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特表2023-541145ポリエチレングリコール誘導体、それを含む組成物、及びそれを利用した生理活性ポリペプチド結合体の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-28
(54)【発明の名称】ポリエチレングリコール誘導体、それを含む組成物、及びそれを利用した生理活性ポリペプチド結合体の製造方法
(51)【国際特許分類】
C08G 65/32 20060101AFI20230921BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20230921BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20230921BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20230921BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230921BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20230921BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230921BHJP
C07K 14/605 20060101ALN20230921BHJP
【ＦＩ】
C08G65/32
C07K16/00
A61K38/17
A61K47/60
A61K47/68
A61P7/00
A61P3/10
C07K14/605 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023515392
(86)(22)【出願日】2021-09-16
(85)【翻訳文提出日】2023-03-07
(86)【国際出願番号】 KR2021012717
(87)【国際公開番号】W WO2022060131
(87)【国際公開日】2022-03-24
(31)【優先権主張番号】10-2020-0119259
(32)【優先日】2020-09-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517095722
【氏名又は名称】ハンミ・ファイン・ケミカル・カンパニー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＨＡＮＭＩ ＦＩＮＥ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(71)【出願人】
【識別番号】516132149
【氏名又は名称】ハンミ ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ムン、チ ヒョ
(72)【発明者】
【氏名】チャン、ヨン チョン
(72)【発明者】
【氏名】シム、ヒョン チョン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ウン ヒョ
(72)【発明者】
【氏名】オム、テ イン
(72)【発明者】
【氏名】イ、ス ミ
(72)【発明者】
【氏名】キム、ユ イム
(72)【発明者】
【氏名】チョン、ヨン ギュ
(72)【発明者】
【氏名】キム、チ ヒョ
(72)【発明者】
【氏名】アン、ソン ア
(72)【発明者】
【氏名】ユ、オク チョル
(72)【発明者】
【氏名】チョ、ヨン ポム
(72)【発明者】
【氏名】イ、キョン ミン
(72)【発明者】
【氏名】イ、チェ ホン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
4J005
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC14
4C076CC21
4C076EE59
4C076FF31
4C076FF65
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA44
4C084CA53
4C084CA59
4C084DA19
4C084NA03
4C084NA12
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA30
4H045FA50
4H045FA52
4H045FA57
4H045GA26
4J005AA04
4J005BD00
(57)【要約】
一態様によるポリエチレングリコール誘導体化合物は、明細書内の化学式１で表される。該化学式１で、ｎは、３０ないし１１５の自然数であり、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、あるいは異なるＣ１－Ｃ５アルキルである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学式１で表される、ポリエチレングリコール誘導体化合物：化学式１
【化1】
前記化学式１で、ｎは、３０ないし１１５の自然数であり、
Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、あるいは異なるＣ１－Ｃ５アルキルである。
【請求項2】
前記Ｃ１－Ｃ５アルキルは、メチル、エチル、プロピルまたはブチルである、請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体化合物。
【請求項3】
前記Ｒ１及び前記Ｒ２は、エチルである、請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体化合物。
【請求項4】
ｎは、５０ないし１００の自然数である、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の化合物。
【請求項5】
ｎは、６７ないし８３の自然数である、請求項４に記載の化合物。
【請求項6】
ポリエチレングリコール誘導体組成物であり、下記化学式１Ａで表されるポリエチレングリコール誘導体と、
下記化学式２で表されるポリエチレングリコール誘導体と、
下記化学式３で表されるポリエチレングリコール誘導体と、を含み、
化学式１Ａ
【化2】
化学式２
【化3】
化学式３
【化4】
前記組成物において、
数平均分子量２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある前記化学式１Ａで表されるポリエチレングリコール誘導体の含量比が、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、少なくとも７０面積％と示され、
数平均分子量範囲２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある前記化学式２で表されるポリエチレングリコール誘導体の含量比が、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、１５面積％以下と示され、
数平均分子量範囲２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある前記化学式３で表されるポリエチレングリコール誘導体の含量比が、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、１０面積％以下と示される、ポリエチレングリコール誘導体組成物。
【請求項7】
前記ポリエチレングリコール誘導体の数平均分子量は、ゲル透過クロマトグラフィで測定したとき、２，９５０～３，６５０の範囲にある、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
前記ポリエチレングリコール誘導体の数平均分子量は、ゲル透過クロマトグラフィで測定したとき、３，０００～３，２００の範囲にある、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
（ａ）下記化学式１のポリエチレングリコール誘導体を生理活性ポリペプチドと反応させ、下記化学式１のポリエチレングリコール誘導体のアルデヒド炭素に、前記生理活性ポリペプチドが共有結合で連結された連結体を生成させるペギル化(pegylation)段階と、（ｂ）前記連結体を酸性の水性条件で処理し、連結体加水分解物を生成する加水分解段階と、
（ｃ）前記連結体加水分解物を免疫グロブリンＦｃ切片またはその誘導体に反応させ、結合体を生成する連結(conjugation)段階と、を含み、
前記結合体は、前記連結体加水分解物内の下記化学式１のポリエチレングリコール誘導体のアセタール炭素に由来する炭素原子に、Ｆｃ切片またはその誘導体が共有結合で連結されている構造である、生理活性ポリペプチド結合体の製造方法：
化学式１
【化5】
前記化学式１で、ｎは、５０ないし１００の自然数であり、
Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、あるいは異なるＣ１－Ｃ５アルキルである。
【請求項10】
前記生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液凝固因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質または受容体からなる群のうちから選択される、請求項９に記載の生理活性ポリペプチド結合体の製造方法。
【請求項11】
（ａ）段階の反応は、還元的アミン化であり、前記連結体は、前記生理活性ポリペプチドのＮ末端窒素、またはリシンのε－アミノ基窒素の原子が、前記化学式１の化合物のアルデヒド炭素原子に共有結合で連結された物質である、請求項９に記載の生理活性ポリペプチド結合体の製造方法。
【請求項12】
（ａ）段階のペギル化反応は、ｐＨ３．０～９．０の範囲でなされる、請求項１１に記載の結合体の製造方法。
【請求項13】
（ｂ）段階の加水分解は、ｐＨ１．０～５．０の範囲でなされる、請求項１１に記載の結合体の製造方法。
【請求項14】
（ｃ）段階の連結反応は、還元的アミン化である、請求項９に記載の結合体の製造方法。
【請求項15】
前記還元的アミン化は、ｐＨ５．０～８．５の範囲でなされる、請求項１４に記載の結合体の製造方法。
【請求項16】
前記Ｆｃ切片またはその誘導体の配列は、Ｎ末端がプロリンである、請求項９に記載の結合体の製造方法。
【請求項17】
前記結合体は、前記アセタール炭素に由来する炭素原子に、Ｆｃ切片またはその誘導体のＮ末端プロリンの窒素の原子が、共有結合で連結されている、請求項１６に記載の結合体の製造方法。
【請求項18】
前記Ｆｃ切片またはその誘導体は、配列番号２である、請求項１７に記載の結合体の製造方法。
【請求項19】
Ｒ１とＲ２は、エチルである、請求項９に記載の化合物。
【請求項20】
ｎは、６７ないし８３の自然数である、請求項９に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ポリエチレングリコール誘導体、それを含む組成物、及びそのようなポリエチレングリコール誘導体を利用した生理活性ポリペプチド結合体の製造に関する。
【背景技術】
【0002】
ペプチド医薬品は、２以上のアミノ酸が、一定化学結合形態で連結された物質であり、主に、化学的な合成を介して生産される医薬品を言う。該ペプチド医薬品は、「生体親和的」、「生体内特異性」という特性を有し、副作用は、少ないとも、少量でも強力な薬理作用及び活性を示しうると知られている。従って、該ペプチド医薬品は、合成医薬品とタンパク質医薬品との短所を補完すると期待されている。
【0003】
しかしながら、ペプチド医薬品は、消化管において、タンパク質酵素により、アミノ酸に分解されやすいので、経口投与が困難であり、注射を介して伝達されなければならず、血中半減期が短いために、生体利用率が低く、反復的な投与が必要である。また、タンパク質医薬品よりも小サイズであることにより、薬物投与時、標的まで逹することができず、腎臓を介し、体内でいち早く消失してしまうという限界を有する。
【0004】
そのような問題を解決するために、ペプチド薬物の生体膜透過度を上昇させ、口腔または鼻腔を介する吸入でもってペプチド薬物を体内に伝達させる方法、ペプチドのタンパク質加水分解酵素による分解を抑制するために、タンパク質加水分解酵素に敏感な特定アミノ酸配列を変更する方法、組み換え融合技術を利用した生理活性ポリペプチドと、ヒト血清アルブミンまたはヒト免疫グロブリン切片（Ｆｃ）との融合タンパク質製造、及び溶解度が高い非ペプチド性重合体をペプチド表面に化学的に付加させる方法のようなところが研究されてきた。
【0005】
非ペプチド性重合体であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、非イオン性、非毒性、生体適合性、及び高い親水性を有する重合体である。該ＰＥＧは、化学的に容易に変形が可能であるので、ペプチドやタンパク質薬物に共有結合で付着し、当該薬物の分子量を増大させることにより、腎臓による消失を抑制し、タンパク質分解酵素から薬物を保護することができる。該ＰＥＧは、特別な副作用も起こさないので、最近、ペプチド薬物の血中半減期を延長させるための方法として活発に研究されている。
【0006】
ＰＥＧは、アメリカ食品医薬局により、「一般的に安全なものであると認定（ＧＲＡＳ）」される物質として承認を受けた。国際特許公開ＷＯ０６／０７６４７１号は、鬱血性心不全症（congestive heart failure）治療剤として使用されるＢ型ナトリウム排泄増加ペプチド（ＢＮＰ：B-type natriuretic peptide）にＰＥＧを結合し、生理活性を持続させることについて記述している。米国特許第６，９２４，２６４号は、エクセンディン－４（exendin-4）のリシン（lysine）残基にＰＥＧを結合させ、生体内持続時間を延長させる方法を記述している。
【0007】
改質または変形されていないＰＥＧであるエチレングリコールのホモポリマーには、両方または一方の末端に、ヒドロキシ基がある。薬物と結合させるための用途のために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体を使用することもできるが、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の一末端または両末端のヒドロキシ基を、反応性が高い作用基に変換させたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体を使用することもできる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体として、ＰＥＧ－アルデヒド、ＰＥＧ－アセトアルデヒド、ＰＥＧ－プロピオンアルデヒドなどを使用することができる。そのようなアルデヒドポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体は、末端に存在するアルデヒド基が、タンパク質のアミノ酸一端と選択的に反応し、ペプチド薬物と化学結合を形成しても連結される。
【0008】
しかしながら、薬物結合に、両末端がいずれもアルデヒド基であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体を使用する場合、双方アルデヒド基が、いずれも反応に参与しうるので、所望しない付加生成物の生成や、ＰＥＧの過量使用などをもたらし、結果として、収率と純度とに望ましくない影響を及ぼしてしまう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の一目的は、ペプチド医薬品製造に使用されうるポリエチレングリコール誘導体、及びそれを含む組成物を提供することである。
【0010】
本発明の他の一目的は、前述のポリエチレングリコール誘導体を利用する生理活性ポリペプチド結合体の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
一態様によるポリエチレングリコール誘導体化合物は、下記化学式１で表される：
【0012】
化学式１
前記化学式１で、ｎは、３０ないし１１５の自然数であり、
Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、あるいは異なるＣ１－Ｃ５アルキルである。
前記Ｃ１－Ｃ５アルキルは、メチル、エチル、プロピルまたはブチルでもある。
前記Ｒ１及びＲ２は、エチルでもある。
ｎは、５０ないし１００の自然数でもある。
ｎは、６７ないし８３の自然数でもある。
【化1】
前記化学式１で、ｎは、３０ないし１１５の自然数であり、
Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、あるいは異なるＣ１－Ｃ５アルキルである。
前記Ｃ１－Ｃ５アルキルは、メチル、エチル、プロピルまたはブチルでもある。
前記Ｒ１及びＲ２は、エチルでもある。
ｎは、５０ないし１００の自然数でもある。
ｎは、６７ないし８３の自然数でもある。
【0013】
一態様によるポリエチレングリコール誘導体組成物は、
下記化学式１Ａで表されるポリエチレングリコール誘導体と、
下記化学式２で表されるポリエチレングリコール誘導体と、
下記化学式３で表されるポリエチレングリコール誘導体と、を含む：
下記化学式１Ａで表されるポリエチレングリコール誘導体と、
下記化学式２で表されるポリエチレングリコール誘導体と、
下記化学式３で表されるポリエチレングリコール誘導体と、を含む：
【0014】
化学式１Ａ
【化2】
【0015】
化学式２
【化3】
【0016】
化学式３
ｎは、３０ないし１１５の自然数でもある。
【化4】
ｎは、３０ないし１１５の自然数でもある。
【0017】
前記組成物において、
数平均分子量２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある前記化学式１Ａで表されるポリエチレングリコール誘導体の含量比が、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、少なくとも７０面積％と示され、
数平均分子量範囲２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある前記化学式２で表されるポリエチレングリコール誘導体の含量比が、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、１５面積％以下と示され、
数平均分子量範囲２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある前記化学式３で表されるポリエチレングリコール誘導体の含量比が、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、１０面積％以下と示される。
数平均分子量２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある前記化学式１Ａで表されるポリエチレングリコール誘導体の含量比が、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、少なくとも７０面積％と示され、
数平均分子量範囲２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある前記化学式２で表されるポリエチレングリコール誘導体の含量比が、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、１５面積％以下と示され、
数平均分子量範囲２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある前記化学式３で表されるポリエチレングリコール誘導体の含量比が、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、１０面積％以下と示される。
【0018】
前記組成物において、前記ポリエチレングリコール誘導体の数平均分子量は、ゲル透過クロマトグラフィで測定したとき、２，９５０～３，６５０の範囲内である。
前記組成物において、前記ポリエチレングリコール誘導体の数平均分子量は、ゲル透過クロマトグラフィで測定したとき、３，０００～３，２００の範囲内である。
前記組成物において、前記ポリエチレングリコール誘導体の数平均分子量は、ゲル透過クロマトグラフィで測定したとき、３，０００～３，２００の範囲内である。
【0019】
一態様による生理活性ポリペプチド結合体の製造方法は、
（ａ）下記化学式１のポリエチレングリコール誘導体を生理活性ポリペプチドと反応させ、下記化学式１のポリエチレングリコール誘導体のアルデヒド炭素に、前記生理活性ポリペプチドが共有結合で連結された連結体を生成させるペギル化（pegylation）段階と、
（ｂ）前記連結体を酸性の水性条件で処理し、連結体加水分解物を生成する加水分解段階と、
（ｃ）前記連結体加水分解物を免疫グロブリンＦｃ切片またはその誘導体に反応させ、結合体を生成する連結（conjugation）段階と、を含む：
（ａ）下記化学式１のポリエチレングリコール誘導体を生理活性ポリペプチドと反応させ、下記化学式１のポリエチレングリコール誘導体のアルデヒド炭素に、前記生理活性ポリペプチドが共有結合で連結された連結体を生成させるペギル化（pegylation）段階と、
（ｂ）前記連結体を酸性の水性条件で処理し、連結体加水分解物を生成する加水分解段階と、
（ｃ）前記連結体加水分解物を免疫グロブリンＦｃ切片またはその誘導体に反応させ、結合体を生成する連結（conjugation）段階と、を含む：
【0020】
化学式１
前記化学式１で、ｎは、５０ないし１００の自然数であり、
Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、あるいは異なるＣ１－Ｃ５アルキルである。
前記結合体は、前記連結体加水分解物内の前記化学式１のポリエチレングリコール誘導体のアセタール炭素に由来する炭素原子に、Ｆｃ切片またはその誘導体が共有結合で連結されている構造である。
前記生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液凝固因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群のうちからも選択される。
【化5】
前記化学式１で、ｎは、５０ないし１００の自然数であり、
Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、あるいは異なるＣ１－Ｃ５アルキルである。
前記結合体は、前記連結体加水分解物内の前記化学式１のポリエチレングリコール誘導体のアセタール炭素に由来する炭素原子に、Ｆｃ切片またはその誘導体が共有結合で連結されている構造である。
前記生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液凝固因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群のうちからも選択される。
【0021】
前記（ａ）段階の反応は、還元的アミン化であり、
前記連結体は、前記生理活性ポリペプチドのＮ末端窒素、またはリシンのε－アミノ基窒素の原子が、前記化学式１の化合物のアルデヒド炭素原子に共有結合で連結された物質でもある。
前記（ａ）段階のペギル化反応は、ｐＨ３．０～９．０の範囲においてもなされる。
前記（ｂ）段階の加水分解は、ｐＨ１．０～５．０の範囲においてもなされる。
前記（ｃ）段階の連結反応は、還元的アミン化でもある。
前記還元的アミン化は、ｐＨ５．０～８．５の範囲においてもなされる。
前記連結体は、前記生理活性ポリペプチドのＮ末端窒素、またはリシンのε－アミノ基窒素の原子が、前記化学式１の化合物のアルデヒド炭素原子に共有結合で連結された物質でもある。
前記（ａ）段階のペギル化反応は、ｐＨ３．０～９．０の範囲においてもなされる。
前記（ｂ）段階の加水分解は、ｐＨ１．０～５．０の範囲においてもなされる。
前記（ｃ）段階の連結反応は、還元的アミン化でもある。
前記還元的アミン化は、ｐＨ５．０～８．５の範囲においてもなされる。
【0022】
前記Ｆｃ切片またはその誘導体の配列は、Ｎ末端がプロリンでもある。
前記結合体は、前記アセタール炭素に由来する炭素原子に、Ｆｃ切片またはその誘導体のＮ末端プロリンの窒素の原子が、共有結合で連結されてもいる。
前記Ｆｃ切片またはその誘導体は、配列番号２のアミノ酸配列を有しうる。
前記Ｒ１と前記Ｒ２は、エチルでもある。
ｎは、６７ないし８３の自然数でもある。
前記結合体は、前記アセタール炭素に由来する炭素原子に、Ｆｃ切片またはその誘導体のＮ末端プロリンの窒素の原子が、共有結合で連結されてもいる。
前記Ｆｃ切片またはその誘導体は、配列番号２のアミノ酸配列を有しうる。
前記Ｒ１と前記Ｒ２は、エチルでもある。
ｎは、６７ないし８３の自然数でもある。
【発明の効果】
【0023】
一端には、反応性アルデヒド基を有し、他端には、非反応性アセタール基を有するポリエチレングリコール誘導体に、生理活性ポリペプチド、及びＦｃ切片またはその誘導体を結合させることにより、生理活性ポリペプチド結合体を高収率で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】一態様による生理活性ポリペプチド結合体の製造方法について説明するフローチャートである。
【図2A】試験例２で製造されたＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析グラフである。
【図2B】商用のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析グラフである。
【図3A】試験例２のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰの核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルのグラフである。
【図3B】商用のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤの核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルのグラフである。
【図3C】試験例２のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰの核磁気共鳴（１３Ｃ ＮＭＲ）スペクトルのグラフである。
【図3D】商用のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤの核磁気共鳴（１３Ｃ ＮＭＲ）スペクトルのグラフである。
【図4A】試験例２のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰのＦＴ－ＩＲスペクトルである。
【図4B】商用のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤのＦＴ－ＩＲスペクトルである。
【図5】実施例１の連結体加水分解物と、比較例１の連結体とのアルデヒド基活性度を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で使用される全ての技術用語は、取り立てて定義されない以上、本発明の関連分野の当業者が一般的に理解するような意味で使用される。また、本明細書には、望ましい方法や試料が記載されるが、それと類似していたり、同等であったりするものも、本発明の範疇に含まれる。また、本明細書に記載された数値は、明示されていなくとも、「約」の意味を含むと見なされる。本明細書に参考文献として記載される全ての刊行物の内容は、全体が本明細書に参照として統合される。
本発明で使用される全ての技術用語は、取り立てて定義されない以上、本発明の関連分野の当業者が一般的に理解するような意味で使用される。また、本明細書には、望ましい方法や試料が記載されるが、それと類似していたり、同等であったりするものも、本発明の範疇に含まれる。また、本明細書に記載された数値は、明示されていなくとも、「約」の意味を含むと見なされる。本明細書に参考文献として記載される全ての刊行物の内容は、全体が本明細書に参照として統合される。
【0026】
本発明の一態様によるポリエチレングリコール誘導体について説明する。
前記ポリエチレングリコール誘導体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の一端に、アルデヒド基（ＡＬＤ）を有し、他端に、アセタール基（ＡＣＴ）を有するポリエチレングリコール誘導体である。前記ポリエチレングリコール誘導体は、下記式１によっても表示される：
前記ポリエチレングリコール誘導体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の一端に、アルデヒド基（ＡＬＤ）を有し、他端に、アセタール基（ＡＣＴ）を有するポリエチレングリコール誘導体である。前記ポリエチレングリコール誘導体は、下記式１によっても表示される：
【0027】
＜式１＞
ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＣＴ
式１で、ＡＬＤは、アルデヒド作用基であり、ＰＥＧは、ポリエチレングリコール部位であり、ＡＣＴは、アセタール基である。
ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＣＴ
式１で、ＡＬＤは、アルデヒド作用基であり、ＰＥＧは、ポリエチレングリコール部位であり、ＡＣＴは、アセタール基である。
【0028】
式１で、前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部位は、（－Ｏ－Ｃ２Ｈ４）ｎ－Ｏ－で示され、このとき、ｎは、３０ないし１１５、または５０ないし１００でもある。さらに具体的な例において、ｎは、６７ないし８３の範囲でもある。前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、生理活性ポリペプチド、及びＦｃ切片またはその誘導体と結合し、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を増大させ、該生理活性ポリペプチドを体内に運搬する役割を行うことができる。
【0029】
前記アルデヒド基（ＡＬＤ）は、反応性作用基であり、アルキルアルデヒド、例えば、Ｃ２－Ｃ６アルキルアルデヒドでもある。前記アルデヒド基（ＡＬＤ）は、具体的には、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基などでもあるが、特別にそれらに制限されるものではない。前記アルデヒド基（ＡＬＤ）は、生理活性ポリペプチドと反応し、該生理活性ポリペプチドを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合させることができる。または、前記アルデヒド基（ＡＬＤ）は、Ｆｃ切片またはその誘導体と反応し、Ｆｃ切片またはその誘導体を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合させることができる。
【0030】
前記アセタール基（ＡＣＴ）は、非反応性作用基であり、生理活性ポリペプチド、あるいはＦｃ切片またはその誘導体と反応しない。従って、アルデヒド基（ＡＬＤ）の反応を介し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の一端が、生理活性ポリペプチド、あるいはＦｃ切片またはその誘導体に結合される間、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の他端は、非反応性であるアセタール基（ＡＣＴ）によっても保護される。
【0031】
前記アセタール基（ＡＣＴ）は、－Ｒ１ＣＨ（ＯＲ２）（ＯＲ３）によって示され、Ｒ１ないしＲ３は、互いに独立して、Ｃ２－Ｃ６アルキル基でもある。前記アセタール基（ＡＣＴ）は、具体的には、１，１－ジエトキシプロピル基、１，１－ジエトキシブチル基などでもあるが、特別にそれら制限されるものではない。
【0032】
一方、前記アセタール基（ＡＣＴ）は、アルデヒド基に加水分解され、第２のアルデヒド基（ＡＬＤ）を形成しうる。該第２のアルデヒド基（ＡＬＤ）は、生理活性ポリペプチド、あるいはＦｃ切片またはその誘導体と反応し、該生理活性ポリペプチド、あるいは該Ｆｃ切片またはその誘導体を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の他端に結合させることができる。
【0033】
前記式１のポリエチレングリコール誘導体の具体的な一例は、下記化学式１によっても表示される：
【0034】
化学式１
前記化学式１で、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、あるいは異なるＣ１－Ｃ５アルキル基でもある。このとき、Ｃ１－Ｃ５アルキル基は、線状、分枝状または環状のアルキル基を含むものでもある。該Ｃ１－Ｃ５アルキル基は、例えば、メチル、エチル、プロピルまたはブチルでもある。Ｒ１及びＲ２は、例えば、エチル基でもある。
【化6】
前記化学式１で、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、あるいは異なるＣ１－Ｃ５アルキル基でもある。このとき、Ｃ１－Ｃ５アルキル基は、線状、分枝状または環状のアルキル基を含むものでもある。該Ｃ１－Ｃ５アルキル基は、例えば、メチル、エチル、プロピルまたはブチルでもある。Ｒ１及びＲ２は、例えば、エチル基でもある。
【0035】
ｎは、３０ないし１１５、例えば、５０ないし１００、例えば、６７ないし８３の範囲でもある。前記化学式１のアセタール基は、生理活性ペプチド結合体形成過程において加水分解され、第２のアルデヒド基にも変換される。
【0036】
具体的には、化学式１のポリエチレングリコール誘導体は、下記化学式１Ａによっても表示される：
【0037】
化学式１Ａ
ｎは、化学式１のｎを参照する。
【化7】
ｎは、化学式１のｎを参照する。
【0038】
本発明の他の一態様によるポリエチレングリコール誘導体組成物について説明する。
前述のポリエチレングリコール誘導体は、不純物を含む組成物を形成しうる。前記不純物は、ポリエチレングリコールの両端がいずれもアセタール基であるポリエチレングリコール誘導体、及び／またはポリエチレングリコールの両端がいずれもアルデヒド基であるポリエチレングリコール誘導体を含むものでもある。前記組成物のうち一端は、アルデヒド基を有し、他端は、アセタール基を有するポリエチレングリコール誘導体の含量比につき、一端は、アルデヒド基を有し、他端は、アセタール基を有するポリエチレングリコール誘導体の純度と見ることができる。そのような不純物の含量は、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で測定された当該ピークの面積％としても計算される。
前述のポリエチレングリコール誘導体は、不純物を含む組成物を形成しうる。前記不純物は、ポリエチレングリコールの両端がいずれもアセタール基であるポリエチレングリコール誘導体、及び／またはポリエチレングリコールの両端がいずれもアルデヒド基であるポリエチレングリコール誘導体を含むものでもある。前記組成物のうち一端は、アルデヒド基を有し、他端は、アセタール基を有するポリエチレングリコール誘導体の含量比につき、一端は、アルデヒド基を有し、他端は、アセタール基を有するポリエチレングリコール誘導体の純度と見ることができる。そのような不純物の含量は、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で測定された当該ピークの面積％としても計算される。
【0039】
例えば、ポリエチレングリコール誘導体組成物は、
下記化学式１Ａで表されるポリエチレングリコール誘導体と、
下記化学式２で表されるポリエチレングリコール誘導体と、
下記化学式３で表されるポリエチレングリコール誘導体と、を含むものでもある：
下記化学式１Ａで表されるポリエチレングリコール誘導体と、
下記化学式２で表されるポリエチレングリコール誘導体と、
下記化学式３で表されるポリエチレングリコール誘導体と、を含むものでもある：
【0040】
化学式１Ａ
【化8】
【0041】
化学式２
【化9】
【0042】
化学式３
化学式１Ａ、化学式２及び化学式３でｎは、３０ないし１１５の自然数でもある。
【化10】
化学式１Ａ、化学式２及び化学式３でｎは、３０ないし１１５の自然数でもある。
【0043】
前記組成物において、
前記化学式１Ａで表されるポリエチレングリコール誘導体は、２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある数平均分子量を有し、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、少なくとも７５面積％と示される含量比を有しうる。
前記化学式２で表されるポリエチレングリコール誘導体は、２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある数平均分子量を有し、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、１５面積％以下と示される含量比を有しうる。
前記化学式３で表されるポリエチレングリコール誘導体は、２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある数平均分子量を有し、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、１０面積％以下と示される含量比を有しうる。
前記化学式１Ａで表されるポリエチレングリコール誘導体は、２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある数平均分子量を有し、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、少なくとも７５面積％と示される含量比を有しうる。
前記化学式２で表されるポリエチレングリコール誘導体は、２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある数平均分子量を有し、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、１５面積％以下と示される含量比を有しうる。
前記化学式３で表されるポリエチレングリコール誘導体は、２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある数平均分子量を有し、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、１０面積％以下と示される含量比を有しうる。
【0044】
前記組成物において、前記ポリエチレングリコール誘導体の数平均分子量は、ゲル透過クロマトグラフィで測定された値でもある。
前記組成物において、前記ポリエチレングリコール誘導体の数平均分子量は、ゲル透過クロマトグラフィで測定したとき、３，０００～３，２００の範囲内でもある。
化合物の数平均分子量は、ゲル透過クロマトグラフィによっても測定される。
前記組成物において、前記ポリエチレングリコール誘導体の数平均分子量は、ゲル透過クロマトグラフィで測定したとき、３，０００～３，２００の範囲内でもある。
化合物の数平均分子量は、ゲル透過クロマトグラフィによっても測定される。
【0045】
本発明の他の一態様による生理活性ポリペプチド結合体の製造方法について説明する。
図１は、一態様による生理活性ポリペプチド結合体の製造方法について説明するフローチャートである。
図１を参照すれば、前記生理活性ポリペプチド結合体の製造方法は、まず、一端に、アルデヒド作用基を有し、他端に、アセタール作用基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリエチレングリコール誘導体を提供する（Ｓ１１０）。前記ポリエチレングリコール誘導体は、前述の前述の式１、化学式１または化学式１Ａによって示される化合物であり、前述の式１、化学式１または化学式１Ａの化合物に係わる説明を参照する。
図１は、一態様による生理活性ポリペプチド結合体の製造方法について説明するフローチャートである。
図１を参照すれば、前記生理活性ポリペプチド結合体の製造方法は、まず、一端に、アルデヒド作用基を有し、他端に、アセタール作用基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリエチレングリコール誘導体を提供する（Ｓ１１０）。前記ポリエチレングリコール誘導体は、前述の前述の式１、化学式１または化学式１Ａによって示される化合物であり、前述の式１、化学式１または化学式１Ａの化合物に係わる説明を参照する。
【0046】
次に、前記ポリエチレングリコール誘導体を生理活性ポリペプチドと反応させる（Ｓ１２０）。前記反応により、ポリエチレングリコール誘導体のアルデヒド炭素に、前記生理活性ポリペプチドが共有結合で連結された連結体を形成しうる。そのような連結体形成反応は、ペギル化反応（pegylation reaction）でもある。該ペギル化反応は、還元的アミン化反応でもある。前記ペギル化反応は、ｐＨ３．０～９．０の範囲、例えば、ｐＨ５．０～９．０の範囲においてもなされる。
【0047】
前記生理活性ポリペプチドは、例えば、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液凝固因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質または受容体を含むものでもある。例えば、該生理活性ポリペプチドは、エクセンディン－４またはイミダゾ－アセチルエクセンディン－４（imidazoacetyl exendin-4）でもある。例えば、前記連結体は、前記生理活性ポリペプチドのＮ末端窒素、またはリシンのε－アミノ基窒素の原子が、前記化学式１の化合物のアルデヒド炭素原子に共有結合で連結された物質でもある。
【0048】
次に、一端が、前記生理活性ポリペプチドと結合された前記ポリエチレングリコール誘導体の他端の前記アセタール基を、アルデヒド基に変換させることができる（Ｓ１３０）。
例えば、加水分解により、アセタール基をアルデヒド基に変換させることができる。このとき、該加水分解は、例えば、酸性の水性条件においてもなされる。前記加水分解は、ｐＨ１．０～５．０の範囲、例えば、ｐＨ２．０～５．０の範囲においてもなされる。前記化学式１のアセタール基のＲ１及び／またはＲ２がプロピル基である場合、加水分解されて生成されるアルデヒド基は、プロピオンアルデヒド基でもある。
例えば、加水分解により、アセタール基をアルデヒド基に変換させることができる。このとき、該加水分解は、例えば、酸性の水性条件においてもなされる。前記加水分解は、ｐＨ１．０～５．０の範囲、例えば、ｐＨ２．０～５．０の範囲においてもなされる。前記化学式１のアセタール基のＲ１及び／またはＲ２がプロピル基である場合、加水分解されて生成されるアルデヒド基は、プロピオンアルデヒド基でもある。
【0049】
次に、前記ポリエチレングリコール誘導体の変換されたアルデヒド基を、Ｆｃ切片またはその誘導体と反応させることができる（Ｓ１４０）。前記反応により、前記ポリエチレングリコール誘導体の他端が、Ｆｃ切片またはその誘導体と連結（conjugation）されうる。このとき、該Ｆｃ切片またはその誘導体は、アセタール基の炭素に由来する炭素原子に共有結合によっても連結される。
【0050】
例えば、ポリエチレングリコール誘導体が、前記化学式１で表されるポリエチレングリコール誘導体である場合、該ポリエチレングリコール誘導体のアルデヒド基を、まず、生理活性ポリペプチドと反応させ、該ポリエチレングリコール誘導体の一端に、生理活性ポリペプチドを結合させることができる。このとき、該生理活性ポリペプチドが、アルデヒド基とペギル化反応されうる。該ペギル化反応には、例えば、還元的アミン化反応を利用することができる。次に、そのようにして得られたポリエチレングリコール誘導体・生理活性ポリペプチド連結体において、反応せずに残っていた作用基のアセタール基（ＡＣＴ）を加水分解し、反応性を有する第２のアルデヒド基に変換させることができる。該ポリエチレングリコール誘導体・生理活性ポリペプチド連結体の変換された第２のアルデヒド基を、Ｆｃ切片またはその誘導体と反応させることができる。該反応は、連結反応（conjugation reaction）であり、例えば、還元的アミン化反応を利用することができる。前記還元的アミン化は、ｐＨ５．０～８．５の範囲においてもなされる。該反応により、ポリエチレングリコール誘導体・生理活性ポリペプチド連結体の他端に、Ｆｃ切片またはその誘導体を結合させることができる。そのような過程により、ポリエチレングリコール誘導体の一端は、生理活性ポリペプチドと連結され、他端は、Ｆｃ切片またはその誘導体と連結された生理活性ポリペプチド結合体を形成しうる。前記結合体は、例えば、ポリエチレングリコール誘導体のアセタール炭素に由来する炭素原子に、Ｆｃ切片またはその誘導体のＮ末端プロリンの窒素の原子が、共有結合で連結されている結合体でもある。アセチル炭素は、アセチル基において、－ＯＲ基が連結された炭素である。
【0051】
本発明の具現例によるポリエチレングリコール誘導体を利用した生理活性ポリペプチド結合体の製造方法は、不純物または類縁物質（related substance）の発生を抑制する一方、収率が高いという長所がある。
末端に作用基を含むポリエチレングリコール誘導体に、生理活性ポリペプチドを連結させる段階（ペギル化）において、副産物として、１単位の生理活性ポリペプチドに、２単位以上のポリエチレングリコール誘導体が連結された類縁物質中間体が不可避的に生成されてしまう。該ポリエチレングリコール誘導体の分子量が大きくなければ、一般的なクロマトグラフィ方法だけでは、そのような類縁物質中間体を、後続連結反応段階に入る前に、完璧に精製して濾し出すことが容易ではない。
末端に作用基を含むポリエチレングリコール誘導体に、生理活性ポリペプチドを連結させる段階（ペギル化）において、副産物として、１単位の生理活性ポリペプチドに、２単位以上のポリエチレングリコール誘導体が連結された類縁物質中間体が不可避的に生成されてしまう。該ポリエチレングリコール誘導体の分子量が大きくなければ、一般的なクロマトグラフィ方法だけでは、そのような類縁物質中間体を、後続連結反応段階に入る前に、完璧に精製して濾し出すことが容易ではない。
【0052】
両末端がいずれもアルデヒド作用基を有する従来技術のポリエチレングリコール誘導体を使用する場合、そのように残留する類縁物質中間体が、後続連結段階において、Ｆｃ切片と反応し、多重体（二量体、三量体など）形態の不純物を発生させてしまう。また、従来技術のポリエチレングリコール誘導体を利用した製造においては、ペギル化段階において、生理活性ポリペプチド・ポリエチレングリコール誘導体・生理活性ポリペプチドのようなサンドイッチ構造のポリエチレングリコール連結体も生成され、そのような反応副産物により、収率が低下するという短所があった。
【0053】
両末端がいずれもアルデヒド作用基を有する従来技術のポリエチレングリコール誘導体を使用する場合もまた、アルデヒド基の高い反応性のために、アルデヒド基が反応標的以外の物質とまず反応して消失されていまう。また、該ポリエチレングリコール誘導体の製造過程において、末端基の変質された不純物が生成され、該ポリエチレングリコール誘導体自体が、不純物をある程度含むものでもある。そのようなアルデヒド基の活性消失や変質により、一端のアルデヒド基がヒドロキシ基やエーテル基などに変換され、単一アルデヒド基を有する類縁物質がペギル化反応を行う場合、それに対応する構造のポリエチレングリコール連結体が生成されてしまう。そのようなポリエチレングリコール連結体には、後続連結反応により、Ｆｃ切片またはその誘導体と反応することができるアルデヒド基がないために、最終結合体に至らない。従って、そのような単一アルデヒド基を有する類縁物質の発生は、従来技術の結合体の製造方法において、不純物を生じさせ、収率を落とす原因にもなる。
【0054】
本発明の具現例によるポリエチレングリコール誘導体を、生理活性ポリペプチド結合体の製造に使用する場合、そのような不純物発生を基本的に予防することができる。従来技術のポリエチレングリコール誘導体と異なり、本発明の具現例によるポリエチレングリコール誘導体は、一端にだけアルデヒド基を含むので、基本的に多重体を形成することができない。また、本発明の具現例によるポリエチレングリコール誘導体を利用した製造方法においては、ペギル化前、アルデヒド基が消失したり、類縁物質に変わったりすることになれば、ペギル化生成物である生理活性ポリペプチド・ポリエチレングリコール連結体を始めから生成することができない。従って、類縁物質発生を抑制することができ、精製が簡便になり、それは、ペギル化段階の収率向上につながる。さらには、後述するように、ペギル化後の連結反応段階の効率も、従来技術より高く、精製工程における純度も、改善されるという効果がある。
【0055】
前述の利点と係わり、本発明の製法と従来技術の製法との収率を概括的に比較する。まず、本発明の具体的な実施形態においては、一般的に、ペギル化産物である生理活性ポリペプチド・ポリエチレングリコール連結体のアルデヒド活性度（アルデヒド基が連結反応直前まで維持される程度）が８０～９５％レベルである。それは、従来技術のポリエチレングリコール誘導体を利用した連結体のアルデヒド活性度である６０～７５％と比較し、はるかに高い。また、本発明の製造方法においては、連結段階の収率も向上されるために、本発明の具体的な実施形態として、生理活性ポリペプチド結合体の最終収率は、一般的に、従来技術の製造方法の約１．２倍ないし約１．７倍のレベルで向上される。
【0056】
以下において、本発明の生理活性ポリペプチド結合体の製造方法につき、具体的な実施例を挙げて説明する。
【0057】
まず、エチレングリコール反復部の両末端を、それぞれプロピルアルデヒド基と３－ジエトキシプロピル基とで改質されたポリエチレングリコール誘導体（ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰ）を製造した。
【0058】
●試験例１：ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰの製造１
（ａ）ＰＥＧ－Ｍｓの製造
（ａ）ＰＥＧ－Ｍｓの製造
【化11】
【0059】
窒素大気下の反応器において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（数平均分子量３，４００）１００ｇを、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）３００ｍＬに溶解させた溶液を、５℃に冷却させた。該溶液に、トリエチルアミン（ＴＥＡ）２３．０ｍＬを加え、５℃を維持し、メタンスルホニルクロリド（ＭｓＣｌ）１２．６ｍＬを加えた。この反応液を、５℃で２．５時間撹拌した後、蒸溜水３００ｍＬを加え、１０分間撹拌した後、有機層が分離させた。
【0060】
水層にジクロロメタン３００ｍＬを加え、有機層をさらに抽出した後、すでに分離させた有機層に合わせた。合わせられた有機層を蒸溜水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させて濾過した。濾液を減圧濃縮した後、その濃縮液をジクロロメタン１００ｍＬに溶解させ、メチルｔ－ブチルエーテル１，５００ｍＬに３０分間滴加した。反応液を室温で１時間撹拌した後、固体を濾過し、メチルｔ－ブチルエーテルで固体を洗浄した後、室温で窒素乾燥させ、目的化合物であるＰＥＧ－Ｍｓ（mesylate）９７ｇ（収率：９２．６％）を得た。
【0061】
（ｂ）ＰＥＧ－ＤＥＰの製造
窒素大気下において、第１反応器に、３，３－ジエトキシ－１－プロパノール１．８ｍＬとトルエン４０ｍＬとを投入した。カリウムｔ－ブトキシド（ｔ－ＢｕＯＫ）１．４ｇを投入し、５０℃に昇温させて１時間撹拌し、反応液を室温に冷却させた。
【化12】
窒素大気下において、第１反応器に、３，３－ジエトキシ－１－プロパノール１．８ｍＬとトルエン４０ｍＬとを投入した。カリウムｔ－ブトキシド（ｔ－ＢｕＯＫ）１．４ｇを投入し、５０℃に昇温させて１時間撹拌し、反応液を室温に冷却させた。
【0062】
窒素大気下において、第２反応器に、前述のように製造されたＰＥＧ－Ｍｓ １０ｇと、トルエン４０ｍＬとを投入した。そこに、活性化された第１反応器の溶液を、１時間徐々に滴加した。室温で２時間撹拌し、反応が完結された後、反応物に、飽和された塩化アンモニウム水溶液を添加した。該反応物を５分間撹拌した後、ジクロロメタンを添加し、有機層を抽出した。水層にジクロロメタンを添加し、有機層をさらに抽出した。該有機層を集めて減圧濃縮し、ジクロロメタン１０ｍＬに完全に溶かした後、メチルｔ－ブチルエーテルを滴加して結晶化させた。室温で２時間撹拌した後、結晶を濾過し、メチルｔ－ブチルエーテルで洗浄した。該結晶を室温で窒素乾燥させ、目的化合物であるＰＥＧ－ジエチルアセタル（ＰＥＧ－ＤＥＰ）９．３ｇ（収率：９０．０％）を得た。
【0063】
（ｃ）ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰの製造
反応器に、０．１Ｎ酢酸３６０ｍＬとＰＥＧ－ＤＥＰ ６０ｇとを投入して溶解させた後、２０℃で４時間撹拌した。その溶液に５％炭酸水素ナトリウム水溶液と蒸溜水とを投入した後、５分間撹拌した。その反応液に、ジクロロメタンとヘキサンとを投入し、１０分間撹拌した後、水層が分離させた。該水層に、ジクロロメタンとヘキサンとを投入し、１０分間撹拌した後、有機層が分離させた。該有機層を集め、硫酸マグネシウムで乾燥させて濾過した後、減圧濃縮した。その濃縮液に、ジクロロメタンを加えて溶解させた後、メチルｔ－ブチルエーテルを滴加して結晶化させた。室温で３０分間撹拌した後、結晶を濾過し、メチルｔ－ブチルエーテルで洗浄した。該結晶を室温で窒素乾燥させ、目的化合物を得た。該目的化合物は、３．４ｋＤａエチレングリコール反復部の両末端が、それぞれプロピルアルデヒド基と３－ジエトキシプロピル基とで改質されたポリエチレングリコール誘導体である３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰであり、生成量は、１６．０ｇ（収率：２６．７％）であった。ゲル透過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）で測定した数、平均分子量は、３，１１１であった。
【化13】
反応器に、０．１Ｎ酢酸３６０ｍＬとＰＥＧ－ＤＥＰ ６０ｇとを投入して溶解させた後、２０℃で４時間撹拌した。その溶液に５％炭酸水素ナトリウム水溶液と蒸溜水とを投入した後、５分間撹拌した。その反応液に、ジクロロメタンとヘキサンとを投入し、１０分間撹拌した後、水層が分離させた。該水層に、ジクロロメタンとヘキサンとを投入し、１０分間撹拌した後、有機層が分離させた。該有機層を集め、硫酸マグネシウムで乾燥させて濾過した後、減圧濃縮した。その濃縮液に、ジクロロメタンを加えて溶解させた後、メチルｔ－ブチルエーテルを滴加して結晶化させた。室温で３０分間撹拌した後、結晶を濾過し、メチルｔ－ブチルエーテルで洗浄した。該結晶を室温で窒素乾燥させ、目的化合物を得た。該目的化合物は、３．４ｋＤａエチレングリコール反復部の両末端が、それぞれプロピルアルデヒド基と３－ジエトキシプロピル基とで改質されたポリエチレングリコール誘導体である３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰであり、生成量は、１６．０ｇ（収率：２６．７％）であった。ゲル透過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）で測定した数、平均分子量は、３，１１１であった。
【0064】
●試験例２：ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰの製造２
（ａ）ＰＥＧ－Ｍｓの製造
試験例１のＰＥＧ－Ｍｓの製造方法と同一方法で、ＰＥＧ－Ｍｓを製造した。
【化14】
（ａ）ＰＥＧ－Ｍｓの製造
試験例１のＰＥＧ－Ｍｓの製造方法と同一方法で、ＰＥＧ－Ｍｓを製造した。
【0065】
（ｂ）ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰの製造
窒素大気下において、第１反応器に、３，３－ジエトキシ－１－プロパノール４５ｍＬとトルエン４００ｍＬとを投入した。カリウムｔ－ペントキシド（ｔ－ＰｅＯＫ）１５．７ｇを投入し、５０℃に昇温させ、１時間撹拌した。反応液を室温に冷却させた。
窒素大気下において、第２反応器に、前述のように製造されたＰＥＧ－Ｍｓ １００ｇと、トルエン４００ｍＬとを投入した。そこに、活性化された第１反応器の溶液を、１時間徐々に滴加した。室温で２．５時間撹拌し、反応が完結された後、反応物に蒸溜水を添加した。該反応物を５分間撹拌した後、水層が分離させた。該水層に、ジクロロメタン、トルエンを添加して有機層を抽出した。該有機層に蒸溜水を添加し、５分間撹拌した後、水層をさらに分離させた。
窒素大気下において、第１反応器に、３，３－ジエトキシ－１－プロパノール４５ｍＬとトルエン４００ｍＬとを投入した。カリウムｔ－ペントキシド（ｔ－ＰｅＯＫ）１５．７ｇを投入し、５０℃に昇温させ、１時間撹拌した。反応液を室温に冷却させた。
窒素大気下において、第２反応器に、前述のように製造されたＰＥＧ－Ｍｓ １００ｇと、トルエン４００ｍＬとを投入した。そこに、活性化された第１反応器の溶液を、１時間徐々に滴加した。室温で２．５時間撹拌し、反応が完結された後、反応物に蒸溜水を添加した。該反応物を５分間撹拌した後、水層が分離させた。該水層に、ジクロロメタン、トルエンを添加して有機層を抽出した。該有機層に蒸溜水を添加し、５分間撹拌した後、水層をさらに分離させた。
【0066】
分離された水層に酢酸１３ｍＬを投入し、常温で２．５時間撹拌した。そこに、５％炭酸水素ナトリウム水溶液を投入した後、５分間撹拌した。第３反応器に、ジクロロメタンとヘキサンとを混合させた後、前述の反応液を添加した。その混合液を１０分撹拌した後、水層が分離させた。分離された水層に、５％炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、５分間撹拌した。第３反応器に、ジクロロメタンとヘキサンとを混合させた後、前述の反応液を添加し、１０分撹拌した後、有機層が分離させた。分離された有機層に蒸溜水を投入して撹拌した後、有機層が分離させた。該有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させて濾過した後、減圧濃縮した。その濃縮液にジクロロメタンを加えて溶解させた後、メチルｔ－ブチルエーテルを滴加して結晶化させた。室温で３０分間撹拌した後、結晶を濾過し、メチルｔ－ブチルエーテルで洗浄した。該結晶を室温で窒素乾燥させ、目的化合物である３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰ １０．１ｇ（収率：１０．１％）を得た。ゲル透過クロマトグラフィで測定した数平均分子量は、３，１６３であった。
【0067】
●分析例：ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰとＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤとの特性比較
本発明の具現例による方法によって製造されたポリエチレングリコール誘導体であるＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰと、両末端がプロピルアルデヒド基で改質された、商用のポリエチレングリコール誘導体であるＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ（韓国・韓米精密化学社製）（、エチレングリコール反復部の化学式量が３．４ｋＤａである）の特性を測定して比較した。そのために、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析、核磁気共鳴分析（１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ）及びフーリエ変換赤外線分光法（ＦＴ－ＩＲ）を遂行した。
本発明の具現例による方法によって製造されたポリエチレングリコール誘導体であるＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰと、両末端がプロピルアルデヒド基で改質された、商用のポリエチレングリコール誘導体であるＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ（韓国・韓米精密化学社製）（、エチレングリコール反復部の化学式量が３．４ｋＤａである）の特性を測定して比較した。そのために、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析、核磁気共鳴分析（１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ）及びフーリエ変換赤外線分光法（ＦＴ－ＩＲ）を遂行した。
【0068】
図２Ａ及び図２Ｂは、それぞれ試験例２で製造されたＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰ、及び商用のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析グラフである。以下の表１は、得られた、試験例２で製造されたＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰ、及び商用のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤの分子量を比較した表である。
【0069】
【表1】
【0070】
図２Ａ、図２Ｂ及び表１を参照すれば、試験例２のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰと、市販中のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤとの間に、有意な分子量差がないことが分かる。図３Ａ及び図３Ｂは、それぞれ試験例２のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰ、及び商用のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤの核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルのグラフである。図３Ａ及び図３Ｂの１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいて、ジエトキシ基と符合するピーク（三重線である４．６ｐｐｍ近辺の（ｂ）、及び１．２ｐｐｍ近辺の（ｉ）、多重線である１．８ｐｐｍ近辺の（ｈ）を介し、試験例のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰが、アセタール末端基を有するということを確認することができる。なお、図２Ｂの１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいては、ジエトキシ基と符合するピークが示されていない。
【0071】
図３Ｃ及び図３Ｄは、それぞれ試験例２のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰ、及び商用のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤの核磁気共鳴（１３Ｃ ＮＭＲ）スペクトルのグラフである。図３Ｃの１３Ｃ ＮＭＲスペクトルにおいて、δ １５ｐｐｍ（ｉ），６２ｐｐｍ（ｆ）において、エチル基と符合するピークと、δ １０１ｐｐｍ（ｂ）において、二次炭素のピークとが観察された。図３Ｃのグラフにおいては、分子構造上、非対称である構造を有するＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰのピークが観察され、それと対比し、図３Ｄのグラフにおいては、分子構造上対称である構造をなすＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤのピークが観察された（ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰの（ｅ），（ｆ）ピーク対ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ（ｃ）ピーク、ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰの（ｈ），（ｉ）ピーク対ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤの（ｄ）ピーク）。
【0072】
図４Ａ及び図４Ｂは、それぞれ試験例２のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰ、及び商用のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤのＦＴ－ＩＲスペクトルである。図４Ａ及び図４ＢのＦＴ－ＩＲスペクトルが、類似したピークパターンを有することから、試験例２のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰと、商用のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤとが類似した高分子骨格を有していることが分かる。
【0073】
ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰを含む該ポリエチレングリコール誘導体組成物の純度を把握するために、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分析した。カラムとしては、オクチルシリル化シリカゲルで充填されたカラム（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ（５．０μｍ））を使用し、精製水及びアセト二トリルを移動相にし、逆相クロマトグラフィ法を利用して分析した。ポリエチレングリコール誘導体の含量比を、高性能液体クロマトグラフィで測定された当該ピークの面積の比率として計算した。
【0074】
●実施例１：ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰを利用したＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
【化15】
【0075】
生理活性ポリペプチドとして、ヒトグルカゴン類似ペプチド－２（ＧＬＰ－２）の誘導体である配列番号１のポリペプチドＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）を使用し、生理活性ポリペプチド結合体を製造した。
配列番号１のポリペプチドＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）のアミノ酸配列は、以下の通りである：
(4-imidazoacetyl-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Arg-Ile-Thr-Asp-Lys)
配列番号１のポリペプチドＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）のアミノ酸配列は、以下の通りである：
(4-imidazoacetyl-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Arg-Ile-Thr-Asp-Lys)
【0076】
（１）ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＤＥＰ結合体の製造
３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰのアルデヒド末端に、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）の３４番リシン残基を連結させ、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＤＥＰを製造した。このとき、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）とＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤとのモル比を１：８にし、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）ペプチドの濃度を１０ｍｇ／ｍＬにし、常温で約２５時間反応させた。このとき、反応液としては、５０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ８．０）に、還元剤として１００ｍＭシアン化水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）を含む溶液を使用した。反応終結後、反応混合物を、２０ｍＭビストリス（Bis－Tris）緩衝液（ｐＨ６．２）と、ＮａＣｌ濃度勾配を利用した陰イオン交換クロマトグラフィとを利用して精製することにより、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＤＥＰを分離させた。精製収率は、５９．６％であり、ＳＥ－ＨＰＬＣとＲＰ－ＨＰＬＣと分析結果純度は、それぞれ９９％、９９％であった。
３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰのアルデヒド末端に、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）の３４番リシン残基を連結させ、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＤＥＰを製造した。このとき、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）とＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤとのモル比を１：８にし、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）ペプチドの濃度を１０ｍｇ／ｍＬにし、常温で約２５時間反応させた。このとき、反応液としては、５０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ８．０）に、還元剤として１００ｍＭシアン化水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）を含む溶液を使用した。反応終結後、反応混合物を、２０ｍＭビストリス（Bis－Tris）緩衝液（ｐＨ６．２）と、ＮａＣｌ濃度勾配を利用した陰イオン交換クロマトグラフィとを利用して精製することにより、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＤＥＰを分離させた。精製収率は、５９．６％であり、ＳＥ－ＨＰＬＣとＲＰ－ＨＰＬＣと分析結果純度は、それぞれ９９％、９９％であった。
【0077】
（２）ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体の製造
精製されたＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＤＥＰのジエトキシ作用基（ＤＥＰ）を加水分解し、アルデヒド基（ＡＬＤ）に変換するために、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．０）緩衝液を利用し、ｐＨを低くした後、次の工程のために、２０ｍＭビストリス（ｐＨ６．５）緩衝液を利用し、緩衝液を交換し、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＡＬＤを得た。
精製されたＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＤＥＰのジエトキシ作用基（ＤＥＰ）を加水分解し、アルデヒド基（ＡＬＤ）に変換するために、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．０）緩衝液を利用し、ｐＨを低くした後、次の工程のために、２０ｍＭビストリス（ｐＨ６．５）緩衝液を利用し、緩衝液を交換し、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＡＬＤを得た。
【0078】
（３）ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
次に、そのようにして得られたＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＡＬＤと、免疫グロブリンＦｃ切片（配列番号２）のモル比を１：２にし、全体タンパク質（ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）及び免疫グロブリンＦｃ切片）の濃度を３０ｍｇ／ｍＬにし、室温で１４～１６時間連結反応(conjugation)を進めた。このとき、反応液に、２０ｍＭビストリス（ｐＨ６．２）及びエタノール、還元剤として、３０ｍＭ ＮａＢＨ３ＣＮを添加した。反応が終結された後、その反応混合物から、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）と陰イオン交換クロマトグラフィとを利用し、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃを精製した。精製収率は、７０．２％であり、ＳＥ－ＨＰＬＣとＲＰ－ＨＰＬＣとの分析結果純度は、それぞれ９８．１％、９７％であった。
次に、そのようにして得られたＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＡＬＤと、免疫グロブリンＦｃ切片（配列番号２）のモル比を１：２にし、全体タンパク質（ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）及び免疫グロブリンＦｃ切片）の濃度を３０ｍｇ／ｍＬにし、室温で１４～１６時間連結反応(conjugation)を進めた。このとき、反応液に、２０ｍＭビストリス（ｐＨ６．２）及びエタノール、還元剤として、３０ｍＭ ＮａＢＨ３ＣＮを添加した。反応が終結された後、その反応混合物から、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）と陰イオン交換クロマトグラフィとを利用し、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃを精製した。精製収率は、７０．２％であり、ＳＥ－ＨＰＬＣとＲＰ－ＨＰＬＣとの分析結果純度は、それぞれ９８．１％、９７％であった。
【0079】
配列番号２の免疫グロブリンＦｃのアミノ酸配列は、以下の通りである：
(Pro-Ser-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Phe-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Asn-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Lys)
(Pro-Ser-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Phe-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Asn-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Lys)
【0080】
●比較例１：ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤを利用したＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
（１）ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体の製造
３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ（ＰＧＡ（韓国・韓米精密化学社製））を、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）の３４番リシン残基にペギル化させるために、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）と３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤとのモル比を１：８にし、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）の濃度を１２ｍｇ／ｍＬにし、常温で約２～４時間反応させた。このとき、反応液としての、５０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ８．０）及びイソプロパノールに、還元剤として、２００ｍＭ ２－ピコリンボラン複合体を添加した。反応終結後、反応液を２０ｍＭビストリス（ｐＨ６．２）緩衝液と、塩化ナトリウム濃度勾配を利用した陰イオン交換カラムとに適用し、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＡＬＤを精製した。精製収率は、５５．３％であり、ＳＥ－ＨＰＬＣとＲＰ－ＨＰＬＣとの分析結果純度は、それぞれ９０％、８７％であった（表１）。
【化16】
（１）ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体の製造
３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ（ＰＧＡ（韓国・韓米精密化学社製））を、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）の３４番リシン残基にペギル化させるために、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）と３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤとのモル比を１：８にし、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）の濃度を１２ｍｇ／ｍＬにし、常温で約２～４時間反応させた。このとき、反応液としての、５０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ８．０）及びイソプロパノールに、還元剤として、２００ｍＭ ２－ピコリンボラン複合体を添加した。反応終結後、反応液を２０ｍＭビストリス（ｐＨ６．２）緩衝液と、塩化ナトリウム濃度勾配を利用した陰イオン交換カラムとに適用し、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＡＬＤを精製した。精製収率は、５５．３％であり、ＳＥ－ＨＰＬＣとＲＰ－ＨＰＬＣとの分析結果純度は、それぞれ９０％、８７％であった（表１）。
【0081】
（２）ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
次に、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＡＬＤと免疫グロブリンＦｃ切片（配列番号２）とのモル比を１：２にし、免疫グロブリンＦｃ切片濃度を３０ｍｇ／ｍＬにし、室温で１４～１６時間反応させた。このとき、反応液としての、２０ｍＭビストリス（ｐＨ６．２）とイソプロパノールとに、還元剤として、２０ｍＭ２－ピコリンボラン複合体を含む溶液を使用した。反応終結後、その反応混合物から、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）と陰イオン交換クロマトグラフィとを利用し、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃを精製した。精製収率は、６７．７％であり、ＳＥ－ＨＰＬＣとＲＰ－ＨＰＬＣとの分析結果純度は、それぞれ９８．６％と９６．１％とであった。
次に、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－ＡＬＤと免疫グロブリンＦｃ切片（配列番号２）とのモル比を１：２にし、免疫グロブリンＦｃ切片濃度を３０ｍｇ／ｍＬにし、室温で１４～１６時間反応させた。このとき、反応液としての、２０ｍＭビストリス（ｐＨ６．２）とイソプロパノールとに、還元剤として、２０ｍＭ２－ピコリンボラン複合体を含む溶液を使用した。反応終結後、その反応混合物から、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）と陰イオン交換クロマトグラフィとを利用し、ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃを精製した。精製収率は、６７．７％であり、ＳＥ－ＨＰＬＣとＲＰ－ＨＰＬＣとの分析結果純度は、それぞれ９８．６％と９６．１％とであった。
【0082】
●分析例：ポリエチレングリコール誘導体のアルデヒド基活性油脂
生理活性ポリペプチド結合体製造方法において、Ｆｃ切片との連結反応段階直前まで、アルデヒド基が残留する程度（活性度）につき、本発明のポリエチレングリコール誘導体を利用した実施例と、従来技術の、両末端アルデヒド基ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体を利用した比較例とを比較した。
生理活性ポリペプチド結合体製造方法において、Ｆｃ切片との連結反応段階直前まで、アルデヒド基が残留する程度（活性度）につき、本発明のポリエチレングリコール誘導体を利用した実施例と、従来技術の、両末端アルデヒド基ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体を利用した比較例とを比較した。
【0083】
実施例１の結合体製造工程で使用した生理活性ポリペプチドであるＧＬＰ－２誘導体につき、実施例１に記載されたペギル化、クロマトグラフィ精製及び加水分解の段階まで遂行し、連結体加水分解物を得た。同じ生理活性ポリペプチドにつき、比較例１に記載されたペギル化及びクロマトグラフィ精製まで遂行し、対応する連結体を得た。
【0084】
次に、前記連結体加水分解物及び前記連結体を試薬と反応させ、誘導体を形成し、誘導体生成程度を、紫外線・可視光線分光光度法によって定量することにより、アルデヒド基の活性度を測定し、それを図５に示した。
図５を参照すれば、本発明によるＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰを利用して得られた連結体加水分解物のアルデヒド基活性度は、８７．２％であり、従来のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤを利用して得られた連結体のアルデヒド基活性度６９．８％に比べ、かなり高い比率でもって、アルデヒド基が維持されていることを確認した。
図５を参照すれば、本発明によるＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰを利用して得られた連結体加水分解物のアルデヒド基活性度は、８７．２％であり、従来のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤを利用して得られた連結体のアルデヒド基活性度６９．８％に比べ、かなり高い比率でもって、アルデヒド基が維持されていることを確認した。
【0085】
そのように、本発明の実施例によるポリエチレングリコール誘導体化合物を利用した生理活性ポリペプチド結合体の製造方法において、アルデヒド末端の活性をさらに高く維持することができる。さらには、その後工程において、従来技術の製法と同一精製工程を使用しても、本発明の製造方法の連結(conjugation)反応段階の製造収率が、従来技術より向上された。本発明の実施例の場合、連結反応製造収率は、５０．８％であり、従来のＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ使用時の４０．５％より２５％以上上昇された。
ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体製造において、本発明の実施例１における全体的収率は、３０．３％であり、従来技術の比較例１の２２．４％に比べ、約３５％向上された結果を示した。
ＣＡ ＧＬＰ－２（ＲＫ）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体製造において、本発明の実施例１における全体的収率は、３０．３％であり、従来技術の比較例１の２２．４％に比べ、約３５％向上された結果を示した。
【0086】
●実施例２：ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰを利用したＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
（１）ＣＡ ＥＸＤ４－ＰＥＧ－ＤＥＰ結合体の製造
生理活性ポリペプチドとして、エクセンディン－４の誘導体であるイミダゾアセチル－エクセンディン－４（imidazoacetyl-exendin-4（韓国・韓米精密化学社製）（以下、ＣＡ ＥＸＤ４と表示（配列番号３））を使用し、生理活性ポリペプチド結合体を製造した。
配列番号３のＣＡ ＥＸＤ４のアミノ酸配列は、以下の通りである：
(4-imidazoacetyl-Gly -Glu -Gly -Thr -Phe -Thr -Ser -Asp -Leu -Ser -Lys -Gln -Met -Glu -Glu -Glu -Ala -Val -Arg -Leu -Phe -Ile -Glu -Trp -Leu -Lys -Asn -Gly -Gly -Pro -Ser -Ser -Gly -Ala -Pro -Pro -Pro -Ser -NH2)
【化17】
（１）ＣＡ ＥＸＤ４－ＰＥＧ－ＤＥＰ結合体の製造
生理活性ポリペプチドとして、エクセンディン－４の誘導体であるイミダゾアセチル－エクセンディン－４（imidazoacetyl-exendin-4（韓国・韓米精密化学社製）（以下、ＣＡ ＥＸＤ４と表示（配列番号３））を使用し、生理活性ポリペプチド結合体を製造した。
配列番号３のＣＡ ＥＸＤ４のアミノ酸配列は、以下の通りである：
(4-imidazoacetyl-Gly -Glu -Gly -Thr -Phe -Thr -Ser -Asp -Leu -Ser -Lys -Gln -Met -Glu -Glu -Glu -Ala -Val -Arg -Leu -Phe -Ile -Glu -Trp -Leu -Lys -Asn -Gly -Gly -Pro -Ser -Ser -Gly -Ala -Pro -Pro -Pro -Ser -NH2)
【0087】
試験例１で製造された３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰを、ＣＡ ＥＸＤ４のリシン２７（Ｌｙｓ２７）位置にペギル化させるために、ＣＡ ＥＸＤ４：ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰのモル比を１：３にし、ＣＡ ＥＸＤ４の濃度を１２ｇ／Ｌにし、８±２℃で約１６時間反応させた。具体的には、該反応は、０．１Ｍビス－トリス（ｐＨ７．９）、４５％（ｖ／ｖ）イソプロパノール下でなされ、還元剤として、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＳＣＢ：sodium cyanoborohydride（ＮａＣＮＢＨ３））を５０ｍＭになるように添加し、反応させた。
【0088】
反応終結後、クエン酸ナトリウムとエタノールとが含まれた緩衝溶液と、ＫＣｌ線形濃度勾配とを適用し、ＳＯＵＲＣＥ １５Ｓカラム（Cytiva）を使用し、反応液からＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＤＥＰ結合体を分離させて精製した。
投入されたＣＡ ＥＸＤ４対比で、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＤＥＰの収率は、５０％ほどと確認された。
投入されたＣＡ ＥＸＤ４対比で、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＤＥＰの収率は、５０％ほどと確認された。
【0089】
（２）ＣＡ ＥＸＤ４－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体の製造
ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＤＥＰ結合体のジエトキシプロピル（ＤＥＰ）作用基を、プロピルアルデヒド基（ＡＬＤ）に加水分解させるために、酸性溶液で緩衝液交換を行った。具体的には、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＤＥＰを水に希釈させた後、分離膜限外／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）方法を介し、２５ｍＭ塩酸でもって、緩衝液交換及び濃縮を行い、最終回収濃度が約０．８ｇ／Ｌ以上になるように、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体を分離させた。末端作用基の変換程度を、ＲＰ－ＨＰＬＣ分析法を利用して分析した結果、ジエトキシプロピル基がプロピルアルデヒド基に９５％以上変換されたことを確認した。
ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＤＥＰ結合体のジエトキシプロピル（ＤＥＰ）作用基を、プロピルアルデヒド基（ＡＬＤ）に加水分解させるために、酸性溶液で緩衝液交換を行った。具体的には、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＤＥＰを水に希釈させた後、分離膜限外／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）方法を介し、２５ｍＭ塩酸でもって、緩衝液交換及び濃縮を行い、最終回収濃度が約０．８ｇ／Ｌ以上になるように、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体を分離させた。末端作用基の変換程度を、ＲＰ－ＨＰＬＣ分析法を利用して分析した結果、ジエトキシプロピル基がプロピルアルデヒド基に９５％以上変換されたことを確認した。
【0090】
（３）ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を製造するために、（２）で得られたＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体と、免疫グロブリンＦｃ（配列番号２）とを連結させた。このとき、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体と免疫グロブリンＦｃとのモール比が１：２になるようにし、全体タンパク質（ＣＡ ＥＸＤ４及び免疫グロブリンＦｃ）の濃度を１０ｇ／Ｌにし、室温で２時間反応させた。このとき、反応溶液としては、ビス－トリスと、還元剤であるＳＣＢとを含む溶液を使用した。
ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を製造するために、（２）で得られたＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体と、免疫グロブリンＦｃ（配列番号２）とを連結させた。このとき、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体と免疫グロブリンＦｃとのモール比が１：２になるようにし、全体タンパク質（ＣＡ ＥＸＤ４及び免疫グロブリンＦｃ）の濃度を１０ｇ／Ｌにし、室温で２時間反応させた。このとき、反応溶液としては、ビス－トリスと、還元剤であるＳＣＢとを含む溶液を使用した。
【0091】
反応が終結された後、該反応混合物から、疎水性相互作用クロマトグラフィと陰イオン交換クロマトグラフィとを利用し、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を得た。
投入されたＣＡ ＥＸＤ４生理活性ポリペプチド対比で、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の収率は、５０％ないし６０％ほどと確認された。
投入されたＣＡ ＥＸＤ４生理活性ポリペプチド対比で、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の収率は、５０％ないし６０％ほどと確認された。
【0092】
●比較例２：ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤを利用したＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
（１）ＣＡ ＥＸＤ４－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体の製造
３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ（韓国・韓米精密化学社製）を、エクセンディン－４の誘導体であるＣＡ ＥＸＤ４のＬｙｓ２７位置にペギル化させるために、ＣＡ ＥＸＤ４：ＰＥＧのモル比を１：５にし、ＣＡ ＥＸＤ４の濃度を１８ｇ／Ｌにし、８±２℃で約４時間反応させた。このとき、該反応は、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．５）、４５％イソプロパノールによってなり、還元剤として、ＳＣＢ（ＮａＣＮＢＨ３）を、５０ｍＭになるように添加して反応させた。
【化18】
（１）ＣＡ ＥＸＤ４－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体の製造
３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ（韓国・韓米精密化学社製）を、エクセンディン－４の誘導体であるＣＡ ＥＸＤ４のＬｙｓ２７位置にペギル化させるために、ＣＡ ＥＸＤ４：ＰＥＧのモル比を１：５にし、ＣＡ ＥＸＤ４の濃度を１８ｇ／Ｌにし、８±２℃で約４時間反応させた。このとき、該反応は、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．５）、４５％イソプロパノールによってなり、還元剤として、ＳＣＢ（ＮａＣＮＢＨ３）を、５０ｍＭになるように添加して反応させた。
【0093】
反応が終結された後、クエン酸ナトリウム、エタノールが含まれた緩衝液と、ＫＣｌ線形濃度勾配とを適用し、ＳＯＵＲＣＥ １５Ｓカラム（Cytiva）を使用し、反応液から、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体を分離させて精製した。
その後、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体の精製液を水に希釈させた後、分離膜限外／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）方法を介し、１０ｍＭリン酸カリウム溶液でもって、緩衝液交換及び濃縮し、最終回収濃度が約０．６ｇ／Ｌ以上になるようにした。
その後、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体の精製液を水に希釈させた後、分離膜限外／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）方法を介し、１０ｍＭリン酸カリウム溶液でもって、緩衝液交換及び濃縮し、最終回収濃度が約０．６ｇ／Ｌ以上になるようにした。
【0094】
投入されたＣＡ ＥＸＤ４生理活性ポリペプチド対比で、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体の収率は、３５％ないし４３％と確認された。
【0095】
（２）ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を製造するために、（１）で得られたＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体と、免疫グロブリンＦｃ（配列番号２）とを連結させた。このとき、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体と免疫グロブリンＦｃとのモル比が１：２になるようにし、全体タンパク質（ＣＡ ＥＸＤ４及び免疫グロブリンＦｃ）の濃度を１０ｇ／Ｌにし、室温で１６時間反応させた。このとき、反応液としては、ＨＥＰＥＳと、エタノール還元剤としてのＳＣＢとを含む溶液を使用した。
反応が終結された後、該反応混合物から、疎水性相互作用クロマトグラフィと陰イオン交換クロマトグラフィとを利用し、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を得た。投入生理活性ポリペプチド対比で、収率は、３５％ないし４０％と確認された。
ＣＡ －ＥＸＤ４－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ製造の全体的収率を比較したとき、実施例２の収率は、比較例２の収率より向上された結果を示した。
ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を製造するために、（１）で得られたＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体と、免疫グロブリンＦｃ（配列番号２）とを連結させた。このとき、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－ＡＬＤ結合体と免疫グロブリンＦｃとのモル比が１：２になるようにし、全体タンパク質（ＣＡ ＥＸＤ４及び免疫グロブリンＦｃ）の濃度を１０ｇ／Ｌにし、室温で１６時間反応させた。このとき、反応液としては、ＨＥＰＥＳと、エタノール還元剤としてのＳＣＢとを含む溶液を使用した。
反応が終結された後、該反応混合物から、疎水性相互作用クロマトグラフィと陰イオン交換クロマトグラフィとを利用し、ＣＡ ＥＸＤ４（Ｌｙｓ２７）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を得た。投入生理活性ポリペプチド対比で、収率は、３５％ないし４０％と確認された。
ＣＡ －ＥＸＤ４－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ製造の全体的収率を比較したとき、実施例２の収率は、比較例２の収率より向上された結果を示した。
【0096】
●実施例３：ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰを利用したＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
（１）ＧＣＳＦ－ＰＥＧ－ＤＥＰの製造
生理活性ポリペプチドとしてヒト顆粒球コロニー成長因子（ＧＣＳＦ：granulocyte colony stimulating factor）の誘導体（配列番号４）を利用し、生理活性ポリペプチド結合体を製造した。
配列番号４のＧＣＳＦ誘導体のアミノ酸配列は、以下の通りである：
(TPLGPASSLP QSFLLKSLEQ VRKIQGDGAA LQEKLCATYK LCHPEELVLL GHSLGIPWAP LSSCSSQALQ LAGCLSQLHS GLFLYQGLLQ ALEGISPELG PTLDTLQLDV ADFATTIWQQ MEELGMAPAL QPTQGAMPAF ASAFQRRAGG VLVASHLQSF LEVSYRVLRH LAQP)
試験例１で製造された３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰを、前記ＧＣＳＦ誘導体のＮ末端のスレオニン位置にペギル化させるために、ＧＣＳＦ誘導体：ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰのモル比を１：４にし、ＧＣＳＦ誘導体の濃度を８ｇ／Ｌにし、６±４℃で８時間反応させた。具体的には、該反応は、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）下でなされ、還元剤として、ＳＣＢを５０ｍＭになるように添加して反応させた。
【化19】
（１）ＧＣＳＦ－ＰＥＧ－ＤＥＰの製造
生理活性ポリペプチドとしてヒト顆粒球コロニー成長因子（ＧＣＳＦ：granulocyte colony stimulating factor）の誘導体（配列番号４）を利用し、生理活性ポリペプチド結合体を製造した。
配列番号４のＧＣＳＦ誘導体のアミノ酸配列は、以下の通りである：
(TPLGPASSLP QSFLLKSLEQ VRKIQGDGAA LQEKLCATYK LCHPEELVLL GHSLGIPWAP LSSCSSQALQ LAGCLSQLHS GLFLYQGLLQ ALEGISPELG PTLDTLQLDV ADFATTIWQQ MEELGMAPAL QPTQGAMPAF ASAFQRRAGG VLVASHLQSF LEVSYRVLRH LAQP)
試験例１で製造された３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰを、前記ＧＣＳＦ誘導体のＮ末端のスレオニン位置にペギル化させるために、ＧＣＳＦ誘導体：ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＤＥＰのモル比を１：４にし、ＧＣＳＦ誘導体の濃度を８ｇ／Ｌにし、６±４℃で８時間反応させた。具体的には、該反応は、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）下でなされ、還元剤として、ＳＣＢを５０ｍＭになるように添加して反応させた。
【0097】
結合反応以後、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＤＥＰを、ＳＰ－ＨＰカラム（陽イオン交換クロマトグラフィ）（Cytiva）を利用して精製した。このとき、酢酸ナトリウム緩衝液を使用し、塩化ナトリウム濃度勾配を利用して精製した。
投入されたＧＣＳＦ誘導体対比で、ＧＣＳＦ－ＰＥＧ－ＤＥＰの収率は、６１．２％と確認された。
投入されたＧＣＳＦ誘導体対比で、ＧＣＳＦ－ＰＥＧ－ＤＥＰの収率は、６１．２％と確認された。
【0098】
（２）ＤＥＰ作用基の加水分解
ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＤＥＰのジエトキシプロピル（ＤＥＰ）作用基を、プロピルアルデヒド基（ＡＬＤ）に加水分解させるために、酸性溶液で緩衝液交換を行った。具体的には、精製されたＧＣＳＦ－ＰＥＧ－ＤＥＰを、分離膜限外／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）方法を介し、緩衝液のｐＨを２．０に低くさせた後、常温で１６時間保管した。
ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＤＥＰのジエトキシプロピル（ＤＥＰ）作用基を、プロピルアルデヒド基（ＡＬＤ）に加水分解させるために、酸性溶液で緩衝液交換を行った。具体的には、精製されたＧＣＳＦ－ＰＥＧ－ＤＥＰを、分離膜限外／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）方法を介し、緩衝液のｐＨを２．０に低くさせた後、常温で１６時間保管した。
【0099】
（３）ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
ＧＣＳＦ－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を製造するために、（２）で得られたＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＡＬＤと、免疫グロブリンＦｃ（配列番号２）とを連結させた。このとき、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＡＬＤ連結体と免疫グロブリンＦｃとのモル比が１：４になるようにし、全体タンパク質（ＧＣＳＦ及び免疫グロブリンＦｃ）の濃度を５０ｇ／Ｌにし、６±４℃で１６時間反応させた。具体的には、該反応は、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）下でなされ、還元剤として、ＳＣＢを２０ｍＭになるように添加して反応させた。
反応が終結された後、該反応混合物から、疎水性相互作用クロマトグラフィと陰イオン交換クロマトグラフィとを利用し、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を得た。
投入されたＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＤＥＰ対比で、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の収率は、５０．２％と確認された。
ＧＣＳＦ－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を製造するために、（２）で得られたＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＡＬＤと、免疫グロブリンＦｃ（配列番号２）とを連結させた。このとき、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＡＬＤ連結体と免疫グロブリンＦｃとのモル比が１：４になるようにし、全体タンパク質（ＧＣＳＦ及び免疫グロブリンＦｃ）の濃度を５０ｇ／Ｌにし、６±４℃で１６時間反応させた。具体的には、該反応は、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）下でなされ、還元剤として、ＳＣＢを２０ｍＭになるように添加して反応させた。
反応が終結された後、該反応混合物から、疎水性相互作用クロマトグラフィと陰イオン交換クロマトグラフィとを利用し、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を得た。
投入されたＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＤＥＰ対比で、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の収率は、５０．２％と確認された。
【0100】
●比較例３：ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤを利用したＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
（１）ＧＣＳＦ－ＰＥＧ－ＡＬＤの製造
３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ（ＮＯＦ）を、ＧＣＳＦ誘導体（配列番号４）のＮ末端スレオニン位置にペギル化させるために、ＧＣＳＦ誘導体：ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤのモル比を１：１０にし、ＧＣＳＦ誘導体の濃度を５ｇ／Ｌにし、６±４℃で１．５時間反応させた。具体的には、該反応は、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）下でなされ、還元剤として、ＳＣＢを２０ｍＭになるように添加して反応させた。
結合反応以後、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＡＬＤ連結体を、ＳＰ－ＨＰカラム（Cytiva、陽イオン交換クロマトグラフィ）を利用して精製した。このとき、酢酸ナトリウム緩衝液を使用し、塩化ナトリウム濃度勾配を利用して精製した。
投入ＧＣＳＦ誘導体対比で、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＡＬＤ連結体の収率は、５６．５％と確認された。
【化20】
（１）ＧＣＳＦ－ＰＥＧ－ＡＬＤの製造
３．４ｋＤａ ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ（ＮＯＦ）を、ＧＣＳＦ誘導体（配列番号４）のＮ末端スレオニン位置にペギル化させるために、ＧＣＳＦ誘導体：ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤのモル比を１：１０にし、ＧＣＳＦ誘導体の濃度を５ｇ／Ｌにし、６±４℃で１．５時間反応させた。具体的には、該反応は、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）下でなされ、還元剤として、ＳＣＢを２０ｍＭになるように添加して反応させた。
結合反応以後、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＡＬＤ連結体を、ＳＰ－ＨＰカラム（Cytiva、陽イオン交換クロマトグラフィ）を利用して精製した。このとき、酢酸ナトリウム緩衝液を使用し、塩化ナトリウム濃度勾配を利用して精製した。
投入ＧＣＳＦ誘導体対比で、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＡＬＤ連結体の収率は、５６．５％と確認された。
【0101】
（２）ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を製造するために、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＡＬＤと免疫グロブリンＦｃ（配列番号２）とを連結させた。このとき、ＧＣＳＦ－ＰＥＧ－ＡＬＤ連結体と免疫グロブリンＦｃとのモール比が１：４になるようにし、全体タンパク質（ＧＣＳＦ誘導体及び免疫グロブリンＦｃ）の濃度を５０ｇ／Ｌにし、６±４℃で１６時間反応させた。具体的には、該反応は、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）下でなされ、還元剤として、ＳＣＢを２０ｍＭになるように添加して反応させた。
反応が終結された後、該反応混合物から、疎水性相互作用クロマトグラフィと陰イオン交換クロマトグラフィとを利用し、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を得た。
投入されたＧＣＳＦ誘導体対比で、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＤＥＰ結合体の収率は、３９．９％と確認された。
ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体製造の全体的収率を比較したとき、本発明製法による実施例３は、従来技術の比較例３より１．３６倍向上された結果を示した。
ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を製造するために、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＡＬＤと免疫グロブリンＦｃ（配列番号２）とを連結させた。このとき、ＧＣＳＦ－ＰＥＧ－ＡＬＤ連結体と免疫グロブリンＦｃとのモール比が１：４になるようにし、全体タンパク質（ＧＣＳＦ誘導体及び免疫グロブリンＦｃ）の濃度を５０ｇ／Ｌにし、６±４℃で１６時間反応させた。具体的には、該反応は、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）下でなされ、還元剤として、ＳＣＢを２０ｍＭになるように添加して反応させた。
反応が終結された後、該反応混合物から、疎水性相互作用クロマトグラフィと陰イオン交換クロマトグラフィとを利用し、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を得た。
投入されたＧＣＳＦ誘導体対比で、ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－ＤＥＰ結合体の収率は、３９．９％と確認された。
ＧＣＳＦ誘導体－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体製造の全体的収率を比較したとき、本発明製法による実施例３は、従来技術の比較例３より１．３６倍向上された結果を示した。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-02-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学式１で表される、ポリエチレングリコール誘導体化合物：化学式１
【化1】
前記化学式１で、ｎは、３０ないし１１５の自然数であり、
Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、あるいは異なるＣ１－Ｃ５アルキルである。
【請求項2】
前記Ｃ１－Ｃ５アルキルは、メチル、エチル、プロピルまたはブチルである、請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体化合物。
【請求項3】
前記Ｒ１及び前記Ｒ２は、エチルである、請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体化合物。
【請求項4】
ｎは、５０ないし１００の自然数である、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載のポリエチレングリコール誘導体化合物。
【請求項5】
ｎは、６７ないし８３の自然数である、請求項４に記載のポリエチレングリコール誘導体化合物。
【請求項6】
ポリエチレングリコール誘導体組成物であり、下記化学式１Ａで表されるポリエチレングリコール誘導体と、
下記化学式２で表されるポリエチレングリコール誘導体と、
下記化学式３で表されるポリエチレングリコール誘導体と、を含み、
化学式１Ａ
【化2】
化学式２
【化3】
化学式３
【化4】
前記組成物において、
数平均分子量２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある前記化学式１Ａで表されるポリエチレングリコール誘導体の含量比が、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、少なくとも７０面積％と示され、
数平均分子量範囲２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある前記化学式２で表されるポリエチレングリコール誘導体の含量比が、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、１５面積％以下と示され、
数平均分子量範囲２，９５０ないし３，６５０の範囲内にある前記化学式３で表されるポリエチレングリコール誘導体の含量比が、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）基準で、１０面積％以下と示される、ポリエチレングリコール誘導体組成物。
【請求項7】
前記ポリエチレングリコール誘導体の数平均分子量は、ゲル透過クロマトグラフィで測定したとき、２，９５０～３，６５０の範囲にある、請求項６に記載のポリエチレングリコール誘導体組成物。
【請求項8】
前記ポリエチレングリコール誘導体の数平均分子量は、ゲル透過クロマトグラフィで測定したとき、３，０００～３，２００の範囲にある、請求項７に記載のポリエチレングリコール誘導体組成物。
【請求項9】
（ａ）下記化学式１のポリエチレングリコール誘導体を生理活性ポリペプチドと反応させ、下記化学式１のポリエチレングリコール誘導体のアルデヒド炭素に、前記生理活性ポリペプチドが共有結合で連結された連結体を生成させるペギル化(pegylation)段階と、（ｂ）前記連結体を酸性の水性条件で処理し、連結体加水分解物を生成する加水分解段階と、
（ｃ）前記連結体加水分解物を免疫グロブリンＦｃ切片またはその誘導体に反応させ、結合体を生成する連結(conjugation)段階と、を含み、
前記結合体は、前記連結体加水分解物内の下記化学式１のポリエチレングリコール誘導体のアセタール炭素に由来する炭素原子に、Ｆｃ切片またはその誘導体が共有結合で連結されている構造である、生理活性ポリペプチド結合体の製造方法：
化学式１
【化5】
前記化学式１で、ｎは、５０ないし１００の自然数であり、
Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、あるいは異なるＣ１－Ｃ５アルキルである。
【請求項10】
前記生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液凝固因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質または受容体からなる群のうちから選択される、請求項９に記載の生理活性ポリペプチド結合体の製造方法。
【請求項11】
（ａ）段階の反応は、還元的アミン化であり、前記連結体は、前記生理活性ポリペプチドのＮ末端窒素、またはリシンのε－アミノ基窒素の原子が、前記化学式１の化合物のアルデヒド炭素原子に共有結合で連結された物質である、請求項９に記載の生理活性ポリペプチド結合体の製造方法。
【請求項12】
（ａ）段階のペギル化反応は、ｐＨ３．０～９．０の範囲でなされる、請求項１１に記載の生理活性ポリペプチド結合体の製造方法。
【請求項13】
（ｂ）段階の加水分解は、ｐＨ１．０～５．０の範囲でなされる、請求項１１に記載の生理活性ポリペプチド結合体の製造方法。
【請求項14】
（ｃ）段階の連結反応は、還元的アミン化である、請求項９に記載の生理活性ポリペプチド結合体の製造方法。
【請求項15】
前記還元的アミン化は、ｐＨ５．０～８．５の範囲でなされる、請求項１４に記載の生理活性ポリペプチド結合体の製造方法。
【請求項16】
前記Ｆｃ切片またはその誘導体の配列は、Ｎ末端がプロリンである、請求項９に記載の生理活性ポリペプチド結合体の製造方法。
【請求項17】
前記結合体は、前記アセタール炭素に由来する炭素原子に、Ｆｃ切片またはその誘導体のＮ末端プロリンの窒素の原子が、共有結合で連結されている、請求項１６に記載の生理活性ポリペプチド結合体の製造方法。
【請求項18】
前記Ｆｃ切片またはその誘導体は、配列番号２である、請求項１７に記載の生理活性ポリペプチド結合体の製造方法。
【請求項19】
Ｒ１とＲ２は、エチルである、請求項９に記載の生理活性ポリペプチドの製造方法。
【請求項20】
ｎは、６７ないし８３の自然数である、請求項９に記載の生理活性ポリペプチドの製造方法。
【国際調査報告】