▶ チャンヂョウ シンザオール ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッドの特許一覧 ▶ シャンハイ エスティーエー ファーマシューティカル アールアンドディー カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-28
(54)【発明の名称】オリゴヌクレオチドを調製するための方法
(51)【国際特許分類】
C07F 9/6561 20060101AFI20230921BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230921BHJP
C40B 50/14 20060101ALN20230921BHJP
【ＦＩ】
C07F9/6561 Z
C12N15/11 Z ZNA
C40B50/14
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022577378
(86)(22)【出願日】2020-07-10
(85)【翻訳文提出日】2023-02-08
(86)【国際出願番号】 CN2020101401
(87)【国際公開番号】W WO2022006871
(87)【国際公開日】2022-01-13
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522486139
【氏名又は名称】チャンヂョウ シンザオール ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＡＮＧＺＨＯＵ ＳＹＮＴＨＥＡＬＬ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(71)【出願人】
【識別番号】522486140
【氏名又は名称】シャンハイ エスティーエー ファーマシューティカル アールアンドディー カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＳＴＡ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ Ｒ＆Ｄ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】フー， チェンチェン
(72)【発明者】
【氏名】チャオ， チャン
(72)【発明者】
【氏名】リ， チン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン， ジミン
【テーマコード（参考）】
4H050
【Ｆターム（参考）】
4H050AA02
(57)【要約】
オリゴヌクレオチドを調製するための方法を開示する。この方法は、（ａ）式Ｘ－１の化合物を式Ｘ－２の化合物に変換するステップであって、Ｒ１０はオリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー）の残基であり；Ｒ１１はアミン保護基であり；式Ｘ－１の化合物は固体支持体に結合されていないステップと；及び（ｂ）任意選択で式Ｘ－２の化合物における保護基を除去してオリゴヌクレオチドを得るステップと；を含む。本明細書に記載された合成方法は、標的ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーの収率及び純度を向上でき、４－ニトロスチレン付加物不純物を低減できる等、多くの側面において有利であるが、これに限定されない。
【化１】
【選択図】なし
【化１】
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）式Ｘ－１の化合物を式Ｘ－２の化合物に変換するステップ【化1】
（式中：
Ｒ１０は、出発オリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー）の残基であり、
Ｒ１１は、アミン保護基であり、
前記式Ｘ－１の化合物は、固体支持体に結合していない。）と、
（ｂ）任意選択で前記式Ｘ－２の化合物中の保護基を除去して、オリゴヌクレオチドを得るステップと、
を含む、オリゴヌクレオチドを調製するための方法。
【請求項2】
前記変換するステップが、好ましくは溶液中の前記式Ｘ－１の化合物を、アルカリ試薬、及び式Ｘ－３の化合物と反応できる捕捉剤を含む混合物に添加することを含む、請求項１に記載の方法。【化2】
【請求項3】
前記アルカリ試薬が、水中でのｐＫａが約９以上の塩基性有機アミンであり、例えば、前記アルカリ試薬が、環状塩基性アミン、例えば１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン又は１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ－５－エンである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記捕捉剤が、－ＳＨ部分又は１，３－ジカルボニル部分を有し、例えば、前記捕捉剤がＸ－４の化合物である、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。【化3】
（式中、
ｑは０、１、又は２であり、
ＲＡは、存在ごとに、独立的に、置換されていてもよいＣ１～６アルキル（例えば、メチル）である。）
【請求項5】
前記捕捉剤が、チミン又はその誘導体である、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
Ｒ１１が、ＮＨ３による処理によって除去され得るアミン保護基、例えば、Ｒ１１がアシル基、例えば－Ｃ（＝Ｏ）－ＲＢ（式中、ＲＢは置換されていてもよいＣ１～６アルキル、例えばＣ１～６アルキル（例えば、イソプロピル）、アリールで置換されたＣ１～６アルキル（例えば、ベンジル）、又はアリールオキシで置換されたＣ１～６アルキルである。）である、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
（ａ）式Ｘ－５の化合物を式Ｘ－６の化合物に変換するステップ【化4】
（式中、
ｍ１及びｍ２は、独立的に０～５０の整数（例えば、０～３０）であり、
Ｒ１１は、アミン保護基であり、
Ｂａｓｅは、存在ごとに、独立的に、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、及びＴ（チミン）、それらの修飾類似物、及びそれらの保護された誘導体より選択される塩基であり、ただし、前記式Ｘ－５におけるＢａｓｅが保護された塩基である場合、式Ｘ－６の対応するＢａｓｅは同じ保護された塩基又は対応する一部若しくは完全に脱保護された塩基であってよく、
式中、
Ｔ１は適当な５’末端基（例えば、短いペプチド、置換されていてもよいアルキルアミノ基、置換されていてもよい複素環基等）であり、及び
Ｔ２は適当な３’末端基、例えば水素又は保護基（例えば、アシル基、トリチル等）である。）と、
（ｂ）前記式Ｘ－６の化合物中の保護基を任意選択で部分的又は完全に除去して、オリゴヌクレオチドを得るステップと、
を含む、オリゴヌクレオチドを調製するための方法。
【請求項8】
式Ｘ－５又はＸ－６におけるＢａｓｅが、存在ごとに、以下から独立的に選択される、請求項７に記載の方法。【化5】
（式中、Ｒ１１はアミン保護基である。）
【請求項9】
ｍ１及びｍ２の一方が０であるか、又はｍ１もｍ２も０でない、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
ｍ１とｍ２との和が５～５０、例えば１０～４０である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項11】
Ｔ１が、置換されていてもよいアルキルアミン又は置換されていてもよい複素環、例えば、アミド（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）で置換されたアルキルアミン、例えば、【化6】
、置換されていてもよいピペリジン環、例えば、
【化7】
、（式中、ＲＣは、アシル基、アシルオキシ基、又はペプチド残基である。）である、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
Ｔ２が、水素、トリチル又はアシル基（例えば、アセチル）である、請求項７～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記変換するステップが、好ましくは溶液中の前記式Ｘ－５の化合物を、アルカリ試薬及び式Ｘ－３の化合物と反応できる捕捉剤を含む混合物に添加することを含む、請求項７～１２のいずれか一項に記載の方法。【化8】
【請求項14】
前記アルカリ試薬が、水中でのｐＫａが約９以上の塩基性有機アミンであり、例えば、前記アルカリ試薬が、環状塩基性アミン、例えば１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン又は１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ－５－エンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記捕捉剤が、－ＳＨ部分又は１，３－ジカルボニル部分を有し、例えば、前記捕捉剤がＸ－４の化合物である、請求項１３又は１４に記載の方法。【化9】
（式中、
ｑは０、１、又は２であり、
ＲＡは、存在ごとに、独立的に置換されていてもよいＣ１～６アルキル（例えば、メチル）である。）
【請求項16】
前記捕捉剤が、チミン又はその誘導体である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
Ｒ１１が、ＮＨ３での処理によって除去可能なアミン保護基であり、例えば、Ｒ１１が、アシル基、例えば－Ｃ（＝Ｏ）－ＲＢ（式中、ＲＢは置換されていてもよいＣ１～６アルキル、例えば、Ｃ１～６アルキル（例えば、イソプロピル）、アリールで置換されたＣ１～６アルキル（例えば、ベンジル）、又はアリールオキシで置換されたＣ１～６アルキルである。）である、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
ＮＨ３で式Ｘ－６の化合物を処理して、式Ｘ－６における保護基を部分的又は完全に除去するステップを更に含む、請求項７～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記式Ｘ－５の化合物は、式Ｘ－７のオリゴヌクレオチドから固体支持体を例えばＮＨ３により切断することを含む過程によって調製される、請求項７～１８のいずれか一項に記載の方法。【化10】
（式中、
ＳＳは固相支持体、例えばポリスチレン固体支持体であり、
Ｌ１はリンカー、例えば、サルコシン系リンカー、例えば、
【化11】
（式中、窒素末端がリン原子に結合し、カルボニル末端が固体支持体とアミド結合を形成している。）であり、
式Ｘ－７におけるｍ１、ｍ２、及びＲ１１は、式Ｘ－５における対応する基と同じであり、
Ｂａｓｅは、存在ごとに、独立的に、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、及びＴ（チミン）、それらの修飾類似物、及びそれらの保護された誘導体より選択される塩基であり、ただし、前記式Ｘ－７におけるＢａｓｅが保護された塩基である場合、式Ｘ－５における対応する塩基は同じ保護された塩基又は対応する部分的若しくは完全に脱保護された塩基であってよく、及び
Ｔ２は、適当な３’末端基、例えば水素又は保護基（例えば、アシル基、トリチル）である。）。
【請求項20】
請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法により製造された製品。【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［技術分野］
本開示は、一般に、オリゴヌクレオチド、例えばホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）、を調製するための方法に関する。
本開示は、一般に、オリゴヌクレオチド、例えばホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）、を調製するための方法に関する。
【0002】
［背景］
ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー、すなわちＰＭＯは、相補的なＲＮＡに配列特異的に堅く結合する核酸類似物であり、タンパク質合成の調節、ひいては遺伝子発現の調節に有用である。このオリゴマーは、モルフォリノ骨格系で支持された塩基対認識部分（複素環塩基）からなる。このようなオリゴマーの合成に使用するモルフォリノサブユニットは、入手が容易で安価な前駆体である、対応するリボヌクレオシドから容易に調製することが可能である。
ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー、すなわちＰＭＯは、相補的なＲＮＡに配列特異的に堅く結合する核酸類似物であり、タンパク質合成の調節、ひいては遺伝子発現の調節に有用である。このオリゴマーは、モルフォリノ骨格系で支持された塩基対認識部分（複素環塩基）からなる。このようなオリゴマーの合成に使用するモルフォリノサブユニットは、入手が容易で安価な前駆体である、対応するリボヌクレオシドから容易に調製することが可能である。
【0003】
このような合成の間、従来のオリゴヌクレオチド合成と同様、複素環塩基上の官能基は合成変換の妨げにならないよう、通常遮蔽される。
【0004】
Ｏ６－非保護グアニンサブユニットは、オリゴマーの段階で副反応を起こすことが知られている。例えば、Ｏ６酸素はカップリングステップにおいて活性化サブユニットと反応でき、Ｏ６－リン酸化種又は誘導体種を形成して、塩基の保護基をアンモニアで最終切断する際、アンモニアはＣ６で反応して、これらの種を置換し、ジアミノプリン誘導体が得られる。このような不純物はクロマトグラフィーで除去することが困難であり、収率を大きく低下させる原因となる。
【0005】
従来のオリゴヌクレオチド合成において、保護されていないグアニンＯ６位の副反応を低減するために、当該技術分野では様々な保護スキームが提案されている。しかし、これらのプロトコルをホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー合成に適用すると、ほとんど失敗した。したがって、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー合成、特にＧモルフォリノサブユニットの使用において、収率と純度を高めるための改善法が必要とされている。
【0006】
［概要］
モルフォリノ化学に特有の課題として、塩基の保護基はいくつかの要件を満たす必要がある。保護基は、複素環部分に容易に導入でき、導入後、サブユニットの活性化、精製条件、固相合成に対して安定である必要がある。保護基は、成長する鎖のモルフォリノアミン部分と反応性であってはならず、活性化モルフォリノサブユニットが成長するオリゴマー鎖ときれいにカップリングできる必要がある。保護基は、新たな不純物を導入することなく、好ましくはアンモニアで、切断されなければならない。最後に、活性化の前にクロマトグラフィーによる精製を必要としないように、結晶性のサブユニット誘導体に至る必要がある。
モルフォリノ化学に特有の課題として、塩基の保護基はいくつかの要件を満たす必要がある。保護基は、複素環部分に容易に導入でき、導入後、サブユニットの活性化、精製条件、固相合成に対して安定である必要がある。保護基は、成長する鎖のモルフォリノアミン部分と反応性であってはならず、活性化モルフォリノサブユニットが成長するオリゴマー鎖ときれいにカップリングできる必要がある。保護基は、新たな不純物を導入することなく、好ましくはアンモニアで、切断されなければならない。最後に、活性化の前にクロマトグラフィーによる精製を必要としないように、結晶性のサブユニット誘導体に至る必要がある。
【0007】
米国特許出願公開第２００９／０１３１６２４号に記載されているように、Ｏ６－位の４－ニトロフェネチル（ＮＰＥ）基は、これらの基準を十分に満たしていない。ＮＰＥ基は、アルカリ試薬によりβ－エリミネーション機構により切断される。これらの条件では、反応性の副産物である４－ニトロスチレンを生成しやすく、この化合物はオリゴマーの反応部位と反応できる。オリゴマーによる副生成物の捕捉を防ぐために、脱保護混合物に様々な捕捉剤（チオールや１，３－ジカルボニル化合物等）を導入したが、この内部回帰の問題を完全に解決するものはなかった。精製後であっても、このサブユニットを使用して調製したオリゴマーは、黄色味を帯びていた。様々な実施形態において、本開示は、これらの問題の１つ又は複数を解決するのに有用な方法及び過程を提供する。
【0008】
１つの態様において、本開示は、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（「ＰＭＯ」）等のオリゴヌクレオチドを調製するための方法を提供する。
【0009】
更なる態様において、本開示は、固相支持されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴヌクレオチドの調製に有用な方法及び組成物を提供する。
【0010】
本明細書に記載されたＰＭＯの合成方法は、多くの側面において有利であり、例えば、目的のホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーの収率及び純度の向上、及び４－ニトロスチレン付加物の不純物の低減が挙げられるが、これらに限らない。
【0011】
本開示のこれら及び他の目的及び特徴は、以下の本開示の詳細な説明を読めば、より完全に明らかとなる。
【0012】
［開示の詳細な説明］
オリゴヌクレオチド合成の例示的方法
本開示は、
（ａ）式Ｘ－１の化合物を式Ｘ－２の化合物に変換するステップ：
（式中、
Ｒ１０は、出発オリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー）の残基であり；
Ｒ１１は、アミン保護基であり；
好ましくは、式Ｘ－１の化合物は、固体支持体に結合していない。）と
（ｂ）任意選択で式Ｘ－２の化合物中の保護基を除去して、オリゴヌクレオチドを得るステップと
を含む、オリゴヌクレオチドを調製するための方法を提供する。
オリゴヌクレオチド合成の例示的方法
本開示は、
（ａ）式Ｘ－１の化合物を式Ｘ－２の化合物に変換するステップ：
【化1】
（式中、
Ｒ１０は、出発オリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー）の残基であり；
Ｒ１１は、アミン保護基であり；
好ましくは、式Ｘ－１の化合物は、固体支持体に結合していない。）と
（ｂ）任意選択で式Ｘ－２の化合物中の保護基を除去して、オリゴヌクレオチドを得るステップと
を含む、オリゴヌクレオチドを調製するための方法を提供する。
【0013】
式Ｘ－１及びＸ－２において、Ｒ１０は、同じ又は異なってもよく、それは式Ｘ－１における出発オリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー）の残基が、ＮＰＥ基が除去される条件下で変化するかどうかに依存することは、当業者には明らかである。例えば、いくつかの実施形態において、式Ｘ－１で示されるＮＰＥ基以外、他の保護基が脱保護されないならば、Ｒ１０は式Ｘ－１とＸ－２で同じであり得る。いくつかの実施形態において、式Ｘ－２中のＲ１０は、式Ｘ－１中のＲ１０の脱保護バージョンを表し得る。
【0014】
オリゴヌクレオチド（及び出発オリゴヌクレオチド）は、特に限定されない。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーである。通常、オリゴヌクレオチドは、標的核酸に配列特異的に結合するためのターゲティング塩基配列を含む。標的配列とターゲティング配列は、逆平行な配置でハイブリダイゼーションが起こる場合、互いに「相補的」であると説明される。ターゲティング配列は、標的配列に対して、「近い」又は「実質的な」相補性を有していてもよく、ここで記載されている方法の目的のために依然として機能する、すなわち、依然として「相補的」であってよい。好ましくは、ここで記載されている方法で採用されるオリゴヌクレオチド類似化合物は、１０ヌクレオチドごとに標的配列とのミスマッチが最大１個、好ましくは２０ヌクレオチドごとにミスマッチが最大１個である。或いは、採用されるアンチセンスオリゴマーは、本明細書で指定される例示的なターゲティング配列と、少なくとも８０％の配列相同性、少なくとも９０％の配列相同性、又は少なくとも９５％の配列相同性を有する。ＲＮＡ標的への相補的結合のため、及び以下に議論されるように、グアニン塩基はシトシン又はウラシルＲＮＡ塩基のいずれかと相補的であってよい。
【0015】
Ｒ１１として、様々なアミン保護基を使用できる。通常、Ｒ１１は、ＮＨ３で処理することによって除去できるアミン保護基である。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、アシル基、すなわち、ＲＢ－Ｃ（＝Ｏ）－であり、ここで、ＲＢは、例えば、水素、アルキル、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリールであってよく、それらのそれぞれが置換されていてもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、－Ｃ（＝Ｏ）－ＲＢであり、ここでＲＢは、置換されていてもよいＣ１～６のアルキル、例えば，Ｃ１～６のアルキル（例えば、イソプロピル）、アリール置換されたＣ１～６アルキル（例えば、ベンジル）、又はアリールオキシ置換されたＣ１～６アルキルである。いくつかの特定の実施形態において、Ｒ１１は、－Ｃ（＝Ｏ）－ＲＢであってよく、ここでＲＢは、Ｃ１～６アルキル（例えば、イソプロピル）、アリール（例えば、フェニル）又はアリール置換されたＣ１～６アルキル（例えば、ベンジル）で、好ましくはＲＢは、イソプロピルである。
【0016】
いくつかの好ましい実施形態において、式Ｘ－１の化合物は、固体支持体に結合していない。理論に縛られることは望まないが、固体支持体に結合することなく、式Ｘ－１のＮＰＥ基の脱保護を制御でき、それによって４－ニトロスチレン副生成物が式Ｘ－２の化合物よりも反応媒体中で捕捉剤と優先的に反応できると考えられる。しかしながら、いくつかの実施形態においては、式Ｘ－１の化合物は固体支持体に結合してもよく、例えば、過剰量の捕捉剤を加えることによって反応を制御でき、それによって、４－ニトロスチレン副生成物が式Ｘ－２の化合物よりも反応媒体中で捕捉剤と優先的に反応できる。
【0017】
式Ｘ－１の化合物を式Ｘ－２の化合物に変換する際の条件は、特に限定されない。しかしながら、いくつかの好ましい実施形態において、変換するステップは、式Ｘ－１の化合物を、好ましくは溶液中で、アルカリ試薬（例えば、本明細書に記載）及び式Ｘ－３の化合物と反応できる捕捉剤を含む混合物に加えることを含む。
【化2】
【0018】
アルカリ試薬は、通常、塩基性有機アミンである。例えば、いくつかの実施形態において、アルカリ試薬は、水中でのｐＫａが約９以上、例えば、約９～１５、約１０～１４、約１２、約１３、又は約１４、である塩基性有機アミンである。いくつかの実施形態において、アルカリ試薬は、塩基性環状アミンである。いくつかの実施形態において、アルカリ試薬は、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（「ＤＢＵ」）又は１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ－５－エン（「ＤＢＮ」）である。
【0019】
アルカリ試薬は、通常、過剰に添加され、例えば、式Ｘ－１の化合物のＮＰＥ基（複数可）に対するアルカリ試薬のモル比は、通常、１：１を超え、例えば１．２：１、１．５：１、２：１、５：１若しくは１０：１、又は列挙された値の間の任意の範囲、例えば１：１～１０：１である。
【0020】
捕捉剤は、式Ｘ－３の副生成物と反応できるものであれば、特に限定されない。通常、捕捉剤は－ＳＨ又は１，３－ジカルボニル部分を有する。いくつかの実施形態において、捕捉剤は、式Ｘ－４の化合物であってよい：
（式中：
ｑは０、１、又は２であり、
ＲＡは、存在ごとに、独立的に置換されていてもよいＣ１～６アルキル（例えば、メチル）である。）。
【化3】
（式中：
ｑは０、１、又は２であり、
ＲＡは、存在ごとに、独立的に置換されていてもよいＣ１～６アルキル（例えば、メチル）である。）。
【0021】
いくつかの実施形態において、ｑは０である。いくつかの実施形態において、ｑは１であり、ＲＡは、置換されていてもよいＣ１～６アルキル、例えばメチルである。式Ｘ－４の化合物が式Ｘ－３の化合物の捕捉剤として作用できるのであれば、ＲＡは利用可能ないずれの位置にも付着できる。いくつかの特定の実施形態において、捕捉剤はチミン又はその誘導体である。いくつかの特定の実施形態において、捕捉剤はチミンである。
【0022】
捕捉剤も、通常、過剰に使用される。例えば、式Ｘ－１の化合物のＮＰＥ基（複数可）に対する捕捉剤のモル比は、通常、１：１を超え、例えば１．２：１、１．５：１、２：１、５：１、１０：１、又は列挙された値の間の任意の範囲、例えば１：１～１０：１である。式Ｘ－１の化合物が４－ニトロスチレンと反応できる塩基を１個又は複数個有する場合、捕捉剤の量を、例えば、式Ｘ－１の化合物のＮＰＥ基（複数可）に対して５０：１（又はそれを超える）まで更に増やすことができる。
【0023】
式Ｘ－１から式Ｘ－２への変換は、通常、１種又は複数種の溶媒を使用する。様々な溶媒が適合する。有用な溶媒は、本明細書に記載されるもののいずれかを非限定的に含む。例えば、いくつかの実施形態において、溶媒は、非プロトン性極性溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＡ、ＤＭＩ、ＮＭＰ等であってよい。いくつかの好ましい実施形態において、溶媒はＮＭＰであってよい。
【0024】
いくつかの実施形態において、式Ｘ－１の化合物のアルカリ試薬と捕捉剤の混合物への添加は、オリゴヌクレオチドに対するＮＰＥ付加物の量が最小になるように、例えば、１０％未満、例えば５％未満となるように、制御できる。
【0025】
いくつかの実施形態において、本方法は、式Ｘ－２の化合物をＮＨ３で処理して、式Ｘ－２の保護基を部分的又は完全に除去することを更に含む。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、Ｃ１～６アルキル－Ｃ（＝Ｏ）－であり、ＮＨ３で処理すると、Ｒ１１基が除去されて脱保護された塩基Ｇが生成する。
【0026】
式Ｘ－１の化合物を式Ｘ－２に変換する例示的な手順は、本明細書に記載してあり、その記載から当業者は本開示の実施形態に容易に適合させることができる。
【0027】
ＰＭＯ合成の例示的方法
いくつかの特定の実施形態において、本開示は、ＰＭＯを調製するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、
（ａ）式Ｘ－５の化合物を式Ｘ－６の化合物に変換するステップ：
（式中：
ｍ１及びｍ２は、独立的に０～５０の整数（例えば、０～３０）であり；
Ｒ１１は、アミン保護基であり；
Ｂａｓｅは、存在ごとに、独立的に、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、及びＴ（チミン）、それらの修飾類似物、及びそれらの保護された誘導体より選択される塩基であり、ただし式Ｘ－５におけるＢａｓｅが保護された塩基である場合、式Ｘ－６の対応するＢａｓｅは同じ保護された塩基又は対応する部分的若しくは完全に脱保護された塩基であってよく；
式中：
Ｔ１は適当な５’末端基（例えば、短いペプチド、置換されていてもよいアルキルアミノ基、置換されていてもよい複素環基等）であり；及び
Ｔ２は適当な３’末端基、例えば水素又は保護基（例えば、アシル基、トリチル等）である。）と；
（ｂ）式Ｘ－６の化合物中の保護基を任意選択で部分的又は完全に除去して、オリゴヌクレオチドを得るステップと
を含む。
いくつかの特定の実施形態において、本開示は、ＰＭＯを調製するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、
（ａ）式Ｘ－５の化合物を式Ｘ－６の化合物に変換するステップ：
【化4】
（式中：
ｍ１及びｍ２は、独立的に０～５０の整数（例えば、０～３０）であり；
Ｒ１１は、アミン保護基であり；
Ｂａｓｅは、存在ごとに、独立的に、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、及びＴ（チミン）、それらの修飾類似物、及びそれらの保護された誘導体より選択される塩基であり、ただし式Ｘ－５におけるＢａｓｅが保護された塩基である場合、式Ｘ－６の対応するＢａｓｅは同じ保護された塩基又は対応する部分的若しくは完全に脱保護された塩基であってよく；
式中：
Ｔ１は適当な５’末端基（例えば、短いペプチド、置換されていてもよいアルキルアミノ基、置換されていてもよい複素環基等）であり；及び
Ｔ２は適当な３’末端基、例えば水素又は保護基（例えば、アシル基、トリチル等）である。）と；
（ｂ）式Ｘ－６の化合物中の保護基を任意選択で部分的又は完全に除去して、オリゴヌクレオチドを得るステップと
を含む。
【0028】
式Ｘ－５又はＸ－６のオリゴヌクレオチドは、配列の様々な位置に様々な数のＧモノマーを有し得る。いくつかの実施形態において、ｍ１は０である。いくつかの実施形態において、ｍ２は０である。いくつかの実施形態において、ｍ１もｍ２も０でない。いくつかの実施形態において、ｍ１とｍ２との合計は、５～５０の間、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は列挙された値の間の任意の範囲、例えば１０～４０、１５～３０である。
【0029】
式Ｘ－５又はＸ－６におけるＢａｓｅは、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、及びＴ（チミン）、それらの修飾類似物、及びそれらの保護された誘導体より独立的に選択できる。本明細書で使用される修飾類似物としては、非標準的な塩基、例えば５－メチルシトシン、イノシン（Ｉ）、及び７－デアザ－Ｇ塩基が挙げられる。いくつかの実施形態において、式Ｘ－５又はＸ－６におけるＢａｓｅは、以下から独立的に選択できる。
【化5】
【0030】
いくつかの実施形態において、式Ｘ－５におけるＢａｓｅがＧモノマー単位である場合、それはＮＰＥＧであってよい：
（式中、Ｒ１１は、本明細書において定義されている。いくつかの実施形態において、式Ｘ－５のＧモノマー単位のすべてが、ＮＰＥＧであってよい。）。
【化6】
（式中、Ｒ１１は、本明細書において定義されている。いくつかの実施形態において、式Ｘ－５のＧモノマー単位のすべてが、ＮＰＥＧであってよい。）。
【0031】
オリゴヌクレオチド、例えばＰＭＯは、５’末端や３’末端に様々な末端を持つことができる。本明細書に記載された合成方法では、このような末端の正確な識別は重要ではなく、ＰＭＯに適した既知の末端のいずれかを含み得る。
【0032】
いくつかの実施形態において、式Ｘ－５又は式Ｘ－６におけるＴ１は、置換されていてもよいアルキルアミン、例えば、－Ｎ（Ｃ１～６アルキル）（Ｃ１～６アルキル）であって、この場合、２つのＣ１～６アルキルは同じ又は異なっていてよく、これらのそれぞれは例えばアミドにより置換されていてもよい。いくつかの実施形態において、式Ｘ－５又はＸ－６におけるＴ１は、アミド（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）で置換されたアルキルアミン、例えば、
であってよい。
【化7】
であってよい。
【0033】
いくつかの実施形態において、式Ｘ－５又はＸ－６におけるＴ１は、置換されていてもよい複素環、例えば、Ｎ、Ｏ、及びＳから独立的に選択される１個又は２個の環ヘテロ原子を有する、置換されていてもよい４～７員複素環、例えば置換されていてもよいピペリジン環等、例えば、
（式中、ＲＣは、アシル基、アシルオキシ基、又はペプチド残基である。）
であってよい。
【化8】
（式中、ＲＣは、アシル基、アシルオキシ基、又はペプチド残基である。）
であってよい。
【0034】
いくつかの実施形態において、式Ｘ－５又はＸ－６におけるＴ２は、水素であってよい。
【0035】
いくつかの実施形態において、式Ｘ－５又はＸ－６におけるＴ２は、トリチル基又はメトキシ基置換されたトリチル基（例えば、ＭＭＴ、ＤＭＴ等）であってよい。
【0036】
いくつかの実施形態において、式Ｘ－５又はＸ－６におけるＴ２は、アシル基（例えば、アセチル）であってよい。
【0037】
式Ｘ－５又はＸ－６のＰＭＯは、任意の配列を有してもよく、標的核酸に配列特異的に結合するためのターゲティング塩基配列を好ましくは含む。
【0038】
式Ｘ－５又はＸ－６におけるＲ１１としては、種々のアミン保護基を使用できる。通常、Ｒ１１は、ＮＨ３で処理することによって除去できるアミン保護基である。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、アシル基、すなわち、ＲＢ－Ｃ（＝Ｏ）－であり、ここで、ＲＢは、例えば、水素、アルキル、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリールであってよく、それらのそれぞれが置換されていてもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、－Ｃ（＝Ｏ）－ＲＢであり、ここでＲＢは、置換されていてもよいＣ１～６のアルキル、例えば、Ｃ１～６アルキル（例えば、イソプロピル）、アリールで置換されたＣ１～６アルキル（例えば、ベンジル）、又はアリールオキシで置換されたＣ１～６アルキルである。いくつかの特定の実施形態において、Ｒ１１は、－Ｃ（＝Ｏ）－ＲＢであってよく、ここでＲＢは、Ｃ１～６アルキル（例えば、イソプロピル）、アリール（例えば、フェニル）又はアリールで置換されたＣ１～６アルキル（例えば、ベンジル）であり、好ましくは、ＲＢは、イソプロピルである。
【0039】
いくつかの好ましい実施形態において、式Ｘ－５の化合物は、固体支持体に結合していない。
【0040】
式Ｘ－５の化合物を式Ｘ－６の化合物に変換する際の条件は特に限定されない。しかしながら、いくつかの好ましい実施形態において、変換するステップは、好ましくは溶液中の式Ｘ－５の化合物を、アルカリ試薬（例えば、本明細書に記載されている）及び式Ｘ－３の化合物と反応できる捕捉剤を含む混合物に添加することを含む：
【化9】
【0041】
アルカリ試薬は、通常、塩基性有機アミンである。例えば、いくつかの実施形態において、アルカリ試薬は、水中でのｐＫａが約９以上、例えば約９～１５、約１０～１４、約１２、約１３、又は約１４の塩基性有機アミンである。いくつかの実施形態において、アルカリ試薬は、塩基性環状アミンである。いくつかの実施形態において、アルカリ試薬は、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（「ＤＢＵ」）又は１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ－５－エン（「ＤＢＮ」）である。アルカリ試薬は、通常、過剰に添加され、例えば、式Ｘ－５の化合物のＮＰＥ基（複数可）に対するアルカリ試薬のモル比は、通常、１：１を超え、例えば１．２：１、１．５：１、２：１、５：１、１０：１、又は列挙された値の間の任意の範囲、例えば１：１～１０：１である。
【0042】
捕捉剤は、式Ｘ－３の副生成物と反応できるものであれば、特に限定されない。通常、捕捉剤は－ＳＨ部分又は１，３－ジカルボニル部分を有する。いくつかの実施形態において、捕捉剤は、式Ｘ－４の化合物であってよい：
（式中：
ｑは０、１、又は２であり、
ＲＡは、存在ごとに、独立的に置換されていてもよいＣ１～６アルキル（例えば、メチル）である）。
【化10】
（式中：
ｑは０、１、又は２であり、
ＲＡは、存在ごとに、独立的に置換されていてもよいＣ１～６アルキル（例えば、メチル）である）。
【0043】
いくつかの実施形態において、ｑは０である。いくつかの実施形態において、ｑは１であり、ＲＡは、置換されていてもよいＣ１～６アルキル、例えばメチルである。式Ｘ－４の化合物が式Ｘ－３の化合物の捕捉剤として作用できるのであれば、ＲＡは利用可能ないずれの位置にも付着できる。いくつかの特定の実施形態において、捕捉剤はチミン又はその誘導体である。いくつかの特定の実施形態において、捕捉剤はチミンである。
【0044】
通常、捕捉剤も過剰に使用される。例えば、式Ｘ－５の化合物のＮＰＥ基（複数可）に対する捕捉剤のモル比は、通常、１：１を超え、例えば１．２：１、１．５：１、２：１、５：１、１０：１、又は列挙された値の間の任意の範囲、例えば１：１～１０：１である。式Ｘ－５の化合物が４－ニトロスチレンと反応できる１個又は複数個の塩基を有する場合、捕捉剤の量は、例えば、式Ｘ－５の化合物のＮＰＥ基（複数可）に対して５０：１（又はそれを超える）まで更に増やすことができる。
【0045】
式Ｘ－５から式Ｘ－６への変換は、通常、１種又は複数種の溶媒を使用する。様々な溶媒が適合する。有用な溶媒は、本明細書に記載されるもののいずれかを非限定的に含む。例えば、いくつかの実施形態において、溶媒は、非プロトン性極性溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＡ、ＤＭＩ、ＮＭＰ等であってよい。いくつかの好ましい実施形態において、溶媒はＮＭＰであってよい。
【0046】
いくつかの実施形態において、式Ｘ－５の化合物のアルカリ試薬と捕捉剤の混合物への添加は、オリゴヌクレオチドへのＮＰＥ付加物の量が最小になるように、例えば、１０％未満、例えば５％未満となるように、制御できる。
【0047】
いくつかの実施形態において、本方法は、式Ｘ－６の化合物をＮＨ３で処理して、式Ｘ－６の保護基を部分的又は完全に除去することを更に含む。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、Ｃ１～６アルキル－Ｃ（＝Ｏ）－であり、ＮＨ３で処理すると、Ｒ１１基が除去されて脱保護された塩基Ｇが生成する。
【0048】
式Ｘ－５の化合物は、本開示の観点から、当業者によって容易に調製できる。例えば、いくつかの実施形態において、式Ｘ－５の化合物は、式Ｘ－７のオリゴヌクレオチドから固体支持体を、例えば、ＮＨ３で切断することを含む方法によって調製できる：
（式中：
ＳＳは固相支持体、例えばポリスチレン固体支持体であり、
Ｌ１はリンカー、例えばサルコシン系リンカー、例えば、
（式中、窒素末端はリン原子に結合し、カルボニル末端は固体支持体とアミド結合を形成している。）であり；
式Ｘ－７におけるｍ１、ｍ２、Ｒ１１は、式Ｘ－５中の対応する基と同じであり、
Ｂａｓｅは、存在ごとに、独立的に、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、及びＴ（チミン）、それらの類似体、及びそれらの保護された誘導体より選択される塩基であり、ただし式Ｘ－７におけるＢａｓｅが保護された塩基である場合、式Ｘ－５における対応する塩基は同じ保護された塩基又は対応する部分的又は完全に脱保護された塩基であってよく；及び
Ｔ２は適当な３’末端基、例えば水素又は保護基（例えば、アシル基、トリチル）である。）。
【化11】
（式中：
ＳＳは固相支持体、例えばポリスチレン固体支持体であり、
Ｌ１はリンカー、例えばサルコシン系リンカー、例えば、
【化12】
（式中、窒素末端はリン原子に結合し、カルボニル末端は固体支持体とアミド結合を形成している。）であり；
式Ｘ－７におけるｍ１、ｍ２、Ｒ１１は、式Ｘ－５中の対応する基と同じであり、
Ｂａｓｅは、存在ごとに、独立的に、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、及びＴ（チミン）、それらの類似体、及びそれらの保護された誘導体より選択される塩基であり、ただし式Ｘ－７におけるＢａｓｅが保護された塩基である場合、式Ｘ－５における対応する塩基は同じ保護された塩基又は対応する部分的又は完全に脱保護された塩基であってよく；及び
Ｔ２は適当な３’末端基、例えば水素又は保護基（例えば、アシル基、トリチル）である。）。
【0049】
いくつかの実施形態において、ＳＳは、固体支持体、例えばポリスチレン固体支持体であって、－ＣＨ２－ＮＨ２基を有し、代替的にＳＳ－ＣＨ２－ＮＨ２とされる。
【0050】
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、サルコシン系のリンカー、例えば
（式中、窒素末端がリン原子に結合し、カルボニル末端が固体支持体とアミド結合を形成している。）である。
【化13】
（式中、窒素末端がリン原子に結合し、カルボニル末端が固体支持体とアミド結合を形成している。）である。
【0051】
いくつかの実施形態において、式Ｘ－７におけるＢａｓｅは、以下から独立的に選択できる。
【化14】
【0052】
いくつかの実施形態において、式Ｘ－７におけるＴ２は、水素であってよい。
【0053】
いくつかの実施形態において、式Ｘ－７におけるＴ２は、トリチル、又はメトキシで置換されたトリチル基（例えば、ＭＭＴ、ＤＭＴ等）であってよい。
【0054】
いくつかの実施形態において、式Ｘ－７におけるＴ２は、アシル基（例えば、アセチル）であってよい。
【0055】
式Ｘ－７の化合物は、本開示の観点から、当業者が調製できる。例示された手順は、本明細書の実施例の項にも記載されている。
【0056】
式Ｘ－５の化合物を式Ｘ－６に変換する例示された手順は、本明細書に記載してあり、その記載から当業者は本開示の実施形態に容易に適合させることができる。
【0057】
本明細書で定義されている、式Ｘ－５、Ｘ－６、又はＸ－７の化合物も、本開示の新規組成物であることに留意されたい。加えて、本明細書に記載の方法によって製造されるオリゴヌクレオチドのいずれもが、本開示の新規組成物でもある。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の方法によって製造されたオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を更に提供する。
【0058】
更なる態様において、塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーから４－ニトロフェネチル（ＮＰＥ）基を脱保護する方法であって、アルカリ試薬及び捕捉剤、例えば１、３－ジカルボニル部分を有するものの存在下で、塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーを処理することを含む方法が提供される。ＰＭＯは、標的核酸に配列特異的に結合するためのターゲティング塩基配列を好ましくは含んでいる。
【0059】
本開示のいくつかの実施形態において、本方法は、塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーを、アルカリ試薬及び捕捉剤の混合物中に添加することを含む。
【0060】
本開示のいくつかの実施形態において、塩基によって保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーは、例えば、本開示に記載されるような式Ｘ－５の化合物である。
【0061】
ＮＰＥ基を脱保護するためのアルカリ試薬は、特に限定されるものではない。しかし、このようなアルカリ試薬は、例えば、ＰＭＯの主鎖に対して大きな反応性を持たない。アルカリ試薬は、通常、保護された塩基、例えば保護されたグアニンからＮＰＥ基を除去するのに適したｐＫａを有する。本開示において、アルカリ試薬は、有機アルカリ試薬、例えば、水中で約９以上、例えば約９～１５、約１０～１４、約１２、約１３、又は約１４等のｐＫａを有する塩基性有機アミンであってよい。いくつかの実施形態において、アルカリ試薬は、塩基性環状アミン、例えばＤＢＵ（１，８－ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ－７－エン）、ＤＢＮ（１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ－５－エン）、ＤＡＢＣＯ（１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン）又はそれらの混合物、例えば、ＤＢＵである。
【0062】
本明細書の方法で使用する捕捉剤は、ＮＰＥ基（複数可）の脱保護によって生成する４－ニトロスチレンと反応できる当技術分野で公知のもののいずれかが挙げられる。いくつかの実施形態において、捕捉剤は、例えば、本明細書に記載されるような－ＳＨ基又は１，３－ジカルボニル部分を有してもよい（例えば、本開示に記載されるような式Ｘ－４の化合物）。本開示のいくつかの好ましい実施形態において、捕捉剤は、１，３－ジカルボニル化合物、例えば、チミン、マロン酸ジエチル又はそれらの混合物、例えば、チミンであってよい。
【0063】
一つの実施形態において、塩基によって保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー中のＮＰＥ基（複数可）に対するアルカリ試薬のモル比は、１：１より大きく、例えば１：１～１０：１、１．２～１０：１又は１．５：１～１０：１であってよい。一つの実施形態において、アルカリ試薬の量は、ＮＰＥ基（複数可）に対して過剰である。
【0064】
一つの実施形態において、捕捉剤は、通常、過剰に使用されることもある。例えば、塩基によって保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーにおけるＮＰＥ基（複数可）に対する捕捉剤のモル比は、通常、１：１を超え、例えば１．２：１、１．５：１、２：１、５：１、１０：１、又は列挙された値の間の任意の範囲、例えば１：１～１０：１である。塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーが４－ニトロスチレンと反応できる１個又は複数個の塩基を有する場合、捕捉剤の量は、例えば、塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーのＮＰＥ基（複数可）に対して５０：１まで（又はそれを超える）更に増やすことができる。
【0065】
本開示において、ＮＰＥ基を脱保護する過程は、溶媒の存在下で行ってよい。溶媒は、ＮＰＥ基を脱保護するために当技術分野で使用される任意の溶媒であってよい。本開示において、溶媒は、極性非プロトン性溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＡ、ＤＭＩ、ＮＭＰ等より選択できる。
【0066】
本開示のいくつかの実施形態において、塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーからＮＰＥ基を脱保護する過程は、第１の溶媒中の塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーの混合物を、第２の溶媒中のアルカリ試薬及び捕捉剤の混合物に添加することを含む。第１の溶媒と第２の溶媒は、同じでも異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、第１及び第２の溶媒は、極性非プロトン性溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＡ、ＤＭＩ、ＮＭＰ等より選択されてよい。第１の溶媒中の塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーの混合物において、塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーの濃度は、０．００１Ｍ～０．１Ｍ、例えば０．０１Ｍ～０．０２Ｍであってよい。第２の溶媒中のアルカリ試薬と捕捉剤の混合物において、アルカリ試薬の濃度は、０．１Ｍ～５Ｍ、例えば０．５Ｍ～１．０Ｍであり得；捕捉剤の濃度は、０．１Ｍ～５Ｍ、例えば０．５Ｍ～１．５Ｍ、例えば、０．８Ｍであり得る。
【0067】
本開示のいくつかの実施形態において、塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーからＮＰＥ基を脱保護する過程は、第１の溶媒中の塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーの混合物を、第２の溶媒中のアルカリ試薬及び捕捉剤の混合物に添加することを含む。第１の溶媒と第２の溶媒は、同じでも異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、第１及び第２の溶媒は、極性非プロトン性溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＡ、ＤＭＩ、ＮＭＰ等より選択されてよい。第１の溶媒中の塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーの混合物において、塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーの濃度は、０．００１Ｍ～０．１Ｍ、例えば０．０１Ｍ～０．０２Ｍであり得る。第２の溶媒中のアルカリ試薬及び捕捉剤の混合物において、アルカリ試薬の濃度は、０．１Ｍ～５Ｍ、例えば、０．５Ｍ～１．０Ｍであり得；及び捕捉剤の濃度は、０．１Ｍ～５Ｍ、例えば、０．５Ｍ～１．５Ｍ、例えば０．８Ｍであり得る。一つの実施形態において、添加の速度は、１～１０ｍＬ／分、例えば、２ｍＬ／分、３ｍＬ／分、４ｍＬ／分、５ｍＬ／分、６ｍＬ／分、７ｍＬ／分、８ｍＬ／分又は９ｍＬ／分であってよい。
【0068】
いくつかの実施形態において、本開示は、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーを調製するための方法を提供し、これは、本明細書の上記に記載されるように、塩基によって保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーからＮＰＥ基（複数可）を脱保護する過程を含む。
【0069】
本明細書におけるオリゴマーの合成は、一般に、本明細書に記載するように、支持体－媒体上で実施される。一般的には、第一の出発原料（例えば、モノマー、例えばモルフォリノサブユニット）を支持媒体に最初に結合させた後、支持体に結合した出発原料にサブユニットを順次カップリングさせることによりオリゴマーを合成する。この反復伸長により、最終的なオリゴマー化合物を生成する。適切な支持媒体は、可溶性でも不溶性でもよく、伸長する支持体に結合したポリマーを所望に応じて溶液中又は溶液外にできるように、異なる溶媒に対して様々な溶解度を有してもよい。従来の支持媒体は、ほとんどの場合不溶性であり、一般的に反応容器に入れられ、オリゴマーが目的の長さになるまで、試薬や溶媒が成長する鎖と反応しながら及び／又は成長する鎖を洗浄しながら、目的の長さになった後は支持体から切断され、必要なら更に加工して、最終的な高分子化合物を生成する。最近のアプローチでは、可溶性高分子支持体を含有する可溶性支持体を導入し、合成の任意の時点で、繰り返し合成される生成物を沈殿、溶解させることができるようになった。
【0070】
特定の実施形態において、モルフォリノは、その安定性及び／又は溶解性を高めるために、オリゴマーの５’又は３’末端で「テール」部分とコンジュゲートされる。例示的なテールとしては、短いペプチド、置換されていてもよいアルキルアミノ基、置換されていてもよい複素環基等、アシル基、トリチル等が挙げられる。一つの実施形態において、好適な５’末端基は、例えば、短いペプチド、置換されていてもよいアルキルアミノ基、置換されていてもよい複素環基等（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）で置換されたアルキルアミン、例えば、
である。別の実施形態において、好適な３’末端基は、例えば、水素又は保護基（例えば、アシル基、トリチル等）である。
【化15】
である。別の実施形態において、好適な３’末端基は、例えば、水素又は保護基（例えば、アシル基、トリチル等）である。
【0071】
いくつかの実施形態において、本開示は、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーを調製するための方法であって、
（ａ）保護されていない環窒素を有する、固相に支持されたモルフォリノサブユニットと、保護された環窒素及び５’－環外炭素上の活性化ホスホルアミデート基を有する、塩基が保護されたモルフォリノサブユニットモノマーとを反応させ、
それによって、５’－環外炭素と保護されていない窒素との間にホスホロジアミデート結合を形成するステップ；
（ｂ）保護された窒素を脱保護し、保護されていない窒素を形成するステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）を別の塩基が保護されたモルフォリノサブユニットモノマーで１回又は複数回繰り返して、塩基が保護されたモルフォリノ修飾固体支持体を得るステップ；及び
（ｄ）切断及び脱保護の３段階を実施して、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーを得るステップであって；切断及び脱保護の３段階は、上記のように塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーからＮＰＥ基を脱保護する過程を含むステップ；
を含み、
ここで、塩基が保護されたモルフォリノサブユニットモノマーの少なくとも１個は、（Ｍ）の構造を有する保護されたグアニンモルフォリノ化合物である：
（式中、Ｒ１は、クロロホスホルアミデート基であり；
Ｒ２は、低級アルキル、単環のアリールメチル基、又は単環の（アリールオキシ）メチルであり；
Ｒ３は、トリアリールメチル基である）。
（ａ）保護されていない環窒素を有する、固相に支持されたモルフォリノサブユニットと、保護された環窒素及び５’－環外炭素上の活性化ホスホルアミデート基を有する、塩基が保護されたモルフォリノサブユニットモノマーとを反応させ、
それによって、５’－環外炭素と保護されていない窒素との間にホスホロジアミデート結合を形成するステップ；
（ｂ）保護された窒素を脱保護し、保護されていない窒素を形成するステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）を別の塩基が保護されたモルフォリノサブユニットモノマーで１回又は複数回繰り返して、塩基が保護されたモルフォリノ修飾固体支持体を得るステップ；及び
（ｄ）切断及び脱保護の３段階を実施して、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーを得るステップであって；切断及び脱保護の３段階は、上記のように塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーからＮＰＥ基を脱保護する過程を含むステップ；
を含み、
ここで、塩基が保護されたモルフォリノサブユニットモノマーの少なくとも１個は、（Ｍ）の構造を有する保護されたグアニンモルフォリノ化合物である：
【化16】
（式中、Ｒ１は、クロロホスホルアミデート基であり；
Ｒ２は、低級アルキル、単環のアリールメチル基、又は単環の（アリールオキシ）メチルであり；
Ｒ３は、トリアリールメチル基である）。
【0072】
モルフォリノ環窒素（Ｒ３）に対するトリアリールメチル保護基の例は、トリフェニルメチル（トリチル）、４－メチルトリチル、４，４’－ジメチルトリチル、４，４’，４”－トリメチルトリチル、モノメトキシトリチル（例えば、４－メトキシトリチル）、又はジメトキシトリチル（例えば、４，４’－ジメトキシトリチル）であってよい。
【0073】
Ｒ１は、－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）－Ｎ（ＣＨ３）２Ｃｌであってよい。
【0074】
Ｒ２は、ベンジル又は－ＣＨ（ＣＨ３）２であってよい。
【0075】
１つの態様において、式（ＩＩ）の化合物を調製するための方法であって、化合物（Ｅ）をデブロッキング剤と接触させて式（ＩＩ）の化合物を得るステップを含む方法を、本明細書で提供する：
（式中、ＳＳは支持媒体であり、Ｚ１は
であり、酸素末端はサルコシン単位に接続し、ｍは１、２、３、４又は５であり、Ｒ４はＴｒ（トリフェニルメチル）又はその誘導体、例えばＴｒ（トリフェニルメチル）、ＭＭＴｒ（ｐ－メトキシフェニルジフェニルメチル）又はＤＭＴｒ（ジ－（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル）である。好ましい実施形態において、ｍは３であり、Ｒ４は、Ｔｒ（トリフェニルメチル）である。）。
【化17】
（式中、ＳＳは支持媒体であり、Ｚ１は
【化18】
であり、酸素末端はサルコシン単位に接続し、ｍは１、２、３、４又は５であり、Ｒ４はＴｒ（トリフェニルメチル）又はその誘導体、例えばＴｒ（トリフェニルメチル）、ＭＭＴｒ（ｐ－メトキシフェニルジフェニルメチル）又はＤＭＴｒ（ジ－（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル）である。好ましい実施形態において、ｍは３であり、Ｒ４は、Ｔｒ（トリフェニルメチル）である。）。
【0076】
１つの実施形態において、式（ＩＩ）の化合物を調製するための方法は、脱ブロックされた化合物を中和剤と接触させるステップを更に含む。
【0077】
別の態様において、式（ＩＩＩ）の化合物を調製するための方法であって、式（ＩＩ）の化合物と式（Ｇ）の化合物とをカップリングして式（ＩＩＩ）の化合物を得ることを含む方法、を本明細書で提供する。
【化19】
【0078】
Ｂａｓｅは、任意に保護された核酸塩基、例えばＰＣ、Ｔ、ＰＡ、Ｐ５ｍＣ、Ｕ、Ｉ、ＰＧ、ＤＰＧ又はＮＰＥＧ；Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）及びＴ（チミン）、それらの修飾類似物、及びそれらの保護された誘導体、例えばＰＣ、Ｔ、ＰＡ、Ｐ５ｍＣ、Ｕ、Ｉ、ＰＧ、ＤＰＧ又はＮＰＥＧ等の保護されていてもよい核酸塩基より選択される。
【化20】
【0079】
ＳＳ、Ｚ１、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の定義は、本開示で説明したとおりである。
【0080】
１つの実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物を調製するための方法は、式（ＩＩ）の化合物をキャッピング剤と接触させることを更に含む。
【0081】
別の実施形態において、式（ＩＩ）の化合物は、上記で定義したような方法から得られる。
【0082】
別の態様において、式（ＩＶ）の化合物を調製するための方法であって、以下の連続的なステップを含む方法が、本明細書で提供される：
（ｉ）式（ＩＩ）の化合物を式（Ｇ）の化合物とカップリングさせて、式（ＩＩＩ）の化合物を得るステップと；
（ｉｉ）以下の順次ステップをｎ－１回反復して行うステップと；
（ｉｉ－１）直前のステップで得られた生成物を脱ブロッキング剤と接触させるステップと；
（ｉｉ－２）直前のステップで得られた化合物を式（Ｇ）の化合物とカップリングさせ、式（ＩＶ）の化合物を形成させるステップを含む；
ここで、任意選択で塩基の少なくとも１個はＮＰＥＧである；
（式中、ＳＳ、Ｚ１、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の定義は、本開示に記載のとおりであり；ｎは１０～４０の整数、例えば、ｎは２０～３０の整数、例えば２５であり。
Ｂａｓｅは、存在ごとに、独立的に、保護されていてもよい核酸塩基、例えば、ＰＣ、Ｔ、ＰＡ、Ｐ５ｍＣ、Ｕ、Ｉ、ＰＧ、ＤＰＧ又はＮＰＥＧ；Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）及びＴ（チミン）、それらの修飾類似物及びそれらの保護誘導体、例えば、保護されていてもよい核酸塩基、例えばＰＣ、Ｔ、ＰＡ、Ｐ５ｍＣ、Ｕ、Ｉ、ＰＧ、ＤＰＧ又はＮＰＥＧより選択される塩基である。）。
（ｉ）式（ＩＩ）の化合物を式（Ｇ）の化合物とカップリングさせて、式（ＩＩＩ）の化合物を得るステップと；
（ｉｉ）以下の順次ステップをｎ－１回反復して行うステップと；
（ｉｉ－１）直前のステップで得られた生成物を脱ブロッキング剤と接触させるステップと；
（ｉｉ－２）直前のステップで得られた化合物を式（Ｇ）の化合物とカップリングさせ、式（ＩＶ）の化合物を形成させるステップを含む；
【化21】
ここで、任意選択で塩基の少なくとも１個はＮＰＥＧである；
【化22】
（式中、ＳＳ、Ｚ１、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の定義は、本開示に記載のとおりであり；ｎは１０～４０の整数、例えば、ｎは２０～３０の整数、例えば２５であり。
Ｂａｓｅは、存在ごとに、独立的に、保護されていてもよい核酸塩基、例えば、ＰＣ、Ｔ、ＰＡ、Ｐ５ｍＣ、Ｕ、Ｉ、ＰＧ、ＤＰＧ又はＮＰＥＧ；Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）及びＴ（チミン）、それらの修飾類似物及びそれらの保護誘導体、例えば、保護されていてもよい核酸塩基、例えばＰＣ、Ｔ、ＰＡ、Ｐ５ｍＣ、Ｕ、Ｉ、ＰＧ、ＤＰＧ又はＮＰＥＧより選択される塩基である。）。
【0083】
一つの実施形態において、ステップ（ｉｉ－１）は、脱ブロックされた化合物を中和剤と接触させるステップを更に含む。
【0084】
別の実施形態において、ステップ（ｉｉ－２）は、直前のステップによって得られた化合物を、キャッピング剤と接触させることを更に含む。
【0085】
更に別の態様において、式（Ｖ）の化合物を調製するための方法であって、式（ＩＶ）の化合物をデブロッキング剤と接触させて式（Ｖ）の化合物を得ることを含む方法を、本明細書で提供する。
（式中、ＳＳ、Ｚ１、Ｂａｓｅ、Ｒ３及びｎの定義は、本開示に記載されている。
一つの実施形態において、式（Ｖ）の化合物を調製する方法は、脱ブロックされた化合物を中和剤と接触させるステップを更に含む。）。
【化23】
（式中、ＳＳ、Ｚ１、Ｂａｓｅ、Ｒ３及びｎの定義は、本開示に記載されている。
一つの実施形態において、式（Ｖ）の化合物を調製する方法は、脱ブロックされた化合物を中和剤と接触させるステップを更に含む。）。
【0086】
更に別の態様では、式（ＶＩ）の化合物を調製するための方法であって、式（Ｖ）の化合物を切断剤と接触させ、式（ＶＩ）の化合物を得ることを含む方法を提供する；
（式中、ＳＳ、Ｚ１、Ｂａｓｅ、Ｒ３及びｎの定義は、本開示に記載されている。）。
【化24】
（式中、ＳＳ、Ｚ１、Ｂａｓｅ、Ｒ３及びｎの定義は、本開示に記載されている。）。
【0087】
別の態様において、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーを調製するための方法であって、
（ａ）式（ＶＩ）の化合物を脱保護剤と接触させるステップと；
（ｂ）任意選択で、直前のステップで得られた化合物に対してアミノリシス反応を行って、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーを得るステップと；
を含む方法を本明細書で提供する；
（式中、Ｂａｓｅ及びｎの定義は、本開示で説明したとおりである。）。
（ａ）式（ＶＩ）の化合物を脱保護剤と接触させるステップと；
（ｂ）任意選択で、直前のステップで得られた化合物に対してアミノリシス反応を行って、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーを得るステップと；
を含む方法を本明細書で提供する；
【化25】
（式中、Ｂａｓｅ及びｎの定義は、本開示で説明したとおりである。）。
【0088】
一つの実施形態において、各過程（ステップ）は、少なくとも１種の溶媒の存在下で実施される。
【0089】
別の実施形態において、中和剤は、ジクロロメタンとイソプロピルアルコールとを含む溶液中に存在する。
【0090】
更に別の実施形態において、中和剤はモノアルキルアミン、ジアルキルアミン、又はトリアルキルアミンである。
【0091】
これとは別の実施形態において、中和剤は、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである。
【0092】
好ましい実施形態において、各過程（ステップ）で使用される中和剤は、２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中５％ジイソプロピルエチルアミンである。
【0093】
別の実施形態において、式（Ｇ）の化合物は、エチルモルフォリン及びジメチルイミダゾリジノンを含む溶液中に存在する。
【0094】
更なる実施形態において、式（Ｇ）の化合物は、ＰＭＯ－ＮＰＥＧモノマー、ＰＭＯ－ＰＡモノマー、ＰＭＯ－ＰＣモノマー及びＰＭＯ－Ｔモノマーより選択される；
【化26】
【0095】
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、当技術分野で知られている連続流れモード又は非連続流れモードで実行できる。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、特注のペプチドバッチ反応装置において実行されてよい。
【0096】
更に別の態様では、化合物（Ｅ）の調製方法であって、化合物（Ｄ）を化合物（Ｓ）と接触させて化合物（Ｅ）を得ることを含む方法を、提供する；
（式中、ＳＳ、Ｚ１及びＲ４の定義は、本開示において定義されているとおりである。）。
【化27】
（式中、ＳＳ、Ｚ１及びＲ４の定義は、本開示において定義されているとおりである。）。
【0097】
化合物（Ｅ）を調製する過程において、化合物（Ｓ）は使用前に活性化する必要がある場合があり、化合物（Ｓ）の活性化は、化合物（Ｓ）を溶媒に懸濁させて膨潤させるステップと、その後、溶媒を除去して、塩素化炭化水素溶媒及び溶媒中の塩基の混合物で順次洗浄するステップとを含んでもよい。
【0098】
化合物（Ｓ）の活性化において、化合物（Ｓ）を懸濁させる溶媒は、極性非プロトン性溶媒、例えばアルカノン溶媒、例えばＮＭＰより選択できる。溶媒の量は、特に限定されない。化合物（Ｓ）に対する溶媒の体積－質量比は、１０ｍＬ／ｇ～３０ｍＬ／ｇであってよい。溶媒を除去する操作は、濾過であってよい。塩素化炭化水素溶媒は、ＤＣＭであってよい。混合物中の塩基は、有機塩基、例えばＤＩＰＥＡであってもよい。混合物中の溶媒は、アルコール溶媒（例えば、ＩＰＡ）、塩素化炭化水素溶媒（例えば、ＤＣＭ）又はそれらの組合せであってよく、より好ましくはアルコール溶媒と塩素化炭化水素溶媒の組合せ（例えば、ＩＰＡとＤＣＭの組合せ、容量比は１：１～１：５、例えば１：３であってよい）である。混合物中、塩基の質量パーセンテージは、１％～１０％、例えば、５％であってよく、％は、混合物の全質量中の塩基の質量を表す。
【0099】
化合物（Ｅ）を調製する過程は、溶媒中で行える。溶媒は、極性非プロトン性溶媒、例えば、アルカノン溶媒、アミド溶媒又はそれらの混合物、例えばＮＭＰ、ＤＭＩ、ＤＭＦ又はそれらの混合物より選択できる。溶媒の量は、特に限定されない。化合物（Ｓ）に対する溶媒の体積－質量比は、１０ｍＬ／ｇ～３０ｍＬ／ｇであってよい。
【0100】
化合物（Ｅ）の調製過程において、化合物（Ｄ）と化合物（Ｓ）のモル比は、１：１～１：３であってよい。
【0101】
化合物（Ｅ）の調製過程において、反応温度は２０～５０℃、例えば４０～４５℃であってよい。反応の進行は、当技術分野における慣用的な検出方法（例えば、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＧＣ又はＮＭＲ）を使用して監視できる。化合物（Ｄ）の消失は、一般に反応の完了と判断される。そして、反応時間は２４～４８時間であってよい。
【0102】
好ましい実施形態において、化合物（Ｅ）を調製する過程は、好ましくは、化合物（Ｄ）の溶媒溶液を化合物（Ｓ）の溶媒懸濁液に加えて、反応を行うことを含む。
【0103】
化合物（Ｅ）の調製過程において、後処理は、当技術分野において、このような反応のための慣用的な後処理であってよい。本開示において、後処理は、好ましくは、得られた混合物を濾過すること、次に濾過ケーキを溶媒（例えば、アルカノン溶媒、塩素化炭化水素溶媒又はそれらの組合せ等；アルカノン溶媒はＮＭＰであってよい；塩素化炭化水素溶媒はＤＣＭであってよい；溶媒がアルカノン溶媒と塩素化炭化水素溶媒の組合せの場合、その容量比は１：１～１：１０であってよい。）で洗浄し、次にＮＥＭ（０．２～１．０Ｍ）の溶媒（例えば、アルカノン溶媒；例えば、ＮＭＰ；化合物（Ｓ）に対する溶媒の体積－質量比は５０ｍＬ／ｇ～２００ｍＬ／ｇであってよい）溶液、及びＢｚ２Ｏ（０．２～１．０Ｍ）の溶媒（例えば、アルカノン溶媒；例えば、ＮＭＰ；化合物（Ｓ）に対する溶媒の体積－質量比は５０ｍＬ／ｇ～２００ｍＬ／ｇであってよい）溶液を順次加えて、キャッピング反応を実行し、キャッピング反応の終了後、得られた混合物を濾過して溶媒（例えば、塩素化炭化水素溶媒、ＤＣＭ；化合物（Ｓ）に対する溶媒の体積－質量比は１００ｍＬ／ｇ～３００ｍＬ／ｇであってよい。）で洗浄して、乾燥させ、化合物（Ｅ）を得る。
【0104】
本開示の好ましい実施形態において、化合物（Ｓ）はアミノメチルポリスチレン樹脂であり、これはＸｉ’ａｎ Ｌａｎｘｉａｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から入手できる。
【0105】
本開示の好ましい実施形態において、化合物（Ｅ）を調製する過程は、溶媒中、触媒、塩基及び縮合剤の存在下で、化合物（Ｃ）を化合物（ＳＭ４）と接触させて、化合物（Ｄ）を得ることを更に含んでもよい；
（式中、Ｚ１及びＲ４の定義は、本開示において定義されているとおりである。）。
化合物（Ｄ）の調製過程において、触媒は、当技術分野において、このような反応のための慣用的な触媒である。本開示において、触媒は、ＤＭＡＰであってよい。化合物（Ｃ）に対する触媒のモル比は、０．０１：１～０．５：１、例えば０．３３：１であってよい。
【化28】
（式中、Ｚ１及びＲ４の定義は、本開示において定義されているとおりである。）。
化合物（Ｄ）の調製過程において、触媒は、当技術分野において、このような反応のための慣用的な触媒である。本開示において、触媒は、ＤＭＡＰであってよい。化合物（Ｃ）に対する触媒のモル比は、０．０１：１～０．５：１、例えば０．３３：１であってよい。
【0106】
化合物（Ｄ）の調製過程において、塩基は当技術分野でこのような反応のための慣用的な塩基である。本開示において、塩基は、有機塩基、例えば、有機アミン、例えば、ＤＩＰＥＡであってよい。塩基の量は、当技術分野でこのような反応のための慣用的な量である。本開示において、化合物（Ｃ）に対する塩基のモル比は、１～３：１、例えば、２．５：１であり得る。
【0107】
化合物（Ｄ）の調製過程において、縮合剤は、当技術分野において、このような反応のための慣用的な縮合剤である。本開示において、縮合剤は、ＥＤＣＩ、ＤＣＣ、ＤＩＣ、又はそれらの混合物であってよい。縮合剤の量は、当技術分野において、このような反応のための慣用的な量である。本開示において、化合物（Ｃ）に対する縮合剤のモル比は、１：１～２：１、例えば、１．１：１であってよい。
【0108】
化合物（Ｄ）の調製過程において、化合物（Ｃ）と化合物（ＳＭ４）のモル比は、１：１～１：２、例えば、１：１．０２であり得る。
【0109】
化合物（Ｄ）の調製過程において、溶媒は当技術分野において、このような反応のための慣用的な溶媒であり得る。本開示において、溶媒は、塩素化炭化水素溶媒、例えばＤＣＭであってよい。化合物（Ｃ）に対する溶媒の体積－質量比は、１０ｍＬ／ｇ～２０ｍＬ／ｇ、例えば１０ｍＬ／ｇであってよい。
【0110】
化合物（Ｄ）の調製過程において、反応温度は２０～３０℃であってよい。反応の進行は、当技術分野における慣用的な検出方法（例えば、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＧＣ又はＮＭＲ）を使用して監視できる。化合物（Ｃ）の消失は、反応の完了と一般的に判断される。
【0111】
好ましい実施形態において、化合物（Ｄ）を調製する過程は、化合物（ＳＭ４）、触媒、塩基及び縮合剤を、溶媒中の化合物（Ｃ）の溶液に添加して反応を行うことを含む。
【0112】
化合物（Ｄ）の調製過程において、後処理は、当技術分野において、このような反応のための慣用的な後処理であってよい。本開示において、後処理は、好ましくは、反応混合物をクエン酸（例えば、１０％クエン酸溶液）及び塩水で順次洗浄したのち、有機層を濃縮して乾燥し、化合物（Ｄ）を得ることを含む。
【0113】
本開示の好ましい実施形態において、化合物（Ｅ）を調製する過程は、化合物（Ｂ）を溶媒中で化合物（ＳＭ３）と接触させて化合物（Ｃ）を得ることを含む、化合物（Ｃ）の調製過程を更に含んでよい；
（式中、ｍは１～５の整数であり、Ｒ４の定義は、本開示において定義されているとおりである。）。
【化29】
（式中、ｍは１～５の整数であり、Ｒ４の定義は、本開示において定義されているとおりである。）。
【0114】
化合物（Ｃ）の調製過程において、化合物（ＳＭ３）に対する化合物（Ｂ）のモル比は、１：１～１：２、例えば、１：２であってよい。
【0115】
化合物（Ｃ）の調製過程において、溶媒は当技術分野でのこのような反応のための慣用的な溶媒であり得る。本開示において、溶媒は、エーテル溶媒、例えばＴＨＦであってよい。化合物（Ｂ）に対する溶媒の体積－質量比は、１０～２０ｍＬ／ｇ、例えば１０ｍＬ／ｇであってよい。
【0116】
化合物（Ｃ）の調製過程において、反応温度は２０～５５℃であってよい。反応の進行は、当技術分野における慣用的な検出方法（例えば、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＧＣ又はＮＭＲ）を使用して監視できる。化合物（Ｂ）の消失は、反応の完了と一般的に判断される。
【0117】
好ましい実施形態において、化合物（Ｃ）を調製する過程は、化合物（ＳＭ３）を溶媒中で化合物（Ｂ）の溶液に添加して反応を行うことを好ましくは含む。
【0118】
化合物（Ｃ）の調製過程において、後処理は、当技術分野において、このような反応のための慣用的な後処理であってよい。本開示において、後処理は、反応混合物のｐＨをＮａＨＣＯ３水溶液（例えば、１０％ＮａＨＣＯ３水溶液）で約８．５に調整した後、エーテル溶媒（例えばＭＴＢＥ）を添加して、得られた水層のｐＨをクエン酸溶液（２０％クエン酸溶液）で３～５に調整し、その後、塩素化炭化水素溶媒（例えば、ＤＣＭ）で抽出して、Ｎａ２ＳＯ４水溶液（例えば、１０％Ｎａ２ＳＯ４水溶液）で洗浄し、得られた有機層を濃縮することにより、化合物（Ｃ）を得る。
【0119】
本開示の好ましい実施形態において、化合物（Ｅ）を調製する過程は、化合物（Ｂ）を調製する過程を更に含んでいてよく、この過程は溶媒中で化合物（Ａ）を塩基の存在下で化合物（ＳＭ２）と接触させて、化合物（Ｂ）を得ることを含む：
（式中、ｍは１～５の整数であり、Ｒ４の定義は、本開示において定義されているとおりである。）。
【化30】
（式中、ｍは１～５の整数であり、Ｒ４の定義は、本開示において定義されているとおりである。）。
【0120】
化合物（Ｂ）の調製過程において、塩基は、当技術分野でこのような反応のための慣用的な塩基である。本開示において、塩基は、金属水素化物、例えばＮａＨあってよい。化合物（ＳＭ２）に対する塩基のモル比は、０．０１：１～１：１、例えば、０．０１：１であってよい。
【0121】
化合物（Ｂ）の調製過程において、化合物（ＳＭ２）に対する化合物（Ａ）のモル比は、１：５～１：２０、例えば、１：１０であってよい。
【0122】
化合物（Ｂ）の調製過程において、溶媒は、当技術分野におけるこのような反応のための慣用的な溶媒であってよい。本開示において、溶媒は、アルカノン溶媒；例えば、ＮＭＰであってよい。溶媒の量は、特に限定されなくてもよい。化合物（Ａ）に対する溶媒の体積－質量比は、１５ｍＬ／ｇ～２５ｍＬ／ｇ、例えば２０ｍＬ／ｇであってよい。
【0123】
化合物（Ｂ）の調製過程において、反応温度は２０～３０℃であってよい。反応の進行は、当技術分野における慣用的な検出方法（例えば、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＧＣ又はＮＭＲ）を使用して監視できる。化合物（Ａ）の消失は、反応の完了と一般的に判断される。
【0124】
好ましい実施形態において、化合物（Ｂ）を調製する過程は、化合物（ＳＭ２）の溶媒溶液に塩基を撹拌下で添加した後、化合物（Ａ）を添加して反応を行うことを好ましくは含み、より好ましくは、化合物（ＳＭ２）の溶媒溶液に２０～３０℃にて塩基を添加して、得られた混合物を２０～３０℃にて１０～３０分間撹拌した後、化合物（Ａ）を添加して反応を行うことを含む。
【0125】
化合物（Ｂ）の調製過程において、後処理は、当技術分野において、このような反応のための慣用的な後処理であってよい。本開示において、後処理は、抽出のために水及び有機溶媒（例えば、塩素化炭化水素溶媒、エーテル溶媒又はそれらの混合物、好ましくはＤＣＭとＭＴＢＥとの混合溶媒）を反応混合物に添加して、得られた有機層を塩水で洗浄し、得られた有機層を濃縮して精製（例えば、シリカゲルカラム）し、化合物（Ｂ）を得ることを含む。
【0126】
本開示の好ましい実施形態において、化合物（Ｅ）を調製する過程は、化合物（Ａ）を調製する過程を更に含むことができ、この過程は、溶媒中、化合物（ＳＭ１）を塩基の存在下でＲ４Ｃｌと接触させ、化合物（Ａ）を得ることを含む；
（式中、Ｒ４は、本開示において定義されているとおりである。）。
【化31】
（式中、Ｒ４は、本開示において定義されているとおりである。）。
【0127】
化合物（Ａ）の調製過程において、塩基は当技術分野におけるこのような反応のための慣用的な塩基である。本開示において、塩基は、有機塩基、例えば、有機アミン、例えば、ＤＩＰＥＡであってよい。塩基の量は、当技術分野におけるこのような反応のために慣用的な量である。本開示において、Ｒ４Ｃｌに対する塩基のモル比は、１：１～３：１、例えば、１．５：１であってよい。
【0128】
化合物（Ａ）の調製過程において、Ｒ４Ｃｌに対する化合物（ＳＭ１）のモル比は、１：１～１：３、例えば１：２であってよい。
【0129】
化合物（Ａ）の調製過程において、溶媒は、当技術分野におけるこのような反応の慣用的な溶媒である。本開示において、溶媒は、アミド溶媒、例えば、アミド溶媒類、アルカノン溶媒類、塩素化炭化水素溶媒又はそれらの混合物、例えば、ＤＭＦ、ＤＣＭ、ＮＭＰ又はそれらの混合物より選択できる。溶媒の量は、特に限定されなくてもよい。本開示において、化合物（ＳＭ１）に対する溶媒の体積－質量比は、１０ｍＬ／ｇ～３０ｍＬ／ｇ、例えば、１０ｍＬ／ｇであってよい。
【0130】
化合物（Ａ）の調製過程において、反応温度は２０～２５℃であってよい。反応の進行は、当技術分野における慣用的な検出方法（例えば、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＧＣ又はＮＭＲ）を使用して監視できる。化合物（ＳＭ１）の消失は、反応の完了と一般的に判断される。
【0131】
好ましい実施形態において、化合物（Ａ）を調製する過程は、塩基及びＲ４Ｃｌを、化合物（ＳＭ１）の溶媒中溶液に順次添加して反応を行うことを好ましくは含む。
【0132】
化合物（Ａ）の調製過程において、後処理は、当技術分野におけるこのような反応のための慣用的な後処理であってよい。本開示において、後処理は、反応混合物に抽出のための水及び有機溶媒（例えば、エステル溶媒、好ましくはＥｔＯＡｃ）を添加した後、得られた有機層をＮａＣｌ水溶液（例えば、２０％ＮａＣｌ水溶液）で洗浄して、得られた有機層を濃縮して精製（例えば、シリカゲルカラム）し、化合物（Ａ）を得ることを含む。
【0133】
更に別の態様では、化合物（Ｅ）が提供される：
（式中、Ｚ１は、
であり、酸素端はサルコシン単位に接続され、ｍは１、２、３、４、又は５であり、ＳＳ及びＲ４の定義は、本開示において定義されているとおりである。）。
【化32】
（式中、Ｚ１は、
【化33】
であり、酸素端はサルコシン単位に接続され、ｍは１、２、３、４、又は５であり、ＳＳ及びＲ４の定義は、本開示において定義されているとおりである。）。
【0134】
更なる態様において、オリゴヌクレオチド、例えばホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）の調製における、本開示に記載の化合物（Ｅ）の使用が提供される。
【0135】
本明細書に記載されているように、ＮＰＥ保護されたグアニンモノマーユニットを使用することにより、オリゴヌクレオチドを高い収率と純度で調製できることを発見した。また、非固体支持体結合オリゴヌクレオチドからのＮＰＥ基の脱保護は、ＮＰＥ付加物（不純物）を最小限に抑えながら高効率に行えることも発見した。
【0136】
［定義］
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0137】
実施形態が本明細書で「含む」という言葉で記載されている場合、そうでなければ「含有する」、「からなる」及び／又は「から本質的になる」という用語で記載される類似の実施形態も提供されることを理解されたい。しかし、移行語句として請求項で使用される場合、それぞれは別々に、適切な法的及び事実的文脈で解釈されるべきである（例えば、請求項では、移行語句「含む」はよりオープンエンドな表現とされ、「からなる」はより排他的であり、「から本質的になる」は中間的な立場である。）。
【0138】
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、明示的に記述されているか、又は文脈から明確に意図されていない限り、複数形の参照を含有する。
【0139】
見出しや小見出しは、便宜上及び／又は形式的な遵守のためにのみ使用され、対象技術を限定するものではなく、対象技術の記述の解釈と関連して参照されるものではない。主題の開示の１つの見出し又は１つの小見出しの下で説明される特徴は、様々な実施形態において、他の見出し又は小見出しの下で説明される特徴と組み合わされてもよい。更に、１個の見出し又は１個の小見出しの下にあるすべての特徴が、実施形態で一緒に使用されるとは限らない。
【0140】
値の範囲が挙げられている場合、その範囲内の各値及び小範囲を包含することを意図している。例えば「Ｃ１～６」は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１～６、Ｃ１～５、Ｃ１～４、Ｃ１～３、Ｃ１～２、Ｃ２～６、Ｃ２～５、Ｃ２～４、Ｃ２～３、Ｃ３～６、Ｃ３～５、Ｃ３～４、Ｃ４～５及びＣ５～６を包含することを意図するものである。
【0141】
「モルフォリノオリゴマー」とは、通常のポリヌクレオチドに水素結合可能な塩基を支持する骨格を有する高分子であって、ペントース糖骨格部分、より具体的にはヌクレオチドやヌクレオシドに通常に見られる、リン酸ジエステル結合で連結されたリボース骨格がなく、その代わりに、環窒素を含有し、環窒素を介してカップリングするものを指す。好ましいモルフォリノオリゴマーは、以下に示すような「モルフォリノサブユニット」構造で構成され、オリゴマーにおいてその構造は、好ましくは（チオ）ホスホロジアミデート結合によって連結され、あるサブユニットのモルフォリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に結合する。各サブユニットは、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基に結合するために有効である、プリン又はピリミジン塩基対部分Ｂａｓｅを含む。
【化34】
【0142】
「ホスホロジアミデート」基は、２個の酸素原子と２個の窒素原子が結合したリンを含み、本明細書では１個の酸素原子と３個の窒素原子が結合したリンを指す場合もある。
本明細書に記載のオリゴマーのサブユニット間結合において、第１の窒素は、通常、主鎖につり下がっており、第２の窒素は環窒素ｍモルフォリノ環構造：下記式（ａ１）に示すようなものである。代替的に又は追加的に、下記式（ｂ１）及び（ｃ１）に示すように、５’－環外炭素に窒素が存在してもよい。
本明細書に記載のオリゴマーのサブユニット間結合において、第１の窒素は、通常、主鎖につり下がっており、第２の窒素は環窒素ｍモルフォリノ環構造：下記式（ａ１）に示すようなものである。代替的に又は追加的に、下記式（ｂ１）及び（ｃ１）に示すように、５’－環外炭素に窒素が存在してもよい。
【化35】
【0143】
Ｂａｓｅ１、Ｂａｓｅ２は同じでも異なっていてもよく、その定義は本開示に記載の塩基と同じである。
【0144】
チオホスホロジアミデート結合では、１個の酸素原子、通常、本明細書に記載のオリゴマーの主鎖につり下がっている酸素が、硫黄に置き換えられている。
【0145】
好ましい実施形態において、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーは、以下の一般構造のホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーを指す。
【化36】
【0146】
「固相支持されたモルフォリノサブユニット」は、本明細書に記載の固相段階的合成によってモルフォリノオリゴマーに組み込まれた最初又はその後の任意のモルフォリノサブユニットモノマーであってよい。サブユニットは、その５’環外炭素を介して、固体支持体、又は固体支持体上で成長しているオリゴマー鎖に結合している。「塩基が保護された」とは、モルフォリノサブユニット上の塩基対基、例えば、プリン又はピリミジン塩基を、オリゴマーの段階的合成における塩基対基の反応又は干渉を防止するのに適した保護基で、保護することを指す。
【0147】
「活性化ホスホルアミデート基」は、通常、クロロホスホルアミデート基であり、オリゴマー中の最終的なホスホルアミデート結合に含まれることが望まれる窒素での置換を有している。例えば、（ジメチルアミノ）クロロホスホルアミデート、すなわち－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（ＮＭｅ２）Ｃｌが挙げられる。
【0148】
「塩基が保護された」又は「塩基保護」とは、モルフォリノサブユニット上の塩基対基、例えばプリン又はピリミジン塩基を、オリゴマーの段階的合成における塩基対基の反応又は干渉を防止するのに適した保護基で、保護することを指す。好ましい実施形態において、塩基が保護されたモルフォリノサブユニットモノマーの少なくとも１個は、構造（Ｍ）を有する保護されたグアニンモルフォリノ化合物から誘導される。
【化37】
【0149】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の定義は、本開示に記載されているとおりである。
【0150】
「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用できるものであれば特に限定されず、例えば、シトシル基、ウラシル基、チミニル基等のピリミジン塩基、及びアデニル基、グアニル基等のプリン塩基が挙げられる。「保護されていてもよい核酸塩基」とは、例えば、アデニル基、グアニル基又はシトシル基においてアミノ基が保護されていてもよいことを意味し、それは、アミノ基を有する核酸塩基であって、そのアミノ基がモルフォリノヌクレオチドのモルフォリン環窒素原子の脱保護条件下で持続的に保護基によって保護される核酸塩基が好ましい。「アミノ保護基」は、特に限定されず、「アミノ保護基」の具体例としては、ピバロイル基、ピバロイルオキシメチル基、トリフルオロアセチル基、フェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、アセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、ジメチルホルムアミジニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基等が挙げられる。加えて、核酸塩基のカルボニル基は保護されていてもよく、例えば、フェノール、２，５－ジクロロフェノール、３－クロロフェノール、３，５－ジクロロフェノール、２－ホルミルフェノール、２－ナフトール、４－メトキシフェノール、４－クロロフェノール、２－ニトロフェノール、４－ニトロフェノール、４－アセチルアミノフェノール、ペンタフルオロフェノール、４－ピバロイルオキシベンジルアルコール、４－ニトロフェネチルアルコール、２－（メチルスルホニル）エタノール、２－（フェニルスルホニル）エタノール、２－シアノエタノール、２－（トリメチルシリル）エタノール、塩化ジメチルカルバモイル、塩化ジエチルカルバモイル、塩化エチルフェニルカルバモイル、塩化１－ピロリジンカルボニル、塩化４－モルフォリンカルボニル、塩化デフェニルカルバモイル等と反応させて、保護される。場合によっては、カルボニル保護基を特に導入する必要はない。更に上記の基に加えて、修飾核酸塩基（例えば、８－ブロモアデニル基、８－ブロモグアニル基、５－ブロモシトシル基、５－ヨードシトシル基、５－ブロモウラシル基、５－ヨードウラシル基、５－フルオロウラシル基、ヒポキサンチニル基等）が挙げられ、これらは、任意の１～３個の置換基（例えば、ハロゲン原子、アルキル基、アラルキル基、アルコキシ基、アシル基、アルコキシアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ等）により任意の位置で置換された核酸塩基であり、これらも「核酸塩基」に包含される。
【0151】
「低級アルキル」とは、炭素原子１～６個のアルキル基を指し、メチル、エチル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソアミル、ｎ－ペンチル、及びイソペンチルが例示される。選択された実施形態において、「低級アルキル」基は、１～４個の炭素原子、又はｌ～２個の炭素原子、すなわち、メチル又はエチルを有する。
【0152】
「支持体に結合」とは、支持媒体と共有結合している化学物質を指す。
【0153】
用語「支持媒体」とは、例えば、粒子、ビーズ、表面等を含む材料であって、オリゴマーをその上に付着若しくはその上で合成できるもの、又はオリゴマーを付着する若しくは合成するために修飾されるものを指す。代表的な基材としては、無機支持体及び有機支持体、例えば、ガラス、改質又は機能化ガラス、プラスチック（例えば、アクリル、ポリスチレン及びスチレンと他の材料との共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）等が挙げられる。）、多糖類、ナイロン若しくはニトロセルロース、セラミックス、樹脂、シリカ、又はシリコンや変性シリコンを含むシリカ系材料、カーボン、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバー束、その他様々な高分子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態のために、特に有用な支持媒体及び固体表面は、フローセル装置内に配置される。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、支持媒体は、１％のジビニルベンゼンで架橋されたポリスチレンを含む。本明細書に記載の方法の他の実施形態において、支持媒体は、アミノメチルポリスチレン樹脂（例えば、Ｘｉ’ａｎ Ｌａｎｘｉａｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，から購入し、その充填量は、例えば、１ｍｍｏｌ／ｇである。）である。
【0154】
いくつかの実施形態において、代表的な支持媒体は、オリゴマーの付着又は合成のための少なくとも１つの反応部位を含む。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の支持媒体は、オリゴマーを付着又は合成するために、流入するサブユニット又は他の活性化基と化学結合を形成できる１個又は複数個の末端アミノ基又は水酸基を含む。
【0155】
用語「フローセル装置」は、１種又は複数種の試薬（液体、気体等）を流すことができる表面（固体表面等）を含むチャンバーを指す。
【0156】
用語「デブロッキング剤」は、保護基を除去するための化学的な酸又は化学的な酸の組合せを含む組成物（例えば、溶液）を指す。デブロッキング剤に使用される例示的な化学的な酸は、ハロゲン化酸、例えば、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸、及びトリフルオロ酢酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、デブロッキング剤は、例えば、オリゴマー、支持体に結合しているオリゴマー、支持体に結合しているサブユニット、又は他の保護された窒素若しくは酸素部分から、１個又は複数個のトリチル基を除去する。別の実施形態において、各過程（ステップ）で使用されるデブロッキング剤は、４－シアノピリジン、ジクロロメタン、トリフルオロ酢酸、トリフルオロエタノール、及び水を含む溶液、又は４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸、トリフルオロエタノール、ジクロロメタン及びエタノールを含む溶液である。好ましい実施形態において、各過程（ステップ）で使用されるデブロッキング剤は、１％エタノールを含む２０％トリフルオロエタノール／ジクロロメタン中２％４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩（ＣＹＴＦＡ）（ｗ／ｖ）である。
【0157】
用語「ハロゲン」及び「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素より選択される原子を指す。
【0158】
用語「キャッピング剤」は、例えば、流入するサブユニット又は他の活性化基と化学結合を形成する支持媒体の反応性部位をブロックするのに有用な酸無水物（例えば、無水安息香酸、無水酢酸、無水フェノキシ酢酸等）を指す。一実施形態において、キャッピング剤は、エチルモルフォリンとメチルピロリジノンとを溶液中に含む。好ましい実施形態において、本開示のキャッピング剤は、キャッピングＡ及びキャッピングＢを含み、キャッピングＡは、ＮＥＭのＮＭＰ溶液であり、キャッピングＢは、キャッピング剤のＮＭＰ溶液である。
【0159】
用語「切断剤」は、例えば、支持体に結合しているオリゴマーを支持媒体から切断するのに有用な化学的塩基（例えば、アンモニア又は１，８－ジアザビシクロウンデカ－７－エン）又は化学的塩基の組合せを含む組成物（例えば、液剤又はガス状混合物）を指す。更に別の実施形態において、切断剤は、溶液中にＮ－メチル－２－ピロリドンを含む。
【0160】
用語「脱保護剤」は、保護基の除去に有用な化学的な塩基（例えば、アンモニア、１，８－ジアザビシクロウンデカ－７－エン、又は炭酸カリウム）又は化学的な塩基の組合せを含む組成物（例えば、液剤又はガス状混合物）を指す。例えば、脱保護剤は、いくつかの実施形態において、例えば、モルフォリノサブユニット、モルフォリノオリゴマーのモルフォリノサブユニット、又はそれらの支持体に結合したバージョンから、塩基保護を除去できる。別の実施形態において、切断剤は、ジチオスレイトールと１，８－ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ－７－エンを含む。
【0161】
用語「溶媒」とは、溶質が溶解している溶液又は混合物の成分を指す。溶媒は、無機物でも有機物でもよい（例えば、酢酸、アセトン、アセトニトリル、アセチルアセトン、２－アミノエタノール、アニリン、アニソール、ベンゼン、ベンゾニトリル、ベンジルアルコール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブタノール、２－ブタノン、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、二硫化炭素、四塩化炭素、クロロベンゼン、クロロホルム、シクロヘキサン、シクロヘキサノール、シクロヘキサノン、フタル酸ジ－ｎ－ブチル、１，１－ジクロロエタン、１，２－ジクロロエタン、ジエチルアミン、ジエチレングリコール、ジグリム、ジメトキシエタン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、１－メチル－２－ピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルフタレート、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、エタノール、エーテル、酢酸エチル、アセト酢酸エチル、安息香酸エチル、エチレングリコール、グリセリン、ヘプタン、１－ヘプタノール、ヘキサン、１－ヘキサノール、メタノール、酢酸メチル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、塩化メチレン、１－オクタノール、ペンタン、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、２－ペンタノン、３－ペンタノン、１－プロパノール、２－プロパノール、ピリジン、テトラヒドロフラン、トルエン、水、ｐ－キシレン）。
【0162】
本開示において、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｕ及びＴは、それぞれグアニン、シトシン、アデニン、ウラシル、及びチミンである。
【化38】
【0163】
略称
ＤＭＦは、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを表す。
ＤＩＰＥＡは、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを表す。
ＴｒＣｌは、トリフェニルメチルクロライドを表す。
ＴＬＣは、薄層クロマトグラフィーを表す。
ＥｔＯＡｃは、酢酸エチルを表す。
ＮａＣｌは、塩化ナトリウムを表す。
ＤＢＵは１，８－ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ－７－エンを表す。
ＤＢＮは１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ－５－エンを表す。
ＤＡＢＣＯは１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンを表す。
ＮＭＰは１－メチル－２－ピロリジノンを表す。
ＮＰＥは、４－ニトロフェネチル（ＮＰＥ）基を表す。
ＩＰＣは工程内管理を表す。
ＵＶは、紫外線を表す。
ＣＹＴＦＡは、４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩を表す。
Ｖｏｌ．（ｖｏｌ．）は、容量を表す。
ＤＣＭは、ジクロロメタンを表す。
ＭＴＢＥは、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを表す。
ＤＭＡＰはジメチルアミノピリジンを表す。
ＥＤＣＩは、１－エチル－３－（３－ジメチルアミンプロピル）カルボジイミド塩酸塩を表す。
ＩＰＡは、イソプロピルアルコールを表す。
ＮＥＭは、Ｎ－エチルモルフォリンを表す。
Ｂｚ２Ｏは、無水安息香酸を表す。
ＤＭＩは、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンを表す。
ＰＭＯは、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーを表す。
ＣＡＰ Ａは、キャッピングＡを表す。
ＣＡＰ Ｂは、キャッピングＢを表す。
「ａ Ｍ」は、「ａ ｍｏｌ／Ｌ」を表し、ここでａは数字である。
ｍｉｎは、分を表す。
ＤＭＦは、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを表す。
ＤＩＰＥＡは、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを表す。
ＴｒＣｌは、トリフェニルメチルクロライドを表す。
ＴＬＣは、薄層クロマトグラフィーを表す。
ＥｔＯＡｃは、酢酸エチルを表す。
ＮａＣｌは、塩化ナトリウムを表す。
ＤＢＵは１，８－ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ－７－エンを表す。
ＤＢＮは１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ－５－エンを表す。
ＤＡＢＣＯは１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンを表す。
ＮＭＰは１－メチル－２－ピロリジノンを表す。
ＮＰＥは、４－ニトロフェネチル（ＮＰＥ）基を表す。
ＩＰＣは工程内管理を表す。
ＵＶは、紫外線を表す。
ＣＹＴＦＡは、４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩を表す。
Ｖｏｌ．（ｖｏｌ．）は、容量を表す。
ＤＣＭは、ジクロロメタンを表す。
ＭＴＢＥは、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを表す。
ＤＭＡＰはジメチルアミノピリジンを表す。
ＥＤＣＩは、１－エチル－３－（３－ジメチルアミンプロピル）カルボジイミド塩酸塩を表す。
ＩＰＡは、イソプロピルアルコールを表す。
ＮＥＭは、Ｎ－エチルモルフォリンを表す。
Ｂｚ２Ｏは、無水安息香酸を表す。
ＤＭＩは、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンを表す。
ＰＭＯは、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーを表す。
ＣＡＰ Ａは、キャッピングＡを表す。
ＣＡＰ Ｂは、キャッピングＢを表す。
「ａ Ｍ」は、「ａ ｍｏｌ／Ｌ」を表し、ここでａは数字である。
ｍｉｎは、分を表す。
【実施例】
【0164】
以下の実施例は本発明をより詳しく例示するが、本発明は以下の実施例により限定されない。実施例の操作において温度が限定されていない場合、その操作は室温で実行されることを意味する。
【0165】
実施例１ 化合物（Ｅ）の合成
合成経路
合成経路
【化39】
【0166】
ステップ１ 化合物（Ａ）の合成
化合物（ＳＭ１）（３５ｇ、０．２５ｍｏｌ、１ｅｑ．）のＤＭＦ（３５０ｍＬ）中溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．７５ｍｏｌ、３ｅｑ．）及びＴｒＣｌ（０．５ｍｏｌ、２ｅｑ．）を連続して加えた。化合物（ＳＭ１）が完全に消費されたことをＴＬＣが示すまで、２０～２５℃で反応液を撹拌した。反応混合物に水（１４００ｍＬ、４０ｖｏｌ．）及びＥｔＯＡｃ（１４００ｍＬ、４０ｖｏｌ．）を加えた。有機層を分離して、２０％のＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＤＭＦを除去した。得られた有機層を濃縮し、シリカゲルカラムで精製して、収率９１％で７９ｇの白色粉末（化合物（Ａ））を得た。1H-NMR (CDCl3) δ: 7.56 (d, 6H), 7.30-7.28(m, 6H), 7.20-7.18(m, 6H), 3.71-3.68(m,3H), 2.95(s, 2H), 2.04(s, 3H).
化合物（ＳＭ１）（３５ｇ、０．２５ｍｏｌ、１ｅｑ．）のＤＭＦ（３５０ｍＬ）中溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．７５ｍｏｌ、３ｅｑ．）及びＴｒＣｌ（０．５ｍｏｌ、２ｅｑ．）を連続して加えた。化合物（ＳＭ１）が完全に消費されたことをＴＬＣが示すまで、２０～２５℃で反応液を撹拌した。反応混合物に水（１４００ｍＬ、４０ｖｏｌ．）及びＥｔＯＡｃ（１４００ｍＬ、４０ｖｏｌ．）を加えた。有機層を分離して、２０％のＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＤＭＦを除去した。得られた有機層を濃縮し、シリカゲルカラムで精製して、収率９１％で７９ｇの白色粉末（化合物（Ａ））を得た。1H-NMR (CDCl3) δ: 7.56 (d, 6H), 7.30-7.28(m, 6H), 7.20-7.18(m, 6H), 3.71-3.68(m,3H), 2.95(s, 2H), 2.04(s, 3H).
【0167】
ステップ２ 化合物（Ｂ）の合成
トリグリコール（１０ｅｑ．）のＮＭＰ（５００ｍＬ、１０ｖｏｌ．）中溶液に、６０％ＮａＨ（０．１ｅｑ．、鉱油に溶解）を２０～３０℃で加えた後、２０～３０℃で２０分間撹拌した。次に、化合物（Ａ）（５０ｇ、１ｅｑ．）を２０～３０℃で反応混合物に加えた。化合物（Ａ）の大部分が消費されるまで、２０～３０℃で反応液を撹拌した。反応後、ＤＣＭ／ＭＴＢＥ（３／７、１０００ｍＬ、２０ｖｏｌ．）と水（１０００ｍＬ、２０ｖｏｌ．）とを反応混合物に加えた。有機層を分離し、塩水で洗浄した。得られた有機層を濃縮し、粗化合物（Ｂ）を得た。粗化合物（Ｂ）をシリカゲルカラムで精製し、収率７０％で４７ｇの生成物を得た。1H-NMR (CDCl3) δ: 7.56 (d, 6H), 7.30-7.28(m, 6H), 7.20-7.18(m, 6H), 4.36-4.34(m,2H), 3.75-3.60(m, 8H), 3.60-3.59(m, 2H), 3.05(s, 2H), 2.15(s, 3H).
トリグリコール（１０ｅｑ．）のＮＭＰ（５００ｍＬ、１０ｖｏｌ．）中溶液に、６０％ＮａＨ（０．１ｅｑ．、鉱油に溶解）を２０～３０℃で加えた後、２０～３０℃で２０分間撹拌した。次に、化合物（Ａ）（５０ｇ、１ｅｑ．）を２０～３０℃で反応混合物に加えた。化合物（Ａ）の大部分が消費されるまで、２０～３０℃で反応液を撹拌した。反応後、ＤＣＭ／ＭＴＢＥ（３／７、１０００ｍＬ、２０ｖｏｌ．）と水（１０００ｍＬ、２０ｖｏｌ．）とを反応混合物に加えた。有機層を分離し、塩水で洗浄した。得られた有機層を濃縮し、粗化合物（Ｂ）を得た。粗化合物（Ｂ）をシリカゲルカラムで精製し、収率７０％で４７ｇの生成物を得た。1H-NMR (CDCl3) δ: 7.56 (d, 6H), 7.30-7.28(m, 6H), 7.20-7.18(m, 6H), 4.36-4.34(m,2H), 3.75-3.60(m, 8H), 3.60-3.59(m, 2H), 3.05(s, 2H), 2.15(s, 3H).
【0168】
ステップ３ 化合物（Ｃ）の合成
化合物（Ｂ）（４７ｇ、１ｅｑ．）のＴＨＦ（４７０ｍＬ）中溶液に、無水コハク酸（２ｅｑ．）を加えた。化合物（Ｂ）が完全に消費されたことをＴＬＣが示すまで、５５℃で２．０時間、反応液を撹拌した。反応後、１０％ＮａＨＣＯ３水溶液で反応混合物のｐＨを約８．５に調整した。次に、ＭＴＢＥ（９４０ｍＬ、２０ｖｏｌ．）を混合物に添加し、水層を分離した。得られた水層のｐＨを２０％クエン酸溶液で３～５に調整して、ＤＣＭで抽出（９４０ｍＬ、２０Ｖｏｌ．）し、１０％Ｎａ２ＳＯ４水溶液（４７０ｍＬ、１０ｖｏｌ．）で洗浄し、有機相を得た。濃縮後、収率９８％で５６ｇの黄色油状物を得て、これを更に精製することなく次のステップで利用した。1H-NMR (CDCl3) δ: 7.46 (d, 6H), 7.17-7.21(m, 6H), 7.07-7.10(m, 6H), 4.20-4.24(m,2H), 4.17-4.15(m, 2H), 3.65-3.50(m, 8H), 2.96(s, 2H), 2.54-2.52(m, 4H), 2.05(s,3H).
化合物（Ｂ）（４７ｇ、１ｅｑ．）のＴＨＦ（４７０ｍＬ）中溶液に、無水コハク酸（２ｅｑ．）を加えた。化合物（Ｂ）が完全に消費されたことをＴＬＣが示すまで、５５℃で２．０時間、反応液を撹拌した。反応後、１０％ＮａＨＣＯ３水溶液で反応混合物のｐＨを約８．５に調整した。次に、ＭＴＢＥ（９４０ｍＬ、２０ｖｏｌ．）を混合物に添加し、水層を分離した。得られた水層のｐＨを２０％クエン酸溶液で３～５に調整して、ＤＣＭで抽出（９４０ｍＬ、２０Ｖｏｌ．）し、１０％Ｎａ２ＳＯ４水溶液（４７０ｍＬ、１０ｖｏｌ．）で洗浄し、有機相を得た。濃縮後、収率９８％で５６ｇの黄色油状物を得て、これを更に精製することなく次のステップで利用した。1H-NMR (CDCl3) δ: 7.46 (d, 6H), 7.17-7.21(m, 6H), 7.07-7.10(m, 6H), 4.20-4.24(m,2H), 4.17-4.15(m, 2H), 3.65-3.50(m, 8H), 2.96(s, 2H), 2.54-2.52(m, 4H), 2.05(s,3H).
【0169】
ステップ４ 化合物（Ｄ）の合成
化合物（Ｃ）（５６ｇ、１ｅｑ．）のＤＣＭ（５６０ｍＬ）中溶液に、Ｎ－ヒドロキシ－５－ノルボルネン－２，３－ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ、１．０２ｅｑ．）、ＤＭＡＰ（０．３３ｅｑ．）、ＤＩＰＥＡ（２．５ｅｑ．）を加えた後、ＥＤＣＩ（１．１ｅｑ．）を加えた。化合物（Ｃ）が完全に消費されたことをＴＬＣが示すまで、２０～３０℃で反応液を撹拌した。１０％クエン酸溶液及び塩水で、混合物を順次洗浄した。有機層を乾燥するまで濃縮し、更に精製することなく次のステップに進んだ。収率９３％で６７ｇの発泡固体を得た。1H-NMR (CDCl3) δ: 7.46 (d, 6H), 7.17-7.21(m, 6H), 7.07-7.10(m, 6H), 6.11(d, 2H),4.20-4.24(m, 2H), 4.17-4.15(m, 2H), 3.65-3.50(m, 8H), 3.36(s, 2H), 3.23(s, 2H),2.96(s, 2H), 2.79(t, 2H), 2.63(t, 2H), 2.05(s, 3H), 1.70(d, 1H), 1.44 (d, 1H).
化合物（Ｃ）（５６ｇ、１ｅｑ．）のＤＣＭ（５６０ｍＬ）中溶液に、Ｎ－ヒドロキシ－５－ノルボルネン－２，３－ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ、１．０２ｅｑ．）、ＤＭＡＰ（０．３３ｅｑ．）、ＤＩＰＥＡ（２．５ｅｑ．）を加えた後、ＥＤＣＩ（１．１ｅｑ．）を加えた。化合物（Ｃ）が完全に消費されたことをＴＬＣが示すまで、２０～３０℃で反応液を撹拌した。１０％クエン酸溶液及び塩水で、混合物を順次洗浄した。有機層を乾燥するまで濃縮し、更に精製することなく次のステップに進んだ。収率９３％で６７ｇの発泡固体を得た。1H-NMR (CDCl3) δ: 7.46 (d, 6H), 7.17-7.21(m, 6H), 7.07-7.10(m, 6H), 6.11(d, 2H),4.20-4.24(m, 2H), 4.17-4.15(m, 2H), 3.65-3.50(m, 8H), 3.36(s, 2H), 3.23(s, 2H),2.96(s, 2H), 2.79(t, 2H), 2.63(t, 2H), 2.05(s, 3H), 1.70(d, 1H), 1.44 (d, 1H).
【0170】
ステップ５ 化合物（Ｅ）の合成
アミノメチルポリスチレン樹脂（１０ｇ、充填量は１ｍｍｏｌ／ｇであった）（Ｘｉ’ａｎ Ｌａｎｘｉａｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）をＮＭＰ（２００ｍＬ）に懸濁して、１～２時間膨潤した。樹脂の懸濁液を濾過してＮＭＰを除去し、ＩＰＡ／ＤＣＭ（２００ｍＬ、ｖ／ｖ＝１：３）中ＤＣＭ（２００ｍＬ）及び５％ＤＩＰＥＡで順次洗浄した。ＮＭＰ（１０ｖｏｌ．）中の化合物（Ｄ）（２．５ｅｑ．）溶液を、ＮＭＰ（１００ｍＬ）中のアミノメチルポリスチレン樹脂（１０ｇ）の懸濁液に加えた。４０～４５℃で２４～４８時間、反応混合物を撹拌した。懸濁液を濾過した後、１００ｍＬのＮＭＰ及び１００ｍＬのＤＣＭで洗浄した。湿った固形物を反応器に移した後、ＮＭＰ（６０ｍＬ）中ＮＥＭ（０．４Ｍ）の溶液及びＮＭＰ（６０ｍＬ）中Ｂｚ２Ｏ（０．４Ｍ）の溶液を添加した。樹脂中に残ったアミノ基を、Ｂｚ２Ｏでキャップした。キャッピング反応の完了後、樹脂を濾過して、ＤＣＭ（１００ｍＬ）で洗浄した。乾燥後、サルコシネート修飾アミノメチル樹脂を得て、これをホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーの合成に用いた。
アミノメチルポリスチレン樹脂（１０ｇ、充填量は１ｍｍｏｌ／ｇであった）（Ｘｉ’ａｎ Ｌａｎｘｉａｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）をＮＭＰ（２００ｍＬ）に懸濁して、１～２時間膨潤した。樹脂の懸濁液を濾過してＮＭＰを除去し、ＩＰＡ／ＤＣＭ（２００ｍＬ、ｖ／ｖ＝１：３）中ＤＣＭ（２００ｍＬ）及び５％ＤＩＰＥＡで順次洗浄した。ＮＭＰ（１０ｖｏｌ．）中の化合物（Ｄ）（２．５ｅｑ．）溶液を、ＮＭＰ（１００ｍＬ）中のアミノメチルポリスチレン樹脂（１０ｇ）の懸濁液に加えた。４０～４５℃で２４～４８時間、反応混合物を撹拌した。懸濁液を濾過した後、１００ｍＬのＮＭＰ及び１００ｍＬのＤＣＭで洗浄した。湿った固形物を反応器に移した後、ＮＭＰ（６０ｍＬ）中ＮＥＭ（０．４Ｍ）の溶液及びＮＭＰ（６０ｍＬ）中Ｂｚ２Ｏ（０．４Ｍ）の溶液を添加した。樹脂中に残ったアミノ基を、Ｂｚ２Ｏでキャップした。キャッピング反応の完了後、樹脂を濾過して、ＤＣＭ（１００ｍＬ）で洗浄した。乾燥後、サルコシネート修飾アミノメチル樹脂を得て、これをホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーの合成に用いた。
【0171】
充填量の決定
代表的な手順：
樹脂の充填量（潜在的に利用可能な反応部位の数）は、乾燥した樹脂の既知重量（２５＋３ｍｇ）をシラン処理した２５ｍＬ容量のフラスコに移して、約５ｍＬのジクロロメタン中２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を加える分光分析で決定した。内容物を穏やかに旋回させて混合し、３０分間放置した。更なるジクロロメタン中２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を添加して、容量を２５ｍＬに上げ、内容物を十分に混合した。ポジティブディスプレイスメント式ピペットを使用して、トリチル含有溶液の一定分量（５００μＬ）を１０ｍＬ容量フラスコに移し、メタンスルホン酸で容量を１０ｍＬに上げた。最終溶液中のトリチルカチオン含有量を４０６ｎｍのＵＶ吸光度により測定して、化合物Ａを基準として使用することにより、樹脂１グラム当たりのトリチル基量（μｍｏｌ／ｇ）についての樹脂充填量を算出した。分析を２回実行して、平均充填量を算出し、結果を表１に示した。
代表的な手順：
樹脂の充填量（潜在的に利用可能な反応部位の数）は、乾燥した樹脂の既知重量（２５＋３ｍｇ）をシラン処理した２５ｍＬ容量のフラスコに移して、約５ｍＬのジクロロメタン中２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を加える分光分析で決定した。内容物を穏やかに旋回させて混合し、３０分間放置した。更なるジクロロメタン中２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を添加して、容量を２５ｍＬに上げ、内容物を十分に混合した。ポジティブディスプレイスメント式ピペットを使用して、トリチル含有溶液の一定分量（５００μＬ）を１０ｍＬ容量フラスコに移し、メタンスルホン酸で容量を１０ｍＬに上げた。最終溶液中のトリチルカチオン含有量を４０６ｎｍのＵＶ吸光度により測定して、化合物Ａを基準として使用することにより、樹脂１グラム当たりのトリチル基量（μｍｏｌ／ｇ）についての樹脂充填量を算出した。分析を２回実行して、平均充填量を算出し、結果を表１に示した。
【表1】
【0172】
実施例２ ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーの合成
サルコシネート修飾アミノメチル樹脂から、２５サイクルのホスホロジアミデートモルフォリノサブユニットを組み立てて、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーの合成を達成した。ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー合成の合成ルートは以下のとおりである。
サルコシネート修飾アミノメチル樹脂から、２５サイクルのホスホロジアミデートモルフォリノサブユニットを組み立てて、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーの合成を達成した。ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー合成の合成ルートは以下のとおりである。
【化40】
【0173】
ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーの合成は、脱トリチル化、中和、カップリング、キャッピング、洗浄のサイクルのためのペプチド合成装置を使用して、トリグリコールサルコシネート修飾支持体から固相合成によって、手動で実行した。反応はすべてガラス製ジャケットカラムで実施し、そのカラム容量は、２０ｍＬ、１００ｍＬ、５００ｍＬ、及び２Ｌが挙げられる。
【0174】
固体支持体上にモノマーを組み立てる前に、すべての溶液を以下のように調製した。
脱トリチル化溶液：１％エタノールを含む２０％トリフルオロエタノール／ジクロロメタン（１：４、ｖ／ｖ）中２％ ４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩（ＣＹＴＦＡ）（ｗ／ｖ）。
中和液：２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中５％ジイソプロピルエチルアミン。
カップリング溶液：ＤＭＩ中０．３６Ｍモルフォリノサブユニット溶液及びＤＭＩ中０．８Ｍ Ｎ－エチルモルフォリン（ＮＥＭ）。その間、ＤＭＩ中モルフォリノサブユニット溶液を、モレキュラーシーブで１２時間以上処理し、水分量を減少させた。
キャッピング溶液：キャッピングＡとしてＮＭＰ中０．４Ｍ ＮＥＭ；キャッピングＢとしてＮＭＰ中０．４Ｍ無水安息香酸又は無水酢酸。
脱トリチル化溶液：１％エタノールを含む２０％トリフルオロエタノール／ジクロロメタン（１：４、ｖ／ｖ）中２％ ４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩（ＣＹＴＦＡ）（ｗ／ｖ）。
中和液：２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中５％ジイソプロピルエチルアミン。
カップリング溶液：ＤＭＩ中０．３６Ｍモルフォリノサブユニット溶液及びＤＭＩ中０．８Ｍ Ｎ－エチルモルフォリン（ＮＥＭ）。その間、ＤＭＩ中モルフォリノサブユニット溶液を、モレキュラーシーブで１２時間以上処理し、水分量を減少させた。
キャッピング溶液：キャッピングＡとしてＮＭＰ中０．４Ｍ ＮＥＭ；キャッピングＢとしてＮＭＰ中０．４Ｍ無水安息香酸又は無水酢酸。
【表2】
【0175】
ジャケット式カラム反応器に、サルコシネート修飾アミノメチルポリスチレン樹脂を加えて、その後１５ｖｏｌ．の１－メチル－２－ピロリジノン（ＮＭＰ １５ｍＬ／ｇ樹脂）を加え、懸濁液を０．５～１時間静置した。その後、ＮＭＰを脱気して、樹脂をＤＣＭで５回洗浄し、脱トリチル化した。各ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーサブユニットを支持体上に組み立てるためには、４つの反応が行われる。
【0176】
第１に、支持体上のトリチル基を除去するために、２％の４－シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸塩（ＣＹＴＦＡ）（ｗ／ｖ）溶液（２，２，２－トリフルオロエタノール／ＤＣＭ １／４と１％ ＥｔＯＨ）（１５～２５ｖｏｌ．）をカラムリアクタに加えた。混合物をＮ２で２～５分間泡立てた後、真空脱気して溶媒を除去した。ＩＰＣですべてのトリチル基が除去されたことが確認されるまで、この操作を５～９回繰り返した（ＩＰＣ：濾液から試料を採取し、メタンスルホン酸で濾液を希釈した。トリチル基が完全に除去されているかどうかを確認するために、ＵＶスペクトロメーターで４１１ｎｍのＵＶ吸収を試験した）。
【0177】
第２に、脱トリチル化後、ジャケットカラムにＩＰＡ／ＤＣＭ（１／３）中５％ＤＩＰＥＡを加え、樹脂を中和した。カップリングする前に、残留するＣＹＴＦＡを複数回の洗浄で完全に除去する必要がある。
【0178】
第３に、モルフォリノサブユニット溶液とＤＭＩ中ＮＥＭの溶液とを反応器に加え、反応液をＮ２で４５℃、９０分間泡立てることによって、カップリングを実行した。モルフォリノサブユニットを支持体上に組み立てた後、反応混合物を脱気して、ＤＣＭで洗浄した。
【0179】
最後に、支持体上の未反応のモルフォリノサブユニットをキャップして伸長を停止させた。
【0180】
目的配列が完成するまで、以下の表３のように４回の反応を繰り返した。
【表3】
【化41】
【0181】
各カップリング反応について、６０８μｍｏｌ／ｇの充填量を伴う２５０ｍｇの化合物（Ｅ）及び２．５ｅｑ．のホスホロジアミデートモルフォリノサブユニット（ＰＭＯ－ＮＰＥＧモノマー、ＰＭＯ－ＰＡモノマー、ＰＭＯ－ＰＣモノマー、ＰＭＯ－Ｔモノマー、その構造は実施例２に示した）を使用して、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーの合成を１回実施した。２５サイクルの反応の後、２．９５ｇの湿式で塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー修飾固体支持体を得た。塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー修飾固体支持体を、４－ニトロフェネチル基を除去するためのＮＭＰ（２０ｍＬ）中０．５Ｍ ＤＢＵで１５℃、４時間処理し、及び塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーを切断し、他の保護基を削除するための濃水酸化アンモニウムによって引き続き処理した。２８．８％の４－ニトロスチレン付加物である不純物（ＬＣ－ＭＳで測定）を検出し、この物質はホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー合成の収率を著しく低下させた。
【0182】
４－ニトロスチレン付加物である不純物問題を解決するため、３段階の切断と脱保護の戦略を開発した。塩基で保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーを、ＮＭＰ中ＤＢＵ及びチミンの溶液（ＤＢＵの濃度は０．８Ｍ、チミンの濃度は１．０Ｍであった）にゆっくりと（５ｍＬ／ｍｉｎ）加えた。標的ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー配列がチミンを含む場合、チミンの濃度は、標的ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー配列中のチミンの濃度よりはるかに大きいこと、例えば、標的ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー配列中のチミンに対するチミンのモル比は１０：１より大きいことを、当業者は知っている。３段階の切断と脱保護の後、４－ニトロスチレン付加物である不純物は、大幅に減少した（ＬＣ－ＭＳで測定したところ、５％未満であった）。
【0183】
切断と脱保護の３つのステップ
固相組み立て後、グアニン上に４－ニトロフェネチル基を有する塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー修飾固体支持体を得た。その後、以下のように切断と脱保護の３段階を行った。
固相組み立て後、グアニン上に４－ニトロフェネチル基を有する塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー修飾固体支持体を得た。その後、以下のように切断と脱保護の３段階を行った。
【0184】
ステップ（１）、まず塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー粗精製物を濃水酸化アンモニア（２５％～２８％水酸化アンモニア）の使用によって切断して水溶液を得て、これを凍結乾燥又は濃縮して塩基が保護されたホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー粗精製物を生成した。
【0185】
ステップ（２）、ステップ（１）の粗精製物をＮＭＰ（粗精製物に対するＮＭＰの体積－質量比は１０ｍＬ／ｇであった）に再溶解し、ＮＭＰ中ＤＢＵ／チミン（１．０Ｍ／０．８Ｍ）の溶液（粗精製物に対して１０倍容量）にゆっくり（５ｍＬ／ｍｉｎ）加え、４－ニトロスチレン付加物の不純物を最小限に抑えながら４－ニトロフェネチル基を除去した。
【0186】
ステップ（３）、ＮＰＥ脱保護後に得られたオリゴヌクレオチドを濃水酸化アンモニア（２５％～２８％水酸化アンモニア）で再び処理して、イソブチリル等の残存保護基を取り除き、標的ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーＡ（ＰＭＯ－Ａ）を形成し、配列は５’－ＧＴＴ ＧＣＣ ＴＣＣ ＧＧＴ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＴＴ Ｃ－３’（配列番号１）であった。
【化42】
【0187】
ＰＭＯ－Ｂ、ＰＭＯ－Ｃ、ＰＭＯ－Ｄ及びＰＭＯ－Ｅは、ＰＭＯ－Ａの調製方法と同じ方法を使用して調製した。
ＰＭＯ－Ｂの塩基配列は、５’－ ＣＴＣ ＣＡＡ ＣＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＧＧ ＣＡＴ ＴＴＣ ＴＡＧ －３’（配列番号２）であった。
ＰＭＯ－Ｃの塩基配列は、５’－ＣＴＡＴＡＴＡＧＴＴＡＴＴＣＡＡＣＡ－３’（配列番号３）であった。
ＰＭＯ－Ｄの塩基配列は、５’－ＧＧＣ ＣＡＡ ＡＣＣ ＴＣＧ ＧＣＴ ＴＡＣ ＣＴＧ ＡＡＡ Ｔ －３’（配列番号４）であった。
ＰＭＯ－Ｅの塩基配列は５’－ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＧ－３’（配列番号５）であった。
ＰＭＯ－Ｂの塩基配列は、５’－ ＣＴＣ ＣＡＡ ＣＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＧＧ ＣＡＴ ＴＴＣ ＴＡＧ －３’（配列番号２）であった。
ＰＭＯ－Ｃの塩基配列は、５’－ＣＴＡＴＡＴＡＧＴＴＡＴＴＣＡＡＣＡ－３’（配列番号３）であった。
ＰＭＯ－Ｄの塩基配列は、５’－ＧＧＣ ＣＡＡ ＡＣＣ ＴＣＧ ＧＣＴ ＴＡＣ ＣＴＧ ＡＡＡ Ｔ －３’（配列番号４）であった。
ＰＭＯ－Ｅの塩基配列は５’－ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＧ－３’（配列番号５）であった。
【0188】
ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー合成時に、いくつかの典型的な不純物が見つかり、その結果を表４に示した。
【表4】
【0189】
ＦＬＰ純度は、全長生成物のＬＣ－ＭＳ純度を表す。
Ｎ－Ａ、Ｎ－Ｃ、Ｎ－Ｇ、Ｎ－Ｔは、Ｎ－１の４つの不純物を表す。
ＯＨはホスホリルデメチルアミンの加水分解による不純物を表す。
Ｎ＋ＮＰＥは４－ニトロスチレン付加物である不純物を表す。
ＬＣ－ＭＳ： Ｗａｔｅｒｓ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ、Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ－ＴＯＦ検出器。
粗精製物は、３段階の切断、脱保護の後に得られた、精製していないＰＭＯを指す。
精製物は、３段階の切断、脱保護を行った後、イオン交換クロマトグラフィーで精製したＰＭＯを指す。
Ｎ－Ａ、Ｎ－Ｃ、Ｎ－Ｇ、Ｎ－Ｔは、Ｎ－１の４つの不純物を表す。
ＯＨはホスホリルデメチルアミンの加水分解による不純物を表す。
Ｎ＋ＮＰＥは４－ニトロスチレン付加物である不純物を表す。
ＬＣ－ＭＳ： Ｗａｔｅｒｓ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ、Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ－ＴＯＦ検出器。
粗精製物は、３段階の切断、脱保護の後に得られた、精製していないＰＭＯを指す。
精製物は、３段階の切断、脱保護を行った後、イオン交換クロマトグラフィーで精製したＰＭＯを指す。
【0190】
２つの好ましい実施形態の前述の説明は、本発明の原理を純粋に例示することを意図しており、それを包括するのではなく、変更及び変形は当業者には明らかであり、本発明は、以下の請求項に明示的に規定される以外に限定することを意図しないことが理解されよう。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-07-06
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）式Ｘ－１の化合物を式Ｘ－２の化合物に変換するステップ【化1】
Ｒ１０は、出発オリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー）の残基であり、
Ｒ１１は、アミン保護基であり、
前記式Ｘ－１の化合物は、固体支持体に結合していない。）と、
（ｂ）任意選択で前記式Ｘ－２の化合物中の保護基を除去して、オリゴヌクレオチドを得るステップと、
を含む、オリゴヌクレオチドを調製するための方法。
【請求項2】
前記変換するステップが、前記式Ｘ－１の化合物を、好ましくは溶液中の前記式Ｘ－１の化合物を、アルカリ試薬、及び式Ｘ－３の化合物と反応できる捕捉剤を含む混合物に添加することを含む、請求項１に記載の方法。【化2】
【請求項3】
前記アルカリ試薬が、水中でのｐＫａが約９以上の塩基性有機アミンであり、例えば、前記アルカリ試薬が、環状塩基性アミン、例えば１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン又は１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ－５－エンである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記捕捉剤が、－ＳＨ部分又は１，３－ジカルボニル部分を有し、例えば、前記捕捉剤がＸ－４の化合物である、請求項２又は３に記載の方法。【化3】
ｑは０、１、又は２であり、
ＲＡは、存在ごとに、独立的に、置換されていてもよいＣ１～６アルキル（例えば、メチル）である。）
【請求項5】
前記捕捉剤が、チミン又はその誘導体である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項6】
（ａ）式Ｘ－５の化合物を式Ｘ－６の化合物に変換するステップ【化4】
ｍ１及びｍ２は、独立的に０～５０の整数（例えば、０～３０）であり、
Ｒ１１は、アミン保護基であり、
Ｂａｓｅは、存在ごとに、独立的に、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、及びＴ（チミン）、それらの修飾類似物、及びそれらの保護された誘導体より選択される塩基であり、ただし、前記式Ｘ－５におけるＢａｓｅが保護された塩基である場合、式Ｘ－６の対応するＢａｓｅは同じ保護された塩基又は対応する一部若しくは完全に脱保護された塩基であってよく、
式中、
Ｔ１は適当な５’末端基（例えば、短いペプチド、置換されていてもよいアルキルアミノ基、置換されていてもよい複素環基等）であり、及び
Ｔ２は適当な３’末端基、例えば水素又は保護基（例えば、アシル基、トリチル等）である。）と、
（ｂ）前記式Ｘ－６の化合物中の保護基を任意選択で部分的又は完全に除去して、オリゴヌクレオチドを得るステップと、
を含む、オリゴヌクレオチドを調製するための方法。
【請求項7】
式Ｘ－５又はＸ－６におけるＢａｓｅが、存在ごとに、以下から独立的に選択される、請求項６に記載の方法。【化5】
【請求項8】
Ｔ１が、置換されていてもよいアルキルアミン又は置換されていてもよい複素環、例えば、アミド（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）で置換されたアルキルアミン、例えば、【化6】
【化7】
Ｔ２が、水素、トリチル又はアシル基（例えば、アセチル）である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項9】
前記変換するステップが、前記式Ｘ－５の化合物を、好ましくは溶液中の前記式Ｘ－５の化合物を、アルカリ試薬及び式Ｘ－３の化合物と反応できる捕捉剤を含む混合物に添加することを含む、請求項６又は７に記載の方法。【化8】
【請求項10】
前記アルカリ試薬が、水中でのｐＫａが約９以上の塩基性有機アミンであり、例えば、前記アルカリ試薬が、環状塩基性アミン、例えば１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン又は１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ－５－エンである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記捕捉剤が、－ＳＨ部分又は１，３－ジカルボニル部分を有し、例えば、前記捕捉剤がＸ－４の化合物である、請求項９又は１０に記載の方法。【化9】
ｑは０、１、又は２であり、
ＲＡは、存在ごとに、独立的に置換されていてもよいＣ１～６アルキル（例えば、メチル）である。）
【請求項12】
前記捕捉剤が、チミン又はその誘導体である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項13】
ＮＨ３で式Ｘ－６の化合物を処理して、式Ｘ－６における保護基を部分的又は完全に除去するステップを更に含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項14】
前記式Ｘ－５の化合物は、式Ｘ－７のオリゴヌクレオチドから固体支持体を例えばＮＨ３により切断することを含む過程によって調製される、請求項６又は７に記載の方法。【化10】
ＳＳは固相支持体、例えばポリスチレン固体支持体であり、
Ｌ１はリンカー、例えば、サルコシン系リンカー、例えば、
【化11】
式Ｘ－７におけるｍ１、ｍ２、及びＲ１１は、式Ｘ－５における対応する基と同じであり、
Ｂａｓｅは、存在ごとに、独立的に、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、及びＴ（チミン）、それらの修飾類似物、及びそれらの保護された誘導体より選択される塩基であり、ただし、前記式Ｘ－７におけるＢａｓｅが保護された塩基である場合、式Ｘ－５における対応する塩基は同じ保護された塩基又は対応する部分的若しくは完全に脱保護された塩基であってよく、及び
Ｔ２は、適当な３’末端基、例えば水素又は保護基（例えば、アシル基、トリチル）である。）。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法により製造された製品。
【国際調査報告】