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特表2023-542036ＩｇＥ介在性炎症性障害を治療するためのＩｇＥフラグメントを含む免疫原性産物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-04
(54)【発明の名称】ＩｇＥ介在性炎症性障害を治療するためのＩｇＥフラグメントを含む免疫原性産物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20230927BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230927BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230927BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230927BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20230927BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230927BHJP
C07K 14/34 20060101ALN20230927BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20230927BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 H
A61P29/00 ZNA
A61P37/08
A61P11/06
C07K16/00
C12N15/13
C07K14/34
C12N15/31
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023518159
(86)(22)【出願日】2021-09-17
(85)【翻訳文提出日】2023-05-15
(86)【国際出願番号】 EP2021075732
(87)【国際公開番号】W WO2022058571
(87)【国際公開日】2022-03-24
(31)【優先権主張番号】20306047.0
(32)【優先日】2020-09-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】63/079,686
(32)【優先日】2020-09-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．プルロニック
３．ＳＰＡＮ
(71)【出願人】
【識別番号】513140880
【氏名又は名称】ネオヴァクス
(71)【出願人】
【識別番号】511074305
【氏名又は名称】インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル）
(71)【出願人】
【識別番号】523098278
【氏名又は名称】インスティチュート パスツール
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】リーバー，ローラン
(72)【発明者】
【氏名】ブルーンス，ピエール
(72)【発明者】
【氏名】コンデ ガルシア，エヴァ
(72)【発明者】
【氏名】バツコヴィッチ，マリヤ
(72)【発明者】
【氏名】セラ，ヴィンセント
(72)【発明者】
【氏名】グラウアード－フォーゲル，ジェラルディン
(72)【発明者】
【氏名】ベルトラン，ロマン
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA03
4C085BB11
4C085CC21
4C085DD56
4C085EE01
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG06
4H045BA10
4H045BA72
4H045CA11
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA83
4H045EA20
4H045FA50
(57)【要約】
本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートされた少なくとも１つの免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含む免疫原性産物に関し、少なくとも１つの免疫グロブリンは、ＩｇＥであり、好ましくはＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥ Ｃε３ドメインを含み、担体タンパク質は、好ましくはＣＲＭ１９７である。本発明はさらに、炎症性障害、特にアレルギー性障害を治療するための上記免疫原性産物の使用に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
担体タンパク質とコンジュゲートされた少なくとも１つの免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントを含む、免疫原性産物であって、前記少なくとも１つの免疫グロブリンが、ＩｇＥ、好ましくはヒトＩｇＥであり、前記ＩｇＥフラグメントが、ＩｇＥ Ｃε３ドメインを含み、前記担体タンパク質が、好ましくはＣＲＭ１９７である、免疫原性産物。
【請求項2】
前記免疫グロブリンフラグメントが、前記ＩｇＥＣε３ドメインおよびＣε４ドメインの一部または全体を含む、請求項１に記載の免疫原性産物。
【請求項3】
前記免疫グロブリンフラグメントが、ＩｇＥ Ｃε２ドメイン、Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメインの一部または全部を含む、請求項１または請求項２に記載の免疫原性産物。
【請求項4】
前記ＩｇＥまたはそのフラグメントが、Ｇ３３５Ｃ変異を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫原性産物。
【請求項5】
前記ＩｇＥフラグメントが、配列番号７を含むかまたは配列番号７からなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫原性産物。
【請求項6】
前記ＩｇＥフラグメントが、少なくとも１つのグリコシル化を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫原性産物。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫原性産物を含む、組成物。
【請求項8】
請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫原性産物と少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項9】
請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫原性産物と少なくとも１つのアジュバントとを含む、ワクチン組成物。
【請求項10】
エマルジョンである、請求項７～９のいずれか一項に記載の組成物、医薬組成物またはワクチン組成物。
【請求項11】
請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫原性産物を生産するための方法であって、ａ）ＮＨＳ－エステル、好ましくはＮ－［γ－マレイミドブチリルオキシ］－スクシンイミドエステル（ｓＧＭＢＳ）を含むヘテロ二官能性架橋剤と前記免疫グロブリンまたはそのフラグメントを接触させ、それによりＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と前記免疫グロブリンまたはそのフラグメントの間の複合体、好ましくはｓＧＭＢＳ－免疫グロブリンまたはそのフラグメント複合体を得るステップと；
ｂ）ＮＨＳ－エステルを含む前記ヘテロ二官能性架橋剤と前記担体の間の複合体、好ましくは担体－ＳＡＴＡ複合体を生成するためにＮＨＳ－エステル、好ましくはＮ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を含むヘテロ二官能性架橋剤と前記担体タンパク質を接触させるステップと；
ｃ）ステップ（ｂ）で得られたＮＨＳ－エステルを含む前記ヘテロ二官能性架橋剤と前記担体の間の前記複合体、好ましくは前記担体－ＳＡＴＡ複合体とステップ（ａ）で得られたＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と前記免疫グロブリンまたはそのフラグメントの間の前記複合体、好ましくは前記ｓＧＭＢＳ－免疫グロブリンまたはそのフラグメント複合体を接触させるステップと、
を含む、方法。
【請求項12】
医薬品としての使用のための請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫原性産物。
【請求項13】
炎症性障害を治療するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫原性産物または請求項７～１０のいずれか一項に記載の組成物、医薬組成物もしくはワクチン組成物であって、好ましくは前記炎症性障害が、異常なＩｇＥ発現または活性に関連する、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫原性産物または請求項７～１０のいずれか一項に記載の組成物、医薬組成物もしくはワクチン組成物。
【請求項14】
前記炎症性障害が、喘息、アレルギー状態（例えば、食物アレルギー、毒物アレルギー、動物に対するアレルギー、薬物アレルギー、高ＩｇＥ症候群、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎およびアレルギー性腸胃炎など）、アナフィラキシー、アトピー性疾患（例えば、蕁麻疹（慢性特発性蕁麻疹および慢性自発性蕁麻疹を含む）、湿疹など）、水疱性類天疱瘡、呼吸器疾患（喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性気管支肺真菌症など）、鼻ポリープ症および気道炎症を伴う他の状態（例えば、好酸球増加症、線維症、および嚢胞性線維症などの過剰な粘液産生、全身性硬化症（ＳＳｃ）など）；炎症性および／または自己免疫障害または状態、胃腸障害または状態（例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、および好酸球性食道炎（ＥＥ）、および好酸球媒介性胃腸疾患、潰瘍性大腸炎、およびクローン病など）；全身性エリテマトーデス；マスト細胞症およびマスト細胞活性化症候群（ＭＣＡＳ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用のための免疫原性産物または組成物。
【請求項15】
前記炎症性障害が、アレルギー、アナフィラキシー、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、鼻ポリープ症から選択され、好ましくは前記炎症性障害が、食物アレルギーまたは毒物アレルギーである、請求項１３または請求項１４に記載の使用のための免疫原性産物または組成物。
【請求項16】
特定の抗原に対してアレルギーのある対象の脱感作を誘導するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫原性産物または請求項７～１０のいずれか一項に記載の組成物、医薬組成物もしくはワクチン組成物であって、前記免疫原性産物または組成物および前記特定の抗原が、前記アレルギー対象に投与される、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫原性産物または請求項７～１０のいずれか一項に記載の組成物、医薬組成物もしくはワクチン組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫原性産物、および異常なＩｇＥの発現または活性に関連する障害、特に、食物アレルギー、毒アレルギー、およびアナフィラキシーなどのＩｇＥ介在性アレルギーを治療するためのその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
アレルギー疾患の有病率は、過去数年間で劇的に増加しており、特に先進国では、３０％を超える小児がアレルギーに罹患している。アレルギーの最も劇的な臨床症状は、致死に至り得る急性全身反応である、アナフィラキシーである。免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）は、アレルギー反応およびアナフィラキシーの媒介において中心的な役割を果たす。アレルゲンへの曝露時に、そのようなアレルゲンは、組織マスト細胞および血液好塩基球の表面のそれらの高親和性受容体ＦｃεＲＩに結合されたアレルゲン特異的ＩｇＥによって認識され、それは、これらの細胞の脱顆粒、およびヒスタミンを含む、以前に形成されたメディエーターおよび新たに合成されたメディエーターの両方の放出を促進する。このため、アレルギーの臨床診断は主に、アレルゲン特異的ＩｇＥの測定結果に基づく。
【0003】
アレルギーのほとんどの治療法は、対症療法（主に抗ヒスタミンおよびコルチコステロイド）である。しかし近年、いくつかの組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、アレルギーの治療用に開発されている。ヒト化抗ＩｇＥｍＡｂであるオマリズマブは、アレルギー性喘息および慢性自然蕁麻疹の治療に臨床的利益を示す。利用可能な臨床データは、このｍＡｂが、食物アレルギーを含む他のタイプのアレルギーの治療にも利益を有し得ることを示唆している。しかし、オマリズマブ（または任意の他のｍＡｂ）の使用はまず第一に、高コストおよび繰り返し注射を行う必要により、およびまた抗薬物抗体（ＡＤＡ）または他の副作用の出現の潜在的なリスクにより制限される。主な医学的制限は、オマリズマブで治療された場合にアナフィラキシーのリスクがあり得る、ＩｇＥレベルが７００ＩＵ／ｍｌを超える患者である。オマリズマブよりもＩｇＥに対する親和性が顕著に高くかつおそらく低減された副作用を有する、次世代抗ＩｇＥ ｍＡｂであるリゲリズマブが開発されたが、重度の喘息患者においてオマリズマブを上回る有効性の改善を示さなかった（ＮＣＴ０２０７５００８）。オマリズマブおよびリゲリズマブは、ＩｇＥ上でそれらが結合するエピトープ、およびＦｃεＲＩ結合ＩｇＥまたはＩｇＥの産生を妨害するそれらの能力について異なる。
【0004】
したがって、ＩｇＥはアレルギーおよびアナフィラキシーの治療の有望な治療標的ではあるが、長期的な治療効果を得るために、ＩｇＥを遮断するための現在の戦略を改善する必要があることは明らかである。
【0005】
キノイドと呼ばれる治療用コンジュゲートワクチンは、異常に高度に産生された標的に対する中和抗体を誘導して、標的レベルをベースラインに戻すまたはそれより低下させるために、能動免疫戦略において使用される。
【0006】
免疫原性担体に連結されたＩｇＥの抗原性ペプチドを含む免疫原の生成を含む、このような治療用コンジュゲートをベースにしたいくつかのアプローチが、ＩｇＥ関連障害の予防および治療のために開発されている（ＷＯ２０１１／１５４８７８，ＷＯ２０１０／０６７２８６，ＷＯ９９／６７２９３，Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｓｐｉｅｇｅｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。しかし、これまでのところ、これらのコンジュゲート（ＩｇＥの小さなペプチドのみを含む）はいずれも、治療的妥当性が立証されていない。特に、第Ｉ相臨床試験中に得られた実験結果は、ＩｇＥに由来しかつ担体に連結されたペプチドが、対象の大多数において血清ＩｇＥの顕著な低下をもたらさなかったことを示した。したがって、それを必要とする患者において、ＩｇＥに対する中和抗体の誘導に有効な化合物が依然として必要とされている。
【0007】
本発明において、出願人は、ジフテリア毒素の非毒性変異体ＣＲＭ１９７に連結されたヒトＩｇＥのＣε３ドメインを含む抗ヒトＩｇＥキノイドを生成した。このワクチンは、ＩｇＥおよびＦｃεＲＩの両方についてヒト化したマウス（ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウス）において、いかなる悪影響も与えることなく、長期にわたる抗ヒトＩｇＥ中和抗体応答を誘導した。抗ＩｇＥワクチン接種は、循環ＩｇＥレベルと、血中好塩基球表面で高親和性受容体ＦｃεＲＩに結合されたＩｇＥレベルの両方を低下させ、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスにおいて、ＩｇＥ介在性アナフィラキシーを完全に防いだ。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートされた少なくとも１つの免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントを含む免疫原性産物に関し、少なくとも１つの免疫グロブリンは、ＩｇＥ、好ましくはヒトＩｇＥであり、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥ Ｃε３ドメインを含み、担体タンパク質は好ましくは、ＣＲＭ１９７である。
【0009】
一実施形態では、免疫グロブリンフラグメントは、ＩｇＥ Ｃε３およびＣε４ドメインの一部または全体を含む。
【0010】
一実施形態では、免疫グロブリンフラグメントは、ＩｇＥ Ｃε２、Ｃε３およびＣε４ドメインの一部または全体を含む。
【0011】
一実施形態では、ＩｇＥまたはそのフラグメントは、Ｇ３３５Ｃ変異を含む。
【0012】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号７を含むかまたは配列番号７からなる。
【0013】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、少なくとも１つのグリコシル化を含む。
【0014】
本発明の別の目的は、上記の免疫原性産物を含む組成物である。
【0015】
本発明の別の目的は、上記の免疫原性産物および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【0016】
本発明の別の目的は、上記の免疫原性産物および少なくとも１つのアジュバントを含むワクチン組成物である。
【0017】
一実施形態では、上記の組成物、医薬組成物またはワクチン組成物は、エマルジョンである。
【0018】
本発明はさらに、上記の免疫原性産物を産生するための方法に関し、本方法は、
ａ）免疫グロブリンまたはそのフラグメントを、ＮＨＳ－エステル、好ましくはＮ－［γ－マレイミドブチリルオキシ］－スクシンイミドエステル（ｓＧＭＢＳ）を含むヘテロ二官能性架橋剤と接触させ、それによりＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と免疫グロブリンまたはそのフラグメント、好ましくはｓＧＭＢＳ－免疫グロブリンまたはそのフラグメント複合体の間の複合体を得るステップと；
ｂ）担体タンパク質を、ＮＨＳ－エステル、好ましくはＮ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を含むヘテロ二官能性架橋剤と接触させて、ＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と担体の間の複合体、好ましくは担体－ＳＡＴＡ複合体を生成するステップと；
ｃ）ステップ（ａ）で得られたＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と免疫グロブリンまたはそのフラグメント、好ましくはｓＧＭＢＳ－免疫グロブリンまたはそのフラグメントの間の複合体を、ステップ（ｂ）で得られたＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と担体の間の複合体、好ましくは、担体－ＳＡＴＡ複合体と接触させるステップ、
を含む。
ａ）免疫グロブリンまたはそのフラグメントを、ＮＨＳ－エステル、好ましくはＮ－［γ－マレイミドブチリルオキシ］－スクシンイミドエステル（ｓＧＭＢＳ）を含むヘテロ二官能性架橋剤と接触させ、それによりＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と免疫グロブリンまたはそのフラグメント、好ましくはｓＧＭＢＳ－免疫グロブリンまたはそのフラグメント複合体の間の複合体を得るステップと；
ｂ）担体タンパク質を、ＮＨＳ－エステル、好ましくはＮ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を含むヘテロ二官能性架橋剤と接触させて、ＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と担体の間の複合体、好ましくは担体－ＳＡＴＡ複合体を生成するステップと；
ｃ）ステップ（ａ）で得られたＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と免疫グロブリンまたはそのフラグメント、好ましくはｓＧＭＢＳ－免疫グロブリンまたはそのフラグメントの間の複合体を、ステップ（ｂ）で得られたＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と担体の間の複合体、好ましくは、担体－ＳＡＴＡ複合体と接触させるステップ、
を含む。
【0019】
本発明の別の目的は、医薬品としての使用のための本明細書に記載の免疫原性産物である。
【0020】
本発明はさらに、炎症性障害を治療するための、本明細書に記載の免疫原性産物または組成物、医薬組成物またはワクチン組成物に関し、好ましくは炎症性障害は、異常なＩｇＥの発現または活性に関連する。
【0021】
一実施形態では、炎症性障害は、喘息、アレルギー状態（例えば、食物アレルギー、毒物アレルギー、動物に対するアレルギー、薬物アレルギー、高ＩｇＥ症候群、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎およびアレルギー性腸胃炎など）、アナフィラキシー、アトピー性疾患（例えば、蕁麻疹（慢性特発性蕁麻疹および慢性自発性蕁麻疹を含む）、湿疹など）、水疱性類天疱瘡、呼吸器疾患（喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性気管支肺真菌症など）、鼻ポリープ症および気道炎症を伴う他の状態（例えば、好酸球増加症、線維症、および嚢胞性線維症を含む過剰な粘液産生、全身性硬化症（ＳＳｃ）など）；炎症性および／または自己免疫障害または状態、胃腸障害または状態（例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、および好酸球性食道炎（ＥＥ）、および好酸球媒介性胃腸疾患、潰瘍性大腸炎、およびクローン病など）；全身性エリテマトーデス；マスト細胞症およびマスト細胞活性化症候群（ＭＣＡＳ）からなる群から選択される。
【0022】
一実施形態では、炎症性障害は、アレルギー、アナフィラキシー、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、鼻ポリープ症から選択され、好ましくは上記炎症性障害は、食物アレルギーまたは毒物アレルギーである。
【0023】
本発明はさらに、特定の抗原に対してアレルギーのある対象の脱感作を誘導するための、上記の免疫原性産物または組成物、医薬組成物またはワクチン組成物に関し、上記免疫原性産物または組成物および上記特定の抗原は、アレルギーの対象に投与される。
【発明を実施するための形態】
【0024】
定義
本発明において、以下の用語は、以下の意味を有する：
本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、そのような変動が開示された方法を実施するために適切であるように、指定された値から±２０％、場合によっては±１０％、または場合によっては±５％、または場合によっては、±１％、または場合によっては±０．１％の変動を包含することを意味する。
本発明において、以下の用語は、以下の意味を有する：
本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、そのような変動が開示された方法を実施するために適切であるように、指定された値から±２０％、場合によっては±１０％、または場合によっては±５％、または場合によっては、±１％、または場合によっては±０．１％の変動を包含することを意味する。
【0025】
本明細書において使用される場合、「アジュバント」は、本発明の免疫原性産物の免疫原性を増強する物質である。アジュバントは多くの場合、免疫応答を高めるために与えられ、当業者に周知である。
【0026】
本明細書で使用される場合、「担体タンパク質分子」という用語は、対象（例えば、ヒト、ネコ、イヌ、またはウマ）に注射される場合に免疫原性である、少なくとも１５、３０、または５０アミノ酸長のタンパク質またはペプチドを指し、これは、ヘテロ複合体を形成するために、少なくとも１つのＩｇＥまたはそのフラグメント（好ましくはＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥＣε３ドメインを含む）に部分的に共有結合により会合されると、少なくとも１つのＩｇＥまたはそのフラグメントの多数の抗原がＢリンパ球に提示されることを可能にし、かつＩｇＥまたはそのフラグメントに対して向けられた抗体のその後の産生を可能にする。
【0027】
本明細書で使用される「免疫応答」という用語は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、および上記細胞または肝臓によって産生される巨大分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の作用を指す。
【0028】
本明細書で使用される「免疫原性産物」という用語は、上記免疫原性産物が投与される、対象、好ましくは哺乳動物において、体液性免疫応答を含む免疫応答、すなわち、例えば、内因性ＩｇＥの生物学的活性などの特性を中和する抗体の産生、を誘導する、担体タンパク質に連結された少なくとも１つのＩｇＥまたはそのフラグメントを指す。
【0029】
本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与されたときに有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を生じない、賦形剤を指す。賦形剤としては、任意のあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に許容される担体または賦形剤はしたがって、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、封入材料、または任意のタイプの製剤補助剤を指し得る。ヒト投与の場合、調製物は、ＦＤＡまたはＥＭＡなどの規制当局が要求する滅菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の基準を満たす必要がある。
【0030】
本明細書で使用される「組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用して生成されるタンパク質（例えば、ＩｇＥまたはそのフラグメントまたは担体タンパク質）、例えば、原核細胞中で（バクテリオファージまたはプラスミド発現系を使用して）または真核細胞中で（例えば、酵母、昆虫または哺乳動物発現系など）発現されるタンパク質を指す。この用語はまた、タンパク質（例えば、ＩｇＥもしくはそのフラグメントまたは担体タンパク質）をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成されるタンパク質（例えば、ＩｇＥもしくはそのフラグメントまたは担体タンパク質）を意味すると解釈されるものとし、ＤＮＡ分子は、タンパク質（例えば、ＩｇＥもしくはそのフラグメントまたは担体タンパク質）、またはタンパク質（例えば、ＩｇＥもしくはそのフラグメントまたは担体タンパク質）を特定するアミノ酸配列を発現し、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当技術分野で利用可能で周知の組換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られる。
【0031】
本明細書で使用する「対象」という用語は、その中で免疫応答が誘発され得る生物（例えば、哺乳動物、特にヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジなど）を含むことを意図する。好ましくは、対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、「患者」、すなわち、医療を受けることを待っているもしくは医療を受けている、または医療処置の対象であった、もしくは対象である、もしくは対象となる、例えば、炎症性障害などの標的とされる疾患または状態の発症について監視される、温血動物、好ましくはヒトであり得る。一実施形態では、対象は、成人（例えば、１８歳を超える対象）である。別の実施形態では、対象は、小児（例えば、１８歳未満の対象）である。一実施形態では、対象は、雄である。別の実施形態では、対象は、雌である。一実施形態では、対象は、炎症性障害に罹患している、炎症性障害を有すると好ましくは診断されている。一実施形態では、対象は、炎症性障害を発症するリスクがある。危険因子の例としては、これらに限定されないが、遺伝的素因、または炎症性障害の家族歴が挙げられる。
【0032】
本明細書で使用される「治療的有効量」という用語は、特定の生物学的結果を達成するのに有効な本明細書に記載の免疫原性産物の量を指す。したがって、「治療的有効量」という用語は、標的に重大な負または有害な副作用を引き起こすことなく、以下を目的とする免疫原性産物のレベルまたは量を意味する；
（１）標的とされる疾患または状態の発症を遅延させるまたは予防する；（２）標的とされる疾患または状態の１つ以上の症状の進行、重大化、または悪化を遅らせる、または停止させる；（３）標的とされる疾患または状態の症状の改善をもたらす；（４）標的とされる疾患もしくは状態の重症度もしくは発生率を低下させる；または（５）標的とされる疾患または状態を治癒させる。治療的有効量は、予防的または防止的作用のために、標的とされる疾患または状態の発症の前に投与され得る。あるいはまたはさらに、治療的有効量は、治療作用のために、標的とされる疾患または状態の開始後に投与され得る。
（１）標的とされる疾患または状態の発症を遅延させるまたは予防する；（２）標的とされる疾患または状態の１つ以上の症状の進行、重大化、または悪化を遅らせる、または停止させる；（３）標的とされる疾患または状態の症状の改善をもたらす；（４）標的とされる疾患もしくは状態の重症度もしくは発生率を低下させる；または（５）標的とされる疾患または状態を治癒させる。治療的有効量は、予防的または防止的作用のために、標的とされる疾患または状態の発症の前に投与され得る。あるいはまたはさらに、治療的有効量は、治療作用のために、標的とされる疾患または状態の開始後に投与され得る。
【0033】
本明細書で使用されるとき「治療」または「治療すること」とは、治療的治療および予防的または防止的措置の両方を指し、目的は、標的とされる疾患または状態を防止するかまたは減速させる（軽減する）ことである。治療を必要とするものは、すでにその状態を有するもの、その状態を有する傾向にあるもの、またはその状態が予防される必要があるものを含む。対象は、本明細書に記載の免疫原性産物の治療的量を受けた後、対象が以下の１つ以上において観察可能なおよび／または測定可能な改善を示す場合、疾患または状態について、うまく「治療され」る：病原性細胞の数の減少；病原性である全細胞の割合の低下；特定の状態に関連する症状の１つ以上のある程度の軽減；罹患率および死亡率の低下；ならびに／または生活の質の問題の改善。治療の奏功および状態の改善を評価するための上記のパラメータは、医師によく知られているルーチン手順によって容易に測定可能である。
【0034】
詳細な説明
本発明は、少なくとも１つの担体タンパク質とコンジュゲートされた少なくとも１つの免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントを含む免疫原性産物に関し、少なくとも１つの免疫グロブリンは、ＩｇＥである。
本発明は、少なくとも１つの担体タンパク質とコンジュゲートされた少なくとも１つの免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントを含む免疫原性産物に関し、少なくとも１つの免疫グロブリンは、ＩｇＥである。
【0035】
出願人は、本発明の免疫原性産物の投与が動物モデルにおいて抗ＩｇＥ中和抗体を誘導し、それによりＩｇＥ介在性炎症性障害を治療することを実証した。
【0036】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、出願人は、本発明の免疫原性産物が、当技術分野で記載される担体タンパク質にコンジュゲートされたペプチドと比較して、ポリクローナル抗ＩｇＥ中和抗体（すなわち、ＩｇＥ配列上の異なるエピトープに向けられた抗体）を誘導する利点を示すことを示唆する。
【0037】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥ Ｃε３ドメインを含むか、またはＩｇＥ Ｃε３ドメインからなる。
【0038】
担体タンパク質の例としては、これらに限定されないが、ＣＲＭ１９７、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、コレラトキソイド、外膜小胞中の髄膜炎菌外膜タンパク質、無莢膜型ヘモフィルスインフルエンザ外膜タンパク質、シュードモナスエルギノーザ毒素Ａ、およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）が挙げられる。
【0039】
一実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
【0040】
ＣＲＭ１９７は、配列番号１の配列を有するジフテリア毒素の非毒性変異体であり、一塩基置換（５２位におけるグリシンからグルタミン酸塩への変異）により毒性活性を有しない。
【0041】
配列番号１
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
【0042】
一実施形態では、ＣＲＭ１９７は、２０１８年にＨｉｃｋｅｙによって記載されたとおり（Ｈｉｃｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、自家系（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）または異種系（大腸菌およびＰ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）において当技術分野で公知の従来の方法によって得られ得る。例えば、組換えＣＲＭ１９７は、ＣＲＭ１９７をコードする核酸配列（例えば、遺伝子）を含む発現ベクターを含む細胞を培養すること、封入体を採取すること、およびＣＲＭ１９７を精製することによって得ることができる。ＣＲＭ１９７はまた、ＡＴＣＣで購入した細菌株（ＡＴＣＣ３９２５５）由来のジフテリア菌の培養物から抽出できる。一実施形態では、ＣＲＭ１９７は市販されており、例えばＲｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳ）から購入できる。
【0043】
一実施形態では、本発明の免疫原性産物は、ＣＲＭ１９７のバリアントを含み、バリアントは、配列番号１と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。一実施形態では、ＣＲＭ１９７の上記バリアントは、ＣＲＭ１９７の５２位でのグリシンからグルタミン酸塩への変異であり、したがって非毒性である。
【0044】
「同一性」または「同一である」とは、２つ以上の核酸配列または２つ以上のポリペプチドの配列間の関係で使用される場合、それぞれ、２つ以上の核酸残基またはアミノ酸残基のストリング間の一致の数によって決定される核酸配列またはポリペプチド間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって指定されるギャップを有するアライメント（存在する場合）によるより小さい２つ以上の配列の間の同一の一致の割合（パーセント）を測定する。関連する核酸配列またはポリペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算できる。このような方法としては、これらに限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載のものが挙げられる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大の一致を与えるように設計される。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムに記述されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＣｌｕｓｔａｌＯ（ＳｉｅｖｅｒｓＦ．，ｅｔａｌ．，２０１１）、ＧＣＧプログラムパッケージ、例えば、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．＼２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０（１９９０））などが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，上記）から公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して、同一性を決定することもできる。
【0045】
一実施形態では、ＣＲＭ１９７は、完全長ＣＲＭ１９７である。
【0046】
一実施形態では、本発明の免疫原性産物は、例えば、配列番号１由来の少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００個のアミノ酸（好ましくは連続アミノ酸）を含むフラグメントなどの、ＣＲＭ１９７のフラグメントを含む。
【0047】
ＩｇＥは、１つの可変ドメインならびにＣε１、Ｃε２、Ｃε３、およびＣε４と名付けられた４つの定常ドメインを含む免疫グロブリンである。ＩｇＥは、異なるドメイン間にリンカーをさらに含む。
【0048】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥの少なくとも１つ（例えば、１、２、３または４つ）の定常ドメインを含む。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥの可変ドメインを含まない。一実施形態では、ＩｇＥまたはそのフラグメントは、完全長ＩｇＥを含まないか、またはそれからならない。
【0049】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、完全長ＩｇＥ定常領域である（すなわち、それは、Ｃε１、Ｃε２、Ｃε３およびＣε４ドメインならびにすべてのリンカー領域を含む）。
【0050】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、例えば、それが由来するＩｇＥの少なくとも約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、または４２５個のアミノ酸（好ましくは、連続アミノ酸）を含むＩｇＥ定常領域のフラグメントなどの、ＩｇＥ定常領域のフラグメントである。
【0051】
一実施形態では、このフラグメントは、ＩｇＥ定常領域の少なくとも１つの特異的エピトープを含む。
【0052】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε３ドメインを含むか、またはそれからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε３ドメインの少なくとも一部を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、フラグメントは、ＩｇＥ Ｃε３ドメインの少なくとも１つの特異的エピトープを含む。
【0053】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε２ドメインおよびＣε３ドメインを含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε２ドメインおよびＣε３ドメインの少なくとも一部を含むか、またはそれらからなる。
【0054】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε２ドメインおよびＣε３ドメイン、ならびにＣε２とＣε３の間のリンカー領域を含むかまたはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε２ドメインおよびＣε３ドメインの少なくとも一部、およびＣε２とＣε３の間のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。
【0055】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε２ドメインおよびＣε３ドメイン、ならびにＣε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε１とＣε２の間のリンカー領域、およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域の少なくとも１つを含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε２ドメインおよびＣε３ドメイン、ならびにＣε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε１とＣε２の間のリンカー領域、およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε２ドメインおよびＣε３ドメインの少なくとも一部と、Ｃε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε１とＣε２の間のリンカー領域、およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域の少なくとも１つを含むか、またはそれらからなる。
【0056】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣε４ドメインを含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣε４ドメインの少なくとも一部を含むか、またはそれらからなる。
【0057】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣε４ドメイン、ならびにＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣε４ドメインの少なくとも一部、およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。
【0058】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣε４ドメイン、およびＣε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε３とＣε４の間のリンカー領域、およびＣε４後のリンカー領域の少なくとも１つを含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣε４ドメイン、Ｃε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε３とＣε４の間のリンカー領域、およびＣε４後のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣε４ドメインの少なくとも一部、Ｃε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε３とＣε４の間のリンカー領域、およびＣε４後のリンカー領域の少なくとも１つを含むか、またはそれらからなる。
【0059】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε２ドメイン、Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメインを含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε２ドメイン、Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメインの少なくとも一部を含むか、またはそれらからなる。
【0060】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε２ドメイン、Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメイン、ならびにＣε２とＣε３の間およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε２ドメイン、Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメインの少なくとも一部と、Ｃε２とＣε３の間およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。
【0061】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε２ドメイン、Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメイン、ならびにＣε１とＣε２の間のリンカー領域、Ｃε２とＣε３との間のリンカー領域、Ｃε３とＣε４の間のリンカー領域の少なくとも１つおよびＣε４後のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε２ドメイン、Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメイン、ならびにＣε１とＣε２の間のリンカー領域、Ｃε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε３とＣε４の間のリンカー領域およびＣε４後のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。
【0062】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥのＣε２ドメイン、Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメインの少なくとも一部、ならびにＣε１とＣε２の間のリンカー領域、Ｃε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε３とＣε４の間のリンカー領域の少なくとも１つおよびＣε４後のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。
【0063】
一実施形態では、ＩｇＥまたはＩｇＥフラグメントは、組換え体である。組換えＩｇＥまたはそのフラグメントは、ＩｇＥまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を使用する当技術分野で知られる従来の方法により得ることができる。
【0064】
例えば、組換えＩｇＥは、ＩｇＥをコードする核酸配列（例えば、遺伝子）を含む発現ベクターを含む細胞を培養すること、封入体を採取すること、およびＩｇＥを精製することによって得ることができる。したがって、組換えＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥフラグメントをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む細胞を培養すること、封入体を採取すること、およびＩｇＥフラグメントを精製することによって得ることができる。
【0065】
一実施形態では、組換えＩｇＥが得られ、この組換えＩｇＥのフラグメントは、例えばタンパク質分解により回収される。
【0066】
本発明の一実施形態では、ＩｇＥまたはそのフラグメントは、哺乳動物に由来する。
【0067】
一実施形態では、ＩｇＥまたはそのフラグメントは、哺乳動物ＩｇＥまたはそのフラグメントのバリアントであり、バリアントは、哺乳動物ＩｇＥまたはそれに由来するフラグメントと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。
【0068】
ＩｇＥは、グリコシル化の部位を含む免疫グロブリンである。一実施形態では、本発明の免疫原性産物に含まれるＩｇＥまたはそのフラグメントは、グリコシル化される。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、出願人は、グリコシル化ＩｇＥ（またはそのフラグメント）を含む免疫原性産物の投与が、ネイティブ免疫グロブリンに対応する、ＩｇＥのグリコシル化形態に特異的な抗ＩｇＥ抗体の産生を誘導し得ることを示唆する。
【0069】
さらに、ＩｇＥは、シアリル化され得る。ｈＩｇＥのシアリル化は、例えば、ＩｇＥエフェクター機能に関与し得る。一実施形態では、本発明の免疫原性産物に含まれるＩｇＥまたはそのフラグメントは、少なくとも１つのシアル酸残基を含む。別の実施形態では、本発明の免疫原性産物に含まれるＩｇＥまたはそのフラグメントは、いかなるシアル酸残基も含まない。
【0070】
一実施形態では、ＩｇＥは、ヒトＩｇＥ、好ましくは組換えヒトＩｇＥである。ヒトＩｇＥ定常領域は、配列番号２（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０１８５４）の配列を有し、ここで、６位～１０３位、１１２位～２１０位、２１４位～３１８位、および３２４位～４２３位由来のアミノ酸は、それぞれドメインＣε１、Ｃε２、Ｃε３およびＣε４に対応する。１～５、１０４～１１１、２１１～２１３、３１９～３２３および４２４～４２８由来のアミノ酸は、それぞれ、Ｃε１の前、Ｃε１とＣε２、Ｃε２とＣε３、Ｃε３とＣε４の間、およびＣε４の後のリンカー領域に対応する。
【0071】
配列番号２
ASTQSPSVFPLTRCCKNIPSNATSVTLGCLATGYFPEPVMVTWDTGSLNGTTMTLPATTLTLSGHYATISLLTVSGAWAKQMFTCRVAHTPSSTDWVDNKTFSVCSRDFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK
ASTQSPSVFPLTRCCKNIPSNATSVTLGCLATGYFPEPVMVTWDTGSLNGTTMTLPATTLTLSGHYATISLLTVSGAWAKQMFTCRVAHTPSSTDWVDNKTFSVCSRDFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK
【0072】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号２のフラグメントであり、フラグメントは、配列番号２の少なくとも約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、または４２５個のアミノ酸（好ましくは連続アミノ酸）を含む。
【0073】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号２のバリアントであり、バリアントは、配列番号２と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。
【0074】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥ定常ドメイン、好ましくはヒトＩｇＥ Ｃε３ドメインの少なくとも１つの特異的エピトープを含む。
【0075】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、完全長ヒトＩｇＥ定常領域である。
【0076】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインを含むか、またはそれからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインの少なくとも一部を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、フラグメントは、ヒトＩｇＥＣε３ドメインの少なくとも１つの特異的エピトープを含む。
【0077】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε２ドメインおよびＣε３ドメインを含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε２およびＣε３ドメインの少なくとも一部を含むか、またはそれらからなる。
【0078】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε２ドメインおよびＣε３ドメイン、ならびにＣε２とＣε３の間のリンカー領域を含むかまたはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε２ドメインおよびＣε３ドメインの少なくとも一部、およびＣε２とＣε３の間のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。
【0079】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε２ドメインおよびＣε３ドメイン、ならびにＣε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε１とＣε２の間のリンカー領域、およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域の少なくとも１つを含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε２ドメインおよびＣε３ドメイン、ならびにＣε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε１とＣε２の間のリンカー領域、およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε２ドメインおよびＣε３ドメインの少なくとも一部と、Ｃε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε１とＣε２の間のリンカー領域、およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域の少なくとも１つとを含むか、またはそれらからなる。
【0080】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣε４ドメインを含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣε４ドメインの少なくとも一部を含むか、またはそれらからなる。
【0081】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣε４ドメイン、ならびにＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣε４ドメインの少なくとも一部、およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。
【0082】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣε４ドメイン、およびＣε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε３とＣε４の間のリンカー領域、およびＣε４後のリンカー領域の少なくとも１つを含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣε４ドメイン、Ｃε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε３とＣε４の間のリンカー領域、およびＣε４後のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインおよびＣε４ドメインの少なくとも一部、Ｃε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε３とＣε４の間のリンカー領域、およびＣε４後のリンカー領域の少なくとも１つを含むか、またはそれらからなる。
【0083】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε２ドメイン、Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメインを含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε２ドメイン、Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメインの少なくとも一部を含むか、またはそれらからなる。
【0084】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε２ドメイン、Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメイン、ならびにＣε２とＣε３の間およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε２ドメイン、Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメインの少なくとも一部と、Ｃε２とＣε３の間およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。
【0085】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε２ドメイン、Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメイン、ならびにＣε１とＣε２の間のリンカー領域、Ｃε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε３とＣε４の間のリンカー領域の少なくとも１つおよびＣε４後のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε２ドメイン、Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメイン、ならびにＣε１とＣε２の間のリンカー領域、Ｃε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε３とＣε４の間のリンカー領域およびＣε４後のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、ヒトＩｇＥのＣε２ドメイン、Ｃε３ドメインおよびＣε４ドメインの少なくとも一部、ならびにＣε１とＣε２の間のリンカー領域、Ｃε２とＣε３の間のリンカー領域、Ｃε３とＣε４の間のリンカー領域の少なくとも１つおよびＣε４後のリンカー領域を含むか、またはそれらからなる。
【0086】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号３の配列を有するヒトＩｇＥのＣε３定常ドメインを含むか、またはそれからなる。
【0087】
配列番号３
PRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS
PRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS
【0088】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、例えば、配列番号３の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個のアミノ酸（好ましくは、連続アミノ酸）を含むヒトＩｇＥのフラグメントなどの、ヒトＩｇＥ Ｃε３ドメインのフラグメントである。
【0089】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号３のバリアントであり、上記バリアントは、配列番号３と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。
【0090】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号３中の３位に変異（グリシン残基のシステイン残基による置換）を含むヒトＩｇＥのＣε３定常ドメインを含むか、またはそれからなる。この変異は、変異Ｇ３３５Ｃと呼ばれ得る（Ｗｕｒｚｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。したがって、一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号８を含むかまたは配列番号８からなる。
【0091】
配列番号８
PRCVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS
PRCVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS
【0092】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、例えば、配列番号８の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個のアミノ酸（好ましくは、連続アミノ酸）を含むヒトＩｇＥのフラグメントなどの、配列番号８のフラグメントである。
【0093】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号８のバリアントであり、上記バリアントは、配列番号８と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。
【0094】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、Ｃε３およびＣε４定常ドメイン、ならびに任意によりＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むヒトＩｇＥのフラグメントを含むか、またはそれからなる。Ｃε３およびＣε４定常ドメインならびにＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むヒトＩｇＥのフラグメントの例は、配列番号４の配列を有する。
【0095】
配列番号４
PRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVS
PRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVS
【0096】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、例えば、配列番号４の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００または２０５個のアミノ酸（好ましくは、連続アミノ酸）を含むヒトＩｇＥのフラグメントなどの、配列番号４のフラグメントである。
【0097】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号４のバリアントであり、上記バリアントは、配列番号４と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。
【0098】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、Ｃε３およびＣε４定常ドメインおよび任意により配列番号４中の３位に変異（システイン残基を有するグリシン残基の置換）をさらに含むＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むヒトＩｇＥのフラグメントを含むか、またはそのフラグメントからなる。Ｃε３およびＣε４定常ドメインならびにＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むそのようなＩｇＥフラグメントの例は、配列番号９を含むまたは配列番号９からなるＩｇＥフラグメントを含む。
【0099】
配列番号９
PRCVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVS
PRCVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVS
【0100】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、例えば、配列番号９の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００または２０５個のアミノ酸（好ましくは、連続アミノ酸）を含むヒトＩｇＥのフラグメントなどの、配列番号９のフラグメントである。
【0101】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号９のバリアントであり、上記バリアントは、配列番号９と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。
【0102】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、Ｃε２およびＣε３定常ドメイン、ならびに任意によりＣε２とＣε３の間のリンカー領域を含むヒトＩｇＥのフラグメントを含むか、またはそれからなる。Ｃε２およびＣε３定常ドメインならびにＣε２とＣε３の間のリンカー領域を含むヒトＩｇＥのフラグメントの例は、配列番号５の配列を有する。
【0103】
配列番号５
PTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS
PTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS
【0104】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、例えば、配列番号５の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００または２０５個のアミノ酸（好ましくは、連続アミノ酸）を含むヒトＩｇＥのフラグメントなどの、配列番号５のフラグメントである。
【0105】
一実施形態では、免疫原性産物は、配列番号５のバリアントであり、上記バリアントは、配列番号５と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。
【0106】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、Ｃε２およびＣε３定常ドメインおよび配列番号５中の１０５位に変異（システイン残基を有するグリシン残基の置換）をさらに含むＣε２とＣε３の間のリンカー領域を含むヒトＩｇＥのフラグメントを含むか、またはそのフラグメントからなる。Ｃε２およびＣε３定常ドメインならびにＣε２とＣε３の間のリンカー領域を含むそのようなＩｇＥフラグメントの例は、配列番号１０を含むまたは配列番号１０からなるＩｇＥフラグメントを含まれる。
【0107】
配列番号１０
PTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRCVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS
PTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRCVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS
【0108】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、例えば、配列番号１０の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００または２０５個のアミノ酸（好ましくは、連続アミノ酸）を含むヒトＩｇＥのフラグメントなどの、配列番号１０のフラグメントである。
【0109】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号１０のバリアントであり、上記バリアントは、配列番号１０と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。
【0110】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、Ｃε２、Ｃε３およびＣε４定常ドメイン、ならびに任意によりＣε２とＣε３の間、およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むヒトＩｇＥのフラグメントを含むか、またはそのフラグメントからなる。Ｃε２、Ｃε３およびＣε４定常ドメインならびにＣε２とＣε３の間、およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むヒトＩｇＥのフラグメントの例は、配列番号６の配列を有する。
【0111】
配列番号６
PTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVS
PTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVS
【0112】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、例えば、配列番号６の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５または３１０個のアミノ酸（好ましくは、連続アミノ酸）を含むヒトＩｇＥのフラグメントなどの、配列番号６のフラグメントである。
【0113】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号６のバリアントであり、上記バリアントは、配列番号６と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。
【0114】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、Ｃε２、Ｃε３およびＣε４定常ドメインならびにＣε２とＣε３の間、およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含み、配列番号６中の１０５位に変異（システイン残基によるグリシン残基の置換）をさらに含む、ヒトＩｇＥのフラグメントを含むか、またはそれからなる。
【0115】
Ｃε２、Ｃε３およびＣε４定常ドメインならびにＣε２とＣε３の間およびＣε３とＣε４の間のリンカー領域を含むこのようなＩｇＥフラグメントの例としては、配列番号１１を含むまたは配列番号１１からなるフラグメントが挙げられる。
【0116】
配列番号１１
PTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRCVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVS
PTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRCVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVS
【0117】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、例えば、配列番号１１の少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５または３１０個のアミノ酸（好ましくは、連続アミノ酸）を含むヒトＩｇＥのフラグメントなどの、配列番号１１のフラグメントである。
【0118】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号１１のバリアントであり、上記バリアントは、配列番号１１と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。
【0119】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号１２を含むかまたは配列番号１２からなる。
【0120】
配列番号１２
ADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK
ADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK
【0121】
一実施形態では、免疫原性産物は、配列番号１２のバリアントであり、上記バリアントは、配列番号１２と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。
【0122】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号７を含むかまたは配列番号７からなる。
【0123】
配列番号７
ADSNPRCVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK
ADSNPRCVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK
【0124】
一実施形態では、免疫原性産物は、配列番号７のバリアントであり、上記バリアントは、配列番号７と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。
【0125】
ヒトＩｇＥは、ｉＣε１ドメイン中の３つのグリコシル化の部位（Ｎ１４０、Ｎ１６８、およびＮ２１８）、Ｃε２ドメイン中の１つのグリコシル化の部位（Ｎ２６５）およびＣε３ドメイン中の３つのグリコシル化の部位（Ｎ３７１、Ｎ３８３、およびＮ３９４）を含む、７つのグリコシル化の部位を含む免疫グロブリンである。当技術分野において、Ｎ３９４残基上のグリコシル化は、タンパク質の折り畳み、ＦｃεＲＩとの安定なＩｇＥ相互作用、およびアナフィラキシーの開始にとって重要であり得ることが示唆された。
【0126】
一実施形態では、グリコシル化の７つの部位は、配列番号２のｈＩｇＥの定常領域の配列中において、それぞれ、残基Ｎ２１、Ｎ４９、Ｎ９９（Ｃε１ドメイン中）、Ｎ１４６（Ｃε２ドメイン中）、およびＮ２５２、Ｎ２６４、Ｎ２７５（Ｃε３ドメイン中）に対応する。
【0127】
一実施形態では、本発明の免疫原性産物に含まれるｈＩｇＥまたはそのフラグメントは、少なくとも１つのグリコシル化を含む。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、出願人は、そのような免疫原性産物の投与がネイティブグリコシル化ｈＩｇＥに対する抗ＩｇＥ抗体を誘導し得ることを示唆する。
【0128】
一実施形態では、本発明の免疫原性産物に含まれるｈＩｇＥまたはそのフラグメントは、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７つ）のグリコシル化を含む。
【0129】
一実施形態では、本発明の免疫原性産物に含まれるｈＩｇＥまたはそのフラグメントは、Ｎ３９４グリコシル化を含む。一実施形態では、本発明の免疫原性産物に含まれるｈＩｇＥまたはそのフラグメントは、Ｎ２７５グリコシル化を含む（アミノ酸が配列番号２でのように番号付けされる場合）。
【0130】
さらに、ｈＩｇＥのシアリル化は、ＩｇＥエフェクター機能に関与し得る。
【0131】
一実施形態では、本発明の免疫原性産物に含まれるｈＩｇＥまたはそのフラグメントは、少なくとも１つのシアル酸残基を含む。一実施形態では、本発明の免疫原性産物に含まれるｈＩｇＥまたはそのフラグメントは、いかなるシアル酸残基も含まない。
【0132】
本発明の一実施形態では、ＩｇＥは、ウマＩｇＥ、好ましくは組換えウマＩｇＥである。ウマＩｇＥ定常領域は、配列番号１３の配列を有し、ここで１～９３位、９４～２００位、２０１～３０７位および３０８～４１９位のアミノ酸は、それぞれドメインＣε１、Ｃε２、Ｃε３およびＣε４に対応する。
【0133】
配列番号１３
VSKQAPLIFPLAACCKDTKTTNITLGCLVKGYFPGAWDAGPLNPSTMTFPAVFDQTSGLYTTISRVVASGKWAKQKFTCGVVHSQETFNKTFNACIVTFTPPTVKLFHSSCDPGGDSHTTIQLLCLISDYTPGDIDIVWLIEGQKVDEQFPTQASMKQEGSWPPTHSELNINQGQWASENTYTCQVTYKDMIFNQARKCTESDPPGVSVYLSPPSPLDLYVSKTPKITCLVVDLANVQGLSLNWSRESGEPLQKHTLATSEQFNKTFSVTSTLPVDTTDWIEGETYKCTVSHPDLPREVVRSIAKAPGKRLSPEVYVFLPPEEDQSSKDKVTLTCLIQNFFPADISVQWRRNNVLIQTDQQATTRPQKANGPDPAFFVFSRLEVSRAEWEQKNKFACKVVHEALSQRTLQKEVSKDPGK
VSKQAPLIFPLAACCKDTKTTNITLGCLVKGYFPGAWDAGPLNPSTMTFPAVFDQTSGLYTTISRVVASGKWAKQKFTCGVVHSQETFNKTFNACIVTFTPPTVKLFHSSCDPGGDSHTTIQLLCLISDYTPGDIDIVWLIEGQKVDEQFPTQASMKQEGSWPPTHSELNINQGQWASENTYTCQVTYKDMIFNQARKCTESDPPGVSVYLSPPSPLDLYVSKTPKITCLVVDLANVQGLSLNWSRESGEPLQKHTLATSEQFNKTFSVTSTLPVDTTDWIEGETYKCTVSHPDLPREVVRSIAKAPGKRLSPEVYVFLPPEEDQSSKDKVTLTCLIQNFFPADISVQWRRNNVLIQTDQQATTRPQKANGPDPAFFVFSRLEVSRAEWEQKNKFACKVVHEALSQRTLQKEVSKDPGK
【0134】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号１３のフラグメントであり、上記フラグメントは、配列番号１３の少なくとも約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、または４１５個のアミノ酸（好ましくは連続アミノ酸）を含む。
【0135】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号１３のバリアントであり、上記バリアントは、配列番号１３と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。
【0136】
本発明の一実施形態では、ＩｇＥは、イヌＩｇＥ、好ましくは組換えイヌＩｇＥである。イヌＩｇＥ定常領域は、配列番号１４の配列を有する。
【0137】
配列番号１４
TSQDLSVFPLASCCKDNIASTSVTLGCLVTGYLPMSTTVTWDTGSLNKNVTTFPTTFHETYGLHSIVSQVTASGKWAKQRFTCSVAHAESTAINKTFSACALNFIPPTVKLFHSSCNPVGDTHTTIQLLCLISGYVPGDMEVIWLVDGQKATNIFPYTAPGTKEGNVTSTHSELNITQGEWVSQKTYTCQVTYQGFTFKDEARKCSESDPRGVTSYLSPPSPLDLYVHKAPKITCLVVDLATMEGMNLTWYRESKEPVNPGPLNKKDHFNGTITVTSTLPVNTNDWIEGETYYCRVTHPHLPKDIVRSIAKAPGKRAPPDVYLFLPPEEEQGTKDRVTLTCLIQNFFPADISVQWLRNDSPIQTDQYTTTGPHKVSGSRPAFFIFSRLEVSRVDWEQKNKFTCQVVHEALSGSRILQKWVSKTPGK
TSQDLSVFPLASCCKDNIASTSVTLGCLVTGYLPMSTTVTWDTGSLNKNVTTFPTTFHETYGLHSIVSQVTASGKWAKQRFTCSVAHAESTAINKTFSACALNFIPPTVKLFHSSCNPVGDTHTTIQLLCLISGYVPGDMEVIWLVDGQKATNIFPYTAPGTKEGNVTSTHSELNITQGEWVSQKTYTCQVTYQGFTFKDEARKCSESDPRGVTSYLSPPSPLDLYVHKAPKITCLVVDLATMEGMNLTWYRESKEPVNPGPLNKKDHFNGTITVTSTLPVNTNDWIEGETYYCRVTHPHLPKDIVRSIAKAPGKRAPPDVYLFLPPEEEQGTKDRVTLTCLIQNFFPADISVQWLRNDSPIQTDQYTTTGPHKVSGSRPAFFIFSRLEVSRVDWEQKNKFTCQVVHEALSGSRILQKWVSKTPGK
【0138】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号１４のフラグメントであり、上記フラグメントは、配列番号１４の少なくとも約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、または４２５個のアミノ酸（好ましくは連続アミノ酸）を含む。
【0139】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号１４のバリアントであり、上記バリアントは、配列番号１４と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。
【0140】
本発明の一実施形態では、ＩｇＥは、ネコＩｇＥ、好ましくは組換えネコＩｇＥである。ネコＩｇＥ定常領域は、配列番号１５の配列を有する。
【0141】
配列番号１５
AYISSGGNTDYADSVKGRFSISRDNAKNTLYLQMTSLKTEDTATYYCARGTGVIPDYWGQGALVTVSSTSIQAPLVFPLATCCKGTIATAPSVTLGCLVTGYFPMPVTVTWDARSLNKSVVTLPATLQENSGLYTTTSHVTVSGEWAKQKFTCSVAHAESPTINKTVSACTMNFIPPTVKLFHSSCNPLGDTGSTIQLLCLISGYVPGDMEVTWLVDGQKATNIFPYTAPGKQEGKVTSTHSELNITQGEWVSQKTYTCQVTYQGFTFEDHARKCTESDPRGVSTYLSPPSPLDLYVHKSPKITCLVVDLANTDGMILTWSRENGESVHPDPMVKKTQYNGTITVTSTLPVDATDWVEGETYQCKVTHPDLPKDIVRSIAKAPGRRFPPEVYVFLPPEGEPKTKDKVTLTCLIQNFFPPDISVQWLHNDSPVRTEQQATTWPHKATGPSPAFFVFSRLEVSRADWEQRDVFTCQVVHEALPGFRTLKKSVSKNPGK
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【0142】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号１５のフラグメントであり、上記フラグメントは、配列番号１５の少なくとも約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５または４９０個のアミノ酸（好ましくは連続アミノ酸）を含む。
【0143】
一実施形態では、ＩｇＥフラグメントは、配列番号１５のバリアントであり、上記バリアントは、配列番号１５と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより大きい同一性を示す。
【0144】
一実施形態では、本発明の免疫原性産物は、約１６：１～約１：４、好ましくは約８：１～約１：２の範囲の、より好ましくは約１：１のＩｇＥ（またはそのフラグメント）：ＣＲＭ１９７のモル比で、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７に連結されたＩｇＥまたはそのフラグメントを含む。
【0145】
一実施形態では、本発明の免疫原性産物は、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７に連結され、かつ抗ＩｇＥ抗体により認識されるＩｇＥまたはＩｇＥフラグメントを含む。
【0146】
免疫原性産物が、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７に連結され、かつ抗ＩｇＥ抗体により認識されるＩｇＥまたはＩｇＥフラグメントを含むことは、当技術分野において公知である従来の方法により検証され得る。そのような方法の例は、例えばビオチンで標識された検出抗体、ストレプトアビジンＨＲＰ増幅システムおよびｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質溶液を使用する、サンドイッチＥＬＩＳＡ抗ＩｇＥまたはそのフラグメント／担体タンパク質である。
【0147】
一実施形態では、本発明の免疫原性産物は、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７に連結されたＩｇＥまたはそのフラグメントを含み、かつ免疫原性であり、これは、免疫原性産物が、試験Ａの条件でのｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗ＩｇＥ抗体を誘導できることを意味する。一実施形態において、本発明の免疫原性産物は、例えば、試験Ａの条件において、ｉｎ ｖｉｖｏでポリクローナル抗ＩｇＥ抗体を誘導できる。
【0148】
試験Ａは、以下の方法に従って実施される：
免疫原性産物の全タンパク質の特定量（例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイにより決定される）を、マウス（３週齢以上）に２８日間に３回注射する。一実施形態では、試験Ａは、約１０～３０μｇの範囲の用量の全タンパク質を投与することを含む。血清サンプルを、免疫化前（免疫前血清サンプル）および免疫化後（試験血清サンプル）に得る。ＥＬＩＳＡ抗ＩｇＥを、以下に説明するように実施する。
免疫原性産物の全タンパク質の特定量（例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイにより決定される）を、マウス（３週齢以上）に２８日間に３回注射する。一実施形態では、試験Ａは、約１０～３０μｇの範囲の用量の全タンパク質を投与することを含む。血清サンプルを、免疫化前（免疫前血清サンプル）および免疫化後（試験血清サンプル）に得る。ＥＬＩＳＡ抗ＩｇＥを、以下に説明するように実施する。
【0149】
簡潔に言えば、ヒトＩｇＥまたはＣＲＭ１９７を、コーティング緩衝液（炭酸塩／重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６）中にてそれぞれ５または１μｇ／ｍＬで、４℃でコートし、一晩インキュベートする。各ステップ後、プレートを、０．００５％のＰＢＳＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄する。ＢＳＡ１％ＰＢＳでブロッキング後、血清サンプルを、添加し、２倍連続希釈を、２０００ｄｉｌ－１で開始して行った（ＰＢＳ、ＢＳＡ１％中で希釈される）。３７℃で９０分間インキュベーション後、結合した抗体を、１／１００００にてＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で検出し、プレートを、ＯＰＤ基質を使用して明らかにする。反応を、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止し、吸光度をその後、４９０ｎｍで記録する。サンプルを、希釈２０００ｄｉｌ－１で始めて１０２４０００ｄｉｌ－１まで分析する。
【0150】
一実施形態では、試験血清サンプルを含むウェルの光学密度（４９０ｎｍ）が、免疫前血清サンプルを含むウェルの光学密度よりも少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍高い場合、免疫原性産物は、免疫原性と見なされ、これは、それがｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗ＩｇＥ抗体を誘導したことを意味する。
【0151】
この試験では、力価は、アッセイにおいてＯＤｍａｘの５０％から対応する免疫前サンプルのＯＤを差し引いた値に達する、血清の希釈として定義され得る。この計算モードは、よく知られているセロコンバージョン力価を見るよりもはるかに厳密であり得るが、より堅牢な分析およびより少ない偽陽性を提供し得る。力価は、血清希釈係数（ｄｉｌ－１）として表され得る。
【0152】
一実施形態では、試験Ａにおいて、≧１０００ｄｉｌ－１、好ましくは≧２０００ｄｉｌ－１の力価値は、本発明の免疫原性産物が、ＩｇＥに対する結合抗体の産生を可能にすることを示す。
【0153】
一実施形態では、本発明の免疫原性産物は、ＣＲＭ１９７に連結されたＩｇＥまたはそのフラグメントを含み、かつ以下に引用する試験Ｂの条件でＩｇＥ活性を中和できる。本発明により、試験Ｂを、免疫原性産物で免疫されたマウスから得た血清の中和能力を評価するために実施する。
【0154】
試験Ｂは、次の方法に従って実施される：
ｈＦｃεＲＩを発現する骨髄由来培養マスト細胞（ＢＭＣＭＣ）を、６週間ＩＬ－３（１０ｎｇ／ｍｌ）含有培地中でＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスからの骨髄細胞を培養することにより得る、その時点で細胞は＞９５％ ｃ－Ｋｉｔ＋ｈＦｃεＲＩα＋であった。本発明の免疫原性産物でのワクチン接種時に産生される抗ｈＩｇＥ抗体の中和能力を評価するために、ＢＭＣＭＣを、本発明の免疫原性産物またはＣＲＭ１９７単独でワクチン接種されたマウスからの血漿の希釈物とインキュベートする。次に、ＦＩＴＣ標識ｈＩｇＥを加え、ＢＣＭＭＣ上のｈＦｃεＲＩに対するＦＩＴＣ－ｈＩｇＥの結合を、フローサイトメトリーにより評価する。
ｈＦｃεＲＩを発現する骨髄由来培養マスト細胞（ＢＭＣＭＣ）を、６週間ＩＬ－３（１０ｎｇ／ｍｌ）含有培地中でＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスからの骨髄細胞を培養することにより得る、その時点で細胞は＞９５％ ｃ－Ｋｉｔ＋ｈＦｃεＲＩα＋であった。本発明の免疫原性産物でのワクチン接種時に産生される抗ｈＩｇＥ抗体の中和能力を評価するために、ＢＭＣＭＣを、本発明の免疫原性産物またはＣＲＭ１９７単独でワクチン接種されたマウスからの血漿の希釈物とインキュベートする。次に、ＦＩＴＣ標識ｈＩｇＥを加え、ＢＣＭＭＣ上のｈＦｃεＲＩに対するＦＩＴＣ－ｈＩｇＥの結合を、フローサイトメトリーにより評価する。
【0155】
結果は、ＩｇＥ－ＦＩＴＣ陽性ＢＭＣＭＣ（ｈＩｇＥ結合の読み取りとして使用される）のパーセンテージとして表され得る。ＮＣ５０を、横座標軸上で５０％のＩｇＥ－ＦＩＴＣ結合をもたらす血漿希釈を内挿することにより、この試験で決定できる。
【0156】
一実施形態では、試験Ｂにおいて、１００ｄｉｌ－１以上、好ましくは２００ｄｉｌ－１以上のＮＣ５０値は、本発明の免疫原性産物が、ＩｇＥに対する中和抗体の産生を可能にすることを示す。一実施形態では、本発明の免疫原性産物の投与により誘導されるＩｇＥに対する中和抗体は、ポリクローナルである。
【0157】
本発明はさらに、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７と連結された少なくとも１つのＩｇＥまたはそのフラグメントを含む免疫原性産物を産生するための方法に関し、好ましくはＩｇＥフラグメントは、ＩｇＥＣε３ドメインを含み、本方法は、以下のステップ：
ａ）少なくとも１つのＩｇＥまたはそのフラグメントを、ＮＨＳ－エステル、好ましくはＮ－［γ－マレイミドブチリルオキシ］－スクシンイミドエステル（ｓＧＭＢＳ）を含むヘテロ二官能性架橋剤と接触させ、それによりＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と免疫グロブリンまたはそのフラグメント、好ましくはｓＧＭＢＳ－免疫グロブリンまたはそのフラグメント複合体の間の複合体を得るステップと；
ｂ）ＮＨＳ－エステル、好ましくはＮ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を含むヘテロ二官能性架橋剤と担体タンパク質を接触させて、ＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と担体との間の複合体、好ましくは担体－ＳＡＴＡ複合体を生成するステップと；
ｃ）ステップ（ａ）で得られたＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と免疫グロブリンまたはそのフラグメントの間の複合体、好ましくはｓＧＭＢＳ－ＩｇＥ複合体を、ステップ（ｂ）で得られたＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と担体の間の複合体、好ましくは、担体－ＳＡＴＡ複合体と接触させるステップ、
を含む。
ａ）少なくとも１つのＩｇＥまたはそのフラグメントを、ＮＨＳ－エステル、好ましくはＮ－［γ－マレイミドブチリルオキシ］－スクシンイミドエステル（ｓＧＭＢＳ）を含むヘテロ二官能性架橋剤と接触させ、それによりＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と免疫グロブリンまたはそのフラグメント、好ましくはｓＧＭＢＳ－免疫グロブリンまたはそのフラグメント複合体の間の複合体を得るステップと；
ｂ）ＮＨＳ－エステル、好ましくはＮ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を含むヘテロ二官能性架橋剤と担体タンパク質を接触させて、ＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と担体との間の複合体、好ましくは担体－ＳＡＴＡ複合体を生成するステップと；
ｃ）ステップ（ａ）で得られたＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と免疫グロブリンまたはそのフラグメントの間の複合体、好ましくはｓＧＭＢＳ－ＩｇＥ複合体を、ステップ（ｂ）で得られたＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤と担体の間の複合体、好ましくは、担体－ＳＡＴＡ複合体と接触させるステップ、
を含む。
【0158】
一実施形態では、ステップａ）において、反応緩衝液は、液体、好ましくは水溶液である。
【0159】
一実施形態では、ステップａ）において、反応緩衝液は、約６～約８の範囲、好ましくは約６．５～約７．５の範囲、より好ましくは約ｐＨ７．２のｐＨである。
【0160】
一実施形態では、ステップａ）において、ＩｇＥまたはそのフラグメントは、約０．１～約１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．５～約５ｍｇ／ｍＬの範囲、より好ましくは約１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶液中に存在する。
【0161】
一実施形態では、ステップａ）において、ＮＨＳ－エステル、好ましくはｓＧＭＢＳを含有するヘテロ二官能性架橋剤は、１ｍＭ～１００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ～５０ｍＭの範囲、より好ましくは１０ｍＭの濃度にて反応緩衝液中で調製される。
【0162】
一実施形態では、ステップａ）において、ＩｇＥまたはそのフラグメントと、ＮＨＳ－エステル、好ましくはｓＧＭＢＳを含むヘテロ二官能性架橋剤を、約１：１２０～約１：１、好ましくは約１：５０～約１：１０、より好ましくは約１：４０～約１：２０の範囲のＩｇＥ（またはそのフラグメント）：ＮＨＳ－エステル、好ましくはｓＧＭＢＳを含むヘテロ二官能性架橋剤のモル比で混合する。
【0163】
一実施形態では、ステップａ）において、少なくとも１つのＩｇＥまたはそのフラグメントを、約３０分～約１２０分、好ましくは約４５分～約９０分間、より好ましくは少なくとも６０分間、ＮＨＳ－エステル、好ましくはｓＧＭＢＳを含むヘテロ二官能性架橋剤とインキュベートする。
【0164】
一実施形態では、ステップａ）において、少なくとも１つのＩｇＥまたはそのフラグメントと、ＮＨＳ－エステル、好ましくはｓＧＭＢＳを含むヘテロ二官能性架橋剤の接触ステップは、約１５℃～約３５℃の範囲、好ましくは約１８℃～約２７℃の温度で実施される。
【0165】
一実施形態では、ステップａ）に続き、反応混合物中に存在する約１０ｋＤａ未満、約５ｋＤａ未満、または約３ｋＤａ未満の分子量を有する小化合物を、除去する。これらの小化合物は主に、ＮＨＳ－エステル（およびＮＨＳ－エステル加水分解関連の副生成物）、好ましくはｓＧＭＢＳを含む過剰なヘテロ二官能性架橋剤、および反応しなかった過剰な分子を含む。そのような除去は、当技術分野で周知の方法によって行われてよい（そのような方法の例については、実施例の部分を参照）。
【0166】
一実施形態では、ステップａ）の最後に、タンパク質含有量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイまたは当技術分野で周知の任意の方法により決定する。
【0167】
一実施形態では、ステップｂ）において、反応緩衝液は、液体、好ましくは水溶液である。
【0168】
一実施形態では、ステップｂ）において、反応緩衝液は、約６～約８の範囲、好ましくは約６．５～約７．５の範囲、より好ましくはｐＨ約７．２である。
【0169】
一実施形態では、ステップｂ）において、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７は、約０．２～約２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１～約１０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約２ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で溶液中に存在する。
【0170】
一実施形態では、ステップｂ）において、ＮＨＳ－エステル、好ましくはＳＡＴＡを含有するヘテロ二官能性架橋剤は、好ましくはＤＭＳＯ中、２０ｍＭ～約５００ｍＭ、好ましくは約５０ｍＭ～約２００ｍＭの範囲の濃度、より好ましくは約１００ｍＭの濃度で溶液中に存在する。
【0171】
一実施形態では、ステップｂ）において、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７、およびＮＨＳ－エステル、好ましくはＳＡＴＡを含むヘテロ二官能性架橋剤を、約１：３２０～約１：１０、好ましくは約１：１６０～約１：４０の範囲の担体：ＮＨＳ－エステル、好ましくはＳＡＴＡを含むヘテロ二官能性架橋剤のモル比で混合する。
【0172】
一実施形態では、ステップｂ）において、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７を、約１０分～約６０分、好ましくは約１５分～約４５分の範囲の時間、より好ましくは３０分の間、ＮＨＳ－エステル、好ましくはＳＡＴＡを含むヘテロ二官能性架橋剤とインキュベートする。
【0173】
一実施形態では、接触ステップｂ）は、約１５℃～約３５℃、好ましくは約１８℃～約２７℃の範囲の温度で実施される。
【0174】
一実施形態では、ステップｂ）に続き、反応混合物中に存在する約１０ｋＤａ未満、約５ｋＤａ未満、または約３ｋＤａ未満の分子量を有する小化合物を、除去する。これらの小化合物は主に、ＮＨＳ－エステル（およびＮＨＳ－エステル加水分解関連の副生成物）、好ましくはＳＡＴＡ、ＤＭＳＯを含む過剰なヘテロ二官能性架橋剤、および反応しなかった過剰な分子を含む。このような除去は、当技術分野で周知の方法により行われてよい。
【0175】
一実施形態では、ステップｂ）の後、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７と、ＮＨＳ－エステル、好ましくはＳＡＴＡを含むヘテロ二官能性架橋剤の複合体を、脱保護して、保護基（ＮＨＳ－エステル、好ましくはＳＡＴＡを含むヘテロ二官能性架橋剤）を官能基に変換させる。一実施形態では、上記脱保護ステップは、反応混合物中に存在する約１０ｋＤａ未満、約５ｋＤａ未満、または約３ｋＤａ未満の分子量を有する小化合物を除去するステップの後に実施される。
【0176】
分子を脱保護するための方法の例は、当技術分野で周知であり、これらに限定されないが、ヒドロキシルアミンの使用、メトキシルアミンの使用、または塩基（例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｋ２ＣＯ３、ＭｅＯＮａ、ＮＨ３を含むメタノール）の使用を含む。
【0177】
一実施形態では、脱保護ステップは、好ましくは約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ～約１００ｍＭの範囲、より好ましくは約５０ｍＭの最終濃度での、反応混合物へのヒドロキシルアミン溶液の添加を含む。
【0178】
一実施形態では、ヒドロキシルアミン溶液を、約６０分～約１８０分、好ましくは約９０分～約１５０分の範囲の時間、より好ましくは１２０分間反応混合物とインキュベートする。
【0179】
一実施形態では、ヒドロキシルアミン溶液を、１２０分間５０ｍＭで添加する。
【0180】
一実施形態では、反応混合物とのヒドロキシルアミン溶液のインキュベーションは、約１５℃～約３５℃、好ましくは約１８℃～約２７℃の範囲の温度で実施される。
【0181】
一実施形態では、脱保護ステップに続き、反応混合物中に存在する約１０ｋＤａ未満、５ｋＤａまたは３ｋＤａの分子量を有する小化合物を、除去する。これらの小化合物は、主に過剰なヒドロキシルアミンと、前のステップからの潜在的な残留ＳＡＴＡを含む。このような除去は、当技術分野で周知の方法により行われてよい。
【0182】
一実施形態では、ステップｂ）の最後に、タンパク質含有量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによりまたは当技術分野で周知の任意の方法により決定する。
【0183】
次いで、本発明の方法のステップｃ）において、ステップａ）の最終生成物を、ステップｂ）の最終生成物と接触させ、それにより本発明の免疫原性産物を生成する。
【0184】
一実施形態では、ステップｃ）において、ＩｇＥまたはＩｇＥフラグメントを含むステップａ）の最終生成物と、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７を含むステップｂ）の最終生成物を、、約８：１～約１：８、好ましくは約４：１～約１：４の範囲の、より好ましくは約１：１のＩｇＥまたはそのフラグメント：担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７のモル比で接触させる。
【0185】
一実施形態では、ステップｃ）において、ＩｇＥまたはＩｇＥフラグメントを含むステップａ）の最終生成物と、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７を含むステップｂ）の最終生成物を、約０．０１～約５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．１～約１ｍｇ／ｍＬの範囲、より好ましくは約０．４ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度で接触させる。
【0186】
一実施形態では、ステップｃ）において、反応緩衝液は、液体、好ましくは水溶液である。
【0187】
一実施形態では、ステップｃ）において、反応緩衝液は、約６～約８の範囲の、好ましくは約６．５～約７．５の範囲のｐＨ、より好ましくはｐＨ約７．２である。
【0188】
ステップｃ）の一実施形態では、接触ステップは、約２時間～約２６時間、好ましくは約１０～１８時間、より好ましくは約１２～約１８時間の範囲の時間の間実施される。
【0189】
一実施形態では、インキュベーションステップｃ）は、約２℃～１０℃、好ましくは約３℃～約７℃、より好ましくは約４℃の範囲の温度で実施される。
【0190】
一実施形態では、ステップｂ）に続き、反応混合物中に存在する約１００ｋＤａ未満、約５０ｋＤａ未満、約２５ｋＤａ未満、約１０ｋＤａ未満、約５ｋＤａ未満または約３ｋＤａ未満の分子量を有する小化合物を、除去する。これらの小化合物は主に、反応しなかった過剰な分子を含む。このような除去は、当技術分野で周知の方法により行われてよい。
【0191】
一実施形態では、ステップｃ）で得られた免疫原性産物を、濃縮する。免疫原性産物の濃縮は、当技術分野で知られている任意の技術、例えば、滅菌濾過と任意に組み合わされてよい遠心限外濾過法などによって、当業者により行われてよい。
【0192】
一実施形態では、ステップｃ）で得られ、任意に濃縮された免疫原性産物は、凍結乾燥される。
【0193】
本発明はさらに、本発明の方法により得られ得る免疫原性産物に関する。
【0194】
本発明はさらに、上記の少なくとも１つの免疫原性産物を含む、上記の少なくとも１つの免疫原性産物から本質的になる、または上記の少なくとも１つの免疫原性産物からなる組成物に関する。一実施形態では、上記組成物は、免疫原性組成物と呼ばれることがある。
【0195】
本発明はさらに、上記の少なくとも１つの免疫原性産物、および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる医薬組成物に関する。
【0196】
本発明の医薬組成物に使用され得る薬学的に許容される賦形剤としては、これらに限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリエチレングリコール、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
【0197】
本発明はさらに、上記の少なくとも１つの免疫原性産物を含む、上記の少なくとも１つの免疫原性産物から本質的になる、または上記の少なくとも１つの免疫原性産物からなる医薬品に関する。
【0198】
本明細書で使用される場合、「本質的にからなる」という用語は、組成物、医薬組成物または医薬品に関して、本発明の少なくとも１つの免疫原性産物が、上記の組成物、医薬組成物または医薬品内で生物学的活性を有する唯一の治療剤または剤であることを意味する。
【0199】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または医薬品は、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７と連結されたＩｇＥまたはＩｇＥフラグメントを含む免疫原性産物を含むか、または本質的にそれらからなる。
【0200】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、または医薬品は、ワクチン組成物である。本発明の一実施形態では、本発明のワクチン組成物は、少なくとも１種のアジュバントを含む。
【0201】
本発明はさらに、本発明の組成物、医薬組成物、医薬品またはワクチンの製剤に関し、組成物、医薬組成物、医薬品またはワクチンは、アジュバント添加される。
【0202】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、医薬品またはワクチンはしたがって、１種以上のアジュバントを含む。
【0203】
本発明において使用され得る好適なアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；
（２）水中油型エマルジョン製剤（他の特異的免疫刺激剤、例えばムラミルペプチド（以下に定義）または細菌細胞壁成分の有無にかかわらず）、例えば、スクアレン系エマルジョンなど（例えば、スクアレンベースの水中油型エマルジョン）またはスクワランベースのエマルジョン、例えば、
（ａ）モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａｓｓ）などのマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に製剤化される５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％のｓｐａｎ８５（任意により、様々な量のＭＴＰ－ＰＥを含有する（下記参照、必須ではないが））を含有する、ＭＦ５９（ＰＣＴ公開第９０／１４８３７号に記載のスクアレン系水中油型アジュバント）
（ｂ）ＳＷＥ０１（水中油型スクアレンベースのアジュバント）、
（ｃ）サブミクロンエマルジョンへとマイクロ流体化される、またはボルテックスしてより大きい粒子サイズのエマルジョンを生成する、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ－ＭＤＰ（下記参照）を含有する、ＳＡＦ
（ｄ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および米国特許第４，９１２，０９４号に記載の３－Ｏ－脱アイル化モノホスホリリピドＡ（ＭＰＬ（商標）（Ｃｏｒｉｘａ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標）からなる群からの１種以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）；
（ｅ）クエン酸緩衝液中に分散される、限定されないが、以下の組成：スクワラン３．９Ｗ／Ｖ％、トリオレイン酸ソルビタン（０．４７Ｗ／Ｖ％）、およびポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレエート（０．４７Ｗ／Ｖ％）を含むスクワラン系アジュバント；
（３）例えば、ＩＳＡ－５１またはスクアレン系油中水型アジュバント（例えば、ＩＳＡ－７２０）などの、油中水型エマルジョン製剤；油中水型エマルジョン中での使用に好適な油アジュバントは、鉱油および／または代謝性油を含み得る。鉱油は、Ｂａｙｏｌ（登録商標）、Ｍａｒｃｏｌ（登録商標）、およびＤｒａｋｅｏｌ、例えば、Ｄｒａｋｅｏ（登録商標）６ＶＲ（ＳＥＰＰＩＣ，Ｆｒａｎｃｅ）から選択できる。代謝可能な油は、ＳＰ油（以下に記載）、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（ＭＰＶ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｌｓｔｏｎ，ＮＺ）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ２６４、２６６、２６（Ｓｅｐｐｉｃ ＳＡ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、ならびに植物油、動物油、例えば、魚油スクワランおよびスクワレン、ならびにトコフェロールおよびその誘導体から選択され得る。
（４）Ｑｕｉｌ ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ－２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ．）（米国特許第５，０５７，５４０号）などの、サポニンアジュバントが使われてよく、またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）などの、それらから生成される粒子；
（５）細菌性リポ多糖類、アミノアルキルグルコサミンリン酸化合物（ＡＧＰ）などの合成脂質Ａ類似体、またはそれらの誘導体もしくは類似体（これらは、Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、かつ米国特許第６，１１３，９１８号に記載される；そのようなＡＧＰの１つは、２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２－デオキシ－４－Ｏ－ホスホノ－３－Ｏｉ［（Ｒ）－３テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］－２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］－ｂ－Ｄグルコピラノシドであり、それは、５２９としても知られており（以前はＲＣ５２９として知られていた）、水性形態または安定なエマルジョンとして製剤化される）、ＣｐＧモチーフ（複数可）を含むオリゴヌクレオチドなどの合成ポリヌデオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）；
（６）インターロイキン類（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロンなど）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子Ｂ７－１およびＢ７－２などの、サイトカイン；
（７）例えば、国際公開第００／１８４３４号（ＷＯ０２／０９８３６８およびＷＯ０２／０９８３６９も参照されたい）に準拠して、アミノ酸２９位のグルタミン酸が別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換される、野生型または変異型のいずれかのコレラ毒素（ＣＴ）などの細菌ＡＤＰリボシル毒素の無毒化変異体、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ－Ｋ６３、ＬＴ－Ｒ７２、ＣＴ－Ｓ１０９、ＰＴ－Ｋ９／Ｇ１２９（例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照されたい）の無毒化変異体；および
（８）組成物の有効性を向上させる免疫刺激剤として作用する他の物質。ムラミルペプチドとしては、これらに限定されないが、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－スレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルノルムラミル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）などが挙げられる。
（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；
（２）水中油型エマルジョン製剤（他の特異的免疫刺激剤、例えばムラミルペプチド（以下に定義）または細菌細胞壁成分の有無にかかわらず）、例えば、スクアレン系エマルジョンなど（例えば、スクアレンベースの水中油型エマルジョン）またはスクワランベースのエマルジョン、例えば、
（ａ）モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａｓｓ）などのマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に製剤化される５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％のｓｐａｎ８５（任意により、様々な量のＭＴＰ－ＰＥを含有する（下記参照、必須ではないが））を含有する、ＭＦ５９（ＰＣＴ公開第９０／１４８３７号に記載のスクアレン系水中油型アジュバント）
（ｂ）ＳＷＥ０１（水中油型スクアレンベースのアジュバント）、
（ｃ）サブミクロンエマルジョンへとマイクロ流体化される、またはボルテックスしてより大きい粒子サイズのエマルジョンを生成する、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ－ＭＤＰ（下記参照）を含有する、ＳＡＦ
（ｄ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および米国特許第４，９１２，０９４号に記載の３－Ｏ－脱アイル化モノホスホリリピドＡ（ＭＰＬ（商標）（Ｃｏｒｉｘａ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標）からなる群からの１種以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）；
（ｅ）クエン酸緩衝液中に分散される、限定されないが、以下の組成：スクワラン３．９Ｗ／Ｖ％、トリオレイン酸ソルビタン（０．４７Ｗ／Ｖ％）、およびポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレエート（０．４７Ｗ／Ｖ％）を含むスクワラン系アジュバント；
（３）例えば、ＩＳＡ－５１またはスクアレン系油中水型アジュバント（例えば、ＩＳＡ－７２０）などの、油中水型エマルジョン製剤；油中水型エマルジョン中での使用に好適な油アジュバントは、鉱油および／または代謝性油を含み得る。鉱油は、Ｂａｙｏｌ（登録商標）、Ｍａｒｃｏｌ（登録商標）、およびＤｒａｋｅｏｌ、例えば、Ｄｒａｋｅｏ（登録商標）６ＶＲ（ＳＥＰＰＩＣ，Ｆｒａｎｃｅ）から選択できる。代謝可能な油は、ＳＰ油（以下に記載）、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（ＭＰＶ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｌｓｔｏｎ，ＮＺ）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ２６４、２６６、２６（Ｓｅｐｐｉｃ ＳＡ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、ならびに植物油、動物油、例えば、魚油スクワランおよびスクワレン、ならびにトコフェロールおよびその誘導体から選択され得る。
（４）Ｑｕｉｌ ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ－２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ．）（米国特許第５，０５７，５４０号）などの、サポニンアジュバントが使われてよく、またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）などの、それらから生成される粒子；
（５）細菌性リポ多糖類、アミノアルキルグルコサミンリン酸化合物（ＡＧＰ）などの合成脂質Ａ類似体、またはそれらの誘導体もしくは類似体（これらは、Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、かつ米国特許第６，１１３，９１８号に記載される；そのようなＡＧＰの１つは、２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２－デオキシ－４－Ｏ－ホスホノ－３－Ｏｉ［（Ｒ）－３テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］－２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］－ｂ－Ｄグルコピラノシドであり、それは、５２９としても知られており（以前はＲＣ５２９として知られていた）、水性形態または安定なエマルジョンとして製剤化される）、ＣｐＧモチーフ（複数可）を含むオリゴヌクレオチドなどの合成ポリヌデオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）；
（６）インターロイキン類（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロンなど）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子Ｂ７－１およびＢ７－２などの、サイトカイン；
（７）例えば、国際公開第００／１８４３４号（ＷＯ０２／０９８３６８およびＷＯ０２／０９８３６９も参照されたい）に準拠して、アミノ酸２９位のグルタミン酸が別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換される、野生型または変異型のいずれかのコレラ毒素（ＣＴ）などの細菌ＡＤＰリボシル毒素の無毒化変異体、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ－Ｋ６３、ＬＴ－Ｒ７２、ＣＴ－Ｓ１０９、ＰＴ－Ｋ９／Ｇ１２９（例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照されたい）の無毒化変異体；および
（８）組成物の有効性を向上させる免疫刺激剤として作用する他の物質。ムラミルペプチドとしては、これらに限定されないが、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－スレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルノルムラミル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）などが挙げられる。
【0204】
使用されるアジュバントは、部分的には、レシピエント生物に依存し得る。さらに、投与するアジュバントの量は、動物の種類および大きさに依存するであろう。
【0205】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、医薬品またはワクチン組成物は、１つ以上の界面活性剤、および任意により上記の少なくとも１つのアジュバントをさらに含むエマルジョンである（または含む）。一実施形態では、エマルジョンは、油中水型エマルジョンまたは水中油型エマルジョンである。
【0206】
本発明で使用され得る界面活性剤の例は、当技術分野で周知であり、これらに限定されないが、Ａｒｌａｃｅｌ（ＳＥＰＰＩＣ、Ｆｒａｎｃｅ）により市販されるＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）８０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ｓｐａｎ８５、トリトンＸ１００などのマンニドモノオレエートを含む。
【0207】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、医薬品、ワクチン組成物は、本発明の少なくとも１つの免疫原性産物の治療的有効量を含む。
【0208】
一実施形態では、保存目的で、本発明の免疫原性産物または組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物は、凍結乾燥される。
【0209】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物はしたがって、フリーズドライ（凍結乾燥）形態で提示され得る。本実施形態によれば、本発明の免疫原性産物は、１つ以上の凍結乾燥補助物質と組み合わされる。様々な凍結乾燥補助物質が当業者に周知であり、これらに限定されないが、ラクトースおよびマンニトールのような糖類を含む。
【0210】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物は、例えば、分解しやすいタンパク質が分解されるのを防ぐため、免疫原性産物の貯蔵寿命を延長させるため、またはフリーズドライ効率を改善するために、安定剤と混合されてよい。有用な安定剤としては、これらに限定されないが、ＳＰＧＡ、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストランまたはグルコース）、タンパク質（例えば、アルブミンまたはカゼインまたはそれらの分解生成物）、アミノ酸、例えばリジンまたはグリシン、および緩衝剤、例えばアルカリ金属リン酸塩が挙げられる。
【0211】
一実施形態では、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、またはワクチン組成物は、注射により、局所的に（例えば、経皮送達によるなどの）、直腸に、鼻に、または膣により投与され得る。
【0212】
一実施形態では、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物は、注射に適合された形態である。したがって、一実施形態では、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物は、筋肉内、腹腔内、または皮下注射により対象に注射される（または注射用である）。
【0213】
注射用途に好適な形態の例としては、これらに限定されないが、注入可能な滅菌溶液または滅菌分散液を即時調製するための滅菌水溶液または滅菌分散液および滅菌粉末が挙げられる。微生物による汚染に対する防止は、組成物中に防腐剤、例えば、例えば、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）を添加することによってもたらされ得る。一実施形態では、注射中の痛みを軽減するために、例えば糖または塩化ナトリウムなどの等張化剤を含めることが好ましい場合がある。一実施形態では、注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によりもたらされ得る。
【0214】
一実施形態では、本発明の凍結乾燥ワクチン組成物を、注射用水に溶解し、穏やかに混合する。次に、上記の免疫アジュバントを加える。混合物を、穏やかに混合し、好適なシリンジに充填する。本発明はしたがってまた、本発明のワクチン組成物が充填されるかまたはあらかじめ充填されたシリンジを含む、医療デバイスにも関する。
【0215】
一実施形態では、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物は、局所投与に適合された形態である。局所投与に適合された形態の例としては、これらに限定されないが、ポリマーパッチ、または制御放出パッチなどが挙げられる。
【0216】
別の実施形態では、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物は、直腸投与に適合された形態である。直腸投与に適合された形態の例としては、これらに限定されないが、坐剤、マイクロ浣腸剤、浣腸剤、ゲル、腸フォーム剤、クリーム、軟膏などが挙げられる。
【0217】
本発明はまた、本発明の組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物が充填されるかまたはあらかじめ充填されたシリンジである医療デバイスにも関する。
【0218】
一実施形態では、シリンジは、デュアルチャンバーシリンジであり、一方のチャンバーは、本発明の免疫原性産物を含む溶液を含み、他方のチャンバーは、アジュバントを含む。
【0219】
本発明はまた、本発明の免疫原性産物、または本発明の組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物があらかじめ充填されたバイアルを含む医療デバイスに関する。
【0220】
本発明はさらに、医薬品としてまたは薬物としての使用のための、本発明の免疫原性産物に関する。
【0221】
本発明はさらに、対象における炎症性障害を治療するための、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物に関する。
【0222】
本発明はさらに、対象における炎症性障害を治療するための医薬品の製造のための本発明の免疫原性産物の使用に関する。
【0223】
本発明はしたがってさらに、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物を対象に投与することを含む、対象における炎症性障害を治療するための方法に関する。
【0224】
本発明はさらに、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物を対象に投与することを含む、対象においてＩｇＥに対する免疫応答を誘導するための方法に関する。
【0225】
本発明はさらに、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物を対象に投与することを含む、ＩｇＥの生物学的活性を阻害するかまたは生物学的活性を中和する抗体の産生を対象において誘導するための方法に関する。一実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。
【0226】
一実施形態では、対象は、炎症性障害、特に異常な全ＩｇＥ発現もしくは活性および／またはアレルゲン特異的ＩｇＥの発現に関連する炎症性障害に罹患している、好ましくはこれらであると診断されている。
【0227】
一実施形態では、対象は、ヒトである。好ましくは、この実施形態によれば、本発明の免疫原性産物に含まれる少なくとも１つのＩｇＥまたはそのフラグメントは、ヒトである。
【0228】
一実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物（例えば、ペットなど）である。好ましくは、この実施形態によれば、本発明の免疫原性産物に含まれる少なくとも１つのＩｇＥまたはそのフラグメントは、非ヒト哺乳動物に由来する。
【0229】
一実施形態では、対象は、ウマ、イヌ、またはネコである。好ましくは、この実施形態によれば、本発明の免疫原性産物に含まれる少なくとも１つのＩｇＥまたはそのフラグメントは、それぞれウマ、イヌ科、またはネコ科である。
【0230】
一実施形態では、炎症性障害は、異常なＩｇＥの発現または活性に関連する障害である。
【0231】
炎症性障害の例としては、これらに限定されないが、喘息、アレルギー状態（例えば、食物アレルギー、毒物アレルギー、ネコアレルギー、薬物アレルギー、高ＩｇＥ症候群、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎およびアレルギー性腸胃炎など）、アナフィラキシー、アトピー性疾患（例えば、蕁麻疹（慢性特発性蕁麻疹および慢性自発性蕁麻疹など）、湿疹など）、水疱性類天疱瘡、呼吸器疾患（喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性気管支肺真菌症など）、鼻ポリープ症および気道炎症を伴う他の状態（例えば、好酸球増加症、線維症、および嚢胞性線維症および肺線維症などの過剰な粘液産生、全身性硬化症（ＳＳｃ）など）；炎症性および／または自己免疫障害または状態、胃腸障害または状態（例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、および好酸球媒介性胃腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病および全身性エリテマトーデスなど）；全身性エリテマトーデス；マスト細胞症およびマスト細胞活性化症候群（ＭＣＡＳ）が挙げられる。
【0232】
一実施形態では、炎症性障害は、喘息（例えば、アレルギー性喘息）、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー（例えば、食物または毒物アレルギー）、アナフィラキシー、および鼻ポリープ症を含む群から選択される。
【0233】
一実施形態では、炎症性障害は、喘息（例えば、アレルギー性喘息）、アレルギー（例えば、食物または毒物アレルギー）およびアナフィラキシーを含む群から選択される。
【0234】
一実施形態では、炎症性障害は、アレルギー、アナフィラキシー、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、鼻ポリープ症から選択され、好ましくは上記炎症性障害は、食物アレルギーまたは毒物アレルギーである。
【0235】
一実施形態では、炎症性障害は、アレルギー性喘息である。
【0236】
本発明はさらに、特定の抗原に対してアレルギーのある対象の脱感作を誘導するための方法に関し、本方法は、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物およびアレルゲンを対象に投与することを含む。
【0237】
本明細書で使用される「脱感作」という用語は、アレルゲン免疫療法、脱感作または低感作またはアレルギーワクチン接種としても知られ、アレルギー性喘息などの環境アレルギーに対する医学的処置を指す。このような処置は、アレルゲンの存在下での免疫系の応答を低下させる試みにおいて、さらに多くの量のアレルゲンにヒトを曝露することを伴う。
【0238】
アレルゲンの例としては、これらに限定されないが、吸入アレルゲン、摂取アレルゲンおよび接触アレルゲンが挙げられる。
【0239】
吸入アレルゲンの例としては、これらに限定されないが、Ａｓｔｉｇｍａｔａ（例えば、Ａｃａｒｕｓ ｓｉｒｏ（ストレージダニ、Ａｃａ ｓ １３）、Ｂｌｏｍｉａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（ダニ、Ｂｌｏ ｔ）、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ（アメリカハウスダストダニ、Ｄｅｒ ｆ）、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｍｉｃｒｏｃｅｒａｓ（ハウスダストダニ、Ｄｅｒ ｍ）、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ（ヨーロッパハウスダストダニ、Ｄｅｒ ｐ）、Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ ｍａｙｎｅｉ（ハウスダストダニ、Ｅｕｒ ｍ）、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ（ストレージダニ、Ｇｌｙ ｄ ２）、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ（ストレージダニ、Ｌｅｐ ｄ）、Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｔｉａｅ（ストレージダニ、Ｔｙｒ ｐ））；Ｂｌａｔｔａｒｉａ（例えば、Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（チャバネゴキブリ、Ｂｌａ ｇ）、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ（ワモンゴキブリ、Ｐｅｒ ａ））；Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ（例えば、Ｈａｒｍｏｎｉａ ａｘｙｒｉｄｉｓ（ナミテントウ、Ｈａｒ ａ））、Ｄｉｐｔｅｒａ（例えば、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（ネッタイシマカ、Ａｅｄ ａ）、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｋｉｉｅｎｓｉｓ（小昆虫、Ｃｈｉ ｋ）、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｈｕｍｍｉ ｔｈｕｍｍｉ（小昆虫、Ｃｈｉ ｔ）、Ｆｏｒｃｉｐｏｍｙｉａ ｔａｉｗａｎａ（ヌカカ（Ｂｉｔｉｎｇ ｍｉｄｇｅ）、Ｆｏｒ ｔ）、Ｇｌｏｓｓｉｎａ ｍｏｒｓｉｔａｎｓ（Ｓａｖａｎｎａｈ Ｔｓｅｔｓｅ ｆｌｙ、Ｇｌｏ ｍ）、Ｈｅｍｉｄｉｐｔｅｒａ：Ｔｒｉａｔｏｍａ ｐｒｏｔｒａｃｔａ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｋｉｓｓｉｎｇ ｂｕｇ、Ｔｒｉａ ｐ））、膜翅目（例えば、Ａｐｉｓ ｃｅｒａｎａ（Ｅａｓｔｅｒｎ ｈｉｖｅ ｂｅｅ、Ａｐｉ ｃ）、Ａｐｉｓ ｄｏｒｓａｔａ（オオミツバチ、Ａｐｉ ｄ）、Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ（ミツバチ、Ａｐｉ ｍ）、Ｂｏｍｂｕｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓ（マルハナバチ、Ｂｏｍ ｐ）、Ｂｏｍｂｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ（マルハナバチ、Ｂｏｍ ｔ）、Ｄｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａ ａｒｅｎａｒｉａ（キイロスズメバチ、Ｄｏｌ ａ）、Ｄｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａ ｍａｃｕｌａｔａ（Ｗｈｉｔｅ ｆａｃｅ ｈｏｒｎｅｔ、Ｄｏｌ ｍ）、Ｍｙｒｍｅｃｉａ ｐｉｌｏｓｕｌａ（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｊｕｍｐｅｒ ａｎｔ、Ｍｙｒ ｐ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ａｎｎｕｌａｒｉｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ａ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｄｏｍｉｎｕｌｕｓ（地中海アシナガバチ、Ｐｏｌ ｄ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｅｘｃｌａｍａｎｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ｅ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｆｕｓｃａｔｕｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ｆ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｇａｌｌｉｃｕｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ｇ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｍｅｔｒｉｃｕｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ｍ）、Ｐｏｌｙｂｉａ ｐａｕｌｉｓｔａ（ワスプ、Ｐｏｌ ｐ）、Ｐｏｌｙｂｉａ ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ｓ）、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｇｅｍｉｎａｔａ（アカカミアリ、Ｓｏｌ ｇ）、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ（ヒアリ、Ｓｏｌ ｉ）、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｒｉｃｈｔｅｒｉ（クロヒアリ、Ｓｏｌ ｒ）、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｓａｅｖｉｓｓｉｍａ（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｆｉｒｅ ａｎｔ、Ｓｏｌ ｓ）、Ｖｅｓｐａ ｃｒａｂｒｏ（モンスズメバチ、Ｖｅｓｐ ｃ）、Ｖｅｓｐａ ｍａｎｄａｒｉｎｉａ（Ｇｉａｎｔ ａｓｉａｎ ｈｏｒｎｅｔ、Ｖｅｓｐ ｍ）、Ｖｅｓｐｕｌａ ｆｉａｖｏｐｉｌｏｓａ（イエロージャケット、Ｖｅｓｐ ｆ）、Ｖｅｓｐｕｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（イエロージャケット、Ｖｅｓｐ ｇ）、Ｖｅｓｐｕｌａ ｍａｃｕｌｉｆｒｏｎｓ（イエロージャケット、Ｖｅｓｐ ｍ）、Ｖｅｓｐｕｌａ ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃａ（イエロージャケット、Ｖｅｓｐ ｐ）、Ｖｅｓｐｕｌａ ｓｑｕａｍｏｓａ（イエロージャケット、Ｖｅｓｐ ｓ）、Ｖｅｓｐｕｌａ ｖｉｄｕａ（ワスプ、Ｖｅｓｐ ｖｉ）、Ｖｅｓｐｕｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（イエロージャケット、Ｖｅｓｐ ｖ））、Ｉｘｏｄｉｄａ（例えば、Ａｒｇａｓ ｒｅｆｌｅｘｕｓ（Ｐｉｇｅｏｎ ｔｉｃｋ、Ａｒｇ ｒ））、鱗翅目（例えば、Ｂｏｍｂｙｘ ｎｉｏｒｉ（Ｓｉｌｋ ｍｏｔｈ、Ｂｏｍｂ ｎ）、ノシメマダラメイガ（Ｉｎｄｉａｎｍｅａｌ ｍｏｔｈ、Ｐｌｏ ｉ）、Ｔｈａｕｍｅｔｏｐｏｅａ ｐｉｔｙｏｃａｍｐａ（Ｐｉｎｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｏｎａｒｙ ｍｏｔｈ、Ｔｈａ ｐ））、シミ目（例えば、セイヨウシミ（Ｓｉｌｖｅｒｆｉｓｈ、Ｌｅｐ ｓ））、隠翅目（例えば、Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｆｅｌｉｓ ｆｅｌｉｓ（Ｃａｔ ｆｌｅａ、Ｃｔｅ ｆ））、食肉目（例えば、イエイヌ（イヌ、Ｃａｎ ｆ）、Ｆｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ（ネコ、Ｆｅｌ ｄ））；ウサギ目（例えば、アナウサギ（ウサギ、Ｏｒｙ ｃ）、奇蹄類：ウマ（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｈｏｒｓｅ、Ｅｑｕ ｃ））、Ｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｉｆｏｒｍｅｓ（例えば、Ｌｅｐｉｄｏｒｈｏｍｂｕｓ ｗｈｉｆｆｉａｇｏｎｉｓ（Ｍｅｇｒｉｍ、Ｗｈｉｆｆ、Ｇａｌｌｏ、Ｌｅｐ ｗ））、げっ歯類（例えば、モルモット（ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ、Ｃａｖ ｐ）、ハツカネズミ（マウス、Ｍｕｓ ｍ）、ドブネズミ（ラット、Ｒａｔ ｎ））；球果植物目：ヒノキ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｃｙｐｒｅｓｓ、Ｃｈａ ｏ）、アリゾナイトスギ（イトスギ、Ｃｕｐ ａ）、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ（スギ、Ｃｒｙ ｊ）、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ（Ｃｏｍｍｏｎ ｃｙｐｒｅｓｓ、Ｃｕｐ ｓ）、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ ｃｅｄａｒ、Ｊｕｎ ａ）、ケードネズ（Ｐｒｉｃｋｌｙ ｊｕｎｉｐｅｒ、Ｊｕｎ ｏ）、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ ｃｅｄａｒ、Ｊｕｎ ｓ）、エンピツビャクシン（Ｅａｓｔｅｒｎ ｒｅｄ ｃｅｄａｒ、Ｊｕｎ ｖ））；Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ（例えば、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ（Ｒｏｓｙ ｐｅｒｉｗｉｎｋｌｅ、Ｃａｔ ｒ））；
イネ目（例えば、Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ ｏｄｏｒａｔｕｍ（Ｓｗｅｅｔ ｖｅｒｎａｌ ｇｒａｓｓ、Ａｎｔ ｏ １）、Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ（ギョウギシバ、Ｃｙｎ ｄ １、Ｃｙｎ ｄ ７、Ｃｙｎ ｄ １２、Ｃｙｎ ｄ １５、Ｃｙｎ ｄ ２２ｗ、Ｃｙｎ ｄ ２３、Ｃｙｎ ｄ ２４）、Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ（カモガヤ、Ｄａｅ ｇ １、Ｄａｅ ｇ ２、Ｄａｅ ｇ ３、Ｄａｅ ｇ ４、Ｄａｅ ｇ ５）、Ｆｅｓｔｕｃａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ（Ｍｅａｄｏｗ ｆｅｓｃｕｅ、Ｆｅｓ ｐ ４））、Ｈｏｌｃｕｓ ｌａｎａｔｕｓ（シラゲガヤ、Ｈｏｌ ｌ １、Ｈｏｌ ｌ ５）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ、Ｈｏｒ ｖ １、Ｈｏｒ ｖ ５、Ｈｏｒ ｖ １２、Ｈｏｒ ｖ １５、Ｈｏｒ ｖ １６、Ｈｏｒ ｖ １７、Ｈｏｒ ｖ ２１）、Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ（Ｒｙｅ ｇｒａｓｓ、Ｌｏｌ ｐ １、Ｌｏｌ ｐ ２、Ｌｏｌ ｐ ３、Ｌｏｌ ｐ ４、Ｌｏｌ ｐ ５、Ｌｏｌ ｐ １１）、イネ（コメ、Ｏｒｙ ｓ １、Ｏｒｙ ｓ １２）、Ｐａｓｐａｌｕｍ ｎｏｔａｒｕｍ（Ｂａｈｉａ ｇｒａｓｓ、Ｐａｓ ｎ １）、Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｑｕａｔｉｃａ（Ｃａｎａｒｙ ｇｒａｓｓ、Ｐｈａ ａ １、Ｐｈａ ａ ５）、オオアワガエリ（Ｔｉｍｏｔｈｙ、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ４、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６、Ｐｈｌ ｐ ７、Ｐｈｌ ｐ １１、Ｐｈｌ ｐ １２、Ｐｈｌ ｐ １３）、ナガハグサ（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ ｂｌｕｅ ｇｒａｓｓ、Ｐｏａ ｐ １、Ｐｏａ ｐ ５）、ライムギ（Ｒｙｅ、Ｓｅｃ ｃ １、Ｓｅｃ ｃ ２０）、セイバンモロコシ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｇｒａｓｓ、Ｓｏｒ ｈ １）、コムギ（Ｗｈｅａｔ、Ｔｒｉ ａ １２、Ｔｒｉ ａ １４、Ｔｒｉ ａ １８５、Ｔｒｉ ａ １９、Ｔｒｉ ａ ２５、Ｔｒｉ ａ ２６、Ｔｒｉ ａ ２７、Ｔｒｉ ａ ２８、Ｔｒｉ ａ ２９、Ｔｒｉ ａ ３０）、トウモロコシ（Ｍａｉｚｅ、Ｚｅａ ｍ １ 、Ｚｅａ ｍ １２、Ｚｅａ ｍ １４、Ｚｅａ ｍ ２５）、Ｆａｇａｌｅｓ：Ａｌｎｕｓ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ（Ａｌｄｅｒ、Ａｌｎ ｇ １、Ａｌｎ ｇ ４）、Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ（Ｂｉｒｃｈ、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４、Ｂｅｔ ｖ ５、Ｂｅｔ ｖ ６、Ｂｅｔ ｖ ７）、セイヨウシデ（Ｈｏｒｎｂｅａｍ、Ｃａｒ ｂ １））；シソ目（例えば、セイヨウトネリコ（Ａｓｈ、Ｆｒａ ｅ ｌ）、ヨウシュイボタ（Ｐｒｉｖｅｔ、Ｌｉｇ ｖ）、ライラック（Ｌｉｌａｃ、Ｓｙｒ ｖ））；キントラノオ目（例えば、パラゴムノキ（ｐａｒａ ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ（ｌａｔｅｘ）、Ｈｅｖ ｂ １、Ｈｅｖ ｂ ２、Ｈｅｖ ｂ ３、Ｈｅｖ ｂ ４、Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６、Ｈｅｖ ｂ ７、Ｈｅｖ ｂ ８、Ｈｅｖ ｂ ９、Ｈｅｖ ｂ １０、Ｈｅｖ ｂ １１、Ｈｅｖ ｂ １２、Ｈｅｖ ｂ １３））；ヤマモガシ目（例えば、Ｐｌａｔａｎｕｓ ａｃｅｒｉｆｏｌｉａ（Ｌｏｎｄｏｎ ｐｌａｎｅ ｔｒｅｅ、Ｐｌａ ａ １、Ｐｌａ ａ ２、Ｐｌａ ａ ３）、Ｐｌａｔａｎｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（Ｏｒｉｅｎｔａｌ ｐｌａｎｅ、Ｐｌａ ｏｒ １、Ｐｌａ ｏｒ ２、Ｐｌａ ｏｒ ３））が挙げられる。
イネ目（例えば、Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ ｏｄｏｒａｔｕｍ（Ｓｗｅｅｔ ｖｅｒｎａｌ ｇｒａｓｓ、Ａｎｔ ｏ １）、Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ（ギョウギシバ、Ｃｙｎ ｄ １、Ｃｙｎ ｄ ７、Ｃｙｎ ｄ １２、Ｃｙｎ ｄ １５、Ｃｙｎ ｄ ２２ｗ、Ｃｙｎ ｄ ２３、Ｃｙｎ ｄ ２４）、Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ（カモガヤ、Ｄａｅ ｇ １、Ｄａｅ ｇ ２、Ｄａｅ ｇ ３、Ｄａｅ ｇ ４、Ｄａｅ ｇ ５）、Ｆｅｓｔｕｃａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ（Ｍｅａｄｏｗ ｆｅｓｃｕｅ、Ｆｅｓ ｐ ４））、Ｈｏｌｃｕｓ ｌａｎａｔｕｓ（シラゲガヤ、Ｈｏｌ ｌ １、Ｈｏｌ ｌ ５）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ、Ｈｏｒ ｖ １、Ｈｏｒ ｖ ５、Ｈｏｒ ｖ １２、Ｈｏｒ ｖ １５、Ｈｏｒ ｖ １６、Ｈｏｒ ｖ １７、Ｈｏｒ ｖ ２１）、Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ（Ｒｙｅ ｇｒａｓｓ、Ｌｏｌ ｐ １、Ｌｏｌ ｐ ２、Ｌｏｌ ｐ ３、Ｌｏｌ ｐ ４、Ｌｏｌ ｐ ５、Ｌｏｌ ｐ １１）、イネ（コメ、Ｏｒｙ ｓ １、Ｏｒｙ ｓ １２）、Ｐａｓｐａｌｕｍ ｎｏｔａｒｕｍ（Ｂａｈｉａ ｇｒａｓｓ、Ｐａｓ ｎ １）、Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｑｕａｔｉｃａ（Ｃａｎａｒｙ ｇｒａｓｓ、Ｐｈａ ａ １、Ｐｈａ ａ ５）、オオアワガエリ（Ｔｉｍｏｔｈｙ、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ４、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６、Ｐｈｌ ｐ ７、Ｐｈｌ ｐ １１、Ｐｈｌ ｐ １２、Ｐｈｌ ｐ １３）、ナガハグサ（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ ｂｌｕｅ ｇｒａｓｓ、Ｐｏａ ｐ １、Ｐｏａ ｐ ５）、ライムギ（Ｒｙｅ、Ｓｅｃ ｃ １、Ｓｅｃ ｃ ２０）、セイバンモロコシ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｇｒａｓｓ、Ｓｏｒ ｈ １）、コムギ（Ｗｈｅａｔ、Ｔｒｉ ａ １２、Ｔｒｉ ａ １４、Ｔｒｉ ａ １８５、Ｔｒｉ ａ １９、Ｔｒｉ ａ ２５、Ｔｒｉ ａ ２６、Ｔｒｉ ａ ２７、Ｔｒｉ ａ ２８、Ｔｒｉ ａ ２９、Ｔｒｉ ａ ３０）、トウモロコシ（Ｍａｉｚｅ、Ｚｅａ ｍ １ 、Ｚｅａ ｍ １２、Ｚｅａ ｍ １４、Ｚｅａ ｍ ２５）、Ｆａｇａｌｅｓ：Ａｌｎｕｓ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ（Ａｌｄｅｒ、Ａｌｎ ｇ １、Ａｌｎ ｇ ４）、Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ（Ｂｉｒｃｈ、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４、Ｂｅｔ ｖ ５、Ｂｅｔ ｖ ６、Ｂｅｔ ｖ ７）、セイヨウシデ（Ｈｏｒｎｂｅａｍ、Ｃａｒ ｂ １））；シソ目（例えば、セイヨウトネリコ（Ａｓｈ、Ｆｒａ ｅ ｌ）、ヨウシュイボタ（Ｐｒｉｖｅｔ、Ｌｉｇ ｖ）、ライラック（Ｌｉｌａｃ、Ｓｙｒ ｖ））；キントラノオ目（例えば、パラゴムノキ（ｐａｒａ ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ（ｌａｔｅｘ）、Ｈｅｖ ｂ １、Ｈｅｖ ｂ ２、Ｈｅｖ ｂ ３、Ｈｅｖ ｂ ４、Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６、Ｈｅｖ ｂ ７、Ｈｅｖ ｂ ８、Ｈｅｖ ｂ ９、Ｈｅｖ ｂ １０、Ｈｅｖ ｂ １１、Ｈｅｖ ｂ １２、Ｈｅｖ ｂ １３））；ヤマモガシ目（例えば、Ｐｌａｔａｎｕｓ ａｃｅｒｉｆｏｌｉａ（Ｌｏｎｄｏｎ ｐｌａｎｅ ｔｒｅｅ、Ｐｌａ ａ １、Ｐｌａ ａ ２、Ｐｌａ ａ ３）、Ｐｌａｔａｎｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（Ｏｒｉｅｎｔａｌ ｐｌａｎｅ、Ｐｌａ ｏｒ １、Ｐｌａ ｏｒ ２、Ｐｌａ ｏｒ ３））が挙げられる。
【0240】
一実施形態では、吸入アレルゲンは、Ａｃａｒｕｓ ｓｉｒｏ（ストレージダニ、Ａｃａ ｓ １３）、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ（アメリカハウスダストダニ、Ｄｅｒ ｆ）、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｍｉｃｒｏｃｅｒａｓ（ハウスダストダニ、Ｄｅｒ ｍ）、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ（ヨーロッパハウスダストダニ、Ｄｅｒ ｐ）、Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ ｍａｙｎｅｉ（ハウスダストダニ、Ｅｕｒ ｍ）、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ（ストレージダニ、Ｇｌｙ ｄ ２）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ａｎｎｕｌａｒｉｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ａ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｄｏｍｉｎｕｌｕｓ（地中海アシナガバチ、Ｐｏｌ ｄ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｅｘｃｌａｍａｎｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ｅ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｆｕｓｃａｔｕｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ｆ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｇａｌｌｉｃｕｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ｇ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｍｅｔｒｉｃｕｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ｍ）、Ｐｏｌｙｂｉａ ｐａｕｌｉｓｔａ（ワスプ、Ｐｏｌ ｐ）、Ｐｏｌｙｂｉａ ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ｓ）、Ｆｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ（ネコ、Ｆｅｌ ｄ）、Ｐｏａｌｅｓ ａｎｄ Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓｅ（Ｂｉｒｃｈ、Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ ２、Ｂｅｔ ｖ ３、Ｂｅｔ ｖ ４、Ｂｅｔ ｖ ５、Ｂｅｔ ｖ ６、Ｂｅｔ ｖ ７）を含むまたはこれらからなる群から選択される。
【0241】
摂取アレルゲンの例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる；例えば、Ｆｕｎｇｉ Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ由来のアレルゲン、例えば、Ｄｏｔｈｉｄｅａｌｅｓ（例えば、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｒｏｔ ｆｕｎｇｕｓ、Ａｌｔ ａ）、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ（Ｃｌａ ｃ）、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｕｍ（Ｃｌａ ｈ）、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｌｕｎａｔａ（Ｃｕｒ ｌ）、－ユーロチウム目：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ａｓｐ ｆｌ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（Ａｓｐ ｆ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（Ａｓｐ ｎ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ（Ａｓｐ ｏ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ（Ｐｅｎ ｂ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（Ｐｅｎ ｃｈ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ（Ｐｅｎ ｃ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ（Ｐｅｎ ｏ））、ボタンタケ目（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ（Ｆｕｓ ｃ））；ホネタケ目（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ（Ｔｒｉ ｒ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ（Ｔｒｉ ｔ）、サッカロミケス目：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（酵母、Ｃａｎｄ ａ）、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ（酵母、Ｃａｎｄ ｂ））；Ｔｕｂｅｒｃｕｌａｒｉａｌｅｓ（例えば、Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ（Ｅｐｉ ｐ））、Ｆｕｎｇｉ Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ由来のアレルゲン、例えば、帽菌類（例えば、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ（ササクレヒトヨタケ、Ｃｏｐ ｃ）、Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓ（マジックマッシュルーム、Ｐｓｉ ｃ）、サビキン綱（例えば、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ（酵母、Ｒｈｏ ｍ））；黒穂菌（例えば、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ（Ｐｉｔｙｒｉａｓｉｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ｉｎｆｅｃｔ．Ａｇｅｎｔ、Ｍａｌａ ｆ）、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ（Ｍａｌａｓ））；抗生物質（例えば、ペニシリン、セファロスポリン、アミノシド、キノロン、マクロライド、テトラサイクリン、スルファミド）；薬物（例えば、アセチルサリチル酸、ワクチン、モルヒネおよび誘導体）；ビタミン、例えば、ビタミンＫ１；および食物アレルギー（例えば、牛乳、卵、落花生、木の実（くるみ、カシューなど）、魚、貝、大豆、小麦、およびニンジン、リンゴ、梨、アボカド、アプリコット、桃）由来のアレルゲン。
【0242】
一実施形態では、摂取アレルゲンは、食物アレルゲンである。
【0243】
一実施形態では、食物アレルゲンは、ミルク、卵、ピーナッツ、木の実（クルミ、カシューなど）、魚、甲殻類、大豆、小麦、およびニンジン、リンゴ、ナシ、アボカド、アプリコット、ピーチ由来のアレルゲンを含むまたはこれらからなる群から選択される。
【0244】
接触アレルゲンの例としては、これらに限定されないが、重金属（例えば、ニッケル、クロム、金など）、ラテックス、ハプテン、例えば、ハロタン、ヒドララジンなどが挙げられる。
【0245】
一実施形態では、アレルゲンは、以下を含むまたは以下からなる群から選択される；Ａｃａｒｕｓ ｓｉｒｏ（ストレージダニ、Ａｃａｓ１３）、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ（アメリカハウスダストダニ、Ｄｅｒ ｆ）、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｍｉｃｒｏｃｅｒａｓ（ハウスダストダニ、Ｄｅｒ ｍ）、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ（ヨーロッパハウスダストダニ、Ｄｅｒ ｐ）、Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ ｍａｙｎｅｉ（ハウスダストダニ、Ｅｕｒ ｍ）、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ（ストレージダニ、Ｇｌｙ ｄ ２）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ａｎｎｕｌａｒｉｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ａ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｄｏｍｉｎｕｌｕｓ（地中海アシナガバチ、Ｐｏｌ ｄ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｅｘｃｌａｍａｎｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ｅ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｆｕｓｃａｔｕｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ｆ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｇａｌｌｉｃｕｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ｇ）、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ ｍｅｔｒｉｃｕｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ｍ）、Ｐｏｌｙｂｉａ ｐａｕｌｉｓｔａ（ワスプ、Ｐｏｌ ｐ）、Ｐｏｌｙｂｉａ ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｓ（ワスプ、Ｐｏｌ ｓ）、Ｆｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ（ネコ、Ｆｅｌ ｄ）、Ｐｏａｌｅｓ ａｎｄ Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ（カバノキ属、Ｂｅｔ ｖ１、Ｂｅｔ ｖ２、Ｂｅｔ ｖ３、Ｂｅｔ ｖ４、Ｂｅｔ ｖ５、Ｂｅｔ ｖ６、Ｂｅｔ ｖ７）および食物アレルゲン。
【0246】
本発明はまたさらに、特定のアレルゲンに対してアレルギーのある対象の効力を増大させるためのおよび／または脱感作の期間を短縮するための方法に関し、対象は、脱感作により処置され、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物をさらに投与される。
【0247】
一実施形態では、本発明の方法において、対象は、最初に本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物を投与され、次にアレルゲンを投与される。
【0248】
一実施形態では、本発明の方法において、対象は、最初にアレルゲンを投与され、次に本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物を投与される。
【0249】
別の実施形態では、本発明の方法において、対象は、本発明の免疫原性産物、組成物、医薬組成物、医薬品、またはワクチン組成物、およびアレルゲンの組み合わされた投与を受ける。
【0250】
本発明はさらに、上記の組成物、医薬組成物、医薬品またはワクチンに関し、上記組成物、医薬組成物、医薬品またはワクチンは、少なくとも１つのアレルゲンをさらに含む。
【0251】
一実施形態では、本発明の少なくとも１つの免疫原性産物の治療的有効量が、対象に投与されているか、または投与される。一実施形態では、治療的有効量は、当技術分野で周知のＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して決定される総タンパク質の量に対応する。
【0252】
一実施形態では、対象に投与される免疫原性産物の量は、顕著な副作用なしに免疫防御応答を誘導する。
【0253】
一実施形態では、対象に投与される免疫原性産物の量は、顕著な副作用なしにアレルゲン脱感作を誘導する。
【0254】
本発明の免疫原性産物の構成成分の最適量は、対象における適切な免疫応答の観察を含む標準的研究により確認できる。初回ワクチン接種に続き、対象は、適切な間隔をあけて１回または数回の追加免疫を受けることができる。
【0255】
一実施形態では、治療は、ある期間にわたる単回投与または複数回投与からなる。
【0256】
本発明の一実施形態では、治療される対象は、上記のように免疫原性産物の治療的有効量を月に少なくとも２回投与される。
【0257】
本発明の別の実施形態では、治療される対象は、本発明の免疫原性産物の治療的有効量を１ヶ月に２回投与される。この実施形態では、対象は、０日目に１度、７日目～２８日目に２回目の投与を受け得る。一実施形態では、対象は、０日目に１度、２８日目に２回目の投与を受ける。
【0258】
本発明の別の実施形態では、治療される対象は、本発明の免疫原性産物の治療的有効量を１ヶ月に３回投与される。この実施形態では、治療される対象は、０日目に１度、７日目～１４日目に２回目、２１日目～２８日目に３回目の投与を受け得る。一実施形態では、対象は、０日目に１度、７日目に２回目、２８日目に３回目の投与を受ける。
【0259】
本発明の別の実施形態では、治療される対象は、本発明の免疫原性産物の治療的有効量を３ヶ月ごとに１度さらに投与され得る。
【0260】
本発明の一実施形態では、治療される対象は、上記のように１ヶ月に３回投与され、次いで本発明の免疫原性産物の治療的有効量を３ヶ月ごとに１度さらに投与される。
【0261】
本発明の別の実施形態では、治療される対象は、ＩｇＥに対する抗体の量が対象から得られた血清試料中で検出できない場合、上記のように免疫原性産物の治療的有効量をさらに投与されてよい。
【図面の簡単な説明】
【0262】
【図1-1】図１は、ｈＩｇＥキノイド（ｈＩｇＥ－Ｋ）の生成を示す。（Ａ）チオールマレイミドコンジュゲートを用いるｈＩｇＥ－Ｋの合成。（Ｂ）ＣＲＭ１９７へのＩｇＥＣε３－Ｃε４フラグメントのコンジュゲートによる高分子量キノイドの生成を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して確認した。（Ｃ）ＩｇＥＣε３－Ｃε４フラグメントのＣＲＭ１９７へのコンジュゲートによる高分子量キノイドの生成を、ＨＰＬＣを使用して確認した。
【図1-2】同上。
【図2】図２は、ｈＩｇＥ－キノイドによる抗ｈＩｇＥ抗体の中和を示す。（Ａ）筋肉内ワクチン接種プロトコールの概要。ｈＩｇＥＫＩマウス（マウスＩｇＥの代わりにヒトＩｇＥを発現する）に、アジュバントの水中スクアレンエマルジョン（ＳＷＥ）で乳化された、ｈＩｇＥ－Ｋ（または対照としてＣＲＭ１９７のみ）をワクチン接種した。キノイドの初回注射後５、９、２１、３０および３９週での血清中の（Ｂ）抗ｈＩｇＥおよび（Ｃ）抗ＣＲＭ１９７抗体の力価。結果は、中央値を示すバーを有して個々のマウスからの値を示す。（Ｄ）５週目に収集された血清中の抗ｈＩｇＥ中和能。ｈＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩを発現する骨髄由来の培養マスト細胞（ＢＭＣＭＣ）は、ＦｃεＲＩについてヒト化されたマウスに由来した。ＢＭＣＭＣを、示された希釈度でｈＩｇＥ－Ｋをワクチン接種されたマウスからの血清（ワクチンの初回注射の３９日後に収集された）とプレインキュベートした。直後に、蛍光標識（ＦＩＴＣ）ｈＩｇＥを、３０分間添加した。細胞を洗浄し、ＢＭＣＭＣ上のＦＩＴＣ蛍光レベルを、フローサイトメトリーで定量化した。（Ｅ）５、９、２１、３０、および３９週目に収集された血清中の総ｈＩｇＥのレベル。結果は、平均±ＳＥＭを示すバーを有して個々のマウスからの値を示す。（Ｂ～Ｅ）データは、グループごとにｎ＝８のマウスを使用した単一の実験からのものであり、２つの独立した実験の代表である。＊＊＊、Ｐ＜０．００１（マンホイットニーのＵ検定）。
【図3-1】図３は、ｈＩｇＥ－Ｋによるワクチン接種が、ＩｇＥ介在性全身性アナフィラキシーを予防することを示す。（Ａ）プロトコールの概要。ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウス（ヒトＩｇＥおよびヒトＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩを発現する）に、アジュバントＳＷＥで乳化された、ｈＩｇＥ－Ｋ（または対照としてＣＲＭ１９７単独）をワクチン接種（筋肉内、ｉ．ｍ）した。９週目に、示されるように、マウスを、ｈＩｇＥ抗ニトロフェニル（ＮＰ）で感作させ、両方の静脈内でＢＳＡに連結されたＮＰ（ニトロフェニル）を１日後に負荷した。（Ｂ）キノイドの初回注射の５週間後の血清中の抗体力価。結果は、中央値±ＳＥＭを示すバーを有して個々のマウスからの値を示す。（Ｃ）ＩｇＥ－ＫまたはＣＲＭ１９７をマウスに注射後０、１および３週目の体温の変化（Δ°Ｔ、平均±ＳＥＭ）。データを、合計ｎ＝７～９匹／群のマウスを用いた２回の独立実験からプールする。（Ｄ）１０μｇ抗ＮＰｈＩｇＥの静脈内注射後の体温の変化（これは、マウスにおけるアナフィラキシーの主な読み取り値として使用される）（Δ°Ｔ、平均±ＳＥＭ）。データを、合計ｎ＝７～９匹／群のマウスを用いた２回の独立実験からプールする。（Ｅ）ＮＰ－ＢＳＡ５００μｇの静脈内注射後の体温の変化（Δ°Ｔ、平均±ＳＥＭ）。データを、合計ｎ＝７～９匹／群のマウスを用いた２回の独立実験からプールする。＊、＊＊または＊＊＊Ｐ＜０．０５、０．０１、または０．００１（マンホイットニーのＵ検定）。
【図3-2】同上。
【図4】図４は、遺伝的素因のあるアレルギーマウスモデルにおいて、ｈＩｇＥ－Ｋによるワクチン接種がＩｇＥ介在性全身性アナフィラキシーを予防することを示す。（Ａ）プロトコールの概要。Ｆ７０９ＩＬ４Ｒａ変異（同等の変異が、ヒトにおけるアトピーに関連づけられており、この変異は、マウスにおけるＩｇＥ介在性アナフィラキシーに対する感受性を高めることが知られている）を保有するＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスに、アジュバントＳＷＥで乳化された、ｈＩｇＥ－Ｋ（または対照としてＣＲＭ１９７単独で）をワクチン接種した。６週目に、マウスに、２５０μｇの抗ｈＩｇＥをｉ．ｖ．注射した。（Ｂ）２５０μｇの抗ｈＩｇＥＡｂの静脈内注射後の体温（これは、アナフィラキシーの主な読み取り値として使用される）の変化（Δ°Ｔ、平均±ＳＥＭ）。（Ｃ）２５０μｇの抗ｈＩｇＥの静脈内注射後の生存曲線。データを、合計ｎ＝９マウス／群の２つの独立実験からプールする。＊＊または＊＊＊、Ｐ＜０．０１、または０．００１（マンホイットニーのＵ検定）。
【実施例】
【0263】
本発明を、以下の実施例によってさらに説明する。
本発明は、担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を使用する免疫原性産物に関する。本発明の免疫原性産物の特性は、以下の実施例によって説明される。
本発明は、担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を使用する免疫原性産物に関する。本発明の免疫原性産物の特性は、以下の実施例によって説明される。
【0264】
ＣＲＭ１９７は、その毒素ドメイン中の、５２位でのグリシンからグルタミン酸塩への単一塩基置換により毒性活性のない、ジフテリア毒素の非毒性形態である（（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９７３ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ）。
【0265】
チオールマレイミドコンジュゲートを、ＩｇＥベースの免疫原性産物の調製に使用する。スルフヒドリル部分を、ＳＡＴＡおよび、その後のヒドロキシルアミン脱保護により担体タンパク質ＣＲＭ１９７に導入し、一方でＩｇＥまたはＩｇＥのフラグメントを、マレイミド含有剤であるｓＧＭＢＳにより誘導体化した。ＳＡＴＡおよびｓＧＭＢＳの両方は、ＮＨＳ－エステルを含むヘテロ二官能性架橋剤であり、それは、第一級アミン（リジン残基のε－アミノ基およびタンパク質Ｎ末端など）と反応する。
【0266】
実施例１：抗ＩｇＥワクチン接種は、ヒト化マウスにおいてヒトＩｇＥ介在性重度アレルギー反応を予防する。
材料および方法
マウス
ｈＩｇＥＫＩマウスを、マウス染色体１２（Ｃｈｒ１２：１１３、１４７、７７８）にヒトＩｇＥ配列（１０８０塩基対、ヒト染色体１４：１０６、０６４、２２４－１０６、０６８、０６５にある）を挿入して得た。ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスを、ｈＩｇＥＫＩおよびｍＦｃεＲＩ－／－ｈＦｃεＲＩＴｇマウスの交配によって作製した（Ｄｏｍｂｒｏｗｉｃｚ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ＩｇＥ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ：１９５０）．１９９６；１５７（４）：１６４５－５１）。Ｆ７０９ ＩＬ４Ｒａ変異を有するｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスを、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスとＦ７０９ ＩＬ４Ｒａマウスとの交配によって生成した（Ｔａｃｈｄｊｉａｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ｔｈｅ ＩＬ－４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；１２５（５）：１１２８－３６．ｅ８）。マウスを、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒにて特定の病原体のない施設で維持した。マウスは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒで飼育され、正常な発育および繁殖パターンを示した。すべての動物の世話および実験を、＃１７００４３で登録された動物倫理委員会ＣＥＴＥＡ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）のガイドラインおよび特定の承認に準拠して、Ｆｒｅｎｃｈ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈにより行った。
材料および方法
マウス
ｈＩｇＥＫＩマウスを、マウス染色体１２（Ｃｈｒ１２：１１３、１４７、７７８）にヒトＩｇＥ配列（１０８０塩基対、ヒト染色体１４：１０６、０６４、２２４－１０６、０６８、０６５にある）を挿入して得た。ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスを、ｈＩｇＥＫＩおよびｍＦｃεＲＩ－／－ｈＦｃεＲＩＴｇマウスの交配によって作製した（Ｄｏｍｂｒｏｗｉｃｚ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ＩｇＥ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ：１９５０）．１９９６；１５７（４）：１６４５－５１）。Ｆ７０９ ＩＬ４Ｒａ変異を有するｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスを、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスとＦ７０９ ＩＬ４Ｒａマウスとの交配によって生成した（Ｔａｃｈｄｊｉａｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ｔｈｅ ＩＬ－４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；１２５（５）：１１２８－３６．ｅ８）。マウスを、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒにて特定の病原体のない施設で維持した。マウスは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒで飼育され、正常な発育および繁殖パターンを示した。すべての動物の世話および実験を、＃１７００４３で登録された動物倫理委員会ＣＥＴＥＡ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）のガイドラインおよび特定の承認に準拠して、Ｆｒｅｎｃｈ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈにより行った。
【0267】
ＩｇＥフラグメントの産生
組換えｈＩｇＥ Ｃε３－４フラグメント（Ｇ３３５Ｃ変異を含み、Ｃ末端にＳｔｒｅｐＴｗｉｎタグを有し、配列番号７のアミノ酸配列を含む）を、合成し、指数関数的に成長するＥｘｐｉ－２９３細胞に一時的にトランスフェクトした。これらの細胞を、１１０ｒｐｍで回転するシェーカープラットフォーム上にて加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で懸濁してＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を、採取し、２ｘ１０６細胞／ｍｌの密度でＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに再懸濁し、上に記載される同じ条件で一晩培養した。２４時間後、５００μｇの発現プラスミドと１３５０μＬのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地中で５分間プレインキュベートし、一緒に混合した。２０分間のインキュベーション後、混合物を、２．９ｘ１０６細胞／ｍＬの密度でＥｘｐｉ－２９３細胞に添加した。トランスフェクションの２０時間後、２５ｍＬおよび２．５ｍＬのトランスフェクションエンハンサー１および２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、それぞれ添加した。細胞を、トランスフェクション後５日間培養し、上清を、採取し、４２００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、濾過した（０．２μｍ）。タンパク質を、ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ＦＰＬＣ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）カラム（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
組換えｈＩｇＥ Ｃε３－４フラグメント（Ｇ３３５Ｃ変異を含み、Ｃ末端にＳｔｒｅｐＴｗｉｎタグを有し、配列番号７のアミノ酸配列を含む）を、合成し、指数関数的に成長するＥｘｐｉ－２９３細胞に一時的にトランスフェクトした。これらの細胞を、１１０ｒｐｍで回転するシェーカープラットフォーム上にて加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で懸濁してＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を、採取し、２ｘ１０６細胞／ｍｌの密度でＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに再懸濁し、上に記載される同じ条件で一晩培養した。２４時間後、５００μｇの発現プラスミドと１３５０μＬのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地中で５分間プレインキュベートし、一緒に混合した。２０分間のインキュベーション後、混合物を、２．９ｘ１０６細胞／ｍＬの密度でＥｘｐｉ－２９３細胞に添加した。トランスフェクションの２０時間後、２５ｍＬおよび２．５ｍＬのトランスフェクションエンハンサー１および２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、それぞれ添加した。細胞を、トランスフェクション後５日間培養し、上清を、採取し、４２００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、濾過した（０．２μｍ）。タンパク質を、ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ＦＰＬＣ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）カラム（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【0268】
ｈＩｇＥキノイドの合成と特徴付け
ｈＩｇＥ Ｃε３～４を、第一級アミンと反応するマレイミド含有剤であるＮ－γ－マレイミドブチリル－オキシスクシンイミドエステル（ｓＧＭＢＳ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により修飾した。ｈＩｇＥ Ｃε３～４の緩衝液を、１ｍｇ／ｍＬにて修飾緩衝液（７０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．２）と交換した。１０ｍＭのｓＧＭＢＳの溶液を、調製し、１：３０の比率でｈＩｇＥ Ｃε３～４に添加し、室温で６０分間インキュベートした（光から保護した）。過剰なｓＧＭＢＳを、除去し、緩衝液を、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、修飾緩衝液と交換した。ＣＲＭ１９７を、Ｐｆｅｎｅｘ（ＵＳＡ）から購入した。スルフヒドリル部分を、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート）により担体タンパク質ＣＲＭ１９７に導入した。ＣＲＭ１９７を、２ｍｇ／ｍＬにて修飾緩衝液中で希釈し、新たに調製した１００ｍＭＳＡＴＡ（ＤＭＳＯ中に溶解された）の溶液を、モル比１：８０で添加し、室温で３０分インキュベートした（光から保護した）。過剰なＳＡＴＡを除去し、緩衝液を、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラムを使用して修飾緩衝液と交換した。ＳＡＴＡ修飾ＣＲＭ１９７を、光から保護して室温で１２０分間、最終濃度５０ｍＭでヒドロキシルアミンの溶液とインキュベートした。過剰なヒドロキシルアミンを除去し、緩衝液を、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラムを使用して修飾緩衝液と交換した。ＣＲＭ１９７およびｈＩｇＥ Ｃε３～４官能化の後、各調製物のタンパク質含有量を、製造業者の指示に従い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）アッセイにより決定した。
ｈＩｇＥ Ｃε３～４を、第一級アミンと反応するマレイミド含有剤であるＮ－γ－マレイミドブチリル－オキシスクシンイミドエステル（ｓＧＭＢＳ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により修飾した。ｈＩｇＥ Ｃε３～４の緩衝液を、１ｍｇ／ｍＬにて修飾緩衝液（７０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．２）と交換した。１０ｍＭのｓＧＭＢＳの溶液を、調製し、１：３０の比率でｈＩｇＥ Ｃε３～４に添加し、室温で６０分間インキュベートした（光から保護した）。過剰なｓＧＭＢＳを、除去し、緩衝液を、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、修飾緩衝液と交換した。ＣＲＭ１９７を、Ｐｆｅｎｅｘ（ＵＳＡ）から購入した。スルフヒドリル部分を、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート）により担体タンパク質ＣＲＭ１９７に導入した。ＣＲＭ１９７を、２ｍｇ／ｍＬにて修飾緩衝液中で希釈し、新たに調製した１００ｍＭＳＡＴＡ（ＤＭＳＯ中に溶解された）の溶液を、モル比１：８０で添加し、室温で３０分インキュベートした（光から保護した）。過剰なＳＡＴＡを除去し、緩衝液を、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラムを使用して修飾緩衝液と交換した。ＳＡＴＡ修飾ＣＲＭ１９７を、光から保護して室温で１２０分間、最終濃度５０ｍＭでヒドロキシルアミンの溶液とインキュベートした。過剰なヒドロキシルアミンを除去し、緩衝液を、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラムを使用して修飾緩衝液と交換した。ＣＲＭ１９７およびｈＩｇＥ Ｃε３～４官能化の後、各調製物のタンパク質含有量を、製造業者の指示に従い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）アッセイにより決定した。
【0269】
官能化ＣＲＭ１９７を、モル比１：１および最終濃度０．４ｍｇ／ｍＬで官能化ｈＩｇＥ Ｃε３～４に添加した。混合物を、４℃で１６時間インキュベートし、光から保護し、その後緩衝液を、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラムを使用して、修飾緩衝液に対して交換した。タンパク質含有量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより決定した。得られたｈＩｇＥキノイド（ｈＩｇＥ－Ｋ）を次いで、０．２２μｍ滅菌濾過し、４℃で保存した。
【0270】
ｈＩｇＥ－Ｋを、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ法を使用して特徴づけた。得られたキノイドのプロファイルを分析するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを、ｈＩｇＥＣε３－４フラグメント（Ｓｔｒｅｐ－ＴＡＣＴＩＮ ＨＲＰコンジュゲート（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ））に対して実施した。Ｂｉｏ ＳＥＣ－５カラム（２０００Ａ、５μｍ、７．８＊３００ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）およびＢｉｏ ＳＥＣ－３カラム（３００Ａ、３μｍ、７．８＊３００ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用するサイズ排除（ＳＥ）－ＨＰＬＣも、使用した。ＳＥ－ＨＰＬＣ分析を、カラム温度２５℃にて１ｍＬ／分のアイソクラティックモードで実施した。濾過（０．２２μｍカットオフ）後、サンプルを、１００μＬで注射し、２８０ｎｍで分析した。合計実施時間は、３５分であった。
【0271】
ヒトＩｇＥ抗体の産生
抗ニトロフェニルｈＩｇＥを、これまでに記載されているとおり生成し、精製した（Ｂａｌｂｉｎｏ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＩｇＥ ｍＡｂ ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｄｖｅｒｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｅｎｇａｇｉｎｇ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０２０）。ＪＷ８／５／１３（ＥＣＡＣＣ８７０８０７０６）細胞を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから得た。この細胞株は、ハプテン４－ヒドロキシ－３－ニトロフェナセチル（ＮＰ）に対して向けられるキメラヒトＩｇＥ抗体を産生し、ヒトＦｃε鎖およびマウス抗ＮＰ可変鎖から構成される。ＪＷ８／５／１３細胞を、９ｘ１０５細胞／ｍｌにて２ｍＭグルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む完全ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。１５日後、上清を、採取し、４２００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、濾過した（０．２μｍ）。アフィニティークロマトグラフィーによりＩｇＥ抗体を精製した。簡潔に説明すると、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ビーズ１グラムあたりタンパク質２．５ｍｇの比率を使用して、ＷＴ抗ＩｇＥと連結した。ビーズを、秤量し、１５倍量の冷１ｍ ＭＨＣｌで洗浄し、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＷＴ抗ＩｇＥを、カップリング溶液（０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１ Ｍ ＮａＨＣＯ３ ｐＨ８．３）中に再懸濁し、撹拌しながら４℃で一晩ビーズと混合した。ビーズを、カップリング緩衝液で洗浄し、未反応基を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０でブロックした。ＷＴ抗ＩｇＥ連結ビーズを次に、低い（０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ３）および高い（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８）ｐＨ溶液を交互に使用して洗浄し、使用まで４℃でホウ酸緩衝液（１００ｍＭホウ酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０）中にて保存した。ＩｇＥの精製のために、ＷＴ抗ＩｇＥ連結したセファロースビーズを、ＸＫ１６／２０カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填し、アフィニティークロマトグラフィーを、ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ＦＰＬＣ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。精製後、ＩｇＥ抗体を、ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩し、使用まで４℃で保存した。
抗ニトロフェニルｈＩｇＥを、これまでに記載されているとおり生成し、精製した（Ｂａｌｂｉｎｏ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＩｇＥ ｍＡｂ ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｄｖｅｒｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｅｎｇａｇｉｎｇ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０２０）。ＪＷ８／５／１３（ＥＣＡＣＣ８７０８０７０６）細胞を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから得た。この細胞株は、ハプテン４－ヒドロキシ－３－ニトロフェナセチル（ＮＰ）に対して向けられるキメラヒトＩｇＥ抗体を産生し、ヒトＦｃε鎖およびマウス抗ＮＰ可変鎖から構成される。ＪＷ８／５／１３細胞を、９ｘ１０５細胞／ｍｌにて２ｍＭグルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む完全ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。１５日後、上清を、採取し、４２００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、濾過した（０．２μｍ）。アフィニティークロマトグラフィーによりＩｇＥ抗体を精製した。簡潔に説明すると、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ビーズ１グラムあたりタンパク質２．５ｍｇの比率を使用して、ＷＴ抗ＩｇＥと連結した。ビーズを、秤量し、１５倍量の冷１ｍ ＭＨＣｌで洗浄し、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＷＴ抗ＩｇＥを、カップリング溶液（０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１ Ｍ ＮａＨＣＯ３ ｐＨ８．３）中に再懸濁し、撹拌しながら４℃で一晩ビーズと混合した。ビーズを、カップリング緩衝液で洗浄し、未反応基を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０でブロックした。ＷＴ抗ＩｇＥ連結ビーズを次に、低い（０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ３）および高い（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８）ｐＨ溶液を交互に使用して洗浄し、使用まで４℃でホウ酸緩衝液（１００ｍＭホウ酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０）中にて保存した。ＩｇＥの精製のために、ＷＴ抗ＩｇＥ連結したセファロースビーズを、ＸＫ１６／２０カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填し、アフィニティークロマトグラフィーを、ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ＦＰＬＣ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。精製後、ＩｇＥ抗体を、ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩し、使用まで４℃で保存した。
【0272】
ｈＩｇＥキノイドによるワクチン接種
マウスを、３０μｇの２回の初期用量とそれに続く１０μｇの追加免疫により０日目、７日目および２８日目に、ＰＢＳ中のＳＷＥ、水中スクアレンエマルジョンアジュバント（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と１：１（ｖ：ｖ）で組み合わせたｈＩｇＥ－Ｋを用いて筋肉内免疫した。対照として、マウス群に、ＳＷＥと組み合わせて、１５μｇの２回の初期用量とそれに続く５μｇの追加免疫（これらの用量は、ＣＲＭ１９７の重量比に基づき定義された）により、同じスケジュールに従いＣＲＭ１９７を注射した。
マウスを、３０μｇの２回の初期用量とそれに続く１０μｇの追加免疫により０日目、７日目および２８日目に、ＰＢＳ中のＳＷＥ、水中スクアレンエマルジョンアジュバント（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と１：１（ｖ：ｖ）で組み合わせたｈＩｇＥ－Ｋを用いて筋肉内免疫した。対照として、マウス群に、ＳＷＥと組み合わせて、１５μｇの２回の初期用量とそれに続く５μｇの追加免疫（これらの用量は、ＣＲＭ１９７の重量比に基づき定義された）により、同じスケジュールに従いＣＲＭ１９７を注射した。
【0273】
ワクチン接種マウス由来の血清中のヒトＩｇＥおよびＣＲＭ１９７に対するＩｇＧの定量
キノイドの免疫原性を、ワクチン接種後の異なる時点で収集された血清中のヒトＩｇＥおよびＣＲＭ１９７に対する抗体を評価することによって判定した。ヒトＩｇＥまたはＣＲＭ１９７を、コーティング緩衝液（炭酸塩／重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６）中にて、それぞれ５または１μｇ／ｍＬで、４℃でコートし、一晩インキュベートした。各ステップ後、プレートを、０．００５％のＰＢＳＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ＢＳＡ１％ＰＢＳでブロッキング後、血清サンプルを添加し、２倍連続希釈を、２０００ｄｉｌ－１（ＰＢＳで希釈、ＢＳＡ１％）で開始して行った。３７℃でのインキュベーションの９０分後に、結合された抗体を、１／１００００にてＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で検出し、プレートを、ＯＰＤ基質を使用して明らかにした。反応を、１ＭＨ２ＳＯ４で停止し、吸光度をその後、４９０ｎｍで記録した。サンプルを、希釈２０００ｄｉｌ－１で始めて１０２４０００ｄｉｌ－１まで分析した。力価を、最大ＯＤの５０％である血清の希釈率として定義した。力価を、血清希釈係数（ｄｉｌ－１）として表した。力価の定量化の限界は、アッセイで試験された最低希釈である：２０００ｄｉｌ－１。
キノイドの免疫原性を、ワクチン接種後の異なる時点で収集された血清中のヒトＩｇＥおよびＣＲＭ１９７に対する抗体を評価することによって判定した。ヒトＩｇＥまたはＣＲＭ１９７を、コーティング緩衝液（炭酸塩／重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６）中にて、それぞれ５または１μｇ／ｍＬで、４℃でコートし、一晩インキュベートした。各ステップ後、プレートを、０．００５％のＰＢＳＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ＢＳＡ１％ＰＢＳでブロッキング後、血清サンプルを添加し、２倍連続希釈を、２０００ｄｉｌ－１（ＰＢＳで希釈、ＢＳＡ１％）で開始して行った。３７℃でのインキュベーションの９０分後に、結合された抗体を、１／１００００にてＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で検出し、プレートを、ＯＰＤ基質を使用して明らかにした。反応を、１ＭＨ２ＳＯ４で停止し、吸光度をその後、４９０ｎｍで記録した。サンプルを、希釈２０００ｄｉｌ－１で始めて１０２４０００ｄｉｌ－１まで分析した。力価を、最大ＯＤの５０％である血清の希釈率として定義した。力価を、血清希釈係数（ｄｉｌ－１）として表した。力価の定量化の限界は、アッセイで試験された最低希釈である：２０００ｄｉｌ－１。
【0274】
ｈＩｇＥ－Ｋでのワクチン接種時に産生される抗ｈＩｇＥ抗体の中和能力の評価
ｈＦｃεＲＩを発現する骨髄由来培養マスト細胞（ＢＭＣＭＣ）を、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスからの骨髄細胞をＩＬ－３（１０ｎｇ／ｍｌ）含有培地で６週間培養することにより得、その時点で細胞は、＞９５％ ｃ－Ｋｉｔ＋ｈＦｃεＲＩα＋であった（データは示さず）。ｈＩｇＥ－Ｋでのワクチン接種で産生された抗ｈＩｇＥ抗体の中和能力を評価するために、ＢＭＣＭＣを、ｈＩｇＥ－ＫまたはＣＲＭ１９７のみ（対照として）をワクチン接種したマウスの血漿の希釈液とインキュベートした。次に、ＦＩＴＣ標識ｈＩｇＥ（以前にＢａｌｂｉｎｏ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＩｇＥ ｍＡｂ ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｄｖｅｒｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｅｎｇａｇｉｎｇ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０２０に記載されたとおりに産生された）を、添加し、フローサイトメトリーによってＢＣＭＭＣ上のｈＦｃεＲＩへのＦＩＴＣ－ｈＩｇＥの結合を評価した。
ｈＦｃεＲＩを発現する骨髄由来培養マスト細胞（ＢＭＣＭＣ）を、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスからの骨髄細胞をＩＬ－３（１０ｎｇ／ｍｌ）含有培地で６週間培養することにより得、その時点で細胞は、＞９５％ ｃ－Ｋｉｔ＋ｈＦｃεＲＩα＋であった（データは示さず）。ｈＩｇＥ－Ｋでのワクチン接種で産生された抗ｈＩｇＥ抗体の中和能力を評価するために、ＢＭＣＭＣを、ｈＩｇＥ－ＫまたはＣＲＭ１９７のみ（対照として）をワクチン接種したマウスの血漿の希釈液とインキュベートした。次に、ＦＩＴＣ標識ｈＩｇＥ（以前にＢａｌｂｉｎｏ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＩｇＥ ｍＡｂ ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｄｖｅｒｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｅｎｇａｇｉｎｇ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０２０に記載されたとおりに産生された）を、添加し、フローサイトメトリーによってＢＣＭＭＣ上のｈＦｃεＲＩへのＦＩＴＣ－ｈＩｇＥの結合を評価した。
【0275】
好塩基球およびマスト細胞の表面におけるＩｇＥの定量化
血液を、ヘパリンを用いて収集した。腹腔洗浄液（ＰＬＦ）については、腹膜の外皮を、静かに取り除いた。次に３ｍＬの冷ＰＢＳを、２７ｇニードルを使用して腹腔に注射した。腹膜を軽くマッサージ後、切開を、腹膜の内皮で行い、鉗子で皮膚を押さえながらＰＬＦを回収した。
血液を、ヘパリンを用いて収集した。腹腔洗浄液（ＰＬＦ）については、腹膜の外皮を、静かに取り除いた。次に３ｍＬの冷ＰＢＳを、２７ｇニードルを使用して腹腔に注射した。腹膜を軽くマッサージ後、切開を、腹膜の内皮で行い、鉗子で皮膚を押さえながらＰＬＦを回収した。
【0276】
赤血球溶解を、赤血球を除去するために行った。
【0277】
血液由来の細胞を、抗ＣＤ４９ｂ－ＢＶ４２１（クローンＤＸ５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＣＤ１３１－ＰＥ（クローンＲＥＡ１９３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、および抗ヒトＩｇＥ－ビオチン（クローンＭＨＥ－１８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および抗ビオチン－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ７４６、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）または抗ヒトＦｃεＲＩ－ＡＰＣ（クローンＡＥＲ－３７（ＣＲＡ－１）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。ＰＬＦ由来の細胞を、抗ｃＫＩＴ－ＡＰＣ（クローン２Ｂ８、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および抗ヒトＩｇＥビオチン（クローンＭＨＥ－１８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および抗ビオチン－ＡＰＣ（クローンＲＥＡ７４６、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）または抗ヒトＦｃεＲＩ－ＡＰＣ（クローンＡＥＲ－３７（ＣＲＡ－１）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。好塩基球を、ＣＤ４９ｂ＋ＣＤ１３１＋としてゲートし、マスト細胞を、ｃＫＩＴ＋ＩｇＥ＋またはＦｃεＲＩ＋としてゲートした。ヒトＦｃεＲＩおよびＩｇＥの表面発現を、評価し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）により表した。
【0278】
ヒトおよびマウスの総ＩｇＥ定量
総ヒトＩｇＥレベルを、ＥＬＩＳＡによって定量した。抗Ｃε２ヒトＩｇＥ抗体（クローン８Ｅ／５Ｄ４、Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ）を、コートし、カップリング緩衝液（炭酸／重炭酸緩衝液Ｈ＝９．６）中５μｇ／ｍＬにて、４℃で一晩インキュベートした。各ステップの後、プレートを、０．００５％のＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。室温で１時間３０分ＰＢＳ中のＢＳＡ１％でのブロッキング後に、血清サンプルを、１／１０最終希釈（ＰＢＳ、ＢＳＡ１％１０％ＦＢＳで希釈）で添加し、室温で９０分間インキュベートした。次いで、抗ヒトＩｇＥ抗体（Ａ８０－１０８Ｐ、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、室温で９０分間１：１０，０００で添加した。プレートを、ＯＰＤ基質を使用して明らかにした。反応を２ＭＨ２ＳＯ４で停止させ、吸光度をその後、４９０ｎｍで記録した。総マウスＩｇＥレベルを、製造業者の指示に従って、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｅ９０－１１５；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するＥＬＩＳＡにより定量した。
総ヒトＩｇＥレベルを、ＥＬＩＳＡによって定量した。抗Ｃε２ヒトＩｇＥ抗体（クローン８Ｅ／５Ｄ４、Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ）を、コートし、カップリング緩衝液（炭酸／重炭酸緩衝液Ｈ＝９．６）中５μｇ／ｍＬにて、４℃で一晩インキュベートした。各ステップの後、プレートを、０．００５％のＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。室温で１時間３０分ＰＢＳ中のＢＳＡ１％でのブロッキング後に、血清サンプルを、１／１０最終希釈（ＰＢＳ、ＢＳＡ１％１０％ＦＢＳで希釈）で添加し、室温で９０分間インキュベートした。次いで、抗ヒトＩｇＥ抗体（Ａ８０－１０８Ｐ、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、室温で９０分間１：１０，０００で添加した。プレートを、ＯＰＤ基質を使用して明らかにした。反応を２ＭＨ２ＳＯ４で停止させ、吸光度をその後、４９０ｎｍで記録した。総マウスＩｇＥレベルを、製造業者の指示に従って、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｅ９０－１１５；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するＥＬＩＳＡにより定量した。
【0279】
受動全身性アナフィラキシー
ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスにおいて、精製マウスＩｇＥ抗ＮＰ抗体を、１００μＬのＰＢＳ中１０μｇの用量で静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。２４時間後に、マウスを、ＰＢＳ中の５００μｇのＮＰ（２１－３１）－ＢＳＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、静脈内負荷した。体温の直腸測定を、負荷直前（時間０）、および負荷後１時間までの様々な時点で実施した。ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化；Ｆ７０９ ＩＬ４Ｒａマウスにおいて、ウサギ抗ｈＩｇＥ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、２５０μｇの用量でｉ．ｖ．投与した。体温の直腸測定を、注射直前（時間０）、および注射後１時間までの様々な時点で実施した。
ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスにおいて、精製マウスＩｇＥ抗ＮＰ抗体を、１００μＬのＰＢＳ中１０μｇの用量で静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。２４時間後に、マウスを、ＰＢＳ中の５００μｇのＮＰ（２１－３１）－ＢＳＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、静脈内負荷した。体温の直腸測定を、負荷直前（時間０）、および負荷後１時間までの様々な時点で実施した。ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化；Ｆ７０９ ＩＬ４Ｒａマウスにおいて、ウサギ抗ｈＩｇＥ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、２５０μｇの用量でｉ．ｖ．投与した。体温の直腸測定を、注射直前（時間０）、および注射後１時間までの様々な時点で実施した。
【0280】
統計分析
統計的有意性を、対応のないスチューデントのｔ検定（対応のないマンホイットニー検定）を使用して決定した。Ｐ≦０．０５を、統計的に有意と見なした。計算を、Ｐｒｉｓｍ７．０ソフトウェアプログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して実行した。
統計的有意性を、対応のないスチューデントのｔ検定（対応のないマンホイットニー検定）を使用して決定した。Ｐ≦０．０５を、統計的に有意と見なした。計算を、Ｐｒｉｓｍ７．０ソフトウェアプログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して実行した。
【0281】
結果
ｈＩｇＥキノイドによるワクチン接種は、ＩｇＥヒト化マウスにおいて強力な抗ＩｇＥ中和抗体を誘導する
ＩｇＥキノイド（ｈＩｇＥ－Ｋ）を、チオール－マレイミドコンジュゲートを使用して、ヒトＩｇＥＣε３－４ドメインをジフテリア「交差反応性物質１９７」（多数の承認されたコンジュゲートワクチンにおいて、担体タンパク質として使用されるジフテリア毒素の非毒性変異体である、ＣＲＭ１９７）と連結することにより生成した（図１Ａ）。３３５位の天然のグリシン残基を、Ｃε３－４へとシステイン残基で置き換えた。その結果、鎖間ジスルフィド結合が形成され、それはＦｃεＲＩではなく、オマリズマブへの高親和性結合を保持する「閉じた」コンフォメーションにＩｇＥフラグメントをロックする。このＧ３３５Ｃ変異を含むＩｇＥコンジュゲートワクチンが、ＦｃεＲＩへのおそらく有害な結合を回避しながら、「オマリズマブ様の」中和抗体の生成を優先すると仮定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ分析は、ｈＩｇＥＣε３－４Ｇ３３５ＣのＣＲＭ１９７へのコンジュゲート時の高分子種の形成を示し、ｈＩｇＥ－Ｋの効率的な合成を確認した（図１Ｂおよび１Ｃ）。
ｈＩｇＥキノイドによるワクチン接種は、ＩｇＥヒト化マウスにおいて強力な抗ＩｇＥ中和抗体を誘導する
ＩｇＥキノイド（ｈＩｇＥ－Ｋ）を、チオール－マレイミドコンジュゲートを使用して、ヒトＩｇＥＣε３－４ドメインをジフテリア「交差反応性物質１９７」（多数の承認されたコンジュゲートワクチンにおいて、担体タンパク質として使用されるジフテリア毒素の非毒性変異体である、ＣＲＭ１９７）と連結することにより生成した（図１Ａ）。３３５位の天然のグリシン残基を、Ｃε３－４へとシステイン残基で置き換えた。その結果、鎖間ジスルフィド結合が形成され、それはＦｃεＲＩではなく、オマリズマブへの高親和性結合を保持する「閉じた」コンフォメーションにＩｇＥフラグメントをロックする。このＧ３３５Ｃ変異を含むＩｇＥコンジュゲートワクチンが、ＦｃεＲＩへのおそらく有害な結合を回避しながら、「オマリズマブ様の」中和抗体の生成を優先すると仮定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ分析は、ｈＩｇＥＣε３－４Ｇ３３５ＣのＣＲＭ１９７へのコンジュゲート時の高分子種の形成を示し、ｈＩｇＥ－Ｋの効率的な合成を確認した（図１Ｂおよび１Ｃ）。
【0282】
スクアレン水中油型エマルジョンアジュバントであるＳＷＥ中のｈＩｇＥ－ＫによるｈＩｇＥＫＩマウス（マウスＩｇＥの代わりにヒトＩｇＥを発現する）の免疫化は、高い抗ｈＩｇＥ抗体価を誘導し、それは初回免疫５週間後にすでに検出可能であり、３９週間後（これまでに評価された最新の時点）を超えて依然として検出できた（図２Ａ～Ｂ）。予想どおり、ＣＲＭ１９７単独またはｈＩｇＥ－Ｋに曝露されたすべてのマウスは、抗ＣＲＭ１９７抗体を発現した（図２Ｃ）。重要なことに、キノイドによるワクチン接種時に生成された抗ｈＩｇＥ抗体は、一次免疫の５週間後に始まる、すべてのマウスにおける強力な中和能力を示した（図２Ｄ）。ＣＲＭ１９７で免疫化された対照マウスの血液中で、ｈＩｇＥを検出できたが、ｈＩｇＥ－Ｋでワクチン接種されたｈＩｇＥＫＩマウスでは検出されず、ワクチン接種時に生成された抗体の中和能力を確認された（図２Ｅ）。まとめると、これらのデータは、ｈＩｇＥの効果的な長期中和が、ｈＩｇＥＫＩマウスにおいてｈＩｇＥ－Ｋをワクチン接種することにより達成され得ることを示す。
【0283】
ｈＩｇＥ介在性アナフィラキシーのモデルにおける抗ｈＩｇＥワクチンの有効性
ヒトＩｇＥおよびヒトＦｃεＲＩの両方を発現するマウス（ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウス）におけるｈＩｇＥ－Ｋの注射後の潜在的な有害事象を、評価した。ＩｇＥ－Ｋワクチン（または対照としてＣＲＭ１９７のみ）の各注射の後でマウスを注意深く監視し（図３Ａ）、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスにおいて何らかの検出可能な悪影響を認めず：またＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスでの各ワクチン注射後１時間にわたり、マウスのアナフィラキシーショックを追跡するために用いたパラメータである、低体温症（図３Ｃ）、あるいは下痢、苦痛、または活力の欠如も認めなかった。こうした副作用がないことは、ワクチンが、マスト細胞および好塩基球の表面のＩｇＥの凝集を介してＦｃεＲＩ活性化を引き起こさないことを示唆する。ｈＩｇＥ－Ｋによるワクチン接種は、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウス中で高力価の抗ｈＩｇＥ抗体を誘導し、それは、ｈＩｇＥＫＩマウスでのそれらの出現（図２Ｅ）と同様に、キノイドの初回注射の５週間後にすでに検出可能であった（図３Ｂ）。
ヒトＩｇＥおよびヒトＦｃεＲＩの両方を発現するマウス（ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウス）におけるｈＩｇＥ－Ｋの注射後の潜在的な有害事象を、評価した。ＩｇＥ－Ｋワクチン（または対照としてＣＲＭ１９７のみ）の各注射の後でマウスを注意深く監視し（図３Ａ）、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスにおいて何らかの検出可能な悪影響を認めず：またＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスでの各ワクチン注射後１時間にわたり、マウスのアナフィラキシーショックを追跡するために用いたパラメータである、低体温症（図３Ｃ）、あるいは下痢、苦痛、または活力の欠如も認めなかった。こうした副作用がないことは、ワクチンが、マスト細胞および好塩基球の表面のＩｇＥの凝集を介してＦｃεＲＩ活性化を引き起こさないことを示唆する。ｈＩｇＥ－Ｋによるワクチン接種は、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウス中で高力価の抗ｈＩｇＥ抗体を誘導し、それは、ｈＩｇＥＫＩマウスでのそれらの出現（図２Ｅ）と同様に、キノイドの初回注射の５週間後にすでに検出可能であった（図３Ｂ）。
【0284】
ｈＩｇＥワクチンの安全性および有効性をさらに評価するために、上記と同じ免疫化スケジュール（図３Ａ）に従って、ｈＩｇＥ－Ｋまたは対照としてＣＲＭ１９７のみでワクチン接種したＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスに、高用量（１０μｇ）の抗ニトロフェニル（ＮＰ）ｈＩｇＥを注射した。再び、抗ＮＰ－ｈＩｇＥの注射後１時間にわたり、低体温、下痢、苦痛、または活力の欠如のいずれも観察せず、ワクチン接種が、非常に高レベルの循環ｈＩｇＥの存在下でも、検出可能な副作用を誘導しないことを確認した（図３Ｄ）。重要なことに、ｈＩｇＥ－Ｋをワクチン接種されたマウスは、ｈＩｇＥ介在性アナフィラキシーから保護されたのに対し、抗ＮＰｈＩｇＥを注射され、ＮＰ抗原を負荷されたＣＲＭ１９７ワクチン接種マウスは、深刻な低体温症に陥り、７匹中１匹のマウスが死亡した（図３Ｅ）。
【0285】
遺伝的に素因のあるアレルギーマウスモデルにおける抗ｈＩｇＥワクチンの有効性
ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスは低レベルの循環ｈＩｇＥを示したが、アレルギー患者は中程度～高レベルの循環ＩｇＥを示し、マウスモデルを、抗ＩｇＥワクチン接種後のＩｇＥ誘導イベントから保護することをおそらく容易にする。この矛盾を解決するために、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスを、インターロイキン４（ＩＬ－４）およびＩＬ－１３受容体サブユニットＩＬ－４Ｒａをコードする遺伝子に機能獲得型Ｙ７０９Ｆ変異を保有するマウスと交配して、ｈＩｇＥ；ｈＦｃεＲＩＴｇ；Ｆ７０９ ＩＬ４Ｒａマウスを生成した（図４Ａ）。Ｙ７０９Ｆ変異は、ＩＬ４Ｒａの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を破壊し、それによりＩＬ－４およびＩＬ－１３に応答して受容体シグナル伝達を強化し、ＩｇＥレベルおよびＩｇＥ介在性アナフィラキシーを増幅する。ｈＩｇＥＫＩ；ｈＦｃεＲＩＴｇ；Ｆ７０９ＩＬ４Ｒａマウスを使用して、アナフィラキシーが内因性ｈＩｇＥにより引き起こされるモデルにおけるｈＩｇＥワクチンの有効性を評価した。そのために、ｈＩｇＥＫＩ；ｈＦｃεＲＩＴｇ；Ｆ７０９ＩＬ４Ｒａマウスに高用量のポリクローナル抗ｈＩｇＥＡｂを注射して、ＦｃεＲＩ結合ｈＩｇＥの架橋を介して肥満細胞の活性化を引き起こした。対照として使用したＣＲＭ１９７免疫化マウスは、重度の低体温症（図４Ｂ）を発症し、抗ｈＩｇＥ注射後３０分以内に死亡率１００％であり（図４Ｃ）、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化Ｆ７０９ＩＬ４Ｒａマウスが、ｈＦｃεＲＩに結合された十分なレベルの内因性ｈＩｇＥを有して、ｈＩｇＥ介在性アナフィラキシーを引き起こすことを確認した。非常に対照的に、抗ｈＩｇＥ注射後に、ＩｇＥ－Ｋワクチン接種マウスは、一時的な軽度の低体温のみを示し、死亡はなかった（図４Ｂ～Ｃ）。
ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスは低レベルの循環ｈＩｇＥを示したが、アレルギー患者は中程度～高レベルの循環ＩｇＥを示し、マウスモデルを、抗ＩｇＥワクチン接種後のＩｇＥ誘導イベントから保護することをおそらく容易にする。この矛盾を解決するために、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化マウスを、インターロイキン４（ＩＬ－４）およびＩＬ－１３受容体サブユニットＩＬ－４Ｒａをコードする遺伝子に機能獲得型Ｙ７０９Ｆ変異を保有するマウスと交配して、ｈＩｇＥ；ｈＦｃεＲＩＴｇ；Ｆ７０９ ＩＬ４Ｒａマウスを生成した（図４Ａ）。Ｙ７０９Ｆ変異は、ＩＬ４Ｒａの免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を破壊し、それによりＩＬ－４およびＩＬ－１３に応答して受容体シグナル伝達を強化し、ＩｇＥレベルおよびＩｇＥ介在性アナフィラキシーを増幅する。ｈＩｇＥＫＩ；ｈＦｃεＲＩＴｇ；Ｆ７０９ＩＬ４Ｒａマウスを使用して、アナフィラキシーが内因性ｈＩｇＥにより引き起こされるモデルにおけるｈＩｇＥワクチンの有効性を評価した。そのために、ｈＩｇＥＫＩ；ｈＦｃεＲＩＴｇ；Ｆ７０９ＩＬ４Ｒａマウスに高用量のポリクローナル抗ｈＩｇＥＡｂを注射して、ＦｃεＲＩ結合ｈＩｇＥの架橋を介して肥満細胞の活性化を引き起こした。対照として使用したＣＲＭ１９７免疫化マウスは、重度の低体温症（図４Ｂ）を発症し、抗ｈＩｇＥ注射後３０分以内に死亡率１００％であり（図４Ｃ）、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩヒト化Ｆ７０９ＩＬ４Ｒａマウスが、ｈＦｃεＲＩに結合された十分なレベルの内因性ｈＩｇＥを有して、ｈＩｇＥ介在性アナフィラキシーを引き起こすことを確認した。非常に対照的に、抗ｈＩｇＥ注射後に、ＩｇＥ－Ｋワクチン接種マウスは、一時的な軽度の低体温のみを示し、死亡はなかった（図４Ｂ～Ｃ）。
【0286】
まとめると、これらの結果は、ヒトＩｇＥＣε３－４ドメインに対するワクチンを、標準的工業方法を使用して産生できること、およびこのワクチンは、ｈＩｇＥの長期的な中和をもたらし、循環中、検出不能なＩｇＥレベルをもたらし、かつＦｃεＲＩ結合ｈＩｇＥを減少させ得ることを示す。ｈＩｇＥ－Ｋワクチン接種は、繰り返される注射の後でも、ＩｇＥおよびＦｃεＲＩについてヒト化されたマウスにおいて何らかの検出可能な悪影響を誘導しない。ＩｇＥ－Ｋワクチン接種は、遺伝的に素因のあるアレルギーマウスモデルにおいてでさえ、重度のＩｇＥ介在性アレルギー反応からの保護をもたらす。これらの結果は、ｈＩｇＥ介在性アレルギー障害に対する効果的な長期ワクチンの臨床開発への道を開く。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】