特表 2023-542233 オリゴペプチドの生産のための組換え酵母

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-05

(54)【発明の名称】オリゴペプチドの生産のための組換え酵母

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/19 20060101AFI20230928BHJP

   C07K 5/093 20060101ALI20230928BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230928BHJP

   C07K 1/14 20060101ALN20230928BHJP

   C12N 15/57 20060101ALN20230928BHJP

【ＦＩ】

C12N1/19 ZNA

C07K5/093

C12P21/02

C07K1/14

C12N15/57

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023518755

(86)(22)【出願日】2021-09-27

(85)【翻訳文提出日】2023-05-22

(86)【国際出願番号】 EP2021076468

(87)【国際公開番号】W WO2022064027

(87)【国際公開日】2022-03-31

(31)【優先権主張番号】102020000022846

(32)【優先日】2020-09-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】506261567

【氏名又は名称】ルサッフル・エ・コンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＬＥＳＡＦＦＲＥ ＥＴ ＣＯＭＰＡＧＮＩＥ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】ダリー，シモーナ

(72)【発明者】

【氏名】ガッリアーニ，ステファノ

(72)【発明者】

【氏名】ビュジエロ，インマコラータ

(72)【発明者】

【氏名】グリギス，マッテオ

(72)【発明者】

【氏名】タグリアーニ，アウロ・ロベルト

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA06

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA24

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA12

4H045CA10

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＰＥＰ４遺伝子が不活性化される組換え酵母に関する。前記酵母は、オリゴペプチドの生産に有用である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＥＰ４遺伝子、及び
γ－ＧＴ又はＤＵＧ経路を介したグルタチオン分解に関与する少なくとも１つの遺伝子
の不活性化により遺伝子組換えされた酵母。

【請求項2】

請求項１記載の酵母であって、ここで、前記γ－ＧＴ又はＤＵＧ経路を介したグルタチオン分解に関与する遺伝子が、ＥＣＭ３８、ＤＵＧ１、ＤＵＧ２及びＤＵＧ３から選択される、酵母。

【請求項3】

請求項１～２記載の酵母であって、ここで、前記ＰＥＰ４遺伝子の不活性化が、遺伝子の全欠失又は部分欠失、あるいは変異原性又は外因性ＤＮＡの挿入、特に外因性ＤＮＡを用いた相同組換えにより得られる、酵母。

【請求項4】

一倍体又は二倍体である、請求項１～３記載の酵母であって、且つここで、ＰＥＰ４遺伝子の複写物の一方又は両方が不活性化されている、酵母。

【請求項5】

サッカロマイセス及びピキアから選択される属に属する、請求項１～４記載の酵母。

【請求項6】

Ｓ・セレビシエ及びＰ・パストリスから選択される、請求項５記載の酵母。

【請求項7】

ＧＳＨ１又はＧＳＨ２遺伝子の１つ以上の追加の複写物の導入によりさらに遺伝子組換えされる、請求項１～６記載の酵母。

【請求項8】

Ｓ・セレビシエ種に属する、請求項１から７記載の酵母であって、その菌株が、登録番号ＣＮＣＭＩ－５５７４又はＣＮＣＭＩ－５５７５でＣＮＣＭ-ＩｎｓｔｉｔｕｔｅＰａｓｔｅｕｒに寄託されている、酵母。

【請求項9】

以下の工程：
（ｉ）請求項１から７において定義された酵母を培養し、それによってバイオマスを形成する工程
（ｉｉ）このバイオマスからグルタチオンを分離し、そして精製する工程
を含む、グルタチオンの生産のための発酵プロセス。

【請求項10】

請求項９の工程（ｉ）記載のプロセスにより得ることが可能な、グルタチオン生産のためのバイオマス。

【請求項11】

グルタチオンの調製のための請求項１～８に定義された酵母の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、オリゴペプチドの発酵生産、具体的には、γ－グルタミル－システイニル－グリシンの生産に有用な遺伝子組換え酵母に関する。

【背景技術】

【0002】

グルタチオン(J. De Rey Pallade, Bull. Chem. Soc. France 31, 987-91, 1904)は、通常、動物細胞中に存在するトリペプチド（γ－グルタミル－システィニル－グリシン、しばしばＧＳＨとして示される）であり、主に解毒剤（グルタチオニル誘導体の形での毒素の除去）、金属キレート剤及び還元剤の役割と共に、多くの生化学的プロセスにおいて酵素基質として関与する。還元剤の役割としては、グルタチオンは、フリーラジカルを還元し、一般的に細胞の老化プロセスを抑制する中で相当な重要性を有する。グルタチオンは酸化する傾向があり、ジスルフィド架橋の存在を特徴とする二量体を形成し、しばしばＧＳＳＧ又は「酸化型グルタチオン」として示される。酸化型と還元型の２つの型は、インビボで共存する。グルタチオンは（還元型と酸化型の両方で）、その生理的重要性の観点から、医薬品、栄養補助食品及び化粧品の処方において有効成分として使用される。

【0003】

グルタチオンは、化学的合成によって調製することができるが、通常は、より安価で、光学的に純粋な形態の製品をもたらすバイオテクノロジーによって生産される(Li et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 233-42, 2004)。バイオマスは、発酵培養液から分離され、その後、溶解（lysis）を受けて上澄中にグルタチオンを放出することができ；その後、グルタチオンは、精製され、固体の形態で単離される。グルタチオンの最も一般的な精製方法は、酸化銅又は銅塩を用いた反応（米国特許第２７０２７９９号）及びそれに続くヒドロ亜硫酸又はその塩を用いた反応（中国特許第１０６２２０７０８号）あるいは電気化学的還元（欧州特許第２４３９３１２号、欧州特許第２９６３１５６号）を含む。あるいは、（欧州特許第１３９１５１７号）、グルタチオンは、クロマトグラフィーのみで精製でき、したがって安全性及び環境上の理由から銅及びＨ_２Ｓの使用を避けることができる。

【0004】

前記文献中の様々な例には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属及びカンジダ（Candida）属の野生型又は遺伝子組換え酵母でのグルタチオンの生産（欧州特許第１３９１５１７号、欧州特許第１５１２７４７号、米国特許第２０１８／０１３５１４２号）、又は遺伝子組換え大腸菌（Escherichia coli）（欧州特許第２０８８１５３号）などの細菌由来の他の微生物でのグルタチオンの生産が記載されている。

【0005】

ＧＳＨは、バイオマス中に蓄積されるか、上清中に排泄される(M. Rollini et al., Production of glutathione in extracellular form by Saccharomyces cerevisiae, Process Biochemistry 45, 441-445, 2010)。

【0006】

Ｓ・セレビシエ（S.cerevisiae）におけるグルタチオンの生合成は、２つの連続した反応を含む。第１の反応は、酵素グルタミン酸 システインリガーゼにより触媒され、Ｌ－グルタミン酸とシステインから始まって、γ－Ｌ－グルタミル－システインの合成をもたらす。第２の反応は、酵素グルタチオン シンセターゼにより触媒され、グリシンをジペプチド γ－Ｌ－グルタミル－システインに結合させ、それによりグルタチオン、又はトリペプチド γ－Ｌ－グルタミル－Ｌ－システイニル－グリシン（γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ）を形成する。生合成は、組換え菌株において、分子生物学的手法を用いて増加させることができる。

【0007】

生合成法との競合では、バイオマス中でグルタチオンの蓄積を防止する生分解法も存在し；グルタチオンは、それぞれの酵素によって触媒される反応により代謝されて、３つの構成アミノ酸に再変換される。知られている主な分解経路では、第１の酵素であるγグルタミルトランスペプチダーゼ（遺伝子ＥＣＭ３８によりコードされる）は、γ－Ｌ－グルタミルを加水分解して、ジペプチド システイニル－グリシンの形成をもたらし、そしてグルタミン酸を放出する；第２の酵素であるシステイニル－グリシン ペプチダーゼは、ジペプチドを加水分解して、システイン及びグリシンを放出する。そのため、グルタチオンの分解は、ジペプチド システイニル－グリシン（Ｃｙｓ－Ｇｌｙ）の形成をもたらす。

【0008】

第２のＧＳＨ分解経路は、組換え出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株が要求されており、ここで、前記主要経路は欠失されている(Kumar et al., FEMS Microbiology Lett 219, 187-94, 2003)。次いで、前記第２の経路が特定され、そして遺伝子ＤＵＧ１、ＤＵＧ２及びＤＵＧ３によりコードされる３つの酵素を含む「ＤＵＧ複合体」により触媒されることが証明された。具体的には、その経路は、プロテアーゼ（ＤＵＧ１、ジペプチダーゼとも呼ばれる）を伴う、ペプチダーゼ（ＤＵＧ２）及びグルタミン アミドトランスフェラーゼ（ＤＵＧ３）の複合作用を含む(Bachhawat et al., Genetics 175, 1137-51, 2007)。

【0009】

工業生産のためには、バイオマス中の濃度が最大レベルに達したとき、発酵の最後で、グルタチオンの分解を制限することが重要であり；工業的な量のバイオマスを処理するには、必然的に数時間の処理時間が必要であり、その間、製品の分解は収量の減少を伴い、精製を複雑にする。したがって、Kumar et al., J Biol Chem 287, 4552-61, 2012に記載されているように、遺伝子ＥＣＭ３８によりコードされるγ－ＧＴ経路と、遺伝子ＤＵＧ１，ＤＵＧ２及びＤＵＧ３によりコードされるＤＵＧ経路の両方を不活性化することによって、分解を防止することを検討するのが合理的であろう。

【0010】

しかし、前記２つのグルタチオン分解経路の二重の欠失では、後述するように不十分である。

【発明の概要】

【0011】

本発明の説明
現在、第３のグルタチオン分解経路が存在することが発見されている。実際、上記の２つの分解経路の二重欠失を保持している組換え酵母でも、グルタチオンを分解することが可能であり；発酵の最後で、バイオマスのＧＳＨ含有量が急速に低下する傾向があり、化学的な（自発的な）分解によるものよりもはるかに低下が速い。したがって、前記分解は酵素的であり、そして工業生産から得ることが可能な収量に対して明らかに悪影響を及ぼす。

【0012】

驚くべきことに、現在、既に公知であり通常酵母中に存在する酵素、すなわち、アスパルチルプロテアーゼ又はプロテイナーゼＡとして知られ、ＰＥＰ４遺伝子によりコードされるプロテアーゼ(Ammerer et al., Mol Cell Biology, 6, 2490-2499,1986)が、加水分解によってグルタチオンをグリシンとγ－Ｌ－グルタミル－システイン（γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ）に分解することが見出されている。

【0013】

プロテイナーゼＡは、Ｓ・セレビシエの液胞中に存在するタンパク質分解性酵素であり、古くからペプシン様アスパルチル プロテイナーゼとして知られ、分類されており；アスパルチルプロテイナーゼは、異なる機能と異なる最適pHの範囲を伴って、脊椎動物、真菌、植物及びレトロウイルス中に広く分布している。機能の違いは、そのファミリーに属する酵素をコードするゲノム配列の間の低い相同性に反映される(Parr et al., Yeast, 2007)。

【0014】

ビールの製造では、Ｓ・セレビシエのプロテイナーゼＡが、泡の形成に寄与するタンパク質の分解に関与しており；ＰＥＰ４遺伝子の欠失は、ビールの泡のより良い品質とより高い安定性をもたらす(Wang et al., Int J of Food Microbiol, 2007; 中国特許第１９４８４６２号)。

【0015】

プロテイナーゼＡの不活性化は、ヒト副甲状腺ホルモンの生産に使用されるピキア・パストリス（Pichia pastoris）の組換え菌株においても記載されており、これは、前記副甲状腺ホルモンのタンパク質分解を防止するためである (Wu et al., J Ind Microbiol Biotechnol, 2013)。

【0016】

しかし、プロテイナーゼＡが、グルタチオンに果たすことが出来、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドの形成を伴う分解を引き起こす作用については、今まで一度も述べられていない。したがって、ＰＥＰ４遺伝子を不活性化することによって、バイオマス中のグルタチオンの安定性が改善されることは、予想されていなかった。

【0017】

実際、活性型のプロテイナーゼＡの存在は、バイオマス中で、部分的に加水分解されるグルタチオンの蓄積に悪影響を及ぼすことが実証されている。加水分解の生成物は、グルタチオン分解経路から予想されるようなシステイニル－グリシン（Ｃｙｓ－Ｇｌｙ）ジペプチドではなく、γ－Ｌ－グルタミル－システイン ジペプチド（γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ）である。したがって、活性型のプロテイナーゼＡの存在は、生産されるグルタチオンの安定性に悪影響を及ぼす。これは特に、発酵プロセスの最後と、次の段階のグルタチオンの溶解、抽出及び精製の間の期間に観察される。前記プロセスの条件下では、バイオマスのグルタチオン含有量の減少と同時に、γ－Ｌ－グルタミル－システイン ジペプチド（γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ）含有量の増加が観察される。

【0018】

γ－Ｌ－グルタミル－システイン ジペプチド（γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ）はまた、それが、グルタチオンの特徴に非常に類似している化学的特徴（還元する能力及び金属錯体化する能力を有する、遊離チオールの存在）及び生化学的特徴（分子量、等電点）を有しているために、グルタチオンから分離することが難しい不純物である。したがって、高濃度のγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドの存在は、グルタチオンの精製プロセスを妨害する可能性がある。したがって、ＰＥＰ４遺伝子の欠失のさらなる利点は、酵母の菌株から得られるグルタチオンのより効率的な精製プロセスである。

【0019】

本発明は、酵母の菌株からなり、ここで、ＰＥＰ４遺伝子は、機能的に、例えば、その遺伝子構造又は発現を変えることにより減少しているか、又は部分的又は完全な遺伝子欠失により抑制されており；したがって、プロテイナーゼＡ酵素は産生されないか、又は触媒活性のない形で産生される。これが、細胞によって産生され、そしてバイオマス中に含有されるグルタチオンの経時的な安定性を高め、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドの低い濃度を維持し、製品の品質とプロセスの収率に有益となる。

【0020】

この酵素を不活性化するさらなる方法は、プロテアーゼ阻害剤、より具体的にはアスパルチルプロテアーゼ阻害剤を加えることである。前記物質は、酵素の活性を阻害し、結果としてこの酵素はグルタチオン分解活性を発揮できなくなる。

【0021】

したがって、前記作用の最終的な結果は、グルタチオンを製造するプロセスの効率を高めることである。

【0022】

発明の詳細な説明
本発明の対象は、グルタチオンを産生することができる組換え微生物であって、ここで、プロテイナーゼＡをコードするＰＥＰ４遺伝子は、前記微生物中で不活性化されていることを特徴とする。

【0023】

本発明の一態様では、前記微生物が一倍体酵母又は二倍体酵母のような酵母であることが求められる。本発明の具体的な実施態様では、前記微生物は、二倍体酵母であって、ここで、ＰＥＰ４遺伝子の両方の複写物は不活性化されている。

【0024】

本発明によれば、ＰＥＰ４遺伝子は、その全欠失又は部分欠失によるか、あるいは相同の組換えプロセスを用いた選択マーカーのような変異原生又は外因性ＤＮＡの挿入により不活性化することができる。いずれにせよ、遺伝子の不活性化は、プロテイナーゼＡの発現を消失させるか又は減少させるか、あるいは機能性の無いプロテイナーゼＡの発現を引き起こす。

【0025】

本発明は、以下を実証する：
－ＰＥＰ４遺伝子の不活性化は、生産されたグルタチオンの安定性を改善する一方で、そ の力価は室温で安定なままである；
－ＰＥＰ４遺伝子の不活性化は、発酵条件下でγ－グルタミル－システイン ジペプチド （γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ）の存在を減少させる；
－グルタチオンのγ－Ｌ－グルタミル－システイン（γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ）への分解も、 非発酵条件下、生成物の精製中（下流）で減少させる。

【0026】

好ましい実施態様では、本発明は、ＰＥＰ４遺伝子、及びγ－ＧＴ又はＤＵＧ経路を介したグルタチオンの分解に関与する少なくとも１つの遺伝子の不活性化による遺伝子組換え酵母を提供する。γ－ＧＴ又はＤＵＧ経路を介したグルタチオンの分解に関与する前記遺伝子は、好ましくは、ＥＣＭ３８、ＤＵＧ１、ＤＵＧ２及びＤＵＧ３から選択される。

【0027】

酵母において、特定の標的遺伝子は、所与の遺伝子を別の（マーカー）遺伝子（例えば、抗生物質又は別の毒性物質、栄養要求性マーカー又はその他の遺伝子に対する耐性を付与する遺伝子）に置き換える組換え機序によって、不活性化することができる。その後の工程を容易にするために、マーカー遺伝子は、ＤＮＡ断片の除去を触媒する特定のリコンビナーゼにより認識される短い反復配列に挟まれるように構成され、その後、マーカー遺伝子を除去する。例えば、「Ｃｒｅ」又は「Ｒ」と呼ばれるリコンビナーゼにより認識される配列ＬｏｘＰ又はＬｏｘＲは、このように使用することができ、そして実質的に同等である多数の代替方法が存在する。

【0028】

本発明によれば、グルタチオンの生合成能力を高めるように設計された、微生物の他の遺伝子改変も、例えば、以下に記載されるように、ＧＳＨ１及びＧＳＨ２遺伝子の１つ以上の複写物を挿入することによって、効果を与えることができる。

【0029】

本発明の具体的な実施態様では、ＰＥＰ４遺伝子の不活性化により得られる組換え微生物は、サッカロマイセス・セレビシエ種に属する微生物である。Ｓ・セレビシエのＰＥＰ４遺伝子は、１２１８個のヌクレオチド（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１８３９６８．１）からなり、ＸＶＩ染色体におけるＳ・セレビシエのゲノムに位置し、その２つの複写物は、二倍体細胞中に存在する。

【0030】

本発明の代表的な実施態様によれば、グルタチオンを産生することができる組換え微生物は、Ｓ・セレビシエに由来するが、その酵母グループに属するいずれの微生物も使用することができる。前記微生物の例としては、Ｃ・ウティリス（C.utilis）などのカンジダ（Candida）属、Ｐ・パストリス（P.pastoris）などのピキア（Pichia）属、Ｋ・ラクティス（K.lactis）などのクリベロマイセス（Kluyveromyces）属、及び分裂酵母（S.pombe）などのシゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属に属する酵母が挙げられる。

【0031】

本発明による組換え微生物の由来となる酵母は、好ましくは、プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＰＥＰ４遺伝子を天然に含有する、Ｓ．セレビシエである、二倍体の菌株ＧＮ２３６１又はＧＮ２３６２又はＧＮ２３７３である。Ｓ．セレビシエ菌株ＧＮ２３６１、ＧＮ２３６２及びＧＮ２３７３は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に保管されているＳ．セレビシエ菌株ＢＹ４７４２に順次由来し、コードＡＴＣＣ２０１３８９が割り当てられている。菌株ＢＹ４７４２から始まって、公知の技術に従って行われた遺伝子工学的手法により、ＥＣＭ３８、ＤＵＧ２及びＧＣＧ１遺伝子によりコードされる、以前から知られていたすべてのグルタチオン分解経路は、不活性化された(Ganguli et al. 2007, Genetics, and Baudouin-Cornu et al. 2012, J. Biol. Chem.)。

【0032】

しかし、代謝経路の不活性化にもかかわらず、前記菌株から得られたバイオマスは、下流の段階においてグルタチオン分解を引き起こし；生成物の精製中に、後にγ－グルタミル－システイン（γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ）と同定される不純物の増加と共に、グルタチオン含有量の減少が観察された。

【0033】

その後、生合成経路、又は公知のグルタチオンの代謝経路に関連しない別の遺伝子、すなわちＰＥＰ４遺伝子が不活性化され、グルタチオンのγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓへの生化学的分解が除去されたバイオマスが得られ；前記改善された安定性を有するバイオマスは、工業的な処理時間と適合し、したがって、より良い製品精製の利点を提供する。

【0034】

驚くべきことに、前記バイオマスはまた、発酵の最後でそのブロス中のＧｌｕ－Ｃｙｓの低い存在を示す。ＰＥＰ４遺伝子を含有する最初の菌株、及びプロテイナーゼＡを欠いた対応する派生菌株を、同じ条件下で発酵させると、後者の菌株において、所望の産物（グルタチオン）と非所望の産物（γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ）との間のより良い比率が得られる。

【0035】

本発明は、ＰＥＰ４遺伝子の不活性化が、グルタチオンの発酵生産においてより良い品質のバイオマスをもたらし、同時にバイオマスの工業的加工性を促進することを実証する。

【0036】

本発明による組換え微生物を導き出すことができる別の酵母は、一倍体菌株ＧＮ２３５７であるＳ・セレビシエ菌株であり、ここで、ＰＥＰ４遺伝子は、ゲノム中、ここでもまた染色体ＸＶＩ中に位置しているが；一倍体の細胞中にその１つの複写物のみが存在する。

【0037】

組換え二倍体又は一倍体の微生物におけるＰＥＰ４遺伝子の不活性化は、遺伝子のヌクレオチド配列を、ゲンタマイシンに類似した構造を有するアミノグリコシド系抗生物質であるＧ４１８に対する耐性を付与する外因性遺伝子の配列に置き換えることにより達成できる。次いで、挿入された外因性遺伝子は、酵母細胞において組換えプロセスの手段を用いて除去される。その結果、ＰＥＰ４遺伝子が欠失し、その機能が失われる。

【0038】

ＰＥＰ４遺伝子の不活性化により、より高い安定性を有するグルタチオンを蓄積することが可能なＳ・セレビシエの組換え菌株を得るために使用される方法は、一般的に、グルタチオンの安定性を改善しようとする他の酵母に適用できる。

【0039】

本発明の一実施態様では、グルタチオン分解及びγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ産生は、ピキア・パストリス菌株において減少し；特に、同じ実験条件下では、ＰＥＰ４遺伝子を欠いた菌株は、長期間かけてもより低いγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓの産生を示す。

【0040】

以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】２つの反復ｌｏｘＰ配列に挟まれたＫ・ラクティスのＵＲＡ３遺伝子を用いた置換によるＤＵＧ２遺伝子の欠失。

【図2】２つのＦＲＴ配列とＰＥＰ４遺伝子と相同な２つの領域に挟まれたＫａｎＭＸ４遺伝子を用いた置換によるＰＥＰ４遺伝子の欠失。

【図3】ＧＳＨの安定性－グラフは、異なる時間でＳ・セレビシエのバイオマス中に存在するγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドのレベルを示す。

【図4】ＧＳＨの安定性－グラフは、異なる時間のＰ・パストリスのバイオマスに存在する－Ｇｌｕ－Ｃｙｓジペプチドのレベルを示す。

【0042】

［実施例１］（比較）
酵母サッカロマイセス・セレビシエ菌株 ＮＣＹＣ２９５８を、欧州特許第１３９１５１７号の実施例３に記載されているように培養し；発酵の最後で酵母を遠心分離し、次いで脱イオン水を用いて遠心分離で洗浄する。得られたバイオマスを、記載されているグルコース及び他の栄養素を含有する１０倍量の水溶液に分散し、バイオマスの還元型グルタチオン含有量を増加させ；前記の手順の最後に、ブロス全体を遠心分離し、バイオマスを脱イオン水で洗浄して上清を除去する。

【0043】

次に、欧州特許第１３９１５１７号の実施例１に記載されているように、ＧＳＨに富んだ酵母バイオマスを、熱酸溶解を受けさせた後に、０．２ミクロンの多孔性を有するセラミック膜を通して精密ろ過する。前記特許の［００６０］項及び［００６１］項に記載されているように、得られたほぼ透明な溶液を、イオン交換樹脂のカラム、次いで吸着性樹脂に通し、最後にナノろ過により濃縮する。

【0044】

粉末状の還元型グルタチオンは、噴霧乾燥により精製された水溶液から得られ；得られた生成物は、欧州薬局方に定められた純度規格に適合する。

【0045】

［実施例２］ＥＣＭ３８及びＤＵＧ２を欠失したＳ・セレビシエの組換え菌株の構築
ＢＹ４７４２菌株から始まって、ＥＣＭ３８とＤＵＧ２遺伝子によりコードされる、以前から知られていたグルタチオン分解経路は、先行技術(Ganguli et al. 2007, Genetics, Baudouin-Cornu et al., 2012, J Biol Chem)に記載されているように行われた遺伝子工学的手法により不活性化された。

【0046】

ＤＵＧ２遺伝子は、ＢＹ４７４２菌株中で、２つの反復ｌｏｘＰ配列により挟まれた、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）のＵＲＡ３遺伝子（サッカロマイセス・セレビシエのＵＲＡ３遺伝子のホモログ）を用いた置換により除去された（図１）。

【0047】

ＬｏｘＰ－ＵＲＡ３－ＬｏｘＰカセットを含有し、ＤＵＧ２遺伝子の領域５’と３’に挟まれたＤＮＡ断片を使用して、ＢＹ４７４２株を形質転換し；ウラシルを含まない合成培地で増殖する能力に対して選択された形質転換物を精製し、且つ分析し、ＵＲＡ３マーカーを用いてＤＵＧ２遺伝子の置換を確認した。その後、グルタチオン生合成に必要な２つの酵素を触媒するＧＳＨ１とＧＳＨ２遺伝子を含有する発現カセットが、最初にＤＵＧ２遺伝子を含有している遺伝子座に挿入された。

【0048】

ＥＣＭ３８遺伝子は、（ＤＵＧ２がすでに欠失している菌株中で、）ＤＵＧ２について記載されているのと同じ工程に従って、クルイベロマイセス・ラクティスのＬＥＵ２遺伝子マーカー（サッカロマイセス・セレビシエのＬＥＵ２遺伝子のホモログ）を用いた置換により除去された。最後に、その後のリコンビナーゼ誘導により、２つのＵＲＡ３及びＬＥＵ２マーカー遺伝子が除去された。

【0049】

このようにして得られた菌株は、ＤＵＧ２及びＥＣＭ３８遺伝子（グルタチオンの分解に関与する）を欠失させるだけでなく、グルタチオンの生合成及び生産を増加させる遺伝子ＧＳＨ１及びＧＳＨ２の追加の複写物も含有する。

【0050】

［実施例３］Ｓ・セレビシエの組換えＰＥＰ４欠失性菌株の構築
既述した実施例の微生物は、化合物Ｇ４１８に対する耐性を付与する配列（ＫａｎＭＸ４）を含有するＤＮＡ断片を用いて形質転換される。形質転換の結果、前記配列は、内在性のＰＥＰ４遺伝子の場所に挿入され、それによりそのノックアウトが誘導される。一倍体菌株の場合、得られたものは、微生物のゲノム中に存在するＰＥＰ４遺伝子の唯一の複写物のノックアウトであり；二倍体酵母の場合、このプロセスが繰り返され、ＰＥＰ４遺伝子の第２の複写物もまた除去される。

【0051】

この形質転換に使用されるＤＮＡ断片は、ＫａｎＭＸ４遺伝子の配列（８１０ｂｐ）を含有し、２つのＦＲＴ（フリッパーゼ認識標的）組換え配列とＰＥＰ４遺伝子と相同な２つの領域（図２の第１の部分）に挟まれ、それがＰＥＰ４遺伝子座における断片の部位特異的組換えを可能にする役割を果たす。

【0052】

ＫａｎＭＸ４遺伝子は、プラスミドｐＷＫＷ (Storici et al. 1999, Yeast 15:271-283)から、プライマーＰ１及びＰ２の結合部位を用いて増幅することにより得られる。

【0053】

それぞれが特定の一対のオリゴヌクレオチドを介して得られる、２つの異なるＤＮＡ断片は、微生物のゲノム中に存在するＰＥＰ４遺伝子のそれぞれ２つの複写物をノックアウトするために使用される。

【0054】

以下のオリゴヌクレオチドは、ＰＥＰ４遺伝子の第１の断片の増幅と第１の複写物のノックアウトに使用される：

【化1】

【0055】

以下のオリゴヌクレオチドは、ＰＥＰ４遺伝子の第２の断片の増幅と第２の複写物のノックアウトに使用される：

【化2】

【0056】

こうして得られた断片１と断片２は精製され、酢酸リチウム法(Kawai et al. 2010 Bioeng bugs 1(6) 395-403)による微生物の形質転換に使用される。

【0057】

酵母は、断片１を用いて形質転換され、選択剤Ｇ４１８を含有するＹＰＤ培地に播種され；３つのＧ４１８耐性コロニーが得られ、そして単離される。ＰＥＰ４遺伝子座における断片１の形質転換と組換えを検証するために、３つのコロニーは、次のプライマーと条件を用いてＰＣＲ増幅により分析される：

【化3】

【0058】

ＰＣＲ産物は、０．８％ゲル電気泳動により分析され、予想どおり９５３ｂｐの断片と７２０ｂｐの断片が同定される。

【0059】

３つの形質転換物を液体ＹＰＤ培地中に接種し、３０℃で２０時間、２００rpmで撹拌しながら増殖するに任せる。細胞のインキュベーションの間に、Ｓ・セレビシエ Ｆｌｐ／ＦＲＴの内在性組換え系が活性化され、これは、異種ＫａｎＭＸ４遺伝子の切除をもたらす(Park YN et al. Yeast28(9) 673-681, 2011)。３つのそれぞれの培養液を、適切に希釈し、（選択剤Ｇ４１８の非存在下で）ＹＰＤ培地に播種する。その後、プレート上で増殖したコロニーを、レプリカプレーティングによりＹＰＤ＋Ｇ４１８培地のプレートに移す。前記プレート上でも成長しないコロニーは、Ｆｌｐ／ＦＲＴの組換えのために、異種ＫａｎＭＸ４遺伝子を失ったコロニーである。前記コロニーは、最初のＹＰＤプレートから単離され、以下のプライマー及び条件を用いてＰＣＲにより分析される：

【化4】

【0060】

ＰＣＲ産物は０．８％ゲル電気泳動により分析され、予想通り、６００ｂｐの断片を同定し、ＰＥＰ４遺伝子の第１の複写物のノックアウトが確認される。

【0061】

［実施例４］Ｓ．セレビシエの組換え二倍体菌株の構築
ＧＮ２３６３株（ＧＮ２３６１株から）、ＧＮ２３６４株（ＧＮ２３６２株から）、ＧＮ２３７６株（ＧＮ２３７３株から）の構築。手順は、実施例２に記載したように、最初の菌株ＧＮ２３６１、ＧＮ２３６２、ＧＮ２３７３に対して行なわれ、対応するＰＥＰ４欠失性菌株：ＧＮ２３６３、ＧＮ２３６４及びＧＮ２３７６が得られる。

【0062】

手順は、様々な酵母の菌株に対して、複製可能であり、且つ適用可能であることを証明した。

【0063】

酵母ＧＮ２３６３は、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（パリ、ブダペスト条約に基づく国際寄託当局）に寄託され、登録番号ＣＮＣＭＩ－５５７４として登録される。

【0064】

酵母ＧＮ２３６４は、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（パリ、ブダペスト条約に基づく国際寄託当局）に寄託され、登録番号ＣＮＣＭＩ－５５７５として登録される。

【0065】

［実施例５］実験室規模での酵母培養及びＧＳＨの安定性試験
ＧＮ２３６１菌株とＧＮ２３６３菌株（最初の菌株と組換え菌株）は、三角フラスコ中で、液体培養における増殖プロセスを用いて、同じ条件下で培養し、このプロセスは、栄養段階とその後の生産段階を含む。

【0066】

栄養段階は、栄養培地 ２０mL（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％ブドウ糖）に貯蔵した細胞 ０．５mL（－８０℃で凍結保存した）を接種することによって得られる。培養物は、２８℃で１６時間、２００rpmで攪拌しながら増殖するに任せる。

【0067】

インキュベーション期間の最後に、栄養培養物 １０mLを、生産用培地 ９０mL（２％酵母エキス、８％グルコース、０．２％システイン、０．２％グリシン、０．２％Ｌ－グルタミン酸）に接種する。培養物は、２８℃で４８時間、２５０rpmで撹拌しながら増殖するに任せる。

【0068】

インキュベーション期間の最後に、培養物を２つの等量の試料に分割して、安定性試験に使用するための２つの等量のサンプルを得る。

【0069】

それぞれの培養物について、１つの試料を直ちに熱溶解に供し、そのグルタチオン及びγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドの含有量をＨＰＬＣ法で分析する。第２の試料を２５℃で２４時間インキュベートする。インキュベーション期間の後、サンプルを熱溶解に供して、そのグルタチオン及びγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドの含有量を分析する。

【0070】

結果を表１に示し、表は、４つの独立したサンプルから得られた平均値を示す。

【表1】

【0071】

結果は、ＰＥＰ４欠失性菌株ＧＮ２３６３が、より少量のγＧｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドを産生し、２５℃での２４時間のインキュベーションの後でも一定のままであることを示す。最初の菌株ＧＮ２３６１（これは、ＰＥＰ４遺伝子を含有する）は、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドの量において１１２％の増加を示し、更により大きなＧＳＨの分解（ＧＳＨ残基で９５％対９８％）を示す。

【0072】

［実施例６］実験室規模での酵母の培養、及びバイオマス中のグルタチオンの安定性試験
ＧＮ２３６２菌株とＧＮ２３６４菌株（最初の菌株と組換え菌株）を培養し、ＧＳＨとγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドの含有量に対する安定性試験を、実験室規模で、実施例４に記載されるものと同じ手順を用いて行う。

【0073】

結果を表２に示し、表は、４つの独立したサンプルから得られた平均値を示している。

【表2】

【0074】

結果は、ＧＮ２３６４株（ＧＮ２３６２に対応するΔｐｅｐ４）が、親菌株よりも少ない量のγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓジペプチドを産生することを示す。γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓの増加は、親菌株ＧＮ２３６２よりもＧＮ２３６４株の方が相当低い（２４時間のインキュベーション後で１４％対８８％）。

【0075】

［実施例７］実験室規模での酵母の培養及びＧＳＨの安定性試験
ＧＮ２３７３株とＧＮ２３７６（最初の菌株と組換え菌株）を培養し、ＧＳＨとγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドの含有量に対する安定性試験を、実験室規模で、実施例４に記載されるものと同じ手順で行う。

【0076】

結果を表３に示し、表は、４つの独立したサンプルから得られた平均値を示す。

【表3】

【0077】

結果は、組換え菌株ＧＮ２３７６が、より少量のγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドを産生し、２５℃で２４時間のインキュベーションの後も一定のままであることを示す。最初の菌株ＧＮ２３７３（これは、さらにＰＥＰ４遺伝子を含有する）は、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドの量の７１％の増加を示す。

【0078】

［実施例８］実験室規模での一倍体Ｓ・セレビシエの培養及びＧＳＨ安定性試験
ＧＮ２３５７菌株及びＧＮ２３５７－Δｐｅｐ４菌株を培養し、ＧＳＨとγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドの含有量に対する安定性試験を、実験室規模で、実施例４に記載されるものと同じ手順で行う。

【0079】

結果を表４に示し、表は、４つの独立したサンプルから得られた平均値を示す。

【0080】

【表4】

結果は、菌株ＧＮ２３５７－Δｐｅｐ４が、より少量のγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドを産生し、２５℃で２４時間のインキュベーションの後も一定のままであることを示す。代わりに、ＰＥＰ４遺伝子をまだ含有している菌株は、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドの量の４６％増加を示す。

【0081】

［実施例９］パイロットスケールでの酵母の培養及びＧＳＨ安定性試験
ＧＮ２３６１菌株及び対応するＧＮ２３６３菌株（組換えΔｐｅｐ４）を、液体培地中で、増殖プロセスにより培養し、このプロセスは、三角フラスコ中での前栄養段階と栄養段階、及びバイオリアクター中での発酵段階と生産段階を含む。

【0082】

前栄養段階は、実施例４に記載されているように行う。

【0083】

栄養段階は、前栄養培養液 ０．１mLを、三角フラスコ中の栄養培地 ４００mL（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％ブドウ糖）に移すことにより行う。培養液を、２８℃で２４時間、２４０rpmの撹拌下でインキュベートする。

【0084】

発酵段階は、生産用培地（酵母エキス、ブドウ糖、アンモニウム、リン酸、硫酸並びにビタミン及びミネラルサプリメント）を含有する７Ｌのバイオリアクターに移し、２８℃で、ガスを流し（１～２VVMの空気流量）、そして撹拌（６００～１２００rpm）することにより行う。

【0085】

発酵培養のバイオマスを収穫し、遠心分離により半分の体積に濃縮し、そして２８℃で、ガスを流し（１VVMの空気流量）且つ撹拌して（６００rpm）、生産用培地（グルコース、アンモニウム、リン酸塩、硫酸塩、システイン、グリシン及びグルタミン酸）を含む７Ｌのバイオリアクターに再導入する。

【0086】

インキュベーション期間の最後に、培養物を４つの等量の試料に分割し、安定性試験に使用する４つの等量のサンプルを得る。

【0087】

それぞれの培養物について、１つの試料を直ちに熱溶解に供し、そのグルタチオン及びγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチド含有量をＨＰＬＣ法により分析する。残りの３つの試料を２５℃で２４時間、それぞれ４８時間及び７２時間インキュベートする。それぞれのインキュベーション期間の後、サンプルを熱溶解に供し、そのグルタチオンとγ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ ジペプチドの含有量を分析する。

【0088】

結果を表１に示す。この表は、最初の菌株ＧＮ２３６１を用いて得られたデータと、対応する遺伝子組換え酵母ＧＮ２３６３を用いた２つの独立した試験から得られたデータを示す。

【表5】

【0089】

データは、全体的に少ない分解（％力価の低下）を伴い、且つ酵素による分解がほとんど除去された（γ－ＧＣの限定的な増加）、遺伝子組換えバイオマス中のグルタチオンの増加した安定性を示す。

【0090】

［実施例１０］パイロットスケールでの酵母の培養及びＧＳＨ安定性試験
ＧＮ２３６２株とそれに対応するＧＮ２３６４菌株（改変されたΔｐｅｐ４）を実施例９に記載のように培養する。

【0091】

結果を下の表及び図３に示す。

【表6】

【0092】

データは、全体的に少ない分解（％力価の低下）を伴い、且つ酵素による分解がほとんど除去されている（γ－ＧＣの限定的な増加）、遺伝子組換えバイオマス中のグルタチオンのより高い安定性を示す。ｙ－ＧＣは、化学的プロセスによりゆっくりと分解する。

【0093】

ＧＮ２３６２では、細胞溶解がプロテイナーゼＡを急速に放出する一方、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓの増殖はより速く、次いで自然分解によりゆっくりと減少する。

【0094】

ＧＮ２３６４では、ｙ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓの増殖は全細胞と溶解細胞の両方で遅い。

【0095】

［実施例１１］ピキア・パストリスの発酵及びグルタチオンの安定性試験
菌株 ピキア・パストリス Ｘ－３３（これは、ＰＥＰ４を含有する）、ＳＭＤ１１６８Ｈ（これは、ＰＥＰ４を含有しない）及びＧＮ２３６４（上記の組換えＳ・セレビシエ）を、適切な培地中、２５０rpmで２８℃で４８時間培養する。発酵の最後で、細胞バイオマスを遠心分離により収穫し、ｄＨ_２Ｏに再懸濁し、それぞれの菌株につき１つの懸濁液を得る。

【0096】

ｄＨ_２Ｏ中のグルタチオンの原液は、１５０g/Lの濃度に調製する。原液の１つの試料を細胞バイオマス懸濁液に加え、最終的に１０g/LＧＳＨ濃度とする。ＧＳＨを加えた細胞バイオマスを１．５mLの試料に分割し、９００rpmで撹拌しながら２５℃の制御温度でインキュベートする。γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓの生成を９６時間まで監視し、インキュベートしたサンプルを異なる時間でＨＰＬＣ分析する。得られたデータを図４に示す。

【0097】

データは、ピキアＸ－３３菌株によるグルタチオンの分解が、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓを与えることを示すが、ＰＥＰ４遺伝子を欠いた２つの酵母、ピキアＳＭＤ１１６８Ｈ及びサッカロマイセスＧＮ２３６４は、同じ挙動を示し、γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓの生産を増加させない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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【国際調査報告】