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特表2023-541473抗４－１ＢＢ－抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体、ならびにその医薬組成物および使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-02
(54)【発明の名称】抗４－１ＢＢ－抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体、ならびにその医薬組成物および使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20230925BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230925BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230925BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230925BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230925BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230925BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230925BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230925BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230925BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230925BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230925BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230925BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230925BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46
C12N15/13 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 T
A61P35/00
A61K45/00
A61K47/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023517741
(86)(22)【出願日】2021-09-17
(85)【翻訳文提出日】2023-05-12
(86)【国際出願番号】 CN2021118908
(87)【国際公開番号】W WO2022057871
(87)【国際公開日】2022-03-24
(31)【優先権主張番号】202010983606.7
(32)【優先日】2020-09-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521530738
【氏名又は名称】普米斯生物技術（珠海）有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＴＨＥＵＳ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１０Ｂ， ＢＵＩＬＤＩＮＧ ４， ＮＯ １ ＫＥＪＩ ７ＴＨ ＲＯＡＤ， ＴＡＮＧＪＩＡＷＡＮ ＴＯＷＮ， ＸＩＡＮＧＺＨＯＵ ＤＩＳＴＲＩＣＴ， ＺＨＵＨＡＩ， ＧＵＡＮＧＤＯＮＧ ５１９０８０， ＰＥＯＰＬＥ’Ｓ ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲ヂャイ▼ 天 航
(72)【発明者】
【氏名】▲ミアオ▼ 小 牛
(72)【発明者】
【氏名】許 英 達
(72)【発明者】
【氏名】王 涛
(72)【発明者】
【氏名】ツン，アンディ
(72)【発明者】
【氏名】黄 威 峰
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB36
4C085DD61
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、抗４－１ＢＢ－抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体、ならびにその医薬組成物および使用に関する。具体的には、本発明は、４－１ＢＢを標的とする第１のタンパク質機能性領域およびＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１を標的とする第２のタンパク質機能性領域を含む二重特異性抗体であって、第１のタンパク質機能性領域が４－１ＢＢに対するシングルドメイン抗体であり；第２のタンパク質機能性領域が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、もしくは抗ＨＥＲ－２抗体、またはその抗原結合性断片である、二重特異性抗体に関する。二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１の受容体ＰＤ－１への結合を遮断する機能を有し、免疫細胞上の４－１ＢＢに結合し、その結果、腫瘍微小環境における免疫細胞活性が活性化され、腫瘍の発生および発達を阻害する効果がより効果的に改善される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
４－１ＢＢを標的とする第１のタンパク質機能性領域、およびＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１を標的とする第２のタンパク質機能性領域
を含む二重特異性抗体であって；
前記第１のタンパク質機能性領域が、抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体であり；
前記第２のタンパク質機能性領域が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、もしくは抗ＨＥＲ－２抗体、またはその抗原結合性断片である、二重特異性抗体。
【請求項2】
前記抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体が重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；好ましくは、前記抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項3】
前記第２のタンパク質機能性領域が、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体、抗ＰＤ－１シングルドメイン抗体、抗ＣＴＬＡ－４シングルドメイン抗体または抗ＨＥＲ－２シングルドメイン抗体であり；好ましくは、前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体が重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
好ましくは、前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１～２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項4】
前記二重特異性抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のＦｃ断片等の１つもしくは複数（例えば、２つもしくは３つ）のＩｇＧのＦｃ断片をさらに含むか；または、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域等の１つもしくは複数の（例えば、２つもしくは３つ）のＩｇＧの定常領域をさらに含み；
好ましくは、前記ＩｇＧのＦｃ断片または前記ＩｇＧの定常領域が、前記第１のタンパク質機能性領域と前記第２のタンパク質機能性領域との間にある、請求項１～３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項5】
前記ＩｇＧのＦｃ断片または前記ＩｇＧの重鎖定常領域が、前記第１のタンパク質機能性領域のＣ末端にライゲーションされ、および／または前記第２のタンパク質機能性領域のＣ末端にライゲーションされ；前記ＩｇＧのＦｃ断片または前記ＩｇＧの重鎖定常領域が、直接的にまたはリンカーを介して前記第１のタンパク質機能性領域にライゲーションされ；前記ＩｇＧのＦｃ断片または前記ＩｇＧの重鎖定常領域が、直接的にまたはリンカーを介して前記第２のタンパク質機能性領域にライゲーションされ；
好ましくは、前記リンカーが、配列番号５および配列番号２２から独立して選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の二重特異性抗体。
【請求項6】
ＥＵ番号付けシステムに従って、前記ＩｇＧのＦｃ断片または前記ＩｇＧの重鎖定常領域が、Ｌ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異を含み；任意に、前記ＩｇＧのＦｃ断片が、Ｇ２３７Ａ変異をさらに含み；好ましくは、前記ＩｇＧのＦｃ断片が、Ｌ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異を含むＩｇＧ１のＦｃ断片であり；好ましくは、前記ＩｇＧ１のＦｃ断片が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記ＩｇＧのＦｃ断片が、ノブ－イン－ホール変異をさらに含み；
好ましくは、前記ＩｇＧ１のＦｃ断片が、ノブ－イン－ホール変異をさらに含み；好ましくは、前記ＩｇＧ１のＦｃ断片が、配列番号８または配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する、請求項４～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項7】
前記二重特異性抗体が、以下の第１のペプチド鎖：前記第１のタンパク質機能性領域、前記ＩｇＧのＦｃ断片もしくは前記ＩｇＧの重鎖定常領域、リンカー、および前記第２のタンパク質機能性領域をＮ末端からＣ末端まで順番に含むか；または前記第２のタンパク質機能性領域、前記ＩｇＧのＦｃ断片もしくは前記ＩｇＧの重鎖定常領域、リンカーおよび前記第１のタンパク質機能性領域を含む第１のペプチド鎖を含み；
好ましくは、前記第１のペプチド鎖が、配列番号１または配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項8】
前記二重特異性抗体が２つの第１のペプチド鎖、好ましくは、配列番号１および／または配列番号６に記載の前記第１のペプチド鎖によって形成される二量体であり；好ましくは、前記２つの第１のペプチド鎖が、２または３対のジスルフィド結合によって連結され；
任意に、前記２つの第１のペプチド鎖が、ノブ－イン－ホール変異をさらに含む、請求項７に記載の二重特異性抗体。
【請求項9】
前記二重特異性抗体が、以下の第２のペプチド鎖：前記ＩｇＧのＦｃ断片または前記ＩｇＧの重鎖定常領域を含む第２のペプチド鎖をさらに含み；好ましくは、前記第２のペプチド鎖のＮ末端および／またはＣ末端が、直接的にまたはリンカーを介して前記第１のタンパク質機能性領域および／または前記第２のタンパク質機能性領域にライゲーションされ；
好ましくは、前記第２のペプチド鎖が、配列番号９または配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の二重特異性抗体。
【請求項10】
前記第１のペプチド鎖および前記第２のペプチド鎖が二量体を形成し；好ましくは、前記第１のペプチド鎖および前記第２のペプチド鎖が、２または３対のジスルフィド結合によって連結され；
好ましくは、前記第１のペプチド鎖および前記第２のペプチド鎖が、ノブ－イン－ホール変異をさらに含み；
好ましくは、前記第１のペプチド鎖が、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有し、前記第２のペプチド鎖が、配列番号９または配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードする、単離された核酸分子。
【請求項12】
請求項１１に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項13】
請求項１１に記載の単離された核酸分子、または請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項14】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を調製する方法であって、請求項１３に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養するステップ、および細胞培養物から前記二重特異性抗体を回収するステップを含む、方法。
【請求項15】
二重特異性抗体およびカップリング部分を含むコンジュゲートであって、前記二重特異性抗体が、請求項１～１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であり、前記カップリング部分が検出可能な標識であり、好ましくは、前記カップリング部分が放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色物質または酵素である、コンジュゲート。
【請求項16】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、または請求項１５に記載のコンジュゲートを含む、キットであって；好ましくは、前記キットが、前記二重特異性抗体に特異的に結合することができる第２の抗体をさらに含み、任意に、前記第２の抗体が、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色物質または酵素等の検出可能な標識をさらに含む、キット。
【請求項17】
試料中の４－１ＢＢおよび／またはＰＤ－Ｌ１の存在またはレベルを検出するためのキットの製造における、請求項１～１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の使用。
【請求項18】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項１５に記載のコンジュゲートを含み、任意に、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、医薬組成物。
【請求項19】
悪性腫瘍の予防および／または治療のための医薬の製造における、請求項１～１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項１５に記載のコンジュゲートの使用であって；好ましくは、前記悪性腫瘍が、直腸がん、結腸がん、肺がん、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、食道がんおよび頭頸部がんからなる群から選択される、使用。
【請求項20】
悪性腫瘍を治療および／または予防する方法であって、有効量の請求項１～１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項１５に記載のコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与するステップを含み；好ましくは、前記悪性腫瘍が、直腸がん、結腸がん、肺がん、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、食道がんおよび頭頸部がんからなる群から選択される、方法。
【請求項21】
悪性腫瘍の治療および／または予防に使用される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項１５に記載のコンジュゲートであって；好ましくは、前記悪性腫瘍が、直腸がん、結腸がん、肺がん、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、食道がんおよび頭頸部がんからなる群から選択される、二重特異性抗体またはコンジュゲート。
【請求項22】
（ａ）抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体；および（ｂ）抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体
を含むことを特徴とする、二重特異性抗体。
【請求項23】
請求項２２に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項24】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項25】
請求項２４に記載のベクターを含むか、または請求項２３に記載のポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれている；または、請求項２２に記載の二重特異性抗体を発現する
ことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項26】
請求項２２に記載の二重特異性抗体を産生する方法であって：（ａ）請求項２５に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、それにより前記二重特異性抗体を含む培養物を得るステップ；ならびに
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記培養物を精製および／または分離して、前記二重特異性抗体を得るステップ
を含む、方法。
【請求項27】
（ａ）請求項２２に記載の二重特異性抗体；ならびに（ｂ）検出可能な標識、薬剤、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはその組合せからなる群から選択されるカップリング部分
を含むことを特徴とする、免疫コンジュゲート。
【請求項28】
医薬、試薬、検出プレートまたはキットの製造における、請求項２２に記載の二重特異性抗体、または請求項２７に記載の免疫コンジュゲートの使用であって、前記試薬、検出プレートまたはキットが：試料中のＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢを検出するために用いられ；前記医薬が、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性）を治療または予防するために使用される、使用。
【請求項29】
（ｉ）請求項２２に記載の二重特異性抗体、または請求項２７に記載の免疫コンジュゲート；および（ｉｉ）薬学的に許容される担体
を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項30】
（ｉ）ヒトＰＤ－Ｌ１分子および／または４－１ＢＢ分子を検出するための使用：（ｉｉ）フロー検出のための使用：（ｉｉｉ）細胞免疫蛍光検出のための使用：（ｉｖ）腫瘍を治療するための使用：（ｖ）腫瘍の診断のための使用：（ｖｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断するための使用：ならびに（ｖｉｉ）４－１ＢＢに結合して免疫細胞を活性化するための使用からなる群から選択される、請求項２２に記載の二重特異性抗体の１つまたは複数の使用。
【請求項31】
（ｉ）請求項２２に記載の二重特異性抗体：ならびに（ｉｉ）発現および／または精製を助けるための任意のタグ配列を含むことを特徴とする、組換えタンパク質。【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
技術分野
本発明は、生物医学の分野に属し、抗４－１ＢＢ－抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体、ならびにその医薬組成物および使用に関する。
本発明は、生物医学の分野に属し、抗４－１ＢＢ－抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体、ならびにその医薬組成物および使用に関する。
【0002】
背景技術
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４－１ＢＢは、ＣＤ１３７またはＴＮＦＲＦ９としても知られ、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである。４－１ＢＢは、２５５アミノ酸（ＮＣＢＩ：ＮＰ＿００１５５２）を有するＩ型膜貫通タンパク質であり、１７アミノ酸を含むＮ末端シグナルペプチド、１６９アミノ酸の細胞外領域、２７アミノ酸の膜貫通領域、および４２アミノ酸のＣ末端細胞内領域からなる。４－１ＢＢは主に、活性化Ｔ細胞、ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、単球、好中球および好酸球に発現し、腫瘍血管の内皮細胞も４－１ＢＢを発現することが報告されている。したがって、腫瘍および一部の自己免疫疾患の治療において、４－１ＢＢはまた、潜在的な標的である。具体的には、直腸結腸がん、肺がん、乳がんおよび黒色腫等の前臨床動物モデルにおいて、４－１ＢＢを標的とするアゴニスト分子は、単剤で、または抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＨＥＲ－２等の追加抗体と組み合わせて有意な抗腫瘍活性を示す（Ｅｔｘｅｂｅｒｒｉａ Ｉら、ＥＳＭＯ Ｏｐｅｎ ２０２０；４：ｅ０００７３３）。
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４－１ＢＢは、ＣＤ１３７またはＴＮＦＲＦ９としても知られ、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである。４－１ＢＢは、２５５アミノ酸（ＮＣＢＩ：ＮＰ＿００１５５２）を有するＩ型膜貫通タンパク質であり、１７アミノ酸を含むＮ末端シグナルペプチド、１６９アミノ酸の細胞外領域、２７アミノ酸の膜貫通領域、および４２アミノ酸のＣ末端細胞内領域からなる。４－１ＢＢは主に、活性化Ｔ細胞、ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、単球、好中球および好酸球に発現し、腫瘍血管の内皮細胞も４－１ＢＢを発現することが報告されている。したがって、腫瘍および一部の自己免疫疾患の治療において、４－１ＢＢはまた、潜在的な標的である。具体的には、直腸結腸がん、肺がん、乳がんおよび黒色腫等の前臨床動物モデルにおいて、４－１ＢＢを標的とするアゴニスト分子は、単剤で、または抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＨＥＲ－２等の追加抗体と組み合わせて有意な抗腫瘍活性を示す（Ｅｔｘｅｂｅｒｒｉａ Ｉら、ＥＳＭＯ Ｏｐｅｎ ２０２０；４：ｅ０００７３３）。
【0003】
プログラム死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、ＣＤ２７４としても知られ、Ｂ７ファミリーの一員であり、ＰＤ－１のリガンドである。ＰＤ－Ｌ１は、ＩｇＶ様領域、ＩｇＣ様領域、膜貫通疎水性領域、および３０アミノ酸からなる細胞内領域を含む総アミノ酸数２９０のＩ型膜貫通タンパク質である。他のＢ７ファミリー分子とは異なり、ＰＤ－Ｌ１は免疫応答を負に制御する。研究により、ＰＤ－Ｌ１は主に活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞で発現していることが明らかになっている。ＰＤ－Ｌ１は、リンパ球に加えて胸腺、心臓、胎盤等の多くの組織の他の内皮細胞、および黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がん、頭頸部がん等の様々な非リンパ系で発現している（Ａｋｉｎｔｕｎｄｅ Ａｋｉｎｌｅｙｅ ＆ Ｚｏａｉｂ Ｒａｓｏｏｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １２巻、記事番号：９２（２０１９））。ＰＤ－Ｌ１は、自己応答性Ｔ細胞およびＢ細胞ならびに免疫寛容を制御する一定の汎用性を持ち、末梢組織のＴ細胞およびＢ細胞の応答に関与している。腫瘍細胞におけるＰＤ－Ｌ１の高発現は、がん患者の予後不良と関連している。
【0004】
現在販売されている抗体医薬のほとんどはモノクローナル抗体である。治療用モノクローナル抗体は、がん、自己免疫疾患、炎症、および他の疾患の治療に使用されており、そのほとんどは１つの標的に特異的である。しかし、患者はモノクローナル抗体療法に抵抗性または無反応になる可能性がある。また、一部の疾患は、異なるシグナル伝達経路、サイトカインおよび受容体の異なる調節機構等を含む、体内の複数の要因の影響を受けており、単一標的免疫療法は、がん細胞を破壊するのに十分ではないと考えられる。そのため、異なる薬剤の組合せ、または多特異性抗体を用いた多重標的戦略を使用して達成する必要がある。
【0005】
二機能性抗体は、抗体医薬の開発における一つの方向性であるが、前臨床評価モデル、低発現、安定性の低さ、工程の複雑さ、および品質管理の大きな差等、多くの課題に直面している。そのため、二機能性抗体の開発は常に困難とされてきた。
【0006】
そこで、ＰＤ－Ｌ１と４－１ＢＢを標的とする二重特異性抗体であって、特異性が高く、治癒効果が高く、かつ調製が容易な二重特異性抗体を開発することが必要である。
【0007】
本発明の内容
本発明者らは、綿密な研究および創造的な研究を経て、抗４－１ＢＢ－抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体（以下、抗ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ二重特異性抗体または抗４－ＩＢＢ／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体とも表す）を得た。本発明者らは、驚くべきことに、本発明の二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１の受容体ＰＤ－１への結合を遮断する機能を有すること；同時に二重特異性抗体は免疫細胞上の４－１ＢＢにも結合し、腫瘍微小環境における免疫細胞を活性化させることによって、腫瘍の発生および発達を阻害する効果をより効果的に改善し、そのため優れた抗腫瘍活性および良好な安全性を示すことを見出した。したがって、以下の発明が提供される：
本発明者らは、綿密な研究および創造的な研究を経て、抗４－１ＢＢ－抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体（以下、抗ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ二重特異性抗体または抗４－ＩＢＢ／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体とも表す）を得た。本発明者らは、驚くべきことに、本発明の二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１の受容体ＰＤ－１への結合を遮断する機能を有すること；同時に二重特異性抗体は免疫細胞上の４－１ＢＢにも結合し、腫瘍微小環境における免疫細胞を活性化させることによって、腫瘍の発生および発達を阻害する効果をより効果的に改善し、そのため優れた抗腫瘍活性および良好な安全性を示すことを見出した。したがって、以下の発明が提供される：
【0008】
本発明の一態様は、
４－１ＢＢを標的とする第１のタンパク質機能性領域、および
ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１を標的とする第２のタンパク質機能性領域を含む二重特異性抗体であって；
第１のタンパク質機能性領域が、抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体であり；
第２のタンパク質機能性領域が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくは抗ＨＥＲ－２抗体、またはその抗原結合性断片である、二重特異性抗体に関する。
４－１ＢＢを標的とする第１のタンパク質機能性領域、および
ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１を標的とする第２のタンパク質機能性領域を含む二重特異性抗体であって；
第１のタンパク質機能性領域が、抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体であり；
第２のタンパク質機能性領域が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくは抗ＨＥＲ－２抗体、またはその抗原結合性断片である、二重特異性抗体に関する。
【0009】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
好ましくは、抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。
好ましくは、抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。
【0010】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、第２のタンパク質機能性領域は、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体、または抗ＨＥＲ－２モノクローナル抗体である。
【0011】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、第２のタンパク質機能性領域は、抗ＰＤ－Ｌ１一本鎖抗体、抗ＰＤ－１一本鎖抗体、抗ＣＴＬＡ－４一本鎖抗体、または抗ＨＥＲ－２一本鎖抗体である。
【0012】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、第２のタンパク質機能性領域は、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体、抗ＰＤ－１シングルドメイン抗体、抗ＣＴＬＡ－４シングルドメイン抗体または抗ＨＥＲ－２シングルドメイン抗体であり；
好ましくは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
好ましくは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する。
好ましくは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み；
好ましくは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する。
【0013】
本発明において、抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体および抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体のＣＤＲは、ＩＭＧＴ番号付けシステムで定義されており、Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ Ｆ，Ｋａａｓ Ｑ，Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ Ｐ，ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ ａｎｄ ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ：ａ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＭＨＣ，ＩｇＳＦ ａｎｄ ＭｈｃＳＦ［Ｊ］，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９；３８ （ｓｕｐｐｌ＿１）：Ｄ３０１－Ｄ３０７を参照されたい。
【0014】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、
抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、
抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。
抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、
抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。
【0015】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、
抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、および
抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する。
抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、および
抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する。
【0016】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ断片等のＩｇＧの１つまたは複数（例えば、２つまたは３つ）のＦｃ断片をさらに含むか；
または、二重特異性抗体は、１つまたは複数（例えば、２つまたは３つ）のＩｇＧの定常領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の重鎖定常領域等をさらに含み；
好ましくは、ＩｇＧのＦｃ断片またはＩｇＧの定常領域は、第１のタンパク質機能性領域と第２タンパク質機能性領域の間に位置する。
または、二重特異性抗体は、１つまたは複数（例えば、２つまたは３つ）のＩｇＧの定常領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の重鎖定常領域等をさらに含み；
好ましくは、ＩｇＧのＦｃ断片またはＩｇＧの定常領域は、第１のタンパク質機能性領域と第２タンパク質機能性領域の間に位置する。
【0017】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、第１のタンパク質機能性領域、第２のタンパク質機能性領域、ＩｇＧのＦｃ断片、および任意のリンカーからなる。
【0018】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、第１のタンパク質機能性領域、第２のタンパク質機能性領域、ＩｇＧ１のＦｃ断片、および任意のリンカーからなる。
【0019】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１の１つのＦｃ断片を含み、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、第１のタンパク質機能性領域と、第２のタンパク質機能性領域との間に位置する。
【0020】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、ＩｇＧのＦｃ断片またはＩｇＧの重鎖定常領域は、第１のタンパク質機能性領域のＣ末端にライゲーションされる、および／または第２のタンパク質機能性領域のＣ末端にライゲーションされ；
ＩｇＧのＦｃ断片またはＩｇＧの重鎖定常領域は、直接的にまたはリンカーを介して第１のタンパク質機能性領域にライゲーションされ；ＩｇＧのＦｃ断片またはＩｇＧの重鎖定常領域は、直接的にまたはリンカーを介して第２のタンパク質機能性領域にライゲーションされ；
好ましくは、リンカーは、配列番号５および配列番号２２から独立して選択されるアミノ酸配列を有する。
ＩｇＧのＦｃ断片またはＩｇＧの重鎖定常領域は、直接的にまたはリンカーを介して第１のタンパク質機能性領域にライゲーションされ；ＩｇＧのＦｃ断片またはＩｇＧの重鎖定常領域は、直接的にまたはリンカーを介して第２のタンパク質機能性領域にライゲーションされ；
好ましくは、リンカーは、配列番号５および配列番号２２から独立して選択されるアミノ酸配列を有する。
【0021】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、第１のタンパク質機能性領域のＣ末端にライゲーションされ、および／または第２のタンパク質機能性領域のＣ末端にライゲーションされ；
ＩｇＧ１のＦｃ断片は、直接的にまたはリンカーを介して第１のタンパク質機能性領域にライゲーションされ；ＩｇＧ１のＦｃ断片は、直接的にまたはリンカーを介して第２のタンパク質機能性領域にライゲーションされ；
好ましくは、接続断片のアミノ酸配列は、配列番号５および配列番号２２から独立して選択される。
ＩｇＧ１のＦｃ断片は、直接的にまたはリンカーを介して第１のタンパク質機能性領域にライゲーションされ；ＩｇＧ１のＦｃ断片は、直接的にまたはリンカーを介して第２のタンパク質機能性領域にライゲーションされ；
好ましくは、接続断片のアミノ酸配列は、配列番号５および配列番号２２から独立して選択される。
【0022】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、ＥＵ番号付けシステムに従って、ＩｇＧのＦｃ断片またはＩｇＧの重鎖定常領域は、Ｌ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異を含み；任意に、ＩｇＧのＦｃ断片は、また、Ｇ２３７Ａ変異を含み；
好ましくは、ＩｇＧのＦｃ断片は、Ｌ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異を含むＩｇＧ１のＦｃ断片であり：任意に、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、Ｇ２３７Ａ変異をさらに含み；
好ましくは、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、ＩｇＧのＦｃ断片は、ノブ－イン－ホール変異をさらに含み；
好ましくは、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、ノブ－イン－ホール変異をさらに含み；好ましくは、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、配列番号８または配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する。
好ましくは、ＩｇＧのＦｃ断片は、Ｌ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異を含むＩｇＧ１のＦｃ断片であり：任意に、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、Ｇ２３７Ａ変異をさらに含み；
好ましくは、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、ＩｇＧのＦｃ断片は、ノブ－イン－ホール変異をさらに含み；
好ましくは、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、ノブ－イン－ホール変異をさらに含み；好ましくは、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、配列番号８または配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する。
【0023】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、二重特異性抗体は、以下の第１のペプチド鎖：
第１のタンパク質機能性領域、ＩｇＧのＦｃ断片もしくはＩｇＧの重鎖定常領域、任意のリンカー、および第２タンパク質機能性領域をＮ末端からＣ末端まで順番に含むか；または第２のタンパク質機能性領域；ＩｇＧのＦｃ断片もしくはＩｇＧの重鎖定常領域、任意のリンカー、および第１のタンパク質機能性領域を含む第１のペプチド鎖を含む。好ましくは、リンカーは、配列番号５および配列番号２２から独立して選択されるアミノ酸配列を有する。
第１のタンパク質機能性領域、ＩｇＧのＦｃ断片もしくはＩｇＧの重鎖定常領域、任意のリンカー、および第２タンパク質機能性領域をＮ末端からＣ末端まで順番に含むか；または第２のタンパク質機能性領域；ＩｇＧのＦｃ断片もしくはＩｇＧの重鎖定常領域、任意のリンカー、および第１のタンパク質機能性領域を含む第１のペプチド鎖を含む。好ましくは、リンカーは、配列番号５および配列番号２２から独立して選択されるアミノ酸配列を有する。
【0024】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、二重特異性抗体は、以下の第１のペプチド鎖：
第１のタンパク質機能性領域、ＩｇＧ１のＦｃ断片もしくはＩｇＧ１の重鎖定常領域、任意のリンカー、および第２のタンパク質機能性領域をＮ末端からＣ末端まで順番に含むか；または第２のタンパク質機能性領域、ＩｇＧ１のＦｃ断片、もしくはＩｇＧ１の重鎖定常領域、任意のリンカー、および第１のタンパク質機能性領域を含む第１のペプチド鎖を含む。好ましくは、リンカーは、配列番号５および配列番号２２から独立して選択されるアミノ酸配列を有する。
第１のタンパク質機能性領域、ＩｇＧ１のＦｃ断片もしくはＩｇＧ１の重鎖定常領域、任意のリンカー、および第２のタンパク質機能性領域をＮ末端からＣ末端まで順番に含むか；または第２のタンパク質機能性領域、ＩｇＧ１のＦｃ断片、もしくはＩｇＧ１の重鎖定常領域、任意のリンカー、および第１のタンパク質機能性領域を含む第１のペプチド鎖を含む。好ましくは、リンカーは、配列番号５および配列番号２２から独立して選択されるアミノ酸配列を有する。
【0025】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、Ｌ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異を含むＩｇＧ１のＦｃ断片（略して「ＬａＬａ変異」と称する）であり；任意に、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、Ｇ２３７Ａ変異をさらに含み；好ましくは、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する。
【0026】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、ノブ－イン－ホール変異を含み；好ましくは、ＥＵ番号付けシステムに従って、「ノブ」は、ＦｃがＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗの変異を受けることを意味し、「ホール」は、ＦｃがＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖの変異を受けることを意味する。
【0027】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、Ｌ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異およびノブ－イン－ホール変異を含み；好ましくは、ＩｇＧ１のＦｃ断片は、配列番号８または配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する。
【0028】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、第１のペプチド鎖は、配列番号１または配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する。
【0029】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体は２つの第１のペプチド鎖で形成された二量体、好ましくは配列番号１および／または配列番号６に記載の第１のペプチド鎖で形成された二量体であり；
好ましくは、２つの第１のペプチド鎖は、２または３対のジスルフィド結合によって連結され；
任意に、２つの第１のペプチド鎖はまた、ノブ－イン－ホール変異を含む。
好ましくは、２つの第１のペプチド鎖は、２または３対のジスルフィド結合によって連結され；
任意に、２つの第１のペプチド鎖はまた、ノブ－イン－ホール変異を含む。
【0030】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、２つのうちの１つの第１のペプチド鎖はノブ変異を含み、他のペプチド鎖はホール変異を含む。
【0031】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、配列番号１に記載の２つの第１のペプチド鎖で形成された二量体である。
【0032】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、配列番号６に記載の２つの第１のペプチド鎖で形成された二量体である。
【0033】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、配列番号１に記載の１つの第１のペプチド鎖および、配列番号６に記載の１つの第１のペプチド鎖で形成された二量体である。
【0034】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、以下の第２のペプチド鎖：
ＩｇＧのＦｃ断片またはＩｇＧの重鎖定常領域を含む第２のペプチド鎖をさらに含み；好ましくは、第２のペプチド鎖のＮ末端および／またはＣ末端は、直接的にまたはリンカーを介して第１のタンパク質機能性領域および／または第２のタンパク質機能性領域にライゲーションされている。
ＩｇＧのＦｃ断片またはＩｇＧの重鎖定常領域を含む第２のペプチド鎖をさらに含み；好ましくは、第２のペプチド鎖のＮ末端および／またはＣ末端は、直接的にまたはリンカーを介して第１のタンパク質機能性領域および／または第２のタンパク質機能性領域にライゲーションされている。
【0035】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、以下の第２のペプチド鎖：
ＩｇＧ１のＦｃ断片またはＩｇＧ１の重鎖定常領域を含む第２のペプチド鎖をさらに含み；好ましくは、第２のペプチド鎖のＮ末端および／またはＣ末端は、直接的にまたはリンカーを介して第１のタンパク質機能性領域および／または第２のタンパク質機能性領域にライゲーションされている。
ＩｇＧ１のＦｃ断片またはＩｇＧ１の重鎖定常領域を含む第２のペプチド鎖をさらに含み；好ましくは、第２のペプチド鎖のＮ末端および／またはＣ末端は、直接的にまたはリンカーを介して第１のタンパク質機能性領域および／または第２のタンパク質機能性領域にライゲーションされている。
【0036】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、第２のペプチド鎖は、配列番号９または配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する。
【0037】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖は二量体を形成し；
好ましくは、第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖は、２対または３対のジスルフィド結合によって連結され；
好ましくは、第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖は、ノブ－イン－ホール変異をさらに含み；
好ましくは、第１のペプチド鎖は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有し、第２のペプチド鎖は、配列番号９または配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する。
好ましくは、第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖は、２対または３対のジスルフィド結合によって連結され；
好ましくは、第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖は、ノブ－イン－ホール変異をさらに含み；
好ましくは、第１のペプチド鎖は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有し、第２のペプチド鎖は、配列番号９または配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する。
【0038】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、第１のペプチド鎖はノブ変異を含み、第２のペプチド鎖はホール変異を含む。
【0039】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体において、第１のペプチド鎖はホール変異を含み、第２のペプチド鎖はノブ変異を含む。
【0040】
本発明の他の態様は、単離された核酸分子に関し、これは、本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体をコードする。
【0041】
本発明はさらに、ベクターに関し、これは、本発明による単離された核酸分子を含む。
【0042】
本発明はまた、宿主細胞に関し、これは、本発明による単離された核酸分子、または本発明によるベクターを含む。
【0043】
本発明の他の態様は、本発明による宿主細胞を適切な条件下で培養する工程、および細胞培養物から二重特異性抗体を回収する工程を含む、本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体を調製する方法に関する。
【0044】
本発明の他の態様は、二重特異性抗体およびカップリング部分を含むコンジュゲートに関し、ここで、二重特異性抗体は、本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体であり、かつカップリング部分は検出可能な標識であり；好ましくは、カップリング部分は、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色物質、または酵素である。
【0045】
本発明の他の態様は、本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体を含むか、または本発明に記載のコンジュゲートを含むキットに関し；
好ましくは、キットは、二重特異性抗体に特異的に結合することができる第２の抗体をさらに含み；任意に、第２の抗体は、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色物質、または酵素等の検出可能な標識をさらに含む。
好ましくは、キットは、二重特異性抗体に特異的に結合することができる第２の抗体をさらに含み；任意に、第２の抗体は、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色物質、または酵素等の検出可能な標識をさらに含む。
【0046】
本発明の他の態様は、試料中の４－１ＢＢおよび／またはＰＤ－Ｌ１の存在またはレベルを検出するためのキットの製造における本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体の使用に関する。
【0047】
本発明の他の態様は、医薬組成物であって、本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体、または本発明によるコンジュゲートを含む医薬組成物に関し；任意に、医薬組成物は薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【0048】
本発明の他の態様は、本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体、または本発明によるコンジュゲートの、悪性腫瘍の予防および／または治療のための医薬の製造における使用に関し；好ましくは、悪性腫瘍は、直腸がん、結腸がん、肺がん、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、食道がん、および頭頸部がんからなる群から選択される。
【0049】
本発明の他の態様は、悪性腫瘍の治療および／または予防のための方法であって、有効量の本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体または本発明によるコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法に関し；好ましくは、悪性腫瘍は、直腸がん、結腸がんからなる群から選択される。
【0050】
本発明のいくつかの実施形態において、方法において、本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体の有効量を、それを必要とする対象へ投与する工程は、外科的治療の前または後に実施され、および／または放射線療法の前または後に実施される。
【0051】
本発明のいくつかの実施形態において、方法において、
本発明の二重特異性抗体は、体重１ｋｇあたり０．１～１００ｍｇ、好ましくは４．８～２４ｍｇまたは１～１０ｍｇの単回用量で投与されるか；または、本発明の二重特異性抗体は１０～ｌ０００ｍｇ、好ましくは５０～５００ｍｇ、１００～４００ｍｇ、１５０～３００ｍｇ、１５０～２５０ｍｇまたは２００ｍｇの単回用量で投与され；
好ましくは、投与は、３日間、４日間、５日間、６日間、１０日間、１週間、２週間または３週間ごとに１回行われ；
好ましくは、投与は、静脈内滴下または静脈内注射により行われる。
本発明の二重特異性抗体は、体重１ｋｇあたり０．１～１００ｍｇ、好ましくは４．８～２４ｍｇまたは１～１０ｍｇの単回用量で投与されるか；または、本発明の二重特異性抗体は１０～ｌ０００ｍｇ、好ましくは５０～５００ｍｇ、１００～４００ｍｇ、１５０～３００ｍｇ、１５０～２５０ｍｇまたは２００ｍｇの単回用量で投与され；
好ましくは、投与は、３日間、４日間、５日間、６日間、１０日間、１週間、２週間または３週間ごとに１回行われ；
好ましくは、投与は、静脈内滴下または静脈内注射により行われる。
【0052】
本発明の項目のいずれか１つに記載の二重特異性抗体またはコンジュゲートは、悪性腫瘍の治療および／または予防のために使用されるものであり、好ましくは、悪性腫瘍は、直腸がん、結腸がん、肺がん、黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞がん、卵巣がん、食道がん、および頭頸部がんからなる群から選択される。
【0053】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、一般的に２対のポリペプチド鎖から構成される免疫グロブリン分子を指し、各対は１つの「軽」（Ｌ）鎖と１つの「重」（Ｈ）鎖とを有する。抗体軽鎖は、κ軽鎖とλ軽鎖に分類し得る。重鎖はμ、δ、γ、α、またはεに分類されてもよく、抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義される。軽鎖および重鎖内では、可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はさらに約３以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）によって構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬからなる。抗体定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典補体系の第１の構成要素（Ｃｌｑ）を含む、宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介する。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる可変性の高い領域に細分化することができ、その中でフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存性の高い領域が散在している。ＶＨとＶＬは、それぞれ３つのＣＤＲと４つのＦＲからなり、これらは以下の順序：アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４で配置されている。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、それぞれ抗体結合部位を形成している。領域またはドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍ．ｄ．，Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，（１９８７ ａｎｄ １９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７；１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ １９８９；３４２：８７８－８８３の定義、またはＩＭＧＴ番号付けシステムに従う、Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ Ｆ，Ｋａａｓ Ｑ，Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ Ｐ．ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ ａｎｄ ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ：ａ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＭＨＣ，ＩｇＳＦ ａｎｄ ＭｈｃＳＦ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９；３８（ｓｕｐｐｌ＿１）：Ｄ３０１－Ｄ３０７の定義を参照のこと。
【0054】
「抗体」という用語は、特定の抗体産生方法に限定されるものではない。例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体が挙げられる。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体であってもよい。
【0055】
本明細書で使用する場合、「ｍＡｂ」および「モノクローナル抗体」という用語は、高度に相同性の抗体分子群、すなわち、自発的に起こり得る天然の変異を除いて、同一の抗体分子群に由来する抗体または抗体断片を指す。ｍＡｂは、抗原上の単一のエピトープに対して高度に特異的である。モノクローナル抗体と比較して、ポリクローナル抗体は通常、少なくとも２つ以上の異なる抗体を含み、これらの異なる抗体は通常、抗原上の異なるエピトープを認識する。モノクローナル抗体は、通常、Ｋｏｈｌｅｒらによって最初に報告されたハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ［Ｊ］，ｎａｔｕｒｅ，１９７５；２５６（５５１７）：４９５）を用いて得ることができ、組換えＤＮＡ技術（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）により得ることもできる。
【0056】
本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）のＣＤＲ領域の全部または一部を非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域で置換することによって得られる抗体または抗体断片を指し、ここで、ドナー抗体は、所望の特異性、親和性および反応性を有する非ヒト（例えばマウス、ラット、またはウサギ）抗体であり得る。さらに、レシピエント抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）の一部のアミノ酸残基は、抗体の性能をさらに改善または最適化するように、非ヒト抗体の対応するアミノ酸残基、または他の抗体のアミノ酸残基で置換してもよい。ヒト化抗体の詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ １９８６；３２１：５２２ ５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８８；３３２：３２３３２９；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９２；２：５９３－５９６；およびＣｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２０００；２１：３９７－４０２を参照されたい。場合によっては、抗体の抗原結合性断片はダイアボディであり、この場合、ＶＨおよびＶＬドメインは単一ポリペプチド鎖上に発現するが、使用されるリンカーは短すぎるために同一鎖の２つのドメイン間の対合が可能にならず、それによりドメインは他の鎖の相補的ドメインと対合することになり、２つの抗原結合部位を形成する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３；９０：６４４４ ６４４８およびＰｏｌｊａｋ Ｒ．Ｊ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １９９４；２：１１２１－１１２３を参照のこと）。
【0057】
本明細書に記載の融合タンパク質は、ＤＮＡ組換えにより２つの遺伝子によって共発現されるタンパク質産物である。抗体および抗原結合性断片を産生および精製する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ’ｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｇｕｉｄｅ、第５章～第８章および第１５章）。
【0058】
本明細書で使用する場合、「単離」または「単離された」という用語は、人工的な手段による天然状態からの取得を意味する。「単離された」物質または構成要素が天然で生じる場合、それは、存在する自然環境が変化しているか、物質が自然環境から単離されているか、またはその両方が起こっている。例えば、生体動物に天然で存在する単離されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドについて、天然状態から単離された高純度の同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されたと呼ばれる。「単離」または「単離された」という用語は、人工または合成物質の混合、および物質活性に影響を与えない他の不純物の存在を排除するものではない。
【0059】
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸送達ビヒクルを指す。ベクターが挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を達成することができる場合、ベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入、またはトランスフェクションによって宿主細胞に導入されてよく、それが有する遺伝物質要素を宿主細胞で発現させることができる。ベクターは当技術分野の当業者に周知であり、プラスミド；ファージミド；コスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体；λファージまたはＭ１３ファージ等のファージ、および動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして使用できる動物ウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）等が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、およびレポーター遺伝子を含むがこれらに限定されない、発現を制御する種々のエレメントを含むことができる。さらに、ベクターは、複製起点を含むこともできる。
【0060】
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、ベクターの導入に使用できる細胞を指し、大腸菌（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））または枯草菌（バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））等の原核細胞、酵母細胞またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）等の真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞またはＳｆ９等の昆虫細胞、または線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＳ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞もしくはヒト細胞等の動物細胞等があるがこれに限定されない。
【0061】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、対象および活性成分と薬学的および／または生理学的に適合する担体および／または賦形剤を指し、これらは当技術分野で周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ編、１９版．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５を参照）、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤を含むがこれらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤は、リン酸緩衝剤を含むが、これに限定されず；界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ－８０等のカチオン性、アニオン性または非イオン性界面活性剤を含むが、これに限定されず；イオン強度増強剤は、塩化ナトリウムを含むが、これに限定されない。
【0062】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、所望の効果を達成する、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指す。例えば、疾患（例えば、腫瘍）を予防するための有効量は、疾患（例えば、腫瘍）の発症を予防、阻止、または遅延するのに十分な量を指し、疾患を治療するための有効量は、疾患を有する患者において疾患およびその合併症を治癒または少なくとも部分的に予防するのに十分な量を指す。このような有効量を決定することは、十分に当技術分野の当業者の能力の範囲内である。例えば、治療的使用のための有効量は、治療すべき疾患の重症度、患者自身の免疫系の一般的状態、年齢、体重、および性別等の患者の一般的状態、薬剤の投与様式、併用して投与される他の治療等に依存するであろう。
【0063】
本発明において、特に記載がない場合、「第１」（例えば、第１のタンパク質機能性領域）および「第２」（例えば、第２のタンパク質機能性領域）は、参照上の区別または表現の明確化の目的で使用され、典型的な順序の意味を有するものではない。
【0064】
また、本発明は、以下の項目１～１０のいずれか１つに関する：
１．二重特異性抗体であって：
（ａ）抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体：および
（ｂ）抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体
を含むことを特徴とする、二重特異性抗体。
２．項目１に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
３．項目２に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
４．項目３に記載のベクターを含むか、または項目２に記載のポリヌクレオチドが、宿主細胞のゲノムに組み込まれているか；
または、項目１に記載の二重特異性抗体を発現することを特徴とする、宿主細胞。
５．項目１に記載の二重特異性抗体を産生する方法であって：
（ａ）適切な条件下で、項目４に記載の宿主細胞を培養し、それにより二重特異性抗体を含む培養物を得るステップ；および
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた培養物の精製および／または分離して、二重特異性抗体を得るステップを含む、方法。
６．（ａ）項目１に記載の二重特異性抗体；ならびに
（ｂ）検出可能な標識、薬剤、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはその組合せからなる群から選択されるカップリング部分を含むことを特徴とする、免疫コンジュゲート。
７．医薬、試薬、検出プレートまたはキットの製造における、項目１に記載の二重特異性抗体、または項目６に記載の免疫コンジュゲートの使用であって；試薬、検出プレートまたはキットが：試料中のＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢを検出するために用いられ；医薬が、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性）を治療または予防するために使用される、使用。
８．（ｉ）項目１に記載の二重特異性抗体、または項目６に記載の免疫コンジュゲート；および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体
を含むことを特徴とする、医薬組成物。
９．以下：
（ｉ）ヒトＰＤ－Ｌ１分子および／または４－１ＢＢ分子を検出するための使用；（ｉｉ）フロー検出のための使用；（ｉｉｉ）細胞免疫蛍光検出のための使用；（ｉｖ）腫瘍を治療するための使用；（ｖ）腫瘍の診断のための使用；（ｖｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断するための使用；ならびに（ｖｉｉ）４－１ＢＢに結合して免疫細胞を活性化させるための使用
を含む群から選択される、項目１に記載の二重特異性抗体の１つまたは複数の使用。
１０．（ｉ）項目１に記載の二重特異性抗体；ならびに（ｉｉ）発現および／または精製を補助する任意のタグ配列を含むことを特徴とする、組換えタンパク質。
１．二重特異性抗体であって：
（ａ）抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体：および
（ｂ）抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体
を含むことを特徴とする、二重特異性抗体。
２．項目１に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
３．項目２に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
４．項目３に記載のベクターを含むか、または項目２に記載のポリヌクレオチドが、宿主細胞のゲノムに組み込まれているか；
または、項目１に記載の二重特異性抗体を発現することを特徴とする、宿主細胞。
５．項目１に記載の二重特異性抗体を産生する方法であって：
（ａ）適切な条件下で、項目４に記載の宿主細胞を培養し、それにより二重特異性抗体を含む培養物を得るステップ；および
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた培養物の精製および／または分離して、二重特異性抗体を得るステップを含む、方法。
６．（ａ）項目１に記載の二重特異性抗体；ならびに
（ｂ）検出可能な標識、薬剤、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはその組合せからなる群から選択されるカップリング部分を含むことを特徴とする、免疫コンジュゲート。
７．医薬、試薬、検出プレートまたはキットの製造における、項目１に記載の二重特異性抗体、または項目６に記載の免疫コンジュゲートの使用であって；試薬、検出プレートまたはキットが：試料中のＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢを検出するために用いられ；医薬が、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性）を治療または予防するために使用される、使用。
８．（ｉ）項目１に記載の二重特異性抗体、または項目６に記載の免疫コンジュゲート；および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体
を含むことを特徴とする、医薬組成物。
９．以下：
（ｉ）ヒトＰＤ－Ｌ１分子および／または４－１ＢＢ分子を検出するための使用；（ｉｉ）フロー検出のための使用；（ｉｉｉ）細胞免疫蛍光検出のための使用；（ｉｖ）腫瘍を治療するための使用；（ｖ）腫瘍の診断のための使用；（ｖｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断するための使用；ならびに（ｖｉｉ）４－１ＢＢに結合して免疫細胞を活性化させるための使用
を含む群から選択される、項目１に記載の二重特異性抗体の１つまたは複数の使用。
１０．（ｉ）項目１に記載の二重特異性抗体；ならびに（ｉｉ）発現および／または精製を補助する任意のタグ配列を含むことを特徴とする、組換えタンパク質。
【0065】
本発明はさらに、以下の第１から第１４の態様のいずれか１つに関する；
本発明の第１の態様において、二重特異性抗体が提供され、二重特異性抗体は；
（ａ）抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体；および
（ｂ）抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体
を含む。
本発明の第１の態様において、二重特異性抗体が提供され、二重特異性抗体は；
（ａ）抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体；および
（ｂ）抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体
を含む。
【0066】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、１～３つの抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体を含み、好ましくは１つ、または２つ抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体を含む。
【0067】
他の好ましい実施形態において、ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断し得る。
【0068】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、１～３つの抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体を含み、好ましくは、１つ、または２つの抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体を含む。
【0069】
他の好ましい実施形態において、４－１ＢＢシングルドメイン抗体は、免疫細胞を活性化し得る。
【0070】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、ヒト免疫グロブリン由来のＦｃ領域をさらに含む。
【0071】
他の好ましい実施形態において、ヒト免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその組合せからなる群から選択され；好ましくはＩｇＧ１である。
【0072】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体のＦｃ領域は、ＣＨ１＋ＣＬ１ドメイン、ヒトＩｇＧドメインまたはその組合せからなる群から選択される。
【0073】
他の好ましい実施形態において、Ｆｃ領域は、操作された変異体、好ましくはＬＡＬＡ変異体であり、ノブ－イン－ホール変異体を含む。
【0074】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、ペプチド鎖ｉおよびペプチド鎖ｉｉから構成される二量体であり、ペプチド鎖ｉおよびペプチド鎖ｉｉは、
それぞれ、式Ｉ、式ＩＩ、
Ａ－Ｌ１－Ｆｃ１－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ－Ｌ３－Ｆｃ２－Ｌ４－Ｂ（式ＩＩ）
に示される構造を有し、式中、
ＡおよびＢは、独立して、存在しない、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体または抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、存在しない、または連結エレメントであり；
Ｌ４は、連結エレメントであり；
Ｆｃ１およびＦｃ２は、それぞれ独立して、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域（好ましくはＬＡＬＡ変異体）であり；および
「－」は、ペプチド結合を表し；
ここで、二重特異性抗体は、少なくとも１つの抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体、および少なくとも１つの抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体を含み；
式Ｉによって表されるポリペプチドおよび式ＩＩによって表されるポリペプチドは、ジスルフィド結合の相互作用およびノブ－イン－ホール構造によりヘテロ二量体を形成する。
それぞれ、式Ｉ、式ＩＩ、
Ａ－Ｌ１－Ｆｃ１－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ－Ｌ３－Ｆｃ２－Ｌ４－Ｂ（式ＩＩ）
に示される構造を有し、式中、
ＡおよびＢは、独立して、存在しない、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体または抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、存在しない、または連結エレメントであり；
Ｌ４は、連結エレメントであり；
Ｆｃ１およびＦｃ２は、それぞれ独立して、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域（好ましくはＬＡＬＡ変異体）であり；および
「－」は、ペプチド結合を表し；
ここで、二重特異性抗体は、少なくとも１つの抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体、および少なくとも１つの抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体を含み；
式Ｉによって表されるポリペプチドおよび式ＩＩによって表されるポリペプチドは、ジスルフィド結合の相互作用およびノブ－イン－ホール構造によりヘテロ二量体を形成する。
【0075】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、ホモ二量体またはヘテロ二量体である。
【0076】
他の好ましい実施形態において、Ｆｃ領域は、ＬＡＬＡ変異体Ｆｃである、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する、または配列番号３に対して８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0077】
他の好ましい実施形態において、Ｆｃ１およびＦｃ２は、それぞれノブ変異およびホール変異を有する。
【0078】
他の好ましい実施形態において、Ｆｃ１のアミノ酸配列において、配列番号３に記載のアミノ酸配列に基づいて、１３２番目の位置はＳ１３２Ｃ変異を有し、１４４番目の位置はＴ１４４Ｗ変異を有する。
【0079】
他の好ましい実施形態において、Ｆｃ２のアミノ酸配列において、配列番号３に記載のアミノ酸配列に基づいて、１２７番目の位置はＹ１２７Ｃ変異を有し、１４４番目の位置はＴ１４４Ｓ変異を有し、１４６番目の位置はＬ１４６Ａ変異を有する。
【0080】
他の好ましい実施形態において、Ｆｃ１は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する、または配列番号８に記載の配列に対して８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0081】
他の好ましい実施形態において、Ｆｃ２は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する、または配列番号９に記載の配列に対して８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0082】
他の好ましい実施形態において、抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、または配列番号２に記載の配列に対して８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0083】
他の好ましい実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、または配列番号４に記載の配列に対して８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0084】
他の好ましい実施形態において、リンカーの配列は（Ｇ４Ｓ）ｎであり、ｎは正の整数（例えば、１、２、３、４、５または６）であり、好ましくは、ｎは２または４である。
【0085】
他の好ましい実施形態において、リンカーは、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する、または配列番号５に記載の配列に対して８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0086】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体はホモ二量体であり、これは、ジスルフィド結合を介して２本の同一のペプチド鎖によって形成され、ペプチド鎖は、配列番号１（すなわち、Ｂｉ－４００）に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号１に記載の配列に対して８５％（好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0087】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、ホモ二量体であり、これは、ジスルフィド結合を介して２本の同一のペプチド鎖によって形成され、ペプチド鎖は、配列番号６（すなわち、Ｂｉ－０８８）に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号６に記載の配列に対して８５％（好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0088】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体はヘテロ二量体であり、これはノブ－イン－ホール相互作用（ノブ－イン－ホール）を介して、ペプチド鎖ｉおよびペプチド鎖ｉｉによって形成され；ここで、ペプチド鎖ｉは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号７に記載の配列に対して８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有し；およびペプチド鎖ｉｉは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号９に記載の配列（すなわち、Ｂｉ－４０１－０９１）に対して８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0089】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体はヘテロ二量体であり、これは、ノブ－イン－ホール相互作用（ノブ－イン－ホール）を介してペプチド鎖ｉおよびペプチド鎖ｉｉによって形成され；ここで、ペプチド鎖ｉは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号７に記載の配列に対して８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有し；およびペプチド鎖ｉｉは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号１０（すなわち、Ｂｉ－０６１－０９１）に記載の配列に対して８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0090】
本発明の第２の態様において、単離されたポリヌクレオチドが提供され、単離されたポリヌクレオチドは、本発明の第１の態様による二重特異性抗体をコードする。
【0091】
他の好ましい実施形態において、二重特異性抗体がヘテロ二量体である場合、ポリヌクレオチド中で、ペプチド鎖ｉをコードするポリヌクレオチド配列、およびペプチド鎖ｉｉをコードするポリヌクレオチド配列は、１：１の比率である。
【0092】
本発明の第３の態様において、ベクターが提供され、ベクターは、本発明の第２の態様によるポリヌクレオチドを含む。
【0093】
他の好ましい実施形態において、ベクターは：ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスベクター、プラスミド、トランスポゾン、他の遺伝子導入系、またはその組合せからなる群から選択され；好ましくは、発現ベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶウイルス、レトロウイルス、またはその組合せ等のウイルスベクターを含む。
【0094】
本発明の第４の態様において、宿主細胞が提供され、宿主細胞は、本発明の第３の態様によるベクターを含む、または本発明の第２の態様によるポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれているか：または
宿主細胞は、本発明の第１の態様による二重特異性抗体を発現する。
宿主細胞は、本発明の第１の態様による二重特異性抗体を発現する。
【0095】
他の好ましい実施形態において、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞を含む。
【0096】
他の好ましい実施形態において、宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、および哺乳動物細胞からなる群から選択される。
【0097】
本発明の第５の態様において、本発明の第１の態様による二重特異性抗体を産生する方法であって：
（ａ）二重特異性抗体を含む培養物を得るように、本発明の第４の態様による宿主細胞を適切な条件下で培養するステップ；および
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた培養物を精製および／または分離して、二重特異性抗体を得るステップを含む、方法が提供される。
（ａ）二重特異性抗体を含む培養物を得るように、本発明の第４の態様による宿主細胞を適切な条件下で培養するステップ；および
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた培養物を精製および／または分離して、二重特異性抗体を得るステップを含む、方法が提供される。
【0098】
他の好ましい実施形態において、精製は、プロテインＡアフィニティーカラム精製および分離により標的抗体に対して行うことができる。
【0099】
他の好ましい実施形態において、精製された標的抗体は、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、好ましくは１００％の純度を有する。
【0100】
本発明の第６の態様において、免疫コンジュゲートが提供され、これは：
（ａ）本発明の第１の態様による二重特異性抗体；ならびに
（ｂ）検出可能な標識、薬剤、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはその組合せからなる群から選択されるカップリング部分を含む。
（ａ）本発明の第１の態様による二重特異性抗体；ならびに
（ｂ）検出可能な標識、薬剤、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはその組合せからなる群から選択されるカップリング部分を含む。
【0101】
他の好ましい実施形態において、放射性核種は：
（ｉ）診断用同位体であって：Ｔｃ－９９ｍ、Ｇａ－６８、Ｆ－１８、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｃｕ－６４、Ｚｒ－８９、Ｃ－１１、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８８、またはその組合せからなる群から選択される診断用同位体；および／または
（ｉｉ）治療用同位体であって：Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｃｓ－１３７、Ｃｒ－５１、Ｃｏ－６０、Ｄｙ－１６５、Ｅｒ－１６９、Ｆｍ－２５５、Ａｕ－１９８、Ｈｏ－１６６、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｒ－１９２、Ｆｅ－５９、Ｐｂ－２１２、Ｍｏ－９９、Ｐｄ－１０３、Ｐ－３２、Ｋ－４２、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ－１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ－１４９、Ｔｈ－２２７、Ｘｅ－１３３、 Ｙｂ－１６９、Ｙｂ－１７７、またはその組合せからなる群から選択される治療用同位体を含む。
（ｉ）診断用同位体であって：Ｔｃ－９９ｍ、Ｇａ－６８、Ｆ－１８、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｃｕ－６４、Ｚｒ－８９、Ｃ－１１、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８８、またはその組合せからなる群から選択される診断用同位体；および／または
（ｉｉ）治療用同位体であって：Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｃｓ－１３７、Ｃｒ－５１、Ｃｏ－６０、Ｄｙ－１６５、Ｅｒ－１６９、Ｆｍ－２５５、Ａｕ－１９８、Ｈｏ－１６６、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｒ－１９２、Ｆｅ－５９、Ｐｂ－２１２、Ｍｏ－９９、Ｐｄ－１０３、Ｐ－３２、Ｋ－４２、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ－１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ－１４９、Ｔｈ－２２７、Ｘｅ－１３３、 Ｙｂ－１６９、Ｙｂ－１７７、またはその組合せからなる群から選択される治療用同位体を含む。
【0102】
他の好ましい実施形態において、カップリング部分は、薬剤または毒素である。
【0103】
他の好ましい実施形態において、薬剤は、細胞毒性薬剤である。
【0104】
他の好ましい実施形態において、細胞毒性薬剤は、抗チューブリン薬剤、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、葉酸アンタゴニスト、代謝拮抗剤、化学療法感作剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、またはその組合せからなる群から選択される。
【0105】
特に有用なクラスの細胞毒性薬剤の例としては、例えば、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤、ＤＮＡアルキル化剤、およびチューブリン阻害剤が挙げられる。典型的な細胞毒性薬剤としては、例えば、オーリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシンおよびメイタンシノイド（例えば、ＤＭ１およびＤＭ４）、タキサン、ベンゾジアゼピン、またはベンゾジアゼピン含有薬剤（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピン、およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン）、ビンカアルカロイドまたはその組合せが挙げられる。
【0106】
他の好ましい実施形態において、毒素は、以下：
アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ＭＭＡＥ、およびＭＭＡＦ）、アウレオマイシン、メイタンシノイド、リシン、リシンＡ鎖、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α－サーチナ、ゲロニン、ミトジェリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン、クロチン、カリケアマイシン、サポナリア オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、グルココルチコイドまたはその組合せからなる群から選択される。
アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ＭＭＡＥ、およびＭＭＡＦ）、アウレオマイシン、メイタンシノイド、リシン、リシンＡ鎖、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α－サーチナ、ゲロニン、ミトジェリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン、クロチン、カリケアマイシン、サポナリア オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、グルココルチコイドまたはその組合せからなる群から選択される。
【0107】
他の好ましい実施形態において、カップリング部分は、検出可能な標識である。
【0108】
他の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、以下：蛍光または発光標識、放射性標識、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）またはＣＴ（コンピュータＸ線断層撮影）造影剤、または検出可能な生成物を生成することができる酵素、放射性核種、生体毒素、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ磁性粒子、プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ダイアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質（ＢＰＨＬ））、化学療法剤（例えば、シスプラチン）からなる群から選択される。
【0109】
他の好ましい実施形態において、免疫コンジュゲートは：本発明の第１の態様に記載の多価（例えば、２価）二重特異性抗体を含む。
【0110】
他の好ましい実施形態において、多価とは、免疫コンジュゲートが本発明の第１の態様による二重特異性抗体の複数の反復を含むアミノ酸配列を有することを指す。
【0111】
本発明の第７の態様において、医薬、試薬、検出プレートまたはキットの製造における、本発明の第１の態様に記載の二重特異性抗体、または本発明の第６の態様に記載の免疫コンジュゲートの使用が提供され；ここで、試薬、検出プレートまたはキットは：試料中のＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢを検出するために用いられ；ここで、医薬は、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性）を治療または予防するために使用される。
【0112】
他の好ましい実施形態において、免疫コンジュゲートのカップリング部分は、診断用の同位体である。
【0113】
他の好ましい実施形態において、試薬は、同位体トレーサー、造影剤、フロー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、磁性ナノ粒子およびイメージング剤からなる群から選択される１つまたは複数の試薬である。
【0114】
他の好ましい実施形態において、試料中のＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢを検出するための試薬は、ＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢ分子を（ｉｎ ｖｉｖｏ）検出するための造影剤である。
【0115】
他の好ましい実施形態において、検出は、ｉｎ ｖｉｖｏ検出またはｉｎ ｖｉｔｒｏ検出である。
【0116】
他の好ましい実施形態において、検出は、フロー検出および細胞免疫蛍光検出を含む。
【0117】
他の好ましい実施形態において、薬剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断し、同時に４－１ＢＢの結合によって免疫細胞を活性化するために使用される。
【0118】
他の好ましい実施形態において、腫瘍は、以下：急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄症、非ホジキンリンパ腫、結腸直腸がん、乳がん、結腸直腸がん、胃がん、肝臓がん、白血病、腎臓腫瘍、肺がん、小腸がん、骨がん、前立腺がん、前立腺がん、子宮頸がん、リンパ腫、副腎腫瘍、膀胱腫瘍またはその組合せを含むが、これらに限定されない。
【0119】
本発明の第８の態様において、医薬組成物が提供され、これは：
（ｉ）本発明の第１の態様に記載の二重特異性抗体、または本発明の第６の態様に記載の免疫コンジュゲート；および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む。
（ｉ）本発明の第１の態様に記載の二重特異性抗体、または本発明の第６の態様に記載の免疫コンジュゲート；および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む。
【0120】
他の好ましい実施形態において、免疫コンジュゲートのカップリング部分は、薬剤、毒素、および／または治療用同位体である。
【0121】
他の好ましい実施形態において、医薬組成物は、腫瘍を治療するための、細胞毒性薬剤等の追加の薬剤をさらに含む。
【0122】
他の好ましい実施形態において、腫瘍を治療するための追加の薬剤は、パクリタキセル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、アキシチニブ、レンバチニブ、およびペムブロリズマブを含む。
【0123】
他の好ましい実施形態において、医薬組成物は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を発現する（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性）腫瘍を治療するために使用される。
【0124】
他の好ましい実施形態において、医薬組成物は、注射剤の形態である。
【0125】
他の好ましい実施形態において、医薬組成物は、腫瘍を予防および治療するための医薬の製造において使用される。
【0126】
本発明の第９の態様において、以下：
（ｉ）ヒトＰＤ－Ｌ１分子および／または４－１ＢＢ分子を検出するための使用；（ｉｉ）フロー検出のための使用；（ｉｉｉ）細胞免疫蛍光検出のための使用；（ｉｖ）腫瘍を治療するための使用；（ｖ）腫瘍の診断のための使用；（ｖｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断するための使用；ならびに（ｖｉｉ）４－１ＢＢに結合して免疫細胞を活性化させるための使用
を含む群から選択される本発明の第１の態様による二重特異性抗体の１つまたは複数の使用が提供される。
（ｉ）ヒトＰＤ－Ｌ１分子および／または４－１ＢＢ分子を検出するための使用；（ｉｉ）フロー検出のための使用；（ｉｉｉ）細胞免疫蛍光検出のための使用；（ｉｖ）腫瘍を治療するための使用；（ｖ）腫瘍の診断のための使用；（ｖｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断するための使用；ならびに（ｖｉｉ）４－１ＢＢに結合して免疫細胞を活性化させるための使用
を含む群から選択される本発明の第１の態様による二重特異性抗体の１つまたは複数の使用が提供される。
【0127】
他の好ましい実施形態において、腫瘍は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を発現する（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性）腫瘍である。
【0128】
他の好ましい実施形態において、使用は、非診断用および非治療用である。
【0129】
本発明の第１０の態様において、組換えタンパク質が提供され、この組換えタンパク質は：（ｉ）本発明の第１の態様による二重特異性抗体；ならびに（ｉｉ）任意に、発現および／または精製を補助するためのタグ配列を有する。
【0130】
他の好ましい実施形態において、タグ配列は、６Ｈｉｓタグ、ＨＡタグおよびＦｃタグを含む。
【0131】
他の好ましい実施形態において、組換えタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢに特異的に結合する。
【0132】
本発明の第１１の態様において、試料中のＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢを検出する方法が提供され、この方法は：（１）試料を本発明の第１の態様に記載の二重特異性抗体と接触させるステップ；（２）抗原抗体複合体が形成されるかどうかを検出し、ここで、複合体の形成が、試料中のＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢの存在を示すステップを含む。
【0133】
本発明の第１２の態様において、疾患を治療するための方法が提供され、この方法は：本発明の第１の態様に記載の二重特異性抗体、または本発明の第６の態様に記載の免疫コンジュゲート、または本発明の第８の態様に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0134】
他の好ましい実施形態において、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトを含む。
【0135】
本発明の第１３の態様において、ＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢ検出試薬が提供され、検出試薬は、本発明の第６の態様に記載の免疫コンジュゲートおよび検出許容可能な担体を含むことを特徴とする。
【0136】
他の好ましい実施形態において、免疫コンジュゲートのカップリング部分は、診断用の同位体である。
【0137】
他の好ましい実施形態において、検出許容可能な担体は、非毒性で不活性な水性担体媒体である。
【0138】
他の好ましい実施形態において、検出試薬は、同位体トレーサー、造影剤、フロー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、磁性ナノ粒子およびイメージング剤からなる群から選択される１つまたは複数の試薬である。
【0139】
他の好ましい実施形態において、検出試薬は、ｉｎ ｖｉｖｏ検出のために使用される。
【0140】
他の好ましい実施形態において、検出試薬の剤形は、液体または粉末（例えば、水性液剤、注射、凍結乾燥散剤、錠剤、頬剤、エアロゾル）である。
【0141】
本発明の第１４の態様において、ＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢを検出するためのキットが提供され、このキットは、本発明の第６の態様に記載の免疫コンジュゲートまたは本発明の第１３の態様に記載の検出試薬、ならびに指示書を含むことを特徴とする。
【0142】
他の好ましい実施形態において、指示書は、キットが、対象におけるＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢの発現の非侵襲的検出に使用されることを記載する。
【0143】
他の好ましい実施形態において、キットは、ＰＤ－Ｌ１タンパク質（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性）を発現する腫瘍の検出に使用される。
【0144】
用語
本開示をより容易に理解できるようにするために、まず、特定の用語を最初に定義する。本出願で使用する場合、本明細書で明示的に別段の記載がない限り、以下の各用語は、以下に示す意味を有するものとする。他の定義は、本出願を通じて記載される。
本開示をより容易に理解できるようにするために、まず、特定の用語を最初に定義する。本出願で使用する場合、本明細書で明示的に別段の記載がない限り、以下の各用語は、以下に示す意味を有するものとする。他の定義は、本出願を通じて記載される。
【0145】
本明細書で使用する場合、「約」という用語は、当技術分野の当業者が判断する特定の値または組成についての許容誤差範囲内の値または組成物を指していてもよく、これはその値または組成がどのように測定または決定されるかに部分的に依存する。
【0146】
本明細書で使用する場合、用語「与える」および「投与する」は、互換的に使用され、
本発明の生成物が、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄、その他の非経口投与経路、
例えば、注射または点滴を含む、当技術分野の当業者に公知の種々の方法および送達系のいずれかを使用して対象に物理的に導入することを指す。
本発明の生成物が、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄、その他の非経口投与経路、
例えば、注射または点滴を含む、当技術分野の当業者に公知の種々の方法および送達系のいずれかを使用して対象に物理的に導入することを指す。
【0147】
二重特異性抗体
本明細書において、「本発明の二重特異性抗体」、「本発明の二重抗体」、および「抗ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ二重特異性抗体」という用語は同じ意味を持ち、これらは全てＰＤ－Ｌ１および４－１ＢＢを特異的に認識し結合できる二重特異性抗体を指す。
本明細書において、「本発明の二重特異性抗体」、「本発明の二重抗体」、および「抗ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ二重特異性抗体」という用語は同じ意味を持ち、これらは全てＰＤ－Ｌ１および４－１ＢＢを特異的に認識し結合できる二重特異性抗体を指す。
【0148】
本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ二重特異性抗体を提供し、これは、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体および抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体を含む。
【0149】
好ましくは、二重特異性抗体は、ペプチド鎖ｉおよびペプチド鎖ｉｉから構成される二量体であり、ペプチド鎖ｉおよびペプチド鎖ｉｉの構造は、それぞれ式Ｉおよび式ＩＩ
Ａ－Ｌ１－Ｆｃ１－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ－Ｌ３－Ｆｃ２－Ｌ４－Ｂ（式ＩＩ）
に示され、
式中、
ＡおよびＢは、独立して、存在しないか、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体または抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、存在しないか、またはリンカーであり；
Ｌ４はリンカーであり；
Ｆｃ１およびＦｃ２は、それぞれ独立してヒト免疫グロブリンのＦｃ領域（好ましくは、ＬＡＬＡ変異体）であり；および
「－」は、ペプチド結合を表し；
二重特異性抗体は、少なくとも１つの抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体および少なくとも１つの抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体を含み、
式Ｉによって表されるポリペプチドおよび式ＩＩによって表されるポリペプチドは、ジスルフィド結合相互作用およびノブインホール構造（ノブ－イン－ホール）を介してヘテロ二量体を形成する。
Ａ－Ｌ１－Ｆｃ１－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ－Ｌ３－Ｆｃ２－Ｌ４－Ｂ（式ＩＩ）
に示され、
式中、
ＡおよびＢは、独立して、存在しないか、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体または抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、存在しないか、またはリンカーであり；
Ｌ４はリンカーであり；
Ｆｃ１およびＦｃ２は、それぞれ独立してヒト免疫グロブリンのＦｃ領域（好ましくは、ＬＡＬＡ変異体）であり；および
「－」は、ペプチド結合を表し；
二重特異性抗体は、少なくとも１つの抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体および少なくとも１つの抗４－１ＢＢシングルドメイン抗体を含み、
式Ｉによって表されるポリペプチドおよび式ＩＩによって表されるポリペプチドは、ジスルフィド結合相互作用およびノブインホール構造（ノブ－イン－ホール）を介してヘテロ二量体を形成する。
【0150】
本発明の一実施形態において、二重特異性抗体は、ホモ二量体またはヘテロ二量体である。
【0151】
一実施形態において、Ｆｃ領域は、ＬＡＬＡ変異体Ｆｃであり、配列番号３に記載のアミノ酸配列、または配列番号３に記載の配列に対して８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0152】
他の実施形態において、Ｆｃ１およびＦｃ２は、それぞれノブ変異およびホール変異を有する。ここで、ノブ変異とは、配列番号３に記載のアミノ酸配列に基づいて、１３２番目の位置にＳ１３２Ｃ変異があり、１４４番目の位置にＴ１４４Ｗ変異があることを指す。ホール変異は、配列番号３に記載のアミノ酸配列に基づいて、１２７番目の位置にＹ１２７Ｃ変異、１４４番目の位置にＴ１４４Ｓ変異があり、１４６番目の位置にＬ１４６Ａ変異があることを指す。
【0153】
好ましくは、Ｆｃ１は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号８に記載の配列に対して、８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有し：Ｆｃ２は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号９に記載の配列に対して８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）以上の配列同一性を有する。
【0154】
本明細書で使用する場合、「シングルドメイン抗体」、「ナノボディＶＨＨ」、および「ナノボディ」という用語は同じ意味を有し、完全な機能を有する最小の抗原結合性断片である抗体重鎖可変領域をクローニングすることによって構築された、１つの重鎖可変領域のみからなるナノボディ（ＶＨＨ）を指す。通常、軽鎖と重鎖の定常領域１（ＣＨ１）を天然に欠く抗体を得た後、抗体重鎖可変領域をクローニングし、１つの重鎖可変領域のみからなるナノボディ（ＶＨＨ）を構築する。
【0155】
本明細書において、「可変」という用語は、抗体可変領域の特定の部分が配列において異なり、これが各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合性および特異性に寄与することを意味する。しかし、可変性は抗体可変ドメイン全体に均一に分布しているわけではない。それは、軽鎖および重鎖の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブの重鎖と軽鎖の可変領域はそれぞれ、４つのＦＲ領域を含み、これらは大まかにフォールド構成であり、結合ループを形成する３つのＣＤＲによって接続されているが、場合によっては部分的にフォールド構造を形成することもある。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって近接し、他の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２，Ｉ巻、ｐｐ．６４７－６６９（１９９１）を参照）。定常領域は、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、例えば抗体の抗体依存性細胞傷害に関与する等の、異なるエフェクター機能を示す。
【0156】
本明細書で使用する場合、「フレームワーク領域」（ＦＲ）という用語は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列、すなわち、単一種の異なる免疫グロブリン間で比較的保存的である免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域の一部を指す。免疫グロブリン軽鎖および重鎖の各々は、それぞれＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－ＬおよびＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈと称される４つのＦＲを有する。したがって、軽鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲ１－Ｌ）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲ２－Ｌ）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲ３－Ｌ）－（ＦＲ４－Ｌ）と称してよく、重鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲ１－Ｈ）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲ２－Ｈ）－（ＦＲ３－Ｈ）－（ＣＤＲ３－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ）と表してもよい。好ましくは、本発明のＦＲはヒト抗体ＦＲまたはその誘導体であり、ヒト抗体ＦＲ誘導体は天然に存在するヒト抗体ＦＲと実質的に同一であり、すなわち、配列同一性は８５％、９０％、９５％、または９６％、９７％、９８％、または９９％に達する。
【0157】
ＣＤＲのアミノ酸配列を知れば、当技術分野の当業者はフレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌおよび／またはＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈを容易に決定できる。
【0158】
本明細書で使用する場合、「ヒトフレームワーク領域」という用語は、天然に存在するヒト抗体フレームワーク領域と実質的に（約８５％以上、具体的には９０％、９５％、９７％、９９％または１００％）同一であるフレームワーク領域である。
【0159】
本明細書で使用する場合、「親和性」という用語は、インタクトな抗体と抗原との間の平衡会合によって理論的に定義される。本発明の二重特異性抗体の親和性は、ＫＤ値（解離定数）または他の測定方法によって評価または決定、例えば、ＦｏｒｔｅｂｉｏＲｅｄ９６装置を用いた生体層干渉法（ＢＬＩ）によって決定し得る。
【0160】
本明細書で使用する場合、「リンカー」という用語は、軽鎖および重鎖のドメインが交換された二重可変領域を有する免疫グロブリンに折り畳まれるのに十分な移動度を提供するように免疫グロブリンドメインに挿入される１つまたは複数のアミノ酸残基を指す。
【0161】
当技術分野の当業者に知られているように、免疫コンジュゲートおよび融合発現産物は、薬剤、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素および他の診断用または治療用分子を本発明の抗体またはその断片に結合させることによって形成されるコンジュゲートを含む。本発明はまた、ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ二重特異性抗体、またはその断片に結合する細胞表面マーカーまたは抗原を含む。
【0162】
本明細書で使用する場合、「可変領域」および「相補性決定領域（ＣＤＲ）」という用語は、互換的に使用される。
【0163】
本発明の好ましい実施形態において、抗体の重鎖可変領域は、３つの相補性決定領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【0164】
本発明の好ましい実施形態において、抗体の重鎖は、上記の重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
【0165】
本発明において、「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、または「本発明のポリペプチド」という用語は、互換的に使用され、これらは全て、ＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢタンパク質に特異的に結合するポリペプチド、例えば、重鎖可変領域を有するタンパク質またはポリペプチドを指す。これらは、開始メチオニンを含んでいても含んでいなくてもよい。
【0166】
本発明はさらに、本発明の抗体を有する他のタンパク質または融合発現産物を提供する。具体的には、本発明は、可変領域が本発明の抗体の重鎖可変領域と同一または少なくとも９０％相同、好ましくは少なくとも９５％相同である限り、可変領域を含む重鎖を有する任意のタンパク質またはタンパク質コンジュゲートおよび融合発現産物（すなわち、免疫コンジュゲートおよび融合発現産物）を含む。
【0167】
一般的に、抗体の抗原結合特性は、重鎖可変領域に位置する３つの特定の領域によって説明することができ、これらはＣＤＲと称され、セグメントを４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分離し、４つのＦＲのアミノ酸配列は比較的保存的であり、結合反応に直接関与していない。これらのＣＤＲは環構造を形成し、その間のＦＲが形成するβフォールドは空間構造上互いに近接しており、重鎖上のＣＤＲと対応する軽鎖上のＣＤＲは抗体の抗原結合部位を構成する。同種の抗体のアミノ酸配列を比較することによって、どのアミノ酸がＦＲ領域またはＣＤＲ領域を構成するかを判断することが可能である。
【0168】
本発明の抗体の重鎖の可変領域は、その少なくとも一部が抗原との結合に関与しているため、特に注目される。したがって、本発明は、ＣＤＲが本明細書で同定したＣＤＲと９０％超（好ましくは９５％超、最も好ましくは９８％超）相同である限り、ＣＤＲを有する抗体重鎖可変領域を有するこれらの分子を含む。
【0169】
本発明は、インタクトな抗体だけでなく、免疫学的活性を有する抗体断片、または抗体と他の配列とで形成される融合タンパク質をも含む。したがって、本発明は、抗体の断片、誘導体およびアナログをさらに含む。
【0170】
本明細書で使用する場合、「断片」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、本発明の抗体の同じ生物学的機能もしくは活性を実質的に保持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド断片、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたは複数の置換された保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）を有するポリペプチドであってよく、そのような置換アミノ酸残基は遺伝コードによってコードされていてもいなくてもよい、または（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドを他の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を延長する化合物、例えば、ポリエチレングリコール）、または（ｉｖ）追加のアミノ酸配列をポリペプチド配列に融合することによって形成されるポリペプチド（例えば、リーダー配列もしくは分泌配列、またはポリペプチドを精製するための配列もしくはプロタンパク質配列、または６Ｈｉｓタグによって形成される融合タンパク質）であってもよい。本明細書の教示に照らして、このような断片、誘導体およびアナログは、当技術分野の当業者の範囲内である。
【0171】
本発明の抗体は、ＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢタンパク質に結合する活性を有する二重抗体を指す。本用語は、本発明の抗体と同じＣＤＲ領域を含み、同じ機能を有するポリペプチドバリアントも指す。このようなバリアント形態には、（これらに限定されないが）：Ｃ末端および／またはＮ末端の１つまたは複数（通常１～５０、好ましくは１～３０、より好ましくは１～２０、最も好ましくは１～１０）のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、ならびに１つまたはいくつか（通常２０以内、好ましくは１０以内、より好ましくは５以内）のアミノ酸の付加が含まれる。例えば、当技術分野では、より近いまたは類似の特性を有するアミノ酸の置換は、一般的に、タンパク質の機能を変化させない。他の例として、Ｃ末端および／またはＮ末端における１つまたはいくつかのアミノ酸の付加は、通常、タンパク質の機能を変化させない。本用語は、本発明の抗体の活性断片および活性誘導体をさらに指す。
【0172】
ポリペプチドのバリアントとしては、相同配列、保存的バリアント、対立遺伝子バリアント、天然変異体、誘導変異体、本発明の抗体のＤＮＡと高度または低度にストリンジェントな条件でハイブリダイズできるＤＮＡがコードするタンパク質、または本発明の抗体に対する抗血清を使用することによって得られるポリペプチドまたはタンパク質が挙げられる。
【0173】
本発明は、さらに他のポリペプチド、例えば、シングルドメイン抗体またはその断片を含む融合タンパク質を提供する。実質的に全長のポリペプチドに加えて、本発明はさらに、本発明のシングルドメイン抗体の断片を含む。典型的には、断片は、本発明の抗体の少なくとも約５０の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０の連続したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００の連続したアミノ酸を有する。
【0174】
本発明において、「本発明の抗体の保存的バリアント」は、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較して、類似または近い特性を有するアミノ酸で、多くとも１０、好ましくは多くとも８、より好ましくは多くとも５、および最も好ましくは多くとも３のアミノ酸配列を置換することにより形成されるポリペプチドを指す。これらの保存的バリアントポリペプチドは、好ましくは、表Ａに記載のアミノ酸置換によって産生される。
【0175】
【表1】
【0176】
本発明は、さらに、上記の抗体もしくはその断片またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡの形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード化鎖または非コード化鎖のいずれかであり得る。
【0177】
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列および種々の追加コード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および任意の追加コード配列）および非コード配列を含む。
【0178】
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいても、または追加のコード配列および／もしくは非コード配列を含んでいてもよい。
【0179】
本発明はさらに、上記の配列にハイブリダイズし、２つの配列の間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本発明のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能であるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「ストリンジェントな条件」は：（１）例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃の低いイオン強度および高温でのハイブリダイゼーションおよび溶出、または（２）例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、４２℃等の変性剤存在下でのハイブリダイゼーション；または（３）２つの配列間の同一性が少なくとも９０％、好ましくは９５％超となる場合にのみ起こるハイブリダイゼーションを指す。さらに、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
【0180】
本発明の抗体の全長ヌクレオチド配列またはその断片は、通常、ＰＣＲ増幅、組換えまたは人工合成により得ることができる。実現可能な方法は、特に断片の長さが短い場合に、人工合成を用いて関連配列を合成することである。通常、非常に長い配列を有する断片は、複数の小さな断片を合成し、それらをライゲーションすることによって得られる。さらに、重鎖のコード配列を発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）と融合させて融合タンパク質を形成することもできる。
【0181】
関連配列が得られると、組換え法を用いて大量に関連配列を得ることができる。通常、ベクターにクローニングした後、細胞を形質転換し、増殖した宿主細胞から従来法により関連配列を単離する。本発明に関わる生体分子（核酸、タンパク質等）には、単離された形態の生体分子が含まれる。
【0182】
現時点では、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列（またはその断片、もしくはその誘導体）は、化学合成により完全に得ることができる。その後、このＤＮＡ配列は、当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（例えば、ベクター）および細胞に導入することができる。また、化学合成により、本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
【0183】
本発明はまた、上記の適切なＤＮＡ配列と適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように適切な宿主細胞を形質転換するために使用することができる。
【0184】
宿主細胞は、細菌細胞等の原核細胞；または酵母細胞等の下等真核細胞；または哺乳動物細胞等の高等真核細胞であってもよい。代表的な例としては大腸菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）等の細菌細胞；酵母等の真菌細胞；ショウジョウバエＳ２またはＳｆ９等の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ７、２９３細胞等の動物細胞等が挙げられる。
【0185】
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当技術分野の当業者に周知の従来技術により行うことができる。宿主が大腸菌のような原核生物である場合、ＤＮＡを取り込むことができるコンピテントセルは、指数関数的成長期後に採取し、当技術分野の当業者に周知の手順を用いてＣａＣｌ２で処理することができる。他の方法は、ＭｇＣｌ２を使用することである。また、所望により、エレクトロポレーションにより形質転換を行うことができる。宿主が真核生物である場合、以下のＤＮＡトランスフェクション法：リン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームパッケージング等の従来の機械的方法等を用いることができる。
【0186】
得られた形質転換体は、従来法により培養し、本発明の遺伝子にコードされるポリペプチドを発現させることができる。培養に用いる培地は、使用する宿主細胞に応じて、従来の種々の培地から選択することができる。培養は、宿主細胞の増殖に適した条件下で行われる。宿主細胞が適当な細胞密度まで増殖した後、選択したプロモーターを適当な方法（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）によって誘導し、細胞をさらに一定期間培養する。
【0187】
上記方法において組換えポリペプチドは、細胞内、または細胞膜上で発現させることができ、または細胞外に分泌させることができる。組換えタンパク質は、所望により、その物理的、化学的およびその他の特性を利用して、種々の分離方法によって単離および精製することができる。これらの方法は、当技術分野の当業者にはよく知られている。これらの方法の例としては、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧破壊、上清処理、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および他の液体クロマトグラフィー技術およびこれらの方法の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【0188】
本発明の抗体は、単独で、または検出可能な標識（診断目的）、治療剤、ＰＫ（プロテインキナーゼ）改変部分、またはこれらの物質いずれかの組合せで結合またはコンジュゲートして用いることができる。
【0189】
診断目的の検出可能な標識としては、蛍光または発光標識、放射性標識、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）またはＣＴ（コンピュータ断層撮影）造影剤、または検出可能な生成物を産生することができる酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
【0190】
本発明の抗体と組み合わせるまたはコンジュゲートすることができる治療剤としては、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：１．放射性核種；２．生物学的毒性；３．ＩＬ－２等のサイトカイン；４．金ナノ粒子／ナノロッド；５．ウイルス；６．リポソーム；７．ナノ磁性粒子；８．プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ダイアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質（ＢＰＨＬ））；１０．化学療法剤（例えばシスプラチン）または任意の形式のナノ粒子等。
【0191】
医薬組成物
本発明は、組成物も提供する。好ましくは、組成物は医薬組成物であり、これは、上記抗体もしくはその活性断片もしくはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む。一般的に、これらの物質は、非毒性で不活性かつ薬学的に許容される水性担体媒体中で製剤化することができ、そのｐＨは、通常、約５～８、好ましくは約６～８であるが、製剤化する物質の性質および治療する状態に応じてｐＨ値を変化させてもよい。調製された医薬組成物は、腫瘍内投与、腹腔内投与、静脈内投与、または局所的投与を含む従来の経路で投与することができる（これらに限定されない）。
本発明は、組成物も提供する。好ましくは、組成物は医薬組成物であり、これは、上記抗体もしくはその活性断片もしくはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む。一般的に、これらの物質は、非毒性で不活性かつ薬学的に許容される水性担体媒体中で製剤化することができ、そのｐＨは、通常、約５～８、好ましくは約６～８であるが、製剤化する物質の性質および治療する状態に応じてｐＨ値を変化させてもよい。調製された医薬組成物は、腫瘍内投与、腹腔内投与、静脈内投与、または局所的投与を含む従来の経路で投与することができる（これらに限定されない）。
【0192】
本発明の医薬組成物は、ＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢタンパク質分子の結合に直接使用することができ、したがって、腫瘍を治療するために使用することができる。さらに、追加の治療剤を併用することもできる。
【0193】
本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記のシングルドメイン抗体（またはそのコンジュゲート）と薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。このような担体としては、生理食塩水、緩衝液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組合せが挙げられるが、これらに限定されない。医薬製剤は、投与様式に適合させるべきである。本発明の医薬組成物は、例えば、生理的食塩水またはグルコースおよび他のアジュバントを含む水溶液を用いて従来法により、注射剤の形態で調製することができる。注射剤または液剤等の医薬組成物は、好ましくは無菌条件下で製造される。有効成分は、治療上有効量、例えば１日あたり約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重で投与される。さらに、本発明のポリペプチドは、追加の治療剤と共に使用することもできる。
【0194】
医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の免疫コンジュゲートが哺乳動物に投与されるが、その安全かつ有効な量は、通常少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重、多くの場合約５０ｍｇ／ｋｇ体重以下であり、好ましくは、投与量は約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。それにもかかわらず、具体的な投与量については、投与経路および患者の健康状態等の要因も考慮する必要があり、これらは当業者の医師の技量の範囲内である。
【0195】
標識化抗体
本発明の好ましい実施形態において、抗体は検出可能な標識を有する。より好ましくは、標識は、同位体、コロイド状金標識、有色標識または蛍光標識からなる群から選択される。
本発明の好ましい実施形態において、抗体は検出可能な標識を有する。より好ましくは、標識は、同位体、コロイド状金標識、有色標識または蛍光標識からなる群から選択される。
【0196】
コロイド状金標識は、当技術分野の当業者に公知の方法を用いて実施することができる。本発明の好ましい実施形態において、ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ二重特異性抗体をコロイド状金で標識し、コロイド状金標識化抗体を得ることができる。
【0197】
検出方法
本発明はまた、ＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢタンパク質を検出する方法に関する。本方法は、大別すると、以下：細胞および／または組織の試料を得るステップ；試料を媒体に溶解するステップ；溶解した試料中のＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢタンパク質のレベルを検出するステップを含む。
本発明はまた、ＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢタンパク質を検出する方法に関する。本方法は、大別すると、以下：細胞および／または組織の試料を得るステップ；試料を媒体に溶解するステップ；溶解した試料中のＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢタンパク質のレベルを検出するステップを含む。
【0198】
本発明の検出方法において、使用する試料は特に限定されず、代表例は、細胞保存溶液中に存在する細胞含有試料である。
【0199】
キット
また、本発明は、本発明の抗体（またはその断片）または検出プレートを含むキットを提供する。本発明の好ましい実施態様において、キットは、容器、使用指示書、緩衝剤等をさらに含む。
また、本発明は、本発明の抗体（またはその断片）または検出プレートを含むキットを提供する。本発明の好ましい実施態様において、キットは、容器、使用指示書、緩衝剤等をさらに含む。
【0200】
また、本発明は、ＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢのレベルを検出するための検出キットを提供し、このキットは、ＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢタンパク質を認識する抗体、試料を溶解するための溶解媒体、および各種緩衝剤、検出標識、検出基質等の一般的な検出試薬および緩衝剤を含む。なお、検出キットはｉｎ ｖｉｔｒｏ診断用デバイス中にあってもよい。
【0201】
使用
以上のように、本発明のシングルドメイン抗体は、生物学的および臨床的応用価値が広く、その使用は、ＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢに関連する疾患の診断および治療、基礎医学研究、生物学研究等の多くの分野に関連する。その好ましい使用は、臨床診断、および腫瘍治療等のＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢに対する標的治療のためのものである。
以上のように、本発明のシングルドメイン抗体は、生物学的および臨床的応用価値が広く、その使用は、ＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢに関連する疾患の診断および治療、基礎医学研究、生物学研究等の多くの分野に関連する。その好ましい使用は、臨床診断、および腫瘍治療等のＰＤ－Ｌ１および／または４－１ＢＢに対する標的治療のためのものである。
【0202】
本発明による有益な効果
本発明は、以下の技術的効果のうち１つまたは複数を達成する：
１）本発明のナノボディは、正しい空間構造のヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質および４－１ＢＢタンパク質に対して高度に特異的である。
２）本発明の二重特異性抗体は強い親和性を有する。
３）本発明の二重特異性抗体の産生は、簡単かつ簡便である。
４）本発明の二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１の受容体ＰＤ－１への結合を遮断する機能を有する。同時に、二重特異性抗体は、免疫細胞上の４－１ＢＢにも結合し、腫瘍微小環境における免疫細胞の活性を活性化させ、腫瘍の発生および発達を阻害する効果をより効果的に改善することができる。
５）二重特異性抗体は、安定性が高く、半減期が長い。
６）肝毒性が少なく、安全性が良好である。
７）本発明の二重特異性抗体の第１のタンパク質機能性領域と第２のタンパク質機能性領域の間に相乗効果がある可能性が非常に高く；例えば、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を遮断する能力が、対照抗体よりもさらに優れており；ヒト４－１ＢＢおよびヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合レベルは、対照抗体よりもさらに優れており；混合リンパ球にＩＬ－２の分泌を誘導する上でも対照抗体より優れていること等が示され、これは、本発明の二重特異性抗体が、Ｔ細胞をよりよく活性化することができること等を示している。
本発明は、以下の技術的効果のうち１つまたは複数を達成する：
１）本発明のナノボディは、正しい空間構造のヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質および４－１ＢＢタンパク質に対して高度に特異的である。
２）本発明の二重特異性抗体は強い親和性を有する。
３）本発明の二重特異性抗体の産生は、簡単かつ簡便である。
４）本発明の二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１の受容体ＰＤ－１への結合を遮断する機能を有する。同時に、二重特異性抗体は、免疫細胞上の４－１ＢＢにも結合し、腫瘍微小環境における免疫細胞の活性を活性化させ、腫瘍の発生および発達を阻害する効果をより効果的に改善することができる。
５）二重特異性抗体は、安定性が高く、半減期が長い。
６）肝毒性が少なく、安全性が良好である。
７）本発明の二重特異性抗体の第１のタンパク質機能性領域と第２のタンパク質機能性領域の間に相乗効果がある可能性が非常に高く；例えば、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を遮断する能力が、対照抗体よりもさらに優れており；ヒト４－１ＢＢおよびヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合レベルは、対照抗体よりもさらに優れており；混合リンパ球にＩＬ－２の分泌を誘導する上でも対照抗体より優れていること等が示され、これは、本発明の二重特異性抗体が、Ｔ細胞をよりよく活性化することができること等を示している。
【図面の簡単な説明】
【0203】
【化1】
【図5A】図５Ａは、ＣＨＯ－Ｓ細胞とヒト４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦ－ＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子を過剰発現している細胞の共インキュベート系における本発明の二重特異性抗体の蛍光シグナル活性化活性の検出結果を示す。
【図5B】図５Ｂは、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現しているＣＨＯ－Ｓ細胞とヒト４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦ－ＡＴルシフェラーゼレポーター遺伝子を過剰発現している細胞の共インキュベート系における本発明の二重特異性抗体の蛍光シグナル活性化の検出結果を示す。
【0204】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【表2-6】
【表2-7】
【実施例】
【0205】
本発明を実施するための具体的なモデル
以下、本発明は特定の実施例と組み合わせてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するために使用されるに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図していないことは理解されるべきである。以下の実施例において具体的な条件を示さない実験方法は、通常、従来の条件に従って、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている条件に従って、または製造業者が推奨する条件に従って実施される。パーセンテージおよび部は、特に指示しない限り、重量によるものである。
以下、本発明は特定の実施例と組み合わせてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するために使用されるに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図していないことは理解されるべきである。以下の実施例において具体的な条件を示さない実験方法は、通常、従来の条件に従って、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている条件に従って、または製造業者が推奨する条件に従って実施される。パーセンテージおよび部は、特に指示しない限り、重量によるものである。
【0206】
特定しない場合、実施例２～１２で使用したＨＺ－Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－０１およびＣ－Ｙｅ－１８－５のＣ末端を、ＩｇＧ１ Ｆｃ（ＬＡＬＡ変異）に直接ライゲーションした。
【0207】
実施例１：二重特異性抗体のクローニングおよび発現
１．１ 抗体コンストラクトの構造
本実施例では、４つの抗４－１ＢＢ／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体を構築した、すなわち：
Ｂｉ－４００：２の同一のポリペプチド鎖から構成されており（２つのペプチド鎖は２対のジスルフィド結合によって連結されていた）、その構造図を図１Ａに示す。ペプチド鎖は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有していたが、これは、抗４－１ＢＢナノボディＨＺ－Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－０１のアミノ酸配列を含み（配列番号２）、抗４－１ＢＢナノボディアミノ酸配列のＣ末端はヒトＩｇＧ１ Ｆｃのアミノ酸配列（ＬＡＬＡ変異で導入、配列番号３、ＩｇＧ１ Ｆｃ（ＬＡＬＡ）と命名）に直接ライゲーションされ、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－１８－５（公開番号：中国特許出願公開第１１２４８０２５３Ａ号）（配列番号４）のＮ末端は、２１アミノ酸残基（Ｇ４Ｓ）４（配列番号５）のリンカーを介してＩｇＧ１ Ｆｃ（ＬＡＬＡ）のＣ末端にライゲーションされた。
Ｂｉ－０８８：２本の同一のポリペプチド鎖から構成されており、その構造模式図は、図１Ｂに示され、ペプチド鎖は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有し、これは抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－１８－５（公開番号：中国特許出願公開第１１２４８０２５３Ａ号）（配列番号４）を含み、ナノボディアミノ酸配列のＣ末端はヒトＩｇＧ１ Ｆｃのアミノ酸配列（ＬＡＬＡ変異を導入、配列番号３）に直接ライゲーションされ、および抗４－１ＢＢナノボディＨＺ－Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－０１アミノ酸配列（配列番号２）のＮ末端は、２１アミノ酸残基（Ｇ４Ｓ）４（配列番号５）のリンカーを介してＩｇＧ１ Ｆｃ（ＬＡＬＡ）のＣ末端にライゲーションされた。
１．１ 抗体コンストラクトの構造
本実施例では、４つの抗４－１ＢＢ／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体を構築した、すなわち：
Ｂｉ－４００：２の同一のポリペプチド鎖から構成されており（２つのペプチド鎖は２対のジスルフィド結合によって連結されていた）、その構造図を図１Ａに示す。ペプチド鎖は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有していたが、これは、抗４－１ＢＢナノボディＨＺ－Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－０１のアミノ酸配列を含み（配列番号２）、抗４－１ＢＢナノボディアミノ酸配列のＣ末端はヒトＩｇＧ１ Ｆｃのアミノ酸配列（ＬＡＬＡ変異で導入、配列番号３、ＩｇＧ１ Ｆｃ（ＬＡＬＡ）と命名）に直接ライゲーションされ、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－１８－５（公開番号：中国特許出願公開第１１２４８０２５３Ａ号）（配列番号４）のＮ末端は、２１アミノ酸残基（Ｇ４Ｓ）４（配列番号５）のリンカーを介してＩｇＧ１ Ｆｃ（ＬＡＬＡ）のＣ末端にライゲーションされた。
Ｂｉ－０８８：２本の同一のポリペプチド鎖から構成されており、その構造模式図は、図１Ｂに示され、ペプチド鎖は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有し、これは抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－１８－５（公開番号：中国特許出願公開第１１２４８０２５３Ａ号）（配列番号４）を含み、ナノボディアミノ酸配列のＣ末端はヒトＩｇＧ１ Ｆｃのアミノ酸配列（ＬＡＬＡ変異を導入、配列番号３）に直接ライゲーションされ、および抗４－１ＢＢナノボディＨＺ－Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－０１アミノ酸配列（配列番号２）のＮ末端は、２１アミノ酸残基（Ｇ４Ｓ）４（配列番号５）のリンカーを介してＩｇＧ１ Ｆｃ（ＬＡＬＡ）のＣ末端にライゲーションされた。
【0208】
Ｂｉ－４０１－０９１：２本のポリペプチド鎖から構成されており、その構造図は図１に示され、ペプチド鎖＃１は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有し、これは抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－１８－５（公開番号：中国特許出願公開第１１２４８０２５３Ａ号）（配列番号４）を含み、ナノボディアミノ酸配列のＣ末端はヒトＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列に直接ライゲーションされ（ＬＡＬＡ変異を導入、ノブ－イン－ホール変異を導入、配列番号８）、抗４－１ＢＢナノボディＨＺ－Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－０１（配列番号２）のＮ末端は、２１アミノ酸残基（Ｇ４Ｓ）４（配列番号５）のリンカーを介して、ＦｃのＣ末端にライゲーションされ；ペプチド鎖＃２は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有し、これは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列（ＬＡＬＡ変異を導入、ノブ－イン－ホール変異を導入、配列番号９）であった。
【0209】
Ｂｉ－０６１－０９１：２本のポリペプチド鎖から構成されており、その構造図は図１Ｄに示され、ペプチド鎖＃１は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有し；ペプチド鎖＃２は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有しており、これは抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディＣ－Ｙｅ－１８－５（公開番号：中国特許出願公開第１１２４８０２５３Ａ号）（配列番号４）を含み、ナノボディアミノ酸配列のＣ末端は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列（Ｆｃ機能を低下させるためにＬＡＬＡ変異を導入、ノブ－イン－ホール変異を導入してヘテロ二量体を形成、配列番号９）に直接ライゲーションされた。
【0210】
１．２ 遺伝子クローニングおよびタンパク質の調製
表Ｂの配列を参照し、対応するアミノ酸配列をコードする遺伝子断片をｐＣＤＮＡ３．１ベクターに構築した。Ｂｉ－４０１－０９１およびＢｉ－０６１－０９１のペプチド鎖＃１およびペプチド鎖＃２については、これら２つの配列は一過性のトランスフェクション間に２つの異なるプラスミドで発現させ、細胞発現プロセス中に自動的にジスルフィド結合が形成された。
表Ｂの配列を参照し、対応するアミノ酸配列をコードする遺伝子断片をｐＣＤＮＡ３．１ベクターに構築した。Ｂｉ－４０１－０９１およびＢｉ－０６１－０９１のペプチド鎖＃１およびペプチド鎖＃２については、これら２つの配列は一過性のトランスフェクション間に２つの異なるプラスミドで発現させ、細胞発現プロセス中に自動的にジスルフィド結合が形成された。
【0211】
ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏより購入）を用いて、プラスミドをＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション方法は製造者の指示に従って実施した。細胞を５日間培養した後、上清を回収し、プロテインＡ磁気ビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔより購入）を用いた分離法に供し、標的タンパク質を精製した。磁気ビーズを適当な体積の結合緩衝剤（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）で再懸濁し（磁気ビーズの１～４倍の体積）、次いで精製する試料に添加し、室温で穏やかに振とうしながら１時間インキュベートした。試料を磁気スタンド（Ｂｅａｖｅｒより購入）に置き、上清を廃棄し、磁気ビーズを結合緩衝剤で３回洗浄した。溶出緩衝剤（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．２）を磁気ビーズの３～５倍の体積になるように添加し、室温で５～１０分間振とうした後、磁気スタンド上に置き、溶出緩衝剤を回収し、中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５４）を加えた回収管に移し、よく混合した。調製した二重特異性抗体試料は、以降の実験に使用した。
【0212】
実施例２：二重特異性抗体の細胞ベースの結合
ヒトまたはカニクイザル４－１ＢＢ（ＰＤ－Ｌ１）を過剰発現するＣＨＯ細胞は、ＭＣＳ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ）にクローニングしたヒトまたはカニクイザル４－１ＢＢ（ＰＤ－Ｌ１）のｃＤＮＡをコードするｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をトランスフェクションすることにより生成した（理論的には、この方法は、トランスフェクションおよびストレススクリーニングにより、過剰発現細胞を得ることができ、後にフローサイトメトリーで確認する）。過剰発現細胞を拡大培養に供し、細胞密度が２×ｌ０６細胞／ｍｌになるように調整した後、９６ウェルフロープレートに、１００μｌ／ウェルで添加し、後で使用するために遠心分離した。精製した４－１ＢＢ抗体をＰＢＳで４００ｎＭから３倍希釈し、合計１２点を得た。上記希釈した試料を、上記の細胞を含む９６ウェルフロープレートに１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００倍希釈したヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＰＥ）（Ａｂｃａｍより購入）を１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄を行った。ＰＢＳを１００μｌ／ウェルで添加して細胞を再懸濁し、検出はＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ）フローサイトメーターで行い、対応するＭＦＩを算出した。ＩＮＢＲＸ－１０５－１Ｂ（ペプチド鎖は１本のみで、アミノ酸配列は配列番号１１に記載。国際公開第２０１７１２３６５０Ａ２号参照）を、二重特異性抗体陽性対照（Ｉｎｈｉｂｒｘの抗ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ二重特異性抗体）として使用し；ナノボディＨＺ－Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－０１は抗４－１ＢＢ陽性対照として、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＬＡＬＡ変異）（配列番号３）にライゲーションされ；ナノボディＣ－Ｙｅ－１８－５（配列番号５）は抗ＰＤ－Ｌ１陽性対照としてヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＬＡＬＡ変異）（配列番号３）にライゲーションされた。さらに、２つの抗４－１ＢＢモノクローナル抗体ウトミルマブ（特許番号：米国特許出願公開第２０１２０２３７４９８号）（その重鎖および軽鎖の配列は、それぞれ配列番号１２および配列番号１３に記載）およびウレルマブ（医薬品の国際非専有名称：１０４、その重鎖および軽鎖の配列は、それぞれ配列番号１４および配列番号１５に記載）は、抗４－１ＢＢ陽性対照として使用された。
ヒトまたはカニクイザル４－１ＢＢ（ＰＤ－Ｌ１）を過剰発現するＣＨＯ細胞は、ＭＣＳ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ）にクローニングしたヒトまたはカニクイザル４－１ＢＢ（ＰＤ－Ｌ１）のｃＤＮＡをコードするｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をトランスフェクションすることにより生成した（理論的には、この方法は、トランスフェクションおよびストレススクリーニングにより、過剰発現細胞を得ることができ、後にフローサイトメトリーで確認する）。過剰発現細胞を拡大培養に供し、細胞密度が２×ｌ０６細胞／ｍｌになるように調整した後、９６ウェルフロープレートに、１００μｌ／ウェルで添加し、後で使用するために遠心分離した。精製した４－１ＢＢ抗体をＰＢＳで４００ｎＭから３倍希釈し、合計１２点を得た。上記希釈した試料を、上記の細胞を含む９６ウェルフロープレートに１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００倍希釈したヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＰＥ）（Ａｂｃａｍより購入）を１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄を行った。ＰＢＳを１００μｌ／ウェルで添加して細胞を再懸濁し、検出はＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ）フローサイトメーターで行い、対応するＭＦＩを算出した。ＩＮＢＲＸ－１０５－１Ｂ（ペプチド鎖は１本のみで、アミノ酸配列は配列番号１１に記載。国際公開第２０１７１２３６５０Ａ２号参照）を、二重特異性抗体陽性対照（Ｉｎｈｉｂｒｘの抗ＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢ二重特異性抗体）として使用し；ナノボディＨＺ－Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－０１は抗４－１ＢＢ陽性対照として、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＬＡＬＡ変異）（配列番号３）にライゲーションされ；ナノボディＣ－Ｙｅ－１８－５（配列番号５）は抗ＰＤ－Ｌ１陽性対照としてヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＬＡＬＡ変異）（配列番号３）にライゲーションされた。さらに、２つの抗４－１ＢＢモノクローナル抗体ウトミルマブ（特許番号：米国特許出願公開第２０１２０２３７４９８号）（その重鎖および軽鎖の配列は、それぞれ配列番号１２および配列番号１３に記載）およびウレルマブ（医薬品の国際非専有名称：１０４、その重鎖および軽鎖の配列は、それぞれ配列番号１４および配列番号１５に記載）は、抗４－１ＢＢ陽性対照として使用された。
【0213】
【0214】
図２Ａに示すように、異なる構造を有する二重特異性抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１－過剰発現ＣＨＯ細胞に対して異なる結合活性を示し、いくつかの二重特異性抗体の結合活性は、対照抗体と同程度であり；図２Ｂに示すように、異なる構造を有する二重特異性抗体は、カニクイザルＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＨＯ細胞に対して異なる結合活性を示し、いくつかの二重特異性抗体の結合活性は、対照抗体と同程度であり；図２Ｃに示すように、異なる構造を有する二重特異性抗体は、ヒト４－１ＢＢ過剰発現ＣＨＯ細胞に対して異なる結合活性を示し、いくつかの二重特異性抗体の結合活性は対照抗体と同程度であり；図２Ｄに示すように、異なる構造を有する二重特異性抗体は、カニクイザル４－１ＢＢ過剰発現ＣＨＯ細胞に対して異なる結合活性を示し、いくつかの二重特異性抗体の結合活性は、対照抗体と同程度であり；図２Ｅに示すように、異なる構造を有する二重特異性抗体はＣＨＯ－Ｓ細胞に対して明らかな非特異的結合を示さなかった。
【0215】
実施例３：ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１ ＣＨＯ細胞への結合を遮断する二重特異性抗体
本実施例において、拡大培養したＣＨＯ－ｈＰＤ－１細胞（ヒトＰＤ－１を過剰発現）を、細胞密度２×１０６細胞／ｍｌに調整し、９６ウェルフロープレートに１００μｌ／ウェルで添加し、後の使用のために遠心分離した。精製した二重特異性抗体を、４００ｎＭからＰＢＳで３倍に希釈し、合計１２点を得、希釈した試料を、９６ウェル試料希釈プレートに、６０μｌ／ウェルで添加した。ビオチン標識したヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）を６０μｌ／ウェルで同時に添加し、最終濃度５００ｎｇ／ｍｌを達成し、４℃で３０分間インキュベートした。共インキュベート試料を、１００μｌ／ウェルで、細胞を含む上記の９６ウェルフロープレートに添加し、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００倍希釈したＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄより購入）を１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを１００μｌ／ウェルで添加し、細胞を再懸濁し、検出はＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ）フローサイトメーターで行い、対応するＭＦＩを算出した。
本実施例において、拡大培養したＣＨＯ－ｈＰＤ－１細胞（ヒトＰＤ－１を過剰発現）を、細胞密度２×１０６細胞／ｍｌに調整し、９６ウェルフロープレートに１００μｌ／ウェルで添加し、後の使用のために遠心分離した。精製した二重特異性抗体を、４００ｎＭからＰＢＳで３倍に希釈し、合計１２点を得、希釈した試料を、９６ウェル試料希釈プレートに、６０μｌ／ウェルで添加した。ビオチン標識したヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）を６０μｌ／ウェルで同時に添加し、最終濃度５００ｎｇ／ｍｌを達成し、４℃で３０分間インキュベートした。共インキュベート試料を、１００μｌ／ウェルで、細胞を含む上記の９６ウェルフロープレートに添加し、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００倍希釈したＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄより購入）を１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを１００μｌ／ウェルで添加し、細胞を再懸濁し、検出はＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ）フローサイトメーターで行い、対応するＭＦＩを算出した。
【0216】
結果を図３に示した。本発明の異なる構造を有する二重特異性抗体は、全てＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の結合を遮断することができ、その遮断レベルは構造によって異なり、Ｂｉ－０８８分子の遮断活性は対照抗体と同等かそれよりも優れていた。
【0217】
実施例４：二重特異性抗体細胞ベースの共結合の検出
本実施例では、ヒト４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ細胞をＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏより購入）を用いて標識し、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞をＣＴＶ（Ｔｈｅｒｍｏより購入）を用いて標識した。細胞をＰＢＳに再懸濁し、細胞密度を４×１０６細胞／ｍｌにそれぞれ調製し、２つの細胞懸濁液を等しい割合で混合して、５０μｌ／ウェルで９６ウェルＵ底プレート（Ｔｈｅｒｍｏより購入）に添加し、同時にＰＢＳで最終濃度ｌ００ｎＭから３倍に勾配希釈し、合計１２点を得た二重特異性抗体または対照抗体を５０μｌ／ウェルで添加し、３７℃で２時間インキュベートし、検出はＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ）フローサイトメーターで行い、二重陽性細胞の比率を算出した。
本実施例では、ヒト４－１ＢＢを過剰発現するＣＨＯ細胞をＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏより購入）を用いて標識し、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞をＣＴＶ（Ｔｈｅｒｍｏより購入）を用いて標識した。細胞をＰＢＳに再懸濁し、細胞密度を４×１０６細胞／ｍｌにそれぞれ調製し、２つの細胞懸濁液を等しい割合で混合して、５０μｌ／ウェルで９６ウェルＵ底プレート（Ｔｈｅｒｍｏより購入）に添加し、同時にＰＢＳで最終濃度ｌ００ｎＭから３倍に勾配希釈し、合計１２点を得た二重特異性抗体または対照抗体を５０μｌ／ウェルで添加し、３７℃で２時間インキュベートし、検出はＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ）フローサイトメーターで行い、二重陽性細胞の比率を算出した。
【0218】
その結果を図４Ａに示した。二重特異性抗体は、同時にヒト４－１ＢＢ過剰発現ＣＨＯ細胞およびヒトＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＨＯ細胞に結合することができ、結合活性は二重特異性抗体の構造によって変化し、Ｂｉ－０８８、Ｂｉ－４００、およびＢｉ－４０１－０９１分子の結合活性は、対照抗体と同等かそれ以上であった。
【0219】
実施例５：二重特異性抗体タンパク質ベースの共結合アッセイ
ヒト４－１ＢＢタンパク質（ＡＣＲＯより購入）を説明書に従って溶解し、ＥＬＩＳＡコーティング溶液（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｎｇｏｎより購入）で１μｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレート上を１００μｌ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩静置し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、５％ＢＳＡ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｓａｎｇｏｎより購入）を２００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を廃棄し、二重特異性抗体または対照抗体を、１％ＢＳＡで最終濃度１００ｎＭから３倍に連続希釈して合計１２点を得、１００μｌ／ウェルで添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ＢＳＡで希釈したビオチン標識したＰＤ－Ｌ１タンパク質（Ｋａｃｔｕｓより購入）を１００μｌ／ウェルで添加し、希釈したタンパク質試料は１μｇ／ｍｌの濃度であり、インキュベートは室温で１時間行った。洗浄はＰＢＳＴで３回行い、１％ＢＳＡで希釈した（１：１００００）ＳＡ－ＨＲＰ（ａｂｃａｍより購入）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で０．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄を行い、ＥＬＩＳＡ発色溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏより購入）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で３分間反応させ、ＥＬＩＳＡ停止溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏより購入）を５０μｌ／ウェルで添加し、４５０ｎｍの吸光値を読み取った。
ヒト４－１ＢＢタンパク質（ＡＣＲＯより購入）を説明書に従って溶解し、ＥＬＩＳＡコーティング溶液（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｎｇｏｎより購入）で１μｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレート上を１００μｌ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩静置し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、５％ＢＳＡ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｓａｎｇｏｎより購入）を２００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を廃棄し、二重特異性抗体または対照抗体を、１％ＢＳＡで最終濃度１００ｎＭから３倍に連続希釈して合計１２点を得、１００μｌ／ウェルで添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ＢＳＡで希釈したビオチン標識したＰＤ－Ｌ１タンパク質（Ｋａｃｔｕｓより購入）を１００μｌ／ウェルで添加し、希釈したタンパク質試料は１μｇ／ｍｌの濃度であり、インキュベートは室温で１時間行った。洗浄はＰＢＳＴで３回行い、１％ＢＳＡで希釈した（１：１００００）ＳＡ－ＨＲＰ（ａｂｃａｍより購入）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で０．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄を行い、ＥＬＩＳＡ発色溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏより購入）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で３分間反応させ、ＥＬＩＳＡ停止溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏより購入）を５０μｌ／ウェルで添加し、４５０ｎｍの吸光値を読み取った。
【0220】
その結果を図４Ｂに示した。二重特異性抗体は、ヒト４－１ＢＢおよびヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に同時に結合でき、結合活性は、分子構造に応じて変化した。中でも、Ｂｉ－０８８分子の結合活性は、対照抗体と同等かそれ以上であった。
【0221】
実施例６：二重特異性抗体活性の検出（ルシフェラーゼレポーター細胞ベースアッセイ）
ヒト４－１ＢＢをコードするプラスミドとＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａより購入）をＪｕｒｋａｔ細胞に共トランスフェクションし、ｈｕ４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦ－κＢ細胞を得た。ｈｕ４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦ－κＢ細胞を拡大培養に供し、その細胞を１６４０完全培地に再懸濁し、４×１０６細胞／ｍｌとした。ヒトＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、およびヒトＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＴ－２６細胞を１６４０完全培地で４×１０５細胞／ｍｌに希釈した。上記３種類の細胞懸濁液を個別にｈｕ４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦ－κＢ細胞と１：１の比率で混合し、５０μｌ／ウェルで滅菌９６ウェル白色底プレート（Ｎｕｎｃより購入）に添加し、最終的な試料濃度２００ｎＭから１６４０完全培地で３倍に連続希釈し、合計１２点を得た二重特異性抗体試料を添加した。インキュベートは、３７℃、５％ＣＯ２で１６時間行い、ルシフェラーゼのシグナルを検出した。
ヒト４－１ＢＢをコードするプラスミドとＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａより購入）をＪｕｒｋａｔ細胞に共トランスフェクションし、ｈｕ４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦ－κＢ細胞を得た。ｈｕ４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦ－κＢ細胞を拡大培養に供し、その細胞を１６４０完全培地に再懸濁し、４×１０６細胞／ｍｌとした。ヒトＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、およびヒトＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＴ－２６細胞を１６４０完全培地で４×１０５細胞／ｍｌに希釈した。上記３種類の細胞懸濁液を個別にｈｕ４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦ－κＢ細胞と１：１の比率で混合し、５０μｌ／ウェルで滅菌９６ウェル白色底プレート（Ｎｕｎｃより購入）に添加し、最終的な試料濃度２００ｎＭから１６４０完全培地で３倍に連続希釈し、合計１２点を得た二重特異性抗体試料を添加した。インキュベートは、３７℃、５％ＣＯ２で１６時間行い、ルシフェラーゼのシグナルを検出した。
【0222】
結果を図５Ａ、図５Ｂ、および図５Ｃに示す。明らかなシグナルの活性化は、ｈｕ４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦ－κＢ細胞およびＣＨＯ－Ｓ細胞の共インキュベート系の二重特異性抗体試料では観察されなかった。ｈｕ４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦ－κＢ細胞とヒトＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＨＯ－Ｓ細胞またはヒトＰＤ－Ｌ１過剰発現させたＣＴ－２６細胞との共インキュベート系において有意なシグナル活性化活性が観察された。これは、ＰＤ－Ｌ１によって引き起こされる架橋効果によるものであり、これによりＪｕｒｋａｔ細胞上の４－１ＢＢが共にクラスター化した抗体の他端に結合し、それによって下流のＮＦ－κＢ経路が活性化された。このことから二重特異性抗体は、ヒト体内で、ＰＤ－Ｌ１架橋効果下でヒトＴ細胞のＮＦ－κＢ経路を活性化し、Ｔ細胞をさらに活性化し、腫瘍を死滅させることができることが示されている。中でも、Ｂｉ－０８８、Ｂｉ－４００、およびＢｉ－４０１－０９１の活性化活性は対照抗体と同等かそれ以上であった。
【0223】
実施例７：二重特異性抗体活性の検出（初代Ｔ細胞活性化アッセイ）
ヒトＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＨＯ－ＳまたはＣＨＯ細胞をマイトマイシンにより４時間処理し、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地で細胞密度が２×１０６細胞／ｍｌとなるように調整した。ＯＫＴ－３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄより購入）を滅菌ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し（Ｈｙｃｌｏｎｅより購入）、９６ウェル細胞培養平底プレート（Ｔｈｅｒｍｏより購入）に１００μｌ／ウェルでコーティングし、３７℃で２時間インキュベートした。凍結ヒトＰＢＭＣ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｉｌｉより購入）を蘇生させ、ヒトＴ細胞単離精製キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌより購入）により単離してＴ細胞を得、Ｔ細胞をＸ－ＶＩＶＯ１５培地（ＬＯＮＺＡより購入）を用いて再懸濁し、細胞密度を２×１０６細胞／ｍｌになるように調整し、マイトマイシン処理したＣＨＯ－Ｓ細胞またはヒトＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＨＯ細胞と等しい割合で混合した。抗体のコーティングが完了した後、コーティング溶液を廃棄し、洗浄をＰＢＳで２回行い、ＰＢＳを廃棄し、上記細胞混合溶液を、１００μｌ／ウェルで添加し、同時にＸ－ＶＩＶＯ１５で連続希釈した二重特異性抗体試料を１００μｌ／ウェルで添加し、試料最終濃度または組合せ群にＨＺ－Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－１－ＩｇＧ１Ｆｃ（ＬＡＬＡ）＋Ｃ－Ｙｅ－１８－５－ＩｇＧ１Ｆｃ（ＬＡＬＡ）を添加し、最終濃度は５０、１０、２ｎＭであった。インキュベートは３７℃、５％ＣＯ２で３日間行い、上清を回収し、ＩＬ－２含有量を検出した。
ヒトＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＨＯ－ＳまたはＣＨＯ細胞をマイトマイシンにより４時間処理し、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地で細胞密度が２×１０６細胞／ｍｌとなるように調整した。ＯＫＴ－３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄより購入）を滅菌ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し（Ｈｙｃｌｏｎｅより購入）、９６ウェル細胞培養平底プレート（Ｔｈｅｒｍｏより購入）に１００μｌ／ウェルでコーティングし、３７℃で２時間インキュベートした。凍結ヒトＰＢＭＣ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｉｌｉより購入）を蘇生させ、ヒトＴ細胞単離精製キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌより購入）により単離してＴ細胞を得、Ｔ細胞をＸ－ＶＩＶＯ１５培地（ＬＯＮＺＡより購入）を用いて再懸濁し、細胞密度を２×１０６細胞／ｍｌになるように調整し、マイトマイシン処理したＣＨＯ－Ｓ細胞またはヒトＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＨＯ細胞と等しい割合で混合した。抗体のコーティングが完了した後、コーティング溶液を廃棄し、洗浄をＰＢＳで２回行い、ＰＢＳを廃棄し、上記細胞混合溶液を、１００μｌ／ウェルで添加し、同時にＸ－ＶＩＶＯ１５で連続希釈した二重特異性抗体試料を１００μｌ／ウェルで添加し、試料最終濃度または組合せ群にＨＺ－Ｌ－Ｙｒ－１３＆１４－１６－１－ＩｇＧ１Ｆｃ（ＬＡＬＡ）＋Ｃ－Ｙｅ－１８－５－ＩｇＧ１Ｆｃ（ＬＡＬＡ）を添加し、最終濃度は５０、１０、２ｎＭであった。インキュベートは３７℃、５％ＣＯ２で３日間行い、上清を回収し、ＩＬ－２含有量を検出した。
【0224】
実験結果は図６Ａおよび図６Ｂに示した。Ｔ細胞とＣＨＯ－Ｓ細胞の共インキュベート系における二重特異性抗体試料については、明らかなシグナル活性化はなかったが、Ｔ細胞とヒトＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＨＯ－Ｓ細胞との共インキュベート系では、有意なＴ細胞の活性化およびＩＬ－２放出が見られ、ここで、Ｂｉ－０８８、Ｂｉ－４００、およびＢｉ－４０１－０９１分子の活性は、対照抗体と同等かそれ以上であった。
【0225】
実施例８：混合リンパ球反応アッセイにおける二重特異性抗体の活性
ＰＢＭＣ（ＳＡＩＬＹ ＢＩＯより購入、ＳＬＢ－ＨＰＢ）を蘇生させ、遠心分離し、ＰＢＭＣを、１０ｍｌのＸ－ＶＩＶＯ－１５培地（ＬＯＮＺＡより購入）で再懸濁し、３７℃の細胞培養インキュベーターで２時間培養し、接着細胞を吸引により除去した。ＤＣ培地１０ｍｌを添加し：１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄより購入）および２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４（Ｒ＆Ｄより購入）をＸ－ＶＩＶＯ－１５培地に添加し、３日間培養し、ＤＣ培地５ｍｌを補充し、６日目まで培養を続け、ＤＣ成熟培地を添加し、２日間培養し、ここで、ＤＣ成熟培地を１０００Ｕ／ｍｌ ＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄより購入）、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６（Ｒ＆Ｄより購入）、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１β（Ｒ＆Ｄより購入）、および１μＭ ＰＧＥ２（Ｔｏｃｒｉｓより購入）をＸ－ＶＩＶＯ－１５培地に添加することにより調製した。成熟ＤＣ細胞を回収し、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５培地を用いて、細胞密度が２×１０５細胞／ｍｌになるように調整した。
ＰＢＭＣ（ＳＡＩＬＹ ＢＩＯより購入、ＳＬＢ－ＨＰＢ）を蘇生させ、遠心分離し、ＰＢＭＣを、１０ｍｌのＸ－ＶＩＶＯ－１５培地（ＬＯＮＺＡより購入）で再懸濁し、３７℃の細胞培養インキュベーターで２時間培養し、接着細胞を吸引により除去した。ＤＣ培地１０ｍｌを添加し：１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄより購入）および２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４（Ｒ＆Ｄより購入）をＸ－ＶＩＶＯ－１５培地に添加し、３日間培養し、ＤＣ培地５ｍｌを補充し、６日目まで培養を続け、ＤＣ成熟培地を添加し、２日間培養し、ここで、ＤＣ成熟培地を１０００Ｕ／ｍｌ ＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄより購入）、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６（Ｒ＆Ｄより購入）、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１β（Ｒ＆Ｄより購入）、および１μＭ ＰＧＥ２（Ｔｏｃｒｉｓより購入）をＸ－ＶＩＶＯ－１５培地に添加することにより調製した。成熟ＤＣ細胞を回収し、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５培地を用いて、細胞密度が２×１０５細胞／ｍｌになるように調整した。
【0226】
他のドナー由来のＰＢＭＣ（ＳＡＩＬＹ ＢＩＯより購入、ＳＬＢ－ＨＰＢ）を蘇生させ、遠心分離し、ＰＢＭＣをＸ－ＶＩＶＯ－１５培地１０ｍｌで再懸濁した。Ｔ細胞をＴ細胞ソーティングキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌより購入）で濃縮し、Ｔ細胞をＸ－ＶＩＶＯ－１５で再懸濁し、細胞密度が２×ｌ０６細胞／ｍｌになるように調整し、上記で回収した成熟ＤＣ細胞と１：１の比率で混合し、９６ウェルＵ底プレートに１００μｌ／ウェルで添加した。同時に、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５培地で希釈した二重特異性抗体試料を１００μｌ／ウェルで添加し、これは１０、２、０．４、０．０８、０．０１６ｎＭの最終濃度を有し、培養を３日間行い、上清を回収し、ＩＬ－２発現レベルをＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅより購入）によって検出した。
【0227】
実験結果を図７に示す。二重特異性抗体試料は、混合リンパ球反応系でＴ細胞を活性化させてＩＬ－２を放出させることができ、Ｂｉ－０８８およびＢｉ－４００の活性化レベルは対照抗体と同程度であった。
【0228】
実施例９：マウスにおける二重特異性抗体の半減期
実験にはＢａｌｂ／ｃマウスを、雄と雌が半々、各採血点で６匹ずつを、１２／１２時間明暗調整、温度２４±２℃、湿度４０％～７０％、水と食事に自由にアクセスできる状態で使用した。実験当日は、二重特異性抗体分子Ｂｉ－０８８をＢａｌｂ／ｃマウスの尾静脈に１回注射し、その注射用量は１０ｍｇ／ｋｇであった。
実験にはＢａｌｂ／ｃマウスを、雄と雌が半々、各採血点で６匹ずつを、１２／１２時間明暗調整、温度２４±２℃、湿度４０％～７０％、水と食事に自由にアクセスできる状態で使用した。実験当日は、二重特異性抗体分子Ｂｉ－０８８をＢａｌｂ／ｃマウスの尾静脈に１回注射し、その注射用量は１０ｍｇ／ｋｇであった。
【0229】
採血時点：投与後５分、０．５時間、２時間、６時間、２４時間、４８時間、９６時間、１６８時間、３３６時間、および５０４時間であり、血液はマウス眼窩から採取した。全血試料を２～８℃で３０分静置し、１２，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して血清を回収し、その後、血清を２～８℃、１２，０００ｒｐｍ、５分間で遠心分離し、－８０℃で保存し、血清中の二重特異性抗体分子の含有量をＥＬＩＳＡによって検出し、その平均値を算出した。結果は図８に示し、マウスにおける本発明の二重特異性抗体分子の半減期は、約１７４時間であった。
【0230】
実施例１０：マウスにおける二重特異性抗体の医薬効果
本実験では、ヒトＰＤ－Ｌ１発現マウス結腸直腸がんＣＴ－２６細胞（ｈ－ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ ＣＴ－２６）を、ヒト４－１ＢＢ／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１トランスジェニックマウス（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈより購入）に移植し、二重特異性抗体の抗腫瘍効果を決定した。まず、ｈ－ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ ＣＴ－２６腫瘍保有マウスモデルを皮下接種により確立し、各マウスに０．６×１０６個の細胞を接種し、グループ分けを、平均腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３に達した時に、マウスを各群６匹になるように行った。処理は、異なる用量の異なる抗体を腹腔内注射することによって実施し、各群のマウスの腫瘍体積および体重の変化を２～３日に１回の頻度でモニターし、２～３週間モニタリングを継続した。投与用量およびモデルは表１に示す通りである。
本実験では、ヒトＰＤ－Ｌ１発現マウス結腸直腸がんＣＴ－２６細胞（ｈ－ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ ＣＴ－２６）を、ヒト４－１ＢＢ／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１トランスジェニックマウス（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈより購入）に移植し、二重特異性抗体の抗腫瘍効果を決定した。まず、ｈ－ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ ＣＴ－２６腫瘍保有マウスモデルを皮下接種により確立し、各マウスに０．６×１０６個の細胞を接種し、グループ分けを、平均腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３に達した時に、マウスを各群６匹になるように行った。処理は、異なる用量の異なる抗体を腹腔内注射することによって実施し、各群のマウスの腫瘍体積および体重の変化を２～３日に１回の頻度でモニターし、２～３週間モニタリングを継続した。投与用量およびモデルは表１に示す通りである。
【0231】
【表3】
【0232】
結果を図９に示した。
結果から、二重特異性抗体はｈ－ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ ＣＴ－２６細胞の増殖を有意に阻害でき、阻害活性は、組合せ薬剤群よりも優れており、Ｂｉ－０８８の阻害活性は対照抗体ＩＮＢＲＸ－１０５－１Ｂと同等かそれ以上であったことが示された。
結果から、二重特異性抗体はｈ－ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ ＣＴ－２６細胞の増殖を有意に阻害でき、阻害活性は、組合せ薬剤群よりも優れており、Ｂｉ－０８８の阻害活性は対照抗体ＩＮＢＲＸ－１０５－１Ｂと同等かそれ以上であったことが示された。
【0233】
実施例１１：ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＭＣ－３８細胞を移植したヒトＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢダブルトランスジェニックマウスの薬理学的モデル
本実験では、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ－３８細胞（ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＭＣ－３８）を使用し、ヒトＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢトランスジェニックマウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より購入）におけるＢｉ－０８８の抗腫瘍効果を決定した。まず、ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＭＣ－３８腫瘍保有マウスモデルは皮下接種によって確立し、各マウスは１×１０６個の細胞を接種され、グループ分けは、平均腫瘍体積が８０～１２０ｍｍ３に達した時点で行った。各群６匹のマウスを異なる用量の異なる抗体で腹腔内注射によって処理し、用量および投与方法は下記表２に示した。マウス腫瘍が完全に退縮した後、新たにｈｕＰＤ－Ｌ１ ＭＣ－３８細胞をマウスの反対側に接種し、各群のマウスの腫瘍体積および体重の変化をモニターした。モニタリング頻度は２～３日に１回、計８週間であった。
本実験では、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ－３８細胞（ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＭＣ－３８）を使用し、ヒトＰＤ－Ｌ１／４－１ＢＢトランスジェニックマウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より購入）におけるＢｉ－０８８の抗腫瘍効果を決定した。まず、ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＭＣ－３８腫瘍保有マウスモデルは皮下接種によって確立し、各マウスは１×１０６個の細胞を接種され、グループ分けは、平均腫瘍体積が８０～１２０ｍｍ３に達した時点で行った。各群６匹のマウスを異なる用量の異なる抗体で腹腔内注射によって処理し、用量および投与方法は下記表２に示した。マウス腫瘍が完全に退縮した後、新たにｈｕＰＤ－Ｌ１ ＭＣ－３８細胞をマウスの反対側に接種し、各群のマウスの腫瘍体積および体重の変化をモニターした。モニタリング頻度は２～３日に１回、計８週間であった。
【0234】
【表4】
【0235】
【0236】
その結果、ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＭＣ－３８細胞を接種した後、陰性対照群の腫瘍体積は増加し続け、Ｂｉ－０８８群の６匹のマウスの腫瘍は処理後に完全に退縮し、最終投与から３１日後には、ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＭＣ－３８細胞を反対側で再度接種しても、腫瘍細胞はあまり増殖しなかった。
【0237】
実施例１２：ヒト４－１ＢＢトランスジェニックマウスにおける肝毒性試験
本実験では、Ｂｉ－０８８の肝毒性を、ヒト４－１ＢＢトランスジェニックマウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より購入）、各群４匹において決定した。Ｂｉ－０８８分子および対照分子を以下、表４に示す方法で腹腔内投与した。初回投与から２０日目に、マウスを安楽死させて肝臓組織を採取し、包埋および固定、切片化、ＨＥ染色、およびＣＤ８陽性細胞染色を行った。
本実験では、Ｂｉ－０８８の肝毒性を、ヒト４－１ＢＢトランスジェニックマウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より購入）、各群４匹において決定した。Ｂｉ－０８８分子および対照分子を以下、表４に示す方法で腹腔内投与した。初回投与から２０日目に、マウスを安楽死させて肝臓組織を採取し、包埋および固定、切片化、ＨＥ染色、およびＣＤ８陽性細胞染色を行った。
【0238】
【表6】
【0239】
結果を図１１および図１２に示した。
結果から、ウレルマブ群のマウスでは、肝臓において明らかな単核細胞の浸潤およびＣＤ８陽性染色細胞が見られ、ＩＮＢＲＸ－１０５－１Ｂ群では一部のマウスにおいて、肝臓における明らかな単核細胞の浸潤およびＣＤ８陽性染色細胞が見られ、Ｂｉ－０８８群のマウスはマウスの肝臓において明らかな単核細胞の浸潤、およびＣＤ８陽性染色細胞を示さなかった。
結果から、ウレルマブ群のマウスでは、肝臓において明らかな単核細胞の浸潤およびＣＤ８陽性染色細胞が見られ、ＩＮＢＲＸ－１０５－１Ｂ群では一部のマウスにおいて、肝臓における明らかな単核細胞の浸潤およびＣＤ８陽性染色細胞が見られ、Ｂｉ－０８８群のマウスはマウスの肝臓において明らかな単核細胞の浸潤、およびＣＤ８陽性染色細胞を示さなかった。
【0240】
本発明の特定の実施形態について詳細に説明したが、当技術分野の当業者であれば、開示された全ての教示に基づいて、様々な改変および置換がそれらの詳細について可能であり、その変更は全て、本発明の範囲内であることは理解するであろう。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によって示される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】