知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ クリップスビーエヌシー・カンパニー・リミテッドの特許一覧 ▶ プサン ナショナル ユニバーシティー インダストリー−ユニバーシティー コーオペレイション ファウンデーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-02
(54)【発明の名称】新規なブドウ状球菌感染疾患の予防または治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/16 20060101AFI20230925BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230925BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230925BHJP
A61K 38/14 20060101ALI20230925BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230925BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230925BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20230925BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230925BHJP
A61K 39/085 20060101ALI20230925BHJP
C07K 16/12 20060101ALI20230925BHJP
C07K 14/31 20060101ALI20230925BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20230925BHJP
【ＦＩ】
A61K38/16
A61P31/04 ZNA
A61K48/00
A61K38/14
A61K39/395 D
A61P9/10
A61P7/02
A61P43/00 121
A61K39/085
C07K16/12
C07K14/31
C12N15/31
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023515623
(86)(22)【出願日】2021-09-08
(85)【翻訳文提出日】2023-05-02
(86)【国際出願番号】 KR2021012222
(87)【国際公開番号】W WO2022055252
(87)【国際公開日】2022-03-17
(31)【優先権主張番号】10-2020-0114435
(32)【優先日】2020-09-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523082772
【氏名又は名称】クリップスビーエヌシー・カンパニー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＬＩＰＳＢＮＣ ＣＯ．，ＬＴＤ．
(71)【出願人】
【識別番号】513281404
【氏名又は名称】プサン ナショナル ユニバーシティ インダストリー－ユニバーシティ コーポレーション ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(74)【代理人】
【識別番号】100176474
【弁理士】
【氏名又は名称】秋山 信彦
(72)【発明者】
【氏名】イ，ボクリュル
(72)【発明者】
【氏名】アン，ドンホ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA13
4C084CA04
4C084DA33
4C084DA44
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZA541
4C084ZA542
4C084ZB351
4C084ZB352
4C084ZC751
4C085AA12
4C085AA13
4C085BA14
4C085BB11
4C085CC07
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG02
4C085GG04
4C085GG06
4H045AA11
4H045AA20
4H045BA10
4H045CA11
4H045DA76
4H045DA86
4H045EA20
4H045EA31
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ブドウ状球菌感染疾患の予防または治療用組成物およびブドウ状球菌感染による血栓性疾患の予防または治療用組成物に関する。本発明は、ブドウ状球菌毒素に対する抗体の交差反応性を活用して、最小限の抗原の組み合わせだけでもブドウ状球菌の１１個の毒素による細胞溶解を万遍なく抑制できる。本発明はまた、オプソニン食作用を誘導し、同時に被感染体における血液凝固を効果的に制御することにより、ブドウ状球菌感染による個別的症状の断片的改善から抜け出して、感染で引き起こされた総合的な病的状態を包括的に除去または軽減させることができる効率的な治療組成物として有用に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｈｌａ（ａｌｐｈａ－ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）、ＬｕｋＳ（Ｌｅｕｋｏｃｉｄａｌ ｔｏｘｉｎ Ｓ）、ＬｕｋＡＢ（Ｌｅｕｋｏｃｉｄａｌ ｔｏｘｉｎ ＡＢ）およびＨｌｇＡ（ｇａｍｍａ－ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）からなる群より選択される３つ以上のブドウ状球菌由来毒素；前記毒素を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片；または前記毒素をコードするヌクレオチドを有効成分として含むブドウ状球菌感染疾患の予防または治療用組成物。
【請求項2】
前記Ｈｌａは、３５番目のアミノ酸残基が置換されたことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記３５番目のアミノ酸残基は、Ｌｅｕに置換されたことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＬｕｋＡＢは、３２３番目のアミノ酸残基が置換されたことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記３２３番目のアミノ酸残基は、Ａｌａに置換されたことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項6】
前記ブドウ状球菌は、メチシリン抵抗性ブドウ状球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、ＭＲＳＡ）であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
ＣｌｆＡ（Ｃｌｕｍｐｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ Ａ）、ＦｎｂｐＡ（ｆｉｂｒｉｎｅｃｔｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）、ＦｎｂｐＢ（ｆｉｂｒｉｎｅｃｔｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ）およびこれらの機能的一部からなる群より選択される１つ以上のタンパク質；前記タンパク質を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片；または前記タンパク質をコードするヌクレオチドを有効成分として含むブドウ状球菌感染疾患の予防または治療用組成物。
【請求項8】
前記機能的一部は、前記タンパク質のＮ２－Ｎ３ドメインを含むことを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記組成物は、ＣｌｆＡのＮ２－Ｎ３ドメインを含む一部の切片およびＦｎｂｐＢのＮ２－Ｎ３ドメインを含む一部の切片；前記切片を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片；または前記切片をコードするヌクレオチドを有効成分として含むことを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記ブドウ状球菌は、メチシリン抵抗性ブドウ状球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、ＭＲＳＡ）であることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項11】
Ｃｏａ（Ｃｏａｇｕｌａｓｅ）、ｖＷｂｐ（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびこれらの機能的一部からなる群より選択される１つ以上のタンパク質；前記タンパク質を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片；または前記タンパク質をコードするヌクレオチドを有効成分として含むブドウ状球菌感染による血栓性疾患（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の予防または治療用組成物。
【請求項12】
前記Ｃｏａの機能的一部は、Ｃｏａタンパク質のＮ－末端から連続した２８４個のアミノ酸残基を含む切片であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記ｖＷｂｐの機能的一部は、ｖＷｂｐタンパク質のＮ－末端から連続した２５３個のアミノ酸残基を含む切片であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項14】
前記ブドウ状球菌は、メチシリン抵抗性ブドウ状球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、ＭＲＳＡ）であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項15】
前記ブドウ状球菌感染による血栓性疾患は、ブドウ状球菌感染による脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、ラクナ梗塞、急性冠動脈症候群、狭心症、大動脈狭窄症、心筋梗塞症、脚ブロック、脳虚血、急性虚血性心血管疾患（ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｒｔｅｒｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｖｅｎｔ）、血栓性静脈炎、静脈血栓塞栓症、深部静脈血栓症（ｄｅｅｐ ｖｅｉｎ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）、肺塞栓症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｅｍｂｏｌｉｓｍ）、末梢血管疾患、アテローム性動脈硬化症、血管痙攣および再狭窄症からなる群より選択される１つ以上の疾患であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項16】
前記組成物は、グリコペプチド（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ）系抗生剤を追加的に含むことを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項17】
前記グリコペプチド系抗生剤は、バンコマイシン、テイコプラニンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
グリコペプチド系抗生剤を有効成分として含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物との併用投与用組成物。
【請求項19】
前記グリコペプチド系抗生剤は、バンコマイシン、テイコプラニンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ブドウ状球菌由来トキシンの特定の組み合わせを有効成分として含むブドウ状球菌感染疾患の予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ブドウ状球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は、人間の皮膚、軟組織および血流で重症感染を引き起こすグラム陽性菌であって、多様な経路を通してベータ－ラクタム系の抗生剤であるメチシリンに対して耐性を有するメチシリン－耐性菌株（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ；ＭＲＳＡ）に変形されうる。このようなＭＲＳＡ感染は治療が難しく、予後が良くなくて、多大な社会的費用を誘発している。
【0003】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの二成分ロイコシジン（ｂｉ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ、ＢＣＬ）は、ポア形成トキシン（ｐｏｒｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｔｏｘｉｎ、ＰＦＴ）ファミリーに属する重要な毒性因子である。ＢＣＬは、宿主細胞をターゲッティングするＳ－成分（クロマトグラフィーカラムで遅く移動するＬｕｋＳ－ＰＶ、ＬｕｋＥ、ＨｌｇＡ、ＨｌｇＣおよびＬｕｋＡ）と重合化Ｆ－成分（クロマトグラフィーカラムで迅速に移動するＬｕｋＦ－ＰＶ、ＬｕｋＤ、ＨｌｇＢおよびＬｕｋＢ）という２つのサブユニットを有する。これに対し、ＬｕｋＡＢは、すでに結合した可溶性ヘテロダイマー形態で分泌され、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ α－トキシン（Ｈｌａ）は、β－バレルＰＦＴを形成する単一成分である。
【0004】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＢＣＬトキシンとＨｌａは、宿主細胞表面で特異的に発現する受容体と結合することで、好中球、単核球／大食細胞および赤血球（ＲＢＣ）のような宿主細胞の溶解を誘導する。ＬｕｋＳＦ－ＰＶおよびＨｌｇＣＢはＣ５ａＲ１とＣ５ａＲ２を用い、ＬｕｋＥＤはＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２を用い、ＨｌｇＡＢおよびＬｕｋＥＤはＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２を受容体として共に用いるが、ＣＣＲ２とＤＡＲＣ（Ｄｕｆｆｙ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ）受容体を用いてもよく、一方、ＬｕｋＡＢはＣＤ１１ｂと結合する。Ｈｌａは、ＲＢＣ、上皮細胞、内皮細胞および好中球、単核球／大食細胞、Ｔ細胞などの免疫細胞の細胞膜で発現するＡＤＡＭ１０タンパク質を認識する。
【0005】
現在までＳ．ａｕｒｅｕｓの侵襲性感染を予防する目的で開発されたワクチンのヒト臨床試験はすべて失敗していた。大部分のワクチンがＳ．ａｕｒｅｕｓの表面抗原に対する高い力価のオプソニン抗体を生成したにもかかわらず、終局的には有効ワクチンに完成できなかったが、これは宿主免疫機序とＳ．ａｕｒｅｕｓの感染メカニズムに対する不完全な理解およびヒトにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓに対する持続可能な長期間の免疫誘導を可能にする手段の不在による。
【0006】
最近、Ｓ．ａｕｒｅｕｓワクチン開発のための２つの新たなアプローチがなされている。１つは、免疫化で生成された抗体を介したオプソニン食作用（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を誘導するためにＳ．ａｕｒｅｕｓの表面抗原を用いることである。生成された抗体は、バクテリア表面に結合してこれを死滅させることが期待されたが、これらのオプソニン抗体ベースのワクチン候補は臨床試験で効果を発揮できず、いくつかは実際にＳ．ａｕｒｅｕｓ感染が発生した時に有害な結果を示した（Ｆｏｗｌｅｒ ＶＧ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊａｍａ３０９：１３６８－７８）。他の１つは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓトキソイドをワクチン候補物質として使用することであり、このような戦略は多重トキソイド抗原の免疫化により中和抗体を誘導するためである。
【0007】
５つのＳ．ａｕｒｅｕｓ ＢＣＬとＨｌａ（α－トキシン）を含む計１１個の成分が、宿主細胞およびＲＢＣでそれぞれ発現する５つの異なる受容体ファミリーであるケモカイン受容体、補体受容体、ＣＤ１１ｂ受容体、ＤＡＲＣ受容体およびＡＤＡＭ１０受容体を特異的に認識するという事実が報告された（Ｗｉｌｋｅ ＧＡ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１０７：１３４７３－８）。活性を有するトキシン成分を用いた免疫化はこれらの毒性によってワクチンとしての使用が困難であり、１１個のトキソイドタンパク質をすべて免疫化する上でも製造上の困難が伴う。
【0008】
そこで、本発明者らは、免疫化により生成された抗体で１１個のトキシン－媒介細胞毒性を広範囲に遮断するための、トキシン候補物質の最も効率的な組み合わせを発掘しようとした。これとともに、本発明者らは、オプソニン食作用を最もよく誘導し、被感染体における血液凝固を最も効果的に制御できるタンパク質の切片およびこれらの組み合わせを探索することにより、ブドウ状球菌感染による個別的症状の断片的改善から抜け出して、感染で引き起こされた総合的な病的状態を包括的に除去または軽減させることができる実質的な予防ワクチンまたは治療剤を開発しようとした。
【0009】
本明細書全体にわたって多数の論文および特許文献が参照され、その引用が表されている。引用された論文および特許文献の開示内容は全体として本明細書に参照により組み込まれ、本発明の属する技術分野の水準および本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明者らは、ブドウ状球菌感染による細胞毒性を著しく中和させて宿主細胞の溶解を効率的に遮断できるブドウ状球菌感染疾患の予防または治療剤組成物を開発すべく、鋭意研究努力した。このために、本発明者らは、ブドウ状球菌由来の各毒素に対する抗体の交差反応性を調べ、これに基づいて最も広範囲な中和活性を発揮する最適な組み合わせを探索した結果、Ｈｌａ、ＬｕｋＳ、ＬｕｋＡＢおよびＨｌｇＡの単一毒素の３つ以上の毒素を組み合わせる場合、より具体的には、４つの毒素をすべて組み合わせる場合、これらを接種して対象体で生成された各抗体によってすべてのブドウ状球菌毒素－媒介細胞溶解活性が万遍なく遮断され、血液溶血作用が著しく抑制できることを見出すことにより、本発明を完成するに至った。
【0011】
したがって、本発明の目的は、ブドウ状球菌感染疾患の予防または治療用組成物を提供することである。本発明の他の目的は、ブドウ状球菌感染による血栓性疾患（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の予防または治療用組成物を提供することである。本発明の他の目的および利点は下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲および図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明の一態様によれば、本発明は、Ｈｌａ（ａｌｐｈａ－ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）、ＬｕｋＳ（Ｌｅｕｋｏｃｉｄａｌ ｔｏｘｉｎ Ｓ）、ＬｕｋＡＢ（Ｌｅｕｋｏｃｉｄａｌ ｔｏｘｉｎ ＡＢ）およびＨｌｇＡ（ｇａｍｍａ－ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）からなる群より選択される３つ以上のブドウ状球菌由来毒素；前記毒素を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片；または前記毒素をコードするヌクレオチドを有効成分として含むブドウ状球菌感染疾患の予防または治療用組成物を提供する。
【0013】
本発明者らは、ブドウ状球菌感染による細胞毒性を著しく中和させて宿主細胞の溶解を効率的に遮断できるブドウ状球菌感染疾患の予防または治療剤組成物を開発すべく、鋭意研究努力した。このために、本発明者らは、ブドウ状球菌由来の各毒素に対する抗体の交差反応性を調べ、これに基づいて最も広範囲な中和活性を発揮する最適な組み合わせを探索した結果、Ｈｌａ、ＬｕｋＳ、ＬｕｋＡＢおよびＨｌｇの３つ以上の毒素を組み合わせる場合、より具体的には、４つの毒素をすべて組み合わせる場合、これらを接種して対象体で生成された各抗体によってブドウ状球菌の１１個の毒素－媒介細胞溶解活性が万遍なく遮断され、血液溶血作用が著しく抑制できることを見出した。
【0014】
本発明は、各毒素タンパク質、またはこれをエンコードするヌクレオチドを対象体に投与して対象体内で各毒素に対する抗体を形成させるワクチンの形態になってもよく、各毒素に対する分離・精製された抗体を薬理成分とする抗体治療剤の形態で用いられてもよい。このため、前者の場合、用語「ブドウ状球菌感染疾患の予防または治療用組成物」は、「ブドウ状球菌ワクチン組成物」と同じ意味を有する。
【0015】
本明細書において、用語「抗体」は、哺乳類の免疫体系によって生成された、抗原のエピトープに結合する１つ以上の可変ドメインを含むことで、当該抗原を特異的に認識する免疫グロブリンタンパク質を意味する。本発明で用いられる各ブドウ状球菌毒素を特異的に認識する抗体としては、多クローンまたは単クローン抗体がすべて使用可能であり、具体的には、交差反応性を有する多クローン抗体を使用することができる。
【0016】
本発明の抗体は、当業界にて通常実施される方法、例えば、融合方法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：５１１－５１９（１９７６））、組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）またはファージ抗体ライブラリー方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８，１－５９７（１９９１））で報告された方法により製造できる。抗体の製造に対する一般的な過程は、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９；およびＺｏｌａ，Ｈ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８４に詳しく記載されている。
【0017】
本明細書において、用語「抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、免疫グロブリン全体構造のうち抗原が結合できるポリペプチドの一部を意味し、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖを含むが、これに限定されるものではない。
【0018】
本明細書において、用語、「特異的に結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、「特異的に認識（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ）」と同じ意味であって、抗原と抗体（またはその断片）が免疫学的反応により特異的に相互作用することを意味する。
【0019】
本発明はまた、上述した４つのトキシンのアミノ酸をコードするヌクレオチドを有効成分として含むＤＮＡワクチンまたはｍＲＮＡワクチンの形態で用いられてもよい。
【0020】
本明細書において、用語「ヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖の形態で存在するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、他に特に言及されていない限り、天然のヌクレオチドの類似体を含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３－５８４（１９９０））。本発明がＤＮＡワクチンまたはｍＲＮＡワクチンの形態で用いられる場合、本発明の３つまたは４つのトキシン遺伝子をそれぞれの遺伝子伝達体（ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）に含めてもよく、複数のトキシン抗原遺伝子を１つの遺伝子伝達体に同時に挿入して対象体で発現させてもよい。
【0021】
本明細書において、用語「発現させる」は、対象体が外来（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子を発現させたり、または内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子の自然的発現量を増加させるために、遺伝子伝達体を用いて人為的にこれを導入することにより、遺伝子が対象体細胞内で染色体外因子としてまたは染色体の統合完成によって複製可能になることを意味する。したがって、用語「発現」は、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」、「形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」または「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」と同じ意味である。
【0022】
本明細書において、用語「遺伝子伝達体」は、所望するターゲット遺伝子を対象細胞に導入して発現させるための媒介体を意味する。理想的な遺伝子伝達体は、人体に無害で、大量生産が容易であり、効率的に遺伝子を伝達できなければならない。
【0023】
本明細書において、用語「遺伝子伝達」は、遺伝子が細胞内に運ばれることを意味し、遺伝子の細胞内浸透（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）と同じ意味を有する。組織レベルで、前記用語の遺伝子伝達は、遺伝子の拡散（ｓｐｒｅａｄ）と同じ意味を有する。したがって、本発明の遺伝子伝達体は、遺伝子浸透システムおよび遺伝子拡散システムと記載されてもよい。
【0024】
本発明の遺伝子伝達体を製造するために、本発明のヌクレオチド配列は、好適な発現コンストラクト（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）内に存在し、発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、転写調節因子結合位置のアレイ）に作動的に連結されることが好ましい。本明細書において、用語「作動的に結合した」は、核酸発現調節配列と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写および／または解読を調節する。
【0025】
本発明の遺伝子伝達体は多様な形態で作製することができるが、これは、（ｉ）ネイキッド（ｎａｋｅｄ）組換えＤＮＡ分子、（ｉｉ）プラスミド、（ｉｉｉ）ウイルスベクター、（ｉｖ）前記ネイキッド組換えＤＮＡ分子またはプラスミドを内包するリポソームまたはニオソームの形態、または（ｖ）ｍＲＮＡを内包するリポソームの形態で作製することができる。
【0026】
本発明の具体的な実施形態によれば、前記Ｈｌａは、Ｈｌａ（ａｌｐｈａ－ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）タンパク質のアミノ酸配列のうち３５番目のアミノ酸残基が置換された変異体である。より具体的には、前記３５番目のアミノ酸Ｈｉｓ残基は、Ｌｅｕに置換される。
【0027】
本発明の具体的な実施形態によれば、前記ＬｕｋＡＢは、ＬｕｋＡＢ（Ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ ＡＢ）タンパク質のアミノ酸配列のうち３２３番目のＧｌｕアミノ酸残基が置換された変異体である。より具体的には、前記３２３番目のアミノ酸Ｇｌｕ残基は、Ａｌａに置換される。
【0028】
本明細書において、用語「予防」は、疾患または疾病を保有していると診断されたことはないが、このような疾患または疾病にかかる可能性がある対象体において疾患または疾病の発生を抑制することを意味する。
【0029】
本明細書において、用語「治療」は、（ａ）疾患、疾病または症状の発展の抑制；（ｂ）疾患、疾病または症状の軽減；または（ｃ）疾患、疾病または症状を除去することを意味する。本発明の組成物を対象体に投与すれば、ブドウ状球菌由来の１１個の毒素で媒介される広範囲な細胞溶解活性が効率的に抑制されることにより、ブドウ状球菌感染による症状の発展を抑制したり、これを除去したり、または軽減させる役割を果たす。したがって、本発明の組成物は、それ自体でこれらの疾患治療の組成物になってもよく、あるいは他の薬理成分と共に投与されて前記疾患に対する治療補助剤として適用されてもよい。このため、本明細書において、用語「治療」または「治療剤」は、「治療補助」または「治療補助剤」の意味を含む。
【0030】
本明細書において、用語「投与」または「投与する」は、本発明の組成物の治療的有効量を対象体に直接的に投与することにより、対象体の体内で同一の量が形成されるようにすることをいう。
【0031】
本発明において、用語「治療的有効量」は、本発明の薬剤学的組成物を投与しようとする個体に組成物中の薬理成分が治療的または予防的効果を提供するのに十分な程度に含有された組成物の含有量を意味し、よって、「予防的有効量」を含む意味である。
【0032】
本明細書において、用語「対象体」は、制限なくヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒヒまたはアカゲザルを含む。具体的には、本発明の対象体は、ヒトである。
【0033】
本発明の具体的な実施形態によれば、前記ブドウ状球菌は、メチシリン抵抗性ブドウ状球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、ＭＲＳＡ）、メチシリン感受性ブドウ状球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、ＭＳＳＡ）または病原性ブドウ状球菌であってもよいし、より具体的には、メチシリン抵抗性ブドウ状球菌である。
【0034】
ブドウ状球菌感染疾患の例は、軟部組織感染、化膿性関節炎、化膿性骨髄炎、中耳炎、肺炎、敗血症、急性呼吸器感染（ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、カテーテルの使用による感染、術後創傷感染、菌血症、心内膜炎および食中毒を含むが、これに限定されるものではない。
【0035】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明の組成物は、有効成分として、前述したブドウ状球菌由来毒素に加えて、グリコペプチド（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ）系抗生剤を追加的に含むことができる。
【0036】
本明細書において、用語「グリコペプチド系抗生剤」は、単糖類が結合した融合環構造であるグリコペプチドコア（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｒｅ）を有する分子量約１，４００Ｄａ以上の親水性抗生剤を意味する。グリコペプチド系抗生剤は、バクテリアのペプチドグリカン合成を抑制し、例えば、ラモプラニン（Ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ）、ダルババンシン（ｄａｌｂａｖａｎｃｉｎ）、オリタバンシン（ｏｒｉｔａｖａｎｃｉｎ）、テラバンシン（ｔｅｌａｖａｎｃｉｎ）、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）およびテイコプラニン（ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ）を含むが、これに限定されず、当業界にて知られたグリコペプチド系抗生剤であればすべて使用可能である。
【0037】
具体的には、本発明で使用されるグリコペプチド系抗生剤は、バンコマイシン、テイコプラニンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【0038】
後述する実施例に示すように、本発明において発掘された毒素の組み合わせまたはこれらの毒素に対する分離・精製された抗体とバンコマイシンまたはテイコプラニンなどのグリコペプチド系抗生剤を併用投与する場合、腎臓内残留バクテリアまで完全除去し、感染個体の生存率もより改善されて、患者に対する多面的かつ相乗的な保護効果が発揮できることを確認した。
【0039】
併用投与は、１つの剤形に、本発明の毒素とグリコペプチド系抗生剤がすべて含まれたまま行われるか、または毒素およびグリコペプチド系抗生剤がそれぞれ含まれた別個の剤形が同時に投与されるか、または任意の順序で適切な時間差をおいて順次に投与されることにより行われる。順次に投与される場合、例えば、本発明の毒素またはこれに対する分離・精製された抗体を先に投与後、グリコペプチド系抗生剤が投与される。
【0040】
本発明の他の態様によれば、本発明は、前述した本発明の組成物を対象体に投与するステップを含むブドウ状球菌感染疾患の予防または治療方法を提供する。
【0041】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、ＣｌｆＡ（Ｃｌｕｍｐｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ Ａ）、ＦｎｂｐＡ（ｆｉｂｒｉｎｅｃｔｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）、ＦｎｂｐＢ（ｆｉｂｒｉｎｅｃｔｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ）およびこれらの機能的一部（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｏｒｔｉｏｎ）からなる群より選択される１つ以上のタンパク質；前記タンパク質を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片；または前記タンパク質をコードするヌクレオチドを有効成分として含むブドウ状球菌感染疾患の予防または治療用組成物を提供する。
【0042】
本発明で使用される抗体またはその抗原結合断片、ヌクレオチドおよび本発明の組成物で予防または治療しようとするブドウ状球菌感染疾患についてはすでに上述したので、過度の重複を避けるためにその記載を省略する。
【0043】
本発明者らはまた、ブドウ状球菌特有の宿主免疫体系回避システムを無力化することにより、ブドウ状球菌感染疾患を予防または治療するか、またはワクチンをはじめとするブドウ状球菌治療組成物の治療感受性を向上させる組成物を探索するために、鋭意研究努力した。その結果、ＭＳＣＲＡＭＭ（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）に属するＣｌｆＡ、ＦｎｂｐＡ、ＦｎｂｐＢおよびこれらの各タンパク質の機能的一部からなる群より選択される１つ以上の組み合わせを対象体に投与する場合、当該タンパク質がバクテリア生菌表面のＭＳＣＲＡＭＭの代わりに宿主血清のＦａｃｔｏｒ Ｈ（ヒト補体因子Ｈ、ＦＨ）と競争的に結合することで補体Ｃ３ｂがｉＣ３ｂに加水分解されることを遮断し、活性が維持されたＣ３ｂによってバクテリアに対するオプソニン食作用が促進されるという事実を見出した。
【0044】
本明細書において、用語「機能的一部（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｏｒｔｉｏｎ）」は、ＣｌｆＡ、ＦｎｂｐＡ、ＦｎｂｐＢタンパク質の生物学的活性を維持するいかなる長さの一部の切片をすべて包括する意味である。したがって、ＣｌｆＡ、ＦｎｂｐＡ、ＦｎｂｐＢタンパク質の機能的一部とは、血清のＦＨと特異的に相互作用できるか、バクテリア生菌表面のＭＳＣＲＡＭＭに特異的に結合可能な抗体の生成を誘導する抗原として機能できる各タンパク質の一部の切片を意味する。
【0045】
本発明の具体的な実施形態によれば、前記機能的一部は、前記タンパク質のＮ２－Ｎ３ドメインを含む切片であり、より具体的には、前記タンパク質のＮ２－Ｎ３ドメイン（ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３およびＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３）である。ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３およびＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３とＦＨとの間の相互作用は知られており、本発明者らは、これらの切片がＦＨに競争的結合をしたり、これらに対する抗体がバクテリア生菌表面のＭＳＣＲＡＭＭと競争的結合をすることで、宿主血清のＦＨとバクテリア表面のＭＳＣＲＡＭＭとの間の相互作用が効率的に遮断できることを初めて究明した。
【0046】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明の組成物は、ＣｌｆＡのＮ２－Ｎ３ドメインを含む一部の切片およびＦｎｂｐＢのＮ２－Ｎ３ドメインを含む一部の切片；前記切片を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片；または前記切片をコードするヌクレオチドを有効成分として含む。
【0047】
本発明の組成物が薬剤学的組成物に製造される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。
【0048】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分のほか、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加的に含むことができる。好適な薬剤学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【0049】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与可能であり、具体的には、静脈、皮下または腹腔投与されてもよい。
【0050】
本発明の薬剤学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方可能である。本発明の薬剤学的組成物の好ましい投与量は、成人ベースで０．００１－１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【0051】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することで単位用量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造されてもよい。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよいし、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。
【0052】
本発明の薬剤学的組成物がワクチン組成物に製造される場合、本発明の複数の抗原と多様な形態の適したアジュバントが選択的に組み合わされた１つのバイアル（ｖｉａｌ）または注射器（ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ ｓｙｒｉｎｇｅ）などに包装されるか、またはそれぞれの抗原とアジュバントが別個のバイアルに包装されて、使用直前にこれを混合して（用時調製、ｂｅｄ ｓｉｄｅ ｍｉｘｉｎｇ）使用することができる。
【0053】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述した本発明の組成物を対象体に投与するステップを含むブドウ状球菌感染疾患の予防または治療方法を提供する。
【0054】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、Ｃｏａ（ｃｏａｇｕｌａｓｅ）、ｖＷｂｐ（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびこれらの機能的一部（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｏｒｔｉｏｎ）からなる群より選択される１つ以上のタンパク質；前記タンパク質を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片；または前記タンパク質をコードするヌクレオチドを有効成分として含むブドウ状球菌感染による血栓性疾患（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の予防または治療用組成物を提供する。
【0055】
本発明者らは、宿主血管においてフィブリン凝固を誘発するブドウ状球菌特有の宿主免疫システム回避メカニズムを効率的に遮断することにより、感染時の血液凝固による患者の全身的損傷を最小化し、生存性をさらに向上させる方法を開発すべく、鋭意研究努力した。その結果、ブドウ状球菌の主要毒性因子として知られたコアグラーゼ（Ｃｏａ）およびｖＷＦ－結合ドメインタンパク質（ｖＷｂｐ）、具体的には、これらの特定の機能的切片を用いる場合、その接種により生成された抗体によって血液凝固が有意に抑制されることを確認した。
【0056】
本明細書において、ＣｏａまたはｖＷｂｐタンパク質を言及して使われる用語「機能的一部（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｏｒｔｉｏｎ）」は、Ｃｏａ、ｖＷｂｐタンパク質の生物学的活性を維持するいかなる長さの一部の切片をすべて包括する意味である。したがって、ブドウ状球菌表面タンパク質（例えば、Ｆｎｂｐ）によって認識されるか、またはブドウ状球菌感染による血液凝固を有意に抑制する抗体の生成を誘導する抗原として機能できる各タンパク質の一部の切片を意味する。
【0057】
本発明の具体的な実施形態によれば、前記Ｃｏａの機能的一部は、Ｃｏａタンパク質のＮ－末端切片であり、より具体的には、Ｎ－末端から連続した２８４個のアミノ酸残基を含む切片である。
【0058】
本発明の具体的な実施形態によれば、前記ｖＷｂｐの機能的一部は、ｖＷｂｐタンパク質のＮ－末端切片であり、より具体的には、ｖＷｂｐタンパク質のＮ－末端から連続した２５３個のアミノ酸残基を含む切片である。
【0059】
本明細書において、用語「血栓性疾患」は、血管の微細循環系に血小板やフィブリンタンパク質が凝集されながら生成された血栓によって血流が減少または遮断され、これによって腎臓、心臓、脳などの各器官に虚血性損傷が誘発される全身疾患を意味する。
【0060】
具体的には、本発明の組成物で予防または治療しようとするブドウ状球菌感染による血栓性疾患は、ブドウ状球菌感染による脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、ラクナ梗塞、急性冠動脈症候群、狭心症、大動脈狭窄症、心筋梗塞症、脚ブロック、脳虚血、急性虚血性心血管疾患（ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｒｔｅｒｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｖｅｎｔ）、血栓性静脈炎、静脈血栓塞栓症、深部静脈血栓症（ｄｅｅｐ ｖｅｉｎ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）、肺塞栓症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｅｍｂｏｌｉｓｍ）、末梢血管疾患、アテローム性動脈硬化症、血管痙攣および再狭窄症からなる群より選択される１つ以上の疾患である。
【0061】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述した本発明の組成物を対象体に投与するステップを含むブドウ状球菌感染による血栓性疾患（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の予防または治療方法を提供する。
【発明の効果】
【0062】
本発明の特徴および利点をまとめると、次の通りである：
（ａ）本発明は、ブドウ状球菌感染疾患の予防または治療用組成物およびブドウ状球菌感染による血栓性疾患の予防または治療用組成物を提供する。
（ｂ）本発明は、ブドウ状球菌毒素に対する抗体の交差反応性を活用して、最小限の毒素抗原の組み合わせだけでもブドウ状球菌の１１個の毒素による細胞溶解を万遍なく抑制することができる。
（ｃ）本発明はまた、オプソニン食作用を誘導し、同時に被感染体における血液凝固を効果的に制御することにより、ブドウ状球菌感染による個別的症状の断片的改善から抜け出して、感染で引き起こされた総合的な病的状態を包括的に除去または軽減させることができる効率的な治療組成物として有用に利用可能である。
（ａ）本発明は、ブドウ状球菌感染疾患の予防または治療用組成物およびブドウ状球菌感染による血栓性疾患の予防または治療用組成物を提供する。
（ｂ）本発明は、ブドウ状球菌毒素に対する抗体の交差反応性を活用して、最小限の毒素抗原の組み合わせだけでもブドウ状球菌の１１個の毒素による細胞溶解を万遍なく抑制することができる。
（ｃ）本発明はまた、オプソニン食作用を誘導し、同時に被感染体における血液凝固を効果的に制御することにより、ブドウ状球菌感染による個別的症状の断片的改善から抜け出して、感染で引き起こされた総合的な病的状態を包括的に除去または軽減させることができる効率的な治療組成物として有用に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【0063】
【0064】
【0065】
【図3】図３は、組換えＢＣＬ、トキソイド、トキシンの精製結果およびこれらの細胞溶媒および溶血活性の測定結果を示す図である。図３Ａは、各タンパク質５μｇを還元条件下で１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにローディングした結果である。図３Ｂは、トキソイドタンパク質５μｇのＳＤＳ－ＰＡＧＥパターンを示す。図３Ｃは、ヒトＰＭＮ（２×１０６細胞）を０．１２５μｇの精製されたＢＣＬおよびトキソイドと１時間共培養した結果を示す。カラム１、トキシンなし；２、ＬｕｋＳＴ２４４Ａ－ＰＶ＋ＬｕｋＦ－ＰＶ；３、ＬｕｋＡＥ３２３ＡＢ；４、ＬｕｋＳ－ＰＶ＋ＬｕｋＦ－ＰＶ；５、ＬｕｋＥ＋ＬｕｋＤ；６、ＨｌｇＣ＋ＨｌｇＢ；７、ＨｌｇＡ＋ＨｌｇＢ；８、ＬｕｋＡＢ。図３Ｄは、２％ラビットＲＢＣをＨｌａＷＴ（０．２５μｇ）およびＨｌａＨ３５Ｌ（０．２５μｇ）トキソイドと３７℃で１時間共培養した結果を示す。カラム：１、ＰＢＳ；２、ＨｌａＷＴ；３、ＨｌａＨ３５Ｌ
【0066】
【0067】
【0068】
【0069】
【0070】
【図8】図８は、ＰＭＮ（２×１０６細胞）とＢＣＬの同系Ｓ－成分（０．２５μｇ／ｍｌ）およびＦ－成分（０．２５μｇ／ｍｌ）の混合物を共培養時の、ヒトＰＭＮの生存率を示す図であって、精製された抗－ＬｕｋＥ＋ＬｕｋＤ－ＩｇＧ（Ａ）、抗－ＨｌｇＡ＋ＨｌｇＢ－ＩｇＧ（Ｂ）、抗－ＨｌｇＣ＋ＨｌｇＢ－ＩｇＧ（Ｃ）、抗－ＬｕｋＳ＋ＬｕｋＦ－ＩｇＧ（Ｄ）および抗－ＬｕｋＡＢ－ＩｇＧ（Ｅ）の存在下で実験した結果をそれぞれ示す。カラム１、トキシンなし（緑色）；カラム２、ＨｌｇＡ＋ＨｌｇＢ（褐色）；カラム３、ＬｕｋＥ＋ＬｕｋＤ（薄緑色）；カラム４、ＬｕｋＳ－ＰＶ＋ＬｕｋＦ－ＰＶ（青色）；カラム５、ＨｌｇＣ＋ＨｌｇＢ（黄色）；カラム６、ＬｕｋＡＢ（橙色）。
【0071】
【図9】図９は、ＰＭＮ（２×１０６細胞）とＢＣＬの同系Ｓ－成分（０．２５μｇ／ｍｌ）およびＦ－成分（０．２５μｇ／ｍｌ）の混合物を共培養時の、ヒトＰＭＮの生存率を示す図であって、精製された抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ＋ＨｌｇＣ－ＩｇＧ（Ａ）、抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ＋ＨｌｇＡ－ＩｇＧ（Ｂ）、抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ＋ＬｕｋＥ－ＩｇＧ（Ｃ）、抗－ＨｌｇＡ＋ＬｕｋＥ－ＩｇＧ（Ｄ）、抗－ＨｌｇＡ＋ＨｌｇＣ－ＩｇＧ（Ｅ）および抗－ＨｌｇＣ＋ＬｕｋＥ－ＩｇＧ（Ｆ）の存在下で実験した結果をそれぞれ示す。カラム１、トキシンなし（緑色）；カラム２、ＨｌｇＡ＋ＨｌｇＢ（褐色）；カラム３、ＬｕｋＥ＋ＬｕｋＤ（薄緑色）；カラム４、ＬｕｋＳ－ＰＶ＋ＬｕｋＦ－ＰＶ（青色）；カラム５、ＨｌｇＣ＋ＨｌｇＢ（黄色）；カラム６、ＬｕｋＡＢ（橙色）。
【0072】
【図10】図１０は、ＰＭＮ（２×１０６細胞）とＢＣＬの同系Ｓ－成分（０．２５μｇ／ｍｌ）およびＦ－成分（０．２５μｇ／ｍｌ）の混合物を共培養時の、ヒトＰＭＮの生存率を示す図であって、精製された抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ＋ＨｌｇＢ－ＩｇＧ（Ａ）、抗－ＬｕｋＤ＋ＨｌｇＢ－ＩｇＧ（Ｂ）、抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ＋ＬｕｋＤ－ＩｇＧ（Ｃ）および抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ＋ＬｕｋＤ＋ＨｌｇＢ－ＩｇＧ（Ｄ）の存在下で実験した結果をそれぞれ示す。カラム１、トキシンなし（緑色）；カラム２、ＨｌｇＡ＋ＨｌｇＢ（褐色）；カラム３、ＬｕｋＥ＋ＬｕｋＤ（薄緑色）；カラム４、ＬｕｋＳ－ＰＶ＋ＬｕｋＦ－ＰＶ（青色）；カラム５、ＨｌｇＣ＋ＨｌｇＢ（黄色）；カラム６、ＬｕｋＡＢ（橙色）。
【0073】
【図11】図１１は、ＰＭＮ（２×１０６細胞）とＢＣＬの同系Ｓ－成分（０．２５μｇ／ｍｌ）およびＦ－成分（０．２５μｇ／ｍｌ）の混合物を共培養時の、ヒトＰＭＮの生存率を示す図であって、精製された抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ＋ＨｌｇＡ＋ＬｕｋＡＢＥ３２３Ａ－ＩｇＧ（Ａ）、抗－ＬｕｋＥ＋ＬｕｋＡＢＥ３２３Ａ－ＩｇＧ（Ｂ）および抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ＋ＨｌｇＢ＋ＬｕｋＤ＋ＬｕｋＡＢＥ３２３Ａ－ＩｇＧ（Ｃ）の存在下で実験した結果をそれぞれ示す。カラム１、トキシンなし（緑色）；カラム２、ＨｌｇＡ＋ＨｌｇＢ（褐色）；カラム３、ＬｕｋＥ＋ＬｕｋＤ（薄緑色）；カラム４、ＬｕｋＳ－ＰＶ＋ＬｕｋＦ－ＰＶ（青色）；カラム５、ＨｌｇＣ＋ＨｌｇＢ（黄色）；カラム６、ＬｕｋＡＢ（橙色）。
【0074】
【0075】
【0076】
【0077】
【0078】
【0079】
【0080】
【0081】
【0082】
【0083】
【図21】図２１は、ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインと精製されたヒトまたはラビットＣＷＡＰＮ２Ｎ３認識ＩｇＧによるＳ．ａｕｒｅｕｓの死滅活性を示す図である。図２１Ａは、１００μｌのＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ細胞（１×１０５細胞／ウェル）に５μｇのそれぞれの精製されたＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインを添加し、ＣＦＵを測定した結果を示す。統計的分析は独立スチューデントｔ－検定で行った。＊、ｐ≦０．０５；ＮＳ：統計的有意性なし。１００μｌのＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ細胞（１×１０５細胞／ウェル）に精製されたヒト（図２１Ｂ）およびラビット（図２１Ｃ）ＩｇＧを添加し、ＣＦＵを測定した結果を示す。統計的分析は独立スチューデントｔ－検定を用いて行った。＊、ｐ≦０．０５；＊＊、ｐ≦０．０１；＊＊＊、ｐ≦０．００１；＊＊＊、ｐ≦０．０００１；ＮＳ：統計的有意性なし。
【0084】
【図22】図２２は、本発明の組成物の作用機序に対する模式図を示す図である。大部分のＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株は表面でＣＷＡＰを発現するが、バクテリアが宿主に侵入すれば、血清補体であるＦＨがＤＬＬメカニズムによってＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインに結合する（１４、１５）。同時に、バクテリアを認識するやいなや、ヒト補体の活性化によってＣ３ｂが表面に蓄積されるはずであり、続いてＦＨがＦＩを引き寄せて蓄積されたＣ３ｂをｉＣ３ｂに転換することにより、宿主の好中球によるＣ３ｂ－媒介オプソニン食作用を減少させる（中間図）。抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３－ＩｇＧがバクテリア表面タンパク質と結合すれば、ＦＨはこれらのＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインと結合できない。ＦＨがバクテリアに移動することを抑制することにより、ＦＩ－媒介Ｃ３ｂの不活性化も減少し、増加した量のＣ３ｂがＣ３ｂ－媒介オプソニン食作用をより良く起こすようになる（左図）。ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインをＳ．ａｕｒｅｕｓ感染部位に投与すれば、これらのタンパク質は血清ＦＨを捕集し、バクテリア表面にＣ３ｂがより良く蓄積されるようにして、Ｃ３ｂ－媒介オプソニン食作用を強化する（右図）。
【0085】
【0086】
【図24】図２４Ａは、還元（左）および非還元（右）条件下で精製された抗－ＦＨ－ＩｇＧおよび抗－ＦＨ－Ｆａｂ’２のＳＤＳ－ＡＰＧＥパターンを示す図である。レーン１、ゴート抗－ヒト因子Ｈ ＩｇＧ；レーン２、ペプシン処理ゴート抗－ヒト因子Ｈ ＩｇＧ；レーン３、タンパク質Ａカラムの通過（ｐａｓｓ－ｔｈｒｏｕｇｈ）分画；レーン４、タンパク質Ａカラム上のペプシン処理ゴート抗－ヒト因子Ｈの分画。図２４Ｂは、６つのタンパク質に対する抗－ＦＨ－ＩｇＧおよび抗－ＦＨ－Ｆ（ａｂ’）２切片の結合特異性を示す図である。図２４Ｃは、５つの抗－ＣＷＡＰ－Ｆａｂ’２切片の７つの異なるＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインに対する結合特異性を示す図である。
【0087】
【0088】
【0089】
【0090】
【0091】
【0092】
【0093】
【0094】
【図32】図３２は、抗－Ｆｎｂｐ－Ｆ（ａｂ’）２切片を用いてＣｏａおよびＦｎｂｐタンパク質の間の結合特異性を確認した結果を示す図である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ細胞（１×１０５細胞）をＣｏａＣと共に１時間培養し、バクテリアペレットを得てＣｏａタンパク質がバクテリア表面に移動したことを確認した（レーン１）。対照群としてバクテリアをＣｏａＣおよび抗－ＳｄｒＣ－Ｆ（ａｂ’）２切片と共に培養しても、ＣｏａＣはバクテリア表面に移動した（レーン２）。しかし、バクテリアをＣｏａＣおよび抗－ＦｎＢｐ－Ｆ（ａｂ’）２切片と共に培養する場合、添加されたＣｏａＣの量はバクテリア表面で大きく減少した（レーン３および４）。これにより、ＦｎＢｐは分泌されるＣｏａＣと選択的な結合能力があることが分かる。
【0095】
【0096】
【図34】図３４は、分泌されたＣｏａおよびｖＷｂｐ－媒介血液凝固が抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ ＩｇＧまたは抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ ＩｇＧによって抑制されることを示す図である。チューブ１、ＲＰＭＩ（１００μｌ）＋ヒト血液（２００μｌ）を１．５時間培養；チューブ２、１μｇのＣｏａｗｈｏｌｅを血液（２００μｌ）と共に１．５時間培養。チューブ３、５μｇのｖＷｂｐを２００μｌの血液に添加；チューブ５、ＵＳＡ３００培養培地（１００μｌ）＋血液；チューブ６、抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ ＩｇＧ（８０μｇ）をＵＳＡ３００培養培地（１００μｌ）＋血液に添加；チューブ７、抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ ＩｇＧ（８０μｇ）＋培養培地および血液；チューブ８、ＵＳＡ３００培養培地（１００μｌ）＋抗－コアグラーゼｗｈｏｌｅ ＩｇＧ（４０μｇ）および抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ ＩｇＧ（４０μｇ）；チューブ９、ＵＳＡ３００培養培地（１００μｌ）＋抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ ＩｇＧ（８０μｇ）＋抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ ＩｇＧ（８０μｇ）＋血液。
【0097】
【0098】
【図36】図３６は、ＵＳＡ３００菌培養液中に含まれたＣｏａまたはｖＷｂｐによる血液凝固（図３６Ａ）と、ＣｏａＮおよびｖＷｂｐＮ－媒介凝固（図３６Ｂ）が抗－ＣｏａＮ－ＩｇＧおよび抗－ｖＷｂｐＮ－ＩｇＧによって抑制されるが、抗－ＣｏａＣおよび抗－ｖＷｂｐＣ ＩｇＧによって抑制されないことを示す図である。図３６Ａのチューブ１、血液２００μｌ＋ＲＰＭＩ培地（１００μｌ）を常温で２．５時間培養；チューブ２、血液＋培養培地（１００μｌ）；チューブ３、血液＋培養培地＋ＣｏａＮ－Ａｂ（６０μｇ）；チューブ４、血液＋培養培地＋ｖＷｂｐＮ－Ａｂ（６０μｇ）；チューブ５、血液＋培養培地＋ＣｏａＣ－Ａｂ；チューブ６、血液＋培養培地＋ｖＷｂｐＣ－Ａｂ（６０μｇ）；図３６Ｂのチューブ１、血液（２００μｌ）＋ＲＰＭＴ（１００μｌ）；チューブ２、血液＋ＣｏａＮ（５μｇ）；チューブ３、血液＋ｖＷｂｐＮ（５μｇ）；チューブ４、血液＋ＣｏａＮ（５μｇ）＋抗－ＣｏａＮ－Ａｂ（８０μｇ）；チューブ５、血液＋ｖＷｂｐＮ（５μｇ）＋抗－ｖＷｂｐＮ－Ａｂ（８０μｇ）。
【0099】
【0100】
【0101】
【0102】
【0103】
【発明を実施するための形態】
【0104】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【実施例】
【0105】
実施例１：ブドウ状球菌トキシンの選定
実験方法
実験倫理
ヒト血液は４人の健康な志願者から得ており、韓国の釜山（プサン）大学ＩＲＢの承認下ですべての実験が行われた（ＰＮＵ ＩＲＢ／２０１９＿５９＿ＢＲ）。すべての研究参加者から書面による同意書を受け取った。
実験方法
実験倫理
ヒト血液は４人の健康な志願者から得ており、韓国の釜山（プサン）大学ＩＲＢの承認下ですべての実験が行われた（ＰＮＵ ＩＲＢ／２０１９＿５９＿ＢＲ）。すべての研究参加者から書面による同意書を受け取った。
【0106】
バクテリア
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ菌株はＴＳＢ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）で中間対数期（ｍｉｄ－ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ ｐｈａｓｅ）（ＯＤ６００ ０．８－１．５）まで３７℃で撹拌しながら培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α菌株は３７℃で撹拌しながら１０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｋｍ）が補充されたＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）で培養した。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ菌株はＴＳＢ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）で中間対数期（ｍｉｄ－ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ ｐｈａｓｅ）（ＯＤ６００ ０．８－１．５）まで３７℃で撹拌しながら培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α菌株は３７℃で撹拌しながら１０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｋｍ）が補充されたＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）で培養した。
【0107】
組換えＢＣＬトキシンの精製およびトキソイドの生産
ポリヒスチジン－タギングされた組換えトキシンをクローニングしてＥ．ｃｏｌｉ発現システムにより発現させた。ＵＳＡ３００ゲノム配列から、ターゲット遺伝子であるＬｕｋＳ－ＰＶ、ＬｕｋＦ－ＰＶ、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、ＨｌｇＡ、ＨｌｇＢ、ＨｌｇＣ、ＬｕｋＡＢ、Ｈｌａ、ＨｌａＨ３５Ｌ、ＬｕｋＳＴ２４４Ａ－ＰＶ、ＬｕｋＡＥ３２３ＡＢをＱ５ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ重合酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物をｐＥＴ２８ａ－ベクターにクローニングしてＮ－末端またはＣ－末端に６ｘ Ｈｉｓ－タギングされたタンパク質を得た。ＬｕｋＡＢおよびＬｕｋＡＥ３２３ＡＢを精製するために、６ｘ Ｈｉｓ－タグをＮ－およびＣ－末端の両側に挿入し、得られたクローンをシーケンシングして構造を確認した。組換えタンパク質は０．２ｍＭイソプロピル－ｌβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．２ｍＭの濃度）を用いてＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉで発現した。発現したタンパク質はＮｉ－セファロース６高速レジン（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－５３１８－０１、５ｍｌ）とローディング緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）、洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）および溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を用いて精製した。実施例１で使用されたプライマー配列は下記表１に示した。
ポリヒスチジン－タギングされた組換えトキシンをクローニングしてＥ．ｃｏｌｉ発現システムにより発現させた。ＵＳＡ３００ゲノム配列から、ターゲット遺伝子であるＬｕｋＳ－ＰＶ、ＬｕｋＦ－ＰＶ、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、ＨｌｇＡ、ＨｌｇＢ、ＨｌｇＣ、ＬｕｋＡＢ、Ｈｌａ、ＨｌａＨ３５Ｌ、ＬｕｋＳＴ２４４Ａ－ＰＶ、ＬｕｋＡＥ３２３ＡＢをＱ５ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ重合酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物をｐＥＴ２８ａ－ベクターにクローニングしてＮ－末端またはＣ－末端に６ｘ Ｈｉｓ－タギングされたタンパク質を得た。ＬｕｋＡＢおよびＬｕｋＡＥ３２３ＡＢを精製するために、６ｘ Ｈｉｓ－タグをＮ－およびＣ－末端の両側に挿入し、得られたクローンをシーケンシングして構造を確認した。組換えタンパク質は０．２ｍＭイソプロピル－ｌβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．２ｍＭの濃度）を用いてＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉで発現した。発現したタンパク質はＮｉ－セファロース６高速レジン（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－５３１８－０１、５ｍｌ）とローディング緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）、洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）および溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を用いて精製した。実施例１で使用されたプライマー配列は下記表１に示した。
【表1】
【0108】
トキシン抗体を得るためのラビットの免疫化
５００μｌのＰＢＳに溶解した６つのＳ．ａｕｒｅｕｓトキシンおよびこれらのトキソイドタンパク質の精製された単一成分５００μｇをフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）５００μｌと混合してエマルジョンを製造した。ラビットに各エマルジョンを皮下注射後、２週後に同量の抗原を５００μｌのフロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合して皮下注射した。２週後にラビット耳静脈から採取した血液５００μｌから各抗原のＩｇＧ形成の有無をウェスタンブロットにより確認した。抗体が形成された場合、ラビット全血を採取して血清を得ており、これを使用前まで－８０℃に保管した。
５００μｌのＰＢＳに溶解した６つのＳ．ａｕｒｅｕｓトキシンおよびこれらのトキソイドタンパク質の精製された単一成分５００μｇをフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）５００μｌと混合してエマルジョンを製造した。ラビットに各エマルジョンを皮下注射後、２週後に同量の抗原を５００μｌのフロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合して皮下注射した。２週後にラビット耳静脈から採取した血液５００μｌから各抗原のＩｇＧ形成の有無をウェスタンブロットにより確認した。抗体が形成された場合、ラビット全血を採取して血清を得ており、これを使用前まで－８０℃に保管した。
【0109】
ＣＮＢｒ－活性化されたセファロースビーズに精製されたタンパク質のカップリング
組換え単一成分トキシンとＣＮＢｒ－活性化されたセファロースビーズとの間のカップリングを製造会社のマニュアル（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）に従って行った。要するに、ＣＮＢｒ－活性化されたセファロースビーズ１ｇをカップリング緩衝液（３ｍｌ／１回、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５）で３回洗浄した。１ｍｌのカップリング緩衝液に溶解した組換えタンパク質５ｍｇをＣＮＢｒ－活性化されたビーズに添加し、４ｍｌのカップリング緩衝液に浮遊させた。常温で２時間培養した後、ビーズをカップリング緩衝液で３回洗浄した。以後、ビーズを１Ｍにメタノールアミン（ｐＨ８．０）４ｍｌと共に常温で４時間培養した。培養後、ビーズを２８０ｎｍでＵＶ吸光度が現れないまで０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で洗浄し、使用前まで４℃に保管した。
組換え単一成分トキシンとＣＮＢｒ－活性化されたセファロースビーズとの間のカップリングを製造会社のマニュアル（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）に従って行った。要するに、ＣＮＢｒ－活性化されたセファロースビーズ１ｇをカップリング緩衝液（３ｍｌ／１回、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５）で３回洗浄した。１ｍｌのカップリング緩衝液に溶解した組換えタンパク質５ｍｇをＣＮＢｒ－活性化されたビーズに添加し、４ｍｌのカップリング緩衝液に浮遊させた。常温で２時間培養した後、ビーズをカップリング緩衝液で３回洗浄した。以後、ビーズを１Ｍにメタノールアミン（ｐＨ８．０）４ｍｌと共に常温で４時間培養した。培養後、ビーズを２８０ｎｍでＵＶ吸光度が現れないまで０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で洗浄し、使用前まで４℃に保管した。
【0110】
ラビット血清由来ＩｇＧを認識するラビット抗－単一成分の精製
抗原－カップリングされたセファロースカラムを洗浄緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化した後、抗原－免疫化されたラビット血清（１ｍｌ、タンパク質６０ｍｇ）をカラムにローディングし、カラムを洗浄緩衝液で強く洗浄した後、結合したＩｇＧを溶出緩衝液（０．１５Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２）で溶出した。収集されたＩｇＧを中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ９．０）で中和させた後、緩衝液をＰＢＳに入れ替え、収集されたＩｇＧを還元および非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
抗原－カップリングされたセファロースカラムを洗浄緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化した後、抗原－免疫化されたラビット血清（１ｍｌ、タンパク質６０ｍｇ）をカラムにローディングし、カラムを洗浄緩衝液で強く洗浄した後、結合したＩｇＧを溶出緩衝液（０．１５Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２）で溶出した。収集されたＩｇＧを中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ９．０）で中和させた後、緩衝液をＰＢＳに入れ替え、収集されたＩｇＧを還元および非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
【0111】
ドットブロット免疫アッセイ
ＰＶＤＦ－膜ストリップ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ、ポアサイズ０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をメタノールで３０秒間活性化させた。以後、ストリップを緩やかに撹拌しながらＨ２Ｏで５分間洗浄した。洗浄後、１μｇの組換え単一成分トキシン（ＬｕｋＳ－ＰＶ、ＬｕｋＦ－ＰＶ、ＨｌｇＡ、ＨｌｇＢ、ＨｌｇＣ、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＤおよびＬｕｋＡＢ）をストリップにローディングした。各単一成分およびＬｕｋＡＢタンパク質（各１μｇ）と、陰性対照群としてＳ．ａｕｒｅｕｓ ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３（フィブロネクチン結合タンパク質のＮ２－Ｎ３ドメイン）をスポッティングした。ストリップを常温で２時間乾燥させた後、タンパク質を１５秒間メタノールで固定し、Ｈ２Ｏで３回、１Ｘ ＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。ストリップを５％脱脂乳で２時間ブロッキングし、単一成分－トキシンで免疫化されたＩｇＧ（５％脱脂乳で１：１６００希釈）と１時間４℃で培養した。培養後、膜を１Ｘ ＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。マウス抗－ラビットＩｇＧ－ＨＲＰ（１：３０００希釈、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）を膜に添加し、４℃で１時間培養した。以後、膜を１Ｘ ＴＢＳＴで３回洗浄し、Ｐｉｃｏ ＥＰＤウェスタンブロッティング検出キット［ＥＬＰＩＳ－Ｂｉｏｔｅｃｈ］に適用した。
ＰＶＤＦ－膜ストリップ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ、ポアサイズ０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をメタノールで３０秒間活性化させた。以後、ストリップを緩やかに撹拌しながらＨ２Ｏで５分間洗浄した。洗浄後、１μｇの組換え単一成分トキシン（ＬｕｋＳ－ＰＶ、ＬｕｋＦ－ＰＶ、ＨｌｇＡ、ＨｌｇＢ、ＨｌｇＣ、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＤおよびＬｕｋＡＢ）をストリップにローディングした。各単一成分およびＬｕｋＡＢタンパク質（各１μｇ）と、陰性対照群としてＳ．ａｕｒｅｕｓ ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３（フィブロネクチン結合タンパク質のＮ２－Ｎ３ドメイン）をスポッティングした。ストリップを常温で２時間乾燥させた後、タンパク質を１５秒間メタノールで固定し、Ｈ２Ｏで３回、１Ｘ ＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。ストリップを５％脱脂乳で２時間ブロッキングし、単一成分－トキシンで免疫化されたＩｇＧ（５％脱脂乳で１：１６００希釈）と１時間４℃で培養した。培養後、膜を１Ｘ ＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。マウス抗－ラビットＩｇＧ－ＨＲＰ（１：３０００希釈、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）を膜に添加し、４℃で１時間培養した。以後、膜を１Ｘ ＴＢＳＴで３回洗浄し、Ｐｉｃｏ ＥＰＤウェスタンブロッティング検出キット［ＥＬＰＩＳ－Ｂｉｏｔｅｃｈ］に適用した。
【0112】
ヒトＰＭＮの分離
収集された全血（２ｍｌ）およびＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐＴＭ（２ｍｌ、Ａｘｉｓ－ｓｈｉｅｌｄ）を用いて、常温で丸底チューブに多形核細胞（ＰＭＮ）を分離した。試料を２０℃で４５０ｘｇで３０分間遠心分離した。上澄液の除去後、単核細胞（上バンド）とＰＭＮ（下バンド）を含む２つの白血球バンドを得た。以後、収集されたＰＭＮをＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄し、４００ｘｇで２０℃で１０分間遠心分離後に収集した。収集された細胞を２ｍｌ ＲＰＭＩ＋０．０２％ＨＳＡ緩衝液で緩やかに再浮遊させ、血球計算器（ＥＫＤＳ、Ｔｏｋｙｏ）で細胞数を計算した。
収集された全血（２ｍｌ）およびＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐＴＭ（２ｍｌ、Ａｘｉｓ－ｓｈｉｅｌｄ）を用いて、常温で丸底チューブに多形核細胞（ＰＭＮ）を分離した。試料を２０℃で４５０ｘｇで３０分間遠心分離した。上澄液の除去後、単核細胞（上バンド）とＰＭＮ（下バンド）を含む２つの白血球バンドを得た。以後、収集されたＰＭＮをＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄し、４００ｘｇで２０℃で１０分間遠心分離後に収集した。収集された細胞を２ｍｌ ＲＰＭＩ＋０．０２％ＨＳＡ緩衝液で緩やかに再浮遊させ、血球計算器（ＥＫＤＳ、Ｔｏｋｙｏ）で細胞数を計算した。
【0113】
ラビットＲＢＣの分離
ラビット血液１ｍｌをヒルジン－コーティングされた真空チューブ（ＢＤ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｒｉｖｅ）に収集して、耳静脈を通した凝集を遮断した。以後、チューブを４℃で９，１００ｘｇで１０分間遠心分離して赤血球（ＲＢＣ）を得た。ＲＢＣをＰＢＳ含有０．０２％ＢＳＡで２回洗浄し、５００ｘｇで４℃で５分間遠心分離して収集した。ＰＢＳ含有０．０２％ＢＳＡでＲＢＣを２％に希釈して保存液を作製した。
ラビット血液１ｍｌをヒルジン－コーティングされた真空チューブ（ＢＤ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｒｉｖｅ）に収集して、耳静脈を通した凝集を遮断した。以後、チューブを４℃で９，１００ｘｇで１０分間遠心分離して赤血球（ＲＢＣ）を得た。ＲＢＣをＰＢＳ含有０．０２％ＢＳＡで２回洗浄し、５００ｘｇで４℃で５分間遠心分離して収集した。ＰＢＳ含有０．０２％ＢＳＡでＲＢＣを２％に希釈して保存液を作製した。
【0114】
細胞溶解および溶血アッセイ
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＢＣＬまたはＨｌａの存在の有無による一次ヒトＰＭＮのインビトロ生存性を評価するために、ＰＭＮを４８ウェルプレート（ＳＰＬ）にウェルあたり２×１０６細胞でシーディングし、同量のＳ－およびＦ－成分（各６５ｎｇ）と共に混合した（ＬｕｋＡＢは１３０ｎｇ）。この混合物を３７℃で５％ＣＯ２条件で１時間培養し、生存した細胞数を血球計算器で測定した。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＢＣＬまたはＨｌａの存在の有無による一次ヒトＰＭＮのインビトロ生存性を評価するために、ＰＭＮを４８ウェルプレート（ＳＰＬ）にウェルあたり２×１０６細胞でシーディングし、同量のＳ－およびＦ－成分（各６５ｎｇ）と共に混合した（ＬｕｋＡＢは１３０ｎｇ）。この混合物を３７℃で５％ＣＯ２条件で１時間培養し、生存した細胞数を血球計算器で測定した。
【0115】
トキシン－媒介ＲＢＣ溶血アッセイ
インビトロでＨｌａＷＴトキシンの存在の有無によるラビットＲＢＣの溶血アッセイを行うために、２％ＲＢＣを９６ウェルプレートにウェルあたり１００μｌでシーディングした。以後、０．２５μｇの精製された組換えＨｌａＷＴトキシンを９６ウェルプレートに添加し、３７℃で５％ＣＯ２条件で１時間培養した。以後、５分間５００ｘｇで遠心分離して上澄液を収集し、分光光度計（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｔｅｒ）を用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
インビトロでＨｌａＷＴトキシンの存在の有無によるラビットＲＢＣの溶血アッセイを行うために、２％ＲＢＣを９６ウェルプレートにウェルあたり１００μｌでシーディングした。以後、０．２５μｇの精製された組換えＨｌａＷＴトキシンを９６ウェルプレートに添加し、３７℃で５％ＣＯ２条件で１時間培養した。以後、５分間５００ｘｇで遠心分離して上澄液を収集し、分光光度計（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｔｅｒ）を用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【0116】
ウェスタンブロット分析
精製されたＢＣＬトキシン、Ｈｌａおよびトキソイドを１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動に適用し、トランスファーバッファー（１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．０２％ＳＤＳ、２０％ＭｔＯＨ）を用いて１００Ｖ、４００ｍＡで４℃で７５分間０．４５μｍのＰＶＤＦ膜に移した。以後、膜を５％脱脂乳で１時間ブロッキングした。膜を免疫化されたラビット血清（１：６０００）と培養した後、５％脱脂乳で４℃で１時間ブロッキングした。培養後、膜を１Ｘ ＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。マウス抗－ラビットＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）を添加し、４℃で１時間培養した。以後、膜を１Ｘ ＴＢＳＴで３回洗浄し、Ｐｉｃｏ ＥＰＤウェスタンブロッティング検出キット［ＥＬＰＩＳ－Ｂｉｏｔｅｃｈ］で分析を行った。
精製されたＢＣＬトキシン、Ｈｌａおよびトキソイドを１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動に適用し、トランスファーバッファー（１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．０２％ＳＤＳ、２０％ＭｔＯＨ）を用いて１００Ｖ、４００ｍＡで４℃で７５分間０．４５μｍのＰＶＤＦ膜に移した。以後、膜を５％脱脂乳で１時間ブロッキングした。膜を免疫化されたラビット血清（１：６０００）と培養した後、５％脱脂乳で４℃で１時間ブロッキングした。培養後、膜を１Ｘ ＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。マウス抗－ラビットＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）を添加し、４℃で１時間培養した。以後、膜を１Ｘ ＴＢＳＴで３回洗浄し、Ｐｉｃｏ ＥＰＤウェスタンブロッティング検出キット［ＥＬＰＩＳ－Ｂｉｏｔｅｃｈ］で分析を行った。
【0117】
実験結果
精製された５つの組換えＳ．ａｕｒｅｕｓの二成分ロイコシジン（ＢＣＬ）とＨｌａはヒトＰＭＮおよびＲＢＣをそれぞれ加水分解したが、トキソイドは分解しなかった。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓトキシンおよびトキシン－媒介された宿主細胞の細胞毒性の間の関係を調べるために、本発明者らは、まず、５つのＢＣＬおよびＨｌａをクローニングした（図１のＡ－Ｃ）。発現した６つの組換えトキシンの精製のために、Ｈｉｓ ｘ ６－ｔａｇをターゲットトキシンのＮ－末端またはＣ－末端部位に挿入した（図２）。図３に示すように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＢＣＬの４つのＳ－成分および３つのＦ－成分の組換えタンパク質を精製して均質化したが、ＬｕｋＡＢの単量体は遅く発現するため、ＬｕｋＡＢＷＴは二量体の形態で精製された（図３Ａ）。また、組換えＨｌａＷＴおよびＨｌａＨ３５Ｌ、ＬｕｋＳＴ２４４ＡおよびＬｕｋＡＥ３２３ＡＢトキソイドも均一に精製された（図３Ｂ）。単一活性アミノ酸置換を有するＨｌａトキソイド（ＨｌａＨ３５Ｌ）はＨｉｓ－３５残基がＬｅｕに置換されたため、細胞溶解ポア（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｐｏｒｅ）を形成できないが、宿主細胞上の受容体と結合する能力は維持することが知られた（Ｍｅｎｚｉｅｓ ＢＥ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ６２：１８４３－７；Ｍｅｎｚｉｅｓ ＢＥ ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ６４：１８３９－４１）。ＬｕｋＳ－ＰＶのＴｈｒ－２４４残基がＡｌａに置換される場合（ＬｕｋＳＴ２４４Ａ－ＰＶ）、ヒト白血球およびＣ５ａ受容体－発現未分化Ｕ９３７細胞全部との結合親和度が大きく減少するため（Ｌａｖｅｎｔｉｅ ＢＪ ｅｔ ａｌ．，２０１４．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ９：ｅ９２０９４）、本発明では、ＬｕｋＳＴ２４４Ａ突然変異を精製した。また、ＬｕｋＡのＧｌｕ－３２３残基がＬｕｋＡＢ細胞毒性に重要であり、ＬｕｋＡＢおよびそのターゲットであるＣＤ１１ｂとの相互作用に必須であると報告されたので（ＤｕＭｏｎｔ ＡＬ ｅｔ ａｌ．，２０１４．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ８２：１２６８－７６）、ＬｕｋＡＥ３２３ＡＢを作製して使用した。野生型ロイコシジンとトキソイドがヒトＰＭＮに対する細胞溶解活性を示すかを確認するために、同量のＳ－成分およびＦ－成分を混合して、ＬｕｋＳＦ－ＰＶ、ＬｕｋＥＤ、ＨｌｇＡＢ、ＨｌｇＣＢ、ＬｕｋＡＢのような野生型ロイコシジンとＬｕｋＳＴ２４４Ａ－ＰＶおよびＬｕｋＡＥ３２３ＡＢのような不活性ロイコシジンを作製した。
精製された５つの組換えＳ．ａｕｒｅｕｓの二成分ロイコシジン（ＢＣＬ）とＨｌａはヒトＰＭＮおよびＲＢＣをそれぞれ加水分解したが、トキソイドは分解しなかった。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓトキシンおよびトキシン－媒介された宿主細胞の細胞毒性の間の関係を調べるために、本発明者らは、まず、５つのＢＣＬおよびＨｌａをクローニングした（図１のＡ－Ｃ）。発現した６つの組換えトキシンの精製のために、Ｈｉｓ ｘ ６－ｔａｇをターゲットトキシンのＮ－末端またはＣ－末端部位に挿入した（図２）。図３に示すように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＢＣＬの４つのＳ－成分および３つのＦ－成分の組換えタンパク質を精製して均質化したが、ＬｕｋＡＢの単量体は遅く発現するため、ＬｕｋＡＢＷＴは二量体の形態で精製された（図３Ａ）。また、組換えＨｌａＷＴおよびＨｌａＨ３５Ｌ、ＬｕｋＳＴ２４４ＡおよびＬｕｋＡＥ３２３ＡＢトキソイドも均一に精製された（図３Ｂ）。単一活性アミノ酸置換を有するＨｌａトキソイド（ＨｌａＨ３５Ｌ）はＨｉｓ－３５残基がＬｅｕに置換されたため、細胞溶解ポア（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｐｏｒｅ）を形成できないが、宿主細胞上の受容体と結合する能力は維持することが知られた（Ｍｅｎｚｉｅｓ ＢＥ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ６２：１８４３－７；Ｍｅｎｚｉｅｓ ＢＥ ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ６４：１８３９－４１）。ＬｕｋＳ－ＰＶのＴｈｒ－２４４残基がＡｌａに置換される場合（ＬｕｋＳＴ２４４Ａ－ＰＶ）、ヒト白血球およびＣ５ａ受容体－発現未分化Ｕ９３７細胞全部との結合親和度が大きく減少するため（Ｌａｖｅｎｔｉｅ ＢＪ ｅｔ ａｌ．，２０１４．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ９：ｅ９２０９４）、本発明では、ＬｕｋＳＴ２４４Ａ突然変異を精製した。また、ＬｕｋＡのＧｌｕ－３２３残基がＬｕｋＡＢ細胞毒性に重要であり、ＬｕｋＡＢおよびそのターゲットであるＣＤ１１ｂとの相互作用に必須であると報告されたので（ＤｕＭｏｎｔ ＡＬ ｅｔ ａｌ．，２０１４．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ８２：１２６８－７６）、ＬｕｋＡＥ３２３ＡＢを作製して使用した。野生型ロイコシジンとトキソイドがヒトＰＭＮに対する細胞溶解活性を示すかを確認するために、同量のＳ－成分およびＦ－成分を混合して、ＬｕｋＳＦ－ＰＶ、ＬｕｋＥＤ、ＨｌｇＡＢ、ＨｌｇＣＢ、ＬｕｋＡＢのような野生型ロイコシジンとＬｕｋＳＴ２４４Ａ－ＰＶおよびＬｕｋＡＥ３２３ＡＢのような不活性ロイコシジンを作製した。
【0118】
ＢＣＬのＳ－、Ｆ－成分、Ｈｌａおよびこれらのトキソイドタンパク質を個別的に発現および精製した後、ヒトＰＭＮおよびＲＢＣを用いてこれらの毒性を試験した。同量のＳ－およびＦ－成分（各０．２５μｇ／ｍｌ）を混合し、ＬｕｋＡＢは０．５μｇ／ｍｌで混合すると、５つの同系ＢＣＬ（ＬｕｋＳＦ－ＰＶ、ＬｕｋＥＤ、ＬｕｋＡＢ、ＨｌｇＡＢ、ＨｌｇＣＢ）はすべてヒト多形核白血球（ＰＭＮ、２×１０６細胞）を３０分内に完全に分解したが、ＬｕｋＳＴ２４４Ａ－ＰＶトキソイド（０．２５μｇ／ｍｌ）およびＬｕｋＦ－ＰＶ（０．２５μｇ／ｍｌ）の混合物はヒトＰＭＮに対して毒性を示さなかった（図３Ｃ）。また、ＬｕｋＡＥ３２３ＡＢダイマートキソイド（０．５μｇ／ｍｌ）もヒトＰＭＮに細胞毒性を示さなかった（図３Ｃ）。これとともに、精製されたＨｌａＷＴ（２．５μｇ／ｍｌ）は２％ラビットＲＢＣを３０分内に溶血させたが、その不活性トキソイドであるＨｌａＨ３５ＬはラビットＲＢＣに対する溶血活性を示すことができなかった（図３Ｄ）。これをまとめると、精製されたＳ．ａｕｒｅｕｓ ＢＣＬおよびこれらのトキソイドタンパク質がうまくクローニングされ、均一に精製されたことが分かる。
【0119】
単一Ｓ－またはＦ－成分の抗－ラビットＩｇＧは他のＢＣＬ成分に対する交差反応性を有する。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＢＣＬはＳ－ＳまたはＦ－Ｆ単一成分間の高い配列相同性を有するため、単一成分－免疫化されたラビット抗体はＳ．ａｕｒｅｕｓ ＢＣＬトキシンの他の単一成分と結合することが期待された。しかし、単一成分－ＩｇＧによるこれらの認識パターンが５つのＢＣＬ－媒介細胞毒性を包括的に中和するＢＣＬ－抗体を探索するのに重要であるので、本発明者らは、単一成分－接合セファロースカラムを用いた親和度精製により８つの異なる単一成分に対するラビット多クローン抗体を得た（図４）。また、本発明の組換えトキシンとトキソイドはＮ－またはＣ－末端に６ｘ Ｈｉｓ－ｔａｇを有するので、６ｘ Ｈｉｓ－タギングされたＳ．ａｕｒｅｕｓフィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ＦｎｂｐＡＮ２－Ｎ３）－接合セファロースカラムを用いてＨｉｓ－ｔａｇ－由来ＩｇＧを除去した（データ未記載）。これらの精製されたラビット単一成分－認識ＩｇＧを用いて、本発明者らは、ドットブロット免疫アッセイによりＢＣＬ単一成分および精製されたＢＣＬ－認識ＩｇＧの間の交差反応性を調べた（図５）。使用されたすべてのＩｇＧは陰性対照群タンパク質であるＦｎｂｐＡＮ２－Ｎ３と結合しなかった。抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－ＩｇＧは４つのＳ－成分（ＬｕｋＳ－ＰＶ＞ＨｌｇＣ＞ＨｌｇＡ＞ＬｕｋＥ）全部を認識したが、３つのＦ成分とＬｕｋＡＢは認識できなかった（図５のカラムａ、濃色と薄色のボックスはそれぞれ同系および非－同系抗原を示す）。抗－ＬｕｋＥ－ＩｇＧも４つのＳ－成分（ＬｕｋＥ＞ＬｕｋＳ＞ＨｌｇＣ＞ＨｌｇＡ）を認識した（図５のカラムｆ）。抗－ＨｌｇＡ－ＩｇＧはＨｌｇ＞ＨｌｇＣ＞ＬｕｋＦを認識した（カラムｃ）。抗－ＨｌｇＣ－ＩｇＧはＨｌｇＣ≧ＬｕｋＳ＞ＨｌｇＡを認識した（図５のカラムｅ）。Ｆ－成分－ＩｇＧの場合、抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ－ＩｇＧはＬｕｋＦ＞ＬｕｋＤに対する陽性シグナルを示した（図５のカラムｂ）。抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧはＬｕｋＦ－ＰＶ＞ＨｌｇＢ＞ＬｕｋＤの３つのＦ成分を認識した（図５のカラムｄ）。抗－ＬｕｋＤ－ＩｇＧはＬｕｋＤ＞ＬｕｋＦ－ＰＶに対する結合親和度を示した（図５のカラムｇ）。予想どおり、ＬｕｋＡＢ－ＩｇＧはその同系抗原であるＬｕｋＡＢ抗原に対してのみ結合特異性を示した（図５のカラムｈ）。これをまとめると、ＬｕｋＳ－ＰＶおよびＬｕｋＥ－ＩｇＧは４つのＢＣＬ Ｓ－成分に対して最も広範囲な結合能力を有することが分かる。しかし、興味深いことに、抗－ＨｌｇＡ－ＩｇＧがＩｇＧを認識するＳ－成分であるにもかかわらず、これはＬｕｋＦ－ＰＶ Ｆ－成分も認識した（図５のカラムｃおよびｇ）。抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧの場合、３つのＦ－成分（ＨｌｇＢ、ＬｕｋＤ、ＬｕｋＦ）を認識するが、他の２つのＦ－成分（ＬｕｋＦ－ＰＶおよびＬｕｋＤ）はこれらの同系Ｆ－成分と１つの非－同系Ｆ－成分だけを認識した。まとめると、ＢＣＬ Ｓ－およびＦ－成分は同系および非－同系抗原に対する異なる認識パターンを有することが分かる。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＢＣＬはＳ－ＳまたはＦ－Ｆ単一成分間の高い配列相同性を有するため、単一成分－免疫化されたラビット抗体はＳ．ａｕｒｅｕｓ ＢＣＬトキシンの他の単一成分と結合することが期待された。しかし、単一成分－ＩｇＧによるこれらの認識パターンが５つのＢＣＬ－媒介細胞毒性を包括的に中和するＢＣＬ－抗体を探索するのに重要であるので、本発明者らは、単一成分－接合セファロースカラムを用いた親和度精製により８つの異なる単一成分に対するラビット多クローン抗体を得た（図４）。また、本発明の組換えトキシンとトキソイドはＮ－またはＣ－末端に６ｘ Ｈｉｓ－ｔａｇを有するので、６ｘ Ｈｉｓ－タギングされたＳ．ａｕｒｅｕｓフィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ＦｎｂｐＡＮ２－Ｎ３）－接合セファロースカラムを用いてＨｉｓ－ｔａｇ－由来ＩｇＧを除去した（データ未記載）。これらの精製されたラビット単一成分－認識ＩｇＧを用いて、本発明者らは、ドットブロット免疫アッセイによりＢＣＬ単一成分および精製されたＢＣＬ－認識ＩｇＧの間の交差反応性を調べた（図５）。使用されたすべてのＩｇＧは陰性対照群タンパク質であるＦｎｂｐＡＮ２－Ｎ３と結合しなかった。抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－ＩｇＧは４つのＳ－成分（ＬｕｋＳ－ＰＶ＞ＨｌｇＣ＞ＨｌｇＡ＞ＬｕｋＥ）全部を認識したが、３つのＦ成分とＬｕｋＡＢは認識できなかった（図５のカラムａ、濃色と薄色のボックスはそれぞれ同系および非－同系抗原を示す）。抗－ＬｕｋＥ－ＩｇＧも４つのＳ－成分（ＬｕｋＥ＞ＬｕｋＳ＞ＨｌｇＣ＞ＨｌｇＡ）を認識した（図５のカラムｆ）。抗－ＨｌｇＡ－ＩｇＧはＨｌｇ＞ＨｌｇＣ＞ＬｕｋＦを認識した（カラムｃ）。抗－ＨｌｇＣ－ＩｇＧはＨｌｇＣ≧ＬｕｋＳ＞ＨｌｇＡを認識した（図５のカラムｅ）。Ｆ－成分－ＩｇＧの場合、抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ－ＩｇＧはＬｕｋＦ＞ＬｕｋＤに対する陽性シグナルを示した（図５のカラムｂ）。抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧはＬｕｋＦ－ＰＶ＞ＨｌｇＢ＞ＬｕｋＤの３つのＦ成分を認識した（図５のカラムｄ）。抗－ＬｕｋＤ－ＩｇＧはＬｕｋＤ＞ＬｕｋＦ－ＰＶに対する結合親和度を示した（図５のカラムｇ）。予想どおり、ＬｕｋＡＢ－ＩｇＧはその同系抗原であるＬｕｋＡＢ抗原に対してのみ結合特異性を示した（図５のカラムｈ）。これをまとめると、ＬｕｋＳ－ＰＶおよびＬｕｋＥ－ＩｇＧは４つのＢＣＬ Ｓ－成分に対して最も広範囲な結合能力を有することが分かる。しかし、興味深いことに、抗－ＨｌｇＡ－ＩｇＧがＩｇＧを認識するＳ－成分であるにもかかわらず、これはＬｕｋＦ－ＰＶ Ｆ－成分も認識した（図５のカラムｃおよびｇ）。抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧの場合、３つのＦ－成分（ＨｌｇＢ、ＬｕｋＤ、ＬｕｋＦ）を認識するが、他の２つのＦ－成分（ＬｕｋＦ－ＰＶおよびＬｕｋＤ）はこれらの同系Ｆ－成分と１つの非－同系Ｆ－成分だけを認識した。まとめると、ＢＣＬ Ｓ－およびＦ－成分は同系および非－同系抗原に対する異なる認識パターンを有することが分かる。
【0120】
４つの抗－Ｓ－成分－ＩｇＧは４つのＢＣＬ－媒介ＰＭＮの細胞溶解活性に対する部分的な中和効果を示す。
本発明者らは、どのようにインビトロでＢＣＬ－媒介好中球の細胞溶解活性が抗－Ｓ－またはＦ－成分－ＩｇＧの添加によって中和されるかを調べようとした。ヒトＰＭＮを各ＢＣＬおよび抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－ＩｇＧと共に共培養すれば（図６Ａ）、抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－ＩｇＧはＬｕｋＳＦ－ＰＶ－（９８．５±０．５％）、ＬｕｋＥＤ－（７４±１％）およびＨｌｇＣＢ－（６８．１±１％）－媒介ＰＭＮの細胞溶解活性を抑制するが、ＨｌｇＡＢ－およびＬｕｋＡＢによるＰＭＮの細胞溶解活性は抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－ＩｇＧによって完全に中和できない。これに対し、抗－ＨｌｇＡ－ＩｇＧはＨｌｇＡＢ－誘発（９０．３±３％）およびＬｕｋＥＤ－媒介ＰＭＮ溶解（２７．５±４％）だけを中和し、ＬｕｋＳＦ－ＰＶ、ＨｌｇＣＢおよびＬｕｋＡＢ－媒介ＰＭＮの細胞毒性はほとんど遮断できなかった（図６Ｂ）。抗－ＨｌｇＣ－ＩｇＧはＨｌｇＡＢ－（４３．９±０．５％）、ＬｕｋＥＤ－（５８．５±１％）およびＬｕｋＳＦ－ＰＶ－（７３．２±０．５％）、ＨｌｇＣＢ－（８５．４±１％）およびＬｕｋＡＢ－（０％）－媒介ＰＭＮ溶解を抑制した（図６Ｃ）。予想どおり、抗－ＬｕｋＥ－ＩｇＧは４つのＢＣＬ－媒介ＰＭＮ溶解を７０％以上抑制したが、ＬｕｋＡＢ－誘発された溶解（図６Ｄ）は完全に抑制できなかった。ドットブロット実験において（図５）、抗－ＬｕｋＥ－ＩｇＧはＬｕｋＥ＞ＬｕｋＳ－ＰＶを強く認識したが、ＨｌｇＣ＞ＨｌｇＡは弱く認識した。しかし、４つのＢＣＬ－媒介ＰＭＮ溶解が抗－ＬｕｋＥ－ＩｇＧによって７５±３％以上遮断されて、ＢＣＬ－媒介ヒトＰＭＮの細胞溶解活性においてドットブロット免疫アッセイと単一Ｓ－成分ＩｇＧの中和能力間の差が存在することが分かった。
本発明者らは、どのようにインビトロでＢＣＬ－媒介好中球の細胞溶解活性が抗－Ｓ－またはＦ－成分－ＩｇＧの添加によって中和されるかを調べようとした。ヒトＰＭＮを各ＢＣＬおよび抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－ＩｇＧと共に共培養すれば（図６Ａ）、抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－ＩｇＧはＬｕｋＳＦ－ＰＶ－（９８．５±０．５％）、ＬｕｋＥＤ－（７４±１％）およびＨｌｇＣＢ－（６８．１±１％）－媒介ＰＭＮの細胞溶解活性を抑制するが、ＨｌｇＡＢ－およびＬｕｋＡＢによるＰＭＮの細胞溶解活性は抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－ＩｇＧによって完全に中和できない。これに対し、抗－ＨｌｇＡ－ＩｇＧはＨｌｇＡＢ－誘発（９０．３±３％）およびＬｕｋＥＤ－媒介ＰＭＮ溶解（２７．５±４％）だけを中和し、ＬｕｋＳＦ－ＰＶ、ＨｌｇＣＢおよびＬｕｋＡＢ－媒介ＰＭＮの細胞毒性はほとんど遮断できなかった（図６Ｂ）。抗－ＨｌｇＣ－ＩｇＧはＨｌｇＡＢ－（４３．９±０．５％）、ＬｕｋＥＤ－（５８．５±１％）およびＬｕｋＳＦ－ＰＶ－（７３．２±０．５％）、ＨｌｇＣＢ－（８５．４±１％）およびＬｕｋＡＢ－（０％）－媒介ＰＭＮ溶解を抑制した（図６Ｃ）。予想どおり、抗－ＬｕｋＥ－ＩｇＧは４つのＢＣＬ－媒介ＰＭＮ溶解を７０％以上抑制したが、ＬｕｋＡＢ－誘発された溶解（図６Ｄ）は完全に抑制できなかった。ドットブロット実験において（図５）、抗－ＬｕｋＥ－ＩｇＧはＬｕｋＥ＞ＬｕｋＳ－ＰＶを強く認識したが、ＨｌｇＣ＞ＨｌｇＡは弱く認識した。しかし、４つのＢＣＬ－媒介ＰＭＮ溶解が抗－ＬｕｋＥ－ＩｇＧによって７５±３％以上遮断されて、ＢＣＬ－媒介ヒトＰＭＮの細胞溶解活性においてドットブロット免疫アッセイと単一Ｓ－成分ＩｇＧの中和能力間の差が存在することが分かった。
【0121】
３つの抗－Ｆ－成分－ＩｇＧはＨｌｇＣＢ－媒介ＰＭＮの細胞溶解活性を中和した
図７に示すように、抗－Ｆ－成分－ＩｇＧとヒトＰＭＮおよびＢＣＬを共培養すれば、抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ ＩｇＧはＬｕｋＳＦ－ＰＶ－媒介ＰＭＮの溶解活性およびＨｌｇＣＢ－誘発されたＰＭＮの溶解活性をそれぞれ８５±０．５％および７４±１％で遮断するが、ＨｌｇＡＢ、ＬｕｋＥＤおよびＬｕｋＡＢ－媒介ＰＭＮの細胞溶解活性は抗－ＬｕｋＦ－ＩｇＧによってほとんど中和できない（図７Ａ）。また、抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧはＨｌｇＡＢ－およびＨｌｇＣＢ－媒介されたＰＭＮの溶解活性をそれぞれ８５．８±１％および６５±０．５％で抑制するが、ＬｕｋＥＤ－（１０±０．５％）、ＬｕｋＳＦ－ＰＶ－（１０±１％）、およびＬｕｋＡＢ－（２±１％）媒介された溶解活性の抑制率は低い（図７Ｂ）。抗－ＬｕｋＤ－ＩｇＧの場合、ＬｕｋＥＤ－（８４±４％）およびＨｌｇＣＢ（７７±１％）－媒介ＰＭＮの溶解活性も抑制するが、ＨｌｇＡＢ－（１８．４±３％）、ＬｕｋＳＦ－（２０．８±０．２％）およびＬｕｋＡＢ（３±０．１％）－媒介溶解活性はうまく中和させることができない（図７Ｃ）。これをまとめると，ドットブロット免疫アッセイにおいて抗－ＬｕｋＦ－ＩｇＧおよび抗－ＬｕｋＤ－ＩｇＧの２つのＦ－成分－ＩｇＧがＨｌｇＢを認識できなかったが（図５）、これら２つのＦ－成分ＩｇＧは一般的にＨｌｇＣＢ－媒介ＰＭＮの溶解活性を中和して、これらが非－同系ＨｌｇＢの特定配列を認識することにより、ＨｌｇＣＢ ＢＣＬの重合体化を抑制することが分かった。
図７に示すように、抗－Ｆ－成分－ＩｇＧとヒトＰＭＮおよびＢＣＬを共培養すれば、抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ ＩｇＧはＬｕｋＳＦ－ＰＶ－媒介ＰＭＮの溶解活性およびＨｌｇＣＢ－誘発されたＰＭＮの溶解活性をそれぞれ８５±０．５％および７４±１％で遮断するが、ＨｌｇＡＢ、ＬｕｋＥＤおよびＬｕｋＡＢ－媒介ＰＭＮの細胞溶解活性は抗－ＬｕｋＦ－ＩｇＧによってほとんど中和できない（図７Ａ）。また、抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧはＨｌｇＡＢ－およびＨｌｇＣＢ－媒介されたＰＭＮの溶解活性をそれぞれ８５．８±１％および６５±０．５％で抑制するが、ＬｕｋＥＤ－（１０±０．５％）、ＬｕｋＳＦ－ＰＶ－（１０±１％）、およびＬｕｋＡＢ－（２±１％）媒介された溶解活性の抑制率は低い（図７Ｂ）。抗－ＬｕｋＤ－ＩｇＧの場合、ＬｕｋＥＤ－（８４±４％）およびＨｌｇＣＢ（７７±１％）－媒介ＰＭＮの溶解活性も抑制するが、ＨｌｇＡＢ－（１８．４±３％）、ＬｕｋＳＦ－（２０．８±０．２％）およびＬｕｋＡＢ（３±０．１％）－媒介溶解活性はうまく中和させることができない（図７Ｃ）。これをまとめると，ドットブロット免疫アッセイにおいて抗－ＬｕｋＦ－ＩｇＧおよび抗－ＬｕｋＤ－ＩｇＧの２つのＦ－成分－ＩｇＧがＨｌｇＢを認識できなかったが（図５）、これら２つのＦ－成分ＩｇＧは一般的にＨｌｇＣＢ－媒介ＰＭＮの溶解活性を中和して、これらが非－同系ＨｌｇＢの特定配列を認識することにより、ＨｌｇＣＢ ＢＣＬの重合体化を抑制することが分かった。
【0122】
抗－ＢＣＬ－成分－ＩｇＧの異なる組み合わせはＢＣＬ－媒介細胞毒性に対する中和能力の差を引き起こす
本発明者らは、５つのＢＣＬ－媒介細胞毒性を包括的に中和させることができるＢＣＬ抗－Ｓ－または抗－Ｆ－成分ＩｇＧの最小限の組み合わせをスクリーニングすれば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する新規治療剤を設計するのに重要な情報になると仮定した。ＬｕｋＳＦ－ＰＶおよびＨｌｇＣＢは、一般的に宿主細胞上で発現するＣ５ａＲ１およびＣ５ａＲ２受容体を認識すると報告された（Ｓｐａａｎ ＡＮ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ１３：５８４－５９４）。しかし、ＬｕｋＥＤはＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２を認識し（Ａｌｏｎｚｏ Ｆ，ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｎａｔｕｒｅ４９３：５１－５）、ＨｌｇＡＢおよびＬｕｋＥＤともＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２を受容体として有しながらＣＣＲ２も認識するのに対し（Ｓｐａａｎ ＡＮ ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１５：４３５－４４７）、ＬｕｋＡＢはＣＤ１１ｂに結合する（ＤｕＭｏｎｔ ＡＬ ｅｔ ａｌ．，２０１４．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ８２：１２６８－７６）。図６および図７の実験結果に基づいて、本発明者らは、抗－単一成分－ＩｇＧまたは抗－トキソイド－ＩｇＧのどの組み合わせが、５つのＢＣＬで誘発された細胞毒性を効率的に中和させるかを調べた。図８に示すように、抗－ＬｕｋＥ－ＩｇＧ（５μｇ）および抗－ＬｕｋＤ－ＩｇＧ（５μｇ）をヒトＰＭＮおよび５つのＢＣＬと６０分間共培養する場合、ＬｕｋＡＢを除いた４つのＢＣＬ－媒介ＰＭＮの細胞毒性がこれら２つのＩｇＧによって７０％以上中和された（図８Ａ）。しかし、抗－ＨｌｇＡ－および抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧの混合物はＨｌｇＡＢ－（７９．８±５％）およびＨｌｇＣＢ－（６０±１％）－媒介細胞毒性だけを中和し（図８Ｂ）、ＬｕｋＥＤ、ＬｕｋＳＦ－ＰＶおよびＬｕｋＡＢに対しては抑制効果が現れなかった。これらの結果から、ＨｌｇＡＢおよびＬｕｋＥＤがＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＣＣＲ２と結合すると報告されたが、ＨｌｇＡおよびＨｌｇＢのＩｇＧ混合物はＬｕｋＥＤ－媒介細胞毒性をほとんど中和させることができないことが分かる。予想とは違って、抗－ＨｌｇＡ－ＩｇＧおよび抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧの混合物はＣ５ａＲ－認識ＨｌｇＣＢの細胞溶解活性を抑制した。
本発明者らは、５つのＢＣＬ－媒介細胞毒性を包括的に中和させることができるＢＣＬ抗－Ｓ－または抗－Ｆ－成分ＩｇＧの最小限の組み合わせをスクリーニングすれば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する新規治療剤を設計するのに重要な情報になると仮定した。ＬｕｋＳＦ－ＰＶおよびＨｌｇＣＢは、一般的に宿主細胞上で発現するＣ５ａＲ１およびＣ５ａＲ２受容体を認識すると報告された（Ｓｐａａｎ ＡＮ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ１３：５８４－５９４）。しかし、ＬｕｋＥＤはＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２を認識し（Ａｌｏｎｚｏ Ｆ，ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｎａｔｕｒｅ４９３：５１－５）、ＨｌｇＡＢおよびＬｕｋＥＤともＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２を受容体として有しながらＣＣＲ２も認識するのに対し（Ｓｐａａｎ ＡＮ ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１５：４３５－４４７）、ＬｕｋＡＢはＣＤ１１ｂに結合する（ＤｕＭｏｎｔ ＡＬ ｅｔ ａｌ．，２０１４．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ８２：１２６８－７６）。図６および図７の実験結果に基づいて、本発明者らは、抗－単一成分－ＩｇＧまたは抗－トキソイド－ＩｇＧのどの組み合わせが、５つのＢＣＬで誘発された細胞毒性を効率的に中和させるかを調べた。図８に示すように、抗－ＬｕｋＥ－ＩｇＧ（５μｇ）および抗－ＬｕｋＤ－ＩｇＧ（５μｇ）をヒトＰＭＮおよび５つのＢＣＬと６０分間共培養する場合、ＬｕｋＡＢを除いた４つのＢＣＬ－媒介ＰＭＮの細胞毒性がこれら２つのＩｇＧによって７０％以上中和された（図８Ａ）。しかし、抗－ＨｌｇＡ－および抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧの混合物はＨｌｇＡＢ－（７９．８±５％）およびＨｌｇＣＢ－（６０±１％）－媒介細胞毒性だけを中和し（図８Ｂ）、ＬｕｋＥＤ、ＬｕｋＳＦ－ＰＶおよびＬｕｋＡＢに対しては抑制効果が現れなかった。これらの結果から、ＨｌｇＡＢおよびＬｕｋＥＤがＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＣＣＲ２と結合すると報告されたが、ＨｌｇＡおよびＨｌｇＢのＩｇＧ混合物はＬｕｋＥＤ－媒介細胞毒性をほとんど中和させることができないことが分かる。予想とは違って、抗－ＨｌｇＡ－ＩｇＧおよび抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧの混合物はＣ５ａＲ－認識ＨｌｇＣＢの細胞溶解活性を抑制した。
【0123】
抗－ＨｌｇＣ－ＩｇＧおよび抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧの混合物はＨｌｇＣＢ（９３．４±０．５％）＞ＬｕｋＳＦ－ＰＶ（７０±１％）＞ＨｌｇＡＢ（５７．８±１％）の溶解活性を中和させることにより、Ｃ５ａＲ－認識ＢＣＬ－ラビット多クローンＩｇＧ混合物もケモカイン－受容体－認識ＨｌｇＡＢの細胞毒性を抑制することを確認した（図８Ｃ）。しかし、抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－ＩｇＧおよび抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ－ＩｇＧの混合物はＬｕｋＳＦ－ＰＶ－（９３．５±１％）およびＨｌｇＣＢ－（７８．７±１％）媒介された溶解活性を中和させ、ＬｕｋＥＤ（６８±０．５％）－誘発されたＰＭＮの溶解活性も抑制した（図８Ｄ）。まとめると、予想どおり、抗－ＬｕｋＡＢ－ＩｇＧはＬｕｋＡＢの細胞毒性だけを中和し、他の４つのＢＣＬ－媒介毒性は抑制できないことを確認した（図８Ｅ）。これにより、抗－ＢＣＬ－ＩｇＧの異なる組み合わせはＢＣＬ－媒介細胞毒性に対する中和能力の差で現れ、ＬｕｋＡＢの毒性には全く影響を及ぼさないことが分かった。
【0124】
抗－Ｓ－成分－ＩｇＧの組み合わせのうち、抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－および抗－ＨｌｇＡ－ＩｇＧの混合物がＢＣＬ－媒介細胞毒性に対する最も高い中和活性を示した。
次に、同系ＢＣＬ Ｓ－ＩｇＧの組み合わせによる５つのＢＣＬ－媒介ＰＭＮの細胞溶解活性に対する中和能力を調べた。このために、６つの互いに異なる抗－Ｓ－成分－ＩｇＧの組み合わせによる５つのＢＣＬ－媒介細胞溶解活性の中和能力を測定した（図９）。抗－Ｓ－成分－ＩｇＧの可能な６つの組み合わせとヒトＰＭＮを５つの異なるＢＣＬと共培養して各ＰＭＮの生存率を計算した。各生存率はＬｕｋＳ－ＰＶ＋ＨｌｇＣ、平均生存率５９．７％（図９Ａ）；ＬｕｋＳ－ＰＶ＋ＨｌｇＡ、８５．８％（図９Ｂ）；ＬｕｋＳ－ＰＶ＋ＬｕｋＥ、４５．２％（図９Ｃ）；ＨｌｇＡ＋ＬｕｋＥ、４５．９％（図９Ｄ）；ＨｌｇＡ＋ＨｌｇＣ、３１．３％（図９Ｅ）；ＨｌｇＣ＋ＬｕｋＥ、３６．８％（図９Ｆ）である。このうち、抗－ＬｕｋＳ－ＰＶおよび抗－ＨｌｇＡ－ＩｇＧの混合物が残りの５つの組み合わせに比べて４つのＢＣＬ－媒介細胞溶解活性を最も効率的に抑制した（図９Ｂ）。これにより、前記組み合わせが４つのＢＣＬ－毒性を抑制できることを確認し、ただし、ＬｕｋＡＢの毒性には依然として影響を及ぼさなかった。
次に、同系ＢＣＬ Ｓ－ＩｇＧの組み合わせによる５つのＢＣＬ－媒介ＰＭＮの細胞溶解活性に対する中和能力を調べた。このために、６つの互いに異なる抗－Ｓ－成分－ＩｇＧの組み合わせによる５つのＢＣＬ－媒介細胞溶解活性の中和能力を測定した（図９）。抗－Ｓ－成分－ＩｇＧの可能な６つの組み合わせとヒトＰＭＮを５つの異なるＢＣＬと共培養して各ＰＭＮの生存率を計算した。各生存率はＬｕｋＳ－ＰＶ＋ＨｌｇＣ、平均生存率５９．７％（図９Ａ）；ＬｕｋＳ－ＰＶ＋ＨｌｇＡ、８５．８％（図９Ｂ）；ＬｕｋＳ－ＰＶ＋ＬｕｋＥ、４５．２％（図９Ｃ）；ＨｌｇＡ＋ＬｕｋＥ、４５．９％（図９Ｄ）；ＨｌｇＡ＋ＨｌｇＣ、３１．３％（図９Ｅ）；ＨｌｇＣ＋ＬｕｋＥ、３６．８％（図９Ｆ）である。このうち、抗－ＬｕｋＳ－ＰＶおよび抗－ＨｌｇＡ－ＩｇＧの混合物が残りの５つの組み合わせに比べて４つのＢＣＬ－媒介細胞溶解活性を最も効率的に抑制した（図９Ｂ）。これにより、前記組み合わせが４つのＢＣＬ－毒性を抑制できることを確認し、ただし、ＬｕｋＡＢの毒性には依然として影響を及ぼさなかった。
【0125】
抗－Ｆ－成分－ＩｇＧの組み合わせのうち、抗－ＬｕｋＦ－および抗－ＬｕｋＤ－ＩｇＧの混合物が４つのＢＣＬ－媒介細胞毒性に対する最も高い中和活性を示した。
さらに、本発明者らは、同系ＢＣＬ Ｆ－ＩｇＧの組み合わせによる５つのＢＣＬ－媒介ＰＭＮの細胞溶解活性に対する中和能力を調べた。このために、４つの互いに異なる抗－Ｆ－成分－ＩｇＧの組み合わせによるＢＣＬ－媒介細胞溶解活性に対する中和能力を測定した（図１０）。各混合物の処理によるＰＭＮの平均生存率は次の通りである：抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ－および抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧ、５２．９％（図１０Ａ）；抗－ＬｕｋＤおよび抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧ、４２．６％（図１０Ｂ）；抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ－および抗－ＬｕｋＤ－ＩｇＧ、６８．６％（図１０Ｃ）；抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ－、抗－ＬｕｋＤおよび抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧ、６９．０％（図１０Ｄ）。これらのうち、抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ－および抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧの組み合わせが他の３つの組み合わせに比べて最も高いＰＭＮの生存率を示した。これにより、３つの抗－Ｆ－成分－ＩｇＧが４つのＢＣＬ－毒性に対して良好な中和活性を示すことが分かり、ただし、ＬｕｋＡＢの毒性には依然として影響を及ぼさなかった。
さらに、本発明者らは、同系ＢＣＬ Ｆ－ＩｇＧの組み合わせによる５つのＢＣＬ－媒介ＰＭＮの細胞溶解活性に対する中和能力を調べた。このために、４つの互いに異なる抗－Ｆ－成分－ＩｇＧの組み合わせによるＢＣＬ－媒介細胞溶解活性に対する中和能力を測定した（図１０）。各混合物の処理によるＰＭＮの平均生存率は次の通りである：抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ－および抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧ、５２．９％（図１０Ａ）；抗－ＬｕｋＤおよび抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧ、４２．６％（図１０Ｂ）；抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ－および抗－ＬｕｋＤ－ＩｇＧ、６８．６％（図１０Ｃ）；抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ－、抗－ＬｕｋＤおよび抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧ、６９．０％（図１０Ｄ）。これらのうち、抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ－および抗－ＨｌｇＢ－ＩｇＧの組み合わせが他の３つの組み合わせに比べて最も高いＰＭＮの生存率を示した。これにより、３つの抗－Ｆ－成分－ＩｇＧが４つのＢＣＬ－毒性に対して良好な中和活性を示すことが分かり、ただし、ＬｕｋＡＢの毒性には依然として影響を及ぼさなかった。
【0126】
抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－、ＨｌｇＡ－およびＬｕｋＡＥ３２３ＡＢ－ＩｇＧｓの混合物は５つのＢＣＬ－媒介ＰＭＮの細胞溶解活性を中和させる
図６～図１０に示すように、どのようなＢＣＬ－成分－ＩｇＧおよびどのようなＩｇＧの組み合わせもＬｕｋＡＢ－誘発された細胞溶解活性を抑制できなかった。そこで、本発明者らは、抗－ＢＣＬ－成分－ＩｇＧを用いて５つのＢＣＬ－誘発された毒性をすべて中和させるためには、抗－ＬｕｋＡＢトキソイド－ＩｇＧと他の選定された抗－ＢＣＬ－成分－ＩｇＧを共に使用しなければならない。このため、精製された組換えＬｕｋＡＥ３２３ＡＢトキソイドおよびそのラビット抗－ＬｕｋＡＥ３２３ＡＢ ＩｇＧを精製した（図４）。抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－およびＨｌｇＡ－ＩｇＧの混合物が４つのＢＣＬ－媒介細胞溶解活性を高い効率で中和させることを確認したので（図９Ｂ）、抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－、抗－ＨｌｇＡおよび抗－ＬｕｋＡＥ３２３ＡＢトキソイド－ＩｇＧの３つのＩｇＧ混合物が５つのＢＣＬ－媒介細胞溶解活性を中和させると仮定した。また、３つの抗－Ｆ－成分ＩｇＧと抗－ＬｕｋＡＥ３２３ＡＢトキソイド－ＩｇＧの混合物も有望な候補になり得る（図１０Ｄ）。
図６～図１０に示すように、どのようなＢＣＬ－成分－ＩｇＧおよびどのようなＩｇＧの組み合わせもＬｕｋＡＢ－誘発された細胞溶解活性を抑制できなかった。そこで、本発明者らは、抗－ＢＣＬ－成分－ＩｇＧを用いて５つのＢＣＬ－誘発された毒性をすべて中和させるためには、抗－ＬｕｋＡＢトキソイド－ＩｇＧと他の選定された抗－ＢＣＬ－成分－ＩｇＧを共に使用しなければならない。このため、精製された組換えＬｕｋＡＥ３２３ＡＢトキソイドおよびそのラビット抗－ＬｕｋＡＥ３２３ＡＢ ＩｇＧを精製した（図４）。抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－およびＨｌｇＡ－ＩｇＧの混合物が４つのＢＣＬ－媒介細胞溶解活性を高い効率で中和させることを確認したので（図９Ｂ）、抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－、抗－ＨｌｇＡおよび抗－ＬｕｋＡＥ３２３ＡＢトキソイド－ＩｇＧの３つのＩｇＧ混合物が５つのＢＣＬ－媒介細胞溶解活性を中和させると仮定した。また、３つの抗－Ｆ－成分ＩｇＧと抗－ＬｕｋＡＥ３２３ＡＢトキソイド－ＩｇＧの混合物も有望な候補になり得る（図１０Ｄ）。
【0127】
このような可能性を検証するために、ヒトＰＭＮを５つのＢＣＬおよび２つの異なるＩｇＧ組み合わせと共に培養した（図１１）。ＰＭＮの平均生存率の測定結果、抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－、抗－ＨｌｇＡおよび抗－ＬｕｋＡＥ３２３ＡＢトキソイド－ＩｇＧの組み合わせ（図１１Ａ）と、抗－ＬｕｋＦ－ＰＶ、抗－ＨｌｇＢ－および抗－ＬｕｋＡＥ３２３ＡＢトキソイド－ＩｇＧの組み合わせ（図１１Ｂ）を用いた場合にそれぞれ９４．７％および６８．０％を示して、２つのＳ－成分ＩｇＧと１つのＬｕｋＡＢトキソイドＩｇＧを混合する場合、５つのＳ．ａｕｒｅｕｓ ＢＣＬ－媒介ＰＭＮの細胞溶解活性が著しく中和されることが分かった。
【0128】
抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－、ＨｌｇＡ－、ＨｌａＨ３５ＬおよびＬｕｋＡＥ３２３ＡＢ－ＩｇＧの混合物は固有のＳ．ａｕｒｅｕｓトキシン－媒介ヒトＰＭＮの細胞溶解および溶血活性のすべてを抑制する
これまで、５つの組換えＢＣＬを用いて、インビトロでヒトＰＭＮの細胞溶解活性を調べた。そこで、本発明者らは、精製された抗－ＢＣＬ ＩｇＧが病原性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００から分泌された固有のＢＣＬに対しても作用できるかを確認しようとした。このために、まず、ＵＳＡ３００培養時点別にＢＣＬの量を測定した。図１２に示すように、５つのＢＣＬとも培養１．５～３時間目に多量分泌されていることを確認した（図１２Ａ）。同一の条件でＨｌａは１．５～９時間の間に高く分泌された。このような結果に基づいて、５つのＢＣＬおよびＨｌａトキシンは一般的に培養３時間目に蓄積されることが分かった。したがって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３０００培養培地で３時間目に培養した上澄液を収集し、タンパク質の濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように濃縮して保存液として使用した。ドットブロット分析で保存液中の分泌されたＢＣＬおよびＨｌａを定量すると、ＬｕｋＳＦ－ＰＶ、ＨｌｇＡＢ、ＬｕｋＥＤ、ＨｌｇＣＢ、ＬｕｋＡＢおよびＨｌａの平均タンパク質量はそれぞれ０．１３，０．２６、０．３２、０．３７、０．２４および１．５０μｇ／ｍｌとなった（表２）。
これまで、５つの組換えＢＣＬを用いて、インビトロでヒトＰＭＮの細胞溶解活性を調べた。そこで、本発明者らは、精製された抗－ＢＣＬ ＩｇＧが病原性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００から分泌された固有のＢＣＬに対しても作用できるかを確認しようとした。このために、まず、ＵＳＡ３００培養時点別にＢＣＬの量を測定した。図１２に示すように、５つのＢＣＬとも培養１．５～３時間目に多量分泌されていることを確認した（図１２Ａ）。同一の条件でＨｌａは１．５～９時間の間に高く分泌された。このような結果に基づいて、５つのＢＣＬおよびＨｌａトキシンは一般的に培養３時間目に蓄積されることが分かった。したがって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３０００培養培地で３時間目に培養した上澄液を収集し、タンパク質の濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように濃縮して保存液として使用した。ドットブロット分析で保存液中の分泌されたＢＣＬおよびＨｌａを定量すると、ＬｕｋＳＦ－ＰＶ、ＨｌｇＡＢ、ＬｕｋＥＤ、ＨｌｇＣＢ、ＬｕｋＡＢおよびＨｌａの平均タンパク質量はそれぞれ０．１３，０．２６、０．３２、０．３７、０．２４および１．５０μｇ／ｍｌとなった（表２）。
【表2】
【0129】
次に、ヒトＰＭＮが抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－、ＨｌｇＡ、ＨｌａＨ３５ＬおよびＬｕｋＡＥ３２３ＡＢトキソイド－ＩｇＧの４つの抗体の混合物によってインビトロで保護できるかを調べた（図１３）。ヒト全血からＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐＴＭ溶液を用いてヒトＰＭＮを作製すると、ＰＭＮバンドが何ら損傷もなく明確に現れたが（図１３Ａの左）、６つの組換えトキシン（Ｈｌａ、ＬｕｋＳＦ－ＰＶ、ＨｌｇＡＢ、ＬｕｋＥＤ、ＨｌｇＣＢ、ＬｕｋＡＢ４μｇ）をヒト全血に添加すると、遠心分離後、白色のＰＭＮバンドが回復できなかった（図１３Ａ、中間）。６つのトキシンと４つのＩｇＧ混合物（抗－ＨｌａＨ３５Ｌ、ＬｕｋＳ－ＰＶ－、ＨｌｇＡおよびＬｕｋＡＥ３２３ＡＢ－ＩｇＧの計６４μｇ）をヒト全血に添加すると、遠心分離後にＰＭＮバンドが再度現れた（図１３Ａの右）。さらに、回復したＰＭＮの細胞数を血球計数器で測定した結果（図１３Ｂ）、６つのトキシン処理された全血（カラム２）から対照群（カラム１）対比２０％ＰＭＮのみが回復した。しかし、４つのＩｇＧ処理ヒト全血（カラム３）から９５％ＰＭＮが回復した。これにより、本発明において選定された４つのＩｇＧがインビトロで６つのトキシン－媒介ＰＭＮの細胞溶解活性を効率的に遮断できることを確認した。
【0130】
また、Ｓ，ａｕｒｅｕｓ ＨｌａおよびＢＣＬは感染時に溶血活性を誘導することが知られた（Ｓｅｉｌｉｅ ＥＳ，ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｓｅｍｉｎ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ７２：１０１－１１６）。６つのトキシンをラビット全血と培養すると、ＰＢＳ処理血液に比べて高い溶血活性が観察されたが（図１３Ｃ、第２チューブ）、本発明において選定された４つのＩｇＧおよび６つのトキシンをラビット全血に投与すると、溶血活性を対照群対比５０％まで抑制された（図１３Ｃおよび１３Ｄ）。これにより、本発明の４つのトキシン抗体がＳ．ａｕｒｅｕｓトキシン－媒介ヒト血液の溶血作用を抑制できることを確認した。
【0131】
最後に、本発明者らは、選定された４つのＩｇＧがＳ．ａｕｒｅｕｓ培養培地－媒介ＰＭＮの細胞溶解作用を抑制する保護効果を調べようとした。まず、ヒトＰＭＮ（２×１０６細胞）に対する毒性を示すために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ培養培地内にどの程度のタンパク質量が必要なのかを調べるために、多様な用量の培養培地をＰＭＮと培養した（図１４Ａ）。１６μｇ／ｍｌの培養培地を添加する時、ＰＭＮは大部分加水分解された。これに基づいてヒトＰＭＮ（２×１０６細胞）を３７℃で２５０μｌのＲＰＭＩで１時間培養すると、１００％ＰＭＮが生存し（図１４Ｂ、カラム１）、ＰＭＮをＵＳＡ３００培養培地（１６μｇ／ｍｌ最終濃度）および抗－ＬｕｋＳ－ＰＶ－、ＨｌｇＡ－、ＬｕｋＡＥ３２３ＡＢおよびＨｌａＨ３５Ｌ－ＩｇＧの混合物（最終濃度計１６０μｇ／ｍｌ）と共培養した場合、約９０％のＰＭＮが生存した（カラム２）。予想どおり、ＵＳＡ３００培養培地（１６μｇ／ｍｌ最終濃度）とのみ培養した場合、５％のＰＭＮのみが生存した（カラム３）。これにより、６つのトキシン－媒介ＰＭＮの細胞溶解による損傷は、インビトロで本発明において選定された４つのトキシンおよびトキソイド－ＩｇＧを添加することにより保護できることが分かる。
【0132】
４つのラビット抗－トキシン－ＩｇＧはヒト全血およびＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００と共培養時にバクテリアの死滅効果を示す
抗原の免疫化で形成された血清抗体は宿主－食細胞－媒介オプソニン食作用を誘導して、感染した病原菌を除去することが知られた（Ｍｉｌｌｅｒ ＬＳ ｅｔ ａｌ．，２０２０．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ４４：１２３－１５３）。本発明において選定された４つの抗－ラビットトキシンＩｇＧがＳ．ａｕｒｅｕｓ ＢＣＬおよびＨｌａトキシン－媒介ＰＭＮの細胞溶解とＲＢＣの溶血活性に対する抑制効果を有することが確認されたので、これら４つの抗体がＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００細胞およびヒト全血と共培養時にバクテリアの死滅効果を有するかを調べようとした。このために、ＵＳＡ３００細胞（２×１０６細胞）を固有の精製されたＩｇＧ（４０μｇ）またはｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ４つのトキシン－由来ＩｇＧ（計４０μｇ）の混合物とヒト全血（１００μｌ）を３時間共培養し、残りのＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を測定した（図１５）。対照群試料が２×１０６ＣＦＵに達した時点で、ＩｇＧ－および４つのトキシン－ＩｇＧ混合物を処理した試料はそれぞれ対照群の２５％および６％ＣＦＵを示すことにより、４つの抗－トキシン－ＩｇＧ混合物がヒト全血においてバクテリアの死滅効果を有することが分かった。
抗原の免疫化で形成された血清抗体は宿主－食細胞－媒介オプソニン食作用を誘導して、感染した病原菌を除去することが知られた（Ｍｉｌｌｅｒ ＬＳ ｅｔ ａｌ．，２０２０．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ４４：１２３－１５３）。本発明において選定された４つの抗－ラビットトキシンＩｇＧがＳ．ａｕｒｅｕｓ ＢＣＬおよびＨｌａトキシン－媒介ＰＭＮの細胞溶解とＲＢＣの溶血活性に対する抑制効果を有することが確認されたので、これら４つの抗体がＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００細胞およびヒト全血と共培養時にバクテリアの死滅効果を有するかを調べようとした。このために、ＵＳＡ３００細胞（２×１０６細胞）を固有の精製されたＩｇＧ（４０μｇ）またはｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ４つのトキシン－由来ＩｇＧ（計４０μｇ）の混合物とヒト全血（１００μｌ）を３時間共培養し、残りのＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を測定した（図１５）。対照群試料が２×１０６ＣＦＵに達した時点で、ＩｇＧ－および４つのトキシン－ＩｇＧ混合物を処理した試料はそれぞれ対照群の２５％および６％ＣＦＵを示すことにより、４つの抗－トキシン－ＩｇＧ混合物がヒト全血においてバクテリアの死滅効果を有することが分かった。
【0133】
実施例２：ヒト補体因子Ｈ（ＦＨ）と結合するＣＷＡＰタンパク質の探索
実験方法
ｃｌｆＡ、ｃｌｆＢ、ｓｄｒＣ、ｓｄｒＤ、ｓｄｒＥ、ｆｎｂｐＡおよびｆｎｂｐＢ Ｎ２－Ｎ３ドメインを含むｐＥＴ２８ａベクターの精製
クローニングはＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）を用いて、製造会社のプロトコルに従って行った。６ヒスチジン－含有モチーフ（６－ｈｉｓ－ｔａｇ）を有するｐＥＴ２８ａプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をベクターとして用いた。ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインを発現させるために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ菌株のＮ２およびＮ３ドメインを含むｃｌｆＡ（２１５－５７５）、ｃｌｆＢ（２００－５５５）、ｓｄｒＣ（１６６－５０７）、ｓｄｒＤ（２２４－５７０）、ｓｄｒＥ（２６１－６１０）、ｆｎｂｐＡ（１８０－５５９）およびｆｎｂｐＢ（１４０－５００）の各遺伝子の約１ｋｂｐを用いた。コード領域をＱ５ ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ重合酵素を用いてＰＣＲで増幅した（プライマー配列は表３にまとめた）。クローニングされたｐＥＴ２８ａ－ｃｌｆＡ、ｃｌｆＢ、ｓｄｒＣ、ｓｄｒＤ、ｓｄｒＥ、ｆｎｂｐＡおよびｆｎｂｐＢをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）に形質転換し、１０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｋｍ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を含むＬＢ寒天プレートに塗抹した後、３７℃で一晩培養した。
実験方法
ｃｌｆＡ、ｃｌｆＢ、ｓｄｒＣ、ｓｄｒＤ、ｓｄｒＥ、ｆｎｂｐＡおよびｆｎｂｐＢ Ｎ２－Ｎ３ドメインを含むｐＥＴ２８ａベクターの精製
クローニングはＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）を用いて、製造会社のプロトコルに従って行った。６ヒスチジン－含有モチーフ（６－ｈｉｓ－ｔａｇ）を有するｐＥＴ２８ａプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をベクターとして用いた。ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインを発現させるために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ菌株のＮ２およびＮ３ドメインを含むｃｌｆＡ（２１５－５７５）、ｃｌｆＢ（２００－５５５）、ｓｄｒＣ（１６６－５０７）、ｓｄｒＤ（２２４－５７０）、ｓｄｒＥ（２６１－６１０）、ｆｎｂｐＡ（１８０－５５９）およびｆｎｂｐＢ（１４０－５００）の各遺伝子の約１ｋｂｐを用いた。コード領域をＱ５ ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ重合酵素を用いてＰＣＲで増幅した（プライマー配列は表３にまとめた）。クローニングされたｐＥＴ２８ａ－ｃｌｆＡ、ｃｌｆＢ、ｓｄｒＣ、ｓｄｒＤ、ｓｄｒＥ、ｆｎｂｐＡおよびｆｎｂｐＢをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）に形質転換し、１０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｋｍ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を含むＬＢ寒天プレートに塗抹した後、３７℃で一晩培養した。
【表3】
【0134】
ｐＥＴ２８ａ－ＣＷＡＰプラスミドＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳｓへの形質転換
ｐＥＴ２８ａ－ｃｌｆＡ、ｃｌｆＢ、ｓｄｒＣ、ｓｄｒＤ、ｓｄｒＥ、ｆｎｂｐＡおよびｆｎｂｐＢのＤＮＡ １００ｎｇ ＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳｓ細胞に熱衝撃方法を用いて形質転換し、１０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｋｍ）および５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ）を含むＬＢ寒天プレートに塗抹した後、３７℃で一晩培養した。
ｐＥＴ２８ａ－ｃｌｆＡ、ｃｌｆＢ、ｓｄｒＣ、ｓｄｒＤ、ｓｄｒＥ、ｆｎｂｐＡおよびｆｎｂｐＢのＤＮＡ １００ｎｇ ＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳｓ細胞に熱衝撃方法を用いて形質転換し、１０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｋｍ）および５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ）を含むＬＢ寒天プレートに塗抹した後、３７℃で一晩培養した。
【0135】
ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインの発現および精製
ｐＥＴ２８ａ－ｃｌｆＡ、ｃｌｆＢ、ｓｄｒＣ、ｓｄｒＤ、ｓｄｒＥ、ｆｎｂｐＡおよびｆｎｂｐＢが挿入されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳｓを、ＬＢで１０μｇ／ｍｌ Ｋｍおよび５０μｇ／ｍｌ Ｃｍと共に３７℃で一晩培養した。１０ｍｌの培養試料を１０μｇ／ｍｌのＫｍと５０μｇ／ｍｌのＣｍを含む１ＬのＬＢに接種し、３７℃で１時間半～２時間培養した。ＯＤ６００値が０．３～０．５に達した時、２００μｌの１Ｍ ＩＰＴＧを１Ｌの試料に参加し、試料を３７℃で３時間培養した。ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＣｌｆＢＮ２Ｎ３、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３、ＳｄｒＤＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３ドメインを精製するために、培養溶液を４℃で７，０００ｘｇで２０分間遠心分離した。－８０℃で３０分間ペレットを凍結させた後、ペレットを１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、および５ｍｇリゾチーム（Ｂｉｏｓｈｏｐ、Ｃａｎａｄａ）を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）４０ｍｌとｃｏｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅプロテアーゼ抑制剤カクテル（Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）に浮遊させ、常温で１５分間培養した。バクテリア細胞壁を壊すために、試料を氷上で３０分間超音波処理した。混合物を４℃で２０分間２０，４００ｘｇで遠心分離した後、上澄液を収集して、０．４５μｍのシリンジ膜フィルタで濾過した。発現した組換えタンパク質をＮｉ－セファロース６高速カラム（ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）で精製した。要するに、試料に適用する前に、Ｎｉ－セファロースカラムを１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭイミダゾールを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）（緩衝液Ａ）で平衡化した。濾過した溶液をカラムにローディングし、カラムを緩衝液Ａで洗浄後、タンパク質を段階的勾配で１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５００ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）でそれぞれ溶出した。溶出された分画を収集して、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。
ｐＥＴ２８ａ－ｃｌｆＡ、ｃｌｆＢ、ｓｄｒＣ、ｓｄｒＤ、ｓｄｒＥ、ｆｎｂｐＡおよびｆｎｂｐＢが挿入されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳｓを、ＬＢで１０μｇ／ｍｌ Ｋｍおよび５０μｇ／ｍｌ Ｃｍと共に３７℃で一晩培養した。１０ｍｌの培養試料を１０μｇ／ｍｌのＫｍと５０μｇ／ｍｌのＣｍを含む１ＬのＬＢに接種し、３７℃で１時間半～２時間培養した。ＯＤ６００値が０．３～０．５に達した時、２００μｌの１Ｍ ＩＰＴＧを１Ｌの試料に参加し、試料を３７℃で３時間培養した。ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＣｌｆＢＮ２Ｎ３、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３、ＳｄｒＤＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３ドメインを精製するために、培養溶液を４℃で７，０００ｘｇで２０分間遠心分離した。－８０℃で３０分間ペレットを凍結させた後、ペレットを１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、および５ｍｇリゾチーム（Ｂｉｏｓｈｏｐ、Ｃａｎａｄａ）を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）４０ｍｌとｃｏｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅプロテアーゼ抑制剤カクテル（Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）に浮遊させ、常温で１５分間培養した。バクテリア細胞壁を壊すために、試料を氷上で３０分間超音波処理した。混合物を４℃で２０分間２０，４００ｘｇで遠心分離した後、上澄液を収集して、０．４５μｍのシリンジ膜フィルタで濾過した。発現した組換えタンパク質をＮｉ－セファロース６高速カラム（ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）で精製した。要するに、試料に適用する前に、Ｎｉ－セファロースカラムを１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭイミダゾールを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）（緩衝液Ａ）で平衡化した。濾過した溶液をカラムにローディングし、カラムを緩衝液Ａで洗浄後、タンパク質を段階的勾配で１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５００ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）でそれぞれ溶出した。溶出された分画を収集して、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。
【0136】
ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン－カップリングされたセファロース親和度カラムの作製
組換えＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインとＣＮＢｒ－活性化されたセファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）との間のカップリングは製造会社のプロトコルに従って行った。要するに、ＣＮＢｒ－活性化されたセファロースビーズ１ｇをカップリング緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５）で３回洗浄し、１ｍｌのカップリング緩衝液に溶解した５ｍｇのＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質を添加した後、カップリング緩衝液４ｍｌに浮遊させた。２時間常温で培養後、ビーズをカップリング緩衝液で３回洗浄した。以後、ビーズを１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．０）４ｍｌと共に４時間常温で培養した後、２８０ｎｍでＵＶ吸光度が現れないまで０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で洗浄し、４℃で保管した。
組換えＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインとＣＮＢｒ－活性化されたセファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）との間のカップリングは製造会社のプロトコルに従って行った。要するに、ＣＮＢｒ－活性化されたセファロースビーズ１ｇをカップリング緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５）で３回洗浄し、１ｍｌのカップリング緩衝液に溶解した５ｍｇのＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質を添加した後、カップリング緩衝液４ｍｌに浮遊させた。２時間常温で培養後、ビーズをカップリング緩衝液で３回洗浄した。以後、ビーズを１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．０）４ｍｌと共に４時間常温で培養した後、２８０ｎｍでＵＶ吸光度が現れないまで０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で洗浄し、４℃で保管した。
【0137】
ラビットにおけるＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン認識抗体の生産
５００μｌのＰＢＳに溶解した５００μｇの精製されたＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインを完全フロイント補助剤（ＣＦＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）５００μｌと混合してエマルジョンを得た。エマルジョンをラビットに皮下注射した後、同量の抗原を混合し、７日後に５００μｌの不完全フロイント補助剤（ＩＦＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に注射した。１週間後、ラビット耳静脈から血液５００μｌを採取し、ウェスタンブロットでＩｇＧの生成を調べた。ＩｇＧの形成が確認されると、ラビット血清を取って－８０℃に保管した。
５００μｌのＰＢＳに溶解した５００μｇの精製されたＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインを完全フロイント補助剤（ＣＦＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）５００μｌと混合してエマルジョンを得た。エマルジョンをラビットに皮下注射した後、同量の抗原を混合し、７日後に５００μｌの不完全フロイント補助剤（ＩＦＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に注射した。１週間後、ラビット耳静脈から血液５００μｌを採取し、ウェスタンブロットでＩｇＧの生成を調べた。ＩｇＧの形成が確認されると、ラビット血清を取って－８０℃に保管した。
【0138】
ラビット血清から抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３認識ＩｇＧの精製
Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質がカップリングされたセファロースカラム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶出緩衝液（０．１５Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２）で洗浄した後、カラムを洗浄緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化した。抗原－免疫化されたラビット血清（２ｍｌ、タンパク質約１００ｍｇ）をカラムにローディングした後、カラムを洗浄緩衝液で洗浄し、ＩｇＧを溶出緩衝液で溶出した。収集されたＩｇＧを中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０）で迅速に中和させた。以後、ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン－カップリングされたセファロースカラムに入れ替え、カラムを溶出緩衝液（０．１５Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２）で洗浄した後、洗浄緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化した。タンパク質Ａカラムに収集されたＩｇＧ（タンパク質約６ｍｇ）をカラムにローディングし、カラムを洗浄緩衝液で洗浄した後、ＩｇＧを溶出緩衝液で溶出した。収集されたＩｇＧを中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０）で迅速に中和させた。緩衝液をＰＢＳに入れ替えた後、収集されたＩｇＧを還元および非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質がカップリングされたセファロースカラム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶出緩衝液（０．１５Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２）で洗浄した後、カラムを洗浄緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化した。抗原－免疫化されたラビット血清（２ｍｌ、タンパク質約１００ｍｇ）をカラムにローディングした後、カラムを洗浄緩衝液で洗浄し、ＩｇＧを溶出緩衝液で溶出した。収集されたＩｇＧを中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０）で迅速に中和させた。以後、ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン－カップリングされたセファロースカラムに入れ替え、カラムを溶出緩衝液（０．１５Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２）で洗浄した後、洗浄緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化した。タンパク質Ａカラムに収集されたＩｇＧ（タンパク質約６ｍｇ）をカラムにローディングし、カラムを洗浄緩衝液で洗浄した後、ＩｇＧを溶出緩衝液で溶出した。収集されたＩｇＧを中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０）で迅速に中和させた。緩衝液をＰＢＳに入れ替えた後、収集されたＩｇＧを還元および非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
【0139】
ラビットＩｇＧからＦ（ａｂ’）２切片の作製
本発明で用いられるＦ（ａｂ’）２切片は従来報告された方法で製造された（Ｈｙｍｅｓ ＡＪ ｅｔ ａｌ．，１９７９．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２５４：３１４８－５１）。抗－ヒトＦＨ－ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２切片の製造方法は、他のＦ（ａｂ’）２切片の製造にも典型的に適用される。まず、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質－カップリングされたセファロースカラム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてゴート抗－ヒトＦＨ－ＩｇＧを精製した。要するに、５００μｌ（タンパク質４０ｍｇ）のゴート－抗－ヒトＦＨ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を緩衝液Ａ（０．１Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化させたタンパク質カラム（１．５×８ｃｍ、１０ｍｌ）にローディングし、カラムを緩衝液Ａで洗浄後、２８０ｎｍでＵＶ吸光度をモニタリングしながら、結合したＩｇＧを緩衝液Ｂ（０．１５Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２）で溶出した。収集されたＩｇＧを１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ９．０）でｐＨ７．５になるまで直ちに中和させ、収集されたＩｇＧをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ．）上で濃縮した後、２．５ｍｇのゴートＦＨ ＩｇＧおよび５０μｇのペプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．１Ｍアセテート緩衝液（ｐＨ４．２）５００μｌと混合した後、３７℃で１８時間培養した。１００ｍＭ ＮａＣｌを含む冷たいリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１００ｍＭで緩衝液交換をしながら反応を終了した後、還元および非還元条件下でＩｇＧが適切に切断されたかを確認した。反応進行時に消化溶液を濃縮して緩衝液Ａと交換し、Ｆ（ａｂ’）２切片を含むタンパク質カラムの流体分画を収集した。
本発明で用いられるＦ（ａｂ’）２切片は従来報告された方法で製造された（Ｈｙｍｅｓ ＡＪ ｅｔ ａｌ．，１９７９．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２５４：３１４８－５１）。抗－ヒトＦＨ－ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２切片の製造方法は、他のＦ（ａｂ’）２切片の製造にも典型的に適用される。まず、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質－カップリングされたセファロースカラム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてゴート抗－ヒトＦＨ－ＩｇＧを精製した。要するに、５００μｌ（タンパク質４０ｍｇ）のゴート－抗－ヒトＦＨ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を緩衝液Ａ（０．１Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化させたタンパク質カラム（１．５×８ｃｍ、１０ｍｌ）にローディングし、カラムを緩衝液Ａで洗浄後、２８０ｎｍでＵＶ吸光度をモニタリングしながら、結合したＩｇＧを緩衝液Ｂ（０．１５Ｍグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．２）で溶出した。収集されたＩｇＧを１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ９．０）でｐＨ７．５になるまで直ちに中和させ、収集されたＩｇＧをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ．）上で濃縮した後、２．５ｍｇのゴートＦＨ ＩｇＧおよび５０μｇのペプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．１Ｍアセテート緩衝液（ｐＨ４．２）５００μｌと混合した後、３７℃で１８時間培養した。１００ｍＭ ＮａＣｌを含む冷たいリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１００ｍＭで緩衝液交換をしながら反応を終了した後、還元および非還元条件下でＩｇＧが適切に切断されたかを確認した。反応進行時に消化溶液を濃縮して緩衝液Ａと交換し、Ｆ（ａｂ’）２切片を含むタンパク質カラムの流体分画を収集した。
【0140】
ヒトＩＶＩｇからヒトＣＷＡＰＮ２Ｎ３認識ＩｇＧの精製
商業的に購入可能な静脈注射用ＩｇＧ（ＩＶＩｇ、タンパク質５００ｍｇ）５ｍｌをＣＷＡＰＮ２Ｎ３カップリングされたセファロースカラム（ＳｄｒＥ、ＦｎｂｐＡ：１ｍｌのビーズ；ＣｌｆＡ、ＦｎｂｐＢ：３ｍｌのビーズ）にローディングし、上述した方法で洗浄した。ヒト抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３認識ＩｇＧを溶出し、上述した方法で中和した。得られたヒトＩｇＧを還元および非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
商業的に購入可能な静脈注射用ＩｇＧ（ＩＶＩｇ、タンパク質５００ｍｇ）５ｍｌをＣＷＡＰＮ２Ｎ３カップリングされたセファロースカラム（ＳｄｒＥ、ＦｎｂｐＡ：１ｍｌのビーズ；ＣｌｆＡ、ＦｎｂｐＢ：３ｍｌのビーズ）にローディングし、上述した方法で洗浄した。ヒト抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３認識ＩｇＧを溶出し、上述した方法で中和した。得られたヒトＩｇＧを還元および非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
【0141】
ドットブロット免疫アッセイ
ＣＷＡＰＮ２Ｎ３（ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＣｌｆＢＮ２Ｎ３、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３、ＳｄｒＤＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３）のＮ２－Ｎ３ドメイン３μｇおよび陰性対照群であるＢＳＡをＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＰＳＱ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）にスポッティングして乾燥させた。膜をＴＢＳ中の５％脱脂乳で常温で２時間ブロッキングし、５％脱脂乳７００μｌに溶解した精製されたヒトフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）、精製されたヒトフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）、ヒトＦＨ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）およびヒトＦＩ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）各７μｇと共に培養した。以後、膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、６０００倍希釈された一次抗体［ラビット－抗－ヒトフィブリノーゲン－ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）、ラビット－抗－ヒトフィブロネクチン－ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）、ゴート抗－ヒトＦＨ－ＩｇＧ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）およびゴート抗－ヒトｆａｃｔｏｒ Ｉ－ＩｇＧ（ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ２３８、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）］と共に常温で１時間培養した。膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、３０００倍希釈された二次抗体（マウス抗－ラビットＩｇＧ ＨＲＰまたはドンキー抗－ゴート－ＩｇＧ－ＨＲＰ、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に１時間常温で培養した。以後、膜を１０分間３回洗浄し、増強化学発光（ＥＣＬ）試薬（ｐｉｃｏ ＥＰＤ、Ｅｌｐｉｓ－Ｂｉｏｔｅｃ、Ｋｏｒｅａ）と共に１分間培養した。
ＣＷＡＰＮ２Ｎ３（ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＣｌｆＢＮ２Ｎ３、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３、ＳｄｒＤＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３）のＮ２－Ｎ３ドメイン３μｇおよび陰性対照群であるＢＳＡをＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＰＳＱ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）にスポッティングして乾燥させた。膜をＴＢＳ中の５％脱脂乳で常温で２時間ブロッキングし、５％脱脂乳７００μｌに溶解した精製されたヒトフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）、精製されたヒトフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）、ヒトＦＨ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）およびヒトＦＩ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）各７μｇと共に培養した。以後、膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、６０００倍希釈された一次抗体［ラビット－抗－ヒトフィブリノーゲン－ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）、ラビット－抗－ヒトフィブロネクチン－ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）、ゴート抗－ヒトＦＨ－ＩｇＧ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）およびゴート抗－ヒトｆａｃｔｏｒ Ｉ－ＩｇＧ（ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ２３８、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）］と共に常温で１時間培養した。膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、３０００倍希釈された二次抗体（マウス抗－ラビットＩｇＧ ＨＲＰまたはドンキー抗－ゴート－ＩｇＧ－ＨＲＰ、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に１時間常温で培養した。以後、膜を１０分間３回洗浄し、増強化学発光（ＥＣＬ）試薬（ｐｉｃｏ ＥＰＤ、Ｅｌｐｉｓ－Ｂｉｏｔｅｃ、Ｋｏｒｅａ）と共に１分間培養した。
【0142】
フローサイトメトリー分析
ＦＨとＳ．ａｕｒｅｕｓとの結合を定量するためにＦＡＣＳ分析を行った。バクテリアを血液プレート上で一晩培養し、ＰＢＳに浮遊させた。バクテリアをＰＢＳで２回洗浄後、６００ｎｍにおける吸光度の測定によりバクテリア数を計測した。ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３ラビットＦ（ａｂ’）２切片のＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン２０μｇをＵＳＡ３００（２×１０７細胞）と共に４℃で１時間培養した。以後、試料を４℃で３分間１，５００ｘｇで遠心分離後、バクテリアペレットを２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した後、バクテリアをＰＢＳに浮遊させ、３０μｇのＦＨを添加して４℃で１時間培養した。以後、試料を４℃で３分間１，５００ｘｇで遠心分離し、バクテリアペレットを２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。以後、バクテリアを多クローンゴート抗－ヒトＦＨ Ｆａｂ’２－ＦＩＴＣ接合体と共に２０μｌのＰＢＳに再浮遊し、氷上で１時間培養した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞を３０秒間超音波処理してフローサイトメトリー分析を行い、１００００回の測定結果を記録した。
ＦＨとＳ．ａｕｒｅｕｓとの結合を定量するためにＦＡＣＳ分析を行った。バクテリアを血液プレート上で一晩培養し、ＰＢＳに浮遊させた。バクテリアをＰＢＳで２回洗浄後、６００ｎｍにおける吸光度の測定によりバクテリア数を計測した。ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３ラビットＦ（ａｂ’）２切片のＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン２０μｇをＵＳＡ３００（２×１０７細胞）と共に４℃で１時間培養した。以後、試料を４℃で３分間１，５００ｘｇで遠心分離後、バクテリアペレットを２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した後、バクテリアをＰＢＳに浮遊させ、３０μｇのＦＨを添加して４℃で１時間培養した。以後、試料を４℃で３分間１，５００ｘｇで遠心分離し、バクテリアペレットを２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。以後、バクテリアを多クローンゴート抗－ヒトＦＨ Ｆａｂ’２－ＦＩＴＣ接合体と共に２０μｌのＰＢＳに再浮遊し、氷上で１時間培養した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞を３０秒間超音波処理してフローサイトメトリー分析を行い、１００００回の測定結果を記録した。
【0143】
ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインの存在下でヒトＦＨ／ＦＩ複合体によるＣ３ｂのｉＣ３ｂへの切断
３μｇのＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン、ＢＳＡおよびゴート抗－ヒトＦＨ－ＩｇＧ（１０００：１希釈）を含む、２５ｍＭ炭酸ナトリウムと２５ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）からなるコーティング緩衝液２０μｌを微細力価プレートにコーティングした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ウェルをＰＢＳ中の０．２％ＢＳＡ１００μｌと共に常温で２時間培養し、ＰＢＳ中のＴｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４）０．０５％を含むＰＢＳＴで３回洗浄した。以後、精製されたヒトＦＨ０．３７μｇを添加した。陰性対照群としてヒトＦＨの代わりにＰＢＳを添加した。３０分間培養した後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、精製されたＣ３ｂ１μｇおよび精製されたヒトＦＩ１μｇを含む混合物７５μｌを各ウェルに添加し、３７℃で３時間培養した。培養後、上澄液を抽出し、６０００：１に希釈されたゴート抗－ヒトＣ３－ＩｇＧ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を一次抗体として用いたウェスタンブロットにより生成されたｉＣ３ｂの量を測定した。以後、膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、二次抗体であるドンキー抗－ゴート－ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に培養した。ＥＣＬ試薬を１分間処理後、上述した方法でイメージを得た。
３μｇのＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン、ＢＳＡおよびゴート抗－ヒトＦＨ－ＩｇＧ（１０００：１希釈）を含む、２５ｍＭ炭酸ナトリウムと２５ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）からなるコーティング緩衝液２０μｌを微細力価プレートにコーティングした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ウェルをＰＢＳ中の０．２％ＢＳＡ１００μｌと共に常温で２時間培養し、ＰＢＳ中のＴｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４）０．０５％を含むＰＢＳＴで３回洗浄した。以後、精製されたヒトＦＨ０．３７μｇを添加した。陰性対照群としてヒトＦＨの代わりにＰＢＳを添加した。３０分間培養した後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、精製されたＣ３ｂ１μｇおよび精製されたヒトＦＩ１μｇを含む混合物７５μｌを各ウェルに添加し、３７℃で３時間培養した。培養後、上澄液を抽出し、６０００：１に希釈されたゴート抗－ヒトＣ３－ＩｇＧ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を一次抗体として用いたウェスタンブロットにより生成されたｉＣ３ｂの量を測定した。以後、膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、二次抗体であるドンキー抗－ゴート－ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に培養した。ＥＣＬ試薬を１分間処理後、上述した方法でイメージを得た。
【0144】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ生菌上でのヒトＦＨの検出
１００μｌのＰＢＳにバクテリア（１×１０５ＣＦＵ）を用意し、５μｇのＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインと０．５μｇのＦＨを添加して４℃で１時間培養した。以後、試料を４℃で３分間１，５００ｘｇで遠心分離し、上澄液９０μｌを収集した後、バクテリアペレットを２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。最後に、バクテリアペレットを９０μｌのＰＢＳに浮遊させた。各浮遊されたバクテリアペレットと収集した上澄液を６－１５％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングした。ゲル電気泳動後、４℃で０．４５μｍのＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）に移し、膜をＴＢＳＴ中の５％脱脂乳で常温で１時間ブロッキングした。以後、膜を一次抗体であるゴート抗－ヒトＦＨ－ＩｇＧと共に培養し、ＴＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体であるドンキー抗－ゴート－ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に培養した。ＥＣＬ試薬を１分間処理した後、上述した方法でイメージを得た。
１００μｌのＰＢＳにバクテリア（１×１０５ＣＦＵ）を用意し、５μｇのＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインと０．５μｇのＦＨを添加して４℃で１時間培養した。以後、試料を４℃で３分間１，５００ｘｇで遠心分離し、上澄液９０μｌを収集した後、バクテリアペレットを２００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。最後に、バクテリアペレットを９０μｌのＰＢＳに浮遊させた。各浮遊されたバクテリアペレットと収集した上澄液を６－１５％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングした。ゲル電気泳動後、４℃で０．４５μｍのＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）に移し、膜をＴＢＳＴ中の５％脱脂乳で常温で１時間ブロッキングした。以後、膜を一次抗体であるゴート抗－ヒトＦＨ－ＩｇＧと共に培養し、ＴＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体であるドンキー抗－ゴート－ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に培養した。ＥＣＬ試薬を１分間処理した後、上述した方法でイメージを得た。
【0145】
ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインの存在下のｉＣ３ｂ量の測定
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ菌株（１×１０５ＣＦＵ）をＧＶＢ＋＋１００μｌに作製した。１０μｇのＣＷＡＰＮ２Ｎ３および０．１μｇのヒトＦＨを添加後、４℃で１時間培養した後、試料を４℃で３分間１，５００ｘｇで遠心分離し、９０μｌの上澄液を収集した。バクテリアペレットを２００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、ＧＶＢ＋＋中の１．５μｇの精製されたＣ３ｂ、０．２５μｇの精製されたヒトＦＩを上澄液およびペレットに添加した後、３７℃で３時間培養した。各ペレットと収集された上澄液を６－１５％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングした。ゲル電気泳動後、バンドを４℃でＰＶＤＦ膜に移した。膜をＴＢＳＴ中の５％脱脂乳で１時間常温でブロッキングした後、一次抗体であるゴート抗－ヒトＣ３－ＩｇＧと共に培養した。以後、膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、二次抗体であるドンキー抗－ゴート－ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に培養した。ＥＣＬ試薬を１分間処理した後、上述した方法でイメージを得た。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ菌株（１×１０５ＣＦＵ）をＧＶＢ＋＋１００μｌに作製した。１０μｇのＣＷＡＰＮ２Ｎ３および０．１μｇのヒトＦＨを添加後、４℃で１時間培養した後、試料を４℃で３分間１，５００ｘｇで遠心分離し、９０μｌの上澄液を収集した。バクテリアペレットを２００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、ＧＶＢ＋＋中の１．５μｇの精製されたＣ３ｂ、０．２５μｇの精製されたヒトＦＩを上澄液およびペレットに添加した後、３７℃で３時間培養した。各ペレットと収集された上澄液を６－１５％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングした。ゲル電気泳動後、バンドを４℃でＰＶＤＦ膜に移した。膜をＴＢＳＴ中の５％脱脂乳で１時間常温でブロッキングした後、一次抗体であるゴート抗－ヒトＣ３－ＩｇＧと共に培養した。以後、膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、二次抗体であるドンキー抗－ゴート－ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に培養した。ＥＣＬ試薬を１分間処理した後、上述した方法でイメージを得た。
【0146】
他のＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインに対するラビット抗－ＣＷＡＰ－Ｆ（ａｂ’）２の結合特異性の調査
１μｇのＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン（ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＣｌｆＢＮ２Ｎ３、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３、ＳｄｒＤＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３）をＰＶＤＦ膜にスポッティングして乾燥させた。膜をＴＢＳ中の５％脱脂乳で２時間常温でブロッキングし、６，０００：１希釈された一次抗体（抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン認識ラビットＦａｂ’２）と共に５％脱脂乳で１時間常温で培養した。膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、３０００：１希釈された二次抗体（マウス抗－ラビットＩｇＧ ＨＲＰ、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に５％脱脂乳で１時間常温で培養した。以後、膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、ＥＣＬ試薬（ｐｉｃｏ ＥＰＤ、Ｅｌｐｉｓ－Ｂｉｏｔｅｃ、Ｋｏｒｅａ）と共に１分間培養した後、上述した方法でイメージを得た。
１μｇのＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン（ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＣｌｆＢＮ２Ｎ３、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３、ＳｄｒＤＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３）をＰＶＤＦ膜にスポッティングして乾燥させた。膜をＴＢＳ中の５％脱脂乳で２時間常温でブロッキングし、６，０００：１希釈された一次抗体（抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン認識ラビットＦａｂ’２）と共に５％脱脂乳で１時間常温で培養した。膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、３０００：１希釈された二次抗体（マウス抗－ラビットＩｇＧ ＨＲＰ、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に５％脱脂乳で１時間常温で培養した。以後、膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、ＥＣＬ試薬（ｐｉｃｏ ＥＰＤ、Ｅｌｐｉｓ－Ｂｉｏｔｅｃ、Ｋｏｒｅａ）と共に１分間培養した後、上述した方法でイメージを得た。
【0147】
他のＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインに対するラビットおよびヒト抗－ＣＷＡＰ－ＩｇＧの結合特異性の調査
２００ｎｇのＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン（ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＣｌｆＢＮ２Ｎ３、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３、ＳｄｒＤＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングした。ゲル電気泳動後、バンドを４℃でＰＶＤＦ膜に移した後、ＴＢＳ中の５％脱脂乳で常温で１時間ブロッキングし、６，０００：１希釈された一次抗体（抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン認識ラビットおよびヒトＩｇＧ）と共に１時間常温で培養した。膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、３０００：１希釈された二次抗体（マウス抗－ラビットＩｇＧ ＨＲＰ、ゴート抗－ヒトＩｇＧ ＨＲＰ、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に５％脱脂乳で１時間常温で培養した。以後、膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、ＥＣＬ試薬（ｐｉｃｏ ＥＰＤ、Ｅｌｐｉｓ－Ｂｉｏｔｅｃ、Ｋｏｒｅａ）と共に１分間培養した後、上述した方法でイメージを得た。
２００ｎｇのＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン（ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＣｌｆＢＮ２Ｎ３、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３、ＳｄｒＤＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングした。ゲル電気泳動後、バンドを４℃でＰＶＤＦ膜に移した後、ＴＢＳ中の５％脱脂乳で常温で１時間ブロッキングし、６，０００：１希釈された一次抗体（抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン認識ラビットおよびヒトＩｇＧ）と共に１時間常温で培養した。膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、３０００：１希釈された二次抗体（マウス抗－ラビットＩｇＧ ＨＲＰ、ゴート抗－ヒトＩｇＧ ＨＲＰ、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に５％脱脂乳で１時間常温で培養した。以後、膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、ＥＣＬ試薬（ｐｉｃｏ ＥＰＤ、Ｅｌｐｉｓ－Ｂｉｏｔｅｃ、Ｋｏｒｅａ）と共に１分間培養した後、上述した方法でイメージを得た。
【0148】
ヒト全血におけるＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインおよび精製されたヒトまたはラビットＣＷＡＰＮ２Ｎ３認識ＩｇＧのＳ．ａｕｒｅｕｓの死滅活性
ヒト全血を用いたオプソニン食作用によるバクテリア死滅アッセイを従来報告された方法により行った（ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａｔｅｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｓｃｉ Ｒｅｐ７：４２１３７）。要するに、精製されたＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質、ヒトおよびラビット抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３－ＩｇＧをＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌの新鮮な全血を１．５ｍｌのチューブに添加した後、１０μｌのタンパク質またはＩｇＧ（５μｇ）の混合物を同一のチューブに添加し、ボルテックスした。最後に、１００μｌのＵＳＡ３００細胞（１×１０５細胞／ウェル）を添加後に１０回浮遊させ、１０～２０秒間ボルテックスした。混合物を３７℃で３時間培養後、バクテリアを順次希釈し、ＴＳＢ寒天プレートまたは羊血（ｓｈｅｅｐ ｂｌｏｏｄ）プレートに塗抹してＣＦＵを測定した。
ヒト全血を用いたオプソニン食作用によるバクテリア死滅アッセイを従来報告された方法により行った（ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａｔｅｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｓｃｉ Ｒｅｐ７：４２１３７）。要するに、精製されたＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質、ヒトおよびラビット抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３－ＩｇＧをＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌの新鮮な全血を１．５ｍｌのチューブに添加した後、１０μｌのタンパク質またはＩｇＧ（５μｇ）の混合物を同一のチューブに添加し、ボルテックスした。最後に、１００μｌのＵＳＡ３００細胞（１×１０５細胞／ウェル）を添加後に１０回浮遊させ、１０～２０秒間ボルテックスした。混合物を３７℃で３時間培養後、バクテリアを順次希釈し、ＴＳＢ寒天プレートまたは羊血（ｓｈｅｅｐ ｂｌｏｏｄ）プレートに塗抹してＣＦＵを測定した。
【0149】
データプロセッシングおよび統計的分析
他に記載されない限り、各実験は最小３回独立して行われ、実験結果は平均±標準偏差で表した。他の実験結果は類似の結果値を有する最小３回の独立的実験の代表値である。統計的有意性は独立スチューデントｔ－検定またはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いたログ順位法により測定した。Ｐ値が０．０５以下の場合、統計的有意性があると見なした。
他に記載されない限り、各実験は最小３回独立して行われ、実験結果は平均±標準偏差で表した。他の実験結果は類似の結果値を有する最小３回の独立的実験の代表値である。統計的有意性は独立スチューデントｔ－検定またはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いたログ順位法により測定した。Ｐ値が０．０５以下の場合、統計的有意性があると見なした。
【0150】
実験結果
細胞壁関連タンパク質（ＣＷＡＰ）の３つのＮ２－Ｎ３ドメインはヒト補体因子Ｈ（ＦＨ）と結合する。
ブドウ状球菌ＣＷＡＰのＮ２－Ｎ３ドメイン（「ＣＷＡＰＮ２Ｎ３」と称する）がヒト血清内の新規なリガンド分子を認識するかを調べるために、７つのＣＷＡＰＮ２Ｎ３のコード領域（６ｘ Ｈｉｓでタギングされた約３５０－３７０アミノ酸、図１６Ａおよび１６Ｂ）をＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ産物（図のＳ１）をｐＥＴ２８ａベクターにクローニングして発現コンストラクト（ｐＥＴ２８ａ－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３）を製造した。Ｈｉｓ－タギングされた組換えＣＷＡＰＮ２Ｎ３を過剰生産するために、ｐＥＴ２８ａ－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３を有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を０．２ｍＭ ＩＰＴＧで３７℃で３時間刺激した。ニッケル－親和度カラムで精製されたタンパク質は予想分子量の３５～４５ｋＤａに一致するようにＳＤＳ－ＰＡＧＥ上を移動した（図１６Ｃ）。精製されたＣＷＡＰＮ２Ｎ３の収率は培養培地１Ｌあたり１５－２０ｍｇと計算された。
細胞壁関連タンパク質（ＣＷＡＰ）の３つのＮ２－Ｎ３ドメインはヒト補体因子Ｈ（ＦＨ）と結合する。
ブドウ状球菌ＣＷＡＰのＮ２－Ｎ３ドメイン（「ＣＷＡＰＮ２Ｎ３」と称する）がヒト血清内の新規なリガンド分子を認識するかを調べるために、７つのＣＷＡＰＮ２Ｎ３のコード領域（６ｘ Ｈｉｓでタギングされた約３５０－３７０アミノ酸、図１６Ａおよび１６Ｂ）をＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ産物（図のＳ１）をｐＥＴ２８ａベクターにクローニングして発現コンストラクト（ｐＥＴ２８ａ－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３）を製造した。Ｈｉｓ－タギングされた組換えＣＷＡＰＮ２Ｎ３を過剰生産するために、ｐＥＴ２８ａ－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３を有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を０．２ｍＭ ＩＰＴＧで３７℃で３時間刺激した。ニッケル－親和度カラムで精製されたタンパク質は予想分子量の３５～４５ｋＤａに一致するようにＳＤＳ－ＰＡＧＥ上を移動した（図１６Ｃ）。精製されたＣＷＡＰＮ２Ｎ３の収率は培養培地１Ｌあたり１５－２０ｍｇと計算された。
【0151】
ＣＷＡＰＮ２Ｎ３は類似の３次元構造を有するので（Ａｒｏｒａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，２０１６．Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ７：５４０）、本発明者らは、フィブリノーゲン（Ｆｇ）、フィブロネクチン（Ｆｎ）、補体因子Ｈ（ＦＨ）および補体因子Ｉ（ＦＩ）の４つのヒトタンパク質が７つのＣＷＡＰＮ２Ｎ３をインビトロで認識するかを調べようとした。Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ染色で同量のタンパク質がＰＶＤＦ膜にブロッティングされたことを確認した後、各ＰＶＤＦ膜ストリップを各７μｇのヒトＦｇ、Ｆｎ、ＦＨおよびＦＩタンパク質と共に培養してドットブロット免疫アッセイを行った。未結合タンパク質を洗浄した後、膜上の結合タンパク質を抗－Ｆｇ－、Ｆｎ－、ＦＨ－およびＦＩ－ＩｇＧを用いて試験した（図１７Ａ）。前記条件で、ヒトＦｇは、従来報告されたように、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３と高い特異的結合力を示したのに対し（Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍ ＣＣ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｅｍｂｏ ｊ２１：６６６０－７２．）、ＦｎはＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３と特異的に結合して（Ｂｒｏｋｅｒ ＢＭ ｅｔ ａｌ，２０１４．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ３０４：２０４－１４）、２つのＦｎｂｐＮ２Ｎ３タンパク質がヒトＦｇおよびＦｎタンパク質と高い結合力を有することが分かった。また、ヒトＦＨはＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３およびＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３の４つのＣＷＡＰＮ２Ｎ３によって認識される。同一の条件で、ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３およびＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３の５つのＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質はＦＩに対する結合能力を示した。興味深いことに、ＣｌｆＢＮ２Ｎ３およびＳｄｒＤＮ２Ｎ３はこれら４つのヒトタンパク質に対する結合能を示さなかった。ＦｎｂｐＡおよびＦｇ、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３およびＦｎ、そしてＳｄｒＥＮ２Ｎ３およびＦＨまたはＦＩの間の相互作用は報告されているが（Ｓｈａｒｐ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．，２０１２．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ７：ｅ３８４０７；Ｂｉｎｇｈａｍ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１０５：１２２５４－８；Ｂｕｒｋｅ ＦＭ ｅ ａｌ．，２０１１．ＦＥＢＳ Ｊ２７８：２３５９－７１；Ｚｈａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ４７４：１６１９－１６３１３０）、ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３およびＦＨ、ＦＩの間の相互作用は知られていない。
【0152】
もし、これらのＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインがヒトＦＨと結合できれば、ＦＨ－結合ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインはＦＩの存在下で補体であるＣ３ｂがｉＣ３ｂに転換されるように誘導することができる。このような可能性を立証するために、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３および抗－ＦＨ－ＩｇＧタンパク質をすべて陽性対照群として用いたが、これはＳｄｒＥＮ２Ｎ３がヒトＦＨと結合することが知られており（Ｓｈａｒｐ ＪＡ ｅｔ ａｌ．，２０１２．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ７：ｅ３８４０７；Ｚｈａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ４７４：１６１９－１６３１）、抗－ＦＨ－ＩｇＧはＦＨに結合するからである。図１７Ｂに示すように、７つのＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質を陽性対照群タンパク質と共にマイクロプレートにコーティングし、陰性対照群としてＢＳＡもコーティングした。ＦＨと共に培養した後、未結合ＦＨを洗い流した。Ｃ３ｂおよびＦＩを添加した後、プレートを３７℃で３時間培養した。形成されたｉＣ３ｂを抗－Ｃ３－ｍＡｂを用いたウェスタンブロットで検出した（図１７Ｂ）。予想どおり、ＢＳＡ－コーティングされた分画はＦＨ／Ｃ３ｂ／ＦＩを添加してもｉＣ３ｂの４２ｋＤａ切片をほとんど形成できず（レーン１）、ＢＳＡがＦＨを誘引できないことが分かった。しかし、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３－および抗－ＦＨ－ＩｇＧ－コーティングされた分画はＦＨ／Ｃ３ｂ／ＦＩの存在下で４２ｋＤａ切片を明確に形成したが（レーン１１および１７）、ＦＩ／Ｃ３ｂのみ添加する時はそうではなく（レーン１２および１８）、これにより、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３および抗－ＦＨ－ＩｇＧがＦＨを引き寄せてＦＩによってＣ３ｂをｉＣ３ｂに変換させることが分かった。同一の条件で、ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３およびＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３－コーティングされた分画はＦＨ、Ｃ３ｂおよびＦＩを添加することで４２ｋＤａ切片を生成したが（それぞれレーン３、１３および１５）、ＦＨが存在しない場合、そうではなかった（レーン４、１４および１６）。このような結果を通して、ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３およびＳｄｒＥＮ２Ｎ３ドメインがヒトＦＨと結合することができ、ＦＨはＦＩを引き寄せることにより、インビトロで補体Ｃ３ｂがｉＣ３ｂに加水分解されるようにすることを改めて確認できた。
【0153】
ＦＨ－結合ＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質の添加によってＦＨがＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞表面に集まることができず、これによってＣ３ｂのＣ３ｂへの変換が減少する。
４つのＳ．ａｕｒｅｕｓ ＣＷＡＰがＦＨに結合できることを確認したので、ＦＨがＣＷＡＰを発現する、生きているＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞に移動することが、ＦＨ－結合ＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質を添加することで抑制できるかを調べようとした。このために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ生菌細胞をＦＨおよび５つの異なるタンパク質（ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３およびＳｄｒＣ）と共に培養した（図１８Ａ）。ＰＢＳ下で、添加されたすべてのＦＨタンパク質はバクテリア表面（ペレット）に移動し（レーン２）、上澄液（レーン１）には存在しなかった。ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３およびＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３の場合、添加されたＦＨのほぼ半分が上澄液（レーン３、５および７）に、残りの半分がペレット（レーン４、６および８）に存在した。予想どおり、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３を添加すると、バクテリア表面のＦＨの増加が完全に抑制されて（レーン１０）、添加されたＦＨの大部分が上澄液に蓄積された（レーン９）。逆に、ＦＨとの結合能がないことが明らかになったＳｄｒＣＮ２Ｎ３の場合（図１７Ａ）、添加されたすべてのＦＨが上澄液でないバクテリア表面に移動することにより（レーン１２）、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３タンパク質はＦＨとＳ．ａｕｒｅｕｓの結合に抑制効果がないことが確認された（レーン１１）。まとめると、このような結果は、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３およびＣｌｆＡＮ２Ｎ３の４つのＦＨ－結合タンパク質がＦＨと結合することで、バクテリア表面で発現するＣＷＡＰタンパク質の競争的抑制剤として機能することを表す。４つのタンパク質のうち、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３はＳ．ａｕｒｅｕｓ表面へのＦＨの移動を著しく抑制した。
４つのＳ．ａｕｒｅｕｓ ＣＷＡＰがＦＨに結合できることを確認したので、ＦＨがＣＷＡＰを発現する、生きているＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞に移動することが、ＦＨ－結合ＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質を添加することで抑制できるかを調べようとした。このために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ生菌細胞をＦＨおよび５つの異なるタンパク質（ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３およびＳｄｒＣ）と共に培養した（図１８Ａ）。ＰＢＳ下で、添加されたすべてのＦＨタンパク質はバクテリア表面（ペレット）に移動し（レーン２）、上澄液（レーン１）には存在しなかった。ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３およびＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３の場合、添加されたＦＨのほぼ半分が上澄液（レーン３、５および７）に、残りの半分がペレット（レーン４、６および８）に存在した。予想どおり、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３を添加すると、バクテリア表面のＦＨの増加が完全に抑制されて（レーン１０）、添加されたＦＨの大部分が上澄液に蓄積された（レーン９）。逆に、ＦＨとの結合能がないことが明らかになったＳｄｒＣＮ２Ｎ３の場合（図１７Ａ）、添加されたすべてのＦＨが上澄液でないバクテリア表面に移動することにより（レーン１２）、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３タンパク質はＦＨとＳ．ａｕｒｅｕｓの結合に抑制効果がないことが確認された（レーン１１）。まとめると、このような結果は、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３およびＣｌｆＡＮ２Ｎ３の４つのＦＨ－結合タンパク質がＦＨと結合することで、バクテリア表面で発現するＣＷＡＰタンパク質の競争的抑制剤として機能することを表す。４つのタンパク質のうち、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３はＳ．ａｕｒｅｕｓ表面へのＦＨの移動を著しく抑制した。
【0154】
このような観察結果を追加的に検証するために、本発明者らは、ＦＨ－認識ＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質がＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００細胞表面でＦＨ－媒介ｉＣ３ｂの形成を遮断するかを調べようとした。ＦＨ－結合ＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質がない条件下でＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞をＦＨ／Ｃ３ｂ／ＦＩと共に培養する場合、バクテリア表面に移動したＦＨが１００ｋＤａのＣ３ｂからより多量の４３ｋＤａ ｉＣ３ｂ切片を生成すると予想され、ＦＨ－結合ＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質を添加する場合、ＣＷＡＰｓＮ２Ｎ３タンパク質がＦＨを捕集するため、少量のＦＨのみがバクテリア表面に移動してより少量の４３ｋＤａ ｉＣ３ｂがバクテリア表面に蓄積されると予想された。このような可能性を確認するために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００細胞をＦＨ／Ｃ３ｂ／ＦＩおよび各５つのタンパク質と共に培養すると（図１８Ｂ）、ＰＢＳおよびＳｄｒＣ添加分画で生成されたｉＣ３ｂの量は４つのＦＨ－結合ＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質においてより高かった（それぞれレーン１および３ｖｓレーン２、４－６）。このような結果は、ＦＨ－結合ＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質がＦＨを捕集することでＣ３ｂからｉＣ３ｂに転換されることを抑制し、これにより、バクテリア表面でＦＩ－媒介されたＣ３ｂからｉＣ３ｂへの転換を遮断することを示す。
【0155】
ラビット抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ Ｆ（ａｂ’）２切片はＦＨのＳ．ａｕｒｅｕｓ表面への移動を抑制する。
次に、ラビット抗－ＦＨ－結合ＣＷＡＰＮ２Ｎ３－ＩｇＧも同じくＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００生菌細胞表面にＦＨが移動することを抑制できるかを調べようとした。このために、ラビット抗－ヒトＦＨ－ＩｇＧまたはラビット抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３－ＩｇＧを使用するにはＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質がＩｇＧのＦｃドメインに結合することで非特異的にＩｇＧを捕集するという点で難点があった。これを解決するために、固有のＦＨ－ＩｇＧにペプシンを処理して６つの異なるＦ（ａｂ’）２切片を作製した（図２３）。図２４Ａに示すように、精製された抗－ＦＨ－Ｆａｂ’２および５つの抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ Ｆ（ａｂ’）２切片は非還元条件で１００ｋＤａ、還元条件下で２５ｋＤａの大きさを示して、すべての抗－Ｆ（ａｂ’）２切片が適切に作製されたことを確認した。同系抗原に対する６つの精製された抗－Ｆ（ａｂ’）２切片の結合特異性を調べた結果、ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３およびＦＨの４つのＦ（ａｂ’）２切片がこれらの同系抗原を特異的に認識したが（図２４Ｂおよび２４Ｃ）、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３およびＳｄｒＥＮ２Ｎ３の２つのＦ（ａｂ’）２切片はＳｄｒＤＮ２Ｎ３およびＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３をそれぞれ弱く認識して（図２４Ｃ）、作製された６つのＦ（ａｂ’）２切片が所望する特性を整えたことを確認した。
次に、ラビット抗－ＦＨ－結合ＣＷＡＰＮ２Ｎ３－ＩｇＧも同じくＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００生菌細胞表面にＦＨが移動することを抑制できるかを調べようとした。このために、ラビット抗－ヒトＦＨ－ＩｇＧまたはラビット抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３－ＩｇＧを使用するにはＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質がＩｇＧのＦｃドメインに結合することで非特異的にＩｇＧを捕集するという点で難点があった。これを解決するために、固有のＦＨ－ＩｇＧにペプシンを処理して６つの異なるＦ（ａｂ’）２切片を作製した（図２３）。図２４Ａに示すように、精製された抗－ＦＨ－Ｆａｂ’２および５つの抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ Ｆ（ａｂ’）２切片は非還元条件で１００ｋＤａ、還元条件下で２５ｋＤａの大きさを示して、すべての抗－Ｆ（ａｂ’）２切片が適切に作製されたことを確認した。同系抗原に対する６つの精製された抗－Ｆ（ａｂ’）２切片の結合特異性を調べた結果、ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３およびＦＨの４つのＦ（ａｂ’）２切片がこれらの同系抗原を特異的に認識したが（図２４Ｂおよび２４Ｃ）、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３およびＳｄｒＥＮ２Ｎ３の２つのＦ（ａｂ’）２切片はＳｄｒＤＮ２Ｎ３およびＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３をそれぞれ弱く認識して（図２４Ｃ）、作製された６つのＦ（ａｂ’）２切片が所望する特性を整えたことを確認した。
【0156】
図１９Ａに示すように、ＵＳＡ３００細胞をＦＨと共培養する場合、ＦＩＴＣ－接合抗－ＦＨ－Ｆａｂ’２切片はバクテリア表面に移動したＦＨをうまく認識して、ＦＨがＵＳＡ３００生菌細胞のＣＷＡＰタンパク質に結合することが分かった。さらに、生バクテリアの４つのＣＷＡＰＮ２－Ｎ３タンパク質とＦＨの結合特異性を調べるために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００細胞（２×１０７細胞）を先に５つの異なる抗－ＣＷＡＰ Ｆ（ａｂ’）２切片（タンパク質量各２０μｇ）と培養し、バクテリア細胞を洗浄して未結合抗－ＣＷＡＰ Ｆ（ａｂ’）２切片を除去した。以後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００細胞を精製されたＦＨ（タンパク質量各３０μｇ）と培養した後、バクテリア細胞を洗浄して未結合ＦＨを除去した。以後、各抗－ＣＷＡＰ Ｆ（ａｂ’）２切片処理されたバクテリア細胞表面に移動したＦＨの量をＦＩＴＣ－接合抗－ＦＨ－Ｆａｂ’２切片を用いたＦＡＣＳ分析で調べた（図１９Ａ）。３つの抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３－Ｆ（ａｂ’）２切片（ＳｄｒＥ、ＦｎｂｐＡおよびＦｎｂｐＢ）を処理したバクテリア細胞は、抗－Ｆ（ａｂ’）２切片－未処理細胞に比べてＦＨの結合が特異的に抑制されたが（図１９Ａのｃ－ｅ ｖｓ ａ）、抗－ＣｌｆＡ Ｆ（ａｂ’）２切片の処理は低いレベルの抑制効果だけを示した（図１９Ａのｂ）。予想どおり、２０μｇの抗－ＳｄｒＣ－Ｆ（ａｂ’）２切片を処理してもＦＨとＵＳＡ３００細胞の結合に影響を及ぼさなかった（図１９Ａのｆ）。まとめると、このような結果は、精製された４つの抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３抗体が生バクテリア表面で発現するＣＷＡＰタンパク質とＦＨとの結合を遮断できることを改めて確認するものである。
【0157】
ＦＡＣＳデータに基づいて、バクテリア表面に移動したＦＨの量を定量した（図１９Ｂ）。予想どおり、抗－ＦｎｂｐＢ－Ｆ（ａｂ’）２切片はＦＨのＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞表面への結合を対照群対比６０％抑制した（カラム６ｖｓ１）。抑制能は抗－ＳｄｒＥ（５０％、カラム４）＞ＦｎｂｐＡ（４０％、カラム５）＞ＣｌｆＡ－Ｆａｂ’２（３０％、カラム６）の順に次第に減少した。抗－ＳｄｒＣ－Ｆ（ａｂ’）２切片はほとんど抑制効果を示すことができず（１０％、カラム３）、このような結果は図２Ａの結果と一致するものである。
【0158】
精製されたラビットＦＨ－結合ＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質およびこれらの抗体はＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００細胞に対するヒト全血－媒介バクテリアの死滅活性を強化する
本発明者らは、ヒト静脈注射ＩｇＧ（ＩＶＩｇ）およびラビット血清からそれぞれＩｇＧを認識するヒトおよびラビット抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインを得るならば、これらの抗－ＦＨ－結合ＣＷＡＰＮ２Ｎ３－認識ＩｇＧがＳ．ａｕｒｅｕｓ ＣＷＡＰタンパク質に結合するはずであり、このような結合によりＳ．ａｕｒｅｕｓ表面にＦＨが移動することを遮断し、窮極的に宿主食細胞によるＣ３ｂ－媒介オプソニン食作用を強化できると仮定した。これを立証すべく、抗－ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、抗－ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、抗－ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３および抗－ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３－ＩｇＧのような精製されたヒトおよびラビット抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３認識ＩｇＧを精製した。これら４つのＩｇＧの精製はこれらの特異的タンパク質－接合セファロースカラムを用いて行われた。健康なヒト血清は抗－Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＣＷＡＰ－特異的－抗体を含むことが知られたので（Ｄｒｙｌａ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ１２：３８７－９８）、ヒト血清源として商業的に購入可能なヒトＩＶＩｇを使用した。ラビット血清はＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインをラビットに３回接種して得た。ヒトＩＶＩｇまたは抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン－接種されたラビット血清をＣＷＡＰＮ２Ｎ３－接合カラムにローディングした後、ラビット抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン認識－ＩｇＧ（図２４）およびヒト抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン認識－ＩｇＧ（図２５）を溶出した。その結果、ヒトＩＶＩｇは約０．１％の抗－ＣＷＡＰｓＮ２Ｎ３ドメイン－認識ＩｇＧを、ラビット血清は約１％の抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン－認識ＩｇＧをそれぞれ含有した。これら４つのＩｇＧの純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥで還元および非還元条件で調べた結果（図２６）、精製されたＩｇＧは非還元条件で四量体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）を形成することが分かった。
本発明者らは、ヒト静脈注射ＩｇＧ（ＩＶＩｇ）およびラビット血清からそれぞれＩｇＧを認識するヒトおよびラビット抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインを得るならば、これらの抗－ＦＨ－結合ＣＷＡＰＮ２Ｎ３－認識ＩｇＧがＳ．ａｕｒｅｕｓ ＣＷＡＰタンパク質に結合するはずであり、このような結合によりＳ．ａｕｒｅｕｓ表面にＦＨが移動することを遮断し、窮極的に宿主食細胞によるＣ３ｂ－媒介オプソニン食作用を強化できると仮定した。これを立証すべく、抗－ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、抗－ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、抗－ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３および抗－ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３－ＩｇＧのような精製されたヒトおよびラビット抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３認識ＩｇＧを精製した。これら４つのＩｇＧの精製はこれらの特異的タンパク質－接合セファロースカラムを用いて行われた。健康なヒト血清は抗－Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＣＷＡＰ－特異的－抗体を含むことが知られたので（Ｄｒｙｌａ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ１２：３８７－９８）、ヒト血清源として商業的に購入可能なヒトＩＶＩｇを使用した。ラビット血清はＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインをラビットに３回接種して得た。ヒトＩＶＩｇまたは抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン－接種されたラビット血清をＣＷＡＰＮ２Ｎ３－接合カラムにローディングした後、ラビット抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン認識－ＩｇＧ（図２４）およびヒト抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン認識－ＩｇＧ（図２５）を溶出した。その結果、ヒトＩＶＩｇは約０．１％の抗－ＣＷＡＰｓＮ２Ｎ３ドメイン－認識ＩｇＧを、ラビット血清は約１％の抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメイン－認識ＩｇＧをそれぞれ含有した。これら４つのＩｇＧの純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥで還元および非還元条件で調べた結果（図２６）、精製されたＩｇＧは非還元条件で四量体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）を形成することが分かった。
【0159】
次に、精製されたラビットおよびヒトＩｇＧの各抗原（ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３、ＣｌｆＡＮ２Ｎ３およびＳｄｒＥＮ２Ｎ３ドメイン）に対する特異性をウェスタンブロットまたはドットブロットでそれぞれ調べた。図２０Ａに示すように、４つのラビット抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３－認識ＩｇＧは７つのＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインに対するこれらの同系抗原を特異的に認識するが、精製されたヒト抗－ＣＷＡＰ－ＩｇＧはＣｌｆＡを除いた広範囲な認識パターンを示した（図２０Ｂ）。例えば、抗－ＳｄｒＥＮ２Ｎ３－ＩｇＧはＣｌｆＡおよび３つのＳｄｒファミリーの４つの抗原を認識した。また、抗－ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３ドメインは３つのＳｄｒおよび２つのＦＮＢＰファミリーの５つの抗原を認識した。抗－ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３－ＩｇＧもＣｌｆＢＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３および２つのＦｎｂｐＮ２Ｎ３タンパク質の４つの抗原を認識した（図２０Ｂ）。このような結果は、ヒト抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３－ＩｇＧがラビット抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３－ＩｇＧに比べてより広範囲な認識パターンを有することを表す。
【0160】
最後に、本発明者らは、ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインまたはこれらの精製された抗体のオプソニン食作用－媒介バクテリアの死滅活性を調べようとした。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００細胞（１×１０５細胞）を１００μｌのヒト全血中のＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインタンパク質（５μｇ）と共に３７℃で３時間培養した後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ細胞のＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を測定した。各ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインを添加すると、ＣＦＵは対照群に比べて有意に減少した（図２１Ａ）。このような結果は、ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインがＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞表面にＦＨが移動することを抑制してＣ３ｂの蓄積を増加させ、宿主食細胞によるＣ３ｂ－媒介オプソニン食作用を誘導できることを裏付ける。同じく、ヒト全血を用いてＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ細胞に対するヒトおよびラビット抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３－ＩｇＧ－媒介バクテリアの死滅効果を調べた（図２１Ｂおよび２１Ｃ）。ヒト抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３－ＩｇＧ（５μｇ）を１００μｌのヒト全血においてＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ細胞（１×１０５細胞）と３時間３７℃で培養すると、ＣＦＵはＰＢＳ、ヒトＩＶＩｇおよび純粋ラビット血清のような対照群に比べて２－４倍減少した（図２１Ｂおよび２１Ｃ）。さらに、抗－ＣｌｆＡＮ２Ｎ３およびＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３ ＩｇＧの混合物をバクテリアおよび全血の混合物に添加すると、同じくＣＦＵが対照群に比べて減少した（図２１Ｂ）。また、５μｇのラビット抗－ＣｌｆＡ、抗－ＦｎｂｐＢおよび抗－ＦＮＢＰＡＮ２Ｎ３－ＩｇＧの混合物をバクテリアおよび全血の混合物に添加すると、ＣＦＵが純粋ラビットＩｇＧより２倍減少した（図２１Ｃ）。ラビットＩｇＧの場合、４つのＩｇＧ混合物が１つのＩｇＧよりも高いバクテリアの死滅活性を示した。まとめると、このような結果は、抗－ＣＷＡＰＮ２Ｎ３ドメインＩｇＧがヒト全血と培養時にＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ菌株に対する特異的バクテリアの死滅活性を有することを表す。
【0161】
実施例３：血液凝固抑制因子の選定
実験方法
組換えＣｏａおよびｖＷｂｐタンパク質の精製
ポリヒスチジン－タギングされた６つの組換えタンパク質（Ｃｏａｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮ、ＣｏａＣ、ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ、ｖＷｂｐＮおよびｖＷｂｐＣ）をクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ発現システムを用いて発現させた。これらの遺伝子はＵＳＡ３００ゲノム配列からＱ５ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ重合酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をｐＥＴ２８ａ－ベクターにクローニングしてＮ－末端またはＣ－末端に６ｘ Ｈｉｓ－タギングされたタンパク質を発現させた。クローニングされた組換えタンパク質を精製するために、６ｘ Ｈｉｓ－タグをＮ－およびＣ－末端の両側に挿入し、得られたクローンをシーケンシングして構造を確認した。組換えタンパク質は０．２ｍＭイソプロピル－ｌβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．２ｍＭの濃度）を用いてＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉで発現した。発現したタンパク質はＮｉ－セファロース６高速レジン（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－５３１８－０１、５ｍｌ）とローディング緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）、洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）および溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を用いて精製した。
実験方法
組換えＣｏａおよびｖＷｂｐタンパク質の精製
ポリヒスチジン－タギングされた６つの組換えタンパク質（Ｃｏａｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮ、ＣｏａＣ、ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ、ｖＷｂｐＮおよびｖＷｂｐＣ）をクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ発現システムを用いて発現させた。これらの遺伝子はＵＳＡ３００ゲノム配列からＱ５ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ重合酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をｐＥＴ２８ａ－ベクターにクローニングしてＮ－末端またはＣ－末端に６ｘ Ｈｉｓ－タギングされたタンパク質を発現させた。クローニングされた組換えタンパク質を精製するために、６ｘ Ｈｉｓ－タグをＮ－およびＣ－末端の両側に挿入し、得られたクローンをシーケンシングして構造を確認した。組換えタンパク質は０．２ｍＭイソプロピル－ｌβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．２ｍＭの濃度）を用いてＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉで発現した。発現したタンパク質はＮｉ－セファロース６高速レジン（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－５３１８－０１、５ｍｌ）とローディング緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）、洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）および溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を用いて精製した。
【0162】
精製された組換えＣｏａおよびｖＷｂｐドメインタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
３μｇの各ドメインタンパク質（Ｃｏａｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮ、ＣｏａＣ、ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ、ｖＷｂｐＮ、ｖＷｂｐＣ）を４Ｘローディングサンプリング緩衝液（ＬＳＢ、ＳＨ＋）と混合し、１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに１時間ローディングした（３５ｍＡ、６００Ｖ、１００Ｗ）。
３μｇの各ドメインタンパク質（Ｃｏａｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮ、ＣｏａＣ、ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ、ｖＷｂｐＮ、ｖＷｂｐＣ）を４Ｘローディングサンプリング緩衝液（ＬＳＢ、ＳＨ＋）と混合し、１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに１時間ローディングした（３５ｍＡ、６００Ｖ、１００Ｗ）。
【0163】
ＣｏａおよびｖＷｂｐタンパク質抗体を得るためのラビット接種
５００μｌのＰＢＳに溶解したＳ．ａｕｒｅｕｓ ＣｏａおよびｖＷｂｐタンパク質の精製された単一成分５００μｇを５００μｌの完全フロイント補助剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合してエマルジョンを作製した。各エマルジョンをラビットに皮下注射後、２週後に同量の抗原を５００μｌの不完全フロイント補助剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合して皮下注射した。２週後、ラビット耳静脈から血液５００μｌを取り、各抗原のＩｇＧ形成の有無をウェスタンブロットで調べた。抗体が形成された場合、ラビット全血を収集して血清を得ており、使用前まで－８０℃で保管した。
５００μｌのＰＢＳに溶解したＳ．ａｕｒｅｕｓ ＣｏａおよびｖＷｂｐタンパク質の精製された単一成分５００μｇを５００μｌの完全フロイント補助剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合してエマルジョンを作製した。各エマルジョンをラビットに皮下注射後、２週後に同量の抗原を５００μｌの不完全フロイント補助剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合して皮下注射した。２週後、ラビット耳静脈から血液５００μｌを取り、各抗原のＩｇＧ形成の有無をウェスタンブロットで調べた。抗体が形成された場合、ラビット全血を収集して血清を得ており、使用前まで－８０℃で保管した。
【0164】
ＣｏａおよびｖＷｂｐの異なるドメインタンパク質に対する抗体－特異性の調査
３μｇの各ドメインタンパク質（Ｃｏａｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮ、ＣｏａＣ、ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ、ｖＷｂｐＮ、ｖＷｂｐＣ）および陰性対照群タンパク質（ＢＳＡ）をＰＶＤＦ膜（０．２２μｍ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＰＳＱ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）にスポッティングして乾燥させた。膜をＴＢＳ中の５％脱脂乳で２時間常温でブロッキングし、５％脱脂乳で３，０００：１に希釈された一次抗体（抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮ、－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ、－ｖＷｂｐＮ）と共に１時間常温で培養した。膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、５％脱脂乳で６０００：１に希釈された二次抗体（マウス抗－ラビットＩｇＧ ＨＲＰ、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に１時間常温で培養した。以後、膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、ＥＣＬ試薬（ｐｉｃｏ ＥＰＤ、Ｅｌｐｉｓ－Ｂｉｏｔｅｃ、Ｋｏｒｅａ）と共に１分間培養した。
３μｇの各ドメインタンパク質（Ｃｏａｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮ、ＣｏａＣ、ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ、ｖＷｂｐＮ、ｖＷｂｐＣ）および陰性対照群タンパク質（ＢＳＡ）をＰＶＤＦ膜（０．２２μｍ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＰＳＱ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）にスポッティングして乾燥させた。膜をＴＢＳ中の５％脱脂乳で２時間常温でブロッキングし、５％脱脂乳で３，０００：１に希釈された一次抗体（抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮ、－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ、－ｖＷｂｐＮ）と共に１時間常温で培養した。膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、５％脱脂乳で６０００：１に希釈された二次抗体（マウス抗－ラビットＩｇＧ ＨＲＰ、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に１時間常温で培養した。以後、膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、ＥＣＬ試薬（ｐｉｃｏ ＥＰＤ、Ｅｌｐｉｓ－Ｂｉｏｔｅｃ、Ｋｏｒｅａ）と共に１分間培養した。
【0165】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００培養中のＣｏａおよびｖＷｂｐタンパク質の発現パターン
ＵＳＡ３００を１０ｍｌ ＲＰＭＩで３７℃、１８０ｒｐｍで一晩培養した。以後、１ｍｌのバクテリアシード（ｓｅｅｄ）培養溶液を５０ｍｌのＲＰＭＩに添加し、３７℃、１８０ｒｐｍで培養しながら、各時間（０ｈ、１．５ｈ、３ｈ、６ｈ、９ｈ、１２ｈ）別にバクテリア培養溶液１ｍｌを取った。以後、採取したバクテリア培養溶液の吸光度（ＯＤ６００）を測定し、常温で３分間４，４００ｘｇで遠心分離した。２０μｌのバクテリア上澄液を１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングし、電気泳動後にバンドを４℃でＰＶＤＦ膜に移した。膜をＴＢＳＴ中の５％脱脂乳で１時間常温でブロッキングした。以後、膜を一次抗体である抗－ラビット－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－および抗－ラビット－ｒｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧと共に培養した。膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、二次抗体であるマウス抗－ラビット－ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に培養した。ＥＣＬ試薬を１分間処理した後、イメージを得た。
ＵＳＡ３００を１０ｍｌ ＲＰＭＩで３７℃、１８０ｒｐｍで一晩培養した。以後、１ｍｌのバクテリアシード（ｓｅｅｄ）培養溶液を５０ｍｌのＲＰＭＩに添加し、３７℃、１８０ｒｐｍで培養しながら、各時間（０ｈ、１．５ｈ、３ｈ、６ｈ、９ｈ、１２ｈ）別にバクテリア培養溶液１ｍｌを取った。以後、採取したバクテリア培養溶液の吸光度（ＯＤ６００）を測定し、常温で３分間４，４００ｘｇで遠心分離した。２０μｌのバクテリア上澄液を１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングし、電気泳動後にバンドを４℃でＰＶＤＦ膜に移した。膜をＴＢＳＴ中の５％脱脂乳で１時間常温でブロッキングした。以後、膜を一次抗体である抗－ラビット－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－および抗－ラビット－ｒｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧと共に培養した。膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、二次抗体であるマウス抗－ラビット－ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に培養した。ＥＣＬ試薬を１分間処理した後、イメージを得た。
【0166】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞表面で発現するＣｏａおよびｖＷｂｐ－認識タンパク質の同定
７つの組換えＭＳＣＲＡＭＭ（ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＣｌｆＢＮ２Ｎ３、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３、ＳｄｒＤＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３）のＮ２－Ｎ３ドメイン３μｇと陰性対照群であるＢＳＡをＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＰＳＱ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）にスポッティングして乾燥させた。膜をＴＢＳ中の５％脱脂乳で２時間常温でブロッキングし、７００μｌの５％脱脂乳に溶解した精製された各組換えタンパク質であるＣｏａｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮ、ＣｏａＣ、ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ、ｖＷｂｐＮ、ｖＷｂｐＣ各７μｇと共に培養した。以後、膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、３，０００：１に希釈された一次抗体（抗－ラビット－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧ、抗－ラビット－ＣｏａＮ－ＩｇＧ、抗－ラビット－ＣｏａＣ－ＩｇＧ、抗－ラビット－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧ、抗－ラビット－ｖＷｂｐＮ－ＩｇＧ、抗－ラビット－ｖＷｂｐＣ－ＩｇＧ）と共に１時間常温で培養した。膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、６０００：１希釈された二次抗体（マウス抗－ラビットＩｇＧ ＨＲＰ、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に５％脱脂乳で１時間常温で培養した。以後、膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、増強化学発光（ＥＣＬ）試薬（ｐｉｃｏ ＥＰＤ、Ｅｌｐｉｓ－Ｂｉｏｔｅｃ、Ｋｏｒｅａ）と共に１分間培養した。
７つの組換えＭＳＣＲＡＭＭ（ＣｌｆＡＮ２Ｎ３、ＣｌｆＢＮ２Ｎ３、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３、ＳｄｒＤＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３）のＮ２－Ｎ３ドメイン３μｇと陰性対照群であるＢＳＡをＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＰＳＱ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）にスポッティングして乾燥させた。膜をＴＢＳ中の５％脱脂乳で２時間常温でブロッキングし、７００μｌの５％脱脂乳に溶解した精製された各組換えタンパク質であるＣｏａｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮ、ＣｏａＣ、ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ、ｖＷｂｐＮ、ｖＷｂｐＣ各７μｇと共に培養した。以後、膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、３，０００：１に希釈された一次抗体（抗－ラビット－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧ、抗－ラビット－ＣｏａＮ－ＩｇＧ、抗－ラビット－ＣｏａＣ－ＩｇＧ、抗－ラビット－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧ、抗－ラビット－ｖＷｂｐＮ－ＩｇＧ、抗－ラビット－ｖＷｂｐＣ－ＩｇＧ）と共に１時間常温で培養した。膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、６０００：１希釈された二次抗体（マウス抗－ラビットＩｇＧ ＨＲＰ、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に５％脱脂乳で１時間常温で培養した。以後、膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、増強化学発光（ＥＣＬ）試薬（ｐｉｃｏ ＥＰＤ、Ｅｌｐｉｓ－Ｂｉｏｔｅｃ、Ｋｏｒｅａ）と共に１分間培養した。
【0167】
抗－Ｆｎｂｐ－Ｆ（ａｂ’）２切片を用いたＣｏａおよびＦｎｂｐタンパク質の間の結合特異性の確認
３μｇのＣｏａＣタンパク質または２０μｇの抗－ＦｎＢｐ－Ｆ（ａｂ’）２および陰性対照群である抗－ＳｄｒＣ－Ｆ（ａｂ’）２切片と共にバクテリア（ＵＳＡ３００、１×１０５ＣＦＵ）を４℃で１時間培養した。以後、試料を４℃で３分間４，４００ｘｇで遠心分離し、バクテリアペレットを５００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。各浮遊されたバクテリアペレットを１５％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングし、電気泳動後にバンドを４℃で０．４５μｍのＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）に移した。膜をＴＢＳＴ中の５％脱脂乳で常温で１時間ブロッキングし、一次抗体である抗－ラビット－ＣｏａＣ－ＩｇＧと共に培養した。以後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、二次抗体であるマウス抗－ラビットＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に培養した。ＥＣＬ試薬を１分間処理した後、イメージを得た。
３μｇのＣｏａＣタンパク質または２０μｇの抗－ＦｎＢｐ－Ｆ（ａｂ’）２および陰性対照群である抗－ＳｄｒＣ－Ｆ（ａｂ’）２切片と共にバクテリア（ＵＳＡ３００、１×１０５ＣＦＵ）を４℃で１時間培養した。以後、試料を４℃で３分間４，４００ｘｇで遠心分離し、バクテリアペレットを５００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。各浮遊されたバクテリアペレットを１５％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングし、電気泳動後にバンドを４℃で０．４５μｍのＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）に移した。膜をＴＢＳＴ中の５％脱脂乳で常温で１時間ブロッキングし、一次抗体である抗－ラビット－ＣｏａＣ－ＩｇＧと共に培養した。以後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、二次抗体であるマウス抗－ラビットＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と共に培養した。ＥＣＬ試薬を１分間処理した後、イメージを得た。
【0168】
精製されたＣｏａｗｈｏｌｅまたはｖＷｂｐｗｈｏｌｅの各用量による血液凝固の誘導
ヒルジン処理されたヒト血液２００μｌを５ｍｌの丸底チューブに入れて、多様な用量のＣｏａｗｈｏｌｅおよびｖＷｂｐｗｈｏｌｅ（１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、４０μｇ、５０μｇ）またはＰＢＳを添加した。試料を常温で培養し、チューブを１．５時間間隔で４５゜の角度に傾斜しながら血液凝固を確認した。
ヒルジン処理されたヒト血液２００μｌを５ｍｌの丸底チューブに入れて、多様な用量のＣｏａｗｈｏｌｅおよびｖＷｂｐｗｈｏｌｅ（１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、４０μｇ、５０μｇ）またはＰＢＳを添加した。試料を常温で培養し、チューブを１．５時間間隔で４５゜の角度に傾斜しながら血液凝固を確認した。
【0169】
各用量の精製された抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧまたは抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧによる血液凝固遮断の測定
ヒルジン処理されたヒト血液２００μｌを５ｍｌの丸底チューブに入れて、多様な用量の抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧおよび抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧ（１０μｇ、２０μｇ、４０μｇ、８０μｇ、１００μｇ）を添加した。以後、５μｇのＣｏａｗｈｏｌｅおよびｖＷｂｐｗｈｏｌｅまたはＰＢＳを添加した。試料を常温で培養し、チューブを１．５時間間隔で４５゜の角度に傾斜しながら血液凝固を確認した。
ヒルジン処理されたヒト血液２００μｌを５ｍｌの丸底チューブに入れて、多様な用量の抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧおよび抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧ（１０μｇ、２０μｇ、４０μｇ、８０μｇ、１００μｇ）を添加した。以後、５μｇのＣｏａｗｈｏｌｅおよびｖＷｂｐｗｈｏｌｅまたはＰＢＳを添加した。試料を常温で培養し、チューブを１．５時間間隔で４５゜の角度に傾斜しながら血液凝固を確認した。
【0170】
抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ ＩｇＧまたは抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ ＩｇＧによるＣｏａおよびｖＷｂｐ－媒介血液凝固の抑制効果
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ細胞を５０ｍｌのＲＰＭＩで２時間３７℃、１８０ｒｐｍで培養し、バクテリアを４，４００ｘｇで４℃で３分間遠心分離した後、バクテリア上澄液１００μｌをヒルジン処理ヒト血液２００μｌに添加した。５μｇのｖＷｂｐｗｈｏｌｅおよび１μｇのＣｏａｗｈｏｌｅをヒルジン処理ヒト血液２００μｌに添加して陽性対照群として用いた。抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧ８０μｇおよび抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧ８０μｇまたは抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧと抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧ各４０μｇの混合物を先にヒルジン処理ヒト血液２００μｌに添加し、以後、１００μｌのバクテリア上澄液を添加した。試料を常温で培養し、チューブを１．５時間間隔で４５゜の角度に傾斜しながら血液凝固を確認した。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ細胞を５０ｍｌのＲＰＭＩで２時間３７℃、１８０ｒｐｍで培養し、バクテリアを４，４００ｘｇで４℃で３分間遠心分離した後、バクテリア上澄液１００μｌをヒルジン処理ヒト血液２００μｌに添加した。５μｇのｖＷｂｐｗｈｏｌｅおよび１μｇのＣｏａｗｈｏｌｅをヒルジン処理ヒト血液２００μｌに添加して陽性対照群として用いた。抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧ８０μｇおよび抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧ８０μｇまたは抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧと抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧ各４０μｇの混合物を先にヒルジン処理ヒト血液２００μｌに添加し、以後、１００μｌのバクテリア上澄液を添加した。試料を常温で培養し、チューブを１．５時間間隔で４５゜の角度に傾斜しながら血液凝固を確認した。
【0171】
インビボにおける抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧまたはｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧによる血液凝固の抑制効果
ＣｏａｗｈｏｌｅおよびｖＷｂｐｗｈｏｌｅのインビボ効果を検証するために、これらをウサギに注射して得た抗体でインビボ受動免疫（ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）実験を行った。まず、４匹のウサギを２匹ずつ２グループに分けた（図３７）。第１グループは、ＰＢＳを注射した後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌を１．６×１０８ＣＦＵを耳静脈に注射し、第２グループは、ｃｏａｗｈｏｌｅタンパク質－接合セファロースカラムで精製した１ｍｇの抗－ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧとｖＷｂｐｗｈｏｌｅタンパク質－接合セファロースカラムで精製した１ｍｇの抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧとを混合して左耳静脈に注射した後、１時間後にＵＳＡ３００菌１．６×１０８ＣＦＵを右耳静脈に注射した。以後、各ウサギの体重変化および生存率を調べた。
ＣｏａｗｈｏｌｅおよびｖＷｂｐｗｈｏｌｅのインビボ効果を検証するために、これらをウサギに注射して得た抗体でインビボ受動免疫（ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）実験を行った。まず、４匹のウサギを２匹ずつ２グループに分けた（図３７）。第１グループは、ＰＢＳを注射した後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌を１．６×１０８ＣＦＵを耳静脈に注射し、第２グループは、ｃｏａｗｈｏｌｅタンパク質－接合セファロースカラムで精製した１ｍｇの抗－ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧとｖＷｂｐｗｈｏｌｅタンパク質－接合セファロースカラムで精製した１ｍｇの抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧとを混合して左耳静脈に注射した後、１時間後にＵＳＡ３００菌１．６×１０８ＣＦＵを右耳静脈に注射した。以後、各ウサギの体重変化および生存率を調べた。
【0172】
実験結果
組換えＳ．ａｕｒｅｕｓコアグラーゼおよびｖＷＦ（ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ）－結合ドメインタンパク質（ｖＷｂｐ）のクローニングと精製
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＣｏａおよびｖＷｂｐタンパク質がＳ．ａｕｒｅｕｓの主要毒性因子として作用すると提案されたため、本発明者らは、これらの因子が感染過程で単純分泌されるよりは、血管でフィブリン凝固を形成することにより、宿主免疫体系を回避するために、特定の受容体を経由してバクテリア表面に結合すると仮定した。これはいくつかの明らかにされていない受容体タンパク質がバクテリア表面に存在することを示唆するが、もしバクテリア表面のこのような受容体を発見できれば、これに対する抗体を用いてＣｏａまたはｖＷｂｐと前記受容体との間の結合を遮断してＳ．ａｕｒｅｕｓ感染過程でのフィブリン凝固形成を防止できるであろう。バクテリア表面で発現するこれらの受容体を同定するために、ＣｏａおよびｖＷｂｐドメインを含む組換えタンパク質とこれらに対する抗体を製造しようとした。
組換えＳ．ａｕｒｅｕｓコアグラーゼおよびｖＷＦ（ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ）－結合ドメインタンパク質（ｖＷｂｐ）のクローニングと精製
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＣｏａおよびｖＷｂｐタンパク質がＳ．ａｕｒｅｕｓの主要毒性因子として作用すると提案されたため、本発明者らは、これらの因子が感染過程で単純分泌されるよりは、血管でフィブリン凝固を形成することにより、宿主免疫体系を回避するために、特定の受容体を経由してバクテリア表面に結合すると仮定した。これはいくつかの明らかにされていない受容体タンパク質がバクテリア表面に存在することを示唆するが、もしバクテリア表面のこのような受容体を発見できれば、これに対する抗体を用いてＣｏａまたはｖＷｂｐと前記受容体との間の結合を遮断してＳ．ａｕｒｅｕｓ感染過程でのフィブリン凝固形成を防止できるであろう。バクテリア表面で発現するこれらの受容体を同定するために、ＣｏａおよびｖＷｂｐドメインを含む組換えタンパク質とこれらに対する抗体を製造しようとした。
【0173】
ドットブロットを用いたＣｏａおよびｖＷｂｐの異なるドメインタンパク質に対する抗体－特異性の調査
図２７に示すように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ菌株のゲノム配列に基づいてＣｏａおよびｖＷｂｐ全長タンパク質、ＣｏａおよびｖＷｂｐのＮ－末端のＤ１－Ｄ２ドメインおよびＣｏａおよびｖＷｂｐのＣ－末端の反復ドメインの計６つのタンパク質を作製した。ＣｏａおよびｖＷｂｐ全長タンパク質はそれぞれ６０７および５０８アミノ酸（ａａ）からなり、ＣｏａおよびｖＷｂｐのＮ－末端ドメインは２８４および２５３ａａ、Ｃ－末端の反復ドメインは２９７および２３３からそれぞれ構成された。これらの遺伝子をクローニングした後、６つの異なる組換えタンパク質（Ｃｏａ－ｗｈｏｌｅ、Ｃｏａ－Ｎ、Ｃｏａ－Ｃ、ｖＷｂｐ－ｗｈｏｌｅ、ｖＷｂｐ－ＮおよびｖＷｂｐ－Ｃ）を発現させた後、図２８に示すように均一に精製した。これらのタンパク質は２回の皮下接種によりラビット多クローン抗－ＣｏａおよびｖＷｂｐ－認識ＩｇＧを生成させるのに使用された。精製された各タンパク質のＩｇＧの抗原認識特異性を調べた結果、抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧはＣｏａｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮおよびＣｏａＣを認識したのに対し、抗－ＣｏａＮ－ＩｇＧはＣｏａｗｈｏｌｅおよびＣｏａＮだけを認識し、ＣｏａＣを認識できなかった（図２９Ａ）。また、抗－ｖＷｂｐ－ＩｇＧもこれらの抗原に対する特異的結合を示した（図２９Ｂ）。このような結果は、生成された４つのＣｏａおよびｖＷｂｐ－ＩｇＧがこれらの抗原に対する適切な特異性を有することを表す。
図２７に示すように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ菌株のゲノム配列に基づいてＣｏａおよびｖＷｂｐ全長タンパク質、ＣｏａおよびｖＷｂｐのＮ－末端のＤ１－Ｄ２ドメインおよびＣｏａおよびｖＷｂｐのＣ－末端の反復ドメインの計６つのタンパク質を作製した。ＣｏａおよびｖＷｂｐ全長タンパク質はそれぞれ６０７および５０８アミノ酸（ａａ）からなり、ＣｏａおよびｖＷｂｐのＮ－末端ドメインは２８４および２５３ａａ、Ｃ－末端の反復ドメインは２９７および２３３からそれぞれ構成された。これらの遺伝子をクローニングした後、６つの異なる組換えタンパク質（Ｃｏａ－ｗｈｏｌｅ、Ｃｏａ－Ｎ、Ｃｏａ－Ｃ、ｖＷｂｐ－ｗｈｏｌｅ、ｖＷｂｐ－ＮおよびｖＷｂｐ－Ｃ）を発現させた後、図２８に示すように均一に精製した。これらのタンパク質は２回の皮下接種によりラビット多クローン抗－ＣｏａおよびｖＷｂｐ－認識ＩｇＧを生成させるのに使用された。精製された各タンパク質のＩｇＧの抗原認識特異性を調べた結果、抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧはＣｏａｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮおよびＣｏａＣを認識したのに対し、抗－ＣｏａＮ－ＩｇＧはＣｏａｗｈｏｌｅおよびＣｏａＮだけを認識し、ＣｏａＣを認識できなかった（図２９Ａ）。また、抗－ｖＷｂｐ－ＩｇＧもこれらの抗原に対する特異的結合を示した（図２９Ｂ）。このような結果は、生成された４つのＣｏａおよびｖＷｂｐ－ＩｇＧがこれらの抗原に対する適切な特異性を有することを表す。
【0174】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００培養中のＣｏａおよびｖＷｂｐタンパク質の発現パターン
６つのタンパク質とこれらのラビット多クローン抗体をすべて得たので、これら２つの分泌酵素の発現パターンを各時点別にＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌株を培養したＲＰＭＩ培地を用いてウェスタンブロットで調べた。図３０Ａに示すように、Ｃｏａｗｈｏｌｅタンパク質（６０ｋＤａ）は１．５時間の培養時点で分泌され、培養３時間目に最大量が検出された後、次第に減少しながら９時間目まで検出された。予想どおり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質Ａ（４５ｋＤａ）は培養３時間目まで培養上澄液に蓄積された（赤い矢印）。しかし、ｖＷｂｐ（５０ｋＤａ）は培養１．５時間目に最大量が検出された後、次第に減少しながら１２時間目まで検出された（図３０Ｂ）。タンパク質の分泌はＣｏａと類似のパターンを示した（図３０Ｂ）。これからＣｏａｗｈｏｌｅおよびｖＷｂｐｗｈｏｌｅタンパク質が１．５時間から３時間の間に最大量が分泌されることが分かる。
６つのタンパク質とこれらのラビット多クローン抗体をすべて得たので、これら２つの分泌酵素の発現パターンを各時点別にＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌株を培養したＲＰＭＩ培地を用いてウェスタンブロットで調べた。図３０Ａに示すように、Ｃｏａｗｈｏｌｅタンパク質（６０ｋＤａ）は１．５時間の培養時点で分泌され、培養３時間目に最大量が検出された後、次第に減少しながら９時間目まで検出された。予想どおり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質Ａ（４５ｋＤａ）は培養３時間目まで培養上澄液に蓄積された（赤い矢印）。しかし、ｖＷｂｐ（５０ｋＤａ）は培養１．５時間目に最大量が検出された後、次第に減少しながら１２時間目まで検出された（図３０Ｂ）。タンパク質の分泌はＣｏａと類似のパターンを示した（図３０Ｂ）。これからＣｏａｗｈｏｌｅおよびｖＷｂｐｗｈｏｌｅタンパク質が１．５時間から３時間の間に最大量が分泌されることが分かる。
【0175】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞表面で発現するＣｏａおよびｖＷｂｐ－認識タンパク質の同定
本発明者らは、バクテリアが生長する間にバクテリア表面で発現する、ＣｏａおよびｖＷｂｐを認識するタンパク質を同定しようとした。まず、これら２つの分泌タンパク質が認識する可能性がある分子としてＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞壁関連タンパク質（ＣＷＡＰ）を注目した。本発明者らは、ドットブロット免疫アッセイを用いて７つの組換えＣＷＡＰタンパク質をＣｏａ－およびｖＷｂｐ－認識タンパク質のスクリーニングに適用した（図３１）。これら７つのＣＷＡＰタンパク質と対照群であるＢＳＡをＰＶＤＦ膜ストリップにスポッティングした後、各ストリップを６つの精製された組換えＣｏａおよびｖＷｂｐドメインタンパク質と共培養し、ストリップを各ドメイン－特異的ＩｇＧと培養してＣｏａ－またはｖＷｂｐのどのようなドメインがＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質と結合するかを調べた。図３１Ａに示すように、Ｃｏａｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮおよびＣｏａＣタンパク質はＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３とＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３ドメインを特異的に認識した。同一の条件で、ｖＷｂｐｗｈｏｌｅタンパク質は５つの異なるＮ２－Ｎ３ドメインであるＣｌｆＢＮ２Ｎ３、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３およびＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３ドメインに対する結合能力を示し、ｖＷｂｐＮドメインはＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３と強く結合し、残りの３つのＣＷＡＰタンパク質とは弱く結合した（図３１Ｂ）。しかし、ｖＷｂｐ－Ｃタンパク質はＣｌｆＡＮ２Ｎ３およびＳｄｒＤＮ２Ｎ３を除いた残りのＮ２－Ｎ３ドメインに対してより広範囲な結合力を示した。このような結果は、Ｃｏａタンパク質がバクテリア表面で発現するＦｎｂｐタンパク質を認識し、このため、２つのＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｆｎｂｐ ＣＷＡＰタンパク質がＣｏａ－認識タンパク質として機能できることを示唆する。しかし、ｖＷｂｐタンパク質はいくつかのＳ．ａｕｒｅｕｓ ＣＷＡＰによって広範囲に認識される。
本発明者らは、バクテリアが生長する間にバクテリア表面で発現する、ＣｏａおよびｖＷｂｐを認識するタンパク質を同定しようとした。まず、これら２つの分泌タンパク質が認識する可能性がある分子としてＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞壁関連タンパク質（ＣＷＡＰ）を注目した。本発明者らは、ドットブロット免疫アッセイを用いて７つの組換えＣＷＡＰタンパク質をＣｏａ－およびｖＷｂｐ－認識タンパク質のスクリーニングに適用した（図３１）。これら７つのＣＷＡＰタンパク質と対照群であるＢＳＡをＰＶＤＦ膜ストリップにスポッティングした後、各ストリップを６つの精製された組換えＣｏａおよびｖＷｂｐドメインタンパク質と共培養し、ストリップを各ドメイン－特異的ＩｇＧと培養してＣｏａ－またはｖＷｂｐのどのようなドメインがＣＷＡＰＮ２Ｎ３タンパク質と結合するかを調べた。図３１Ａに示すように、Ｃｏａｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮおよびＣｏａＣタンパク質はＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３とＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３ドメインを特異的に認識した。同一の条件で、ｖＷｂｐｗｈｏｌｅタンパク質は５つの異なるＮ２－Ｎ３ドメインであるＣｌｆＢＮ２Ｎ３、ＳｄｒＣＮ２Ｎ３、ＳｄｒＥＮ２Ｎ３、ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３およびＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３ドメインに対する結合能力を示し、ｖＷｂｐＮドメインはＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３と強く結合し、残りの３つのＣＷＡＰタンパク質とは弱く結合した（図３１Ｂ）。しかし、ｖＷｂｐ－Ｃタンパク質はＣｌｆＡＮ２Ｎ３およびＳｄｒＤＮ２Ｎ３を除いた残りのＮ２－Ｎ３ドメインに対してより広範囲な結合力を示した。このような結果は、Ｃｏａタンパク質がバクテリア表面で発現するＦｎｂｐタンパク質を認識し、このため、２つのＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｆｎｂｐ ＣＷＡＰタンパク質がＣｏａ－認識タンパク質として機能できることを示唆する。しかし、ｖＷｂｐタンパク質はいくつかのＳ．ａｕｒｅｕｓ ＣＷＡＰによって広範囲に認識される。
【0176】
抗－Ｆｎｂｐ Ｆ（ａｂ’）２切片を用いたＣｏａとＦｎｂｐタンパク質との間の結合特異性の確認
Ｃｏａタンパク質と２つのＦｎｂｐＮ２Ｎ３タンパク質との間の特異的結合が観察されたので、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００生菌バクテリア、Ｃｏａｗｈｏｌｅおよび抗－Ｆｎｂｐ－Ｆ（ａｂ’）２切片を用いてこれを再度確認しようとした。抗－Ｆｎｂｐ－Ｆ（ａｂ’）２切片を作製した理由は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質ＡがＩｇＧ Ｆｃドメインに結合することで添加されたＩｇＧを消耗させることが知られたため、抗－Ｆｎｂｐ－ＩｇＧがＣｏａｗｈｏｌｅおよびＵＳＡ３００細胞のＦｎｂｐタンパク質の間の相互作用をうまく抑制できないと予想されたからである。抗－Ｆｎｂｐ－Ｆ（ａｂ’）２切片を用いることにより、Ｃｏａおよび２つのＦｎｂｐＮ２Ｎ３タンパク質の間の結合が特異的か否かを確認できるであろうと仮定した。図３２に示すように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞をＣｏａＣタンパク質またはＣｏａＣと抗－ＳｄｒＣ－Ｆ（ａｂ’）２切片の混合物と共に培養すれば、ＣｏａＣ－タンパク質がバクテリアペレットに移動する（レーン１および２）。しかし、バクテリア細胞をＣｏａＣおよび抗－ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３－Ｆ（ａｂ’）２切片または抗－ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３－Ｆ（ａｂ’）２切片と共に培養すれば、添加されたＣｏａＣはバクテリアペレットに移動しないが（レーン３および４）、これによりバクテリア表面で発現するＦｎｂｐとＣｏａＣタンパク質との間の相互作用は抗－Ｆｎｂｐ－Ｆ（ａｂ’）２切片によって特異的に抑制されることが分かる。このような結果から、Ｃｏａタンパク質がバクテリア表面で発現するＦｎｂｐタンパク質を認識することを確認した。
Ｃｏａタンパク質と２つのＦｎｂｐＮ２Ｎ３タンパク質との間の特異的結合が観察されたので、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００生菌バクテリア、Ｃｏａｗｈｏｌｅおよび抗－Ｆｎｂｐ－Ｆ（ａｂ’）２切片を用いてこれを再度確認しようとした。抗－Ｆｎｂｐ－Ｆ（ａｂ’）２切片を作製した理由は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質ＡがＩｇＧ Ｆｃドメインに結合することで添加されたＩｇＧを消耗させることが知られたため、抗－Ｆｎｂｐ－ＩｇＧがＣｏａｗｈｏｌｅおよびＵＳＡ３００細胞のＦｎｂｐタンパク質の間の相互作用をうまく抑制できないと予想されたからである。抗－Ｆｎｂｐ－Ｆ（ａｂ’）２切片を用いることにより、Ｃｏａおよび２つのＦｎｂｐＮ２Ｎ３タンパク質の間の結合が特異的か否かを確認できるであろうと仮定した。図３２に示すように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞をＣｏａＣタンパク質またはＣｏａＣと抗－ＳｄｒＣ－Ｆ（ａｂ’）２切片の混合物と共に培養すれば、ＣｏａＣ－タンパク質がバクテリアペレットに移動する（レーン１および２）。しかし、バクテリア細胞をＣｏａＣおよび抗－ＦｎｂｐＡＮ２Ｎ３－Ｆ（ａｂ’）２切片または抗－ＦｎｂｐＢＮ２Ｎ３－Ｆ（ａｂ’）２切片と共に培養すれば、添加されたＣｏａＣはバクテリアペレットに移動しないが（レーン３および４）、これによりバクテリア表面で発現するＦｎｂｐとＣｏａＣタンパク質との間の相互作用は抗－Ｆｎｂｐ－Ｆ（ａｂ’）２切片によって特異的に抑制されることが分かる。このような結果から、Ｃｏａタンパク質がバクテリア表面で発現するＦｎｂｐタンパク質を認識することを確認した。
【0177】
ＣｏａｗｈｏｌｅまたはｖＷｂｐｗｈｏｌｅによる血液凝固誘導および抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧまたはｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧによる血液凝固抑制効果
次に、本発明者らは、ヒト全血を用いて組換えＣｏａｗｈｏｌｅおよびｖＷｂｐｗｈｏｌｅの生物学的機能を調べようとした。ヒト血液を多様な用量のＣｏａｗｈｏｌｅタンパク質と共に培養すると、１μｇのＣｏａｗｈｏｌｅタンパク質を添加する場合に血液が凝固し、５μｇのｖＷｂｐｗｈｏｌｅを添加すると血液が凝固したので（図３３Ａ）、精製された組換えＣｏａｗｈｏｌｅおよびｖＷｂｐｗｈｏｌｅタンパク質が機能的に活性であるタンパク質であることを確認した。次に、本発明者らは、抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧおよび抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧがＣｏａ－およびｖＷｂｐ－媒介血液凝固に及ぼす効果を調べようとした（図３３Ｂ）。８０μｇの抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧまたは８０μｇの抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧをヒト血液と５μｇのＣｏａｗｈｏｌｅまたはｖＷｂｐｗｈｏｌｅタンパク質の混合物に添加すると、すべて酵素－媒介血液凝固が抑制された。これにより、生成された抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－およびｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧがインビトロでＣｏａｗｈｏｌｅ－またはｖＷｂｐｗｈｏｌｅタンパク質－媒介血液凝固反応を抑制することを確認した。
次に、本発明者らは、ヒト全血を用いて組換えＣｏａｗｈｏｌｅおよびｖＷｂｐｗｈｏｌｅの生物学的機能を調べようとした。ヒト血液を多様な用量のＣｏａｗｈｏｌｅタンパク質と共に培養すると、１μｇのＣｏａｗｈｏｌｅタンパク質を添加する場合に血液が凝固し、５μｇのｖＷｂｐｗｈｏｌｅを添加すると血液が凝固したので（図３３Ａ）、精製された組換えＣｏａｗｈｏｌｅおよびｖＷｂｐｗｈｏｌｅタンパク質が機能的に活性であるタンパク質であることを確認した。次に、本発明者らは、抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧおよび抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧがＣｏａ－およびｖＷｂｐ－媒介血液凝固に及ぼす効果を調べようとした（図３３Ｂ）。８０μｇの抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧまたは８０μｇの抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧをヒト血液と５μｇのＣｏａｗｈｏｌｅまたはｖＷｂｐｗｈｏｌｅタンパク質の混合物に添加すると、すべて酵素－媒介血液凝固が抑制された。これにより、生成された抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－およびｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧがインビトロでＣｏａｗｈｏｌｅ－またはｖＷｂｐｗｈｏｌｅタンパク質－媒介血液凝固反応を抑制することを確認した。
【0178】
抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧおよび抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧはＵＳＡ３００培養培地－媒介ヒト血液凝固を抑制する。
図３０に示すように、すでにＳ．ａｕｒｅｕｓ ３００ ＬＡＣ細胞培養時に分泌されたＣｏａおよびｖＷｂｐが検出されたので、分泌されたＣｏａおよびｖＷｂｐ－媒介血液凝固が抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧおよび抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧによって遮断されるかを調べようとした。２００μｌのヒト全血を１００μｌのＵＳＡ３００培養培地（約０．５μｇのＣｏａおよび０．５μｇのｖＷｂｐタンパク質含有）と共に培養すると、培養１．５時間後に血液が凝固した（図３４のチューブ４）。同一の条件で８０μｇの精製された抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧまたは抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧを添加すると、血液は凝固しなかった（チューブ６および７）。また、各４０μｇの抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧまたは抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧをＣｏａまたはｖＷｂｐ－含有血液に添加すると、凝固が誘導された（チューブ８）。このような結果を通して、生菌バクテリアで分泌されたＣｏａまたはｖＷｂｐが添加されたＩｇＧによって抑制されることが分かる。
図３０に示すように、すでにＳ．ａｕｒｅｕｓ ３００ ＬＡＣ細胞培養時に分泌されたＣｏａおよびｖＷｂｐが検出されたので、分泌されたＣｏａおよびｖＷｂｐ－媒介血液凝固が抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧおよび抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧによって遮断されるかを調べようとした。２００μｌのヒト全血を１００μｌのＵＳＡ３００培養培地（約０．５μｇのＣｏａおよび０．５μｇのｖＷｂｐタンパク質含有）と共に培養すると、培養１．５時間後に血液が凝固した（図３４のチューブ４）。同一の条件で８０μｇの精製された抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧまたは抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧを添加すると、血液は凝固しなかった（チューブ６および７）。また、各４０μｇの抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧまたは抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧをＣｏａまたはｖＷｂｐ－含有血液に添加すると、凝固が誘導された（チューブ８）。このような結果を通して、生菌バクテリアで分泌されたＣｏａまたはｖＷｂｐが添加されたＩｇＧによって抑制されることが分かる。
【0179】
ＣｏａＮおよびｖＷｂｐＮドメインはヒト血液凝固を誘導したが、ＣｏａＣおよびｖＷｂｐＣタンパク質はそうではなかった
ＣｏａおよびｖＷｂｐタンパク質のどのようなドメインがヒト血液凝固に関与するかを調べるために、全血をＣｏａＮ、ｖＷｂｐＮ、ＣｏａＣおよびｖＷｂｐＣの４つのタンパク質と培養した。培養１．５時間後、ＣｏａＮおよびｖＷｂｐＮの２つのＮ－末端ドメインだけが血液凝固を誘導したが、２つのＣ－末端ドメインはそうではなかった（図３５）。このような結果から、フィブリノーゲン－結合Ｃ－末端ドメインではないプロトロンビン－結合Ｎ－末端ドメインがヒト血液凝固に必須であることが分かった。
ＣｏａおよびｖＷｂｐタンパク質のどのようなドメインがヒト血液凝固に関与するかを調べるために、全血をＣｏａＮ、ｖＷｂｐＮ、ＣｏａＣおよびｖＷｂｐＣの４つのタンパク質と培養した。培養１．５時間後、ＣｏａＮおよびｖＷｂｐＮの２つのＮ－末端ドメインだけが血液凝固を誘導したが、２つのＣ－末端ドメインはそうではなかった（図３５）。このような結果から、フィブリノーゲン－結合Ｃ－末端ドメインではないプロトロンビン－結合Ｎ－末端ドメインがヒト血液凝固に必須であることが分かった。
【0180】
ＣｏａＮおよびｖＷｂｐＮ－媒介ヒト血液凝固またはＵＳＡ３００で分泌されたＣｏａおよびｖＷｂｐによる血液凝固は、抗－ＣｏａＣおよび抗－ｖＷｂｐＣＩｇＧではない抗－ＣｏａＮ－ＩｇＧおよび抗－ｖＷｂｐＮ－ＩｇＧによって抑制される
ＣｏａＮまたはｖＷｂｐＮが血液凝固に重要という事実を観察したので、抗－ＣｏａＮ－またはｖＷｂｐＮ－特異的ＩｇＧがこれらのタンパク質－媒介凝固を遮断できるかを調べるために、２つのトリガー（ｔｒｉｇｇｅｒ）タンパク質を使用した。１つは、ＵＳＡ３００培養培地に含まれたＣｏａおよびｖＷｂｐであり（図３６Ａ）、他の１つは、精製された組換えＣｏａＮまたはｖＷｂｐＮである（図３６Ｂ）。抗－ＣｏａＮ－ＩｇＧまたは抗－ｖＷｂｐＮ－ＩｇＧを培養培地と血液の入ったチューブ（チューブ２）に添加すると、凝固が誘導されなかったが（チューブ３および４）、抗－ＣｏａＣ－ＩｇＧまたは抗－ｖＷｂｐＣ－ＩｇＧを添加する場合、凝固が誘導された（チューブ５および６）。また、ＣｏａＮおよびｖＷｂｐＮ－媒介ヒト血液凝固は抗－ＣｏａＮ－ＩｇＧおよび抗－ｖＷｂｐＮ－ＩｇＧによって抑制された（図３６Ｂ、チューブ４および５）。このような結果は、抗－ＣｏａＮ－ＩｇＧと抗－ｖＷｂｐＮ－ＩｇＧがＳ．ａｕｒｅｕｓ感染によるＣｏａまたはｖＷｂｐ－媒介血液凝固の防止に重要な分子であることを表す。
ＣｏａＮまたはｖＷｂｐＮが血液凝固に重要という事実を観察したので、抗－ＣｏａＮ－またはｖＷｂｐＮ－特異的ＩｇＧがこれらのタンパク質－媒介凝固を遮断できるかを調べるために、２つのトリガー（ｔｒｉｇｇｅｒ）タンパク質を使用した。１つは、ＵＳＡ３００培養培地に含まれたＣｏａおよびｖＷｂｐであり（図３６Ａ）、他の１つは、精製された組換えＣｏａＮまたはｖＷｂｐＮである（図３６Ｂ）。抗－ＣｏａＮ－ＩｇＧまたは抗－ｖＷｂｐＮ－ＩｇＧを培養培地と血液の入ったチューブ（チューブ２）に添加すると、凝固が誘導されなかったが（チューブ３および４）、抗－ＣｏａＣ－ＩｇＧまたは抗－ｖＷｂｐＣ－ＩｇＧを添加する場合、凝固が誘導された（チューブ５および６）。また、ＣｏａＮおよびｖＷｂｐＮ－媒介ヒト血液凝固は抗－ＣｏａＮ－ＩｇＧおよび抗－ｖＷｂｐＮ－ＩｇＧによって抑制された（図３６Ｂ、チューブ４および５）。このような結果は、抗－ＣｏａＮ－ＩｇＧと抗－ｖＷｂｐＮ－ＩｇＧがＳ．ａｕｒｅｕｓ感染によるＣｏａまたはｖＷｂｐ－媒介血液凝固の防止に重要な分子であることを表す。
【0181】
インビボにおける抗－Ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧまたはｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧによる血液凝固の抑制効果
本発明者らは、Ｃｏａｗｈｏｌｅ、ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮおよびｖＷｂｐＮドメインがヒト血液の凝固誘導活性があるという事実と、これら４種類のタンパク質をウサギに接種して得た各多クローン抗体がこれらのタンパク質に起因する血液凝固反応を選択的に抑制することを観察したので、ＣｏａｗｈｏｌｅおよびｖＷｂｐｗｈｏｌｅタンパク質をウサギに注射して得た抗体でインビボ受動免疫（ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）実験を行った。
本発明者らは、Ｃｏａｗｈｏｌｅ、ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ、ＣｏａＮおよびｖＷｂｐＮドメインがヒト血液の凝固誘導活性があるという事実と、これら４種類のタンパク質をウサギに接種して得た各多クローン抗体がこれらのタンパク質に起因する血液凝固反応を選択的に抑制することを観察したので、ＣｏａｗｈｏｌｅおよびｖＷｂｐｗｈｏｌｅタンパク質をウサギに注射して得た抗体でインビボ受動免疫（ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）実験を行った。
【0182】
４匹のウサギのうち、第１グループの２匹にＰＢＳを注射後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌１．６×１０８ＣＦＵを耳静脈に注射し、第２グループの２匹にｃｏａｗｈｏｌｅタンパク質－接合セファロースカラムで精製した１ｍｇの抗－ｃｏａｗｈｏｌｅ－ＩｇＧとｖＷｂｐｗｈｏｌｅタンパク質－接合セファロースカラムで精製した１ｍｇの抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧを混合して左耳静脈に注射した後、１時間後にＵＳＡ３００菌１．６×１０８ＣＦＵを右耳静脈に注射した。
【表4】
【0183】
ウサギの体重を１２時間間隔で測定した結果、第１群の１番ウサギは１３８時間後に死んだが、第２群のすべてのウサギは１６７時間まで生存しながら体重減少も最も少なく観察された（図３８）。これに基づいて生存率を計算した結果、抗－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧと抗ｉ－ｖＷｂｐｗｈｏｌｅ－ＩｇＧを１ｍｇずつ注射した第２群ウサギ（２番および３番）は７日間生存しながら体重も最も少なく減少する結果を得た（図３９）。以上の結果を通して、インビトロで確認された抗－ｃｏａ－ＩｇＧと抗－ｖＷｂｐ－ＩｇＧの血液凝固抑制効果をインビボ上で改めて確認できた。
【0184】
実施例４：抗生剤と併用投与効果の確認
本発明者らは、前記実施例１で発掘されたブドウ状球菌由来毒素４種の組み合わせによるＭＲＳＡ感染疾患の治療効果を極大化するために、前記毒素との併用投与により感染した個体の腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）内で残りのＭＲＳＡ菌株を完全に除去できる最適な抗生剤を探索した結果、後述のように、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）およびテイコプラニン（ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ）を本発明のワクチン組成物と併用投与する場合に著しい相乗効果があることを確認した。
本発明者らは、前記実施例１で発掘されたブドウ状球菌由来毒素４種の組み合わせによるＭＲＳＡ感染疾患の治療効果を極大化するために、前記毒素との併用投与により感染した個体の腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）内で残りのＭＲＳＡ菌株を完全に除去できる最適な抗生剤を探索した結果、後述のように、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）およびテイコプラニン（ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ）を本発明のワクチン組成物と併用投与する場合に著しい相乗効果があることを確認した。
【0185】
４－１：バンコマイシン
実験方法
まず、４種類の抗原（ＨｌｇＡ、ＬｕｋＳ、ＨｌａＨ３５ＬおよびＬｕｋＡＥ３２３ＡＢ）をそれぞれ２０μｇずつ計８０μｇを２５０μｌの食塩水に溶かした後、同一容積のアラム（ａｌｕｍ）アジュバントと混合した後、１時間培養させた後、２週間隔で３回筋肉注射した。以後、２週後に接種したウサギ５匹の血清を採取した後、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを用いて血清中の全ＩｇＧを分離精製した。精製した全ＩｇＧを１０ｍｇ／ｋｇ／ｒａｂｂｉｔの濃度でウサギにＩ．Ｖ．注射した後、バンコマイシン（７．５ｍｇ／ｋｇ／ｒａｂｂｉｔ）を筋肉注射した後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ＭＲＳＡ菌（１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｒａｂｂｉｔ）を感染させて、１５日間ウサギの生存率、腎臓の残留バクテリア数および腎臓に生成された膿瘍（ａｂｓｃｅｓｓ）の様相を調べた。
実験方法
まず、４種類の抗原（ＨｌｇＡ、ＬｕｋＳ、ＨｌａＨ３５ＬおよびＬｕｋＡＥ３２３ＡＢ）をそれぞれ２０μｇずつ計８０μｇを２５０μｌの食塩水に溶かした後、同一容積のアラム（ａｌｕｍ）アジュバントと混合した後、１時間培養させた後、２週間隔で３回筋肉注射した。以後、２週後に接種したウサギ５匹の血清を採取した後、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを用いて血清中の全ＩｇＧを分離精製した。精製した全ＩｇＧを１０ｍｇ／ｋｇ／ｒａｂｂｉｔの濃度でウサギにＩ．Ｖ．注射した後、バンコマイシン（７．５ｍｇ／ｋｇ／ｒａｂｂｉｔ）を筋肉注射した後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ＭＲＳＡ菌（１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｒａｂｂｉｔ）を感染させて、１５日間ウサギの生存率、腎臓の残留バクテリア数および腎臓に生成された膿瘍（ａｂｓｃｅｓｓ）の様相を調べた。
【0186】
計２０匹のウサギ（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ）を１群あたり５匹ずつ４群に分類した：第１群（Ｇ１－Ａｌｕｍ－ＩｇＧ注射）はアラムのみを注射したウサギの血清で多クローンＩｇＧをｐｒｏｔｅｉｎ－Ａカラムで精製して１０ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈（Ｉ．Ｖ．）注射した後に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌を１×１０９ＣＦＵ／ｒａｂｂｉｔで感染させた。
【0187】
第２群（Ｇ２－ａｎｔｉ－４ ａｎｔｉｇｅｎ－ＩｇＧ－ｍｉｘｔｕｒｅ注射）は４つの抗原（ＨｌｇＡ、ＬｕｋＳ、ＨｌａＨ３５ＬおよびＬｕｋＡＥ３２３Ａ）を各抗原あたり２０μｇずつ計８０μｇを２５０μｌの食塩水に溶かした後、同一容積のアラムと混合して２週間隔で３回筋肉注射で接種させた５匹のウサギからこれらの抗原に１つのＩｇＧをｐｒｏｔｅｉｎ－Ａカラムで精製することにより得た多クローンＩｇＧを１０ｍｇ／ｋｇの濃度でＩ．Ｖ．注射した後に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌を１×１０９ＣＦＵ／ｒａｂｂｉｔで感染させた。
【0188】
第３群（Ｇ３－ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎのみ注射）は５匹のウサギにバンコマイシンを７．５ｍｇ／ｋｇの濃度で毎日２回ずつ５日間１０回筋肉注射した後に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌を１×１０９ＣＦＵ／ｒａｂｂｉｔで感染させた。
【0189】
第４群（Ｇ４－ａｎｔｉ－４ ａｎｔｉｇｅｎ－ＩｇＧ－ｍｉｘｔｕｒｅ－ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ注射）は第２群と同様の方法で抗原を接種した後、得られた血清でＩｇＧをｐｒｏｔｅｉｎ－Ａカラムで精製して、多クローンＩｇＧを１０ｍｇ／ｋｇの濃度でＩ．Ｖ．注射した後に、バンコマイシン７．５ｍｇ／ｋｇを毎日２回ずつ５日間１０回筋肉注射した後に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌を１×１０９ＣＦＵ／ｒａｂｂｉｔで感染させた。
【0190】
以上の４つの群をＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＭＲＳＡ菌で接種させた後、毎日ウサギの体重を測定して体重変化を１４日まで観察し、１５日目には犠牲させて腎臓を摘出して、生成された膿瘍および残留バクテリアの数字をＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）で測定した。
【0191】
実験結果
ＭＲＳＡを感染させた後、２週間各群ウサギの生存率を調べた結果、図４０Ａに示すように、第４群（Ｇ４－ａｎｔｉ－４ ａｎｔｉｇｅｎ－ＩｇＧ－ｍｉｘｔｕｒｅ－ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ注射）の５匹のウサギは１００％生存したのに対し、第３群（Ｇ３－ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎのみ注射）は３日目に１匹、５日目に１匹が死亡して６０％の生存率を示したのに対し、アラムのみ注射した第１群（Ｇ１）は３日目まで５匹が全部死亡して生存率が０％となった。４つの抗原を接種したウサギで精製した抗体のみを注射した第２群（Ｇ２－ａｎｔｉ－４ ａｎｔｉｇｅｎ－ＩｇＧ－ｍｉｘｔｕｒｅ注射）は３日目に２匹、４日目に２匹が死んで１４日目まで２０％の生存率を示した。以上の結果をまとめると、本発明において発掘された４つの抗原によって誘導された抗体混合物とバンコマイシンが併用投与される場合、著しく向上した治療効果が発揮されることが分かった。
ＭＲＳＡを感染させた後、２週間各群ウサギの生存率を調べた結果、図４０Ａに示すように、第４群（Ｇ４－ａｎｔｉ－４ ａｎｔｉｇｅｎ－ＩｇＧ－ｍｉｘｔｕｒｅ－ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ注射）の５匹のウサギは１００％生存したのに対し、第３群（Ｇ３－ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎのみ注射）は３日目に１匹、５日目に１匹が死亡して６０％の生存率を示したのに対し、アラムのみ注射した第１群（Ｇ１）は３日目まで５匹が全部死亡して生存率が０％となった。４つの抗原を接種したウサギで精製した抗体のみを注射した第２群（Ｇ２－ａｎｔｉ－４ ａｎｔｉｇｅｎ－ＩｇＧ－ｍｉｘｔｕｒｅ注射）は３日目に２匹、４日目に２匹が死んで１４日目まで２０％の生存率を示した。以上の結果をまとめると、本発明において発掘された４つの抗原によって誘導された抗体混合物とバンコマイシンが併用投与される場合、著しく向上した治療効果が発揮されることが分かった。
【0192】
第２群と第４群ウサギの腎臓を採取して観察した結果、第２群の５匹のうち死亡したウサギ４匹の腎臓で膿瘍が観察されたのに対し、第４群の５匹のウサギの腎臓には膿瘍が全く観察されなかった（図４０Ｂ）。以上の結果から、４つのブドウ状球菌由来毒素抗原に対する抗体はＭＲＳＡ菌の感染時に分泌される毒素を中和して免疫細胞を保護するが、バンコマイシンの併用投与によってバクテリアをより完璧に除去しながら、宿主を多面的に保護できることを確認した。
【0193】
４－２：テイコプラニン
実験方法
計２０匹のウサギ（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ）を１群あたり５匹ずつ４群に分類した：４種類のワクチンを２週間隔で３回接種した１０匹のウサギを２つの群に分けて、第２群の５匹（Ｇ２）はＵＳＡ３００ ＭＲＳＡ菌を接種した後、７日間の生存率、腎臓残留バクテリア数および腎臓［生成された膿瘍の様相を調べ、残りの５匹である第４群（Ｇ４）はＧ２と同一にＵＳＡ３００ ＭＲＳＡ菌を接種後、３時間後にテイコプラニンを筋肉注射した。残りの１０匹のうち５匹は食塩水のみを注射した第１群（Ｇ１）とテイコプラニンのみを注射した第３群（Ｇ３）とに分類した：
第１群（Ｇ１－ｓａｌｉｎｅのみを接種）は食塩水のみを２週間隔で３回接種し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌を８．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇの濃度で感染させた。
第２群（Ｇ２－４ ａｎｔｉｇｅｎ－ｍｉｘｔｕｒｅを３回接種）は４つの抗原［ＨｌｇＡ４０μｇ／ｒａｂｂｉｔ）、ＬｕｋＳ（３０μｇ／ｒａｂｂｉｔ）、ＨｌａＨ３５Ｌ（２５μｇ／ｒａｂｂｉｔ）およびＬｕｋＡＥ３２３Ａ（４０μｇ／ｒａｂｂｉｔ）］を混合して１３５μｌの食塩水に溶かした後、１３５μｌのアラムと混合した後、２週間隔で３回筋肉注射で接種させた後、７日後に血清ＩｇＧ力価が十分に増加した７日後に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌を８．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇの濃度で感染させた。
第３群（Ｇ３－ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎのみを注射）は５匹のウサギにＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌を８．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇの濃度で筋肉注射し、３時間後にテイコプラニン７．５ｍｇ／ｋｇを１回筋肉注射した。
第４群（Ｇ４－ａｎｔｉ－４ ａｎｔｉｇｅｎ－ＩｇＧ－ｍｉｘｔｕｒｅ－ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ注射）は４つの抗原（ＨｌｇＡ、ＬｕｋＳ、ＨｌａＨ３５ＬおよびＬｕｋＡＥ３２３Ａ）を第２群と同一に２週間隔で３回接種した後、７日後に血清ＩｇＧ力価が十分に増加すれば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌を８．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇの濃度でウサギに接種させた後、３時間後にテイコプラニン７．５ｍｇ／ｋｇを１回筋肉注射した。
実験方法
計２０匹のウサギ（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ）を１群あたり５匹ずつ４群に分類した：４種類のワクチンを２週間隔で３回接種した１０匹のウサギを２つの群に分けて、第２群の５匹（Ｇ２）はＵＳＡ３００ ＭＲＳＡ菌を接種した後、７日間の生存率、腎臓残留バクテリア数および腎臓［生成された膿瘍の様相を調べ、残りの５匹である第４群（Ｇ４）はＧ２と同一にＵＳＡ３００ ＭＲＳＡ菌を接種後、３時間後にテイコプラニンを筋肉注射した。残りの１０匹のうち５匹は食塩水のみを注射した第１群（Ｇ１）とテイコプラニンのみを注射した第３群（Ｇ３）とに分類した：
第１群（Ｇ１－ｓａｌｉｎｅのみを接種）は食塩水のみを２週間隔で３回接種し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌を８．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇの濃度で感染させた。
第２群（Ｇ２－４ ａｎｔｉｇｅｎ－ｍｉｘｔｕｒｅを３回接種）は４つの抗原［ＨｌｇＡ４０μｇ／ｒａｂｂｉｔ）、ＬｕｋＳ（３０μｇ／ｒａｂｂｉｔ）、ＨｌａＨ３５Ｌ（２５μｇ／ｒａｂｂｉｔ）およびＬｕｋＡＥ３２３Ａ（４０μｇ／ｒａｂｂｉｔ）］を混合して１３５μｌの食塩水に溶かした後、１３５μｌのアラムと混合した後、２週間隔で３回筋肉注射で接種させた後、７日後に血清ＩｇＧ力価が十分に増加した７日後に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌を８．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇの濃度で感染させた。
第３群（Ｇ３－ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎのみを注射）は５匹のウサギにＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌を８．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇの濃度で筋肉注射し、３時間後にテイコプラニン７．５ｍｇ／ｋｇを１回筋肉注射した。
第４群（Ｇ４－ａｎｔｉ－４ ａｎｔｉｇｅｎ－ＩｇＧ－ｍｉｘｔｕｒｅ－ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ注射）は４つの抗原（ＨｌｇＡ、ＬｕｋＳ、ＨｌａＨ３５ＬおよびＬｕｋＡＥ３２３Ａ）を第２群と同一に２週間隔で３回接種した後、７日後に血清ＩｇＧ力価が十分に増加すれば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００菌を８．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇの濃度でウサギに接種させた後、３時間後にテイコプラニン７．５ｍｇ／ｋｇを１回筋肉注射した。
【0194】
第２群と第４群ウサギに抗原を接種させた後には、毎週採血をして４つの抗原に対するＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡで定量し、３回接種後、７日後にＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＭＲＳＡ菌を接種させ、毎日ウサギの体重を測定して体重変化を７日まで観察した。７日目にはウサギを犠牲させて腎臓を摘出して、生成された膿瘍および残留バクテリアの数字をＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）で測定した。
【0195】
実験結果
４つの抗原混合物を３回接種しながら毎週ウサギの血液を採取して血清中の各抗原に対するＩｇＧ力価を測定した（図４１Ａ）。第２群の抗体価（図４１Ａ（ｉ））および第４群の抗体価（図４１Ａ（ｉ））に示すように、各抗原は均一に抗体生成を誘導してＩｇＧ力価は一定に維持され、２回の接種後４２日目には、抗体価が少し減少したが、３回接種した後、４９日目に再度上昇したので、ＵＳＡ３００ ＭＲＳＡ菌を感染させた。図２ａ－ｉｉに示したＥＬＩＳＡの結果は第４群の５匹のウサギの血清で生成された抗体価に対して５匹のウサギの平均値を表したものである。第２群とほぼ類似の様相でＩｇＧ値が測定され、３回接種後には各抗原に対するＩｇＧ値が増加することが分かった。
４つの抗原混合物を３回接種しながら毎週ウサギの血液を採取して血清中の各抗原に対するＩｇＧ力価を測定した（図４１Ａ）。第２群の抗体価（図４１Ａ（ｉ））および第４群の抗体価（図４１Ａ（ｉ））に示すように、各抗原は均一に抗体生成を誘導してＩｇＧ力価は一定に維持され、２回の接種後４２日目には、抗体価が少し減少したが、３回接種した後、４９日目に再度上昇したので、ＵＳＡ３００ ＭＲＳＡ菌を感染させた。図２ａ－ｉｉに示したＥＬＩＳＡの結果は第４群の５匹のウサギの血清で生成された抗体価に対して５匹のウサギの平均値を表したものである。第２群とほぼ類似の様相でＩｇＧ値が測定され、３回接種後には各抗原に対するＩｇＧ値が増加することが分かった。
【0196】
ＭＲＳＡを感染させた後、７日間各群ウサギの生存率を調べた結果、第３群（Ｇ３－テイコプラニンのみ注射）と第４群（Ｇ４－４つの抗原混合物を２週間隔で３回注射後、ＵＳＡ３００ ＭＲＳＡ感染させた後、テイコプラニン筋肉注射）の１０匹のウサギは７日まで１００％生存したのに対し、第２群（Ｇ２－４つの抗原混合物を３回接種）はＵＳＡ３００ ＭＲＳＡ感染後に１日目１匹、５日目に１匹が死亡して６０％の生存率を示したのに対し、ＰＢＳのみ注射した第１群（Ｇ１）は１日目１匹、４日目２匹、７日目１匹が死亡して２０％の生存率にとどまった。以上の結果をまとめると、効率的な能動免疫を誘導する本発明の４つの抗原混合物に加えてテイコプラニンを併用投与する場合、ＭＲＳＡに感染した個体の生存率が著しく向上することが分かった。
【0197】
図４１Ｃは、生きているウサギの腎臓を粉砕して残っている残留バクテリアの数字をＣＦＵ値で計算した結果である。４つの抗原混合物を２週間隔で３回注射した第２群とテイコプラニンのみを注射した第３群は、ＰＢＳのみを注射した第１群に比べて腎臓内の残留バクテリア数が統計的有意性を示しながら減少し、４つの抗原とテイコプラニンを併用投与した第４群（Ｇ４）は、第１群に比べておよそ平均約１００倍程度に残留バクテリア数が減少した。
【0198】
７日目まで各群で生きているウサギの腎臓を採取して観察した結果を図４１Ｄに示した。類似レベルの生存率を示した第３群と第４群ウサギの腎臓において、第３群の６匹のウサギのうちＮｏ．１２ウサギの腎臓で膿瘍が観察され、Ｎｏ．１３ウサギの腎臓の色は黒色に変化した状態であった。これに対し、第４群の６匹のウサギの腎臓はＮｏ．６ウサギを除けば膿瘍が全く観察されなかった。一方、ＰＢＳのみを注射した第１群においてＮｏ．２ウサギの腎臓は死亡したウサギから採取したものであり、Ｎｏ．３は生存したウサギの腎臓であるが、すべて膿瘍を有することが分かった。
【0199】
以上のように、本発明において発掘された４つの抗原は最小単位の抗原の組み合わせとしてブドウ状球菌の１１個の毒素による細胞溶解を万遍なく抑制できるが、本発明者らは、このような抗原の組み合わせによる優れた治療効果に加えて、感染した個体の腎臓内に残留するバクテリアまで完全除去するために、バンコマイシン、テイコプラニン、またはこれらの組み合わせを併用投与する場合、残留バクテリアがほぼ完全に除去されるだけでなく、感染個体の生存率もより改善されることを見出した。
【0200】
以上、本発明の特定部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実施形態に過ぎず、よって、本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物によって定義される。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【図21A】
【図21B】
【図21C】
【図22】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【図24C】
【図25A】
【図25B】
【図26】
【図27A】
【図27B】
【図28】
【図29A】
【図29B】
【図30A】
【図30B】
【図31A】
【図31B】
【図32】
【図33A】
【図33B】
【図34】
【図35】
【図36A】
【図36B】
【図37】
【図38】
【図39A】
【図39B】
【図40A】
【図40B】
【図41A】
【図41B】
【図41C】
【図41D】
【配列表】
【国際調査報告】