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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-05
(54)【発明の名称】遺伝子ノックアウトを有する哺乳動物細胞株
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230928BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230928BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20230928BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20230928BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12N5/10 ZNA
C12P21/00 A
C12N15/09 110
C12N15/113 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023518736
(86)(22)【出願日】2021-09-23
(85)【翻訳文提出日】2023-05-02
(86)【国際出願番号】 EP2021076165
(87)【国際公開番号】W WO2022063877
(87)【国際公開日】2022-03-31
(31)【優先権主張番号】20197946.5
(32)【優先日】2020-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】アオスレンダー サイモン
(72)【発明者】
【氏名】バウアー ニールス
(72)【発明者】
【氏名】オズワルド ベネディクト
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
(57)【要約】
本明細書では、異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を生成するための方法、及び前記組換え哺乳動物細胞を使用して異種ポリペプチドを生産するための方法であって、前記組換え細胞において少なくとも内因性遺伝子ＭＹＣの発現が低減されている、方法が報告される。哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞における少なくとも内因性遺伝子ＭＹＣのノックアウトが、細胞による組換え生産性を改善することが見出された。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも内因性遺伝子ＭＹＣの発現を低減させることによって、異種ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む組換え哺乳動物細胞の異種ポリペプチド発現を、同じ条件下で培養された、同一の遺伝子型を有するが前記発現の低減される遺伝子の内因性発現を有する哺乳動物細胞と比較して、増加させる方法。
【請求項2】
異種ポリペプチドを生産するための方法であって、ａ）前記異種ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程、及び
ｂ）前記細胞又は培養培地から前記異種ポリペプチドを回収する工程
を含み、
少なくとも内因性遺伝子ＭＹＣの発現が低減されている、
方法。
【請求項3】
改善された組換え生産性を有する組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、ａ）哺乳動物細胞中の内因性遺伝子ＭＹＣを標的とするヌクレアーゼ支援及び／又は核酸を適用して、前記内因性遺伝子の活性を低減させる工程、並びに
ｂ）前記内因性遺伝子の活性が低減されている哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それにより、同じ条件下で培養された、同一の遺伝子型を有するが前記遺伝子の内因性発現を有する哺乳動物細胞と比較して、組換え生産性が増加した組換え哺乳動物細胞を生産する、
方法。
【請求項4】
遺伝子ノックアウトが、ヘテロ接合性ノックアウト又はホモ接合性ノックアウトである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
改変された細胞の生産性が、前記遺伝子を除いて同じ遺伝子型を有する親哺乳動物細胞と比較して少なくとも１０％増加する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
遺伝子発現の前記低減が、ヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムによって媒介される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、又はメガヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
遺伝子発現の前記低減が、ＲＮＡサイレンシングによって媒介される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
ＲＮＡサイレンシングが、ｓｉＲＮＡ遺伝子ターゲティング及びノックダウン、ｓｈＲＮＡ遺伝子ターゲティング及びノックダウン、並びにｍｉＲＮＡ遺伝子ターゲティング及びノックダウンからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記異種ポリペプチドが抗体である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ノックアウトが、前記異種ポリペプチドをコードする前記外因性核酸の導入前、又は前記異種ポリペプチドをコードする前記外因性核酸の導入後に行われる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
内因性遺伝子ＳＩＲＴ－１及びＭＹＣの発現が低減されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、治療用抗体などの治療用ポリペプチドの組換え生産のための細胞株開発の分野にある。より詳細には、本明細書では、少なくとも１つの内因性遺伝子の機能的ノックアウトを有する哺乳動物細胞が報告されており、これは発現特性の改善をもたらす。
【背景技術】
【0002】
背景
哺乳類の宿主細胞株、特にＣＨＯ及びＨＥＫ細胞株は、供給タンパク質（例えば、抗原、受容体など）及び治療用分子（例えば、抗体、サイトカインなど）などの分泌タンパク質の組換え生産のために使用される。これらの宿主細胞株は、対応する治療用分子をコードする発現カセットを含むベクターでトランスフェクトされる。続いて、選択圧を加えることにより、安定したトランスフェクタントが選択される。これにより、個々のクローンからなる細胞プールができる。単一の細胞クローニングの工程において、これらのクローンが単離され、続いて様々なアッセイでスクリーニングされ、トッププロデューサー細胞が特定される。
哺乳類の宿主細胞株、特にＣＨＯ及びＨＥＫ細胞株は、供給タンパク質（例えば、抗原、受容体など）及び治療用分子（例えば、抗体、サイトカインなど）などの分泌タンパク質の組換え生産のために使用される。これらの宿主細胞株は、対応する治療用分子をコードする発現カセットを含むベクターでトランスフェクトされる。続いて、選択圧を加えることにより、安定したトランスフェクタントが選択される。これにより、個々のクローンからなる細胞プールができる。単一の細胞クローニングの工程において、これらのクローンが単離され、続いて様々なアッセイでスクリーニングされ、トッププロデューサー細胞が特定される。
【0003】
遺伝子工学的アプローチが、それらの特性、例えば、（ｉ）タンパク質の折り畳みと分泌を改善するための折り畳まれていないタンパク質応答経路に関与する内因性タンパク質の過剰発現（Ｇｕｌｉｓ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（２０１４）２６（非特許文献１））、（ｉｉ）細胞生存率を改善し、発酵プロセスを延長するための抗アポトーシスタンパク質の過剰発現（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１０（２０１３）２１９５－２２０７（非特許文献２））、（ｉｉｉ）細胞増殖と生産性を改善するためのｍｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡ分子の過剰発現（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１２（２０１５）３２－４３（非特許文献３））、（ｉｖ）治療用分子（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３（２００６）８５１－８６１（非特許文献４））及び他の多く（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３３（２０１５）１８７８－１８９６（非特許文献５））のグリコシル化パターンを調節するための糖酵素の過剰発現などを改善するために宿主細胞株に適用されてきた。
【0004】
さらに、内因性タンパク質のノックアウトは、細胞の特性を改善することが示されている。例としては、（ｉ）アポトーシス耐性の増加につながるＢＡＸ／ＢＡＫタンパク質のノックアウト（Ｃｏｓｔ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０５（２０１０）３３０－３４０（非特許文献６））、（ｉｉ）非フコシル化タンパク質を生成するためのＰＵＴＳのノックアウト（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７（２００４）６１４－６２２（非特許文献７））、（ｉｉｉ）ＧＳ選択システム（Ｆａｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０９（２０１２）１００７－１０１５（非特許文献８））及び他の多く（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３３（２０１５）１８７８－１８９６（非特許文献５））を使用して選択効率を高めるためのＧＳのノックアウトがある。ジンクフィンガー又はＴＡＬＥＮタンパク質が過去に主に使用されてきたが、最近ではノックアウトを目的としたゲノム配列の多用途かつシンプルなターゲティングのために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が確立されている。例えば、ｍｉＲＮＡ－７４４は、配列切除を可能にする複数のｇＲＮＡを使用することにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＣＨＯ細胞において標的とされた（Ｒａａｂ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．（２０１９）１８００４７７（非特許文献９））。
【0005】
米国特許出願公開第２００７／１６０５８６号（特許文献１）は、細胞の複製寿命を延長するための方法を開示している。
【0006】
欧州特許第３３０８７７８号（特許文献２）は、アルギニンとそのＴ細胞モジュレーターとしての使用を開示している。
【0007】
Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．らは、ＣＨＯ細胞におけるマイクロＲＮＡ－３０ファミリーによるタンパク質産生の亢進が、ユビキチン経路の調節によって媒介されることを開示している（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１２（２０１５）３２－４３（非特許文献３））。
【0008】
生産性を高める単一の内因性遺伝子のノックアウトは、宿主細胞株に導入されるその単純さのために非常に望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】米国特許出願公開第２００７／１６０５８６号
【特許文献2】欧州特許第３３０８７７８号
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ｇｕｌｉｓ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（２０１４）２６
【非特許文献2】Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１０（２０１３）２１９５－２２０７
【非特許文献3】Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１２（２０１５）３２－４３
【非特許文献4】Ｆｅｒｒａｒａ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３（２００６）８５１－８６１
【非特許文献5】Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３３（２０１５）１８７８－１８９６
【非特許文献6】Ｃｏｓｔ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０５（２０１０）３３０－３４０
【非特許文献7】Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７（２００４）６１４－６２２
【非特許文献8】Ｆａｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０９（２０１２）１００７－１０１５
【非特許文献9】Ｒａａｂ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．（２０１９）１８００４７７
【発明の概要】
【0011】
本発明による１つの独立した態様は、異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を生成するための方法及び前記組換え哺乳動物細胞を使用して異種ポリペプチドを生産するための方法であって、組換え哺乳動物細胞において、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる群から選択される内因性遺伝子の１つ又は複数、すなわち少なくとも１つの活性又は機能又は発現は、低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている。
【0012】
本発明は、少なくとも部分的には、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞における、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群からの少なくとも１つの遺伝子の機能的ノックアウトが、特に複雑な抗体フォーマットの組換え生産性を改善するという知見に基づく。
【0013】
本発明の場合、組換え哺乳動物細胞を生成するための一連の工程は決定的ではなく、すなわち、導入遺伝子が、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる群からの遺伝子の少なくとも１つの機能的ノックアウトの前に導入される場合、又は最初に機能的ノックアウトが行われ、その後、細胞が導入遺伝子でトランスフェクトされる場合である。すべての態様及び実施形態の好ましい一実施形態では、導入遺伝子、すなわち異種ポリペプチドをコードする核酸は、内因性遺伝子の機能的ノックアウトの前に導入される。特定の好ましい実施形態では、内因性遺伝子はＭＹＣ遺伝子である。
【0014】
本発明の１つの独立した態様は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の活性又は／及び機能又は／及び発現が低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている哺乳動物細胞である。特定の好ましい実施形態では、内因性遺伝子はＭＹＣ遺伝子である。
【0015】
本発明の１つの独立した態様は哺乳動物細胞であり、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の発現が低減されており、前記哺乳動物は、同じ条件下で培養された、同一の遺伝子型を有するがＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される前記少なくとも１つの内因性遺伝子のそれぞれの内因性遺伝子発現を有する細胞と比較して、異種ポリペプチドの生産性が増加している。特定の好ましい実施形態では、内因性遺伝子はＭＹＣ遺伝子である。
【0016】
本発明の１つの独立した態様は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の低減された発現を有し、外因性核酸、すなわち前記異種ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む、組換え哺乳動物細胞の異種ポリペプチド力価を、同じ条件下で培養された、同一の遺伝子型を有するがＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される前記少なくとも１つの内因性遺伝子の内因性遺伝子発現を有する細胞と比較して、増加させるための方法である。特定の好ましい実施形態では、内因性遺伝子はＭＹＣ遺伝子である。
【0017】
本発明の１つの独立した態様は、改善された組換え生産性を有する組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）哺乳動物細胞においてＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子を標的とするヌクレアーゼ支援及び／又は核酸を適用して、前記内因性遺伝子の活性を低減させる工程、及び
ｂ）内因性遺伝子の活性が低減されている哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それによって、同じ条件下で培養された、同一の遺伝子型を有するがＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される前記少なくとも１つの内因性遺伝子の内因性遺伝子発現を有する細胞と比較して、組換え生産性が増加した組換え哺乳動物細胞を生産する。特定の好ましい実施形態では、内因性遺伝子はＭＹＣ遺伝子である。
ａ）哺乳動物細胞においてＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子を標的とするヌクレアーゼ支援及び／又は核酸を適用して、前記内因性遺伝子の活性を低減させる工程、及び
ｂ）内因性遺伝子の活性が低減されている哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それによって、同じ条件下で培養された、同一の遺伝子型を有するがＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される前記少なくとも１つの内因性遺伝子の内因性遺伝子発現を有する細胞と比較して、組換え生産性が増加した組換え哺乳動物細胞を生産する。特定の好ましい実施形態では、内因性遺伝子はＭＹＣ遺伝子である。
【0018】
本発明の１つの独立した態様は、異種ポリペプチドを製造するための方法であって、以下の工程：
ａ）異種ポリペプチドをコードする外因性デオキシリボ核酸を含む組換え哺乳動物細胞を、任意に異種ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程、及び
ｂ）細胞又は培養培地から異種ポリペプチドを回収する工程
を含み、
前記哺乳動物細胞において、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の活性又は／及び機能又は／及び発現は、低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている。特定の好ましい実施形態では、内因性遺伝子はＭＹＣ遺伝子である。
ａ）異種ポリペプチドをコードする外因性デオキシリボ核酸を含む組換え哺乳動物細胞を、任意に異種ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程、及び
ｂ）細胞又は培養培地から異種ポリペプチドを回収する工程
を含み、
前記哺乳動物細胞において、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の活性又は／及び機能又は／及び発現は、低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている。特定の好ましい実施形態では、内因性遺伝子はＭＹＣ遺伝子である。
【0019】
本発明の別の独立した態様は、改善された及び／又は増加した組換え生産性を有する（ｈａｖｉｎｇ／ｗｉｔｈ）組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子を標的とする核酸又は酵素又はヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムを哺乳動物細胞に適用して、前記内因性遺伝子の活性又は／及び機能又は／及び発現を低減させる、又は除去する、又は減少させる、又は（完全に）ノックアウトする工程、及び
ｂ）前記内因性遺伝子の活性又は／及び機能又は／及び発現が低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それにより、改善された及び／又は増加した組換え生産性を有する（ｈａｖｉｎｇ／ｗｉｔｈ）組換え哺乳動物細胞を生産する、方法である。
ａ）ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子を標的とする核酸又は酵素又はヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムを哺乳動物細胞に適用して、前記内因性遺伝子の活性又は／及び機能又は／及び発現を低減させる、又は除去する、又は減少させる、又は（完全に）ノックアウトする工程、及び
ｂ）前記内因性遺伝子の活性又は／及び機能又は／及び発現が低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それにより、改善された及び／又は増加した組換え生産性を有する（ｈａｖｉｎｇ／ｗｉｔｈ）組換え哺乳動物細胞を生産する、方法である。
【0020】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の好ましい実施形態では、内因性遺伝子はＭＹＣ遺伝子である。
【0021】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、哺乳動物細胞は異種ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【0022】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、異種ポリペプチドをコードする核酸は、前記哺乳動物細胞において機能するプロモーター配列に作動可能に連結され、前記哺乳動物細胞において機能するポリアデニル化シグナルに作動可能に連結される。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、適切な培養条件下で培養した場合に異種ポリペプチドを分泌する。
【0023】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子のノックアウトは、ヘテロ接合ノックアウト又はホモ接合ノックアウトである。
【0024】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態において、ノックアウト細胞株の生産性は、同じ遺伝子型を有するがＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される前記少なくとも１つの内因性遺伝子が完全に機能的に発現するそれぞれの哺乳動物細胞と比較して、少なくとも５％、好ましくは１０％以上、最も好ましい２０％以上増加している。
【0025】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の低減又は除去又は減少又はノックアウトは、ヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムによって媒介される。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、及びメガヌクレアーゼからなる群から選択される。
【0026】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の発現の低減は、ＲＮＡサイレンシングによって媒介される。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシングは、ｓｉＲＮＡ遺伝子ターゲティング及びノックダウン、ｓｈＲＮＡ遺伝子ターゲティング及びノックダウン、並びにｍｉＲＮＡ遺伝子ターゲティング及びノックダウンからなる群から選択される。
【0027】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子のノックアウトは、ｉ）異種ポリペプチドをコードする外来性核酸の導入前、又はｉｉ）異種ポリペプチドをコードする外来性核酸の導入後に行われる。
【0028】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、異種ポリペプチドは抗体である。特定の実施形態では、抗体は、２つ以上の異なる結合部位及び任意にドメイン交換を含む抗体である。特定の実施形態では、抗体は、３つ以上の結合部位又はＶＨ／ＶＬペア又はＦａｂ断片、及び任意にドメイン交換を含む。特定の実施形態では、抗体は、多重特異性抗体である。
【0029】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＣＤＫ１２、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、及びＳＭＡＤ３からなる遺伝子群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、及びＣＤＫ１２からなる遺伝子の群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ及びＳＴＫ１１からなる遺伝子の群から選択される。好ましい一実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子はＭＹＣである。
【0030】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、組換え哺乳動物細胞において、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子並びにＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＣＤＫ１２、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、及びＳＭＡＤ３からなる群から選択される１つ又は複数、すなわち少なくとも１つのさらなる内因性遺伝子の活性又は機能又は発現は、低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている。特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、及びＣＤＫ１２からなる遺伝子の群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる内因性遺伝子は、ＭＹＣ及びＳＴＫ１１からなる遺伝子の群から選択される。好ましい一実施形態では、少なくとも１つのさらなる内因性遺伝子はＭＹＣであり、すなわち、内因性ＳＩＲＴ－１及び内因性ＭＹＣ遺伝子の活性又は機能又は発現は低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている。
【0031】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、異種ポリペプチドは、多重特異性抗体及び抗体－多量体融合ポリペプチドを含む異種ポリペプチドの群から選択される。特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、以下からなる群から選択される：
ｉ）第１のＦａｂ断片と第２のＦａｂ断片を含むドメイン交換を伴う完全長抗体であって、
第１のＦａｂ断片において、
ａ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨ及びＣＬドメインを含む；
ｂ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＨ１ドメインを含む；又は
ｃ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＬドメインを含む；
及び
第２のＦａｂ断片は、ＶＬ及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含む、完全長抗体；
ｉｉ）ドメイン交換及び追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体；
及び
－ １つの追加のＦａｂ断断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、１つの追加のＦａｂ断断片；を含み、
第２の抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片が、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられている、又はｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含むか、又はｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である、完全長抗体；
ｉｉｉ）第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む１アーム一本鎖抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメイン及び軽鎖カッパ又はラムダ定常ドメインを含む軽鎖；
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びノブ変異を有するＣＨ３を含む軽鎖／重鎖の組み合わせ；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール変異を有するＣＨ３ドメインを含む重鎖
を含む、１アーム一本鎖抗体；
ｉｖ）第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位、及び第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む、２アーム一本鎖抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びホール変異を有するＣＨ３を含む、軽鎖／重鎖の第１の組み合わせ；
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びノブ変異を有するＣＨ３ドメインを含む、軽鎖／重鎖の第２の組み合わせ
を含む、２アーム一本鎖抗体；
ｖ）第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む、共通軽鎖二重特異性抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む軽鎖；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール変異を有するＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖
を含む、共通軽鎖二重特異性抗体；
ｖｉ）ドメイン交換を伴う追加の重鎖Ｎ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 第１及び第２のＦａｂ断片であって、第１及び第２のＦａｂ断片の各結合部位が第１の抗原に特異的に結合する、第１及び第２のＦａｂ断片；
－ 第３のＦａｂ断片であって、第３のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合し、第３のＦａｂ断片が、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片；及び
－ 第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＦｃ領域
を含み；
第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片は、それぞれ、重鎖断片及び完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている、完全長抗体；
ｖｉｉ）完全長抗体と、任意にペプチドリンカーを介して互いにコンジュゲートした非免疫グロブリン部分とを含むイムノコンジュゲート、
及び
ｖｉｉｉ）抗体－多量体融合ポリペプチドであって、
（ａ）抗体重鎖及び抗体軽鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメイン又は抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、又は第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドとを含み、
（ｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ｂ）の第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ａ）の抗体軽鎖、及び（ｉｉｉ）（ｂ）の第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の第２の融合ポリペプチドが、それぞれ独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
抗体重鎖及び抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、抗体－多量体融合ポリペプチド。
ｉ）第１のＦａｂ断片と第２のＦａｂ断片を含むドメイン交換を伴う完全長抗体であって、
第１のＦａｂ断片において、
ａ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨ及びＣＬドメインを含む；
ｂ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＨ１ドメインを含む；又は
ｃ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＬドメインを含む；
及び
第２のＦａｂ断片は、ＶＬ及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含む、完全長抗体；
ｉｉ）ドメイン交換及び追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体；
及び
－ １つの追加のＦａｂ断断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、１つの追加のＦａｂ断断片；を含み、
第２の抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片が、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられている、又はｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含むか、又はｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である、完全長抗体；
ｉｉｉ）第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む１アーム一本鎖抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメイン及び軽鎖カッパ又はラムダ定常ドメインを含む軽鎖；
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びノブ変異を有するＣＨ３を含む軽鎖／重鎖の組み合わせ；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール変異を有するＣＨ３ドメインを含む重鎖
を含む、１アーム一本鎖抗体；
ｉｖ）第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位、及び第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む、２アーム一本鎖抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びホール変異を有するＣＨ３を含む、軽鎖／重鎖の第１の組み合わせ；
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びノブ変異を有するＣＨ３ドメインを含む、軽鎖／重鎖の第２の組み合わせ
を含む、２アーム一本鎖抗体；
ｖ）第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む、共通軽鎖二重特異性抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む軽鎖；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール変異を有するＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖
を含む、共通軽鎖二重特異性抗体；
ｖｉ）ドメイン交換を伴う追加の重鎖Ｎ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 第１及び第２のＦａｂ断片であって、第１及び第２のＦａｂ断片の各結合部位が第１の抗原に特異的に結合する、第１及び第２のＦａｂ断片；
－ 第３のＦａｂ断片であって、第３のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合し、第３のＦａｂ断片が、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片；及び
－ 第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＦｃ領域
を含み；
第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片は、それぞれ、重鎖断片及び完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている、完全長抗体；
ｖｉｉ）完全長抗体と、任意にペプチドリンカーを介して互いにコンジュゲートした非免疫グロブリン部分とを含むイムノコンジュゲート、
及び
ｖｉｉｉ）抗体－多量体融合ポリペプチドであって、
（ａ）抗体重鎖及び抗体軽鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメイン又は抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、又は第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドとを含み、
（ｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ｂ）の第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ａ）の抗体軽鎖、及び（ｉｉｉ）（ｂ）の第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の第２の融合ポリペプチドが、それぞれ独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
抗体重鎖及び抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、抗体－多量体融合ポリペプチド。
【0032】
特定の好ましい実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＣＤＫ１２、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、及びＳＭＡＤ３からなる遺伝子の群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、及びＣＤＫ１２からなる遺伝子の群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ及びＳＴＫ１１からなる遺伝子の群から選択される。好ましい一実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子はＭＹＣである。さらに好ましい一実施形態では、さらに、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性又は機能又は発現は低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている。
【0033】
特定の実施形態では、組換え哺乳動物細胞において、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子並びにＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＣＤＫ１２、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、及びＳＭＡＤ３からなる群から選択される１つ又は複数、すなわち少なくとも１つのさらなる内因性遺伝子の活性又は機能又は発現は、低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている。特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、及びＣＤＫ１２からなる遺伝子の群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる内因性遺伝子は、ＭＹＣ及びＳＴＫ１１からなる遺伝子の群から選択される。好ましい一実施形態では、少なくとも１つのさらなる内因性遺伝子はＭＹＣであり、すなわち、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子及び内因性ＭＹＣ遺伝子の活性又は機能又は発現は低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている。
【0034】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、及びＣＤＫＮ１Ａからなる遺伝子群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、及びＣＤＫ１２からなる遺伝子の群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、及びＰＰＰ２ＣＢからなる遺伝子の群から選択される。好ましい一実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子はＭＹＣである。
【0035】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、組換え哺乳動物細胞において、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子並びにＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、及びＣＤＫＮ１Ａからなる群から選択される１つ又は複数、すなわち少なくとも１つのさらなる内因性遺伝子の活性又は機能又は発現は、低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている。特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、及びＣＤＫ１２からなる遺伝子の群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、及びＰＰＰ２ＣＢからなる遺伝子の群から選択される。好ましい一実施形態では、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子及び内因性ＭＹＣ遺伝子の活性又は機能又は発現は低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている。
【0036】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、異種ポリペプチドは、抗体－多量体融合ポリペプチドであって、
（ａ）抗体重鎖及び抗体軽鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメイン又は抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、又は第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドとを含み、
（ｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ｂ）の第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ａ）の抗体軽鎖、及び（ｉｉｉ）（ｂ）の第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の第２の融合ポリペプチドが、それぞれ独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
抗体重鎖及び抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成する。
（ａ）抗体重鎖及び抗体軽鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメイン又は抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、又は第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドとを含み、
（ｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ｂ）の第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ａ）の抗体軽鎖、及び（ｉｉｉ）（ｂ）の第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の第２の融合ポリペプチドが、それぞれ独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
抗体重鎖及び抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成する。
【0037】
特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、及びＣＤＫＮ１Ａからなる遺伝子の群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、及びＣＤＫ１２からなる遺伝子の群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、及びＰＰＰ２ＣＢからなる遺伝子の群から選択される。好ましい一実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子はＭＹＣである。さらに好ましい一実施形態では、加えて、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性又は機能又は発現は低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている。
【0038】
特定の実施形態では、組換え哺乳動物細胞において、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子並びにＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、及びＣＤＫＮ１Ａからなる群から選択される１つ又は複数、すなわち少なくとも１つのさらなる内因性遺伝子の活性又は機能又は発現は、低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている。特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、及びＣＤＫ１２からなる遺伝子の群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、及びＰＰＰ２ＣＢからなる遺伝子の群から選択される。好ましい一実施形態では、少なくとも１つのさらなる内因性遺伝子はＭＹＣである。
【0039】
特定の従属の実施形態では、第１の融合ポリペプチドは、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分として、ペプチドリンカーによって互いに接続されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つの外部ドメイン又はその断片を含み、第２の融合ポリペプチドは、非抗体多量体ポリペプチドの第２部分として、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つの外部ドメイン又はその断片のみを含むか、又はその逆である。特定の実施形態では、第１の融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含み、第２の融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態では、非抗体多量体ポリペプチドの部分に隣り合うＣＬドメインにおいて、位置１２３のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）がアルギニン（Ｒ）によって置き換えられ、かつ位置１２４のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）がリジン（Ｋ）によって置換されており、非抗体多量体ポリペプチドの部分に隣り合うＣＨ１ドメインにおいて、位置１４７のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）及び位置２１３のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている。特定の実施形態では、抗体重鎖及び抗体軽鎖の可変ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群から選択される細胞表面抗原に特異的に結合する結合部位を形成する。特定の実施形態では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、ヒトＴ細胞活性化を共刺激する。特定の実施形態では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、４－１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。１つの好ましい実施形態において、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは４－１ＢＢＬであり、細胞表面抗原はＦＡＰ又はＣＤ１９又はＣＥＡである。
【0040】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、異種ポリペプチドは、二価の単特異的又は二重特異的完全長抗体及び非免疫グロブリン部分を含む融合ポリペプチドであり、抗体は、任意にペプチドリンカーを介して抗体の重鎖又は軽鎖の一方の単末端で非免疫グロブリン部分にコンジュゲートされる。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＣＤＫ１２、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＣＤＫ１２、ＰＡＲＰ－１、ＢＡＲＤ１、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、及びＣＲＥＢＢＰからなる遺伝子群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、及びＣＤＫ１２からなる遺伝子の群から選択される。好ましい一実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子はＭＹＣである。さらに好ましい一実施形態では、加えて、内因性ＳＩＲＴ－１遺伝子の活性又は機能又は発現は低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている。特定の実施形態では、異種ポリペプチドが、インターロイキン－２にコンジュゲートした抗ＰＤ－１抗体である。特定の実施形態では、インターロイキン－２は、望ましくないＣＤ２５媒介毒性及びＴｒｅｇ増殖を回避するために、ＩＬ－２Ｒａ（ＣＤ２５）への結合が消失した操作されたＩＬ２ｖ部分である。
【0041】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞又はＨＥＫ細胞である。好ましい一実施形態では、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞である。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、懸濁増殖哺乳動物細胞である。
【0042】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、異種ポリペプチドの生産性は、４日間のバッチ培養で決定される。特定の実施形態では、４日間のバッチ培養は、少なくとも１＊１０６細胞／ｍｌ（１０Ｅ６細胞／ｍｌ）の細胞密度で接種／開始される。特定の実施形態では、４日間のバッチ培養は、少なくとも２＊１０６細胞／ｍｌの細胞密度で接種／開始される。特定の実施形態では、４日間のバッチ培養は、少なくとも５＊１０６細胞／ｍｌの細胞密度で接種／開始される。特定の実施形態では、４日間のバッチ培養は、少なくとも１０＊１０６細胞／ｍｌの細胞密度で接種／開始される。特定の実施形態では、４日間のバッチ培養は、化学的に定義された無血清培地中で行われる。
【0043】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の従属の実施形態では、１つ、２つ又はそれを超える内因性遺伝子の低減又は除外又は減少又はノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムによるものである。好ましい一実施形態では、内因性遺伝子はＳＩＲＴ－１であり、配列番号１２、１３及び１４の３つのガイドＲＮＡが使用される。さらに好ましい一実施形態では、内因性遺伝子はＭＹＣであり、配列番号１５、１６及び１７の３つのガイドＲＮＡが使用される。特定の実施形態では、内因性遺伝子はＳＴＫ１１であり、配列番号１８、１９及び２０の３つのガイドＲＮＡが使用される。特定の実施形態では、内因性遺伝子はＳＭＡＤ４であり、配列番号２１、２２及び２３の３つのガイドＲＮＡが使用される。特定の実施形態では、内因性遺伝子はＰＰＰ２ＣＢであり、配列番号２４、２５及び２６の３つのガイドＲＮＡが使用される。特定の実施形態では、内因性遺伝子はＲＢＭ３８であり、配列番号２７、２８及び２９の３つのガイドＲＮＡが使用される。特定の実施形態では、内因性遺伝子はＮＦ１であり、配列番号３０、３１及び３２の３つのガイドＲＮＡが使用される。特定の実施形態では、内因性遺伝子はＣＤＫ１２であり、配列番号３３、３４及び３５の３つのガイドＲＮＡが使用される。特定の実施形態では、内因性遺伝子はＳＩＮ３Ａであり、配列番号３６、３７及び３８の３つのガイドＲＮＡが使用される。特定の実施形態では、内因性遺伝子はＰＡＲＰ－１であり、配列番号３９、４０及び４１の３つのガイドＲＮＡが使用される。特定の実施形態では、内因性遺伝子はＡＴＭであり、配列番号４２、４３及び４４の３つのガイドＲＮＡが使用される。特定の実施形態では、内因性遺伝子はＨｉｐｋ２であり、配列番号４５、４６及び４７の３つのガイドＲＮＡが使用される。特定の実施形態では、内因性遺伝子はＢＡＲＤ１であり、配列番号４８、４９及び５０の３つのガイドＲＮＡが使用される。特定の実施形態では、内因性遺伝子はＨＩＦ１ＡＮであり、配列番号５１、５２及び５３の３つのガイドＲＮＡが使用される。特定の実施形態では、内因性遺伝子はＳＭＡＤ３であり、配列番号５４、５５及び５６の３つのガイドＲＮＡが使用される。特定の実施形態では、内因性遺伝子はＣＤＫＮ１Ａであり、配列番号５７、５８及び５９の３つのガイドＲＮＡが使用される。
【0044】
描写され、特許請求される様々な実施形態に加えて、本開示の主題は、本明細書に開示され、特許請求される特徴の他の組合せを有する他の実施形態も対象とする。したがって、本明細書に提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組合せを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組合せられても良い。本開示の主題の特定の実施形態の前述の説明は、例示及び説明目的のために提示されている。包括的であるようにも本開示の主題を開示される実施形態に限定するようにも意図されていない。
【発明を実施するための形態】
【0045】
発明の態様の詳細な説明
異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を生成するための方法及び前記組換え哺乳動物細胞を使用して異種ポリペプチドを生産するための方法が本明細書において報告され、組換え細胞において、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される内因性遺伝子の少なくとも１つの活性／機能／発現は、低減／除去／減少／（完全に）ノックアウトされている。
異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を生成するための方法及び前記組換え哺乳動物細胞を使用して異種ポリペプチドを生産するための方法が本明細書において報告され、組換え細胞において、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される内因性遺伝子の少なくとも１つの活性／機能／発現は、低減／除去／減少／（完全に）ノックアウトされている。
【0046】
本発明は、少なくとも部分的には、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞における、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子のノックアウトが、標準的なＩｇＧ型抗体の、特に複雑な抗体フォーマットの組換え生産性を改善するという知見に基づく。
【0047】
Ｉ．一般的な定義
本発明を実施するための有用な方法及び技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉ～ＩＩＩ巻（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ巻及びＩＩ巻（１９８５），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ．），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。
本発明を実施するための有用な方法及び技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉ～ＩＩＩ巻（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ巻及びＩＩ巻（１９８５），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ．），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。
【0048】
組換えＤＮＡ技術を使用することにより、核酸の誘導体の作製が可能になる。このような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失又は挿入によって、個々の又はいくつかのヌクレオチド位置で修飾することができる。修飾又は誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって行うことができる。このような修飾は、当業者によって容易に行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照）。
【0049】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈において特に明白な規定がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のそのような細胞、及び当業者に公知であるその等価物を含み、他も同様である。同様に、用語「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ又は複数の」、及び「少なくとも１つの」も、本明細書において同義的に使用され得る。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」が同義的に使用され得ることにも留意すべきである。
【0050】
用語「約」は、その後に続く数値の±２０％の範囲を意味する。特定の実施形態では、「約」という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を意味する。特定の実施形態では、「約」という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を意味する。
【0051】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も含む。
【0052】
本明細書で使用される「組換え哺乳動物細胞」という用語は、ポリペプチドを発現することができる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を意味する。そのような組換え哺乳動物細胞は、そのような細胞の子孫を含む、１つ以上の外因性核酸（複数可）が導入された細胞である。したがって、「異種ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞」という用語は、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ、異種ポリペプチドを発現することができる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞を意味する。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞であり、この外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１及び第２の組換え認識配列、並びに第１と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列は全て異なっている。
【0053】
本明細書で使用される「組換え細胞」という用語は、遺伝子修飾後の細胞、例えば、目的の異種ポリペプチドを発現し、該目的のポリペプチドの任意の規模での生産のために使用できる細胞などを意味する。例えば、「外因性ヌクレオチド配列を含む組換え哺乳動物細胞」は、目的の異種ポリペプチドのコード配列が宿主細胞のゲノムに導入されている細胞を意味する。例えば、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）に供され、それによって目的のポリペプチドのコード配列が宿主細胞のゲノム中に導入された「外因性ヌクレオチド配列を含む組換え哺乳動物細胞」は、「組換え細胞」である。
【0054】
「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」及び「組換え細胞」はどちらも、「形質転換細胞」である。この用語は、継代の回数に関わらず、初代形質転換細胞も、それに由来する子孫も含む。子孫は、例えば、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではなくてもよいが、突然変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物活性を有している突然変異子孫は、包含される。
【0055】
「単離された」組成物とは、その天然環境の成分から分離された組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動、ＣＥ－ＳＤＳ）又はクロマトグラフィ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィ又はイオン交換若しくは逆相ＨＰＬＣ）によって測定した場合に９５％又は９９％を超える純度まで精製される。抗体の純度を評価するための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ ８４８（２００７）７９－８７を参照されたい。
【0056】
「単離された」核酸は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外、又は天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【0057】
「単離された」ポリペプチド又は抗体とは、その天然環境の成分から分離されたポリペプチド分子又は抗体分子を意味する。
【0058】
用語「組込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、細胞ゲノム内の核酸配列を意味する。特定の実施形態において、組込み部位は、細胞ゲノム中の隣り合う２つのヌクレオチドの間にある。特定の実施形態において、組込み部位は、ヌクレオチド配列のストレッチを含む。特定の実施形態において、組込み部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置している。特定の実施形態において、組込み部位は、哺乳動物細胞の内因性遺伝子内にある。
【0059】
用語「ベクター」又は「プラスミド」は、同義的に用いることができ、本明細書において使用される場合、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を意味する。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【0060】
用語「に結合する」は、ある結合部位のその標的への結合、例えば、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含む抗体結合部位などの、各抗原への結合を意味する。この結合は、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定することができる。すなわち、用語「（抗原に）結合する」は、インビトロアッセイでの、抗体のその抗原への結合を意味する。特定の実施形態において、結合は、抗体を表面に結合し、その抗体への抗原の結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定する結合アッセイにおいて、測定される。用語「結合する」は、用語「特異的に結合する」も含む。
【0061】
例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイの１つの可能な実施形態では、抗原が表面に結合され、抗体、すなわちその結合部位（複数可）の結合が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される。結合親和性は、用語ｋａ（結合定数：複合体を形成する結合についての速度定数）、ｋｄ（解離定数；複合体の解離についての速度定数）、及びＫＤ（ｋｄ／ｋａ）に基づいて定義される。あるいは、ＳＰＲセンサーグラムの結合シグナルを、共鳴シグナルの高さ及び解離挙動に関して、参照物の応答シグナルと直接比較することもできる。
【0062】
用語「結合部位」は、標的に対して結合特異性を示す任意のタンパク質性実体を意味する。これは、例えば、受容体、受容体リガンド、アンチカリン、アフィボディ、抗体などであり得る。したがって、本明細書で使用される「結合部位」という用語は、第２のポリペプチドに特異的に結合することができるか、又は第２のポリペプチドによって特異的に結合されることのできる、ポリペプチドを意味する。
【0063】
本明細書において使用される場合、用語「選択マーカー」は、その遺伝子を有する細胞が、対応する選択剤の存在下でポジティブ又はネガティブに特異的に選択されることを可能にする遺伝子を意味する。例えば、限定するわけではないが、選択マーカーにより、その選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、各選択剤の存在下（選択的培養条件下）で、ポジティブに選択されることが可能になり得る；形質転換されていない宿主細胞は、選択的培養条件下で増殖することも生存することもできないと考えられる。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、又は二機能性であってよい。ポジティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞の選択が可能になり得るのに対し、ネガティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞を選択的に排除することが可能になり得る。選択マーカーは、宿主細胞において薬物に対する耐性を付与することができるか、又は代謝若しくは異化の欠陥を補うことができる。原核細胞においては、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、又はクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を使用することができる。真核細胞において選択マーカーとして有用な耐性遺伝子としては、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ））の遺伝子、並びにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。さらなるマーカー遺伝子は、国際公開第９２／０８７９６号及び国際公開第９４／２８１４３号に記載されている。
【0064】
対応する選択剤の存在下での選択を容易にすることを超えて、選択マーカーは、別法として、普通は細胞に存在しない分子、例えば、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光性タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅであってよい。例えば、コードされるポリペプチドが発する蛍光の検出又は不在にそれぞれ基づいて、そのような分子を発現する細胞を、この遺伝子を内部に持たない細胞と区別することができる。
【0065】
本明細書において使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、目的の様式でそれらが機能することを可能にする関係にある、２つ以上の成分の近接した配置を意味する。例えば、プロモーター及び／又はエンハンサーがコード配列の転写を調節する役割を果たす場合、そのプロモーター及び／又はエンハンサーはコード配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、「作動可能に連結されて」いるＤＮＡ配列は、単一の染色体上で近接し、隣り合っている。特定の実施形態では、例えば、１つの分泌リーダーと１つのポリペプチドといった２つのタンパク質のコード領域を結合する必要があるとき、これら配列は近接し、隣り合い、かつ同じリーディングフレームに存在する。特定の実施形態では、作動可能に連結されたプロモーターは、コード配列の上流に位置しており、かつコード配列に隣り合うことができる。特定の実施形態では、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、２つの成分は、隣り合ってはいないが、作動可能に連結され得る。エンハンサーがコード配列の転写を増大させる場合、エンハンサーはコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部、又は下流に位置してよく、かつコード配列のプロモーターからかなり離れて位置してよい。作動可能な連結は、当該技術分野で公知の組換え法によって、例えば、ＰＣＲ方法を用いて、かつ／又は好都合な制限部位でのライゲーションによって、達成することができる。好都合な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを従来の手順に従って使用することができる。内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）は、それが５’末端に非依存的な方法により内部位置でＯＲＦの翻訳を開始できる場合、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結されている。
【0066】
本明細書において使用される場合、用語「外因性」は、あるヌクレオチド配列が特定の細胞に由来せず、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、又は形質転換法によって該細胞に導入されることを示す。したがって、外因性ヌクレオチド配列は人工配列であり、この人工物は、例えば、起源が異なる部分配列の組合せ（例えば、ＳＶ４０プロモーターを有するリコンビナーゼ認識配列と緑色蛍光性タンパク質のコード配列との組合せは、人工核酸である）から、又は配列（例えば、膜結合型受容体の細胞外ドメインのみをコードする配列若しくはｃＤＮＡ）の部分的な欠失若しくは核酸塩基の突然変異から、生じ得る。用語「内因性」は、細胞に由来するヌクレオチド配列を意味する。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成が同一である「内因性」対応物を有し得るが、「外因性」配列は、例えば組換えＤＮＡ技術によって細胞に導入されている。
【0067】
本明細書において使用される場合、「異種」という用語は、あるポリペプチドが特定の細胞に由来せず、それぞれのコードする核酸が、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、又は形質転換法によって当該細胞に導入されることを示す。したがって、異種ポリペプチドは、それを発現する細胞に対して人工的なポリペプチドであり、そのため、そのポリペプチドが異なる細胞／生物に由来する天然に存在するポリペプチドであるか、又は人工ポリペプチドであるかどうかに依存しない。
【0068】
本特許出願では以下の内因性遺伝子を使用した：
【0069】
「サーチュイン－１」という用語は、哺乳動物におけるシグナル伝達の一部である酵素、すなわち、ＮＡＤ依存性デアセチラーゼサーチュイン－１を意味する。サーチュイン－１はＳＩＲＴ－１遺伝子によってコードされる。ヒトサーチュイン－１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリＱ９６ＥＢ６を有する。チャイニーズハムスターサーチュイン－１は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリＡ０Ａ３Ｌ７ＩＦ９６を有する。ＳＩＲＴ－１ノックアウトの効果は、参照により本明細書に明示的に組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６７５７９に記載されている。
【0070】
ＩＩ．抗体
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられる。
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられる。
【0071】
本明細書において使用される場合、重鎖及び軽鎖のすべての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）において説明されるＫａｂａｔナンバリングシステムによりナンバリングされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによるナンバリング」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔナンバリングシステム（６４７～６６０ページを参照されたい）は、カッパアイソタイプ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３ページを参照されたい）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３であって、本明細書では、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング」と称することによってさらに明確にしている）に使用される。
【0072】
本明細書での「抗体」という用語は、最も広義に使用され、全長抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体－抗体断片－融合物並びにそれらの組み合わせを含む様々な抗体構造を包含するが、これらに限定されない。
【0073】
「天然抗体」という用語は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）とそれに続く３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有し、それにより、第１の重鎖定常ドメインと第２の重鎖定常ドメインとの間にヒンジ領域が配置される。同様に、ＮからＣ末端に、各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）とそれに続く軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。
【0074】
「完全長抗体」という用語は、天然抗体の構造と実質的に類似した構造を有する抗体を意味する。完全長抗体は、それぞれがＮ末端からＣ末端の方向に、軽鎖可変領域及び軽鎖定常ドメインを含む２つの完全長抗体軽鎖、並びにそれぞれがＮ末端からＣ末端の方向に、重鎖可変領域、第１の重鎖定常ドメイン、ヒンジ領域、第２の重鎖定常ドメイン、及び第３の重鎖定常ドメインを含む、２つの完全長抗体重鎖を含む。天然抗体とは対照的に、全長抗体は、１つ若しくは複数の追加のｓｃＦｖ、又は重鎖若しくは軽鎖Ｆａｂ断片、又は、全長抗体の異なる鎖の１つ若しくは複数の末端にコンジュゲートしているが各末端には１つの断片のみであるｓｃＦａｂなどのさらなる免疫グロブリンドメインを含んでもよい。これらのコンジュゲートもまた、完全長抗体という用語により包含される。
【0075】
「抗体結合部位」という用語は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの対を意味する。抗原への適切な結合を確実にするために、これらの可変ドメインは同族の可変ドメインであり、すなわち一緒に属する。抗体の結合部位は、少なくとも３つのＨＶＲ（例えば、ＶＨＨの場合）又は３～６つのＨＶＲ（例えば、天然に存在する、すなわち、ＶＨ／ＶＬペアを有する従来の抗体の場合）を含む。一般に、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基が、結合部位を形成している。これらの残基は通常、抗体重鎖可変ドメインと対応する抗体軽鎖可変ドメインのペアに含まれる。抗体の抗原結合部位は、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、ＮからＣ末端に向けて、領域ＦＲ１、ＨＶＲ１、ＦＲ２、ＨＶＲ２、ＦＲ３、ＨＶＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖可変ドメインのＨＶＲ３領域は、抗原結合に最も寄与し、抗体の結合特異性を定義する領域である。「機能的結合部位」は、その標的に特異的に結合することができる。「特異的に結合する」という用語は、インビトロアッセイにおいて、特定の実施形態では結合アッセイにおいて、その標的への結合部位の結合を表す。そのような結合アッセイは、結合イベントが検出され得る限り、任意のアッセイであり得る。例えば、抗体を表面に結合させ、該抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、結合アッセイである。あるいは、ブリッジングＥＬＩＳＡを使用することができる。
【0076】
「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、超可変的な配列（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）であり、及び／又は構造的に定義されるループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原に接触する残基（「抗原接触」）を含有するアミノ酸残基ストレッチを含む、抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、重鎖可変ドメインＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、軽鎖可変ドメインＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。
【0077】
ＨＶＲには、次のものが含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）９０１－９１７）、
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２）、
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）及び９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２～７４５（１９９６））；並びに
（ｄ）アミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）、及び９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組合せ。
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）９０１－９１７）、
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２）、
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）及び９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２～７４５（１９９６））；並びに
（ｄ）アミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）、及び９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組合せ。
【0078】
別段の指示がない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、上記のＫａｂａｔらに従ってナンバリングされている。
【0079】
抗体の「クラス」は、定常ドメイン又は定常領域、好ましくは重鎖が持つＦｃ領域の種類を指す。抗体には、次の５種類の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかを、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【0080】
「重鎖定常領域」という用語は、定常ドメイン、すなわち、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖の領域を意味する。特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ定常領域は、重鎖のＡｌａ１１８からカルボキシル末端に及ぶ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。しかし、定常領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、又は存在していなくてもよい（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。「定常領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる２つの重鎖定常領域を含む二量体を意味する。
【0081】
「重鎖Ｆｃ領域」という用語は、少なくともヒンジ領域の一部、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ａｓｐ２２１又はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端に及ぶ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。したがって、Ｆｃ領域は定常領域よりも小さいが、Ｃ末端部分はそれと同一である。しかしながら、重鎖Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよく、又は存在しなくてもよい（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。「Ｆｃ領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる２つの重鎖Ｆｃ領域を含む二量体を意味する。
【0082】
抗体の定常領域、より正確にはＦｃ領域（及び同様に定常領域）は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、Ｃ３活性化、及びＦｃ受容体結合に直接関与している。補体系に対する抗体の影響は、特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ領域における規定の結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は、先行技術で公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５－２５６０、Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．及びＣｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７－９１７、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８－３４４、Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５－１００４、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８－４１８４、Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１－１２１６８、Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９－３２４、及びＥＰ０３０７４３４において記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３の抗体は通常、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、及びＣ３活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑと結合せず、Ｃ３を活性化しない。「抗体のＦｃ領域」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて規定される。
【0083】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、又はモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得るバリアント抗体は例外であり、かかるバリアントは一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない種々の技術によって作製されてもよい。
【0084】
「価数」との用語は、本出願で使用される場合、抗体内の特定数の結合部位の存在を示す。したがって、「二価」、「四価」及び「六価」との用語は、抗体内のそれぞれ２個の結合部位、４個の結合部位及び６個の結合部位の存在を示す。
【0085】
「単一特異性抗体」は、単一の結合特異性を有する、すなわち、１つの抗原に特異的に結合する抗体を意味する。単一特異性抗体を、全長抗体若しくは抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）又はそれらの組合せ（例えば、全長抗体と追加のｓｃＦｖ又はＦａｂ断片）として調製することができる。単一特異性抗体は、一価である必要はない。すなわち、単一特異性抗体は、１つの抗原に特異的に結合する１つを超える結合部位を含んでもよい。例えば、天然抗体は、単一特異性であるが二価である。
【0086】
「多重特異性抗体」は、同じ抗原又は２つの異なる抗原上の少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を表す。多重特異性抗体を、全長抗体若しくは抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）又はそれらの組合せ（例えば、全長抗体と追加のｓｃＦｖ又はＦａｂ断片）として調製することができる。多重特異性抗体は、少なくとも二価であり、すなわち、２つの抗原結合部位を含む。さらに、多重特異性抗体は、少なくとも二重特異性である。したがって、二価の二重特異性抗体は、多重特異性抗体の最も単純な形態である。２つ、３つ又はより多く（例えば、４つ）の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体が報告されている（例えば、ＵＳ ２００２／０００４５８７を参照）。
【0087】
特定の実施形態において、抗体は、多重特異性抗体、例えば、少なくとも二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原又はエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、結合特異性の１つは第一の抗原に対するものであり、他は、異なる第二の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。多重特異性抗体を使用して、抗原を発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させることもできる。
【0088】
多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体－抗体断片－融合物として調製することができる。
【0089】
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．及びＣｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ３０５（１９８３）５３７－５４０、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０（１９９１）３６５５－３６５９を参照されたい）、及び「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の改変（国際公開第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体若しくは断片の架橋（例えば、米国特許第４６７６９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（１９８５）８１－８３を参照のこと）；ロイシンジッパーを使用した二重特異的抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（１９９２）１５４７－１５５３を参照のこと）；軽鎖のミスペアリング問題を回避するための、一般的な軽鎖技術の使用（例えば国際公開第９８／５０４３１号を参照のこと）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）６４４４－６４４８を参照のこと）；及び、例えばＴｕｔｔ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）６０－６９に記載されている三重特異的抗体の調製により作製することができる。
【0090】
例えば、「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む３つ以上の抗原結合部位を有する操作された抗体、又はＤＶＤ－Ｉｇも本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号及び国際公開第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、ＷＯ ２０１０／１１５５８９、ＷＯ ２０１０／１１２１９３、ＷＯ ２０１０／１３６１７２、ＷＯ ２０１０／１４５７９２、及びＷＯ ２０１３／０２６８３１に見出すことができる。二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、「二重作用Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」もまた含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号及び国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照のこと）。
【0091】
多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の１つ又は複数の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称の形で、すなわちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号及び国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（国際公開第２００９／０８０２５３号を参照）又は完全なＦａｂアーム（国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８（２０１１）１１８７－１１９１、及びＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－１０２０も参照）を交換することによっても提供され得る。一態様では、多重特異性抗体はクロスＦａｂ断片を含む。「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域１（ＣＨ１）とで構成されるポリペプチド鎖、及び重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Ｆａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸突然変異をドメインインターフェースに導入して正しいＦａｂペアリングを指示することによって操作することもできる。例えば、ＷＯ ２０１６／１７２４８５を参照。
【0092】
抗体又は断片はまた、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号又は国際公開第２０１０／１４５７９３号に記載されている多重特異性抗体であり得る。
【0093】
抗体又はその断片はまた、ＷＯ２０１２／１６３５２０に開示されるような多重特異性抗体であってもよい。
【0094】
多重特異性抗体の様々なさらなる分子フォーマットが当技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）９５－１０６を参照のこと）。
【0095】
二重特異性抗体は、一般に、同じ抗原上の２つの異なる重複しないエピトープ又は異なる抗原上の２つのエピトープに特異的に結合する抗体分子である。
【0096】
複合体（多重特異性）抗体は
－ ドメイン交換を伴う完全長抗体：
第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片を含む多重特異性ＩｇＧ抗体であって、第１のＦａｂ断片において、
ａ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインのみが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨドメイン及びＣＬドメインを含む）；
ｂ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインのみが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨドメイン及びＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含む）；又は
ｃ）ＣＨ１とＣＬドメインが互いに置き換えられ、ＶＨ及びＶＬドメインが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＬドメインを含む）；及び
第２のＦａｂ断片は、ＶＬ及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含む；
ドメイン交換を伴う完全長抗体は、ＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖と、ＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖とを含み得、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号又は国際公開第２０１３／０９６２９１号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、第１重鎖及び修飾された第２重鎖のヘテロ二量体化を支援するために、両ＣＨ３ドメインは、それぞれのアミノ酸置換によって、相補的な様式で操作されている；
－ ドメイン交換及び追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する完全長抗体：
多重特異性ＩｇＧ抗体であって、
ａ）完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体、及び
ｂ）１つの追加のＦａｂ断断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、１つの追加のＦａｂ断断片、を含み、
第２の抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片が、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられている、又はｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含むか、又はｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である、多重特異性ＩｇＧ抗体；
－ １アーム一本鎖フォーマット（＝１アーム一本鎖抗体）：
第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖カッパ定常ドメイン）
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）；
－ ２アーム一本鎖フォーマット（＝２アーム一本鎖抗体）：
第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－ 軽鎖／重鎖１の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 軽鎖／重鎖２の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ 一般的な軽鎖二重特異性フォーマット（＝一般的な軽鎖二重特異性抗体）：
第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン）
－ 重鎖１（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖２（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ Ｔ細胞二重特異性フォーマット：
ドメイン交換を伴う追加の重鎖Ｎ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 第１及び第２のＦａｂ断片であって、第１及び第２のＦａｂ断片の各結合部位が第１の抗原に特異的に結合する、第１及び第２のＦａｂ断片、
－ 第３のＦａｂ断片であって、第３のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合し、第３のＦａｂ断片が、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片；及び
－ Ｆｃ領域であって、第１のＦｃ領域のポリペプチドと第２のＦｃ領域のポリペプチドとを含む、Ｆｃ領域を含み、
第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片は、それぞれ、重鎖断片及び完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている、完全長抗体；
－ 抗体－多量体－融合物であって、
（ａ）抗体重鎖及び抗体軽鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメイン又は抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、又は第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドとを含み、
（ｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ｂ）の第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ａ）の抗体軽鎖、及び（ｉｉｉ）（ｂ）の第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の第２の融合ポリペプチドが、それぞれ独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
抗体重鎖及び抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、抗体－多量体－融合物
である。
－ ドメイン交換を伴う完全長抗体：
第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片を含む多重特異性ＩｇＧ抗体であって、第１のＦａｂ断片において、
ａ）ＣＨ１ドメインとＣＬドメインのみが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨドメイン及びＣＬドメインを含む）；
ｂ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインのみが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨドメイン及びＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含む）；又は
ｃ）ＣＨ１とＣＬドメインが互いに置き換えられ、ＶＨ及びＶＬドメインが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＬドメインを含む）；及び
第２のＦａｂ断片は、ＶＬ及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含む；
ドメイン交換を伴う完全長抗体は、ＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖と、ＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖とを含み得、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号又は国際公開第２０１３／０９６２９１号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、第１重鎖及び修飾された第２重鎖のヘテロ二量体化を支援するために、両ＣＨ３ドメインは、それぞれのアミノ酸置換によって、相補的な様式で操作されている；
－ ドメイン交換及び追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する完全長抗体：
多重特異性ＩｇＧ抗体であって、
ａ）完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体、及び
ｂ）１つの追加のＦａｂ断断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、１つの追加のＦａｂ断断片、を含み、
第２の抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片が、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられている、又はｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含むか、又はｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である、多重特異性ＩｇＧ抗体；
－ １アーム一本鎖フォーマット（＝１アーム一本鎖抗体）：
第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖カッパ定常ドメイン）
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）；
－ ２アーム一本鎖フォーマット（＝２アーム一本鎖抗体）：
第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－ 軽鎖／重鎖１の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 軽鎖／重鎖２の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ 一般的な軽鎖二重特異性フォーマット（＝一般的な軽鎖二重特異性抗体）：
第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン）
－ 重鎖１（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖２（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ Ｔ細胞二重特異性フォーマット：
ドメイン交換を伴う追加の重鎖Ｎ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 第１及び第２のＦａｂ断片であって、第１及び第２のＦａｂ断片の各結合部位が第１の抗原に特異的に結合する、第１及び第２のＦａｂ断片、
－ 第３のＦａｂ断片であって、第３のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合し、第３のＦａｂ断片が、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片；及び
－ Ｆｃ領域であって、第１のＦｃ領域のポリペプチドと第２のＦｃ領域のポリペプチドとを含む、Ｆｃ領域を含み、
第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片は、それぞれ、重鎖断片及び完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている、完全長抗体；
－ 抗体－多量体－融合物であって、
（ａ）抗体重鎖及び抗体軽鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメイン又は抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、又は第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドとを含み、
（ｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ｂ）の第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ａ）の抗体軽鎖、及び（ｉｉｉ）（ｂ）の第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の第２の融合ポリペプチドが、それぞれ独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
抗体重鎖及び抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、抗体－多量体－融合物
である。
【0097】
「ノブ・イントゥー・ホール」二量体化モジュール及び抗体操作におけるその使用は、Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．；Ｒｉｄｇｗａｙ Ｊ．Ｂ．Ｂ．；Ｐｒｅｓｔａ Ｌ．Ｇ．：Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｎｕｍｂｅｒ １，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９９６，ｐｐ．７３－７３（１）に記載されている。
【0098】
抗体の重鎖のＣＨ３ドメインを、「ノブ・イントゥー・ホール」技術によって改変することができる。例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１；及びＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１に、いくつかの例を伴って詳細に記載されている。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を改変して、これら２つのＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を増加させ、それによってそれらを含むポリペプチドのヘテロ二量体化を増加させる。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインのそれぞれは「ノブ」であることができ、他方は「ホール」である。ジスルフィドブリッジの導入はさらに、ヘテロ二量体を安定化させ（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１；Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６－３５）、収率を増加させる。
【0099】
（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｗは、「ノブ変異」又は「変異ノブ」として表され、（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖは、「ホール変異」又は「変異ホール」として表される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）。ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１）も、例えば、「ノブ変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ変異を導入（「ノブ－ｃｙｓ－変異」又は「変異ノブ－ｃｙｓ」と表記）すること、及び「ホール変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異を導入（「ホール－ｃｙｓ－変異」又は「変異ホール－ｃｙｓ」と表記）することにより、使用できる（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）。
【0100】
「ドメインクロスオーバー」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１断片とその対応する同族の抗体軽鎖とのペアにおいて、すなわち抗体Ｆａｂ（断片－抗原結合）において、少なくとも１つの重鎖ドメインが、その対応する軽鎖ドメインによって置換されており、その逆も同様である、という点について、ドメイン配列が天然抗体の配列から逸脱していることを表す。ドメインクロスオーバーは、一般的に３種類あり、（ｉ）ＣＨ１及びＣＬドメインのクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列（又はＶＨ－ＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン配列を有する全長抗体重鎖）がもたらされるもの、（ｉｉ）ＶＨ及びＶＬドメインのドメインクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされるもの、並びに（ｉｉｉ）完全な軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）及び完全なＶＨ－ＣＨ１重鎖断片のドメインクロスオーバー（「Ｆａｂクロスオーバー」）であって、ドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＨ１ドメイン配列を有する軽鎖がもたらされ、ドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＬドメイン配列を有する重鎖断片がもたらされるもの（上述のすべてのドメイン配列は、Ｎ末端からＣ末端への方向で示されている）がある。
【0101】
本明細書で使用される場合、対応する重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられた」という用語は、上述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、ＣＨ１及びＣＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目（ｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバー、並びに結果として生じる重鎖及び軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、ＶＨ及びＶＬが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目（ｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指し、またＣＨ１及びＣＬドメインが「互いに置き換えられ」、かつＶＨ及びＶＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指す。ドメインクロスオーバーを含む二重特異性抗体は、例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、及びＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８（２０１１）１１１８７－１１１９２において報告されている。このような抗体は、一般にＣｒｏｓｓＭａｂと呼ばれる。
【0102】
多重特異性抗体はまた、一実施形態では、上記の項目（ｉ）で述べたＣＨ１及びＣＬドメインのドメインクロスオーバー、又は上記の項目（ｉｉ）で述べたＶＨ及びＶＬドメインのドメインクロスオーバー、又は上記の項目（ｉｉｉ）で述べたＶＨ－ＣＨ１及びＶＬ－ＶＬドメインのドメインクロスオーバーのいずれかを含む、少なくとも１つのＦａｂ断片を含む。ドメインクロスオーバーを伴う多重特異性抗体の場合、同じ抗原に特異的に結合するＦａｂは、同じドメイン配列であるように構築される。そのため、ドメインクロスオーバーを伴う１つを超えるＦａｂが、多重特異性抗体に含まれる場合、Ｆａｂは、同じ抗原に特異的に結合する。
【0103】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基、及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、それにおいて、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【0104】
「組換え抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、組換え細胞などの組換え手段により調製、発現、作製又は単離された全ての抗体（キメラ、ヒト化及びヒト）を表す。これには、ＮＳ０、ＨＥＫ、ＢＨＫ、羊膜細胞、ＣＨＯ細胞などの組換え細胞から単離された抗体が含まれる。
【0105】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指し、すなわちそれは、機能的な断片である。抗体断片の例としては、以下に限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性Ｆａｂ、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂ）が挙げられる。
【0106】
ＩＩＩ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組換え方法及び組成物を使用して産生することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つ以上の単離された核酸（複数可）が提供される。
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組換え方法及び組成物を使用して産生することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つ以上の単離された核酸（複数可）が提供される。
【0107】
一態様では、抗体を作製する方法であって、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意に、抗体を宿主細胞（又は宿主細胞培養物）から回収することとを含む、方法が提供される。
【0108】
抗体の組換え産生に関しては、例えば、上述の抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニング及び／又は宿主細胞内での発現のために、一又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【0109】
通常、例えば治療用抗体のような目的のポリペプチドの組換え大量生産のためには、該ポリペプチドを安定に発現し分泌する細胞が必要とされる。この細胞は、「組換え細胞」又は「組換え生産細胞」と呼ばれ、このような細胞を作製するために使用される方法は「細胞株開発」と呼ばれる。細胞株開発方法の第１の工程において、例えばＣＨＯ細胞等の適切な宿主細胞に、当該目的のポリペプチドの発現に適した核酸配列をトランスフェクトする。第２の工程において、目的のポリペプチドを安定に発現する細胞を、目的のポリペプチドをコードする核酸と共にコトランスフェクトしておいた選択マーカーの共発現に基づいて選択する。
【0110】
ポリペプチドをコードする核酸、すなわちコード配列は、構造遺伝子と呼ばれる。このような構造遺伝子は、純粋なコード情報である。したがって、その発現にはさらなる調節エレメントが必要である。したがって、通常、構造遺伝子はいわゆる発現カセットに組み込まれる。発現カセットが哺乳動物細胞において機能的となるために必要とされる最小限の制御エレメントは、構造遺伝子の上流、すなわち５’側に位置する、当該哺乳動物細胞において機能的なプロモーター、及び構造遺伝子の下流、すなわち３’側に位置する、当該哺乳動物細胞において機能的なポリアデニル化シグナル配列である。プロモーター配列、構造遺伝子配列、及びポリアデニル化シグナル配列は、作動可能に連結された形態で並べられる。
【0111】
目的のポリペプチドが、異なる（単量体）ポリペプチド、例えば、抗体又は複合体抗体フォーマットなどから構成されるヘテロ多量体ポリペプチドである場合、単一の発現カセットが必要であるだけでなく、含まれる構造遺伝子が異なる多数の発現カセット、すなわち、ヘテロ多量体ポリペプチドの異なる（単量体）ポリペプチドのそれぞれに対して少なくとも１つの発現カセットが必要である。例えば、全長抗体は、軽鎖の２個のコピー及び重鎖の２個のコピーを含むヘテロ多量体ポリペプチドである。したがって、全長抗体は、２つの異なるポリペプチドから構成される。したがって、全長抗体の発現のためには２つの発現カセット、すなわち軽鎖のための１個及び重鎖のための１個が必要とされる。例えば、完全長抗体が二重特異性抗体である場合、すなわち、抗体が２つの異なる抗原に特異的に結合する２つの異なる結合部位を含む場合、２つの軽鎖並びに２つの重鎖もまた互いに異なる。したがって、このような二重特異性完全長抗体は、４つの異なるポリペプチドで構成されているため、４つの発現カセットが必要となる。
【0112】
目的のポリペプチドのための発現カセットは、次に、１つ又は複数のいわゆる「発現ベクター」に組み込まれる。「発現ベクター」は、細菌細胞中で該ベクターを増幅し、かつ含まれる構造遺伝子を哺乳動物細胞中で発現させるのに必要とされるすべてのエレメントを提供する核酸である。典型的には、発現ベクターは、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合、複製開始点及び原核生物選択マーカー、さらには真核生物選択マーカー、並びに目的の構造遺伝子の発現に必要とされる発現カセットを含む、原核生物プラスミド増殖単位を含む。「発現ベクター」は、哺乳動物細胞に発現カセットを導入するための輸送運搬体である。
【0113】
以前のパラグラフで概説したように、発現しようとするポリペプチドが複雑であるほど、必要とされる異なる発現カセットの数もまた多くなる。本質的に、発現カセットの数と共に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる核酸のサイズも大きくなる。同時に、発現ベクターのサイズも大きくなる。しかし、ベクターのサイズの実用的な上限は約１５ｋｂｐの範囲にあり、それを上回ると、操作及び処理の効率が著しく落ちる。この問題は、２つ以上の発現ベクターを用いることによって対処することができる。それにより、発現カセットは、それぞれが発現カセットの一部のみを含む異なる発現ベクター間で分割することができ、その結果サイズの縮小をもたらす。
【0114】
多重特異性抗体などの異種ポリペプチドを発現する組換え細胞を生成するための細胞株開発（ＣＬＤ）は、目的の異種ポリペプチドの発現及び産生に必要なそれぞれの発現カセットを含む核酸のランダム組込み（ＲＩ）又は標的指向性組込み（ＴＩ）のいずれかを使用する。
【0115】
ＲＩを使用すると、一般に、複数のベクター又はその断片が、同一又は異なる遺伝子座で細胞のゲノムに組み込まれる。
【0116】
ＴＩを使用すると、一般に、異なる発現カセットを含む導入遺伝子の単一コピーが、宿主細胞のゲノムの所定の「ホットスポット」に組み込まれる。
【0117】
（グリコシル化された）抗体の発現に適した宿主細胞は、一般に、例えば脊椎動物等の多細胞生物に由来する。
【0118】
ＩＶ．宿主細胞
懸濁液中で増殖するように適合された任意の哺乳動物細胞株を、本発明による方法で使用することができる。さらに、組み込み方法とは無関係に、すなわち、ＲＩ及びＴＩの場合、任意の哺乳動物宿主細胞を使用することができる。
懸濁液中で増殖するように適合された任意の哺乳動物細胞株を、本発明による方法で使用することができる。さらに、組み込み方法とは無関係に、すなわち、ＲＩ及びＴＩの場合、任意の哺乳動物宿主細胞を使用することができる。
【0119】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ヒト羊膜細胞（例えば、Ｗｏｅｌｆｅｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｐｒｏｃ．５（２０１１）Ｐ１３３に記載されているＣＡＰ－Ｔ細胞）；ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９－７４）に記載されたＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３－２５２）に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばＭａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４－６８に記載のＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６－４２２０）、及び、骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．及びＷｕ，Ａ．Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻、Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編．）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００４）、２５５－２６８頁を参照されたい。
【0120】
特定の実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４等）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、リンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）、又はヒト羊膜細胞（例えば、ＣＡＰ－Ｔ等）である。好ましい一実施形態では、哺乳動物（宿主）細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【0121】
標的指向性組み込みにより、哺乳動物細胞ゲノムの予め定められた部位に外因性ヌクレオチド配列が組み込まれることが可能になる。特定の実施形態では、標的指向性組み込みは、ゲノム及び組み込まれる外因性ヌクレオチド配列に存在する１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施形態において、標的化組込みは、相同組換えによって媒介される。
【0122】
「組換え認識配列」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識され、リコンビナーゼに媒介された組換え事象のために必要かつ十分である、ヌクレオチド配列である。ＲＲＳを用いて、組換え事象が起こると考えられるヌクレオチド配列中の位置を定めることができる。
【0123】
特定の実施形態において、ＲＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、ＲＲＳは、ＦＬＰリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、ＲＲＳは、Ｂｘｂ１インテグラーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、φＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。
【0124】
ＲＲＳがＬｏｘＰ部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにＣｒｅリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＦＲＴ部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにＦＬＰリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＢｘｂ１ ａｔｔＰ部位又はＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位である特定の実施形態では、細胞は、組換えを行うためにＢｘｂ１インテグラーゼを必要とする。特定の実施形態では、ＲＲＳがφＣ３１ ａｔｔＰ部位又はφＣ３１ ａｔｔＢ部位である場合、細胞は、組換えを行うためにφＣ３１インテグラーゼを必要とする。これらのリコンビナーゼは、これらの酵素のコード配列を含む発現ベクターを用いて、あるいはタンパク質やｍＲＮＡとして細胞中に導入することができる。
【0125】
ＴＩに関して、ゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた、本明細書に記載のランディング部位を含む、ＴＩに適した任意の既知又は将来の哺乳動物宿主細胞を、本発明において使用することができる。このような細胞は、哺乳動物ＴＩ宿主細胞と呼ばれる。特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、本明細書に記載されるように、ランディング部位を含むハムスター細胞、ヒト細胞、ラット細胞、又はマウス細胞である。好ましい一実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、ゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた、本明細書に記載のランディング部位を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯ Ｋ１Ｓ細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞である。
【0126】
特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、組み込まれたランディング部位を含み、ランディング部位は、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含む。ＲＲＳは、リコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、又はφＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。ＲＲＳは、互いに独立して、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。複数のＲＲＳが存在しなければならない場合、同一でないＲＲＳが選択される限りにおいて、各配列の選択は他方に依存する。
【0127】
特定の実施形態では、ランディング部位は、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、ＲＲＳはリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は３つのＲＲＳを含み、第３のＲＲＳは第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置する。特定の好ましい実施形態では、３つのＲＳＳは全て異なる。特定の実施形態では、ランディング部位は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、及び第３のＲＲＳ、並びに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含み、かつ第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳ及び／又は第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、ランディング部位は更に第２の選択マーカーを含み、かつ第１及び第２の選択マーカーは異なる。特定の実施形態では、ランディング部位は、第３の選択マーカー及び配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）も更に含み、該ＩＲＥＳは該第３の選択マーカーに作動可能に連結されている。第３の選択マーカーは、第１又は第２の選択マーカーとは異なり得る。
【0128】
本発明は、以下ＣＨＯ細胞で例示されるが、これは本発明を例示するためにのみ提示され、限定として解釈されるべきではない。本発明の真の範囲は、特許請求の範囲に記載されている。
【0129】
本発明による方法における使用に適した例示的な哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、そのゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれたランディング部位を有するＣＨＯ細胞であり、ランディング部位はＣｒｅリコンビナーゼを介したＤＮＡ組換えのための３つの異種特異的ｌｏｘＰ部位を含む。
【0130】
この例では、異種特異的ｌｏｘＰ部位は、Ｌ３、ＬｏｘＦａｓ、及び２Ｌであり（例えば、Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．７（２０１２）８９８－９０８；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７を参照）、その際、Ｌ３及び２Ｌはランディング部位の５’末端及び３’末端にそれぞれ隣接し、ＬｏｘＦａｓはＬ３部位と２Ｌ部位の間に位置している。ランディング部位は、ＩＲＥＳを介した選択マーカーの発現を蛍光性ＧＦＰタンパク質の発現に結び付けて、ポジティブ選択によってランディング部位を安定化すること並びにトランスフェクション及びＣｒｅ組換え後に該部位が存在しないものを選択すること（ネガティブ選択）を可能にする、バイシストロン性単位をさらに含む。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、ＲＭＣＥ反応をモニターするのに役立つ。
【0131】
先の段落で概説したようにランディング部位がこのように編成されていることによって、２つのベクター、例えば、いわゆる、Ｌ３部位及びＬｏｘＦａｓ部位を有するフロントベクター並びにＬｏｘＦａｓ部位及び２Ｌ部位を内部に持つバックベクターの同時組み込みが可能になる。ランディング部位に存在するものとは異なる、選択マーカー遺伝子の機能的エレメントは、両方のベクター間に分配させることができ：プロモーター及び開始コドンはフロントベクター上に位置することができるのに対し、コード化領域及びポリＡシグナルはバックベクター上に位置している。両方のベクターに由来する当該核酸の正しいリコンビナーゼ媒介性組み込みのみが、それぞれの選択剤に対する耐性を誘導する。
【0132】
通常、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の１つの部位に組み込まれるランディング部位を含む哺乳動物細胞であって、該ランディング部位が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列及び第２の組換え認識配列、並びに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列が全て異なっている、ランディング部位を含む哺乳動物細胞である。
【0133】
選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、並びにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され得る。また、選択マーカーは、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光性タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ６、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅからなる群から選択される蛍光性タンパク質であってもよい。
【0134】
外因性ヌクレオチド配列は、特定の細胞に由来しないが、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、又は形質転換法などによって前記細胞に導入することができるヌクレオチド配列である。特定の実施形態では、哺乳動物ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中の１つ以上の組み込み部位に組み込まれた少なくとも１つのランディング部位を含む。特定の実施形態では、ランディング部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の１つ以上の組み込み部位に組み込まれる。
【0135】
特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、第１、第２及び第３のＲＲＳ、並びに少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態において、選択マーカーは、第１と第２のＲＲＳの間に位置している。特定の実施形態において、２つのＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカーに隣接する。すなわち、第１のＲＲＳが選択マーカーの５’（上流）に位置し、第２のＲＲＳが選択マーカーの３’（下流）に位置している。特定の実施形態では、第１のＲＲＳは選択マーカーの５’末端と隣り合っており、第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’末端に隣り合っている。特定の実施形態では、ランディング部位は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、及び第３のＲＲＳ、並びに第１のＲＲＳと第３のＲＲＳの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含む。
【0136】
特定の実施形態において、選択マーカーは第１と第２のＲＲＳの間に位置しており、かつこれら２つの隣接ＲＲＳは互いに異なる。特定の好ましい実施形態において、第１の隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、第２の隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。特定の実施形態では、ＬｏｘＰ Ｌ３配列は、選択マーカーの５’に位置し、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は、選択マーカーの３’に位置する。特定の実施形態では、第１の隣接ＲＲＳは野生型ＦＲＴ配列であり、第２の隣接ＲＲＳは変異ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、同じ向きに位置決めされている。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、両方が順方向又は逆方向に向いている。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、反対の向きに位置決めされている。
【0137】
特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、２つのＲＳＳが隣接する、第１の選択マーカー及び第２の選択マーカーを含み、該第１の選択マーカーは該第２の選択マーカーとは異なる。特定の実施形態では、２つの選択マーカーのどちらも、相互に独立して、グルタミン合成酵素選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、ＨＹＧ選択マーカー、及びピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。特定の実施形態では、組み込まれたランディング部位は、チミジンキナーゼ選択マーカー及びＨＹＧ選択マーカーを含む。特定の実施形態では、第１の選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、並びにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第２の選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ蛍光タンパク質からなる群から選択される。特定の実施形態では、第１の選択マーカーはグルタミン合成酵素選択マーカーであり、第２の選択マーカーはＧＦＰ蛍光タンパク質である。特定の実施形態では、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは異なっている。
【0138】
特定の実施形態では、選択マーカーは、プロモーター配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、ＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに作動可能に連結されている。
【0139】
Ｖ．標的指向性組込み
本発明による組換え哺乳動物細胞を作製するための１つの方法は、標的指向性組み込み（ＴＩ）である。
本発明による組換え哺乳動物細胞を作製するための１つの方法は、標的指向性組み込み（ＴＩ）である。
【0140】
標的指向性組み込みでは、哺乳動物ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座に外因性核酸を導入するために部位特異的組換えが用いられる。これは、ゲノムにおける組み込み部位の配列が外因性核酸と交換される酵素プロセスである。このような核酸交換を行うために使用される１つのシステムは、Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムである。交換を触媒する酵素はＣｒｅリコンビナーゼである。交換される配列は、ゲノム内並びに外因性核酸内の２つのｌｏｘ（Ｐ）部位の位置によって定義される。これらのｌｏｘ（Ｐ）部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識される。それ以上は必要なく、すなわちＡＴＰなどは不要である。元々Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムはバクテリオファージＰ１で発見された。
【0141】
Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムは、哺乳動物、植物、細菌、酵母等、様々な種類の細胞で機能する。
【0142】
特定の実施形態では、異種ポリペプチドをコードする外因性核酸は、単一又は二重リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）によって哺乳動物ＴＩ宿主細胞に組み込まれている。それにより、組換えＣＨＯ細胞などの組換え哺乳動物細胞が得られ、その中で、定義された特異的な発現カセット配列が単一の遺伝子座でゲノムに組み込まれ、それが次に異種ポリペプチドの効率的な発現及び産生をもたらす。
【0143】
Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ部位特異的組換え系は、多くの生物学的実験系において広く使用されている。Ｃｒｅリコンビナーゼは、３４ｂｐのＬｏｘＰ配列を認識する３８ｋＤａの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。ＣｒｅリコンビナーゼはバクテリオファージＰ１に由来し、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼに属する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＬｏｘＰ配列間の分子内組換えと分子間組換えの両方を媒介することができる。ＬｏｘＰ配列は、２つの１３ｂｐ逆方向反復に挟まれた８ｂｐの非パリンドロームコア領域から構成される。Ｃｒｅリコンビナーゼは１３ｂｐの反復に結合し、それによって８ｂｐのコア領域内での組換えを媒介する。Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ媒介組換えは、高い効率で起こり、他のいかなる宿主因子も必要としない。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で同じ方向に配置されている場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えは、２つのＬｏｘＰ配列の間に位置するＤＮＡ配列が共有結合で閉じた環として切り取るであろう。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で逆方向の位置に配置されている場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えは、２つの配列の間に位置するＤＮＡ配列の向きを反転するであろう。２つのＬｏｘＰ配列が２つの異なるＤＮＡ分子上にあり、１つのＤＮＡ分子が環状である場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介性組換えにより、環状ＤＮＡ配列の組み込みをもたらすであろう。
【0144】
用語「一致ＲＲＳ」とは、２つのＲＲＳ間で組換えが起こることを示す。特定の実施形態では、２つの一致ＲＲＳは同じである。特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、変異体ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、野生型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、変異体ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、２つの一致ＲＲＳは、異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、第１の一致ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の一致ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、第１の一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列であり、第２の一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列である。
【0145】
「２プラスミドＲＭＣＥ」戦略又は「二重ＲＭＣＥ」は、２つのベクターの組み合わせを使用する場合、本発明による方法で用いられる。例えば、限定されるものではないが、組み込まれたランディング部位は、３つのＲＲＳ、例えば、第３のＲＲＳ（「ＲＲＳ３」）が第１のＲＲＳ（「ＲＲＳ１」）と第２のＲＲＳ（「ＲＲＳ２」）の間に存在する並びを含むことができ、第１のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含み、第２のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第３のＲＲＳ及び第２のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含む。
【0146】
２プラスミドＲＭＣＥ戦略では、３つのＲＲＳ部位を使用して、２つの独立したＲＭＣＥを同時に実行することを含む。したがって、２プラスミドＲＭＣＥ戦略を用いる哺乳動物ＴＩ宿主細胞のランディング部位は、第１のＲＲＳ部位（ＲＲＳ１）に対しても第２のＲＲＳ部位（ＲＲＳ２）に対しても交差活性を有していない第３のＲＲＳ部位（ＲＲＳ３）を含む。標的化される２つのプラスミドは、効率的な標的指向のために同じ隣接ＲＲＳ部位を必要とし、一方のプラスミド（フロント）にはＲＲＳ１及びＲＲＳ３が隣接し、他方（バック）にはＲＲＳ３及びＲＲＳ２が隣接している。さらに、２プラスミドＲＭＣＥでは、２つの選択マーカーも必要とされる。１つの選択マーカー発現カセットは、２つの部分に分割された。フロントプラスミドは、プロモーターとそれに続く開始コドン及びＲＲＳ３配列を含む。バックプラスミドは、開始コドン（ＡＴＧ）を欠き、選択マーカーコード化領域のＮ末端に融合されたＲＲＳ３配列を有する。融合タンパク質のインフレーム翻訳、すなわち動作可能な連結を確実にするために、ＲＲＳ３部位と選択マーカー配列の間に付加的なヌクレオチドを挿入する必要がある場合がある。両方のプラスミドが正確に挿入された場合にのみ、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、したがって、各選択剤に対する耐性が細胞に与えられる。
【0147】
２プラスミドＲＭＣＥは、リコンビナーゼによって触媒される、標的ゲノム遺伝子座内の２つの異種特異的ＲＲＳとドナーＤＮＡ分子の間の二重組換えクロスオーバー事象を伴う。２プラスミドＲＭＣＥは、フロントベクター及びバックベクターに由来する組み合わせられたＤＮＡ配列のコピーを、哺乳動物ＴＩ宿主細胞ゲノムの予め定められた遺伝子座に導入するように設計されている。ＲＭＣＥは、原核生物ベクターの配列が哺乳動物ＴＩ宿主細胞ゲノム中に導入されず、したがって、宿主の免疫又は防御機構の望まれない誘発を低減させ、及び／又は防ぐように、実行することができる。ＲＭＣＥ手順は、複数のＤＮＡ配列を用いて繰り返すことができる。
【0148】
特定の実施形態では、標的指向性組込みは、２回のＲＭＣＥによって実現され、その際、２つの異なるＤＮＡ配列が両方とも、哺乳動物ＴＩ宿主細胞に一致するＲＲＳのゲノムのあらかじめ定められた部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分及び／又は２つの異種特異的ＲＲＳが隣接する少なくとも１つの選択マーカー若しくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施形態では、標的指向性組込みは、複数回のＲＭＣＥによって実現され、その際、複数のベクターに由来するＤＮＡ配列がすべて、哺乳動物ＴＩ宿主細胞のゲノムのあらかじめ定められた部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分及び／又は２つの異種特異的ＲＲＳが隣接する少なくとも１つの選択マーカー若しくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施形態では、選択マーカーは、一部が第１のベクターにおいてコードされ、一部が第２のベクターにおいてコードされてよく、その結果、二重ＲＭＣＥによって両方が正確に組み込まれた場合にのみ、その選択マーカーの発現が可能になる。
【0149】
特定の実施形態では、リコンビナーゼに媒介された組換えによる標的指向性組込みにより、原核生物ベクターに由来する配列を含まずに、宿主細胞ゲノムの１つ又は複数のあらかじめ定められた組込み部位に、選択マーカー及び／又は多量体ポリペプチドの様々な発現カセットが組み込まれる。
【0150】
特定の実施形態のように、ノックアウトは、異種ポリペプチドをコードする外来性核酸の導入前又はその後のいずれでも実施できることが指摘されなければならない。
【0151】
ＶＩ．本発明による組成物及び方法
異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を生成するための方法及び前記組換え哺乳動物細胞を使用して異種ポリペプチドを生産するための方法が本明細書において報告され、組換え哺乳動物細胞において、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる群からの遺伝子の少なくとも１つの活性／機能／発現は、低減／除去／減少／（完全に）ノックアウトされている。
異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を生成するための方法及び前記組換え哺乳動物細胞を使用して異種ポリペプチドを生産するための方法が本明細書において報告され、組換え哺乳動物細胞において、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる群からの遺伝子の少なくとも１つの活性／機能／発現は、低減／除去／減少／（完全に）ノックアウトされている。
【0152】
本発明は、少なくとも部分的には、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞における、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる群からの遺伝子の少なくとも１つのノックアウトが、標準的なＩｇＧ型抗体の、特に複雑な抗体フォーマットの組換え生産性を改善するという知見に基づく。
【0153】
本発明は、例示的な細胞株及び例示的な異種ポリペプチドを使用して以下に例示される。しかしながら、異種ポリペプチド発現に適した任意の細胞を使用することができる。本発明は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性遺伝子ノックアウトを使用してさらに例示される。しかし、標的遺伝子を低減又は破壊するための任意の方法又は技術、例えばＲＮＡｉ、ジンクフィンガー又はＴＡＬＥＮタンパク質を使用してもよい。したがって、このすべては、本発明の基礎となる一般的な概念の単なる例示として提示されており、その限定として解釈されるべきではない。本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
【0154】
例示的な細胞株として、以前に作製され、大規模治療用タンパク質産生に適した性能を有するＣＨＯ細胞株を使用した（例えば、国際公開第２０１９／１２６６３４号を参照）。
【0155】
異なる個々の遺伝子ノックアウト（ＫＯ）を２つの抗体産生ＣＨＯ細胞株に導入した。一方の細胞株は抗ＰＤ１抗体－ＩＬ２ｖ融合物を産生し、他方は抗ＦＡＰ抗体－ＣＤ１３７融合物を産生した。
【0156】
ノックアウトを、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して作製した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性遺伝子ノックアウトのために、３つの異なるｇＲＮＡを使用したそれぞれの遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）内の３つの異なる部位を、多重リボ核タンパク質送達を使用して同時に標的化した。多重リボ核タンパク質送達は、一般的なプラスミドベースのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集と比較して、より高い遺伝子編集有効性及び特異性を示す。遺伝子標的部位での二本鎖切断はインデル形成を誘導し、又は多重化されたｇＲＮＡ使用に起因して、エクソンの欠失も、標的タンパク質のＣＤＳのフレームシフトをもたらす。
【0157】
以下の遺伝子を個々にノックアウトした：
ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、ＨＩＰＫ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＬＡＴＳ２、ＮＦ２、ＰＡＬＢ２、ＴＰ７３、ＦＵＢＰ１、ＮＲ３Ｃ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＣＨ１、ＡＰＣ、ＴＲＰＶ４、ＰＭＬ、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＲＢＰ２、ＥＧＬＮ２、ＭＡＰＫ１４、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＪＵＮ、ｐ５３、ＣＤＫＮ２Ｄ、ＬＡＴＳ１、ＮＦＫＢＩＡ、ＧＳＫ３Ｂ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＮＦ４３、ＨＴＡＴＩＰ２、ＥＥＦ２Ｋ、ＲＢＰ１、ＢＮＩＰ３、ＡＫＴ１、ＨＩＦ１Ａ、ＥＰＨＡ２、ＫＥＡＰ１、ＭＡＰＫ８ＩＰ３、ＥＲＫ１／ＭＡＰＫ３、ＥＲＫ２／ＭＡＰＫ１、Ｅ２Ｆ１、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＮＵＰＲ１、ＣＡＭＫ１、ＢＡＰ１、ＣＨＫ２、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＢＲＣＡ１、ＲＡＳＡ１、ＲＩＰＫ３、ＥＧＬＮ３、ＥＲＫ５／ＭＡＰＫ７、ＲＰＳ６ＫＡ５、ＭＡＰＫ９、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＸＩ１、ＰＲＫＡＧ２、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＦＯＸＯ３、ＢＡＤ、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、Ｅ２Ｆ７、ＦＯＸＯ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＡＪＵＢＡ、ＭＡＰＫ８、ＦＢＸＷ７、ＥＧＬＮ１、ＲＩＰＫ１、ＶＨＬ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＨＫ１、ＲＢＸ１、ＣＵＬ３、ＷＥＥ１。
ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、ＨＩＰＫ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＬＡＴＳ２、ＮＦ２、ＰＡＬＢ２、ＴＰ７３、ＦＵＢＰ１、ＮＲ３Ｃ１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＣＨ１、ＡＰＣ、ＴＲＰＶ４、ＰＭＬ、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＲＢＰ２、ＥＧＬＮ２、ＭＡＰＫ１４、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＪＵＮ、ｐ５３、ＣＤＫＮ２Ｄ、ＬＡＴＳ１、ＮＦＫＢＩＡ、ＧＳＫ３Ｂ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＮＦ４３、ＨＴＡＴＩＰ２、ＥＥＦ２Ｋ、ＲＢＰ１、ＢＮＩＰ３、ＡＫＴ１、ＨＩＦ１Ａ、ＥＰＨＡ２、ＫＥＡＰ１、ＭＡＰＫ８ＩＰ３、ＥＲＫ１／ＭＡＰＫ３、ＥＲＫ２／ＭＡＰＫ１、Ｅ２Ｆ１、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＮＵＰＲ１、ＣＡＭＫ１、ＢＡＰ１、ＣＨＫ２、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＢＲＣＡ１、ＲＡＳＡ１、ＲＩＰＫ３、ＥＧＬＮ３、ＥＲＫ５／ＭＡＰＫ７、ＲＰＳ６ＫＡ５、ＭＡＰＫ９、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＸＩ１、ＰＲＫＡＧ２、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＦＯＸＯ３、ＢＡＤ、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、Ｅ２Ｆ７、ＦＯＸＯ１、ＣＴＮＮＢ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＡＪＵＢＡ、ＭＡＰＫ８、ＦＢＸＷ７、ＥＧＬＮ１、ＲＩＰＫ１、ＶＨＬ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＨＫ１、ＲＢＸ１、ＣＵＬ３、ＷＥＥ１。
【0158】
抗体の生産性及び増殖に対するそれぞれのノックアウトの影響を示すために、４日間のバッチ培養を行った（実施例７参照）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９オンターゲット効率の対照及び非標的対照を含めた。発酵プロセスで使用される細胞密度は着実に増加する。結果を以下の表に示す。
－：発現なし／結果なし
【0159】
ＣＨＫ１及びＷＥＥ１ノックアウトによって分かるように、タンパク質発現に関連すると予測される遺伝子の改変が正又は負の効果をもたらすかどうかは予測できず、すなわち、これら２つの場合のように細胞分裂の停止など、意図された反対の効果をもたらし得る。
【0160】
４日間のバッチ発酵プロセスでは、未改変の細胞プール又はクローンと比較して異なる複合抗体フォーマットを発現するＭＹＣ ＫＯ細胞プールについて、少なくとも５％及び最大４９％又はさらには９９％の生産性の増加、すなわち生産性のほぼ倍増が得られた。これらの細胞プールは、未編集、ホモ接合性及びヘテロ接合性のＭＹＣ遺伝子座を含有する細胞の混合物を含むことを指摘しなければならない。したがって、単離されたクローンで得られる改善はさらに高いであろう。
【0161】
ＭＹＣ遺伝子不活性化について得られた結果を、１４日間の高細胞密度フェドバッチ培養で確認した（実施例９参照）。結果を以下の表に示す。
【0162】
試験した８０を超えるノックアウトに関するデータは、生産性に対する遺伝子ノックアウトの予測不能性を示している。見られ得るように、ノックアウトの４０％のみが生産性の増加をもたらしたのに対して、他の残りは、細胞増殖又は生産性に対する影響を何ら示さなかったか、又は有害な影響を示した。いくつかのノックアウトは細胞にとって致死的であり、細胞死又は細胞増殖なし／低増殖をもたらした。
【0163】
ＭＹＣ遺伝子ノックアウトは、両方の細胞株において生産性に最も大きな影響を及ぼした。ＭＹＣノックアウト細胞プール内のＰＣＲ増幅ＭＹＣ遺伝子座のシーケンシングにより、第１のｇＲＮＡ結合部位でのシーケンシング反応の突然の中断が明らかになった。この理論に束縛されるものではないが、結果として、標的遺伝子のコードされたタンパク質の発現は、その後、発現レベルが実質的に低減又は破壊される。
【0164】
ＭＹＣノックアウトの効果は、以下の表に示すように、様々な異なるタンパク質で確認されている。
【0165】
ＭＹＣ遺伝子ノックアウトに加えて、遺伝子ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１のノックアウトは、異種抗体の発現の増加をもたらした。
【0166】
蒸気に列挙した遺伝子のいずれか１つの活性／発現のノックアウトは、異種ポリペプチドの産生のために使用される真核細胞において、特に、組換えポリペプチド、特に抗体を産生するために使用されるか、又は使用されることが意図されている組換えＣＨＯ細胞において、より具体的には、標的指向性組込み組換えＣＨＯ細胞において有利である。ノックアウトにより、生産性が大幅に向上する。これは、個々のフェドバッチ培養から得ることのできる産物の高収率をもたらすことから、いかなる大規模生産工程にとっても経済的に非常に重要である。
【0167】
蒸気に列挙した遺伝子のノックアウトはＣＨＯ細胞に限定されるものではなく、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＡＰ細胞、及びＢＨＫ細胞のような他の宿主細胞株においても使用することができる。
【0168】
遺伝子の活性／発現をノックアウトするために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術が使用されている。同様に、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はＴＡＬＥＮなどの他の技術を使用することができる。さらに、ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡなどのＲＮＡサイレンシング種を用いて、ｍＲＮＡレベルをノックダウンし、その結果、遺伝子の活性／発現をノックダウンすることができる。
【0169】
この理論に束縛されることなく、ホモ接合性ノックアウトは、ヘテロ接合性ノックアウトよりも生産性の増加に有利な効果を有すると仮定される。
【0170】
本発明は、少なくとも部分的には、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞における、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群からの少なくとも１つの遺伝子の機能的ノックアウトが、特に複雑な抗体フォーマットの組換え生産性を改善するという知見に基づく。
【0171】
本発明は以下に要約される：
本発明の１つの独立した態様は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の活性又は／及び機能又は／及び発現が低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている哺乳動物細胞である。
本発明の１つの独立した態様は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の活性又は／及び機能又は／及び発現が低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている哺乳動物細胞である。
【0172】
本発明の１つの独立した態様は哺乳動物細胞であり、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の発現が低減されており、前記哺乳動物は、同じ条件下で培養された、同一の遺伝子型を有するがＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される前記少なくとも１つの内因性遺伝子のそれぞれの内因性遺伝子発現を有する細胞と比較して、異種ポリペプチドの生産性が増加している。
【0173】
本発明の１つの独立した態様は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の低減された発現を有し、外因性核酸、すなわち前記異種ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む、組換え哺乳動物細胞の異種ポリペプチド力価を、同じ条件下で培養された、同一の遺伝子型を有するがＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される前記少なくとも１つの内因性遺伝子の内因性遺伝子発現を有する細胞と比較して、増加させるための方法である。
【0174】
本発明の１つの独立した態様は、改善された組換え生産性を有する組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）哺乳動物細胞においてＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子を標的とするヌクレアーゼ支援及び／又は核酸を適用して、前記内因性遺伝子の活性を低減させる工程、及び
ｂ）内因性遺伝子の活性が低減されている哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それによって、同じ条件下で培養された、同一の遺伝子型を有するがＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される前記少なくとも１つの内因性遺伝子の内因性遺伝子発現を有する細胞と比較して、組換え生産性が増加した組換え哺乳動物細胞を生産する。
ａ）哺乳動物細胞においてＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子を標的とするヌクレアーゼ支援及び／又は核酸を適用して、前記内因性遺伝子の活性を低減させる工程、及び
ｂ）内因性遺伝子の活性が低減されている哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それによって、同じ条件下で培養された、同一の遺伝子型を有するがＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される前記少なくとも１つの内因性遺伝子の内因性遺伝子発現を有する細胞と比較して、組換え生産性が増加した組換え哺乳動物細胞を生産する。
【0175】
本発明の１つの独立した態様は、異種ポリペプチドを製造するための方法であって、以下の工程：
ａ）異種ポリペプチドをコードする外因性デオキシリボ核酸を含む組換え哺乳動物細胞を、任意に異種ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程、及び
ｂ）細胞又は培養培地から異種ポリペプチドを回収する工程
を含み、
前記哺乳動物細胞において、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の活性又は／及び機能又は／及び発現は、低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている。
ａ）異種ポリペプチドをコードする外因性デオキシリボ核酸を含む組換え哺乳動物細胞を、任意に異種ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程、及び
ｂ）細胞又は培養培地から異種ポリペプチドを回収する工程
を含み、
前記哺乳動物細胞において、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の活性又は／及び機能又は／及び発現は、低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている。
【0176】
本発明の別の独立した態様は、改善された及び／又は増加した組換え生産性を有する（ｈａｖｉｎｇ／ｗｉｔｈ）組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子を標的とする核酸又は酵素又はヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムを哺乳動物細胞に適用して、前記内因性遺伝子の活性又は／及び機能又は／及び発現を低減させる、又は除去する、又は減少させる、又は（完全に）ノックアウトする工程、及び
ｂ）前記内因性遺伝子の活性又は／及び機能又は／及び発現が低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それにより、改善された及び／又は増加した組換え生産性を有する（ｈａｖｉｎｇ／ｗｉｔｈ）組換え哺乳動物細胞を生産する、方法である。
ａ）ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子を標的とする核酸又は酵素又はヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムを哺乳動物細胞に適用して、前記内因性遺伝子の活性又は／及び機能又は／及び発現を低減させる、又は除去する、又は減少させる、又は（完全に）ノックアウトする工程、及び
ｂ）前記内因性遺伝子の活性又は／及び機能又は／及び発現が低減されている、又は除去されている、又は減少している、又は（完全に）ノックアウトされている哺乳動物細胞を選択する工程
を含み、
それにより、改善された及び／又は増加した組換え生産性を有する（ｈａｖｉｎｇ／ｗｉｔｈ）組換え哺乳動物細胞を生産する、方法である。
【0177】
本発明のすべての態様及び実施形態の１つの従属の実施形態では、哺乳動物細胞は異種ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【0178】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、異種ポリペプチドをコードする核酸は、前記哺乳動物細胞において機能するプロモーター配列に作動可能に連結され、前記哺乳動物細胞において機能するポリアデニル化シグナルに作動可能に連結される。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、適切な培養条件下で培養した場合に異種ポリペプチドを分泌する。
【0179】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子のノックアウトは、ヘテロ接合ノックアウト又はホモ接合ノックアウトである。
【0180】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の実施形態において、ノックアウト細胞株の生産性は、同じ遺伝子型を有するがＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される前記少なくとも１つの内因性遺伝子が完全に機能的に発現するそれぞれの哺乳動物細胞と比較して、少なくとも５％、好ましくは１０％以上、最も好ましい２０％以上増加している。
【0181】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の低減又は除去又は減少又はノックアウトは、ヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムによって媒介される。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及びＴＡＬＥＮからなる群から選択される。
【0182】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の発現の低減は、ＲＮＡサイレンシングによって媒介される。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシングは、ｓｉＲＮＡ遺伝子ターゲティング及びノックダウン、ｓｈＲＮＡ遺伝子ターゲティング及びノックダウン、並びにｍｉＲＮＡ遺伝子ターゲティング及びノックダウンからなる群から選択される。
【0183】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子のノックアウトは、ｉ）異種ポリペプチドをコードする外来性核酸の導入前、又はｉｉ）異種ポリペプチドをコードする外来性核酸の導入後に行われる。
【0184】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、異種ポリペプチドは抗体である。特定の実施形態では、抗体は、２つ以上の異なる結合部位及び任意にドメイン交換を含む抗体である。特定の実施形態では、抗体は、３つ以上の結合部位又はＶＨ／ＶＬペア又はＦａｂ断片、及び任意にドメイン交換を含む。特定の実施形態では、抗体は、多重特異性抗体である。
【0185】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、多重特異性抗体及び抗体－多量体融合ポリペプチドを含む異種ポリペプチドの群から選択される。特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、以下からなる群から選択される：
ｉ）第１のＦａｂ断片と第２のＦａｂ断片を含むドメイン交換を伴う完全長抗体であって、
第１のＦａｂ断片において、
ａ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨ及びＣＬドメインを含む；
ｂ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＨ１ドメインを含む；又は
ｃ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＬドメインを含む；
及び
第２のＦａｂ断片は、ＶＬ及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含む；
ｉｉ）ドメイン交換及び追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体；
及び
－ １つの追加のＦａｂ断断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、１つの追加のＦａｂ断断片；を含み、
第２の抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片が、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられている、又はｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含むか、又はｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である、多重特異性ＩｇＧ抗体；
ｉｉｉ）第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む１アーム一本鎖抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメイン及び軽鎖カッパ又はラムダ定常ドメインを含む軽鎖；
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びノブ変異を有するＣＨ３を含む軽鎖／重鎖の組み合わせ；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール変異を有するＣＨ３ドメインを含む重鎖
を含む、１アーム一本鎖抗体；
ｉｖ）第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位、及び第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む、２アーム一本鎖抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びホール変異を有するＣＨ３を含む、軽鎖／重鎖の第１の組み合わせ；
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びノブ変異を有するＣＨ３ドメインを含む、軽鎖／重鎖の第２の組み合わせ
を含む、２アーム一本鎖抗体；
ｖ）第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む、共通軽鎖二重特異性抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む軽鎖；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール変異を有するＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖
を含む、共通軽鎖二重特異性抗体；
ｖｉ）ドメイン交換を伴う追加の重鎖Ｎ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 第１及び第２のＦａｂ断片であって、第１及び第２のＦａｂ断片の各結合部位が第１の抗原に特異的に結合する、第１及び第２のＦａｂ断片；
－ 第３のＦａｂ断片であって、第３のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合し、第３のＦａｂ断片が、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片；及び
－ 第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＦｃ領域
を含み；
第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片は、それぞれ、重鎖断片及び完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている
完全長抗体；
ｖｉｉ）完全長抗体と、任意にペプチドリンカーを介して互いにコンジュゲートした非免疫グロブリン部分とを含むイムノコンジュゲート、
及び
ｖｉｉｉ）抗体－多量体融合ポリペプチドであって、
（ａ）抗体重鎖及び抗体軽鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメイン又は抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、又は第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドとを含み、
（ｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ｂ）の第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ａ）の抗体軽鎖、及び（ｉｉｉ）（ｂ）の第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の第２の融合ポリペプチドが、それぞれ独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
抗体重鎖及び抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、抗体－多量体融合ポリペプチド。
ｉ）第１のＦａｂ断片と第２のＦａｂ断片を含むドメイン交換を伴う完全長抗体であって、
第１のＦａｂ断片において、
ａ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨ及びＣＬドメインを含む；
ｂ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＨ１ドメインを含む；又は
ｃ）第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＬドメインを含む；
及び
第２のＦａｂ断片は、ＶＬ及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含む；
ｉｉ）ドメイン交換及び追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体；
及び
－ １つの追加のＦａｂ断断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、追加のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、１つの追加のＦａｂ断断片；を含み、
第２の抗原に特異的に結合する追加のＦａｂ断片が、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられている、又はｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられているようなドメインクロスオーバーを含むか、又はｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である、多重特異性ＩｇＧ抗体；
ｉｉｉ）第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む１アーム一本鎖抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメイン及び軽鎖カッパ又はラムダ定常ドメインを含む軽鎖；
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びノブ変異を有するＣＨ３を含む軽鎖／重鎖の組み合わせ；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール変異を有するＣＨ３ドメインを含む重鎖
を含む、１アーム一本鎖抗体；
ｉｖ）第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位、及び第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む、２アーム一本鎖抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びホール変異を有するＣＨ３を含む、軽鎖／重鎖の第１の組み合わせ；
－ 可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びノブ変異を有するＣＨ３ドメインを含む、軽鎖／重鎖の第２の組み合わせ
を含む、２アーム一本鎖抗体；
ｖ）第１のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープ又は抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む、共通軽鎖二重特異性抗体であって、
－ 可変軽鎖ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む軽鎖；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ホール変異を有するＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖；
－ 可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ノブ変異を有するＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖
を含む、共通軽鎖二重特異性抗体；
ｖｉ）ドメイン交換を伴う追加の重鎖Ｎ末端結合部位を有する完全長抗体であって、
－ 第１及び第２のＦａｂ断片であって、第１及び第２のＦａｂ断片の各結合部位が第１の抗原に特異的に結合する、第１及び第２のＦａｂ断片；
－ 第３のＦａｂ断片であって、第３のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合し、第３のＦａｂ断片が、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片；及び
－ 第１のＦｃ領域ポリペプチド及び第２のＦｃ領域ポリペプチドを含むＦｃ領域
を含み；
第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片は、それぞれ、重鎖断片及び完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている
完全長抗体；
ｖｉｉ）完全長抗体と、任意にペプチドリンカーを介して互いにコンジュゲートした非免疫グロブリン部分とを含むイムノコンジュゲート、
及び
ｖｉｉｉ）抗体－多量体融合ポリペプチドであって、
（ａ）抗体重鎖及び抗体軽鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメイン又は抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、又は第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドとを含み、
（ｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ｂ）の第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ａ）の抗体軽鎖、及び（ｉｉｉ）（ｂ）の第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の第２の融合ポリペプチドが、それぞれ独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
抗体重鎖及び抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、抗体－多量体融合ポリペプチド。
【0186】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＣＤＫ１２、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、及びＳＭＡＤ３からなる遺伝子群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、及びＣＤＫ１２からなる遺伝子の群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ及びＳＴＫ１１からなる遺伝子の群から選択される。好ましい一実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子はＭＹＣである。
【0187】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、抗体－多量体融合ポリペプチドであって、
（ａ）抗体重鎖及び抗体軽鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメイン又は抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、又は第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドとを含み、
（ｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ｂ）の第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ａ）の抗体軽鎖、及び（ｉｉｉ）（ｂ）の第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の第２の融合ポリペプチドが、それぞれ独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
抗体重鎖及び抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、抗体－多量体融合ポリペプチドである。
（ａ）抗体重鎖及び抗体軽鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体重鎖ＣＨ１ドメイン又は抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び第１のポリペプチドが抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む場合は抗体軽鎖定常ドメイン、又は第１のポリペプチドが抗体軽鎖定常ドメインを含む場合は抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドとを含み、
（ｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ｂ）の第１の融合ポリペプチド、（ｉｉ）（ａ）の抗体重鎖と（ａ）の抗体軽鎖、及び（ｉｉｉ）（ｂ）の第１の融合ポリペプチドと（ｂ）の第２の融合ポリペプチドが、それぞれ独立して、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
抗体重鎖及び抗体軽鎖の可変ドメインが、抗原に特異的に結合する結合部位を形成する、抗体－多量体融合ポリペプチドである。
【0188】
特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、及びＣＤＫＮ１Ａからなる遺伝子の群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、及びＣＤＫ１２からなる遺伝子の群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、及びＰＰＰ２ＣＢからなる遺伝子の群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子はＭＹＣである。特定の実施形態では、第１の融合ポリペプチドは、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分として、ペプチドリンカーによって互いに接続されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つの外部ドメイン又はその断片を含み、第２の融合ポリペプチドは、非抗体多量体ポリペプチドの第２部分として、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つの外部ドメイン又はその断片のみを含むか、又はその逆である。特定の実施形態では、第１の融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第１の部分、抗体軽鎖定常ドメイン、抗体ヒンジ領域、抗体重鎖ＣＨ２ドメイン、及び抗体重鎖ＣＨ３ドメインを含み、第２の融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、非抗体多量体ポリペプチドの第２の部分、及び抗体重鎖ＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態では、非抗体多量体ポリペプチドの部分に隣り合うＣＬドメインにおいて、位置１２３のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）がアルギニン（Ｒ）によって置き換えられ、かつ位置１２４のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）がリジン（Ｋ）によって置換されており、非抗体多量体ポリペプチドの部分に隣り合うＣＨ１ドメインにおいて、位置１４７のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）及び位置２１３のアミノ酸（Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている。特定の実施形態では、抗体重鎖及び抗体軽鎖の可変ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群から選択される細胞表面抗原に特異的に結合する結合部位を形成する。特定の実施形態では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、ヒトＴ細胞活性化を共刺激する。特定の実施形態では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、４－１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。特定の実施形態では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは４－１ＢＢＬであり、細胞表面抗原はＦＡＰである。
【0189】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、二価の単特異的又は二重特異的完全長抗体及び非免疫グロブリン部分を含む融合ポリペプチドであり、抗体は、任意にペプチドリンカーを介して抗体の重鎖又は軽鎖の一方の単末端で非免疫グロブリン部分にコンジュゲートされる。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＣＤＫ１２、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＣＤＫ１２、ＰＡＲＰ－１、ＢＡＲＤ１、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、及びＣＲＥＢＢＰからなる遺伝子群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子は、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、及びＣＤＫ１２からなる遺伝子の群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子はＭＹＣである。特定の実施形態では、異種ポリペプチドが、インターロイキン－２にコンジュゲートした抗ＰＤ－１抗体である。特定の実施形態では、インターロイキン－２は、望ましくないＣＤ２５媒介毒性及びＴｒｅｇ増殖を回避するために、ＩＬ－２Ｒａ（ＣＤ２５）への結合が消失した操作されたＩＬ２ｖ部分である。
【0190】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞又はＨＥＫ細胞である。特定の実施形態において、哺乳動物細胞はＣＨＯ－Ｋ１細胞である。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、懸濁増殖哺乳動物細胞である。
【0191】
本発明の別の独立した態様は、異種ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつ異種ポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を製造するための方法であって、以下：
ａ）哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１及び第２の組換え認識配列、並びに第１及び第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、すべての組換え認識配列が異なり、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の活性／発現／機能が低減／除去／ノックアウトされている、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された細胞に、３つの異なる組換え認識配列及び異種ポリペプチドのポリペプチドのための１～８個の発現カセットを含む２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程であって、
第１のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に、
－ 第１の組換え認識配列、
－ １つ又は複数の発現カセット、
－ １つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分、及び
－ 第３の組換え認識配列の第１のコピー、を含み、
及び
第２のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に、
－ 第３の組換え認識配列の第２のコピー、
－ １つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの３’末端部分、
－ １つ又は複数の発現カセット、及び
－ 第２の組換え認識配列、を含み、
第１及び第２のデオキシリボ核酸の第１～第３の組換え認識配列は、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列上の第１～第３の組換え認識配列と一致しており、
１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分及び３’末端部分が、まとまると、１つの第２の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程；
ｃ）
ｉ）ｂ）の第１及び第２のデオキシリボ核酸と同時に；又は
ｉｉ）その後に逐次的に、
１つ又は複数のリコンビナーゼを導入する工程であって、
１つ又は複数のリコンビナーゼが、第１及び第２のデオキシリボ核酸の組換え認識配列を認識し；（かつ、任意に、１つ又は複数のリコンビナーゼが、２リコンビナーゼ媒介カセット交換を行う）、リコンビナーゼを導入する工程、
及び
ｄ）第２の選択マーカーを発現し、異種ポリペプチドを分泌する細胞を選択する工程、を含み、
それにより、異種ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつ異種ポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を製造する、方法である。
ａ）哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１及び第２の組換え認識配列、並びに第１及び第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、すべての組換え認識配列が異なり、ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の活性／発現／機能が低減／除去／ノックアウトされている、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された細胞に、３つの異なる組換え認識配列及び異種ポリペプチドのポリペプチドのための１～８個の発現カセットを含む２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程であって、
第１のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に、
－ 第１の組換え認識配列、
－ １つ又は複数の発現カセット、
－ １つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分、及び
－ 第３の組換え認識配列の第１のコピー、を含み、
及び
第２のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に、
－ 第３の組換え認識配列の第２のコピー、
－ １つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの３’末端部分、
－ １つ又は複数の発現カセット、及び
－ 第２の組換え認識配列、を含み、
第１及び第２のデオキシリボ核酸の第１～第３の組換え認識配列は、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列上の第１～第３の組換え認識配列と一致しており、
１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分及び３’末端部分が、まとまると、１つの第２の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程；
ｃ）
ｉ）ｂ）の第１及び第２のデオキシリボ核酸と同時に；又は
ｉｉ）その後に逐次的に、
１つ又は複数のリコンビナーゼを導入する工程であって、
１つ又は複数のリコンビナーゼが、第１及び第２のデオキシリボ核酸の組換え認識配列を認識し；（かつ、任意に、１つ又は複数のリコンビナーゼが、２リコンビナーゼ媒介カセット交換を行う）、リコンビナーゼを導入する工程、
及び
ｄ）第２の選択マーカーを発現し、異種ポリペプチドを分泌する細胞を選択する工程、を含み、
それにより、異種ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつ異種ポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を製造する、方法である。
【0192】
本発明の別の独立した態様は、異種ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつ異種ポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を製造するための方法であって、以下：
ａ）哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１及び第２の組換え認識配列、並びに第１と第２の組換え認識配列との間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なっている、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された細胞に、３つの異なる組換え認識配列及び異種ポリペプチドのポリペプチドのための１～８個の発現カセットを含む２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程であって、
第１のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に、
－ 第１の組換え認識配列、
－ １つ又は複数の発現カセット、
－ １つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分、及び
－ 第３の組換え認識配列の第１のコピー、を含み、
及び
第２のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に、
－ 第３の組換え認識配列の第２のコピー、
－ １つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの３’末端部分、
－ １つ又は複数の発現カセット、及び
－ 第２の組換え認識配列、を含み、
第１及び第２のデオキシリボ核酸の第１～第３の組換え認識配列は、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列上の第１～第３の組換え認識配列と一致しており、
１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分及び３’末端部分が、まとまると、１つの第２の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程；
ｃ）１つ又は複数のリコンビナーゼを、
ｉ）ｂ）の第１及び第２のデオキシリボ核酸と同時に；又は
ｉｉ）その後に逐次的に、
１つ又は複数のリコンビナーゼを導入する工程であって、
１つ又は複数のリコンビナーゼが、第１及び第２のデオキシリボ核酸の組換え認識配列を認識し；（かつ、任意に、１つ又は複数のリコンビナーゼが、２リコンビナーゼ媒介カセット交換を行う）、リコンビナーゼを導入する工程、
ｄ）任意に、第２の選択マーカーを発現し、異種ポリペプチドを分泌する細胞を選択する工程、
ｅ）ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の活性／発現／機能を、低減／除去／ノックアウトする工程；
及び
ｆ）任意に、工程ｄ）の力価よりも高い力価で、異種ポリペプチドを発現及び分泌する細胞を選択する工程、を含み、
それにより、異種ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつ異種ポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を製造する、方法である。
ａ）哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１及び第２の組換え認識配列、並びに第１と第２の組換え認識配列との間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なっている、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された細胞に、３つの異なる組換え認識配列及び異種ポリペプチドのポリペプチドのための１～８個の発現カセットを含む２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程であって、
第１のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に、
－ 第１の組換え認識配列、
－ １つ又は複数の発現カセット、
－ １つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分、及び
－ 第３の組換え認識配列の第１のコピー、を含み、
及び
第２のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に、
－ 第３の組換え認識配列の第２のコピー、
－ １つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの３’末端部分、
－ １つ又は複数の発現カセット、及び
－ 第２の組換え認識配列、を含み、
第１及び第２のデオキシリボ核酸の第１～第３の組換え認識配列は、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列上の第１～第３の組換え認識配列と一致しており、
１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分及び３’末端部分が、まとまると、１つの第２の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程；
ｃ）１つ又は複数のリコンビナーゼを、
ｉ）ｂ）の第１及び第２のデオキシリボ核酸と同時に；又は
ｉｉ）その後に逐次的に、
１つ又は複数のリコンビナーゼを導入する工程であって、
１つ又は複数のリコンビナーゼが、第１及び第２のデオキシリボ核酸の組換え認識配列を認識し；（かつ、任意に、１つ又は複数のリコンビナーゼが、２リコンビナーゼ媒介カセット交換を行う）、リコンビナーゼを導入する工程、
ｄ）任意に、第２の選択マーカーを発現し、異種ポリペプチドを分泌する細胞を選択する工程、
ｅ）ＭＹＣ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２ＣＢ、ＲＢＭ３８、ＮＦ１、ＣＤＫ１２、ＳＩＮ３Ａ、ＰＡＲＰ－１、ＡＴＭ、Ｈｉｐｋ２、ＢＡＲＤ１、ＨＩＦ１ＡＮ、ＳＭＡＤ３、ＰＡＬＢ２、ＦＵＢＰ１、ＲＢＬ２、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＧＰＳ２、ＥＴＳ１、Ｅ２Ｆ５、ＣＤＫＮ１Ａ、ＲＮＦ４３、ＥＥＦ２Ｋ、ＡＫＴ１、ＢＲＣＡ１、ＡＴＲ、ＳＭＡＤ２、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ１、ＰＢＲＭ１、ＮＲＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＮＯＴＣＨ１、ＣＲＥＢＢＰ、及びＲＢＸ１からなる遺伝子群から選択される少なくとも１つの内因性遺伝子の活性／発現／機能を、低減／除去／ノックアウトする工程；
及び
ｆ）任意に、工程ｄ）の力価よりも高い力価で、異種ポリペプチドを発現及び分泌する細胞を選択する工程、を含み、
それにより、異種ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつ異種ポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を製造する、方法である。
【0193】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。
【0194】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、デオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノムの単一の部位又は遺伝子座に安定に組み込まれる。
【0195】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、異種ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、少なくとも４つの発現カセットを含み、
－ 第１の組換え認識配列が、最も５’の（すなわち、第１の）発現カセットに対して５’に位置し、
－ 第２の組換え認識配列が、最も３’の発現カセットに対して３’に位置し、
－ 第３の組換え認識配列が、
－ 第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間、かつ
－ ２つの発現カセットの間に位置し、
及び
すべての組換え認識配列は異なる。
－ 第１の組換え認識配列が、最も５’の（すなわち、第１の）発現カセットに対して５’に位置し、
－ 第２の組換え認識配列が、最も３’の発現カセットに対して３’に位置し、
－ 第３の組換え認識配列が、
－ 第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間、かつ
－ ２つの発現カセットの間に位置し、
及び
すべての組換え認識配列は異なる。
【0196】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、第３の組換え認識配列は、第４の発現カセットと第５の発現カセットの間に位置する。
【0197】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、異種ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、選択マーカーをコードする発現カセットをさらに含む。
【0198】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態において、異種ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含み、選択マーカーをコードする発現カセットは、第３の組換え認識配列に対して部分的に５’及び部分的に３’に位置しており、前記発現カセットの、５’に位置する部分は、プロモーター及び開始コドンを含み、前記発現カセットの、３’に位置する部分は、開始コドンのないコード配列及びポリＡシグナルを含み、開始コドンはコード配列に作動可能に連結されている。
【0199】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態では、選択マーカーをコードする発現カセットは、第３の組換え認識配列に対して、
ｉ）５’、又は
ｉｉ）３’、又は
ｉｉｉ）部分的に５’及び部分的に３’
に位置している。
ｉ）５’、又は
ｉｉ）３’、又は
ｉｉｉ）部分的に５’及び部分的に３’
に位置している。
【0200】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態において、選択マーカーをコードする発現カセットは、第３の組換え認識配列に対して部分的に５’及び部分的に３’に位置しており、前記発現カセットの、５’に位置する部分は、プロモーター及び開始コドンを含み、前記発現カセットの、３’に位置する部分は、開始コドンのないコード配列及びポリＡシグナルを含む。
【0201】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態において、選択マーカーをコードする発現カセットの、５’に位置する部分は、開始コドンに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、これにより、プロモーター配列は、上流でそれぞれ第２、第３又は第４の発現カセットに隣接し（すなわち、第２、第３又は第４の発現カセットに対して下流の位置にあり）、開始コドンは、下流で第３の組換え認識配列に隣接し（すなわち、第３の組換え認識配列に対して上流の位置にあり）、かつ、選択マーカーをコードする発現カセットの３’に位置する部分は、開始コドンを欠く選択マーカーをコードする核酸を含み、上流で第３の組換え認識配列に隣接し、下流でそれぞれ第３、第４又は第５の発現カセットに隣接している。
【0202】
本発明のすべての態様及び実施形態の特定の実施形態では、開始コドンは翻訳開始コドンである。特定の実施形態において、開始コドンはＡＴＧである。
【0203】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態において、第１のデオキシリボ核酸は第１のベクターに組み込まれ、第２のデオキシリボ核酸は第２のベクターに組み込まれる。
【0204】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態において、各発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、コード配列、及びポリアデニル化シグナル配列、任意にそれに続くターミネーター配列を含む。
【0205】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態において、異種ポリペプチドは、二価単一特異性抗体、少なくとも１つのドメイン交換を含む二価の二重特異性抗体、及び少なくとも１つのドメイン交換を含む三価の二重特異性抗体からなるポリペプチドの群から選択される。
【0206】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態において、リコンビナーゼ認識配列は、Ｌ３、２Ｌ、及びＬｏｘＦａｓである。特定の実施形態において、Ｌ３は配列番号０１の配列を有し、２Ｌは配列番号０２の配列を有し、ＬｏｘＦａｓは配列番号０３の配列を有する。特定の実施形態において、第１のリコンビナーゼ認識配列はＬ３であり、第２のリコンビナーゼ認識配列は２Ｌであり、第３のリコンビナーゼ認識配列はＬｏｘＦａｓである。
【0207】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態において、プロモーターは、イントロンＡを含むヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列は、ｂＧＨポリＡ部位であり、ターミネーター配列は、ｈＧＴターミネーターである。
【0208】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態において、プロモーターがＳＶ４０プロモーターでありポリアデニル化シグナル配列がＳＶ４０ポリＡ部位でありターミネーター配列が存在しない、選択マーカー（複数可）の発現カセット（複数可）を除いて、プロモーターは、イントロンＡを含むヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列は、ｂＧＨポリＡ部位であり、ターミネーター配列は、ｈＧＴターミネーターである。
【0209】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態において、ヒトＣＭＶプロモーターは、配列番号０４の配列を有する。特定の実施形態において、ヒトＣＭＶプロモーターは、配列番号０５の配列を有する。特定の実施形態において、ヒトＣＭＶプロモーターは、配列番号０６の配列を有する。
【0210】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態において、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は配列番号０７である。
【0211】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態において、ｂＧＨポリアデニル化シグナル配列は配列番号０８である。
【0212】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態において、ｈＧＴターミネーターは、配列番号０９の配列を有する。
【0213】
本発明の全ての態様及び実施形態の特定の実施形態において、ＳＶ４０プロモーターは配列番号１０の配列を有する。
【0214】
以下の実施例、図面及び配列は、本発明の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の思想から逸脱することなく、定められた手順に変更を加えることができると理解される。
【図面の簡単な説明】
【0215】
全ての図面： ＣＨＯ細胞内の例示的な遺伝子について３つの独立したｇＲＮＡを用いて得られたノックアウトの検証。ＲＮＰヌクレオフェクションの７日後に得られた、欠失領域にまたがるＤＮＡ配列のクロマトグラムを、未改変の親細胞（上部クロマトグラム；「１．ＷＴ．ａｂ１」と表記）及びノックアウトを有する細胞（下部クロマトグラム；「２．ＫＯ．ａｂ１」と表記）について示す。Ｓａｎｇｅｒシーケンシングを行って、挿入及び欠失事象の位置及び性質を検証した。ｇＲＮＡ及びＰＡＭモチーフの位置は、それぞれ各ｇＲＮＡ配列について示されている。それぞれのガイドの開裂部位は、垂直線によって示されている。公開されたＣＨＯゲノムにおけるゲノム位置：（ＰＩＣＲゲノム）；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ａｓｓｅｍｂｌｙ／ＧＣＦ＿００３６６８０４５．３／を参照。
【0216】
配列の説明
配列番号０１：Ｌ３リコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号０２：２Ｌリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号０３：ＬｏｘＦａｓリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号０４～０６：ヒトＣＭＶプロモーターの例示的なバリアント
配列番号０７：例示的なＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列
配列番号０８：例示的なｂＧＨポリアデニル化シグナル配列
配列番号０９：例示的なｈＧＴターミネーター配列
配列番号１０：例示的なＳＶ４０プロモーター配列
配列番号１１：例示的なＧＦＰ核酸配列
配列番号１２～１４：ＳＩＲＴ－１ガイドＲＮＡ
配列番号１５～１７：ＭＹＣガイドＲＮＡ
配列番号１８～２０：ＳＴＫ１１ガイドＲＮＡ
配列番号２１～２３：ＳＭＡＤ４ガイドＲＮＡ
配列番号２４～２６：ＰＰＰ２ＣＢガイドＲＮＡ
配列番号２７～２９：ＲＢＭ３８ガイドＲＮＡ
配列番号３０～３２：ＮＦ１ガイドＲＮＡ
配列番号３３～３５：ＣＤＫ１２ガイドＲＮＡ
配列番号３６～３８：ＳＩＮ３ＡガイドＲＮＡ
配列番号３９～４１：ＰＡＲＰ－１ガイドＲＮＡ
配列番号４２～４４：ＡＴＭガイドＲＮＡ
配列番号４５～４７：Ｈｉｐｋ２ガイドＲＮＡ
配列番号４８～５０：ＢＡＲＤ１ガイドＲＮＡ
配列番号５１～５３：ＨＩＦ１ＡＮガイドＲＮＡ
配列番号５４～５６：ＳＭＡＤ３ガイドＲＮＡ
配列番号５７～５９：ＣＤＫＮ１ＡガイドＲＮＡ
配列番号６０＋６１：ＭＹＣ検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号６２＋６３：ＳＴＫ１１検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号６４＋６５：ＳＭＡＤ４検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号６６＋６７：ＰＰＰ２ＣＢ検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号６８＋６９：ＲＢＭ３８検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号７０＋７１：ＮＦ１検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号７２＋７３：ＣＤＫ１２検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号７４＋７５：ＳＩＮ３Ａ検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号７６＋７７：ＰＡＲＰ－１検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号７８＋７９：ＡＴＭ検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号８０＋８１：Ｈｉｐｋ２検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号８２＋８３：ＢＡＲＤ１検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号８４＋８５：ＨＩＦ１ＡＮ検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号８６＋８７：ＳＭＡＤ３検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号８８＋８９：ＣＤＫＮ１Ａ検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号０１：Ｌ３リコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号０２：２Ｌリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号０３：ＬｏｘＦａｓリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号０４～０６：ヒトＣＭＶプロモーターの例示的なバリアント
配列番号０７：例示的なＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列
配列番号０８：例示的なｂＧＨポリアデニル化シグナル配列
配列番号０９：例示的なｈＧＴターミネーター配列
配列番号１０：例示的なＳＶ４０プロモーター配列
配列番号１１：例示的なＧＦＰ核酸配列
配列番号１２～１４：ＳＩＲＴ－１ガイドＲＮＡ
配列番号１５～１７：ＭＹＣガイドＲＮＡ
配列番号１８～２０：ＳＴＫ１１ガイドＲＮＡ
配列番号２１～２３：ＳＭＡＤ４ガイドＲＮＡ
配列番号２４～２６：ＰＰＰ２ＣＢガイドＲＮＡ
配列番号２７～２９：ＲＢＭ３８ガイドＲＮＡ
配列番号３０～３２：ＮＦ１ガイドＲＮＡ
配列番号３３～３５：ＣＤＫ１２ガイドＲＮＡ
配列番号３６～３８：ＳＩＮ３ＡガイドＲＮＡ
配列番号３９～４１：ＰＡＲＰ－１ガイドＲＮＡ
配列番号４２～４４：ＡＴＭガイドＲＮＡ
配列番号４５～４７：Ｈｉｐｋ２ガイドＲＮＡ
配列番号４８～５０：ＢＡＲＤ１ガイドＲＮＡ
配列番号５１～５３：ＨＩＦ１ＡＮガイドＲＮＡ
配列番号５４～５６：ＳＭＡＤ３ガイドＲＮＡ
配列番号５７～５９：ＣＤＫＮ１ＡガイドＲＮＡ
配列番号６０＋６１：ＭＹＣ検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号６２＋６３：ＳＴＫ１１検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号６４＋６５：ＳＭＡＤ４検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号６６＋６７：ＰＰＰ２ＣＢ検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号６８＋６９：ＲＢＭ３８検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号７０＋７１：ＮＦ１検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号７２＋７３：ＣＤＫ１２検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号７４＋７５：ＳＩＮ３Ａ検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号７６＋７７：ＰＡＲＰ－１検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号７８＋７９：ＡＴＭ検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号８０＋８１：Ｈｉｐｋ２検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号８２＋８３：ＢＡＲＤ１検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号８４＋８５：ＨＩＦ１ＡＮ検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号８６＋８７：ＳＭＡＤ３検証プライマーのフォワード及びリバース
配列番号８８＋８９：ＣＤＫＮ１Ａ検証プライマーのフォワード及びリバース
【実施例】
【0217】
実施例１
一般的な技術
１）組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，（１９８９）に記載されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書に従って使用した。
一般的な技術
１）組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，（１９８９）に記載されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書に従って使用した。
【0218】
２）ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡシーケンシングは、ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ ＧｍｂＨ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ、ドイツ）又はＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）又はＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ（Ｂａｌｇａｃｈ、スイス）で行った。
ＤＮＡシーケンシングは、ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ ＧｍｂＨ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ、ドイツ）又はＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）又はＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ（Ｂａｌｇａｃｈ、スイス）で行った。
【0219】
３）ＤＮＡ及びタンパク質配列解析及び配列データ管理
ＥＭＢＯＳＳ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ）ソフトウェアパッケージ及びＧｅｎｅｉｏｕｓ ｐｒｉｍｅ ２０１９（Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を、配列の作成、マッピング、解析、アノテーション、及び図示のために使用した。
ＥＭＢＯＳＳ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ）ソフトウェアパッケージ及びＧｅｎｅｉｏｕｓ ｐｒｉｍｅ ２０１９（Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を、配列の作成、マッピング、解析、アノテーション、及び図示のために使用した。
【0220】
４）遺伝子及びオリゴヌクレオチド合成
所望の遺伝子セグメントを、Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ（レーゲンスブルク、ドイツ）又はＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（サンフランシスコ、米国）での化学合成によって調製した。合成された遺伝子断片を、増殖／増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって検証した。あるいは、短い合成ＤＮＡ断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングするか、ＰＣＲを介して組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドは、ｍｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ（Ｐｌａｎｅｇｇ－Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製された。
所望の遺伝子セグメントを、Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ（レーゲンスブルク、ドイツ）又はＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（サンフランシスコ、米国）での化学合成によって調製した。合成された遺伝子断片を、増殖／増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって検証した。あるいは、短い合成ＤＮＡ断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングするか、ＰＣＲを介して組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドは、ｍｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ（Ｐｌａｎｅｇｇ－Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製された。
【0221】
５）試薬
特に明記されていない限り、すべての市販の化学物質、抗体、及びキットは、製造元のプロトコルに従って提供されたとおりに使用した。
特に明記されていない限り、すべての市販の化学物質、抗体、及びキットは、製造元のプロトコルに従って提供されたとおりに使用した。
【0222】
６）ＴＩ宿主細胞株の培養
ＴＩ ＣＨＯ宿主細胞を、湿度８５％、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で３７℃で培養した。それらを、３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢと４μｇ／ｍｌの第２の選択マーカーを含む独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地で培養した。細胞を３日又は４日ごとに０．３ｘ１０Ｅ６細胞／ｍｌの濃度で総量３０ｍｌに分割した。培養には、１２５ｍｌの非バッフル三角フラスコを使用した。細胞を１５０ｒｐｍで５ｃｍの振とう振幅で振とうした。細胞数は、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）によって決定した。細胞は６０日齢に達するまで培養を続けた。
ＴＩ ＣＨＯ宿主細胞を、湿度８５％、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で３７℃で培養した。それらを、３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢと４μｇ／ｍｌの第２の選択マーカーを含む独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地で培養した。細胞を３日又は４日ごとに０．３ｘ１０Ｅ６細胞／ｍｌの濃度で総量３０ｍｌに分割した。培養には、１２５ｍｌの非バッフル三角フラスコを使用した。細胞を１５０ｒｐｍで５ｃｍの振とう振幅で振とうした。細胞数は、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）によって決定した。細胞は６０日齢に達するまで培養を続けた。
【0223】
７）クローニング
一般
Ｒ部位でのクローニングは、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の隣にあるＤＮＡ配列に依存し、これは次の断片にある配列と等しい配列である。このように、断片の組立ては、等しい配列の重なりと、それに続く、組み立てられたＤＮＡのニックのＤＮＡリガーゼによる封鎖によって可能になる。したがって、単一遺伝子、特に適切なＲ部位を含む予備ベクターのクローニングが必要である。これらの予備ベクターのクローニングが成功した後、Ｒ部位で挟まれている目的の遺伝子は、Ｒ部位のすぐ隣を切断する酵素による制限消化を介して切り出される。最後の工程は、すべてのＤＮＡ断片を１つの工程で組み立てることである。より詳細には、５’－エキソヌクレアーゼは重複領域（Ｒ部位）の５’末端を除去する。その後、Ｒ部位のアニーリングを行なうことができ、ＤＮＡポリメラーゼが３’末端を伸長して配列のギャップを埋める。最後に、ＤＮＡリガーゼはヌクレオチド間のニックを封鎖する。エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼのような異なる酵素を含むアセンブリマスターミックスを添加し、その後反応ミックスを５０℃でインキュベートすると、単一の断片の１つのプラスミドへの組み立てをもたらす。その後、コンピテント大腸菌細胞をプラスミドで形質転換する。
一般
Ｒ部位でのクローニングは、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の隣にあるＤＮＡ配列に依存し、これは次の断片にある配列と等しい配列である。このように、断片の組立ては、等しい配列の重なりと、それに続く、組み立てられたＤＮＡのニックのＤＮＡリガーゼによる封鎖によって可能になる。したがって、単一遺伝子、特に適切なＲ部位を含む予備ベクターのクローニングが必要である。これらの予備ベクターのクローニングが成功した後、Ｒ部位で挟まれている目的の遺伝子は、Ｒ部位のすぐ隣を切断する酵素による制限消化を介して切り出される。最後の工程は、すべてのＤＮＡ断片を１つの工程で組み立てることである。より詳細には、５’－エキソヌクレアーゼは重複領域（Ｒ部位）の５’末端を除去する。その後、Ｒ部位のアニーリングを行なうことができ、ＤＮＡポリメラーゼが３’末端を伸長して配列のギャップを埋める。最後に、ＤＮＡリガーゼはヌクレオチド間のニックを封鎖する。エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼのような異なる酵素を含むアセンブリマスターミックスを添加し、その後反応ミックスを５０℃でインキュベートすると、単一の断片の１つのプラスミドへの組み立てをもたらす。その後、コンピテント大腸菌細胞をプラスミドで形質転換する。
【0224】
一部のベクターでは、制限酵素を介したクローニング戦略を使用した。適切な制限酵素を選択することにより、望みの目的の遺伝子を切り出し、その後、ライゲーションによって別のベクターに挿入することができる。したがって、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）で切断する酵素を使用し、スマートな方法で選択して、正しいアレイ内の断片のライゲーションを実行できるようにすることが好ましい。ベクターと断片が以前に同じ制限酵素で切断されている場合、断片とベクターの粘着末端は完全に適合し、その後ＤＮＡリガーゼでライゲーションすることができる。ライゲーション後、コンピテント大腸菌細胞を新しく作製されたプラスミドで形質転換する。
【0225】
制限消化によるクローニング：
制限酵素によるプラスミドの消化のために、以下の成分を氷上で一緒にピペッティングした。
制限酵素によるプラスミドの消化のために、以下の成分を氷上で一緒にピペッティングした。
【0226】
（表）制限消化反応ミックス
【0227】
１回の消化でより多くの酵素を使用した場合は、各酵素１μｌを使用し、ＰＣＲグレードの水を多かれ少なかれ加えることで容積を調整した。すべての酵素は、ニューイングランドバイオラボのＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（１００％活性）での使用に適格であり、同じインキュベーション温度（すべて３７℃）であるという前提条件で選択された。
【0228】
サーモミキサー又はサーマルサイクラーを使用してインキュベーションを行い、試料を一定温度（３７℃）でインキュベートできるようにした。インキュベーション中、試料は攪拌されなかった。インキュベーション時間は６０分に設定された。その後、試料をローディング色素と直接混合し、アガロース電気泳動ゲルにロードするか、さらなる使用のために４℃／氷上で保存した。
【0229】
ゲル電気泳動用に１％アガロースゲルを調製した。そのため、１．５ｇの多目的アガロースを１２５三角フラスコに量り取り、１５０ｍｌのＴＡＥ緩衝液で満たした。アガロースが完全に溶解するまで、混合物を電子レンジで加熱した。０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムをアガロース溶液に加えた。その後、ゲルを型に流し込んだ。アガロースが固まった後、型を電気泳動チャンバーに入れ、チャンバーをＴＡＥ緩衝液で満たした。その後、試料をロードした。（左から）最初のポケットに、適切なＤＮＡ分子量マーカーをロードし、続いて試料をロードした。ゲルは＜１３０Ｖで約６０分間泳動した。電気泳動後、ゲルをチャンバーから取り出し、ＵＶ－Ｉｍａｇｅｒで分析した。
【0230】
標的バンドを切断し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。ゲルの精製には、ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造元の指示に従って使用した。ＤＮＡ断片を、さらに使用するために－２０ °Ｃで保存した。
【0231】
ライゲーション用の断片は、挿入断片とベクター断片の長さ、及びそれらの相互の相関関係に応じて、１：２、１：３、又は１：５のベクター対挿入断片のモル比で一緒にピペッティングした。ベクターに挿入する必要のある断片が短い場合は、１：５の比率を使用した。挿入断片がより長ければ、ベクターとの相関関係で使用される挿入断片の量はより少なくなる。各ライゲーションで５０ｎｇのベクター量を使用し、特定の挿入断片量をＮＥＢｉｏＣａｌｃｕｌａｔｏｒで計算した。ライゲーションには、ＮＥＢのＴ４ ＤＮＡライゲーションキットを使用した。ライゲーション混合物の例を次の表に示す。
【0232】
（表）ライゲーション反応ミックス
【0233】
ＤＮＡと水の混合から始めて、バッファーの添加、最後に酵素の添加は、すべての成分を氷上で一緒にピペッティングした。反応物を上下にピペッティングすることにより穏やかに混合し、短時間マイクロ遠心分離し、次に室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、Ｔ４リガーゼを６５℃で１０分間熱失活させた。試料を氷上で冷却した。最後の工程で、１０－βコンピテント大腸菌細胞を２μｌのライゲーションプラスミドで形質転換した（以下を参照）。
【0234】
Ｒ部位アセンブリによるクローニング：
アセンブリのために、両端にＲ部位を持つすべてのＤＮＡ断片を、氷上で一緒にピペッティングした。４つを超える断片を組み立てる場合は、製造業者の推奨どおり、すべての断片の等モル比（０．０５ｎｇ）を使用した。反応ミックスの２分の１を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリマスターミックスによって実施した。総反応量は４０μｌであり、ＰＣＲクリーン水を満たして到達させた。次の表に、例示的なピペッティングスキームを示す。
アセンブリのために、両端にＲ部位を持つすべてのＤＮＡ断片を、氷上で一緒にピペッティングした。４つを超える断片を組み立てる場合は、製造業者の推奨どおり、すべての断片の等モル比（０．０５ｎｇ）を使用した。反応ミックスの２分の１を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリマスターミックスによって実施した。総反応量は４０μｌであり、ＰＣＲクリーン水を満たして到達させた。次の表に、例示的なピペッティングスキームを示す。
【0235】
（表）アセンブリ反応ミックス
【0236】
反応混合物の設定後、チューブを恒常的に５０℃で６０分間サーモサイクラー中でインキュベートした。組み立てが成功した後、１０－βコンピテント大腸菌を２μｌの組み立てたプラスミドＤＮＡで形質転換した（以下を参照）。
【0237】
形質転換１０－βコンピテント大腸菌細胞：
形質転換のために、１０－βコンピテント大腸菌細胞を氷上で解凍した。その後、２μｌのプラスミドＤＮＡを細胞懸濁液に直接ピペットで移した。チューブをはじき、氷上に３０分間置いた。その後、細胞を４２℃の温かいサーマルブロックに入れ、正確に３０秒間熱ショックを与えた。その直後に、細胞を氷上で２分間冷却した。９５０μｌのＮＥＢ１０－β増殖培地を細胞懸濁液に添加した。細胞を３７℃で１時間振盪しながらインキュベートした。次に、５０～１００μｌを事前に温めた（３７℃）ＬＢ－Ａｍｐ寒天プレートにピペットで移し、使い捨てスパチュラで広げた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。プラスミドの組込みに成功しアンピシリンに対する耐性遺伝子を持っている細菌だけが、これらのプレート上で増殖可能である。翌日、単一コロニーを採取し、その後のプラスミド調製のためにＬＢ－Ａｍｐ培地で培養した。
形質転換のために、１０－βコンピテント大腸菌細胞を氷上で解凍した。その後、２μｌのプラスミドＤＮＡを細胞懸濁液に直接ピペットで移した。チューブをはじき、氷上に３０分間置いた。その後、細胞を４２℃の温かいサーマルブロックに入れ、正確に３０秒間熱ショックを与えた。その直後に、細胞を氷上で２分間冷却した。９５０μｌのＮＥＢ１０－β増殖培地を細胞懸濁液に添加した。細胞を３７℃で１時間振盪しながらインキュベートした。次に、５０～１００μｌを事前に温めた（３７℃）ＬＢ－Ａｍｐ寒天プレートにピペットで移し、使い捨てスパチュラで広げた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。プラスミドの組込みに成功しアンピシリンに対する耐性遺伝子を持っている細菌だけが、これらのプレート上で増殖可能である。翌日、単一コロニーを採取し、その後のプラスミド調製のためにＬＢ－Ａｍｐ培地で培養した。
【0238】
細菌培養：
大腸菌の培養は、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉの略であるＬＢ培地で行い、１ｍｌ／Ｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを添加して、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリン濃度にした。異なるプラスミド調製量について、以下の量に単一の細菌コロニーを接種した。
大腸菌の培養は、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉの略であるＬＢ培地で行い、１ｍｌ／Ｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを添加して、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリン濃度にした。異なるプラスミド調製量について、以下の量に単一の細菌コロニーを接種した。
【0239】
（表）大腸菌の培養の体積
【0240】
ミニプレップのために、９６ウェル２ｍｌディープウェルプレートにウェルあたり１．５ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地を充填した。コロニーを拾い、つまようじを培地に押し込んだ。すべてのコロニーが拾われたとき、プレートを粘着性の空気多孔質膜で閉じた。プレートを３７℃のインキュベーター中で２００ｒｐｍの振盪速度で２３時間インキュベートした。
【0241】
ミニプレップの場合、１５ｍｌのチューブ（通気蓋付き）に３．６ ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地を充填し、細菌コロニーを均等に接種した。つまようじは取り除かずに、インキュベーションのあいだチューブ内に残した。９６ウェルプレートと同様に、チューブを３７℃、２００ｒｐｍで２３時間インキュベートした。
【0242】
マキシプレップの場合、２００ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地をオートクレーブ処理したガラス製の１Ｌ三角フラスコに充填し、約５時間経過した１ｍｌの細菌の日中培養物を接種した。三角フラスコを紙栓で閉じ、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間インキュベートした。
【0243】
プラスミド調製：
ミニプレップの場合、５０μｌの細菌懸濁液を１ｍｌのディープウェルプレートに移した。その後、細菌細胞をプレート内で３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上澄みを除去し、細菌ペレットを含むプレートをＥｐＭｏｔｉｏｎに入れた。約９０分後、分析が行われ、溶出されたプラスミドＤＮＡをさらなる使用のためにＥｐＭｏｔｉｏｎから取り出すことができた。
ミニプレップの場合、５０μｌの細菌懸濁液を１ｍｌのディープウェルプレートに移した。その後、細菌細胞をプレート内で３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上澄みを除去し、細菌ペレットを含むプレートをＥｐＭｏｔｉｏｎに入れた。約９０分後、分析が行われ、溶出されたプラスミドＤＮＡをさらなる使用のためにＥｐＭｏｔｉｏｎから取り出すことができた。
【0244】
ミニプレップの場合、１５ ｍｌのチューブをインキュベーターから取り出し、３．６ｍｌの細菌培養物を２つの２ｍｌのエッペンドルフチューブに分割した。チューブを卓上マイクロ遠心機で６，８００ｘｇで室温で３分間遠心分離した。その後、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎミニプレップ・キットを使用して、製造元の指示に従ってミニプレップを実行した。プラスミドＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。
【0245】
マキシプレップは、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａ Ｍａｘｉ ＥＦキットを使用して、製造元の指示に従って実行した。ＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。
【0246】
エタノール沈殿：
ＤＮＡ溶液の体積を２．５倍体積のエタノール１００％と混合した。混合物を、－２０℃で１０分間インキュベートした。次に、ＤＮＡを１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上澄みを注意深く除去し、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。この場合も、チューブを１４，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上澄みをピペッティングにより注意深く除去し、ペレットを乾燥させた。エタノールが蒸発したら、適量のエンドトキシンフリーの水を加えた。ＤＮＡを４℃で一晩、水に再溶解する時間を与えた。少量のアリコートを採取し、ＮａｎｏｄｒｏｐデバイスでＤＮＡ濃度を測定した。
ＤＮＡ溶液の体積を２．５倍体積のエタノール１００％と混合した。混合物を、－２０℃で１０分間インキュベートした。次に、ＤＮＡを１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上澄みを注意深く除去し、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。この場合も、チューブを１４，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上澄みをピペッティングにより注意深く除去し、ペレットを乾燥させた。エタノールが蒸発したら、適量のエンドトキシンフリーの水を加えた。ＤＮＡを４℃で一晩、水に再溶解する時間を与えた。少量のアリコートを採取し、ＮａｎｏｄｒｏｐデバイスでＤＮＡ濃度を測定した。
【0247】
実施例２
プラスミドの作製
発現カセットの組成
抗体鎖の発現には、以下の機能的要素を含む転写単位を使用した：
－ イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
－ ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－ マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ それぞれの抗体鎖をコードする核酸、
－ ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）、及び
－ 任意に、ヒトガストリンターミネーター（ｈＧＴ）。
プラスミドの作製
発現カセットの組成
抗体鎖の発現には、以下の機能的要素を含む転写単位を使用した：
－ イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
－ ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－ マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ それぞれの抗体鎖をコードする核酸、
－ ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）、及び
－ 任意に、ヒトガストリンターミネーター（ｈＧＴ）。
【0248】
発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットのほかに、基本的／標準的な哺乳動物発現プラスミドは、
－ 大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、及び
－ 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子を含む。
－ 大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、及び
－ 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子を含む。
【0249】
フロント及びバックベクタークローニング
２プラスミド抗体構築物を構築するために、抗体ＨＣ及びＬＣ断片を、Ｌ３及びＬｏｘＦａｓ配列を含む前方ベクター骨格、並びにＬｏｘＦａｓ及び２Ｌ配列並びにＰａｃ選択マーカーを含む後方ベクターにクローニングした。ＣｒｅリコンビナーゼプラスミドｐＯＧ２３１（Ｗｏｎｇ，Ｅ．Ｔ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１９９７）１４６０２－１４６０７）を、すべてのＲＭＣＥプロセスに使用した。
２プラスミド抗体構築物を構築するために、抗体ＨＣ及びＬＣ断片を、Ｌ３及びＬｏｘＦａｓ配列を含む前方ベクター骨格、並びにＬｏｘＦａｓ及び２Ｌ配列並びにＰａｃ選択マーカーを含む後方ベクターにクローニングした。ＣｒｅリコンビナーゼプラスミドｐＯＧ２３１（Ｗｏｎｇ，Ｅ．Ｔ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１９９７）１４６０２－１４６０７）を、すべてのＲＭＣＥプロセスに使用した。
【0250】
それぞれの抗体鎖をコードするｃＤＮＡを、遺伝子合成（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）によって作製した。３７℃で１時間、遺伝子合成物及びバックボーンベクターをＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ及びＥｃｏＲＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）で消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離した。挿入断片及びバックボーンのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。製造業者のプロトコルに従って迅速ライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、３：１の挿入断片／バックボーン比で、精製した挿入断片及びバックボーン断片をライゲーションした。次いで、４２℃で３０秒間の熱ショックによってライゲーションアプローチをコンピテント大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、３７℃で１時間インキュベートした後、選択用のアンピシリンを含む寒天プレートに播種した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【0251】
翌日、クローンを採取し、ミニプレップ又はマキシプレップのために振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。これは、ＥｐＭｏｔｉｏｎ（登録商標）５０７５（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、又はそれぞれＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）／ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ ＸｔｒａマキシＥＦキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ）を用いて、実施した。すべてのコンストラクトを配列決定して、いかなる不適切な突然変異も存在しないように徹底した（ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ ＧｍｂＨ）。
【0252】
第２のクローニング工程において、第１のクローニングの場合と同じ条件を用いて、あらかじめクローニングしたベクターをＫｐｎＩ－ＨＦ／ＳａｌＩ－ＨＦ及びＳａｌＩ－ＨＦ／ＭｆｅＩ－ＨＦで消化した。ＴＩバックボーンベクターをＫｐｎＩ－ＨＦ及びＭｆｅＩ－ＨＦで消化した。分離及び抽出を、前述したようにして実施した。製造業者のプロトコルに従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、１：１：１の挿入断片／挿入断片／バックボーン比で、精製した挿入断片及びバックボーンのライゲーションを４℃で一晩実施し、６５℃で１０分間、不活性化した。前述したようにして、下記のクローニング工程を実施した。
【0253】
クローニングされたプラスミドを、ＴＩトランスフェクション及びプール作製のために使用した。
【0254】
実施例３
培養、トランスフェクション、選択及び単一細胞クローニング
ＴＩ宿主細胞を、独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地中で、１５０ｒｐｍの一定の撹拌速度で、標準的な加湿条件下（９５％ｒＨ、３７℃、及び５％ＣＯ２）で、使い捨て１２５ｍｌベント・シェイク・フラスコ内にて増殖させた。３～４日ごとに、細胞を、選択マーカー１及び選択マーカー２を有効濃度で含む合成培地に、３ｘ１０Ｅ５細胞／ｍｌの濃度で播種した。培養物の密度と生存率を、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ細胞カウンタ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で測定した。
培養、トランスフェクション、選択及び単一細胞クローニング
ＴＩ宿主細胞を、独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地中で、１５０ｒｐｍの一定の撹拌速度で、標準的な加湿条件下（９５％ｒＨ、３７℃、及び５％ＣＯ２）で、使い捨て１２５ｍｌベント・シェイク・フラスコ内にて増殖させた。３～４日ごとに、細胞を、選択マーカー１及び選択マーカー２を有効濃度で含む合成培地に、３ｘ１０Ｅ５細胞／ｍｌの濃度で播種した。培養物の密度と生存率を、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ細胞カウンタ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で測定した。
【0255】
安定したトランスフェクションのために、等モル量のフロントベクターとバックベクターを混合した。混合物５μｇあたり１μｇのＣｒｅ発現プラスミドを添加した（つまり、５μｇのＣｒｅ発現プラスミド又はＣｒｅ ｍＲＮＡを２５μｇのフロント及びバックベクター混合物に添加した）。
【0256】
トランスフェクションの２日前に、ＴＩ宿主細胞を、４ｘ１０Ｅ５細胞／ｍｌの密度で、新鮮な培地に播種した。トランスフェクションは、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＶ（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、製造元のプロトコルに従ってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイスで実施した。３ｘ１０Ｅ７細胞を、合計３０μｇの核酸、すなわち、３０μｇのプラスミド（５μｇのＣｒｅプラスミド及び２５μｇのフロント及びバックベクター混合物）、又は５μｇのＣｒｅ ｍＲＮＡ及び２５μｇのフロント及びバックベクター混合物のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、選択剤を含まない３０ｍｌの培地に播種した。
【0257】
播種後５日目に細胞を遠心分離し、組換え細胞の選択のために６ｘ１０Ｅ５細胞／ ｍｌの有効濃度のピューロマイシン（選択剤１）と１－（２’－デオキシ－２’－フルオロ－１－β－Ｄ－アラビノフラノシル－５－ヨード）ウラシル（ＦＩＡＵ；選択剤２）を含む合成培地８０ｍＬに移した。細胞を３７℃、１５０ｒｐｍでインキュベートした。この日から５％ＣＯ２、８５％湿度で、分割はしなかった。培養物の細胞密度及び生存率を定期的にモニターした。培養物の生存率が再び増加し始めたとき、選択剤１及び２の濃度を、以前に使用した量の約半分に減少させた。より詳細には、細胞の回収を促進するために、生存率が４０％より高く、かつ生細胞濃度（ＶＣＤ）が０．５×１０Ｅ６細胞／ｍＬより高い場合は選択圧を下げた。したがって、４×１０Ｅ５細胞／ｍｌを遠心分離し、選択培地ＩＩ（合成培地、１／２選択マーカー１及び２）４０ｍｌに再懸濁した。これらの細胞を以前と同じ条件で、かつこの場合も分割せずに、インキュベートした。
【0258】
選択を開始してから１０日後、細胞内ＧＦＰ及び細胞表面に結合した細胞外異種ポリペプチドの発現を測定するフローサイトメトリーによって、Ｃｒｅ媒介性カセット交換の成功を確認した。ＦＡＣＳ染色のために、ヒト抗体の軽鎖及び重鎖に対するＡＰＣ抗体（アロフィコシアニン標識Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ）を使用した。フローサイトメトリーは、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。試料あたり１万事象を測定した。生細胞を、側方散乱（ＳＳＣ）に対する前方散乱（ＦＳＣ）のプロットでゲートした。生細胞ゲートは、トランスフェクトされていないＴＩ宿主細胞で定義され、ＦｌｏｗＪｏ ７．６．５ ＥＮソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、オルテン、スイス）を用いて、全ての試料に適用された。ＧＦＰの蛍光を、ＦＩＴＣチャネル（４８８ｎｍでの励起、５３０ｎｍでの検出）で定量化した。異種ポリペプチドを、ＡＰＣチャネル（６４５ｎｍでの励起、６６０ｎｍでの検出）で測定した。親ＣＨＯ細胞、すなわちＴＩ宿主細胞の作製に使用した細胞を、ＧＦＰ及び異種ポリペプチドの発現に関して陰性対照として使用した。選択開始から１４～２１日後、生存率は９０％を超え、選択は完了したと見なされた。
【0259】
選択後、安定的にトランスフェクトされた細胞のプールを、限界希釈による単一細胞クローニングに供することができる。この目的のために、細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で染色し、３８４ウェルプレートに０．６細胞／ウェルで播種する。単一細胞クローニング及びその後の全ての培養工程では、選択剤２を培地から除外する。１つの細胞のみを含むウェルを、明視野及び蛍光ベースのプレートイメージングによって同定する。１つの細胞を含むウェルのみを、さらに検討する。プレーティング後約３週間で、コンフルエントなウェルからコロニーを採取し、９６ウェルプレートでさらに培養する。
【0260】
実施例４
ＦＡＣＳスクリーニング
ＦＡＣＳ解析を実施して、トランスフェクション効率及びトランスフェクションのＲＭＣＥ効率を調べた。トランスフェクトされたアプローチの４×１０Ｅ５細胞を遠心分離し（１２００ｒｐｍ、４分）、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを用いる洗浄工程の後、沈殿物を４００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳチューブ（セルストレーナーキャップ付きのＦａｌｃｏｎ（登録商標）丸底チューブ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩを用いて測定を実施し、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏを用いてデータを解析した。
ＦＡＣＳスクリーニング
ＦＡＣＳ解析を実施して、トランスフェクション効率及びトランスフェクションのＲＭＣＥ効率を調べた。トランスフェクトされたアプローチの４×１０Ｅ５細胞を遠心分離し（１２００ｒｐｍ、４分）、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを用いる洗浄工程の後、沈殿物を４００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳチューブ（セルストレーナーキャップ付きのＦａｌｃｏｎ（登録商標）丸底チューブ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩを用いて測定を実施し、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏを用いてデータを解析した。
【0261】
実施例５
フェドバッチ培養
フェドバッチ生産培養は、独自の既知組成培地を含む振盪フラスコ又はＡｍｂｒ１５容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）で実施した。細胞を０日目に２×１０Ｅ６細胞／ｍｌで播種した。３、７、及び１０日目に、培養物に独自のフィード培地を加えた。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を使用して、０、３、７、１０、及び１４日目に、培養物中の細胞の生存細胞数（ＶＣＣ）及び生存率割合を測定した。グルコース、乳酸及び生成物力価の濃度を、３、５、７、１０、１２及び１４日目にＣｏｂａｓアナライザー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を使用して測定した。フェドバッチ培養開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍ及び１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィを使用して、１４日目の力価を測定した。製品の品質は、ＣａｌｉｐｅｒのＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定した。
フェドバッチ培養
フェドバッチ生産培養は、独自の既知組成培地を含む振盪フラスコ又はＡｍｂｒ１５容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）で実施した。細胞を０日目に２×１０Ｅ６細胞／ｍｌで播種した。３、７、及び１０日目に、培養物に独自のフィード培地を加えた。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を使用して、０、３、７、１０、及び１４日目に、培養物中の細胞の生存細胞数（ＶＣＣ）及び生存率割合を測定した。グルコース、乳酸及び生成物力価の濃度を、３、５、７、１０、１２及び１４日目にＣｏｂａｓアナライザー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を使用して測定した。フェドバッチ培養開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍ及び１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィを使用して、１４日目の力価を測定した。製品の品質は、ＣａｌｉｐｅｒのＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定した。
【0262】
実施例６
ＣＨＯ細胞におけるＲＮＰベースのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子ノックアウト
材料／リソース：
● ガイド及びプライマー設計のためのＧｅｎｅｉｏｕｓ １１．１．５ソフトウェア
● ＣＨＯ ＴＩ宿主細胞株；培養状態：３０～６０日目
● ＴｒｕｅＣｕｔ（商標）Ｃａｓ９ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｖ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））
● ＴｒｕｅＧｕｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇＲＮＡ（標的遺伝子に対して特注設計、３ｎｍ未修飾ｇＲＮＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
● ＴｒｕｅＧｕｉｄｅ（商標）ｓｇＲＮＡネガティブコントロール、非ターゲティング１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
● 培地（２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ、４μｇ／ｍｌの選択剤２）
● ＤＰＢＳ－ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Ｃａ及びＭｇを含まず）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
● マイクロプレート２４ディープウェルプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｏｒｖｏｉｒ ｓｃｉｅｎｃｅ）、カバー（自作）付き
● ＯＣ－１００カセット装着用の細長いＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ、パイロジェンフリーのフィルターチップ。（Ｂｉｏｚｙｍｅ）
● Ｈｅｒａ Ｓａｆｅ Ｈｏｏｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
● Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）
● Ｌｉｃｏｎｉｃ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ Ｓｔｏｒｅｘ ＩＣ
● ＨｙＣｌｏｎｅエレクトロポレーション緩衝液
● ＭａｘＣｙｔｅ ＯＣ－１００カセット
● ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸエレクトロポレーションシステム
ＣＨＯ細胞におけるＲＮＰベースのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子ノックアウト
材料／リソース：
● ガイド及びプライマー設計のためのＧｅｎｅｉｏｕｓ １１．１．５ソフトウェア
● ＣＨＯ ＴＩ宿主細胞株；培養状態：３０～６０日目
● ＴｒｕｅＣｕｔ（商標）Ｃａｓ９ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｖ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））
● ＴｒｕｅＧｕｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇＲＮＡ（標的遺伝子に対して特注設計、３ｎｍ未修飾ｇＲＮＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
● ＴｒｕｅＧｕｉｄｅ（商標）ｓｇＲＮＡネガティブコントロール、非ターゲティング１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
● 培地（２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ、４μｇ／ｍｌの選択剤２）
● ＤＰＢＳ－ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Ｃａ及びＭｇを含まず）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
● マイクロプレート２４ディープウェルプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｏｒｖｏｉｒ ｓｃｉｅｎｃｅ）、カバー（自作）付き
● ＯＣ－１００カセット装着用の細長いＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ、パイロジェンフリーのフィルターチップ。（Ｂｉｏｚｙｍｅ）
● Ｈｅｒａ Ｓａｆｅ Ｈｏｏｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
● Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）
● Ｌｉｃｏｎｉｃ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ Ｓｔｏｒｅｘ ＩＣ
● ＨｙＣｌｏｎｅエレクトロポレーション緩衝液
● ＭａｘＣｙｔｅ ＯＣ－１００カセット
● ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸエレクトロポレーションシステム
【0263】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＲＮＰ送達
５μｇのＣａｓ９を１μｇのｇＲＮＡ混合物（等しい比の各ｇＲＮＡ－例示的な遺伝子特異的ｇＲＮＡ配列については以下の表を参照）と１０μＬのＰＢＳ中で混合することによってＲＮＰを予め組み立て、ＲＴで２０分間インキュベートした。２－４ｘ１０Ｅ６細胞／ｍＬの間の濃度の細胞を遠心分離（３分間、３００ｇ）し、５００μＬのＰＢＳで洗浄した。洗浄工程の後、細胞を再度遠心分離し（３００ｇで３分間）、９０μＬのＨｙＣｌｏｎｅエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁すした。あらかじめインキュベートしたＲＮＰミックスを細胞に加え、５分間インキュベートした。次に、この細胞／ＲＮＰ溶液をＯＣ－１００キュベットに移し、ＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーションシステムを使用してプログラム「ＣＨＯ２」でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション直後、細胞懸濁液を２４ウェル（ｄｗｅｌｌ）に移し、３７℃で３０分間インキュベートした。新鮮で予熱した培地を添加して、最終細胞濃度を１×１０Ｅ６にし、細胞増殖のために３５０ ｒｐｍで振盪しながら３７°Ｃでインキュベートした。ゲノムＤＮＡ調製（６日目又は８日目）のために、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔキット（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を細胞に添加し、ＰＣＲ鋳型として利用した。特定の遺伝子アンプリコンを、標準的なＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅプロトコル（ＮＥＢ）及びｇＲＮＡ標的部位にまたがる遺伝子特異的プライマーを使用してＰＣＲ増幅した（例については以下の表を参照）。それぞれのアンプリコンをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨによるＳａｎｇｅｒシーケンシングによって分析して、ノックアウトによる遺伝子不活性化を検証した（例については図１～図１３を参照）。
５μｇのＣａｓ９を１μｇのｇＲＮＡ混合物（等しい比の各ｇＲＮＡ－例示的な遺伝子特異的ｇＲＮＡ配列については以下の表を参照）と１０μＬのＰＢＳ中で混合することによってＲＮＰを予め組み立て、ＲＴで２０分間インキュベートした。２－４ｘ１０Ｅ６細胞／ｍＬの間の濃度の細胞を遠心分離（３分間、３００ｇ）し、５００μＬのＰＢＳで洗浄した。洗浄工程の後、細胞を再度遠心分離し（３００ｇで３分間）、９０μＬのＨｙＣｌｏｎｅエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁すした。あらかじめインキュベートしたＲＮＰミックスを細胞に加え、５分間インキュベートした。次に、この細胞／ＲＮＰ溶液をＯＣ－１００キュベットに移し、ＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーションシステムを使用してプログラム「ＣＨＯ２」でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション直後、細胞懸濁液を２４ウェル（ｄｗｅｌｌ）に移し、３７℃で３０分間インキュベートした。新鮮で予熱した培地を添加して、最終細胞濃度を１×１０Ｅ６にし、細胞増殖のために３５０ ｒｐｍで振盪しながら３７°Ｃでインキュベートした。ゲノムＤＮＡ調製（６日目又は８日目）のために、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔキット（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を細胞に添加し、ＰＣＲ鋳型として利用した。特定の遺伝子アンプリコンを、標準的なＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅプロトコル（ＮＥＢ）及びｇＲＮＡ標的部位にまたがる遺伝子特異的プライマーを使用してＰＣＲ増幅した（例については以下の表を参照）。それぞれのアンプリコンをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨによるＳａｎｇｅｒシーケンシングによって分析して、ノックアウトによる遺伝子不活性化を検証した（例については図１～図１３を参照）。
【0264】
実施例７
４日間バッチ培養
バッチ生産培養は、独自の化学的に定義された培地を含む６ウェル、ディープウェルプレート又は２４ウェル、ディープウェルプレート又は振盪フラスコで行った。５ｘ１０Ｅ６細胞／ｍｌで細胞を播種した。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＣｅｌｌａｖｉｓｔａ（Ｓｙｎｅｎｔｅｃ ＧｍｂＨ，Ｅｌｍｓｈｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、０、２、４日目に、培養物中の細胞の生存細胞数（ＶＣＣ）及び生存率割合を測定した。グルコース濃度、乳酸塩濃度及び生成物力価を、Ｃｏｂａｓ分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して０、２、４日目に測定した。バッチ開始後４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍ、続いて１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィを使用して、力価を測定した。製品の品質は、ＣａｌｉｐｅｒのＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定した。
４日間バッチ培養
バッチ生産培養は、独自の化学的に定義された培地を含む６ウェル、ディープウェルプレート又は２４ウェル、ディープウェルプレート又は振盪フラスコで行った。５ｘ１０Ｅ６細胞／ｍｌで細胞を播種した。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＣｅｌｌａｖｉｓｔａ（Ｓｙｎｅｎｔｅｃ ＧｍｂＨ，Ｅｌｍｓｈｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、０、２、４日目に、培養物中の細胞の生存細胞数（ＶＣＣ）及び生存率割合を測定した。グルコース濃度、乳酸塩濃度及び生成物力価を、Ｃｏｂａｓ分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して０、２、４日目に測定した。バッチ開始後４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍ、続いて１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィを使用して、力価を測定した。製品の品質は、ＣａｌｉｐｅｒのＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定した。
【0265】
実施例８
フェドバッチ培養
流加生産培養は、独自の合成培地を含む振盪フラスコ又はＡｍｂｒ１５容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）で実施した。細胞を２×１０Ｅ６細胞／ｍｌで播種した。３、７、及び１０日目に、培養物に独自のフィード培地を加えた。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、０、３、７、１０、及び１４日目に、培養物中の細胞の生存細胞数（ＶＣＣ）及び生存率割合を測定した。グルコース濃度、乳酸塩濃度及び生成物力価を、Ｃｏｂａｓ分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して３、５、７、１０、１２及び１４日目に測定した。フェドバッチ開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍ、続いて１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィを使用して、１４日目の力価をさらに決定した。製品の品質は、ＣａｌｉｐｅｒのＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定した。
フェドバッチ培養
流加生産培養は、独自の合成培地を含む振盪フラスコ又はＡｍｂｒ１５容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）で実施した。細胞を２×１０Ｅ６細胞／ｍｌで播種した。３、７、及び１０日目に、培養物に独自のフィード培地を加えた。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、０、３、７、１０、及び１４日目に、培養物中の細胞の生存細胞数（ＶＣＣ）及び生存率割合を測定した。グルコース濃度、乳酸塩濃度及び生成物力価を、Ｃｏｂａｓ分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して３、５、７、１０、１２及び１４日目に測定した。フェドバッチ開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍ、続いて１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィを使用して、１４日目の力価をさらに決定した。製品の品質は、ＣａｌｉｐｅｒのＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定した。
【0266】
実施例９
高細胞密度のフェドバッチ培養
フェドバッチ生産培養は、独自の既知組成培地を含むＡｍｂｒ １５容器又はＡｍｂｒ ２５０容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）で実施した。細胞を０日目に１５×１０Ｅ６細胞／ｍｌで播種した。１、３、及び６日目に、培養物に独自のフィード培地を加えた。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を使用して、０、３、７、１０、及び１４日目に、培養物中の細胞の生存細胞数（ＶＣＣ）及び生存率割合を測定した。グルコース濃度、乳酸塩濃度及び生成物力価を、Ｃｏｂａｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して３、５、７、１０、１２、及び１４日目に測定した。培養開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍ、続いて１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィを使用して、１４日目の力価をさらに決定した。製品の品質は、ＣａｌｉｐｅｒのＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定した。
高細胞密度のフェドバッチ培養
フェドバッチ生産培養は、独自の既知組成培地を含むＡｍｂｒ １５容器又はＡｍｂｒ ２５０容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）で実施した。細胞を０日目に１５×１０Ｅ６細胞／ｍｌで播種した。１、３、及び６日目に、培養物に独自のフィード培地を加えた。Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を使用して、０、３、７、１０、及び１４日目に、培養物中の細胞の生存細胞数（ＶＣＣ）及び生存率割合を測定した。グルコース濃度、乳酸塩濃度及び生成物力価を、Ｃｏｂａｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して３、５、７、１０、１２、及び１４日目に測定した。培養開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍ、続いて１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィを使用して、１４日目の力価をさらに決定した。製品の品質は、ＣａｌｉｐｅｒのＬａｂＣｈｉｐ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定した。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図11-4】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【配列表】
【国際調査報告】