特表 2023-541606 腎臓を保護しながらがんを治療するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-03

(54)【発明の名称】腎臓を保護しながらがんを治療するための方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/295 20060101AFI20230926BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20230926BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230926BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230926BHJP

   A61K 31/7068 20060101ALI20230926BHJP

   A61K 33/24 20190101ALI20230926BHJP

   A61K 49/04 20060101ALI20230926BHJP

   A61K 31/409 20060101ALI20230926BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230926BHJP

   B82Y 5/00 20110101ALI20230926BHJP

【ＦＩ】

A61K31/295

A61P13/12

A61P35/00

A61K45/00

A61K31/7068

A61K33/24

A61K49/04 210

A61K31/409

A61K39/395 T

B82Y5/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023516137

(86)(22)【出願日】2021-09-13

(85)【翻訳文提出日】2023-05-02

(86)【国際出願番号】 US2021050064

(87)【国際公開番号】W WO2022056378

(87)【国際公開日】2022-03-17

(31)【優先権主張番号】62/706,829

(32)【優先日】2020-09-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/158,803

(32)【優先日】2021-03-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520457096

【氏名又は名称】レニバス・セラピューティクス・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】カイザー，ドナルド

(72)【発明者】

【氏名】ギエム，アルバロ

(72)【発明者】

【氏名】ゼーガー，リチャード

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA07

4C084ZB26

4C084ZC751

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC23

4C085DD61

4C085EE03

4C085HH05

4C085KB08

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB04

4C086EA17

4C086HA12

4C086HA28

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA07

4C086ZB26

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206JB11

4C206MA02

4C206MA04

4C206NA07

4C206ZA81

4C206ZC75

(57)【要約】

本発明は、化学療法剤の細胞毒性から患者の腎臓を保護するのに十分な量の鉄スクロース及び／又はスズプロトポルフィリンなどのプロトポルフィリンの同時投与を含むがんの治療のための新規方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

がん化学療法の間に腎臓を保護するための方法であって、
化学療法剤及びある量の鉄組成物をヒト患者に投与するステップであって、その量の鉄組成物が、化学療法剤の細胞毒性効果から患者の腎臓の保護を付与するステップを含む、方法。

【請求項2】

化学療法剤が、ベバシズマブ、ゲムシタビン、ＩＦＮ療法、シスプラチン、イホスファミド、ペメトレキセド、セツキシマブ若しくはメトトレキセート又はそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

化学療法剤が、シスプラチンである、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。

【請求項4】

ヒト患者においてヘプシジンの増加を誘導する、請求項１～３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

鉄組成物が、鉄スクロース組成物である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

鉄スクロース組成物が、重炭酸塩を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

鉄スクロース組成物が、およそ１～１０％のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比、５～１９ｍｇ／ｍｌの全鉄含有量、４～１１％の有機炭素含有量、１１００～１６００ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧、約１～３ｎｍの鉄コアサイズ、０．８％～３％のＮａ含有量及び１０，０００～３０，０００ダルトンの平均分子量を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

鉄スクロース組成物が、およそ３～４％のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比、１０～１５ｍｇ／ｍｌの全鉄含有量、６～９％の有機炭素含有量、１４００～１５８０ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧、約２～２．８ｎｍの鉄コアサイズ、１％～２％のＮａ含有量及び２０，０００～２５，０００ダルトンの平均分子量を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

鉄スクロース組成物が、およそ約３．４％のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比、約１２ｍｇ／ｍｌの全鉄含有量、約７．７％の有機炭素含有量、約１５４０ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧、約２．３９ｎｍの鉄コアサイズ、約１．２６％のＮａ含有量及び約２３，８８１ダルトンの平均分子量を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項10】

放射線造影画像化の間に腎臓を保護するための方法であって、
造影剤及びある量の鉄組成物をヒト患者に投与するステップであって、その量の鉄スクロースが、造影剤の細胞毒性効果から患者の腎臓の保護を付与する、ステップを含む、方法。

【請求項11】

造影剤が、ヨウ素含有造影剤である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

造影剤が、ジアトリゾエート、メトリゾエート、イオン性イオタラメート、イオン性イオキサグレート、イオパミドール、イオヘキソール、イオキシラン、イオプロミド、イオジキサノール、イオベルソール、ガドペンテテート、ガドベネート、ガドジアミド、ガドテレート、ガドテリドール、ガドブトロール若しくはガドキセテート又はそれらの組合せである、請求項１０又は１１のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

ヒト患者においてヘプシジンの増加を誘導する、請求項１０～１２のいずれかに記載の方法。

【請求項14】

鉄組成物が、鉄スクロース組成物を含む、請求項１０～１３のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

鉄スクロース組成物が、重炭酸塩を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

鉄スクロース組成物が、およそ１～１０％のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比、５～１９ｍｇ／ｍｌの全鉄含有量、４～１１％の有機炭素含有量、１１００～１６００ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧、約１～３ｎｍの鉄コアサイズ、０．８％～３％のＮａ含有量及び１０，０００～３０，０００ダルトンの平均分子量を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

鉄スクロース組成物が、およそ３～４％のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比、１０～１５ｍｇ／ｍｌの全鉄含有量、６～９％の有機炭素含有量、１４００～１５８０ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧、約２～２．８ｎｍの鉄コアサイズ、１％～２％のＮａ含有量及び２０，０００～２５，０００ダルトンの平均分子量を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

鉄スクロース組成物が、およそ約３．４％のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比、約１２ｍｇ／ｍｌの全鉄含有量、約７．７％の有機炭素含有量、約１５４０ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧、約２．３９ｎｍの鉄コアサイズ、約１．２６％のＮａ含有量及び約２３，８８１ダルトンの平均分子量を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項19】

がん化学療法の間に腎臓を保護するための方法であって、
化学療法剤及びある量のプロトポルフィリンをヒト患者に投与するステップであって、その量のプロトポルフィリンが、化学療法剤の細胞毒性効果から患者の腎臓の保護を付与する、ステップを含む、方法。

【請求項20】

化学療法剤が、ベバシズマブ、ゲムシタビン、ＩＦＮ療法、シスプラチン、イホスファミド、ペメトレキセド、セツキシマブ若しくはメトトレキセート又はそれらの組合せである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

化学療法剤が、シスプラチンである、請求項１９又は２０のいずれかに記載の方法。

【請求項22】

ヒト患者においてヘプシジンの増加を誘導する、請求項１９～２１のいずれかに記載の方法。

【請求項23】

プロトポルフィリンが、金属プロトポルフィリンである、請求項１９～２２のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

金属プロトポルフィリンが、スズプロトポルフィリンである、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

放射線造影画像化の間に腎臓を保護するための方法であって、
造影剤及びある量のプロトポルフィリンをヒト患者に投与するステップであって、その量のプロトポルフィリンが、造影剤の細胞毒性効果から患者の腎臓の保護を付与する、ステップを含む、方法。

【請求項26】

造影剤が、ヨウ素含有造影剤である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

造影剤が、ジアトリゾエート、メトリゾエート、イオン性イオタラメート、イオン性イオキサグレート、イオパミドール、イオヘキソール、イオキシラン、イオプロミド、イオジキサノール、イオベルソール、ガドペンテテート、ガドベネート、ガドジアミド、ガドテレート、ガドテリドール、ガドブトロール若しくはガドキセテート又はそれらの組合せである、請求項２５又は２６のいずれかに記載の方法。

【請求項28】

ヒト患者においてヘプシジンの増加を誘導する、請求項２５～２７のいずれかに記載の方法。

【請求項29】

プロトポルフィリンが、金属プロトポルフィリンである、請求項２５～２８のいずれかに記載の方法。

【請求項30】

金属プロトポルフィリンが、スズプロトポルフィリンである、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

がん化学療法の間に腎臓を保護するための方法であって、
化学療法剤及びある量のプロトポルフィリン及びある量の鉄組成物をヒト患者に投与するステップであって、その量のプロトポルフィリン及びその量の鉄組成物が、化学療法剤の細胞毒性効果から患者の腎臓の保護を付与する、ステップを含む、方法。

【請求項32】

化学療法剤が、ベバシズマブ、ゲムシタビン、ＩＦＮ療法、シスプラチン、イホスファミド、ペメトレキセド、セツキシマブ若しくはメトトレキセート又はそれらの組合せである、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

化学療法剤が、シスプラチンである、請求項３１又は３２のいずれかに記載の方法。

【請求項34】

ヒト患者においてヘプシジンの増加を誘導する、請求項３１～３３のいずれかに記載の方法。

【請求項35】

プロトポルフィリンが、金属プロトポルフィリンである、請求項３１～３４のいずれかに記載の方法。

【請求項36】

金属プロトポルフィリンが、スズプロトポルフィリンである、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

鉄組成物が、鉄スクロース組成物である、請求項３１～３６のいずれかに記載の方法。

【請求項38】

鉄スクロースが、重炭酸塩を含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

鉄スクロース組成物が、およそ１～１０％のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比、５～１９ｍｇ／ｍｌの全鉄含有量、４～１１％の有機炭素含有量、１１００～１６００ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧、約１～３ｎｍの鉄コアサイズ、０．８％～３％のＮａ含有量及び１０，０００～３０，０００ダルトンの平均分子量を含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

鉄スクロース組成物が、およそ３～４％のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比、１０～１５ｍｇ／ｍｌの全鉄含有量、６～９％の有機炭素含有量、１４００～１５８０ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧、約２～２．８ｎｍの鉄コアサイズ、１％～２％のＮａ含有量及び２０，０００～２５，０００ダルトンの平均分子量を含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項41】

鉄スクロース組成物が、およそ約３．４％のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比、約１２ｍｇ／ｍｌの全鉄含有量、約７．７％の有機炭素含有量、約１５４０ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧、約２．３９ｎｍの鉄コアサイズ、約１．２６％のＮａ含有量及び約２３，８８１ダルトンの平均分子量を含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項42】

放射線造影画像化の間に腎臓を保護するための方法であって、
造影剤及びある量のプロトポルフィリン及びある量の鉄組成物をヒト患者に投与するステップであって、その量のプロトポルフィリン及びその量の鉄組成物が、造影剤の細胞毒性効果から患者の腎臓の保護を付与する、ステップを含む、方法。

【請求項43】

造影剤が、ヨウ素含有造影剤である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

造影剤が、ジアトリゾエート、メトリゾエート、イオン性イオタラメート、イオン性イオキサグレート、イオパミドール、イオヘキソール、イオキシラン、イオプロミド、イオジキサノール、イオベルソール、ガドペンテテート、ガドベネート、ガドジアミド、ガドテレート、ガドテリドール、ガドブトロール若しくはガドキセテート又はそれらの組合せである、請求項４２又は４３のいずれかに記載の方法。

【請求項45】

ヒト患者においてヘプシジンの増加を誘導する、請求項４２～４４のいずれかに記載の方法。

【請求項46】

プロトポルフィリンが、金属プロトポルフィリンである、請求項４２～４５のいずれかに記載の方法。

【請求項47】

金属プロトポルフィリンが、スズプロトポルフィリンである、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

鉄組成物が、鉄スクロース組成物である、請求項４２～４７のいずれかに記載の方法。

【請求項49】

鉄スクロース組成物が、重炭酸塩を含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

鉄スクロース組成物が、およそ１～１０％のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比、５～１９ｍｇ／ｍｌの全鉄含有量、４～１１％の有機炭素含有量、１１００～１６００ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧、約１～３ｎｍの鉄コアサイズ、０．８％～３％のＮａ含有量及び１０，０００～３０，０００ダルトンの平均分子量を含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項51】

鉄スクロース組成物が、およそ３～４％のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比、１０～１５ｍｇ／ｍｌの全鉄含有量、６～９％の有機炭素含有量、１４００～１５８０ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧、約２～２．８ｎｍの鉄コアサイズ、１％～２％のＮａ含有量及び２０，０００～２５，０００ダルトンの平均分子量を含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項52】

鉄スクロース組成物が、およそ約３．４％のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比、約１２ｍｇ／ｍｌの全鉄含有量、約７．７％の有機炭素含有量、約１５４０ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧、約２．３９ｎｍの鉄コアサイズ、約１．２６％のＮａ含有量及び約２３，８８１ダルトンの平均分子量を含む、請求項４８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

シスプラチンは、５０年よりも前にその抗がん作用が発見されて以来、よく使用されている化学療法剤である。現在、ｃｉｓ－ジアンミンジクロロ白金ＩＩ（シスプラチン）は、精巣がん、卵巣がん、頭頸部がん、膀胱がん及び非小細胞肺がんに対する抗がん剤として臨床的に広く使用されている。しかし、シスプラチンは腎臓に集中的に蓄積し、腎臓に損傷を与え、重大な毒性副作用をもたらすため、使用が制限されてきた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0002】

【特許文献1】米国特許第９８４４５６３号明細書

【発明の概要】

【0003】

腎臓の保護は、以前にＦｅＳ及びＳｎＰＰの投与により確認されている。Ｚａｇｅｒらへの米国特許第９，８４４，５６３号を参照されたい。しかし、化学療法中の腎損傷から効果的に保護するためには、保護剤が腫瘍細胞への化学療法剤の効果を損なわない選択的な保護が必要となる。化学療法中に使用するための効果的な保護剤を開発するために、さらなる研究が必要とされている。

【図面の簡単な説明】

【0004】

【図1】ＲＢＴ－３（３６０ｍｇ）が、ヒト対象において血漿ヘプシジンレベルの急速かつ著しい増加を誘導することを示す図である。

【図2】ＲＢＴ－３（２４０ｍｇ）が、血漿ヘプシジンレベルの急速かつ著しい増加を誘導することを示す図である。

【図3】ＲＢＴ－３（１２０ｍｇ）が、健康なボランティア（ＨＶ）及びＣＫＤ対象の両方において血漿ヘプシジンの増加を誘導することを示す図である。

【図4】ベースライン値を超える血漿ヘプシジンレベルの増加を示す図である。

【図5】Ｎｒｆ２経路が、ＣＤ－１マウスにおいてＲＢＴ－３注射により活性化されることを示す図である。

【図6A】免疫組織化学により評価した結果、ＲＢＴ－３が、マウス近位尿細管におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）の発現の顕著な増加を誘導することを示す図である。

【図6B】免疫組織化学により評価した結果、ＲＢＴ－３が、マウス近位尿細管におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）の発現の顕著な増加を誘導することを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0005】

本発明は、がん細胞に対して、腎臓及び／又は肝臓を選択的に保護する腎保護剤の使用、及びそのような腎保護剤を使用した化学療法剤を使用したがんを治療する方法又は造影剤を使用したがんを検査する方法に関する。一態様では、腎保護剤は、鉄スクロース（ＦｅＳ）などの鉄組成物である。別の態様では、腎保護剤は、プロトポルフィリン（例えば、スズプロトポルフィリン、ＳｎＰＰ）である。別の態様では、本発明は、がん化学療法又は放射線造影画像化の間に鉄組成物とプロトポルフィリンの組合せを投与することを含む。例えば、化学療法剤と一緒に鉄スクロース及びスズプロトポルフィリンを投与することである。

【0006】

本発明は、２０２０年２月２０日出願の米国特許出願第１６／８０５，２２３号、表題「ＮＯＶＥＬ ＩＲＯＮ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＭＡＫＩＮＧ ＡＮＤ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥ」に記載されているＲＢＴ－３などの鉄スクロースなどの鉄組成物を利用し、２０１９年２月２０日出願の米国仮特許出願第６２／８１２，０２８号に対する優先権を主張し、その開示はその全体が本明細書に組み込まれる。プロトポルフィリンは、スズプロトポルフィリン（ＳｎＰＰ）などの金属ポルフィリンを含む。鉄プロトポルフィリンＩＸの複数の合成アナログが知られている。これらの化合物は市販されている及び／又は既知の方法により容易に合成することができる。これらは、例えば、白金、亜鉛、ニッケル、コバルト、銅、銀、マンガン、クロム、及びスズのプロトポルフィリンＩＸを含む。便宜上これらの化合物は、総称的にＭｅ－プロトポルフィリン又はＭｅＰＰと呼ばれ、Ｍｅは金属を表し、具体的には、クロム、スズ、亜鉛のプロトポルフィリン化合物の場合は、それぞれＣｒ－プロトポルフィリン（ＣｒＰＰ）、Ｓｎ－プロトポルフィリン（ＳｎＰＰ）、Ｚｎ－プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）などの金属の化学記号を用いて呼ばれる場合がある。

【0007】

本発明に関連して使用できる化学療法剤は、シスプラチン、並びにカルボプラチン、エロキサチン又はオキサリプラチンを含む白金アナログのクラスの化合物を含む。

【0008】

化学療法中の鉄組成物の腎保護効果
ヘプシジンは、マクロファージ鉄レベル及び炎症促進性状態に応じて主に肝細胞で産生される、よく認識されている鉄調節タンパク質である。Ｃｏｆｆｅｙ Ｒ、Ｇａｎｚ Ｔ、Ｉｒｏｎ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ：Ａｎ ａｎｔｈｒｏｐｏｃｅｎｔｒｉｃ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２０１７；２９２：１２７２７～１２７３４。当初は抗菌特性があると考えられていたが、Ｍｉｃｈｅｌｓ Ｋ、Ｎｅｍｅｔｈ Ｅ、Ｇａｎｚ Ｔ、Ｍｅｈｒａｄ Ｂ、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ、２０１５；１１（８）：ｅ１００４９９８、近年では、急性腎臓保護効果を有することが証明されている。Ｖａｎ Ｓｗｅｌｍ ＲＰ、Ｗｅｔｚｅｌｓ ＪＦ、Ｖｅｒｗｅｉｊ ＶＧ、ら、Ｒｅｎａｌ ｈａｎｄｌｉｎｇ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｎａｌ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｈｅｐｃｉｄｉｎ ａｎｄ Ｉｔｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ、２０１６；２７：２７２０～２７３２；Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ Ｓ、Ｉｒｏｎ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ、Ｎｅｐｈｒｏｎ、２０１８；１４０：１５６～１５９；Ｓｃｉｎｄｉａ Ｙ、Ｗｌａｚｌｏ Ｅ、Ｌｅｅｄｓ Ｊ、ら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｉｎ ｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｅｐｓｉｓ ａｎｄ ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ、Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２０１９；１０：６１５、２０１９年６月６日発行、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｐｈａｒ．２０１９．００６１５；Ｓｃｉｎｄｉａ Ｙ、Ｄｅｙ Ｐ、Ｔｈｉｒｕｎａｇａｒｉ Ａ、Ｌｉｐｉｎｇ Ｈ、Ｒｏｓｉｎ ＤＬ、Ｆｌｏｒｉｓ Ｍ、Ｍａｒｋ Ｄ．Ｏｋｕｓａ ＭＤ、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ Ｓ、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｍｉｔｉｇａｔｅｓ ｒｅｎａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｒｏｎ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ、２０１５；２６：２８００～２８１４；Ｗａｎｇ Ｘ、Ｚｈｅｎｇ Ｘ、Ｚｈａｎｇ Ｊ、Ｚｈａｏ Ｓ、Ｗａｎｇ Ｚ、Ｗａｎｇ Ｆ、Ｓｈａｎｇ Ｗ、Ｂａｒａｓｃｈ Ｊ、Ｑｉｕ Ａ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｎａｌ ｉｒｏｎ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０１８；３１５：Ｆ１０４２～Ｆ１０５７。例えば、組換えヘプシジン投与は、実験的虚血性ＡＫＩを緩和することが示されている。

【0009】

逆に、ヘプシジン欠損マウスは、虚血性腎損傷に対して非常に影響を受けやすい（６）。ヘプシジンがその保護作用を発揮するメカニズムは、不確かなままである。しかし、ほとんどの関心は、以下の潜在的な経路に集中している（６、７）：ｉ）ヘプシジンは、その小さなサイズ（２５ｋＤａ）から、急速な糸球体ろ過を受け、次いで近位尿細管のエンドサイトーシスによる取込みを受ける、ｉｉ）ヘプシジンは、鉄エクスポーターフェロポーチンに結合し、その細胞再分布及びその後のタンパク質分解性の破壊を引き起こす、ｉｉｉ）フェロポーチンの損失は、細胞内の触媒的鉄レベルを増加させ得る、及びｉｖ）サイトゾルの鉄の上昇は、フェリチンの合成を刺激し、そのよく知られた細胞保護／抗酸化効果を付与することができる。Ｊｏｈｎｓｏｎ ＡＣ、Ｇｏｏｌｅｙ Ｔ、Ｇｕｉｌｌｅｍ Ｋｅｙｓｅｒ ＪＡ、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ Ｈ、Ｓｉｎｇｈ Ｂ、Ｚａｇｅｒ ＲＡ、Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｉｒｏｎ ｓｕｃｒｏｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｎａｌ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆｅｒｒｉｔｉｎ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｓｍａ，ｕｒｉｎｅ，ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｏｒｇａｎｓ、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０１９；３１７：Ｆ１５６３～Ｆ１５７１；Ｚａｒｊｏｕ Ａ、Ｂｏｌｉｓｅｔｔｙ Ｓ、Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ、ら、Ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ Ｈ－ｆｅｒｒｉｔｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｒｏｎ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、２０１３；１２３：４４２３～４４３４。しかし、追加の保護メカニズムも機能している可能性がある。単なる一例として、ヘプシジンと細胞保護性Ｎｒｆ２経路との相互作用が存在する可能性がある（１０～１３）。Ｌｉｍ ＰＪ、Ｄｕａｒｔｅ ＴＬ、Ａｒｅｚｅｓ Ｊ、ら、Ｎｒｆ２ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｉｒｏｎ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｈａｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ ｖｉａ Ｂｍｐ６ ａｎｄ ｈｅｐｃｉｄｉｎ、Ｎａｔ Ｍｅｔａｂ、２０１９；１：５１９～５３１；Ｂａｙｅｌｅ ＨＫ、Ｂａｌｅｓａｒｉａ Ｓ、Ｓｒａｉ ＳＫ、Ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｎｒｆ２：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｉｅｔａｒｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｒｏｎ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ、２０１５；８９：１１９２～１２０２；Ｔａｎａｋａ Ｙ、Ｉｋｅｄａ Ｔ、 Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｋ、Ｏｇａｗａ Ｈ、Ｋａｍｉｓａｋｏ Ｔ、Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｉｒｏｎ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｌｉｖｅｒｓ ｏｆ Ｎｒｆ２－ｎｕｌｌ ｍｉｃｅ、Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ、２０１２；２７：１７１１～１７１７；Ｈａｒａｄａ Ｎ、Ｋａｎａｙａｍａ Ｍ、Ｍａｒｕｙａｍａ Ａ、ら、Ｎｒｆ２ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ １－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｒｏｎ ｅｆｆｌｕｘ ａｎｄ ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｓ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ １ ｍＲＮＡ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ、２０１１；５０８：１０１～１０９。

【0010】

組換えヘプシジンがＡＫＩからの腎臓保護を付与することができるという急激に進んでいる証拠があることから、本発明者は、腎臓への安全性が証明されている、新たに開発された新規ＩＶ鉄スクロース製剤（ＲＢＴ－３）が、健康なボランティア及びＣＫＤ患者に投与されたとき、ヘプシジン産生を強く刺激して、その結果腎臓ヘプシジンレベルを増加させるか否か疑問に思った。ＲＢＴ－３は、２０２０年２月２０日出願の米国特許出願第１６／８０５，２２３号、表題「ＮＯＶＥＬ ＩＲＯＮ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＭＡＫＩＮＧ ＡＮＤ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥ」、に記載されており、２０１９年２月２０日出願の米国仮特許出願第６２／８１２，０２８号に対する優先権を主張し、その開示はその全体が本明細書に組み込まれる。

【0011】

これらの可能性を探索するために、本発明者は、異なる用量のＲＢＴ３を健康なボランティア（ＨＶ）及びステージ３～４ＣＫＤの対象に投与し、血漿ヘプシジン濃度を７２時間の期間にわたり測定した。尿中ヘプシジンレベルも、腎臓ヘプシジン送達を確認するために測定した。補完的なマウス実験では、肝臓及び腎臓皮質ヘプシジン産生の両方へのＲＢＴ－３の潜在的な効果を探った。ヘプシジン－Ｎｒｆ２相互作用に現在関心が集まっていることから、Ｎｒｆ２活性へのＲＢＴ－３の影響を評価した。最後に、ＲＢＴ－３が、臨床的に関連するＡＫＩモデルであるシスプラチン腎毒性からの保護を付与する能力、及び潜在的な作用メカニズムを試験した。これらの補完的な臨床研究及び実験研究の結果は、本報告の基礎を形成する。

【0012】

本発明者は、化学療法剤の腎臓への細胞毒性効果が、化学療法と鉄組成物の同時投与により軽減され得ることを見出した。また、造影剤と鉄組成物の同時投与は、造影剤の細胞毒性効果を軽減する可能性がある。鉄組成物は、好ましくは鉄スクロース組成物である。鉄スクロース組成物は、好ましくは重炭酸塩を含む鉄スクロース組成物である。一実施形態では、鉄スクロース組成物は、ＲＢＴ－３である。鉄組成物は、以下の特性のうちの１つ以上を含むことがあり、およそ１～１０％、２～５％、３～４％又は約３．４％のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比、５～１９ｍｇ／ｍｌ、８～１８ｍｇ／ｍｌ、１０～１５ｍｇ／ｍｌ又は約１２ｍｇ／ｍｌの全鉄含有量及び４～１１％、６～９％又は約７．７％の有機炭素含有量、１１００～１６００ｍＯｓｍ／Ｋｇ、１４００～１５８０ｍＯｓｍ／Ｋｇ又は約１５４０ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧、約１～３ｎｍ、２～２．８ｎｍ又は約２．３９ｎｍの鉄コアサイズ、０．８％～３％、１～２％又は約１．２６％のＮａ含有量及び１０，０００～３０，０００ダルトン、２０，０００～２５，０００ダルトン又は約２３，８８１ダルトンの平均分子量などである。

【0013】

ヘプシジンは、全身性及び細胞内鉄恒常性の重要な調節因子であり、近年、腎尿細管細胞保護効果を有することが指摘されている。前述のように、組換えヘプシジン投与後、腎臓ろ過、近位尿細管の取込み及びその後のフェロポーチンの分解が起こる。フェロポーチンは、唯一知られている鉄の細胞エクスポーター（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｏｒｔｅｒ）であるため、その分解は近位尿細管の鉄含有量を増やし、それからフェリチン産生を刺激すると考えられている。フェリチンは強力な抗酸化剤であることから、ヘプシジンの細胞保護効果の重要な決定者である可能性がある。

【0014】

以前に報告された２つのマウス研究において、本発明者の研究室は、Ｖｅｎｏｆｅｒ ＦｅＳ投与から１８～２４時間以内に、多様な形態のＡＫＩ（グリセロール、マレエート又は虚血再灌流）から腎臓を保護することを実証した。Ｊｏｈｎｓｏｎ ＡＣＭ、Ｚａｇｅｒ ＲＡ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｏｘｉｄａｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｎａｌ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ：ａｎ Ｎｒｆ２－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，Ｐ２１－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ａｎｔｉ－ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｐａｔｈｗａｙ、Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２０１８；３３：１９２７～１９４１；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＡＣ、Ｂｅｃｋｅｒ Ｋ、Ｚａｇｅｒ ＲＡ、Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｉｒｏｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔ ＭＣＰ－１，ＨＯ－１，ａｎｄ ＮＧＡＬ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｎａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｉｎｊｕｒｙ、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１０；２９９：Ｆ４２６～Ｆ４３５。

【0015】

本発明者は、これは、ＦｅＳによって促進される近位尿細管フェリチン含有量の増加が一因であることを示唆した。Ｊｏｈｎｓｏｎ ＡＣ、Ｇｏｏｌｅｙ Ｔ、Ｇｕｉｌｌｅｍ Ｋｅｙｓｅｒ ＪＡ、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ Ｈ、Ｓｉｎｇｈ Ｂ、Ｚａｇｅｒ ＲＡ、Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｉｒｏｎ ｓｕｃｒｏｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｎａｌ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆｅｒｒｉｔｉｎ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｓｍａ，ｕｒｉｎｅ，ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｏｒｇａｎｓ、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０１９；３１７：Ｆ１５６３～Ｆ１５７１。しかし、Ｖｅｎｏｆｅｒ ＦｅＳは、最小限の近位尿細管管腔へのアクセスを実現する。Ｚａｇｅｒ ＲＡ、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＡＣ、Ｈａｎｓｏｎ ＳＹ、Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｉｒｏｎ ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ、２００４；６６：１４４～１５６。これは、ＦｅＳによって促進されるフェリチンの増加の代替の可能性：ＦｅＳが肝臓のヘプシジン合成を刺激し、それが次に上述の経路により腎臓のフェリチン産生を引き起こす可能性があることを示唆している。しかし、ＦｅＳが、本発明者が以前に記述したＦｅＳによって誘導されるプレコンディショニング状態に寄与するのに必要とされるなどの、急速で持続的なヘプシジン産生（すなわち、２４時間以内）を引き起こすことが可能か否かに関しては、不明のままであった。

【0016】

この問題に取り組むために、本発明者は、健康なヒト対象及び進行したＣＫＤの患者におけるヘプシジン産生への新規ＦｅＳ「ＲＢＴ－３」の影響を評価した。本発明者は、ＲＢＴ－３が等モルのＶｅｎｏｆｅｒよりも強固な細胞保護作用を誘導するという本発明者の研究室からの予備的な証拠に基づいて、この鉄製剤を研究のために選択した。さらなる洞察を得るために、正常のマウスにおけるヘプシジン発現へのＲＢＴ－３の効果を評価した。図１～３に示されるように、健康なヒト及びＣＫＤ対象の両方において、急速で用量依存的な血漿ヘプシジンの増加がＲＢＴ－３注射後に観察された。この反応は２４時間でピークとなり、両方の対象群が２４０又は３６０ｍｇのＲＢＴ－３注射に反応して約１５倍の血漿ヘプシジンの増加を明示した。ベースラインでは、血漿ヘプシジンレベルは、健康なボランティアと比較してＣＫＤ対象において上昇しており、ＣＫＤの炎症促進性状態を反映しているとみられる。Ｈｏｎｄａ Ｈ、Ｈｏｓａｋａ Ｎ、Ｇａｎｚ Ｔ、Ｓｈｉｂａｔａ Ｔ、Ｉｒｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ、Ｃｏｎｔｒｉｂ Ｎｅｐｈｒｏｌ、２０１９；１９８：１０３～１１１；Ｗｅｉｓｓ Ｇ、Ｇａｎｚ Ｔ、Ｇｏｏｄｎｏｕｇｈ ＬＴ、Ａｎｅｍｉａ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、Ｂｌｏｏｄ、２０１９；１３３：４０～５０。

【0017】

これは、ＣＫＤ患者において、ヘプシジンの増加はすでに最大限であり、ＲＢＴ－３を介したヘプシジンのさらなる増加を妨げているという理論的可能性を提起した。しかし、ベースライン値を超える絶対的なヘプシジン上昇がＨＶ及びＣＫＤ研究群では視覚的に同一であったと考えると（図４）、これは明らかに事実とは異なった。興味深いことに、２４時間のピーク値は、ＲＢＴ－３注射後４８～７２時間以内に約５０％低下した。これは、急速な腎臓のヘプシジン取込み及び尿中のヘプシジン排出と協調してヘプシジン産生の減少を反映したものと推定される。実際、急速な尿中のヘプシジン排出は、ＲＢＴ－３注射後２４時間に、ＣＫＤ及び健康なボランティア群の両方において尿中ヘプシジン濃度が約４倍増加したことにより証明された。

【0018】

鉄負荷に反応した肝臓のヘプシジン産生は、ホロトランスフェリンのその肝臓受容体（Ｔｆｒ１、Ｔｒｆ２）への結合により開始される遺伝子転写の増加によってのみ生じると考えられている。その後のＢＭＰ－ＳＭＡＤ経路の活性化は、次にＨＡＭＰ１遺伝子の転写を上方制御する。この経路がＲＢＴ－３注射により活性化されたことを確認するため、本発明者は、ＲＢＴ－３投与後２４時間に、マウスの肝臓及び腎臓の両方においてＨＡＭＰ１ ｍＲＮＡを測定した。驚くべきことに、ＨＡＭＰ１ ｍＲＮＡの著しい増加が両臓器で観察されたのに対し、腎臓では１０倍を超える反応が観察された。本発明者の知る限り、Ｆｅに反応して、肝臓に対して腎臓に優先的にＨＡＭＰ１が誘導されることは、これまで報告されていない。これは、ＦｅＳ／ＲＢＴ－３が非直接的（肝臓での産生）及び直接的（腎臓由来）なメカニズムの両方により腎臓ヘプシジン負荷を引き起こし得るという興味深い可能性を提起する。

【0019】

ＦｅＳ／ＲＢＴ－３の保護作用の範囲の本発明者の理解を拡大するために、今回本発明者は、それが実験的なシスプラチン誘導ＡＲＦに対して発現され得るか否かを試験した。このモデルは、以下の４つの検討事項を踏まえて、研究のために選択された。第１に、本発明者が以前に試験したＡＫＩモデル（虚血、マレエート、グリセロール誘導横紋筋変性）が約２４時間以内に完全に明らかになるのとは異なり、シスプラチン腎毒性はゆっくりと進行し、腎不全の完全な発現には少なくとも３日を要する。したがって、ＦｅＳ／ＲＢＴ－３を介した保護効果がこの長期間にわたり発現され得るか否かに関しては不明であった。第２に、シスプラチン付加物は、早期の顕著なＤＮＡ損傷（例えば、ＤＮＡ架橋結合）を誘導し、アポトーシス性又は壊死性細胞死に至る。Ｍｉｌｌｅｒ ＲＰ、Ｔａｄａｇａｖａｄｉ ＲＫ、Ｒａｍｅｓｈ Ｇ、Ｒｅｅｖｅｓ ＷＢ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｔｏｘｉｃｉｔｙ、Ｔｏｘｉｎｓ、２０１０；１１：２４９０～２５１８。

【0020】

この独特の損傷開始事象を考慮すると、ＲＢＴ－３が依然として保護効果を付与するか否かは不明であった。第３に、シスプラチンは依然として広く使用されている化学療法剤であり、臨床的ＡＫＩ率は２５～３０％である。Ｌａｔｃｈａ Ｓ、Ｊａｉｍｅｓ ＥＡ、Ｐａｔｉｌ Ｓ、Ｇｌｅｚｅｒｍａｎ ＩＧ、Ｍｅｈｔａ Ｓ、Ｆｌｏｍｂａｕｍ ＣＤ、Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｒｅｎａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ａｆｔｅｒ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｃｌｉｎ Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ、２０１６；１１：１１７３～１１７９。したがって、シスプラチンの毒性を緩和する保護メカニズムを特定することは、現在満たされていない医療ニーズを満たすことができ、第４に、シスプラチン投与は予定された臨床事象である。したがって、ＲＢＴ－３は、シスプラチン注入の約１８～２４時間前に投与することで、ＦｅＳを介した細胞抵抗性状態（ｃｙｔｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔａｔｅ）の完全な発現に必要となる時間を与えることができる。実際、ＲＢＴ－３をシスプラチン注射の１８時間前にマウスに投与したとき、ＢＵＮ、血漿クレアチニン及び血漿ＮＡＧ濃度の急激な減少から明らかなように（表３）、著しい腎臓保護が観察された。したがって、これらの知見は、ＦｅＳ／ＲＢＴ－３プレコンディショニングが、広範囲にわたる、潜在的に臨床的に適用可能な腎保護効果を発揮することができるという概念にさらなる支持を与える。

【0021】

第４に、完全に予想外であったが、ＲＢＴ－３プレコンディショニングにより引き起こされた保護作用は、腎臓のシスプラチン取込みの劇的な抑制であった。シスプラチン腎毒性は、近位尿細管細胞の取込みに大きく依存するため、観察された腎臓皮質シスプラチンレベルの４０％の低下は、ＲＢＴ－３の保護作用に支配的な役割を果たしたに違いない。近位尿細管細胞のシスプラチン取込みは、側底膜に位置する有機カチオントランスポーター（例えば、ＯＣＴ２、ＭＡＴＥ１）により仲介される。ＯＣＴ２輸送は、近位尿細管のシスプラチン取込みの主要な決定要素であるが、ＭＡＴＥ１（「多剤及び毒素排出タンパク質１（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ａｎｄ ｔｏｘｉｎ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ １）」）も管腔シスプラチン排出を引き起こすことが、近年示唆されている（２４）。ＲＢＴ－３が、これらの細胞取込み及び排出経路にどのように影響するかは、未だ不明である。しかし、ヘプシジン－ＭＡＴＥ－１相互作用が近位尿細管のシスプラチン排出を増加させる可能性を推測する人もいるかもしれない。Ｓｐｒｅｃｋｅｌｍｅｙｅｒ Ｓ、ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅ Ｍ、Ｂｅｒｔｒａｎｄ Ｂ、Ｂｏｄｉｏ Ｅ、Ｓｔｕｒｕｐ Ｓ、Ｃａｓｉｎｉ Ａ、Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｃａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｃｙｃｌｏｍｅｔａｌｌａｔｅｄ ｇｏｌｄ（ＩＩＩ） ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｆｒｏｎｔ Ｃｈｅｍ、２０１８；６：３７７；Ｎｉｅｓｋｅｎｓ ＴＴＧ、Ｐｅｔｅｒｓ ＪＧＰ、Ｄａｂａｇｈｉｅ Ｄ、ら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １ ｏｒ ３ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌｅ ｃｅｌｌｓ ｒｅｄｕｃｅｓ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ、２０１８；４６：５９２～５９９。

【0022】

以前の複数の論文では、本発明者の研究室は、鉄デキストラン、グルコン酸鉄、ヴェノファー及びフェルモキシトールを含む様々な非経口鉄製剤に対する腎臓の生物学的反応の明らかな違いを実証してきた。これらの違いは、様々な毒性の程度、酸化ストレスの重大性及び潜在的炎症促進性効果を含む。最も注目すべきは、ＦｅＳ（Ｖｅｎｏｆｅｒ及び今回のＲＢＴ－３の両方）だけが、腎臓のプレコンディショニング効果を誘導することが示されていることである。実際、未発表の研究において、本発明者は、Ｖｅｎｏｆｅｒ及びＲＢＴ３の両方がそれぞれグリセロールＡＫＩモデルを緩和するが、ＲＢＴ－３はおよそ３５％大きな腎保護効果を付与することを発見した。本発明者は今回、ＲＢＴ－３が、Ｖｅｎｏｆｅｒに対して５倍大きいＲＢＴ－３への腎臓ＨＡＭＰ１反応を誘導することを実証する。さらに、ＲＢＴ３は、Ｖｅｎｏｆｅｒに対して２倍の腎臓ＨＯ－１ ｍＲＮＡ反応を誘導した。このように、ＶｅｎｏｆｅｒとＲＢＴ３は、量的に異なる腎臓の細胞保護タンパク質反応を明らかに発揮する。これらの違いを説明するＶｅｎｏｆｅｒとＲＢＴ－３の物理化学的な違いが何であるかは未だ不明である。しかし、これらのデータは、すべてのＦｅ調合剤が同様ではないことを明らかに示し、現時点では、ＲＢＴ３が最大の細胞保護的影響を与えると思われる。

【0023】

本発明者は、腎臓ヘプシジン負荷が、ＩＶ ＲＢＴ－３注射により著しく（１５×）、急速に（２４時間未満）誘導されることを実証した。しかし、ヘプシジンへのその影響に加えて、ＲＢＴ－３は、組換えヘプシジン注射により再現することができない追加の保護作用を発揮することは、注目すべきである。最も見込みのある２つは、１）本研究で初めて実証された近位尿細管内のＮｒｆ２経路活性化及び２）少なくともシスプラチンの場合において、細管のネフロトキシン取込み（又は蓄積）を鈍らせるＲＢＴ－３の能力である。これらの考察から、ＲＢＴ－３誘導プレコンディショニングは、ヘプシジン負荷に加えて、多数の細胞経路により仲介されることが明らかであるように思われる。ＦｅＳが、ヒトにおいて優れた臨床的安全性プロファイルを有することが示唆されていることは、腎保護／プレコンディショニング剤としての潜在的な臨床価値をさらに示唆している。最後に、データは、すべてのＦｅスクロース調合剤が同じ生物学的効果を発揮するのではないことを裏付ける。今までに集められたデータから、ＲＢＴ３は、腎臓のプレコンディショニング状態を誘導するのに最も見込みがあると思われる。

【0024】

臨床研究
９人の健康なボランティア（ＨＶ、ｅＧＦＲ＞７０ｍｌ／分／１．７３ｍ２）及びステージ３～４ＣＫＤの９人の患者（１５～５９ｍｌ／分／１．７３ｍ２）が、この調査のために募集された。今回の研究の基礎を形成した対象は、重鎖及び軽鎖フェリチン発現へのＦｅＳの特異的効果を評価した以前の研究（８）の基礎でもある。本研究は、Ａｄｖａｒｒａ ＩＲＢ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤからＩＲＢの承認を受け、各対象からインフォームドコンセントを得た。本研究は、ヘルシンキ宣言に準拠した。除外基準は、妊娠、ＣＫＤの存在以外の重大な医学的疾患、過去３０日間の鉄投与又は５００ｎｇ／ｍｌを超える血漿フェリチン濃度を含む。２つの研究群の具体的な人口統計データ、ｅＧＦＲの検査（ＣＫＤ－ＥＰＩ式）、ＢＵＮ、血清クレアチニン及び血圧は、表１にまとめられる。より詳細な情報は、以前に紹介されている。Ｊｏｈｎｓｏｎ ＡＣ、Ｇｏｏｌｅｙ Ｔ、Ｇｕｉｌｌｅｍ Ｋｅｙｓｅｒ ＪＡ、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ Ｈ、Ｓｉｎｇｈ Ｂ、Ｚａｇｅｒ ＲＡ、Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｉｒｏｎ ｓｕｃｒｏｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｎａｌ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆｅｒｒｉｔｉｎ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｓｍａ，ｕｒｉｎｅ，ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｏｒｇａｎｓ、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０１９；３１７：Ｆ１５６３～Ｆ１５７１。本治験は、Ｃｌｉｎｉｃｉａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ（ＮＣＴ０４０７２４３２）に登録された。

【0025】

本研究の目的のために、Ｃａｓｃａｄｅ Ｃｕｓｔｏｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲにより製造された新規ＦｅＳ製剤「ＲＢＴ－３」を用いた。ＲＢＴ－３と、広く使用されているＦｅＳ調合剤「Ｖｅｎｏｆｅｒ」との間には、複数の物理化学的な違いが存在する（未発表データ）。これらは、以下を含む（それぞれ、ＲＢＴ３対Ｖｅｎｏｆｅｒ）：低いＦｅ２＋／Ｆｅ３＋比、３．４％対１５．８％；低い全Ｆｅ含有量、１２ｍｇ／ｍｌ対２０ｍｇ／ｍｌ；低い有機炭素含有量、７．７％対１２．１４％；低い浸透圧１５４０対１６８１ｍＯｓｍ／Ｋｇ；小さい鉄コアサイズ２．３９対３．８８ｎｍ；高いＮａ含有量１．２６％対０．５％；及び低い平均分子量、２３，８８１対３１，３３５ダルトン。これらの構造的な違いに加え、ＲＢＴ－３及びＶｅｎｏｆｅｒに対する生物学的反応を選択する際の量的な違いも指摘されている（考察参照）。

【0026】

ＨＶ群及びＣＫＤ群をそれぞれ３つの等しいコホートに分け（ｎ、それぞれ３）、各コホートはＲＢＴ－３（１２ｍｇ／ｍｌ原液）１２０、２４０又は３６０ｍｇを受けた。ＲＢＴ－３用量（原液１０、２０又は３０ｍｌ）を生理的食塩水１００ｍｌと共に２時間かけてＩＶ注入した。対象は、潜在的な有害事象を検査するために研究場所（Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｅｄｇｅｗａｔｅｒ、ＦＬ）に一晩とどまった。ベースライン時（０）並びに４、１２、２４及び７２時間にタイミングを合わせて、ヘパリン化血漿試料が回収された。「スポット」尿試料が、ベースライン時及びＲＢＴ－３注入後２４時間に得られた。試料は、市販のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、キット＃ＤＹ８３０７）を使用して、ヘプシジンについて二重でアッセイされた。尿ヘプシジン値は、尿クレアチニン濃度によって算出された。ＥＬＩＳＡ標準曲線試料は、製造業者から提供された。

【0027】

マウス実験
１．マウスにおけるＲＢＴ－３誘導ヘプシジン発現。オスのＣＤ－１マウス（３５～４０グラム、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）が、施設のＩＡＣＵＣにより承認されたすべての動物研究で使用された。マウスに尾静脈から１ｍｇのＲＢＴ－３又はビヒクルのいずれかを注射した（ｎ、それぞれ５）。１８時間後、それらをペントバルビタール（４０～５０ｍｇ／Ｋｇ）で深く麻酔し、腹腔を開き、血液試料を大静脈から得てから腎臓及び肝臓を素早く切除し、氷で冷やし、全ＲＮＡ及びタンパク質を抽出した（１４）。腎臓皮質及び肝臓のヘプシジン（ＨＡＭＰ１）ｍＲＮＡレベルは、以下のプライマーペアを使用した競合的ＲＴ－ＰＣＲにより測定された：左、ｃａｇｃａｇａａｃａｇａａｇｇｃａｔｇａ；右、ａｇａｔｇｃａｇａｔｇｇｇｇａａｇｔｔｇ。ｍＲＮＡ値は、同時に決定されたＧＡＰＤＨ産物によって算出された（１４）。血漿、肝臓及び腎臓皮質のヘプシジンレベルも、ＥＬＩＳＡにより決定された（１４）。

【0028】

２．マウス腎臓Ｎｒｆ２発現へのＲＢＴ－３の効果。ヘプシジンへのその効果に加えて、ＲＢＴ－３がＮｒｆ２経路を活性化するか否かを評価するために、５匹の対照マウス及び５匹のＲＢＴ－３処理マウスの腎臓試料を注射後４時間に回収した。全ｍＲＮＡを抽出し、４つのＮｒｆ２活性化遺伝子：１）ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）、２）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンデヒドロゲナーゼ１（ＮＱＯ１）、３）スルフィレドキシン－１（ＳＲＸＮ１）及び４）グルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）について、以前記載されたように（１５）ＲＴ－ＰＣＲによりアッセイした。さらに、Ｎｒｆ２核移行は、この研究室が以前行ったように（１５）、核タンパク質を抽出しＥＬＩＳＡによりＮｒｆ２についてアッセイすることにより評価された。

【0029】

３．近位尿細管ＨＯ－１発現へのＲＢＴ－３の効果の免疫組織化学分析。ＲＢＴ３を介したＮｒｆ２活性化が近位尿細管細胞においてＮｒｆ２感受性タンパク質レベルの増加をもたらしたことを確認するため、ＨＯ－１タンパク質発現を、ＲＢＴ－３又はビヒクル注射から１８時間後に得られた腎臓で評価した。ホルマリン固定パラフィン包埋組織を、正に荷電したスライドに４ミクロンで切り出し、６０℃で１時間焼成した。スライドは次に、Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤ Ｒｘ染色装置（Ｌｅｉｃａ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）で、脱脂用（Ｄｅｗａｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、抗原賦活化用（Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２）のＬｅｉｃａ Ｂｏｎｄ試薬を使用して脱脂し、染色し、各ステップの後にすすいだ（Ｂｏｎｄ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）。抗原賦活化は、１００℃で２０分間行い、他のステップはすべて周囲温度で行った。内因性のペルオキシダーゼを３％Ｈ２Ｏ２で５分間ブロックした後、ＴＣＴバッファー（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．２５％カゼイン、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．０５％ ＰｒｏＣｌｉｎ３００ ｐＨ ７．６）で１０分間タンパク質ブロッキングを行った。一次抗体ＨＯ－１（Ａｂｃａｍ ａｂ１８９４９１）を６０分間塗布し、その後Ｌｅｉｃａ抗ウサギＨＲＰポリマーを１０分間塗布し、三次ＴＳＡ増幅試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＯＰＡＬ ６５０、１：１００）を１０分間塗布した。スライドを染色装置から取り出し、ＤＡＰＩで５分間染色し、すすぎ、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）でカバーガラスをかけた（ｃｏｖｅｒ ｓｌｉｐｐｅｄ）。

【0030】

４．シスプラチン腎毒性及び腎臓のシスプラチン取込みへのＲＢＴ－３プレコンディショニングの影響。マウスに１ｍｇのＲＢＴ－３又は生理的食塩水ビヒクルを尾静脈から注射した（ｎ、それぞれ５）。１８時間後、すべてのマウスにシスプラチン（１５ｍｇ／Ｋｇ、ＩＰ）を注射した。初めから終わりまで、餌及び水が自由に与えられた。注射から３日後、マウスをペントバルビタール（５０ｍｇ／Ｋｇ ＩＰ）で深く麻酔し、血液試料を、ＢＵＮ及びクレアチニン濃度のために下大静脈から得た。近位尿細管酵素、Ｎ－アセチルグルコサミダーゼ（「ＮＡＧ」）の血漿レベルも評価した（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＤＮＡＧ－１００、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）。さらに、腎臓皮質抽出物を蒸留水で調製し、シスプラチン濃度を製造業者の指示に従って決定した（ＰｒｏＦｏｌｄｉｎ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。

【0031】

５．ＲＢＴ３とＶｅｎｏｆｅｒの比較。構造的な違いに加え、ＲＢＴ３とＶｅｎｏｆｅｒの機能的な違いを実証するため、本発明者は、２つの鉄スクロース調合剤間でヘプシジンｍＲＮＡとＨＯ－１ｍＲＮＡの反応を比較した。６匹のマウスにＲＢＴ３又はＶｅｎｏｆｅｒのいずれか１ｍｇを投与し、２４時間後に肝臓及び腎臓のｍＲＮＡ試料を得た。６つの正常試料は対照値を提供した。

【0032】

統計。各試料は二重でアッセイされ、平均値がデータの表示及び分析に使用された。ヒトヘプシジンデータは、平均値±１ＳＤで表示されている。ＨＶ群及びＣＫＤ群のベースライン血漿ヘプシジン値を、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した。ヘプシジンレベルの経時的な比較は、反復測定のＡＮＯＶＡにより分析し、９５％信頼区間を提示した。ベースラインの人口統計データは、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により比較した。マウスのデータは、平均値±１ＳＥＭとして与えられている。有意性は、ｐ値＜０．０５で判断した。

【0033】

ベースラインの対象情報。研究対象集団の選択された人口統計は、以前に詳細が示されている。表１に概要を示す。

【0034】

【表1】

【0035】

表１説明文。今回の研究の基礎を形成した、９人の健康なボランティア（ＨＶ）及びステージ３～４ＣＫＤの９人の対象のベースライン特性。平均値及び９５％信頼区間の範囲＝平均値±括弧内の数字。Ｐ値は、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により導いた。

【0036】

ＣＫＤ対象は、ＨＶより有意に年齢が高く、ＨＶ群と比較してＣＫＤ男性は少なかった。ＣＫＤ群の平均ｅＧＦＲは、３８±８ｍｌ／分／１．７３ｍ^２（ＨＶ群の＞７０ｍｌ／分．１．７３ｍ^２の約半分）であった。ＣＫＤ対象のｅＧＦＲが低いことは、ＨＶで見られるものに対して、ベースライン及び血漿クレアチニン濃度が上昇することにより明示された。

【0037】

ＨＶ及びＣＫＤ対象におけるベースライン及びＲＢＴ－３後の血漿ヘプシジン濃度。文献と一致して（１６、１７）、ＣＫＤ対象は、ＨＶに対して、ベースライン血漿ヘプシジンレベルが高かった。（それぞれ、２６±２５ｎｇ／ｍｌ対４±５ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．００１）。これは、ＣＫＤに伴う炎症促進性状態及び場合によりＣＫＤに伴うＧＦＲの低下による腎臓ヘプシジンクリアランスの減少を反映したものと推定される。

【0038】

すべての対象が、ＲＢＴ－３注射に反応して、劇的で用量依存的な血漿ヘプシジンの増加を明示した（図１～３）。増加は、ＲＢＴ－３注射から４時間後に早くも観察され、２４時間でピーク値に達した（図１～３）。２４０及び３６０ｍｇの投与量では、２４時間血漿ヘプシジンレベルは、そのベースライン値よりおよそ１５倍高かった。２４時間後、血漿ヘプシジンの急速な減少が観察された。しかし、最終評価時点（７２時間）では、ベースライン値に対して約２～４倍の血漿ヘプシジンの増加が依然として観察された（全群、ｐ＜０．００１）。

【0039】

ＣＫＤがベースラインヘプシジンレベルの増加を伴っていたという事実にも関わらず、これらの増加は、ＲＢＴ－３が引き起こす血漿ヘプシジンの増加の程度に影響を与えなかった。例えば、基底値を超える２４時間の増加は、対象が１２０、２４０又は３６０ｍｇのいずれのＲＢＴ－３投与量を受けても、ＨＶ群及びＣＫＤ群でほとんど同じであった（図４）。

【0040】

結果
ＲＢＴ－３注射に反応するヒト尿中ヘプシジン濃度。ベースラインでは、尿中ヘプシジン濃度は、ＨＶ群とＣＫＤ群とで有意差はなかった（それぞれ、４７±３６対５１±７２ｎｇ／ｍｇ尿クレアチニン）。ＲＢＴ－３注射から２４時間後までに、両群は、ベースライン値に対して約４倍の尿中ヘプシジンの増加を示した（ＨＶ、２１９±１０４、ｐ＝０．０４対ベースライン；ＣＫＤ １７６±９３、ｐ＝０．０１４対ベースライン）。したがって、これらの尿中の増加は、循環するヘプシジンのろ過レベルの増加又は場合により細管からのヘプシジン排出と一致している。

【0041】

マウス実験
１．マウスＨＡＭＰ１遺伝子発現；ＲＢＴ－３に対する血漿、腎臓、肝臓ヘプシジン反応。

【0042】

ベースラインのマウス肝臓ＨＡＭＰ１ ｍＲＮＡ発現（表２）は、腎皮質で観察されるものよりもおよそ２５倍多く、肝臓がヘプシジン産生の主要な部位であることと一致している（１）。肝臓及び腎臓の両方がそれぞれＲＢＴ－３注射に反応し、ＨＡＭＰ１ ｍＲＮＡが増加したが、ＨＡＭＰ１ ｍＲＮＡの増加の程度は、肝臓に対して腎臓で劇的に大きかった（１０倍）。しかし、ベースライン及びＲＢＴ－３後のヘプシジンタンパク質レベルは、２つの臓器で同等であった（ベースライン値に対して約５倍上昇、表２参照）。これらの増加は、ＲＢＴ－３によって誘導されたおよそ３倍の血漿ヘプシジンレベルの増加に対応した（表２）。

【0043】

【表2】

【0044】

表２説明文。２群は、１群につき５匹のマウスで構成された。ＨＡＭＰ１ ｍＲＮＡは、ＧＡＰＤＨによって算出される。値は、平均値±１ＳＥＭである。Ｐ値は、対応のないＳｔｕｄｅｎｔの検定により導いた。

【0045】

２．ＲＢＴ－３に反応するマウス腎臓皮質Ｎｒｆ２遺伝子活性化。試験した４つのＮｒｆ２応答性遺伝子のそれぞれが、ＲＢＴ－３注射後、それらのｍＲＮＡの有意な増加を明示した（図５参照）。対照レベルに対してＨＯ－１ ｍＲＮＡが約２０倍増加したことから、最も応答性の高い遺伝子はＨＯ－１であるように思われた。さらに、ＲＢＴ－３処理群では、対照と比較して、核内Ｎｒｆ２タンパク質レベルの有意な増加が観察された（ｐ＝０．０１７）。

【0046】

３．ＨＯ－１免疫蛍光法。局所的な近位尿細管ＨＯ－１染色が、対照腎臓組織で観察された（図６）。ＨＯ－１染色の範囲及び強度は、ＲＢＴ－３注射後１８時間に大きく増加した。この増加は、主に近位尿細管細胞に限定されているように思われ、それは非常に強い細胞質染色を明示した。糸球体又は髄質のＨＯ－１染色の明らかな増加は、ＲＢＴ－３注射に反応して観察されなかった。

【0047】

４．シスプラチン腎毒性へのＲＢＴ－３の効果。シスプラチン注射から３日後までに、ＢＵＮ及び血漿クレアチニンの著しい上昇により示されるように（表３）、重度の腎損傷が対照マウスで明らかとなった。ＲＢＴ－３プレコンディショニングは、ＢＵＮ及びクレアチニンレベルで評価した場合、シスプラチン誘導損傷をおよそ５０％減少させた。この保護が近位尿細管損傷の減少を反映していることは、体循環へのＮＡＧ放出がほぼ完全に遮断されたことで示された（表３）。興味深いことに、ＲＢＴ－３を介した保護は、腎臓皮質シスプラチン濃度の４０％減少と関連していた（少なくとも部分的には、そのためとみられる）（表３）。

【0048】

【表3】

【0049】

表３説明文。値は、平均値±１ＳＥＭで表示されている。ＢＵＮ及びクレアチニンの値は、ｍｇ／ｄＬである。血漿ＮＡＧの値は、活性単位／リットルである。シスプラチンの値は、μｇ／グラム組織湿重量である。統計的比較は、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により行われた。

【0050】

５．ＶｅｎｏｆｅｒとＲＢＴ３ ＦｅＳ調合剤の比較。肝臓及び腎臓の両方が、ＲＢＴ－３の注射後にＨＡＭＰ１ ｍＲＮＡ値の有意な増加を示した。しかし、腎臓ＨＡＭＰ１ ｍＲＮＡの増加は、ＲＢＴ３ではるかに大きかった（ＲＢＴ－３で１１倍に対しＶｅｎｏｆｅｒで２倍の増加（ｐ＝０．０１５、表４）。対照的に、両鉄がヘプシジンｍＲＮＡを上昇させた一方で、Ｖｅｎｏｆｅｒ対ＲＢＴ－３で肝臓で観察されたヘプシジンタンパク質濃度に差はなかった。これは、腎臓に特異的なＨＡＭＰ１増加反応を示している。腎臓試料においてＨＯ－１ ｍＲＮＡも調査したところ、ＲＢＴ３対Ｖｅｎｏｆｅｒ処理で増加は２倍であった。これらのデータは、２つのＦｅＳ調合剤間の生物学的反応の違いを明らかに実証した。

【0051】

【表4】

【0052】

表４説明文。マウスに１ｍｆのＶｅｎｏｆｅｒ ＦｅＳ又はＲＢＴ－３ ＦｅＳを注射し、続いて２４後にＨＡＭＰ１ ｍＲＮＡ及びＨＯ－１ ｍＲＮＡを評価した。ＲＢＴ－３は、ＨＡＭＰ１（ヘプシジン）ｍＲＮＡの１１倍の増加を誘導したのに対し、Ｖｅｎｏｆｅｒは２．２倍の増加を誘導した。ＲＢＴ－３は、Ｖｅｎｏｆｅｒと比較して、ＨＯ－１ ｍＲＮＡの倍増も誘導した。１０を底とする対数データ変換後Ｐ＝０．０１５。非変換、ｐ＝０．０３７。

【0053】

図１。ＲＢＴ－３（３６０ｍｇ）は、ヒト対象において血漿ヘプシジンレベルの急速かつ著しい増加を誘導する。ＲＢＴ－３注射（３６０ｍｇ）の４時間以内に、血漿ヘプシジンの増加が観察され、２４時間でピークとなった（ベースラインの約１５倍）。ほぼ同じ反応が、健康なボランティア（ＨＶ）及びＣＫＤのコホートで観察された。ＨＶ群及びＣＫＤ群の９５％信頼区間（±）は、図の下部の表に与えられている。反復測定のＡＮＯＶＡから導かれたＰ値。ＨＶ＝健康なボランティア、ＣＫＤ＝慢性腎疾患。

【0054】

図２。ＲＢＴ－３（２４０ｍｇ）は、血漿ヘプシジンレベルの急速かつ著しい増加を誘導する。３６０ｍｇ用量の場合と同様に、ヘプシジンの増加は、４時間で観察され、２４時間の時点でピークとなった。ＣＫＤ群と健康なボランティア（ＨＶ）群とで有意差は観察されなかった。健康なボランティア（ＨＶ）群及びＣＫＤ群の９５％信頼区間（±）は、図の下部の表に与えられている。反復測定のＡＮＯＶＡから導かれたＰ値。

【0055】

図３。ＲＢＴ－３（１２０ｍｇ）は、健康なボランティア（ＨＶ）及びＣＫＤ対象の両方において血漿ヘプシジンの増加を誘導する。ＣＫＤ対象は、７２時間の期間を通して、ＨＶと比較して血漿ヘプシジンレベルが高かった。これは、ＣＫＤ群におけるより高いベースライン（開始）ヘプシジンレベルを反映していると推定される（本文参照）。これは、３６０ｍｇ、２４０ｍｇ及び１２０ｍｇのＲＢＴ－３処理群全体に当てはまることであった（本文及び図４の右側パネル参照）。

【0056】

図４。ベースライン値を超える血漿ヘプシジンレベルの増加。ベースライン血漿ヘプシジンレベルが、健康なボランティア（ＨＶ、右側パネル参照）と比較してＣＫＤコホートでは上昇していたため、これらのベースライン値を超えるＲＢＴ－３によって誘導された増加を計算した（２４時間ピーク値－ベースライン値）。これは、ＣＫＤと健康なボランティアのヘプシジン反応の比較を可能にした。明らかなように、ＨＶ群及びＣＫＤ群は、各鉄投与に伴い、非常に同等のヘプシジンの増加を明示した。値は、平均値±９５％信頼区間である。２４０ｍｇ及び３６０ｍｇのＲＢＴ－３用量は、同等のヘプシジンの増加を誘導し、その両方が、１２０ｍｇのＲＢＴ－３用量群で観察されたものより大きかった。

【0057】

図５。Ｎｒｆ２経路は、ＣＤ－１マウスにおいてＲＢＴ－３注射により活性化される。マウスへのＲＢＴ－３注射後４時間で、試験した４つのＮｒｆ２応答性遺伝子のｍＲＮＡそれぞれの有意な増加が観察された（同時に調査した対照マウスと比較して）。Ｎｒｆ２経路活性化のさらなる証拠は、核タンパク質抽出物において、核Ｎｒｆ２タンパク質結合の増加が見られたことであった。ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンデヒドロゲナーゼ１（ＮＱＯ１）、スルフィレドキシン－１（ＳＲＸＮ１）及びグルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）。

【0058】

図６。免疫組織化学により評価した結果、ＲＢＴ－３は、マウス近位尿細管におけるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）の発現の顕著な増加を誘導する。左側パネルに示される対照腎臓は、近位尿細管セグメントの多様な細胞質染色を実証している。対照的に、ＦｅＳ注射から１８時間後に摘出された腎臓（右側パネル）は、顕著な、ほぼコンフルエントの近位尿細管ＨＯ－１の増加を示した。一方、アスタリスクで表される糸球体では、ＨＯ－１染色の増加は明白ではなかった。したがって、これらの知見は、図５に表されたＨＯ－１ ｍＲＮＡの変化が、ｉ）ＨＯ－１タンパク質レベルの増加及びｉｉ）これらの増加が近位尿細管内で起こったこと、に反映されたことを確認した。

【0059】

化学療法中のプロトポルフィリンの腎保護効果
ＳｎＰＰ（１μモル）又はビヒクル（Ｖ）を０日目に与え、シスプラチン１５ｍｇ／ｋｇを１日目に与え、シスプラチン注射から３日後に、ＢＵＮ、クレアチニン、腎臓皮質ＬＤＨ、並びにＮＧＡＬ、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＨＯ－１及びｐ２１のｍＲＮＡを測定した。ＳｎＰＰは、すべてのシスプラチン処理マウスにおいて、シスプラチン単独と比較して、統計的に有意な保護を付与したＰ＜０．０１）。

【0060】

【表5】

【0061】

本発明の他の実施形態及び使用は、本明細書に開示された本発明の明細書及び実施を考慮することにより、当業者には明らかである。米国及び外国のすべての特許及び特許出願を含む、本明細書に引用されたすべての参考文献は、本明細書によって、参照により本明細書に具体的かつ全体的に組み込む。本明細書及び実施例は、例示的なものに過ぎないと考えられ、本発明の真の範囲及び趣旨が以下の特許請求の範囲により示されることが意図されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【国際調査報告】