ホーム > 特許ランキング > ソルボンヌ ウニベルシテ
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ソルボンヌ ウニベルシテの特許一覧 ▶ セントレ ナショナル デ ラ リシェルシェ サイエンティフィケの特許一覧 ▶ エコール スュペリユール デ フィジク エ デ シミ アンドゥストゥリエーレ デ ラ ヴィレ デ パリの特許一覧 ▶ インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル）の特許一覧
特表2023-541719視覚または任意の他の脳機能を回復するための超音波をベースとするデバイスおよび方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-03
(54)【発明の名称】視覚または任意の他の脳機能を回復するための超音波をベースとするデバイスおよび方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20230926BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230926BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20230926BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230926BHJP
C12N 5/0793 20100101ALN20230926BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 Z ZNA
C12Q1/02
C12N15/864 100Z
C12N5/10
C12N5/0793
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023539209
(86)(22)【出願日】2021-09-09
(85)【翻訳文提出日】2023-04-28
(86)【国際出願番号】 EP2021074868
(87)【国際公開番号】W WO2022053587
(87)【国際公開日】2022-03-17
(31)【優先権主張番号】20306000.9
(32)【優先日】2020-09-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518170446
【氏名又は名称】ソルボンヌ ウニベルシテ
(71)【出願人】
【識別番号】523083735
【氏名又は名称】セントレ ナショナル デ ラ リシェルシェ サイエンティフィケ
(71)【出願人】
【識別番号】523084558
【氏名又は名称】エコール スュペリユール デ フィジク エ デ シミ アンドゥストゥリエーレ デ ラ ヴィレ デ パリ
(71)【出願人】
【識別番号】514203362
【氏名又は名称】インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル）
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ピコー，サージ
(72)【発明者】
【氏名】カドーニ，サラ
(72)【発明者】
【氏名】サヘル，ホセ－アラン
(72)【発明者】
【氏名】タンター，ミカエル
(72)【発明者】
【氏名】デメネ，チャーリー
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ13
4B063QS39
4B063QS40
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BC50
4B065CA24
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、対象において神経細胞を可逆的に刺激するためのデバイスおよび方法に関する。本発明のデバイスは、４ＭＨｚ以上で超音波を発生させて、この超音波で機械受容チャネルを発現する神経細胞を刺激するためのモジュールを備える。本発明の方法は、機械受容チャネルを神経細胞に発現させることと、この細胞を超音波に４ＭＨｚ以上で曝露することと、を含む。本発明はまた、対象における視覚回復のための方法またはデバイスの使用にも関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の神経細胞を形質導入する際に使用し、それにより、それを必要とする前記対象における感覚欠損を回復させるための機械受容チャネルをコードする核酸配列を含むベクターであって、ここで、前記対象は、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数の範囲の少なくとも１つの超音波刺激にさらに曝露される、ベクター。
【請求項2】
対象において神経細胞を可逆的に刺激するための方法であって、（ｉ）機械受容チャネルをコードする核酸配列を含むベクターを神経細胞に形質導入し、それによって前記神経細胞による外因性機械受容チャネルの発現を誘導することと、
（ｉｉ）外因性機械受容チャネルを発現する前記神経細胞を、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数の範囲の少なくとも１つの超音波刺激に曝露することと、を含む、方法。
【請求項3】
前記超音波刺激が、約１５ＭＨｚの中心周波数である、請求項１に記載の使用のためのベクターまたは請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記少なくとも１つの超音波刺激が、約０．０１～約２ＭＰａに含まれるピーク音圧、および約０．１～約２００ｍｓに含まれる超音波処理持続時間を有し、前記超音波刺激は、約０．００１～約１０秒の刺激間間隔（ＩＳＩ）で繰り返され、好ましくは、前記少なくとも１つの超音波刺激は、超音波信号のバーストである、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのベクターまたは方法。
【請求項5】
前記少なくとも１つの超音波刺激が、マルチ周波超音波刺激である、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のためのベクターまたは方法。
【請求項6】
前記少なくとも１つの超音波刺激が非集束であり、好ましくは、前記少なくとも１つの超音波刺激が、複数の場所で同時に集束されるか、前記少なくとも１つの超音波刺激が、前記超音波刺激の全持続時間内に異なる場所に連続的に集束されるいくつかの超音波ビームから構成されるか、または前記少なくとも１つの超音波刺激が、複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンである、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のためのベクターまたは方法。
【請求項7】
前記神経細胞またはその伸長が皮質領域内、または脳幹などの皮質下領域；または脊髄内にある、または前記神経細胞が、網膜内、前庭内または蝸牛内にある、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のためのベクターまたは方法。
【請求項8】
前記神経細胞が、視覚皮質の皮質ニューロン 、外側膝状体核のニューロン 、または網膜神経節細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のためのベクターまたは方法。
【請求項9】
好ましくは前記対象が視覚機能障害を有し、より好ましくは前記視覚機能障害が糖尿病性網膜症、視神経症、緑内障または外傷に起因する、前記対象において画像の視覚を誘導するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のためのベクターまたは方法。
【請求項10】
前記少なくとも１つの超音波刺激が、画像情報の符号化から得られる複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンである、請求項９に記載の使用のためのベクターまたは方法。
【請求項11】
前記機械受容チャネルが、Ｐｉｅｚｏチャネル、ＭｓｃＬ（大コンダクタンス機械受容チャネル） およびＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子）チャネル を含むかまたはこれらからなる群から選択され、好ましくは、前記機械受容チャネルは、ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓであり、任意により、前記機械受容チャネルは、レポータータンパク質に融合される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用のためのベクターまたは方法。
【請求項12】
前記ベクターが、細胞型特異的プロモーターを含み、好ましくは前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＣＡＭＫＩＩプロモーター、ＳＮＣＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、シナプシンＩプロモーター、およびＥＦ－１ａプロモーターからなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用のためのベクターまたは方法。
【請求項13】
前記ベクターが、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルスおよび単純ヘルペスウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の使用のためのベクターまたは方法。
【請求項14】
前記ベクターが、ＡＡＶ、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５およびＡＡＶ９血清型を含む群から選択されるＡＡＶであり、より好ましくは前記ベクターが、ＡＡＶ９またはＡＡＶ２である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の使用のためのベクターまたは方法。
【請求項15】
前記ベクターが、ＡＡＶ１－７ｍ８、ＡＡＶ２－７ｍ８、ＡＡＶ５－７ｍ８およびＡＡＶ９－７ｍ８血清型を含む群から選択され、好ましくは、前記ベクターは、ＡＡＶ２－７ｍ８またはＡＡＶ９－７ｍ８である、請求項１４に記載の使用のためのベクターまたは方法。
【請求項16】
前記ベクターが、ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＣａｍＫＩＩプロモーターに融合されたＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓをコードする核酸配列を含むＡＡＶ９－７ｍ８である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の使用のためのベクターまたは方法。
【請求項17】
任意によりレポータータンパク質、プロモーター、および任意により小胞体輸出シグナルに融合された機械受容チャネルをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターであって、好ましくは前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５およびＡＡＶ９血清型を含む群から選択され、より好ましくは、前記ベクターは、ＡＡＶ９またはＡＡＶ２である、ＡＡＶベクター。
【請求項18】
前記ベクターが、ＡＡＶ１－７ｍ８、ＡＡＶ２－７ｍ８、ＡＡＶ５－７ｍ８およびＡＡＶ９－７ｍ８血清型を含む群から選択され、好ましくは、前記ベクターは、ＡＡＶ９－７ｍ８またはＡＡＶ２－７ｍ８である請求項１７に記載のＡＡＶベクター。
【請求項19】
前記プロモーターが、細胞型特異的プロモーターであり、好ましくは、前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＣＡＭＫＩＩプロモーター、ＳＮＣＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、シナプシンＩプロモーターおよびＥＦ－１ａプロモーターを含む群から選択される、請求項１７または請求項１８に記載のＡＡＶベクター。
【請求項20】
ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＣａｍＫＩＩプロモーターに融合されたＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓをコードする核酸配列を含むＡＡＶ９－７ｍ８である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、超音波を使用して特定の神経細胞を刺激するためのデバイスおよび方法に関する。特に、本発明は、対象における視覚回復のためのデバイスまたは方法の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ニューロモデュレーションは、中枢神経系、末梢神経系、または自律神経系中でのニューロン活動を刺激するプロセスとして定義できる。ニューロモデュレーションは、障害を有する神経機能に置き換わる神経補綴物の開発、新しい治療形態、ニューロンおよび神経機能を調査するための新しい研究ツールなど、幅広い潜在的用途を有する。特に、皮質および皮質下の非侵襲的ニューロン刺激の開発は、広範囲の神経疾患および視力喪失などの知覚障害にとって興味深いものである。それにより、視覚の回復のために様々なアプローチが試験されてきたが、それらの有効性を制限するいくつかの制限に遭遇した。
【0003】
視覚の形成をもたらす皮質表面電極は、そのサイズ（０．５ｍｍ）が大きいことおよび間隔が２～４ｍｍ２と広いことによって制限される。それらの長期使用は、経時的な有効性の喪失が報告されていることにより、揺れ動いている。光遺伝学的療法は、網膜上で実証されているとおり、潜在的により高い分解能で、離れているニューロンを刺激する代替手段をもたらしている。しかし、脳の用途では、光刺激は、硬膜および組織の回折および吸収によって妨げられる。超音（ＵＳ）波は、非侵襲的に皮質および皮質下の脳領域を刺激するための光波のこれらの制限を克服する。
【0004】
今日まで、超音波刺激を使用するいくつかの方法およびデバイスが当技術分野において報告されている。
【0005】
国際公開公報第２０１３／０５９８３３号は、脳の活動を調節するための方法およびシステムを開示しており、ここでは、音響信号は、脳内の標的領域に経頭蓋的に向けられる。音響信号は、１００ｋＨｚ～１０ＭＨｚの範囲の周波数を有する。
【0006】
米国特許出願公開第２０１３／０２４５５０５号は、音響周波数が２０ＭＨｚ～１００ＭＨｚの範囲である集束超音波信号を放出する網膜刺激および補綴デバイスを開示している。
【0007】
米国特許出願公開第２０１４／０２４９４５４号は、脳に放出する２００ｋＨｚ～１０ＭＨｚの周波数範囲の超音波を用いて、強度難聴者などの感覚能力を治療するためのデバイスおよび方法を開示している。
【0008】
米国特許出願公開第２０１３／００７９６２１号は、音響波源を動作させる方法およびシステムを開示しており、より具体的には診断、刺激および／または阻害のための音響波源の音響エネルギーの使用に関する。音響波は、１～２０ＭＨｚの周波数範囲を有する。
【0009】
しかし、低周波数刺激の使用では、空間分解能が低下し、応答が長く継続し、視覚回復などの一部の用途に適合しない一方で、高周波数刺激の使用では、高音響エネルギーの蓄積が生じ、これは、熱加熱および超音波による組織損傷リスクを伴う。
【0010】
したがって、皮質および皮質下領域を刺激するための新しい安全で効率的な方法を開発する必要があり、特に対象における視覚を回復させるための安全で効率的な方法を開発する必要がある。
【0011】
超音波刺激とニューロンにおける機械受容チャネルの外因性発現との組み合わせは、米国特許出願公開第２０１９／０２１７１２９号および米国特許出願公開第２０１９／０３０８０３５号にも記載されている。しかし、これらの方法では低周波数刺激（すなわち、それぞれ、２０～１０００ｋＨｚおよび５００ｋＨｚ）を使用するため、本明細書の上記と同じ制限を受ける（すなわち、例えば、低空間分解能は、視覚回復に適合しない）。
【0012】
ここで、本発明者らは、高周波数刺激と組み合わせた大コンダクタンス細菌機械受容イオンチャネル（ＭｓｃＬ）によるニューロンの感作に基づいて、視覚回復に適合する音響遺伝学的アプローチを開発した。実際に、本発明者らは、１５ＭＨｚ超音波刺激によるＭｓｃＬを発現する皮質ニューロンおよび網膜ニューロンの刺激が、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ビデオレート刺激を必要とする視覚回復に適合する、ニューロンの高度な時空間活性化を誘導することを実証した。
【発明の概要】
【0013】
本発明は、第一に、対象において機械受容チャネルを発現する神経細胞を可逆的に刺激するための入力として電気信号を受信するように構成されている超音波システムに関し、
ここで、超音波システムは、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数の範囲の少なくとも１つの超音波刺激、好ましくは約１５ＭＨｚの中心周波数の少なくとも１つの超音波刺激を放出するための、少なくとも１つの超音波素子を有する超音波アレイを含むモジュール（Ａ）を備え、
少なくとも１つの超音波刺激は、集束されていない。
ここで、超音波システムは、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数の範囲の少なくとも１つの超音波刺激、好ましくは約１５ＭＨｚの中心周波数の少なくとも１つの超音波刺激を放出するための、少なくとも１つの超音波素子を有する超音波アレイを含むモジュール（Ａ）を備え、
少なくとも１つの超音波刺激は、集束されていない。
【0014】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約０．０１～約２ＭＰａに含まれるピーク音圧、および約０．１～約２００ミリ秒（ｍｓ）に含まれる超音波処理持続時間を有し、約０．００１～約１０秒の刺激間間隔（ＩＳＩ）で繰り返され、好ましくは、少なくとも１つの超音波刺激は、超音波信号のバーストである。
【0015】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、マルチ周波超音波刺激である。
【0016】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激が、複数の場所で同時に集束されるか、少なくとも１つの超音波刺激が、超音波刺激の全持続時間内において異なる場所で連続的に集束されるいくつかの超音波ビームから構成されるか、または少なくとも１つの超音波刺激が、複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンである。
【0017】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波素子は、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの範囲、好ましくは約１５ＭＨｚの中心周波数を有する超音波刺激トランスデューサーである。
【0018】
一実施形態では、神経細胞またはその伸長は、視覚皮質、前前頭皮質、知覚皮質、運動皮質、聴覚皮質、ブローカ野、ウェルニッケ野および連合野などの皮質領域；または大脳基底核、視床、視床下部、脳幹、海馬、扁桃体を含む皮質下領域；または脊髄内にあるか、または神経細胞が網膜、前庭、または蝸牛内にある。一実施形態では、神経細胞は、視覚皮質の皮質ニューロン、外側膝状体核のニューロン、または網膜神経節細胞である。
【0019】
一実施形態では、本システムは、対象において画像の視覚を誘導するためのものであり、好ましくは、対象は視覚機能障害を有し、より好ましくは、視覚機能障害は、糖尿病性網膜症、視神経症、緑内障または外傷に起因する。
【0020】
一実施形態では、システムは、
－画像または視覚情報を取得するための取得モジュール（Ｂ）と、
－画像または視覚情報を出力として電気信号に変換するように構成された処理モジュール（Ｃ）と、をさらに備え、電気信号は、複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンを放出するためにモジュール（Ａ）に送信される。
－画像または視覚情報を取得するための取得モジュール（Ｂ）と、
－画像または視覚情報を出力として電気信号に変換するように構成された処理モジュール（Ｃ）と、をさらに備え、電気信号は、複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンを放出するためにモジュール（Ａ）に送信される。
【0021】
一実施形態では、機械受容チャネルは、Ｐｉｅｚｏチャネル、ＭｓｃＬ（大コンダクタンス機械受容チャネル）、およびＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子）チャネルを含むかまたはこれらからなる群から選択され、好ましくは機械受容チャネルは、ＭｓｃＬであり、より好ましくはＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓであり、かつ任意により、機械受容チャネルは、レポータータンパク質、好ましくは細胞質可溶性タンパク質、より好ましくはｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質に融合される。
【0022】
本発明はまた、対象における画像の視覚を誘導するための少なくとも１つの超音波刺激の使用にも関し、
ここで、対象は、機械受容チャネルを発現する神経細胞を含み、
超音波刺激は、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数、好ましくは約１５ＭＨｚの中心周波数の範囲であり、
神経細胞は、視覚皮質の皮質ニューロン、外側膝状体核のニューロン、または網膜神経節細胞である。
ここで、対象は、機械受容チャネルを発現する神経細胞を含み、
超音波刺激は、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数、好ましくは約１５ＭＨｚの中心周波数の範囲であり、
神経細胞は、視覚皮質の皮質ニューロン、外側膝状体核のニューロン、または網膜神経節細胞である。
【0023】
一実施形態では、対象は、好ましくは糖尿病性網膜症、視神経症、緑内障または外傷に起因する視覚機能障害を呈する。
【0024】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約０．０１～約２ＭＰａに含まれるピーク音圧、および約０．１～約２００ｍｓに含まれる超音波処理持続時間を有し、約０．００１～約１０秒の刺激間間隔（ＩＳＩ）で繰り返され、好ましくは、少なくとも１つの超音波刺激は、超音波信号のバーストである。
【0025】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、マルチ周波超音波刺激である、および／または少なくとも１つの超音波刺激は、集束されておらず、好ましくは、少なくとも１つの超音波刺激は、複数の場所で同時に集束され、超音波刺激の全持続時間内において異なる場所で連続的に集束されるいくつかの超音波ビームで構成されているか、複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンである。
【0026】
一実施形態では、機械受容チャネルは、Ｐｉｅｚｏチャネル、ＭｓｃＬ（大コンダクタンス機械受容チャネル）、およびＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子）チャネルを含むかまたはこれらからなる群から選択され、好ましくは機械受容チャネルは、ＭｓｃＬであり、より好ましくはＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓであり、かつ任意により、機械受容チャネルは、レポータータンパク質、好ましくは細胞質可溶性タンパク質、より好ましくはｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質に融合される。
【0027】
本発明はさらに、対象の神経細胞を形質導入する際に使用し、それにより、それを必要とする対象における感覚欠損を回復させるための機械受容チャネルをコードする核酸配列を含むベクターに関し、ここで、対象は、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数の範囲の少なくとも１つの超音波刺激にさらに曝露されるか、または治療される。
【0028】
本発明はさらに、対象において神経細胞を可逆的に刺激するための方法に関し、方法は、
（ｉ）神経細胞中で外因性機械受容チャネルを発現させることと、
（ｉｉ）外因性機械受容チャネルを発現する神経細胞を、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数の範囲の少なくとも１つの超音波刺激、好ましくは約１５ＭＨｚの中心周波数の少なくとも１つの超音波刺激に曝露することと、を含む。
（ｉ）神経細胞中で外因性機械受容チャネルを発現させることと、
（ｉｉ）外因性機械受容チャネルを発現する神経細胞を、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数の範囲の少なくとも１つの超音波刺激、好ましくは約１５ＭＨｚの中心周波数の少なくとも１つの超音波刺激に曝露することと、を含む。
【0029】
一実施形態では、ステップ（ｉ）は、機械受容チャネルをコードする核酸配列を含むベクターを神経細胞に形質導入し、それによって神経細胞による外因性機械受容チャネルの発現を誘導するステップを含む。
【0030】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約０．０１～約２ＭＰａに含まれるピーク音圧、および約０．１～約２００ｍｓの超音波処理持続時間（ＳＤ）を有し、約０．００１～約１０秒の刺激間間隔（ＩＳＩ）で繰り返される。
【0031】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、超音波信号のバーストである。
【0032】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、マルチ周波超音波刺激である。
【0033】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、異なる空間場所に集束する異なる周波数を有するマルチ周波超音波刺激である。
【0034】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、集束されていない。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、複数の場所で同時に集束される。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、超音波刺激の全持続時間内で異なる場所に連続的に集束させるいくつかの超音波ビームから構成される。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンである。
【0035】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、少なくとも１つの超音波素子を有する超音波アレイを含むモジュール（Ａ）によって放出される。
【0036】
一実施形態では、神経細胞またはその伸長は、視覚皮質、前前頭皮質、知覚皮質、運動皮質、聴覚皮質、ブローカ野、ウェルニッケ野および連合野などの皮質領域；または大脳基底核、視床、視床下部、脳幹、海馬、扁桃体を含む皮質下領域；または脊髄内にあるか、または神経細胞が網膜、蝸牛、または前庭内にある。一実施形態では、神経細胞は、視覚皮質の皮質ニューロン、外側膝状体核のニューロン、または網膜神経節細胞である。
【0037】
一実施形態では、方法は、対象における画像の視覚を誘導するためのものである。一実施形態では、本方法は、視覚機能障害を有する対象において画像の視覚を誘導するためのものである。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、画像情報の符号化から得られる複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンである。一実施形態では、視覚障害は、糖尿病性網膜症、緑内障、視神経症または外傷に起因する。
【0038】
一実施形態では、機械受容チャネルは、Ｐｉｅｚｏチャネル、ＭｓｃＬ（大コンダクタンス機械受容チャネル）およびＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子）チャネルを含むかまたはこれらからなる群から選択される。一実施形態では、機械受容チャネルは、ＭｓｃＬ、好ましくはＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓである。一実施形態では、例えばＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓなどの機械受容チャネルは、例えば細胞質可溶性タンパク質などのレポータータンパク質に、優先的にｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質に融合される。
【0039】
一実施形態では、外因性機械受容チャネルをコードする組換え核酸は、神経細胞に導入されるか、または導入された。
【0040】
一実施形態では、機械受容チャネルをコードするベクターまたは組換え核酸は、細胞型特異的プロモーター、好ましくはニューロン特異的プロモーターを含み、より好ましくは、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、ＣＡＭＫＩＩプロモーター、ＳＮＣＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、シナプシンＩプロモーター、およびＥＦ－１ａプロモーターを含むかまたはこれらからなる群から選択される。一実施形態では、機械受容チャネルをコードするベクターまたは組換え核酸は、原形質膜、より好ましくはＫｉｒ２．１への発現を駆動するＥＲ輸出シグナルを含む。
【0041】
一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであり、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルスおよび単純ヘルペスウイルスからなる群から選択される。一実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５およびＡＡＶ９血清型を含むかまたはこれらからなる群から選択されるＡＡＶであり、より好ましくはベクターは、ＡＡＶ９またはＡＡＶ２である。一実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ１－７ｍ８、ＡＡＶ２－７ｍ８、ＡＡＶ５－７ｍ８およびＡＡＶ９－７ｍ８血清型を含むかまたはこれらからなる群から選択され、好ましくはベクターは、ＡＡＶ９－７ｍ８またはＡＡＶ２－７ｍ８である。一実施形態では、ベクターは、ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＣａｍＫＩＩプロモーターに融合されたＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓをコードする核酸配列を含むＡＡＶ９－７ｍ８である。
【0042】
一実施形態では、機械受容チャネルをコードする組換え核酸は、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスを含むかまたはこれらからなる群から選択されるウイルスによる感染によって、細胞に導入されるか、または導入されたものであり、好ましくは、ウイルスは、ＡＡＶである。
【0043】
本発明はさらに、任意によりレポータータンパク質、プロモーター、および任意により小胞体輸出シグナルに融合された、機械受容チャネルをコードする核酸配列を含むベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはＡＡＶベクターに関する。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５およびＡＡＶ９血清型を含むかまたはこれらからなる群から選択されるＡＡＶベクターであり、より好ましくは、ベクターは、ＡＡＶ９またはＡＡＶ２である。一実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ１－７ｍ８、ＡＡＶ２－７ｍ８、ＡＡＶ５－７ｍ８およびＡＡＶ９－７ｍ８血清型を含むかまたはこれらからなる群から選択され、好ましくはベクターは、ＡＡＶ９－７ｍ８またはＡＡＶ２－７ｍ８である。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＣａｍＫＩＩプロモーターに融合されたＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓをコードする核酸配列を含むＡＡＶ９－７ｍ８である。
【0044】
定義
数字の前の「約」は、その数字の値のプラスマイナス１０％を意味する。
数字の前の「約」は、その数字の値のプラスマイナス１０％を意味する。
【0045】
「チャープ」とは、周波数が時間とともに増加（「アップチャープ」）または減少（「ダウンチャープ」）する信号を指す。
【0046】
「嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子」（ＣＦＴＲ）は、嚢胞性線維症に関連する陰イオンおよび細胞内リガンド依存性チャネルを指す。ＣＦＴＲは、膜の引張によって活性化する。
【0047】
「皮質領域」とは、大脳の灰白質の入り組んだ表層内にある大脳皮質の空間的に限定された構成単位を指す。皮質領域には、これらに限定されないが、前前頭皮質、視覚皮質、知覚皮質、運動皮質、聴覚皮質、ブローカ野、ウェルニッケ野および連合野が含まれる。
【0048】
「欠損」とは、精神的または身体的機能の欠如または障害を指す。「感覚欠損」という用語は、視覚、聴覚、触覚、味覚などの主要な感覚のうちの１つの問題、または複数の感覚の問題を含み得る、幅広い症状の組み合わせ（ａｒｒａｎｇｅ）を含む。
【0049】
「イベント」とは、ある状況の変化を指す。
【0050】
「機能的磁気共鳴画像法」または「ｆＭＲＩ」とは、磁気共鳴（ＭＲ）技術を使用して、神経血管結合の結果から局所的な脳神経細胞の活性化を画像化する技術を指す。
【0051】
「機能的超音波イメージング法」または「ｆＵＳイメージング法」は、超音波技術を使用して、神経血管結合の結果から局所的な脳神経細胞の活性化を画像化する技術を指す。
【0052】
「機能的近赤外顕微鏡法」または「ｆＮＩＲＳ」は、近赤外分光法技術を使用して、神経血管結合の結果から局所的な脳神経細胞の活性化を画像化する技術を指す。
【0053】
「同一性」または「同一である」は、２つ以上のアミノ酸配列の配列間の関係で使用する場合、２つ以上のアミノ酸残基のストリング間の一致数によって決定される、アミノ酸配列間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって指定されたギャップアラインメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうちの小さい方の間の同一の一致の割合（パーセント）を測定する。関連するアミノ酸配列の同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。このような方法としては、これらに限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載のものが挙げられる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験対象の配列間で最大の一致が得られるように設計されている。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムに記述されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ、例えば、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．＼２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０（１９９０））などが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，上記）から公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して、同一性を決定することもできる。
【0054】
「機械受容チャネル」とは、脂質二重層内の触覚、聴覚、鶏鳴（ｃｒｏｗｉｎｇ）、引張、および細胞容積などの機械的刺激に応答するイオンチャネルのクラスを指す。
【0055】
「大コンダクタンス機械受容チャネル」（ＭｓｃＬ）は、膜の引張に応答して開く、細菌中で同定された膜貫通チャネルタンパク質のファミリーを指す。ＭｓｃＬは、陰イオンおよび陽イオンの両方に対して非選択的であり、大きいユニタリーコンダクタンス（約３ｎＳ）を有する大きい非選択的チャネル（直径３０～４０Ａ（オングストローム））を形成する。チャネル構造に関して、大腸菌由来のＭｓｃＬは、５つの同一のサブユニットのそれぞれ中に１３６のアミノ酸を含む。
【0056】
タンパク質の「ネイティブ形態」、「オリジナル形態」または「野生型形態」は、その天然の、未変異（未変化）形態のタンパク質を指す。したがって、「ネイティブ」、「オリジナル」または「野生型」タンパク質は、天然由来（例えば、任意の種由来）のタンパク質と同じアミノ酸配列を有するものである。そのようなネイティブタンパク質は、天然から単離することができるか、または組換えもしくは合成手段によって産生することができる。本明細書で使用されるタンパク質バリアントという用語は、典型的には、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において、本明細書で具体的に開示されるタンパク質（例えば、機械受容チャネル）とは異なるタンパク質である。そのようなバリアントは、天然に存在し得るか、または、例えば、本発明の配列のうちの１つ以上を修飾することによって、および本明細書に記載のタンパク質の１つ以上の生物学的活性を評価することによって、および／または当技術分野において周知である複数の技術のうちのいずれかを使用することによって合成により生成され得る。本発明のタンパク質の構造に改変を加えても、望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体タンパク質をコードする機能分子を得ることができる。タンパク質のアミノ酸配列を改変して、本発明のタンパク質の同等の、またはさらに改善されたバリアントまたは領域を作製することが望まれる場合、当業者は、典型的には、コードするＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変更する。例えば、特定のアミノ酸は、その生物学的機能活性を感知できるほど喪失することなく、タンパク質構造内の他のアミノ酸に置換されてもよい。特定のアミノ酸配列置換は、タンパク質配列、および当然のことながらその基礎となるＤＮＡコード配列中で行われ得、それにもかかわらず、同様の性質を有するタンパク質を得ることができる。したがって、それらの生物学的有用性または活性を感知できるほど喪失することなく、本開示の組成物のアミノ酸配列、または上記タンパク質をコードする対応するＤＮＡ配列に様々な変更を加え得ることが企図される。多くの場合、タンパク質バリアントは、１つ以上の保存的置換を含むであろう。「保存的置換」は、アミノ酸が同様の性質を有する別のアミノ酸に置換される置換であり、これは、ペプチド化学の当業者であれば、タンパク質の二次構造およびハイドロパシー特性が実質的に変化しないことが予想されるであろう。このため、上記のとおり、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。前述の特徴のいくつかを考慮に入れた例示的な置換は、当業者に周知であり、アルギニンとリジン、グルタメートとアスパラギン酸、セリンとスレオニン、グルタミンとアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。アミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質の類似性に基づいてさらに行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ、同様の親水性値を有する非電荷極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、およびバリン；グリシンとアラニン；アスパラギンとグルタミン；セリン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシンが挙げられる。保存的変更を表す可能性のあるアミノ酸の他の基としては、以下が挙げられる：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。またあるいは代替的にはバリアントには、非保存的変更が含まれてもよい。好ましい実施形態では、バリアントタンパク質は、５個以下のアミノ酸の置換、欠失、または付加によってネイティブ配列と異なる。バリアントはまた（または代替的に）、例えば、タンパク質の二次構造およびハイドロパシー特性に最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって修飾され得る。
【0057】
「Ｐｉｅｚｏファミリー」は、機械的力によって直接ゲート制御される興奮性イオンチャネルのファミリーを指す。これらのイオンチャネルは、細胞のメカノトランスダクションに関与しており、すなわち、機械力を生体信号に変換する。ほとんどの脊椎動物は、次の２つのチャネルアイソフォーム：Ｐｉｅｚｏ１およびＰｉｅｚｏ２を有する。
【0058】
「プロモーター」は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）分子内の部位を指し、ここでは、ＲＮＡ（リボ核酸）ポリメラーゼと転写因子が結合して、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写を開始する。プロモーター配列は、典型的には、転写開始部位のすぐ上流または５’末端にある。プロモーター配列は、転写の方向を定義し、どのＤＮＡ鎖が転写されるかを示し、この鎖はセンス鎖として知られている。細胞型特異的プロモーターは、特定の細胞型中でのみ活性を有するプロモーターである。ニューロン特異的プロモーターは、ニューロン中でのみ、または特定の種類のニューロン中でのみ活性を有するプロモーターである。ベクター中の細胞型特異的またはニューロン特異的プロモーターの使用は、望ましくない導入遺伝子の発現を制限するのみでなく、永続的な導入遺伝子の発現を容易にすることができる。
【0059】
「タンパク質」は、１つ以上のペプチドまたはポリペプチド、および任意により非ポリペプチド補因子から形成される機能実体を指す。
【0060】
「ランダムコーダ」とは、瞬時周波数が時間に対してランダムに変化する信号を指す。
【0061】
「組換え核酸」とは、核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を結合することによって構築され、生きている細胞内で複製できる分子を指す。
【0062】
「レポータータンパク質」は、通常はプロモーターによって駆動される、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。レポーター遺伝子は、容易にアッセイされるタンパク質をコードする核酸配列である。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光レポーター遺伝子を目的のタンパク質に融合させることにより、生細胞および組織中でのタンパク質の場所およびトラフィキングを観察することができる。
【0063】
「回復」とは、正常または健康な状態に戻す行為を指す。回復は、部分的（すなわち、対象が正常または健康な状態には至らない状態に戻った場合）または全体的（すなわち、対象が正常または健康な状態と同一またはほぼ同一の状態に戻った場合）であり得る。
【0064】
「網膜」とは、眼の裏側を覆い、光を感知し、視神経を通って脳に伝わるインパルスを生成する神経層を指す。
【0065】
「網膜神経節細胞」とは、網膜の内側表面（神経節細胞層）付近にある神経細胞の一種である。双極細胞、水平細胞、およびアマクリン細胞の３つの主要な中間ニューロンタイプを介して光受容体から視覚情報を受け取る。
【0066】
「センサー」とは、視覚、聴覚、触覚、嗅覚、および味覚の五感のいずれかによって一般的に検出される刺激を受信するデバイスを指す。
【0067】
「感覚能力」とは、感覚器官（例えば、眼、耳、舌、鼻、および皮膚）からの入力を正確に受け取る感覚器官の能力を指す。
【0068】
「皮質下領域」とは、大脳皮質の下の構造を指す。皮質下構造は、脳の表面を見たときに見えず、これらに限定されないが、大脳基底核（線条体、淡蒼球、腹側淡蒼球、黒質および視床下核）、視床、視床下部、脳幹、海馬および扁桃体が挙げられる。
【0069】
「対象」とは、温血動物、好ましくは哺乳動物対象、より好ましくはヒトを指す。目的の非ヒト哺乳動物の対象として、非限定的に、ペット、例えば、イヌ、ネコ、モルモット；経済的に重要な動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サルを挙げることができる。一実施形態では、対象は、「患者」、すなわち、対象は、医療が施されるのを待機している、または医療を受けている、または医療行為の対象である／対象となる、または疾患、障害または状態の発症について監視される。別の実施形態では、対象は、健康な個体である。
【0070】
「トランスジェニック法」とは、外来（組換え）核酸を宿主生物のゲノムに導入する方法を指す。レシピエントに移入される外来核酸または「導入遺伝子」は、同種の他の個体から、または無関係の種からのものでさえあり得る。
【0071】
「非集束」超音波刺激、好ましくは超音波信号のバーストに言及する場合、１つの焦点のみに集束されていない超音波刺激を指す（集束超音波刺激は、刺激、好ましくは超音波信号のバーストの全持続時間において１つの焦点のみを有する超音波刺激である）。本発明の意味の範囲内で、非集束超音波刺激、好ましくは超音波信号の非集束バーストは、これらに限定されないが、以下の構成を含む：超音波刺激は、複数の場所で同時に集束させ得（すなわち、多集束刺激）、超音波刺激は、超音波刺激の全持続時間内に異なる場所に連続的に集束したいくつかの超音波ビームからなる、または超音波刺激は、任意の種類の複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンであり得る。
【0072】
「血管超音波」とは、高周波数の音波を用いて画像を作成し、血管を通る血流の速度を検出する技術を指す。超音波画像は、全身での血栓および狭窄血管を検出するために使用できる。
【0073】
「ウイルスベクター」は、遺伝子送達ビヒクルとして機能し、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）キャプシド内にパッケージングされた組換えウイルスゲノムを含む非野生型組換えウイルス粒子を指すことを意図している。特定のタイプのウイルスベクターは、「組換えアデノ随伴ウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター」であり得る。
【0074】
「ウイルス」とは、動物、植物、または細菌の生きている細胞中でのみ増殖できる、サイズが小さく単純な組成の感染性病原体を指す。ウイルス粒子は、タンパク質シェルまたはキャプシド内に収容されたゲノムを含む。ウイルスのゲノムは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡからなり得、線状または環状の形態であり得る。レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、および単純ヘルペスウイルスなどのウイルスは、ニューロンなどの細胞に遺伝子を導入するために使用される。
【0075】
「超音波刺激」とは、音圧波の形態での刺激を指す。本発明では、超音波刺激がニューロンに送達され、少なくとも１つのエレメントのセットから構成されるトランスデューサーアレイで生成される。
【発明を実施するための形態】
【0076】
本発明は、対象において神経細胞を可逆的に刺激するための方法に関し、本方法は、機械受容チャネル（好ましくは外因性機械受容チャネル）を発現する神経細胞を、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数の範囲の少なくとも１つの超音波刺激に曝露することを含む。
【0077】
一実施形態では、対象において神経細胞を可逆的に刺激するための方法は、
（ｉ）神経細胞中で外因性機械受容チャネルを発現させることと、
（ｉｉ）機械受容チャネルを発現する神経細胞を、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数の範囲の少なくとも１つの超音波刺激に曝露することと、を含む。
（ｉ）神経細胞中で外因性機械受容チャネルを発現させることと、
（ｉｉ）機械受容チャネルを発現する神経細胞を、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数の範囲の少なくとも１つの超音波刺激に曝露することと、を含む。
【0078】
一実施形態では、ステップ（ｉ）は、機械受容チャネルをコードする核酸配列を含むベクターを神経細胞に形質導入し、それによって神経細胞による外因性機械受容チャネルの発現を誘導するステップを含む。
【0079】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約５～約１８ＭＨｚの中心周波数の範囲、例えば、約１２～約１６ＭＨｚの中心周波数である。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約４ＭＨｚ、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ＭＨｚの中心周波数のものである。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約１５ＭＨｚの中心周波数のものである。
【0080】
一実施形態では、神経細胞またはそれらの伸長（シナプス終末）は、皮質領域内にある。
【0081】
皮質領域の例としては、これらに限定されないが、視覚皮質、前前頭皮質、知覚皮質、運動皮質、聴覚皮質、ブローカ野、ウェルニッケ野および連合野が挙げられる。したがって、一実施形態では、神経細胞またはそれらの伸長は、視覚皮質、前前頭皮質、知覚皮質、運動皮質、聴覚皮質、ブローカ野、ウェルニッケ野および連合野内にある。
【0082】
一実施形態では、神経細胞またはそれらの伸長（シナプス終末）は、皮質下領域内にある。
【0083】
皮質下領域の例としては、これらに限定されないが、大脳基底核、視床、視床下部、脳幹、海馬、および扁桃体が挙げられる。したがって、一実施形態では、神経細胞またはそれらの伸長は、大脳基底核、視床、視床下部、脳幹、海馬および扁桃体中にある。一実施形態では、神経細胞またはその伸長は、脳幹内にある。
【0084】
一実施形態では、神経細胞は、網膜内にある。
【0085】
一実施形態では、神経細胞は、蝸牛内にある。一実施形態では、神経細胞は、前庭内にある。
【0086】
一実施形態では、神経細胞またはその伸長（シナプス終末）は脊髄内にある。
【0087】
一実施形態では、神経細胞またはその伸長（シナプス終末）は、視覚皮質内にある。一実施形態では、神経細胞は、視覚皮質の皮質ニューロンである。
【0088】
一実施形態では、神経細胞またはそれらの伸長（シナプス終末）は、外側膝状体核内にある。一実施形態では、神経細胞は、外側膝状体核のニューロンである。
【0089】
一実施形態では、神経細胞は、網膜神経節細胞である。
【0090】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約０．０１～約２ＭＰａ、好ましくは約０．５～約２ＭＰａ、より好ましくは約０．１～２ＭＰａに含まれるピーク音圧を有する。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約０．１１～約１．６ＭＰａ、より好ましくは約０．２～約１．４ＭＰａに含まれるピーク音圧を有する。
【0091】
一実施形態では、少なくとも１回の超音波刺激は、約０．１～約２００ｍｓ、好ましくは約１～約１００ｍｓ、より好ましくは約５～約５０ｍｓに含まれる超音波処理持続時間（ＳＤ）を有する。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約１０～約２００ｍｓに含まれる超音波処理持続時間を有する。
【0092】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激が繰り返される。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約０．００１～約１０秒、好ましくは０．０１～約５秒、より好ましくは約０．０１～約２秒の刺激間間隔（ＩＳＩ）で繰り返される。
【0093】
一実施形態では、少なくとも１回の超音波刺激は、約０．０１～約２ＭＰａに含まれるピーク音圧、および約０．１～約２００ｍｓに含まれる超音波処理持続時間を有し、ここで、超音波刺激は、約０．００１～約１０秒の刺激間間隔（ＩＳＩ）で繰り返される。
【0094】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約１ｋＨｚのパルス繰り返し周波数（ＰＲＦ）を有する。
【0095】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約５０％のデューティサイクル（ＤＣ）を有する。
【0096】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、超音波信号のバーストである。
【0097】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、マルチ周波超音波刺激、すなわち、多様な超音波周波数によって構成される超音波刺激である。一実施形態では、マルチ周波超音波刺激は、異なる空間場所において集束する異なる周波数を有する。
【0098】
一実施形態では、マルチ周波超音波刺激により、短パルス信号、チャープ、またはランダムコーダの高速繰り返しが可能になる。
【0099】
一実施形態では、マルチ周波超音波刺激により、例えば、より高い周波数で皮質の上層内の脳表面近くに集束させる、およびより低い周波数で皮質または皮質下領域のより深い層内の脳のより深い場所で集束させるなど、異なる場所で異なる周波数の空間的集束が可能になる。
【0100】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、集束されていない。
【0101】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、複数の場所で同時に集束させる。本発明の意味の範囲内で、「複数の場所」という用語は、少なくとも２つの場所（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１００を超える場所）を指す。したがって、一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、多集束超音波刺激である。
【0102】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、超音波刺激の全持続時間内で異なる場所に連続的に集束させるいくつかの超音波ビームから構成され、好ましくは、超音波信号のバーストである。
【0103】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンである。一実施形態では、複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンは、寸法が超音波波長よりも大きい、目的である大きい領域に超音波を照射する。
【0104】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、例えば、視覚、聴覚、嗅覚、平衡感覚、触覚または味覚情報などの感覚情報の符号化から得られる。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、視覚情報の符号化から得られ、それによって、複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンを生成する。
【0105】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、本明細書に記載のモジュール（Ａ）で放出される。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、少なくとも１つの超音波素子を有する超音波アレイを含むモジュール（Ａ）によって放出される。
【0106】
一実施形態では、刺激を受ける神経細胞は、外因性機械受容チャネルを発現する。
【0107】
一実施形態では、刺激を受ける神経細胞は、細胞体（ｃｅｌｌ ｂｏｄｙ）（または細胞体（ｓｏｍａ））、伸長（またはシナプス終末）、または両方の領域で機械受容チャネルを発現する。したがって、一実施形態では、刺激を受ける神経細胞は、細胞体レベル、シナプス終末レベル、またはその両方のレベルで刺激を受ける。
【0108】
一実施形態では、機械受容チャネルは、神経細胞に対して非毒性であり、すなわち、神経細胞によるその発現は、細胞の生存に影響を及ぼさない。
【0109】
一実施形態では、機械受容チャネルは、例えば、Ｐｉｅｚｏ１などのＰｉｅｚｏファミリーに由来する哺乳動物の機械受容チャネルである。
【0110】
一実施形態では、機械受容チャネルは、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子）チャネルである。
【0111】
一実施形態では、機械受容チャネルは、ＭｓｃＬ（大コンダクタンス細菌機械受容イオンチャネル）ファミリーからのチャネルである。
【0112】
一実施形態では、機械受容チャネルは、Ｐｉｅｚｏチャネル、ＭｓｃＬ（大コンダクタンス機械受容チャネル）およびＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子）チャネルを含むかまたはこれらからなる群から選択される。
【0113】
一実施形態では、機械受容チャネルは、ＭｓｃＬの野生型形態（オリジナル形態またはネイティブ形態とも呼ばれ得る）である。一実施形態では、機械受容チャネルは、大腸菌由来の野生型形態のＭｓｃＬ（配列番号１）である。
配列番号：１
MASIIKEFREFAMRGNVVDLAVGVIIGAAFGKIVSSLVADIIMPPLGLLIGGIDFKQFAVTLRDAQGDIPAVVMHYGVFIQNVFDFLIVAFAIFMAIKLINKLNRKKEEPAAAPAPTKEEVLLTEIRDLLKEQNNRSASLVP
配列番号：１
MASIIKEFREFAMRGNVVDLAVGVIIGAAFGKIVSSLVADIIMPPLGLLIGGIDFKQFAVTLRDAQGDIPAVVMHYGVFIQNVFDFLIVAFAIFMAIKLINKLNRKKEEPAAAPAPTKEEVLLTEIRDLLKEQNNRSASLVP
【0114】
一実施形態では、機械受容チャネルは、ＭｓｃＬの変異形態である。一実施形態では、機械受容チャネルは、大腸菌由来のＭｓｃＬの変異形態である。一実施形態では、機械受容チャネルは、ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓ（配列番号２）である。本発明の意味の範囲内で、ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓは、２２位の残基グリシン（配列番号１中の残基２３に対応する）がセリン残基に置換されている、ＭｓｃＬの変異形態である。
配列番号：２
MASIIKEFREFAMRGNVVDLAVSVIIGAAFGKIVSSLVADIIMPPLGLLIGGIDFKQFAVTLRDAQGDIPAVVMHYGVFIQNVFDFLIVAFAIFMAIKLINKLNRKKEEPAAAPAPTKEEVLLTEIRDLLKEQNNRSASLVP
配列番号：２
MASIIKEFREFAMRGNVVDLAVSVIIGAAFGKIVSSLVADIIMPPLGLLIGGIDFKQFAVTLRDAQGDIPAVVMHYGVFIQNVFDFLIVAFAIFMAIKLINKLNRKKEEPAAAPAPTKEEVLLTEIRDLLKEQNNRSASLVP
【0115】
ＭｓｃＬの野生型または変異形態のタンパク質バリアントも本発明に含まれる。
【0116】
一実施形態では、ＭｓｃＬの野生型形態のタンパク質バリアントは、ＭｓｃＬのアミノ酸配列（配列番号１）と少なくとも７０％、７５％、８０％；８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する。
【0117】
一実施形態では、ＭｓｃＬの変異形態のタンパク質バリアントは、ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓのアミノ酸配列（配列番号２）と少なくとも７０％、７５％、８０％；８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する。
【0118】
一実施形態では、例えばＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓなどの機械受容チャネルは、細胞質可溶性タンパク質などのレポータータンパク質に融合される。レポータータンパク質の例としては、タンデム二量体トマト（ｔｄＴｏｍａｔｏ）、イソギンチャク（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、増強型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）が挙げられる。
【0119】
一実施形態では、例えばＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓなどの機械受容チャネルは、ｔｄＴｏｍａｔｏ（配列番号３）に融合されている。
配列番号：３
MVSKGEEVIKEFMRFKVRMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGLVTVTQDSSLQDGTLIYKVKMRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPRDGVLKGEIHQALKLKDGGRYLVEFKTIYMAKKPVQLPGYYYVDTKLDITSHNEDYTIVEQYERSEGRHHLFLGHGTGSTGSGSSGTASSEDNNMAVIKEFMRFKVRMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGLVTVTQDSSLQDGTLIYKVKMRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPRDGVLKGEIHQALKLKDGGHYLVEFKTIYMAKKPVQLPGYYYVDTKLDITSHNEDYTIVEQYERSEGRHHLFLYGMDELYK
配列番号：３
MVSKGEEVIKEFMRFKVRMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGLVTVTQDSSLQDGTLIYKVKMRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPRDGVLKGEIHQALKLKDGGRYLVEFKTIYMAKKPVQLPGYYYVDTKLDITSHNEDYTIVEQYERSEGRHHLFLGHGTGSTGSGSSGTASSEDNNMAVIKEFMRFKVRMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGLVTVTQDSSLQDGTLIYKVKMRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPRDGVLKGEIHQALKLKDGGHYLVEFKTIYMAKKPVQLPGYYYVDTKLDITSHNEDYTIVEQYERSEGRHHLFLYGMDELYK
【0120】
一実施形態では、外因性機械受容チャネルの発現を誘導するために、機械受容チャネルをコードする組換え核酸が神経細胞に導入されるか、または導入されている。一実施形態では、組換え核酸を神経細胞に導入するステップは、本発明の方法の一部ではない。
【0121】
一実施形態では、機械受容チャネルをコードする組換え核酸は、細胞型特異的プロモーター、好ましくはニューロン特異的プロモーターを含む。
【0122】
一実施形態では、機械受容チャネルをコードする組換え核酸は、皮質ニューロンに特異的なプロモーターを含む。
【0123】
一実施形態では、機械受容チャネルをコードする組換え核酸は、網膜神経節細胞に特異的なプロモーターを含む。
【0124】
一実施形態では、機械受容チャネルをコードする組換え核酸は、外側膝状体核のニューロンに特異的なプロモーターを含む。
【0125】
本発明で使用できるプロモーターの例としては、限定されないが、ＣＡＧ（ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン）プロモーター、ＣＡＭＫＩＩ（カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ）プロモーター、ＳＮＣＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、シナプシンＩプロモーター、およびＥＦ－１ａプロモーターが挙げられる。
【0126】
一実施形態では、機械受容チャネルをコードする組換え核酸は、ＣａｍＫＩＩプロモーター、ＣＡＧプロモーター、およびＳＮＣＧプロモーターを含むかまたはこれらからなる群から選択されるプロモーターを含む。
【0127】
一実施形態では、機械受容チャネルをコードする組換え核酸は、小胞体（ＥＲ）輸出シグナルを含む。一実施形態では、機械受容チャネルをコードする組換え核酸は、Ｋｉｒ２．１ ＥＲ輸出シグナルを含む。
【0128】
一実施形態では、機械受容チャネルをコードする組換え核酸は、トランスジェニック法によって神経細胞に導入されるか、または以前に導入されている。
【0129】
一実施形態では、機械受容チャネルをコードする組換え核酸は、ウイルスによる感染によって神経細胞に導入されるか、または以前に導入されている。
【0130】
本発明に好適であるウイルスの例としては、限定されないが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスが挙げられる。
【0131】
一実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶである。一実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５およびＡＡＶ９血清型を含むか、またはこれらからなる群から選択されるＡＡＶである。一実施形態では、ウイルスは、例えばＡＡＶ９血清型またはＡＡＶ２血清型などのＡＡＶである。
【0132】
一実施形態では、ウイルスは、７ｍ８変異を含む。したがって、一実施形態では、ウイルスは、ＡＡＶ１－７ｍ８、ＡＡＶ２－７ｍ８、ＡＡＶ５－７ｍ８およびＡＡＶ９－７ｍ８血清型を含むかまたはこれらからなる群から選択されるＡＡＶであり、好ましくは、ＡＡＶは、ＡＡＶ２－７ｍ８またはＡＡＶ９－７ｍ８である。
【0133】
一実施形態では、前述のウイルスは、例えば頭蓋手術（定位固定）などによって対象の脳内に導入されるか、または以前に導入されている。一実施形態では、ウイルスは、対象の脳の特定の領域内に導入されるか、または以前に導入されている。一実施形態では、ウイルスは、血液脳関門（ＢＢＢ）を局所的に透過性にし、血管新生にウイルスを注入するために、この領域内に超音波ビームを集束させることによって、対象の脳の特定の領域内に導入されるか、または以前に導入されている。したがって、一実施形態では、ウイルスは、血管新生内への注入によって特定の領域に導入されるか、または以前に導入されている。
【0134】
一実施形態では、機械受容チャネルをコードする組換え核酸は、トランスフェクションによって神経細胞に導入されるか、または以前に導入されている。
【0135】
トランスフェクションのために本発明で使用できる試薬の例としては、これらに限定されないが、ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔ ＰＥＩ（例えば、ｃＧＭＰ ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔ ＰＥＩ）（ポリプラストランスフェクション）が挙げられる。
【0136】
一実施形態では、機械受容チャネルをコードする組換え核酸およびトランスフェクションに必要な試薬（複数可）は、頭蓋手術（定位固定）によって対象の脳に導入されるか、または以前に導入されている。一実施形態では、機械受容チャネルをコードする組換え核酸およびトランスフェクションに必要な試薬（複数可）は、対象の脳の特定の領域内に導入されるか、または以前に導入されている。
【0137】
したがって、本発明は、組織の加温および出血を誘導することなく、神経細胞を特異的に刺激するという利点を提示する。
【0138】
本発明はまた、視覚回復に適合する時空間分解能で神経細胞を刺激するという利点を提示する。
【0139】
特に、本発明の方法では、制限領域内で神経細胞を刺激することが可能になる。一実施形態では、本発明の方法では、約０．０１～約１ｍｍ２、好ましくは約０．０１～約０．１ｍｍ２の制限領域内で神経細胞を刺激することが可能になる。
【0140】
一実施形態では、本発明の方法では、約１ｍｍ２未満、好ましくは約０．５０ｍｍ２未満、好ましくは約０．２０ｍｍ２未満、好ましくは約０．１０ｍｍ２未満の領域内での神経細胞の刺激が可能になる。
【0141】
一実施形態では、本発明の方法では、約１ｍｍ２、約０．９０ｍｍ２、約０．８０ｍｍ２、約０．７０ｍｍ２、約０．６０ｍｍ２、約０．５０ｍｍ２、約０．４０ｍｍ２、約０．３０ｍｍ２、約０．２０ｍｍ２、約０．１０ｍｍ２、または約０．０５ｍｍ２の領域内での神経細胞の刺激が可能になる。
【0142】
一実施形態では、本発明の方法では、約０．１６ｍｍ２の領域内での神経細胞の刺激が可能になる。一実施形態では、本発明の方法では、約０．３５ｍｍ２の領域内での神経細胞の刺激が可能になる。一実施形態では、本発明の方法では、約０．５８ｍｍ２の領域内での神経細胞の刺激が可能になる。
【0143】
一実施形態では、本発明の方法では、約１０ｍｓ程度で神経細胞の刺激が可能になる。一実施形態では、本発明の方法で、約１～５０ｍｓ程度、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍｓ、または約２０、３０、４０または５０ｍｓの時間分解能で神経細胞を刺激することが可能になる。
【0144】
さらに、例えば、パターン化された超音波刺激（例えば、超音波アレイを使用する）などの非集束超音波刺激を使用する場合には、高い時空間分解能が得られ得る。
【0145】
特に、例えば、多集束超音波刺激、超音波刺激の全持続時間内に異なる場所に連続的に集束させたいくつかの超音波ビームを含む超音波刺激、または複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターン（例えば、超音波アレイを使用して）などの非集束超音波刺激を使用する場合、本発明の方法では、視覚回復に適合する時空間分解能で神経細胞を刺激することができる（図６、図７Ａ～Ｃ）。
【0146】
一実施形態では、本発明の方法は、神経障害を治療するためのものであり、この治療には、正確な皮質および／または皮質下刺激が必要である。
【0147】
治療のために正確な皮質および皮質下刺激を必要とする神経障害の例としては、これらに限定されないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、糖尿病、重度のうつ病、本態性振戦、てんかん、統合失調症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、認知症、神経痛、筋ジストロフィー、神経筋疾患、強迫性障害、発作、慢性疲労症候群、脳卒中、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、失語症、疼痛が挙げられる。
【0148】
一実施形態では、本発明の方法は、対象における感覚能力、例えば、視覚、聴覚、平衡感覚、嗅覚、触覚および／または味覚の能力を増強するためのものである。
【0149】
一実施形態では、本発明の方法は、対象における感覚欠損を回復するためのものである。
【0150】
一実施形態では、本発明の方法は、対象における視覚、聴覚、嗅覚、平衡感覚、触覚および／または味覚の欠損を回復させるためのものであり、好ましくは対象における視覚欠損を回復するためのものである。
【0151】
一実施形態では、本発明の方法は、対象における画像の視覚を誘導するためのものである。一実施形態では、対象は、視覚機能障害を有する。本明細書で使用される場合、視覚機能の障害は、スネレン検査など、当業者に周知の検査または方法によって評価することができる。
【0152】
一実施形態では、本発明の方法は、視覚機能障害を有する対象において画像の視覚を回復するためのものである。
【0153】
したがって、一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、画像またはイベントベースの視覚情報の符号化から得るかまたは導出され、それによって、好ましくは、複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンを生成する。
【0154】
一実施形態では、画像、画像の輪郭、またはイベントベースの視覚情報が抽出され、符号化されて、複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンが生成される。
【0155】
一実施形態では、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。一実施形態では、対象は、雄である。別の実施形態では、対象は、雌である。
【0156】
一実施形態では、対象は、小児（例えば、１８歳未満の対象）である。
【0157】
一実施形態では、対象は、成人（例えば、１８歳を超える対象）である。
【0158】
一実施形態では、対象は、視覚、聴覚、嗅覚、平衡感覚、触覚および／または味覚の欠損などの感覚能力における障害を有する。
【0159】
一実施形態では、対象は、視覚機能障害を有する。一実施形態では、視覚機能の障害は、対象における眼と脳との接続、すなわち光路の喪失によって生じる。したがって、一実施形態では、対象は、眼と脳との接続を喪失している。一実施形態では、視覚機能の障害は、眼または光路の機能不全（例えば、眼の奇形、感染症、変性疾患（例えば、加齢黄斑変性など）、腫瘍、および／または血管イベント（例えば、脳卒中など））により生じる。
【0160】
一実施形態では、対象における視覚機能の障害は、糖尿病性網膜症、視神経症（遺伝性または後天性）、緑内障または外傷により生じる。
【0161】
一実施形態では、本発明の方法は、刺激領域における神経細胞の活性化を可視化および／または監視するステップをさらに含む。
【0162】
一実施形態では、神経細胞の活性化の可視化および／または監視は、非侵襲機能イメージングをベースとする。非侵襲機能イメージング法の例としては、これらに限定されないが、機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）、機能的超音波（ｆＵＳ）イメージング、機能的近赤外分光法（ｆＮＩＲＳ）、ＥＥＧまたはＭＥＧ記録が挙げられる。
【0163】
一実施形態では、本発明の方法は、ｆＭＲＩを用いて神経細胞の活性化を可視化および／または監視するステップをさらに含む。一実施形態では、本発明の方法は、ｆＮＩＲＳを用いて神経細胞の活性化を可視化および／または監視するステップをさらに含む。一実施形態では、本発明の方法は、機能的超音波を用いて神経細胞の活性化を可視化および／または監視するステップをさらに含む。一実施形態では、本発明の方法は、ＥＥＧを用いて神経細胞の活性化を可視化および／または監視するステップをさらに含む。一実施形態では、本発明の方法は、ＭＥＧを用いて神経細胞の活性化を可視化および／または監視するステップをさらに含む。
【0164】
一実施形態では、神経細胞の活性化の可視化および／または監視は、蛍光カルシウムセンサー（またはカルシウムインジケーター）を用いたカルシウムイメージングをベースとする。本発明で使用できるカルシウムセンサー（またはインジケーター）の例としては、これらに限定されないが、ＧＣＡＭＰ、Ｆｕｒａ－２、Ｉｎｄｏ－１、Ｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４、カルシウムグリーン－１およびオレゴングリーン４８８ＢＡＰＴＡ－１が挙げられる。
【0165】
したがって、一実施形態では、本発明の方法は、
－蛍光カルシウムセンサーまたはカルシウムセンサーをコードする核酸配列を神経細胞に導入するステップと、
－神経細胞の活性化を可視化および／または監視するために、蛍光カルシウムセンサーからの蛍光発光を可視化するステップと、をさらに含む。
－蛍光カルシウムセンサーまたはカルシウムセンサーをコードする核酸配列を神経細胞に導入するステップと、
－神経細胞の活性化を可視化および／または監視するために、蛍光カルシウムセンサーからの蛍光発光を可視化するステップと、をさらに含む。
【0166】
一実施形態では、蛍光カルシウムセンサーまたはセンサーをコードする核酸配列を脳に導入するステップは、本発明の方法の一部ではない。
【0167】
一実施形態では、神経細胞の活性化の可視化および／または監視は、電極記録に基づく。一実施形態では、電極を脳に導入するステップは、本発明の方法の一部ではない。
【0168】
したがって、一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つの電極を用いてニューロン活動を記録するステップをさらに含む。
【0169】
一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つの多電極アレイを用いてニューロン活動を記録するステップをさらに含む。
【0170】
一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つのμＥｃｏＧ（マイクロ皮質電図検査法）電極アレイを用いて、ニューロン活動を記録するステップをさらに含む。
【0171】
本発明はまた、対象において神経細胞を可逆的に刺激するための、本明細書に記載の少なくとも１つの超音波刺激の使用に関し、ここで、神経細胞は、機械受容チャネルを発現し、超音波刺激は、少なくとも約４ＭＨｚの中心周波数、好ましくは、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ＭＨｚの中心周波数を有する。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数、好ましくは約５～約１８ＭＨｚの中心周波数、例えば、約１２～約１６ＭＨｚの中心周波数の範囲である。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約４ＭＨｚ、好ましくは約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ＭＨｚの中心周波数のものである。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約１５ＭＨｚの中心周波数のものである。
【0172】
本発明はまた、対象において画像の視覚を誘導するための少なくとも１つの超音波刺激の使用に関し、ここで、対象は、機械受容チャネルを発現する神経細胞を含み、超音波刺激は、少なくとも約４ＭＨｚ、好ましくは少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ＭＨｚの中心周波数を有し、神経細胞は、視覚皮質の皮質ニューロン、外側膝状体核のニューロン、または網膜神経節細胞である。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数、好ましくは約５～約１８ＭＨｚの中心周波数、例えば、約１２～約１６ＭＨｚの中心周波数の範囲である。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約４ＭＨｚ、好ましくは約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ＭＨｚの中心周波数のものである。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約１５ＭＨｚの中心周波数のものである。
【0173】
本発明はさらに、本明細書に記載の方法を実施するための手段を備える超音波システムに関する。
【0174】
したがって、本発明のシステムは、入力として電気信号を受信して、対象において機械受容チャネルを発現する神経細胞を可逆的に刺激するように構成された超音波システムであり、超音波システムは、少なくとも約４ＭＨｚ、好ましくは少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ＭＨｚの中心周波数の少なくとも１つの超音波刺激を放出するために、少なくとも１つの超音波素子を有する超音波アレイを含むモジュール（Ａ）を備える。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数、好ましくは約５～約１８ＭＨｚの中心周波数、例えば、約１２～約１６ＭＨｚの中心周波数の範囲の中心周波数を有する。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約４ＭＨｚ、好ましくは約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ＭＨｚの中心周波数の中心周波数を有する。一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、約１５ＭＨｚの中心周波数の中心周波数を有する。
【0175】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波刺激は、集束されていない。
【0176】
一実施形態では、モジュール（Ａ）は、超音波信号のバーストを放出するように構成される。
【0177】
一実施形態では、モジュール（Ａ）は、マルチ周波超音波刺激を放出するように構成される。一実施形態では、マルチ周波超音波刺激により、短パルス信号、チャープまたはランダムコーダの高速繰り返しが可能になる。
【0178】
一実施形態では、モジュール（Ａ）は、非集束超音波刺激を放出するように構成される。
【0179】
一実施形態では、モジュール（Ａ）は、複数の場所に同時に集束させる超音波刺激を放出するように構成される。
【0180】
一実施形態では、モジュール（Ａ）は、超音波刺激の全持続時間内で異なる場所に連続的に集束させるいくつかの超音波ビームから構成される超音波刺激を放出するように構成され、好ましくは、超音波信号のバーストである。
【0181】
一実施形態では、モジュール（Ａ）は、複雑に構造化された空間的および時間的パターンを放出するように構成される。一実施形態では、複雑に構造化された空間的および時間的パターンは、寸法が超音波波長よりも大きい、目的である大きい領域に超音波を照射する。
【0182】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波素子を含む超音波アレイは、超音波マトリックス、スパースアレイおよび／または行－列アドレス指定（ＲＣＡ）アレイである。
【0183】
本発明で使用できる超音波マトリックスの一例を図８（Ａ～Ｃ）に示す。
【0184】
一実施形態では、少なくとも１つの超音波素子は、少なくとも約４ＭＨｚ、好ましくは少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ＭＨｚの中心周波数の中心周波数を有する超音波刺激トランスデューサーである。一実施形態では、少なくとも１つの超音波素子は、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚ中心周波数、好ましくは約５～約１８ＭＨｚ中心周波数、例えば、約１２～約１６ＭＨｚの中心周波数の範囲の中心周波数を有する超音波刺激トランスデューサーである。一実施形態では、少なくとも１つの超音波素子は、約４ＭＨｚ、好ましくは約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ＭＨｚの中心周波数の中心周波数を有する超音波刺激トランスデューサーである。一実施形態では、少なくとも１つの超音波素子は、約１５ＭＨｚの中心周波数の中心周波数を有する超音波刺激トランスデューサーである。
【0185】
一実施形態では、本発明で使用されるトランスデューサーは、ピエゾコンポジット素子、ピエゾセラミック素子、容量性微細加工超音波トランスデューサー、液浸トランスデューサー、ポリフッ化ビニリデン素子、または超音波刺激の放出に好適である他の素子から選択される。
【0186】
一実施形態では、モジュール（Ａ）は、超音波アレイに送信される電気信号をプログラムできる波形発生器を備え、好ましくは、電気信号は、超音波アレイの各超音波素子で送信される。一実施形態では、波形発生器は、ケーブルまたは遠隔接続を介して超音波アレイに接続される。一実施形態では、波形発生器は、マルチメータ、オシロスコープ、スペクトルアナライザ、およびトランジェントレコーダの機能を備える。
【0187】
一実施形態では、モジュール（Ａ）は、電力増幅器を含む。
【0188】
一実施形態では、モジュール（Ａ）は、少なくとも１つの超音波刺激を脳内の限定され決定された領域に向けて送信するための手段を備える。少なくとも１つの超音波刺激を限定され決定された領域に向けて送信するための手段の例としては、これらに限定されないが、エミッター間の位相差を変化させること、またはフィルター、レンズ、コンデンサーを追加すること、またはこれらの手段の組み合わせが挙げられる。
【0189】
一実施形態では、モジュール（Ａ）は、対象の頭蓋骨内に移植される（開頭術）支持体に含まれる。一実施形態では、支持体は、対象の頭蓋骨に皮下移植される。一実施形態では、支持体は、硬膜上に移植される。
【0190】
一実施形態では、支持体は、生体適合性材料で作製される。一実施形態では、支持体は、スキャナー、ｆＭＲＩ、ｆＵＳイメージング、ｆＮＩＲＳイメージング、ＥＥＧまたはＭＥＧイメージングに適合する材料で作製される。
【0191】
一実施形態では、超音波システムは、電気エネルギーをシステムに供給するための電源をさらに備える。一実施形態では、電源は、再充電式電池からなる。
【0192】
一実施形態では、本発明の超音波システムは、対象における感覚能力、例えば、視覚、聴覚、平衡感覚、嗅覚、触覚および／または味覚の能力を増強するためのものである。
【0193】
一実施形態では、本発明の超音波システムは、視覚、聴覚、平衡感覚、嗅覚、触覚および／または味覚の欠損など、対象における感覚欠損を回復させるためのものである。
【0194】
したがって、一実施形態では、本発明の超音波システムは、電子変換器をさらに備える。この電子変換器は、対象によって検出される感覚信号を電気信号に変換し、この電気信号は、少なくとも１つの超音波刺激を放出するためにモジュール（Ａ）（またはモジュール（Ａ）に含まれる波形発生器）に送信され、神経細胞の刺激を通じて脳に感覚情報を生成する。
【0195】
一実施形態では、感覚信号は、センサーなどの遠隔器具によって放出される。したがって、一実施形態では、電子変換器は、センサーによって感知された感覚信号を電気信号に変換するために、少なくとも１つのセンサーに接続される。センサーは、視覚、聴覚、嗅覚、触覚および／または味覚情報を感知することができる。
【0196】
感覚情報を検出できるセンサーの例としては、これらに限定されないが、カメラまたはニューロモーフィックビジョンセンサー（視覚）、マイク（聴覚）、加速度計またはフォースバランスセンサー（平衡感覚）、電子ノーズ（嗅覚）、タッチセンサー（触覚）、および味覚センサー（味覚）が挙げられる。
【0197】
一実施形態では、感覚信号は、コンピュータなどのデバイスによって生成されるコンピュータ化された感覚情報である。したがって、一実施形態では、電子変換器は、コンピュータ化された感覚情報を送達するデバイスに接続される。
【0198】
一実施形態では、本発明の超音波システムは、対象における視覚欠損を回復するためのものである。
【0199】
一実施形態では、本発明の超音波システムは、対象における画像の視覚を回復するためのものであり、以下に説明する特徴のうちの１つ以上を備える。
【0200】
一実施形態では、本発明の超音波システムは、対象による画像の視覚を誘導するためのものであり、以下に説明する特徴のうちの１つ以上を備える。
【0201】
一実施形態では、本発明の超音波システムは、画像または視覚情報を取得するための取得モジュール（Ｂ）を備える。
【0202】
一実施形態では、取得モジュール（Ｂ）は、カメラなど、画像を取得できるセンサーである。したがって、一実施形態では、本発明のシステムは、画像を取得するために少なくとも１つのカメラを備える。一実施形態では、少なくとも１つのカメラは、視覚状況をリアルタイムで画像化することができる。
【0203】
一実施形態では、取得モジュール（Ｂ）は、ニューロモーフィック視覚センサーまたはイベントベースのカメラなど、視覚情報を取得できるセンサーである。したがって、一実施形態では、本発明のシステムは、視覚情報を取得するための少なくとも１つの視覚センサーを備える。
【0204】
一実施形態では、取得モジュール（Ｂ）、好ましくはカメラは、画像の輪郭を抽出する、または連続する画像間の移動物体および構造の輪郭を抽出するシステムをさらに備える。
【0205】
一実施形態では、本発明の超音波システムは、画像または視覚情報を電気信号に変換するように構成された処理モジュール（Ｃ）を備え、電気信号は、出力として、モジュール（Ａ）（またはモジュール（Ａ）に含まれる波形発生器）に送信され、これにより、少なくとも１つの超音波刺激、好ましくは複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンを放出するようにする。一実施形態では、画像または視覚情報処理モジュール（Ｃ）は、有線または無線接続によって取得モジュール（Ｂ）に接続される。
【0206】
一実施形態では、処理モジュール（Ｃ）は、電子システム、ソフトウェア、およびアルゴリズムを含む。一実施形態では、モジュール（Ｃ）は、取得モジュール（Ｂ）で得られた視覚信号を、モジュール（Ａ）（またはモジュール（Ａ）に含まれる波形発生器）に送信される電気信号に変換する電子変換器を備え、これにより、少なくとも１つの超音波刺激、好ましくは複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンを放出するようになる。
【0207】
したがって、一実施形態では、パターン化された超音波刺激は、取得モジュール（Ｂ）によって取り込まれた視覚情報の画像である。
【0208】
一実施形態では、本発明の超音波システムは、刺激領域内の神経細胞の活性化を可視化および／または監視するための手段をさらに含む。
【0209】
一実施形態では、神経細胞の活性化の可視化および／または監視は、電極記録に基づく。
【0210】
したがって、一実施形態では、本発明の超音波システムは、神経細胞の活性化を監視するために、ニューロン活動を記録するための少なくとも１つの電極をさらに備える。一実施形態では、少なくとも１つの電極は、対象の頭蓋骨内に移植される支持体に組み込まれる。
【0211】
一実施形態では、本発明の超音波システムは、少なくとも１つの多電極アレイを備える。一実施形態では、少なくとも１つの多電極アレイは、少なくとも２つの電極を含む。一実施形態では、少なくとも１つの多電極アレイは、対象の頭蓋骨内に移植される支持体内に含まれる。
【0212】
一実施形態では、本発明の超音波システムは、少なくとも１つのμＥｃｏＧ電極アレイを備える。一実施形態では、少なくとも１つのμＥｃｏＧ電極アレイは、少なくとも２つの電極を含む。一実施形態では、少なくとも１つのμＥｃｏＧ電極アレイは、対象の頭蓋骨内に移植される支持体内に含まれる。
【0213】
一実施形態では、超音波システムは、目的の脳領域における集束超音波によってニューロン活性化を画像化できるイメージングシステムをさらに備える。
【0214】
一実施形態では、神経細胞の活性化の可視化および／または監視は、非侵襲的血管機能イメージングに基づく。
【0215】
一実施形態では、本発明の超音波システムは、機能的超音波技術を用いて神経細胞の活性化を可視化するための手段を備える。
【0216】
したがって、一実施形態では、本発明の超音波システムは、神経細胞の活性化を可視化および／または監視するために、血管機能応答を評価するためのプローブ（または超音波トランスデューサー）をさらに備える。一実施形態では、プローブは、対象の頭蓋骨内に移植される支持体に組み込まれる。
【0217】
一実施形態では、神経細胞の活性化を可視化および／または監視するために、血管機能応答を評価するためのイメージングプローブ（または超音波トランスデューサー）は、神経刺激に使用されるものと同じプローブである。
【0218】
一実施形態では、超音波システムは、機能イメージング情報に基づいて超音波活性化パターンを補正する手段をさらに備える。一例として、目的の領域におけるＣＢＶ（脳血液量）変化の振幅または空間範囲は、超音波活性化パターンを漸進的に変化させることによって最適化することができる機能イメージングによって測定される。
【0219】
一実施形態では、神経細胞の活性化の可視化および／または監視は、蛍光カルシウムセンサー（またはカルシウムインジケーター）を用いたカルシウムイメージングをベースとする。
【0220】
したがって、一実施形態では、本発明の超音波システムは、蛍光カルシウムセンサーによって放出された蛍光を可視化するための手段をさらに備える。一実施形態では、本発明の超音波システムは、蛍光イメージングシステムをさらに備える。
【0221】
したがって、本発明はさらに、機械受容チャネルをコードする核酸配列を含むベクター、好ましくはウイルスベクターに関する。
【0222】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、発現する核酸配列に操作可能に連結されている発現制御配列を含む遺伝子構築物を指す。
【0223】
一実施形態では、ベクターは、例えば、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
【0224】
一実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。一実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５およびＡＡＶ９血清型を含むかまたはこれらからなる群から選択されるＡＡＶである。一実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ、好ましくはＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）またはＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）である。
【0225】
一実施形態では、ベクターは、７ｍ８変異を含む。したがって、一実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ１－７ｍ８、ＡＡＶ２－７ｍ８、ＡＡＶ５－７ｍ８およびＡＡＶ９－７ｍ８血清型を含むかまたはこれらからなる群から選択されるＡＡＶであり、より好ましくはベクターは、ＡＡＶ９－７ｍ８またはＡＡＶ２－７ｍ８である。
【0226】
一実施形態では、ベクターは、ＭｓｃＬをコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ベクターは、ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓをコードする核酸配列を含む。
【0227】
一実施形態では、ベクターは、例えば細胞質可溶性タンパク質などのレポータータンパク質をコードする核酸配列を含む（任意により、レポータータンパク質は、機械受容チャネルに融合されている）。レポータータンパク質の例としては、タンデム二量体トマト（ｔｄＴｏｍａｔｏ）、イソギンチャク（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、増強型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）が挙げられる。一実施形態では、ベクターは、ｔｄＴｏｍａｔｏをコードする核酸配列を含む。
【0228】
一実施形態では、ベクターは、プロモーターの核酸配列をさらに含む。一実施形態では、プロモーターは、細胞型特異的プロモーター、好ましくはニューロン特異的プロモーターである。プロモーターの例としては、これらに限定されないが、ＣＡＧプロモーター、ＣＡＭＫＩＩプロモーター、ＳＮＣＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、シナプシンＩプロモーターおよびＥＦ－１ａプロモーターが挙げられる。
【0229】
一実施形態では、ベクターは、ＣａｍＫＩＩプロモーター、ＣＡＧプロモーター、およびＳＮＣＧプロモーターを含むかまたはこれらからなる群から選択されるプロモーターを含む。一実施形態では、ベクターは、ＣＡＭＫＩＩプロモーターを含む。
【0230】
一実施形態では、ベクターは、例えば、Ｋｉｒ２．１ ＥＲ輸出シグナルなどの小胞体（ＥＲ）輸出シグナルをさらに含む。
【0231】
一実施形態では、本発明のベクターは、ＣａｍＫＩＩプロモーターの制御下で赤色蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏに融合されたＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓチャネルをコードする核酸配列を含むＡＡＶ９－７ｍ８ベクターである（ＡＡＶ９．７ｍ８－ＣａｍＫＩＩ－ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓ－ｔｄＴｏｍａｔｏと呼ばれることもある）。
【0232】
本発明はさらに、上記のベクターを含む組成物に関する。
【0233】
本発明はさらに、上記のベクターおよび少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【0234】
「薬学的に許容される賦形剤」または「薬学的に許容される担体」という用語は、動物、好ましくはヒトに投与されたときに有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を生じない賦形剤を指す。賦形剤としては、任意のあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。ヒト投与の場合、調製物は、例えば、ＦＤＡ ＯｆｆｉｃｅまたはＥＭＡなどの規制当局が要求する滅菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の基準を満たす必要がある。
【0235】
本発明はさらに、医薬品として使用するための上記のベクターに関する。
【0236】
本発明はさらに、神経細胞において機械受容チャネルの発現を誘導するための、上記の機械受容チャネルをコードする核酸配列（例えば、ＡＡＶ９．７ｍ８－ＣａｍＫＩＩ－ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）を含むベクターに関する。
【0237】
一実施形態では、神経細胞またはその伸長は、視覚皮質、前前頭皮質、知覚皮質、運動皮質、聴覚皮質、ブローカ野、ウェルニッケ野および連合野などの皮質領域；または大脳基底核、視床、視床下部、脳幹、海馬、扁桃体を含む皮質下領域；または脊髄内にあるか、または神経細胞が網膜、蝸牛、または前庭内にある。一実施形態では、神経細胞は、視覚皮質の皮質ニューロン、外側膝状体核のニューロン、または網膜神経節細胞である。
【0238】
本発明はさらに、それを必要とする対象において、感覚欠損、特に視覚欠損の治療または回復に使用するための、上記の機械受容チャネルをコードする核酸配列（例えば、ＡＡＶ９．７ｍ８－ＣａｍＫＩＩ－ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）を含むベクターに関する。一実施形態では、対象は、上記のように、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数の範囲の超音波刺激にさらに曝露されるか、またはこの範囲の超音波刺激で治療される。一実施形態では、ベクターは、対象の神経細胞に形質導入するためのものである。
【0239】
本発明はさらに、対象において画像の視覚を誘導するために使用するための、上記の機械受容チャネルをコードする核酸配列（例えば、ＡＡＶ９．７ｍ８－ＣａｍＫＩＩ－ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）を含むベクターに関する。一実施形態では、対象は、上記のように、約４ＭＨｚ～約２０ＭＨｚの中心周波数の範囲の超音波刺激にさらに曝露されるか、またはこの範囲の超音波刺激で治療される。
【図面の簡単な説明】
【0240】
【図1】ＭｓｃＬ（大コンダクタンス機械受容チャネル）が網膜神経節細胞の機能的応答を誘発したことを示すヒストグラムとグラフとを組み合わせたものを示す。図１Ａ：５つのＭｓｃＬＧ２２ｓおよび５つのＭｓｃＬ ＷＴ（野生型）網膜のＲＢＰＭＳ陽性、ＭｓｃＬ陽性、および二重標識細胞の細胞密度を示す。図１Ｂ：ＭｓｃＬを発現する３つのＲＧＣの代表的な周辺刺激時間ヒストグラムは、１５ＭＨｚ ＵＳ（超音波）刺激開始後の潜時が短いことおよび応答が持続することを示している。スケールバーは、１０スパイク／ビンを表す。灰色のボックスは、２００ｍｓの刺激を表す。図１Ｃ：長いまたは短い潜時応答のいずれかによるＭｓｃＬ（ＭｓｃＬＷＴおよびＧ２２ｓ）（ｎ＝９）およびＷＴ（ｎ＝４）網膜の１５ＭＨｚ ＵＳ（超音波）刺激に応答する網膜あたりの最大細胞数の平均を示す。図１Ｄ：ＭｓｃＬ（ＭｓｃＬ ＷＴおよびＧ２２ｓ）発現網膜（ｎ＝８）および非トランスフェクト網膜（ｎ＝４）について、ＵＳ圧力を増加させたＵＳ刺激に対する応答ＲＧＣ率を示す。＊、ｐ＝．０３８２、＊＊、ｐ＝．００６５、＊、ｐ＝．０２１８、対応のないｔ検定。図１Ｅ：ＭｓｃＬ ＷＴ（ｎ＝３）およびＭｓｃＬＧ２２ｓ（ｎ＝５）網膜に対する圧力を増加させたＵＳ刺激に対する短潜時ＲＧＣ細胞の応答を示す。＊＊、ｐ＝．００６、＊＊、ｐ＝．００３５、対応のないｔ検定。すべてのパネルのエラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図2】音響遺伝学的網膜応答の時空間特性を示すヒストグラムとグラフの組み合わせを示す。図２Ａ～図２Ｂ：刺激持続時間（Ａ）の延長および刺激繰り返し周波数（Ｂ）の上昇ためのＭｓｃＬ Ｇ２２ｓ発現網膜の２つの代表的なＲＧＣのスパイク密度関数であり、スケールバーは、それぞれ１００Ｈｚおよび５０Ｈｚである。図２Ｃ：すべての細胞の異なる刺激持続時間の平均最大発火率、および平均ファノ因子値（１０、２０ｍｓ刺激持続時間ｎ＝８を除くｎ＝９の網膜）を示す。図２Ｄ：応答持続時間と刺激持続時間との相関は、線形回帰直線によって確認された（ｎ＝９網膜）。図２Ｅ：すべての細胞の異なる刺激繰り返し周波数の平均最大発火率、および平均ファノ因子値（５および１０Ｈｚの刺激周波数ｎ＝８を除くｎ＝９網膜）を示す。図２Ｆ～図２Ｇ：最大発火率（Ｆ）に重み付けした活性化細胞間の平均ユークリッド距離、および３つのＵＳ周波数のＭＥＡチップ上の刺激領域に対する活性化細胞数（Ｇ）の比率を示す。＊＊＊＊、ｐ＜．０００１、＊＊＊、ｐ＝．０００８、ｐ＝．０１６９、対応のないｔ検定。０．５ＭＨｚではｎ＝１２網膜、２．２５ＭＨｚではｎ＝５網膜、１５ＭＨｚではｎ＝９網膜。図２Ｈ：１５ＭＨｚ ＵＳトランスデューサーの変位後の応答中心の相対的変位を示す。＊＊＊＊、ｐ＜．０００１、＊＊、ｐ＝．００１８、対応のないｔ検定。それぞれ０、０．４、および０．８ｍｍの変位の４、４、および２つの網膜ｎ＝９、９、６の位置。ＵＳ圧力：１．１ＭＰａ。すべてのパネルのエラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図3】ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓタンパク質を発現するＶ１ニューロンのｉｎ ｖｉｖｏ音響遺伝学的活性化を示すグラフ、スキーマ、およびヒストグラムの組み合わせである。図３Ａ：ｉｎ ｖｉｖｏ電気生理学的記録およびＵＳ刺激に使用されるセットアップの模式図を示す。図３Ｂ：左。（上）典型的なＰ０、Ｎ１、およびＰ１のたわみが見られる１００ｍｓのフラッシュに対する代表的な視覚誘発皮質電位を示す。（下）ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓタンパク質を発現する皮質ニューロンを有するＷＴラットの１００ｍｓ１５ＭＨｚＵＳ刺激に対する代表的な応答を示す。右。持続時間を延長させ、１５ＭＨｚのＵＳ刺激に対する代表的な音響遺伝学的誘発電位を示す。黒のトレースは、１００回の試行における平均誘発電位を表す。各灰色のトレースは、１回の試行を表す。黒い矢印は、刺激の開始を示す。スケールバーは、５０μＶ／５０ｍｓである。図３Ｃ：１０、２０、および５０ｍｓ刺激に対する音響遺伝学的μＥｃｏｇ応答持続時間（ｎ＝５８、６匹の動物でそれぞれ３２回および５６回の試行）を示す。図３Ｄ～図３Ｆ：ＵＳの圧力の増加（Ｄ）、持続時間の延長（Ｅ）および周波数の増加（Ｆ）に対するＮ１ピーク振幅（刺激持続時間：１０ｍｓ）（ｎ＝６動物）を示す。図３Ｇ～図３Ｈ：ＵＳの圧力を増加させた刺激（Ｇ）およびＵＳトランスデューサーの０．８ｍｍの変位（Ｈ）のグレイコード化させた活性化マップ（矢印は変位の方向を示す）を示す。各白い点は、電極アレイの電極を表す。グレイバーは、Ｎ１ピーク振幅を表す（μＶ）。図３Ｉ：ＵＳ圧力値を増加させた、活性化領域（ｎ＝６動物）を示す。図３Ｊ：ＵＳトランスデューサーを０．４ｍｍ移動させたときの活性化中心の以前の位置への変位を示す。ｐ＜．０００１、１サンプルｔ検定、６匹の動物においてｎ＝３７の位置。図３Ｋ：皮質ニューロン内でのＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓタンパク質を発現するＷＴラットの視覚刺激およびＵＳ刺激に対する応答の代表的なスパイク密度関数（ＳＤＦ）を示し、スケールバーは、５０Ｈｚを表す。図３Ｌ：異なる刺激持続時間（上）および周波数（下）の刺激に対する５８および２７ニューロンの応答のＳＤＦを示す。上行は、５０～１０ｍｓ（刺激周波数１Ｈｚ）の刺激持続時間、および１Ｈｚ～１３Ｈｚ（刺激持続時間１０ｍｓ）に変化させた周波数に対する応答の発火率を示す。下行は、刺激パターンを示す。ＵＳ圧力：１ＭＰａ。図３Ｍ：５０ｍｓおよび１０ｍｓの長さのＵＳ刺激後の平均応答潜時（５０ｍｓ ｎ＝５８細胞、７匹の動物；１０ｍｓ、ｎ＝２７細胞、５匹の動物）を示す。図３Ｎ：ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓ発現ラット（ｎ＝７）におけるＵＳ応答細胞（ｎ＝５８）の深さを示す。すべてのパネルのエラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図4】異なる周波数のＵＳ刺激に対する網膜音響遺伝学的応答特性を示すグラフおよびヒストグラムの組み合わせを示す図である。図４Ａ：光刺激に対する応答による、１５ＭＨｚ刺激に対するＳＬとＬＬの応答の分類を示す。ｎｓ：ｐ＝０．３、０．６、０．５（ＯＮ、ＯＮ－ＯＦＦおよびＯＦＦ細胞）、対応のないｔ検定、ｎ＝９網膜。図４Ｂ：０．５および２．２５ＭＨｚのＵＳ刺激に対するＳＬ細胞の平均応答潜時を示す。ｎ＝９、網膜８個、ＵＳ圧：０．５および２．２５ＭＨｚでそれぞれ０．４３、１．５４ＭＰａ。図４Ｃ～図４Ｅ：テストされた３つのＵＳ周波数について、音圧を増加させたＵＳ刺激に対する応答細胞率（実験での応答細胞の最大数に正規化）を示す：０．５ＭＨｚ（Ｃ，ｎｓ，ｐ＝．１６６１；＊，ｐ＝．０２９２；＊，ｐ＝．０２６０；ｎｓ，ｐ＝．８６２８；ｎｓ，ｐ＝．１３１６；ｎｓ，ｐ＝．７７３１；対応のないｔ検定）、２．２５ＭＨｚ（Ｄ，ｎｓ，ｐ＝．１４７４；ｎｓ，ｐ＝．０５２２；＊，ｐ＝．０１４０；＊＊＊，ｐ＝．０００５；＊＊＊＊，ｐ＜．０００１；ｎｓ，ｐ＝．５０００；対応のないｔ検定）、１５ＭＨｚ（Ｅ，＊，ｐ＝．０３８２；＊＊，ｐ＝．００６５；＊，ｐ＝．０２１８；ｎｓ，ｐ＝．８６２８；ｎｓ，ｐ＝．５８５９；ｎｓ，ｐ＝．４２２３；対応のないｔ検定）。下のｘ軸は、対応する音響強度（Ｉｓｐｔａ）を表す。すべてのパネルのエラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図5】０．５ＭＨｚ、２．２５ＭＨｚおよび１５ＭＨｚトランスデューサーのＵＳ圧力場を示す圧力マップの組み合わせである。図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ：０．５ＭＨｚ（Ａ）、２．２５ＭＨｚ（Ｂ）、および１５ＭＨｚ（Ｃ）のｘｙおよびｘｚ平面でのグレイコード化した圧力マップを示す。白線は、－３ｄＢの圧力場を示す。スケールバーは、２ｍｍを表す。
【図6】視覚回復に適用される本発明の方法の原理を示す図である。例えば、超音波マトリックス、スパースアレイ、またはＲＣＡ（行列アレイ）などの超音波アレイは、非集束超音波刺激を放出して神経細胞を刺激し、対象の視覚皮質内で画像を再現する。
【図7】対象における画像の視覚を回復するには、妥当な時間内で神経細胞を活性化するために、非集束超音波刺激が必要であることを示す図を組み合わせたものである。図７Ａ：集束超音波刺激の原理のスキームを示す。超音波刺激（すなわち、超音波信号のバースト）は、完全な画像を再構築するために、対象の脳上の固有の焦点で順次放出させる。このプロトコールは長過ぎるため、対象の画像を回復できない。図７Ｂ：多集束超音波刺激の原理のスキームを示す。超音波刺激は、完全な画像が再構築されるまで、いくつかの焦点で同時に放出させる。このプロトコールは、対象における画像の回復に適合する。図７Ｃ：複雑に構造化された空間的および時間的超音波パターンによる刺激（すなわち、超高速ホログラフィック刺激）の原理のスキームを示す。画像の視覚情報の符号化から得た超音波パターンを対象の脳上に放出させて、画像を再構築する。このプロトコールは、対象における画像の回復に適合する。
【図8】非集束超音波刺激を放出するための超音波マトリックスアレイの例を示す図を組み合わせたものである。図８Ａ：長い超音波バーストで３つの焦点に到達するように構成された３２ｘ３２マトリックスアレイ（構成例：０．２ｍｍピッチ、１５ＭＨｚ中心周波数）の図である。２つの焦点は、同じ振幅を有するが、１つの焦点は、より小さい振幅を有する（４分の１の振幅）。標的の横断面（右下）で特定のエネルギーパターンに到達するように、各素子に対して特定の波形パターンの放射を設計する（これらの波形の３２個が列１０に示され、これらの波形の別の３２個が行７に示される）。図８Ｂ～図８Ｃ：超音波マトリックスアレイによって生成された超音波パターンの例の図である。投影する画像（例えば、チェッカーボードを表す画像（Ｂ）またはより複雑な画像（Ｃ））は、生成される画像と同じパターンを表示する超音波パターン刺激に変換される。
【図9】関連付け視覚トレーニング後のマウスのＶ１皮質の音響遺伝学的活性化によって誘導される行動応答を示すグラフ、ヒストグラム、およびスキーマの組み合わせを示す図である。図９Ａ：マウスが行う行動タスクの模式図を示す。水報酬を有する光刺激のための関連付け学習パラダイムでトレーニングされた水制限動物は、Ｖ１の１５ＭＨｚのＵＳ刺激により刺激される。動物が水報酬前に５００ｍｓの時間枠内で少なくとも１つの予期リックを行った場合、試験は奏功したと見なす。図９Ｂ：光刺激（５０ｍｓ）と水報酬（ＬＳ濃灰）およびその後のＵＳ刺激（ＵＳ薄灰）の間の関連付け学習中の４日間のトレーニングの試行の平均奏功率（５０ｍｓ１．２ＭＰａ、ｎｓ、ｐ＝．４３１１、対応のないｔ検定）を示す。図９Ｃ：光（５０ｍｓ）およびＵＳ刺激（５０ｍｓ、１．２ＭＰａ）後の最初の予測的リックの潜時を示す（＊＊＊＊、ｐ＜．０００１、対応のないｔ検定）。図９Ｄ：ＵＳ圧力を増加させた５０ｍｓのＵＳ刺激後の、非トランスフェクト（ＮＴ）およびＭｓｃＬ－Ｇ２２Ｓトランスフェクトマウスに対する４日間のＵＳ刺激の試行の平均奏功率を示す（ｎｓ、ｐ＝．０７５１、＊、ｐ＝．０１１４、＊＊＊、ｐ＝．０００６、対応のないｔ検定、それぞれ０．２、０．７、１．２ＭＰａの場合）。図９Ｅ：ＵＳ圧力を増加させたＮＴおよびＭｓｃＬ－Ｇ２２Ｓトランスフェクトマウスの予測的リック率を示す（＊、ｐ＝．０４２４、＊、ｐ＝．０１５０、＊＊、ｐ＝．００３１、対応のないｔ検定それぞれ、０．２、０．７、および１．２ＭＰａの場合）。
【図10】無傷の硬膜を通る視覚回復に対する超音波送信周波数の影響を示すスキーマおよびグラフの組み合わせを示す図である。図１０Ａ：ヒトにおける一次視覚皮質内での局所化したＵＳニューロモデュレーションのために頭蓋枠に移植させたＵＳマトリックスアレイを使用した視覚回復の想定される概念を示す。ＵＳビームは、無傷の硬膜、硬膜下腔、くも膜下腔を通過させながら、Ｖ１皮質内の様々な場所に適応的に集束させることができる。図１０Ｂ：開頭したマウスに高周波集束トランスデューサーを使用する、げっ歯動物のＶ１音響遺伝学的活性化に使用する一連の概念実証を示す。図１０Ｃ：本試験で使用された０．５ＭＨｚトランスデューサーの放射場の特徴を示す。（上）２５．４ｍｍO（スラッシュ付きO）、３１．７５ｍｍ集束トランスデューサーによって０．５ＭＨｚで放射した単色音場の最大圧力の縦方向の図である。２５．９ｍｍで圧力の最大値に達し、これは、報告されている効果である幾何学的焦点よりもトランスデューサーにわずかに近い６３。（中央）深さｚ＝２５．９ｍｍでの最大圧力場の横断面である。（下）焦点スポットのＦＷＨＭ（０．５ＭＨｚで４．３６ｍｍ）であるこの横断面の一次元プロファイルを示す。図１０Ｄ：２．２５ＭＨｚ １２．７ｍｍO（スラッシュ付きO） ２５．４ｍｍ集束ストランスデューサーの同じ特性を示す。図１０Ｅ：１５ＭＨｚ １２．７ｍｍO（スラッシュ付きO） ２５．４ｍｍ集束ストランスデューサーの同じ特性を示す。この構成では、最大圧力が幾何学的集束の非常に近くに達していることに留意のこと（幾何学的集束の２５．４ｍｍと比較して２５．２１ｍｍ）。焦点スポットのＦＷＨＭは、０．２７６ｍｍである。
【図11】シミュレートした音場および温度上昇を示すグラフの組み合わせを示す図である。図１１Ａ：２．２５ＭＨｚトランスデューサーで取得され、－１．１１ＭＰａのピーク負圧に到達する較正させた水中聴音器（黒）を使用した集束での水タンク測定値と、同じ負圧に到達する集束（灰色）でのシミュレートした波形との比較を示す。２つの波形は、非常によく一致しており（誤差０．４２％）、シミュレーションのセットアップおよび物理パラメーターが妥当であることが保証される。図１１Ｂ：測定された波形（黒）とシミュレートした波形（灰色）のパワースペクトル密度であり、シミュレーションによって非線形伝播の重要性を推定できることを示す。基本波より２０ｄＢ低い二次高調波は、エネルギーに関して１００倍であることを示し、これは、吸収を線形近似で計算できることを意味する。図１１Ｃ～図１１Ｆ：熱シミュレーションは、最悪のシナリオ（方法を参照）に対応する２つのプロセス：水媒体での伝播、および脳を模倣した媒体での熱吸収を使用して実施する。図１１Ｃ：２００ｍｓの刺激（１５ＭＨｚおよび１．２７ＭＰａ）終了時の３Ｄ温度マップを示す。図１１Ｄ：圧力の７つの値（０．２６、０．３９、０．５４、０．７４、０．９６、１．１５、１．２７ＭＰａ）での１５ＭＨｚ ２００ｍｓ刺激の焦束での温度上昇を示す。増加している曲線を拡大すると、１ｋＨｚのオン／オフサイクルによる変動が明らかになる。図１１Ｅ：圧力の同じ７つの値での１５ＭＨｚ ５０ｍｓ刺激の焦束での温度上昇を示す。図１１Ｆ：０．９６ＭＰａおよび０．５４ＭＰａの集束圧力に対する、８Ｈｚおよび１３Ｈｚの繰り返し率での１５ＭＨｚ １０ｍｓ刺激（１ｋＨｚ変調）に対する集束での温度上昇を示す。 実施例
【0241】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明する。
【0242】
材料および方法
動物
すべての実験は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従って実施した。実験プロトコールは、各国の動物倫理委員会によって承認され、欧州議会の指令２０１０／６３／ＥＵに従って行った。この研究に含まれるすべてのラットは、Ｊａｎｖｉｅｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＬｏｎｇ Ｅｖａｎｓラットであった。
動物
すべての実験は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従って実施した。実験プロトコールは、各国の動物倫理委員会によって承認され、欧州議会の指令２０１０／６３／ＥＵに従って行った。この研究に含まれるすべてのラットは、Ｊａｎｖｉｅｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＬｏｎｇ Ｅｖａｎｓラットであった。
【0243】
プラスミドのクローニングおよびＡＡＶの産生
ＷＴ（野生型）形態中の大腸菌ＭｓｃＬ配列を含み、Ｇ２２Ｓ変異を有するプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１０７４５４および＃１０７４５５に対応する（これらのプラスミドはＦｒａｎｃｅｓｃｏ Ｄｉｆａｔｏから贈呈された（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１０７４５４；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１０７４５４；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１０７４５４；Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃１０７４５５；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１０７４５５；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１０７４５５；Ｓｏｌｏｐｅｒｔｏ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２０１８ Ｊａｎ ２９．ｐｉｉ：ｊｃｓ．２１０３９３．ｄｏｉ：１０．１２４２／ｊｃｓ．２１０３９３）。網膜神経節細胞を標的にするために、ＳＮＣＧプロモーターを、ｔｄＴｏｍａｔｏと融合したＭｓｃＬ配列および原形質膜への発現を駆動するＫｉｒ２．１ ＥＲ輸出シグナルを含むＡＡＶ２－７ｍ８骨格プラスミドにクローニングした。皮質層のニューロンを標的とするために、ＳＮＣＧプロモーターをＣＡＧおよびＣａｍＫＩＩプロモーターに置き換えた。使用したすべての組換えＡＡＶは、プラスミド共トランスフェクション法を使用して産生され、得られたライセートを精製して、高力価の組換えＡＡＶウイルスを得た。
ＷＴ（野生型）形態中の大腸菌ＭｓｃＬ配列を含み、Ｇ２２Ｓ変異を有するプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１０７４５４および＃１０７４５５に対応する（これらのプラスミドはＦｒａｎｃｅｓｃｏ Ｄｉｆａｔｏから贈呈された（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１０７４５４；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１０７４５４；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１０７４５４；Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃１０７４５５；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１０７４５５；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１０７４５５；Ｓｏｌｏｐｅｒｔｏ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２０１８ Ｊａｎ ２９．ｐｉｉ：ｊｃｓ．２１０３９３．ｄｏｉ：１０．１２４２／ｊｃｓ．２１０３９３）。網膜神経節細胞を標的にするために、ＳＮＣＧプロモーターを、ｔｄＴｏｍａｔｏと融合したＭｓｃＬ配列および原形質膜への発現を駆動するＫｉｒ２．１ ＥＲ輸出シグナルを含むＡＡＶ２－７ｍ８骨格プラスミドにクローニングした。皮質層のニューロンを標的とするために、ＳＮＣＧプロモーターをＣＡＧおよびＣａｍＫＩＩプロモーターに置き換えた。使用したすべての組換えＡＡＶは、プラスミド共トランスフェクション法を使用して産生され、得られたライセートを精製して、高力価の組換えＡＡＶウイルスを得た。
【0244】
ＵＳ刺激
３つの異なる中心周波数を有する３つのトランスデューサー：０．５ＭＨｚトランスデューサー（Ｖ３０１－ＳＵ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）、２．２５ＭＨｚトランスデューサー（Ｖ３０６－ＳＵ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）および１５ＭＨｚトランスデューサー（Ｖ３１９－ＳＵ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して、異なるサイズの焦点スポットを作製した。ＴｉｅＰｉｅ Ｈａｎｄｙｓｃｏｐｅ（ＨＳ３，ＴｉｅＰｉｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を使用して刺激波形を生成し、トランスデューサーに接続させた８０ｄＢ ＲＦ電力増幅器（ＶＢＡ ２３０－８０，Ｖｅｃｔａｗａｖｅ）を通過させた。ＵＳトランスデューサーの音響場分布は、水浴内でレーザー干渉計を使用して測定した。０．５、２．２５、および１５ＭＨｚのトランスデューサーでは、ｘｙ平面での焦点スポット直径の推定半値全幅（ＦＷＨＭ）は、それぞれ、６．５０、１．７４、および０．４８ｍｍとし、ｘｚ平面の長軸は、４３．４５、１８．２２、および４．９ｍｍとした（図５）。Ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ刺激に使用するＵＳ刺激は、次の特徴を有するものであった：５０％デューティサイクル（ＤＣ）の１ｋＨｚパルス繰り返し周波数（ＰＲＦ）、超音波処理持続時間（ＳＤ）１０～２００ｍｓにおいて変動、および刺激間間隔（ＩＳＩ）０．０１～２秒。ピーク音圧、０．５ＭＨｚ、２．２５、および１５ＭＨｚトランスデューサーで、それぞれ、０．１１～０．８８ＭＰａ、０．３～１．６ＭＰａ、０．２～１．４ＭＰａにおいて変動。対応する推定Ｉｓｐｔａ値は、０．０６～２．２８Ｗ／ｃｍ２、０．２９～１０．８４Ｗ／ｃｍ２および１．１３～２６．８８Ｗ／ｃｍ２で変動させた。
３つの異なる中心周波数を有する３つのトランスデューサー：０．５ＭＨｚトランスデューサー（Ｖ３０１－ＳＵ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）、２．２５ＭＨｚトランスデューサー（Ｖ３０６－ＳＵ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）および１５ＭＨｚトランスデューサー（Ｖ３１９－ＳＵ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して、異なるサイズの焦点スポットを作製した。ＴｉｅＰｉｅ Ｈａｎｄｙｓｃｏｐｅ（ＨＳ３，ＴｉｅＰｉｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を使用して刺激波形を生成し、トランスデューサーに接続させた８０ｄＢ ＲＦ電力増幅器（ＶＢＡ ２３０－８０，Ｖｅｃｔａｗａｖｅ）を通過させた。ＵＳトランスデューサーの音響場分布は、水浴内でレーザー干渉計を使用して測定した。０．５、２．２５、および１５ＭＨｚのトランスデューサーでは、ｘｙ平面での焦点スポット直径の推定半値全幅（ＦＷＨＭ）は、それぞれ、６．５０、１．７４、および０．４８ｍｍとし、ｘｚ平面の長軸は、４３．４５、１８．２２、および４．９ｍｍとした（図５）。Ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ刺激に使用するＵＳ刺激は、次の特徴を有するものであった：５０％デューティサイクル（ＤＣ）の１ｋＨｚパルス繰り返し周波数（ＰＲＦ）、超音波処理持続時間（ＳＤ）１０～２００ｍｓにおいて変動、および刺激間間隔（ＩＳＩ）０．０１～２秒。ピーク音圧、０．５ＭＨｚ、２．２５、および１５ＭＨｚトランスデューサーで、それぞれ、０．１１～０．８８ＭＰａ、０．３～１．６ＭＰａ、０．２～１．４ＭＰａにおいて変動。対応する推定Ｉｓｐｔａ値は、０．０６～２．２８Ｗ／ｃｍ２、０．２９～１０．８４Ｗ／ｃｍ２および１．１３～２６．８８Ｗ／ｃｍ２で変動させた。
【0245】
Ｅｘ ｖｉｖｏ
硝子体内遺伝子送達および網膜イメージング
ラットをイソフルラン（誘導用に５％、維持用に３％）で麻酔し、ニードルの先端を直接観察しながら、８～１４×１０１０のウイルス粒子を含むＡＡＶ溶液２μｌを硝子体腔の中心に注射した。注射の１ヶ月後、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶ網膜イメージング顕微鏡（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）を使用して、注射された眼の蛍光イメージングを実施し、蛍光ｔｄＴｏｍａｔｏタグを介してＭｓｃＬの発現を観察した。電気生理学的記録は、注射の少なくとも１ヶ月後に実施した。
硝子体内遺伝子送達および網膜イメージング
ラットをイソフルラン（誘導用に５％、維持用に３％）で麻酔し、ニードルの先端を直接観察しながら、８～１４×１０１０のウイルス粒子を含むＡＡＶ溶液２μｌを硝子体腔の中心に注射した。注射の１ヶ月後、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶ網膜イメージング顕微鏡（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）を使用して、注射された眼の蛍光イメージングを実施し、蛍光ｔｄＴｏｍａｔｏタグを介してＭｓｃＬの発現を観察した。電気生理学的記録は、注射の少なくとも１ヶ月後に実施した。
【0246】
ＭＥＡ記録
網膜は、室温で９５％Ｏ２および５％ＣＯ２でバブリングさせたエイムス培地（Ａ１４２０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中、暗赤色光下で単離させた。網膜片をフィルター膜（Ｗｈａｔｍａｎ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で平らにし、ポリ－Ｌ－リジン（０．１％，Ｓｉｇｍａ）でコーティングした多電極アレイ（ＭＥＡ）（電極直径３０μｍ、間隔２００μｍ、ＭＥＡ２５６２００／３０ｉＲ－ＩＴＯ，Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に入れ、電極は、網膜神経節細胞に面している。網膜は、実験中、３４℃で２ｍＬ／分の速度でバブリングさせたエイムス培地で連続的に灌流させた。
網膜は、室温で９５％Ｏ２および５％ＣＯ２でバブリングさせたエイムス培地（Ａ１４２０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中、暗赤色光下で単離させた。網膜片をフィルター膜（Ｗｈａｔｍａｎ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で平らにし、ポリ－Ｌ－リジン（０．１％，Ｓｉｇｍａ）でコーティングした多電極アレイ（ＭＥＡ）（電極直径３０μｍ、間隔２００μｍ、ＭＥＡ２５６２００／３０ｉＲ－ＩＴＯ，Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に入れ、電極は、網膜神経節細胞に面している。網膜は、実験中、３４℃で２ｍＬ／分の速度でバブリングさせたエイムス培地で連続的に灌流させた。
【0247】
実体顕微鏡（ＳＭＺ２５，Ｎｉｋｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＴｄＴｏｍａｔｏの蛍光を確認して、記録し、記録された領域での導入遺伝子の発現を観察した。いくつかの実験では、ＡＭＰＡ／カイニン酸グルタミン酸受容体アンタゴニスト、６－シアノ－７－ニトロキノキサリン－２，３－ジオン（ＣＮＱＸ，２５μＭ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＮＭＤＡグルタミン酸受容体アンタゴニスト、［３Ｈ］３－（２－カルボキシピペラジン－４－イル）プロピル－１－ホスホン酸（ＣＰＰ，１０μＭ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および選択的グループＩＩＩ代謝型グルタミン酸受容体アゴニスト、Ｌ－（＋）－２－アミノ－４－ホスホノ酪酸（Ｌ－ＡＰ４，５０μＭ，Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）を新たに希釈し、記録する１０分前に灌流システムを介して浸浴させた。
【0248】
全視野光刺激は、光受容体面に集束させ白色光ＬＥＤ光源（ＭＮＷＨＬ４，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）と組み合わせたデジタルマイクロミラーディスプレイ（ＤＭＤ，Ｖｉａｌｕｘ，解像度１０２４ｘ７６８）を使用して送達させた。光放射照度値は、１μＷ／ｃｍ２である。ＵＳトランスデューサーは、脱気水で満たした特注のカップリングコーンに連結させ、電動ステージ（ＰＴ３／Ｍ－Ｚ８、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）に取り付け、網膜の上の記録チャンバーに直交させて置いた。
【0249】
ＵＳトランスデューサーを網膜上に位置付けるために、ＭＥＡチップおよび網膜の反射シグナルをＵＳ－ｋｅｙデバイス（Ｌｅｃｏｅｕｒ Ｅｌｅｔｒｏｎｉｑｕｅ）を使用して検出した。網膜とトランスデューサーとの間の距離は、トランスデューサーの焦点距離に等しく、反射シグナルの飛行時間を使用して検証した。
【0250】
ＲＧＣ記録は、２５２チャネルのプリ増幅器（ＭｕｌｔｉＣｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してデジタル化した。個々のニューロンからのスパイクは、ＳｐｙｋｉｎｇＣｉｒｃｕｓソフトウェアを使用して分類した。次に、Ｍａｔｌａｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ、ＵＳＡ）で記述されたカスタムスクリプトを使用して、ＲＧＣ応答を分析した。それらは、応答支配指数を使用して、閃光に対する応答に従ってＯＮ、ＯＮ－ＯＦＦ、またはＯＦＦに分類した。刺激の開始またはオフセットまでの各細胞の潜時は、スパイク密度関数の導関数の最大値として計算した。ＵＳ刺激に応答する細胞について、ＵＳに対する自然応答の潜時分布の最小値（４５ｍｓ）に等しい閾値を固定することにより、それらの潜時（短潜時および長潜時）に従って、２つのクラスを識別させた。応答持続時間を計算するために、スパイク密度関数のピーク値Ａを決定した。応答持続時間は、ＳＤＦがＡ／ｅ（ｅ：オイラー数）に等しい２つの時点間の時間間隔として定義する。ＵＳ圧力を増加させた、ＵＳ刺激に対する応答細胞率は、活性化された細胞の数と考慮されたすべてのＵＳ圧力に対する応答細胞の最大数との比率として計算した。スパイク数のばらつきを定量化するファノ因子は、平均値に対するスパイク数の分散の比率として計算した。１未満の値は、情報内容量の増加を示す。２つの活性化細胞間のユークリッド距離は、細胞の最大発火率に重み付けした。活性化細胞数とＭＥＡチップ上の刺激領域のサイズとの比率は、焦点スポットがＭＥＡよりも大きいため、２．２５ＭＨｚおよび１５ＭＨｚのＵＳ焦点スポットサイズおよび０．５ＭＨｚのＭＥＡのサイズを考慮して計算した。応答の中心は、各細胞の発火率の最大値を他の応答細胞からの距離に重み付けすることによって推定し、応答の変位は、２つの位置間のユークリッド距離として計算した。
【0251】
Ｉｎ ｖｉｖｏ
頭蓋内注射
ラットは、ケタミン／メデトミジン（４０ｍｇ／ｋｇ／０．１４ｍｇ／ｋｇ）混合物で麻酔した。手術部位を剃毛し、頭蓋骨を露出させるために正中切開を行った。動物を定位固定フレームに入れた後、注射部位に２つの穿頭孔を開けた。ＡＡＶ溶液は、右半球の２つの異なる場所に注射した（ブレグマからの座標：２．６ｍｍ ＭＬ、６．８ｍｍ ＡＰおよび３．１ｍｍ ＭＬ、７．２ｍｍ ＡＰ）。各場所について、２００ｎｌのウイルスベクター（０．２～８ｘ１０１５のウイルス粒子を含む）を、マイクロシリンジポンプコントローラー（Ｍｉｃｒｏ４、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、速度５０ｎｌ／分および１０μｌハミルトンシリンジを用いて、３つの異なる深さ（１１００、１３５０、および１５００μｍ ＤＶ）で注射した。電気生理学的記録は、少なくとも注射１ヶ月後に実施した。
頭蓋内注射
ラットは、ケタミン／メデトミジン（４０ｍｇ／ｋｇ／０．１４ｍｇ／ｋｇ）混合物で麻酔した。手術部位を剃毛し、頭蓋骨を露出させるために正中切開を行った。動物を定位固定フレームに入れた後、注射部位に２つの穿頭孔を開けた。ＡＡＶ溶液は、右半球の２つの異なる場所に注射した（ブレグマからの座標：２．６ｍｍ ＭＬ、６．８ｍｍ ＡＰおよび３．１ｍｍ ＭＬ、７．２ｍｍ ＡＰ）。各場所について、２００ｎｌのウイルスベクター（０．２～８ｘ１０１５のウイルス粒子を含む）を、マイクロシリンジポンプコントローラー（Ｍｉｃｒｏ４、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、速度５０ｎｌ／分および１０μｌハミルトンシリンジを用いて、３つの異なる深さ（１１００、１３５０、および１５００μｍ ＤＶ）で注射した。電気生理学的記録は、少なくとも注射１ヶ月後に実施した。
【0252】
Ｉｎ ｖｉｖｏ細胞外記録
ラットは、ケタミン／メデトミジン（４０ｍｇ／ｋｇ／０．１４ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔した。瞳孔は、トロピカミド（Ｍｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ， Ｄｉｓｐｅｒｓａ）を使用して、拡張させた。小開頭（５ｘ５ｍｍ四方）は、右半球のＶ１上にドリルで行った。記録前に、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶ網膜イメージング顕微鏡（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）を使用して、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光を確認した。
ラットは、ケタミン／メデトミジン（４０ｍｇ／ｋｇ／０．１４ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔した。瞳孔は、トロピカミド（Ｍｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ， Ｄｉｓｐｅｒｓａ）を使用して、拡張させた。小開頭（５ｘ５ｍｍ四方）は、右半球のＶ１上にドリルで行った。記録前に、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶ網膜イメージング顕微鏡（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）を使用して、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光を確認した。
【0253】
３２部位Ｅｃｏｇ電極アレイ（電極直径３０μｍ、電極間隔３００μｍ、ＦｌｅｘＭＥＡ３６、ＭｕｌｔｉＣｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＭｓｃＬを発現するラットのトランスフェクトされた脳領域上、または対照ラットの同じゾーンに位置付けた。Ｅｃｏｇの記録後、１６部位シリコンマイクロプローブ（電極直径３０μｍ、間隔５０μｍ、Ａ１ｘ１６－５ｍｍ－５０－７０３、ＮｅｕｒｏＮｅｘｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、多電極（ＭＥＡ）記録を実施した。ＭＥＡプローブは、３軸マイクロマニピュレーター（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を使用して、皮質内に垂直に１１００μｍ前進させた。ＵＳトランスデューサーは、脱気水およびＵＳゲルで満たした特注のカップリングコーンを使用して脳に連結させ、電動ステージを使用して目的の領域上に位置付けた。プローブおよびＵＳトランスデューサーは、μＥｃｏｇ記録では、垂直に、皮質内記録では、４５°傾斜させた。皮質内の標的とトランスデューサーとの間の距離は、トランスデューサーの焦点距離に等しく、ＵＳ－ｋｅｙ（Ｌｅｃｏｅｕｒ Ｅｌｅｔｒｏｎｉｑｕｅ）により反射シグナルを使用して検証した。
【0254】
視覚刺激は、眼から１５ｃｍ離して配置した白色光コリメートＬＥＤ（ＭＮＷＨＬ４、Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）によって生じさせた。角膜レベルでの光放射照度は、４．５ｍＷ／ｃｍ２であった。
【0255】
μＥｃｏｇおよび細胞外シグナルは、それぞれ３２チャネル増幅器および１６チャネル増幅器（モデルＭＥ３２／１６－ＦＡＩ－μＰＡ－Ｓｙｓｔｅｍ，ＭｕｌｔｉＣｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してデジタル化した。μＥｃｏｇの記録は、カスタムＭａｔｌａｂスクリプトを使用してさらに分析した。ＳｐｙｋｉｎｇＣｉｒｃｕｓソフトウェアを使用してＭＥＡ記録をさらに分析し、カスタムＭａｔｌａｂスクリプトを使用して単一チャネルイベントを分析した。μＥｃｏｇ記録の場合、応答持続時間は、皮質誘発電位がＡ／ｅに等しい２つの時点間の時間間隔として計算した（式中、Ａはピーク脱分極であり、ｅ：オイラー数である）。各チャネルのピーク脱分極を直線的に補間して、疑似カラー活性化マップを作成する。活性化領域は、ピーク脱分極が３０μＶを超えた疑似カラー活性化マップの領域として画定した。応答の中心は、各電極のピーク脱分極を他の電極からの距離に重み付けすることによって推定した。皮質内記録では、細胞潜時は、スパイク密度関数の導関数の最大値として推定した。
【0256】
Ｉｎ ｖｉｖｏ行動試験のための手術
ケタミン／キシラジン（８０ｍｇ／ｋｇ／８ｍｇ／ｋｇ）の混合物を使用してマウスを麻酔し、頭を定位固定フレームに固定した。小開頭（約３ｍｍｘ３ｍｍ）は、右半球のＶ１上にドリルで行った。皮質は、ＴＰＸプラスチックシートを使用してカバーし、歯科用アクリルセメント（Ｔｅｔｒｉｃ Ｅｖｏｆｌｏｗ）を使用して密封した。行動実験では、頭部固定用の金属製ヘッドバー（Ｐｈｅｎｏｓｙｓ）を歯科用セメント（ＦＵＪＵＣＥＭ ＩＩ）を使用して左半球の頭蓋骨に接着させた。マウスの行動トレーニングは、外科手術の少なくとも１０日後に行った。
ケタミン／キシラジン（８０ｍｇ／ｋｇ／８ｍｇ／ｋｇ）の混合物を使用してマウスを麻酔し、頭を定位固定フレームに固定した。小開頭（約３ｍｍｘ３ｍｍ）は、右半球のＶ１上にドリルで行った。皮質は、ＴＰＸプラスチックシートを使用してカバーし、歯科用アクリルセメント（Ｔｅｔｒｉｃ Ｅｖｏｆｌｏｗ）を使用して密封した。行動実験では、頭部固定用の金属製ヘッドバー（Ｐｈｅｎｏｓｙｓ）を歯科用セメント（ＦＵＪＵＣＥＭ ＩＩ）を使用して左半球の頭蓋骨に接着させた。マウスの行動トレーニングは、外科手術の少なくとも１０日後に行った。
【0257】
マウス行動試験
Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスを水制限スケジュールに置き、自由体重の約８０～８５％に達するまで、約０．５～１ｍＬ／日の水を毎日与えた。最初の５日間は、マウスをシリンジから飲むように徐々に慣れさせ、頭を固定し、円筒形の本体チューブに封入した。次に、マウスは、左眼の白色光全視野刺激（長さ２００ｍｓおよび５０ｍｓ）に応答して、ウォータースパウト（鈍い１８Ｇニードル、口から約５ｍｍ）をリックすることによって自発的な検出タスクを行うことにより、光刺激に応答するようにトレーニングした（トロピカミド、Ｍｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ Ｄｉｓｐｅｒｓａを使用して拡張）。水（約４μＬ）は、較正させた水システムを介して、光の開始から５００ｍｓ後に自動的に分配させた。行動プロトコールおよびリックの検出は、特注のシステムによって制御した。可視光トレーニングは、光刺激のために４日間継続した。典型的なトレーニングセッションを約３０分間継続させ、その間にマウスは７５～１００回試行した。光刺激トレーニング後、４日間（１日目と２日目は、週末に２日間の休憩を入れた）右半球内のＶ１のＵＳ刺激を行った。これらの４日間は、３つの異なる圧力値（０．２、０．７、および１．２ＭＰａ）での長さ５０ｍｓのＵＳ刺激を挿入したが、刺激の順序は毎日変更した。光とＵＳ刺激の試行間隔は、ランダムに変更し、１０秒から３０秒の範囲であった。１５ ＭＨｚ ＵＳトランスデューサーは、水およびＵＳゲルで満たした特注のカップリングコーンを使用して脳に連結させ、電動ステージにより目的の領域上に位置付けた。マウスの行動に対する光およびＵＳ刺激の影響を評価するために、奏功率は、マウスが予測的リック、すなわち刺激の開始と水弁の開口との間に起こったリックを行ったときの試行回数を数えることによって評価した。予測的リック率は、自発的リック率（刺激開始前に１秒の時間枠で計算）を差し引き、その後奏功率を乗算して、計算した。リック潜時時間は、刺激開始後の最初の予測的リックの潜時時間を決定することによって計算した。
Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスを水制限スケジュールに置き、自由体重の約８０～８５％に達するまで、約０．５～１ｍＬ／日の水を毎日与えた。最初の５日間は、マウスをシリンジから飲むように徐々に慣れさせ、頭を固定し、円筒形の本体チューブに封入した。次に、マウスは、左眼の白色光全視野刺激（長さ２００ｍｓおよび５０ｍｓ）に応答して、ウォータースパウト（鈍い１８Ｇニードル、口から約５ｍｍ）をリックすることによって自発的な検出タスクを行うことにより、光刺激に応答するようにトレーニングした（トロピカミド、Ｍｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ Ｄｉｓｐｅｒｓａを使用して拡張）。水（約４μＬ）は、較正させた水システムを介して、光の開始から５００ｍｓ後に自動的に分配させた。行動プロトコールおよびリックの検出は、特注のシステムによって制御した。可視光トレーニングは、光刺激のために４日間継続した。典型的なトレーニングセッションを約３０分間継続させ、その間にマウスは７５～１００回試行した。光刺激トレーニング後、４日間（１日目と２日目は、週末に２日間の休憩を入れた）右半球内のＶ１のＵＳ刺激を行った。これらの４日間は、３つの異なる圧力値（０．２、０．７、および１．２ＭＰａ）での長さ５０ｍｓのＵＳ刺激を挿入したが、刺激の順序は毎日変更した。光とＵＳ刺激の試行間隔は、ランダムに変更し、１０秒から３０秒の範囲であった。１５ ＭＨｚ ＵＳトランスデューサーは、水およびＵＳゲルで満たした特注のカップリングコーンを使用して脳に連結させ、電動ステージにより目的の領域上に位置付けた。マウスの行動に対する光およびＵＳ刺激の影響を評価するために、奏功率は、マウスが予測的リック、すなわち刺激の開始と水弁の開口との間に起こったリックを行ったときの試行回数を数えることによって評価した。予測的リック率は、自発的リック率（刺激開始前に１秒の時間枠で計算）を差し引き、その後奏功率を乗算して、計算した。リック潜時時間は、刺激開始後の最初の予測的リックの潜時時間を決定することによって計算した。
【0258】
免疫組織化学および共焦点イメージング
形質導入させた網膜および脳は、４％パラホルムアルデヒド（１００４９６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で固定した（網膜は３０分間、脳は一晩）。脳を３０％スクロース（８４０９７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で凍結保護し、ミクロトーム（ＨＭ４５０、Ｍｉｃｒｏｍ）を使用して、厚さ５０μｍの矢状スライスを切り出した。各脳の最もｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光スライスを、さらなる免疫組織化学およびイメージングのために選択した。網膜および矢状脳凍結切片を、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含むＰＢＳで、室温で１時間透過処理後、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で、室温で１時間インキュベートした。サンプルを、半希釈ブロッキングバッファー＋０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１０中、網膜の場合はモノクローナル抗ＲＢＰＭＳ抗体（１：５００、ウサギ、ＡＢＮ１３６２、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で、脳切片の場合はモノクローナル抗ＮｅｕＮ抗体（１：５００、マウス、ＭＡＢ３７７、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で、４℃で一晩インキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（１：５００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）およびＤＡＰＩ（１：１０００、Ｄ９５４２、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とコンジュゲートさせた二次抗体を室温で１時間適用した。オリンパスＦＶ１０００レーザー走査型共焦点顕微鏡、対物レンズ２０倍（ＵＰＬＳＡＰＯ ２０ＸＯ、ＮＡ：０．８５）を使用して、フラットマウントさせた網膜および脳切片の画像を取得した。
形質導入させた網膜および脳は、４％パラホルムアルデヒド（１００４９６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で固定した（網膜は３０分間、脳は一晩）。脳を３０％スクロース（８４０９７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で凍結保護し、ミクロトーム（ＨＭ４５０、Ｍｉｃｒｏｍ）を使用して、厚さ５０μｍの矢状スライスを切り出した。各脳の最もｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光スライスを、さらなる免疫組織化学およびイメージングのために選択した。網膜および矢状脳凍結切片を、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含むＰＢＳで、室温で１時間透過処理後、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で、室温で１時間インキュベートした。サンプルを、半希釈ブロッキングバッファー＋０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１０中、網膜の場合はモノクローナル抗ＲＢＰＭＳ抗体（１：５００、ウサギ、ＡＢＮ１３６２、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で、脳切片の場合はモノクローナル抗ＮｅｕＮ抗体（１：５００、マウス、ＭＡＢ３７７、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で、４℃で一晩インキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（１：５００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）およびＤＡＰＩ（１：１０００、Ｄ９５４２、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とコンジュゲートさせた二次抗体を室温で１時間適用した。オリンパスＦＶ１０００レーザー走査型共焦点顕微鏡、対物レンズ２０倍（ＵＰＬＳＡＰＯ ２０ＸＯ、ＮＡ：０．８５）を使用して、フラットマウントさせた網膜および脳切片の画像を取得した。
【0259】
形質転換効率の計算
共焦点画像は、形質転換効率を評価するためにＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ）で処理した。ＲＢＰＭＳおよびＮｅｕＮ陽性細胞は、分析粒子ＦＩＪＩプラグインを使用して、自動的にカウントした。ＭｓｃＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＭｓｃＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏ－ＲＢＰＭＳ／ＮｅｕＮ陽性細胞は、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｅｒ ＦＩＪＩプラグインを使用して２名の異なるユーザーによって手動でカウントした。網膜については、各網膜内のトランスフェクトされた領域を特定し、ランダムに選択された０．４ｍｍ２の８つの領域内で共焦点スタックを取得する定量化を行った。
共焦点画像は、形質転換効率を評価するためにＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ）で処理した。ＲＢＰＭＳおよびＮｅｕＮ陽性細胞は、分析粒子ＦＩＪＩプラグインを使用して、自動的にカウントした。ＭｓｃＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＭｓｃＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏ－ＲＢＰＭＳ／ＮｅｕＮ陽性細胞は、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｅｒ ＦＩＪＩプラグインを使用して２名の異なるユーザーによって手動でカウントした。網膜については、各網膜内のトランスフェクトされた領域を特定し、ランダムに選択された０．４ｍｍ２の８つの領域内で共焦点スタックを取得する定量化を行った。
【0260】
Ｖ１ニューロンの場合、最大のＭｓｃＬ発現ゾーンを有する矢状脳スライスを各動物において選択した。一部のスライスでは、ｔｄＴｏｍａｔｏがＶ１の外側にも拡散したため、Ｖ１内のＲＯＩを手動で画定し、ランダムに選択した０．４ｍｍ２の８つの領域で定量化を実施した。
【0261】
ＵＳ誘導組織加熱シミュレーション
ＵＳのニューロモデュレーションの文献で通常説明されているよりも高いＵＳ周波数（１５ＭＨｚ）での細胞刺激を考慮する場合、熱効果が重要になる可能性があるため、この影響を推定することが必須である。この推定は、次の３つのプロセスを通じて行った：１）現実的な音響パラメーターを使用した研究で使用した３つのトランスデューサーによって生成された音場のシミュレーション、２）非線形音響は、熱伝達において重要な役割を果たしていないという判定、および３）この研究で使用されたパラメーターの線形領域で、ＵＳによる集束によって誘導された熱伝達および温度上昇の現実的なシミュレーション。
ＵＳのニューロモデュレーションの文献で通常説明されているよりも高いＵＳ周波数（１５ＭＨｚ）での細胞刺激を考慮する場合、熱効果が重要になる可能性があるため、この影響を推定することが必須である。この推定は、次の３つのプロセスを通じて行った：１）現実的な音響パラメーターを使用した研究で使用した３つのトランスデューサーによって生成された音場のシミュレーション、２）非線形音響は、熱伝達において重要な役割を果たしていないという判定、および３）この研究で使用されたパラメーターの線形領域で、ＵＳによる集束によって誘導された熱伝達および温度上昇の現実的なシミュレーション。
【0262】
非線形シミュレーションでは、ＭａｔｌａｂのツールボックスｋＷａｖｅを使用して、トランスデューサーのジオメトリを３Ｄで定義し、伝播媒体（水）に次のパラメーターを使用した：音速c＝１５００ｍｓ－１、体積質量p＝１０００ｋｇｍ－３、非直線係数Ｂ／Ａ＝５、減衰係数α＝２．２ １０－３ｄＢｃｍ－１ＭＨｚ－ｙ、および減衰係数の周波数べき乗則ｙ＝２。準単色３Ｄ波動場は、５０サイクルの長いバーストを使用してシミュレートした。これにより、３Ｄでの最大圧力場および集束での波形の両方が得られた。シミュレーションは、実際のトランスデューサーを使用して水タンク中で測定した集束での圧力に到達するように、入力圧力（シミュレートされたトランスデューサーの励起）を調整することによって較正した。０．５、２．２５、および１５ＭＨｚトランスデューサーについて、ｘｙ平面のＦＷＨＭ焦点スポット径は、４．３６、１．６１、および０．２７６ｍｍであり、ｘｚ平面の主軸は、長さ、それぞれ３２．３、２０．６、および３．７５ｍｍであった。非線形効果は、集束での波形の相対的な高調波成分を推定することによって評価した。１５ＭＨｚ集束トランスデューサーの例では、焦点スポットでの実験信号とシミュレートされた信号とを比較し、非常によく一致していることがわかった（図１１Ａ）。さらに、二次高調波の振幅は、基本波よりも１９．８ｄＢ低く（シミュレートされた症例では２０．９ｄＢ）、基本波エネルギーがＥの場合、二次高調波のエネルギーはＥ／９５であることを意味する（図１１Ｂ）。したがって、非線形効果は、関与するエネルギーの約１％を占めるため、熱効果の計算では無視することができる。結論は、０．５ＭＨｚおよび１５ＭＨｚで同じであった。線形波動伝播近似を使用すると、シミュレーションの計算コストが大幅に軽減される。線形伝播シミュレーションは、３Ｄ最大圧力場を取得するために、ｋＷａｖｅ（水）を使用する場合と同じ媒体特性を有する単色モードでＭａｔｌａｂのＦｉｅｌｄ ＩＩツールボックスを使用して実施した。これらの最大圧力場は、熱源項
を構築するために使用され、式中、αnpは、検討されている周波数での脳の吸収係数（１５ＭＨｚで５９．０４Ｎｐｍ－１であり、αbrain＝０．２１ｄＢｃｍ－１ＭＨｚ－ｙおよびｙ＝１．１８から算出）であり、pbrainは、脳の体積質量＝１０４６ｋｇｍ－３であり、Cbrainは、脳の音速＝１５４６ｍｓ－１であり、Pmaxは、３Ｄの最大圧力場である。この熱源項は、ペンネのバイオ熱方程式の解法ｋＷａｖｅ中での
を使用した。ここで、Cbrainは、血液の比熱容量（３６３０Ｊ．ｋｇ－１℃－１）であり、Ktは、脳の熱伝導率（０．５１Ｗｍ－１℃－１）であり、pbloodは、血液密度１０５０ｋｇｍ－３であり、Cbloodは、血液の比熱容量（３６１７Ｊ．ｋｇ－１℃－１）であり、Pbloodは、血液灌流係数（９．７１０－３ｓ－１）であり、Tαは、動脈温度（３７℃）であり、および
であり、γbrainは、脳組織の発熱（１１．３７Ｗｋｇ－１）61,62である。脳温の初期条件はT0＝３７℃に設定した。
【数1】
【数2】
【数3】
【0263】
このシミュレーションは、以下に示す温度上昇に関する最悪のシナリオに対応する。１）伝播の一部が脳中で発生したとしても、音響伝播は脳（０．５９ｄＢｃｍＭＨｚ－１．２７）よりも低い減衰係数（２．２１０－３ｄＢｃｍＭＨｚ－２）で水においてのみシミュレートする。したがってpmaxマップは、過大に推定される。２）熱吸収は、脳組織内のみでシミュレートし、最大圧力場の一部が実際に音響カップリングコーンの水中にある場合でも、水と比較して高い吸収係数（０．２１ｄＢｃｍＭＨｚ－１．１８）を示す。したがって、ここでもQUSは、わずかに過大に推定される。温度は、３Ｄおよび時間でマッピングし、最大温度上昇のポイントを探した（図１１Ｃ～Ｆ）。
【0264】
データ分析
Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ ７、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、バージョン７．０）を使用して、統計分析を実施した。すべての値は、平均±標準誤差平均として表す。実施した統計検定は、図の例中に詳細に示す。
Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ ７、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、バージョン７．０）を使用して、統計分析を実施した。すべての値は、平均±標準誤差平均として表す。実施した統計検定は、図の例中に詳細に示す。
【0265】
結果
実施例１：３つの集束超音波トランスデューサーの特性評価
音響遺伝学的脳活性化の概念を実証する好適なアプローチを調べるために、３つの集束超音波トランスデューサーの特徴を最初に明らかにした。それらの寸法および幾何学的集束は、ヒトでの適用において今後移植するマトリックスアレイの関連モデルを提供し、かつげっ歯類における概念の実証実験に適するように選択した（図１０Ａ～Ｂ）。トランスデューサーは、異なる周波数範囲（それぞれ波長３．０、０．７、および０．１ｍｍに対応するｆ＝０．５ＭＨｚ、ｆ＝２．２５ＭＨｚ、およびｆ＝１５ＭＨｚ）で、集束ビームを送信する同様の集束距離（低周波数ではＦ＝３１．７ｍｍ、２つの高周波数ではＦ＝２５．４ｍｍ）で設計した（図１０Ｃ～Ｅ）。超音波刺激の周波数を０．５ＭＨｚ（典型的なニューロモデュレーション）（図１０Ｃ）から１５ＭＨｚ（図１０Ｅ）に増加させると、達成可能な分解能が劇的に変化し、波長を約３０で割ると、焦点スポットのサイズが小さくなり、このため、刺激される体積が２７，０００分の１になる。したがって、ほとんどの実験は、１５ＭＨｚで行い、効率および空間分解能の点で比較するために、２つの低い周波数を最初に使用した。
実施例１：３つの集束超音波トランスデューサーの特性評価
音響遺伝学的脳活性化の概念を実証する好適なアプローチを調べるために、３つの集束超音波トランスデューサーの特徴を最初に明らかにした。それらの寸法および幾何学的集束は、ヒトでの適用において今後移植するマトリックスアレイの関連モデルを提供し、かつげっ歯類における概念の実証実験に適するように選択した（図１０Ａ～Ｂ）。トランスデューサーは、異なる周波数範囲（それぞれ波長３．０、０．７、および０．１ｍｍに対応するｆ＝０．５ＭＨｚ、ｆ＝２．２５ＭＨｚ、およびｆ＝１５ＭＨｚ）で、集束ビームを送信する同様の集束距離（低周波数ではＦ＝３１．７ｍｍ、２つの高周波数ではＦ＝２５．４ｍｍ）で設計した（図１０Ｃ～Ｅ）。超音波刺激の周波数を０．５ＭＨｚ（典型的なニューロモデュレーション）（図１０Ｃ）から１５ＭＨｚ（図１０Ｅ）に増加させると、達成可能な分解能が劇的に変化し、波長を約３０で割ると、焦点スポットのサイズが小さくなり、このため、刺激される体積が２７，０００分の１になる。したがって、ほとんどの実験は、１５ＭＨｚで行い、効率および空間分解能の点で比較するために、２つの低い周波数を最初に使用した。
【0266】
実施例２：Ｅｘ ｖｉｖｏでの網膜神経節細胞の刺激
哺乳動物の神経回路における音響遺伝学療法を調査するために、大コンダクタンス機械受容イオンチャネル（ＭｓｃＬ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでの眼の硝子体へのアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）送達を使用して、ラット網膜神経節細胞（ＲＧＣ）で発現させた。ベクターは、大腸菌由来のＭｓｃＬ遺伝子をそのオリジナル形態（ＷＴ）で、アミノ酸置換Ｇ２２ｓを使用して産生し、培養ニューロンの機械的刺激に対する感受性が増大した。アデノ随伴ウイルスベクター、血清型ＡＡＶ２．７ｍ８である音響遺伝学的ベクターは、ＳＮＣＧ特異的ＲＧＣプロモーター下で赤色蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏに融合したこれらのＭｓｃＬチャネルをコードしていた。Ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、両方のＡＡＶベクターの硝子体内注射後、ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏの発現が眼底で検出された。フラットマウントした網膜の検査では、神経節細胞層および光線維束に限定されたｔｄＴｏｍａｔｏ発現が示された。発現がＲＧＣに限定されていることをさらに実証するために、これらの細胞をＲＰＢＭＳ抗体で標識した。染色は、トランスフェクトされた領域において、ＲＰＢＭＳ陽性細胞の３３．７３％および４５．８３％が、それぞれＭｓｃＬ－ＷＴおよびＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓタンパク質のｔｄＴｏｍａｔｏを発現したことを示した（図１Ａ）。ＭｓｃＬ遺伝子の発現は、細胞体および軸索上の細胞膜に集中しているように見えた。
哺乳動物の神経回路における音響遺伝学療法を調査するために、大コンダクタンス機械受容イオンチャネル（ＭｓｃＬ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでの眼の硝子体へのアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）送達を使用して、ラット網膜神経節細胞（ＲＧＣ）で発現させた。ベクターは、大腸菌由来のＭｓｃＬ遺伝子をそのオリジナル形態（ＷＴ）で、アミノ酸置換Ｇ２２ｓを使用して産生し、培養ニューロンの機械的刺激に対する感受性が増大した。アデノ随伴ウイルスベクター、血清型ＡＡＶ２．７ｍ８である音響遺伝学的ベクターは、ＳＮＣＧ特異的ＲＧＣプロモーター下で赤色蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏに融合したこれらのＭｓｃＬチャネルをコードしていた。Ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、両方のＡＡＶベクターの硝子体内注射後、ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏの発現が眼底で検出された。フラットマウントした網膜の検査では、神経節細胞層および光線維束に限定されたｔｄＴｏｍａｔｏ発現が示された。発現がＲＧＣに限定されていることをさらに実証するために、これらの細胞をＲＰＢＭＳ抗体で標識した。染色は、トランスフェクトされた領域において、ＲＰＢＭＳ陽性細胞の３３．７３％および４５．８３％が、それぞれＭｓｃＬ－ＷＴおよびＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓタンパク質のｔｄＴｏｍａｔｏを発現したことを示した（図１Ａ）。ＭｓｃＬ遺伝子の発現は、細胞体および軸索上の細胞膜に集中しているように見えた。
【0267】
超音波に対するＲＧＣの感受性を測定するために、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、多電極アレイ上で網膜を記録した。ＭｓｃＬチャネルを発現する網膜の場合、多くのＲＧＣは、非常に短い潜時（ＳＬ）（１２．２±２．５ｍｓ）で強力かつ持続的なＯＮ応答を示した（図１Ｂ）。これらのＳＬ ＯＮ ＵＳ（超音波）応答の生成は、光に対するＯＮおよび／またはＯＦＦ応答のいずれかを生成する細胞中で測定したため、特定のＲＧＣ細胞型とは関連がなかった（図４Ａ）。ＭｓｃＬの発現は、潜時を短縮したが、ＵＳ応答細胞の数も増加した（図１Ｃ）。さらに、ＵＳ圧力値を低下させるＲＧＣ感受性を大幅に向上させた（図１Ｄ）。
【0268】
異なるＵＳ周波数で刺激した場合のＵＳの応答も比較した。応答の特徴は、０．５ＭＨｚおよび２．２５ＭＨｚの両方のＵＳ刺激で類似していた（図４Ａ～Ｅ）。さらに、Ｇ２２ｓ変異は、ＲＧＣのＵＳ圧力を低下させるＵＳ感受性をさらに向上させることが観察された（図１Ｅ）。
【0269】
ＵＳ応答の時間的動力学は、様々なＵＳ刺激持続時間および様々な繰り返し率で調査した。ニューロンは、非常に短い刺激持続時間（１０ｍｓ）にも応答し、刺激のオフセット後も応答が持続した（図２Ａ）。１００ｍｓを超える長い刺激では、応答は一過性となり、この形態の慣れにより、応答が解消されることはないが、最大発火率は低下した（図２Ｃ）。ＵＳ応答持続時間は、刺激持続時間と相関していた（図２Ｄ）。１５ＭＨｚのＵＳ刺激（刺激間間隔の１０％に等しい刺激持続時間）の異なる繰り返し率を使用すると、ＲＧＣは１０Ｈｚまでリズムを追従可能であった（図２Ｂ～図２Ｅ）。以前の実験におけるファノ因子は、応答の高い再現性および高い内容を示した（図２Ｃ～図２Ｅ）。
【0270】
次に、異なる超音波周波数（０．５、２．２５、および１５ＭＨｚ）が、高いＵＳ周波数において小さくなる測定されたＵＳ圧力場と一致して、空間分解能に影響を与え得るかを調査した（図５Ａ～Ｃ）。ＵＳ応答細胞は、０．５および２．５ＭＨｚにおいて、記録された網膜全体に広く分布しているが、１５ＭＨｚではスポット内により限定されているように見える。次に、刺激を受けた網膜ごとに、ＵＳ応答細胞間の重み付けした平均距離を異なるＵＳ周波数で計算した。対応する平均値は、それぞれ０．５ＭＨｚおよび２．２５ＭＨｚにおいて、１．４８±０．１２ｍｍ（ｎ＝１２網膜）および１．３０±０．１８ｍｍ（ｎ＝５網膜）から、１５ＭＨｚにおいて０．５９±０．０３ｍｍ（ｎ＝９網膜）に減少した（図２Ｆ）（ＭＥＡチップ上の２つのランダムに選択された電極間の平均距離は１．７３ｍｍであった）。ＭＥＡチップ上の刺激領域のサイズにスケーリングさせた活性化細胞の数は、ＵＳ周波数を上昇させたときに大幅に増加し（図２Ｇ）、これは、高い周波数のＵＳ刺激がより効果的であることを示唆している。実際に、２．２５ＭＨｚおよび１５ＭＨｚでの単位面積あたりの音響強度は非常に類似しており（それぞれＩｓｐｔｐ＝４０．３Ｗ／ｃｍ２およびＩｓｐｔｐ＝５６．３Ｗ／ｃｍ２）、その結果、１５ＭＨｚでもたらされる音響パワーは２．２５ＭＨｚよりも低かった。活性化細胞間の平均距離は、測定された超音波圧力場のサイズと十分に一致していた（図５Ａ～Ｃ）。興味深いことに、１５ＭＨｚでは、記録領域が十分に大きかったため、刺激プローブを網膜上に移動させることができ、それによって応答細胞のシフトの引き金となった。応答細胞のこのシフトは、網膜上へのプローブの動きと同じ方向およびペースに追従した。応答の中心は、各細胞の発火率の最大値を他の応答細胞からの距離に重み付けすることによって推定した。応答の中心は、ＵＳトランスデューサーの変位に応じて移動することが判明した（図２Ｈ）。これらの結果により、本明細書で提示された音響遺伝学療法が、視覚回復に必要なパターン化された刺激に適合する空間分解能を提供できることが実証された。
【0271】
実施例３：ｉｎ ｖｉｖｏでの視覚皮質における皮質ニューロンの刺激
１５ＭＨｚの刺激が高い時間的および空間分解能でＲＧＣを確実に活性化できることがｅｘ ｖｉｖｏで確立されると、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、この音響遺伝学療法を脳にも適用できるかを調べた。赤色蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏに融合したＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓチャネルをコードするＡＡＶベクター血清型ＡＡＶ９－７ｍ８ ＣａｍＫＩＩ（ＡＡＶ９．７ｍ８－ＣａｍＫＩＩ－ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）をラットＶ１視覚皮質に注射した。ＴｄＴｏｍａｔｏ蛍光は、脳レベルおよび皮質スライスで既に検出された。皮質Ｖ１細胞は、特に、層４でｔｄＴｏｍａｔｏを発現していた。ＮｅｕＮ抗体により検出された皮質ニューロンの３３．４±１４．４％（ｎ＝３ラット）が、ＣａｍＫＩＩプロモーターのトランスフェクトされた領域内でｔｄＴｏｍａｔｏを発現していた。
１５ＭＨｚの刺激が高い時間的および空間分解能でＲＧＣを確実に活性化できることがｅｘ ｖｉｖｏで確立されると、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、この音響遺伝学療法を脳にも適用できるかを調べた。赤色蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏに融合したＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓチャネルをコードするＡＡＶベクター血清型ＡＡＶ９－７ｍ８ ＣａｍＫＩＩ（ＡＡＶ９．７ｍ８－ＣａｍＫＩＩ－ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）をラットＶ１視覚皮質に注射した。ＴｄＴｏｍａｔｏ蛍光は、脳レベルおよび皮質スライスで既に検出された。皮質Ｖ１細胞は、特に、層４でｔｄＴｏｍａｔｏを発現していた。ＮｅｕＮ抗体により検出された皮質ニューロンの３３．４±１４．４％（ｎ＝３ラット）が、ＣａｍＫＩＩプロモーターのトランスフェクトされた領域内でｔｄＴｏｍａｔｏを発現していた。
【0272】
Ｖ１ニューロンを活性化する短い１５ＭＨｚ刺激の能力を調査するために、μＥｃｏＧ電極アレイをＶ１のトランスフェクトされた領域に置いた（図３Ａ）。ＡＡＶ注射でない場合、ＵＳ誘発シグナルは記録されなかったが（図３Ｂ）、ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓ－ｔｄＴを発現するＶ１では、皮質表面のＵＳ刺激によって大きな負のμＥｃｏＧ電位が生じた（図３Ｂ）。音響遺伝学的応答は、視覚誘発電位について観察されたように、負の偏向を示した（図３Ｂ）。これらのＵＳ応答は、上記の網膜で観察されたとおり、ＵＳ刺激オフセットの数ミリ秒後、持続していたため（図３Ｂ）、ＭｓｃＬ活性化と一致していた。ＵＳ応答持続時間は、ＵＳ刺激持続時間と明らかに関連していた（図３Ｃ）。ＵＳ誘発電位の振幅は、ＵＳ圧力値の増加とともに増加し（図３Ｄ）、ＵＳ刺激持続時間とも関連していた（図３Ｅ）。網膜でも同様に、Ｖ１も最大８Ｈｚの繰り返し率に追従できた（図３Ｆ）。
【0273】
次に、ＵＳ誘発神経活動の空間分布を調べた。各チャネルのピーク脱分極を測定し、直線的に補間してグレイコード化させた活性化マップを作成した（図３Ｇ）。ＵＳ応答皮質領域のサイズは、０．２６および１．２７ＭＰａでそれぞれ、０．５８±０．１７ｍｍ２（ｎ＝６ラット）～１．４１±０．２３ｍｍ２（ｎ＝５ラット）であった（図３Ｉ）。パターン化されたＵＳ刺激を得る可能性を調べるために、ＵＳトランスデューサーは、記録された領域で０．４ｍｍずつ移動させた。超音波プローブを横方向に動かしたときに、生成されたニューロン活動の源は、同様の方向に移動した（図３Ｈ）。誘発電位の空間場所は、前の場所から０．２９±０．０９ｍｍ（ｎ＝６ラット）大幅に移動した（図３Ｊ）。これらの測定値は、μＥｃｏＧ電極の３００μｍ離散空間ピッチ分布および回路内の活動の横方向の広がりによっておそらく調整される。これらの結果は、音響遺伝学療法のこのアプローチが１５ＭＨｚ刺激で少なくとも４００μｍの空間分解能を提供できるという結論と一致しており、この周波数での焦点スポットは、２７６μｍである。圧力レベルに応じて、非常に小さい領域（０．２６ＭＰａで０．５８ｍｍ２以下）を標的にする可能性が開かれる。これらの非常に局所化されたＵＳ誘発応答およびそれらのＵＳプローブ位置への依存性により、それらがＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓ発現Ｖ１ニューロンの局所的活性化によるものであることが確認された。
【0274】
次に、１５ＭＨｚのＵＳ刺激が異なるＶ１深さでニューロンを活性化できるかを調べた。Ｖ１ニューロンは、多電極アレイを貫通する１６部位で記録した。ＭｓｃＬ－Ｇ２２ｓ－ｔｄＴを発現するＶ１では、１５ＭＨｚのＵＳ刺激により、１０ｍｓの長さのＵＳ刺激に対してさえもＳＬ持続応答が生じた（図３Ｋ）。これらの応答の潜時は短く（１０ｍｓおよび５０ｍｓの刺激で、それぞれ、５．１０±０．６２ｍｓ、ｎ＝２７細胞および７．５１±１．００ｍｓ、ｎ＝５８細胞、図３Ｍ）、これは、記録された皮質ニューロンの直接的なＵＳ活性化と一致する。応答するニューロンは、１００μｍから１ｍｍの範囲の様々な皮質深さで記録した（図３Ｎ）。これは、ｘｚ平面で３．７５ｍｍのＵＳプローブの焦点スポット直径である。深部ニューロンは、５０ｍｓから１０ｍｓに持続時間を短縮させた刺激に対して、異なる刺激持続時間に対する同様の発火率で確実に応答したが、長く刺激することにより、より広いニューロン集団において応答を誘導できた（図３Ｌ）。
【0275】
したがって、この音響遺伝学療法は、ビデオレートの広い脳パターン刺激に必要な高速応答時間、高い空間分解能、および高い細胞選択性と感受性の独自の組み合わせを提供する。
【0276】
実施例４：マウスでは、音響遺伝学的刺激により、光知覚を誘導する
音響遺伝学的刺激が光知覚も誘導できるかを判断するために、ＭｓｃＬ Ｇ２２Ｓトランスフェクト動物（ｎ＝９）および非トランスフェクト動物（ｎ＝７）において、Ｖ１の１５ＭＨｚＵＳ刺激後のマウスの行動を評価した。水制限マウスは、片眼の可視光刺激を水報酬と関連付けるようにトレーニングした（図９Ａ）。２３．５７％から７６．０９％に変化したこの期間中の奏功率の上昇によって示されるとおり、マウスは、このタスクを４日以内で学習した（図９Ｂ）。奏功率は、光刺激のオンセットおよび５００ｍｓ後に放出された水報酬との間に発生する予期的リックの発生によって測定した（図９Ａ）。
音響遺伝学的刺激が光知覚も誘導できるかを判断するために、ＭｓｃＬ Ｇ２２Ｓトランスフェクト動物（ｎ＝９）および非トランスフェクト動物（ｎ＝７）において、Ｖ１の１５ＭＨｚＵＳ刺激後のマウスの行動を評価した。水制限マウスは、片眼の可視光刺激を水報酬と関連付けるようにトレーニングした（図９Ａ）。２３．５７％から７６．０９％に変化したこの期間中の奏功率の上昇によって示されるとおり、マウスは、このタスクを４日以内で学習した（図９Ｂ）。奏功率は、光刺激のオンセットおよび５００ｍｓ後に放出された水報酬との間に発生する予期的リックの発生によって測定した（図９Ａ）。
【0277】
この関連付け学習段階後、５日目にマウスをＶ１のＵＳ刺激に曝露した（図９Ｂ）。最大圧力でのＵＳ刺激により、ＭｓｃＬ－Ｇ２２Ｓトランスフェクトマウスは、４日目の光刺激の奏功率（６６．９８％）と同様の奏功率（６６．９８％）を達成し（図９Ｂ）、この差は、統計的に有意でなかった。その後、週末（６日目から７日目）にかけて一時停止後、動物は、音響遺伝学的刺激を水報酬に関連付けるタスクを一部忘却していた（図９Ｂ）。しかし、１０日目に効率的な関連付けをすぐに回復させた（図９Ｂ）。これらの結果を考慮すると、最初の予測的リックの潜時は、閃光によって誘発されたもの（２８５．３±１２．４ｍｓ、ｎ＝１５）よりも音響遺伝学的刺激（１９３．２±１２．８ｍｓ、ｎ＝９）の方が短いことが観察された（図９Ｃ）。ＵＳ応答に対して潜時が短いことは、眼の光刺激に対するものよりも音響遺伝学的刺激に対する皮質ニューロンのニューロン活性化がより短いことと完全に一致している。したがって、これは、眼からＶ１への視覚情報の伝達の遅延が短縮することによって説明できる。非トランスフェクト動物は、皮質のＵＳ刺激を水報酬に関連付けることができず（図９Ｄ）、それによって、皮質ニューロンの音響遺伝学的活性化が真にトリガー因子であることが実証された。トランスフェクトマウスの視覚皮質に異なるＵＳ圧力を印加したとき、奏功率は、圧力と共に増加した（図９Ｄ）。興味深いことに、水報酬前の５００ｍｓの間のリック頻度も、ＵＳ圧力と共に増加していた（図９Ｅ）。これらの結果は、視覚皮質の音響遺伝学的刺激がマウスにおける光知覚を生じさせることを示している。
【0278】
実施例５：脳組織内でのＵＳ誘導加熱シミュレーション
脳組織内でのＵＳ誘導加熱シミュレーションでは、典型的なＵＳパラメーター（すなわち２０ｍｓ１．２７ＭＰａ）（図３Ｂ～Ｅ）では、局所温度を０．１２℃上昇させると推定され（方法を参照）、それらの高い繰り返し率（最大１３Ｈｚ）でさえ、中程度の温度上昇（＜０．３℃）につながる（図１１Ｃ～Ｆ）ことが明らかになった。ＦＤＡの制限に準拠しているこれらの低温変動および刺激手順により、このアプローチが、いかなる毒性の副作用も引き起こすことなく、ＵＳ誘発応答が温度駆動型ではなく、ＵＳによるＭｓｃＬチャネルの機械的活性化によって媒介される可能性が非常に高いことを証明する傾向にある。
脳組織内でのＵＳ誘導加熱シミュレーションでは、典型的なＵＳパラメーター（すなわち２０ｍｓ１．２７ＭＰａ）（図３Ｂ～Ｅ）では、局所温度を０．１２℃上昇させると推定され（方法を参照）、それらの高い繰り返し率（最大１３Ｈｚ）でさえ、中程度の温度上昇（＜０．３℃）につながる（図１１Ｃ～Ｆ）ことが明らかになった。ＦＤＡの制限に準拠しているこれらの低温変動および刺激手順により、このアプローチが、いかなる毒性の副作用も引き起こすことなく、ＵＳ誘発応答が温度駆動型ではなく、ＵＳによるＭｓｃＬチャネルの機械的活性化によって媒介される可能性が非常に高いことを証明する傾向にある。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図3-5】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-05
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】