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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-05
(54)【発明の名称】試料調製のための自律型マイクロ流体デバイス
(51)【国際特許分類】
G01N 1/28 20060101AFI20230928BHJP
G01N 37/00 20060101ALI20230928BHJP
G01N 35/08 20060101ALI20230928BHJP
【ＦＩ】
G01N1/28 J
G01N37/00 101
G01N35/08 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023514108
(86)(22)【出願日】2021-08-23
(85)【翻訳文提出日】2023-03-02
(86)【国際出願番号】 US2021047081
(87)【国際公開番号】W WO2022060536
(87)【国際公開日】2022-03-24
(31)【優先権主張番号】17/023,922
(32)【優先日】2020-09-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507339869
【氏名又は名称】インテリジェント ヴァイルス イメージング インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100192924
【弁理士】
【氏名又は名称】石井 裕充
(72)【発明者】
【氏名】ヤノッシュ ハウザー
(72)【発明者】
【氏名】グスタフ カルベグ
(72)【発明者】
【氏名】ヨーラン ステンメ
(72)【発明者】
【氏名】イダ－マリア シントーン
(72)【発明者】
【氏名】ニクラス ロクスヒアド
【テーマコード（参考）】
2G052
2G058
【Ｆターム（参考）】
2G052AA28
2G052AB11
2G052AB16
2G052AB27
2G052CA39
2G052DA08
2G052DA09
2G052DA15
2G052DA23
2G052EA02
2G052FA08
2G052FC07
2G052FD09
2G052GA09
2G052GA34
2G052GA35
2G052JA06
2G052JA08
2G052JA11
2G052JA16
2G058BA07
2G058BA08
2G058BA10
2G058GA20
(57)【要約】
マイクロ流体デバイス（１００、２００）は、好ましくは、第１の液体（１０８、２０８）を含む第１のリザーバ（１０２、２０２）を有する。第１の液体（１０８、２０８）は、第１のリザーバ（１０２、２０２）の毛細管ストップバルブ（２２８、２３０）によって保持されている。第２のリザーバ（１０４、２０４）は、第１のリザーバ（１０２、２０２）と流体連通している。第２のリザーバ（１０４、２０４）は、第２の液体（１１０、２１０）と、第２のリザーバ（１０４、２０４）内に配置された試料支持体（１１６、２１６）とを有する。第２のリザーバ（１０４、２０４）は、第２のリザーバ（１０４、２０４）内に規定された開口部（１４５、２３６）を有する。排出ユニット（１０６、２０６）は、第２のリザーバ（１０４、２０４）に隣接している。排出ユニット（１０６、２０６）は、第２のリザーバ（１０４、２０４）と流体連通している。排出ユニット（１０６、２０６）は、排出ユニット（１０６、２０６）内に配置された第１の吸収部材（１５８、２１８、８５８）を有する。
【選択図】図１３
【選択図】図１３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料調製のためのマイクロ流体デバイスであって、第１のリザーバ（１０２、２０２）内に配置された毛細管ストップバルブ（２２８、２３０）を有する前記第１のリザーバ（１０２、２０２）と、
前記第１のリザーバ（２０２）と流体連通している第２のリザーバ（１０４、２０４）であって、前記第２のリザーバ（１０４、２０４）は、前記第２のリザーバ（１０４、２０４）内に配置された試料支持体（１１６、２１６）を有し、前記第２のリザーバ（１０４、２０４）は、前記第２のリザーバ（１０４、２０４）内に規定された開口部（１４５、２３６）を有する、前記第２のリザーバと、
前記第２のリザーバ（１０４、２０４）に隣接している排出ユニット（１０６、２０６）であって、前記排出ユニット（１０６、２０６）は、前記第２のリザーバ（１０４、２０４）と流体連通しており、前記排出ユニット（１０６、２０６）は、前記排出ユニット（１０６、２０６）内に配置された第１の吸収部材（１５８、２１８、８５８）を有する、前記排出ユニット（１０６、２０６）と、
を含む、マイクロ流体デバイス。
【請求項2】
前記第１のリザーバ（１０２、２０２）は、前記毛細管ストップバルブ（２２８、２３０）によって前記第１のリザーバ（１０２、２０２）に保持されている第１の液体（１０８、２０８）を有する、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項3】
前記マイクロ流体デバイス（１００、２００）は、前記マイクロ流体デバイス（１００、２００）内に規定されたチャネル（１５０、２５０）を有し、前記第１のリザーバ（１０２、２０２）は、前記チャネル（１５０、２５０）を介して前記第２のリザーバ（１０４、２０４）と流体連通している、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項4】
前記チャネル（１５０、２５０）は、エッジ（２２８）に延在する、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項5】
前記試料支持体（１１６、２１６）は、第１の幅を有し、前記開口部（１４５、２３６）は、前記第１の幅に実質的に類似する幅を有する、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項6】
試料調製のためのマイクロ流体デバイスであって、
第１のリザーバ（１０２、２０２）内に配置された毛細管ストップバルブ（２２８、２３０）を有する前記第１のリザーバ（１０２、２０２）と、
前記第１のリザーバ（２０２）と流体連通している第２のリザーバ（１０４、２０４）であって、前記第２のリザーバ（１０４、２０４）は、前記第２のリザーバ（１０４、２０４）内に配置された試料支持体（１１６、２１６）を有し、前記第２のリザーバ（１０４、２０４）は、前記第２のリザーバ（１０４、２０４）内に規定された開口部（１４５、２３６）を有する、前記第２のリザーバ（１０４、２０４）と、
前記第２のリザーバ（１０４、２０４）に隣接している排出ユニット（１０６、２０６）であって、前記排出ユニット（１０６、２０６）は、前記第２のリザーバ（１０４、２０４）と流体連通しており、前記排出ユニット（１０６、２０６）は、前記排出ユニット（１０６、２０６）内に配置された第１の吸収部材（１５８、２１８、８５８）を有し、前記排出ユニット（１０６、２０６）は、前記第１の吸収部材（１６２、２２０）の下流にある前記排出ユニット（１０６、２０６）内に配置された溶解性膜（３２０）を有する、前記排出ユニット（１０６、２０６）と、
を含む、マイクロ流体デバイス。
【請求項7】
前記排出ユニット（１０６、２０６）は、前記排出ユニット（１０６、２０６）内に配置された溶解性膜（１６２、２２０）と、前記排出ユニット（１０６、２０６）内に規定された毛細管チャネルとを有する、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項8】
前記排出ユニットは、前記第１の吸収部材（８５８）の上流に、前記排出ユニット内に配置された溶解性膜（８６２）を有する、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項9】
前記排出ユニット（１０６、２０６）は、前記溶解性膜（１６２、２２０）が、前記第１の吸収部材（１５８、２１８）と第２の吸収部材（１６０、２２２）との間に配置されるように、前記溶解性膜（１６２、２２０）の下流に前記第２の吸収部材（１６０、２２２）を有する、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項10】
前記第１のリザーバ（１０２、２０２）は、液体（１０８、２０８）がプリロードされている、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項11】
前記第１の液体（１０８、２０８）は、染色液である、請求項１０に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項12】
前記毛細管ストップバルブの第１の液体は、前記チャネル（１５０、２５０）の前記エッジ（２２８）と別の表面エッジとの間に延在する、請求項４に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項13】
前記第１の吸収部材（１５８、２１８）は、第１の多孔質マトリクスであり、前記第２の吸収部材（１６０、２２２）は、第２の多孔質マトリクスである、請求項９に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項14】
前記第１の溶解性膜（１６２、２２０）は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）に基づくフィルムである、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項15】
前記試料支持体（１１６、２１６）は、ネガティブ染色による透過型電子顕微鏡調製のためのグリッドである、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項16】
前記デバイスは、前記第１のリザーバ（１０２、２０２）の上流に追加のリザーバ（３０２）を有する、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項17】
前記排出ユニット（１０６、２０６）は、前記第２の吸収部材（１６０）の下流に第２の溶解性部材（３２０）を有する、請求項９に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項18】
前記排出ユニット（１０６、２０６）は、前記排出ユニット（１０６、２０６）内に規定されたベント開口部（１６４、２６４）を有する、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項19】
前記排出ユニット（１０６、２０６）は、前記第１の溶解性膜（１５８）の下流に、第２の溶解性膜（３２０）と第３の吸収部材（３２２）とを有する、請求項９に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項20】
前記試料支持体（１１６、２１６）は、前記試料支持体（１１６、２１６）の下方に、前記試料支持体（１１６、２１６）内に規定された空間を有する、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、顕微鏡学又は他の検査技術を使用したその後の解析のために、マイクロ粒子、ナノ粒子及び／又はマイクロ／ナノサイズの繊維などの、粒子状或いは細長い繊維状の試料の、一貫性のある、ユーザに依存しない調製のためのデバイス及び方法に関する。特に、これは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）又は走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）における用途に有用である。
【背景技術】
【0002】
一貫性があり、ユーザに依存しない、再現性のある試料調製方法は、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、タンパク質、タンパク質複合体、繊維、デリバリーベシクル、医薬品、及び無機粒子などの、マイクロ及びナノサイズの粒子の液体試料の客観的な解析のために必要である。
【0003】
例えば、一般的に、改変ウイルスベクターは、遺伝子治療用途において使用される。試料中の感染性粒子と、非感染性粒子及び破片／その他の材料との比率を決定することは、最終的な遺伝子治療製品の品質及び有効性と、上流開発プロセスとについての貴重な情報を提供する。
【0004】
ＳＥＭ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）及びｎｓＴＥＭ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｔａｉｎ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）用途は、臨床診断デバイスであり、ＳＥＭ及びｎｓＴＥＭは、診断目的のために、ウイルスなどの感染因子を検出し、解析するために使用される。さらに、ＳＥＭ及びｎｓＴＥＭは、ワクチン、医薬品及び材料の研究、開発、品質管理における、生物学的粒子及び無機粒子及び材料の特性評価において広く使用される。化学的或いは生化学的特性評価の技術に対するＳＥＭ／ｎｓＴＥＭの主な利点は、対象の試料を直接可視化する可能性である。これは、例えば、細胞の形態を決定し、或いは病原体のウイルス科を特定することを可能にする。ｎｓＴＥＭでは、画像のコントラストは、対象の粒子を埋め込み、保存する、重金属染色溶液（酢酸ウラニル、リンタングステン酸など）によって得られる。
【0005】
感染症におけるウイルス病原体を特定する最初のスクリーニングツールとしてのＴＥＭの価値は、診断用ＴＥＭが、原因ウイルスがコロナウイルス科の属であったことを最初に示した、２００３年のＳＡＲＳ流行中に実証された。グローバル化された貿易及び旅行の結果として、大陸間レベルで急速に拡散する、エボラ出血熱、ジカ熱、又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ２などの、新興感染因子の能力と、世界的な政治情勢の不安定さに起因したバイオテロ攻撃のリスクとを考慮すると、効率的なＴＥＭ解析へのアクセスが、緊急時の準備、管理、民間防衛の不可欠な部分であることは明らかである。これは、ＴＥＭの日常的な臨床使用と、医薬品の開発及び製造のプロセス設計及び品質管理における使用とに加えてである。
【0006】
ＴＥＭを使用して撮像されるとき、染色剤は、試料中の粒子よりも多くの電子を散乱する。これは、数ナノメートルの分解能で、粒子が暗い背景上に明るく見える画像をもたらす。従来、ＴＥＭグリッドは、手動調製プロトコルにしたがうことによって調製される。これは、３－５μｌの試料液をＴＥＭグリッド上にピペッティングし、次いで、試料に依存して約１０－６０秒間試料液を吸着させることを含む。次いで、余分な試料は、吸い取り紙を使用することによって、グリッドから手動で吸い取られる。試料を吸い取った直後に、３－５μｌの水性染色溶液は、グリッドに添加される。
【0007】
次いで、余分な染色剤は、吸着された試料を覆う染色液の均一な薄層又は薄いフィルムを残して理想的に吸い取られる。この薄いフィルムは、乾燥させる。フィルムは、ＴＥＭイメージングのための試料を埋め込み、試料を脱水から保護する。染色剤はまた、コントラストを高める。１つの問題は、この手動手順がオペレータのスキルに大きく依存し、調製の一貫性に影響を与え、信頼性のない結果につながることである。手動ステップと最終的な吸い取りとの一貫性のないタイミングはしばしば、不良のＴＥＭグリッド調製の原因である。
【0008】
一貫性のあるｎｓＴＥＭ試料調製を取得しようとするための代替的な方法は、ピペッティングロボットがＴＥＭグリッド上に液体を自動的に分注するコンタクトピンプリント（contact pin-printing）技術を採用する。これらのアプローチは、液量の削減及び自動化の可能性などの、手動調製に対していくつかの利点を有する。しかしながら、それらは、特別な機器を必要とし、手動調製プロトコルよりもかなり複雑であり、時間がかかる。
【0009】
また、ｎｓＴＥＭグリッド調製のためのマイクロ流体デバイスは、説明されている。ＴＥＭグリッドは、マイクロ流体チャネルに閉じ込められ、試料調製のためのリキッドハンドリングは、外圧ポンプによって制御される。これは、手動調製に対する調製の一貫性を向上させるが、アプローチは、手動手順よりもかなり多くの液量を必要とする。それはまた、特別な器具を必要とし、ユーザが、調製方法を信頼性がなく、一貫性のないものにさせる全ての調製ステップのタイミングを制御することを含む。
【0010】
医薬品の製造における開発及び品質管理と、材料合成と、日常的な臨床診断となどの、時間及び資源が限られた状況において電子顕微鏡を使用する実現可能性に達するために、克服されなければならないいくつかのハードルが存在する。上述されたように、解析のための試料を調製する専門的な作業は、極度の複雑性と関連付けられている。これは、ＴＥＭ技術の使用を、少数の専門家に限られた職人技にさせる。試料調製方法は、基礎的な実験技術を有する人に関して１ヶ月で習得され得るが、それをマスターするには、約１０年かかり、しかも著しい専門家のばらつきを生む。これは、分野の専門家でさえも、望ましくないばらつきなしに一貫性のある結果をもたらすことができないことを意味する。
【0011】
通常、試料調製は、標準化された手順にしたがって実行される。最初に、試料は、試料支持体（ＴＥＭのケースでは、直径約３ｍｍである金属製グリッドである）上に供給され、試料支持体に付着したままにさせる。次のステップでは、余分な試料溶液は、除去され、粒子を保護し、且つ／或いはコントラストを高めるための染色剤は、瞬時に添加される。ネガティブ染色によるＴＥＭのケースでは、この染色剤は、重金属塩溶液である。次いで、余分な染色剤は、除去される。余分な液体／染色剤の除去は、ろ紙で吸い取ることによって行われる。余分な液体の除去の後の追加の洗浄ステップは時々、試料添加後と、染色剤を添加する前とに行われる。代替的に、液体の添加は、グリッドを液滴に浸すことによって行われ得る。典型的に、これらのステップは、機器のオペレータによって手動で実行され、したがって、結果は、一貫して正しい手順を実行するオペレータの能力に強く依存する。
【0012】
また、オペレータがどんなに一貫性があり、熟練しているかにかかわらず、異なる調製ステップが粒子に与える力を一貫して制御することは可能でない。これは、調製された試料の品質に影響を与え、その後の解析結果の信頼性を制限する。
【0013】
上述されたように、いくつかの自動又は半自動調製方法は、過去に提案されている。それらは、ロボットディスペンサ、特別な器具を使用したマイクロ流体力学、又はピペッティングデバイスに接続されている特別な試料ホルダに依存する。ロボットディスペンサは、微量の試料量のみを必要とするが、代わりに高度な専用器具に依存する。マイクロ流体ベースの試料調製アプローチは、より一貫性のある調製をもたらすが、やはり、特別な器具（特別なグリッドホルダ及び外圧ポンプ）に依存し、手動調製と比較して約１０倍多い試料量を必要とする。グリッドを保持するポケット／スリットを有する特別なピペットチップを使用する方法はまた、提案されている。このｍｐｒｅｐベースのアプローチはまた、より多くの試料量を必要とし、手動タイミングステップを含む。さらに、液体は、低品質の調製のリスクを高めるグリッドの両側に流される。
【発明の概要】
【0014】
したがって、より信頼性があり、一貫性のあるｎｓＴＥＭ試料調製方法が必要である。本発明は、手動調製と関連付けられたユーザバイアス及び一貫性の問題を有することなく、また、従来の自動化アプローチと関連付けられた品質、多くの試料量、高価で特別な器具という欠点なしに、上述された問題への解決策を提供する。
【0015】
より具体的には、本発明のデバイス及び方法は、その後のイメージング及び解析のために、亜可視（sub-visible）粒子の試料の一貫性のある目的（ユーザに依存しない）及び再現性のある調製を提供する。本発明の方法は、遅延バルブとして機能する溶解性フィルムと吸収膜とを組み合わせたマイクロ流体技術に基づいている。それは全て、使い捨ての試料調製デバイス又はカードに組み込まれており、したがって、特別な器具又は多くの試料量を必要としない。異なる液体は、溶解性フィルムと吸収膜（フィルタ）の設計とによって規定される一定の遅延及び速度で、グリッド上を順次流れる。
【0016】
この組み合わせは、異なる試料調製液が、制御されて十分に規定された方法で試料グリッド上に自動的に流される、高度な自動化手順を可能にする。ユーザが試料液を添加すると、毛細管力及び他の表面張力効果に依存することによって、追加の入力を必要とすることなく、様々な液体が本発明のデバイスを通して自動的に駆動されるので、グリッド調製プロセス全体は、自己駆動、自己完結或いは自動である。染色液及び試料液の使用は、本発明のデバイスにおいて使用される適切な液体の単なる例示であることを理解されたい。必要に応じて、多種多様な他の液体は、使用されてもよい。ユーザとのインタラクションは、時間的制限のない方法で、染色剤をデバイスの特定の位置にプリロードした後、試料液を添加するだけになる。試料の添加は、カード／デバイスにあらかじめ添加されているか、或いはあらかじめ保存されているかのいずれかである液体（染色剤など）を用いて試料グリッド上で一連の流水ステップを引き起こす。自動調製が完了するとき、オペレータは、正しく調製された試料グリッドをＴＥＭ又はＳＥＭ顕微鏡に単に移し、或いはカード自体をＳＥＭ又は光学顕微鏡に移すだけである。
【0017】
好ましくは、本発明のデバイスは、液体及び吸収膜を添加するための容器からなる、使い捨ての紙ベースのキットとして構成され、或いは実現され、試料がロードされるグリッドは、あらかじめ作り付けられているか、或いはユーザによって追加されるかのいずれかである。あらかじめ作り付けられたグリッドのケースでは、ユーザ入力は、染色剤（染色剤がプリロードされている場合を除く）と、次いで試料液とをデバイス内の異なる容器にピペッティングすることのみからなる。最後の液体の添加は、自律型調製プロセスの開始を引き起こし、マイクロ流体力が、グリッド上の２つの液体（すなわち、染色剤及び試料液）の流れを駆動し、溶解性バルブが、プロセスのタイミングを制御する。以下に詳細に説明されるように、グリッドは、薄いカーボン層でコーティングされ、或いは覆われてもよく、その上に試料液中の粒子が、排出又はユニットの溶解性膜が溶解されるまで、吸着し、或いは付着することを許容されるので、粒子は、グリッド上に残り、その後、染色液によって埋め込まれる。
【0018】
より具体的には、好ましくは、本発明の自律型マイクロ流体デバイスは、顕微鏡試料調製のためのものである。デバイスにおける積層体の使用は、単なる例示であり、本発明のデバイスは、積層体を使用することに限定されないことを理解されたい。成形などの任意の他の製作方法は、使用され得る。
【0019】
好ましくは、本発明のマイクロ流体デバイスは、第１の液体を含み、或いは第１の液体が添加される第１のリザーバを有する。第１の液体は、第１のリザーバの毛細管ストップバルブによって保持されている。第２のリザーバは、第１のリザーバと流体連通している。第２のリザーバは、第２の液体と、第２のリザーバ内に配置された試料支持体とを有する。第２のリザーバは、第２のリザーバ内に規定された入口開口部を有する。排出ユニットは、第２のリザーバに隣接している。排出ユニットは、第２のリザーバと流体連通している。排出ユニットは、排出ユニット内に配置された第１の吸収部材を有する。
【0020】
本発明の代替的な一実施形態では、マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイス内に規定されたチャネルを有し、第１のリザーバは、チャネルを介して第２のリザーバと流体連通している。
【0021】
本発明のさらに代替的な一実施形態では、チャネルは、第２のリザーバでのエッジに延在する。
【0022】
本発明の別の代替的な実施形態では、試料支持体は、第１の幅を有し、開口部は、第１の幅と実質的に類似する幅を有する。
【0023】
本発明の代替的な一実施形態では、排出又は吸い取りユニットは、第１の吸収部材の下方に、排出又は吸い取りユニット内に配置された溶解性膜を有する。
【0024】
本発明の別の実施形態では、排出ユニットは、溶解性膜が第１の吸収部材と第２の吸収部材との間に配置されるように、溶解性膜の下方に位置する第２の吸収部材を有する。
【0025】
本発明のさらに別の実施形態では、第１のリザーバは、染色液を含むプリロードされた染色剤リザーバである。
【0026】
本発明の代替的な一実施形態では、毛細管ストップバルブの第１の液体は、チャネルのエッジと別の表面エッジとの間に延在する。
【0027】
本発明の別の実施形態では、第１の吸収部材は、第１のフィルタ又は紙であり、第２の吸収部材は、第２のフィルタ又は紙である。
【0028】
本発明のさらに別の実施形態では、溶解性膜は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）に基づくフィルムである。
【0029】
本発明の別の実施形態では、試料支持体は、ネガティブ染色による透過型電子顕微鏡調製のためのグリッドである。
【0030】
本発明のデバイスの代替的な一実施形態では、第１の液体は、染色剤である。
【0031】
さらに別の実施形態では、デバイスは、第１のリザーバの上流に追加のリザーバを有する。
【0032】
本発明のデバイスの別の実施形態では、排出ユニットは、第２の吸収部材の下方に第２の溶解性部材と、第２の溶解性部材の下方に第３の吸収部材とを有する。
【0033】
代替的な一実施形態では、排出ユニットは、排出ユニット内に規定されたベント開口部を有する。
【0034】
さらに代替的な一実施形態では、排出ユニットは、第２の溶解性部材と、第１の溶解性部材の下方に配置された第３の吸収部材とを有する。
【0035】
本発明の方法は、マイクロ流体デバイスにおいて試料を調製するための方法である。排出ユニット内に配置された第１の吸収部材を有する排出ユニットと流体連通して、隣接している第２のリザーバと流体連通している第１のリザーバを有するマイクロ流体デバイスは、提供される。第１のリザーバは、毛細管ストップバルブによって第１のリザーバに保持されている第１の液体を含む。第２のリザーバは、第２のリザーバ内に配置された試料支持体を有する。物質を含む、第２の液体は、第２のリザーバに添加される。第２の液体は、第１の液体及び第１の吸収部材に接触する。第１の吸収部材は、第２の液体及び第１の液体を吸収する。物質は、試料支持体に付着する。
【0036】
代替的な一実施形態では、排出ユニットは、第１の吸収部材の上流に溶解性膜を設ける。第２の液体又は第１の液体は、第１の吸収部材が第１及び第２の液体を吸収する前に、溶解膜を溶解する。
【0037】
別の実施形態では、物質は、第２の液体又は第１の液体が溶解性膜を溶解する間に、試料支持体に付着する。
【0038】
さらに別の実施形態では、第１の液体を第１のリザーバに保持する毛細管ストップバルブは、第２の液体を第２のリザーバに添加する前に、第１の液体が第２のリザーバに流入することを防止する。
【0039】
別の実施形態では、物質を埋め込む第１の液体は、試料支持体に付着される。
【0040】
さらに別の実施形態では、毛細管ストップバルブは、第１のリザーバを第２のリザーバから分離するエッジを設け、エッジは、第１の液体を第１のリザーバに保持する。
【0041】
別の実施形態では、溶解性膜は、第１の吸収部材の下流に設けられ、第２の吸収部材は、溶解性膜の下流に設けられ、第１の吸収部材は、第２の液体を吸収し、第２の液体が溶解性膜と接触することを許容する。
【0042】
さらに別の実施形態では、第２の吸収部材は、溶解性膜が溶解された後、第１の液体及び第２の液体を吸収する。
【0043】
別の実施形態では、第２の液体は、毛細管ストップバルブに保持された第１の液体との接触時に、第１の液体の表面張力を破壊する。
【0044】
さらに別の実施形態では、溶解性膜を溶解するのに必要とされる時間は、物質が試料支持体に付着する許容時間を制御する。
【0045】
別の実施形態では、第２の液体は、第１の液体の前に吸収部材に接触する。
【図面の簡単な説明】
【0046】
ここで、本発明は、添付の図面を参照しながら、例として説明される。
【図1】図１Ａは、試料添加を示す、本発明のデバイスの立面断面側面図である。図１Ｂは、時間制御された試料吸着を示す、本発明のデバイスの立面断面側面図である。図１Ｃは、余分な試料及び染色剤の自動排出を示す、本発明のデバイスの立面断面側面図である。図１Ｄは、グリッド除去前のフィルム乾燥を示す、本発明のデバイスの立面断面側面図である。
【発明を実施するための形態】
【0047】
本発明の毛細管駆動マイクロ流体デバイスは、従来の手動手順が行うのと同じ小さい液量を必要とし、最小限のユーザとのインタラクションを必要とする試料調製のために、本明細書に提示される。より具体的には、好ましくは、試料支持体は、ＴＥＭグリッドなどの、グリッドである。ユーザは、単に自律型試料調製プロセスを開始し、約１分間待ち、次いで、ＴＥＭ又はＳＥＭ顕微鏡におけるイメージングの準備ができているＴＥＭグリッドを抽出する。典型的に、本発明の自律型プロセスは、試料吸着と余分な液体の排出との時間を自動的に制御する、水性試料液のためのＰＶＡ（ポリビニルアルコール）フィルムなどの、試料液によって溶解するフィルムを必要とする。以下に、５台のマイクロ流体デバイスに対するマイクロ流体の一貫性は、マイクロ流体ＴＥＭグリッド調製イベントのタイミングと時間とを比較することによって実証される。さらに、時間遅延の調整可能性は、３種類の水溶性フィルムの厚さ（１２μｍ、２４μｍ、３６μｍ）を使用した１５台のデバイスに関して説明される。試料調製の一貫性は、試料としてＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）粒子と、染色剤としてメチルアミンバナデートとを用いて、５枚の自律的に調製されたＴＥＭグリッドを撮像することによって検証される。
【0048】
平均粒子サイズなどの形態情報を抽出する、粒子検出スクリプトは、グリッド毎に４５枚の顕微鏡画像上で実行され、画像が自動画像解析に適しているか否かを調査した。本発明のデバイスはまた、ＴＥＭ調査のためのタンパク質試料及び繊維を調製するために使用されてもよく、他の染色剤は、使用されてもよい。
【0049】
本発明のデバイスは、手動手順の試料調製ステップを適応させ、ユーザとのインタラクションを、自動化されて毛細管駆動のマイクロ流体イベントに置き換える。好ましくは、しかしながら必ずしもそうではないが、デバイスは、シングルユースのために設計され、特別な機器を必要としない。
【0050】
【0051】
より具体的には、デバイス２００は、試料リザーバ又はグリッドチャンバ２０４に隣接している染色剤リザーバ２０２を有する。試料リザーバは、排出又は吸い取りユニット２０６に隣接している。染色剤リザーバ２０２は、染色液２０８を保持し、或いは含む。好ましくは、染色液２０８は、使用する前にプリロードされる。試料リザーバ２０４は、解析される、オブジェクト、分子又は粒子などの、物質２１４を含む試料液２１０を含む。粒子は、ウイルス又はウイルス様粒子又は任意の他のタイプの繊維状或いは粒子状の生物学的或いは無機的なオブジェクトであり得る。
【0052】
試料液２１０が試料リザーバ２０４内に適用されるとき、液体２１０は、ＴＥＭグリッドなどの試料支持体２１６を覆い、試料支持体又はグリッド２１６の上流で、プリロードされた染色剤２０８に接続し、グリッド２１６の下流に位置する排出又は吸い取りユニット２０６の吸い取り紙又はフィルタ２１８に接続する。（図１Ｂに示されるように）試料液２１０と排出ユニット２０６の吸収ユニットとの間の接触は、時間制御された試料吸着ステップを開始する。試料液２１０が試料リザーバ２０４に堆積され、或いは添加されるとき、試料液２１０は、排出ユニット２０６の第１の吸収ユニット２１８（第１の吸い取り紙／ろ紙など）と接触する。排出ユニット２０６は、第１の吸収ユニット２１８の下方に位置する溶解性バルブ又は膜２２０を有する。試料液２１０は、第１の吸い取り紙２１８を、第２の吸い取り紙／ろ紙２２２などの第２の吸収ユニットから分離する、溶解性バルブ２２０が閉じられている間、ＴＥＭグリッド２１６を覆う。バルブ２２０は、第１の吸収部材２１８によって吸収された液体によって溶解されるまで閉じられている。溶解性バルブ又は膜２２０を溶解するのにかかる時間は、この間、試料液２１０中の粒子２１４がグリッド２１６に付着し、或いはグリッド２１６によって吸着されることを許容されるので、本発明のクリティカルなステップである。
【0053】
図１Ｃに示されるように、バルブ２２０が溶解されると、試料液２１０と染色液２０８との両方の余分な量は、２つの吸収ユニット、吸い取り紙／ろ紙２１８及び２２２によって自律的に排出され、或いは吸い取られる。（図１Ｄに示されるように）粒子２１４は、グリッド２１６に付着し、或いはグリッド２１６によって吸着される。残りの薄い染色剤フィルム２２４は、グリッド２１６上の粒子２１４を覆い、或いは埋め込み、フィルム２２４が試料粒子２１４を埋め込む間に乾燥する。次いで、グリッド２１６は、イメージングの準備ができ、フラップ２２６を剥がすことによって、例えば、一対のピンセットを用いてグリッド２１６を抽出することによって、容易に取り出され得る。
【0054】
【0055】
【0056】
上述されたように、本発明のマイクロ流体デバイス２００は、液体（染色剤）リザーバ２０２と、第２の液体（試料）リザーバ又はグリッドチャンバ２０４と、排出ユニット２０６とからなる。以下に詳細に説明されるように、染色剤リザーバ２０２の重要な機能は、ユーザが、最終的に染色液２０８と接触する粒子２１４を含む試料液２１０（図１Ａ－図１Ｄに最も良く示されている）を添加するまで、染色液２０８を含むことである。
【0057】
重要な有効な特徴は、染色剤リザーバ２０２をグリッドチャンバ２０４から分離する、図３に示されるように、毛細管ストップバルブ又はピニングエッジ２２８などの液体ピン止め機構である。毛細管ストップバルブ又は機構は、疎水性表面領域及び／又は幾何学的構造であることがあり、表面張力は、液体が疎水性領域及び／又は幾何学的構造を超えることを防止する。好ましくは、幾何学的なストップバルブは、チャネル又はチャネルの一部の流れ方向におけるチャネル断面の突発的な分岐（例えば、エッジ）である。好ましい実施形態では、毛細管ストップバルブは、チャネルのエッジに位置し、第２のリザーバが開始するところで終了する。第１の液体が第２のリザーバに流入することを阻止する第２のリザーバでエッジが存在する限り、チャネルを有する必要はない。エッジが第２のリザーバから離れて位置している場合、２つの液体間の接触が確立されることができないように、気泡が第１の液体と第２の液体との間に形成されるリスクが存在する。２つの液体が接続することができ、第１の液体の表面張力が破壊されるように、第１の液体が第２の液体に容易にアクセスできることが非常に重要である。
【0058】
本発明の液体ピン止め機構の１つの目的は、第２のリザーバと接続されている（流体連通している）１つのリザーバに液体を閉じ込めることである。染色液２０８は、ピニングエッジ２２８でピン止めされ、或いはピニングエッジ２２８によって保持され、染色液２０８と裏面２３０との間の表面張力に起因して、第１の積層体部分２３２の親水性の裏面２３０に保持される。
【0059】
好ましくは、ピン止め機構２２８は、水平な底面２３１と、積層体２５３に向かって延在し、グリッド２１６を所定の位置に保持する接着テープ２５４の下方に延在する、積層体２５２の垂直な側壁２３３との間に形成された、エッジ、より具体的には、９０度のエッジなどの、鋭利なエッジである。ピニングエッジ２２８と裏面２３０との間に延在する表面２３４での表面張力は、染色液２０８を染色剤リザーバ２０２の所定の位置に保持し、表面２３４及び第１の積層体部分２３２は、ピニングエッジ２２８上に延在する。表面張力は、表面フィルムの見かけ上の存在と、表面上の毛細管現象とにつながる表面付近の分子間力によって引き起こされる。液体の表面は、収縮する傾向があり、延伸された弾性膜の特性に類似する特性を有する。したがって、ピニングエッジ２２８と、親水性の裏面２３０と、表面２３４における表面張力との組み合わせは、自律型試料調製プロセスが、試料液２１０の添加によって開始されることを可能にする。
【0060】
グリッドチャンバ２０４は、フラップ積層体２４０の前方エッジ２３８と、積層体部分２３２の後方エッジ２４２との間に規定された試料入口開口部２３６を有する。染色剤リザーバ２０２は、第２の積層体部分２４６の後方エッジ２４４と、第１の積層体部分２３２の前方エッジ２４８との間に規定される入口開口部２０３を有する。好ましくは、第１及び第２の積層体部分２３２、２４６と、フラップ積層体２４０とは、同じ積層体の一部であり、デバイス２００の製作をより容易にする。
【0061】
グリッドチャンバ２０４は、ＴＥＭグリッドなどの、グリッド２１６を含み、グリッド２１６の上流で染色剤リザーバ２０２に接続されて、流体連通している。グリッドチャンバ２０４はまた、グリッド２１６の下流で排出ユニット２０６に接続されて、流体連通している。好ましくは、毛細管力は、排出ユニット２０６に向かって、且つ、排出ユニット２０６内に、液体を横方向に駆動する。より具体的には、グリッドチャンバ２０４は、染色剤リザーバ２０２の積層体２３２と底部積層体２５２との間に規定されたチャネル２５０を介して染色剤リザーバ２０２と流体連通している。
【0062】
グリッド２１６は、グリッド２１６が積層体２５４に取り外し可能に保持されるように、裏側のグリッドの周囲で低タックの接着積層体２５４によって固定される。空間２５６は、グリッド２１６の下方に形成され、そうでなければ、液体が、ＴＥＭイメージングアーチファクトにつながり得るグリッド２１６の裏側又は下側に達しないようにする。
【0063】
グリッドチャンバ２０４の上部又は開口部は、試料入口２３６として機能し、余分な液体の排出（吸い取り）後の薄い染色剤フィルムの高速乾燥を保証する。開口部２３６は、第１の積層体部分２３２及びその後方エッジ２４２がグリッド２１６上に延在するので、ＴＥＭグリッド２１６の長さよりもわずかに小さい。同様に、フラップ部分２４０及びその前方エッジ２３８は、グリッド２１６上に延在する。これは、最上層の親水性層又は積層体部分２３２、２４０と、グリッド２１６との間にオーバラップを残す。オーバラップは、試料液２１０が、プリロードされた染色液２０８及び排出ユニット２０６と確実に接続することを保証する。
【0064】
好ましくは、排出ユニット２０６は、２つの吸収ユニット又はろ紙ユニット２１８及び２２２の紙ユニットのスタックと、２つの吸収ユニット又は部材２１８、２２２を互いに分離するＰＶＡフィルム２２０などの水溶性バルブ／膜とによって形成されている。第１及び第２の吸収部材は、紙、すなわち、セルロースだけでなく、綿繊維、ニトロセルロース及びガラス繊維などの液体の良好な吸収を提供する任意の適切な多孔質マトリクスであり得る。第１又は上部の吸収部材２１８の１つの機能は、排出ユニットと第２のリザーバの第２の液体との間の良好な接触を保証することである。第２の吸収部材２２２の１つの機能は、溶解性膜２２０が溶解したときに、第１及び第２のリザーバからの液体の適切な流れと、第２の吸収部材への液体の適切な流れとを保証することである。好ましくは、２つの液体は、最初に試料液２１０が試料支持体上を流れるように、試料支持体又はＴＥＭグリッド２１６上で順次流れ、２つの液体は、染色液２０８の一部分が試料支持体上に残り、試料液２１０の物質又はオブジェクトを埋め込むように、第１の吸収部材２１８に続いて染色液２０８と接触する。この原理は、デバイスが１つの吸収部材しか有していない場合、或いは吸収部材がＰＶＡフィルムなどの溶解性膜の下流に位置する場合でも、本発明の全ての実施形態に適用される。典型的に、生体試料は、水溶液で調製されるので、ＰＶＡは、本発明の範囲に特に適している。上部の紙ユニット２１８は、グリッドチャンバ２０４とＰＶＡ層２２０との間に安定した接続を提供する。紙ユニット２１８は、試料リザーバ又はグリッドチャンバ２０４と流体連通している。上部の紙ユニット２１８の上方に位置する、ベント２６４は、排出プロセスを妨げ得る空気が閉じ込められないことを保証する。ベントは、気密性膜を使用するとき、重要な特徴である。
【0065】
本発明の重要な一態様は、ＰＶＡ層２２０の溶解時間が、ＴＥＭグリッド２１６上に堆積された試料液２１０の吸着時間を制御することである。排出又は吸い取りステップは、ＰＶＡ層２２０が試料液２１０によって溶解され、液体が第２の吸収（紙）ユニット２２２に達するときに引き起こされる。第２の吸収（紙）ユニット２２２の高い毛細管（排出）力は、デバイス２００に含まれる液量２１０及び２０８の高速吸収につながる。試料調製が完了した後、フラップ部分２４０は、剥がされ、グリッド２１６を収集し得る。グリッドの収集に加えて、フラップ部分２４０は、調製手順の前に、ユーザが選択したグリッドを導入することを可能にし得る。
【0066】
図５は、本発明のデバイス２００の製作されたバージョンの上面図である。
【0067】
図６は、本発明の５種類のデバイス（デバイス番号１－５）の試験結果を示す模式図４００である。図は、粒子を含む試料液の添加に対する異なる時間での染色剤のプリローディングを示す。より具体的には、それは、５種類のデバイスのマイクロ流体タイミング結果、及び、染色剤がプリロードされた時間を示し、すなわち、各デバイスの、染色剤添加と試料添加との間の時間、吸着時間、排出／吸い取り時間、及び乾燥時間を示す。上で詳細に説明されたように、自律型ＴＥＭグリッド調製は、時間０に試料添加で開始し、試料添加によって引き起こされる。染色剤は、デバイス番号１において試料添加（試料液２１０など）の約４０秒前に添加される。染色剤は、デバイス番号２において試料添加の約２０秒前に、デバイス番号３において約６０秒前に、デバイス番号４において約４０秒前に、デバイス番号５において試料液の添加の約５０秒前に添加される。試料液の添加までの染色剤をプリロードするための時間４０２、４０４、４０６、４０８、４１０は、２０秒から６０秒の間で変化するが、吸着、排出、及び乾燥ステップを完了する時間４１２は、５台のデバイス全てに関してほぼ同じである。プリローディングステップに続くステップは全て、合計で２０秒よりもわずかに長い。したがって、吸着時間は、第１の吸収媒体（紙など）に吸収された試料液が溶解膜（ＰＶＡフィルム）を溶解するのにかかる時間と同じである。これは、染色剤が添加され、或いはプリロードされた時間に対して、試料液が添加されるときはタイムクリティカルではなく、試料液を添加するユーザにとってプロセスをより容易にすることを意味する。
【0068】
図７は、それぞれ、厚さ１２μｍ、２４μｍ及び３６μｍを有する３種類の溶解性膜２２０ａ、２２０ｂ、２２０ｃを溶解するのに必要とされる時間を示す模式図４２０である。膜２２０ａは、溶解するのに約１５秒、膜２２０ｂは、約９０秒、膜２２０ｃは、溶解するのに１８０秒超えを必要とした。
【0069】
図８は、合計２２５枚の画像４４６をもたらす、グリッド毎に５つのグリッドスクエア４４２と、グリッドスクエア４４２毎に９枚の画像４４４とを有する５枚のグリッド４３２、４３４、４３８及び４４０を有するイメージングスキームを示す模式図４３０である。
【0070】
図９Ａは、本発明のデバイスによって調製されたＴＥＭグリッドの、第１の部分６０２を含む、例示的な拡大図６００である。図９Ｂは、図９Ａの図６００に対して、より高い倍率の、図６０４であり、図９Ａに示される、図６００における部分６０２のマークと同じサイズの、第２の部分６０６を含む。同様に、図９Ｃは、図９Ｂの図６０４に対して、より高い倍率であり、図９Ｂに示される、図６０４の部分６０６と同じサイズの、図６０８である。
【0071】
図１０Ａは、本発明のデバイス及び方法を使用することによって調製された第１のグリッド４３２、６１２からの画像６１０の一例である。画像６１０は、ウイルス粒子などの粒子６１４を含み、或いは描写している。図１０Ａと同様に、図１０Ｂは、本発明のデバイス及び方法を使用することによって調製された第２のグリッド４３４、６１８からの画像６１６の一例である。画像６１６は、ウイルス粒子などの粒子６２０を含む。図１０Ｃは、本発明のデバイス及び方法を使用することによって調製された第３のグリッド４３６、６２４からの画像６２２の一例である。画像６２２は、ウイルス粒子などの粒子６２６を含む。図１０Ｄは、本発明のデバイス及び方法を使用することによって調製された第４のグリッド４３８、６３０からの画像６２８の一例である。画像６２８は、粒子６３２を含み、或いは描写している。図１０Ｅは、本発明のデバイス及び方法を使用することによって調製された第５のグリッド４４０、６３６からの画像６３４の一例である。画像６３４は、ウイルス粒子又は任意の他の適切な粒子などの粒子６３８を含み、或いは描写している。
【0072】
図１１は、本発明のデバイス及び方法を使用することによって調製された各グリッド上の粒子の平均直径及び粒子数のグラフ６４０である。
【0073】
図１２は、グリッド毎に５枚の画像を用いた手動サブセット試験の結果、及び、真陽性と偽陽性との比率を示す表６４２である。
【0074】
図１３は、本発明のマイクロ流体デバイス１００の断面図である。デバイス１００は、積層体から製作されていないことに留意されたい。デバイス１００は、デバイス２００と実質的に類似しており、デバイス１００に適用する全てはまた、デバイス２００に適用し、逆も同様である。デバイス１００は、流体連通している液体リザーバを有するマイクロ流体プラットフォームと、遅延バルブを有する時間制御された液体排出として機能する吸収ユニット及び溶解性フィルムとを有する。ここでは、ＴＥＭグリッドとして説明される、試料支持体１１６は、試料リザーバ１０４の底部に配置される。染色剤リザーバ１０２は、デバイスの後方セクション１４１の前端と、デバイスの中間セクション１３２の後端との間に規定された入口開口部１４３を有する。好ましくは、デバイスが積層体技術を使用して構築される場合、セクション１４０、１３２及び１４１は、同じ積層体の一部であり、デバイス１００を製作することを、より容易にする。
【0075】
試料リザーバ１０４は、積層体又はセクション１３２と、積層体又はセクション１４０との間に規定された入口開口部１４５を有する。試料リザーバ１０４は、試料リザーバ１０４と上流の染色剤リザーバ１０２との間に延在するマイクロ流体チャネル１５０を介して、上流（片側）で染色剤リザーバ１０２に接続されて、流体連通している。チャネル１５０は、例えば、側壁がエッジを有さないように、チャネル１５０の端部の一部分のみにピニングエッジ又は不連続性を有してもよいことを理解されたい。また、チャネルの端部に２つの対向するエッジが存在するように、内表面の上側にチャネルのエッジが存在してもよい。
【0076】
好ましくは、チャネル１５０は、第１の積層体部分又はセクション１３２の親水性の裏面１３０と、染色剤リザーバ１０２の底面１３１との間に規定される。底面１３１は、ピニングエッジ１２８に延在する。液体１０８と裏面１３０との間の毛細管力及び表面１３４の表面張力は、液体１０８を染色剤リザーバ１０２に保持し、液体１０８が試料リザーバ１０４に流入することを防止する。言い換えれば、ピニングエッジ１２８は、染色剤リザーバ１０２に添加された染色液などの、液体１０８が、試料リザーバ１０４に流入することを防止する。
【0077】
試料リザーバ１０４は、溶解性フィルム、膜又はバルブ１６２によって、第２のフィルタ又は吸収媒体１６０から分離されている第１のフィルタ又は吸収媒体１５８に接続されて、流体連通している、下流（染色剤リザーバ１０２への上流の接続に対して反対側）にある。第１のフィルタ１５８はまた、ベント１６４に接続されている。ベント１６４は、潜在的に閉じ込められた空気及びガスのための非常口として機能し、そうでなければ、第１及び第２のフィルタ１５８、１６０への液体１０８、１１０の流れを妨げ、第１及び第２のフィルタ１５８、１６０によって吸収される液体１０８、１１０の流れを妨げる。
【0078】
図１４を参照すると、取り外し可能なフラップ１２６は、グリッド調製の完了時に、試料グリッド１１６を試料リザーバ１０２から除去する前に、デバイス１００から除去される。
【0079】
図１５は、図１３に示されるデバイス１００と実質的に類似しているが、追加のリザーバ３０２と、追加の溶解性フィルム又は膜又はバルブ３２０と、追加の吸収ユニット３２２とを含むデバイス３００を示す。ここでは、デバイス１００とデバイス３００との間の主な差異のみが説明される。デバイス３００は、追加の液体が、順次、時間制御された方法で、グリッド１１６上に流されるべきであるときに使用される。追加の液体リザーバ３０２は、染色剤又は第２のリザーバ１０２の上流に配置され、リザーバ３０２の底面３０６と、積層体部分又はセクション３１０の親水性の裏面３０８との間に規定されるチャネル３０４を介して流体連通して、接続されている。リザーバ３０２と１０２との間に、上流リザーバ３０２の液体３１４が染色剤リザーバ１０２、３０３に流入することを防止する第２のピニングエッジ３１２が存在する。液体３１４は、リザーバ１０２の液体１０８と同じ方法で、すなわち、親水性の裏面３０８への毛細管力及び表面３１６における表面張力によって、リザーバ３０２の所定の位置に保持される。
【0080】
リザーバの順序は、液体がグリッド１１６上を流れる順序に対応する。すなわち、液体が試料、洗浄液、染色剤である場合、染色液は、上流リザーバ３０２に添加されるべきである。洗浄液は、中間又は第２のリザーバ１０２に添加されるべきであり、添加時に上流リザーバ３０２の液体に接続される。試料液は、グリッド１１６上の第１のリザーバ１０４に添加されるべきであり、添加時に洗浄液３０５及び染色剤３１４の上流液列に接続し、下流で排出ユニット３１８に接続する。
【0081】
排出ユニット３１８は、吸収部材（ろ紙）１５８、１６０と、溶解性フィルム１６２とを有し、試料リザーバ１０４の下流に位置する。排出ユニット３１８は、追加の溶解性フィルム３２０と、別のフィルタ又は吸収部材３２２とを有し、追加の液体のタイミングがどのように制御され得るかを説明する。第１の溶解性フィルム１５８の厚さは、試料リザーバ１０４に添加された第１の液体１１０が、どのくらいの時間グリッド１１６の上に存在し、或いは留まるか、すなわち、試料液１１０及び粒子１１４が、どのくらいの時間グリッド１１６に付着することを許容されるかを決定する。第２のフィルタ１６０は、試料液１１０の体積に対応する液量を吸収し、保存するほど、十分に大きいべきである。液体１１０が第２の溶解性フィルム又は膜３２０に達すると、グリッド１１６上の液体の流れは、フィルム３２０が溶解するまで停止し、３つの液体を有するこのセットアップにおける最後のフィルタ３２２は、３つの液体１１０、１０８／３０５及び３１４全ての体積全てを吸収することによって、グリッド１１６上の第２の液体１０８、３０５及び第３の液体３１４を引き寄せる。
【0082】
図１６は、図１３及び図１５に示されたデバイスの変更を含むデバイス３８０を示し、排出ユニット３８４のろ紙３８２の形状が、液体の流速を変えるためにどのように変更され得るかを説明する。デバイス３８０の他の全ては、デバイス１００及び３００のコンポーネントと同一である。幅が狭く、薄いろ紙又はネック３８６を有するろ紙３８２は、グリッド１１６上の流速を遅くし、幅が広く、厚いフィルタは、流速を増加させる。
【0083】
図１８－図１９は、排出又は吸い取りユニット７０６、８０６が、それぞれ、排出又は吸い取りユニット１０６と異なることを除いて、図１３に示されるデバイス１００と実質的に同一であるデバイス７００、８００、それぞれの代替的な実施形態を示す。好ましくは、図１３に示されるように、排出ユニット７０６は、１つの第１の吸収部材７５８のみを有するが、溶解性膜又は第２の吸収部材を有さない。デバイス１００、２００を参照して詳細に説明されたように、デバイス７００の動作は、試料液中の粒子がグリッド１１６に付着するのに十分な時間があるように、第１及び第２のリザーバの液体が、適切な時間中に吸収部材７５８によって吸収されるという点で、デバイス１００の動作と実質的に類似している。
【0084】
同様に、デバイス８００は、排出ユニット８０６が溶解性膜８６２及び第１の吸収部材８５８を有することを除いて、デバイス１００のそれと実質的に類似している。排出ユニット８０６は、溶解性膜８６２を溶解することを開始するために溶解性部材と接触する前に、第２の液体が吸収部材を通過する必要なく、溶解性膜８６２が第２の液体と直接接触するように、溶解性膜８６２と第２のリザーバ１０４との間に吸収部材を有しない。排出ユニット１０６と比較した排出ユニット７０６、８０６の差異を除いて、デバイス７００、８００の全ての他の特徴及び方法ステップは、上で詳細に説明されたデバイス１００、２００と同じである。
【0085】
図２０は、第１の吸収部材１５８の代わりに、排出又は吸い取りユニット９０６において毛細管チャネル９５８を有することを除いて、図１３に示されるデバイス１００と実質的に類似しているデバイス９００のさらに別の実施形態である。デバイス１００及び２００に関連して詳細に説明されたように、チャネル９５８内の毛細管力は、液体１１０が溶解性膜１６２と接触し、膜を溶解するように、第２の液体１１０を第２のリザーバ１０４からチャネル９５８へ促す。
【0086】
動作では、本発明の方法は、あらかじめ取り付けられたグリッド２１６を有するグリッドチャンバ又は試料液リザーバ２０４に接続されて、流体連通している染色剤リザーバ２０２を提供するステップを含む。リザーバ２０４は、排出ユニット２０６に接続されて、流体連通している。染色液２０８は、染色剤リザーバ２０２に添加され、ユーザが粒子２１４を含む試料液２１０を試料液リザーバ２０４に添加するまで、リザーバ２０２に含まれる。
【0087】
この重要な特徴は、毛細管ストップバルブ又はピン留め機構、ここでは、染色剤リザーバ２０２をグリッドチャンバ２０４から分離するチャネル２５０の端部に位置するエッジ２２８の形態によって可能になる。染色液２０８は、液体２０８が裏面２３０に付着し、ピニングエッジ２２８上に延在するように、毛細管力に起因してピニングエッジ２２８でピン止めされ、チャネル２５０を介して、染色剤リザーバ２０２と、試料リザーバ又はグリッドチャンバ２０４との間に流体連通が存在するものの、表面２３４での表面張力は、液体２０８がグリッドチャンバ２０４に流入することを防止する。このようにして、染色液２０８が染色剤リザーバ２０２の内部に保持されるという事実は、試料調製プロセスが、粒子２１４を含む試料液２１０を試料リザーバ２０４に添加することによって開始されることを可能にする。液体２１０は、液体２１０が表面２３４と接触し、ピニングエッジ２２８と裏面２３０との間の液体２０８の表面張力を破壊するような量で添加される。表面２３４の表面張力が破壊されるとき、２つの液体２１０、２０８は、界面で液体のわずかな混合のみと接続される。粒子２１４を含む試料液２１０がデバイス２００の上方から開口部２３６を介してグリッドチャンバ２０４に添加されるとき、液体２１０はまた、試料リザーバ２０４の下流にある排出ユニット２０６に流入し、接続する。試料液２１０及び粒子２１４が添加される開口部２３６は、試料液２１０が染色液２０８及び吸い取りユニット２０６と確実に接続するように、グリッド２１６の幅よりもわずかに小さい。グリッド２１６の下方に位置する空間２５６は、液体が、グリッド２１６の間違った側に流れて、付着し、調製の品質を妨げないようにする。
【0088】
排出ユニット２０６は、２つの吸収ユニット（ろ紙など）２１８及び２２２と、２つのフィルタ２１８、２２２の間に位置する溶解性ＰＶＡフィルム２２０とを有する。上部のフィルタ２１８は、液体が、フィルタ２１８の上部から、溶解性フィルム２２０と接触しているフィルタ２１８の底部に移動するように、試料液２１０が、試料液２１０を吸収することによって、ＰＶＡフィルム２２０に確実に接続するようにする。
【0089】
上部のフィルタの上方のベント２６４は、試料液２１０と排出ユニット２０６との間の接続を妨げ得る、潜在的に閉じ込められた空気の非常口として機能する。試料液２１０は、液体がフィルタ２１８の下方に位置するフィルタ２２２に流入し得るように、上部のフィルタ２１８を通って流れ、ＰＶＡフィルム又は層２２０との接触時に、ＰＶＡ層２２０を溶解する。試料液２１０がＰＶＡ層２２０を溶解するのにかかる時間は、試料液２１０中の粒子２１４がグリッド２１６に付着し、吸着することを許容される時間を制御するので、クリティカルである。ＰＶＡ層２２０が溶解されると、液体２１０に続いて、デバイス２００の全ての液体２１０、２０８を吸収する底部のフィルタ２２２に流入し、接続する。フィルタ又は吸収部材２２２は、最初に試料液２１０、次いで染色液２０８を吸収する。したがって、底部のフィルタ２２２は、手動吸い取りステップに対応する。ここで、試料液２１０及び粒子２１４が添加されたグリッド２１６上の開口部２３６は、２つの吸収部材又はフィルタ２１８、２２２による排出／吸い取りが全ての余分な液体２１０、２０８を吸収した後に残される薄い染色剤フィルム２２４の高速乾燥を保証する。最後に、フラップ２２６は、デバイス２００から剥がされ、例えば、ｎｓ－ＴＥＭデバイスにおけるその後のイメージングのためにデバイス２００から容易に抽出されるグリッド２１６に容易なアクセスを提供し得る。
【0090】
図１５に関連して示され、説明されるように、例えば、染色液３１４が試料液１１０に添加される前の洗浄ステップにおける洗浄液３０５といった、より多くの液体が順次添加される必要がある場合、チャネル３０４を介して中間リザーバ３０３に接続されて、流体連通しており、ピニングエッジ３１２によって分離されている別の液体リザーバ３０２は、追加され得る。次いで、染色液３１４が最も上流のリザーバ３０２に添加された後、洗浄液３０５は、中間リザーバ３０３に添加されるべきである。追加の液体（ここでは、洗浄液３０５）のインキュベーション時間が制御される必要がある場合、溶解性フィルム３２０及びろ紙３２２の追加の層は、排出ユニット３１８に追加され得る。
【0091】
グリッド１１６上の流れの速度は、排出ユニットのろ紙の形状及び厚さによって制御され得る。より少ない量の利用可能な吸収媒体（すなわち、フィルタ／紙）、又は、より低いフィルタの毛細管現象（ウィッキング率としても知られている）は、より遅い流れ／排出をもたらし、逆も同様である。例えば、溶解性フィルムの後の薄く、幅が狭く、長いフィルタは、より遅い液体の流れ及び排出ペースをもたらす。
【0092】
あらかじめ混合された染色溶液の液滴を添加する代わりに、染色剤を構成する塩は、染色剤リザーバ１０２の底部で乾燥され、次いで、染色剤リザーバ及びグリッドを調製するとき、水又は別の溶解剤／緩衝剤のみが、リザーバ１０２に添加され得る。次いで、溶解剤が添加されるとき、染色剤の塩は、溶解され、染色液２０８を生成する。
【0093】
調製アセンブリキットに親水化グリッドを追加する代わりに、アルシアンブルーなどの親水化液は、試料液が添加される前に、グリッド上に流され得る。このようにして、染色液及び試料液は、マイクロ流体チャネル３０４及び１５０を介して接続されるが、ピニングエッジ１２８及び３１２を介して分離状態に保たれた（図１５に最も良く示されている）、グリッドチャンバ１０２及び３０２の上流の２つの分離したリザーバにロードされる。次いで、グリッド親水化液は、グリッドチャンバ１０４のグリッド１１６上に直接添加され、グリッド１１６上を流れる液体のシーケンスを開始する、すなわち、グリッド調製プロセスを開始する。
【0094】
本発明の方法の代替的な一使用は、グリッド１１６の上にマトリクスの制御された堆積のために使用することである。１つの液体のみ、すなわち、基質が使用され、それがグリッドチャンバ１０４に添加されることを除いて、上述されたのと同じ方法は、適用される。例えば、スパイダーシルクなどの、繊維は、グリッド１１６上に添加された試料（基質）の液滴上の気液界面において重合することを許容されてもよい。溶解性層１６２が溶解されるとき、ろ紙１６０がデバイスを排出する間、スパイダーシルクは、ＥＭグリッド上に静かに落下する。次いで、グリッドの上に配置された繊維網（このケースでは、スパイダーシルク）は、（クライオ又はネガティブ染色による）ＴＥＭにおけるその後の単粒子の再構築の前に、後に添加されるタンパク質をグリッド上でランダムな方向に配置させるマトリクスとして機能する。グリッド１１６に直接タンパク質を添加することはしばしば、タンパク質がそれ自体を好ましい方向（すなわち、細長い且つ／或いは平らなときに横になる）に配向することをもたらし、再構築において実現され得る解像度を制限する。
【0095】
（実験）
上述されたように、本発明のマイクロ流体デバイスは、例えば、図３に特に示されるように、異なる材料のいくつかの層からなる。それは、親水性シート（タイプＣのレーザー印刷透明体、ゼロックス、エルムストック、英国）と、接着テープ１（６４６２０、Ｔｅｓａ、ノルダーシュテッド、ドイツ）と、接着テープ２（３００ＬＳＥ、３Ｍ、ＶＷＲ、スポーンガ、スウェーデン）とから製作された。低タックの接着剤（Ｓｃｏｔｃｈ（登録商標） ９２８、３Ｍ、Ａｍａｚｏｎ、コブレンツ、ドイツ）は、連続カーボンフィルムを有するフォルムバールコーティングされた銅グリッドである、４００メッシュＴＥＭグリッド（０１７５４－Ｆ、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．、レディング、カリフォルニア州）を固定するために使用された。Ａｈｌｓｔｒｏｍ ｇｒａｄｅ２３８及び２２２（Ａｈｌｓｔｒｏｍ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ＬＬＣ、マウント・ホーリー・スプリングス、ペンシルバニア州）は、それぞれ、排出又は吸い取りユニットにおける吸水紙１及び吸水紙２として使用された。溶解性フィルム又は膜／バルブは、粒状ＰＶＡ（３６０６２７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）から製作された。１×１０１３ｇｃ／ｍＬのストック濃度で、緑色蛍光タンパク質のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ駆動の発現で封入されたＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）粒子、セロタイプ２（ＡＡＶ２）（ＣＶ１０００４－５０ＵＬ、ＡＭＳ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．、アビンドン、英国）は、試料として使用された。
上述されたように、本発明のマイクロ流体デバイスは、例えば、図３に特に示されるように、異なる材料のいくつかの層からなる。それは、親水性シート（タイプＣのレーザー印刷透明体、ゼロックス、エルムストック、英国）と、接着テープ１（６４６２０、Ｔｅｓａ、ノルダーシュテッド、ドイツ）と、接着テープ２（３００ＬＳＥ、３Ｍ、ＶＷＲ、スポーンガ、スウェーデン）とから製作された。低タックの接着剤（Ｓｃｏｔｃｈ（登録商標） ９２８、３Ｍ、Ａｍａｚｏｎ、コブレンツ、ドイツ）は、連続カーボンフィルムを有するフォルムバールコーティングされた銅グリッドである、４００メッシュＴＥＭグリッド（０１７５４－Ｆ、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．、レディング、カリフォルニア州）を固定するために使用された。Ａｈｌｓｔｒｏｍ ｇｒａｄｅ２３８及び２２２（Ａｈｌｓｔｒｏｍ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ＬＬＣ、マウント・ホーリー・スプリングス、ペンシルバニア州）は、それぞれ、排出又は吸い取りユニットにおける吸水紙１及び吸水紙２として使用された。溶解性フィルム又は膜／バルブは、粒状ＰＶＡ（３６０６２７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）から製作された。１×１０１３ｇｃ／ｍＬのストック濃度で、緑色蛍光タンパク質のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ駆動の発現で封入されたＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）粒子、セロタイプ２（ＡＡＶ２）（ＣＶ１０００４－５０ＵＬ、ＡＭＳ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．、アビンドン、英国）は、試料として使用された。
【0096】
ＡＡＶ試料は、リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ（－／－） １４１９０－０９４、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、ウプサラ、スウェーデン）を用いて、１×１０１２ｇｃ／ｍＬの濃度に希釈された。２６Ｓプロテアソーム（＃：Ｅ－３５０、ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）は、大きい球状タンパク質複合体を表す試験試料として使用された。４０ｍｇ／ｍｌの初期濃度で、ホエイタンパク質分離物（ＷＰＩ）１６からのタンパク質繊維を有する試料は、スウェーデン、ストックホルムの王立工科大学の応用物理化学学科からの寄贈であった。
【0097】
ＮａｎｏＶａｎ（登録商標）、２％のメチルアミンバナデート溶液（＃２０１１－５ＭＬ、Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ、ヤップハンク、ニューヨーク州）と、２％の酢酸ウラニル溶液（＃２２４０－２、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハットフィールド、ペンシルバニア州）とは、染色剤として使用された。食用色素の水溶液（ＥＡＮコード：５７０１０７３０６４６６５及び５７０１０７３０６４６７２、Ｄｒ．Ｏｅｔｋｅｒ、Ｃｏｏｐ、ソルナ、スウェーデン）は、試料及び染色剤のモデルとして使用された。
【0098】
前述されたように、各デバイスは、デバイスが異なる材料のいくつかの層を積み重ねることによって形成された積層技術を使用して製作された。図３の断面図は、異なる層を示す。これらの層の名称、ブランド名及び厚さは、以下であった。
【0099】
【表1】
【0100】
接着剤及び親水性シートは、カッティングプロッタ（ＣＥ６０００、Ｇｒａｐｈｔｅｃ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．、アーバイン、カリフォルニア州）を使用して構築された。
【0101】
ＰＶＡフィルム又は膜は、２０ｗｔ％の粒状ＰＶＡの水溶液から製作された。薄いフィルムのアプリケータ（４３４０、Ｅｌｃｏｍｅｔｅｒ、マンチェスター、英国）を使用して、ＰＶＡフィルムは、ラミネートパウチ（３３８５６９４、Ｏｆｆｉｃｅ Ｄｅｐｏｔ、ＬＡ Ｖｅｎｌｏ、オランダ）に均一に移され、室温で乾燥された。最終的なＰＶＡフィルムの厚さは、１μｍ目盛りの厚さ計（２１０９Ｌ Ｍｅｔｒｉｃ Ｄｉａｌ Ｇａｕｇｅ、Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、ウプランズ・ヴェスビー、スウェーデン）を使用して測定された。
【0102】
ＰＶＡフィルムは、ラミネータ（Ｈｅａｔ Ｓｅａｌ Ｐｒｏ Ｈ６００、ＧＢＣ、ノースブルック、イリノイ州）を使用して、８５℃で吸水紙２に積層された。紙－ＰＶＡ積層体は、使用３０分前まで８０％の相対湿度で湿度チャンバに保管された。
【0103】
紙－ＰＶＡ積層体を含む、紙材料は、レーザーカッタ（ＶＬＳ ２．３０、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ウィーン、オーストリア）によって切断された。構築した後、層は、アライメントピンを使用することによってアセンブルされ、室温で積層された。向上された粒子接着性に関して、本発明のマイクロ流体デバイスを完全にアセンブルする前に、ＴＥＭグリッドは、ＰＥＬＣＯ ｅａｓｉＧｌｏｗ（商品商標）（９１０００Ｓ－２３０、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．、レディング、カリフォルニア州）を用いて、酸素プラズマ中でグロー放電された。完全にアセンブルされた、製作されたデバイスは、図５に示される。デバイスの寸法は、６×１２ｍｍ２である。デバイスは、ＴＥＭグリッドをグロー放電した後、１時間以内に使用された。
【0104】
本発明のマイクロ流体デバイスの１つの重要な特徴は、ユーザとのインタラクションを最小限にするように設計されることである。自律型デバイスの動作及びマイクロ流体の一貫性を実証するために、６台のデバイスは、評価された。５台のデバイスは、試料としてＡＡＶ粒子と、染色剤としてＮａｎｏＶａｎとを用いて使用された。これらの５台のデバイスからのグリッドは、合計２２５枚の画像上で自動画像解析のためのＴＥＭ画像を収集するために使用された。自律型デバイスの個々の調製ステップをより良く可視化するために、１台のデバイスは、着色色素溶液を用いて使用された。青色色素溶液及び黄色色素溶液は、それぞれ、試料及び染色剤のモデルとして使用された。最初に、５μｌの染色液は、染色剤入口を介して染色剤リザーバに添加された。次いで、自律型ＴＥＭグリッド調製機構は、試料リザーバ又はグリッドチャンバの試料入口に５μｌの試料を添加することによって引き起こされた。
【0105】
全てのデバイスのＴＥＭグリッド調製シーケンスは、１秒あたり５０フレームのフレームレートを有するカメラで記録された。デバイスの性能と自律型調製ステップの一貫性とを解析するために、各ステップの時間間隔は、手動で取得された。染色剤の添加と試料液（粒子を含む）の添加との間の時間は、染色剤のプリローディング時間として規定された。
【0106】
染色剤リザーバのロバスト性、すなわち、漏れのない染色剤の閉じ込めを実証するために、染色剤添加と試料添加との間の時間は、２０－６０秒の間で変化され、染色液は、ピニングエッジと親水性表面の裏面との間に延在する表面、すなわち、毛細管力及び表面張力によって所定の位置に保持された。図１Ａ－図１Ｄに説明されるように、試料添加後のマイクロ流体ＴＥＭグリッド調製ステップは、試料吸着、排出／吸い取り及び薄いフィルム乾燥を含む。本発明の方法のクリティカルな態様としては、ＴＥＭグリッド上の試料の吸着時間が、ＰＶＡフィルムの溶解時間に対応し、その溶解時間と同じであることである。それは、紙１の濡れと吸い取りイベントの開始との間の時間として規定された。ＰＶＡ層の厚さは、１０μｍであった。吸い取り時間は、排出／吸い取りイベントの開始と終了との間の間隔である。吸い取りイベントの開始は、液体が排出ユニットに最初に移動する瞬間として規定される。吸い取りイベントの終了は、液体の大部分が、ＴＥＭグリッド上に薄い染色剤フィルムを残したまま、排出ユニットによって排出される瞬間として規定される。この後、乾燥間隔は、開始し、グリッド上の残りの染色剤の薄いフィルムが視覚的に乾燥するまで続く。
【0107】
概して、ＴＥＭイメージングは、様々なタイプの試料に関して強力な可視化技術である。しかしながら、必要とされる試料吸着時間は、異なる試料間で変化する。これの主な理由は、試料吸着が、試料とＴＥＭグリッドのカーボン表面との間の相互作用に依存することである。したがって、異なる試料要件を構成する異なる吸着時間を有するデバイスは、望まれることとなる。
【0108】
本発明のマイクロ流体デバイスの別の重要な要素は、デバイスのタイミングを自律的に制御する水溶性ＰＶＡフィルムの溶解時間が、グリッド上の試料（すなわち、染色剤に埋め込まれた粒子のフィルム又は層）の試料吸着時間に対応することである。
【0109】
グリッド上の試料の吸着時間の調整可能性を実証するために、３種類の厚さの水溶性フィルム（１２μｍ、２４μｍ及び３６μｍ）を有するマイクロ流体デバイスは、製作され、調査された。溶解時間に影響を与えるパラメータ（例えば、温度、相対湿度）の中で、溶解性フィルムの厚さは、最も調整（tune and adjust）しやすいパラメータのうちの１つである。２４μｍ及び３６μｍのＰＶＡの厚さは、１２μｍのＰＶＡシートの複数の層を積み重ね、ラミネータを用いて８５℃で、それらをＰＶＡシートの下方の紙２に積層することによって得られた。紙－ＰＶＡ積層体は、使用３０分前まで８０％の相対湿度の湿度チャンバに保管された。試料及び染色剤のモデルとして、５μｌの青色色素溶液及び５μｌの黄色色素溶液、それぞれを使用して、フィルムの厚さ毎に５台、１５台のデバイスの吸着時間は、評価された。
【0110】
試料調製の品質を評価するために、ＴＥＭイメージングは、試料としてＡＡＶ粒子と、染色剤としてＮａｎｏＶａｎとを用いて、５枚の自律的に調製されたＴＥＭグリッド上で実行された。ＮａｎｏＶａｎは、一般的に使用されている酢酸ウラニルとは異なり、放射性ではないので選択され、通常のラボラトリにおいて取り扱われ得る。５枚のグリッド全てに関して、ＡＡＶが、ＴＥＭグリッドに成功裏に吸着され、染色剤に十分に埋め込まれたか否かが調査された。異なる倍率レベルのＡＡＶ粒子は、１６μｍから５００ｎｍの間の視野（ＦＯＶ）で、検査された。イメージングは、２５ｋＶの動作電圧で、ＭｉｎｉＴＥＭ（商品商標）顕微鏡（Ｖｉｒｏｎｏｖａ ＡＢ、ストックホルム、スウェーデン）上で実行された。
【0111】
取得されたＴＥＭ画像が自動画像解析に有用であったか否かを調査するために、粒子検出スクリプトは、５枚の自律的に調製されたグリッドのＴＥＭ画像に適用された。合計２２５枚の画像は、図８に示されるイメージングスキームにしたがって収集された。低い倍率では、ユーザは、５つの隣接していないグリッドスクエアを手動で選択した。次いで、９枚の高い倍率の画像は、２μｍのＦＯＶで、グリッドスクエア毎に取得され、グリッド毎に４５枚の画像をもたらした。この倍率では、１画素は、約１ｎｍを表し、通常、画像毎に多数の粒子は、見られ、典型的に、ＡＡＶの形態は、可視的である。グリッド１、グリッド４及びグリッド５は、同じ顕微鏡上で撮像され、グリッド２及びグリッド３は、第２の顕微鏡上で撮像された。粒子検出スクリプトは、２２５枚の画像全てに適用された。ＡＡＶは、丸く見える正２０面体のキャプシドを有し、２０－２５ｎｍの予想される直径を有する。しかしながら、スクリプトは、粒子が実際のウイルスサイズよりも大きく見えるように、ＡＡＶ粒子の周りの染色エンベロープを検出するように設計された。したがって、粒子検出スクリプトは、２４ｎｍから３２ｎｍの直径範囲内で丸いオブジェクトを検出するように設定された。自動画像解析から、グリッド毎に検出された粒子数は、取得され、各検出された粒子は、その位置及びサイズによって特徴付けられる。
【0112】
粒子検出の結果を定量化するために、手動粒子検出は、ＴＥＭグリッド毎に５枚のランダムに選択された画像と共に、２５枚の画像のサブセットに対して実行された。粒子数は、手動でカウントされ、検出スクリプトからの結果と比較された。これは、真陽性と偽陽性との比率を求めるために行われ、両方は、検出スクリプトの性能の重要な尺度である。
【0113】
ｎｓＴＥＭは、構造生物学のための生体試料、例えば、タンパク質複合体の調製中に品質管理として日常的に使用される。より広い用途のための、異なる染色剤を用いたマイクロ流体デバイスの使用の可能性を調査するために、プロテアソームは、より大きい球状タンパク質複合体として、調製され、撮像され、ＷＰＩからのタンパク質繊維は、糸状タンパク質として、調製され、撮像された。使用されたマイクロ流体デバイスにおけるＰＶＡフィルムは、１５μｍの厚さを有し、約３５秒の溶解時間に相当する。プロテアソーム及び繊維に関して、酢酸ウラニルの原液及びＮａｎｏＶａｎは、それぞれ使用された。
【0114】
上で詳細に説明されたように、ＴＥＭグリッド調製シーケンスは、図２Ａ－図２Ｄに示される。可視性に関して、着色された色素溶液は、試料溶液及び染色溶液の代わりに使用された。第１のステップは、どのように、プリロードされた染色剤２０８（黄色色素溶液）が染色剤リザーバ２０２に含まれ、試料２１０、２１４（青色色素溶液）が添加されるかを示す（図２Ａに最も良く示されている）。第２のステップでは、ＰＶＡフィルム又はバルブが閉じられている限り、粒子、２１４を含む試料２１０は、ＴＥＭグリッドを覆う（図２Ｂに最も良く示されている）。ＰＶＡフィルム又はバルブが溶解したとき、染色液及び試料液は、吸い取られる（図２Ｃに最も良く示されている）。最後に、液体の大部分は、排出媒体（吸い取りフィルタ／紙）に含まれ、そこに埋め込まれた粒子を含む、染色剤フィルムは、乾燥する（図２Ｄに最も良く示されている）。従来報告されているマイクロ流体ＴＥＭグリッド調製と比較して、ユーザとのインタラクションは、水溶性ＰＶＡフィルムによって制御される自律型マイクロ流体の動作を提供することによって低減された。さらに、かなり低い液体消費は、手動調製プロトコルと同じ液量で実証された。
【0115】
マイクロ流体の一貫性を実証するために、ビデオ録画は、試料としてＡＡＶと、染色剤としてＮａｎｏＶａｎとを用いて使用された５台のデバイス上のマイクロ流体イベントのタイミングと時間とに関して解析された。図６は、４つの試料調製ステップの各々の時間間隔の棒グラフを提示する。結果は、染色剤のプリローディング時間の長さに関わらず、吸着、排出／吸い取り及び乾燥を含む以下のステップ全ては、５台のデバイスで同一に近いことを示す。これは、染色剤のプリローディング時間に関係なく、試料が添加されるまで、染色剤リザーバが染色剤を確実に含むことを実証する。５台のデバイスの平均吸着時間は、１０．６±０．３秒であり、３％のＣＶに相当する。これは、本発明のマイクロ流体デバイスの非常に一貫性のある、自律的な時間制御を示す。平均排出／吸い取り時間は、０．８±０．１秒であり、１２．５％のＣＶに相当する。ＣＶは、高いように見えるが、絶対偏差は、低く、本発明のデバイスのマイクロ流体の一貫性を確証する。乾燥ステップは、突然終了しなく、ビデオを見ることによって正確な乾燥間隔を測定することを困難にする。しかしながら、全てのＴＥＭグリッドは、１分以内に視覚的に乾燥したことが観察された。信頼性のある、高速乾燥は、グリッドチャンバのグリッド領域サイズの上部の開口部によって可能になる。
【0116】
結果は、ユーザ入力が最小限であったが、本発明のマイクロ流体デバイスが意図されたように動作することを示す。染色剤のプリローディング時間に関係なく、試料添加後の自律型デバイスの動作は、高いマイクロ流体の一貫性を実証する、５台のデバイスで同一に近い。
【0117】
ＰＶＡの溶解時間に相当する、試料吸着時間の調整可能性を実証するために、水溶性ＰＶＡフィルムの３種類の厚さ（１２μｍ、２４μｍ及び３６μｍ）は、本発明のマイクロ流体デバイスにおいて試験された。図７は、吸着時間の測定結果を示す。ＰＶＡフィルムの溶解時間は、ＰＶＡフィルムの厚さと共に増加する。ＰＶＡフィルムの１２μｍ、２４μｍ及び３６μｍの厚さに関して、平均溶解時間は、それぞれ、１４．４±０．９秒（ｎ＝５）、８９．９±１２．０秒（ｎ＝５）、１９１．６±２０．３秒（ｎ＝５）である。結果は、ＰＶＡフィルムの厚さを変化することによって、吸着時間を容易に調整することが可能であることを示す。溶解時間のばらつきは、増大されたＰＶＡフィルムの厚さと共に増加する。これは、異なるデバイス間のＰＶＡフィルムの厚さの小さな差異に起因し得る。しかしながら、ばらつきは、吸着時間が本発明のＰＶＡ層の設計によって制御され得ると結論付けるほど、十分に小さい。
【0118】
５枚の自律的に調製されたＴＥＭグリッドのＴＥＭイメージングは、試料調製の品質を評価することを可能にした。図９Ａ－図９Ｃは、１６μｍ、２μｍ及び５００ｎｍの３つのＦＯＶでの倍率系列を示す。最大のＦＯＶ（１６μｍ）では、ＡＡＶ粒子は、暗いスポットとして見える。中間のＦＯＶ（２μｍ）は、より高いレベルの詳細を示す。粒子は、放射状に薄くなる染色勾配を有する暗いリングによって囲まれた、明るく、丸いオブジェクトとして可視的である。この系列での最小のＦＯＶ（５００ｎｍ）は、最も高いレベルの詳細を有し、ＡＡＶ粒子のクローズアップ図を提供する。
【0119】
図１０Ａ－図１０Ｅは、５枚のグリッド（ＦＯＶ ２μｍ）の各々からの１つの例示的な画像を示す。５枚のＴＥＭグリッド全ては、グリッド上の染色剤フィルムに十分に埋め込まれた粒子を含み、暗い染色エンベロープによって囲まれた明るいスポットとして可視的であることを発見した。染色エンベロープの外観のばらつきは、染色剤の厚さの局所的なばらつきに起因し得る。また、例えば、カーボンフィルムの局所的な不均一性によって引き起こされる、ＴＥＭグリッドの厚さのばらつきは、画像の暗さのばらつきをもたらし得る。全体として、５台のマイクロ流体デバイスからの結果は、十分に埋め込まれたＡＡＶ粒子を有するＴＥＭグリッドの一貫性のある調製を示した。
【0120】
試料調製の一貫性をさらに実証するために、２２５枚のＴＥＭ画像は、収集され、自動粒子検出は、実行された。粒子検出スクリプトは、２２５枚の画像全てにおいて５１７１個の粒子を検出した。４５枚の画像を有する、グリッド全ては、平均１０３４±６５個の粒子を含み、６％のＣＶに相当する。これは、５枚の、独立して調製されたＴＥＭグリッド上で、再現性があり、一貫性のあるＡＡＶ粒子の広がりを示す。自動粒子検出の結果を使用して、検出された粒子のサイズは、抽出された。
【0121】
図１１は、各グリッドにおいて、検出された粒子の平均粒子直径を示すグラフ６４０である。２種類の顕微鏡は、使用され、キャリブレーションがわずかに異なり得るものの、各グリッドの平均粒子サイズは、他の試料のエラーバー内に十分に収まっている。全ての検出された粒子の平均サイズは、２８±２ｎｍ（ｎ＝５１７１）であり、７％のＣＶに相当する。この小さいばらつきは、グリッドに関係なく、全ての検出された粒子が同様の検出されたサイズを有することを意味する。ＡＡＶ粒子の実際のサイズは、２０－２５ｎｍであるが、ｎｓＴＥＭにおいて撮像されるとき、染色エンベロープに起因して、より大きく見える。検出スクリプトは、染色剤層、すなわち、実際の粒子の外側で粒子の輪郭を描き、測定するように設計される。したがって、検出された粒子サイズは、予想されるサイズウィンドウ内に十分に収まっている。
【0122】
２５枚の画像のサブセットにおける手動粒子検出の結果は、自動検出の結果を定量化することを可能にした。図１２は、サブセット試験の結果をまとめている。手動カウントは、サブセットにおいて６０５個の粒子をもたらした。自動粒子スクリプトは、これらの粒子のうちの５５７個を正しく発見し（真陽性）、９２％の成功率に相当する。スクリプトは、正しくなかった２９個のオブジェクトを発見し（偽陽性）、４．９％に相当する。９０％を上回る真陽性及び約５％の偽陽性と共に、画像及び自律型試料調製は、簡単な自動画像解析に十分な品質を有すると結論付けられ得る。
【0123】
用途範囲を広げるために、プロテアソーム及びＷＰＩからのタンパク質繊維は、調製され、撮像された。図１７Ａ－図１７Ｄに提示される、これらの２つの試料５００、５０２の結果は、ＴＥＭ調査に適した十分に埋め込まれた領域を有するＴＥＭグリッド上のタンパク質の一様な広がりを明らかにする。図１７Ａ－図１７Ｂは、２つの異なる倍率での２６５個のプロテアソームの画像５００を示す。プロテアソームの上面図５０４及び側面図５０６は、観察され得る。図１７Ｃ－図１７Ｄは、２つの異なる倍率でのＷＰＩ繊維５０８の画像を示す。プロテアソーム試料（図１７Ａ－図１７Ｂに最も良く示されている）の解析は、個々のプロテアソームが明確に識別され、サブユニットの詳細などの構造的特徴が区別され得ることを示す。異なる投影は、画像上で観察され、上面図が円形の粒子として見え、側面図が長方形として見え得る。ＷＰＩ繊維（図１７Ｃ－図１７Ｄに最も良く示されている）の解析は、様々な長さの十分に規定された個々の繊維の観察及び特性評価を可能にする。全体として、形態観察は、従来の手動ｎｓＴＥＭで調製された同様の試料の報告データと一致する。これらの２つのタンパク質試料の調製は、マイクロ流体デバイスのさらなる調整を必要としなかったので、本方法の汎用性及びロバスト性を実証した。
【0124】
以下は、変更されたデバイスを必要とし得る、本発明の方法のための分野のさらに別の可能性のある用途である。可能性のあるｎｓＴＥＭ試料調製の用途例は、イムノゴールドラベリングであり、４つの液体は、試料上に流される必要がある。調製ステップのシーケンスは、以下となる。
１）試料が既に付着された、グリッドは、デバイスに追加される。
２）１次抗体は、グリッドに付着することを許容される（上の説明では、試料液としてグリッドに直接添加される）。
３）結合が起こると、ブロッキング液は、グリッド上に流される（例えば、ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン、又は粉ミルク）。
４）次いで、金粒子に結合された２次抗体は、流され、１次抗体の位置に結合し、したがってマークする。
５）最後に、結合されていない金粒子は、最後の洗浄ステップで洗い落とされる。
１）試料が既に付着された、グリッドは、デバイスに追加される。
２）１次抗体は、グリッドに付着することを許容される（上の説明では、試料液としてグリッドに直接添加される）。
３）結合が起こると、ブロッキング液は、グリッド上に流される（例えば、ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン、又は粉ミルク）。
４）次いで、金粒子に結合された２次抗体は、流され、１次抗体の位置に結合し、したがってマークする。
５）最後に、結合されていない金粒子は、最後の洗浄ステップで洗い落とされる。
【0125】
要約すると、自律型ＴＥＭ試料調製のための本発明の毛細管駆動シングルユースデバイスが提示された。オペレータのバイアス及びエラーを起こしやすい手動ステップを回避するために、本発明のデバイスは、ユーザとのインタラクションを最小限にするように設計される。重要な設計要素は、水溶性バルブ又はＰＶＡフィルムと吸収膜とを組み合わせた染色剤リザーバ及び試料リザーバである。これらの重要な要素は、一度のみのクリティカルでないユーザとのインタラクションで、自律型ＴＥＭグリッド調製の開始を可能にする。マイクロ流体の性能と試料調製の品質との両方のデバイスの一貫性は、実証されている。マイクロ流体の性能の一貫性は、同一に近いＴＥＭグリッド調製シーケンスを有する５台のマイクロ流体デバイスによって示された。試料調製の一貫性は、全てが十分に埋め込まれたＡＡＶ粒子を示す５枚のＴＥＭグリッドによって実証された。この調製の一貫性は、自動粒子検出の結果によってさらに強調された。９０％を上回る真陽性及び約５％の偽陽性のサブセット試験から、画像及び自律型試料調製は、画像解析に十分な品質を保持すると結論付けられた。２つのタンパク質試料の追加の調製は、より広い用途範囲のためのマイクロ流体デバイスの汎用性を実証した。さらに、マイクロ流体イベントのタイミングの調整可能性は、水溶性バルブ又はＰＶＡフィルムの厚さを変化することによって実証された。これは、異なる試料吸着要件を構成することが可能である。異なる染色時間を必要とするＴＥＭ試料調製を構成するために、本発明のデバイスは、第２の排出ユニットによって拡張され得る。結論として、実証された本発明のマイクロ流体デバイスは、手動ＴＥＭグリッド調製における人間の不整合と関連付けられた問題を軽減するために、有望で、効果的であり、信頼性のある解決策を提示する。
【0126】
本発明の蒸発配置は、重要であり、試料支持体は、適切な蒸発のために空気にさらされることである。別の態様は、開口部の幅と試料支持体の幅とが、ほぼ同じであるべきであることである。試料支持体の真上の湿度条件は、開口部の外側、すなわち、デバイスの上方の湿度よりも高い。試料支持体上の液体試料の液体境界では、湿度は、１００％であり、デバイスの外側の周囲空気の相対湿度は、より低く、開口部を通して染色剤層の液体の蒸発を促進する。第１の液体は、エッジを使用せずに、第１のリザーバに保持され得ることを理解されたい。２つの液体は、エッジの使用なしに、しかしながら、例えば、液滴のうちの１つに圧力をかけて接続し得る。しかしながら、エッジは、第１の液体が第２のリザーバに流入することを防止する。これは、エッジが２つのリザーバ間のチャネルにおいて不連続であり、チャネルの壁に沿った毛細管力の移動が停止されるからである。染色液などの、第１の液体は、エッジを使用せずに、第１のリザーバ、すなわち、染色剤リザーバに保持され得る。ピニングエッジは、液体を試料リザーバに添加する間、染色液を所定の位置に保持する、すなわち、染色液が試料リザーバに流入することを防止する。エッジと親水性の上面との間の第１の液体の膨張（膨出）は、有益であるが、必要ではない。それは、デバイスを、よりロバストにする。
【0127】
また、第１の液体を第１のリザーバに保持するために毛細管力を使用する必要はないことを理解されたい。好ましくは、しかしながら必ずしもそうではないが、デバイスは、第１のリザーバから第２のリザーバに向かうチャネルを有する。好ましくは、２つのリザーバは、流体連通しているべきであり、第１の液体は、第１のリザーバに保持されるべきである。好ましくは、しかしながら必ずしもそうではないが、第１のリザーバの第１の液体のこの閉じ込めは、第２の液体が、添加され、第１の液体に接続するときに容易に破壊される毛細管力及び／又は表面張力に基づいている。第１のリザーバが、第２のリザーバ及び吸い取りユニットと比較して、より高い高さにあることは必要ではない。３つのユニット全ては、同じ高さで共通の表面上に位置し得る。
【0128】
好ましくは、溶解性部材が試料支持体上の試料粒子の吸着のタイミングを決定するが、これはまた、異なる速度で液体を吸収する異なるフィルタを使用することによって調整され得る。例えば、小さい、幅の狭いフィルタは、吸着速度を落とす。マイクロチャネルにおける排出はまた、遅延機構及び排出速度の制御として機能する。また、試料粒子が試料支持体又はグリッドに付着するのに十分な時間を与えるために、最低速度又は一定の遅延時間を有することが必要であり得る。また、染色剤層を残すために、第１の液体（染色剤）を排出するとき、高速であることが必要であり得る。第１の液体の排出が遅すぎる場合、余分な染色剤は、粒子が保護されないまま排出されることとなる。これは、低品質の調製をもたらす。溶解性膜又はフィルムは、液体の流れを遅らせるが、膜が溶解されると、流量は、非常に遅い一定の流量とは対照的に、かなり速いことに留意されたい。
【0129】
本発明は、好ましい組成及び実施形態にしたがって説明されてきたが、特定の置換及び変更は、以下の請求項の趣旨及び範囲から逸脱することなく、行われ得ることを理解されたい。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図18】
【図19】
【図20】
【国際調査報告】