(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-03
(54)【発明の名称】ＩＬ１ＲＡＰに結合する抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20230926BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230926BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230926BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230926BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20230926BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230926BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230926BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230926BHJP
A61P 21/02 20060101ALI20230926BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20230926BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230926BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230926BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20230926BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230926BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20230926BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230926BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230926BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20230926BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230926BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20230926BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230926BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230926BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230926BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20230926BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230926BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230926BHJP
A61P 25/20 20060101ALI20230926BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230926BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230926BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230926BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20230926BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
C12Q1/02
A61K39/395 N
A61P17/00
A61P1/18
A61P27/02
A61P11/00
A61P37/08
A61P21/02
A61P11/02
A61P19/02
A61P35/00
A61P27/06
A61P37/06
A61P9/04
A61P13/12
A61P25/00
A61P19/10
A61P21/00
A61P25/04
A61P25/16
A61P17/06
A61P31/04
A61P1/02
A61P11/06
A61P37/02
A61P25/20
A61P3/10
A61P9/10
C12N15/13
C12N5/071
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023516693
(86)(22)【出願日】2021-09-14
(85)【翻訳文提出日】2023-05-09
(86)【国際出願番号】 EP2021075235
(87)【国際公開番号】W WO2022053715
(87)【国際公開日】2022-03-17
(31)【優先権主張番号】20195961.6
(32)【優先日】2020-09-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21151218.1
(32)【優先日】2021-01-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21159485.8
(32)【優先日】2021-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21179711.3
(32)【優先日】2021-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523089863
【氏名又は名称】イシュノス サイエンシズ ソシエテ アノニム
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】ジュリー マコワン
(72)【発明者】
【氏名】アメリー クロゼ
(72)【発明者】
【氏名】ジェレミー ロヨー
(72)【発明者】
【氏名】ティエリー モネイ
(72)【発明者】
【氏名】ラミン ムボウ
(72)【発明者】
【氏名】マリー－アニエス ドゥセイ
(72)【発明者】
【氏名】バレンティーナ ラバンカ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA05
4B063QQ08
4B063QR48
4B063QR77
4B063QS31
4B063QS35
4B065AA90X
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4B065BD39
4B065CA46
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、特異的に、ヒトＩＬ１ＲＡＰに結合し、カニクイザル及び／又はマウスＩＬ１ＲＡＰにも結合し得る抗体に関する。本発明は、ヒト疾患を診断及び治療するためのかかる抗体の使用にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の重鎖ＣＤＲ領域（ＣＤＲ－Ｈ１）、第２の重鎖ＣＤＲ領域（ＣＤＲ－Ｈ２）、及び第３の重鎖ＣＤＲ領域（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む、抗ＩＬ１ ＲＡＰ抗体であって、前記領域は、（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＦＸＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号２６５）を含み、３位のＸが、アミノ酸Ｉ、Ｔ、Ｐのうちのいずれか１つであり得、４位のＸが、アミノ酸Ｌ、Ｆ、Ｙのうちのいずれか１つであり得、５位のＸが、アミノ酸Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｅ、Ｄのうちのいずれか１つであり得、６位のＸが、アミノ酸Ｖ、Ｇ、Ｔ、Ｈ、Ｑ、Ｅ、Ｎ、Ｄのうちのいずれか１つであり得、７位のＸが、アミノ酸Ｆ、Ａ、Ｓ、Ｙのうちのいずれか１つであり得、８位のＸが、アミノ酸Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｐのうちのいずれか１つであり得、９位のＸが、アミノ酸Ｌ、Ｍ、Ａのうちのいずれか１つであり得、１０位のＸが、アミノ酸Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｎのうちのいずれか１つであり得る、ＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列ＡＩＳＹＤＧＥＧＴＬ（配列番号２６６）を含む、ＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＡＲＦＸＹＸＸＡＦＤＹ（配列番号２６７）を含み、４位のＸが、アミノ酸Ｒ、Ｈのうちのいずれか１つであり得、６位のＸが、アミノ酸Ｙ、Ｒのうちのいずれか１つであり得、７位のＸが、アミノ酸Ｔ、Ｓのうちのいずれか１つであり得る、ＣＤＲ－Ｈ３、
又は
（ｄ）ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＸＸＸＸＸＸＡＩＸ（配列番号２６２）を含み、２位のＸが、アミノ酸Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｐ、Ｅのうちのいずれか１つであり得、３位のＸが、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｐ、Ｈ、Ｋ、Ｒのうちのいずれか１つであり得、４位のＸが、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｓ、Ｗ、Ｈ、Ｎ、Ｒのうちのいずれか１つであり得、５位のＸが、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｎ、Ｒのうちのいずれか１つであり得、６位のＸが、アミノ酸Ｖ、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｑ、Ｎ、Ｄのうちのいずれか１つであり得、７位のＸが、アミノ酸Ｙ、Ｈのうちのいずれか１つであり得、１０位のＸが、アミノ酸Ｈ、Ｑのうちのいずれか１つであり得る、ＣＤＲ－Ｈ１、
（ｅ）ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列ＹＩＩＰＸＸＧＸＸＤ（配列番号２６３）を含み、５位のＸが、アミノ酸Ｔ、Ｓのうちのいずれか１つであり得、６位のＸが、アミノ酸Ｖ、Ｌのうちのいずれか１つであり得、８位のＸが、アミノ酸Ｇ、Ｑのうちのいずれか１つであり得、９位のＸが、アミノ酸Ｆ、Ｙのうちのいずれか１つであり得る、ＣＤＲ－Ｈ２、
（ｆ）ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＡＲＧＱＴＬＹＸＸＧＲＱＦＤＩ（配列番号２６４）を含み、８位のＸが、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｄのうちのいずれか１つであり得、および９位のＸが、アミノ酸Ａ、Ｔ、Ｓのうちのいずれか１つであり得る、ＣＤＲ－Ｈ３、からなる群から選択され、前記抗ＩＬ１ ＲＡＰ抗体が、配列番号２６８を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＩＬ１ ＲＡＰ抗体。
【請求項2】
（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列配列番号１２８を含み、（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列配列番号１８８を含み、
（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列配列番号２４８を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記抗体が、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項4】
前記抗体が、１×１０８Ｍ以下、１×１０９Ｍ以下、１×１０１０Ｍ以下、又は１×１０１１Ｍ以下の結合親和性でヒトＩＬ１ ＲＡＰに結合し、任意選択で、前記結合親和性が、配列番号１又は６のヒトＩＬ１ＲＡＰポリペプチドに対する平衡解離定数（ＫＤ）によって測定される、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項5】
前記抗体が、ＩＬ－１刺激シグナル、ＩＬ－３３刺激シグナル、及び／又はＩＬ－３６刺激シグナルを、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％減少させ、前記シグナルの減少が、細胞ベースのブロッキングアッセイによって測定される、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項6】
前記抗体が、配列番号２のカニクイザルＩＬ１ ＲＡＰポリペプチドと交差反応する、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項7】
前記抗体が、配列番号２６１のマウスＩＬ１ ＲＡＰポリペプチドと交差反応する、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項8】
前記抗体が、クラスＩｇＧの全長抗体であり、特に、前記クラスＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及び、ＩｇＧ４から選択されるアイソタイプを有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項9】
前記抗体が、多重特異性抗体である、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体と同じエピトープに特異的に結合する、抗ＩＬ１ ＲＡＰ抗体。
【請求項11】
抗ＩＬ１ ＲＡＰであって、前記抗体が、ＩＬ１ ＲＡＰのドメイン２内の１つ以上のアミノ酸残基に特異的に結合する、抗ＩＬ１ ＲＡＰ。
【請求項12】
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項13】
ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を治療するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項14】
ざ瘡、膵臓炎、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、気道過敏性、気道炎症、アレルギー性結膜炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アレルギー性鼻炎、アレルギー、アルツハイマー病／認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、好中球性皮膚症、化膿性汗腺炎、魚鱗癬、アナフィラキシー、関節炎、喘息／アトピー／鼻ポリープ、アテローム性動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、自己免疫／自己炎症性血管炎（巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、川崎病を含むが、これらに限定されない）、ベーチェット病（神経ベーチェット病を含む）、骨肉腫、脳腫瘍、乳がん、悪液質／拒食症、軟骨炎症、脳虚血、慢性疲労症候群、慢性閉塞性肺疾患、クロストリジウム関連疾患、結腸がん、うっ血性心不全、結膜炎、冠動脈炎症、冠動脈再狭窄、糖尿病、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症、ドライアイ疾患、子宮内膜症、好酸球性消化管疾患、好酸球性食道炎、家族性寒冷自己炎症症候群、家族性地中海熱、線維筋痛症、線維性障害、食物アレルギー、汎発型膿疱性乾癬、緑内障、糸球体腎炎、痛風性関節炎、移植片対宿主病、蠕虫感染症、出血性ショック、汗腺膿瘍、痛覚過敏、高ＩｇＤ症候群、高尿酸血症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、がん性疼痛、感染、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、潰瘍性大腸炎及びクローン病を含むが、これらに限定されない）、挫傷から生じる炎症状態、角膜移植に関連する炎症性眼疾患、炎症性疼痛、インフルエンザ関連後遺症、腸がん、虚血、若年性関節炎、川崎病、腎臓がん、レーバー先天性黒内障、肝臓がん、肝疾患、肺がん、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）、黄斑変性、マックル・ウェルズ症候群、多発性骨髄腫、多発性硬化症、筋骨格系疼痛、骨髄性白血病及び他の白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、心筋機能障害、筋疾患、鼻ポリープ、新生児期発症多臓器系炎症性疾患、神経毒性、好中球性皮膚疾患（掌蹠膿疱症を含む、壊疽性膿皮症、乾癬、スウィート症候群、非感染性結膜炎、非感染性ぶどう膜炎、非小細胞肺がん、整形外科手術、変形性関節症、骨粗鬆症、疼痛、膵臓がん、パーキンソン病、歯周病、末梢動脈疾患、リウマチ性多発筋痛症、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、子癇前症又は子癇、早期陣痛、前立腺がん、原虫性感染症、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、虚血再灌流障害、虚血再灌流障害（ＲＳＶ）、特に、血管形成術及びステント植え込み術後の再狭窄、網膜剥離、網膜色素変性症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、関節リウマチ、強皮症、好酸球性筋膜炎、敗血症性ショック、鎌状赤血球貧血症、放射線療法による副作用、ＳＡＰＨＯ（滑膜炎、ざ瘡、膿疱症、骨増殖症及び骨炎）症候群、副鼻腔炎、皮膚がん、睡眠障害、捻挫による炎症、スティル病、胃がん、全身性エリテマトーデス（ループス腎炎を含む）、顎関節疾患、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群及び他の遺伝性発熱性症候群、移植片拒絶反応、外傷、外傷性眼球損傷、２型糖尿病、並びに白斑を含む群から選択される疾患を治療することにおける使用のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒトＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体及び誘導体に関する。本発明は、ヒト疾患を診断及び治療するためのかかる抗体の使用にも関する。
【背景技術】
【0002】
インターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＩＬ１ＲＡＰ又はＩＬ１－Ｒａｐ）は、インターロイキン１応答性遺伝子の活性化をもたらすシグナル伝達事象を開始させるインターロイキン１受容体複合体の成分である。この遺伝子の選択的スプライシングは、Ｃ末端が異なる膜結合型アイソフォーム及び可溶性アイソフォームをもたらす。可溶性形態対膜結合形態の比率は、急性期誘導又はストレス中に増加する。
【0003】
サイトカインリガンド及び受容体のインターロイキン－１（interleukin-1、ＩＬ－１）ファミリーは、炎症、自己免疫、免疫調節、細胞増殖、及び宿主防御に関連し、炎症性、自己免疫、免疫調節、変性、細胞増殖（例えば、がん）疾患及び障害の病理に寄与し、そのサイトカイン及び受容体は、かかる疾患及び障害の病原性メディエーターとして機能する。例えば、Ｇａｒｌａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３９：１００３－１０１８（２０１３）を参照されたい。
【0004】
サイトカインのＩＬ－１ファミリーには、インターロイキン－１α、インターロイキン－１β、インターロイキン－３３、インターロイキン３６α、インターロイキン－３６β及びインターロイキン－３６γが含まれる。これらのサイトカインの各々は、特定の細胞の表面上に発現される特異的なＩＬ－１ファミリー細胞膜レセプターに結合し得るリガンドとして機能する。ＩＬ－１ファミリーサイトカインのその同族受容体への結合時に、共受容体が動員されて、サイトカイン、その同族膜受容体、及びその共受容体を含む三元複合体が形成される。もたらされた複合体は、細胞内シグナル伝達並びにＮＦ－κＢ及びＡＰ－１並びに分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼを含む転写因子のセットの活性化を促進し、これは、多数のサイトカイン、ケモカイン、酵素、及び接着分子の産生を含む炎症応答及び免疫応答のカスケードを誘発する。
【0005】
ＩＬ１ＲＡＰは、インターロイキン－１受容体１、インターロイキン－１受容体様１としても知られるＳＴ２、及びインターロイキン－１受容体様２（interleukin-1 receptor-like 2、ＩＬ１ＲＬ２）を含む、ＩＬ－１ファミリーにおけるいくつかの受容体についての共通の細胞膜共受容体として機能する。ＩＬ１ＲＡＰは、上記のＩＬ－１ファミリーサイトカインの１つ、サイトカインの特異的同族受容体、及びＩＬ１ＲＡＰ共受容体によって形成される三元シグナル伝達複合体の必要な成分である。したがって、ＩＬ１ＲＡＰは、ＩＬ－１ファミリーサイトカインＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γによって刺激される特定の下流シグナル伝達経路を容易にするために必要とされるので、ＩＬ１ＲＡＰは、ＩＬ－１ファミリーシグナル伝達経路において重要な機能を果たす。
【0006】
国際公開第２０１２／０９８４０７（Ａ１）号は、ＩＬ１ＲＡＰを発現する固形腫瘍に関連する細胞死の誘導並びに／又は細胞の成長及び／若しくは増殖の阻害における使用のための、ＩＬ１ＲＡＰについての特異性を有する抗体などの結合部分を含む薬剤に関する。国際公開第２０１２／０９８４０７（Ａ１）号は、ヒトＩＬ１ＲＡＰに対するマウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体「ｍＡｂ ８１．２」を開示しており、これはインビボで投与されると、黒色腫マウスモデルにおいて腫瘍増殖の統計的に有意な遅延をもたらした。
【0007】
国際公開第２０１５／１３２６０２（Ａ１）号は、ヒトＩＬ１ＲＡＰに対する特異性を有する抗体及び固形腫瘍の治療のためのそれらの使用に関する。国際公開第２０１５／１３２６０２（Ａ１）号は、２００ｐＭのＫＤでヒトＩＬ１ＲＡＰのドメイン２に特異的に結合し、カニクイザルＩＬ１ＲＡＰと交差反応し、１つ以上のがん細胞株（ＣＭＬなど）においてＡＤＣＣを誘導することができ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及びＩＬ－３３刺激シグナル伝達に対していくらかの阻害効果を有する、特異的マウス由来抗体「ＣＡＮ０４」を開示している。
【0008】
国際公開第２０１６／０２０５０２（Ａ１）号は、それぞれ、１．４ｎＭ及び０．９ｎＭのＫＤでヒトＩＬ１ＲＡＰのドメイン３に特異的に結合し、カニクイザルＩＬ１ＲＡＰと交差反応し、１つ以上のがん細胞株（ＣＭＬなど）においてＡＤＣＣを誘導することができる２つの特異的マウス由来抗体「ＣＡＮ０１」及び「ＣＡＮ０３」を開示している。ＣＡＮ０３は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及びＩＬ－３３刺激シグナル伝達に対していくらかの阻害効果を有することが決定されたが、ＣＡＮ０１は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及びＩＬ－３３シグナル伝達に対してかなりの阻害作用を欠くことが見出された。
【0009】
国際公開第２０１６／２０７３０４（Ａ１）号は、ヒトＩＬ－１ＲＡｃＰに特異的に結合し、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６βによって刺激されるＮＦκＢ活性に対していくらかの阻害効果を有するウサギ由来抗体に関する。
【0010】
国際公開第２０１７／１９１３２５（Ａ９）号は、ヒトＩＬ－１Ｒ３に特異的に結合し、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６βによって刺激されるＮＦｋＢ活性に対していくらかの阻害効果を有するヒト化ＩｇＧ１抗体に関する。
【0011】
国際公開第２０２０／０３７１５４（Ａ１）号は、ヒトＩＬ－１Ｒａｐに特異的に結合し、限定されたインビトロモデルにおいていくらかの阻害効果を有するヒト化抗体に関する。
【0012】
サイトカインリガンド及び受容体のＩＬ－１ファミリーを介した不適切なシグナル伝達に関連する炎症性、自己免疫、免疫調節、変性、及び細胞増殖性の疾患又は障害を治療、改善、又は予防する療法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0013】
本開示は、高い親和性でヒトＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、以下のアゴニスト：ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６のうちの１つ以上の結合によって刺激されるシグナル伝達を含む、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６γシグナル伝達経路を減少させる、阻害する、及び／又は完全に遮断することができる。本開示は、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６シグナル伝達の阻害に応答する疾患及び状態を治療する方法も提供する。
【0014】
自己免疫疾患は、しばしば複数の原因を有し、いくつかのシグナル伝達経路の不適切な相互作用から生じ得る。したがって、本発明は、３つ全てのＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６シグナル伝達経路を阻害する抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体に関する。
【0015】
特許請求される本発明による抗体は、例えば線維芽細胞及びＰＢＭＣにおいて、ＩＬ１ＲＡＰによって媒介される３つ全てのサイトカインシグナル伝達経路の遮断を引き起こす。
【0016】
３つ全ての経路を遮断することによって、これは、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ３３Ｒ及びＩＬ３６Ｒを含む炎症性サイトカインのＩＬ１ファミリーの複数の疾患ドライバーを排除し、ＩＳＢ ８８０を、単一サイトカイン遮断療法、又は３つ全てのシグナル伝達経路にアンタゴナイズしない初期の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体と区別する。
【0017】
いくつかの実施形態では、本開示は、第１の重鎖ＣＤＲ領域（ＣＤＲ－Ｈ１）、第２の重鎖ＣＤＲ領域（ＣＤＲ－Ｈ２）、及び第３の重鎖ＣＤＲ領域（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体であって、領域は、
（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＦＸＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号２６５）を含み、３位のＸが、アミノ酸Ｉ、Ｔ、Ｐのうちのいずれか１つであり得、４位のＸが、アミノ酸Ｌ、Ｆ、Ｙのうちのいずれか１つであり得、５位のＸが、アミノ酸Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｅ、Ｄのうちのいずれか１つであり得、６位のＸが、アミノ酸Ｖ、Ｇ、Ｔ、Ｈ、Ｑ、Ｅ、Ｎ、Ｄのうちのいずれか１つであり得、７位のＸが、アミノ酸Ｆ、Ａ、Ｓ、Ｙのうちのいずれか１つであり得、８位のＸが、アミノ酸Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｐのうちのいずれか１つであり得、９位のＸが、アミノ酸Ｌ、Ｍ、Ａのうちのいずれか１つであり得、１０位のＸが、アミノ酸Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｎのうちのいずれか１つであり得る、ＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列ＡＩＳＹＤＧＥＧＴＬ（配列番号２６６）を含む、ＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＡＲＦＸＹＸＸＡＦＤＹ（配列番号２６７）を含み、４位のＸが、アミノ酸Ｒ、Ｈのうちのいずれか１つであり得、６位のＸが、アミノ酸Ｙ、Ｒのうちのいずれか１つであり得、７位のＸが、アミノ酸Ｔ、Ｓのうちのいずれか１つであり得る、ＣＤＲ－Ｈ３、
又は
（ｄ）ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＸＸＸＸＸＸＡＩＸ（配列番号２６２）を含み、２位のＸが、アミノ酸Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｐ、Ｅのうちのいずれか１つであり得、３位のＸが、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｐ、Ｈ、Ｋ、Ｒのうちのいずれか１つであり得、４位のＸが、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｓ、Ｗ、Ｈ、Ｎ、Ｒのうちのいずれか１つであり得、５位のＸが、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｎ、Ｒのうちのいずれか１つであり得、６位のＸが、アミノ酸Ｖ、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｑ、Ｎ、Ｄのうちのいずれか１つであり得、７位のＸが、アミノ酸Ｙ、Ｈのうちのいずれか１つであり得、１０位のＸが、アミノ酸Ｈ、Ｑのうちのいずれか１つであり得る、ＣＤＲ－Ｈ１、
（ｅ）ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列ＹＩＩＰＸＸＧＸＸＤ（配列番号２６３）を含み、５位のＸが、アミノ酸Ｔ、Ｓのうちのいずれか１つであり得、６位のＸが、アミノ酸Ｖ、Ｌのうちのいずれか１つであり得、８位のＸが、アミノ酸Ｇ、Ｑのうちのいずれか１つであり得、９位のＸが、アミノ酸Ｆ、Ｙのうちのいずれか１つであり得る、ＣＤＲ－Ｈ２、
（ｆ）ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＡＲＧＱＴＬＹＸＸＧＲＱＦＤＩ（配列番号２６４）を含み、８位のＸが、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｄのうちのいずれか１つであり得る。９位のＸが、アミノ酸Ａ、Ｔ、Ｓのうちのいずれか１つであり得る、ＣＤＲ－Ｈ３、からなる群から選択され、
当該抗ＩＬ１ ＲＡＰ抗体が、配列番号２６８を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を提供する。
（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＦＸＸＸＸＸＸＸＸ（配列番号２６５）を含み、３位のＸが、アミノ酸Ｉ、Ｔ、Ｐのうちのいずれか１つであり得、４位のＸが、アミノ酸Ｌ、Ｆ、Ｙのうちのいずれか１つであり得、５位のＸが、アミノ酸Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｅ、Ｄのうちのいずれか１つであり得、６位のＸが、アミノ酸Ｖ、Ｇ、Ｔ、Ｈ、Ｑ、Ｅ、Ｎ、Ｄのうちのいずれか１つであり得、７位のＸが、アミノ酸Ｆ、Ａ、Ｓ、Ｙのうちのいずれか１つであり得、８位のＸが、アミノ酸Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｐのうちのいずれか１つであり得、９位のＸが、アミノ酸Ｌ、Ｍ、Ａのうちのいずれか１つであり得、１０位のＸが、アミノ酸Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｎのうちのいずれか１つであり得る、ＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列ＡＩＳＹＤＧＥＧＴＬ（配列番号２６６）を含む、ＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＡＲＦＸＹＸＸＡＦＤＹ（配列番号２６７）を含み、４位のＸが、アミノ酸Ｒ、Ｈのうちのいずれか１つであり得、６位のＸが、アミノ酸Ｙ、Ｒのうちのいずれか１つであり得、７位のＸが、アミノ酸Ｔ、Ｓのうちのいずれか１つであり得る、ＣＤＲ－Ｈ３、
又は
（ｄ）ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列ＧＸＸＸＸＸＸＡＩＸ（配列番号２６２）を含み、２位のＸが、アミノ酸Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｐ、Ｅのうちのいずれか１つであり得、３位のＸが、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｐ、Ｈ、Ｋ、Ｒのうちのいずれか１つであり得、４位のＸが、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｓ、Ｗ、Ｈ、Ｎ、Ｒのうちのいずれか１つであり得、５位のＸが、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｎ、Ｒのうちのいずれか１つであり得、６位のＸが、アミノ酸Ｖ、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｑ、Ｎ、Ｄのうちのいずれか１つであり得、７位のＸが、アミノ酸Ｙ、Ｈのうちのいずれか１つであり得、１０位のＸが、アミノ酸Ｈ、Ｑのうちのいずれか１つであり得る、ＣＤＲ－Ｈ１、
（ｅ）ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列ＹＩＩＰＸＸＧＸＸＤ（配列番号２６３）を含み、５位のＸが、アミノ酸Ｔ、Ｓのうちのいずれか１つであり得、６位のＸが、アミノ酸Ｖ、Ｌのうちのいずれか１つであり得、８位のＸが、アミノ酸Ｇ、Ｑのうちのいずれか１つであり得、９位のＸが、アミノ酸Ｆ、Ｙのうちのいずれか１つであり得る、ＣＤＲ－Ｈ２、
（ｆ）ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＡＲＧＱＴＬＹＸＸＧＲＱＦＤＩ（配列番号２６４）を含み、８位のＸが、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｄのうちのいずれか１つであり得る。９位のＸが、アミノ酸Ａ、Ｔ、Ｓのうちのいずれか１つであり得る、ＣＤＲ－Ｈ３、からなる群から選択され、
当該抗ＩＬ１ ＲＡＰ抗体が、配列番号２６８を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を提供する。
【0018】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）第１の重鎖ＣＤＲ領域（ＣＤＲ－Ｈ１）、第２の重鎖ＣＤＲ領域（ＣＤＲ－Ｌ２）、及び第３の重鎖ＣＤＲ領域（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体であって、（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号８１～１４０から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１４１～２００から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号２０１～２６０から選択されるアミノ酸配列を含む、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を提供する。
【0019】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、配列番号８～５１、６０～７０から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む。
【0020】
本発明は、配列番号１２８、１８８及び２４８の重鎖ＣＤＲを含む抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体に関する。
【0021】
本開示によって提供される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の様々な実施形態では、抗体は、以下の特性：
（ａ）抗体が、１×１０－８Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、１×１０－１０Ｍ以下、又は１×１０－１１Ｍ以下の結合親和性でヒトＩＬ１ＲＡＰに結合し、任意選択で、結合親和性が、配列番号１又は配列番号６のＩＬ１ＲＡＰポリペプチドに対する平衡解離定数（ＫＤ）によって測定される、
（ｂ）抗体が、ＩＬ－１刺激シグナル、ＩＬ－３３刺激シグナル、及び／又はＩＬ－３６刺激シグナルを、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％減少させ、任意選択で、シグナルの減少が、細胞ベースのブロッキングアッセイによって測定され、任意選択で、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６刺激シグナルが、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γから選択されるアゴニストによって刺激される。
（ｃ）抗体が、その同族受容体に結合するＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γアゴニストのうちの１つ以上によって開始される細胞内シグナルを、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％減少させ、任意選択で、細胞内シグナルの減少が、細胞ベースのブロッキングアッセイによって測定される、
（ｄ）抗体が、初代ＨａＣａＴケラチノサイト細胞株由来のＩＬ８の、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及び／又はＩＬ－３６βにより刺激された放出を阻害する、
（ｅ）抗体が、初代ヒト単核細胞由来のＩＬ８の、ＩＬ－１βにより刺激された放出を阻害する、
（ｆ）抗体が、初代ヒト単核細胞由来のＩＦＮ－γの、ＩＬ－３３により刺激された放出を阻害する、
（ｇ）抗体が、ＩＬ－１β及びＩＬ－３６γによる刺激後のＨａＣａＴ馴化培地でのインキュベ－ション時に好中球活性化を阻害する、
（ｈ）抗体が、ヒトＩＬ１ＲＡＰのドメイン２内のアミノ酸残基に結合する、
（ｉ）抗体が、配列番号７のカニクイザルＩＬ１ＲＡＰポリペプチドと交差反応する、及び／又は
（ｊ）抗体が、配列番号２６１のマウスＩＬ１ＲＡＰポリペプチドと交差反応する、のうちの１つ以上を特徴とする。
（ａ）抗体が、１×１０－８Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、１×１０－１０Ｍ以下、又は１×１０－１１Ｍ以下の結合親和性でヒトＩＬ１ＲＡＰに結合し、任意選択で、結合親和性が、配列番号１又は配列番号６のＩＬ１ＲＡＰポリペプチドに対する平衡解離定数（ＫＤ）によって測定される、
（ｂ）抗体が、ＩＬ－１刺激シグナル、ＩＬ－３３刺激シグナル、及び／又はＩＬ－３６刺激シグナルを、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％減少させ、任意選択で、シグナルの減少が、細胞ベースのブロッキングアッセイによって測定され、任意選択で、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６刺激シグナルが、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γから選択されるアゴニストによって刺激される。
（ｃ）抗体が、その同族受容体に結合するＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γアゴニストのうちの１つ以上によって開始される細胞内シグナルを、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％減少させ、任意選択で、細胞内シグナルの減少が、細胞ベースのブロッキングアッセイによって測定される、
（ｄ）抗体が、初代ＨａＣａＴケラチノサイト細胞株由来のＩＬ８の、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及び／又はＩＬ－３６βにより刺激された放出を阻害する、
（ｅ）抗体が、初代ヒト単核細胞由来のＩＬ８の、ＩＬ－１βにより刺激された放出を阻害する、
（ｆ）抗体が、初代ヒト単核細胞由来のＩＦＮ－γの、ＩＬ－３３により刺激された放出を阻害する、
（ｇ）抗体が、ＩＬ－１β及びＩＬ－３６γによる刺激後のＨａＣａＴ馴化培地でのインキュベ－ション時に好中球活性化を阻害する、
（ｈ）抗体が、ヒトＩＬ１ＲＡＰのドメイン２内のアミノ酸残基に結合する、
（ｉ）抗体が、配列番号７のカニクイザルＩＬ１ＲＡＰポリペプチドと交差反応する、及び／又は
（ｊ）抗体が、配列番号２６１のマウスＩＬ１ＲＡＰポリペプチドと交差反応する、のうちの１つ以上を特徴とする。
【0022】
本開示は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体であって、（ｉ）抗体が、モノクローナル抗体であり、（ｉｉ）抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体であり、（ｉｉｉ）抗体が、クラスＩｇＧの全長抗体であり、任意選択で、クラスＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選択されるアイソタイプを有し、（ｉｖ）抗体が、Ｆｃ領域バリアント、任意選択で、エフェクター機能を改変するＦｃ領域バリアント（例えば、エフェクター機能の増加又は減少をもたらすバリアント）、減少したＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、及び／又はＡＤＣＰ活性を示すＦｃ領域変異体、ヒト単球、好中球、及び／又はＪｕｒｋａｔ細胞に対する減少した細胞傷害活性を示すＦｃ領域バリアント、又は抗体半減期を改変するＦｃ領域バリアントであり、（ｖ）抗体が、任意選択で、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）、及びｓｃＦｖからなる群から選択される抗体断片であり、（ｖｉ）抗体が免疫複合体であり、任意選択で、免疫複合体が、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患若しくは状態の治療のための治療剤を含み、（ｖｉｉ）抗体が、多重特異性抗体、任意選択で、二重特異性抗体であり、（ｖｉｉｉ）抗体が、合成抗体であり、ＣＤＲが、免疫グロブリン足場又はフレームワーク以外の足場又はフレームワークに、任意選択で、代替タンパク質足場及び人工ポリマー足場から選択される足場にグラフトされている、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の実施形態も提供する。
【0023】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞も提供する。
【0024】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞も提供する。
【0025】
本開示は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を産生する方法であって、抗体が産生されるように、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をコードする核酸（又はベクター）を含む宿主細胞を培養することを含む、方法も提供する。
【0026】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６、及び／又はＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患若しくは状態の治療のための治療剤を更に含み、任意選択で、治療剤は、化学療法剤である。
【0027】
本開示は、対象におけるＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を治療する方法であって、対象に、治療有効量の本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体、又は治療有効量の本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の医薬製剤を投与することを含む、方法も提供する。
【0028】
本開示は、対象におけるＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６シグナル伝達によって媒介される疾患を治療する方法であって、対象に、治療有効量の本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体、又は治療有効量の本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の医薬組成物を投与することを含む、方法も提供する。
【0029】
本開示は、対象におけるＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γ刺激シグナル伝達によって媒介される疾患を治療する方法であって、対象に、治療有効量の本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体、又は治療有効量の本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の医薬組成物を投与することを含む、方法も提供する。
【0030】
本明細書に開示される治療方法の様々な実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患及び状態、又はＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／若しくはＩＬ－３６シグナル伝達によって媒介される疾患には、炎症性疾患、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、呼吸器疾患、代謝障害、感染症、及びがんが含まれる。いくつかの実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患及び状態は、ざ瘡、膵臓炎、加齢黄斑変症（age-related macular degeneration、ＡＭＤ）、気道過敏性、気道炎症、アレルギー性結膜炎、筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis、ＡＬＳ）、アレルギー性鼻炎、アレルギー、アルツハイマー病／認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、好中球性皮膚症、化膿性汗腺炎、魚鱗癬、アナフィラキシー、関節炎、喘息／アトピー／鼻ポリープ、アテローム性動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、自己免疫／自己炎症性血管炎（巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、川崎病を含むが、これらに限定されない）、ベーチェット病（神経ベーチェット病を含む）、骨肉腫、脳腫瘍、乳がん、悪液質／拒食症、軟骨炎症、脳虚血、慢性疲労症候群、慢性閉塞性肺疾患、クロストリジウム関連疾患、結腸がん、うっ血性心不全、結膜炎、冠動脈炎症、冠動脈再狭窄、糖尿病、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症、ドライアイ疾患、子宮内膜症、好酸球性消化管疾患、好酸球性食道炎、家族性寒冷自己炎症症候群、家族性地中海熱、線維筋痛症、線維性障害、食物アレルギー、汎発型膿疱性乾癬、緑内障、糸球体腎炎、痛風性関節炎、移植片対宿主病、蠕虫感染症、出血性ショック、汗腺膿瘍、痛覚過敏、高ＩｇＤ症候群、高尿酸血症、特発性肺線維症（idiopathic pulmonary fibrosis、ＩＰＦ）、がん性疼痛、感染、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ、潰瘍性大腸炎及びクローン病を含むが、これらに限定されない）、挫傷から生じる炎症状態、角膜移植に関連する炎症性眼疾患、炎症性疼痛、インフルエンザ関連後遺症、腸がん、虚血、若年性関節炎、川崎病、腎臓がん、レーバー先天性黒内障、肝臓がん、肝疾患、肺がん、マクロファージ活性化症候群（macrophage activation syndrome、ＭＡＳ）、黄斑変性、マックル・ウェルズ症候群、多発性骨髄腫、多発性硬化症、筋骨格系疼痛、骨髄性白血病及び他の白血病、骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome、ＭＤＳ）、心筋機能障害、筋疾患、鼻ポリープ、新生児期発症多臓器系炎症性疾患、神経毒性、好中球性皮膚疾患（掌蹠膿疱症を含む、壊疽性膿皮症、乾癬、スウィート症候群、非感染性結膜炎、非感染性ぶどう膜炎、非小細胞肺がん、整形外科手術、変形性関節症、骨粗鬆症、疼痛、膵臓がん、パーキンソン病、歯周病、末梢動脈疾患、リウマチ性多発筋痛症、ポリープ状脈絡膜血管症（polypoidal choroidal vasculopathy、ＰＣＶ）、子癇前症又は子癇、早期陣痛、前立腺がん、原虫性感染症、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、虚血再灌流障害、虚血再灌流障害（respiratory syncytial virus、ＲＳＶ）、特に、血管形成術及びステント植え込み術後の再狭窄、網膜剥離、網膜色素変性症、未熟児網膜症（retinopathy of prematurity、ＲＯＰ）、関節リウマチ、強皮症、好酸球性筋膜炎、敗血症性ショック、鎌状赤血球貧血症、放射線療法による副作用、ＳＡＰＨＯ（滑膜炎（synovitis）、ざ瘡、膿疱症（pustulosis）、骨増殖症（hyperostosis）、及び骨炎（osteitis））症候群、副鼻腔炎、皮膚がん、睡眠障害、捻挫による炎症、スティル病、胃がん、全身性エリテマトーデス（ループス腎炎）、顎関節疾患、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群及び他の遺伝性発熱性症候群、移植片拒絶反応、外傷、外傷性眼球損傷、２型糖尿病、並びに白斑を含む群から選択され得る。
【0031】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象におけるがんを治療する方法であって、対象に、治療有効量の本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の抗体、又は治療有効量の本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の医薬製剤を投与することを含む、方法も提供する。実施形態では、がんは、乳がん、大腸がん、非小細胞肺がん、膵臓がんから選択される。
【0032】
いくつかの実施形態では、本開示は、生物学的試料におけるＩＬ１ＲＡＰのレベルを検出するための方法であって、試料を本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体と接触させるステップを含む、方法も提供する。本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ１ＲＡＰの検出及び定量化のために、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、免疫沈降アッセイ及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＥＩＳＡ）（ｓｏｌａ，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７－１５８，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい）などの任意の公知のアッセイ方法で用いられ得る。抗体は、広範囲のアッセイに適した高い親和性でヒトＩＬ１ＲＡＰポリペプチド（配列番号１又は６）に結合する。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】表面プラズモン共鳴によって評価された、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８ Ｆａｂ及び抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３ ＦａｂのヒトＩＬ－１ＲＡＰへの結合時のヒトＩＬ－１ＲＡＰ／ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１β共受容体／受容体／サイトカイン複合体形成の遮断。組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃと結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーＣＨＩＰ上に固定化した。Ｆａｂ断片を、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中に３００ｎＭで注入して、固定化ヒトＩＬ－１ＲＡＰの飽和に到達させた後、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中に５０ｎＭのＩＬ－１Ｒ１、１００ｎＭのＩＬ－１β及び３００ｎＭのＦａｂ断片の予混合溶液の第２の注入を行った。抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｅ１ Ｆａｂを非ブロッカー対照として使用した。プロットは、共鳴単位（略してＲＵ、Ｙ軸）の数対時間（Ｘ軸）として表されるデータを示す。曲線は、Ｆａｂクローン名を飽和させることによって標識される。
【図2A】表面プラズモン共鳴を用いた、ヒト－ニワトリＩＬ－１ＲＡＰキメラに対する抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８クローン及び抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３クローンのドメインマッピング。抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ（Ａ）又は抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ（Ｂ）を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃと結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーＣＨＩＰ上に固定化した。ヒト－ニワトリＩＬ－１ＲＡＰキメラを、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中５０ｎＭの固定化抗ＩＬ－１ＲＡＰ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ上に注入し、続いてＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中で解離させ、「ｈｓ」はヒトドメインを表し、「ｇｇ」はニワトリドメインを表す。次いで、ヒト－ニワトリキメラは、連続した順序でそれらのそれぞれのヒトドメイン又はニワトリドメインによって記述され、例えば、ｈｓ－ｇｇ－ｇｇ ＩＬ－１ＲＡＰは、ヒトドメイン１、ニワトリドメイン２及びニワトリドメイン３を有するＩＬ－１ＲＡＰを表す。プロットは、共鳴単位（略してＲＵ、Ｙ軸）の数対時間（Ｘ軸）として表されるデータを示す。
【図2B】表面プラズモン共鳴を用いた、ヒト－ニワトリＩＬ－１ＲＡＰキメラに対する抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８クローン及び抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３クローンのドメインマッピング。抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ（Ａ）又は抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ（Ｂ）を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃと結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーＣＨＩＰ上に固定化した。ヒト－ニワトリＩＬ－１ＲＡＰキメラを、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中５０ｎＭの固定化抗ＩＬ－１ＲＡＰ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ上に注入し、続いてＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中で解離させ、「ｈｓ」はヒトドメインを表し、「ｇｇ」はニワトリドメインを表す。次いで、ヒト－ニワトリキメラは、連続した順序でそれらのそれぞれのヒトドメイン又はニワトリドメインによって記述され、例えば、ｈｓ－ｇｇ－ｇｇ ＩＬ－１ＲＡＰは、ヒトドメイン１、ニワトリドメイン２及びニワトリドメイン３を有するＩＬ－１ＲＡＰを表す。プロットは、共鳴単位（略してＲＵ、Ｙ軸）の数対時間（Ｘ軸）として表されるデータを示す。
【図3】Ｏｃｔｅｔ Ｂｉｏｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙを用いた、ヒトＩＬ－１ＲＡＰに対する抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８クローン及び抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３クローンのエピトープビニング。ビオチン化ヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質をストレプトアビジンＳＡバイオセンサー上にロードした。抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８ Ｆａｂを、動態緩衝液中２００ｎＭの固定化ヒトＩＬ－１ＲＡＰ上に注入して、表面の飽和に到達させた。次いで、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３ Ｆａｂ及び抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８ Ｆａｂの予め混合した溶液を各々、２００ｎＭの最終濃度で飽和表面上に注入した。同じ実験手順を、非競合対照として、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３ Ｆａｂの代わりに抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｅ１ Ｆａｂを使用して実行した。プロットは、波長シフト（ｎｍ、Ｙ軸）対時間（Ｘ軸）としてのシフトセンサーチップへの結合を示す。曲線は、競合Ｆａｂクローン名によって標識されている。
【図4A】ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対する抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅＣＣ－ＥＳ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡの表面プラズモン共鳴測定。抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅＣＣ－ＥＳ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡを、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃと結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーＣＨＩＰ上に固定化した。ヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓ又はカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓを、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中の濃度系列における固定化ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ上に注入した。（Ａ）ヒトＩＬ－１ＲＡＰ及び（Ｂ）カニクイザルＩＬ－１ＲＡＰについての１つの代表的な複製を示す。プロットは、共鳴単位の数（略してＲＵ、Ｙ軸）対時間（ｓ、Ｘ軸）として表されるデータを示す。点線は測定データを表し、実線はシミュレートされた適合を表す。ＫＤ：平衡解離定数；Ｋａ：会合定数；Ｋｄ：解離定数。
【図4B】ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対する抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅＣＣ－ＥＳ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡの表面プラズモン共鳴測定。抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅＣＣ－ＥＳ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡを、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃと結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーＣＨＩＰ上に固定化した。ヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓ又はカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓを、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中の濃度系列における固定化ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ上に注入した。（Ａ）ヒトＩＬ－１ＲＡＰ及び（Ｂ）カニクイザルＩＬ－１ＲＡＰについての１つの代表的な複製を示す。プロットは、共鳴単位の数（略してＲＵ、Ｙ軸）対時間（ｓ、Ｘ軸）として表されるデータを示す。点線は測定データを表し、実線はシミュレートされた適合を表す。ＫＤ：平衡解離定数；Ｋａ：会合定数；Ｋｄ：解離定数。
【図5】マウスＩＬ－１ＲＡＰに対する抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３－Ａ３マウスＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡの表面プラズモン共鳴測定。抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３－Ａ３マウスＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡを、抗マウスＩｇＧ Ｆｃと結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーＣＨＩＰ上に固定化した。マウスＩＬ－１ＲＡＰ－ｈｉｓを、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中の濃度系列における固定化ＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ上に注入した。１つの代表的な複製を提示する。プロットは、共鳴単位の数（略してＲＵ、Ｙ軸）対時間（ｓ、Ｘ軸）として表されるデータを示す。点線は測定データを表し、実線はシミュレートされた適合を表す。ＫＤ：平衡解離定数；Ｋａ：会合定数；Ｋｄ：解離定数。
【図6A】抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに特異的に結合する。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又はアイソタイプ対照３（■）の用量反応を、様々な細胞株及び細胞型とインキュベートした。結合した抗体を、モノクローナル抗ヒトＩｇＧ ＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７二次抗体で検出した。グラフは、細胞株毎の非線形シグモイド回帰結合曲線（相対幾何平均蛍光強度）を示す。各データポイントは、所与の細胞株についての測定値である。複数の独立した実験を、数人のドナーにわたって実行した（ＨａＣａＴ及びＨａＣａＴ ＩＬ－１ＲＡＰ ＫＯ：４及び３つの独立した実験；ヒト皮膚線維芽細胞：２つの独立した実験－合計５人のドナー；ヒト好中球：２つの実験－合計６人のドナー；カニクイザル皮膚線維芽細胞：２つの独立した実験－合計４人のドナー）。
【図6B】抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに特異的に結合する。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又はアイソタイプ対照３（■）の用量反応を、様々な細胞株及び細胞型とインキュベートした。結合した抗体を、モノクローナル抗ヒトＩｇＧ ＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７二次抗体で検出した。グラフは、細胞株毎の非線形シグモイド回帰結合曲線（相対幾何平均蛍光強度）を示す。各データポイントは、所与の細胞株についての測定値である。複数の独立した実験を、数人のドナーにわたって実行した（ＨａＣａＴ及びＨａＣａＴ ＩＬ－１ＲＡＰ ＫＯ：４及び３つの独立した実験；ヒト皮膚線維芽細胞：２つの独立した実験－合計５人のドナー；ヒト好中球：２つの実験－合計６人のドナー；カニクイザル皮膚線維芽細胞：２つの独立した実験－合計４人のドナー）。
【図6C】抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに特異的に結合する。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又はアイソタイプ対照３（■）の用量反応を、様々な細胞株及び細胞型とインキュベートした。結合した抗体を、モノクローナル抗ヒトＩｇＧ ＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７二次抗体で検出した。グラフは、細胞株毎の非線形シグモイド回帰結合曲線（相対幾何平均蛍光強度）を示す。各データポイントは、所与の細胞株についての測定値である。複数の独立した実験を、数人のドナーにわたって実行した（ＨａＣａＴ及びＨａＣａＴ ＩＬ－１ＲＡＰ ＫＯ：４及び３つの独立した実験；ヒト皮膚線維芽細胞：２つの独立した実験－合計５人のドナー；ヒト好中球：２つの実験－合計６人のドナー；カニクイザル皮膚線維芽細胞：２つの独立した実験－合計４人のドナー）。
【図6D】抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに特異的に結合する。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又はアイソタイプ対照３（■）の用量反応を、様々な細胞株及び細胞型とインキュベートした。結合した抗体を、モノクローナル抗ヒトＩｇＧ ＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７二次抗体で検出した。グラフは、細胞株毎の非線形シグモイド回帰結合曲線（相対幾何平均蛍光強度）を示す。各データポイントは、所与の細胞株についての測定値である。複数の独立した実験を、数人のドナーにわたって実行した（ＨａＣａＴ及びＨａＣａＴ ＩＬ－１ＲＡＰ ＫＯ：４及び３つの独立した実験；ヒト皮膚線維芽細胞：２つの独立した実験－合計５人のドナー；ヒト好中球：２つの実験－合計６人のドナー；カニクイザル皮膚線維芽細胞：２つの独立した実験－合計４人のドナー）。
【図6E】抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに特異的に結合する。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又はアイソタイプ対照３（■）の用量反応を、様々な細胞株及び細胞型とインキュベートした。結合した抗体を、モノクローナル抗ヒトＩｇＧ ＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７二次抗体で検出した。グラフは、細胞株毎の非線形シグモイド回帰結合曲線（相対幾何平均蛍光強度）を示す。各データポイントは、所与の細胞株についての測定値である。複数の独立した実験を、数人のドナーにわたって実行した（ＨａＣａＴ及びＨａＣａＴ ＩＬ－１ＲＡＰ ＫＯ：４及び３つの独立した実験；ヒト皮膚線維芽細胞：２つの独立した実験－合計５人のドナー；ヒト好中球：２つの実験－合計６人のドナー；カニクイザル皮膚線維芽細胞：２つの独立した実験－合計４人のドナー）。
【図7A】抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ＨａＣａＴ刺激アッセイにおいて、ＩＬ－１及びＩＬ－３６誘導性サイトカイン放出の両方を阻害する。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又はアイソタイプ対照＿３（■）の用量反応を、ＩＬ－１β又はＩＬ－３副刺激ＨａＣａＴ野生型細胞株とインキュベートした。グラフは、刺激（ＩＬ－１β又はＩＬ－３６γ）毎の非線形シグモイド回帰阻害曲線を示す。各データポイントは、独立した実験の測定値である。２つの独立した実験を実行した。
【図7B】抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ＨａＣａＴ刺激アッセイにおいて、ＩＬ－１及びＩＬ－３６誘導性サイトカイン放出の両方を阻害する。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又はアイソタイプ対照＿３（■）の用量反応を、ＩＬ－１β又はＩＬ－３副刺激ＨａＣａＴ野生型細胞株とインキュベートした。グラフは、刺激（ＩＬ－１β又はＩＬ－３６γ）毎の非線形シグモイド回帰阻害曲線を示す。各データポイントは、独立した実験の測定値である。２つの独立した実験を実行した。
【図8A】抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ヒト末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）刺激アッセイにおいてＩＬ－３３誘導性サイトカイン放出を阻害する。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又は対照アイソタイプ＿３（■）の用量反応を、ＩＬ－１β又はＩＬ－１２＋ＩＬ－３３刺激ｈＰＢＭＣとインキュベートした。グラフは、刺激（ＩＬ－１β又はＩＬ－１２＋ＩＬ－３３）毎の非線形シグモイド回帰阻害オーバーレイ曲線を示す。各曲線は、３人のドナーのオーバーレイを表す。２つの独立した実験を行った。
【図8B】抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ヒト末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）刺激アッセイにおいてＩＬ－３３誘導性サイトカイン放出を阻害する。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又は対照アイソタイプ＿３（■）の用量反応を、ＩＬ－１β又はＩＬ－１２＋ＩＬ－３３刺激ｈＰＢＭＣとインキュベートした。グラフは、刺激（ＩＬ－１β又はＩＬ－１２＋ＩＬ－３３）毎の非線形シグモイド回帰阻害オーバーレイ曲線を示す。各曲線は、３人のドナーのオーバーレイを表す。２つの独立した実験を行った。
【図9A】抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、組み合わされたサイトカイン刺激の際に全血再刺激アッセイにおいてサイトカイン放出を阻害する。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又は対照アイソタイプ＿３（■）を、ヒト全血中でＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γの組み合わせとインキュベートした。グラフは、サイトカイン及びケモカイン放出に対する組み合わせの影響、並びに可溶性マーカー放出（Ａ、Ｂ、Ｃ）及び正規化阻害データ（Ｄ）のいずれかに対する各読み出しに対する抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の効果を示す。各ポイントは、１人のドナーについての測定値である。８つの独立した実験を行った。ＮＳは、有意でないこと（Not significant）を表す。＊０，０１＜ｐ＜０，０５の場合、＊＊０，００１＜ｐ＜０，０１の場合。＊ｐ＜０，００１の場合。
【図9B】抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、組み合わされたサイトカイン刺激の際に全血再刺激アッセイにおいてサイトカイン放出を阻害する。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又は対照アイソタイプ＿３（■）を、ヒト全血中でＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γの組み合わせとインキュベートした。グラフは、サイトカイン及びケモカイン放出に対する組み合わせの影響、並びに可溶性マーカー放出（Ａ、Ｂ、Ｃ）及び正規化阻害データ（Ｄ）のいずれかに対する各読み出しに対する抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の効果を示す。各ポイントは、１人のドナーについての測定値である。８つの独立した実験を行った。ＮＳは、有意でないこと（Not significant）を表す。＊０，０１＜ｐ＜０，０５の場合、＊＊０，００１＜ｐ＜０，０１の場合。＊ｐ＜０，００１の場合。
【図9C】抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、組み合わされたサイトカイン刺激の際に全血再刺激アッセイにおいてサイトカイン放出を阻害する。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又は対照アイソタイプ＿３（■）を、ヒト全血中でＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γの組み合わせとインキュベートした。グラフは、サイトカイン及びケモカイン放出に対する組み合わせの影響、並びに可溶性マーカー放出（Ａ、Ｂ、Ｃ）及び正規化阻害データ（Ｄ）のいずれかに対する各読み出しに対する抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の効果を示す。各ポイントは、１人のドナーについての測定値である。８つの独立した実験を行った。ＮＳは、有意でないこと（Not significant）を表す。＊０，０１＜ｐ＜０，０５の場合、＊＊０，００１＜ｐ＜０，０１の場合。＊ｐ＜０，００１の場合。
【図9D】抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、組み合わされたサイトカイン刺激の際に全血再刺激アッセイにおいてサイトカイン放出を阻害する。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又は対照アイソタイプ＿３（■）を、ヒト全血中でＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γの組み合わせとインキュベートした。グラフは、サイトカイン及びケモカイン放出に対する組み合わせの影響、並びに可溶性マーカー放出（Ａ、Ｂ、Ｃ）及び正規化阻害データ（Ｄ）のいずれかに対する各読み出しに対する抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の効果を示す。各ポイントは、１人のドナーについての測定値である。８つの独立した実験を行った。ＮＳは、有意でないこと（Not significant）を表す。＊０，０１＜ｐ＜０，０５の場合、＊＊０，００１＜ｐ＜０，０１の場合。＊ｐ＜０，００１の場合。
【図10】抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ＩＬ－１β及びＩＬ－３６γによる刺激後のＨＡＣＡＴ馴化培地を伴うインキュベーション時に好中球活性化を阻害する。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又はアイソタイプ対照＿３（■）を、ＩＬ－１β及びＩＬ－３副刺激ＨａＣａＴ野生型細胞株とインキュベートした。刺激の２４時間後の馴化培地を、回収し、新たに単離した好中球とインキュベートした。グラフは、活性化好中球のパーセンテージに対する抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の効果を示す。各ポイントは、１人のドナーについての測定値である。３つの独立した実験を、合計９人のドナーで行った。ＮＳは、有意でないこと（Not significant）を表す。＊＊０，０１＜ｐ＜０，０５の場合、＊＊＊＊０，００１＜ｐ＜０，０１の場合、＊＊ｐ＜０，００１の場合。
【図11】抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、マウスＩＬ－１ＲＡＰに特異的に結合する。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又は対照アイソタイプ＿３（■）の用量反応を、様々な細胞株及び細胞型とインキュベートした。結合した抗体を、モノクローナル抗ヒトＩｇＧ ＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７二次抗体で検出した。グラフは、細胞株毎の非線形シグモイド回帰結合曲線（相対幾何平均蛍光強度）を示す。各データポイントは、所与の細胞株についての測定値である。複数の独立した実験を、数人のドナーにわたって行った（ＨａＣａＴ及びＨａＣａＴ ＩＬ－１ＲＡＰ ＫＯ：４及び３つの独立した実験、ヒト皮膚線維芽細胞：２つの独立した実験－合計５人のドナー、ヒト好中球：２つの実験－合計６人のドナー、カニクイザル皮膚線維芽細胞：２つの独立した実験－合計４人のドナー）。
【図12A】抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ＮＩＨ－３Ｔ３刺激アッセイにおいてＩＬ－３３及びＩＬ－３６誘導性サイトカイン放出の両方を阻害する。マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又は対照アイソタイプ＿２（■）の用量反応を、ｍＩＬ－１β、ｈＩＬ－３３、又はｍＩＬ－３６ｓ刺激ＮＩＨ－３Ｔ３とインキュベートした。グラフは、刺激毎の非線形シグモイド回帰阻害曲線を示す。各データポイントは、測定値を表す。
【図12B】抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ＮＩＨ－３Ｔ３刺激アッセイにおいてＩＬ－３３及びＩＬ－３６誘導性サイトカイン放出の両方を阻害する。マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又は対照アイソタイプ＿２（■）の用量反応を、ｍＩＬ－１β、ｈＩＬ－３３、又はｍＩＬ－３６ｓ刺激ＮＩＨ－３Ｔ３とインキュベートした。グラフは、刺激毎の非線形シグモイド回帰阻害曲線を示す。各データポイントは、測定値を表す。
【図12C】抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ＮＩＨ－３Ｔ３刺激アッセイにおいてＩＬ－３３及びＩＬ－３６誘導性サイトカイン放出の両方を阻害する。マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又は対照アイソタイプ＿２（■）の用量反応を、ｍＩＬ－１β、ｈＩＬ－３３、又はｍＩＬ－３６ｓ刺激ＮＩＨ－３Ｔ３とインキュベートした。グラフは、刺激毎の非線形シグモイド回帰阻害曲線を示す。各データポイントは、測定値を表す。
【図13】抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、インターロイキン注射の２４時間後にマウス血清中のＩＬ－５放出を阻害する。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスに、０日目に異なる処理物を腹腔内注射した。処理物注射の２時間後に、マウスにインターロイキン（マウスＩＬ－１β、ヒトＩＬ－３３並びにマウスＩＬ３６α、β及びγ）の混合物を腹腔内注射した。最初の処理物注射の２４時間後に、マウスを安楽死させた。マウス血清を、Ｌｕｍｉｎｅｘ分析のために採取した。ＩＬ－５放出の定量化。Ｂｅｌｙ＿４研究からのデータ。
【図14】抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、インターロイキン注射の７２時間後にマウス血清中のＩＬ－５放出を阻害する。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスに、０日目、１日目及び２日目に異なる処理物を腹腔内注射した。処理物注射の２時間後、マウスにインターロイキン（マウスＩＬ－１β、ヒトＩＬ－３３並びにマウスＩＬ３６α、β及びγ）の混合物を腹腔内注射した。最初の処理物注射の７２時間後に、マウスを安楽死させた。マウス血清を、Ｌｕｍｉｎｅｘ分析のために採取した。ＩＬ－５放出の定量化。 Ｂｅｌｙ＿５試験からのデータ。
【図15】抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、インターロイキン注射の７２時間後にマウス血清中のＧｒｏ－α放出を阻害する。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスに、０日目、１日目及び２日目に異なる処理物を腹腔内注射した。処理物注射の２時間後に、マウスにインターロイキン（マウスＩＬ－１β、ヒトＩＬ－３３並びにマウスＩＬ３６α、β及びγ）の混合物を腹腔内注射した。最初の処理物注射の７２時間後に、マウスを安楽死させた。マウス血清を、Ｌｕｍｉｎｅｘ分析のために採取した。Ｇｒｏ－α放出の定量化。Ｂｅｌｙ＿５研究からのデータ。
【図16】抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、乾癬様皮膚炎症モデルにおいて落屑及び病変スコアの有意な減少を誘導した。剃毛したマウスの背中及び両耳に、５％ＩＭＱクリーム（Ａｌｄａｒａ（登録商標））を毎日局所塗布して、７～１４日間連続してＩＭＱを投与した。局所塗布を保護する手段として、ＩＭＱ処理皮膚領域をＴｅｇａｄｅｒｍ（商標）滅菌不透明包帯で覆った。全ての分子の場合、処理物を、３日に１回腹腔内経路を介してマウスに投与し、アナキンラのみ、毎日腹腔内経路を介して注射した。マウスを毎日物理的に検査し、ＰＡＳＩ（乾癬面積及び重症度指数）スコアを以下のように適用した：紅斑（皮膚の刺激／発赤）及び焼痂（かさぶた）形成（１～４スコア）／落屑及び病変重症度スケール（１～４スコア）。ＩＭＱ＿ｓ２研究からのデータ。
【図17】抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、乾癬様皮膚炎症マウスモデルにおいて好中球浸潤を阻害する。剃毛したマウスの背中及び両耳に、５％ＩＭＱクリーム（Ａｌｄａｒａ（登録商標））を毎日局所塗布して、１２日間連続してＩＭＱを投与した。局所塗布を保護する手段として、ＩＭＱ処理皮膚領域をＴｅｇａｄｅｒｍ（商標）滅菌不透明包帯で覆った。全ての分子の場合、処理物を、３日に１回腹腔内経路を介してマウスに投与し、アナキンラのみ、毎日腹腔内経路を介して注射した。マウスを毎日物理的に検査し、ＰＡＳＩ（乾癬面積及び重症度指数）スコアを以下のように適用した：紅斑（皮膚の刺激／発赤）及び焼痂（かさぶた）形成（１～４スコア）／落屑及び病変重症度スケール（１～４スコア）。本研究の最後に、ＩＨＣを背側皮膚に行った。表皮肥厚の定量化は、マウス１匹当たりスライド１枚当たり４つの皮膚試料／スライド１枚当たり１０枚の写真に関して行った。ＩＭＱ＿ｓ２研究からのデータ。
【図18A】マウスの背側皮膚に対して行った組織学の写真。マウスを、イミキモド及びＰＢＳ（Ａ）、アイソタイプ対照＿３（Ｂ）、１ｍｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（Ｃ）、２５０ｕｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ候補１（Ｄ）、アナキンラ（Ｅ）、ｍＩＬ３６Ｒａ（Ｆ）又は未処理マウス（Ｇ）で処理した。ＩＭＱ＿ｓ２研究からのデータ。
【図18B】マウスの背側皮膚に対して行った組織学の写真。マウスを、イミキモド及びＰＢＳ（Ａ）、アイソタイプ対照＿３（Ｂ）、１ｍｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（Ｃ）、２５０ｕｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ候補１（Ｄ）、アナキンラ（Ｅ）、ｍＩＬ３６Ｒａ（Ｆ）又は未処理マウス（Ｇ）で処理した。ＩＭＱ＿ｓ２研究からのデータ。
【図18C】マウスの背側皮膚に対して行った組織学の写真。マウスを、イミキモド及びＰＢＳ（Ａ）、アイソタイプ対照＿３（Ｂ）、１ｍｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（Ｃ）、２５０ｕｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ候補１（Ｄ）、アナキンラ（Ｅ）、ｍＩＬ３６Ｒａ（Ｆ）又は未処理マウス（Ｇ）で処理した。ＩＭＱ＿ｓ２研究からのデータ。
【図18D】マウスの背側皮膚に対して行った組織学の写真。マウスを、イミキモド及びＰＢＳ（Ａ）、アイソタイプ対照＿３（Ｂ）、１ｍｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（Ｃ）、２５０ｕｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ候補１（Ｄ）、アナキンラ（Ｅ）、ｍＩＬ３６Ｒａ（Ｆ）又は未処理マウス（Ｇ）で処理した。ＩＭＱ＿ｓ２研究からのデータ。
【図18E】マウスの背側皮膚に対して行った組織学の写真。マウスを、イミキモド及びＰＢＳ（Ａ）、アイソタイプ対照＿３（Ｂ）、１ｍｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（Ｃ）、２５０ｕｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ候補１（Ｄ）、アナキンラ（Ｅ）、ｍＩＬ３６Ｒａ（Ｆ）又は未処理マウス（Ｇ）で処理した。ＩＭＱ＿ｓ２研究からのデータ。
【図18F】マウスの背側皮膚に対して行った組織学の写真。マウスを、イミキモド及びＰＢＳ（Ａ）、アイソタイプ対照＿３（Ｂ）、１ｍｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（Ｃ）、２５０ｕｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ候補１（Ｄ）、アナキンラ（Ｅ）、ｍＩＬ３６Ｒａ（Ｆ）又は未処理マウス（Ｇ）で処理した。ＩＭＱ＿ｓ２研究からのデータ。
【図18G】マウスの背側皮膚に対して行った組織学の写真。マウスを、イミキモド及びＰＢＳ（Ａ）、アイソタイプ対照＿３（Ｂ）、１ｍｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（Ｃ）、２５０ｕｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ候補１（Ｄ）、アナキンラ（Ｅ）、ｍＩＬ３６Ｒａ（Ｆ）又は未処理マウス（Ｇ）で処理した。ＩＭＱ＿ｓ２研究からのデータ。
【図19A】（Ａ）抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又は最大用量のアイソタイプ対照＿４（■）の用量反応を、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１α又は５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１βとともにヒト全血中でインキュベートした。グラフは、各読み出しに対する抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の阻害効果を示す。各ポイントは、ベースラインと比較して３倍を超える刺激指数（ＳＩ＞３）を示したドナーについての阻害パーセンテージ±信頼区間の平均である。３つの独立した実験を、試験した合計１５人のドナーで行った。Ｂ）表は、試験した１５人のドナーのうち、刺激及び読み出し毎のグラフに含まれる応答者ドナー（ベースラインと比較してＳＩ＞３）の数を示す。
【図19B】（Ａ）抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又は最大用量のアイソタイプ対照＿４（■）の用量反応を、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１α又は５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１βとともにヒト全血中でインキュベートした。グラフは、各読み出しに対する抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の阻害効果を示す。各ポイントは、ベースラインと比較して３倍を超える刺激指数（ＳＩ＞３）を示したドナーについての阻害パーセンテージ±信頼区間の平均である。３つの独立した実験を、試験した合計１５人のドナーで行った。Ｂ）表は、試験した１５人のドナーのうち、刺激及び読み出し毎のグラフに含まれる応答者ドナー（ベースラインと比較してＳＩ＞３）の数を示す。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本開示は、高い親和性でヒトＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合するヒト化抗体を含む抗体を提供する。開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６シグナル伝達経路を含むＩＬ１ＲＡＰ媒介性経路による細胞内シグナル伝達を減少させる、阻害する、及び／又は完全に遮断することができる。より具体的には、本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、以下のアゴニスト：ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６Γのうちの１つ以上の結合によって刺激されるシグナル伝達を減少させる、阻害する、及び／又は完全に遮断することができる。本開示は、様々ながん（例えば、乳がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、膵臓がん）、並びに炎症性疾患、感染性疾患、及び自己免疫疾患を含むが、これらに限定されない、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６シグナル伝達の阻害に応答する疾患及び状態を含む、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を治療する方法における抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の使用も提供する。
【0035】
用語及び技術の概要
本明細書の説明及び添付の特許請求の範囲について、単数形「１つの（a）」及び「１つの（an）」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「タンパク質（a protein）」への言及は、２つ以上のタンパク質を含み、「化合物（a compound）」への言及は、２つ以上の化合物を指す。「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（include）」、「含む（includes）」、及び「含む（including）」の使用は、互換可能であり、限定することを意図しない。様々な実施形態の説明が、「含む（comprising）」という用語を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例において、ある実施形態が「から本質的になる（consisting essentially of）」又は「からなる（consisting of）」という言語を使用して代替的に説明され得ることを理解するであろうことが、更に理解されるべきである。
本明細書の説明及び添付の特許請求の範囲について、単数形「１つの（a）」及び「１つの（an）」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「タンパク質（a protein）」への言及は、２つ以上のタンパク質を含み、「化合物（a compound）」への言及は、２つ以上の化合物を指す。「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（include）」、「含む（includes）」、及び「含む（including）」の使用は、互換可能であり、限定することを意図しない。様々な実施形態の説明が、「含む（comprising）」という用語を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例において、ある実施形態が「から本質的になる（consisting essentially of）」又は「からなる（consisting of）」という言語を使用して代替的に説明され得ることを理解するであろうことが、更に理解されるべきである。
【0036】
値の範囲が提供される場合、文脈が他を明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限との間の値の各介在整数、及び文脈が他に明確に指示しない限り、その値の各介在整数の各１０分の１、並びにその記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値が、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、また、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界に従う本発明内に包含される。記載された範囲がこれらの限界の一方又は両方を含む場合、これらの含まれる限界の（ｉ）いずれか又は（ｉｉ）両方を除外した範囲も、本発明に含まれる。例えば、「１～５０」は、「２～２５」、「５～２０」、「２５～５０」、「１～１０」などを含む。
【0037】
一般に、本明細書で使用される命名法並びに本明細書で説明される技術及び手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９（以下「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；分子生物学におけるカレント・プロトコル、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の共同事業（２０１１年まで補足）（以下「Ａｕｓｕｂｅｌ」）；抗体エンジニアリング、Ｖｏｌｓ．１ ａｎｄ ２，Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｓ．Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ ａｎｄ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０）；モノクローナル抗体：方法及びプロトコル、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖ．Ｏｓｓｉｐｏｗ ａｎｄ Ｎ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｅｄｓ．，２ ｎｄ Ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１４）；治療抗体：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｚ．Ａｎ，ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．（２００９）；及びファージディスプレイ、Ｔｉｍ Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｒｙ Ｂ．Ｌｏｗｍａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ（２００４）に記載されている一般的な技術及び方法論などの当業者により十分に理解されかつ一般的に用いられるもの含む。
【0038】
本開示において参照される全ての刊行物、特許、特許出願、及び他の文書は、各個別の刊行物、特許、特許出願又は他の文書が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれるように個別に示されるのと同程度に、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0039】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。本開示を解釈する目的で、用語の以下の説明が適用され、適切な場合、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆もまた同様である。
【0040】
「ＩＬ１ＲＡＰ」とは、インターロイキン－１受容体１（ＩＬ１Ｒ１）、ＳＴ２（インターロイキン－１受容体様１又はＩＬ１ＲＬ１としても知られる）、及びインターロイキン－１受容体様タンパク質２（ＩＬ１ＲＬ２）を含む、ＩＬ－１ファミリーにおけるいくつかの受容体についての細胞膜共受容体であるインターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質を指す。インターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質、又はＩＬ１ＲＡＰは、当該技術分野において「ＩＬ－１ＲＡＰ」、「ＩＬ－１ＲＡｃＰ」、「ＩＬ１ＲＡｃＰ」又は「ＩＬ－１Ｒ３」と呼ばれることがあることに留意されたい。「ＩＬ１ＲＡＰ」、「ＩＬ－１Ｒａｐ」及び「ＩＬ１ＲＡＰタンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【0041】
「ＩＬ１ＲＡＰ媒介性状態」又は「ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患」は、本明細書で使用される場合、ＩＬ－１ファミリーサイトカインＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β及びＩＬ－３６Γによって刺激される下流シグナル伝達経路を含むが、これらに限定されない、共受容体として作用するＩＬ１ＲＡＰとともにサイトカインのＩＬ－１ファミリーによって媒介されるシグナル伝達経路の異常な機能に関連する任意の医学的状態を包含する。例えば、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患としては、がん、炎症性、感染性、及び自己免疫疾患を含む、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６シグナル伝達経路のアンタゴニスト又は阻害剤によって媒介される及び／又はそれらに応答する疾患を挙げることができるが、これらに限定されない。より詳細には、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患は、ざ瘡、急性重症潰瘍性大腸炎、成人発症スティル病、アレルギー性鼻炎、痛風性関節炎、若年性関節炎、変形性関節症、関節リウマチ、全身性強皮症、関節痛、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性湿疹、ベーチェット病、悪液質、乳がん、大腸がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、慢性閉塞性肺疾患、ドライアイ症候群、家族性寒冷自己炎症性症候群、家族性地中海熱、食物アレルギー、汎発性膿疱性乾癬、化膿性汗腺炎、高ｌｇＤ症候群、高尿酸血症、マックル・ウェルズ症候群、新生児期発症多臓器系炎症性疾患、筋骨格系疼痛、掌蹠膿疱症、末梢血管疾患、リウマチ性多発筋痛症、鼻ポリープ、乾癬、壊疽性膿皮症、再狭窄、鎌状赤血球貧血症、静脈洞炎、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、２型糖尿病、及び潰瘍性結腸炎を含み得るが、これらに限定されない。
【0042】
「ＩＬ－１刺激シグナル」は、本明細書で使用される場合、ＩＬ－１α又はＩＬ－１βなどのＩＬ－１サイトカインの、その同族細胞表面受容体ＩＬ１Ｒ１への結合によって開始される細胞内シグナルを指す。例示的なＩＬ－１刺激シグナルとしては、本明細書の実施例に開示されるものなどの細胞ベースのブロッキングアッセイを使用して測定可能なものが挙げられる。
【0043】
「ＩＬ－３３刺激シグナル」は、本明細書で使用される場合、ＩＬ－３３などのＩＬ－３３サイトカインの、その同族細胞表面受容体ＩＬ１ＲＬ１（ＳＴ２としても知られる）への結合によって開始される細胞内シグナルを指す。例示的なＩＬ－３３刺激シグナルとしては、本明細書の実施例に開示されるものなどの細胞ベースのブロッキングアッセイを使用して測定可能なものが挙げられる。
【0044】
「ＩＬ－３６刺激シグナル」は、本明細書で使用される場合、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γなどのＩＬ－３６サイトカインの、その同族細胞表面受容体ＩＬ１ＲＬ２への結合によって開始される細胞内シグナルを指す。例示的なＩＬ－３６刺激シグナルとしては、本明細書の実施例に開示されるものなどの、代理細胞ベースのブロッキングアッセイによって測定されるものが挙げられる。
【0045】
「細胞ベースのブロッキングアッセイ」とは、抗体が結合する抗原の生物学的活性を阻害又は減少させる抗体の能力を測定することができるアッセイを指す。例えば、細胞ベースのブロッキングアッセイを使用して、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６シグナル伝達経路を介したＩＬ１ＲＡＰ媒介性細胞内シグナル伝達などの特定の生物学的又は生化学的機能を阻害するのに必要な抗体の濃度を測定することができる。一部の実施形態では、抗体（例えば、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体）の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）及び／又は９０％阻害濃度（ＩＣ９０）は、細胞ベースのブロッキングアッセイを使用して測定される。いくつかの実施形態では、細胞ベースのブロッキングアッセイを使用して、抗体がアゴニスト（例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、ＩＬ－３６γ）とその同族受容体との間の相互作用を遮断するかを決定する。本開示の抗体で有用な細胞ベースのブロッキングアッセイは、初代細胞アッセイ（例えば、ＨａＣａＴ細胞）並びにレポーター又はセンサー細胞アッセイを含み得る。ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６シグナル伝達経路についての例示的な細胞ベースのブロッキングアッセイ、例えば、本明細書に提供される実施例に記載されるもの。
【0046】
「抗体」は、本明細書で使用される場合、特定の抗原に特異的に結合するか、又は特定の抗原と免疫学的に反応性である１つ以上のポリペプチド鎖を含む分子を指す。本開示の例示的な抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、多重特異性（又はヘテロコンジュゲート）抗体（例えば、二重特異性抗体）、一価抗体（例えば、シングルアーム抗体）、多価抗体、抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ、及びｓｃＦｖ断片）、抗体融合体、並びに合成抗体（又は抗体模倣物）が挙げられる。
【0047】
「抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体」又は「ＩＬ１ＲＡＰに結合する抗体」は、抗体がＩＬ１ＲＡＰの標的化において診断剤及び／又は治療剤として有用であるように、十分な親和性でＩＬ１ＲＡＰに結合する抗体を指す。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の非関連ｎｏｎ－ＩＬ１ＲＡＰ抗原への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＩＬ１ＲＡＰへの結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰに結合する抗体は、＜１ｐＭ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜０．０１ｎＭ、又は＜１ｐＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【0048】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、又は「全抗体」は、本明細書で互換的に使用されて、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、又は本明細書において定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【0049】
「抗体断片」は、全長抗体と同じ抗原に結合することができる全長抗体の一部分を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；一価又はシングルアーム抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0050】
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びａと呼ばれる。
【0051】
「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般に、類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＣＤＲ）を含む（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，９１ページを参照されたい）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングする抗原に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを使用して単離され得る（例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０：８８０－８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい）。
【0052】
「超可変領域」又は「ＣＤＲ」は、本明細書で使用される場合、配列が超可変であり、かつ／又は構造的に規定されたループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然抗体は、６つのＣＤＲ、重鎖可変ドメインにおける３つ、ＶＨ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、軽鎖可変ドメインにおける３つ、ＶＬ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）を有する４つの鎖を含む。ＣＤＲは、一般に、超可変ループ由来の及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含む。別段の指示がない限り、可変ドメイン内のＣＤＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に従って番号付けされる。
【0053】
「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、本明細書で使用される場合、最も高い配列可変性を有し、かつ／又は抗原認識に関与する可変ドメインのＣＤＲ内の領域を指す。一般に、天然抗体は、６つのＣＤＲ、重鎖可変ドメインにおける３つ、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、軽鎖可変ドメインにおける３つ、ＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を有する４つの鎖を含む。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４～３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０～５６、Ｌ３のアミノ酸残基８９～９７、Ｈ１のアミノ酸残基２６～３５又は３１～３５、Ｈ２のアミノ酸残基５０～６５又は５０～６５、及びＨ３のアミノ酸残基９３～１０２又は９５～１０２に存在する。（Ｋａｂａｔら、前出）。免疫グロブリンスーパーファミリーの異なるメンバーの配列を収集し、整列させたＫａｂａｔら（前出）の代替方法は、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ－Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８７ Ａｕｇ ２０；１９６（４）：９０１－１７ ａｎｄ Ｎａｔｕｒｅ．１９８９ Ｄｅｃ ２１－２８；３４２（６２５２）：８７７－８３．）及びＬｅｆｒａｎｃら（ＩＭＧＴ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９ Ｊａｎ １；２７（１）：２０９－１２．）によって提案され、彼らは、免疫グロブリン可変ドメイン生殖系列配列についての統一番号付けスキームを提案した。全てのかかる代替的定義は、本発明によって包含され、本明細書に提供される配列が、配列表に提供されるＣＤＲ配列の一部分のみを含み得る代替的に定義されたＣＤＲ配列を除外するように意図されない。具体的には、ＣｈｏｔｈｉａらによるＣＤＲ配列は、Ｈ１のアミノ酸残基２６～３１、Ｈ２のアミノ酸残基５２～６５、及びＨ３のアミノ酸残基９５～１０２に存在する。
【0054】
具体的には、ＬｅＦｒａｎｃらによるＣＤＲ配列は、Ｈ１のアミノ酸残基２７～３８、Ｈ２のアミノ酸残基５６～６５、及びＨ３のアミノ酸残基１０５～１１７に存在する。
【0055】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＣＤＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＣＤＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）において以下の配列に現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
【0056】
「天然抗体」は、天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（Λ）と呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てられ得る。
【0057】
「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体を指す、すなわち、可能なバリアント抗体（例えば、バリアント抗体は、天然に生じるか、又はモノクローナル抗体の産生中に生じ、一般に少量で存在する変異を含む）を除いて、集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられるものである。したがって、「モノクローナル」という用語は、抗体の実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない様々な技術によって作製され得、かかる方法及びモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【0058】
「キメラ抗体」は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の供給源又は種に由来する抗体を指し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
【0059】
「ヒト化抗体」は、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸配列及びヒトＦＲ由来のアミノ酸配列を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【0060】
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生されるか、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【0061】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３におけるようなサブグループである。一実施形態では、ＶＬについて、サブグループは、Ｋａｂａｔら（上記）にあるようなサブグループカッパＩである。一実施形態では、ＶＨについて、サブグループは、Ｋａｂａｔら（上記）にあるようなサブグループＩＩＩである。
【0062】
本明細書で使用される「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、又はそれはアミノ酸配列変化を含み得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【0063】
「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含む二量体複合体を指し、Ｃ末端ポリペプチド配列は、インタクトな抗体のパパイン消化によって得ることができるものである。Ｆｃ領域は、天然又はバリアントＦｃ配列を含み得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ配列の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ配列は、通常、およそＣｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、又はおよそＰｒｏ２３０位から、Ｌｙｓ４４７のＦｃ配列のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。しかしながら、Ｆｃ配列のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、組換え産生（例えば、ＣＨＯ細胞における産生）のために使用される細胞培養系において起こり得る酵素的切断に起因して、組換え抗体のＦｃ領域に存在しても存在しなくてもよい。免疫グロブリンのＦｃ配列は、一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、任意選択で、ＣＨ４ドメインを含む。
【0064】
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を指す。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、天然ヒトＦｃＲである。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子多型及び選択的スプライシングフォームを含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif、ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif、ＩＴＩＭ）を含む（例えば、Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：２０３－２３４（１９９７）を参照されたい）。ＦｃＲには、本明細書で使用される場合、胎児への母体ＩｇＧの移動（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１ １７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４２９－２４３４（１９９４））及び免疫グロブリンの恒常性の調節を担う新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲは、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，９：４５７－９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５－３４（１９９４）、及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１２６：３３０－４１（１９９５）でレビューされている。
【0065】
「多価抗体」は、本明細書で使用される場合、３つ以上の抗原結合部位を含む抗体である。多価抗体は、好ましくは、３つ以上の抗原結合部位を有するように操作され、一般的に、天然配列ＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。
【0066】
「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる結合部位を有し、各部位が異なる結合特異性を有する抗体である。多重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片であり得、異なる結合部位が各々異なる抗原に結合してもよく、又は異なる結合部位が同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合してもよい。
【0067】
「Ｆｖ断片」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む抗体断片を指す。この領域は、強固に会合した１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなり、これは、例えば、ｓｃＦｖにおいて、本質的に共有結合であり得る。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定するのは、この立体配置においてである。集合的に、６つのＣＤＲ又はそのサブセットは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、通常は結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【0068】
「Ｆａｂ断片」は、軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメイン並びに重鎖の可変ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、それらの間のヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端付近で一般的に共有結合される一対のＦａｂ断片を含む。抗体断片の他の化学的カップリングもまた、当該技術分野で公知である。
【0069】
「抗原結合アーム」は、本明細書で使用される目的場合、目的の標的分子に特異的に結合する能力を有する抗体の構成要素を指す。典型的には、抗原結合アームは、免疫グロブリンポリペプチド配列、例えば、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のＣＤＲ及び／又は可変ドメイン配列の複合体である。
【0070】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を指し、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが所望の抗原結合構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインとの間に更に含む。
【0071】
「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ及びＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位を生成する。
【0072】
「直鎖状抗体」は、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５）に記載されている抗体を指す。簡潔に説明すると、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドとともに、一対の抗原結合領域を形成する重鎖断片の縦列反復（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は、二重特異性又は単一特異性であり得る。
【0073】
「ネイキッド抗体」は、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。
【0074】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原との）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、平衡解離定数（ＫＤ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野で公知の一般的な方法によって測定され得る。結合親和性を測定するための特定の説明のためのかつ例示的な実施形態を以下に記載する。
【0075】
「特異的に結合する」又は「特異的結合」は、約１×１０－７Ｍ以下の親和性値での抗体の抗原への結合を指す。
【0076】
「親和性成熟」抗体は、かかる改変を有しない親抗体と比較して、１つ以上のＣＤＲに１つ以上の改変を有する抗体を指し、かかる改変は、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。
【0077】
抗体の「機能的抗原結合部位」は、標的抗原に結合することができるものである。抗原結合部位の抗原結合親和性は、抗原結合部位が由来する親抗体ほど強力である必要はないが、抗原に結合する能力は、抗原への抗体結合を評価するための公知の種々の方法のいずれか１つを使用して測定可能でなければならない。
【0078】
「単離された抗体」は、その自然環境の構成要素から分離された抗体を指す。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（isoelectric focusing、ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換若しくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定されるように、９５％又は９９％の純度を超えるまで精製される。抗体純度の評価のための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，８４８：７９－８７を参照されたい。
【0079】
「実質的に類似」又は「実質的に同じ」は、本明細書で使用される場合、２つの数値（例えば、一方は試験抗体に関連し、他方は参照抗体に関連する）間の十分に高い程度の類似性を指し、その結果、当業者は、２つの値間の差異が、当該値（例えば、ＫＤ値）によって測定される生物学的特徴の文脈内で、生物学的及び／又は統計的有意性が殆ど又は全くないと考えるであろう。
【0080】
「実質的に異なる」とは、本明細書で使用される場合、２つの数値（一般に、一方は分子に関連し、他方は参照分子に関連する）間の十分に高い程度の差を指し、その結果、当業者は、２つの値間の差が、当該値（例えば、ＫＤ値）によって測定される生物学的特徴の文脈内で統計的に有意であると考えるであろう。
【0081】
「エフェクター機能」とは、抗体アイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因するその生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（complement dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化が含まれる。
【0082】
「免疫複合体」は、細胞傷害性薬剤を含むが、これに限定されない１つ以上の異種分子にコンジュゲートされた抗体を指す。
【0083】
「治療」、「治療する」、又は「治療すること」は、治療されている個体における障害の自然経過を変化させる試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過中のいずれかで行われ得る。治療の所望の結果としては、障害の発生又は再発の予防、症状の緩和、障害の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、進行速度の減少、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、治療は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む治療有効量の医薬製剤を対象に投与して、ＩＬ１ＲＡＰによって媒介される疾患又は状態の発症を遅延させるか、又はその進行を遅らせることを含み得る。
【0084】
「医薬製剤」は、活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にし、製剤が投与される対象に対して毒性である追加の成分を含まない形態の調製物を指す。
【0085】
「薬学的に許容される担体」は、それが投与される対象に対して非毒性である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0086】
「治療有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するための、例えば、対象における疾患、障害、又は状態を治療又は予防するための、活性成分又は薬剤（例えば、医薬製剤）の量を指す。ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患又は状態の場合、治療剤の治療有効量は、疾患、障害、又は状態に関連する症状のうちの１つ以上をある程度まで軽減、予防、抑制、及び／又は緩和する量である。喘息治療の場合、インビボでの有効性は、例えば、症状の持続期間、重症度、及び／若しくは再発、応答率（response rate、ＲＲ）、応答の持続期間、並びに／又は生活の質を評価することによって測定され得る。
【0087】
「同時に」は、本明細書で使用される場合、投与の少なくとも一部が時間的に重複する、２つ以上の治療剤の投与を指す。したがって、同時投与は、１つ以上の他の薬剤の投与を中断した後に１つ以上の薬剤の投与が継続する場合の投薬レジメンを含む。
【0088】
「個体」又は「対象」は、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、並びに齧歯類（例えば、マウス及びラット）を含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。
【0089】
抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の結合親和性及び細胞シグナル伝達阻害
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ヒトＩＬ１ＲＡＰへの結合について、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜０．０１ｎＭ、又は＜０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の平衡解離定数（ＫＤ）を有する。より具体的には、いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、１×１０－８Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、１×１０－１０Ｍ以下、又は１×１０－１１Ｍ以下の結合親和性でヒトＩＬ１ＲＡＰに結合する。いくつかの実施形態では、結合親和性は、ヒトＩＬ１ＲＡＰポリペプチド（配列番号１又は６）への結合についての平衡解離定数（ＫＤ）として測定される。一般に、リガンドのその受容体に対する結合親和性は、種々のアッセイのいずれかを使用して決定され得、かつ種々の定量値に関して表され得る。抗体の親和性を決定することにおいて有用な特異的ＩＬ１ＲＡＰ結合アッセイは、本明細書の実施例に開示されている。更に、抗原結合アッセイは当該技術分野で公知であり、かつ本明細書で使用され得、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunoabsorbent assay、ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、表面プラズモン共鳴ベースのアッセイ（例えば、国際公開第２００５／０１２３５９号に記載されるＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する任意の直接的又は競合的結合アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ヒトＩＬ１ＲＡＰへの結合について、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜０．０１ｎＭ、又は＜０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の平衡解離定数（ＫＤ）を有する。より具体的には、いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、１×１０－８Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、１×１０－１０Ｍ以下、又は１×１０－１１Ｍ以下の結合親和性でヒトＩＬ１ＲＡＰに結合する。いくつかの実施形態では、結合親和性は、ヒトＩＬ１ＲＡＰポリペプチド（配列番号１又は６）への結合についての平衡解離定数（ＫＤ）として測定される。一般に、リガンドのその受容体に対する結合親和性は、種々のアッセイのいずれかを使用して決定され得、かつ種々の定量値に関して表され得る。抗体の親和性を決定することにおいて有用な特異的ＩＬ１ＲＡＰ結合アッセイは、本明細書の実施例に開示されている。更に、抗原結合アッセイは当該技術分野で公知であり、かつ本明細書で使用され得、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunoabsorbent assay、ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、表面プラズモン共鳴ベースのアッセイ（例えば、国際公開第２００５／０１２３５９号に記載されるＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する任意の直接的又は競合的結合アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【0090】
したがって、いくつかの実施形態では、結合親和性は、ＫＤ値として表され、固有の結合親和性（例えば、最小化されたアビディティー効果を有する）を反映する。本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ヒトＩＬ１ＲＡＰポリペプチド（配列番号１又は６）に対して強い結合親和性を示し、例えば、１０ｎＭ～１ｐＭのＫＤ値を示す。
【0091】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６シグナル伝達経路を含むＩＬ１ＲＡＰ媒介性経路による細胞内シグナル伝達、より具体的には、以下のアゴニスト：ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６Γの１つ以上の結合により刺激されるシグナル伝達経路を減少させる、阻害する、及び／又は完全に遮断する。これらのＩＬ１ＲＡＰ媒介性シグナル伝達経路を阻害する抗体の能力は、本開示の実施例に記載されるレポーター細胞アッセイ及び初代細胞ベースのブロッキングアッセイを含む公知の細胞ベースのブロッキングアッセイを使用してインビトロでアッセイされ得る。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達を減少させる、阻害する、及び／又は完全に遮断する抗体の能力は、およそＥＣ５０の濃度でアゴニストＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γとともにレポーター細胞ベースのブロッキングアッセイを使用して、抗体のＩＣ５０として決定される。アゴニストＥＣ５０は、多くの場合、アッセイ前にのみ推定することができ、アッセイがデータの非線形回帰分析を使用して完了した後に決定される。かかるアッセイにおいて、およそＥＣ５０の値は、典型的には、ＥＣ４０～４５～ＥＣ５５～６０の範囲にある。
【0092】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性経路による細胞内シグナル伝達を減少させる、阻害する、及び／又は完全に遮断する能力に基づく以下の機能的特性のうちの１つ以上を特徴とする。
【0093】
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ－１刺激シグナル、ＩＬ－３３刺激シグナル、及び／又はＩＬ－３６刺激シグナルを少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％減少させる。いくつかの実施形態では、シグナルの減少は、レポーター細胞ベースのブロッキングアッセイを使用して測定され得る。当業者は、ＩＬ－１刺激経路、ＩＬ－３３刺激経路、及び／又はＩＬ－３６刺激経路における細胞シグナル伝達の阻害を決定する際の使用のために公知のレポーター細胞アッセイのいずれかを選択することができる。一般に、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、又は１ｎＭの抗体についてＩＣ５０値で、およそＥＣ５０（例えば、ＥＣ４０～ＥＣ６０）の濃度のアゴニストの結合によって開始されるＩＬ１ＲＡＰ媒介性細胞内シグナルを減少させる。
【0094】
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ－１刺激シグナル、ＩＬ－３３刺激シグナル、及びＩＬ－３６刺激シグナルを少なくとも９５％、又は少なくとも９９％減少させ、任意選択で、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６刺激シグナルは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γから選択されるアゴニストによって刺激され、任意選択で、およそＥＣ５０のアゴニスト濃度で、抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。
【0095】
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、その同族受容体に結合するアゴニストによって、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γのうちの１つ以上によって開始される細胞内シグナルを少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％減少させる。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、初代ヒト肺線維芽細胞（primary human lung fibroblast、ＰＨＬＦ）由来のＩＬ８のＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及び／又はＩＬ－３６β刺激放出を阻害し、任意選択で、およそＥＣ５０のＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及び／又はＩＬ－３６β濃度で、抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、初代ヒト単球由来のＩＬ６のＩＬ－１β刺激放出を阻害し、任意選択で、およそＥＣ５０のＩＬ－１β濃度で、抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ヒトナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞由来のＩＮＦ－γのＩＬ－３３刺激放出を阻害し、任意選択で、およそＥＣ５０のＩＬ－３３濃度で、抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）由来のＩＬ８のＩＬ－３６β刺激放出を阻害し、任意選択で、およそＥＣ６０のＩＬ－３６β濃度で、抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、又は２ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、好塩基球におけるＩＬ－３３刺激リン酸化を阻害し、任意選択で、およそＥＣ５６のＩＬ－３３濃度で、抗体は、７５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、又は４５ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞由来のＩＮＦ－γのＩＬ－３３刺激放出を阻害し、任意選択で、およそＥＣ３４のＩＬ－３３濃度で、抗体は、７５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、又は４５ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。
【0096】
抗体断片
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、抗体フラグメントであり得る。本開示の結合決定基を有する有用な抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一価、一アーム（又は単一アーム）抗体、ｓｃＦｖ断片、並びに本明細書に記載されかつ当該技術分野で公知の他の断片が挙げられるが、これらに限定されない。様々な抗体断片の概説については、例えば、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたく、国際公開第９３／１６１８５号、並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。他の一価抗体形態は、例えば、国際公開第２００７／０４８０３７号、国際公開第２００８／１４５１３７号、国際公開第２００８／１４５１３８号、及び国際公開第２００７／０５９７８２号に記載されている。一価のシングルアーム抗体は、例えば、国際公開第２００５／０６３８１６号に記載されている。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である（例えば、欧州特許第０４０４０９７号、国際公開第９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、抗体フラグメントであり得る。本開示の結合決定基を有する有用な抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一価、一アーム（又は単一アーム）抗体、ｓｃＦｖ断片、並びに本明細書に記載されかつ当該技術分野で公知の他の断片が挙げられるが、これらに限定されない。様々な抗体断片の概説については、例えば、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたく、国際公開第９３／１６１８５号、並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。他の一価抗体形態は、例えば、国際公開第２００７／０４８０３７号、国際公開第２００８／１４５１３７号、国際公開第２００８／１４５１３８号、及び国際公開第２００７／０５９７８２号に記載されている。一価のシングルアーム抗体は、例えば、国際公開第２００５／０６３８１６号に記載されている。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である（例えば、欧州特許第０４０４０９７号、国際公開第９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい）。
【0097】
いくつかの実施形態では、抗体断片は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい）。
【0098】
抗体断片は、本明細書に記載される場合、インタクトな抗体のタンパク質分解消化並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含むが、これらに限定されない様々な技術によって作製され得る。
【0099】
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のいずれかは、当該技術分野で公知であり、かつ／又は本明細書に記載される方法及び技術を使用して、抗体断片として調製され得ることが企図される。例えば、本開示の様々な抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のＦａｂバージョンの調製及び分析は、実施例８に記載されている。
【0100】
キメラ抗体及びヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、キメラ抗体であり得る。（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４）に記載されるキメラ抗体を参照されたい）。一実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のクラス又はサブクラスから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含み得ることが企図される。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、キメラ抗体であり得る。（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４）に記載されるキメラ抗体を参照されたい）。一実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のクラス又はサブクラスから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含み得ることが企図される。
【0101】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減させるようにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、抗体特異性又は親和性を回復又は改善する非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【0102】
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ，１３：１６１９－１６３３（２００８）に概説され、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２７（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９－１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（α－ＣＤＲ）グラフティングを記載）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング」を記載）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）、及びＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）ＦＲシャッフリングへの「ガイドされた選択」アプローチを記載）に更に記載されている。
【0103】
ヒト化に有用なヒトフレームワーク領域としては、「ベストフィット」法（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）を用いて選択されるフレームワーク領域、軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照されたい）、及びスクリーニングＦＲライブラリーに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0104】
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のいずれかは、当該技術分野で公知であり、かつ／又は本明細書に記載される方法及び技術を使用してヒト化抗体として調製され得ることが企図される。例えば、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のヒト化バージョンの調製及び分析は、実施例に記載されている。
【0105】
ヒト抗体
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ヒト抗体であり得る。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して産生され得る。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，５：３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するか、若しくは動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。かかるトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号におけるＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術、米国特許第５，７７０，４２９号におけるＨＵＭＡＢ（登録商標）技術、米国特許第７，０４１，８７０号におけるＫ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術、及び米国特許出願公開第２００７／００６１９００号におけるＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を参照されたい。かかる動物によって生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、更に改変され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ヒト抗体であり得る。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して産生され得る。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，５：３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するか、若しくは動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。かかるトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号におけるＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術、米国特許第５，７７０，４２９号におけるＨＵＭＡＢ（登録商標）技術、米国特許第７，０４１，８７０号におけるＫ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術、及び米国特許出願公開第２００７／００６１９００号におけるＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を参照されたい。かかる動物によって生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、更に改変され得る。
【0106】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）にも記載されている。ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する更なる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号に記載されるものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（すなわち、トリオーマ技術）は、例えば、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）に記載されている。
【0107】
ヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成される場合もある。次いで、かかる可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
【0108】
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のうちのいずれかは、当該技術分野で公知であり、かつ／又は本明細書に記載される方法及び技術を使用して、ヒト抗体として調製され得ることが企図される。
【0109】
ライブラリー由来抗体
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、所望の活性又は複数の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてかかるライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が，当該技術分野で公知である。本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のヒト化バージョンの親和性成熟バリアントの調製のためのファージディスプレイの使用は、本明細書に開示される実施例に記載されている。かかるライブラリー由来抗体を産生するための他の方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００１）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２－５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）、Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３８（２）：２９９－３１０（２００４）、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）において見出され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、所望の活性又は複数の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてかかるライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が，当該技術分野で公知である。本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のヒト化バージョンの親和性成熟バリアントの調製のためのファージディスプレイの使用は、本明細書に開示される実施例に記載されている。かかるライブラリー由来抗体を産生するための他の方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００１）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２－５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）、Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３８（２）：２９９－３１０（２００４）、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）において見出され得る。
【0110】
コンビナトリアルライブラリースクリーニングを使用して、当該技術分野で公知であり、かつ／又は本明細書に記載の方法及び技術を使用して、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のバリアントを作製することができることが企図される。例えば、本開示のヒト化抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の広範囲の親和性成熟バリアントを調製するファージディスプレイライブラリー生成及びスクリーニングの使用は、実施例１に記載されている。
【0111】
多重特異性抗体
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる結合部位を有するモノクローナル抗体であり、各々が異なる抗原に対する結合特異性を有し、そのうちの少なくとも１つがＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、結合部位のうちの少なくとも１つは、細胞傷害性薬剤に特異的に結合する。例示的な実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、二重特異性抗体であり、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に細胞毒性薬剤を局在化させるように使用され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる結合部位を有するモノクローナル抗体であり、各々が異なる抗原に対する結合特異性を有し、そのうちの少なくとも１つがＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、結合部位のうちの少なくとも１つは、細胞傷害性薬剤に特異的に結合する。例示的な実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、二重特異性抗体であり、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に細胞毒性薬剤を局在化させるように使用され得る。
【0112】
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え同時発現が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、国際公開第２０１２／１３１５５５号を参照されたい）。
【0113】
多重特異性抗体は、ホモ二量体ではなくＦｃ－ヘテロ二量体抗体分子の形成に有利に働く「静電ステアリング」効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４（Ａ１）号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）を参照されたい）、二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）、又は三重特異性抗体（例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：６０（１９９１）を参照されたい）によって作製され得る。
【0114】
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のいずれかは、当該技術分野で公知であり、かつ／又は本明細書に記載される方法及び技術を使用して、多重特異性抗体として調製され得ることが企図される。
【0115】
抗体バリアント
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のバリアントも企図される。例えば、抗体の改善された結合親和性及び／又は他の生物学的特性を有する抗体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。かかる改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はその中への挿入、及び／又はその置換が含まれる。最終構築物がＩＬ１ＲＡＰ抗原結合の所望の特徴を有するという条件で、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行って、最終構築物に到達することができる。本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の広範なバリアントは、当該技術分野で公知であり、かつ／又は本明細書に記載されている方法及び技術を使用して調製され得ることが企図され、これには、（ｉ）アミノ酸置換、挿入及び／又は欠失バリアント、（ｉｉ）グリコシル化バリアント、（ｉｉｉ）Ｆｃ領域バリアント、（ｉｖ）システイン操作バリアント、及び（ｖ）誘導体化バリアントが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のバリアントも企図される。例えば、抗体の改善された結合親和性及び／又は他の生物学的特性を有する抗体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。かかる改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はその中への挿入、及び／又はその置換が含まれる。最終構築物がＩＬ１ＲＡＰ抗原結合の所望の特徴を有するという条件で、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行って、最終構築物に到達することができる。本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の広範なバリアントは、当該技術分野で公知であり、かつ／又は本明細書に記載されている方法及び技術を使用して調製され得ることが企図され、これには、（ｉ）アミノ酸置換、挿入及び／又は欠失バリアント、（ｉｉ）グリコシル化バリアント、（ｉｉｉ）Ｆｃ領域バリアント、（ｉｖ）システイン操作バリアント、及び（ｖ）誘導体化バリアントが含まれるが、これらに限定されない。
【0116】
置換、挿入、及び欠失バリアント
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるものに加えて１つ以上のアミノ酸置換を有する抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体バリアントが提供される。変異誘発のための部位は、ＣＤＲ及びＦＲを含み得る。典型的な「保存的」アミノ酸置換及び／又は共通の側鎖クラス若しくは特性に基づく置換は、当該技術分野で周知であり、本開示の実施形態で使用され得る。本開示は、アミノ酸側鎖クラスのうちの１つのメンバーが別のクラス由来のアミノ酸と交換される非保存的アミノ酸置換に基づくバリアントも企図する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるものに加えて１つ以上のアミノ酸置換を有する抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体バリアントが提供される。変異誘発のための部位は、ＣＤＲ及びＦＲを含み得る。典型的な「保存的」アミノ酸置換及び／又は共通の側鎖クラス若しくは特性に基づく置換は、当該技術分野で周知であり、本開示の実施形態で使用され得る。本開示は、アミノ酸側鎖クラスのうちの１つのメンバーが別のクラス由来のアミノ酸と交換される非保存的アミノ酸置換に基づくバリアントも企図する。
【0117】
アミノ酸側鎖は、典型的には、以下のクラス又は共通の特性に従って分類される：（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ノルロイシン；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向の影響：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【0118】
抗体へのアミノ酸置換、及び所望の機能、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについてのその後のスクリーニングのための技術は、当該技術分野で周知である。
【0119】
アミノ酸置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含み得る。一般に、更なる研究のために選択された得られたバリアントは、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持している。例示的な置換バリアントは、親和性成熟抗体であり、これは、例えば、本明細書の実施例に記載されるものなどのファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して、好都合に生成され得る。簡潔に説明すると、１つ以上のＣＤＲ残基が変異され、バリアント抗体がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【0120】
変異誘発のために標的化され得る抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」である（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５を参照されたい）。この方法において、標的残基の残基又は基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの帯電残基）を同定し、中性又は負帯電アミノ酸（例えば、Ａｌａ又はポリアラニン）で置換して、抗体の抗原との相互作用が影響を受けるかを決定する。更なる置換を、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置で導入してもよい。あるいは、又は更に、抗体と抗原との間の接触点を同定するための抗原－抗体複合体の結晶構造を決定することができる。かかる接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的化また又は排除され得る。バリアントは、それらが所望の特性を含むかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【0121】
アミノ酸配列の挿入には、長さが１つの残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドにまで及ぶアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一若しくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントには、抗体の血清半減期を増加させる酵素又はポリペプチドに対する抗体のＮ又はＣ末端への融合が含まれる。
【0122】
抗体親和性を改善するために、ＣＤＲにおいて置換を行うことができる。かかる改変は、「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．，Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照されたい）で行われ得、結果として生じるバリアントＶＨ又はＶＬが、結合親和性について試験される。一実施形態では、二次ライブラリーを構築し、そこから再選択することによって、親和性成熟を実行することができる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，（２００１）を参照されたい）。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に４～６個の残基）がランダム化される、ＣＤＲ指向型アプローチを伴う。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して特異的に同定され得る。特に、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が、しばしば標的化される。
【0123】
いくつかの実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、かかる改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減しない限り、１つ以上のＣＤＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的改変（例えば、本明細書で提供される保存的置換）が、ＣＤＲにおいて行われ得る。かかる改変は、ＣＤＲ「ホットスポット」の外側にあり得る。上記に提供されるバリアントＶＨ及びＶＥ配列のいくつかの実施形態では、各ＣＤＲは、改変されていないか、又は１つ、２つ、若しくは３つ以下のアミノ酸置換を含むかのいずれかである。
【0124】
グリコシル化バリアント
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって実行することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって実行することができる。
【0125】
抗体がＦｃ領域を含む実施形態では、Ｆｃ領域に付着した炭水化物を改変することができる。典型的には、哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって付着した分岐した二分岐オリゴ糖を含む（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，１５：２６－３２（１９９７）を参照されたい）。オリゴ糖は、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（N-acetyl glucosamine、ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸などの様々な炭水化物、並びに二分岐オリゴ糖構造の「幹」中のＧｌｃＮＡｃに付着したフコースを含み得る。いくつかの実施形態では、抗体のＦｃ領域のオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有するバリアントを作成することができる。
【0126】
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、親抗体のバリアントであり得、バリアントは、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）付着したフコースを欠く炭水化物構造を含む。例えば、かかる抗体中のフコースの量は、約１％～約８０％、約１％～約６５％、約５％～約６５％、又は約２０％～約４０％であり得る。フコースの量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に付着した全ての糖構造（例えば、複合、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に対するＡｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって、決定することができる（例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号を参照されたい）。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内のおよそ２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指す。しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体内の軽微な配列バリエーションに起因して、約±３個のアミノ酸で２９７位の上流又は下流、すなわち、２９４位と３００位との間に位置する場合もある。
【0127】
いくつかの実施形態では、フコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号又は同第２００４／００９３６２１号を参照されたい。「脱フコシル化された」又は「フコース欠乏」抗体及びそれらを調製するための関連する方法の例は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、同第２００３／０１１５６１４号、同第２００２／０１６４３２８号、同第２００４／００９３６２１号、同第２００４／０１３２１４０号、同第２００４／０１１０７０４号、同第２００４／０１１０２８２号、同第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２０００／６１７３９号、同第２００１／２９２４６号、同第２００３／０８５１１９号、同第２００３／０８４５７０号、同第２００５／０３５５８６号、同第２００５／０３５７７８号、同第２００５／０５３７４２号、同第２００２／０３１１４０号、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３６：１２３９－１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）に開示されている。
【0128】
脱フコシル化された抗体を産生するために有用な細胞株としては、タンパク質フコシル化が欠乏しているＬｅｄ ３ ＣＨＯ細胞（例えば、Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，２４９：５３３－５４５（１９８６）、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号及び国際公開第２００４／０５６３１２号を参照されたい）、及びアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）、及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照されたい）が含まれる。
【0129】
Ｆｃ領域バリアント
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、Ｆｃ領域内に１つ以上のアミノ酸改変（すなわち、Ｆｃ領域バリアント）を含むことができる。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸残基位置にアミノ酸置換を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体とともに有用である、当該技術分野で公知の広範囲のＦｃ領域バリアントを以下に記載する。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、Ｆｃ領域内に１つ以上のアミノ酸改変（すなわち、Ｆｃ領域バリアント）を含むことができる。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸残基位置にアミノ酸置換を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体とともに有用である、当該技術分野で公知の広範囲のＦｃ領域バリアントを以下に記載する。
【0130】
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、改変されたエフェクター機能を有するＦｃ領域バリアントである。いくつかの実施形態では、改変されたエフェクター機能を有する抗体は、親抗体のエフェクター機能のうちの（全てではないが）いくつかを保有するか、減少したエフェクター機能を保有するか、又はいずれのエフェクター機能も保有していない（例えば、エフェクターレスである）。エフェクターレスＦｃ領域バリアントは、エフェクター機能（ＡＤＣＣなど）が不必要若しくは有害であり、かつ／又は抗体のインビボ半減期が重要である、特定の用途のためにより望ましい。
【0131】
低減したエフェクター機能を有するか、又はエフェクターレスであるＦｃ領域バリアント抗体は、以下のＦｃ領域位置：２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ以上にアミノ酸置換を含むことができる。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号を参照されたい）。かかるＦｃ領域バリアントは、位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上にアミノ酸置換を含むことができる。かかるＦｃ領域バリアントは、残基２６５及び２９７の両方のアラニンへの置換を含むこともできる（例えば、米国特許第７，３３２，５８１号を参照されたい）。実施例及び本明細書の他の箇所に開示されるように、いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、エフェクターレスＦｃ領域バリアントである。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のエフェクターレスＦｃ領域バリアントは、アミノ酸置換Ｎ２９７Ｇを含む。
【0132】
改善又は減退したＦｃＲへの結合を有するＦｃ領域バリアントは、例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、国際公開第２００４／０５６３１２号、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（９）：６５９１－６６０４（２００１）に開示されている。改善されたＡＤＣＣを有するＦｃ領域バリアントは、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／又は３３４位（ＥＵ番号付けに基づく）に１つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。改変された（すなわち、改善若しくは減退した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有するＦｃ領域バリアントは、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されている。増加した半減期及び改善された新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を有するＦｃ領域バリアントは、例えば、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４（Ａ１）号（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に開示されている。かかるＦｃ領域バリアントは、位置：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、及び４３４のうちの１つ以上にアミノ酸置換を含む。増加した半減期を有する他のＦｃ領域バリアントは、例えば、米国特許第７，６５８，９２１（Ｂ２）号（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．）に記載されている、２５２位、２５４位、及び２５６位におけるＹＴＥ変異のセット（すなわち、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）を含む。実施例及び本明細書の他の箇所に開示されるように、いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＹＴＥ変異のセットを含むＦｃ領域バリアントである。Ｆｃ領域バリアントの他の例は、例えば、米国特許第５，６４８，２６０号及び同第５，６２４，８２１号、並びに国際公開第９４／２９３５１号に見出され得る。
【0133】
本明細書の他の箇所に記載されるように、天然に存在する抗体のＦｃ領域は、典型的には、４４７位にＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）を含む。しかしながら、このＣ末端リジンは、しばしば、酵素的切断（例えば、ＣＨＯ細胞における産生）に起因して、細胞培養における組換え抗体の産生中にＦｃ領域から切断される。したがって、Ｃ末端リジンを有するＦｃ領域を含むものとして本明細書に記載される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のうちのいずれかは、Ｃ末端リジンがないことを除いてＦｃ領域を含む同一の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体も含むことが意図される。同様に、Ｃ末端リジンがないＦｃ領域を含むものとして本明細書に記載される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のうちのいずれかは、Ｃ末端リジンを有することを除いてＦｃ領域を含む同一の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体も含むことが意図される。
【0134】
一般的に、インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害アッセイを実行して、Ｆｃ領域バリアントにおけるＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞が、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照されたい）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載されている。代替的に、非放射性アッセイ方法が用いられてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．、及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を参照されたい）。かかるアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的に、又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているものなどの動物モデルにおいて評価され得る。抗体がＣ１ｑに結合することができず、したがって、ＣＤＣ活性を欠くことを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイも実行され得る。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び同第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが実施され得る（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９７）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１，１０４５－１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ，１０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。当該技術分野で公知の方法を使用して、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定を実施することができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照されたい）。
【0135】
システイン操作バリアント
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、反応性チオール基を作成するように、具体的な非ＣＤＲ位置においてシステイン残基で置換され得ることが企図される。かかる操作された「チオＭＡｂ」は、本明細書の他の箇所に記載されるように、抗体を、例えば、薬物部分又はリンカー・薬物部分にコンジュゲートし、それによって、免疫複合体を作成するために使用することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように生成することができる。いくつかの実施形態では、以下の抗体残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のうちのいずれか１つ以上を、システインで置換することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、反応性チオール基を作成するように、具体的な非ＣＤＲ位置においてシステイン残基で置換され得ることが企図される。かかる操作された「チオＭＡｂ」は、本明細書の他の箇所に記載されるように、抗体を、例えば、薬物部分又はリンカー・薬物部分にコンジュゲートし、それによって、免疫複合体を作成するために使用することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように生成することができる。いくつかの実施形態では、以下の抗体残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のうちのいずれか１つ以上を、システインで置換することができる。
【0136】
誘導体化バリアント
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、非タンパク質性部分で更に修飾（すなわち、誘導体化）され得る。抗体の誘導体化に好適な非タンパク質性部分としては、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）、エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸ホモポリマー又はランダムコポリマー、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、メトキシ－ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを使用して、抗体の修飾を実行することができる。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐又は非分岐であり得る。抗体に付着したポリマーの数は、変化し得、１つより多いポリマーが付着している場合、それらは、同じ又は異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、抗体の特定の特性又は機能、例えば、抗体誘導体が定義された条件下で治療法において使用されるかを含むが、これらに限定されない、考慮事項に基づいて決定することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、非タンパク質性部分で更に修飾（すなわち、誘導体化）され得る。抗体の誘導体化に好適な非タンパク質性部分としては、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）、エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸ホモポリマー又はランダムコポリマー、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、メトキシ－ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを使用して、抗体の修飾を実行することができる。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐又は非分岐であり得る。抗体に付着したポリマーの数は、変化し得、１つより多いポリマーが付着している場合、それらは、同じ又は異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、抗体の特定の特性又は機能、例えば、抗体誘導体が定義された条件下で治療法において使用されるかを含むが、これらに限定されない、考慮事項に基づいて決定することができる。
【0137】
免疫複合体
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、免疫複合体とすることもでき、免疫複合体は、１つ以上の細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む。本開示によって企図される好適な細胞毒性剤には、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位体が含まれる。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、免疫複合体とすることもでき、免疫複合体は、１つ以上の細胞毒性剤にコンジュゲートされた抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む。本開示によって企図される好適な細胞毒性剤には、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位体が含まれる。
【0138】
いくつかの実施形態では、免疫複合体は、本明細書に記載される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体が１つ以上の薬物にコンジュゲートされている、抗体－薬物コンジュゲート（antibody-drug conjugate、ＡＤＣ）である。
【0139】
いくつかの実施形態では、本開示の免疫複合体は、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６、及び／又はＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患若しくは状態の治療のための薬物又は治療剤にコンジュゲートされた本明細書に記載される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む。
【0140】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質、ツルレイシ（Momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（Sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含むが、これらに限定されない、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートされ得る。
【0141】
いくつかの実施形態では、本開示の免疫複合体は、放射性同位体にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体（すなわち、放射性複合体）を含む。様々な放射性同位体が、かかる放射性複合体の産生のために利用可能である。例としては、２１１Ａｔ、１３１１、１２５１、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、２１２Ｐｂ、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫複合体は、シンチグラフィー検出のための放射性同位体、又はＮＭＲ検出若しくはＭＲＩのためのスピン標識を含み得る。適切な放射性同位体又はスピン標識には、１２３１、１３１１、１１Ｉｎ、１３０、１９Ｆ、１５Ｎ、１７０、Ｇｄ、Ｍｎ、及びＦｅの様々な同位体が含まれ得る。
【0142】
タンパク質にコンジュゲートするために好適な様々な周知の二官能性試薬及び化学物質を使用して、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体及び細胞毒性剤の免疫複合体を作製することができる。かかる試薬には、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ、ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－４－（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（iminothiolane、ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジポイミド酸ジメチルＨＱ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス－（ｐ－アジドベンゾイル）－ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン－２，６－ジイソシアネート）、及びビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）が含まれるが、これらに限定されない。
【0143】
本開示の免疫複合体を調製するための試薬には、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）などの市販の「架橋」試薬も含まれ得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｕ．Ｓ．Ａを参照されたい）。
【0144】
合成抗体
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、代替タンパク質足場又は人工ポリマー足場などの免疫グロブリン足場又はフレームワーク以外の足場又はフレームワークにグラフトされた抗ＩＬ１ＲＡＰ免疫グロブリン（例えば、ＣＤＲ－Ｌ１など）由来のＣＤＲのセットを含む、合成抗体であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、代替タンパク質足場又は人工ポリマー足場などの免疫グロブリン足場又はフレームワーク以外の足場又はフレームワークにグラフトされた抗ＩＬ１ＲＡＰ免疫グロブリン（例えば、ＣＤＲ－Ｌ１など）由来のＣＤＲのセットを含む、合成抗体であり得る。
【0145】
本開示の合成抗体の調製のために企図される例示的な代替タンパク質足場には、フィブロネクチン、ネオカルジノスタチンＣＢＭ４－２、リポカリン、Ｔ細胞受容体、プロテインＡドメイン（プロテインＺ）、Ｉｍ９、ＴＰＲタンパク質、ジンクフィンガードメイン、ｐＶＩＩＩ、トリ膵臓ポリペプチド、ＧＣＮ４、ＷＷドメインＳｒｃ相同ドメイン３、ＰＤＺドメイン、ＴＥＭ－１β－ラクタマーゼ、チオレドキシン、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、ＰＨＤ－フィンガードメイン、ＣＬ－２、ＢＰＴＩ、ＡＰＰＩ、ＨＰＳＴＩ、エコチン、ＬＡＣＩ－Ｄ１、ＥＤＴＩ、ＭＴＩ－ＩＩ、サソリ毒素、昆虫ディフェンシン－Ａペプチド、ＥＥＴＩ－ＩＩ、Ｍｉｎ－２３、ＣＢＤ、ＰＢＰ、シトクロムｂ－５６２、Ｅｄｉ受容体ドメイン、γ－クリスタリン、ユビキチン、トランスフェリン、及び／又はＣ型レクチン様ドメインが含まれ得るが、これらに限定されない。
【0146】
合成抗体に有用な例示的な人工ポリマー（非タンパク質）足場は、例えば、Ｆｉｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）「Ｎｏｎ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ，」ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｅｄｓ．Ｓ．ＤＯｂｅｌ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｒｅｉｃｈｅｒｔ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．；Ｇｅｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１３：２４５－２５５（２００９）、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３（１０）：１２５７－１２６８（２００５）に記載されている。
【0147】
組換え方法及び組成物
抗体産生の分野で周知の組換え方法及び材料を使用して、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を産生することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をコードする単離された核酸を提供する。核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードすることができる。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をコードする核酸配列を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をコードする核酸配列を含む宿主細胞が提供される。一実施形態では、宿主細胞は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む、ベクターで形質転換されている。別の実施形態では、宿主細胞は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターで形質転換されている。
抗体産生の分野で周知の組換え方法及び材料を使用して、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を産生することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をコードする単離された核酸を提供する。核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードすることができる。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をコードする核酸配列を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体をコードする核酸配列を含む宿主細胞が提供される。一実施形態では、宿主細胞は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む、ベクターで形質転換されている。別の実施形態では、宿主細胞は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターで形質転換されている。
【0148】
組換え方法のいくつかの実施形態では、使用される宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary、ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、ＹＯ、ＮＳＯ、Ｓｐ２０）などの真核細胞である。一実施形態では、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を作製する方法が提供され、本方法は、抗体の発現に好適な条件下で、上記に提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意選択で、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することとを含む。
【0149】
簡潔に説明すると、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の組換え産生は、（例えば、本明細書に記載される）抗体をコードする核酸を単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために、この核酸を１つ以上のベクターに挿入することによって実行される。かかる核酸は、当該技術分野で周知の従来の手順を使用して（例えば、所望の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離及び配列決定される。抗体をコードするベクターをクローニング又は発現するための好適な宿主細胞及び培養方法は、当該技術分野で周知であり、原核細胞又は真核細胞を含む。典型的には、発現後、抗体は、可溶性画分中の細胞ペーストから単離され、更に精製され得る。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす真菌及び酵母株を含む、抗体をコードするベクターのための好適なクローニング又は発現宿主である（例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２：１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２４：２１０－２１５（２００６）を参照されたい）。
【0150】
本開示のグリコシル化された抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の発現のための好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来し得る。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。特にツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用され得る、多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物もまた、宿主として利用することができる（例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、及び同第７，１２５，９７８号を参照されたい。
【0151】
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の産生に有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）を参照されたい）、ＹＯ、ＮＳＯ及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ系（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７）に記載されている２９３又は２９３細胞）、ベビーハムスター腎細胞（baby hamster kidney cell、ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されているＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶＩ）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４－６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞が挙げられる。抗体産生に好適である有用な哺乳動物宿主細胞株の一般論評については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。
【0152】
抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の医薬組成物及び製剤
本開示は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む医薬組成物及び医薬製剤も提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬製剤を提供する。かかる医薬製剤は、所望の純度を有する抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を、１つ以上の薬学的に許容される担体と混合することによって、調製することができる。典型的には、かかる抗体製剤は、水溶液（例えば、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号を参照されたい）として、又は凍結乾燥製剤（例えば、米国特許第６，２６７，９５８号を参照されたい）として調製することができる。
本開示は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む医薬組成物及び医薬製剤も提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬製剤を提供する。かかる医薬製剤は、所望の純度を有する抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を、１つ以上の薬学的に許容される担体と混合することによって、調製することができる。典型的には、かかる抗体製剤は、水溶液（例えば、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号を参照されたい）として、又は凍結乾燥製剤（例えば、米国特許第６，２６７，９５８号を参照されたい）として調製することができる。
【0153】
本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む組成物及び製剤は、製剤が投与される対象において治療されている特定の適応症に有用である、抗ＩＬ１ＲＡＰに加えた他の活性成分（すなわち、治療剤）を更に含み得ることも企図される。好ましくは、任意の追加の治療剤は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体活性を補完する活性を有し、活性は、互いに悪影響を及ぼさない。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供し、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６、及び／又はＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患若しくは状態の治療に有用な治療剤を更に含む。いくつかの実施形態では、例えば、適応疾患ががんである場合、治療剤は、特定のがんに適切な化学療法剤である。いくつかの実施形態では、組成物中の更なる治療剤は、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６シグナル伝達経路のアンタゴニストである。
【0154】
薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントにとって非毒性である。広範なかかる薬学的に許容される担体が、当該技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）を参照されたい）。本開示の製剤において有用な例示的な薬学的に許容される担体には、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメソニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール）、低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれ得るが、これらに限定されない。
【0155】
本開示の製剤において有用な薬学的に許容される担体は、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（例えば、ｒＨｕＰＨ２０又はＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などの可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（soluble neutral-active hyaluronidase glycoprotein、ｓＨＡＳＥＧＰ）（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号を参照されたい）などの間質薬物分散剤を含むこともできる。
【0156】
更なる治療剤及び活性成分が、例えば、コアセルベーション技法によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入され得る。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【0157】
いくつかの実施形態では、製剤は、抗体及び／又は他の活性成分の徐放性調製物であり得る。徐放性調製物の好適な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられ、これらのマトリクスは、成形された物品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。
【0158】
典型的には、対象に投与される本開示の製剤は、無菌である。無菌製剤は、周知の技術を使用して、例えば、無菌濾過膜を通した濾過によって、容易に調製され得る。
【0159】
治療の使用及び方法
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む組成物又は製剤のうちのいずれかは、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する、及び／又はＩＬ１ＲＡＰの活性を遮断する、具体的には、ＩＬ－１ファミリーサイトカイン、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β及び／又はＩＬ－３６Γによる細胞内シグナル伝達を媒介するＩＬ１ＲＡＰの能力を遮断する能力を利用する、治療方法などにおける任意の方法又は使用のために使用され得ることが企図される。ＩＬ１ＲＡＰによって媒介される細胞内シグナル伝達経路は、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６経路を含み、より具体的には、少なくとも、サイトカインアゴニストＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γによって刺激されるシグナル伝達経路を含む。ＩＬ１ＲＡＰ媒介性シグナル伝達経路の阻害は、本開示の実施例に記載されるレポーター細胞アッセイ及び初代細胞ベースのブロッキングアッセイを含む公知の細胞ベースのブロッキングアッセイを使用して、インビトロでアッセイされ得る。
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む組成物又は製剤のうちのいずれかは、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する、及び／又はＩＬ１ＲＡＰの活性を遮断する、具体的には、ＩＬ－１ファミリーサイトカイン、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β及び／又はＩＬ－３６Γによる細胞内シグナル伝達を媒介するＩＬ１ＲＡＰの能力を遮断する能力を利用する、治療方法などにおける任意の方法又は使用のために使用され得ることが企図される。ＩＬ１ＲＡＰによって媒介される細胞内シグナル伝達経路は、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６経路を含み、より具体的には、少なくとも、サイトカインアゴニストＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γによって刺激されるシグナル伝達経路を含む。ＩＬ１ＲＡＰ媒介性シグナル伝達経路の阻害は、本開示の実施例に記載されるレポーター細胞アッセイ及び初代細胞ベースのブロッキングアッセイを含む公知の細胞ベースのブロッキングアッセイを使用して、インビトロでアッセイされ得る。
【0160】
ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患には、ＩＬ１ＲＡＰがシグナル伝達の媒介において共受容体として作用するＩＬ－１ファミリーのサイトカイン：ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γの体液又は組織中の上昇したレベルに関連する任意の疾患又は状態が含まれ得る。ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γの上昇したレベルは、例えば、特定の細胞若しくは組織で通常見出されるレベルを超えるレベルを含むことができるか、又はこれらのサイトカインを通常発現しない細胞若しくは組織中の任意の検出可能なレベルであり得る。
【0161】
典型的には、ＩＬ ＲＡＰ媒介性状態又は疾患は、以下の特徴を示す：（１）状態又は疾患に関連する病理は、ＩＬ－ｌａ、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６Γの投与によって、並びに／若しくはＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６Γの発現のアップレギュレーションによって、動物において実験的に誘導され得る、（２）実験動物モデルにおいて生成された状態又は疾患に関連する病理は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６Γの作用を阻害することが知られている薬剤によって阻害され得る。
【0162】
ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６Γは、炎症性サイトカインであることが知られているが、共受容体としてＩＬ ＲＡＰによって媒介されるこれらのサイトカインによって刺激されるＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６シグナル伝達経路の異常機能は、一般に、炎症性疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝障害、感染症、及びがんを含むが、これらに限定されない、広範囲の疾患及び状態に関連することが知られている。
【0163】
例えば、ＩＬ－３３シグナル伝達の異常機能に関連し、その結果として、ＩＬ１ＲＡＰの共受容体活性によっても媒介される、広範囲の状態及び疾患には、限定されないが、以下が含まれ、媒介性障害は、炎症状態（例えば、喘息、気道過敏性、気道炎症、敗血症、敗血症性ショック、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、関節リウマチ、又は慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease、ＣＯＰＤ））、免疫障害（例えば、喘息、関節リウマチ、アレルギー、アトピー性アレルギー、アナフィラキシー、アナフィラキシーショック、アレルギー性鼻炎、乾癬、全身性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、糖尿病、又は肝疾患）、線維性障害（例えば、特発性肺線維症（ＩＰＦ））、好酸球性疾患（例えば、好酸球性食道炎などの好酸球関連胃腸障害）、感染症（例えば、蠕虫、リーシュマニアなどの原生動物、又はＲＳＶ若しくはインフルエンザなどのウイルス感染症）、疼痛（例えば、炎症性疼痛）、中枢神経系障害（例えば、アルツハイマー病）、固形腫瘍（例えば、乳房腫瘍、結腸腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、腸腫瘍、脳腫瘍、骨腫瘍、又は皮膚腫瘍）、又は眼科障害であり得る。Ｉｌ－３３によって媒介される具体的な眼科障害には、滲出型加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、萎縮型ＡＭＤ、中間型ＡＭＤ、進行型ＡＭＤ、及び地図状萎縮（geographic atrophy、ＧＡ））を含む、ＡＭＤ、網膜症（例えば、糖尿病性網膜症（diabetic retinopathy、ＤＲ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、及び高地ＤＲ）、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、糖尿病黄斑浮腫、ドライアイ疾患、ベーチェット病、網膜剥離、緑内障、ぶどう膜炎（例えば、感染性及び非感染性ぶどう膜炎）、網膜色素変性、レーバー先天性黒内障、スタルガルト病、外傷性眼球損傷、並びに結膜炎（例えば、感染性結膜炎、非感染性結膜炎、及びアレルギー性結膜炎）が含まれるが、これらに限定されない。
【0164】
同様に、ＩＬ－１の異常機能に関連し、その結果として、ＩＬ１ＲＡＰの共受容体活性によっても媒介される、広範囲の状態及び疾患には、急性膵炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、ＡＩＤ誘発型悪液質を含む悪液質／拒食症、喘息及び他の肺疾患、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性血管炎、慢性疲労症候群、クロストリジウム関連下痢を含むクロストリジウム関連疾患、うっ血性心不全、冠動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能障害（例えば、敗血症に関連する）、及び冠動脈バイパス移植を含む、冠動脈の状態及び適応症、多発性骨髄腫並びに骨髄性白血病（例えば、ＡＭＬ又はＣＭＬ）及び他の白血病などのがん、並びに腫瘍転移、糖尿病（例えば、インスリン依存性糖尿病）、子宮内膜症、発熱、線維筋痛症、糸球体腎炎、移植片対宿主病／移植片拒絶反応、出血性ショック、痛覚過敏、炎症性腸疾患、変形性関節症、乾癬性関節炎、及び関節リウマチを含む、関節の炎症状態、例えば、角膜移植に関連し得るような炎症性眼疾患、脳虚血（例えば、各々神経変性につながり得る、外傷、てんかん、出血、又は脳卒中の結果としての脳損傷）を含む虚血、川崎病、学習障害、肺疾患（例えば、ＡＲＤＳ）、多発性硬化症、ミオパシー（例えば、特に敗血症における筋タンパク質代謝）、神経毒性（例えば、ＨＩＶによって誘導される）、骨粗鬆症、がん関連疼痛を含む疼痛、パーキンソン病、歯周病、早期陣痛、乾癬、再灌流傷害、敗血症性ショック、放射線療法からの副作用、一時的下顎関節疾患、睡眠障害、ぶどう膜炎、又は挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染若しくは他の疾患過程から生じる炎症状態が含まれるが、これらに限定されない。
【0165】
ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６シグナル伝達経路のアンタゴニスト又は阻害剤として作用する薬剤は、限定されないが以下を含む、一連の疾患及び状態：ざ瘡、急性重症潰瘍性大腸炎、成人発症スティル病、アレルギー性鼻炎、全身性硬化症、関節炎（痛風性、若年性、変形性、及びリウマチを含む）、関節炎痛、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性湿疹、ベーチェット病、悪液質、がん（乳がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、及び膵臓がんを含む）、慢性閉鎖性肺疾患、ドライアイ症候群、家族性寒冷自己炎症症候群、家族性地中海熱、食物アレルギー、汎発性膿疱性乾癬、汗腺膿瘍、高ｌｇＤ症候群、高尿酸血症、マックル・ウェルズ症候群、新生児期発症多臓器系炎症性疾患、筋骨格系疼痛、掌蹠膿疱症、末梢血管疾患、リウマチ性多発筋痛症、鼻ポリープ、乾癬、壊疸性膿皮症、再狭窄、鎌状赤血球貧血症、静脈洞炎、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、２型糖尿病、及び潰瘍性結腸炎の治療のために臨床開発中である。
【0166】
本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む組成物又は製剤のうちのいずれかは、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６シグナル伝達経路の異常機能に関連し、したがって、ＩＬ１ＲＡＰの共受容体活性によって媒介される、上記に列挙される疾患又は状態のうちのいずれかの治療のための方法又は使用において使用され得ることが企図される。一般に、これらの状態及び疾患には、炎症性疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝障害、感染症、及びがんが含まれるが、これらに限定されない。
【0167】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰを含む組成物又は製剤は、ざ瘡、急性膵炎、急性重症潰瘍性結腸炎、成人発症スティル病、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、気道過敏性、気道炎症、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アナフィラキシー、関節炎痛、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、自己免疫性血管炎、ベーチェット病、骨肉腫、脳腫瘍、乳がん、悪液質／拒食症、軟骨損傷、脳虚血、慢性疲労症候群、慢性閉鎖性肺疾患、クロストリジウム関連疾患、結腸がん、うっ血性心不全、結膜炎、冠動脈バイパス移植、冠動脈再狭窄、クローン病、糖尿病、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、ドライアイ疾患、子宮内膜症、好酸球性消化管疾患、好酸球性食道炎、家族性寒冷自己炎症症候群、家族性地中海熱、発熱、線維筋痛症、線維性障害、食物アレルギー、汎発型膿疱性乾癬、緑内障、糸球体腎炎、痛風性関節炎、移植片対宿主病、蠕虫感染症、出血性ショック、汗腺膿瘍、痛覚過敏、高ＩｇＤ症候群、高尿酸血症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、がん関連疼痛、感染症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、挫傷から生じる炎症状態、角膜移植に関連する炎症性眼疾患、炎症性疼痛、インフルエンザ、腸がん、虚血、若年性関節炎、川崎病、腎臓がん、レーバー先天性黒内障、肝臓がん、肝疾患、肺がん、マックル・ウェルズ症候群、多発性骨髄腫、多発性硬化症、筋骨格系疼痛、骨髄性白血病及び他の白血病、心筋機能障害、筋疾患、鼻ポリープ、新生児期発症多臓器系炎症性疾患、神経毒性、非感染性結膜炎、非小細胞肺がん、整形外科手術、変形性関節症、骨粗鬆症、疼痛、掌蹠膿疱症、膵臓がん、パーキンソン病、歯周病、末梢血管疾患、リウマチ性多発筋痛症、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、早期陣痛、前立腺がん、原虫感染症、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、再灌流傷害、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、再狭窄、網膜剥離、網膜色素変性症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、関節リウマチ、敗血症性ショック、鎌状赤血球貧血症、放射線療法からの副作用、静脈洞炎、皮膚がん、睡眠障害、挫傷、スタルガルト病、胃がん、一時的下顎関節疾患、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、移植片拒絶反応、外傷、外傷性眼球損傷、２型糖尿病、潰瘍性結腸炎、及びぶどう膜炎から選択される状態又は疾患の治療で使用するための方法、治療法、薬剤、診断、又は使用において使用することができる。
【0168】
以下の実施例を含む本明細書に開示されるように、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６シグナル伝達経路を含む、ＩＬ１ＲＡＰによって媒介される細胞内シグナル伝達を減少させる、阻害する、及び／又は遮断する能力を有する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、対象におけるＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患又は状態を治療する方法であって、対象に治療有効量の本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を投与すること、又は治療を必要とする対象に、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【0169】
本明細書の他の箇所に開示されるように、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６シグナル伝達経路を減少させる、阻害する、及び／又は遮断する能力を有する。したがって、本開示は、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６シグナル伝達経路の減少、阻害、及び／又は遮断に応答する疾患及び状態を治療する方法も提供する。
【0170】
加えて、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、アゴニストＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６Γによって刺激される細胞内シグナル伝達を減少させる、阻害する、及び／又は遮断する能力を有する。したがって、本開示は、アゴニストＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γによって刺激される細胞内シグナル伝達の減少、阻害、及び／又は遮断に応答する疾患及び状態を治療する方法も提供する。
【0171】
ＩＬ１ＲＡＰ媒介経路でもある、ＩＬ－１シグナル伝達経路は、多くの形態のがんと関連付けられている。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、対象におけるがんを治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療有効量の本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を投与すること、又は対象に、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【0172】
ＩＬ１ＲＡＰ媒介経路でもある、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６シグナル伝達経路の３つ全ては、喘息と関連付けられている。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、対象における喘息を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療有効量の本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を投与すること、又は対象に、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【0173】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６シグナル伝達経路媒介性疾患、並びに／又はアゴニストＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／若しくはＩＬ－３６γによって刺激される細胞内シグナル伝達によって媒介される疾患を治療及び／又は予防する方法を提供する。かかる治療方法の実施形態では、方法は、治療を必要とする対象に、治療有効量の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体、又は本明細書に記載される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む組成物若しくは医薬製剤を投与することを含む。
【0174】
本治療方法に従う抗体、組成物、又は医薬製剤の投与は、対象におけるＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患から対象を保護する、及び／又はその進行を治療する抗体誘導性治療効果を提供する。いくつかの実施形態では、本治療方法は、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患又は状態を予防及び／又は治療するための、当業者に公知である１つ以上の追加の治療剤又は治療の投与を更に含むことができる。１つ以上の追加の薬剤の投与を含むかかる方法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ又は別個の製剤に含まれる）及び別個の投与を包含することができ、その場合、抗体組成物又は製剤の投与は、追加の治療剤の投与の前に、それと同時に、及び／又はその後に起こり得る。
【0175】
本開示の治療方法のいくつかの実施形態では、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体又は抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む医薬製剤は、薬剤を全身又は所望の標的組織に送達する任意の投与様式によって対象に投与される。全身投与は、一般に、抗体又はその製剤が対象の循環系に進入し、したがって、代謝及び他の同様のプロセスを受けるように、所望の標的部位、組織、又は臓器内への直接投与以外の部位における対象への抗体の任意の投与様式を指す。
【0176】
したがって、本開示の治療方法において有用な投与様式には、注射、注入、点滴、及び吸入が含まれ得るが、これらに限定されない。注射による投与には、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、髄腔内、及び胸骨内注射並びに注入が含まれ得る。
【0177】
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の医薬製剤は、抗体が腸内の不活性化から保護されるように製剤化される。したがって、本治療方法は、製剤の経口投与を含むことができる。
【0178】
いくつかの実施形態では、薬剤としての本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む組成物又は製剤の使用も提供される。加えて、いくつかの実施形態では、本開示は、薬剤、具体的には、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を治療、予防、又は抑制するための薬剤の製造又は調製における抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を含む組成物又は製剤の使用も提供する。更なる実施形態では、薬剤は、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を有する個体に有効量の薬剤を投与することを含む、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を治療、予防、又は抑制するための方法で使用するためのものである。特定の実施形態では、薬剤は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤又は治療を更に含む。
【0179】
更なる実施形態では、薬剤は、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を治療、抑制、又は予防するために、有効量の薬剤を対象に投与することを含む、対象におけるＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を治療、抑制、又は予防する際に使用するためのものである。
【0180】
ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患又は状態の予防又は治療のために、（単独で、又は１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用されるときの）本開示の組成物及び製剤に含まれる抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の適切な投薬量は、治療されている具体的な疾患又は状態、疾患の重症度及び経過、抗体が予防又は治療目的のために投与されるか、患者に投与された以前の治療法、患者の病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。本明細書に記載される組成物及び製剤に含まれる抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、一度に、又は一連の治療にわたって患者に好適に投与することができる。単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書で企図される。
【0181】
疾患のタイプ及び重症度に応じて、本開示の製剤中の約１ｐｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇの抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体が、例えば、１回以上の別個の投与によるか、又は連続注入によるかにかかわらず、ヒト対象への投与のための初期候補投薬量である。一般に、抗体の投与される投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。いくつかの実施形態では、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ ｍｇ／ｋｇ（若しくはそれらの任意の組み合わせ）の１つ以上の用量が、患者に投与され得る。
【0182】
投薬量投与は、対象の状態に応じて、数日以上にわたって維持することができ、例えば、投与は、当該技術分野で公知の方法によって決定されるように、ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患が十分に治療されるまで継続することができる。いくつかの実施形態では、初期高負荷用量が投与され、続いて、１回以上の低用量が投与され得る。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であり得る。投薬量投与の治療効果の進行は、従来の技法及びアッセイによって監視することができる。
【0183】
したがって、本開示の方法のいくつかの実施形態では、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の投与は、約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの１日投薬量を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の投薬量は、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇの１日投薬量を含む。
【0184】
加えて、本開示の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、ＩＬ１ＲＡＰの検出のためのアッセイ方法で使用され得る。高親和性でヒトＩＬ１ＲＡＰに結合するそれらの能力に起因して、本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、広範囲のアッセイ方法及びフォーマットに適切である。抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体が、ＩＬ１ＲＡＰの検出及び定量のための競合結合アッセイ、直接及び間接的サンドイッチアッセイ、免疫沈降アッセイ、並びに酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）（Ｓｏｌａ，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７－１５８，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい）などの任意の公知のアッセイ方法で用いられ得ることが企図される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、生体試料中のＩＬ１ＲＡＰのレベルを検出するための方法であって、試料を本明細書に開示される抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体と接触させるステップを含む、方法を提供する。更に、いくつかの実施形態では、生体試料中のＩＬ１ＲＡＰのレベルを検出する方法は、例えば、ヒト対象由来の生体試料中のＩＥ １ ＲＡＰ媒介性状態又は疾患を検出及び／又は診断するために使用され得ることが企図される。
【実施例】
【0185】
実施例１：抗ＩＬ－１ＲＡＰ抗体の生成
方法
組換え標的抗原
全長ヒトＩＬ－１ＲＡＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＮＰＨ３、配列番号６）及び全長カニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ（受託番号Ｐ５９８２２、配列番号７）をコードするヒトコドン最適化配列が、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＵＳＡ）によって合成された。ヒトＩＬ－１ＲＡＰ（残基２１～３５９、配列番号１）及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ（残基２１～３５９、配列番号２）の可溶性細胞外領域が、修飾ｐｃＤＮＡ（商標）３．１プラスミド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｖ７９０２０）においてクローニングされ、Ｃ末端Ａｖｉｔａｇ（商標）（Ａｖｉｄｉｔｙ ＬＬＣ）、続いて、２つのタグ（ヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ－Ａｖｉ－Ｈｉｓ及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ－Ａｖｉ－Ｈｉｓと略称される）の間にＧｌｙ３リンカー配列を有する１０－Ｈｉｓタグを用いて、タンパク質を生成した。
方法
組換え標的抗原
全長ヒトＩＬ－１ＲＡＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＮＰＨ３、配列番号６）及び全長カニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ（受託番号Ｐ５９８２２、配列番号７）をコードするヒトコドン最適化配列が、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＵＳＡ）によって合成された。ヒトＩＬ－１ＲＡＰ（残基２１～３５９、配列番号１）及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ（残基２１～３５９、配列番号２）の可溶性細胞外領域が、修飾ｐｃＤＮＡ（商標）３．１プラスミド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｖ７９０２０）においてクローニングされ、Ｃ末端Ａｖｉｔａｇ（商標）（Ａｖｉｄｉｔｙ ＬＬＣ）、続いて、２つのタグ（ヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ－Ａｖｉ－Ｈｉｓ及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ－Ａｖｉ－Ｈｉｓと略称される）の間にＧｌｙ３リンカー配列を有する１０－Ｈｉｓタグを用いて、タンパク質を生成した。
【0186】
発現ベクターは、生成物分泌を駆動するためのマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチド並びにＯｒｉＰ配列を担持していた。タンパク質発現のために、ヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ－Ａｖｉ－Ｈｉｓ及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ－Ａｖｉ－Ｈｉｓ（残基２１～３５９、それぞれ、配列番号１及び配列番号２）をコードするプラスミド、及び非コードプラスミドが、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、懸濁適応ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ－ＬＧＬ ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ、カタログ番号ＣＲＬ－１０８５２）に同時トランスフェクトされた。簡潔に説明すると、細胞を、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｂｉｏｗｅｓｔ）中、８００万細胞／ｍＬで調製した。次いで、細胞にＤＮＡ－ＰＥＩ混合物を３７℃でトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、細胞培養物を、フェノールレッド及び４ｍＭのＬ－グルタミンを補充したＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）２９３（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で１：１に希釈し、３７℃、５％Ｃ０２、及び８０％湿度で軌道振盪しながら５日間インキュベートした。発現後、清澄化した上清を遠心分離及び濾過によって調製し、１Ｍ水酸化ナトリウムを使用して、ｐＨを７．４（４℃）に調整した。Ｎｉ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｅｘｃｅｌｌビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、清澄化した上清に添加し、穏やかに撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。次に、混合物を、重力流精製のためにＥｃｏｎｏ－Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上に装填した。ビーズを、最初にｐＨ７．４の１Ｘ ＰＢＳ（１×１０ＣＶ）で洗浄し、次いで、２０ｍＭイミダゾール（２×１０ＣＶ）を補充した１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、４０ｍＭ（１０×１ＣＶ）、８０ｍＭ（１５×１ＣＶ）、２５０ｍＭ（４×２ＣＶ）、及び５００ｍＭ（２×２ＣＶ）イミダゾールを補充したｐＨ７．４の１Ｘ ＰＢＳを順次使用して、段階溶出プロトコルに従ってタンパク質を溶出した。画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分析し、見かけの純度に基づいて選択した。次いで、目的の画分をプールし、４℃でｐＨ７．４の１Ｘ ＰＢＳに対して透析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びエンドトキシン測定によって、タンパク質の品質を評価した。簡潔に説明すると、Ｗａｔｅｒｓ ２９９８ ＰＤＡ検出器（Ｗａｔｅｒｓ）を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ ＨＰＬＣシステム上で、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＬ／分の流速における溶離液としてｐＨ６．８の０．１５Ｍ塩化ナトリウムとともに、室温でＴｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（カタログ番号０８５４１、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ＳＥ－ＨＰＬＣを実施し、２１４ｎｍ及び２８０ｎｍで監視した。カブトガニ血球抽出物（Limulus amebocyte lysate、ＬＡＬ）ベースのアッセイを利用したＣｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒからのＭｕｌｔｉ－Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｎｄｏｓａｆｅ－ＭＣＳを使用して、０．５ＥＵ／ｍｇを下回る細菌内毒素レベルを確認した。本明細書に記載されるヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ－Ａｖｉ－Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質は、それぞれ、配列番号１及び２を有する。
【0187】
ニワトリＩＬ－１ＲＡＰ（受託番号ＸＰ＿４２２７１９．４、配列番号３）及びニワトリ／ヒトキメラ（配列番号４及び５）の細胞外ドメインをコードするヒトコドン最適化配列が、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。ニワトリＩＬ－１ＲＡＰ（残基１３９～４７８、配列番号３）及びニワトリ／ヒトＩＬ－１ＲＡＰキメラ（ＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ（ｇｇＤ１（Ｓ１３９－Ｐ２４６）－ｈｓＤ２（Ｖ１３２－Ｖ２３３）－ｈｓＤ３（Ｖ２３４－Ｅ３５９））－Ａｖｉ－Ｈｉｓ及びＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ（ｇｇＤ１（Ｓ１３９－Ｈ２６０）－ｇｇＤ２（Ｓ２６１－Ｖ３４９）－ｈｓＤ３（Ｖ２４３－Ｅ３５９））－Ａｖｉ－Ｈｉｓ、それぞれ、配列番号４及び５）の可溶性細胞外領域が、修飾ｐｃＤＮＡ（商標）３．１プラスミド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｖ７９０２０）においてクローニングされ、Ｃ末端Ａｖｉｔａｇ（商標）（Ａｖｉｄｉｔｙ ＬＬＣ）、続いて、２つのタグ（ｇｇＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ－Ａｖｉ－Ｈｉｓ、ＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ（ｇｇＤｌ（Ｓ１３９－Ｐ２４６）－ｈｓＤ２（Ｖ１３２－Ｖ２３３）－ｈｓＤ３（Ｖ２３４－Ｅ３５９））－Ａｖｉ－Ｈｉｓ、及びＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ（ｇｇＤ１（Ｓ１３９－Ｈ２６０）－ｇｇＤ２（Ｓ２６１－Ｖ３４９）－ｈｓＤ３（Ｖ２４３－Ｅ３５９））－Ａｖｉ－Ｈｉｓと略称される）の間にＧｌｙ３リンカー配列を有する１０－Ｈｉｓタグを用いて、タンパク質を生成した。発現ベクターは、生成物分泌を駆動するためのマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチド並びにＯｒｉＰ配列も担持していた。タンパク質発現のために、前述のプラスミド及び非コードプラスミドが、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、懸濁適応ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ－ＬＧＬ ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ、カタログ番号ＣＲＬ－１０８５２）に同時トランスフェクトされた。簡潔に説明すると、細胞を、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｂｉｏｗｅｓｔ）中、８００万細胞／ｍＬで調製した。次いで、細胞にＤＮＡ－ＰＥＩ混合物を３７℃でトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、細胞培養物を、フェノールレッド及び４ｍＭのＥ－グルタミンを補充したＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）２９３（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で１：１に希釈し、３７℃、５％Ｃ０２、及び８０％湿度で軌道振盪しながら５日間インキュベートした。組換えタンパク質の精製は、５００ｍＭイミダゾールを補充した１Ｘ ＰＢＳで実施された溶出ステップを除いて、上記に記載されるものと同じステップに従った。上記に記載されるように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びエンドトキシン測定によって、タンパク質の品質を評価した。本明細書に記載されるニワトリＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ－Ａｖｉ－Ｈｉｓ、ＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ（ｇｇＤｌ（Ｓ１３９－Ｐ２４６）－ｈｓＤ２（Ｖ１３２－Ｖ２３３）－ｈｓＤ３（Ｖ２３４－Ｅ３５９））－Ａｖｉ－Ｈｉｓ及びＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ（ｇｇＤ１（Ｓ１３９－Ｈ２６０）－ｇｇＤ２（Ｓ２６１－Ｖ３４９）－ｈｓＤ３（Ｖ２４３－Ｅ３５９））－Ａｖｉ－Ｈｉｓは、それぞれ、配列番号３、４及び５を有する。
【0188】
組換え細胞株
全長ヒトＩＬ－１ＲＡＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ配列番号Ｑ９ＮＰＨ３、残基１～５７０、配列番号６）又は全長カニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ配列番号Ｐ５９８２２、残基１～５７０、配列番号７）のいずれかのヒトコドン最適化配列を、修飾ｐｃＤＮＡ（商標）３．１プラスミド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｖ７９０２０）においてクローニングした。ベクターは、強化緑色蛍光タンパク質（enhanced Green Fluorescent Protein、ｅＧＦＰ）及びプロマイシン耐性遺伝子（介在リボソーム間進入部位（intercalated intraribosomal entry site、ＩＲＥＳ）エレメントを有する）も含んだ。タンパク質発現のために、前述のプラスミドが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Polysciences）を使用して、ＣＨＯ－Ｓ細胞（ｃＧＭＰバンク保存、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１１３６４０１）にトランスフェクトされた。簡潔に説明すると、細胞を、ＣＤ ＣＨＯ（Ｇｉｂｃｏ）中、２００万細胞／ｍＬで調製した。次いで、細胞にＤＮＡ－ＰＥＩ混合物を３７℃でトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、細胞培養物を、４ｍＭのＥ－グルタミンを補充したＰｏｗｅｒＣＨＯ ２（Ｌｏｎｚａ）で１：１に希釈し、３７℃、５％Ｃ０２、及び８０％湿度で軌道振盪しながら５日間インキュベートした。ヒト又はカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰの発現を、蛍光顕微鏡を用いてｅＧＦＰレポータータンパク質発現を監視することによって評価した。本明細書に記載されるヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ－Ａｖｉ－Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質は、それぞれ、配列番号６及び７を有する。
全長ヒトＩＬ－１ＲＡＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ配列番号Ｑ９ＮＰＨ３、残基１～５７０、配列番号６）又は全長カニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ（ＵｎｉＰｒｏｔ配列番号Ｐ５９８２２、残基１～５７０、配列番号７）のいずれかのヒトコドン最適化配列を、修飾ｐｃＤＮＡ（商標）３．１プラスミド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｖ７９０２０）においてクローニングした。ベクターは、強化緑色蛍光タンパク質（enhanced Green Fluorescent Protein、ｅＧＦＰ）及びプロマイシン耐性遺伝子（介在リボソーム間進入部位（intercalated intraribosomal entry site、ＩＲＥＳ）エレメントを有する）も含んだ。タンパク質発現のために、前述のプラスミドが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Polysciences）を使用して、ＣＨＯ－Ｓ細胞（ｃＧＭＰバンク保存、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１１３６４０１）にトランスフェクトされた。簡潔に説明すると、細胞を、ＣＤ ＣＨＯ（Ｇｉｂｃｏ）中、２００万細胞／ｍＬで調製した。次いで、細胞にＤＮＡ－ＰＥＩ混合物を３７℃でトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、細胞培養物を、４ｍＭのＥ－グルタミンを補充したＰｏｗｅｒＣＨＯ ２（Ｌｏｎｚａ）で１：１に希釈し、３７℃、５％Ｃ０２、及び８０％湿度で軌道振盪しながら５日間インキュベートした。ヒト又はカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰの発現を、蛍光顕微鏡を用いてｅＧＦＰレポータータンパク質発現を監視することによって評価した。本明細書に記載されるヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ－Ａｖｉ－Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質は、それぞれ、配列番号６及び７を有する。
【0189】
ライブラリー生成
本明細書で使用されるライブラリーは、重鎖（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）に制限された多様性及び固定されたＶκ３－１５／Ｊκ１軽鎖を有する合成起源に由来した。ライブラリーは、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－１５及びＶＨ３－５３抗体生殖系列に基づく４つの異なるサブライブラリーを含んでいた。ＣＤＲは、三量体オリゴヌクレオチドを使用してランダム化されている。ＣＤＲ－Ｈ１及びＣＤＲ－Ｈ２を多様化するために使用されるプライマーは、各サブライブラリーについて設計され、それぞれ、Ｋａｂａｔ残基２７～３５及び５０～５８において生殖系列特異的な天然に存在する多様性をコードした。ＣＤＲ－Ｈ３は、１５個のＣＤＲ－Ｈ３の長さ（６～２０）及びＫａｂａｔ残基９５～１０２における長さ特異的な天然に存在する多様性をコードするオリゴヌクレオチドのプールを使用して、ランダム化されている。多様化されたｓｃＦｖ断片は、天然のＣＤＲ－Ｈ３の長さ分布を模倣するようにプールされ、ｐＮＧＬＥＮ（自社修飾ｐＵＣ１１９ファジミドベクター）にクローニングされており、結果として生じる連結反応物は、Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞に電気穿孔されている。各サブライブラリーは、１．２×１０１０～１．７×１０１０の多様性を有し、４つのサブライブラリーは、５．６×１０１０の全多様性に達した。
本明細書で使用されるライブラリーは、重鎖（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）に制限された多様性及び固定されたＶκ３－１５／Ｊκ１軽鎖を有する合成起源に由来した。ライブラリーは、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－１５及びＶＨ３－５３抗体生殖系列に基づく４つの異なるサブライブラリーを含んでいた。ＣＤＲは、三量体オリゴヌクレオチドを使用してランダム化されている。ＣＤＲ－Ｈ１及びＣＤＲ－Ｈ２を多様化するために使用されるプライマーは、各サブライブラリーについて設計され、それぞれ、Ｋａｂａｔ残基２７～３５及び５０～５８において生殖系列特異的な天然に存在する多様性をコードした。ＣＤＲ－Ｈ３は、１５個のＣＤＲ－Ｈ３の長さ（６～２０）及びＫａｂａｔ残基９５～１０２における長さ特異的な天然に存在する多様性をコードするオリゴヌクレオチドのプールを使用して、ランダム化されている。多様化されたｓｃＦｖ断片は、天然のＣＤＲ－Ｈ３の長さ分布を模倣するようにプールされ、ｐＮＧＬＥＮ（自社修飾ｐＵＣ１１９ファジミドベクター）にクローニングされており、結果として生じる連結反応物は、Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞に電気穿孔されている。各サブライブラリーは、１．２×１０１０～１．７×１０１０の多様性を有し、４つのサブライブラリーは、５．６×１０１０の全多様性に達した。
【0190】
ライブラリー選択
各サブライブラリーからの精製されたファージ粒子を、プールし（２．５×１０１１個のプラーク形成単位／サブライブラリー）、３％（ｗ／ｖ）脱脂乳（３％ＭＰＢＳ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて室温（room temperature、ＲＴ）で１時間ブロックした。Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＧビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０００３Ｄ）及び２００ｎＭのヒトＩｇＧ１を、３％ＭＰＢＳ中で混合し、室温で１時間インキュベートした。ブロックされたファージを、ＩｇＧ１でコーティングされたビーズに対して室温で１時間選択解除した。次いで、ファージを、５０ｎＭの組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＩＬＰ－Ｈ５２５６）と室温で２時間インキュベートした。抗原結合ファージを、プロテインＧビーズ上に室温で３０分間捕捉し、ビーズを、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．１％）で５回、ＰＢＳで２回洗浄した。ファージを、１００ｍＭトリエチルアミンを用いて室温で１０分間溶出し、ｐＨ８のＴｒｉｓ－ＨＣｌ １Ｍを使用して中和した。溶出されたファージが、１０ｍＬの指数関数的に増殖するＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞を感染させるために使用された。感染した細胞を、２ＹＴ培地内で、３７℃及び１００回転／分（rotation per minute、ＲＰＭ）で１時間増殖させ、次いで、２ＹＴＡＧ（１００ｐｇ／ｍＬのアンピシリン及び２％グルコースを補充した２ＴＹ培地）寒天プレート上に広げ、３０℃で一晩（overnight、ＯＮ）インキュベートした。コロニーをプレートから掻き取って１０ｍＬの２ＹＴに入れ、－８０℃で保存するために１５％グリセロール（ｖ／ｖ）を添加した。６００ｎｍでのＯＤが０．５に達するまで、グリセロールストックからのＴＧ１細胞を、２ＹＴＡＧ培地内で３７℃及び２４０ＲＰＭで増殖させた。次いで、３７℃及び１００ＲＰＭで１時間、１０の感染多重度（multiplicity of infection、ＭＯＩ）を使用して、細胞をＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージに重複感染させた。次いで、培養培地を２ＹＴＡＫ（１００ｐｇ／ｍＬのアンピシリン及び５０ｐｇ／ｍＬのカナマイシンを補充した２ＹＴ培地）に交換し、細胞を３０℃及び２８０ＲＰＭで更に一晩培養した。翌日、１０μＬのファージ含有無細胞上清を、後続回の選択に使用した。同じ実験設定を使用して、合計３回の選択を実行した。
各サブライブラリーからの精製されたファージ粒子を、プールし（２．５×１０１１個のプラーク形成単位／サブライブラリー）、３％（ｗ／ｖ）脱脂乳（３％ＭＰＢＳ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて室温（room temperature、ＲＴ）で１時間ブロックした。Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＧビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０００３Ｄ）及び２００ｎＭのヒトＩｇＧ１を、３％ＭＰＢＳ中で混合し、室温で１時間インキュベートした。ブロックされたファージを、ＩｇＧ１でコーティングされたビーズに対して室温で１時間選択解除した。次いで、ファージを、５０ｎＭの組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＩＬＰ－Ｈ５２５６）と室温で２時間インキュベートした。抗原結合ファージを、プロテインＧビーズ上に室温で３０分間捕捉し、ビーズを、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．１％）で５回、ＰＢＳで２回洗浄した。ファージを、１００ｍＭトリエチルアミンを用いて室温で１０分間溶出し、ｐＨ８のＴｒｉｓ－ＨＣｌ １Ｍを使用して中和した。溶出されたファージが、１０ｍＬの指数関数的に増殖するＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞を感染させるために使用された。感染した細胞を、２ＹＴ培地内で、３７℃及び１００回転／分（rotation per minute、ＲＰＭ）で１時間増殖させ、次いで、２ＹＴＡＧ（１００ｐｇ／ｍＬのアンピシリン及び２％グルコースを補充した２ＴＹ培地）寒天プレート上に広げ、３０℃で一晩（overnight、ＯＮ）インキュベートした。コロニーをプレートから掻き取って１０ｍＬの２ＹＴに入れ、－８０℃で保存するために１５％グリセロール（ｖ／ｖ）を添加した。６００ｎｍでのＯＤが０．５に達するまで、グリセロールストックからのＴＧ１細胞を、２ＹＴＡＧ培地内で３７℃及び２４０ＲＰＭで増殖させた。次いで、３７℃及び１００ＲＰＭで１時間、１０の感染多重度（multiplicity of infection、ＭＯＩ）を使用して、細胞をＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージに重複感染させた。次いで、培養培地を２ＹＴＡＫ（１００ｐｇ／ｍＬのアンピシリン及び５０ｐｇ／ｍＬのカナマイシンを補充した２ＹＴ培地）に交換し、細胞を３０℃及び２８０ＲＰＭで更に一晩培養した。翌日、１０μＬのファージ含有無細胞上清を、後続回の選択に使用した。同じ実験設定を使用して、合計３回の選択を実行した。
【0191】
ＳＰＲによるｓｃＦｖスクリーニング
表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance、ＳＰＲ）分析を使用して、ｓｃＦｖクローンの特異的結合活性を確認した。測定を、室温でＢｉａｃｏｒｅ ２０００ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ３．２を使用してＢｉａｃｏｒｅ ２０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行い、同じ製造業者からのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ３．１）を用いて分析した。組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＩＬＰ－Ｈ５２５６）及び組換えマウスＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号５２６５７－Ｍ０２Ｈ）を、個別に、ｐＨ４．５の酢酸緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００３５０）中で２００ｎＭの最終濃度に希釈し、その後、製造業者の推奨に従ってアミンカップリングキットを使用して、それぞれ、Ｆｃ２及びＦｃ４上で、ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００１２）上で約１０００共鳴単位（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔ、ＲＵと略称される）のレベルまで固定化した。ＨＢＳ－ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００１８８）を泳動緩衝液として使用した。濾過したペリプラズム抽出物を、共有結合したヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ及びマウスＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ ＣＭ５センサーチップ上に直接注入した。試料を、流路１、２、３及び４（流路１及び３が基準として使用される）上に３０μＬ／分の流速で３分間注入し、その後に、泳動緩衝液中で５分の解離時間が続いた。各結合事象後、表面を、３０μＬ／分で１分間注入されたｐＨ１．５の１０ｍＭグリシン溶液（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００３５４）で再生した。各測定は、それぞれ、参照及び特異性のために、０濃度試料並びに無関係なｓｃＦｖペリプラズム抽出物を含んだ。
表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance、ＳＰＲ）分析を使用して、ｓｃＦｖクローンの特異的結合活性を確認した。測定を、室温でＢｉａｃｏｒｅ ２０００ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ３．２を使用してＢｉａｃｏｒｅ ２０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行い、同じ製造業者からのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ３．１）を用いて分析した。組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＩＬＰ－Ｈ５２５６）及び組換えマウスＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号５２６５７－Ｍ０２Ｈ）を、個別に、ｐＨ４．５の酢酸緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００３５０）中で２００ｎＭの最終濃度に希釈し、その後、製造業者の推奨に従ってアミンカップリングキットを使用して、それぞれ、Ｆｃ２及びＦｃ４上で、ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００１２）上で約１０００共鳴単位（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔ、ＲＵと略称される）のレベルまで固定化した。ＨＢＳ－ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００１８８）を泳動緩衝液として使用した。濾過したペリプラズム抽出物を、共有結合したヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ及びマウスＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ ＣＭ５センサーチップ上に直接注入した。試料を、流路１、２、３及び４（流路１及び３が基準として使用される）上に３０μＬ／分の流速で３分間注入し、その後に、泳動緩衝液中で５分の解離時間が続いた。各結合事象後、表面を、３０μＬ／分で１分間注入されたｐＨ１．５の１０ｍＭグリシン溶液（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００３５４）で再生した。各測定は、それぞれ、参照及び特異性のために、０濃度試料並びに無関係なｓｃＦｖペリプラズム抽出物を含んだ。
【0192】
フローサイトメトリーによるｓｃＦｖスクリーニング
ヒトＩＬ－１ＲＡＰタンパク質（配列番号６）又はカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰタンパク質（配列番号７）を一過性に発現するＣＨＯ細胞へのｓｃＦｖクローンの結合を、フローサイトメトリーによって評価した。３回目の選択からの個々のＥ．ｃｏｌｉを採取し、９６ウェルディープウェルプレート内の１００ｐｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．１％グルコースを補充した２ＴＹ培地中で増殖させた。０．０２ｍＭのＩＰＴＧの添加、並びに３０℃及び２５０ＲＰＭにおける一晩のインキュベーションによって、ｓｃＦｖ発現を誘導した。細胞を遠心分離し、細菌ペレットをＴＥＳ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８、２０％スクロース）中に再懸濁し、続いて、氷上で３０分間インキュベートすることによって、ペリプラズム抽出物を得た。細胞破片を遠心分離によって除去し、ｓｃＦｖ含有上清をフローサイトメトリー実験に使用した。ＩＬ－１ＲＡＰ発現及び非トランスフェクトＣＨＯ細胞を、１０５細胞／ウェルの密度でマイクロタイタープレート内に播種した。次に、プレートを遠心分離して細胞上清を除去し、３％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ－ＢＳＡ ３％）中で事前に１：１に希釈された１００μＬのペリプラズム抽出物を各ウェルに添加し、プレートを４℃で３０分間更にインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ－ＢＳＡ ３％で洗浄し、ＰＢＳ－ＢＳＡ ３％中で１：２００に希釈されたビオチン－ニワトリ抗ｃ－Ｍｙｃ抗体（Ｇａｌｌｕｓ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈカタログ番号ＡＣＭＹＣ－Ｂ）と４℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳ－ＢＳＡ ３％で洗浄し、ＰＢＳ－ＢＳＡ ３％中で１：１００に希釈されたストレプトアビジンＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１７－４３１７）と４℃で３０分間インキュベートした。最後に、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（BD biosciences）を使用して細胞蛍光を測定した。
ヒトＩＬ－１ＲＡＰタンパク質（配列番号６）又はカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰタンパク質（配列番号７）を一過性に発現するＣＨＯ細胞へのｓｃＦｖクローンの結合を、フローサイトメトリーによって評価した。３回目の選択からの個々のＥ．ｃｏｌｉを採取し、９６ウェルディープウェルプレート内の１００ｐｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．１％グルコースを補充した２ＴＹ培地中で増殖させた。０．０２ｍＭのＩＰＴＧの添加、並びに３０℃及び２５０ＲＰＭにおける一晩のインキュベーションによって、ｓｃＦｖ発現を誘導した。細胞を遠心分離し、細菌ペレットをＴＥＳ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８、２０％スクロース）中に再懸濁し、続いて、氷上で３０分間インキュベートすることによって、ペリプラズム抽出物を得た。細胞破片を遠心分離によって除去し、ｓｃＦｖ含有上清をフローサイトメトリー実験に使用した。ＩＬ－１ＲＡＰ発現及び非トランスフェクトＣＨＯ細胞を、１０５細胞／ウェルの密度でマイクロタイタープレート内に播種した。次に、プレートを遠心分離して細胞上清を除去し、３％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ－ＢＳＡ ３％）中で事前に１：１に希釈された１００μＬのペリプラズム抽出物を各ウェルに添加し、プレートを４℃で３０分間更にインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ－ＢＳＡ ３％で洗浄し、ＰＢＳ－ＢＳＡ ３％中で１：２００に希釈されたビオチン－ニワトリ抗ｃ－Ｍｙｃ抗体（Ｇａｌｌｕｓ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈカタログ番号ＡＣＭＹＣ－Ｂ）と４℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳ－ＢＳＡ ３％で洗浄し、ＰＢＳ－ＢＳＡ ３％中で１：１００に希釈されたストレプトアビジンＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１７－４３１７）と４℃で３０分間インキュベートした。最後に、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（BD biosciences）を使用して細胞蛍光を測定した。
【0193】
ＥＬＩＳＡによるｓｃＦｖ競合
抗ＩＬ－１ＲＡＰ抗体と競合するｓｃＦｖクローンの能力をＥＬＩＳＡによって評価した。ヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＩＬＰ－Ｈ５２５６）を、ＰＢＳ中１．５μｇ／ｍＬで９６ウェルマイクロタイタープレート上に４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．０５％で３回洗浄し、ＰＢＳ－ＢＳＡ ３％を用いて室温で１時間ブロックした。ブロック及び洗浄した後、１０ｕｇ／ｍＬにおける５０μＬのＦａｂをプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。洗浄することなく、５０μＬのペリプラズム抽出物を添加し、プレートを室温で３０分間更にインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ＰＢＳ－ＢＳＡ ３％中で１：５０００に希釈された５０μＬのビオチン－ニワトリ抗ｃ－Ｍｙｃ抗体（Ｇａｌｌｕｓ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈカタログ番号ＡＣＭＹＣ－Ｂ）を室温で１時間添加した。洗浄した後、ストレプトアビジンＨＲＰをＰＢＳ－ＢＳＡ ０．３％中で１／８０００に希釈し、室温で３０分間プレートに添加した。次いで、プレートを洗浄し、ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、アッセイを室温で５分間発現させた。Ｈ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ）との反応を停止させた後、分光光度計を使用して、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
抗ＩＬ－１ＲＡＰ抗体と競合するｓｃＦｖクローンの能力をＥＬＩＳＡによって評価した。ヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＩＬＰ－Ｈ５２５６）を、ＰＢＳ中１．５μｇ／ｍＬで９６ウェルマイクロタイタープレート上に４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．０５％で３回洗浄し、ＰＢＳ－ＢＳＡ ３％を用いて室温で１時間ブロックした。ブロック及び洗浄した後、１０ｕｇ／ｍＬにおける５０μＬのＦａｂをプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。洗浄することなく、５０μＬのペリプラズム抽出物を添加し、プレートを室温で３０分間更にインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ＰＢＳ－ＢＳＡ ３％中で１：５０００に希釈された５０μＬのビオチン－ニワトリ抗ｃ－Ｍｙｃ抗体（Ｇａｌｌｕｓ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈカタログ番号ＡＣＭＹＣ－Ｂ）を室温で１時間添加した。洗浄した後、ストレプトアビジンＨＲＰをＰＢＳ－ＢＳＡ ０．３％中で１／８０００に希釈し、室温で３０分間プレートに添加した。次いで、プレートを洗浄し、ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、アッセイを室温で５分間発現させた。Ｈ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ）との反応を停止させた後、分光光度計を使用して、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【0194】
Ｆａｂ及びＩｇＧ１ ＬＡＬＡ発現
異なる抗体定常領域をコードするｃＤＮＡが、ＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって遺伝子合成され、標準的な分子生物学技法を使用して修飾された。ＰＣＲ産物を、適切なＤＮＡ制限酵素で消化し、精製し、ＣＭＶプロモーター及びウシホルモンポリアデニル化（ポリ（Ａ））を担持する修飾ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において連結した。発現ベクターは、エプスタイン－バーウイルスのプラスミド複製の起点であるｏｒｉＰ、及びコードされたポリペプチド鎖の分泌のためのマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドも担持した。ｓｃＦｖライブラリークローンをヒトＩｇＧ１ Ｆａｂ断片又はヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡ（Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１、ＥＵ番号付け）に再フォーマットするために、そのファージライブラリーベクター中の各ｓｃＦｖクローンを使用して、その個々のＶＨ ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、次に、ＶＨ ＰＣＲ産物を、ヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨＩドメインをコードするｃＤＮＡの上流又はヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨＩ、ヒンジ、ＣＨ２（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）及びＣＨ３ドメインをコードするｃＤＮＡの上流で、上記に記載される修飾ｐｃＤＮＡ ３．１ベクターにおいてクローニングした一方で、固定されたＶκ３－１５／Ｊκ１軽鎖（配列番号７１）を、ヒトカッパ定常軽鎖ドメインをコードするｃＤＮＡの上流で、上記に記載される修飾ｐｃＤＮＡ ３．１ベクターにおいてクローニングした。
異なる抗体定常領域をコードするｃＤＮＡが、ＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって遺伝子合成され、標準的な分子生物学技法を使用して修飾された。ＰＣＲ産物を、適切なＤＮＡ制限酵素で消化し、精製し、ＣＭＶプロモーター及びウシホルモンポリアデニル化（ポリ（Ａ））を担持する修飾ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において連結した。発現ベクターは、エプスタイン－バーウイルスのプラスミド複製の起点であるｏｒｉＰ、及びコードされたポリペプチド鎖の分泌のためのマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドも担持した。ｓｃＦｖライブラリークローンをヒトＩｇＧ１ Ｆａｂ断片又はヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡ（Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１、ＥＵ番号付け）に再フォーマットするために、そのファージライブラリーベクター中の各ｓｃＦｖクローンを使用して、その個々のＶＨ ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、次に、ＶＨ ＰＣＲ産物を、ヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨＩドメインをコードするｃＤＮＡの上流又はヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨＩ、ヒンジ、ＣＨ２（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）及びＣＨ３ドメインをコードするｃＤＮＡの上流で、上記に記載される修飾ｐｃＤＮＡ ３．１ベクターにおいてクローニングした一方で、固定されたＶκ３－１５／Ｊκ１軽鎖（配列番号７１）を、ヒトカッパ定常軽鎖ドメインをコードするｃＤＮＡの上流で、上記に記載される修飾ｐｃＤＮＡ ３．１ベクターにおいてクローニングした。
【0195】
Ｆａｂ及びＩｇＧ１ ＬＡＬＡ発現のために、ＰＥＬを使用して、等量の重鎖及び軽鎖ベクターを懸濁適合ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－１０８５２）に同時トランスフェクトした。典型的には、細胞を、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を補充したＲＰＭＩ中、８００万細胞／ｍＬで調製した。次いで、細胞をＤＮＡ－ＰＥＩ混合物でトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、細胞培養物を、フェノールレッド及び４ｍＭのＬ－グルタミンを補充したＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）２９３中で１：１に希釈し、３７℃、５％Ｃ０２、及び８０％湿度で軌道振盪しながら５日間インキュベートした。組換えタンパク質を含有する無細胞培養上清を、遠心分離、続いて濾過によって調製し、更なる精製に使用した。Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＧ－ＣＨｌ親和性マトリクス（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１９４３２００５０）を使用して、Ｆａｂタンパク質を精製し、ＣａｐｔｉｖＡ（登録商標）プロテインＡ親和性樹脂（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、カタログ番号ＣＡ－ＰＲＩ－０１００）を使用して、ＩｇＧ１ ＬＡＬＡタンパク質を精製した。両方について、親和性樹脂を濾過した培養上清に添加し、穏やかに混合しながら４℃でインキュベートした。翌日、樹脂ビーズをＰｏｌｙ－Ｐｒｅｐカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）内に回収し、ＰＢＳで洗浄し、組換えタンパク質を酸性緩衝液（典型的にはグリシン０．１Ｍ、ｐＨ３）で溶出した。１／１０容量のｐＨ８のＴｒｉｓ－ＨＣｌを用いた中和後、調製物をＰＢＳに緩衝液交換した。
【0196】
ＩＬ－ＲＡＰに対するＦａｂ結合親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ヒト、カニクイザル及び／又はマウスＩＬ－１ＲＡＰに対するＦａｂ断片の結合親和性を測定した。親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で２５℃で測定し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ３．１）を用いて分析した。測定を、市販のアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００５０）を使用して、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）と結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００５３０）上で、又はＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＢｉｏｔｉｎＣＡＰｔｕｒｅチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８９２０２３４）上で行った。ＳＰＲ測定を、市販の組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＩＬＰ－Ｈ５２５６）及び組換えマウスＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号５２６５７－Ｍ０２Ｈ）を用いて、又は自社で産生されたビオチン化組換えカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号２）を用いて行った。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ヒト、カニクイザル及び／又はマウスＩＬ－１ＲＡＰに対するＦａｂ断片の結合親和性を測定した。親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で２５℃で測定し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ３．１）を用いて分析した。測定を、市販のアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００５０）を使用して、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）と結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００５３０）上で、又はＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＢｉｏｔｉｎＣＡＰｔｕｒｅチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８９２０２３４）上で行った。ＳＰＲ測定を、市販の組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＩＬＰ－Ｈ５２５６）及び組換えマウスＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号５２６５７－Ｍ０２Ｈ）を用いて、又は自社で産生されたビオチン化組換えカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号２）を用いて行った。
【0197】
ＩＬ－１ＲＡＰを固定化し、分析物としてＦａｂ断片を使用することによって、ヒト、カニクイザル及びマウスＩＬ－１ＲＡＰに対する親和性を評価した。約１００ＲＵのヒト又はマウスＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃと結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップのｆｃ２上で捕捉し、約１５０ＲＵのビオチン化カニクイザルＩＬ－１ＲＡＰタンパク質を、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＢｉｏｔｉｎＣＡＰｔｕｒｅチップのｆｃ２上で捕捉した。Ｆａｂ断片を、ｆｃ１及びｆｃ２（ｆｃ１が基準として使用される）上で３０μＬ／分の流速で３分間、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００６６９）中で７．８～５００ｎＭに及ぶ異なる濃度において単一サイクル動態で注入した。解離を５分間監視した。各サイクル後、表面を、それぞれ、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉キット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）又はＢｉｏｔｉｎＣＡＰｔｕｒｅキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８９２０２３４）とともに提供された６０μＬの再生溶液で再生した。１：１ラングミュア動態適合モデルを使用して、実験データを処理した。測定は、参照用の０濃度試料を含んだ。Ｃｈｉ２、Ｕ、及び残余値を使用して、実験データと個々の結合モデルとの間の適合の質を評価した。
【0198】
ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１β／／ＩＬ－１ＲＡＰブロッキングアッセイ
ＩＬ－１ＲＡＰとＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１β受容体／サイトカイン複合体との間の相互作用を遮断するＦａｂ断片の能力を、ＳＰＲによって評価した。約５０ＲＵのヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＩＬＰ－Ｈ５２５６）を、市販のアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００５０）を使用して、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）で事前にコーティングされたＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップのｆｃ２上で固定化した。Ｆａｂ断片を、固定化されたヒトＩＬ－１ＲＡＰの飽和に達するように、ｆｃ１及びｆｃ２（ｆｃ１が基準として使用される）にわたってＨＢＳ－ＥＰ＋中の３００ｎＭで４分間注入して、その後、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中の５０ｎＭにおけるＩＬ－１Ｒ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９６－ＩＲ－１００）、ｌ００ｎＭにおけるＩＬ－１β（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０ＩＢ）、及び３００ｎＭにおけるＦａｂ断片の２分間の第２の注入が続いた。各サイクル後、表面を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉キット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）とともに提供された６０μＬの再生溶液で再生した。
ＩＬ－１ＲＡＰとＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１β受容体／サイトカイン複合体との間の相互作用を遮断するＦａｂ断片の能力を、ＳＰＲによって評価した。約５０ＲＵのヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＩＬＰ－Ｈ５２５６）を、市販のアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００５０）を使用して、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）で事前にコーティングされたＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップのｆｃ２上で固定化した。Ｆａｂ断片を、固定化されたヒトＩＬ－１ＲＡＰの飽和に達するように、ｆｃ１及びｆｃ２（ｆｃ１が基準として使用される）にわたってＨＢＳ－ＥＰ＋中の３００ｎＭで４分間注入して、その後、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中の５０ｎＭにおけるＩＬ－１Ｒ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９６－ＩＲ－１００）、ｌ００ｎＭにおけるＩＬ－１β（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０ＩＢ）、及び３００ｎＭにおけるＦａｂ断片の２分間の第２の注入が続いた。各サイクル後、表面を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉キット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）とともに提供された６０μＬの再生溶液で再生した。
【0199】
ドメインマッピング
ＩｇＧ１ ＬＡＬＡクローンによって標的化されたＩＬ－１ＲＡＰのドメインを、ＳＰＲ結合アッセイによって同定した。約１５０ＲＵのＩｇＧ１ ＬＡＬＡを、市販のアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００５０）を使用して、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）で事前にコーティングされたＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップのｆｃ２上で固定化した。ヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓ、ニワトリＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓ、ＩＬ－１ＲＡＰのヒトドメイン２及び３に融合したＩＬ－ＲＡＰのニワトリドメイン１を含むキメラタンパク質（ｇｇ－ｈｓ－ｈｓ－ＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ－ａｖｉ－ｈｉｓ）、並びにＩＬ－１ＲＡＰのヒトドメイン３に融合したＩＬ－１ＲＡＰのニワトリドメイン１及び２を含むキメラタンパク質（ｇｇ－ｇｇ－ｈｓ－ＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓ）を、個別に、ｆｃ１及びｆｃ２（ｆｃ１が基準として使用される）にわたってＨＢＳ－ＥＰ＋中で５０ｎＭにおいて３分間注入し、続いて、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中で５分間解離した。各結合事象後、表面を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉キット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）とともに提供された６０μＬの再生溶液で再生した。
ＩｇＧ１ ＬＡＬＡクローンによって標的化されたＩＬ－１ＲＡＰのドメインを、ＳＰＲ結合アッセイによって同定した。約１５０ＲＵのＩｇＧ１ ＬＡＬＡを、市販のアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００５０）を使用して、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）で事前にコーティングされたＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップのｆｃ２上で固定化した。ヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓ、ニワトリＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓ、ＩＬ－１ＲＡＰのヒトドメイン２及び３に融合したＩＬ－ＲＡＰのニワトリドメイン１を含むキメラタンパク質（ｇｇ－ｈｓ－ｈｓ－ＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ－ａｖｉ－ｈｉｓ）、並びにＩＬ－１ＲＡＰのヒトドメイン３に融合したＩＬ－１ＲＡＰのニワトリドメイン１及び２を含むキメラタンパク質（ｇｇ－ｇｇ－ｈｓ－ＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓ）を、個別に、ｆｃ１及びｆｃ２（ｆｃ１が基準として使用される）にわたってＨＢＳ－ＥＰ＋中で５０ｎＭにおいて３分間注入し、続いて、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中で５分間解離した。各結合事象後、表面を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉キット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）とともに提供された６０μＬの再生溶液で再生した。
【0200】
エピトープビニング
バイオレイヤー干渉法（Bio-Layer Interferometry、ＢＬＩ）を使用して、ヒトＩＬ－１ＲＡＰ上のＦａｂ断片のエピトープビニングを評価した。測定を、ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６ｅ機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上で行い、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｉｓ ＨＴバージョン１１．１ソフトウェア（Ｏｃｔｅｔ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して分析した。自社で産生されたビオチン化ヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号１）を、ストレプトアビジンＳＡバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１５－５０１９）上に、動態緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８－１１０５）中１ｐｇ／ｍＬで５分間装填した。ビオチン化ヒトＩＬ－１ＲＡＰ抗原で固定化されたストレプトアビジンバイオセンサーを、２００ｎＭのＦａｂ １（飽和Ｆａｂ）の溶液に１０分間浸漬し、続いて、２００ｎＭのＦａｂ １及び２００ｎＭのＦａｂ ２（競合Ｆａｂ）の混合溶液に連続的に５分間浸漬した。全てのステップを、２５℃及び１０００ＲＰＭの振盪で実施した。新鮮なストレプトアビジンバイオセンサーを、各サイクルの前にビオチン化ヒトＩＬ－１ＲＡＰで固定化した。
バイオレイヤー干渉法（Bio-Layer Interferometry、ＢＬＩ）を使用して、ヒトＩＬ－１ＲＡＰ上のＦａｂ断片のエピトープビニングを評価した。測定を、ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６ｅ機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上で行い、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｉｓ ＨＴバージョン１１．１ソフトウェア（Ｏｃｔｅｔ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して分析した。自社で産生されたビオチン化ヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号１）を、ストレプトアビジンＳＡバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１５－５０１９）上に、動態緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８－１１０５）中１ｐｇ／ｍＬで５分間装填した。ビオチン化ヒトＩＬ－１ＲＡＰ抗原で固定化されたストレプトアビジンバイオセンサーを、２００ｎＭのＦａｂ １（飽和Ｆａｂ）の溶液に１０分間浸漬し、続いて、２００ｎＭのＦａｂ １及び２００ｎＭのＦａｂ ２（競合Ｆａｂ）の混合溶液に連続的に５分間浸漬した。全てのステップを、２５℃及び１０００ＲＰＭの振盪で実施した。新鮮なストレプトアビジンバイオセンサーを、各サイクルの前にビオチン化ヒトＩＬ－１ＲＡＰで固定化した。
【0201】
結果：
ＳＰＲによるヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質への特異的結合並びにヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ ＣＨＯ細胞の両方への特異的結合を示すが、ＳＰＲによるマウスＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質への結合を示さない、ｓｃＦｖクローンを配列決定し、更なる特性評価のために、独自の配列をＦａｂ断片に再フォーマットした。ＳＰＲによるヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質及びマウスＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質の両方への特異的結合を示すとともに、ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ ＣＨＯ細胞の両方への特異的結合を示し、ＩＬ－１ＲＡＰと受容体／サイトカイン複合体ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－Ｐとの間の相互作用を遮断することが知られている抗ＩＬ－１ＲＡＰ抗体と競合する、ｓｃＦｖクローンを配列決定し、更なる特性評価のために、独自の配列もＦａｂ断片に再フォーマットした。生化学的特性評価は、結合親和性の評価を含み、ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１β／ＩＬ－１ＲＡＰブロッキングアッセイを使用して、機能評価を実施し、ドメインマッピング及びエピトープビニングアッセイを使用して、エピトープ標的化を決定した。
ＳＰＲによるヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質への特異的結合並びにヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ ＣＨＯ細胞の両方への特異的結合を示すが、ＳＰＲによるマウスＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質への結合を示さない、ｓｃＦｖクローンを配列決定し、更なる特性評価のために、独自の配列をＦａｂ断片に再フォーマットした。ＳＰＲによるヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質及びマウスＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質の両方への特異的結合を示すとともに、ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ ＣＨＯ細胞の両方への特異的結合を示し、ＩＬ－１ＲＡＰと受容体／サイトカイン複合体ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－Ｐとの間の相互作用を遮断することが知られている抗ＩＬ－１ＲＡＰ抗体と競合する、ｓｃＦｖクローンを配列決定し、更なる特性評価のために、独自の配列もＦａｂ断片に再フォーマットした。生化学的特性評価は、結合親和性の評価を含み、ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１β／ＩＬ－１ＲＡＰブロッキングアッセイを使用して、機能評価を実施し、ドメインマッピング及びエピトープビニングアッセイを使用して、エピトープ標的化を決定した。
【0202】
ＩＬ－ＲＡＰに対するＦａｂ結合親和性
２４個のＦａｂクローンが、ＳＰＲによって決定される１μＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）とともにヒトＩＬ－１ＲＡＰに対する結合親和性を示した。以後、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８とも称される、クローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－ＵＣＰ０２－Ｃ８は、ヒトＩＬ－１ＲＡＰ（２．２ｎＭ）及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ（２．２ｎＭ）の両方に対する最も高い親和性を示したが、マウスＩＬ－１ＲＡＰには結合しなかった。以後、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３とも称される、クローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－ＵＣＰ０２－Ｃ３は、マウスＩＬ－１ＲＡＰに対する高い親和性（０．６３ｎＭ）、及びヒトＩＬ－１ＲＡＰに対するクローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８と同様の親和性（それぞれ、２．８ｎＭ及び２．２ｎＭ）を示した。しかしながら、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３は、ヒトＩＬ－１ＲＡＰ（２．８ｎＭ）に対するよりもカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ（１１０ｎＭ）に対して約４０倍低い親和性を示した。前述のクローンの重鎖配列識別番号及び結合親和性を表１に報告する。
２４個のＦａｂクローンが、ＳＰＲによって決定される１μＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）とともにヒトＩＬ－１ＲＡＰに対する結合親和性を示した。以後、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８とも称される、クローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－ＵＣＰ０２－Ｃ８は、ヒトＩＬ－１ＲＡＰ（２．２ｎＭ）及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ（２．２ｎＭ）の両方に対する最も高い親和性を示したが、マウスＩＬ－１ＲＡＰには結合しなかった。以後、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３とも称される、クローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－ＵＣＰ０２－Ｃ３は、マウスＩＬ－１ＲＡＰに対する高い親和性（０．６３ｎＭ）、及びヒトＩＬ－１ＲＡＰに対するクローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８と同様の親和性（それぞれ、２．８ｎＭ及び２．２ｎＭ）を示した。しかしながら、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３は、ヒトＩＬ－１ＲＡＰ（２．８ｎＭ）に対するよりもカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ（１１０ｎＭ）に対して約４０倍低い親和性を示した。前述のクローンの重鎖配列識別番号及び結合親和性を表１に報告する。
【0203】
【表1】
【0204】
ＩＬ－１ＲＡＰ／ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１β ブロッキングアッセイ
Ｏｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法を使用して、ヒトＩＬ－１ＲＡＰ／ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１β複合体形成を遮断することにおいて、ＳＰＲによって測定される１００ｎＭ未満のヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質に対するＫＤを有するＦａｂ断片を試験した。全ての試験したＦａｂ断片は、ヒトＩＬ－１ＲＡＰとＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１β受容体／サイトカイン複合体との間の相互作用を遮断することが確認された。クローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８及び抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３を用いたヒトＩＬ－１ＲＡＰとＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１β受容体／サイトカイン複合体との間の相互作用の遮断が、図１に例証されている。以後、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｅｌとも称される、クローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－ＵＣＰ０５－Ｅｌを、非遮断薬対照として使用した。
Ｏｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法を使用して、ヒトＩＬ－１ＲＡＰ／ＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１β複合体形成を遮断することにおいて、ＳＰＲによって測定される１００ｎＭ未満のヒトＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質に対するＫＤを有するＦａｂ断片を試験した。全ての試験したＦａｂ断片は、ヒトＩＬ－１ＲＡＰとＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１β受容体／サイトカイン複合体との間の相互作用を遮断することが確認された。クローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８及び抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３を用いたヒトＩＬ－１ＲＡＰとＩＬ－１Ｒ１／ＩＬ－１β受容体／サイトカイン複合体との間の相互作用の遮断が、図１に例証されている。以後、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｅｌとも称される、クローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－ＵＣＰ０５－Ｅｌを、非遮断薬対照として使用した。
【0205】
ドメインマッピング
抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８の作用機序への洞察を得て、エピトープに関して抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３クローンを関連マウス代理として検証するために、両方の抗体によって標的化されるＩＬ－１ＲＡＰのドメインを研究した。表１に記載されるように、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３ Ｆａｂは、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８ Ｆａｂと同様の親和性でヒトＩＬ－１ＲＡＰに結合する。ヒト－ニワトリＩＬ－１ＲＡＰキメラを使用して両方の抗体のエピトープを比較するために、この結合特性を使用した。図２に示されるように、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８及び抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３の両方は、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６、それらのそれぞれの受容体とＩＬ－１ＲＡＰとの間の相互作用に関与することが知られている、ＩＬ－１ＲＡＰのドメイン２を標的としている。この実験は、そのマウス代理としての抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８及び抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３の遮断効力への洞察を提供する。
抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８の作用機序への洞察を得て、エピトープに関して抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３クローンを関連マウス代理として検証するために、両方の抗体によって標的化されるＩＬ－１ＲＡＰのドメインを研究した。表１に記載されるように、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３ Ｆａｂは、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８ Ｆａｂと同様の親和性でヒトＩＬ－１ＲＡＰに結合する。ヒト－ニワトリＩＬ－１ＲＡＰキメラを使用して両方の抗体のエピトープを比較するために、この結合特性を使用した。図２に示されるように、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８及び抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３の両方は、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６、それらのそれぞれの受容体とＩＬ－１ＲＡＰとの間の相互作用に関与することが知られている、ＩＬ－１ＲＡＰのドメイン２を標的としている。この実験は、そのマウス代理としての抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８及び抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３の遮断効力への洞察を提供する。
【0206】
エピトープビニング
抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３を抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８の関連マウス代理として更に検証するために、ヒトＩＬ－１ＲＡＰを使用して、両方の抗体を互いに競合させた。この実験は、図３に提示され、両方の抗体が互いに競合し、ＩＬ－１ＲＡＰ上の重複するエピトープを認識することを示す。抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｅｌを非競合対照として使用した。
抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３を抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８の関連マウス代理として更に検証するために、ヒトＩＬ－１ＲＡＰを使用して、両方の抗体を互いに競合させた。この実験は、図３に提示され、両方の抗体が互いに競合し、ＩＬ－１ＲＡＰ上の重複するエピトープを認識することを示す。抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｅｌを非競合対照として使用した。
【0207】
実施例２：抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８クローンの最適化
組換え標的抗原
以後、組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質とも称される、組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ（Ｓ２１－Ｅ３５９）－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号１）、及び以後、組換えカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質とも称される、組換えカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ（Ｓ２１－Ｅ３５９）－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号２）を、実施例１に記載されるように自社で産生した。
組換え標的抗原
以後、組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質とも称される、組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ（Ｓ２１－Ｅ３５９）－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号１）、及び以後、組換えカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質とも称される、組換えカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ（Ｓ２１－Ｅ３５９）－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号２）を、実施例１に記載されるように自社で産生した。
【0208】
ライブラリー生成及び選択
ＣＤＲの重鎖に多様性を導入することによって、５つの親和性成熟ライブラリーを生成した。それぞれ、Ｋａｂａｔ残基２７～３５、５０～５８、９５～１０１マイナス２における縮重ＮＮＫコドンオリゴヌクレオチド（Ｎが、４つのデオキシリボヌクレオチドのうちのいずれかであり、Ｋが、Ｇ又はＴである）を使用して、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３をランダム化した。５つの連続縮重コドンを含む重複オリゴヌクレオチドのプールを使用して、各ライブラリーを生成した。それぞれ、Ｋａｂａｔ ２７～３５位及び５０～５８位における三量体オリゴヌクレオチドを使用して、ＣＤＲ－Ｈ１及びＣＤＲ－Ｈ２も多様化した。結果として生じる５つのライブラリーＰＣＲ産物を、ｐＮＧＬＥＮ（自社修飾ｐＵＣ１１９ファジミドベクター）にクローニングし、結果として生じる連結反応物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞に電気穿孔した。形質転換細胞を２ＹＴＡＧプレート上に広げ、３０℃で一晩インキュベートした。コロニーをプレートから掻き取って１０ｍＬの２ＹＴに入れ、－８０℃で保存するために１５％グリセロール（最終濃度）を添加した。ファージを産生し、３分の１ｖ／ｖの２０％ＰＥＧ－６０００、２．５ＭのＮａＣｌを用いた２回の沈殿ステップによって精製し、ＰＢＳに再懸濁した。
ＣＤＲの重鎖に多様性を導入することによって、５つの親和性成熟ライブラリーを生成した。それぞれ、Ｋａｂａｔ残基２７～３５、５０～５８、９５～１０１マイナス２における縮重ＮＮＫコドンオリゴヌクレオチド（Ｎが、４つのデオキシリボヌクレオチドのうちのいずれかであり、Ｋが、Ｇ又はＴである）を使用して、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３をランダム化した。５つの連続縮重コドンを含む重複オリゴヌクレオチドのプールを使用して、各ライブラリーを生成した。それぞれ、Ｋａｂａｔ ２７～３５位及び５０～５８位における三量体オリゴヌクレオチドを使用して、ＣＤＲ－Ｈ１及びＣＤＲ－Ｈ２も多様化した。結果として生じる５つのライブラリーＰＣＲ産物を、ｐＮＧＬＥＮ（自社修飾ｐＵＣ１１９ファジミドベクター）にクローニングし、結果として生じる連結反応物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞に電気穿孔した。形質転換細胞を２ＹＴＡＧプレート上に広げ、３０℃で一晩インキュベートした。コロニーをプレートから掻き取って１０ｍＬの２ＹＴに入れ、－８０℃で保存するために１５％グリセロール（最終濃度）を添加した。ファージを産生し、３分の１ｖ／ｖの２０％ＰＥＧ－６０００、２．５ＭのＮａＣｌを用いた２回の沈殿ステップによって精製し、ＰＢＳに再懸濁した。
【0209】
ファージディスプレイ選択を、以下の修正を加えて実施例１に記載されるように実施した。各親和性成熟ライブラリーを独立して選択した。精製されたファージ粒子（１０１２プラーク形成単位）及び磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ＭｙＯｎｅ（商標）ストレプトアビジンＣ１ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６５００２）を、３％ＭＰＢＳを用いて室温で１時間ブロックした。ファージを、事前にブロックされたビーズに対して室温で１時間選択解除した。選択解除されたファージを、それぞれ、１回目、２回目、及び３回目について、自社で産生された５ｎＭ、０．５ｎＭ、及び０．１ｎＭのビオチン化組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号１）とインキュベートした。１時間のインキュベーション後、自社で産生された１ｐＭの組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（非ビオチン化、配列番号１）を、２回目及び３回目の間に室温で３時間添加した。抗原結合ファージを、ストレプトアビジンビーズ上に室温で３０分間捕捉し、ビーズをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．１％で５回、ＰＢＳで２回洗浄した。
【0210】
ＳＰＲによる親和性スクリーニング
ＳＰＲ分析を使用して、新しいｓｃＦｖクローンの特異的結合活性を確認し、それらの結合プロファイルに従って陽性クローンをランク付けした。測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．０を使用してＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、２５℃で行い、同じ製造業者からのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ３．１）を用いて分析した。自社で産生された組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号１）又は自社で産生された組換えカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号２）を、ｐＨ４．５の酢酸緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号奨ＢＲ－１００３－５０）中で２００ｎＭの最終濃度に希釈し、その後、製造業者の推奨に従ってアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００５０）を使用して、それぞれ、Ｆｃ２及びＦｃ４上で、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００５３０）上で約１０００共鳴単位（ＲＵと略称される）のレベルまで固定化した。ＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲＩ００６６９）を泳動緩衝液として使用した。濾過したペリプラズム抽出物を、共有結合したヒトＩＬ－１ＲＡＰ及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ ＣＭ５センサーチップ上に直接注入した。試料を、流路１、２、３及び４（流路１及び３が基準として使用される）上に３０μＬ／分の流速で３分間注入し、その後に、泳動緩衝液中で５分の解離時間が続いた。各結合事象後、表面を、３０μＬ／分で１分間注入されたｐＨ１．５の１０ｍＭグリシン（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００３５４）で再生した。各測定は、それぞれ、参照及び特異性のために、０濃度試料並びに無関係なｓｃＦｖペリプラズム抽出物を含んだ。次いで、最良の結合プロファイルを示すｓｃＦｖクローンを、実施例１に記載されるようにＦａｂ断片に再フォーマットした。ヒトＩＬ－１ＲＡＰ及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対するＦａｂの親和性を、修正されたＦａｂ注入濃度範囲（０．０８ｎＭ～５０ｎＭ）を用いて、実施例１に記載されるように測定した。
ＳＰＲ分析を使用して、新しいｓｃＦｖクローンの特異的結合活性を確認し、それらの結合プロファイルに従って陽性クローンをランク付けした。測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．０を使用してＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、２５℃で行い、同じ製造業者からのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ３．１）を用いて分析した。自社で産生された組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号１）又は自社で産生された組換えカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号２）を、ｐＨ４．５の酢酸緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号奨ＢＲ－１００３－５０）中で２００ｎＭの最終濃度に希釈し、その後、製造業者の推奨に従ってアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００５０）を使用して、それぞれ、Ｆｃ２及びＦｃ４上で、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００５３０）上で約１０００共鳴単位（ＲＵと略称される）のレベルまで固定化した。ＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲＩ００６６９）を泳動緩衝液として使用した。濾過したペリプラズム抽出物を、共有結合したヒトＩＬ－１ＲＡＰ及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ ＣＭ５センサーチップ上に直接注入した。試料を、流路１、２、３及び４（流路１及び３が基準として使用される）上に３０μＬ／分の流速で３分間注入し、その後に、泳動緩衝液中で５分の解離時間が続いた。各結合事象後、表面を、３０μＬ／分で１分間注入されたｐＨ１．５の１０ｍＭグリシン（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００３５４）で再生した。各測定は、それぞれ、参照及び特異性のために、０濃度試料並びに無関係なｓｃＦｖペリプラズム抽出物を含んだ。次いで、最良の結合プロファイルを示すｓｃＦｖクローンを、実施例１に記載されるようにＦａｂ断片に再フォーマットした。ヒトＩＬ－１ＲＡＰ及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対するＦａｂの親和性を、修正されたＦａｂ注入濃度範囲（０．０８ｎＭ～５０ｎＭ）を用いて、実施例１に記載されるように測定した。
【0211】
ヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡ発現
ＣＤＲ組換え後にヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対する最も高い親和性を示す抗ＩＬ－１ＲＡＰクローンを、実施例１に記載されるようにヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡフォーマットで発現させた。クローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ（配列番号５４）のＣＤＲＨ３（Ｋａｂａｔ）中の既知の潜在的異性化部位（ＤＳ）を除去するために、Ｄ１００及びＳ１００ａ（Ｋａｂａｔ）残基を、それぞれ、ＡＡ、ＡＳ、ＤＡ、ＥＳ又はＥＴによって、５つの追加のＩｇＧ１ ＬＡＬＡ重鎖（配列番号５５～５９）内に置き換えた。実施例１に記載されるように、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＡＡ、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＡＳ、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＤＡ、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＥＳ、及び抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＥＴの異なる抗体可変重鎖をコードするｃＤＮＡを、標準的な分子技法を使用した部位特異的変異誘発によって構築し、ヒトＩｇＧ１鎖のＣＨ１、ＣＨ２（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）、及びＣＨ３ドメインをコードするｃＤＮＡの上流の修飾ｐｃＤＮＡ ３．１ベクターにおいてクローニングした。ヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡ分子を発現させ、実施例１に記載されるように、又は以下のように精製した。抗ＩＬ１－ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＥＳ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（配列番号７１及び７２）の発現のために、等量の各操作された鎖ベクター及びエプスタイン－バーウイルス（Epstein-Barr Virus、ＥＢＶ）核抗原－１（nuclear antigen-1、ＥＢＮＡ－１）をコードするベクターが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＣＨＯ－Ｓ細胞（ｃＧＭＰバンク保存、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１１３６４０１）に同時トランスフェクトされた。典型的には、細胞を、ＣＤ－ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ）中８００万細胞／ｍＬで調製した。次いで、細胞にＤＮＡ－ＰＥＩ混合物を３７℃でトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、細胞培養物を、４ｍＭのＬ－グルタミンを補充したＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標）２（Ｌｏｎｚａ）で１：１に希釈し、３２℃、５％Ｃ０２、及び８０％湿度で軌道振盪しながら１４日間インキュベートした。組換えタンパク質を含有する清澄化した無細胞培養上清を、遠心分離、続いて濾過によって調製し、更なる精製に使用した。室温でＫＡＮＥＫＡ ＫａｎＣａｐＡ（商標）樹脂（Ｋａｎｅｋａ）を使用する重力流モードによって、抗体を精製した。ＫＡＮＥＫＡ ＫａｎＣａｐＡ（商標）ビーズを清澄化した上清に添加し、穏やかに撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。次に、混合物を、重力流精製のためにＰｏｌｙ－Ｐｒｅｐカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上に装填した。ビーズを最初にｐＨ７．４の１Ｘ ＰＢＳ（１×１０ＣＶ）で洗浄し、タンパク質を以下に記載されるように溶出した。抗ＩＬ１－ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＥＳ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（配列番号７１及び７２）について、ｐＨ４．３、ｐＨ４．１、ｐＨ３．９、及びｐＨ３．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウムを連続的に使用した段階溶出プロトコルを使用して、タンパク質を溶出した。回収した画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分析し、見かけの純度に基づいて選択した。次いで、目的の画分をプールし、４℃でｐＨ７．４の１Ｘ ＰＢＳに対して透析した。精製された抗体を、０．２μｍフィルター上の滅菌濾過後に－８０℃で保存した。それらを、還元及び非還元条件下で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ４～１２％アクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及びＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＡ ８００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓ．Ａ．，Ｎｙｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上のｃＧＥによって更に分析して、純度を評価した。単量体及び凝集形態の含量を決定するために、ＳＥ－ＨＰＬＣによってタンパク質を分析した。簡潔に説明すると、Ｗａｔｅｒｓ ２９９８ ＰＤＡ検出器（Ｗａｔｅｒｓ）を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ ＨＰＬＣシステム上で、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＬ／分の流速での溶離液としてｐＨ６．８の０．１５Ｍ塩化ナトリウムとともに、室温でＴｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＴＳＲｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（カタログ番号０８５４１、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ＳＥ－ＨＰＬＣを実施し、２１４ｎｍ及び２８０ｎｍで監視した。カブトガニ血球抽出物（Limulus amebocyte lysate、ＬＡＬ）ベースのアッセイを利用したＣｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒからのＭｕｌｔｉ－Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｎｄｏｓａｆｅ－ＭＣＳを使用して、０．５ＥＵ／ｍｇを下回る細菌内毒素レベルを確認した。典型的には、精製された抗体について、凝集形態の含量は。５％よりも低く、ＳＥ－ＨＰＬＣによって測定された純度は、９５％を上回った。
ＣＤＲ組換え後にヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対する最も高い親和性を示す抗ＩＬ－１ＲＡＰクローンを、実施例１に記載されるようにヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡフォーマットで発現させた。クローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ（配列番号５４）のＣＤＲＨ３（Ｋａｂａｔ）中の既知の潜在的異性化部位（ＤＳ）を除去するために、Ｄ１００及びＳ１００ａ（Ｋａｂａｔ）残基を、それぞれ、ＡＡ、ＡＳ、ＤＡ、ＥＳ又はＥＴによって、５つの追加のＩｇＧ１ ＬＡＬＡ重鎖（配列番号５５～５９）内に置き換えた。実施例１に記載されるように、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＡＡ、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＡＳ、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＤＡ、抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＥＳ、及び抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＥＴの異なる抗体可変重鎖をコードするｃＤＮＡを、標準的な分子技法を使用した部位特異的変異誘発によって構築し、ヒトＩｇＧ１鎖のＣＨ１、ＣＨ２（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）、及びＣＨ３ドメインをコードするｃＤＮＡの上流の修飾ｐｃＤＮＡ ３．１ベクターにおいてクローニングした。ヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡ分子を発現させ、実施例１に記載されるように、又は以下のように精製した。抗ＩＬ１－ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＥＳ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（配列番号７１及び７２）の発現のために、等量の各操作された鎖ベクター及びエプスタイン－バーウイルス（Epstein-Barr Virus、ＥＢＶ）核抗原－１（nuclear antigen-1、ＥＢＮＡ－１）をコードするベクターが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＣＨＯ－Ｓ細胞（ｃＧＭＰバンク保存、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１１３６４０１）に同時トランスフェクトされた。典型的には、細胞を、ＣＤ－ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ）中８００万細胞／ｍＬで調製した。次いで、細胞にＤＮＡ－ＰＥＩ混合物を３７℃でトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、細胞培養物を、４ｍＭのＬ－グルタミンを補充したＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標）２（Ｌｏｎｚａ）で１：１に希釈し、３２℃、５％Ｃ０２、及び８０％湿度で軌道振盪しながら１４日間インキュベートした。組換えタンパク質を含有する清澄化した無細胞培養上清を、遠心分離、続いて濾過によって調製し、更なる精製に使用した。室温でＫＡＮＥＫＡ ＫａｎＣａｐＡ（商標）樹脂（Ｋａｎｅｋａ）を使用する重力流モードによって、抗体を精製した。ＫＡＮＥＫＡ ＫａｎＣａｐＡ（商標）ビーズを清澄化した上清に添加し、穏やかに撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。次に、混合物を、重力流精製のためにＰｏｌｙ－Ｐｒｅｐカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上に装填した。ビーズを最初にｐＨ７．４の１Ｘ ＰＢＳ（１×１０ＣＶ）で洗浄し、タンパク質を以下に記載されるように溶出した。抗ＩＬ１－ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＥＳ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（配列番号７１及び７２）について、ｐＨ４．３、ｐＨ４．１、ｐＨ３．９、及びｐＨ３．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウムを連続的に使用した段階溶出プロトコルを使用して、タンパク質を溶出した。回収した画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分析し、見かけの純度に基づいて選択した。次いで、目的の画分をプールし、４℃でｐＨ７．４の１Ｘ ＰＢＳに対して透析した。精製された抗体を、０．２μｍフィルター上の滅菌濾過後に－８０℃で保存した。それらを、還元及び非還元条件下で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ４～１２％アクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及びＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＡ ８００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓ．Ａ．，Ｎｙｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上のｃＧＥによって更に分析して、純度を評価した。単量体及び凝集形態の含量を決定するために、ＳＥ－ＨＰＬＣによってタンパク質を分析した。簡潔に説明すると、Ｗａｔｅｒｓ ２９９８ ＰＤＡ検出器（Ｗａｔｅｒｓ）を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ ＨＰＬＣシステム上で、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＬ／分の流速での溶離液としてｐＨ６．８の０．１５Ｍ塩化ナトリウムとともに、室温でＴｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＴＳＲｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（カタログ番号０８５４１、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ＳＥ－ＨＰＬＣを実施し、２１４ｎｍ及び２８０ｎｍで監視した。カブトガニ血球抽出物（Limulus amebocyte lysate、ＬＡＬ）ベースのアッセイを利用したＣｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒからのＭｕｌｔｉ－Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｎｄｏｓａｆｅ－ＭＣＳを使用して、０．５ＥＵ／ｍｇを下回る細菌内毒素レベルを確認した。典型的には、精製された抗体について、凝集形態の含量は。５％よりも低く、ＳＥ－ＨＰＬＣによって測定された純度は、９５％を上回った。
【0212】
ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対するヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡ結合親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対するヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡ分子の結合親和性を測定した。親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で２５℃で測定し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ３．１）を用いて分析した。市販のアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００５０）を使用して、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）と結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００５３０）上で、測定を実施した。自社で産生された組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号１）及び自社で産生された組換えカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号２）を用いて、ＳＰＲ測定を実施した。抗ＩＬ－１ＲＡＰ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ分子を固定化し、分析物としてＩＬ－１ＲＡＰタンパク質を使用することによって、ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対する親和性を評価した。約１５０ＲＵのヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡを、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃと結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップのｆｃ２上に捕捉した。組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質又は組換えカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質を、ｆｃ１及びｆｃ２（ｆｃ１が基準として使用される）上で３０μＬ／分の流速で３分間、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００６６９）中で０．１４～１００ｎＭに及ぶ異なる濃度において複数サイクル動態で注入した。解離を１２分間監視した。各サイクル後、表面を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉キット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）とともに提供された６０μＬの再生溶液で再生した。１：１ラングミュア動態適合モデルを使用して、実験データを処理した。測定は、参照用の０濃度試料を含んだ。Ｃｈｉ２、Ｕ、及び残余値を使用して、実験データと個々の結合モデルとの間の適合の質を評価した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対するヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡ分子の結合親和性を測定した。親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で２５℃で測定し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ３．１）を用いて分析した。市販のアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００５０）を使用して、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）と結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００５３０）上で、測定を実施した。自社で産生された組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号１）及び自社で産生された組換えカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号２）を用いて、ＳＰＲ測定を実施した。抗ＩＬ－１ＲＡＰ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ分子を固定化し、分析物としてＩＬ－１ＲＡＰタンパク質を使用することによって、ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対する親和性を評価した。約１５０ＲＵのヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡを、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃと結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップのｆｃ２上に捕捉した。組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質又は組換えカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質を、ｆｃ１及びｆｃ２（ｆｃ１が基準として使用される）上で３０μＬ／分の流速で３分間、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００６６９）中で０．１４～１００ｎＭに及ぶ異なる濃度において複数サイクル動態で注入した。解離を１２分間監視した。各サイクル後、表面を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉キット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）とともに提供された６０μＬの再生溶液で再生した。１：１ラングミュア動態適合モデルを使用して、実験データを処理した。測定は、参照用の０濃度試料を含んだ。Ｃｈｉ２、Ｕ、及び残余値を使用して、実験データと個々の結合モデルとの間の適合の質を評価した。
【0213】
結果：
抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８クローン（重鎖配列番号１４）の親和性成熟は、５つの個々のライブラリーにおけるＣＤＲ－Ｈ１（Ｋａｂａｔ位置２７～３５）、ＣＤＲ－Ｈ２（Ｋａｂａｔ位置５０～５８）、及びＣＤＲ－Ｈ３（Ｋａｂａｔ位置９５～１０１マイナス２）の多様化を伴った。ＳＰＲによって測定される親抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８クローンより遅いオフレートを有するｓｃＦｖクローンを単離した。ｓｃＦｖクローンを再フォーマットし、Ｆａｂ断片として発現させ、ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対する親和性を実施例１に記載されるように測定した。この評価から、ＣＤＲ－Ｈ１及びＣＤＲ－Ｈ２ライブラリーに由来する選択された変異を、更なるオフレート改善のために組み合わせた。Ｆａｂクローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣと称される１つのクローンは、ヒトＩＬ－１ＲＡＰに対する最も高い親和性を有していた。前述のクローンの重鎖配列識別番号及びヒトＩＬ－１ＲＡＰに対する結合親和性を表２に報告する。
抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８クローン（重鎖配列番号１４）の親和性成熟は、５つの個々のライブラリーにおけるＣＤＲ－Ｈ１（Ｋａｂａｔ位置２７～３５）、ＣＤＲ－Ｈ２（Ｋａｂａｔ位置５０～５８）、及びＣＤＲ－Ｈ３（Ｋａｂａｔ位置９５～１０１マイナス２）の多様化を伴った。ＳＰＲによって測定される親抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８クローンより遅いオフレートを有するｓｃＦｖクローンを単離した。ｓｃＦｖクローンを再フォーマットし、Ｆａｂ断片として発現させ、ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対する親和性を実施例１に記載されるように測定した。この評価から、ＣＤＲ－Ｈ１及びＣＤＲ－Ｈ２ライブラリーに由来する選択された変異を、更なるオフレート改善のために組み合わせた。Ｆａｂクローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣと称される１つのクローンは、ヒトＩＬ－１ＲＡＰに対する最も高い親和性を有していた。前述のクローンの重鎖配列識別番号及びヒトＩＬ－１ＲＡＰに対する結合親和性を表２に報告する。
【0214】
【表2】
【0215】
クローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣの一連の５つの変異バージョンを、ヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡ骨格において発現させて、ＣＤＲＨ３（Ｋａｂａｔ）内の潜在的異性化部位（ＤＳ）の除去を評価した。クローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＥＳは、親クローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣと同様のヒトＩＬ－１ＲＡＰ及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対する親和性を示し、更に特性評価された。重鎖配列識別番号、並びに記述されたクローンのヒトＩＬ－１ ＲＡＰ及びカニクイザルＩＬ－１ ＲＡＰに対する少なくとも２つの独立した実験（適用可能である場合）から計算された平均結合速度定数及び標準偏差を表３ａに報告する。前述のクローンのＣＤＲ配列を表３ｂに提供する。ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対する抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＥＳ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡのＳＰＲ結合センサーグラムの代表例が、図４に示されている。
【0216】
【表3】
【0217】
【表4-1】
【0218】
【表4-2】
【0219】
【表4-3】
【0220】
実施例３：抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３クローンの最適化
組換え標的抗原
組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ（Ｓ２１－Ｅ３５９）－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号１）（以後、組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質と称する）を、実施例１に記載したように自社で産生した。
組換え標的抗原
組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ＥＣＤ（Ｓ２１－Ｅ３５９）－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（配列番号１）（以後、組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質と称する）を、実施例１に記載したように自社で産生した。
【0221】
ライブラリー生成及び選択
抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３クローンの親和性成熟を、以下の修正を加えて実施例２に記載したように行った。精製したファージ粒子（１０１２プラーク形成単位）及び磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＧビーズ（Ｎｏｖｅｘ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、３％ＭＰＢＳを用いて室温で１時間ブロックした。２００ｎＭのヒトＩｇＧ１を、ブロッキングしたプロテインＧビーズ上に室温で３０分間捕捉した。次に、ブロックしたファージをＩｇＧ１被覆ビーズに対して室温で１時間選択解除した。次いで、選択解除したファージを、それぞれ、１回目、２回目、及び３回目について、１ｎＭ、０．５ｎＭ、及び０．１ｎＭのマウスＩＬ－１ＲＡＰ－Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号５２６５７－Ｍ０２Ｈ）とインキュベートした。１時間のインキュベーション後、自社で産生した１ｐＭの組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（非ビオチン化、配列番号１）を、２回目及び３回目の間に室温で３時間添加した。抗原結合ファージを、プロテインＧビーズ上に室温で３０分間捕捉し、ビーズをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．１％で５回、ＰＢＳで２回洗浄した。
抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３クローンの親和性成熟を、以下の修正を加えて実施例２に記載したように行った。精製したファージ粒子（１０１２プラーク形成単位）及び磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＧビーズ（Ｎｏｖｅｘ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、３％ＭＰＢＳを用いて室温で１時間ブロックした。２００ｎＭのヒトＩｇＧ１を、ブロッキングしたプロテインＧビーズ上に室温で３０分間捕捉した。次に、ブロックしたファージをＩｇＧ１被覆ビーズに対して室温で１時間選択解除した。次いで、選択解除したファージを、それぞれ、１回目、２回目、及び３回目について、１ｎＭ、０．５ｎＭ、及び０．１ｎＭのマウスＩＬ－１ＲＡＰ－Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号５２６５７－Ｍ０２Ｈ）とインキュベートした。１時間のインキュベーション後、自社で産生した１ｐＭの組換えヒトＩＬ－１ＲＡＰ－ａｖｉ－ｈｉｓタンパク質（非ビオチン化、配列番号１）を、２回目及び３回目の間に室温で３時間添加した。抗原結合ファージを、プロテインＧビーズ上に室温で３０分間捕捉し、ビーズをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．１％で５回、ＰＢＳで２回洗浄した。
【0222】
ＳＰＲによる親和性スクリーニング
ＳＰＲ分析を使用して、新しいｓｃＦｖクローンの特異的結合活性を確認し、それらの結合プロファイルに従って陽性クローンをランク付けした。測定を、以下の修正を加えて実施例２に記載されるように行った。組換えマウスＩＬ－１ＲＡＰ－Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号５２６５７－Ｍ０２Ｈ）を、酢酸緩衝液ｐＨ４．５（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００３５０）中で２００ｎＭの最終濃度に希釈し、その後、製造業者の推奨に従ってアミンカップリングキットを使用して、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００５３０）上で、ｆｃ２上に約１５００ＲＵのレベルまで固定化した。濾過したペリプラズム抽出物を、流路１及び流路２（流路１を参照として使用する）上の共有結合したマウスＩＬ－１ＲＡＰ ＣＭ５センサーチップ上に直接注入した。最良の結合プロファイルを示すｓｃＦｖクローンを、実施例１に記載されるようにＦａｂ断片に再フォーマットした。
ＳＰＲ分析を使用して、新しいｓｃＦｖクローンの特異的結合活性を確認し、それらの結合プロファイルに従って陽性クローンをランク付けした。測定を、以下の修正を加えて実施例２に記載されるように行った。組換えマウスＩＬ－１ＲＡＰ－Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号５２６５７－Ｍ０２Ｈ）を、酢酸緩衝液ｐＨ４．５（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００３５０）中で２００ｎＭの最終濃度に希釈し、その後、製造業者の推奨に従ってアミンカップリングキットを使用して、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００５３０）上で、ｆｃ２上に約１５００ＲＵのレベルまで固定化した。濾過したペリプラズム抽出物を、流路１及び流路２（流路１を参照として使用する）上の共有結合したマウスＩＬ－１ＲＡＰ ＣＭ５センサーチップ上に直接注入した。最良の結合プロファイルを示すｓｃＦｖクローンを、実施例１に記載されるようにＦａｂ断片に再フォーマットした。
【0223】
マウスＩＬ－１ＲＡＰに対するＦａｂ断片の親和性を、以下の修正を加えて実施例１に記載されるように測定した。測定を、市販のアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００５０）を使用して、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）と結合したシリーズＳ ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００５３０）上で行った。ＳＰＲ測定を、市販の組換えマウスＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号５２６５７－Ｍ０２Ｈ）を用いて行った。マウスＩＬ－１ＲＡＰに対する親和性を、マウスＩＬ－１ＲＡＰ－Ｆｃを固定化し、かつ分析物としてＦａｂ断片を使用することによって評価した。約６０ＲＵのマウスＩＬ－１ＲＡＰ Ｆｃ融合タンパク質を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃと結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップのｆｃ２上に捕捉した。Ｆａｂ断片を、ｆｃ１及びｆｃ２（ｆｃ１が基準として使用される）上で３０μＬ／分の流速で３分間、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００６６９）中で０．０４～５ｎＭに及ぶ異なる濃度において単一サイクル動態で注入した。解離を１０分間監視した。
【0224】
マウスＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ発現
抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３－Ａ３－ｍｍＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡ（配列番号７３及び７４）の発現のために、等量の各操作された鎖ベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、懸濁適合ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ－ＬＧＬ標準、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ、カタログ番号：ＣＲＬ－１０８５２）に同時トランスフェクトした。典型的には、細胞を、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｂｉｏｗｅｓｔ）中、８００万細胞／ｍＬで調製した。次いで、細胞にＤＮＡ－ＰＥＩ混合物を３７℃でトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、細胞培養物を、フェノールレッド又はＢａｌａｎＣＤ ＨＥＫ２９３（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び４ ｍＭのＬ－グルタミンを補充したＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）２９３中で１：１に希釈し、３７℃、５％Ｃ０２、及び８０％湿度で軌道振盪しながら５日間インキュベートした。組換えタンパク質を含有する無細胞培養上清を、遠心分離、続いて濾過によって調製し、更なる精製に使用した。抗体を、以下の修正を加えて実施例２に抗ＩＬｌ－ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＥＳ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡについて記載したように精製した。抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３－Ａ３－ｍｍＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡ（配列番号７３及び７４）の場合、タンパク質を酸性緩衝液（典型的にはグリシン０．１Ｍ ｐＨ３．５）で溶出した。回収した画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分析し、見かけの純度に基づいて選択した。次いで、目的の画分をプールし、４℃でｐＨ７．４の１Ｘ ＰＢＳに対して透析した。精製した抗体を０．２μｍフィルター上で滅菌濾過した後に－８０℃で保存し、実施例２に抗ＩＬ１－ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＥＳ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡについて記載したように更に分析した。
抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３－Ａ３－ｍｍＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡ（配列番号７３及び７４）の発現のために、等量の各操作された鎖ベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、懸濁適合ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ－ＬＧＬ標準、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ、カタログ番号：ＣＲＬ－１０８５２）に同時トランスフェクトした。典型的には、細胞を、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｂｉｏｗｅｓｔ）中、８００万細胞／ｍＬで調製した。次いで、細胞にＤＮＡ－ＰＥＩ混合物を３７℃でトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、細胞培養物を、フェノールレッド又はＢａｌａｎＣＤ ＨＥＫ２９３（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び４ ｍＭのＬ－グルタミンを補充したＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）２９３中で１：１に希釈し、３７℃、５％Ｃ０２、及び８０％湿度で軌道振盪しながら５日間インキュベートした。組換えタンパク質を含有する無細胞培養上清を、遠心分離、続いて濾過によって調製し、更なる精製に使用した。抗体を、以下の修正を加えて実施例２に抗ＩＬｌ－ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＥＳ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡについて記載したように精製した。抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３－Ａ３－ｍｍＩｇＧ２ａ－ＬＡＬＡ（配列番号７３及び７４）の場合、タンパク質を酸性緩衝液（典型的にはグリシン０．１Ｍ ｐＨ３．５）で溶出した。回収した画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分析し、見かけの純度に基づいて選択した。次いで、目的の画分をプールし、４℃でｐＨ７．４の１Ｘ ＰＢＳに対して透析した。精製した抗体を０．２μｍフィルター上で滅菌濾過した後に－８０℃で保存し、実施例２に抗ＩＬ１－ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣ－ＥＳ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡについて記載したように更に分析した。
【0225】
マウスＩＬ－１ＲＡＰに対するマウスＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ結合親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、マウスＩＬ－１ＲＡＰに対するマウスＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ分子の結合親和性を測定した。親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて２５℃で測定し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ３．１）で分析した。測定を、市販のアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００５０）を使用して、抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３８）と結合したシリーズＳ ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００５３０）上で行った。ＳＰＲ測定を、市販の組換えマウスＩＬ－１ＲＡＰ－ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号５２６５７－Ｍ０８Ｈ）を用いて行った。マウスＩＬ－１ＲＡＰに対する親和性を、抗マウスＩＬ－１ＲＡＰマウスＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ分子を固定化し、かつ分析物としてマウスＩＬ－１ＲＡＰタンパク質を使用することによって評価した。約１５０ＲＵのマウスＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡを、抗マウスＩｇＧ Ｆｃと結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップのｆｃ２上に捕捉した。マウスＩＬ－１ＲＡＰ－ｈｉｓを、ｆｃ１及びｆｃ２（ｆｃ１が基準として使用される）上で３０μＬ／分の流速で３分間、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲＩ００６６９）中で０．１４～１００ｎＭに及ぶ異なる濃度において単一サイクル動態で注入した。解離を１５分間監視した。各サイクル後、表面を、抗マウスＩｇＧ Ｆｃ捕捉キット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３８）とともに提供された６０μＬの再生溶液で再生した。１：１ラングミュア動態適合モデルを使用して、実験データを処理した。測定は、参照用の０濃度試料を含んだ。Ｃｈｉ２、Ｕ、及び残余値を使用して、実験データと個々の結合モデルとの間の適合の質を評価した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、マウスＩＬ－１ＲＡＰに対するマウスＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ分子の結合親和性を測定した。親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて２５℃で測定し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ３．１）で分析した。測定を、市販のアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１０００５０）を使用して、抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３８）と結合したシリーズＳ ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００５３０）上で行った。ＳＰＲ測定を、市販の組換えマウスＩＬ－１ＲＡＰ－ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号５２６５７－Ｍ０８Ｈ）を用いて行った。マウスＩＬ－１ＲＡＰに対する親和性を、抗マウスＩＬ－１ＲＡＰマウスＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ分子を固定化し、かつ分析物としてマウスＩＬ－１ＲＡＰタンパク質を使用することによって評価した。約１５０ＲＵのマウスＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡを、抗マウスＩｇＧ Ｆｃと結合したＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップのｆｃ２上に捕捉した。マウスＩＬ－１ＲＡＰ－ｈｉｓを、ｆｃ１及びｆｃ２（ｆｃ１が基準として使用される）上で３０μＬ／分の流速で３分間、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲＩ００６６９）中で０．１４～１００ｎＭに及ぶ異なる濃度において単一サイクル動態で注入した。解離を１５分間監視した。各サイクル後、表面を、抗マウスＩｇＧ Ｆｃ捕捉キット（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３８）とともに提供された６０μＬの再生溶液で再生した。１：１ラングミュア動態適合モデルを使用して、実験データを処理した。測定は、参照用の０濃度試料を含んだ。Ｃｈｉ２、Ｕ、及び残余値を使用して、実験データと個々の結合モデルとの間の適合の質を評価した。
【0226】
結果：
抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３クローン（配列番号１２）の親和性成熟は、５つの個々のライブラリーにおけるＣＤＲ－Ｈ１（Ｋａｂａｔ位置２７～－３５）、ＣＤＲ－Ｈ２（Ｋａｂａｔ位置５０～５３及び５５～５８）、及びＣＤＲ－Ｈ３（Ｋａｂａｔ位置９５～１０１マイナス２）の多様化を伴った。ＳＰＲによって測定される親抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３クローンより遅いオフレートを有するｓｃＦｖクローンを単離した。選択したｓｃＦｖクローンを再フォーマットし、Ｆａｂ断片として発現させ、ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対する親和性を実施例１に記載されるように測定した。Ｆａｂクローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３－Ａ３と称される１つのクローンは、マウスＩＬ－１ＲＡＰに対して最も高い親和性を有していた。前述のクローンの重鎖配列識別番号及び結合親和性を表４に報告する。
抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３クローン（配列番号１２）の親和性成熟は、５つの個々のライブラリーにおけるＣＤＲ－Ｈ１（Ｋａｂａｔ位置２７～－３５）、ＣＤＲ－Ｈ２（Ｋａｂａｔ位置５０～５３及び５５～５８）、及びＣＤＲ－Ｈ３（Ｋａｂａｔ位置９５～１０１マイナス２）の多様化を伴った。ＳＰＲによって測定される親抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３クローンより遅いオフレートを有するｓｃＦｖクローンを単離した。選択したｓｃＦｖクローンを再フォーマットし、Ｆａｂ断片として発現させ、ヒト及びカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対する親和性を実施例１に記載されるように測定した。Ｆａｂクローン抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３－Ａ３と称される１つのクローンは、マウスＩＬ－１ＲＡＰに対して最も高い親和性を有していた。前述のクローンの重鎖配列識別番号及び結合親和性を表４に報告する。
【0227】
【表5】
【0228】
抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３－Ａ３を、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ候補の潜在的なマウス代理として選択し、マウスにおけるヒトＩｇＧ１ ＬＡＬＡアイソタイプと同等のマウスＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ骨格において発現させた。配列識別番号、並びに前述のクローンのヒトＩＬ－１ＲＡＰ又はマウスＩＬ－１ＲＡＰに対する少なくとも２つの独立した実験から計算された平均結合速度定数及び標準偏差を表５に報告する。抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３－Ａ３クローンは、ＳＰＲによってカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰへの検出可能な結合を示さなかった（データ示さず）。配列識別番号、並びに前述のクローンのマウスＩＬ－１ＲＡＰに対する３つの独立した実験から計算された平均結合速度定数及び標準偏差を表５に報告する。マウスＩＬ－１ＲＡＰに対する抗ＩＬ－１ＲＡＰ－Ｃ３－Ａ３ ｍｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡのＳＰＲ結合センサーグラムの１つの代表的な例を図５に示す。
【0229】
【表6】
【0230】
実施例４：抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ候補１のインビトロ生物学的特徴付け
４．１抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ候補１は、ヒトＩＬ－１ＲＡＰに特異的に結合する
膜結合型ヒトＩＬ－１ＲＡＰ上の抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（本明細書で抗ＩＬ１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣと称され、重鎖ＣＤＲ配列番号１２８、１８８、及び２４８、並びに軽鎖配列配列番号７１を含む）の結合を、ＨａＣａＴケラチノサイト細胞株（ＡｄｄｅｘＢｉｏ、Ｔ００２０００１）などの複数のヒト細胞株及びヒト細胞型のみならず、ヒト初代細胞（ヒト好中球及び線維芽細胞）も使用してフローサイトメトリーによって評価した。
４．１抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ候補１は、ヒトＩＬ－１ＲＡＰに特異的に結合する
膜結合型ヒトＩＬ－１ＲＡＰ上の抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（本明細書で抗ＩＬ１ＲＡＰ－Ｃ８－ＲｅｃＣと称され、重鎖ＣＤＲ配列番号１２８、１８８、及び２４８、並びに軽鎖配列配列番号７１を含む）の結合を、ＨａＣａＴケラチノサイト細胞株（ＡｄｄｅｘＢｉｏ、Ｔ００２０００１）などの複数のヒト細胞株及びヒト細胞型のみならず、ヒト初代細胞（ヒト好中球及び線維芽細胞）も使用してフローサイトメトリーによって評価した。
【0231】
簡単に説明すると、細胞を採取し、計数し、９６ウェル丸底プレートに５０’０００細胞／ウェルでプレーティングした。プレートを３５０ｇで３分間遠心分離し、細胞を、様々な濃度（５０～０．００００３ｐｇ／ｍＬの範囲）の抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１抗体又はアイソタイプ対照＿５抗体のいずれかを含有する５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（１Ｘ）＋２．５％ＦＣＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．０５％ＮａＮ３）中に再懸濁した。染色した細胞を４℃で３０分間インキュベートし、３５０ｇで３分間、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で１／２００に希釈した１００μＬのモノクローナル抗ヒトＩｇＧ ＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０９３１６）中に再懸濁した。次いで、細胞を２回洗浄し、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ死細胞染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓ３４８６０）を含有する２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、試料をＣｙｔｏＦｌｅｘ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で取得した。細胞を、ＦＳＣ対ＳＳＣでサイズに基づいてゲートし、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７－幾何平均（幾何平均）蛍光強度について分析した。最後に、相対幾何平均蛍光強度を、アイソタイプ対照＿５の蛍光当たりの抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の蛍光を差し引くことによって計算した。図６に示すように、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１抗体は、ＨａＣａＴ細胞株及び全ての初代細胞上で発現した膜結合型ＩＬ－１ＲＡＰを認識する。複数の独立した実験を、複数のドナーを用いて行った。会合ＫＤ値を表６に要約する。
【0232】
【表7】
【0233】
表６は、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ候補１（●）又はアイソタイプ対照＿３（■）（図６）を様々な細胞株及び細胞型とインキュベートしたフローサイトメトリー実験から決定したＫＤ値を示す。ＫＤ値を非線形シグモイド回帰から抽出した。十分な適合度（Ｒ２＞０．７）を示す曲線を要約表に含めた。
【0234】
抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１のＩＬ－１ＲＡＰへの選択的結合を更に実証するために、同じ手順を、以前に生成され、かつ内部で特徴付けられたＩＬ－１ＲＡＰ遺伝子をノックアウトしたＨａＣａＴ細胞株に行った。実験を上記と同じプロトコルに従って行った。図６からの結果は、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１抗体がＨａＣａＴ ＩＬ－１ＲＡＰノックアウト細胞株に結合しないため、膜結合型ＩＬ－１ＲＡＰに選択的に結合することを示す。
【0235】
４．２抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ候補１は、初代サル細胞上のカニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに結合する
カニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対する抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の交差反応性を評価するために、サル線維芽細胞を使用して上記と同じ手順を行った。このアッセイでは、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ候補１は、カニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ発現線維芽細胞に結合する（図６）。試験した細胞型のＫＤ値を表６に要約する。
カニクイザルＩＬ－１ＲＡＰに対する抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の交差反応性を評価するために、サル線維芽細胞を使用して上記と同じ手順を行った。このアッセイでは、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ候補１は、カニクイザルＩＬ－１ＲＡＰ発現線維芽細胞に結合する（図６）。試験した細胞型のＫＤ値を表６に要約する。
【0236】
４．３抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ候補１は、ＨａＣａＴ刺激アッセイにおいてＩＬ－１誘導性サイトカイン放出及びＩＬ－３６誘導性サイトカイン放出の両方を阻害する
抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１がＩＬ－１経路、ＩＬ－３３経路、及びＩＬ－３６経路を阻害する可能性を評価するために、異なる細胞系を使用していくつかのアッセイを開発した。ケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴが、ＩＬ－６及びＩＬ－８（ＣＸＣＬ８）などの下流メディエーターの産生によって測定されるように、ＩＬ－１サイトカイン及びＩＬ－３６サイトカインに対して感受性であるが、ＩＬ－３３サイトカインに対して感受性ではないため、この特定の細胞株を使用して、ＩＬ－１経路及びＩＬ－３６経路の阻害を試験した。
抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１がＩＬ－１経路、ＩＬ－３３経路、及びＩＬ－３６経路を阻害する可能性を評価するために、異なる細胞系を使用していくつかのアッセイを開発した。ケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴが、ＩＬ－６及びＩＬ－８（ＣＸＣＬ８）などの下流メディエーターの産生によって測定されるように、ＩＬ－１サイトカイン及びＩＬ－３６サイトカインに対して感受性であるが、ＩＬ－３３サイトカインに対して感受性ではないため、この特定の細胞株を使用して、ＩＬ－１経路及びＩＬ－３６経路の阻害を試験した。
【0237】
簡潔に説明すると、ＨａＣａＴ細胞を採取し、計数し、完全ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％グルタミン＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｐ＋１％ＮＥＡＡ＋１％ＮａＰｙｒ）中に０．０５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。１００μＬの細胞を９６ウェル平底プレートに分配し、３７℃、５％ＣＯ２で１６時間インキュベートした。翌日、細胞を、アッセイ培地（完全ＤＭＥＭ培地）中で連続希釈した５０μＬの抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（５０～０．０００００５ｐｇ／ｍＬの範囲）又はアイソタイプ対照＿５（５０ｐｇ／ｍＬの固有用量）のいずれかと３０分間インキュベートした。インキュベーションの最後に、５０μＬのヒトＩＬ－１β又はＩＬ－３６Γ（いずれもＰｅｐｒｏｔｅｃｈ製）を適切なウェルに供給した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、１００μＬの上清を９６ウェル丸底プレートに移し、サイトカイン／ケモカインの定量化まで－８０℃の冷凍庫に保存した。培養上清中のＩＬ－６及びＩＬ－８産生を、ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＰＸ０１Ａ－１０２１３－９０１及びＥＰＸ０１Ａ－１０２０４－９０１）を製造業者の指示に従って使用してＬｕｍｉｎｅｘで測定した。
【0238】
図７に示すように、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ＨａＣａＴ細胞のＩＬ－１β又はＩＬ－３６γ刺激時にＩＬ－６サイトカイン及びＩＬ－８ケモカインの両方の放出を阻害する。この効果は、両方の経路に用量依存的であり、ＩＬ－３６／ＩＬ－３６Ｒ／ＩＬ－１ＲＡＰ三量体複合体形成をもたらす相互作用が、ＩＬ－ｌ／ＩＬ－１Ｒ／ＩＬ－１ＲＡＰ複合体形成を調節する相互作用よりも弱いため、ＩＬ－３６γに対して更により強力である。組み入れ基準を確立し、全てのアッセイに適用して、阻害パーセンテージを決定するために十分な刺激ウィンドウ又は刺激指数（ＳＩ）を得た。刺激指数を以下の式で計算した。
【0239】
【数1】
－「サイトカインのみ」は、細胞を刺激物質（ＩＬ－１β又はＩＬ－３６γ）のみとインキュベートした条件である。
－「細胞のみ」は、細胞を培地とインキュベートした条件である。
【0240】
２つの独立した実験を行い、阻害のＥＣ５０値を表７に要約する。
【0241】
【表8】
【0242】
この表は、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又はアイソタイプ対照＿３（■）（図７）をＩＬ－１β又はＩＬ－３６γ刺激ＨａＣａＴとインキュベートした刺激アッセイから決定したＥＣ２０、ＥＣ５０、ＥＣ８０、及び最大阻害値を示す。ＥＣｘ値を非線形シグモイド回帰から抽出した。十分な刺激条件（刺激指数＞１．８）及び十分な適合度（Ｒ２＞０．７）を示す曲線を要約表に含めた。
【0243】
４．４抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ候補１は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）刺激アッセイにおいてＩＬ－３３誘導性サイトカイン放出を阻害する
ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を使用して、ＩＬ－１２共刺激アッセイにおけるＩＬ－３３経路の阻害を試験した。ＩＬ－１２のみ又はＩＬ－３３のみではｈＰＢＭＣからのＩＦＮ－ｇ産生を全く又は最小限にしか誘発しないが、ＩＬ－３３及びＩＬ－１２での併用処理により、ＩＦＮ－ｇの相乗的産生がもたらされたことが文献に報告されている（Ｓｍｉｔｈｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｏｃｈａｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を使用して、ＩＬ－１２共刺激アッセイにおけるＩＬ－３３経路の阻害を試験した。ＩＬ－１２のみ又はＩＬ－３３のみではｈＰＢＭＣからのＩＦＮ－ｇ産生を全く又は最小限にしか誘発しないが、ＩＬ－３３及びＩＬ－１２での併用処理により、ＩＦＮ－ｇの相乗的産生がもたらされたことが文献に報告されている（Ｓｍｉｔｈｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｏｃｈａｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
【0244】
簡単に説明すると、ｈＰＭＢＣを、ｆｉｃｏｌｌ密度勾配単離を使用してＬａ Ｃｈａｕｘ－ｄｅ－Ｆｏｎｄｓ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）輸血センターから得たハフィーコートから採取した。細胞を計数し、完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％グルタミン＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中に１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。１００μＬのｈＰＢＭＣを９６ウェル丸底プレートに分配した。細胞を５０μＬのヒトＩＬ－１２及びＩＬ－３３（いずれもＰｅｐｒｏｔｅｃｈ製）と１５分間インキュベートした。インキュベーションの最後に、アッセイ培地（完全ＲＰＭＩ培地）中で連続希釈した５０μＬのいずれかの抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（５０～０．０００００５μｇ／ｍＬの範囲）を適切なウェルに添加した。アイソタイプ対照＿５抗体を、５０μｇ／ｍＬの固有用量で試験した。３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした後、１００μＬの上清を９６ウェル丸底プレートに移し、サイトカインレベルの定量化まで－８０℃の冷凍庫に保存した。培養上清中のＩＦＮ－ｇ産生を、ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＰＸ０１Ａ－１０２２８－９０１）を製造業者の指示に従って使用してＬｕｍｉｎｅｘで測定した。ＩＬ－３３＋ＩＬ－１２の代わりにＩＬ－１β刺激を使用して同じ手順を行い、ＩＬ－８放出を引き起こした。
【0245】
図８（灰色の曲線、下の図）に示すように、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ＰＢＭＣのＩＬ－１２及びＩＬ－３３の同時刺激時にＩＦＮ－ｇサイトカインの放出を阻害する。この効果は用量依存的である。
【0246】
更に、ＩＬ－１ＲＡＰがおよそ３００ｎｇ／ｍＬに達する濃度を有する末梢血中の可溶性分子として検出することができたことが報告されている。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１が可溶性ＩＬ－１ＲＡＰの存在下でＩＬ－１／ＩＬ－３３経路を阻害することができるかを評価するために、可溶性ＩＬ－１ＲＡＰをＩＬ－１β又はＩＬ－１２＋ＩＬ－３３サイトカイン混合物に添加して、上記と同じ実験手順を行った。結果を図８に示し、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１が可溶性ＩＬ－１ＲＡＰと競合することができ、ヒトＰＢＭＣのＩＬ－１ｂ及びＩＬ－３３での刺激時にサイトカイン放出をブロックする能力を保持することができることを実証する。
【0247】
２つの独立した実験を、合計６人のドナーを使用して行った。阻害のＥＣ５０値を表８に要約する。
【0248】
【表9】
【0249】
表８は、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又はアイソタイプ対照＿３（■）（図８）をＩＬ－１β又はＩＬ－１２＋ＩＬ－３３刺激ＰＢＭＣとインキュベートした刺激アッセイから決定したＥＣ２０、ＥＣ５０、ＥＣ８０、及び最大阻害値を示す。ＥＣｘ値を非線形シグモイド回帰から抽出した。
【0250】
十分な刺激条件（刺激指数＞１．８）及び十分な適合度（Ｒ２＞０．７）を示す曲線を要約表に含めた。
【0251】
まとめると、これらのデータは、疾患関連ヒト細胞アッセイを使用して、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１が全ての個々の経路を効率的に阻害していることを強調する。
【0252】
４．５抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ候補１は、組み合わせサイトカイン刺激時に全血再刺激アッセイにおいてサイトカイン放出を阻害する
先のアッセイは、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１が個々の経路を阻害する能力を評価することを可能にしたが、全血アッセイを使用して、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１が、ＩＬ－１刺激経路、ＩＬ－３３刺激経路、及びＩＬ－３６刺激経路の組み合わせを阻害する能力を評価した。健常ドナー由来の新たに採取したヒト血液（クエン酸チューブ）を１５ｍＬのチューブに分配し、培地のみ（ＲＰＭＩ）、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１又はアイソタイプ対照＿５（飽和用量）のいずれかと３０分間プレインキュベートした後、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６Γの組み合わせで刺激して、最終体積０．６ｍＬにした。
先のアッセイは、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１が個々の経路を阻害する能力を評価することを可能にしたが、全血アッセイを使用して、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１が、ＩＬ－１刺激経路、ＩＬ－３３刺激経路、及びＩＬ－３６刺激経路の組み合わせを阻害する能力を評価した。健常ドナー由来の新たに採取したヒト血液（クエン酸チューブ）を１５ｍＬのチューブに分配し、培地のみ（ＲＰＭＩ）、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１又はアイソタイプ対照＿５（飽和用量）のいずれかと３０分間プレインキュベートした後、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６Γの組み合わせで刺激して、最終体積０．６ｍＬにした。
【0253】
３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、上清を回収した。培養上清中の様々なサイトカイン及びケモカインの産生を、複数のＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１プレックスキット）を製造業者の指示に従って使用してＬｕｍｉｎｅｘで測定した。統計分析を試験した２６人のドナーにわたって８つの個々の実験から行った。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１又はアイソタイプ対照＿５間の差を各ドナー及び各分析物内で計算して、全てのデータを対にし、次いで、平均検定（ｔ検定）を使用して分析した。この場合、Ｈ０又は帰無仮説は、「差の平均が０に等しい」である。ｔ検定のｐ値が０，０５未満である場合、Ｈ０は拒絶される、つまり、アイソタイプ対照＿５に対する統計的有意差を意味する。
【0254】
図９に示す結果は、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１が、アイソタイプ対照＿５と比較して、大部分のサイトカイン及びケモカインの放出を統計的に有意に阻害することを示す。
【0255】
４．６抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ候補１は、ＩＬ－１Ｂ及びＩＬ－３６Γでの刺激後にＨａＣａＴ馴化培地とインキュベートした際に好中球活性化を阻害する
ＩＬ－１サイトカインファミリーメンバーは、疾患病態生理学に関連する重要な炎症プロセスに関与する（Ｍｉｇｌｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０））。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ候補１の特性を更に特定するために、インビトロアッセイを行い、好中球と皮膚細胞との間の細胞クロストークを阻害するその潜在的能力を評価した。
ＩＬ－１サイトカインファミリーメンバーは、疾患病態生理学に関連する重要な炎症プロセスに関与する（Ｍｉｇｌｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０２０））。抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ候補１の特性を更に特定するために、インビトロアッセイを行い、好中球と皮膚細胞との間の細胞クロストークを阻害するその潜在的能力を評価した。
【0256】
好中球を、ＥａｓｙＳｅｐ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１９６６６）を製造業者の指示に従って使用して、健常ドナーから新たに採取したヒト血液（ＥＤＴＡチューブ）から単離した。
【0257】
単離した好中球の純度を、好中球に対する特異的マーカーとしてＣＤ１５を使用してフローサイトメトリーによって評価した。
【0258】
ＨａＣａＴ馴化培地を、ＨａＣａＴ細胞を培地、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１又はアイソタイプ対照＿５（飽和用量）と３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートすることによって調製した。インキュベーションの最後に、簡易培地又はヒトＩＬ－１βサイトカイン及びＩＬ－３６γサイトカイン（いずれもＰｅｐｒｏｔｅｃｈ製）を適切なウェルに添加した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、上清を９６ウェルディーププレートに移し、サイトカイン／ケモカインの定量化まで－８０℃の冷凍庫に保存した。培養上清中のＩＬ－８、ＭＣＰ－１、ＧＲＯ－ａ産生を、ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＰＸ０１Ａ－１０２０４－９０１、ＥＰＸ０１Ｂ－１０２８１－９０１、及びＥＰＸ０１Ａ－１２１２２－９０１）を製造業者の指示に従って使用してＬｕｍｉｎｅｘによって測定した。
【0259】
単離直後に、ヒト好中球を、先に調製した馴化培地と３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収し、様々な表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ１５、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を標的とする標識抗体で２０分間染色した。
【0260】
３時間のインキュベーション後、活性化好中球を、以下の表現型：ＣＤ４５＋ＣＤ１５＋ＣＤ６６ｂ＋ＣＤ５４－ＣＤ６２Ｌ－によって特徴付けた。上記と同じ方法を使用して、刺激指数及び阻害パーセンテージを好中球ドナー毎に計算した。
【0261】
【数2】
【0262】
抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１又はアイソタイプ対照＿５間の差を各ドナー内で計算して、全てのデータを対にし、次いで、平均検定（ｔ検定）を使用して分析した。この場合、Ｈ０又は帰無仮説は、「差の平均が０に等しい」である。ｔ検定のｐ値が０，０５未満である場合、Ｈ０は拒絶される、つまり、アイソタイプ対照＿５に対する統計的有意差を意味する。
【0263】
図１０に示す結果は、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１が、アイソタイプ対照＿５と比較して、刺激したＨａＣａＴ細胞によって放出されるケモカインによって媒介される好中球の活性化を阻害することを示す。
【0264】
実施例５：抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ候補１のインビトロ生物学的特徴付け
５．１．１抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ候補１は、マウスＩＬ－１ＲＡＰに特異的に結合する
膜結合型マウスＩＬ－１ＲＡＰ上の抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（重鎖ＣＤＲ配列番号２６５、２６６、２６７、及び軽鎖配列配列番号７４を含む）の結合を、マウス線維芽細胞ＮＩＨ－３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６５８）などの関連細胞株を使用してフローサイトメトリーによって評価した。
５．１．１抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ候補１は、マウスＩＬ－１ＲＡＰに特異的に結合する
膜結合型マウスＩＬ－１ＲＡＰ上の抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（重鎖ＣＤＲ配列番号２６５、２６６、２６７、及び軽鎖配列配列番号７４を含む）の結合を、マウス線維芽細胞ＮＩＨ－３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６５８）などの関連細胞株を使用してフローサイトメトリーによって評価した。
【0265】
簡単に説明すると、細胞を採取し、計数し、９６ウェル丸底プレートに５０’０００細胞／ウェルでプレーティングした。プレートを３５０ｇで３分間遠心分離し、細胞を、様々な濃度（２０～０．０００１ ｐｇ／ｍＬの範囲）の抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１抗体又はアイソタイプ対照＿２抗体のいずれかを含有する５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（１Ｘ）＋２．５％ＦＣＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．０５％ＮａＮ３）中に再懸濁した。染色した細胞を４℃で３０分間インキュベートし、３５０ｇで３分間、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で１／２００に希釈した１００μＬのモノクローナル抗マウスＩｇＧ ＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０７１１４）中に再懸濁した。次いで、細胞を２回洗浄し、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ死細胞染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓ３４８６０）を含有する２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、試料をＣｙｔｏＦｌｅｘ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で取得した。細胞を、ＦＳＣ対ＳＳＣでサイズに基づいてゲートし、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７－幾何平均（幾何平均）蛍光強度について分析した。最後に、相対幾何平均蛍光強度を、アイソタイプ対照＿２の蛍光当たりの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の蛍光を差し引くことによって計算した。図１１に示すように、抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１抗体は、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞株上で発現した膜結合型ＩＬ－１ＲＡＰを認識する。複数の独立した実験を行った。会合Ｋｄ値を表９に要約する。
【0266】
【表10】
【0267】
この表は、抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ候補１（●）又は対照アイソタイプ＿２（■）（図１１）をＮＩＨ－３Ｔ３細胞株とインキュベートしたフローサイトメトリー実験から決定したＫＤ値を示す。ＫＤ値を非線形シグモイド回帰から抽出した。十分な適合度（Ｒ２＞０．７）を示す曲線を要約表に含めた。
【0268】
５．１．２抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ候補１は、ＮＩＨ－３Ｔ３刺激アッセイにおいてＩＬ－３３誘導性サイトカイン放出及びＩＬ－３６誘導性サイトカイン放出の両方を阻害する
ＩＬ－１経路、ＩＬ－３３経路、及びＩＬ－３６経路を阻害する抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の能力を、ＨａＣａＴ細胞株について上記した方法と同じ方法を使用して、マウス線維芽細胞株ＮＩＨ－３Ｔ３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６５８）を用いて試験した。
ＩＬ－１経路、ＩＬ－３３経路、及びＩＬ－３６経路を阻害する抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の能力を、ＨａＣａＴ細胞株について上記した方法と同じ方法を使用して、マウス線維芽細胞株ＮＩＨ－３Ｔ３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６５８）を用いて試験した。
【0269】
簡潔に説明すると、細胞を採取し、計数し、完全ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％グルタミン＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｐ＋１％ＨＥＰＥＳ＋０．１％β－メルカプトエタノール）中に０．０５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。１００μＬの細胞を９６ウェル平底プレートに分配し、３７℃、５％ＣＯ２で１６時間インキュベートした。翌日、細胞を、アッセイ培地（完全ＤＭＥＭ培地）中で連続希釈した５０μＬの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（５０～０．０００００５ｐｇ／ｍＬの範囲）又はアイソタイプ対照＿２（５０ｐｇ／ｍＬの固有用量）のいずれかと３０分間インキュベートした。インキュベーションの最後に、５０μＬのマウスＩＬ－１β若しくはヒトＩＬ－３３又はマウスＩＬ－３６α、Ｐ、若しくはｙの組み合わせ（全てＰｅｐｒｏｔｅｃｈ製であり、ｍＩＬ－３６サイトカインのみＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）のいずれかを適切なウェルに供給した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間～４８時間インキュベートした後、１００μＬの上清を９６ウェル丸底プレートに移し、サイトカイン／ケモカインの定量化まで－８０℃の冷凍庫に保存した。培養上清中のＩＬ－６及びＣＸＣＬ－１／ＧＲＯ－α産生を、ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＰＸ０１Ａ－２０６０３－９０１及びＥＰＸ０１Ａ－２６０３１－９０１）を製造業者の指示に従って使用してＬｕｍｉｎｅｘで測定した。
【0270】
図１２に示すように、抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞のマウスＩＬ－１β、ヒトＩＬ－３３、又はマウスＩＬ－３６ｓ刺激時にＩＬ－６サイトカイン及びＣＸＣＬ－１／ＧＲＯ－αケモカインの両方の放出を阻害する。マウスＩＬ－１βに対する抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の効果は、これらの細胞がマウスＩＬ－１β刺激に対して感受性が低く、結果として刺激ウィンドウが非常に小さくなるため、非常に弱い。この効果は、ＩＬ－３３経路及びＩＬ－３６経路に対して用量依存的である。組み入れ基準を確立し、全てのアッセイに適用して、阻害パーセンテージを決定するために十分な刺激ウィンドウ又は刺激指数（ＳＩ）を得た。
【0271】
抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１のＦｃ部分バリアントを用いて複数の実験を行い、最終実験は先の所見と一致しており、図１２に示し、阻害のＥＣ５０値を表１０に要約する。
【0272】
【表11】
【0273】
この表は、抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（●）又はアイソタイプ対照＿２（■）（図１２）をｍＩＬ－１β、ｈＩＬ－３３、又はｍＩＬ－３６ｓで刺激したＮＩＨ－３Ｔ３とインキュベートした刺激アッセイから決定したＥＣ５０及び最大阻害値を示す。ＥＣｘ値を非線形シグモイド回帰から抽出した。十分な刺激条件（刺激指数＞１．８）及び十分な適合度（Ｒ２＞０．７）を示す曲線を要約表に含めた。
【0274】
実施例６：インビボ急性炎症誘導マウスモデルにおける抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ候補１の有効性
材料及び方法
畜産
インビボ実験を、ＪＡＮＶＩＥＲ ＥＡＢＳからの６～７週齢の免疫適格性雌Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスで行った。全てのマウスを齧歯類ケージ内の標準化環境条件下（室温２０±１℃、相対湿度５０±１０％、１２時間の明暗サイクル）で維持した。マウスに、放射線照射した食品及び寝床並びに０．２２μｍの濾過飲料水を与えた。
材料及び方法
畜産
インビボ実験を、ＪＡＮＶＩＥＲ ＥＡＢＳからの６～７週齢の免疫適格性雌Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスで行った。全てのマウスを齧歯類ケージ内の標準化環境条件下（室温２０±１℃、相対湿度５０±１０％、１２時間の明暗サイクル）で維持した。マウスに、放射線照射した食品及び寝床並びに０．２２μｍの濾過飲料水を与えた。
【0275】
インビボ急性炎症誘導マウスモデル
２つの実験を行い、それぞれ、Ｂｅｌｙ＿４研究及びＢｅｌｙ＿５研究と名付けた。
２つの実験を行い、それぞれ、Ｂｅｌｙ＿４研究及びＢｅｌｙ＿５研究と名付けた。
【0276】
Ｂｅｌｙ＿４研究。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスに、０日目に異なる処理物を腹腔内注射した。処理物注射の２時間後に、マウスにインターロイキンの混合物（マウスＩＬ－１β、ヒトＩＬ－３３、並びにマウスＩＬ３６α、β、及びγ）を腹腔内注射した。最初の処理物注射の２４時間後に、マウスを安楽死させた。マウス血清、脾細胞、及び腹腔内洗浄液をエクスビボ分析のために採取した。Ｌｕｍｉｎｅｘをマウス血清で行った。ＦＡＣＳ分析を脾細胞及び腹腔内洗浄液で行った。
【0277】
Ｂｅｌｙ＿５研究。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスに、０日目、１日目、及び２日目に異なる処理物を腹腔内注射した。処理物注射の２時間後に、マウスにインターロイキンの混合物（マウスＩＬ－１β、ヒトＩＬ－３３、並びにマウスＩＬ３６α、β、及びγ）を腹腔内注射した。最初の処理物注射の２４時間及び／又は７２時間後に、マウスを安楽死させた。マウス血清、脾細胞、及び腹腔内洗浄液をエクスビボ分析のために採取した。Ｌｕｍｉｎｅｘをマウス血清で行った。ＦＡＣＳ分析を脾細胞及び腹腔内洗浄液で行った。
【0278】
フローサイトメトリーのためのマウス試料調製。
脾細胞の場合、脾臓を採取し、機械的に解離させた。細胞懸濁液を濾過し、遠心分離した。次いで、細胞を計数し、免疫細胞プロファイリングのために染色した。完全抗体パネルでの染色及び相対的対照をＦＡＣＳ緩衝液中で調製した。試料をＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｓ機器（ＣＹＴＥＫ）で分析した。データを、Ｋａｌｕｚａ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して分析した。
脾細胞の場合、脾臓を採取し、機械的に解離させた。細胞懸濁液を濾過し、遠心分離した。次いで、細胞を計数し、免疫細胞プロファイリングのために染色した。完全抗体パネルでの染色及び相対的対照をＦＡＣＳ緩衝液中で調製した。試料をＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｓ機器（ＣＹＴＥＫ）で分析した。データを、Ｋａｌｕｚａ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して分析した。
【0279】
腹腔内洗浄液の場合、ＰＢＳを腹腔内に注射した。腹膜を穏やかにマッサージして細胞を剥離し、次いで、腹膜を切開することによって腹水を回収した。細胞懸濁液を濾過し、遠心分離した。次いで、細胞を計数し、免疫細胞プロファイリングのために染色した。完全抗体パネルでの染色及び相対的対照をＦＡＣＳ緩衝液中で調製した。試料をＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｓ機器（ＣＹＴＥＫ）で分析した。データを、Ｋａｌｕｚａ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して分析した。
【0280】
Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイのためのマウス試料調製。
血清試料を、製造業者の指示に従ってＭｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｌｕｍｉｎｅｘ定量化によって評価した。ビーズ、インビボ試料、及び／又は上清、並びにキットによって提供される希釈標準をプレートに添加し、一晩インキュベートした。検出抗体をプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン－ＰＥを添加し、室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、読み取り緩衝液を添加し、室温でインキュベートした後、Ｌｕｍｉｎｅｘ ２００機器で読み取った。Ｌｕｍｉｎｅｘデータを、ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ １．０ Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアを使用して分析した。サイトカイン濃度を定量化の上限値（ＵＬＯＱ）及び下限値（ＬＬＯＱ）に対して正規化した。ＬＬＯＱ未満の全てのデータを標準曲線の最低点に設定し、分析不可能とみなした（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析の場合、０は許可されていない）。データを、Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して分析した。
血清試料を、製造業者の指示に従ってＭｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｌｕｍｉｎｅｘ定量化によって評価した。ビーズ、インビボ試料、及び／又は上清、並びにキットによって提供される希釈標準をプレートに添加し、一晩インキュベートした。検出抗体をプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン－ＰＥを添加し、室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、読み取り緩衝液を添加し、室温でインキュベートした後、Ｌｕｍｉｎｅｘ ２００機器で読み取った。Ｌｕｍｉｎｅｘデータを、ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ １．０ Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアを使用して分析した。サイトカイン濃度を定量化の上限値（ＵＬＯＱ）及び下限値（ＬＬＯＱ）に対して正規化した。ＬＬＯＱ未満の全てのデータを標準曲線の最低点に設定し、分析不可能とみなした（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析の場合、０は許可されていない）。データを、Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して分析した。
【0281】
統計分析
データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを使用して分析した。行った統計分析：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてダネット多重比較。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。有意水準をアスタリスクで表す。（０．０００１未満の場合は＊＊＊＊であり、０．０００１の場合は＊＊＊であり、０．００１の場合は＊＊であり、０．０１の場合は＊である）。
データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを使用して分析した。行った統計分析：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてダネット多重比較。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。有意水準をアスタリスクで表す。（０．０００１未満の場合は＊＊＊＊であり、０．０００１の場合は＊＊＊であり、０．００１の場合は＊＊であり、０．０１の場合は＊である）。
【0282】
結果及び結論
抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補１（配列番号７３及び配列番号７４を含む）の有効性を、２つの独立したインビボ急性炎症誘導マウスモデルで試験した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスに、第１の研究の場合は０日目に、第２の研究の場合は０日目、１日目、及び２日目に、異なる処理物を腹腔内注射した。各処理物注射の２時間後に、マウスにインターロイキンの混合物（マウスＩＬ－１β、ヒトＩＬ－３３、並びにマウスＩＬ３６α、β、及びγ）を腹腔内注射した。第１の研究の場合は最初の処理物注射の２４時間後に、第２の研究の場合は最初の処理物注射の７２時間後に、マウスを安楽死させた。マウス血清、脾細胞、及び腹腔内洗浄液をエクスビボ分析のために採取した。
抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補１（配列番号７３及び配列番号７４を含む）の有効性を、２つの独立したインビボ急性炎症誘導マウスモデルで試験した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスに、第１の研究の場合は０日目に、第２の研究の場合は０日目、１日目、及び２日目に、異なる処理物を腹腔内注射した。各処理物注射の２時間後に、マウスにインターロイキンの混合物（マウスＩＬ－１β、ヒトＩＬ－３３、並びにマウスＩＬ３６α、β、及びγ）を腹腔内注射した。第１の研究の場合は最初の処理物注射の２４時間後に、第２の研究の場合は最初の処理物注射の７２時間後に、マウスを安楽死させた。マウス血清、脾細胞、及び腹腔内洗浄液をエクスビボ分析のために採取した。
【0283】
最初の注射の２４時間後、抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、対照群と比較してＩＬ－５の有意な下方調節を示した（図１）（ｐ値＝０．００１８）。ベンチマークであるアナキンラ（ｐ値＝０．１６１１）及びｍＩＬ３６Ｒａ（ｐ値＝０．４７１９）によって誘導されたＩＬ－５の有意な下方調節はなかった。
【0284】
【表12】
【0285】
最初の注射の７２時間後、抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、対照群と比較してＩＬ－５（図１４）及びＧｒｏ－α（図３）の有意な下方調節を示した（それぞれ、ｐ値＝０．０３５６及びｐ値＝０．０００９）。ベンチマークであるアナキンラ（ｐ値＝０．５４１３）及びｍＩＬ３６Ｒａ（ｐ値＝０．１３３７）によって誘導されたＩＬ－５の有意な下方調節はなかった。有意な下方調節は、アナキンラ（ｐ値＝０．０１６２）によって誘導されるが、ｍＩＬ３６Ｒａ（ｐ値＝０．９３３）によっては誘導されない。
【0286】
【表13】
【0287】
【表14】
【0288】
抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、インターロイキン注射の２４時間後及び７２時間後にマウス血清中のＩＬ－５放出を阻害し、インターロイキン注射の７２時間後にマウス血清中のＧｒｏ－α放出を阻害する。これらのデータにより、ベンチマークと比較して、ＩＬ－１ＲＡＰを標的とすることにより、インビボでのＩＬ－３６、ＩＬ－３３、及びＩＬ１シグナル伝達経路の遮断が可能になることが確認された。
【0289】
実施例７：インビボ慢性炎症誘導マウスモデルにおける抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ候補１の有効性
材料及び方法
畜産
インビボ実験を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）によって開発された８～９週齢免疫適格性雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＪＲ番号００６６４）近交系に行った。全てのマウスを齧歯類ケージ内の標準化環境条件下（室温２０±１℃、相対湿度５０±１０％、１２時間の明暗サイクル）で維持した。マウスに、放射線照射した食品及び寝床並びに０．２２μｍの濾過飲料水を与えた。
材料及び方法
畜産
インビボ実験を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）によって開発された８～９週齢免疫適格性雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＪＲ番号００６６４）近交系に行った。全てのマウスを齧歯類ケージ内の標準化環境条件下（室温２０±１℃、相対湿度５０±１０％、１２時間の明暗サイクル）で維持した。マウスに、放射線照射した食品及び寝床並びに０．２２μｍの濾過飲料水を与えた。
【0290】
乾癬様マウスモデル
生存中の観察及び手順。マウスを、本研究の開始の３日前及び生涯にわたって秤量した。ＩＭＱ適用の４８時間前にマウスを剃毛した。剃毛したマウスの背中及び両耳に、５％ＩＭＱクリーム（Ａｌｄａｒａ（登録商標））を毎日局所塗布した。局所塗布を保護する手段として、ＩＭＱ処理皮膚領域をＴｅｇａｄｅｒｍ（商標）滅菌不透明包帯で覆った。全ての分子の場合、処理物を、３日に１回腹腔内経路を介してマウスに投与し、アナキンラのみ、毎日腹腔内経路を介して注射した。マウスを毎日物理的に検査し、ＰＡＳＩ（乾癬面積及び重症度指数）スコアを以下のように適用した：紅斑（皮膚の刺激／発赤）及び焼痂（かさぶた）形成（１～４スコア）／落屑及び病変重症度スケール（１～４スコア）。本研究の最後に、背側皮膚をエクスビボ分析のために採取した。組織学的検査を背側皮膚で行った。
生存中の観察及び手順。マウスを、本研究の開始の３日前及び生涯にわたって秤量した。ＩＭＱ適用の４８時間前にマウスを剃毛した。剃毛したマウスの背中及び両耳に、５％ＩＭＱクリーム（Ａｌｄａｒａ（登録商標））を毎日局所塗布した。局所塗布を保護する手段として、ＩＭＱ処理皮膚領域をＴｅｇａｄｅｒｍ（商標）滅菌不透明包帯で覆った。全ての分子の場合、処理物を、３日に１回腹腔内経路を介してマウスに投与し、アナキンラのみ、毎日腹腔内経路を介して注射した。マウスを毎日物理的に検査し、ＰＡＳＩ（乾癬面積及び重症度指数）スコアを以下のように適用した：紅斑（皮膚の刺激／発赤）及び焼痂（かさぶた）形成（１～４スコア）／落屑及び病変重症度スケール（１～４スコア）。本研究の最後に、背側皮膚をエクスビボ分析のために採取した。組織学的検査を背側皮膚で行った。
【0291】
エクスビボ実験のためのマウス試料調製
４％ホルマリンに固定する前に、背側皮膚の左側を１ｃｍ幅の細片（横断切片）に切断した。
４％ホルマリンに固定する前に、背側皮膚の左側を１ｃｍ幅の細片（横断切片）に切断した。
【0292】
組織学アッセイ
背側皮膚（スライド１枚当たり４つの試料）をヘマトキシリンで染色した。スライドを、ＣｅｌｌＳｅｎｓ標準ソフトウェアを使用して分析した。乳頭間突起形成定量化（表皮肥厚と呼ばれる）を、マウス１匹当たりスライド１枚当たり４つの皮膚試料／スライド１枚当たり１０枚の写真／１群当たり６匹のマウスで行った。二重スコアリングを行った。データを、Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して分析した。
背側皮膚（スライド１枚当たり４つの試料）をヘマトキシリンで染色した。スライドを、ＣｅｌｌＳｅｎｓ標準ソフトウェアを使用して分析した。乳頭間突起形成定量化（表皮肥厚と呼ばれる）を、マウス１匹当たりスライド１枚当たり４つの皮膚試料／スライド１枚当たり１０枚の写真／１群当たり６匹のマウスで行った。二重スコアリングを行った。データを、Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して分析した。
【0293】
統計分析
データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを使用して分析した。行った統計分析：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いて多重比較のためのダネット多重比較検定。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。有意水準をアスタリスクで表す（０．０００１未満の場合は＊＊＊＊であり、０．０００１の場合は＊＊＊であり、０．００１の場合は＊＊であり、０．０１の場合は＊である）。
データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを使用して分析した。行った統計分析：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いて多重比較のためのダネット多重比較検定。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。有意水準をアスタリスクで表す（０．０００１未満の場合は＊＊＊＊であり、０．０００１の場合は＊＊＊であり、０．００１の場合は＊＊であり、０．０１の場合は＊である）。
【0294】
結果及び結論
乾癬は、表皮細胞代謝回転の加速を伴う炎症性皮膚疾患である。循環好中球は乾癬病変に移動し、呼吸バースト、脱顆粒、及び好中球細胞外トラップの形成を誘導し、それにより、Ｔ細胞不均衡、ケラチノサイト増殖、血管新生、及び自己抗原形成を含む乾癬の免疫病因に寄与する。皮膚における好中球の蓄積は、乾癬の組織学的特徴のうちの１つである。高レベルで産生及び分泌されるＩＬ－３６は、イミキモドによって誘導される乾癬型皮膚疾患において重要な役割を果たす。ＩＬ－３６は、好中球動員を促進し得る。ＩＬ－３６とＩＬ－１が協働して、相互調節を介して乾癬形態の皮膚炎症を駆動する。抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補１の有効性を、インビボ慢性炎症誘導マウスモデル：乾癬様皮膚炎症マウスモデルにおいて試験した。
乾癬は、表皮細胞代謝回転の加速を伴う炎症性皮膚疾患である。循環好中球は乾癬病変に移動し、呼吸バースト、脱顆粒、及び好中球細胞外トラップの形成を誘導し、それにより、Ｔ細胞不均衡、ケラチノサイト増殖、血管新生、及び自己抗原形成を含む乾癬の免疫病因に寄与する。皮膚における好中球の蓄積は、乾癬の組織学的特徴のうちの１つである。高レベルで産生及び分泌されるＩＬ－３６は、イミキモドによって誘導される乾癬型皮膚疾患において重要な役割を果たす。ＩＬ－３６は、好中球動員を促進し得る。ＩＬ－３６とＩＬ－１が協働して、相互調節を介して乾癬形態の皮膚炎症を駆動する。抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補１の有効性を、インビボ慢性炎症誘導マウスモデル：乾癬様皮膚炎症マウスモデルにおいて試験した。
【0295】
剃毛したマウスの背中及び両耳に、５％ＩＭＱクリーム（Ａｌｄａｒａ（登録商標））を毎日局所塗布した。局所塗布を保護する手段として、ＩＭＱ処理皮膚領域をＴｅｇａｄｅｒｍ（商標）滅菌不透明包帯で覆った。全ての分子の場合、処理物を、３日に１回腹腔内経路を介してマウスに投与、アナキンラのみ、毎日腹腔内経路を介して注射した。マウスを毎日物理的に検査し、ＰＡＳＩ（乾癬面積及び重症度指数）スコアを以下のように適用した：紅斑（皮膚の刺激／発赤）及び焼痂（かさぶた）形成（１～４スコア）／落屑及び病変重症度スケール（１～４スコア）。
【0296】
１０日目に、抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、対照群と比較して、乾癬様皮膚炎症モデルにおいて落屑及び病変スコアの有意な減少を誘導した（１ｍｇでｐ値＝０．０１４１及び２５０ｕｇでｐ値＝０．００２５）（図１６）。
【0297】
【表15】
【0298】
組織学データは、抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１が、対照群及びアイソタイプ群と比較して、乾癬様皮膚炎症モデルにおいて表皮肥厚とも呼ばれる乳頭間突起の形成を阻害することができることを実証した（ｐ値＝０．０００１）（図１７及び図１８）。ｍＩＬ３６Ｒａでは表皮肥厚形成が有意に減少した（ｐ値＝０．０００６）が、アナキンラでは減少しなかった（ｐ値＝０．０７０２）。
【0299】
マウスの背側皮膚に対して行った組織学の写真を図１８に示す。簡潔に説明すると、マウスをイミキモド及びＰＢＳ（Ａ）、アイソタイプ対照＿３（Ｂ）、１ｍｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（Ｃ）、２５０ｕｇの抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１（Ｄ）、アナキンラ（Ｅ）、ｍＩＬ３６Ｒａ（Ｆ）、又は未処理マウス（Ｇ）で処理した。抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ候補１の投与は、乾癬様皮膚炎症マウスモデルにおいて好中球浸潤を阻害した。
【0300】
ＩＭＱ＿ｓ２研究からのデータ。
【0301】
【表16】
【0302】
抗マウスＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、乾癬様皮膚炎症マウスモデルにおいて好中球浸潤を阻害する。これらのデータにより、ベンチマークと比較して、ＩＬ－１ＲＡＰを標的とすることにより、インビボでのＩＬ－３６、ＩＬ－３３、及びＩＬ１シグナル伝達経路の遮断が可能になることが確認された。
【0303】
実施例８：抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１のインビトロ生物学的特徴付け
抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ＩＬ－１刺激時に全血再刺激アッセイにおいてサイトカイン放出を用量依存的に阻害する。
抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、ＩＬ－１刺激時に全血再刺激アッセイにおいてサイトカイン放出を用量依存的に阻害する。
【0304】
先のアッセイは、全血アッセイとの関連でＩＬ１ＲＡＰによって媒介される組み合わせ経路を阻害する抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の能力の評価を可能にしたが、ここでは、分離したＩＬ－１α又はＩＬ－１βを使用して、ＩＬ－１刺激経路を阻害する抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の能力を評価し、阻害の半最大有効濃度（又はＥＣ５０）を決定した。
【0305】
材料及び方法
健常ドナー由来の新たに採取したヒト血液（クエン酸塩チューブ）を１５ｍＬのチューブに分配し、培地のみ（ＲＰＭＩ）、２５ｕｇ／ｍＬ～０．０００３２ｐｇ／ｍＬの範囲の抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の連続希釈物、又はアイソタイプ対照＿４（２５ｕｇ／ｍＬ）のいずれかと３０分間プレインキュベートした後、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１α又は５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１βで刺激して、最終体積０．６ｍＬにした。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、上清を回収した。培養上清中の様々なサイトカイン及びケモカインの産生を、複数のＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、９プレックスキット）を製造者の指示に従って使用してＬｕｍｉｎｅｘで測定した。分析物の定量化を刺激指数に対して正規化した。
刺激指数（試料）、［ＳＩ］＿Ｘ＝（［サイトカイン放出］＿Ｘ（試料））／（［平均サイトカイン放出］＿Ｘ（未刺激血液））
健常ドナー由来の新たに採取したヒト血液（クエン酸塩チューブ）を１５ｍＬのチューブに分配し、培地のみ（ＲＰＭＩ）、２５ｕｇ／ｍＬ～０．０００３２ｐｇ／ｍＬの範囲の抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１の連続希釈物、又はアイソタイプ対照＿４（２５ｕｇ／ｍＬ）のいずれかと３０分間プレインキュベートした後、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１α又は５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１βで刺激して、最終体積０．６ｍＬにした。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、上清を回収した。培養上清中の様々なサイトカイン及びケモカインの産生を、複数のＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、９プレックスキット）を製造者の指示に従って使用してＬｕｍｉｎｅｘで測定した。分析物の定量化を刺激指数に対して正規化した。
刺激指数（試料）、［ＳＩ］＿Ｘ＝（［サイトカイン放出］＿Ｘ（試料））／（［平均サイトカイン放出］＿Ｘ（未刺激血液））
【0306】
３（ベースラインと比較して３倍）未満の刺激指数（刺激／未刺激血液）を、阻害パーセンテージの決定のために除外した。
阻害％（試料）＝（１－（［ＳＩ］＿Ｘ（試料）－［ＳＩ］＿Ｘ平均（未刺激血液））／（［平均ＳＩ］＿Ｘ（刺激）－［平均ＳＩ］＿Ｘ（未刺激血液）））×１００
阻害％（試料）＝（１－（［ＳＩ］＿Ｘ（試料）－［ＳＩ］＿Ｘ平均（未刺激血液））／（［平均ＳＩ］＿Ｘ（刺激）－［平均ＳＩ］＿Ｘ（未刺激血液）））×１００
【0307】
「Ｘ」が考慮されるサイトカイン／ケモカインである場合、「刺激血液」は、アイソタイプ対照、次いでサイトカインＸとプレインキュベートした全血について得た値に対応し、「未刺激血液」は、刺激なしの全血について得た値に対応する。各計算はドナー及びサイトカイン特異的である。
【0308】
半最大有効濃度（ＥＣ５０）値を非線形シグモイド回帰から抽出した。十分な刺激条件（刺激指数＞３）及び十分な適合度を示す曲線（Ｒ２＞０．７及びスパン＞５０％）を要約表に含めた。
【0309】
３つの独立した実験を、試験した合計１５人のドナーで行った。図１８の表Ｂは、十分な刺激条件（刺激指数＞３）を示す組み入れたドナーの数を記載している。
【0310】
図１８及び表１６に示す結果は、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１が、ヒト全血再刺激アッセイにおけるＩＬ－１α又はＩＬ－１βでの刺激後に、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、及びＭＩＰ－１β放出の濃度依存的阻害を示し、平均ＥＣ５０はＩＬ－１α及びＩＬ－１βのいずれでもナノモル範囲であった。
【0311】
【表17】
【0312】
抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１又は最大用量のアイソタイプ対照＿４の用量応答を、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１α又は５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１βとヒト全血中でインキュベートした。
【0313】
表１６は、刺激及び読み出し毎の全ての組み入れたドナーについての阻害のＥＣ５０を示す。ＥＣｘ値を非線形シグモイド回帰から抽出した。十分な刺激条件（刺激指数＞３）及び十分な適合度を示す曲線（Ｒ２＞０．７及びスパン＞５０％）を要約表に含めた。３つの独立した実験を、試験した合計１５人のドナーで行った。Ｘ／Ｙは、ＩＬ－１刺激に応答したドナー数Ｙのうち、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１が阻害を示すドナー数Ｘを表す。
【0314】
自己免疫障害において、抗ヒトＩＬ－１ＲＡＰ＿候補＿１は、病原性サイトカイン産生を増幅し、かつ疾患病態生理を悪化させるＩＬ－１駆動型炎症反応を下方調節することができた。
【0315】
データを、刺激物質としてＩＬ－１２／ＩＬ－３３及びＩＬ－３６α／ＩＬ－３６β／ＩＬ－３６γを使用して生成し、サイトカイン及びケモカイン放出の用量依存的調節を示す（データ示さず）。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図18E】
【図18F】
【図18G】
【図19A】
【図19B】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-05-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の重鎖ＣＤＲ領域（ＣＤＲ－Ｈ１）、第２の重鎖ＣＤＲ領域（ＣＤＲ－Ｈ２）、及び第３の重鎖ＣＤＲ領域（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体であって、前記領域は、（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１が、アミノ酸配列配列番号１２８を含み、
（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２が、アミノ酸配列配列番号１８８を含み、
（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列配列番号２４８を含み、
前記抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体が、配列番号２６８を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体。
【請求項2】
前記抗体が、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記抗体が、１×１０８Ｍ以下、１×１０９Ｍ以下、１×１０１０Ｍ以下、又は１×１０１１Ｍ以下の結合親和性でヒトＩＬ１ＲＡＰに結合し、任意選択で、前記結合親和性が、配列番号１又は６のヒトＩＬ１ＲＡＰポリペプチドに対する平衡解離定数（ＫＤ）によって測定される、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項4】
前記抗体が、ＩＬ－１刺激シグナル、ＩＬ－３３刺激シグナル、及び／又はＩＬ－３６刺激シグナルを、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％減少させ、前記シグナルの減少が、細胞ベースのブロッキングアッセイによって測定される、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項5】
前記抗体が、配列番号２のカニクイザルＩＬ１ＲＡＰポリペプチドと交差反応する、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項6】
前記抗体が、配列番号２６１のマウスＩＬ１ＲＡＰポリペプチドと交差反応する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項7】
前記抗体が、クラスＩｇＧの全長抗体であり、特に、前記クラスＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選択されるアイソタイプを有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項8】
前記抗体が、多重特異性抗体である、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体と同じエピトープに特異的に結合する、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体。
【請求項10】
抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体であって、前記抗体が、ＩＬ１ＲＡＰのドメイン２内の１つ以上のアミノ酸残基に特異的に結合する、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体。
【請求項11】
請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項12】
ＩＬ１ＲＡＰ媒介性疾患を治療するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項13】
ざ瘡、膵臓炎、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、気道過敏性、気道炎症、アレルギー性結膜炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アレルギー性鼻炎、アレルギー、アルツハイマー病／認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、好中球性皮膚症、化膿性汗腺炎、魚鱗癬、アナフィラキシー、関節炎、喘息／アトピー／鼻ポリープ、アテローム性動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、自己免疫／自己炎症性血管炎（巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、川崎病を含むが、これらに限定されない）、ベーチェット病（神経ベーチェット病を含む）、骨肉腫、脳腫瘍、乳がん、悪液質／拒食症、軟骨炎症、脳虚血、慢性疲労症候群、慢性閉塞性肺疾患、クロストリジウム関連疾患、結腸がん、うっ血性心不全、結膜炎、冠動脈炎症、冠動脈再狭窄、糖尿病、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症、ドライアイ疾患、子宮内膜症、好酸球性消化管疾患、好酸球性食道炎、家族性寒冷自己炎症症候群、家族性地中海熱、線維筋痛症、線維性障害、食物アレルギー、汎発型膿疱性乾癬、緑内障、糸球体腎炎、痛風性関節炎、移植片対宿主病、蠕虫感染症、出血性ショック、汗腺膿瘍、痛覚過敏、高ＩｇＤ症候群、高尿酸血症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、がん性疼痛、感染、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、潰瘍性大腸炎及びクローン病を含むが、これらに限定されない）、挫傷から生じる炎症状態、角膜移植に関連する炎症性眼疾患、炎症性疼痛、インフルエンザ関連後遺症、腸がん、虚血、若年性関節炎、川崎病、腎臓がん、レーバー先天性黒内障、肝臓がん、肝疾患、肺がん、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）、黄斑変性、マックル・ウェルズ症候群、多発性骨髄腫、多発性硬化症、筋骨格系疼痛、骨髄性白血病及び他の白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、心筋機能障害、筋疾患、鼻ポリープ、新生児期発症多臓器系炎症性疾患、神経毒性、好中球性皮膚疾患（掌蹠膿疱症を含む、壊疽性膿皮症、乾癬、スウィート症候群、非感染性結膜炎、非感染性ぶどう膜炎、非小細胞肺がん、整形外科手術、変形性関節症、骨粗鬆症、疼痛、膵臓がん、パーキンソン病、歯周病、末梢動脈疾患、リウマチ性多発筋痛症、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、子癇前症又は子癇、早期陣痛、前立腺がん、原虫性感染症、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、虚血再灌流障害、虚血再灌流障害（ＲＳＶ）、特に、血管形成術及びステント植え込み術後の再狭窄、網膜剥離、網膜色素変性症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、関節リウマチ、強皮症、好酸球性筋膜炎、敗血症性ショック、鎌状赤血球貧血症、放射線療法による副作用、ＳＡＰＨＯ（滑膜炎、ざ瘡、膿疱症、骨増殖症及び骨炎）症候群、副鼻腔炎、皮膚がん、睡眠障害、捻挫による炎症、スティル病、胃がん、全身性エリテマトーデス（ループス腎炎を含む）、顎関節疾患、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群及び他の遺伝性発熱性症候群、移植片拒絶反応、外傷、外傷性眼球損傷、２型糖尿病、並びに白斑を含む群から選択される疾患を治療することにおける使用のための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体。
【国際調査報告】