、ペプチドであって、その配列がアルファ螺旋を形成する傾向を有すると予測されており、かつ古典的（Ｗｎｔ／β－カテニン）及び非古典的（ＣａｍＫＩＩ）Ｗｎｔ経路の調節において役割を有する（すなわち、変形性関節症において過剰発現される古典的経路の活性化を低下させ、関節の保護的役割を有する非古典的経路の活性化を増加させる）、ペプチドである。加えて、ＰＥＰ１６は、変形性関節症の生理病理学に特に関与する、Ｈｉｐｐｏ／ＹＡＰ／ＴＡＺ経路の活性化を低減することができる。変形性関節症軟骨を特異的に標的化するために、ＰＥＰ１６は、コラーゲン２ａ１（ｃｏｌ２ａ１）への結合に特異的なアドレス指定配列でベクトル化され得る。
【0014】
アルファ螺旋立体配座がＰＥＰ１６の活性に不可欠であったことを考慮して、本発明者らは、次いで、このアルファ螺旋立体配座を促進するために、ＰＥＰ１６ペプチドから変異配列を導出した。本発明者らはまた、ＰＥＰ１６の活性に強く関連付けられ得るトリプトファン残基のない変異体配列（結合）を、試験した５つの配列の中に含めている。次いで、この変異体配列は、この配列の立体障害がトリプトファン残基を介したより選択的な結合を構成することができるため、活性の陰性対照を構成し得る。これらの変異体配列において、疎水性アミノ酸のアラニンへの変異は、予測される螺旋形状を尊重することを可能としたが、アラニンはこの構造的特性を有することから螺旋の巻きを好み、ひいては潜在的に螺旋の剛性を高める。更に、リジンのアルギニンへの変換は、ペプチドの電荷の概念及びその包括的な電荷全体を、その一次配列を変更しながら保存することを可能とし、電荷のみに起因し得る可能性のある効果を解明する。５つの変異体配列は、以下のとおりである（ＰＥＰ１６からのバリエーションは太字）。
【表1】
【0015】
そのうちの１つ（ＰＥＰ１６ビス：ＤＲＡＧＫＫＶＫＲＷＤＭＫＡＲＨ、配列番号３）は、ＳｕｐｅｒＴＯＰｆｌａｓｈ古典的Ｗｎｔ経路のレポーター系における初期配列ＰＥＰ１６と非常に類似した特性（生物学的活性）を有したことから、特に興味深いものであった。
【0016】
他の変異は、本発明の一部であり、３位及び１４位のロイシン残基は、イソロイシン（Ｉ）又はセリン（Ｓ）残基（ＰＥＰ１６からのバリエーションは太字）に変更された。
【表2】
【0017】
したがって、本発明の目的は、以下の配列を有するペプチドを含む、１６～５０アミノ酸のペプチドに関し、
ＤＲＸ３ＧＫＫＶＫＲＷＤＭＫＸ１４ＲＨ（配列番号１）
式中、Ｘ３及びＸ１４は、互いに独立して、任意のアミノ酸である。
ＤＲＸ３ＧＫＫＶＫＲＷＤＭＫＸ１４ＲＨ（配列番号１）
式中、Ｘ３及びＸ１４は、互いに独立して、任意のアミノ酸である。
【0018】
本発明のペプチドの特定の実施形態によれば、Ｘ３及びＸ１４は、互いに独立して、アラニン、ロイシン、イソロイシン、又はセリンである。例えば、本発明のペプチドは、配列番号２（ＤＲＬＧＫＫＶＫＲＷＤＭＫＬＲＨ）、配列番号３（ＤＲＡＧＫＫＶＫＲＷＤＭＫＡＲＨ）、ＤＲＩＧＫＫＶＫＲＷＤＭＫＩＲＨ（配列番号９）、若しくはＤＲＳＧＫＫＶＫＲＷＤＭＫＳＲＨ（配列番号１０）の配列を含むか、又はそれからなる。
【0019】
本発明の別の目的は、薬物として使用するための本発明のペプチドに関する。
【0020】
本発明の別の目的は、本発明のペプチドと、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物に関する。
【0021】
本発明の別の目的は、変形性関節症、骨粗鬆症、及びがんからなる群から選択されるＷｎｔ／β－カテニン及び／又はＨｉｐｐｏ／ＹＡＰ／ＴＡＺ経路関連疾患の予防又は治療において使用するための、本発明のペプチド又は医薬組成物に関する。好ましくは、変形性関節症の予防又は治療において使用するための、本発明のペプチド又は医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】ＯＡの過程における関節軟骨細胞の表現型の変化を表す。表現型バイオマーカーを細胞の周りに示し、表現型の主なモジュレーターを細胞内に示す。＋：刺激効果、－：抑制効果。
【図2-1】非処理対照（ＣＴＬ）と比較して、３０、１００、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６（それぞれ、Ｐ３０、Ｐ１００、及びＰ３００）で処理したＡＴＤＣ５マイクロマスにおける、１、７、１４、２１、及び２８日目の（Ａ）アグリカン、（Ｂ）ｃｏｌ２ａ１、（Ｃ）ｃｔｇｆ、（Ｄ）ｍｍｐ３、及び（Ｅ）ｍｍｐ１３の相対発現レベルを表す。結果を、ハウスキーピング遺伝子ｐｐｉａで正規化した。＊Ｐ＜０．０５。結果は、３つの実験を表す。
【図2-2】非処理対照（ＣＴＬ）と比較して、３０、１００、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６（それぞれ、Ｐ３０、Ｐ１００、及びＰ３００）で処理したＡＴＤＣ５マイクロマスにおける、１、７、１４、２１、及び２８日目の（Ａ）アグリカン、（Ｂ）ｃｏｌ２ａ１、（Ｃ）ｃｔｇｆ、（Ｄ）ｍｍｐ３、及び（Ｅ）ｍｍｐ１３の相対発現レベルを表す。結果を、ハウスキーピング遺伝子ｐｐｉａで正規化した。＊Ｐ＜０．０５。結果は、３つの実験を表す。
【図2-3】非処理対照（ＣＴＬ）と比較して、３０、１００、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６（それぞれ、Ｐ３０、Ｐ１００、及びＰ３００）で処理したＡＴＤＣ５マイクロマスにおける、１、７、１４、２１、及び２８日目の（Ａ）アグリカン、（Ｂ）ｃｏｌ２ａ１、（Ｃ）ｃｔｇｆ、（Ｄ）ｍｍｐ３、及び（Ｅ）ｍｍｐ１３の相対発現レベルを表す。結果を、ハウスキーピング遺伝子ｐｐｉａで正規化した。＊Ｐ＜０．０５。結果は、３つの実験を表す。
【図3-1】非処理対照（ＣＴＬ）と比較して、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６及びＰＥＰ１６ビスで処理したＡＴＤＣ５マイクロマスにおける、１、２１、及び２８日目の（Ａ）アグリカン、（Ｂ）ｃｏｌ２ａ１、（Ｃ）ｍｍｐ３、（Ｄ）ｍｍｐ１３、及び（Ｅ）ａｎｋｒｄの相対発現レベルを表す。結果を、ハウスキーピング遺伝子ｐｐｉａで正規化した。＊Ｐ＜０．０５。結果は、２つの実験（（Ｅ）においては３つの実験）を表す。
【図3-2】非処理対照（ＣＴＬ）と比較して、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６及びＰＥＰ１６ビスで処理したＡＴＤＣ５マイクロマスにおける、１、２１、及び２８日目の（Ａ）アグリカン、（Ｂ）ｃｏｌ２ａ１、（Ｃ）ｍｍｐ３、（Ｄ）ｍｍｐ１３、及び（Ｅ）ａｎｋｒｄの相対発現レベルを表す。結果を、ハウスキーピング遺伝子ｐｐｉａで正規化した。＊Ｐ＜０．０５。結果は、２つの実験（（Ｅ）においては３つの実験）を表す。
【図3-3】非処理対照（ＣＴＬ）と比較して、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６及びＰＥＰ１６ビスで処理したＡＴＤＣ５マイクロマスにおける、１、２１、及び２８日目の（Ａ）アグリカン、（Ｂ）ｃｏｌ２ａ１、（Ｃ）ｍｍｐ３、（Ｄ）ｍｍｐ１３、及び（Ｅ）ａｎｋｒｄの相対発現レベルを表す。結果を、ハウスキーピング遺伝子ｐｐｉａで正規化した。＊Ｐ＜０．０５。結果は、２つの実験（（Ｅ）においては３つの実験）を表す。
【図4】非処理対照（ＣＴＬ）と比較して、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６及びＰＥＰ１６ビスで処理したＡＴＤＣ５マイクロマスにおけるグリコサミノグリカンの定量化を表す。アルシアンブルー染色は、２８日目に実施されている。結果を、生化学的定量化後の吸光度（６５０ｎｍ）で表す。＊Ｐ＜０．０５。結果は、２つの実験を表す。
【図5-1】（Ａ）３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６若しくはＰＥＰ１６ビス、及び同時に１００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａでの２４時間のトランスフェクションの翌日に処理したＡＴＤＣ５マクロマスにおける７Ｘ ＴＣＦ／ＬＥＦ応答要素（Ｓｕｐｅｒ ８ｘ ＴＯＰＦｌａｓｈレポーター）、（Ｂ）８Ｘ ＹＡＰ応答要素（８ｘ ＧＴＩＩＣレポーター）、又は（Ｃ）３、３０、１００、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６（それぞれ、Ｐ３、Ｐ３０、Ｐ１００、及びＰ３００）、及び同時に１００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａでの２４時間のトランスフェクションの翌日に処理したＡＴＤＣ５マクロマスにおける７Ｘ ＴＣＦ／ＬＥＦ応答要素（Ｓｕｐｅｒ ８ｘ ＴＯＰＦｌａｓｈレポーター）の制御下での、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む構築物を使用して評価された、目的のプロモーターの転写活性を表す。データを、チロシンキナーゼプロモーターの制御下でのウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase under the control of tyrosine kinase promoter、ＴＫ－ＲＬ）を使用して正規化した。結果を、ホタル／ウミシイタケルシフェラーゼ活性の比として表す。ＮＳＣ６６８０３６（ＮＳＣ、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の広範な阻害剤）を、Ｗｎｔ３ａ拮抗作用の陽性対照として使用した。＊Ｐ＜０．０５。結果は、２つの実験を表す。
【図5-2】（Ａ）３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６若しくはＰＥＰ１６ビス、及び同時に１００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａでの２４時間のトランスフェクションの翌日に処理したＡＴＤＣ５マクロマスにおける７Ｘ ＴＣＦ／ＬＥＦ応答要素（Ｓｕｐｅｒ ８ｘ ＴＯＰＦｌａｓｈレポーター）、（Ｂ）８Ｘ ＹＡＰ応答要素（８ｘ ＧＴＩＩＣレポーター）、又は（Ｃ）３、３０、１００、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６（それぞれ、Ｐ３、Ｐ３０、Ｐ１００、及びＰ３００）、及び同時に１００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａでの２４時間のトランスフェクションの翌日に処理したＡＴＤＣ５マクロマスにおける７Ｘ ＴＣＦ／ＬＥＦ応答要素（Ｓｕｐｅｒ ８ｘ ＴＯＰＦｌａｓｈレポーター）の制御下での、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む構築物を使用して評価された、目的のプロモーターの転写活性を表す。データを、チロシンキナーゼプロモーターの制御下でのウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase under the control of tyrosine kinase promoter、ＴＫ－ＲＬ）を使用して正規化した。結果を、ホタル／ウミシイタケルシフェラーゼ活性の比として表す。ＮＳＣ６６８０３６（ＮＳＣ、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の広範な阻害剤）を、Ｗｎｔ３ａ拮抗作用の陽性対照として使用した。＊Ｐ＜０．０５。結果は、２つの実験を表す。
【図6】非処理対照（ＣＴＬ）と比較して、３０、１００、及び３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６（それぞれ、Ｐ３０、Ｐ１００、及びＰ３００）で処理し、２８日間培養されたＡＴＤＣ５マイクロマスにおける、（Ａ）コンピュータプログラム（青色ピクセル定量化）での、（Ｂ）生化学的定量化（グアニジンＨＣｌ ６Ｍ中の染色の可溶化）での、グリコサミノグリカン定量化を表す。アルシアンブルー染色は、２８日目に実施された。＊Ｐ＜０．０５。結果は、３つの実験を表す。
【図7-1】非処理対照（ＣＴ又はＣＴＬ）と比較して、１００及び３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６での処理後１、７、１４、及び２１日目のＡＴＤＣ５マクロマスにおける、（Ａ）Ｗｎｔ／β－カテニン経路活性化（Ｂ）ＣａｍｋＩＩ経路活性化を調査するウェスタンブロットを表す。結果を、総タンパク質形態に対する活性タンパク質形態で表す。結果は、３つの実験を表す。
【図7-2】非処理対照（ＣＴ又はＣＴＬ）と比較して、１００及び３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６での処理後１、７、１４、及び２１日目のＡＴＤＣ５マクロマスにおける、（Ａ）Ｗｎｔ／β－カテニン経路活性化（Ｂ）ＣａｍｋＩＩ経路活性化を調査するウェスタンブロットを表す。結果を、総タンパク質形態に対する活性タンパク質形態で表す。結果は、３つの実験を表す。
【図8-1】非処理対照（ＣＴ又はＣＴＬ）と比較して、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６又はＰＥＰ１６ビスでの処理後２１及び２８日目のＡＴＤＣ５マクロマスにおける、（Ａ）Ｗｎｔ／β－カテニン経路活性化（Ｂ）ＣａｍＫＩＩ経路活性化を調査するウェスタンブロットを表す。結果を、総タンパク質形態に対する活性タンパク質形態（すなわち、（Ｂ）についてはＰ－ＣａｍＫＩＩ）で表す。結果は、３つの実験を表す。
【図8-2】非処理対照（ＣＴ又はＣＴＬ）と比較して、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６又はＰＥＰ１６ビスでの処理後２１及び２８日目のＡＴＤＣ５マクロマスにおける、（Ａ）Ｗｎｔ／β－カテニン経路活性化（Ｂ）ＣａｍＫＩＩ経路活性化を調査するウェスタンブロットを表す。結果を、総タンパク質形態に対する活性タンパク質形態（すなわち、（Ｂ）についてはＰ－ＣａｍＫＩＩ）で表す。結果は、３つの実験を表す。
【図9】非処理対照（ＣＴＬ）と比較して、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６及び／又は１００ｐｇ／ｍＬのＩＬ１βで２４時間処理したマウス関節軟骨細胞の培養上清における、ＭＭＰ１３酵素活性を表す。ＩＬ１βを、ＭＭＰ１３活性の陽性対照として使用した。＊Ｐ＜０．０５。
【図10】非処理対照（ＣＴＬ）と比較して、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６及び／又は１００ｎｇ／ｍＬのｗｎｔ３ａで処理したマウス関節軟骨細胞における、２４及び４８時間での（Ａ）アグリカン、（Ｂ）ｃｏｌ２ａ１の相対発現レベルを表す。結果を、ハウスキーピング遺伝子ｐｐｉａで正規化した。結果は、３つの実験を表す。
【図11-1】非処理対照（ＣＴＬ）と比較して、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６若しくはＰＥＰ１６ビス、及び／又は１００、５０、３０ｎｇ／ｍＬのｗｎｔ３ａで処理したマウス関節軟骨細胞における、（Ａ、Ｂ）ｍｍｐ３及び（Ｃ）ａｎｋｒｄの相対発現レベルを表す。結果を、ハウスキーピング遺伝子ｐｐｉａで正規化した。＊Ｐ＜０．０５。Ｍｍｐ３発現を刺激の２４時間後にモニタリングし、一方、ａｎｋｒｄ発現を刺激の１２時間後にモニタリングした。結果は、３つの実験を表す。
【図11-2】非処理対照（ＣＴＬ）と比較して、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６若しくはＰＥＰ１６ビス、及び／又は１００、５０、３０ｎｇ／ｍＬのｗｎｔ３ａで処理したマウス関節軟骨細胞における、（Ａ、Ｂ）ｍｍｐ３及び（Ｃ）ａｎｋｒｄの相対発現レベルを表す。結果を、ハウスキーピング遺伝子ｐｐｉａで正規化した。＊Ｐ＜０．０５。Ｍｍｐ３発現を刺激の２４時間後にモニタリングし、一方、ａｎｋｒｄ発現を刺激の１２時間後にモニタリングした。結果は、３つの実験を表す。
【図12】非処理対照（ＣＴＬ）と比較して、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６で７日間処理（７日間で３回刺激）したヒト関節軟骨外植片（人工膝関節全置換手術後の末期変形性関節症の３人の患者由来）の培養上清における、ＭＭＰ１３酵素活性を表す。＊Ｐ＜０．０５。（Ｎ＝３人の患者）
【図13-1】骨形成分化に対するＰＥＰ１６の影響を表す。ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を、異なる濃度のＰＥＰ１６で２１日間刺激し、非処理対照と比較した。結果を、ハウスキーピング遺伝子Ｓ２９で正規化した。＊Ｐ＜０．０５。（Ａ）オステオカルシン及びオステリックスの相対発現レベルを研究し、同様に（Ｂ）Ｗｎｔ／β－カテニン経路及びＣａｍＫＩＩ経路活性化を調査するウェスタンブロット、並びに（Ｃ）２１日間の分化培養後の石灰化レベルを研究した。結果は、３つの実験を表す。
【図13-2】骨形成分化に対するＰＥＰ１６の影響を表す。ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を、異なる濃度のＰＥＰ１６で２１日間刺激し、非処理対照と比較した。結果を、ハウスキーピング遺伝子Ｓ２９で正規化した。＊Ｐ＜０．０５。（Ａ）オステオカルシン及びオステリックスの相対発現レベルを研究し、同様に（Ｂ）Ｗｎｔ／β－カテニン経路及びＣａｍＫＩＩ経路活性化を調査するウェスタンブロット、並びに（Ｃ）２１日間の分化培養後の石灰化レベルを研究した。結果は、３つの実験を表す。
【図13-3】骨形成分化に対するＰＥＰ１６の影響を表す。ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を、異なる濃度のＰＥＰ１６で２１日間刺激し、非処理対照と比較した。結果を、ハウスキーピング遺伝子Ｓ２９で正規化した。＊Ｐ＜０．０５。（Ａ）オステオカルシン及びオステリックスの相対発現レベルを研究し、同様に（Ｂ）Ｗｎｔ／β－カテニン経路及びＣａｍＫＩＩ経路活性化を調査するウェスタンブロット、並びに（Ｃ）２１日間の分化培養後の石灰化レベルを研究した。結果は、３つの実験を表す。
【図13-4】骨形成分化に対するＰＥＰ１６の影響を表す。ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を、異なる濃度のＰＥＰ１６で２１日間刺激し、非処理対照と比較した。結果を、ハウスキーピング遺伝子Ｓ２９で正規化した。＊Ｐ＜０．０５。（Ａ）オステオカルシン及びオステリックスの相対発現レベルを研究し、同様に（Ｂ）Ｗｎｔ／β－カテニン経路及びＣａｍＫＩＩ経路活性化を調査するウェスタンブロット、並びに（Ｃ）２１日間の分化培養後の石灰化レベルを研究した。結果は、３つの実験を表す。
【図14-1】実施例３：ａ）ＣＴＬ、３００ｎｇ／ｍｌのＰＥＰ１２、及び１０００ｎｇ／ｍｌのＰＥＰ１２についての、細胞外マトリックス石灰化の生化学的定量化（吸光度：４０５ｎｍ）、並びにｂ）１日目（Ｄ１）及び２１日目（Ｄ２１）の、３００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌの濃度の、又はいかなるペプチド刺激も含まない（ＣＴＬ）、ＰＥＰ１６及びＰＥＰ１２についての特定のアルカリホスファターゼ活性（μｍｏｌのパラ－ニトロフェノール／分／ｍｇのタンパク質）の結果を表す。
【図14-2】実施例３：ａ）ＣＴＬ、３００ｎｇ／ｍｌのＰＥＰ１２、及び１０００ｎｇ／ｍｌのＰＥＰ１２についての、細胞外マトリックス石灰化の生化学的定量化（吸光度：４０５ｎｍ）、並びにｂ）１日目（Ｄ１）及び２１日目（Ｄ２１）の、３００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌの濃度の、又はいかなるペプチド刺激も含まない（ＣＴＬ）、ＰＥＰ１６及びＰＥＰ１２についての特定のアルカリホスファターゼ活性（μｍｏｌのパラ－ニトロフェノール／分／ｍｇのタンパク質）の結果を表す。
【図15-1】３００ｎｇ／ｍｌの濃度のペプチドＰＥＰ１６、ＰＥＰ Ｉ、又はＰＥＰ ｓでの、又はいかなるペプチド刺激も含まない（ＣＴＬ）、実施例４に説明するように培養したＡＴＤＣ５細胞における、ＩＩ型コラーゲン並びにアグリカン、ＣＴＧＦ、及びＭＭＰ３についてのＤ１及びＤ１４に実施したｑＰＣＲ分析（ＰＰＩＡハウスキーピング遺伝子に対して正規化）を表す。＊は、Ｄ１４対照（ＣＴＬ）と比較してｐ値＜０．０５を示し、￡は、Ｄ１ ＣＴＬ（ＡＮＯＶＡ）と比較してｐ値＜０．０５を示す。
【図15-2】３００ｎｇ／ｍｌの濃度のペプチドＰＥＰ１６、ＰＥＰ Ｉ、又はＰＥＰ ｓでの、又はいかなるペプチド刺激も含まない（ＣＴＬ）、実施例４に説明するように培養したＡＴＤＣ５細胞における、ＩＩ型コラーゲン並びにアグリカン、ＣＴＧＦ、及びＭＭＰ３についてのＤ１及びＤ１４に実施したｑＰＣＲ分析（ＰＰＩＡハウスキーピング遺伝子に対して正規化）を表す。＊は、Ｄ１４対照（ＣＴＬ）と比較してｐ値＜０．０５を示し、￡は、Ｄ１ ＣＴＬ（ＡＮＯＶＡ）と比較してｐ値＜０．０５を示す。
【図15-3】３００ｎｇ／ｍｌの濃度のペプチドＰＥＰ１６、ＰＥＰ Ｉ、又はＰＥＰ ｓでの、又はいかなるペプチド刺激も含まない（ＣＴＬ）、実施例４に説明するように培養したＡＴＤＣ５細胞における、ＩＩ型コラーゲン並びにアグリカン、ＣＴＧＦ、及びＭＭＰ３についてのＤ１及びＤ１４に実施したｑＰＣＲ分析（ＰＰＩＡハウスキーピング遺伝子に対して正規化）を表す。＊は、Ｄ１４対照（ＣＴＬ）と比較してｐ値＜０．０５を示し、￡は、Ｄ１ ＣＴＬ（ＡＮＯＶＡ）と比較してｐ値＜０．０５を示す。
【図16】実施例４に説明するような、ＰＥＰ１６、ＰＥＰ Ｉ、及びＰＥＰ ｓについての生化学的アルシアンブルー定量化（グアニジンＨＣｌ ６Ｍ溶解後の６５０ｎｍでの吸光度読み取り）を表す。＊は、Ｄ１４対照（ＣＴＬ）と比較してｐ値＜０．０５を示す。
【図17-1】３００ｎｇ／ｍｌの濃度のＰＥＰ１６若しくはＰＥＰ５０、又は１０００ｎｇ／ｍｌ（ＰＥＰ５０モル条件）での、又はいかなるペプチド刺激も含まない（ＣＴＬ）、実施例５に説明するように培養したＡＴＤＣ５細胞における、ＩＩ型コラーゲン並びにアグリカン、ＣＴＧＦ、及びＭＭＰ３についてのＤ１及びＤ１４に実施したｑＰＣＲ分析（ＰＰＩＡハウスキーピング遺伝子に対して正規化）を表す。＊は、Ｄ１４対照（ＣＴＬ）と比較してｐ値＜０．０５を示し、￡は、Ｄ１ ＣＴＬ（ＡＮＯＶＡ）と比較してｐ値＜０．０５を示す。
【図17-2】３００ｎｇ／ｍｌの濃度のＰＥＰ１６若しくはＰＥＰ５０、又は１０００ｎｇ／ｍｌ（ＰＥＰ５０モル条件）での、又はいかなるペプチド刺激も含まない（ＣＴＬ）、実施例５に説明するように培養したＡＴＤＣ５細胞における、ＩＩ型コラーゲン並びにアグリカン、ＣＴＧＦ、及びＭＭＰ３についてのＤ１及びＤ１４に実施したｑＰＣＲ分析（ＰＰＩＡハウスキーピング遺伝子に対して正規化）を表す。＊は、Ｄ１４対照（ＣＴＬ）と比較してｐ値＜０．０５を示し、￡は、Ｄ１ ＣＴＬ（ＡＮＯＶＡ）と比較してｐ値＜０．０５を示す。
【図18】ＰＥＰ１６、ＰＥＰ５０、又はＰＥＰ５０モル濃度条件についての生化学的アルシアンブルー定量化（グアニジンＨＣｌ ６Ｍ溶解後の６５０ｎｍでの吸光度読み取り）を表す。＊は、Ｄ１４対照（ＣＴＬ）と比較してｐ値＜０．０５を示す。
【図19】実施例６に説明するような、ＦＲＺＢ暫定生成のウェスタンブロットメンブレン及びＳＤＳ ＰＡＧＥを表す。
【図20】実施例６に説明するような、ＮＴＮ暫定生成のウェスタンブロットメンブレン及びＳＤＳ ＰＡＧＥを表す。
【図21】３００ｎｇ／ｍｌの濃度のＰＥＰ１６で処理したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞又はＮＴＮ ドメインを安定的に過剰発現するＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞における、ＡＮＫＲＤ（ＹＡＰ／ＴＡＺ標的遺伝子、経路活性の指標）についてＤ１及びＤ１４に実施したｑＰＣＲ分析を表す。処理した細胞及びＮＴＮ過剰発現細胞を、対照細胞（ＣＴＬ）と比較した。＊は、Ｄ１４対照（ＣＴＬ）と比較してｐ値＜０．０５を示し、￡は、Ｄ１ ＣＴＬ（ＡＮＯＶＡ）と比較してｐ値＜０．０５を示す。
【実施例】
【0023】
実施例１：材料及び方法
ＡＴＤＣ５マイクロマス培養
マウス軟骨形成ＡＴＤＣ５細胞（軟骨特異的軟骨形成株）を、１％抗生物質（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ、ＡＢ、ペニシリン－ストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ）、５％ウシ胎仔血清（fetal bovine serum、ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）を補充し、１０μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）及び３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）で富化した１：１のダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s modified Eagle’s medium、ＤＭＥＭ）：Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２ミックス（Ｇｉｂｃｏ）を含有する維持培地中で、コンフルエントになるまで培養した。細胞をトリプシン処理し、洗浄し、１倍ＩＴＳプレミックス（結果的に１０μｇ／ｍＬのインスリン、１０μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、及び３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウムとなる）（Life technologies）で富化した維持培地
からなる軟骨形成培地中で、２．１０７細胞／ｍＬで再懸濁した。１滴の細胞懸濁液（１０μＬ）を、２４ウェルプレートの各ウェルの中心に配置した。細胞を３７℃で２時間接着させ、続いて５００μＬの軟骨形成培地を添加した。培養全体の間、細胞を、異なる濃度（３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、及び／又は３００ｎｇ／ｍＬ）のＰＥＰ１６（配列番号２）及び／又はＰＥＰ１６ビス（配列番号３）の非存在下又は存在下で培養した。１４日後、肥大化分化及び石灰化の誘導を、１％ＡＢ、５％ＦＢＳ、５μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、１倍ＩＴＳプレミックス、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸－２－ホスフェート（ＡＡ）（Ｓｉｇｍａ）、及び１０ｍＭのβ－グリセロホスフェート（ＢＧＰ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するα－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）からなる石灰化培地によって誘導した。細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で維持した。マイクロマスを、１、７、１４、２１及び２８日の時点で回収した。各時点を、３つの技術的複製で処理した。培地を１日おきに交換した。読み出しは、プロテオグリカン含有量、シグナル伝達経路活性化状態、及び目的の遺伝子の評価を含んだ。目的の遺伝子は、関節軟骨細胞マーカー（アグリカン、２型コラーゲン（ｃｏｌ２ａ１））、ＹＡＰ／ＴＡＺ標的遺伝子（ｃｔｇｆ、ａｎｋｒｄ）、及びＯＡの病態生理学に関与する異化促進酵素（ｍｍｐ３、ｍｍｐ１３）であった。
ＡＴＤＣ５マイクロマス培養
マウス軟骨形成ＡＴＤＣ５細胞（軟骨特異的軟骨形成株）を、１％抗生物質（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ、ＡＢ、ペニシリン－ストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ）、５％ウシ胎仔血清（fetal bovine serum、ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）を補充し、１０μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）及び３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）で富化した１：１のダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s modified Eagle’s medium、ＤＭＥＭ）：Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２ミックス（Ｇｉｂｃｏ）を含有する維持培地中で、コンフルエントになるまで培養した。細胞をトリプシン処理し、洗浄し、１倍ＩＴＳプレミックス（結果的に１０μｇ／ｍＬのインスリン、１０μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、及び３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウムとなる）（Life technologies）で富化した維持培地
からなる軟骨形成培地中で、２．１０７細胞／ｍＬで再懸濁した。１滴の細胞懸濁液（１０μＬ）を、２４ウェルプレートの各ウェルの中心に配置した。細胞を３７℃で２時間接着させ、続いて５００μＬの軟骨形成培地を添加した。培養全体の間、細胞を、異なる濃度（３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、及び／又は３００ｎｇ／ｍＬ）のＰＥＰ１６（配列番号２）及び／又はＰＥＰ１６ビス（配列番号３）の非存在下又は存在下で培養した。１４日後、肥大化分化及び石灰化の誘導を、１％ＡＢ、５％ＦＢＳ、５μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、１倍ＩＴＳプレミックス、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸－２－ホスフェート（ＡＡ）（Ｓｉｇｍａ）、及び１０ｍＭのβ－グリセロホスフェート（ＢＧＰ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するα－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）からなる石灰化培地によって誘導した。細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で維持した。マイクロマスを、１、７、１４、２１及び２８日の時点で回収した。各時点を、３つの技術的複製で処理した。培地を１日おきに交換した。読み出しは、プロテオグリカン含有量、シグナル伝達経路活性化状態、及び目的の遺伝子の評価を含んだ。目的の遺伝子は、関節軟骨細胞マーカー（アグリカン、２型コラーゲン（ｃｏｌ２ａ１））、ＹＡＰ／ＴＡＺ標的遺伝子（ｃｔｇｆ、ａｎｋｒｄ）、及びＯＡの病態生理学に関与する異化促進酵素（ｍｍｐ３、ｍｍｐ１３）であった。
【0024】
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１単層培養
マウス骨形成性ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞（骨特異的骨形成株）を、１％ＡＢ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充し、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）で富化したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）を含有する維持培地中で、コンフルエントになるまで培養した。細胞をトリプシン処理し、洗浄し、次いで６ウェルプレート中に２６００細胞／ｃｍ２で播種した。その翌日（Ｄ１）、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１分化の誘導を、１０％ＦＢＳ、１％ＡＢ、１％ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＢＧＰ、及び５０μｇ／ｍｌのＡＡを補充したα－最小必須培地（α-Minimal Essential medium、α－ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で細胞を２１日間培養することによって開始した。
マウス骨形成性ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞（骨特異的骨形成株）を、１％ＡＢ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充し、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）で富化したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）を含有する維持培地中で、コンフルエントになるまで培養した。細胞をトリプシン処理し、洗浄し、次いで６ウェルプレート中に２６００細胞／ｃｍ２で播種した。その翌日（Ｄ１）、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１分化の誘導を、１０％ＦＢＳ、１％ＡＢ、１％ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＢＧＰ、及び５０μｇ／ｍｌのＡＡを補充したα－最小必須培地（α-Minimal Essential medium、α－ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で細胞を２１日間培養することによって開始した。
【0025】
培養全体の間、細胞を、異なる濃度（１００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、又は１０００ｎｇ／ｍｌ）のＰＥＰ１６（配列番号２）の非存在下又は存在下で培養した。細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で維持した。細胞を、１、７、１４、２１日の時点で回収した。各時点を、３つの技術的複製で処理した。培地を２日ごとに交換した。読み出しは、ミネラル含有量、シグナル伝達経路活性化状態、及び目的の遺伝子の評価を含んだ。目的の遺伝子は、骨形成分化マーカー（オステオカルシン、オステリックス）であった。
【0026】
マウス関節軟骨細胞培養
マウス関節軟骨細胞（Mouse articular chondrocyte、ＭＡＣ）を、全大腿骨頭蓋部の
酵素消化によって大腿骨頭から単離した。試料を１％ＡＢ／リン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline、ＰＢＳ）中で３回洗浄し、１００ｒｐｍの低速回転で、３７℃
で１時間、２ｍｇ／ｍｌのプロナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）／ＤＭＥＭ－Ｆ１２とともにインキュベートし、続いて３７℃で３時間、１．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＢ（Ｒｏｃｈｅ）／ＤＭＥＭ－Ｆ１２とともにインキュベートした。細胞を１×１０６細胞／７５ｍｍ２で播種し、１％ ＡＢ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、及び５％ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する増殖培地ＤＭＥＭ－Ｆ１２中で、７～１４日間培養した。第一継代細胞を実験に利用した。次いで、ＭＭＰ１３酵素活性アッセイを実施するために、培養上清を回収した。目的の遺伝子の発現の評価は、関節軟骨細胞マーカー（アグリカン、２型コラーゲン（ｃｏｌ２ａ１））、ＹＡＰ／ＴＡＺ標的遺伝子（ａｎｋｒｄ）、及びＯＡの病態生理学に関与する異化促進酵素（ｍｍｐ３）を含んだ。
マウス関節軟骨細胞（Mouse articular chondrocyte、ＭＡＣ）を、全大腿骨頭蓋部の
酵素消化によって大腿骨頭から単離した。試料を１％ＡＢ／リン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline、ＰＢＳ）中で３回洗浄し、１００ｒｐｍの低速回転で、３７℃
で１時間、２ｍｇ／ｍｌのプロナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）／ＤＭＥＭ－Ｆ１２とともにインキュベートし、続いて３７℃で３時間、１．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＢ（Ｒｏｃｈｅ）／ＤＭＥＭ－Ｆ１２とともにインキュベートした。細胞を１×１０６細胞／７５ｍｍ２で播種し、１％ ＡＢ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、及び５％ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する増殖培地ＤＭＥＭ－Ｆ１２中で、７～１４日間培養した。第一継代細胞を実験に利用した。次いで、ＭＭＰ１３酵素活性アッセイを実施するために、培養上清を回収した。目的の遺伝子の発現の評価は、関節軟骨細胞マーカー（アグリカン、２型コラーゲン（ｃｏｌ２ａ１））、ＹＡＰ／ＴＡＺ標的遺伝子（ａｎｋｒｄ）、及びＯＡの病態生理学に関与する異化促進酵素（ｍｍｐ３）を含んだ。
【0027】
病変ヒト関節軟骨の外植片の培養
ヒト関節軟骨の外植片を、ＮａｎｃｙのＣＨＲＵの整形外科部門（Ｐｒ．Ｄｉｄｉｅｒ
Ｍａｉｎａｒｄ）による人工膝関節全置換手術から得た。試料を１％ ＡＢ／ＰＢＳ中で３回洗浄し、増殖培地（１％ ＡＢ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、及び５％ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＤＭＥＭ－Ｆ１２）中で２４時間インキュベートした。次いで、外植片を、３００ｎｇ／ｍｌの濃度のＰＥＰ１６で７日間刺激した。次いで、ＭＭＰ１３酵素活性アッセイを実施するために、培養上清を回収した。
ヒト関節軟骨の外植片を、ＮａｎｃｙのＣＨＲＵの整形外科部門（Ｐｒ．Ｄｉｄｉｅｒ
Ｍａｉｎａｒｄ）による人工膝関節全置換手術から得た。試料を１％ ＡＢ／ＰＢＳ中で３回洗浄し、増殖培地（１％ ＡＢ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、及び５％ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＤＭＥＭ－Ｆ１２）中で２４時間インキュベートした。次いで、外植片を、３００ｎｇ／ｍｌの濃度のＰＥＰ１６で７日間刺激した。次いで、ＭＭＰ１３酵素活性アッセイを実施するために、培養上清を回収した。
【0028】
プロモーター活性化アッセイ
ＡＴＤＣ５細胞を、ＹＡＰ／ＴＡＺホタルルシフェラーゼレポータープラスミド（８ｘ
ＧＴＩＩＣ、プラスミド＃３４６１５、Ａｄｄｇｅｎｅ）、β－カテニン経路レポータープラスミド（Ｓｕｐｅｒ ８ｘ ＴＯＰＦｌａｓｈ、プラスミド＃１２４５６、Ａｄｄｇｅｎｅ）又は不活性β－カテニン対照レポータープラスミド（Ｓｕｐｅｒ ８ｘ ＴＯＰＦｌａｓｈ、＃１２４５７、Ａｄｄｇｅｎｅ）のいずれかでトランスフェクトした。結果を、上記プラスミドの各々をチロシンキナーゼ－ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）でコトランスフェクトすることによって正規化した。トランスフェクションを、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ ｋｂトランスフェクション試薬（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実行した。簡潔に述べると、レポータープラスミド及びトランスフェクション試薬を無血清培地中で希釈し、次いで、希釈したＤｈａｒｍａｆｅｃｔ ｋｂを、室温で１０分間のインキュベーション時間にわたってプラスミドに添加した。その間、細胞をＰＢＳですすぎ、新鮮な維持培地中に配置した。インキュベーションが終わると、トランスフェクション試薬－プラスミドの混合物を各ウェル中に分配した。刺激（Ｗｎｔ３ａ及び／又はＰＥＰ１６及び／又はＰＥＰ１６ビス）を翌日に実行した。
ＡＴＤＣ５細胞を、ＹＡＰ／ＴＡＺホタルルシフェラーゼレポータープラスミド（８ｘ
ＧＴＩＩＣ、プラスミド＃３４６１５、Ａｄｄｇｅｎｅ）、β－カテニン経路レポータープラスミド（Ｓｕｐｅｒ ８ｘ ＴＯＰＦｌａｓｈ、プラスミド＃１２４５６、Ａｄｄｇｅｎｅ）又は不活性β－カテニン対照レポータープラスミド（Ｓｕｐｅｒ ８ｘ ＴＯＰＦｌａｓｈ、＃１２４５７、Ａｄｄｇｅｎｅ）のいずれかでトランスフェクトした。結果を、上記プラスミドの各々をチロシンキナーゼ－ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）でコトランスフェクトすることによって正規化した。トランスフェクションを、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ ｋｂトランスフェクション試薬（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実行した。簡潔に述べると、レポータープラスミド及びトランスフェクション試薬を無血清培地中で希釈し、次いで、希釈したＤｈａｒｍａｆｅｃｔ ｋｂを、室温で１０分間のインキュベーション時間にわたってプラスミドに添加した。その間、細胞をＰＢＳですすぎ、新鮮な維持培地中に配置した。インキュベーションが終わると、トランスフェクション試薬－プラスミドの混合物を各ウェル中に分配した。刺激（Ｗｎｔ３ａ及び／又はＰＥＰ１６及び／又はＰＥＰ１６ビス）を翌日に実行した。
【0029】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction、ｑＲＴ－ＰＣＲ）（健常軟骨細胞及び肥大軟骨細胞マーカーの発現を見るために）
全ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して単離し、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写した。ｉＴａｑ ＳＹＢＲグリーンｑＰＣＲマスターミックス（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、目的の標的遺伝子のｍＲＮＡ発現を評価した。プライマー配列は、要求に応じて提供することができる。以下のＰＣＲ条件を使用した：９５℃で１分間、９５℃で１５秒間の熱変性、続いて６０℃で１分間のアニーリング－伸長を４０サイクル。融解曲線解析を実施して、特定の生成物の増幅を決定した。結果を、比較閾値法を使用して表し、ＡＴＤＣ５細胞及びＭＡＣのハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ）ｍＲＮＡレベルに対して
正規化したか、又はＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞のハウスキーピング遺伝子Ｓ２９（リボソームタンパク質Ｓ２９）ｍＲＮＡレベルに対して正規化した。Ｖｉａ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をｑＲＴ－ＰＣＲ測定に使用した。
全ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して単離し、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写した。ｉＴａｑ ＳＹＢＲグリーンｑＰＣＲマスターミックス（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、目的の標的遺伝子のｍＲＮＡ発現を評価した。プライマー配列は、要求に応じて提供することができる。以下のＰＣＲ条件を使用した：９５℃で１分間、９５℃で１５秒間の熱変性、続いて６０℃で１分間のアニーリング－伸長を４０サイクル。融解曲線解析を実施して、特定の生成物の増幅を決定した。結果を、比較閾値法を使用して表し、ＡＴＤＣ５細胞及びＭＡＣのハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ）ｍＲＮＡレベルに対して
正規化したか、又はＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞のハウスキーピング遺伝子Ｓ２９（リボソームタンパク質Ｓ２９）ｍＲＮＡレベルに対して正規化した。Ｖｉａ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をｑＲＴ－ＰＣＲ測定に使用した。
【0030】
プロテオグリカン形成の定量化
マイクロマスをＰＢＳで洗浄し、染色のために４℃で３０分間、９５％氷冷エタノールで固定した。蒸留水で洗浄した後、マイクロマスをアルシアンブルー（０．１％ Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ ８ＧＸ（Ｓｉｇｍａ））で染色し、蒸留水で３回洗浄して、非結合染色を除去し、風乾した。染色の定量化を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用した青色ピクセル定量化によって、次いで、６Ｍグアニジン－ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）でマイクロマスを溶解することによって、及び分光光度計（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて６５０ｎｍでの吸光度を測定することによって実施した。
マイクロマスをＰＢＳで洗浄し、染色のために４℃で３０分間、９５％氷冷エタノールで固定した。蒸留水で洗浄した後、マイクロマスをアルシアンブルー（０．１％ Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ ８ＧＸ（Ｓｉｇｍａ））で染色し、蒸留水で３回洗浄して、非結合染色を除去し、風乾した。染色の定量化を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用した青色ピクセル定量化によって、次いで、６Ｍグアニジン－ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）でマイクロマスを溶解することによって、及び分光光度計（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて６５０ｎｍでの吸光度を測定することによって実施した。
【0031】
石灰化形成の定量化
細胞をＰＢＳで洗浄し、染色のために４℃で３０分間、９５％氷冷エタノールで固定した。蒸留水で洗浄した後、細胞をアリザリンレッド染色（１％ Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓ（Ｓｉｇｍａ））で染色し、蒸留水で３回洗浄して、非結合染色を除去し、風乾した。染色の定量化は、灰分を８００μｌの１０％酢酸に３０分間溶解することによって実施した。次いで、ウェルを掻き取り、各ウェルの内容物を別個のチューブに回収し、３０秒間ボルテックスした。各チューブを８５℃で１０分間加熱し、次いで氷上に５分間置いた。最後に、チューブを１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、液相を回収し、１００μｌの１０％水酸化アンモニウムと混合した。吸光度を、分光光度計（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて４０５ｎｍで測定した。
細胞をＰＢＳで洗浄し、染色のために４℃で３０分間、９５％氷冷エタノールで固定した。蒸留水で洗浄した後、細胞をアリザリンレッド染色（１％ Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓ（Ｓｉｇｍａ））で染色し、蒸留水で３回洗浄して、非結合染色を除去し、風乾した。染色の定量化は、灰分を８００μｌの１０％酢酸に３０分間溶解することによって実施した。次いで、ウェルを掻き取り、各ウェルの内容物を別個のチューブに回収し、３０秒間ボルテックスした。各チューブを８５℃で１０分間加熱し、次いで氷上に５分間置いた。最後に、チューブを１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、液相を回収し、１００μｌの１０％水酸化アンモニウムと混合した。吸光度を、分光光度計（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて４０５ｎｍで測定した。
【0032】
タンパク質抽出及びウェスタンブロット分析（古典的及び非古典的Ｗｎｔ経路の活性化を見るために）
タンパク質を、１倍Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％２－ベータメルカプトエタノール、０．００２％ブロモフェノールブルー、１２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８））を使用して、マイクロマスから単離した。試料を９５℃で５分間熱変性させ、氷上で冷却し、１９２ｍＭのグリシン、２０ｍＭのトリス塩基、０．１％ＳＤＳを含有する移動緩衝液を使用する電気泳動によって、トリス－グリシン伸長勾配ゲル４～２０％（Ｂｉｏｒａｄ）上で分離した。（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。次いで、タンパク質を、Ｔｒａｎｓ－ｂｌｏｔターボシステム（ＢｉｏＲａｄ）を７分間使用して、ポリビニルジフルオリド（polyvinylidine difluoride、ＰＶＤＦ）膜上に移した。室温で
、ブロッキング緩衝液（５％脱脂粉乳を補充したＴＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ））中で２時間後、膜をＴＢＳＴ中で３回洗浄し、ＴＢＳＴ－５％ウシ血清アルブミン中で、活性β－カテニン、総β－カテニン、ホスホＣａｍＫＩＩ、又は総ＣａｍＫＩＩのいずれかに対する１つの一次抗体とともに、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、各ブロットを、ブロッキング緩衝液中の西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートされた抗ウサギ又は抗マウス抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories
）とともに、室温で１時間インキュベートした。ブロットを、製造元の推奨に従ってＣｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ基質（ＢｉｏＲａｄ）を使用して視覚化した。画像を、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ ＣＣＤカメラシステム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて取得した。密度測定分析を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて実施した。結果を、活性（ホスホ）タンパク質形態／総タンパク質形態の比として
表す。
タンパク質を、１倍Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％２－ベータメルカプトエタノール、０．００２％ブロモフェノールブルー、１２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８））を使用して、マイクロマスから単離した。試料を９５℃で５分間熱変性させ、氷上で冷却し、１９２ｍＭのグリシン、２０ｍＭのトリス塩基、０．１％ＳＤＳを含有する移動緩衝液を使用する電気泳動によって、トリス－グリシン伸長勾配ゲル４～２０％（Ｂｉｏｒａｄ）上で分離した。（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。次いで、タンパク質を、Ｔｒａｎｓ－ｂｌｏｔターボシステム（ＢｉｏＲａｄ）を７分間使用して、ポリビニルジフルオリド（polyvinylidine difluoride、ＰＶＤＦ）膜上に移した。室温で
、ブロッキング緩衝液（５％脱脂粉乳を補充したＴＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ））中で２時間後、膜をＴＢＳＴ中で３回洗浄し、ＴＢＳＴ－５％ウシ血清アルブミン中で、活性β－カテニン、総β－カテニン、ホスホＣａｍＫＩＩ、又は総ＣａｍＫＩＩのいずれかに対する１つの一次抗体とともに、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、各ブロットを、ブロッキング緩衝液中の西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートされた抗ウサギ又は抗マウス抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories
）とともに、室温で１時間インキュベートした。ブロットを、製造元の推奨に従ってＣｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ基質（ＢｉｏＲａｄ）を使用して視覚化した。画像を、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ ＣＣＤカメラシステム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて取得した。密度測定分析を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて実施した。結果を、活性（ホスホ）タンパク質形態／総タンパク質形態の比として
表す。
【0033】
ＭＭＰ１３酵素活性アッセイ
ＭＭＰ１３酵素活性を、ＭＭＰ１３蛍光発生基質（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して評価した。簡潔に述べると、異なる実験の終了時に回収した培養上清を、１．５ｍＭの酢酸４－アミノフェニル水銀と混合し、全てのｐｒｏ－ＭＭＰを活性ＭＭＰにするために、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、蛍光発生基質を添加し、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。蛍光を、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈデバイス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、以下のパラメータ、励起３２５ｎｍ及び発光３９３ｎｍを使用して評価した。組換えヒトＭＭＰ１３を、陽性対照として使用した（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。陰性対照は、増殖培地に存在する。
ＭＭＰ１３酵素活性を、ＭＭＰ１３蛍光発生基質（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して評価した。簡潔に述べると、異なる実験の終了時に回収した培養上清を、１．５ｍＭの酢酸４－アミノフェニル水銀と混合し、全てのｐｒｏ－ＭＭＰを活性ＭＭＰにするために、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、蛍光発生基質を添加し、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。蛍光を、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈデバイス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、以下のパラメータ、励起３２５ｎｍ及び発光３９３ｎｍを使用して評価した。組換えヒトＭＭＰ１３を、陽性対照として使用した（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。陰性対照は、増殖培地に存在する。
【0034】
統計分析
統計分析を、ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍ ｖ６．０を使用して実行した。ＡＮＯＶＡを、対照群（Ｗｎｔ３ａ、ＩＬ１β、又はＰＥＰ１６の非存在下の細胞）と処理群（Ｗｎｔ３ａ単独、ＩＬ１β単独、ＰＥＰ１６単独、又はＰＥＰ１６ビス（配列番号３）単独）との間の、また、Ｗｎｔ３ａ処理群とＷｎｔ３ａ＋ＰＥＰ１６、Ｗｎｔ３ａ＋ＰＥＰ１６ビス群との間の違いを評価するために実施した。
統計分析を、ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍ ｖ６．０を使用して実行した。ＡＮＯＶＡを、対照群（Ｗｎｔ３ａ、ＩＬ１β、又はＰＥＰ１６の非存在下の細胞）と処理群（Ｗｎｔ３ａ単独、ＩＬ１β単独、ＰＥＰ１６単独、又はＰＥＰ１６ビス（配列番号３）単独）との間の、また、Ｗｎｔ３ａ処理群とＷｎｔ３ａ＋ＰＥＰ１６、Ｗｎｔ３ａ＋ＰＥＰ１６ビス群との間の違いを評価するために実施した。
【0035】
実施例２：結果
３０、１００、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６（それぞれ、Ｐ３０、Ｐ１００、及びＰ３００）でのＡＴＤＣ５細胞株の処理
３０、１００、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６で処理したＡＴＤＣ５マイクロマスにおける、１、７、１４、２１、及び２８日目の（Ａ）アグリカン、（Ｂ）ｃｏｌ２ａ１、（Ｃ）ｃｔｇｆ、（Ｄ）ｍｍｐ３、及び（Ｅ）ｍｍｐ１３の相対発現レベルの結果を、図２に示す。
３０、１００、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６（それぞれ、Ｐ３０、Ｐ１００、及びＰ３００）でのＡＴＤＣ５細胞株の処理
３０、１００、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６で処理したＡＴＤＣ５マイクロマスにおける、１、７、１４、２１、及び２８日目の（Ａ）アグリカン、（Ｂ）ｃｏｌ２ａ１、（Ｃ）ｃｔｇｆ、（Ｄ）ｍｍｐ３、及び（Ｅ）ｍｍｐ１３の相対発現レベルの結果を、図２に示す。
【0036】
３０、１００、及び３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６（それぞれ、Ｐ３０、Ｐ１００、及びＰ３００）で処理し、２８日間培養されたＡＴＤＣ５マイクロマスにおける、（Ａ）コンピュータプログラム（青色ピクセル定量化）での、（Ｂ）生化学的定量化（グアニジンＨＣｌ ６Ｍ中の染色の可溶化）での、グリコサミノグリカン定量化の結果を図６に示す。
【0037】
１００及び３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６での処理後１、７、１４、２１、及び２８日目のＡＴＤＣ５マクロマスにおける、（Ａ）Ｗｎｔ／β－カテニン経路活性化（Ｂ）ＣａｍｋＩＩ経路活性化を調査するウェスタンブロットの結果を、図７に表す。
【0038】
得られた結果は、ＰＥＰ１６が、ＡＴＤＣ５軟骨形成中の健常関節軟骨表現型のマーカー（アグリカン及び２型コラーゲン）の発現の誘導を有意に増強したことを示す。更に、ＰＥＰ１６は、変形性関節症関連ＭＭＰ、すなわちＭＭＰ３及びＭＭＰ１３の発現、並びにＨｉｐｐｏ／ＹＡＰ／ＴＡＺ経路の標的遺伝子であるＣｔｇｆの発現を効率的に低減させた。加えて、ＰＥＰ１６は、軟骨形成中の細胞外マトリックスにおけるグリコサミノグリカンの蓄積を有意に増加させた。最後に、ＰＥＰ１６は、軟骨形成の予備石灰化段階におけるＣａｍＫＩＩ経路の活性化を増加させたが（Ｄ１４）、軟骨形成中のＷｎｔ／β－カテニン経路の活性化を低減させた。
【0039】
３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６及びＰＥＰ１６ビスでのＡＴＤＣ５細胞株の処理
３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６又はＰＥＰ１６ビスで処理したＡＴＤＣ５マイクロマスにおける１、２１、及び２８日目の（Ａ）アグリカン、（Ｂ）ｃｏｌ２ａ１、（Ｃ）ｍｍ
ｐ３、（Ｄ）ｍｍｐ１３、及び（Ｅ）ａｎｋｒｄの相対発現レベルの結果を、図３に示す。
３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６又はＰＥＰ１６ビスで処理したＡＴＤＣ５マイクロマスにおける１、２１、及び２８日目の（Ａ）アグリカン、（Ｂ）ｃｏｌ２ａ１、（Ｃ）ｍｍ
ｐ３、（Ｄ）ｍｍｐ１３、及び（Ｅ）ａｎｋｒｄの相対発現レベルの結果を、図３に示す。
【0040】
３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６又はＰＥＰ１６ビスで処理したＡＴＤＣ５マイクロマスにおける２８日目のグリコサミノグリカン定量化の結果を、図４に示す。
【0041】
（Ａ）３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６若しくはＰＥＰ１６ビス、及び１０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａでの２４時間のトランスフェクションの翌日に処理したＡＴＤＣ５マクロマスにおける７Ｘ ＴＣＦ／ＬＥＦ応答要素（Ｓｕｐｅｒ ８ｘ ＴＯＰＦｌａｓｈレポーター）、（Ｂ）８Ｘ ＹＡＰ応答要素（８ｘ ＧＴＩＩＣレポーター）、又は（Ｃ）３、３０、１００、３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６ ＰＥＰ１６（それぞれ、Ｐ３、Ｐ３０、Ｐ１００、及びＰ３００）、及び１００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａでの２４時間のトランスフェクションの翌日に処理したＡＴＤＣ５マクロマスにおける７Ｘ ＴＣＦ／ＬＥＦ応答要素（Ｓｕｐｅｒ ８ｘ ＴＯＰＦｌａｓｈレポーター）の制御下での、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む構築物でトランスフェクトしたＡＴＤＣ５細胞におけるプロモーター活性化アッセイの結果を、図５に示す。
【0042】
３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６又はＰＥＰ１６ビスでの処理後２１及び２８日目のＡＴＤＣ５マクロマスにおける、（Ａ）Ｗｎｔ／β－カテニン経路活性化（Ｂ）ＣａｍｋＩＩ経路活性化を調査するウェスタンブロットの結果を、図８に示す。
【0043】
得られた結果は、ＰＥＰ１６ビスもまた、ＡＴＤＣ５軟骨形成中の健常関節軟骨表現型のマーカー（アグリカン及び２型コラーゲン）の発現の誘導を支持したことを示す。更に、ＰＥＰ１６ビスは、変形性関節症関連ＭＭＰ、すなわちＭＭＰ３及びＭＭＰ１３の発現、並びにＨｉｐｐｏ／ＹＡＰ／ＴＡＺ経路の標的遺伝子であるＣｔｇｆの発現を効率的に低減させた。加えて、ＰＥＰ１６ビスは、軟骨形成中の細胞外マトリックスにおけるグリコサミノグリカンの蓄積を有意に増加させた。更に、３００ｎｇ／ｍｌでのＰＥＰ１６及びＰＥＰ１６ビスは、Ｓｕｐｅｒ ＴＯＰＦｌａｓｈルシフェラーゼレポーターシステム（システムを活性化する、レポータープラスミドでトランスフェクトされ、１０又は１００ｎｇ／ｍＬの組換えＷｎｔ３ａタンパク質で刺激されたＡＴＤＣ５細胞）における古典的経路の活性を有意に低減することができたが、他の４つの配列は、それを低減することができない。同様に、３０ｎｇ／ｍｌのＰＥＰ１６は、ルシフェラーゼ型レポーターシステム（プラスチックとの接触に対して自発的に活性化する、ＹＡＰ経路のレポータープラスミドでトランスフェクトされたＡＴＤＣ５細胞）におけるＨｉｐｐｏ／ＹＡＰ／ＴＡＺ経路の活性を有意に低減させた。最後に、ＰＥＰ１６ビスは、ＣａｍＫＩＩ経路の活性化を増加させたが、軟骨形成中のＷｎｔ／β－カテニン経路の活性化を低減させた。
【0044】
３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６又はＰＥＰ１６ビスでのマウス関節軟骨細胞培養物の処理
３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６、及び／又はＭＭＰ１３活性の陽性対照としての１００ｐｇ／ｍＬのＩＬ１βで２４時間処理したマウス関節軟骨細胞の培養上清におけるＭＭＰ１３酵素活性の結果を、図９に示す。
３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６、及び／又はＭＭＰ１３活性の陽性対照としての１００ｐｇ／ｍＬのＩＬ１βで２４時間処理したマウス関節軟骨細胞の培養上清におけるＭＭＰ１３酵素活性の結果を、図９に示す。
【0045】
３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６及び／又は１００ｎｇ／ｍＬのｗｎｔ３ａで処理したマウス関節軟骨細胞における、２４及び４８時間での（Ａ）アグリカン、（Ｂ）ｃｏｌ２ａ１の相対発現レベルの結果を、図１０に表す。
【0046】
３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６若しくはＰＥＰ１６ビス、及び／又は１００、５０、３０ｎｇ／ｍＬのｗｎｔ３ａで処理したマウス関節軟骨細胞における、（Ａ、Ｂ）ｍｍｐ３及び（Ｃ）ａｎｋｒｄの相対発現レベルの結果を、図１１に示す。
【0047】
得られた結果は、試験中のペプチドの保護的役割を示す。ＰＥＰ１６は、マウス関節軟骨細胞の培養上清において測定されたＩＬ１β誘導性ＭＭＰ１３活性を有意に低減させた。更に、ＰＥＰ１６は、健常関節軟骨表現型のマーカー（アグリカン及び２型コラーゲン）の減少に対する、及びＮＧＦ（疼痛、データは示さず）の増加に対する、Ｗｎｔ３ａによるβ－カテニン活性化の有害作用に対抗する傾向を有した。試験中のペプチドはまた、組換えＷｎｔ３ａの使用によって誘導される有害作用に対抗することができ、特に、ＰＥＰ１６は、ＭＭＰ３の発現に対するＷｎｔ３ａの誘起効果に対抗する。加えて、ＰＥＰ１６及びＰＥＰ１６ビスは、この一次培養系におけるＨｉｐｐｏ／ＹＡＰ／ＴＡＺ経路の標的遺伝子であるＡｎｋｒｄの発現を低減することができる。Ｈｉｐｐｏ／ＹＡＰ／ＴＡＺ経路の他の２つの標的遺伝子であるＣｙｒ６１及びＣｔｇｆについても、同様の傾向が観察される。
【0048】
３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６での病変ヒト関節軟骨外植片（変形性関節症）の処理
３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６で７日間処理（７日間で３回刺激）したヒト関節軟骨外植片（人工膝関節全置換手術後の末期変形性関節症の３人の患者由来）の培養上清におけるＭＭＰ１３酵素活性の結果を、図１２に示す。
３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６で７日間処理（７日間で３回刺激）したヒト関節軟骨外植片（人工膝関節全置換手術後の末期変形性関節症の３人の患者由来）の培養上清におけるＭＭＰ１３酵素活性の結果を、図１２に示す。
【0049】
得られた結果は、ＰＥＰ１６が、ヒト軟骨外植片の培養上清において測定されたＭＭＰ１３の酵素活性を低減することができることを示す。
【0050】
ＰＥＰ１６でのＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株の処理
１００ｎｇ／ｍＬ又は３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６（それぞれ、Ｐ１００及びＰ３００）で処理したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞における７、１４、及び２１日目のオステオカルシン及びオステリックスの相対発現レベルの結果を、図１３Ａに示す。３００ｎｇ／ｍＬ又は１０００ｎｇ／ｍＬ（それぞれＰ３００及びＰ１０００）のＰＥＰ１６での処理後７、１４、及び２１日目のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞における、Ｗｎｔ／β－カテニン経路及びＣａｍｋＩＩ経路活性化を調査するウェスタンブロットの結果を、図１３Ｂに示す。１００ｎｇ／ｍＬ又は３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６で処理したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞における２１日目の石灰化定量化の結果を、図１３Ｃに示す。
１００ｎｇ／ｍＬ又は３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６（それぞれ、Ｐ１００及びＰ３００）で処理したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞における７、１４、及び２１日目のオステオカルシン及びオステリックスの相対発現レベルの結果を、図１３Ａに示す。３００ｎｇ／ｍＬ又は１０００ｎｇ／ｍＬ（それぞれＰ３００及びＰ１０００）のＰＥＰ１６での処理後７、１４、及び２１日目のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞における、Ｗｎｔ／β－カテニン経路及びＣａｍｋＩＩ経路活性化を調査するウェスタンブロットの結果を、図１３Ｂに示す。１００ｎｇ／ｍＬ又は３００ｎｇ／ｍＬのＰＥＰ１６で処理したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞における２１日目の石灰化定量化の結果を、図１３Ｃに示す。
【0051】
得られた結果は、ＰＥＰ１６が、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１骨形成分化中の骨形成性マーカー（オステオカルシン及びオステリックス）の発現の誘導を支持したことを示す。更に、ＰＥＰ１６は、初期骨形成段階におけるＣａｍＫＩＩ経路の活性化を効率的に増加させたが、骨形成中のＷｎｔ／β－カテニン経路の活性化を低減させた。加えて、ＰＥＰ１６は、細胞外マトリックスにおける灰分の蓄積を有意に増加させた。これらの結果は、極めて直観に反するものであるが、骨粗鬆症の予防又は治療におけるＰＥＰ１６の使用を支持するものである。実際、この疾患において、Ｗｎｔ／β－カテニン経路、特に抗スクレロスチン抗体を促進する試みが通常行われる。
【0052】
実施例３：ＰＥＰ１２はＰＥＰ１６と比較して生物学的に活性ではない
本出願者らは、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１モデルにおけるＰＥＰ１２の影響について以下に記載し、ＰＥＰ１６について有するデータセットの一部（アルカリホスファターゼ活性）を追加する。
本出願者らは、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１モデルにおけるＰＥＰ１２の影響について以下に記載し、ＰＥＰ１６について有するデータセットの一部（アルカリホスファターゼ活性）を追加する。
【0053】
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を、前述したように２１日間分化させた。３００ｎｇ／ｍｌの濃度の異なるペプチド（ＰＥＰ１２又はＰＥＰ１６）を使用し、各培養培地の交換時（２日ごと）に導入した。処理した細胞を、いかなるペプチド刺激も含まない細胞（ＣＴＬ）と比較した。
【0054】
石灰化レベルを、２１日間の分化培養後、前述したような生化学アッセイによって評価した。結果は、３つの実験を表す。
【0055】
本出願者らはまた、特定のアルカリホスファターゼ活性（μｍｏｌのパラ－ニトロフェノール／分／ｍｇのタンパク質）も評価した。その目的のために、本出願者らは、０．２Ｍのトリス塩基、１．６ｍＭ-のＭｇＣｌ２（ｐＨ８．１）、及び１％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ－１００を含有する３００μＬの緩衝液を使用して、細胞を溶解した。次いで、試料をチューブに入れ、氷上に３０分間置いた。この間、３０秒間のボルテックスと氷上での５分間を交互にした。次いで、試料を超音波処理し、４℃で、１３０００ｇで１５分間遠心分離した。上清を回収し、総タンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイを使用して評価した。
Ｘ－１００を含有する３００μＬの緩衝液を使用して、細胞を溶解した。次いで、試料をチューブに入れ、氷上に３０分間置いた。この間、３０秒間のボルテックスと氷上での５分間を交互にした。次いで、試料を超音波処理し、４℃で、１３０００ｇで１５分間遠心分離した。上清を回収し、総タンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイを使用して評価した。
【0056】
回収した上清をパラ－ニトロフェニルホスフェート（para-nitrophenyl phosphate、ｐＮＰＰ）溶液中に入れることによって、アルカリホスファターゼ活性を測定した。アルカリホスファターゼは、この基材を切断し、パラ－ニトロフェノール（para-nitrophenol、ｐＮＰ）を生成する。
【0057】
４ｍｇ／ｍＬのｐＮＰＰの溶液を、緩衝液Ａ（０．１ＭのグリシンｐＨ１０．５、０．１１％（ｍ／ｖ）酢酸亜鉛、及び０．０１１％塩化マグネシウム（ｍ／ｖ））中に調製する。この溶液を、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ中に調製した０．２４％（ｍ／ｖ）の塩化コバルト）中に１／２（２ｍｇ／ｍｌのｐＮＰＰ）に希釈した。ｐＮＰの標準曲線を、緩衝液Ａ中に１／２０（０．５ｍＭのｐＮＰ）に希釈した１０ｍＭのｐＮＰの市販調製物を使用して、０、０．０１、０．０２、０．０４、０．０５、０．０７５、０．１、及び０．２ｍＭに調製した。
【0058】
５０μＬの体積の試料を１ｍＬのｐＮＰＰに添加し、５０μＬの超純水を添加した。次いで、試料を３７℃で３０分間インキュベートした。反応を、０．１ｍＭの１００μＬのＥＤＴＡ及び０．０４Ｍの５ｍＬのＮａＯＨを添加することによって停止する。吸光度を、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ装置で４１０ｎｍで読み取る。アルカリホスファターゼ活性を、標準曲線（式Ａ４１０＝ａ×量（ｐＮＰ）＋ｂ）に基づいて、以下の式：活性＝（（Ａ（４１０ｎｍ）－ｂ）×反応体積）／（ａ×試料体積×反応時間）で計算する。
【0059】
結果は、ＰＥＰ１２については１つの実験、ＰＥＰ１６については２つの実験を表す。
【0060】
概して、ＰＥＰ１２は、骨形成中に細胞外マトリックス石灰化を増加させることができず、かつアルカリホスファターゼ活性を増加させることができなかった。ＰＥＰ１６は、アルカリホスファターゼ活性を増加させる傾向があった（図１４を参照されたい）。
【0061】
実施例４：ＰＥＰ１６への置換：ＬからＩへ及びＬからＳへの置換
２つの置換を有するＰＥＰ１６（同様に、２つのＬ（３位及び１４位）がＡに変更されたＰＥＰ１６ビス）のペプチド配列、すなわち、３位及び１４位のＬがイソロイシン（Ｉ）に変更されたＰＥＰ ｉ（配列番号９に対応する）、並びに３位及び１４位のＬがセリン（Ｓ）に変更されたＰＥＰ ｓ（配列番号１０に対応する）を試験した。
２つの置換を有するＰＥＰ１６（同様に、２つのＬ（３位及び１４位）がＡに変更されたＰＥＰ１６ビス）のペプチド配列、すなわち、３位及び１４位のＬがイソロイシン（Ｉ）に変更されたＰＥＰ ｉ（配列番号９に対応する）、並びに３位及び１４位のＬがセリン（Ｓ）に変更されたＰＥＰ ｓ（配列番号１０に対応する）を試験した。
【0062】
ＡＴＤＣ５細胞をマイクロマスとして培養し、前述のように ＩＴＳを使用して１４日間分化させた。３００ｎｇ／ｍｌの濃度の異なるペプチド（ＰＥＰ１６、ＰＥＰ Ｉ、又はＰＥＰ ｓ）を使用し、各培養培地の交換時（毎日）に導入した。処理した細胞を、いかなるペプチド刺激も含まない細胞（ＣＴＬ）と比較した。ＲＮＡを単離し、異なる標的遺伝子、すなわち、ＩＩ型コラーゲン及びアグリカン（関節軟骨細胞細胞外マトリックス）、ＣＴＧＦ（ＹＡＰ／ＴＡＺ標的遺伝子、経路活性の指標）、並びにＭＭＰ３（変形性
関節症中に増加した軟骨分解酵素）についてｑＰＣＲを実施した（図１５）。アルシアンブルー染色をマイクロマス培養物に実施し、生化学的定量化を前述のように実施した（図１６）。
関節症中に増加した軟骨分解酵素）についてｑＰＣＲを実施した（図１５）。アルシアンブルー染色をマイクロマス培養物に実施し、生化学的定量化を前述のように実施した（図１６）。
【0063】
結果を以下に記載する。＊は、Ｄ１４対照（ＣＴＬ）と比較してｐ値＜０．０５を示し、￡は、Ｄ１ ＣＴＬ（ＡＮＯＶＡ）と比較してｐ値＜０．０５を示す。
【0064】
概して、ＰＥＰ ｓ及びＰＥＰ ｉは、ＰＥＰ１６によって得られたものと比較して非常に類似した結果、すなわち、関節軟骨細胞細胞外マトリックス遺伝子の増加、並びにＹＡＰ／ＴＡＺ標的遺伝子及びＭＭＰ３の有意な減少を提供した。各ペプチドは、対照細胞と比較して、細胞外マトリックスにおけるプロテオグリカン沈着を有意に増加させることができた。
【0065】
実施例５：ＰＥＰ１６対５０ＡＡ長ペプチド（ＰＥＰ５０）の比較
ＰＥＰ１６と比較してその効力を評価するために、５０アミノ酸長ペプチド（ＰＥＰ５０）を試験した。ペプチドがより長いほど、３００ｎｇ／ｍｌのような濃度のＰＥＰ１６の使用は、ペプチドのモル濃度の変化をもたらした。３００ｎｇ／ｍｌで使用したＰＥＰ１６のモル濃度は約１４５ｎＭであるが、３００ｎｇ／ｍｌのＰＥＰ５０は、約４８ｎＭのモル濃度をもたらした。同じモル濃度で細胞を検証するために、本出願者らは、実験条件、すなわちＰＥＰ５０モル濃度を追加し、ここで、１４５ｎＭのＰＥＰ５０を使用した（これは約１０００ｎｇ／ｍｌに換算される）。したがって、３００ｎｇ／ｍｌのＰＥＰ５０又は１４５ｎＭのＰＥＰ５０モル濃度を、３００ｎｇ／ｍｌ⇔１４５ｎＭのＰＥＰ１６と直接比較することができる。
ＰＥＰ１６と比較してその効力を評価するために、５０アミノ酸長ペプチド（ＰＥＰ５０）を試験した。ペプチドがより長いほど、３００ｎｇ／ｍｌのような濃度のＰＥＰ１６の使用は、ペプチドのモル濃度の変化をもたらした。３００ｎｇ／ｍｌで使用したＰＥＰ１６のモル濃度は約１４５ｎＭであるが、３００ｎｇ／ｍｌのＰＥＰ５０は、約４８ｎＭのモル濃度をもたらした。同じモル濃度で細胞を検証するために、本出願者らは、実験条件、すなわちＰＥＰ５０モル濃度を追加し、ここで、１４５ｎＭのＰＥＰ５０を使用した（これは約１０００ｎｇ／ｍｌに換算される）。したがって、３００ｎｇ／ｍｌのＰＥＰ５０又は１４５ｎＭのＰＥＰ５０モル濃度を、３００ｎｇ／ｍｌ⇔１４５ｎＭのＰＥＰ１６と直接比較することができる。
【0066】
ＡＴＤＣ５細胞をマイクロマスとして培養し、前述のようにＩＴＳを使用して１４日間分化させた。３００ｎｇ／ｍｌの濃度のＰＥＰ１６若しくはＰＥＰ５０、又は１０００ｎｇ／ｍｌ（ＰＥＰ５０モル濃度条件）を使用し、各培養培地の交換時（毎日）に導入した。処理した細胞を、いかなるペプチド刺激も含まない細胞（ＣＴＬ）と比較した。ＲＮＡを単離し、異なる標的遺伝子、すなわち、ＩＩ型コラーゲン及びアグリカン（関節軟骨細胞細胞外マトリックス）、ＣＴＧＦ（ＹＡＰ／ＴＡＺ標的遺伝子、経路活性の指標）、並びにＭＭＰ３（変形性関節症中に増加した軟骨分解酵素）についてｑＰＣＲを実施した（図１７）。アルシアンブルー染色をマイクロマス培養物に実施し、生化学的定量化を前述のように実施した（図１８）。
【0067】
結果を以下に記載する。＊は、Ｄ１４対照（ＣＴＬ）と比較してｐ値＜０．０５を示し、￡は、Ｄ１ ＣＴＬ（ＡＮＯＶＡ）と比較してｐ値＜０．０５を示す。
【0068】
概して、ＰＥＰ５０条件は、ＰＥＰ１６を使用して得られたものと比較して非常に類似した結果、すなわち、関節軟骨細胞細胞外マトリックス遺伝子の増加、並びにＹＡＰ／ＴＡＺ標的遺伝子及びＭＭＰ３の有意な減少をもたらした。ＰＥＰ５０モル濃度条件は、ＰＥＰ１６と同じモル濃度で使用される場合、ＰＥＰ５０が関節軟骨細胞細胞外マトリックス遺伝子発現を有意に低減させることを実証した。しかしながら、これは、ＭＭＰ３及びＣＴＧＦ発現を有意に低減させる能力を維持した。各ペプチドは、細胞外マトリックスにおけるプロテオグリカン沈着を増加させることができた。
【0069】
実施例６：ＦＲＺＢのネトリン様（ＮＴＮ）ドメインの細菌生産の仮説
本出願者らは、細菌におけるＦＲＺＢ全長タンパク質及びネトリン様ドメイン（ＮＴＮ）の生成を実施した。これを、欧州特許第３４５５２４６（Ｂ１）号を使用して実施し、炭水化物認識ドメイン（carbohydrate-recognition domain、ＣＲＤ）タグ付き組換えタ
ンパク質の生成をもたらした。
本出願者らは、細菌におけるＦＲＺＢ全長タンパク質及びネトリン様ドメイン（ＮＴＮ）の生成を実施した。これを、欧州特許第３４５５２４６（Ｂ１）号を使用して実施し、炭水化物認識ドメイン（carbohydrate-recognition domain、ＣＲＤ）タグ付き組換えタ
ンパク質の生成をもたらした。
【0070】
精製タグＣＲＤに対する抗体を使用して、ウェスタンブロット分析を実施した。
【0071】
本出願者らは、親和性クロマトグラフィー（ラクトース－セファロース）の溶出液中に少量の組換えＦＲＺＢを生成することに成功したが（図１９）、いかなる使用可能量の組換えＮＴＮタンパク質も生成することができなかった（図２０）。
【0072】
実施例７：ＮＴＮドメインの過剰発現はＹＡＰ／ＴＡＺ経路の調節においてＰＥＰ１６を模倣することができない
ＰＥＰ１６がＮＴＮドメインと比較して新規活性をもたらすことができるかどうかを評価するために、本出願者らはＭＣ３Ｔ３－Ｅ１系を使用し、ここで、ＰＥＰ１６はその有効性を示すことができ、ＮＴＮドメインは同様の特性を示した（Ｔｈｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１６［１５］）。
ＰＥＰ１６がＮＴＮドメインと比較して新規活性をもたらすことができるかどうかを評価するために、本出願者らはＭＣ３Ｔ３－Ｅ１系を使用し、ここで、ＰＥＰ１６はその有効性を示すことができ、ＮＴＮドメインは同様の特性を示した（Ｔｈｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１６［１５］）。
【0073】
簡潔に述べると、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を、前述したように１４日間分化させた。３００ｎｇ／ｍｌの濃度のＰＥＰ１６を使用し、各培養培地の交換時（２日ごと）に導入した。同じ実験において、本出願者らは、ＮＴＮドメインを安定的に過剰発現するＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞も使用した。処理した細胞及びＮＴＮ過剰発現細胞を、対照細胞（ＣＴＬ）と比較した。
【0074】
ＲＮＡを単離し、ＡＮＫＲＤ（ＹＡＰ／ＴＡＺ標的遺伝子、経路活性の指標）についてｑＰＣＲを実施した（図２１）。
【0075】
結果を以下に記載する。＊は、Ｄ１４対照（ＣＴＬ）と比較してｐ値＜０．０５を示し、￡は、Ｄ１ ＣＴＬ（ＡＮＯＶＡ）と比較してｐ値＜０．０５を示す。
【0076】
概して、ＮＴＮは、ＹＡＰ／ＴＡＺ標的遺伝子を有意に減少させることができなかったが、ＰＥＰ１６は、何とかそれを減少させることができた。
【0077】
参照文献のリスト
１．Ｌｏｒｉｅｓ ａｎｄ Ｌｕｙｔｅｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，７（１）：ｐ．４３－９，２０１１
２．Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｆｅｌｓｏｎ，ＢＭＪ，３３２（７５４２）：ｐ．６３９－４２，２００６
３．Ｖａｌｄｅｓ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ，３４（３）：ｐ．５８１－６０３，２００８
４．Ｌｏｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，５６（１２）：ｐ．４０９５－１０３，２００７
５．Ｌｏｄｅｗｙｃｋｘ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ，１４（１）：Ｒ１６，２０１２
６．Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，５６（１０）：ｐ．３３１９－２５，２００７
７．Ｒｏｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１２６（５）：ｐ．１６４９－６３，２０１６
８．Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，５８（７）：ｐ．２０５３－２０６４，２００８
９．Ｔａｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８０（１９）：ｐ．１９１８５－９５，２００５
１０．Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ，２４（１）：ｐ．１２－２１，２００９
１１．Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，９７（１）：１０３－１１４．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００１０９－０１８－１７０５－ｙ，２０１９
１２．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２３２：１１９７２４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１９．１１９７２４，２０２０
１３．Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１１；１３８（２）：ｐ．３５９－７０．
１４．Ｎａｌｅｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２４ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ１４９，２０１６
１５．Ｔｈｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ，９６（５）：ｐ．５７０－８０，２０１６
１６．Ｔｈｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ，７３ Ｓｕｐｐｌ
１：Ａ６７－８，２０１４
１７．Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，４３（８）：ｐ．６２３－６３４，２０１８
１８．Ｚｈｅｎｇ ａｎｄ Ｐａｎ，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ，５０（３）：ｐ．２６４－２８２，２０１９
１．Ｌｏｒｉｅｓ ａｎｄ Ｌｕｙｔｅｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，７（１）：ｐ．４３－９，２０１１
２．Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｆｅｌｓｏｎ，ＢＭＪ，３３２（７５４２）：ｐ．６３９－４２，２００６
３．Ｖａｌｄｅｓ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ，３４（３）：ｐ．５８１－６０３，２００８
４．Ｌｏｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，５６（１２）：ｐ．４０９５－１０３，２００７
５．Ｌｏｄｅｗｙｃｋｘ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ，１４（１）：Ｒ１６，２０１２
６．Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，５６（１０）：ｐ．３３１９－２５，２００７
７．Ｒｏｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１２６（５）：ｐ．１６４９－６３，２０１６
８．Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，５８（７）：ｐ．２０５３－２０６４，２００８
９．Ｔａｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８０（１９）：ｐ．１９１８５－９５，２００５
１０．Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ，２４（１）：ｐ．１２－２１，２００９
１１．Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，９７（１）：１０３－１１４．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００１０９－０１８－１７０５－ｙ，２０１９
１２．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２３２：１１９７２４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１９．１１９７２４，２０２０
１３．Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１１；１３８（２）：ｐ．３５９－７０．
１４．Ｎａｌｅｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２４ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ１４９，２０１６
１５．Ｔｈｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ，９６（５）：ｐ．５７０－８０，２０１６
１６．Ｔｈｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ，７３ Ｓｕｐｐｌ
１：Ａ６７－８，２０１４
１７．Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，４３（８）：ｐ．６２３－６３４，２０１８
１８．Ｚｈｅｎｇ ａｎｄ Ｐａｎ，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ，５０（３）：ｐ．２６４－２８２，２０１９
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【図13-4】
【図14-1】
【図14-2】
【図15-1】
【図15-2】
【図15-3】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【配列表】
【国際調査報告】