特表2023-541518植物の窒素利用率と収量を調節するタンパク質、及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-03
(54)【発明の名称】植物の窒素利用率と収量を調節するタンパク質、及びその使用
(51)【国際特許分類】
A01H 1/00 20060101AFI20230926BHJP
A01H 6/46 20180101ALI20230926BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20230926BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230926BHJP
C07K 14/415 20060101ALN20230926BHJP
【ＦＩ】
A01H1/00 A ZNA
A01H6/46
C12N15/29
C12N15/09 110
C07K14/415
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023507424
(86)(22)【出願日】2021-09-14
(85)【翻訳文提出日】2023-03-28
(86)【国際出願番号】 CN2021118140
(87)【国際公開番号】W WO2022057780
(87)【国際公開日】2022-03-24
(31)【優先権主張番号】202010965332.9
(32)【優先日】2020-09-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517264214
【氏名又は名称】中国科学院遺▲伝▼与▲発▼育生物学研究所
【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １ Ｗｅｓｔ Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１０１， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】儲成才
(72)【発明者】
【氏名】劉永強
(72)【発明者】
【氏名】胡斌
(72)【発明者】
【氏名】汪鴻儒
【テーマコード（参考）】
2B030
4H045
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB03
2B030AD07
2B030AD20
2B030CA17
2B030CA24
2B030CB02
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA31
4H045EA05
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、植物の窒素利用率と収量を調節するタンパク質、及びその使用を提供するものである。トランスジェニック技術及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術により、それぞれｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネ及びイネのＯｓＴＣＰ１９突然変異体を得る。結果から判明したように、ｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネは、野生型イネと比べて、分蘖数が減少し、窒素応答性が低下したが、イネのＯｓＴＣＰ１９突然変異体は、野生型イネと比べて、分蘖数が増加した。このことから分かるように、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質が植物の収量及び窒素利用率を調節する機能を担っている。これにより、高収量・高窒素利用率の品種の育成の基礎となる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＯｓＴＣＰ１９タンパク質の、植物の分蘖及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性に対する調節における使用であって、前記ＯｓＴＣＰ１９タンパク質は、以下のＡ１）又はＡ２）又はＡ３）又はＡ４）のいずれか一つで示されるタンパク質：
Ａ１）配列表における配列３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
Ａ２）配列表における配列３に示されるタンパク質のＮ末端又は／及びＣ末端にタグを結合して得られた融合タンパク質、
Ａ３）配列表における配列３に示されるアミノ酸配列が１つ又は複数のアミノ酸残基で置換及び／又は欠失及び／又は付加されるとともに、同一の機能を有するタンパク質、
Ａ４）Ａ１）～Ａ３）のいずれか一つに規定されるアミノ酸配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上又は８０％以上の相同性を有するとともに、同一の機能を有するタンパク質
である、使用。
【請求項2】
前記植物は、Ｍ１）単子葉植物又は双子葉植物、又は
Ｍ２）イネ科の植物、又は
Ｍ３）イネ
であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
ＯｓＴＣＰ１９タンパク質に関連する生体材料の、下記Ｂ１）～Ｂ４）のいずれか一つ：Ｂ１）植物の分蘖及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性を調節すること、
Ｂ２）分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を示すトランスジェニック植物を育成すること、
Ｂ３）分蘖数の減少及び／又は収量の減少及び／又は品質の低下及び／又は窒素利用率の低下及び／又は窒素反応性の低下を示すトランスジェニック植物を育成すること、
Ｂ４）植物育種、
における使用であって、
ＯｓＴＣＰ１９タンパク質に関連する前記生体材料は、以下のＣ１）～Ｃ８）のいずれか一つ：
Ｃ１） ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする核酸分子、
Ｃ２） Ｃ１）に係る核酸分子を含む発現カセット、
Ｃ３） Ｃ１）に係る核酸分子を含む組換えベクター、
Ｃ４） Ｃ２）に係る発現カセットを含む組換えベクター、
Ｃ５） Ｃ１）に係る核酸分子を含む組換え微生物、
Ｃ６） Ｃ２）に係る発現カセットを含む組換え微生物、
Ｃ７） Ｃ３）に係る組換えベクターを含む組換え微生物、
Ｃ８） Ｃ４）に係る組換えベクターを含む組換え微生物
であり、
前記ＯｓＴＣＰ１９タンパク質は、以下のＡ１）又はＡ２）又はＡ３）又はＡ４）のいずれか一つで示されるタンパク質：
Ａ１）配列表における配列３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
Ａ２）配列表における配列３に示されるタンパク質のＮ末端又は／及びＣ末端にタグを結合して得られた融合タンパク質、
Ａ３）配列表における配列３に示されるアミノ酸配列が１つ又は複数のアミノ酸残基で置換及び／又は欠失及び／又は付加されるとともに、同一の機能を有するタンパク質、
Ａ４）Ａ１）～Ａ３）のいずれか一つに規定されるアミノ酸配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上又は８０％以上の相同性を有するとともに、同一の機能を有するタンパク質
である、使用。
【請求項4】
Ｃ１）に係る核酸分子が、以下の１）又は２）又は３）又は４）又は５）に係るＤＮＡ分子：１） 配列表における配列１に示されるゲノムＤＮＡ分子、
２） 配列表における配列２に示されるｃＤＮＡ分子、
３） １）又は２）で規定されたＤＮＡ配列と９８％以上の相同性を有するとともに、植物の分蘖数及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性に関連するタンパク質をコードする、イネ由来のＤＮＡ分子、
４） ストリンジェントな条件下で１）又は２）で規定されたＤＮＡ配列とハイブリダイズするとともに、植物の分蘖数及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性に関連するタンパク質をコードするＤＮＡ分子、
５） １）又は２）で規定されたＤＮＡ配列と９０％以上の相同性を有するとともに、植物の分蘖数及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性に関連するタンパク質をコードするＤＮＡ分子
であることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項5】
前記植物は、Ｍ１）単子葉植物又は双子葉植物、又は
Ｍ２）イネ科の植物、又は
Ｍ３）イネ
であることを特徴とする、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項6】
Ｎ１） ＯｓＴＣＰ１９タンパク質活性を阻害する物質の、分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を示すトランスジェニック植物を育成することにおける使用、又はＮ２） ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害する物質、又はＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトする物質の、分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を示すトランスジェニック植物を育成することにおける使用
であって、
前記ＯｓＴＣＰ１９タンパク質は、以下のＡ１）又はＡ２）又はＡ３）又はＡ４）のいずれか一つで示されるタンパク質：
Ａ１）配列表における配列３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
Ａ２）配列表における配列３に示されるタンパク質のＮ末端又は／及びＣ末端にタグを結合して得られた融合タンパク質、
Ａ３）配列表における配列３に示されるアミノ酸配列が１つ又は複数のアミノ酸残基で置換及び／又は欠失及び／又は付加されるとともに、同一の機能を有するタンパク質、
Ａ４）Ａ１）～Ａ３）のいずれか一つに規定されるアミノ酸配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上又は８０％以上の相同性を有するとともに、同一の機能を有するタンパク質
である、使用。
【請求項7】
前記物質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムであり、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡを含み、前記ｓｇＲＮＡは、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子の配列又はその上流プロモーター配列又はその非コード領域の配列又はその下流調節領域の配列を標的とすることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項8】
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列４に示されるＤＮＡ分子及び配列５に示されるＤＮＡ分子であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項9】
前記植物は、Ｍ１）単子葉植物又は双子葉植物、又は
Ｍ２）イネ科の植物、又は
Ｍ３）イネ
であることを特徴とする、請求項６から８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項10】
以下のＤ１）又はＤ２）に係る、分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を示すトランスジェニック植物を育成する方法：Ｄ１）目的植物におけるＯｓＴＣＰ１９タンパク質の活性を阻害して、分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を示すトランスジェニック植物を得るステップを、含む方法、又は
Ｄ２）目的植物におけるＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害するか、目的植物におけるＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより、分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を示すトランスジェニック植物を得るステップを、含む方法
であって、
前記ＯｓＴＣＰ１９タンパク質は、以下のＡ１）又はＡ２）又はＡ３）又はＡ４）のいずれか一つで示されるタンパク質：
Ａ１）配列表における配列３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
Ａ２）配列表における配列３に示されるタンパク質のＮ末端又は／及びＣ末端にタグを結合して得られた融合タンパク質、
Ａ３）配列表における配列３に示されるアミノ酸配列が１つ又は複数のアミノ酸残基で置換及び／又は欠失及び／又は付加されるとともに、同一の機能を有するタンパク質、
Ａ４）Ａ１）～Ａ３）のいずれか一つに規定されるアミノ酸配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上又は８０％以上の相同性を有するとともに、同一の機能を有するタンパク質
である、方法。
【請求項11】
目的植物におけるＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトする方法は、目的植物にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入するステップを含み、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡを含み、前記ｓｇＲＮＡは、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子の配列又はその上流プロモーター配列又はその非コード領域の配列又はその下流調節領域の配列を標的とすることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列４に示されるＤＮＡ分子及び配列５に示されるＤＮＡ分子であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記植物は、Ｍ１）単子葉植物又は双子葉植物、又は
Ｍ２）イネ科の植物、又は
Ｍ３）イネ
であることを特徴とする、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
目的植物におけるＯｓＴＣＰ１９タンパク質の活性及び／又は含量を増加させて、分蘖数の減少及び／又は収量の減少及び／又は品質の低下及び／又は窒素利用率の低下及び／又は窒素反応性の低下を示すトランスジェニック植物を得るステップを含む、分蘖数の減少及び／又は収量の減少及び／又は品質の低下及び／又は窒素利用率の低下及び／又は窒素反応性の低下を示すトランスジェニック植物を育成する方法であって、前記ＯｓＴＣＰ１９タンパク質は、以下のＡ１）又はＡ２）又はＡ３）又はＡ４）のいずれか一つで示されるタンパク質：
Ａ１）配列表における配列３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
Ａ２）配列表における配列３に示されるタンパク質のＮ末端又は／及びＣ末端にタグを結合して得られた融合タンパク質、
Ａ３）配列表における配列３に示されるアミノ酸配列が１つ又は複数のアミノ酸残基で置換及び／又は欠失及び／又は付加されるとともに、同一の機能を有するタンパク質、
Ａ４）Ａ１）～Ａ３）のいずれか一つに規定されるアミノ酸配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上又は８０％以上の相同性を有するとともに、同一の機能を有するタンパク質
である、方法。
【請求項15】
前記植物は、Ｍ１）単子葉植物又は双子葉植物、又は
Ｍ２）イネ科の植物、又は
Ｍ３）イネ
であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
請求項１０から１３のいずれか１項に記載の方法により調製されたトランスジェニック植物。
【請求項17】
請求項１４又は１５に記載の方法により調製されたトランスジェニック植物。
【請求項18】
Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムであって、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列４に示されるＤＮＡ分子及び配列５に示されるＤＮＡ分子であることを特徴とする、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム。
【請求項19】
請求項１８に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの、分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を示すトランスジェニック植物を育成すること、又は植物育種における使用。
【請求項20】
前記植物は、Ｍ１）単子葉植物又は双子葉植物、又は
Ｍ２）イネ科の植物、又は
Ｍ３）イネ
であることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジー分野に属し、具体的には、植物の窒素の利用率と収量を調節するタンパク質及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
窒素は、植物が最も必要とする無機栄養素である。農業生産では、窒素肥料を主とする化学肥料の継続的な投入により、食糧生産量の大幅な増加がもたらされた。しかし、窒素肥料の過剰な施用により、作物が吸収・利用しなかった大量の窒素肥料が大気や水域に流入したり、土壌に残留したりすることで、大気汚染や地表水の富栄養化、土壌の酸性化などを引き起こし、深刻な環境破壊を引き起こした。また、世界人口の継続的な増加に伴い、食糧に対する需要は今後も増加し続けるので、農業を持続的に発展させるために、「肥料の減少及び効率の増加」という育種目標を達成し、農作物の窒素利用率（ｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｕｓｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ、ＮＵＥ）を向上させることが重要である。イネは、世界で広く栽培されている主食作物であり、その窒素肥料の施用量は、他の作物を大きく上回っているため、イネのＮＵＥ関連遺伝子を同定し利用することは農業生産にとって非常に重要である。
【0003】
ＮＵＥは、多種多様な遺伝的要因と環境要因の組み合わせによって影響を受け、窒素の吸収、転流、同化、再利用、後続の成長発育の過程などに関する複雑な農業形質であり、単一の指標を用いてその表現型を同定することが困難である。このことから、伝統的な遺伝学的手法では関連する機能遺伝子のクローニングや同定が困難であり、窒素利用効率の高い育種の発展には大きな制約があった。
【0004】
ＮＵＥは一定量の窒素を施用した作物の単位面積あたりの収量と定義することができ、イネの収量は分蘖数、穂粒数及び千粒重という三つの要因により決まることから、これらの収量要因の窒素応答性（低窒素（ＬＮ）から高窒素（ＨＮ）までの増加比率、即ち、（ＨＮ－ＬＮ）／ＬＮと解釈できる）をＮＵＥの相対的表現型値として用い、ＮＵＥに関連する遺伝子サイトのクローニングを行うことは、より実用的な価値を具備していると考えられる。
【発明の概要】
【0005】
本発明の第１の目的は、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質の新規用途を提供することである。
【0006】
本発明は、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質の、植物の分蘖及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性に対する調節における使用を提供する。
【0007】
前記ＯｓＴＣＰ１９タンパク質は、以下のＡ１）又はＡ２）又はＡ３）又はＡ４）のいずれか一つで示されるタンパク質：
Ａ１）配列表における配列３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
Ａ２）配列表における配列３に示されるタンパク質のＮ末端又は／及びＣ末端にタグを結合して得られた融合タンパク質、
Ａ３）配列表における配列３に示されるアミノ酸配列が１つ又は複数のアミノ酸残基で置換及び／又は欠失及び／又は付加されるとともに、同一の機能を有するタンパク質、
Ａ４）Ａ１）～Ａ３）のいずれか一つに規定されるアミノ酸配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上又は８０％以上の相同性を有するとともに、同一の機能を有するタンパク質
である。
Ａ１）配列表における配列３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
Ａ２）配列表における配列３に示されるタンパク質のＮ末端又は／及びＣ末端にタグを結合して得られた融合タンパク質、
Ａ３）配列表における配列３に示されるアミノ酸配列が１つ又は複数のアミノ酸残基で置換及び／又は欠失及び／又は付加されるとともに、同一の機能を有するタンパク質、
Ａ４）Ａ１）～Ａ３）のいずれか一つに規定されるアミノ酸配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上又は８０％以上の相同性を有するとともに、同一の機能を有するタンパク質
である。
【0008】
ここで、配列表における配列３は、３８７個のアミノ酸残基からなる。
【0009】
前記タグは、具体的に表１に示す。
【0010】
【0011】
上記Ａ１）～Ａ４）のいずれか一つに示されるタンパク質は、人工的に合成することもできるし、それらをコードする遺伝子をまず合成し、さらに、生物学的に発現させることにより得ることもできる。
【0012】
本発明の第２の目的は、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質に関連する生体材料の新規用途を提供することである。
【0013】
本発明は、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質に関連する生体材料の、下記Ｂ１）～Ｂ４）のいずれか一つ：
Ｂ１）植物の分蘖及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性を調節すること、
Ｂ２）分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を示すトランスジェニック植物を育成すること、
Ｂ３）分蘖数の減少及び／又は収量の減少及び／又は品質の低下及び／又は窒素利用率の低下及び／又は窒素反応性の低下を示すトランスジェニック植物を育成すること、
Ｂ４）植物育種；
における使用を提供し、
ここで、前記ＯｓＴＣＰ１９タンパク質に関連する前記生体材料は、以下のＣ１）～Ｃ８）のいずれか一つ：
Ｃ１） ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする核酸分子、
Ｃ２） Ｃ１）に係る核酸分子を含む発現カセット、
Ｃ３） Ｃ１）に係る核酸分子を含む組換えベクター、
Ｃ４） Ｃ２）に係る発現カセットを含む組換えベクター、
Ｃ５） Ｃ１）に係る核酸分子を含む組換え微生物、
Ｃ６） Ｃ２）に係る発現カセットを含む組換え微生物、
Ｃ７） Ｃ３）に係る組換えベクターを含む組換え微生物、
Ｃ８） Ｃ４）に係る組換えベクターを含む組換え微生物
である。
Ｂ１）植物の分蘖及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性を調節すること、
Ｂ２）分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を示すトランスジェニック植物を育成すること、
Ｂ３）分蘖数の減少及び／又は収量の減少及び／又は品質の低下及び／又は窒素利用率の低下及び／又は窒素反応性の低下を示すトランスジェニック植物を育成すること、
Ｂ４）植物育種；
における使用を提供し、
ここで、前記ＯｓＴＣＰ１９タンパク質に関連する前記生体材料は、以下のＣ１）～Ｃ８）のいずれか一つ：
Ｃ１） ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする核酸分子、
Ｃ２） Ｃ１）に係る核酸分子を含む発現カセット、
Ｃ３） Ｃ１）に係る核酸分子を含む組換えベクター、
Ｃ４） Ｃ２）に係る発現カセットを含む組換えベクター、
Ｃ５） Ｃ１）に係る核酸分子を含む組換え微生物、
Ｃ６） Ｃ２）に係る発現カセットを含む組換え微生物、
Ｃ７） Ｃ３）に係る組換えベクターを含む組換え微生物、
Ｃ８） Ｃ４）に係る組換えベクターを含む組換え微生物
である。
【0014】
前記使用において、Ｃ１）に係る核酸分子が、以下の１）又は２）又は３）又は４）又は５）に係るＤＮＡ分子：
１） 配列表における配列１に示されるゲノムＤＮＡ分子、
２） 配列表における配列２に示されるｃＤＮＡ分子、
３） １）又は２）で規定されたＤＮＡ配列と９８％以上の相同性を有するとともに、植物の分蘖数及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性に関連するタンパク質をコードする、イネ由来のＤＮＡ分子、
４） ストリンジェントな条件下で、１）又は２）で規定されたＤＮＡ配列とハイブリダイズするとともに、植物の分蘖数及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性に関連するタンパク質をコードするＤＮＡ分子、
５） １）又は２）で規定されたＤＮＡ配列と９０％以上の相同性を有するとともに、植物の分蘖数及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性に関連するタンパク質をコードするＤＮＡ分子
である。
１） 配列表における配列１に示されるゲノムＤＮＡ分子、
２） 配列表における配列２に示されるｃＤＮＡ分子、
３） １）又は２）で規定されたＤＮＡ配列と９８％以上の相同性を有するとともに、植物の分蘖数及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性に関連するタンパク質をコードする、イネ由来のＤＮＡ分子、
４） ストリンジェントな条件下で、１）又は２）で規定されたＤＮＡ配列とハイブリダイズするとともに、植物の分蘖数及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性に関連するタンパク質をコードするＤＮＡ分子、
５） １）又は２）で規定されたＤＮＡ配列と９０％以上の相同性を有するとともに、植物の分蘖数及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性に関連するタンパク質をコードするＤＮＡ分子
である。
【0015】
当業者であれば、定向進化及び点突然変異などの公知の方法によって、本発明に係るＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を容易に突然変異させることが可能である。ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードするヌクレオチド配列と７５％以上の相同性を有している、人工的に修飾されたヌクレオチドは、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードし、且つ同一の機能を有するヌクレオチドであれば、いずれも、本発明に係るヌクレオチド配列から誘導されるとともに本発明と同等である配列である。
【0016】
ここで使用される「相同性」という用語は、天然の核酸配列との配列類似性を意味する。「相同性」には、本発明の、配列３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列と７５％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列が含まれる。相同性の評価は、肉眼又はコンピュータソフトウェアで行うことができる。コンピュータソフトウェアを用いる場合、２つ以上の配列間の相同性をパーセンテージ（％）で表示することができ、関連配列間の相同性を評価するのに利用できる。
【0017】
前記９０％以上の相同性は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の相同性であってもよい。
【0018】
前記使用において、ストリンジェントな条件では、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの溶液中で、６８℃でハイブリダイゼーションと膜の洗浄を２回、毎回５分間ずつ行い、さらに、０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの溶液中で、６８℃でハイブリダイゼーションと膜の洗浄を２回、毎回１５分間ずつ行い；又は、０．１ｘＳＳＰＥ（又は０．１ｘＳＳＣ）、０．１％ＳＤＳの溶液中で、６５℃でハイブリダイゼーションと膜の洗浄を行う。
【0019】
上記使用において、前記ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、又はウイルスベクターであってもよい。
【0020】
前記組換えベクターは、前記核酸分子を発現ベクターに挿入することにより、前記タンパク質を発現する組換えベクターが得られる。前記核酸分子を用いて組換えベクターを構築する場合は、それが開始ヌクレオチドを転写する前に、増強型、組成型、組織特異型又は誘導型プロモーターのいずれかを付加してもよく、これらは単独で用いてもよく、又は、他の植物プロモーターと組み合わせて用いてもよい。さらに、前記核酸分子を用いて組換え発現ベクターを構築する場合は、翻訳エンハンサー又は転写エンハンサーなどのエンハンサーを用いてよく、これらのエンハンサー領域は、ＡＴＧ開始コドン、又は隣接領域開始コドンなどであってもよいが、配列全体を正しく翻訳するように、コード配列の読み枠と同一であることが必要となる。前記翻訳制御シグナル及び開始コドンのソースは幅広く、天然であってもよく、合成であってもよい。翻訳開始領域は、転写開始領域又は構造遺伝子に由来することができる。トランスジェニック植物の細胞又は植物の同定及びスクリーニングを容易にするために、使用される植物発現ベクターを加工することができる。例えば、前記植物発現ベクターに、植物内で発現できる、色の変化を生じる酵素又は発光化合物をコードする遺伝子（ＧＵＳ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など）、薬剤耐性を有する抗生物質マーカー（ゲンタマイシンマーカー、カナマイシンマーカーなど）、又は化学試薬耐性マーカー遺伝子（除草剤耐性遺伝子など）などを添加してもよい。トランスジェニック植物の安全性のために、いかなる選択的マーカー遺伝子を付加することなく、そのまま、逆境で植株をスクリーニングして形質転換させることができる。本発明の具体的な実施形態において、前記組換えベクターは、ｇＯｓＴＣＰ１９である。前記ｇＯｓＴＣＰ１９は、ベクターｐＣＡＭＢＩＡ２３００－ｏｃｓのＢａｍＨＩ酵素切断部位及びＨｉｎｄＩＩＩ酵素切断部位の間に、配列１に示されるＤＮＡフラグメントを挿入して得られた組換えベクターである。
【0021】
前記使用における前記微生物は、酵母、細菌、藻類又は真菌であってよく、例えば、アグロバクテリウムであってもよい。前記組換え微生物は、上記組換えベクターを含む微生物である。本発明の具体的な実施形態において、前記組換え微生物は、上記組換えベクターを含むアグロバクテリウムＡＧＬ１である。
【0022】
上記使用において、前記植物収量の調節は、植物分蘖数の調節に具現化されており、前記植物窒素利用率の調節は、植物窒素応答性の調節に具現化されている。前記植物分蘖及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性の調節は、植物中のＯｓＴＣＰ１９タンパク質の含量及び／又は活性が減少した時に前記植物分蘖数及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性が増加したり、向上したりしたこと；前記植物中のＯｓＴＣＰ１９タンパク質の含量及び／又は活性が向上した時に前記植物分蘖数及び／又は収量及び／又は品質及び／又は窒素利用率及び／又は窒素応答性が減少したり、低下したりしたことに、具現化されている。
【0023】
本発明の第３の目的は、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質活性を阻害する物質、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害する物質、又はＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトする物質の新規使用を提供することである。
【0024】
本発明は、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質活性を阻害する物質、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害する物質、又はＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトする物質の、分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を示すトランスジェニック植物を育成することにおける使用を提供することである。
【0025】
さらに、前記物質がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムであり、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡを含み、前記ｓｇＲＮＡは、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子の配列又はその上流プロモーター配列又はその非コード領域の配列又はその下流調節領域の配列を標的とする。
【0026】
さらに、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、配列４に示されるＤＮＡ分子及び配列５に示されるＤＮＡ分子である。前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＯｓＴＣＰ１９ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトベクターである。前記ＯｓＴＣＰ１９ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトベクターは、それぞれ、ｓｇＲＮＡ１とｓｇＲＮＡ２と表記される２つのｓｇＲＮＡを含む。前記ｓｇＲＮＡ１の標的配列は、配列４に示すＤＮＡ分子であり、前記ｓｇＲＮＡ２の標的配列は、配列５に示されるＤＮＡ分子である。
【0027】
本発明の第４の目的は、分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を示すトランスジェニック植物を育成する方法を提供することである。
【0028】
本発明により提供される分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を示すトランスジェニック植物を育成する方法は、下記のＤ１）又はＤ２）である：
Ｄ１）目的植物におけるＯｓＴＣＰ１９タンパク質の活性を阻害して、分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を有するトランスジェニック植物を得るステップを含む方法、又は
Ｄ２）目的植物におけるＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害するか、目的植物におけるＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより、分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を示すトランスジェニック植物を得るステップを含む方法。
Ｄ１）目的植物におけるＯｓＴＣＰ１９タンパク質の活性を阻害して、分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を有するトランスジェニック植物を得るステップを含む方法、又は
Ｄ２）目的植物におけるＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害するか、目的植物におけるＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより、分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を示すトランスジェニック植物を得るステップを含む方法。
【0029】
さらに、前記目的植物におけるＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトする方法は、目的植物に前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを導入するステップを含む。
【0030】
よりさらに、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、前記ＯｓＴＣＰ１９ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトベクターである。
【0031】
本発明の第５の目的は、分蘖数の減少及び／又は収量の減少及び／又は品質の低下及び／又は窒素利用率の低下及び／又は窒素反応性の低下を示すトランスジェニック植物を育成する方法を提供することである。
【0032】
本発明により提供される分蘖数の減少及び／又は収量の減少及び／又は品質の低下及び／又は窒素利用率の低下及び／又は窒素反応性の低下を示すトランスジェニック植物を育成する方法は、目的植物におけるＯｓＴＣＰ１９タンパク質の活性及び／又は含量を増加させて、分蘖数の減少及び／又は収量の減少及び／又は品質の低下及び／又は窒素利用率の低下及び／又は窒素反応性の低下を示すトランスジェニック植物を得るステップを含む。
【0033】
さらに、前記窒素応答性の低下は、前記トランスジェニック植物の分蘖の窒素応答性が前記目的植物よりも低いことに、具体的に具現化されている。前記分蘖の窒素応答性の計算公式は、（高窒素処理群の分蘖数－低窒素処理群の分蘖数）／低窒素処理群の分蘖数の通りである。前記高窒素処理群は、１００ｍ２あたり、尿素１．５ｋｇを施肥し、前記低窒素処理群は、１００ｍ２あたり、尿素０．５ｋｇを施肥する。
【0034】
目的植物におけるＯｓＴＣＰ１９タンパク質の活性及び／又は含量を増加させる前記方法は、目的植物においてＯｓＴＣＰ１９タンパク質を過剰発現させることである。前記過剰発現の方法は、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子を目的植物に導入する方法である。
【0035】
よりさらに、前記ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子は、配列１に示されるＤＮＡ分子である。前記ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子は、前記組換えベクターｇＯｓＴＣＰ１９により目的植物に導入される。
【0036】
いずれか一つの前記方法により調製して得られたトランスジェニック植物も、本発明の権利範囲に含まれる。
【0037】
本発明の最後の目的は、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを提供することである。
【0038】
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの、分蘖数の増加及び／又は収量の増加及び／又は品質の向上及び／又は窒素利用率の向上及び／又は窒素反応性の向上を示すトランスジェニック植物を育成すること、又は植物育種における使用も、本発明の権利範囲に含まれる。
【0039】
いずれか一つの前記使用又は方法においても、前記植物は、単子葉植物であってもよく、双子葉植物であってもよい。さらに、前記単子葉植物は、イネ科の植物であってもよい。よりさらに、前記イネ科の植物は、具体的に、イネである（例えば、イネ品種である中花１１）である。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】ｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネと野生型イネの分蘖数である。ａは、ｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネと野生型イネの表現型である。ｂは、ｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネと野生型イネの中でのＯｓＴＣＰ１９発現量の検出結果である。ｃは、ｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネと野生型イネの分蘖数である。
【図2】ｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネと野生型イネの窒素応答性アッセイである。ａは、低窒素処理下におけるｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネと野生型イネの分蘖数である。ｂは、高窒素処理下におけるｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネと野生型イネの分蘖数である。ｃは、ｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネと野生型イネの分蘖の窒素応答値である。
【図3】イネＯｓＴＣＰ１９突然変異体及び野生型イネの分蘖数の検測である。ａは、イネＯｓＴＣＰ１９突然変異体及び野生型イネの表現型である。ｂは、イネＯｓＴＣＰ１９突然変異体及び野生型イネの分蘖数である。
【発明を実施するための形態】
【0041】
以下の実施例は、本発明をより良く理解するためのものであるが、本発明を限定するものではない。以下の実施例における実験方法は、特に指定がない限り、一般的なものである。以下の実施例で使用する試験材料は、特に指定がない限り、いずれも、一般的な生化学試薬店から購入するものである。以下の実施例における定量試験では、いずれも３回の繰り返し実験を設置し、結果を平均化した。
【0042】
Ｚｈｏｎｇｈｕａ １１は、下記文献：Ｍａ Ｙ， Ｌｉｕ Ｌ， Ｚｈｕ Ｃ， Ｓｕｎ Ｃ， Ｘｕ Ｂ， Ｆａｎｇ Ｆ， Ｔａｎｇ Ｊ， Ｌｕｏ Ａ， Ｃａｏ Ｓ， Ｌｉ Ｇ， Ｑｉａｎ Ｑ， Ｘｕｅ Ｙ， Ｃｈｕ Ｃ （２００９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ａ ｍｕｌｔｉ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｔ－ＤＮＡ ｔａｇｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ， Ｊ． Ｇｅｎｅｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３６（５）：２６７－２７６に記載されている。公衆は、中国科学院遺伝と発育生物学研究所から入手可能であり、当該生体材料は、ただ本発明に関連する実験を繰り返すために用いられており、他の用途に用いられるべきではない。
【0043】
ｐＣＡＭＢＩＡ２３００－ｏｃｓは、下記文献：Ｗａｎｇ Ｗ， Ｈｕ Ｂ， Ｙｕａｎ Ｄ， Ｌｉｕ Ｙ， Ｃｈｅ Ｒ， Ｈｕ Ｙ， Ｏｕ Ｓ， Ｚｈａｎｇ Ｚ， Ｗａｎｇ Ｈ， Ｌｉ Ｈ， Ｊｉａｎｇ Ｚ， Ｚｈａｎｇ Ｚ， Ｇａｏ Ｘ， Ｑｉｕ Ｙ， Ｍｅｎｇ Ｘ， Ｌｉｕ Ｙ， Ｂａｉ Ｙ， Ｌｉａｎｇ Ｙ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｚｈａｎｇ Ｌ． ， Ｌｉ Ｌ， Ｍｅｒｇｅｎ Ｓ， Ｊｉｎｇ Ｈ， Ｌｉ Ｊ， ａｎｄ Ｃｈｕ Ｃ （２０１８） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＯｓＮＲＴ１．１Ａ／ＯｓＮＰＦ６．３ ｃｏｎｆｅｒｓ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ３０（３）： ６３８－６５１に記載されている。公衆は、中国科学院遺伝と発育生物学研究所から入手可能であり、当該ベクターは、ただ本発明に関連する実験を繰り返すために用いられており、他の用途に用いられるべきではない。
【0044】
ｐＹＬｓｇＲＮＡ－Ｕ３、ｐＹＬｓｇＲＮＡ－Ｕ６ａ及びｐＹＬＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９Ｐｕｂｉ－Ｈベクターは、いずれも、下記文献：Ｍａ Ｘ， Ｚｈａｎｇ Ｑ， Ｚｈｕ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ａ Ｒｏｂｕｓｔ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ， Ｈｉｇｈ－Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｏｔ ａｎｄ Ｄｉｃｏｔ Ｐｌａｎｔｓ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ．２０１５；８（８）：１２７４－１２８４に記載されている。公衆は、中国科学院遺伝と発育生物学研究所から入手可能であり、当該ベクターは、ただ本発明に関連する実験を繰り返すために用いられており、他の用途に用いられるべきではない。
【0045】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ） ＡＧＬ１ ｓｔｒａｉｎは、下記文献：Ｗａｎｇ Ｗ， Ｈｕ Ｂ， Ｙｕａｎ Ｄ， Ｌｉｕ Ｙ， Ｃｈｅ Ｒ， Ｈｕ Ｙ， Ｏｕ Ｓ， Ｚｈａｎｇ Ｚ， Ｗａｎｇ Ｈ， Ｌｉ Ｈ， Ｊｉａｎｇ Ｚ， Ｚｈａｎｇ Ｚ， Ｇａｏ Ｘ， Ｑｉｕ Ｙ， Ｍｅｎｇ Ｘ， Ｌｉｕ Ｙ， Ｂａｉ Ｙ， Ｌｉａｎｇ Ｙ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｚｈａｎｇ Ｌ， Ｌｉ Ｌ， Ｍｅｒｇｅｎ Ｓ， Ｊｉｎｇ Ｈ， Ｌｉ Ｊ， ａｎｄ Ｃｈｕ Ｃ （２０１８） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｉｔｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＯｓＮＲＴ１．１Ａ／ＯｓＮＰＦ６．３ ｃｏｎｆｅｒｓ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ３０（３）： ６３８－６５１に記載されている。公衆は、中国科学院遺伝と発育生物学研究所から入手可能であり、当該ベクターは、ただ本発明に関連する実験を繰り返すために用いられており、他の用途に用いられるべきではない。
【0046】
実施例１ ｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネの獲得及びその分蘖の検測
Ｉ．ｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネの獲得
１．組換え発現ベクターの構築
（１）遺伝子のクローニング
中花１１（Ｚｈｏｎｇｈｕａ １１、ＺＨ１１）のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｆ／ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｒプライマーの組み合わせ（当該ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｆ／ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｒプライマーの組み合わせは、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの二つの制限酵素切断部位の接合部、及びその後の相同組換えに用いられるベクター配列を含む）を用いてＰＣＲ増幅を行い、大きさが３８４４ｂｐであるＤＮＡフラグメントが得られ、そのヌクレオチド配列を配列表の配列１に示す。ここで、配列１における１－１９４４位は、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子のプロモーターであり、１９４５－２２４０位は、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子の５’ＵＴＲ配列であり、２２４１－３４０４位は、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子のコード領域の配列であり、３４０５－３６５４位は、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子の３’ＵＴＲ配列であり、３６５５－３８４４位は、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子の下流配列である。プライマー配列は、詳しくは以下の通りである。
ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｆ：５’－ＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＴＡＴＧＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧ－３’；
ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｒ：５’－ＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＧＴＧＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＴＧＧＡ－３’。
Ｉ．ｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネの獲得
１．組換え発現ベクターの構築
（１）遺伝子のクローニング
中花１１（Ｚｈｏｎｇｈｕａ １１、ＺＨ１１）のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｆ／ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｒプライマーの組み合わせ（当該ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｆ／ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｒプライマーの組み合わせは、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの二つの制限酵素切断部位の接合部、及びその後の相同組換えに用いられるベクター配列を含む）を用いてＰＣＲ増幅を行い、大きさが３８４４ｂｐであるＤＮＡフラグメントが得られ、そのヌクレオチド配列を配列表の配列１に示す。ここで、配列１における１－１９４４位は、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子のプロモーターであり、１９４５－２２４０位は、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子の５’ＵＴＲ配列であり、２２４１－３４０４位は、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子のコード領域の配列であり、３４０５－３６５４位は、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子の３’ＵＴＲ配列であり、３６５５－３８４４位は、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子の下流配列である。プライマー配列は、詳しくは以下の通りである。
ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｆ：５’－ＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＴＡＴＧＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧ－３’；
ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｒ：５’－ＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＧＴＧＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＴＧＧＡ－３’。
【0047】
ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｆプライマー配列の５’末端にはＢａｍＨＩ制限酵素切断部位が付加されており、ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｒプライマー配列の５’末端にはＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位（下線で示される）が付加されている。ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｆ／ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｒプライマー配列における太字の配列は、ベクターにおける配列であり、その後の相同組換えに用いられてベクターを構築する。ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｆプライマー配列における斜体の配列は、配列１における１－２０位のヌクレオチド配列であり、ｇＯｓＴＣＰ１９－Ｒプライマー配列における斜体の配列は、配列１における３８２５－３８４４位のヌクレオチド配列と逆相補的な配列である。
【0048】
（２）発現ベクターの構築
ステップ（１）で得られた、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子を含み且つ全長の大きさが３８４４ｂｐであるＤＮＡフラグメントを、ベクターｐＣＡＭＢＩＡ２３００－ｏｃｓのＢａｍＨＩ酵素切断部位とＨｉｎｄＩＩＩ酵素切断部位との間に挿入し、組換え発現ベクターｇＯｓＴＣＰ１９が得られた。
ステップ（１）で得られた、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子を含み且つ全長の大きさが３８４４ｂｐであるＤＮＡフラグメントを、ベクターｐＣＡＭＢＩＡ２３００－ｏｃｓのＢａｍＨＩ酵素切断部位とＨｉｎｄＩＩＩ酵素切断部位との間に挿入し、組換え発現ベクターｇＯｓＴＣＰ１９が得られた。
【0049】
２．トランスジェニックイネの獲得
ステップ１で得られた組換え発現ベクターｇＯｓＴＣＰ１９を、ヒートショック法によりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ） ＡＧＬ１株に形質転換し、スクリーングしてｇＯｓＴＣＰ１９を含む組換えアグロバクテリウム菌株を得た。ｇＯｓＴＣＰ１９を含む組換えアグロバクテリウム菌株を用いて中花１１のカルス（ｃａｌｌｕｓ）を浸染させており、具体的な形質転換及びスクリーニング法は、「易自力、曹守雲、王力、何シ（注：金編に「思」）潔、儲成才、唐祚舜、周朴華、田文忠、アグロバクテリウムによるイネ形質転換の頻度増加に関する検討、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００１， ２８（４）：３５２－３５８」を参照し、最終的にトランスジェニックイネを得た。得られたトランスジェニックイネは、Ｔ０世代のトランスジェニックイネである。Ｔ０世代株の種子を収穫し、Ｔ１世代のトランスジェニックイネを得た。
ステップ１で得られた組換え発現ベクターｇＯｓＴＣＰ１９を、ヒートショック法によりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ） ＡＧＬ１株に形質転換し、スクリーングしてｇＯｓＴＣＰ１９を含む組換えアグロバクテリウム菌株を得た。ｇＯｓＴＣＰ１９を含む組換えアグロバクテリウム菌株を用いて中花１１のカルス（ｃａｌｌｕｓ）を浸染させており、具体的な形質転換及びスクリーニング法は、「易自力、曹守雲、王力、何シ（注：金編に「思」）潔、儲成才、唐祚舜、周朴華、田文忠、アグロバクテリウムによるイネ形質転換の頻度増加に関する検討、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００１， ２８（４）：３５２－３５８」を参照し、最終的にトランスジェニックイネを得た。得られたトランスジェニックイネは、Ｔ０世代のトランスジェニックイネである。Ｔ０世代株の種子を収穫し、Ｔ１世代のトランスジェニックイネを得た。
【0050】
Ｔ１世代のトランスジェニックイネを得る方法に従って、空ベクターｐＣＡＭＢＩＡ２３００－ｏｃｓを中花１１に形質転換し、空ベクターの対照植株を得た。
【0051】
３．トランスジェニックイネの同定
１）ＰＣＲによる同定
ステップ２で得られたＴ１世代のトランスジェニックイネのゲノムＤＮＡを抽出した。ＮｐｔＩＩ遺伝子に対するプライマーＦ１及びＲ１を用いてＰＣＲ同定を行ったところ、ＮｐｔＩＩ遺伝子を含む植株（ＰＣＲ産物の大きさは約５００ｂｐである）、即ち、陽性のトランスジェニックイネであると判明し、ｔｒａｎｓ－ＯＳＴＣＰ１９イネと命名された。プライマー配列は、具体的に以下の通りである。
Ｆ１：５’－ＴＣＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧ－３’；
Ｒ１：５’－ＣＴＧＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＣＴＧＡＴＧＣＴ－３’。
１）ＰＣＲによる同定
ステップ２で得られたＴ１世代のトランスジェニックイネのゲノムＤＮＡを抽出した。ＮｐｔＩＩ遺伝子に対するプライマーＦ１及びＲ１を用いてＰＣＲ同定を行ったところ、ＮｐｔＩＩ遺伝子を含む植株（ＰＣＲ産物の大きさは約５００ｂｐである）、即ち、陽性のトランスジェニックイネであると判明し、ｔｒａｎｓ－ＯＳＴＣＰ１９イネと命名された。プライマー配列は、具体的に以下の通りである。
Ｆ１：５’－ＴＣＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧ－３’；
Ｒ１：５’－ＣＴＧＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＣＴＧＡＴＧＣＴ－３’。
【0052】
２）転写レベルの解析（ＲＮＡ発現量）
実験材料としては、ステップ（１）で得られた全てのＴ１世代の陽性トランスジェニックイネ株、及び野生型イネ品種中花１１を使用した。各材料からトータルＲＮＡを抽出し、逆転写させてｃＤＮＡを得た。さらに、得られたｃＤＮＡをテンプレートとし、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子に対するリアルタイム定量蛍光ＰＣＲを行い、各材料におけるＯｓＴＣＰ１９遺伝子の転写レベルでの発現量を検出した。実験は３回繰り返し、結果を平均化した。内部標準遺伝子としてＯｓＡｃｔｉｎ１を使用した。ＯｓＴＣＰ１９遺伝子とＯｓＡｃｔｉｎ１遺伝子の検出に用いられたプライマー配列は、以下の通りである：
ＯｓＴＣＰ１９－ｑＦ：５’－ＧＡＣＡＧＴＧＴＡＣＣＧＴＧＧＣＧＴ－３’；
ＯｓＴＣＰ１９－ｑＲ：５’－ＣＧＣＣＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＧＡＡＡＴ－３’；
ＯｓＡｃｔｉｎ１－Ｆ：５’－ＡＣＣＡＴＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＴＴＴ－３’；
ＯｓＡｃｔｉｎ１－Ｒ：５’－ＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＴＴＣＣＴＡＴＧＡＡ－３’。
実験材料としては、ステップ（１）で得られた全てのＴ１世代の陽性トランスジェニックイネ株、及び野生型イネ品種中花１１を使用した。各材料からトータルＲＮＡを抽出し、逆転写させてｃＤＮＡを得た。さらに、得られたｃＤＮＡをテンプレートとし、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子に対するリアルタイム定量蛍光ＰＣＲを行い、各材料におけるＯｓＴＣＰ１９遺伝子の転写レベルでの発現量を検出した。実験は３回繰り返し、結果を平均化した。内部標準遺伝子としてＯｓＡｃｔｉｎ１を使用した。ＯｓＴＣＰ１９遺伝子とＯｓＡｃｔｉｎ１遺伝子の検出に用いられたプライマー配列は、以下の通りである：
ＯｓＴＣＰ１９－ｑＦ：５’－ＧＡＣＡＧＴＧＴＡＣＣＧＴＧＧＣＧＴ－３’；
ＯｓＴＣＰ１９－ｑＲ：５’－ＣＧＣＣＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＧＡＡＡＴ－３’；
ＯｓＡｃｔｉｎ１－Ｆ：５’－ＡＣＣＡＴＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＴＴＴ－３’；
ＯｓＡｃｔｉｎ１－Ｒ：５’－ＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＴＴＣＣＴＡＴＧＡＡ－３’。
【0053】
ＯｓＴＣＰ１９－ｑＦは、配列２における８６４－８８１位のヌクレオチド配列であり、ＯｓＴＣＰ１９－ｑＲは、配列２における８９６－９１５位のヌクレオチド配列と逆相補的な配列である。
【0054】
各実験材料におけるＯｓＴＣＰ１９遺伝子の発現量に対するリアルタイム定量蛍光ＰＣＲ検出の結果に基づいて、それぞれＴＯ１及びＴＯ２と命名された、中発現及び高表現の合計２つのＴ１世代株がその後の検討に選ばれ、ＴＯ１及びＴＯ２の発現量の検出結果が図１ｂに示された（空ベクター対照は、中花１１の対照表現型と一致しているため、図１ｂでは省略）。トランスジェニックではない野生型イネ品種の中花１１と比較して、Ｔ１世代のｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネ株のＴＯ１及びＴＯ２では、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子の発現量が転写レベルで有意に向上した。
【0055】
ＩＩ．ｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネの分蘖検出
１．ｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネの分蘖数検出
正常の条件で、生殖成長期に、Ｔ１世代のｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネ株ＴＯ１及びＴＯ２、中花１１の対照植株及び空ベクターの対照植株の分蘖数について、各材料１６個の単株ずつ計数した。
１．ｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネの分蘖数検出
正常の条件で、生殖成長期に、Ｔ１世代のｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネ株ＴＯ１及びＴＯ２、中花１１の対照植株及び空ベクターの対照植株の分蘖数について、各材料１６個の単株ずつ計数した。
【0056】
その結果を図１ａ及び図１ｃに示した（空ベクター対照は、中花１１の対照表現型と一致しているため、図１ａ及び図１ｃでは省略）。中花１１の対照植株及び空ベクターの対照と比べて、Ｔ１世代のｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネ株ＴＯ１及びＴＯ２の分蘖数は、有意に低下した。ここで、ＴＯ１は、中花１１の対照植株と比べて、平均の分蘖数は、６．３個から４．２個に減少した。ＴＯ２は、中花１１の対照植株と比べて、平均の分蘖数は、６．３個から３．３個に減少した。
【0057】
２．ｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネの分蘖の窒素応答性に対する検出
さらに、高窒素及び低窒素の条件（低窒素：５０ｋｇ ｈａ－１、高窒素：１５０ｋｇ ｈａ－１）で、Ｔ１世代のｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネ株ＴＯ１及びＴＯ２、中花１１の対照植株及び空ベクターの対照植株の分蘖数について統計し、分蘖の窒素応答値を計算した。具体的な処理手順：圃場試験では、２つの窒素肥料勾配（高窒素と低窒素）を設置した。ここで、高窒素処理群は、１００ｍ２あたり、尿素１．５ｋｇを施肥し、前記低窒素処理群は、１００ｍ２あたり、尿素０．５ｋｇを施肥する。分蘖の窒素応答値＝（高窒素処理群の分蘖数－低窒素処理群の分蘖数）／低窒素処理群の分蘖数であり、各材料について、二つの条件で、いずれも１６個の単株を統計した。
さらに、高窒素及び低窒素の条件（低窒素：５０ｋｇ ｈａ－１、高窒素：１５０ｋｇ ｈａ－１）で、Ｔ１世代のｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネ株ＴＯ１及びＴＯ２、中花１１の対照植株及び空ベクターの対照植株の分蘖数について統計し、分蘖の窒素応答値を計算した。具体的な処理手順：圃場試験では、２つの窒素肥料勾配（高窒素と低窒素）を設置した。ここで、高窒素処理群は、１００ｍ２あたり、尿素１．５ｋｇを施肥し、前記低窒素処理群は、１００ｍ２あたり、尿素０．５ｋｇを施肥する。分蘖の窒素応答値＝（高窒素処理群の分蘖数－低窒素処理群の分蘖数）／低窒素処理群の分蘖数であり、各材料について、二つの条件で、いずれも１６個の単株を統計した。
【0058】
その結果を図２に示す。Ｔ１世代のｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネ株ＴＯ１及びＴＯ２は、低窒素条件及び高窒素条件で、中花１１の対照植株及び空ベクターの対照と比べて、分蘖数がいずれも有意に低下した（図２ａ及び２ｂ）。ここで、低窒素条件で、中花１１の対照植株と比較して、ＴＯ１の平均分蘖数は５．１個から３．４個に減少したが、ＴＯ２の平均分蘖数は５．１個から２個に減少した。高窒素条件下で、中花１１の対照植株と比較して、ＴＯ１の平均分蘖数は９．５個から５．５個に減少したが、ＴＯ２の平均分蘖数は９．５個から２．５個に減少した。さらに、中花１１の対照植株及び空ベクターの対照と比べて、Ｔ１世代のｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネ株ＴＯ１及びＴＯ２の窒素応答性は、有意に低下した。ここで、中花１１の対照植株と比較して、ＴＯ１の平均の分蘖の窒素応答値は０．８から０．４に減少したが、ＴＯ２の平均の分蘖の窒素応答値は０．８本から０．３に減少した（図２ｃ）。
【0059】
実施例２：イネのＯｓＴＣＰ１９突然変異体の獲得及びその分蘖の検測
Ｉ．イネのＯｓＴＣＰ１９突然変異体の獲得
１．ｓｇＲＮＡの設計
参照配列として配列１を使用し、ＯｓＴＣＰ１９コード領域において、ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｆ／ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３ＲとＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＦ／ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＲとの２対のｓｇＲＮＡプライマー配列をそれぞれ設計した。プライマー配列は以下の通りである：
ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｆ：５’－ｇｇｃＡＧＡＧＴＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣ－３’；
ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｒ：５’－ａａａｃＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＴＣＴ－３’；
ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＦ：５’－ｇｃｃＧＡＧＣＴＣＧＧＧＣＡＣＡＡＧＡＣＣＧＡ－３’；
ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＲ：５’－ａａａｃＴＣＧＧＴＣＴＴＧＣＣＣＧＡＧＣＴ－３’。
Ｉ．イネのＯｓＴＣＰ１９突然変異体の獲得
１．ｓｇＲＮＡの設計
参照配列として配列１を使用し、ＯｓＴＣＰ１９コード領域において、ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｆ／ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３ＲとＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＦ／ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＲとの２対のｓｇＲＮＡプライマー配列をそれぞれ設計した。プライマー配列は以下の通りである：
ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｆ：５’－ｇｇｃＡＧＡＧＴＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣ－３’；
ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｒ：５’－ａａａｃＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＴＣＴ－３’；
ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＦ：５’－ｇｃｃＧＡＧＣＴＣＧＧＧＣＡＣＡＡＧＡＣＣＧＡ－３’；
ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＲ：５’－ａａａｃＴＣＧＧＴＣＴＴＧＣＣＣＧＡＧＣＴ－３’。
【0060】
その後の結合を容易にするため、ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｆプライマー配列の５’末端にｇｇｃコネクターを付加させ、ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｒプライマー配列の５’末端にａａａｃコネクターを付加させ、ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＦプライマー配列の５’末端にｇｃｃコネクターを付加させ、ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＲのプライマー配列の５’末端にａａａｃコネクターを付加させた。
【0061】
ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｆは、配列１における２２３２－２２５１位のヌクレオチド配列であり、ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｒは、配列１における２２３２－２２５１位のヌクレオチド配列と逆相補的な配列である。ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＦは、配列１における２５０５－２５２４位のヌクレオチド配列であり、ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｒは配列１における２５０５－２５２４位のヌクレオチド配列と逆相補的な配列である。
【0062】
２．ノックアウトベクターの構築
１）ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｆ／ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｒのプライマー対を変性させ、アニールしてＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｆ／Ｒの二量体生成物を得た。ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＦ／ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＲプライマー対を変性させ、アニールしてＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＦ／Ｒの二量体生成物を得た。
２）ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｆ／Ｒの二量体生成物をｐＹＬｓｇＲＮＡ－Ｕ３ベクターに結合したとともに、ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＦ／Ｒの二量体生成物をｐＹＬｓｇＲＮＡ－Ｕ６ａベクターに結合させて、それぞれ中間ベクターを２個得た。その後、参考文献：Ｍａ Ｘ， Ｚｈａｎｇ Ｑ， Ｚｈｕ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ａ Ｒｏｂｕｓｔ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ， Ｈｉｇｈ－Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｏｔ ａｎｄ Ｄｉｃｏｔ Ｐｌａｎｔｓ． Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ． ２０１５；８（８）：１２７４－１２８４．におけるステップに従って、カットアンドジョイン法により、２つの中間ベクターをいずれもｐＹＬＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９Ｐｕｂｉ－Ｈエンドベクターに結合させて、デュアルターゲットＯｓＴＣＰ１９ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトベクターを得た。デュアルターゲットＯｓＴＣＰ１９ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトベクターは、ｓｇＲＮＡ １とｓｇＲＮＡ ２と表記した２つのｓｇＲＮＡを含んでいる。ｓｇＲＮＡ １の標的配列はＡＧＡＧＴＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣ（配列４）であり、ｓｇＲＮＡ ２の標的配列はＧＡＧＣＴＣＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＡ（配列５）である。
１）ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｆ／ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｒのプライマー対を変性させ、アニールしてＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｆ／Ｒの二量体生成物を得た。ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＦ／ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＲプライマー対を変性させ、アニールしてＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＦ／Ｒの二量体生成物を得た。
２）ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ３Ｆ／Ｒの二量体生成物をｐＹＬｓｇＲＮＡ－Ｕ３ベクターに結合したとともに、ＯｓＴＣＰ１９－Ｕ６ａＦ／Ｒの二量体生成物をｐＹＬｓｇＲＮＡ－Ｕ６ａベクターに結合させて、それぞれ中間ベクターを２個得た。その後、参考文献：Ｍａ Ｘ， Ｚｈａｎｇ Ｑ， Ｚｈｕ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ａ Ｒｏｂｕｓｔ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ， Ｈｉｇｈ－Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｏｔ ａｎｄ Ｄｉｃｏｔ Ｐｌａｎｔｓ． Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ． ２０１５；８（８）：１２７４－１２８４．におけるステップに従って、カットアンドジョイン法により、２つの中間ベクターをいずれもｐＹＬＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９Ｐｕｂｉ－Ｈエンドベクターに結合させて、デュアルターゲットＯｓＴＣＰ１９ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトベクターを得た。デュアルターゲットＯｓＴＣＰ１９ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトベクターは、ｓｇＲＮＡ １とｓｇＲＮＡ ２と表記した２つのｓｇＲＮＡを含んでいる。ｓｇＲＮＡ １の標的配列はＡＧＡＧＴＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣ（配列４）であり、ｓｇＲＮＡ ２の標的配列はＧＡＧＣＴＣＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＡ（配列５）である。
【0063】
３．イネのＯｓＴＣＰ１９突然変異体の獲得
ステップ２で得られたノックアウトベクターＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＩＳＰＲをヒートショック法によりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ） ＡＧＬ１株に形質転換し、スクリーングしてＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＩＳＰＲを含む組換えアグロバクテリウム菌株を得た。ＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＩＳＰＲを含む組換えアグロバクテリウム菌株を用いて中花１１のカルス（ｃａｌｌｕｓ）を浸染させており、具体的な形質転換及びスクリーニング法は、「易自力、曹守雲、王力、何シ（注：金編に「思」）潔、儲成才、唐祚舜、周朴華、田文忠、アグロバクテリウムによるイネ形質転換の頻度増加に関する検討、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００１， ２８（４）：３５２－３５８」を参照し、最終的にＴ０世代のトランスジェニックイネを得た。
ステップ２で得られたノックアウトベクターＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＩＳＰＲをヒートショック法によりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ） ＡＧＬ１株に形質転換し、スクリーングしてＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＩＳＰＲを含む組換えアグロバクテリウム菌株を得た。ＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＩＳＰＲを含む組換えアグロバクテリウム菌株を用いて中花１１のカルス（ｃａｌｌｕｓ）を浸染させており、具体的な形質転換及びスクリーニング法は、「易自力、曹守雲、王力、何シ（注：金編に「思」）潔、儲成才、唐祚舜、周朴華、田文忠、アグロバクテリウムによるイネ形質転換の頻度増加に関する検討、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００１， ２８（４）：３５２－３５８」を参照し、最終的にＴ０世代のトランスジェニックイネを得た。
【0064】
４．イネのＯｓＴＣＰ１９突然変異体の同定
ステップ３で得られたＴ０世代のトランスジェニックイネは、ＰＣＲ及びシークエンスにより検出された。具体的なステップは、以下の通りである。ステップ３で得られたＴ０世代のトランスジェニックイネのゲノムＤＮＡを抽出し、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子に対するプライマーＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＦ及びＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＲにより、ＰＣＲ同定を行ったとともに、ＰＣＲ産物をシークエンスしてＯｓＴＣＰ１９遺伝子を突然変異させたトランスジェニック株を得た。プライマー配列は、以下の通りである：
ＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＦ：５’－ＴＣＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＣＣＧＧＣＧ－３’；
ＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＲ：５’－ＣＧＣＣＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＧＡＡＡＴ－３’。
ステップ３で得られたＴ０世代のトランスジェニックイネは、ＰＣＲ及びシークエンスにより検出された。具体的なステップは、以下の通りである。ステップ３で得られたＴ０世代のトランスジェニックイネのゲノムＤＮＡを抽出し、ＯｓＴＣＰ１９遺伝子に対するプライマーＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＦ及びＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＲにより、ＰＣＲ同定を行ったとともに、ＰＣＲ産物をシークエンスしてＯｓＴＣＰ１９遺伝子を突然変異させたトランスジェニック株を得た。プライマー配列は、以下の通りである：
ＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＦ：５’－ＴＣＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＣＣＧＧＣＧ－３’；
ＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＲ：５’－ＣＧＣＣＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＧＡＡＡＴ－３’。
【0065】
ここで、ＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＦは、配列１における２０５２－２０７１位のヌクレオチド配列であり、ＯｓＴＣＰ１９－ＣＲＲは、配列１における３１３６－３１５５位のヌクレオチド配列と逆相補的な配列である。
【0066】
シークエンスにより同定したところ、Ｔ０世代のトランスジェニックイネにおいて合計で２つのＯｓＴＣＰ１９遺伝子の突然変異体純粋株が得られ、それぞれイネのＯｓＴＣＰ１９突然変異株Ｔ－ｃｒ１及びイネのＯｓＴＣＰ１９突然変異株Ｔ－ｃｒ２と命名された。
【0067】
Ｔ０世代のイネのＯｓＴＣＰ１９突然変異株Ｔ－ｃｒ１は、野生型イネ中花１１のゲノムＤＮＡと比較すると、それらの差異は、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子において、２本の染色体がすべて一つの塩基欠失の突然変異を生じており、当該欠失の突然変異が、配列１における２５２１位に位置したことにより、ＯｓＴＣＰ１９の機能が失われたり、低下したりしている点にある。
【0068】
Ｔ０世代のイネのＯｓＴＣＰ１９突然変異株Ｔ－ｃｒ２は、野生型イネ中花１１のゲノムＤＮＡと比較すると、それらの差異は、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質をコードする遺伝子において、２本の染色体がすべて一つの塩基挿入の突然変異及び２０４個の塩基欠失の突然変異を生じており、当該挿入の突然変異の、塩基の挿入位置が配列１における２５２１位と２２４９位との間に位置し、当該欠失の突然変異が、配列１における２３１９－２５２２位に位置したことにより、ＯｓＴＣＰ１９の機能が失われたり、低下したりしている点にある。
【0069】
Ｔ０世代のイネのＯｓＴＣＰ１９突然変異株Ｔ－ｃｒ１及びＴ－ｃｒ２の種子を得て、Ｔ１世代のイネのＯｓＴＣＰ１９突然変異株Ｔ－ｃｒ１及びＴ－ｃｒ２を得て、下記の分蘖検出に用いた。
【0070】
ＩＩ．イネのＯｓＴＣＰ１９突然変異体の分蘖検出
正常の条件で、生殖成長期に、Ｔ１世代のイネのＯｓＴＣＰ１９突然変異株Ｔ－ｃｒ１、Ｔ－ｃｒ２及び中花１１対照植株の分蘖数について、各材料を２４個の単株でそれぞれ統計した。
正常の条件で、生殖成長期に、Ｔ１世代のイネのＯｓＴＣＰ１９突然変異株Ｔ－ｃｒ１、Ｔ－ｃｒ２及び中花１１対照植株の分蘖数について、各材料を２４個の単株でそれぞれ統計した。
【0071】
その結果を図３に示した。中花の対照植株と比べて、イネのＯｓＴＣＰ１９突然変異株Ｔ－ｃｒ１及びＴ－ｃｒ２の分蘖数は、いずれも有意に増加した。ここで、イネのＯｓＴＣＰ１９突然変異株Ｔ－ｃｒ１の平均分蘖数は、６．８個から８．８個に増加し、Ｔ－ｃｒ２は、６．８から９．２に増加した。
【0072】
上述したものは、本発明の好ましい実施形態に過ぎず、当業者にとっては、本発明の技術原理から逸脱することなく、ＯｓＴＣＰ１９プロモーター調節配列又はＯｓＴＣＰ１９遺伝子自体に対する遺伝子編集最適化などのいくつかの改良及び修正を行うことができ、これらの改良及び修正も本発明の権利範囲とみなされるべきであることに注意すべきである。
【産業上の利用可能性】
【0073】
本発明は、植物の収量及び窒素利用率に関連するＯｓＴＣＰ１９タンパク質を提供し、トランスジェニック技術及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術により、それぞれｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネ及びイネのＯｓＴＣＰ１９突然変異体を得るものである。実験から、ｔｒａｎｓ－ＯｓＴＣＰ１９イネは、野生型イネと比べて、分蘖数が減少し、窒素応答性が低下したが、イネのＯｓＴＣＰ１９突然変異体は、野生型イネと比べて、分蘖数が増加したことが判明した。このことから分かるように、ＯｓＴＣＰ１９タンパク質が植物の収量及び窒素利用率を調節する機能を担っている。これにより、高収量・高窒素利用率の品種の育成の基礎となる。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】
【国際調査報告】